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CN101970488A - 对il-31特异的人源化抗体分子 - Google Patents

对il-31特异的人源化抗体分子 Download PDF

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CN101970488A CN2008801196549A CN200880119654A CN101970488A CN 101970488 A CN101970488 A CN 101970488A CN 2008801196549 A CN2008801196549 A CN 2008801196549A CN 200880119654 A CN200880119654 A CN 200880119654A CN 101970488 A CN101970488 A CN 101970488A
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Abstract

本发明提供了人源化小鼠抗人IL-31抗体和抗体片段，其能够结合IL-31，并且从而中和、抑制、限制或减少IL-31的促炎或促瘙痒效应。

Description

对IL-31特异的人源化抗体分子
发明背景
已发现新鉴定的细胞因子IL-31当在小鼠中过表达时导致皮炎样症状。参见，Dillon，等人，Nature Immunol.5：752-760，2004。这些症状可以通过使用拮抗剂得到减轻，所述拮抗剂阻断、抑制、减少、拮抗或中和IL-31的活性，并且包括抗IL-31抗体。还参见，于2003年1月21日提交的美国专利申请序列号10/352,554(美国专利公开号2003-0224487)，现在的美国专利序列号7,064,186、7,425,325和7,459,293。
单克隆抗体技术已提供用于在鉴定且治疗疾病中使用的广泛多样的治疗以及诊断。包括啮齿类动物抗原结合位点的许多重组或生物合成分子已得到描述。特别地，通过仅将啮齿类动物结合位点而不是整个可变结构域移植到人免疫球蛋白重和轻链结构域内，具有直接构建到人抗体上的啮齿类动物抗原结合位点的分子已得到描述。参见例如，Riechmann等人(1988)Nature 332：323-327和Verhoeyen等人(1988)Science 239：1534-1536。具有抗原结合位点的分子已在于1994年9月21日公开的英国专利公开号GB 2,276,169中得到描述，其中可变结构域的至少一个互补决定区(CDRS)衍生自鼠类单克隆抗体，并且分子的其余免疫球蛋白衍生部分衍生自人免疫球蛋白。许多单链抗原结合位点多肽和单链Fv(sFv)分子也已得到描述。参见例如，属于Huston等人的美国专利号5,132,405和5,091,513；以及属于Ladner等人的美国专利号4,946,778。
小鼠抗人IL-31单克隆抗体先前已在2006年5月8日提交的美国专利申请序列号11/430,066中得到描述(美国专利公开号2006-02752960)，其描述了这样的小鼠单克隆抗体，其识别人IL-31，并且可以用于产生嵌合抗体。然而，嵌合抗体可能引起免疫原性，并且人源化小鼠抗人IL-31抗体是希望的。人源化抗体一般具有超过小鼠或在某些情况下超过嵌合抗体的用于在人治疗中的至少3个潜在优点：(1)因为效应子部分是人，所以它可以与人免疫系统的其他部分更好地相互作用(例如，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞)；(2)人免疫系统不会将人源化抗体的构架或恒定区识别为外源的，并且因此针对此类所注入抗体的抗体应答应小于针对完全外源的小鼠抗体或部分外源的嵌合抗体；和(3)已报告所注射的小鼠抗体在人循环中具有比正常抗体的半衰期短得多的半衰期(D.Shaw等人，J.Immunol，138，4534-4538(1987))。所注射的人源化抗体推测将具有更类似于天然存在的人抗体的半衰期，允许给予更小且更不频繁的剂量。
因此，需要提供关于小鼠抗人IL-31抗体的人源化可变区氨基酸序列的分子，用于治疗IL-31介导的炎症。
发明概述
在一个方面中，本发明涉及与人IL-31结合的经分离的抗体，其包括：a)包括分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2和3组成或分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、4和3组成的CDRs的人源化重链可变结构域；b)包括由氨基酸序列SEQ IDNO：5、6和7组成的CDRs的人源化轻链可变结构域。在另一个方面，本发明涉及本文描述的抗体，其中：a)所述人源化重链可变结构域包括与选自下述的氨基酸序列具有至少90％等同的氨基酸序列的构架区FR1、FR2、FR3和FR4：1)分别地SEQ ID NO：8(FR1)、9(FR2)、10(FR3)和11(FR4)的氨基酸序列；2)分别地SEQ ID NO：12(FR1)、13(FR2)、14(FR3)和15(FR4)的氨基酸序列；3)分别地SEQ ID NO：12(FR1)、13(FR2)、16(FR3)和15(FR4)的氨基酸序列；和b)所述人源化轻链可变结构域包括与选自下述的氨基酸序列构架区具有至少90％等同的氨基酸序列的构架区FR5、FR6、FR7和FR8：1)分别地SEQ ID NO：17(FR5)、18(FR6)、19(FR7)和20(FR8)的氨基酸序列；和2)分别地SEQ ID NO：17(FR5)、18(FR6)、21(FR7)和20(FR8)的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述同一性是至少95％，更加优选至少98％，最优选至少99％。
在另一个方面，本发明涉及如本文所描述的经分离的抗体，其中在重链的FR1中位置29处的氨基酸是亮氨酸，并且在重链的FR3中位置32处的氨基酸是苯丙氨酸。在另一个方面，本发明涉及如本文所描述的经分离的抗体，其中在重链的FR3中位置8处的氨基酸是赖氨酸，并且在轻链的FR7中位置15处的氨基酸是酪氨酸。
在一个进一步的方面，本发明涉及与人IL-31结合的经分离的抗体，其包括：a)包括分别具有SEQ ID NO：1和3的氨基酸序列的CDR1和CDR3以及具有AIYPGDGDTRYSXaa1Xaa2FXaa3G(SEQID NO：22)的氨基酸序列的CDR2的人源化重链可变结构域，其中Xaa1是谷氨酰胺或脯氨酸，Xaa2是丝氨酸或赖氨酸，并且Xaa3是谷氨酰胺或赖氨酸；所述人源化重链可变结构域包括与下述氨基酸序列具有至少90％等同的氨基酸序列的构架区FR1、FR2、FR3和FR4：分别地SEQ ID NO：8、9、10和11，或分别地SEQ ID NO：12、13、14和15，或分别地SEQ ID NO：12、13、16和15；并且前提是在FR1中位置29处的氨基酸是亮氨酸，并且在FR3中位置32处的氨基酸是苯丙氨酸；b)包括由SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列组成的CDRs的人源化轻链可变结构域，所述人源化轻链可变结构域包括分别与SEQ ID NO：17、18、19和20的氨基酸序列具有至少90％等同，或分别与SEQ ID NO：17、18、21和20的氨基酸序列具有至少90％等同的氨基酸序列的构架区FR5、FR6、FR7和FR8。在本发明的一个方面，所述同一性是至少95％，更加优选至少98％，最优选至少99％。在另一个方面，本发明涉及如本文所描述的经分离的抗体，其中在重链的FR3中位置8处的氨基酸是赖氨酸，并且在轻链的FR7中位置15处的氨基酸是酪氨酸。在另一个方面，本发明涉及如本文所描述的经分离的抗体，其中氨基酸Xaa1是谷氨酰胺，Xaa2是赖氨酸，并且Xaa3是赖氨酸；氨基酸Xaa1是脯氨酸，Xaa2是丝氨酸，并且Xaa3是谷氨酰胺；或氨基酸Xaa1是谷氨酰胺，Xaa2是赖氨酸，并且Xaa3是谷氨酰胺。
在另一个方面，本发明涉及如本文所描述的经分离的抗体，其中重链可变结构域的CDRs分别由SEQ ID NO：1、4和3组成，轻链可变结构域的CDRs分别由SEQ ID NO：5、6和7组成，重链可变结构域的构架区分别由SEQ ID NO：8、9、10和11组成，并且轻链可变结构域的构架区分别由SEQ ID NO：17、18、19和20组成。
在另一个方面，本发明涉及如本文所描述的经分离的抗体，其中重链可变结构域的CDRs分别由SEQ ID NO：1、2和3组成，轻链可变结构域的CDRs分别由SEQ ID NO：5、6和7组成，重链可变结构域的构架区分别由SEQ ID NO：12、13、14和15组成，并且轻链可变结构域的构架区分别由SEQ ID NO：17、18、19和20组成。
在另一个方面，本发明涉及如本文所描述的经分离的抗体，其中重链可变结构域的CDRs分别由SEQ ID NO：1、2和3组成，轻链可变结构域的CDRs分别由SEQ ID NO：5、6和7组成，重链可变结构域的构架区分别由SEQ ID NO：12、13、16和15组成，并且轻链可变结构域的构架区分别由SEQ ID NO：17、18、21和20组成。
如由本文实施例和教导显示的，在本文描述的人源化抗体的FR1中位置29处的亮氨酸和在FR3中位置32处的苯丙氨酸的存在对所述抗体的亲和力和效力而言具有正面影响。如例如在Biacore测定法中显示的，当与在以下这些位置处具有另一个氨基酸的人源化抗体相比较时，具有在FR1中位置29处的亮氨酸和在FR3中位置32处的苯丙氨酸的人源化抗体的结合亲和力更佳(比较例如实施例3的表2中的克隆编号7、10、13和14)。在重链的FR1的位置29和FR3的94处的这些氨基酸对亲和力和效力而言的正面影响也已通过2种其他生物学测试加以证实(参见实施例4和5)。
在本发明的一个实施方案中，本文公开的抗体包括选自α、γ、μ、δ或ε人免疫球蛋白重链的恒定区的重链免疫球蛋白恒定结构域。在本发明的一个实施方案中，本文公开的抗体包括选自人IgG1恒定结构域；人IgG2恒定结构域；人IgG3恒定结构域；人IgG4恒定结构域；人IgM恒定结构域；人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域的重链免疫球蛋白恒定结构域。在一个实施方案中，人IgG4恒定结构域是在溶液中稳定并且具有很少的补体活化活性或无补体活化活性的突变形式。在一个实施方案中，重链免疫球蛋白恒定区结构域是在位置241处(Kabat编号)具有Ser至Pro突变的人IgG4恒定结构域。
在一个实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定区结构域选自κ或λ人免疫球蛋白轻链的恒定区。优选地，免疫球蛋白轻链恒定区结构域是κ人免疫球蛋白轻链的恒定区。
发明详述
在详细阐述本发明前，定义下述术语对于其理解可能是有帮助的：
如本文所使用的，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和力纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段，例如F(ab′)2、Fab蛋白酶解片段、和单链可变区片段(scFvs)。通常还包括遗传改造的完整抗体或片段，例如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等，以及合成抗原结合肽和多肽。非人抗体可以通过下述进行人源化：将非人CDRs移植到人构架和恒定区上，或掺入整个非人可变结构域(任选地通过替换所暴露的残基用人样表面对其进行“掩饰(cloaking)”，其中结果是“镶盖(veneered)”抗体)。在某些情况下，人源化抗体可以保留在人可变区构架结构域内的非人残基，以增强合适的结合特征。通过对抗体进行人源化，可以增加生物半衰期，并且减少关于在施用于人后的不利免疫反应的可能性。
术语“嵌合抗体”指其轻和重链基因一般已通过遗传改造由属于不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因构建的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段可以与人恒定区段例如γ1和γ3连接。一般的治疗性嵌合抗体因此是由来自小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定结构域组成的杂交蛋白质，尽管也可以使用其他哺乳动物物种。
如本文所使用的，术语“免疫球蛋白”指由基本上通过免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。一种形式的免疫球蛋白构成抗体的基本结构单元。这种形式是四聚体，并且由2对等同的免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链。在每对中，轻和重链可变区一起负责与抗原结合，并且恒定区负责抗体效应子功能。
全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)由在NH2末端处的可变区基因(约110个氨基酸)和在COOH末端处的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)相似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其他前述恒定区基因之一(约330个氨基酸)编码。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并且将抗体的同种型分别限定为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻和重链内，可变和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。(一般参见，Fundamental Immunology(Paul，W.，编辑，第二版Raven Press，N.Y.，1989)，第7章(其关于产生抗体和抗体片段的公开内容通过引用合并入本文)。
免疫球蛋白轻或重链可变区由通过3个高变区间断的“构架”区组成。因此，术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917)(这两者都通过引用合并入本文)。“构架区”或“FR”残基是除如本文所限定的高变区残基外的那些可变结构域残基。不同轻或重链的构架区的序列在物种内是相对保守的。因此，“人构架区”是与天然存在的人免疫球蛋白的构架区基本上等同(约85％或更多，通常90-95％或更多)的构架区。其为组成的轻和重链的组合构架区的抗体构架区作用于定位且对齐CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。
因此，术语“人源化”免疫球蛋白指包括人构架区和来自非人(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，并且提供构架的人免疫球蛋白被称为“受体”。恒定区不一定存在，但如果它们存在，那么它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本上等同，即至少约85-90％、优选约95％或更多等同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除CDR外，与天然人免疫球蛋白序列的相对应部分基本上等同。“人源化抗体”是包括人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体将不包括如上文定义的一般嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可变区是非人的。
术语“重组抗体”意指其中氨基酸序列已与天然抗体的那种不同的抗体。因为重组DNA技术在抗体产生中的关联性，所以无需局限于在天然抗体中发现的氨基酸序列；可以重新设计抗体以获得所需特征。可能的变异有许多并且范围从仅一个或数个氨基酸的改变到例如可变或恒定区的完全重新设计。一般而言，将进行恒定区中的改变以便改善或改变特征，例如补体结合、与膜的相互作用和其他效应子功能。将进行可变区中的改变以便改善抗原结合特征。
除抗体外，免疫球蛋白还可以以各种其他形式存在，包括例如单链或Fv、Fab和(Fab’)2，以及双抗体、线性抗体、多价或多特异性杂交抗体(如上文所述且在下述中详述的：Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17，105(1987))和以单链(例如，Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird等人，Science，242，423-426(1988)，其就其关于抗体片段的教导通过引用合并入本文)。(一般参见，Hood等人，″Immunology″，Benjamin，N.Y.，第二版(1984)，以及Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986)，其关于抗体通过引用合并入本文)。
如本文所使用的，术语“单链Fv”、“单链抗体”、“Fv”或“scFv”指包括来自重和轻链的可变区但缺乏恒定区但在单条多肽链内的抗体片段。一般地，单链抗体进一步包括在VH和VL结构域之间的多肽接头，这使得其形成将允许抗原结合的所需结构。单链抗体由Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)中详细讨论；还参见国际专利申请公开号WO 88/01649以及美国专利号4,946,778和5,260,203，其公开内容为了任何目的通过引用合并入本文。在特定实施方案中，单链抗体也可以是双特异性和/或人源化的。
“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链无法与另一个重链分子形成二硫键。
“Fab′片段”包含一条轻链和一条重链，其包含在CH1和CH2结构域之间的更多恒定区，从而使得链间二硫键可以在2条重链之间形成，以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”包括包含在CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的2条轻链和2条重链，从而使得链间二硫键在2条重链之间形成。
由不精确的分析方法(例如凝胶电泳)测定的多聚体的分子量和长度应理解为近似值。当此类值表示为“约”X或“大约”X时，所述值X应理解为精确至±10％。
本文引用的所有参考文献通过引用整体合并入本文。
本发明基于抗体的人源化小鼠抗人IL-31可变区序列的发现。这些抗体作为针对IL-31的拮抗剂的使用可以抑制一般而言的炎症，并且特异性地皮炎和瘙痒疾病的症状。本发明提供了抗体的人源化轻链和重链区的用途，所述抗体识别、结合和/或中和IL-31多肽。此类人源化轻和重链区可以与免疫球蛋白恒定区例如IgG4或IgG1融合，并且在各种宿主细胞中表达。使用单克隆抗体的小鼠抗人IL-31轻链和重链可变区的氨基酸序列产生本文描述的人源化抗IL-31可变区序列，所述单克隆抗体先前在通过引用合并入本文、于2006年5月8日提交的美国专利申请序列号11/430,066(美国专利公开号2006-02752960)中描述。
抗体可以包括包含轻链可变区和重链可变区或由轻链可变区和重链可变区组成的抗体或抗体片段，并且可以是中和、抑制、减少、阻止或最小化IL-31对其受体的作用的嵌合、人源化或抗体片段。抗体或抗体片段的临床结果可以是炎性或自身免疫疾病中的减少，所述疾病例如皮炎，特别是特应性皮炎以及瘙痒疾病和克罗恩氏病，如本文进一步描述的。在一个实施方案中，皮炎是特应性皮炎。在另一个实施方案中，皮炎是结节性痒疹。在另一个实施方案中，皮炎是湿疹。减少也可以是发痒、搔抓或脱发中的减少。
IL-31是新发现的T细胞细胞因子，其当在小鼠中过表达时导致皮炎样症状。参见，Dillon，等人，Nature Immunol.5：752-760，2004。IL-31是关于这样的细胞因子的HUGO名称，所述细胞因子先前在于2003年1月21日提交的美国专利申请序列号10/352,554(美国专利公开号2003-0224487)，目前的美国专利序列号7,064,186，Sprecher，Cindy等人，2003，通过引用合并入本文)中描述为Zcyto17rlig。还参见Dillon，等人，Nature Immunol.，同上。人IL-31的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：24中。组织分析揭示小鼠IL-31的表达在睾丸、脑、CD90+细胞、前列腺细胞、唾液腺和皮肤中发现。
关于IL-31的异二聚受体在美国专利公开号20030224487中描述为zcytor17(HUGO名称，IL-31RA)，其与制癌素M受体β(OSMRβ)形成异二聚体。IL-31从由活化人外周血细胞(hPBC)产生的cDNA文库中分离，所述细胞就CD3进行选择。CD3是对于淋巴样起源的细胞特别是T细胞独特的细胞表面标记。
通过包括人源化小鼠抗人轻链可变结构域和/或人源化小鼠抗人重链可变结构域的分子(本文称为“IL-31抗原结合分子”或“IL-31拮抗剂”)抑制、中和或阻断信号转导可以通过本领域技术人员已知的许多测定法进行测量。例如，测量增殖中的减少的测定法包括关于染料的减少的测定法，例如AlamarBlueTM(AccuMed International，Inc.Westlake，Ohio)，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(Mosman，J.Immunol.Meth.65：55-63，1983)；3，(4，5二甲基噻唑-2-基)-5-3-羧基甲氧基苯基-2H-四唑；2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑氢氧化物；和氰基二甲苯基-四唑氯化物(其从Polysciences，Inc.，Warrington，PA商购可得)；促有丝分裂测定法，例如3H-胸苷掺入的测量；使用例如萘黑或台盼蓝的染料排除测定法；使用二乙酰荧光素的染料摄取；和铬释放。一般而言，参见Freshney，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，第三版Wiley-Liss，1994，其通过引用合并入本文。除上述外，关于表达IL-31RA和全长OSMRβ的BaF3细胞的例子或如本文描述的活性例子中显示的，参见公开的美国专利公开号20030224487，(Sprecher，Cindy等人，2003)。
用于制备编码本文描述的抗体的多核苷酸(包括DNA和RNA)的方法是本领域众所周知的。总RNA可以使用异硫氰酸胍提取随后通过在CsCl梯度中离心分离而制备(Chirgwin等人，Biochemistry 18：52-94，1979)。多聚(A)+RNA使用Aviv和Leder的方法(Proc. Natl.Acad.Sci.USA 69：1408-12，1972)由总RNA制备。互补DNA(cDNA)使用已知方法由多聚(A)+RNA制备。在备选方法中，可以分离基因组DNA。编码IL-31抗体的多核苷酸随后通过例如杂交或PCR进行鉴定且分离。
本发明还包括人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂，其结合IL-31多肽的功能片段，和编码此类功能片段的核酸分子。如本文所定义的“功能性”IL-31或其片段的特征在于其增殖或分化活性，其诱导或抑制专门化细胞功能的能力，或其与这些受体(可溶或固定的)的抗IL-31抗体或IL-31RA/OSMRβ异二聚体特异性结合的能力。因此，本发明进一步提供了人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂，其结合包括一个或多个IL-31功能片段的多肽分子。
本发明还提供了人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂，其与包括IL-31多肽的具有表位的部分或免疫原性表位或抗原性表位的多肽片段或肽结合。抗体与这些表位的结合导致IL-31在其同源受体上的信号转导的抑制、阻断、中和和/或减少。
小鼠抗人IL-31单克隆抗体先前已在于2006年5月8日提交的共同未决的美国专利申请序列号11/430,066(美国专利公开号2006-02752960)中得到描述。小鼠抗人IL-31抗体的可变区的氨基酸序列在于2007年9月4日提交的共同未决的美国专利申请序列号11/850,006和于2007年9月4日提交的共同拥有的PCT申请US07/77555中得到描述，这两个专利都为了可变区序列和抗体产生方法而通过引用合并入本文。这些氨基酸序列用作关于本文描述的人源化序列的原材料。特别地，小鼠抗人IL-31抗体序列来自具有克隆编号292.12.3.1的杂交瘤。
如本文所描述的抗体的活性可以通过其抑制或减少增殖的能力进行测量，使用测量表达IL-31RA受体的细胞的增殖或与表达IL-31RA受体的细胞的结合的各种测定法。特别感兴趣的是IL-31依赖性细胞中的改变。待改造为IL-31依赖性的合适细胞系包括IL-3依赖性BaF3细胞系(Palacios和Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot等人Mol.Cell.Biol.6：4133-4135，1986)、FDC-P1(Hapel等人Blood 64：786-790，1984)和MO7e(Kiss等人，Leukemia 7：235-240，1993)。生长因子依赖性细胞系可以根据已公开的方法建立(例如Greenberger等人，Leukemia Res.8：363-375，1984；Dexter等人，Baum等人编辑，Experimental Hematology Today，8th Ann.Mtg.Int.Soc.Exp.Hematol.1979，145-156，1980)。人源化抗IL-31抗体或拮抗剂的活性也可以在本文描述的BaF3增殖测定法、Biacore测定法或NHK测定法中进行测量。
在一个实施方案中，免疫球蛋白重链恒定区结构域选自α、γ、μ、δ或ε人免疫球蛋白重链的恒定区。所述恒定区可以是γ1、γ2、γ3或γ4人免疫球蛋白重链的恒定区。
在另一个实施方案中，免疫球蛋白轻链恒定区结构域选自κ或λ人免疫球蛋白轻链的恒定区。
在另一个实施方案中，重恒定链是人γ4，其在溶液中是稳定的并且具有很少的补体活化活性或无补体活化活性。在另一个实施方案中，重恒定链是人γ1。
免疫球蛋白可以选自免疫球蛋白主要类别中的任何，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及任何亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、lgG3和IgG4；IgA-1和IgA-2。
IL-31的活性的抑制可以通过许多测定法进行测量。除本文公开的这些测定法外，样品可以在各种测定法内就IL-31活性的抑制进行测试，所述测定法经设计为测量受体结合、IL-31依赖性细胞应答的刺激/抑制或IL-31RA受体表达细胞的增殖。
IL-31结合多肽包括IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂也可以用于配体的纯化。多肽固定在固体支持物上，例如琼脂糖、交联琼脂糖、玻璃、纤维树脂、基于二氧化硅的树脂、聚苯乙烯、交联聚丙烯酰胺或类似材料的珠，所述材料在使用条件下是稳定的。用于使多肽与固体支持物链接的方法是本领域已知的，并且包括胺化学、溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化和酰肼活化。所得到的介质一般将以柱的形式配置，并且使包含配体的液体流经柱一次或多次，以允许配体与受体多肽结合。配体随后使用盐浓度、离液剂(胍HCl)或pH中的改变进行洗脱，以破坏配体-受体结合。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂视为特异性结合，如果：1)它们显示结合活性的阈值水平，和2)它们不与相关多肽分子显著交叉反应。如果与和对照(非IL-31)多肽的结合亲和力相比较，本文的IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂以至少10倍大的亲和力与IL-31多肽、肽或表位结合，那么测定结合的阈值水平。优选抗体显示106M-1或更大的结合亲和力(Ka)，优选107M-1或更大，更优选108M-1或更大，且最优选109M-1或更大。人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的结合亲和力可以由本领域技术人员例如通过Scatchard分析(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)容易地测定。
使用标准Western印迹分析(Ausubel等人，同上)，例如通过检测IL-31多肽而不是已知相关多肽的IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂显示IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂是否不与相关多肽分子显著交叉反应。筛选还可以使用非人IL-31和IL-31突变多肽完成。此外，IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以针对已知相关多肽进行“筛选”，以分离与IL-31多肽特异性结合的群体。例如，IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂与相关多肽吸附，所述相关多肽与不溶性基质粘附；对IL-31特异的IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂将在合适的缓冲条件下流经基质。Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane(编辑)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；Current Protocols in Immunology，Cooligan，等人(编辑)，National Institutesof Health，John Wiley和Sons，Inc.，1995。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的特征在于当在经纯化的重组蛋白质人IL-31的存在下生长时，其阻断、抑制、阻止或减少受体结合的能力。例如，人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以以许多方法进行表征，所述方法包括框并(即，测定每种抗体是否可以抑制任何其他结合的结合)、相对亲和力和中和。
本发明的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂显示于下文表1和图1中。
在下表1中，关于具有指定“12VH1”的克隆(即，克隆7、9、10、13-18和26-36)：术语“fback”意指LC(back)+HC(fback)；术语“LC(back)”意指LC(G66R、G68E、D70Q、F71Y、T72S)；并且术语“HC(back)”意指HC(F29L、M69L、R71A、T73K、V78A、R94F)。相似地，在下表1中，关于指定“12VH5”的克隆(即，克隆8、11和21-24)：术语“fback”意指LC(back)+HC(fback)；术语“LC(back)”意指LC(G66R、G68E、D70Q、F71Y、T72S)；并且术语“HC(back)”意指HC(G24A、S28T、F29L、I69L、S70T、R94F)。
表1：人源化292.12.3.1构建体
  克隆编号   突变描述   重链SEQ IDNO：   轻链SEQ IDNO：
  7   12VH1-gly+fback   25   26
  8   12VH5-gly+fback   27   26
  9   12VH1-gly+HC(fback)   25   28
  10   12VH1-gly+LC(fback)   29   26
  11   12VH5-gly+HC(fback)   27   28
  13   12VH1-gly+HC(F29L，M69L，R71A，T73K，V78A)+LC(fback)   30   26
  14   12VH1-gly+HC(M69L，R71A，T73K，V78A，R94F)+LC(fback)   31   26
  16   12VH1-gly+HC(fback)+LC(G66R，G68E，D70Q，T72S)   25   32
  17   12VH1-gly+HC(fback)+LC(D70Q，F71Y，T72S)   25   33
  18   12VH1-gly+HC(fback)+LC(G66R，G68E，F71Y)   25   34
  21   12VH5-gly+HC(G24A，S28T，F29L，R94F)+LC(fback)   35   26
  22   12VH5-gly+HC(fback)+LC(G66R，G68E，D70Q，T72S)   27   32
  23   12VH5-gly+HC(fback)+LC(D70Q，F71Y，T72S)   27   33
  24   12VH5-gly+HC(fback)+LC(G66R，G68E，F71Y)   27   34
  25   12VH1-gly+HC(F29L，R94F)+LC(F71Y)   36   37
  26   12VH1-gly+HC(fback)+LC(F71Y)   25   37
  27   12VH1-gly+HC(F29L，M69L，R94F)+LC(F71Y)   38   37
  28   12VH1-gly+HC(F29L，R71A，R94F)+LC(F71Y)   39   37
  29   12VH1-gly+HC(F29L，T73K，R94F)+LC(F71Y)   40   37
  30   12VH1-gly+HC(F29L，V78A，R94F)+LC(F71Y)   41   37
  31   12VH1-gly+HC(F29L，M69L，R71A，V78A，R94F)+LC(F71Y)   42   37
  32   12VH1-gly+HC(F29L，R71A，V78A，R94F)+LC(F71Y)   43   37
  33   12VH1(germ)-gly+fback   44   26
  34   12VH1-gly+HC(F29L，R94F)+LC(fback)   36   28
  35   12VH1-gly+HC(F29L，R94F)   36   28
  36   12VH1(germ)-gly+HC(F29L，T73K，R94F)+LC(F71Y)   45   37
本文公开的抗体可以通过本领域本身已知的任何技术来产生，例如通过重组技术、化学合成、克隆、连接或其组合。在一个实施方案中，本发明的抗体通过重组技术产生，例如通过在合适宿主细胞中表达相对应的核酸。所产生的多肽可以是或不是糖基化的，或可以包含其他翻译后修饰，依赖于所使用的宿主细胞类型。许多书本和综述提供关于如何使用载体和原核或真核宿主细胞来克隆且产生重组蛋白质的教导，例如由Oxford University Press出版的系列″A PracticalApproach″中的某些书目(″DNA Cloning 2：Expression Systems″，1995；″DNA Cloning 4：Mammalian Systems″，1996；″ProteinExpression″，1999；″Protein Purification Techniques″，2001)。
本发明的一个进一步目的因此是编码本文上文或下文描述的任何抗体、或其互补链或简并序列的经分离的核酸分子。在这点上，术语“核酸分子”包括所有不同类型的核酸，包括但不限于脱氧核糖核酸(例如，DNA、cDNA、gDNA、合成DNA等)，核糖核酸(例如RNA、mRNA等)和肽核酸(PNA)。在一个优选实施方案中，核酸分子是DNA分子，例如双链DNA分子或cDNA分子。术语“经分离的”意指这样的核酸分子，其已鉴定且与它在天然来源中通常与之结合的至少一种污染核酸分子分开。经分离的核酸分子与其中它在自然界中发现的形式或背景不同。经分离的核酸分子因此不同于当它在天然细胞中存在时的特定核酸分子。简并序列指定这样的任何核苷酸序列，其编码与参考核酸序列相同的氨基酸序列，但包括由于遗传密码简并的不同核苷酸序列。
本发明的一个进一步目的是包括编码上文或下文描述的抗体中的任何的DNA的载体。该载体可以是任何克隆或表达载体、整合或自主复制的、在任何原核或真核细胞中起作用。特别地，该载体可以是质粒、粘粒、病毒、噬菌体、附加体(episome)、人工染色体等。所述载体可以包括关于重和轻链的编码序列、或轻和重链编码序列中的任一。该载体应包括关于重和轻链的编码序列，重和轻链可以各自与启动子可操作地连接。启动子对于重和轻链可以是相同或不同的。重和轻链还可以与一种单一启动子可操作地连接，在这种情况下关于重和轻链的编码序列可以优选通过内部核糖体进入位点(IRES)分离。用于真核基因表达的合适启动子是例如衍生自病毒基因的启动子，例如鼠类或人巨细胞病毒(CMV)或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，其是本领域技术人员众所周知的。所述载体可以包括调节元件，例如启动子、终止子、增强子、选择标记、复制起点等。此类载体的特定例子包括原核质粒，例如pBR、pUC或pcDNA质粒；病毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒或AAV载体；噬菌体；杆状病毒；BAC或YAC等，如下文将讨论的。合适的核酸序列可以通过各种操作插入载体内。一般而言，使用本领域已知的技术将DNA插入一个或多个合适的限制性核酸内切酶位点内。包含这些组分中的一种或多种的合适载体的构建采用本领域技术人员已知的标准连接技术。
本发明的一个进一步方面是重组宿主细胞，其中所述细胞包括如上文定义的核酸分子或载体。宿主细胞可以是原核或真核细胞。原核细胞的例子包括细菌，例如大肠杆菌(E.coli)。真核细胞的例子是酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞，包括任何原代细胞培养物或已建立的细胞系(例如，3T3，Véro，HEK293，TN5等)。用于表达糖基化蛋白质的合适宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞例如果蝇属(Drosophila)S2和斜纹夜蛾属(Spodoptera)Sf9，以及植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)和COS细胞。更具体的例子包括通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(对于在悬浮培养中生长亚克隆的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol，36：59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl，Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)。本发明的特别优选的哺乳动物细胞是CHO细胞。适合于表达本发明的抗体的进一步特别优选的哺乳动物细胞是鼠类细胞，例如小鼠骨髓瘤(NS0)细胞。
如本文上文公开的，本发明的抗体可以通过本领域本身已知的任何技术来产生，例如通过重组技术、化学合成、克隆、连接或其组合。在一个特定实施方案中，可溶受体通过重组技术来产生，例如通过在合适宿主细胞中表达相对应的核酸。本发明的另一个目的因此是产生本发明的抗体的方法，该方法包括在允许核酸分子表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞，并且回收所产生的多肽。本发明的生产方法可以进一步包括将多肽配制到药物组合物内的步骤。所产生的多肽可以是或不是糖基化的，或可以包含其他翻译后修饰，依赖于所使用的宿主细胞类型。许多书本和综述提供关于如何使用载体和原核或真核宿主细胞来克隆且产生重组蛋白质的教导，例如由Oxford UniversityPress出版的系列″A Practical Approach″中的某些书目(″DNACloning 2：Expression Systems″，1995；″DNA Cloning 4：MammalianSystems″，1996；″Protein Expression″，1999；″Protein PurificationTechniques″，2001)。
待在根据本发明的产生抗体的方法中使用的载体可以是附加体或非/同源整合载体，其可以通过任何合适方法(转化、转染、缀合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等)引入合适的宿主细胞内。在选择特定质粒、病毒或逆转录病毒载体中的重要因素包括：包含载体的受体细胞可以由不包含载体的那些受体细胞中识别且选择的容易性；在特定宿主中需要的载体拷贝数；以及是否希望能够使载体在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”。载体应允许在原核或真核宿主细胞中表达本发明的多肽或融合蛋白，在合适的转录起始/终止调节序列的控制下，其选择为在所述细胞中组成性活性或诱导的。随后可以分离在此类细胞中基本上富集的细胞系，以提供稳定细胞系。
宿主细胞用本文描述的表达或克隆载体转染或转化用于蛋白质产生，并且在适当修饰的常规营养培养基中培养，用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。培养条件例如培养基、温度、pH等可以通过技术人员进行选择，无需过度实验。一般而言，用于使细胞培养的生产力达到最大的原理、方案和实践技术可以在Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach，M.Butler，编辑(IRL Press，1991)和Sambrook等人，同上中发现。
对于真核宿主细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)，可以采用不同转录和翻译调节序列，依赖于宿主的性质。它们可以衍生自病毒来源，例如腺病毒、乳头状瘤病毒、猿猴病毒等，其中调节信号与具有高表达水平的特定基因结合。例子是疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选择允许阻遏和活化的转录起始调节信号，从而使得可以调节基因的表达。通过所引入的DNA稳定转化的细胞也可以通过引入一种或多种标记进行选择，所述标记允许选择包含表达载体的宿主细胞。标记还可以对营养缺陷宿主提供光营养、杀生物剂抗性，例如抗生素或重金属例如铜等。可选标记基因可以直接与待表达的DNA序列连接(例如在相同载体上)，或通过共转染引入相同细胞内。另外的元件也可能是本发明的蛋白质的最佳合成所需的。
合适的原核细胞包括用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌)。此类细胞一般产生包括N末端甲硫氨酸残基的蛋白质。待在本发明中使用的优选细胞是真核宿主细胞，例如哺乳动物细胞，例如人、猴、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为它们对蛋白质分子提供翻译后修饰，包括正确折叠或在正确位点处的糖基化。合适哺乳动物宿主细胞的例子包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21，BHK-570；ATCC CRL 8544，ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCCCCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44(Chasin等人，Som.Cell.Molec.Genet.12：555，1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝瘤细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)、Bowes黑素瘤和人肝细胞癌(例如Hep G2)、鼠类胚细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)和各种其他细胞系。备选真核宿主细胞是用酵母表达载体转化的酵母细胞(例如糖酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)等)。此外，酵母细胞可以执行翻译后肽修饰包括糖基化。存在利用强启动子序列和高拷贝数质粒的许多重组DNA策略，其可以用于在酵母中产生所需蛋白质。酵母细胞识别在经克隆的哺乳动物基因产物中的前导序列，并且分泌具有前导序列的多肽(即，前肽)。
对于重组多肽的长期、高得率生产，稳定表达是优选的。例如，稳定表达目的多肽的细胞系可以使用表达载体进行转化，所述表达载体可以在相同或分开载体上包含病毒复制起点和/或内源表达元件和可选标记基因。在载体引入后，在它们转换至选择培养基前，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天。可选标记的目的是赋予对于选择以抗性，并且它的存在允许成功表达所引入序列的细胞的生长和回收。稳定转化细胞的抗性克隆可以使用对细胞类型合适的组织培养技术进行增殖。随后可以分离在此类细胞中基本上富集的细胞系，以提供稳定细胞系。
本发明的重组多肽的高得率生产的特别优选方法是通过使用在DHFR缺陷CHO细胞中的二氢叶酸还原酶(DHFR)扩增，通过使用如US 4,889,803中描述的顺次增加水平的氨甲蝶呤。所获得的多肽可以是糖基化形式的。
本文公开的抗体还可以在其他真核细胞中表达，例如禽类、真菌、昆虫、酵母或植物细胞。杆状病毒系统提供将所克隆的基因引入昆虫细胞内的有效方法。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料是以试剂盒形式尤其从Invitrogen商购可得的。
除重组DNA技术外，本发明的抗体还可以通过化学合成技术进行制备。化学合成技术的例子是固相合成和液相合成。作为固相合成，例如，与待合成多肽的羧基末端相对应的氨基酸与支持物结合，所述支持物在有机溶剂中是不可溶的，并且通过反应的交替反复(例如，通过氨基酸与其由合适保护基团保护的氨基和侧链官能团的顺次缩合)，使多肽链延伸。固相合成方法在很大程度上通过tBoc方法和Fmoc方法分类，依赖于所使用的保护基团的类型。完全合成的蛋白质公开于文献(Brown A等人，1996)中。
本发明的抗体可以以其他备选形式产生、配制、施用或一般使用，所述其他备选形式根据所需使用和/或生产方法可以是优选的。本发明的蛋白质可以是例如通过糖基化翻译后修饰的。本发明的多肽或蛋白质可以以经分离的(或经纯化的)生物学活性形式提供，或作为其前体、衍生物和/或盐提供。
也可以产生有用的缀合物或复合物用于就药物递送效率而言改善试剂。为了这个目的，本文描述的抗体可以是具有分子例如聚乙二醇和其他天然或合成聚合物的活性缀合物或复合物形式(Harris JM和Chess RB，2003；Greenwald RB等人，2003；Pillai O和PanchagnulaR，2001)。在这点上，本发明考虑了如本文公开的化学修饰的抗体，其中抗体与聚合物连接。一般地，聚合物是水溶性的，从而使得缀合物在水环境例如生理环境中不沉淀。合适聚合物的例子是已修饰以具有单个反应基团的那种，例如用于酰化的活性酯，或用于烷基化的醛。以这种方式，可以控制聚合度。反应性醛的例子是其聚乙二醇丙醛、ormono-(C1-C10)烷氧基、或芳氧基衍生物(参见例如Harris，等人，美国专利号5,252,714)。聚合物可以是分支或未分支的。此外，聚合物的混合物可以用于产生缀合物。用于治疗的缀合物可以包括药学上可接受的水溶性聚合物部分。合适的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚(N-乙烯吡咯烷酮)PEG、tresyl单甲氧基PEG、PEG丙醛、双-琥珀酰亚胺碳酸酯PEG、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或其他基于碳水化合物的聚合物。合适的PEG可以具有约600至约60,000的分子量，例如5,000、12,000、20,000和25,000。缀合物还可以包括此类水溶性聚合物的混合物。
缀合物的例子包括本文上文公开的抗体中的任何和与所述可溶性受体的N末端附着的聚丙烯氧化物部分。PEG是一种合适的聚烷基氧化物。作为举例说明，本文公开的抗体中的任何可以用PEG进行修饰，称为“PEG化”的过程。PEG化可以通过本领域已知的任何PEG化反应来执行(参见例如，EP 0 154 316，Delgado等人，Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249(1992)，Duncan和Spreafico，Clin.Pharmacokinet.27：290(1994)，和Francis等人，Int J Hematol 68：1(1998))。例如，PEG化可以通过酰化反应或通过烷基化反应用反应性聚乙二醇分子来执行。在备选方法中，缀合物可以通过使活化的PEG缩合来形成，其中PEG的末端羟基或氨基已由活化接头替换(参见例如，Karasiewicz等人，美国专利号5,382,657)。优选地，所有这些修饰不显著影响抗体结合人IL-31的能力。
本文描述的抗体可以包括另外的N末端氨基酸残基，优选甲硫氨酸。事实上，依赖于表达系统和条件，可以在重组宿主细胞中表达具有起始甲硫氨酸的多肽。这个另外的氨基酸随后可以在所得到的重组蛋白质中维持，或借助于外肽酶例如甲硫氨酸氨肽酶消除，根据文献中公开的方法(Van Valkenburgh HA和Kahn RA，Methods Enzymol.(2002)344：186-93；Ben-Bassat A，Bioprocess Technol.(1991)12：147-59)。
如本文件的实施例部分中所示，小鼠抗人IL-31抗体可以在其可变结构域内包括潜在的糖基化位点。例如，克隆292.12.3.1在重链可变结构域的构架区FR1中具有糖基化位点。本发明的发明人目前已发现所述糖基化位点不是保持关于人IL-31的良好结合亲和力所需的。此外，取消这个糖基化位点(例如通过突变)对抗体的热稳定性具有正面作用。因此，在本发明的一个实施方案中，如本文所公开的抗体在其可变结构域中不具有糖基化位点。
通过本文描述的方法产生的IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以通过各种方法就中和进行测试。例如，可以使用如已公开的美国专利申请(参见公开号20030224487，Sprecher，Cindy等人，2003)中描述的萤光素酶测定法。此外，在配体和单克隆抗体的存在下，通过测量来自角化细胞培养物的促炎细胞因子例如TARC和MDC产生中的减少可以测试中和。中和还可以通过本文描述的体内和体外测定法进行测量。
TARC和MDC响应本文描述的人源化抗IL-31抗体和拮抗剂的减少可以如下在AD小鼠模型中进行测量：
方法Ⅰ)6周大的雄性NC/Nga小鼠(CRL Japan)用50μg尘螨提取物(D.pteronyssinus，Indoor Biotechnologies)在背部上进行皮内致敏，一周3次，并且就AD样损害进行评分。在致敏5周后，使小鼠安乐死，并且切下右耳，并且放置到补充有RPMI+2％FBS(GIBCO Invitrogen)的48孔培养皿(Corning)的单个孔内。将平板放置在5％CO2湿度控制温箱内。在24小时后收集上清液，并且冷冻至-20℃直至进一步分析。
方法Ⅱ)12周大的雌性NC/Nga小鼠(CRL Japan)用10μg SEB(Toxin Technology)在耳中和在背部上进行皮内致敏，一周3次。小鼠就AD样损害进行评分。在致敏5周后，使小鼠安乐死，并且从每只小鼠的所注射耳获得6mm活组织检查穿孔，并且放置到补充有RPMI+2％FBS的48孔培养皿的单个孔内。将平板放置在5％CO2湿度控制温箱内。在24小时后收集上清液，并且冷冻至-20℃直至进一步分析。
2个研究中的小鼠组用人源化IL-31抗原结合分子或人源化IL-31抗体或拮抗剂进行腹膜内处理，每周2次，在致敏1至2周后开始。通过常规ELISA(R&D Systems)测量在24小时上清液器样品中的TARC和MDC浓度。
在一个实施方案中，本发明的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键合的Fvs(sdFv)和包括VL或VH结构域的片段。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以包括单独地或与下述整体或部分组合的一个或多个可变区(即，SEQ ID NOs：25-45)：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。在本发明中还包括的是这样的抗原结合片段，其还包括一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。在另一个实施方案中，SEQ ID NO：s 25；27；29；30；31；35；36；38；39；40；41；42；43；44和45中的任何的重链可变区可以与SEQ ID NOs：26；28；32；33；34；和37中的任何的轻链可变区相组合。
在另一个实施方案中，本发明提供了与人IL-31结合的经分离的抗体或抗体片段，其包括人源化重链可变结构域和人源化轻链可变结构域，其中人源化重链可变结构域和人源化轻链可变结构域选自：a)包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；b)包括SEQID NO：27的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ IDNO：26的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；c)包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；d)包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；e)包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；f)包括SEQ ID NO：30的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；g)包括SEQ ID NO：31的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；h)包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；i)包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；j)包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；k)包括SEQID NO：35的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ IDNO：26的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；l)包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：32的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；m)包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：33的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；n)包括SEQ ID NO：27的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：34的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；o)包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；p)包括SEQ ID NO：25的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；q)包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；r)包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；s)包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；t)包括SEQID NO：41的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ IDNO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；u)包括SEQ ID NO：42的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；v)包括SEQ ID NO：43的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；w)包括SEQ ID NO：44的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；x)包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；y)包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；和z)包括SEQ ID NO：45的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供了与人IL-31结合的经分离的抗体或抗体片段，其包括人源化重链可变结构域和人源化轻链可变结构域，其中人源化重链可变结构域和人源化轻链可变结构域选自：a)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；b)与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ IDNO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；c)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；d)与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；e)与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；f)与SEQ IDNO：30的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；g)与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；h)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；i)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ IDNO：33的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；j)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；k)与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；l)与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；m)与SEQID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；n)与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；o)与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；p)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和包括SEQID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；q)包括SEQ IDNO：38的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；r)包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；s)与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ IDNO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；t)与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；u)与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；v)与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；w)与SEQID NO：44的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；x)与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；y)与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；和z)与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域。
在一个方面，本发明提供了选自下述的经分离的抗体：a)包括由氨基酸序列SEQ ID NO：46组成的轻链和由氨基酸序列SEQ ID NO：47组成的重链的抗体；b)包括由氨基酸序列SEQ ID NO：48组成的轻链和由氨基酸序列SEQ ID NO：49组成的重链的抗体；和c)包括由氨基酸序列SEQID NO：50组成的轻链和由氨基酸序列SEQ IDNO：51组成的重链的抗体。
本发明还包括重组人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂，其在功能上等价于上文描述的那些。还包括的是提供改良稳定性和/或治疗效果的经修饰的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂。经修饰的抗体的例子包括具有氨基酸残基的保守置换，以及氨基酸的一个或多个缺失或添加的那些，其不会显著不利地改变抗原结合效用。置换可以从改变或修饰一个或多个氨基酸残基到完全重新设计区域，只要维持治疗效用。本发明的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以进行翻译后修饰(例如，乙酰化和磷酸化)，或可以进行合成修饰(例如，标记基团的附着)。应当理解通过本方法设计的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以具有另外的保守氨基酸置换，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上无作用。
本发明的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂包括经修饰的衍生物，例如但不限于，衍生物包括已例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白酶解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接等进行修饰的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂。众多化学修饰中的任何可以通过已知技术来进行，包括但不限于特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以包含一个或多个非常规氨基酸。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂包括小鼠供体免疫球蛋白的CDRs以及人受体免疫球蛋白的重链和轻链构架。制造人源化抗体的方法公开于美国专利号5,301,101；5,585,089；5,693,762；和6,180,370(其各自通过引用整体合并)中。这些抗体的CDRs随后可以移植给本领域已知的任何选择的人构架，以产生所需人源化抗体。
本发明还提供了人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂，其竞争性抑制本文描述的单克隆抗体与人IL-31的结合。竞争抑制可以通过本领域已知的任何方法进行测定，例如使用本文描述的竞争结合测定法。在优选实施方案中，抗体竞争性抑制本发明的单克隆抗体与多肽的结合以至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
本发明还提供了人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂，其竞争性抑制抗体与本发明的表位的结合，如通过本领域已知用于测定竞争结合的任何方法测定的，例如，本文描述的免疫测定法。在优选实施方案中，抗体竞争性抑制与表位的结合以至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的体内半衰期可以通过修饰(例如置换、缺失或添加)氨基酸残基得到增加，所述氨基酸残基鉴定为涉及Fc结构域和FcRn受体之间的相互作用(参见例如，国际公开号WO 97/34631和WO 02/060919，其通过引用整体合并入本文)，或通过附着聚合物分子例如高分子量聚乙二醇(PEG)得到增加。可以用或不用多功能接头通过PEG与所述抗体或抗体片段的N或C末端的位点特异性缀合或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基来附着PEG。将使用导致生物活性的最低限度丧失的线性或分支聚合物衍生化。缀合程度将通过SDS-PAGE和质谱法紧密监控，以确保PEG分子与抗体的适当缀合。未反应的PEG可以通过例如尺寸排阻或离子交换层析与抗体-PEG缀合物分开。
本发明包括通过其使得人源化免疫球蛋白链的构架中有限数目的氨基酸选择为与供体而不是受体中的那些位置处的氨基酸相同的标准，以便增加包括人源化免疫球蛋白链的抗体的亲和力。
除本文特别描述的人源化免疫球蛋白外，利用本领域技术人员众所周知的各种重组DNA技术，可以容易地设计且制造其他与天然序列“基本上同源的”经修饰的免疫球蛋白。各种不同人构架区可以单独或组合使用，作为用于本发明的人源化免疫球蛋白的基础。一般而言，基因的修饰可以通过各种众所周知的技术容易地完成，例如定点诱变(参见，Gillman和Smith，Gene，8，81-97(1979)和S.Roberts等人，Nature，328，731-734(1987)，这两者都通过引用合并入本文)。
本发明的人源化抗体包括片段以及完整抗体。一般地，这些片段与它们由其衍生的完整抗体竞争抗原结合。片段一般以至少107M.-1、并且更一般地108M.-1或109M.-1的亲和力结合(即在与完整抗体相同的范围内)。人源化抗体片段包括分开的重链、轻链Fab、Fab′F(ab′)2和Fv。片段通过重组DNA技术来产生，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离来产生。
关于人源化抗体中的细节，参见欧洲专利号EP 239,400、EP592,106和EP 519,596；国际公开号WO 91/09967和WO 93/17105；美国专利号5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886和6,407,213；和Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489 498；Studnicka等人，1994，Protein Engineering 7(6)：805 814；Roguska等人，1994，PNAS 91：969 973；Tan等人，2002，J.Immunol.169：1119 25；Caldas等人，2000，Protein Eng.13：353 60；Morea等人，2000，Methods 20：267 79；Baca等人，1997，J.Biol.Chem.272：10678 84；Roguska等人，1996，Protein Eng.9：895 904；Couto等人，1995，Cancer Res.55(23Supp)：5973s 5977s；Couto等人，1995，Cancer Res.55：1717 22；Sandhu，1994，Gene 150：409 10；Pedersen等人，1994，J.Mol.Biol.235：959 73；Jones等人，1986，Nature 321：522-525；Reichmann等人，1988，Nature 332：323-329；和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
已开发各种技术用于产生抗体片段。这些片段可以经由完整抗体的蛋白酶解消化而衍生(参见例如，Morimoto等人，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等人，Science，229：81(1985))，或通过重组宿主细胞直接产生。例如，抗体片段可以从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离。备选地，Fab′-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收，并且化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab′)2片段可以直接从重组宿主细胞培养中分离。用于产生抗体片段的其他技术对于技术人员将是显而易见的。此外，可以用于产生单链Fvs和抗体的技术的例子包括美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 90：7995-7999(1993)；和Skerra等人，Science240：1038-1040(1988)中描述的那些。
本发明包括与本发明的多肽(或其部分，优选多肽的至少10、20或50个氨基酸)重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)的抗体，以产生融合蛋白。因此，本发明还涉及包括与细胞毒素剂缀合的本文描述的抗体的免疫缀合物，所述细胞毒素剂例如化学治疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)。
本发明进一步包括包含与异源多肽序列(例如除可变区外的抗体结构域)融合或缀合的本发明的多肽(即包括免疫原性或抗原表位的那些)的组合物。例如，本发明的多肽可以与抗体Fc区或其部分融合或缀合。例如，本发明的多肽(包括其片段或变体)可以与免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定结构域或其部分(CH1、CH2、CH3或其任何组合及其部分融合，产生嵌合多肽。与本发明的多肽融合的抗体部分可以包括恒定区、铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域或完整结构域或其部分的任何组合。多肽还可以与上述抗体部分融合或缀合以形成多聚体。例如，与本发明的多肽融合的Fc部分可以通过Fc部分之间的二硫键合形成二聚体。更高级的多聚形式可以通过使多肽与IgA和IgM的部分融合而制备。用于使本发明的多肽与抗体部分融合或缀合的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；PCT公开WO 96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Zheng等人，J.Immunol.154：5590-5600(1995)；和Vil等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341(1992)(所述参考文献通过引用整体合并)。作为另一个非限制性例子，本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)可以与白蛋白(包括但不限于重组人血清白蛋白或其片段或变体(参见例如，于1999年3月2日颁发的美国专利号5,876,969，EP专利0 413 622和于1998年6月16日颁发的美国专利号5,766,883，通过引用整体合并入本文))融合。本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)可以与异源蛋白质(例如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N或C末端融合。编码本发明的融合蛋白的多核苷酸也由本发明包括。
如上文讨论的，本发明的多肽可以与上述抗体部分融合或缀合，以增加多肽的体内半衰期或用于在免疫测定法中使用，使用本领域已知的方法。此外，本发明的多肽可以与上述抗体部分融合或缀合，以促进纯化。一个报告的例子描述了由人CD4-多肽的前2个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链的恒定区的各个结构域组成的嵌合蛋白质(参见例如，EP 394,827；Traunecker等人，Nature 331：84-86(1988))。已对于与FcRn结合配偶体例如IgG或Fc片段缀合的抗原(例如胰岛素)证实抗原跨越上皮屏障至免疫系统的增强递送(参见例如，PCT公开WO 96/22024和WO 99/04813)。与具有二硫键合二聚结构(由于IgG)的抗体融合或缀合的本发明的多肽也可以在结合且中和其他分子中比单独的单体分泌蛋白质或蛋白质片段更有效。(Fountoulakis等人，J.Biochem.270：3958-3964(1995))。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中是有利的，并且因此可以导致例如改良的药代动力学性质。(EP A 232,262)。备选地，在融合蛋白已表达、检测且纯化后缺失Fc部分将是需要的。例如，如果融合蛋白用作抗原用于免疫接种，那么Fc部分可能阻碍治疗和诊断。在药物开发中，例如，人蛋白质例如hIL-5已与Fc部分融合用于高流通量筛选测定法的目的，以鉴定hIL-5的拮抗剂。(参见，D.Bennett等人，J.Molecular Recognition 8：52-58(1995)；K.Johanson等人，J.Biol.Chem.270：9459-9471(1995)0。此类技术还包括但不限于，双功能缀合试剂的使用(参见例如，美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003；其各自的内容在此通过引用整体合并)。
此外，本发明的多肽(例如，抗体或其片段)可以与标记序列例如肽融合，以促进其纯化。在一个进一步的实施方案中，编码本发明的多肽的核酸(包括但不限于编码免疫原性和/或抗原性表位的核酸)也可以与作为表位标签(例如血凝素标签(“HA”)或flag标签)的目的基因重组，以帮助检测和纯化所表达多肽。在优选实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，尤其例如在pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif，91311)中提供的标签，其中许多是商购可得的。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824(1989)中描述的，例如，六组氨酸提供融合蛋白的方便纯化。对于纯化有用的其他肽标签包括但不限于与衍生自流感血凝素蛋白质的表位(Wilson等人，Cell 37：767(1984))相对应的“HA”标签和“flag”标签。
本发明进一步包括与诊断或治疗剂缀合的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂。IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以在诊断上使用，例如以监控瘙痒疾病的发展或进展，作为临床测试操作的部分，以例如测定给定治疗、诊断、检测和/或预防方案的功效。检测可以通过使抗体与可检测物质偶联得到促进。可检测物质的例子包括各种酶、辅基(prosthetic group)、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层摄影的正电子发射金属、和非放射性顺磁金属离子。关于可以与抗体缀合用于用作根据本发明的诊断的金属离子，参见例如美国专利号4,741,900。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母素；并且合适放射性材料的例子包括125I、131I、111In或99Tc。
此外，人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以与治疗部分缀合，所述治疗部分例如细胞毒素例如细胞生长抑制剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子。细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害的任何试剂。例子包括紫杉醇(paclitaxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢药(例如氨甲蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、噻替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前地道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(以前地放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂药(例如长春新碱和长春碱)。
本发明的缀合物可以用于修饰给定生物应答，治疗剂或药物部分不被构建为限制于常规化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织型纤溶酶原激活物、血栓形成试剂或抗血管生成试剂例如血管他丁或内皮他丁；或生物应答调节剂例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂还可以附着至固体支持物，所述固体载体对于免疫测定法或靶抗原的纯化特别有用。此类固体载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
用于使此类治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的，参见例如，Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等人(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：BiologicalAnd Clinical Applications，Pinchera等人(编辑)，第475-506页(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，inMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
备选地，人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以与第二种抗体缀合，以形成抗体异缀合物(heteroconjugate)，如通过Segal在美国专利号4,676,980中描述的。
具有或不具有与之缀合的治疗部分的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂，单独或与一种或多种细胞毒性因子和/或一种或多种细胞因子组合施用可以用作治疗。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以用于对表达IL-31的细胞加标签；用于通过亲和纯化分离IL-31；用于诊断测定法用于测定IL-31多肽的循环水平；用于检测或定量作为潜在病理状态或疾病的标记的可溶性IL-31；用于采用FACS的分析方法中；用于筛选表达文库；用于产生抗独特型抗体；并且用作中和抗体或用作拮抗剂以在体外和体内阻断IL-31活性。合适的直接标签或标志包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等；间接标签或标志可以以生物素-抗生物素蛋白或其他互补/抗互补对用作中间产物为特征。本文抗体还可以与药物、毒素、放射性核素等直接或间接缀合，并且这些缀合物用于体内诊断或治疗应用。此外，针对IL-31的抗体或其片段可以在体外用于在测定法中检测变性IL-31或其片段，例如Western印迹或本领域已知的其他测定法。
合适的检测分子可以与多肽或抗体直接或间接附着，并且包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等。合适的细胞毒性分子可以与多肽或抗体直接或间接附着，并且包括细菌或植物毒素(例如，白喉毒素、皂苷(saporin)、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、蓖麻蛋白、相思豆毒蛋白等)，以及治疗放射性核素例如碘-131、铼-188或钇-90(与多肽或抗体直接附着，或通过例如螯合部分的方式间接附着)。多肽或抗体还可以与细胞毒素类药物例如阿霉素缀合。对于可检测或细胞毒性分子的间接附着，可检测或细胞毒性分子可以与互补/抗互补对的成员缀合，其中其他成员与多肽或抗体部分结合。为了这些目的，生物素/链霉亲和素是示例性互补/抗互补对。
本发明的IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以就其抑制、阻断或中和IL-31配体的能力进行测量，如通过本领域已知和本文描述的各种体内模型测定的，包括但不限于NC/Nga模型、Ova表皮模型、慢性过敏反应模型和慢性半抗原模型。
皮肤归巢(skin-homing)T细胞和表皮角化细胞都牵涉于人的皮肤疾病的病理学中。IL-31 mRNA和蛋白质表达限制于人的皮肤归巢CLA+T细胞群体。参见于2006年2月14日提交的美国专利申请号11/353,427(美国专利公开号2006-0188499)和于2006年2月14日提交的美国专利申请号11/353,454(美国专利公开号2006-0188500)，这两个专利都通过引用合并入本文。像这样，针对IL-31的拮抗剂包括抗体或受体拮抗剂在治疗具有CLA+T细胞的表达的皮肤和表皮疾病中将是有用的。此类疾病包括例如特应性皮炎、接触性皮炎、药物造成的变态反应、皮肤向性病毒(skin-tropic virus)和病毒相关的瘙痒、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃、红斑痤疮、寻常痤疮、结节性痒疹和大疱性类天疱疮。趋化因子标记例如TARC和MDC用于测量中和单克隆抗体对IL-31的的作用。用本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂处理的抑制作用可以通过监控TARC和MDC的水平进行测量。
接触性皮炎
变应性接触性皮炎定义为针对与皮肤接触的抗原的T细胞介导的免疫反应。CLA+T细胞群体被认为涉及皮炎的起始，因为变应原依赖性T细胞应答在很大程度上局限于细胞的CLA+群体(参见Santamaria-Babi，L.F.，等人，J Exp Med：181 1935，(1995))。近期数据已发现仅记忆(CD45RO+)CD4+CLA+而不是CD8+T细胞响应镍(常见的接触超敏反应变应原)而增殖且产生1型(IFN-)和2型(IL-5)细胞因子。此外，表达与CD4、CD45RO(记忆)或CD69组合的CLA的细胞在镍特异性刺激后增加，并且表达趋化因子受体CXCR3、CCR4、CCR10而不是CCR6。参见Moed H.，等人，Br J Dermatol：51，32，(2004)。
在动物模型中，已证实变应性接触性皮炎是T细胞依赖性的，并且变应性应答性T细胞迁移至变应原应用的位点。一般参见：EngemanT.M.，等人，J Immunol：164，5207，(2000)；Ferguson T.A.&KupperT.S.J Immunol：150，1172，(1993)；和Gorbachev A.V.&FairchildR.L.Crit Rev Immunol：21，451(2001)。因为CLA+T细胞产生IL-31，并且皮肤角化细胞的IL-31刺激可以诱导促炎趋化因子例如TARC和MDC，所以IL-31可能涉及接触性皮炎的病理生理学。通过在接触性超敏反应的小鼠模型中使用中和IL-31抗体。
因此，通过抑制、减少、中和、阻止或阻断与疾病相关的炎症和/或搔抓，通过本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可以用于改善接触性超敏反应的临床结果。
特应性皮炎
特应性皮炎(AD)是慢性复发性炎症皮肤疾病，在过去十年中具有急剧增加的发病率。临床AD的特征在于显示慢性复发过程的高度瘙痒通常表皮脱落的斑和丘疹。AD的诊断主要基于主要和次要临床发现。参见Hanifin J.M.，Arch Dermatol：135，1551(1999)。组织病理学揭示急性损害中的海绵层水肿、高度和局部角化不全，而具有高度和角化不全的明显表皮增生、棘皮症/颗粒层增厚以及真皮由淋巴细胞和丰富肥大细胞的血管周围浸润是慢性损害的标志。
T细胞在组织中的局部免疫应答起始中起关键作用，并且证据暗示特别地皮肤浸润T细胞可能在皮肤中的失调免疫应答的起始和维持中起关键作用。皮肤炎症位点中约90％的浸润T细胞表达皮肤淋巴细胞相关的Ag(CLA+)，其结合在内皮上的可诱导粘附分子E-选择素(在Santamaria-Babi L.F.，等人，Eur J Dermatol：14，13，(2004)中综述)。已证实与对照个体相比较，在AD患者中循环CLA+T细胞中的显著增加(参见Teraki Y.，等人，Br J Dermatol：143，373(2000)，而其他人已证实与CLA-群体相比较，来自AD患者的记忆CLA+T细胞优先响应变应原浸出物(参见Santamaria-Babi，L.F.，等人，J Exp Med：181，1935，(1995))。在人中，皮肤的变应性病症的发病机理已与CLA+T细胞中的增加相关，所述CLA+T细胞表达增加水平的Th2类型细胞因子如IL-5和IL-13、9、10。参见AkdisM.，等人，Eur J Immunol：30，3533(2000)；和Hamid Q.，等人，JAllergy Clin Immunol：98，225(1996)。
当在约6-8周大时在非无特定病原体(非SPF)条件下饲养时，NC/Nga小鼠自发地发展AD样损害，这在许多方面类似人AD，包括临床过程和体征、组织病理学和免疫病理学。相比之下，维持在SPF条件下的NC/Nga小鼠不发展皮肤损害。然而，通过每周皮内注射粗制尘螨抗原，自发性皮肤损害和搔抓行为的发作可以在SPF实验室中饲养的NC/Nga小鼠中同步。参见Matsuoka H.，等人，Allergy：58，139(2003)。因此，在NC/Nga中AD的发展是用于评估用于治疗AD的新治疗的有用模型。
除自发性AD的NC/Nga模型外，使用OVA的小鼠表皮致敏也可以用作模型，以诱导抗原依赖性表皮和真皮增厚，具有在致敏小鼠的皮肤中的单核浸润。这通常与总的特异性IgE的血清水平升高相一致，然而，在这个模型中通常不发生皮肤屏障功能障碍或瘙痒。参见Spergel J.M.，等人，J Clin Invest，101：1614，(1998)。这个方案可以通过用OVA致敏DO11.10 OVA TCR转基因小鼠进行修饰，以便诱导皮肤屏障失调和瘙痒。增加可以识别致敏性抗原的抗原特异性T细胞数目可以增加皮肤中的炎症水平，以诱导可见的搔抓行为和皮肤的苔藓化/脱皮。
NC/Nga自发性AD模型和OVA表皮DO11.10模型都用于评估本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂抑制、减少或中和IL-31的作用的能力。人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的施用可以导致搔抓中的减少，这可以在治疗瘙痒疾病中有效，所述瘙痒疾病包括但不限于特应性皮炎、结节性痒疹和湿疹，因为搔抓的停止将终止皮炎的进展，所述皮炎的发展依赖于搔抓。
测量本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的抑制作用的另外模型由Umeuchi，H.等人，European Journal ofPharmacology，518：133-139，2005；并且由Yoo，J.等人，J.Experimental Medicine，202：541-549，2005描述。
因此，通过抑制、减少、阻止或阻断与疾病相关的炎症和/或搔抓，通过本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可以用于改善皮炎和瘙痒疾病包括特应性皮炎、结节性瘙痒和湿疹的临床结果。
测量人源化抗IL-31抗体和拮抗剂抑制、减少或中和发痒应答的方法包括下述测定法和模型：
Ⅰ)经IL-31处理的小鼠的辣椒碱处理
在将溶于盐水的10％乙醇+10％Tween-80中的0.25ml 4mg/ml辣椒辣素溶液皮下注射到颈背内之前，10周大的BALB/c动物(CRL)进行麻醉，并且用长效镇痛剂盐酸丁丙诺啡(bupranorphinehydrochloride)以0.1mg/kg皮下注射。在尿毒素处理后使动物保持麻醉至少30分钟。48小时后，皮下植入14天渗透泵用于持续递送20ug/天IL-31，共14天。小鼠每天就脱发和瘙痒进行监控，共6天，使用下述标准：0＝无搔抓，动物看起来正常，1＝小区域中的被毛变薄，注意到搔抓，2＝较少的脱发(小斑)，搔抓，3＝中等脱发，搔抓，和4＝严重脱发，过度搔抓。
通过人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和、抑制或减少IL-31可以减少患有涉及发痒的皮肤病症的患者中发痒且因此皮炎的发生和强度。
Ⅱ)Tacl基因表达
对于Tacl基因纯合无效的小鼠不表达可检测P物质或神经激肽A。这些小鼠具有针对中等至强烈刺激显著减少的伤害性疼痛应答，并且因此是用于研究速激肽对疼痛/发痒处理和炎性疾病状态的贡献的有用工具。12周大的、Tacl敲除小鼠被植入递送1ug/天IL-31蛋白质的14天渗透泵，并且每天就脱发和瘙痒进行观察，使用下述标准：0＝无搔抓，动物看起来正常，1＝小区域中的被毛变薄，注意到搔抓，2＝较少的脱发(小斑)，搔抓，3＝中等脱发，搔抓，和4＝严重脱发，过度搔抓。
这个研究的结果显示与野生型对照小鼠相比较，Tacl缺陷小鼠对IL-31诱导的瘙痒/脱发更不敏感。尽管100％(10/10)的野生型小鼠到IL-31处理第6天时已发展搔抓和脱发的证据，但仅33.3％(2/6)的Tacl缺陷小鼠在相同时间点时显示搔抓和脱发的体征。因此，通过人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和、抑制或减少IL-31可以减少在皮炎背景中搔抓的发生和强度。
Ⅲ)IL-31中和抗体的施用
约8至12周大的正常雌性BALB/c小鼠(CRL)可以皮下植入递送1ug/天mIL-31的14天渗透泵(Alzet，#2002)。小鼠组接受大鼠抗小鼠IL-31单克隆抗体10mg/kg(200ug/小鼠)的腹膜内(i.p.)注射，每周2次，在IL-31递送前1周开始。对照小鼠组接受用相同给药方案的媒介物(PBS/0.1％BSA)的i.p.注射。小鼠每天就脱发和瘙痒进行评分，使用下述标准：0＝无搔抓，动物看起来正常，1＝小区域中的被毛变薄，注意到搔抓，2＝较少的脱发(小斑)，搔抓，3＝中等脱发，搔抓，和4＝严重脱发，过度搔抓。
因此，通过IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的中和、减少或抑制IL-31可以延迟由IL-31诱导的搔抓/脱发应答的发作。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的作用通过抑制搔抓、发痒、皮炎、角化细胞中的IL-31RA表达的减少、和/或关于脱发和瘙痒的得分中的减少进行测量。
药物诱导的迟发型皮肤变态反应
药物诱导的迟发型皮肤变态反应是非常异质的，并且可以反映许多不同的病理生理学事件。参见Brockow K.，等人，Allergy：57，45(2002)。涉及这些反应的免疫学机制已显示为抗体或细胞介导的。在直接药物变态反应中，IgE介导的抗体反应可以通过在20分钟后的阳性皮肤穿刺和/或皮内测试得到证实，而针对药物的非直接反应可以在最后一次药物摄取后超过1小时发生，并且通常是T细胞介导的。非直接的T细胞介导的迟发型反应可以在具有例如针对青霉素的不利药物反应的患者中发生。针对青霉素的增殖性T细胞应答已显示限制于来自青霉素过敏患者的T细胞的记忆(CD45RO+)CLA+亚群，而CD45RO+CLA-子集不显示增殖性应答。参见Blanca M.，Leyva L.，等人，Blood Cells Mol Dis：31，75(2003)。迟发型超敏(DTH)反应可以在小鼠中人工再现，允许评估可能涉及DTH应答的起始和永存的因子。人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂在限制、减少、抑制迟发型超敏反应中可以是有效的。
中毒性表皮坏死松解症(TEN)是非常罕见但极端严重的药物反应，特征在于广泛分布的表皮凋亡伴随广泛的水泡。研究已显示浸润水泡的淋巴细胞是CLA+T细胞，并且可以显示针对表皮角化细胞的细胞毒性。参见Leyva L.，等人，.J Allergy Clin Immunol：105，157(2000)；和Nassif A.，Bensussan A.，等人，J Allergy Clin Immunol：114，1209 2004)。已产生由此在小鼠的表皮和毛发毛囊角化细胞中在角蛋白-5(K5)启动子的控制下表达OVA的转基因小鼠系统，以建立关于TEN的动物模型。当过继转移到K5-OVA小鼠内时，OVA特异性CD8+T细胞在皮肤-引流淋巴结中经历活化和增殖，并且靶向K5-OVA小鼠的皮肤，导致暗示TEN的皮肤损害的发展。参见Azukizawa H.，等人，Eur J Immunol：33，1879(2003)。
因此，通过抑制、减少、阻止或阻断与疾病相关的炎症和/或搔抓，通过本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可以用于改善TEN的临床结果。
大疱性类天疱疮
大疱性类天疱疮是表皮下病症，其表现为表皮下水泡伴随嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的真皮浸润。诊断的特征在于针对表皮和真皮-表皮交界部的特异性粘附蛋白质的抗原特异性抗体的存在。参见Jordon R.E.，等人，JAMA：200，751(1967)。通过分析PBL和皮肤水泡T细胞来分析T细胞在大疱性类天疱疮的发病机理中的作用的研究已发现表达增加水平的Th2细胞因子如IL-4和IL-13的CLA+T细胞的优势。参见Teraki Y.，等人，J Invest Dermatol：117，1097(2001)。在用全身性皮质类固醇治疗后的大疱性类天疱疮患者中，CLA+而不是CLA-，白介素-13生产细胞的频率显著减少。在皮质类固醇处理后CLA+细胞中的减少与临床改善相关。参见Teraki，同上。
因此，通过抑制、减少、阻止或阻断与疾病相关的炎症和/或搔抓，通过本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可以用于改善大疱性类天疱疮的临床结果。
斑秃
斑秃(AA)被视为毛囊的组织局限性自身免疫疾病，其中由于淋巴细胞性浸润的持续活性，毛囊活性停止。AA导致在身体上任何地方的完全脱发的斑，尽管不发生毛囊的实际丧失，即使在无毛损害中。尽管不存在炎症的临床体征，但来自活跃疾病位点的皮肤活组织检查显示主要是CD4+细胞的毛囊周围淋巴细胞炎症，连同CD8+毛囊内浸润。参见Kalish R.S.&Gilhar A.J Investig Dermatol Symp Proc：8，164(2003)。
研究已显示头皮皮肤浸润CD4+或CD8+淋巴细胞表达CLA，并且在具有AA的个体的外周血中，CLA+CD4+或CD8+淋巴细胞的百分比显著高于正常对照的那种。此外，与从疾病恢复的患者相比较，具有严重或进行性AA的患者显示高得多的CLA阳性，并且CLA+细胞百分比中的减少与良好的临床过程平行。参见Yano S.，等人，Acta Derm Venereol：82，82(2002)。这些研究因此暗示CLA+淋巴细胞可能在AA中起重要作用。异种移植物模型已证实活化的T细胞很可能在AA的发病机理中起作用。移植到裸鼠上的来自AA患者的损害头皮再生长毛发，与来自移植物的浸润淋巴细胞丧失一致，并且将活化的损害T细胞转移给SCID小鼠可以将脱发转移给在SCID小鼠上的人头皮外植决。参见Kalish R.S.&Gilhar A.J InvestigDermatol Symp Proc：8，164(2003)。
各种免疫调节治疗是用于这种病症的通常治疗的部分，然而，这些治疗无一在其功效中一致。参见Tang L.，等人，J Invest Dermatol：120，400(2003)；Tang L.，等人，(2004)；和Tang L.，等人，J AmAcad Dermatol：49，1013(2003)。然而，它们在有效动物模型中的使用提供了剖析疗效的分子机制的工具。参见Shapiro J.，等人，JInvestig Dermatol Symp Proc：4，239(1999)；Tang L.，等人，Oldwine in new bottles：reviving old therapies for alopecia areata usingrodent models(2003)；和Verma D.D.，等人，Eur J Dermatol：14，332(2004)。
因此，通过抑制、减少、阻止或阻断与疾病相关的炎症和/或搔抓，通过本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可以用于改善斑秃的临床结果。
红斑痤疮/寻常痤疮
寻常痤疮，毛囊皮脂腺器的病症，是最常见的青春期皮肤问题。毛囊角化中的异常被认为产生粉刺损害。红斑痤疮与寻常痤疮的不同之处在于红色丘疹、脓疱、囊肿和广泛毛细管扩张的存在，但黑头粉刺(白头)的不存在。来自皮脂腺的皮脂分泌增加是寻常痤疮的病理生理学中的主要因素。其他皮脂腺功能也与粉刺的发展相关，包括皮脂促炎脂质；局部产生的不同细胞因子；腺周肽和神经肽，例如由皮质细胞产生的促肾上腺皮质激素释放激素；和在粉刺患者的健康外观腺体附近的神经末梢中表达的P物质。参见Zouboulis CC.ClinDermatol：22，360(2004)。
尽管寻常痤疮和红斑痤疮的病理生理学仍是未知的，但临床观察和组织病理学研究暗示毛皮脂腺囊的炎症可能对于红斑和寻常痤疮的发病机理是关键的。关于浸润红斑损害的T细胞子集分析的早期研究指出大多数T细胞表达CD4。参见Rufli T.&Buchner S.A.Dermatologica：169，1(1984)。
CD4+T细胞产生IL-31，并且皮肤关于IL-31表达的IHC分析暗示IL-31在皮脂和汗腺中表达。表皮角化细胞的IL-31刺激诱导趋化因子的表达，所述趋化因子很可能导致细胞浸润，暗示IL-31可能促进皮肤中的促炎应答。参见Dillon S.R.，等人，Nat Immunol：5，752(2004)。IL-31因此可能促进红斑痤疮和寻常痤疮的病理生理学。
因此，通过抑制、减少、阻止或阻断与疾病相关的炎症和/或搔抓，通过本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可以用于改善寻常痤疮的临床结果。
结节性痒疹
结节性痒疹是通过难以治疗的顽固性瘙痒引起的苔藓化或表皮脱落结节的出疹。尽管慢性摩擦导致苔藓化，以及线性抓痕中的搔抓，在其发痒、受刺激皮肤上的挑和挖的个体趋于产生明显增厚的丘疹，称为痒疹结节。尽管结节性痒疹对特应性皮炎不是特异的，但具有这些结节的许多患者也具有特应性反应，这表现为变应性鼻炎、哮喘或食物变态反应。T细胞代表在痒疹损害中的大多数浸润细胞，并且这些损害通常代表特应性患者中的大多数瘙痒皮肤损害。
用辣椒辣素(通过耗尽小感觉皮肤神经中的神经肽如P物质来干扰瘙痒和疼痛感觉的止痒生物碱)局部处理结节性痒疹，已证明是有效且安全的方案，导致皮肤损害的清除。参见Stander S.，等人，J AmAcad Dermatol：44，471(2001)。使用辣椒辣素处理在NC/Nga小鼠中的发痒应答的研究显示皮肤损害的自发性发展几乎完全得到阻止。此外，血清IgE水平的升高得到显著阻遏，并且在辣椒辣素处理的小鼠的损害皮肤中的浸润嗜酸性粒细胞和肥大细胞数目减少。参见Mihara K.，等人，Br J Dermatol：151，335(2004)。来自这个团体的观察暗示搔抓行为可能通过增强各种免疫应答促进皮炎的发展，因此暗示发痒感觉和/或发痒相关搔抓行为的阻止可能是用于AD的有效治疗。参见Mihara K.，等人，Br J Dermatol：151，335(2004)。因此，本文描述的人源化抗IL-31抗体在使AD、结节性痒疹和其他瘙痒疾病的作用降到最低中将是有用的，因为它们在本文中显示减少在NC/Nga小鼠中的搔抓量。
IL-31的慢性递送在小鼠中诱导瘙痒和脱发，随后为类似皮炎的皮肤损害发展，暗示IL-31可以诱导发痒。参见See Dillon S.R.，等人，Nat Immunol：5，752(2004)。IL-31在发痒应答诱导中的牵涉可以例如通过2种方法进行测量：(i)经IL-31处理的小鼠的辣椒辣素处理；和(ii)Tacl敲除小鼠的IL-31处理，其具有显著减少的伤害性疼痛应答，因为缺乏神经肽的表达。此外，可以在这些模型中测试用人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和经IL-31处理的小鼠中的IL-31是否可以阻止瘙痒和脱发。
因此，通过抑制、减少、阻止或阻断与疾病相关的炎症和/或搔抓，通过本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可以用于改善结节性痒疹的临床结果。
皮肤向性病毒和病毒相关的瘙痒
在外周血中的单纯疱疹病毒(HSV)特异性CD8+T细胞和从疱疹损害中回收的HSV特异性CD8+T细胞表达高水平的CLA，而非皮肤向性疱疹病毒特异性CD8+T缺乏CLA表达。参见Koelle D.M.，等人，J Clin Invest：110，537(2002)。HSV-2反应性CD4+T淋巴细胞也表达CLA，但水平低于先前对于CD8+T淋巴细胞观察到的那些。参见Gonzalez J.C，等人，J Infect Dis：191，243(2005)。瘙痒也与疱疹病毒感染相关(参见Hung K.Y.，等人，Blood Purif：16，147(1998)，尽管其他病毒疾病如HIV，也已与瘙痒皮肤损害相关。通常与红斑丘疹(erythematopapular)皮肤损害和嗜酸性粒细胞增多症相关的严重的顽固性瘙痒，是在某些非变应性、HIV感染患者36中观察到的病状。参见Singh F.&Rudikoff D，Am J Clin Dermatol；4，177(2003)；和Milazzo F.，Piconi S.，等人，Allergy：54，266(1999)。
皮肤向性病毒与瘙痒和CLA+T细胞的关联暗示产生IL-31的T细胞可能涉及病毒感染的病理生理学。
因此，通过抑制、减少、阻止或阻断与疾病相关的炎症和/或搔抓，通过本文描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可以用于改善与皮肤向性病毒相关的瘙痒的临床结果。
此外，炎症是通过生物体避开侵入因子的保护性应答。炎症是涉及许多细胞和体液介质的级联事件。一方面，炎症应答的抑制可以使得宿主免疫妥协；然而，如果置于不检查，那么炎症可以导致严重并发症，包括慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠病等)、脓毒性休克和多器官衰竭。重要的是，这些不同疾病状态共享共同的炎症介质。特征在于炎症的集合疾病对人发病率和死亡率具有很大影响。因此，明确的是抗炎抗体和结合多肽，例如本文描述的抗IL-31抗体和结合多肽，可以具有用于广泛多样的人和动物疾病的决定性治疗潜力，所述疾病从哮喘和变态反应到自身免疫和脓毒性休克。像这样，本文描述的抗炎抗IL-31抗体和结合多肽的使用可以在治疗上用作本文描述的IL-31拮抗剂，特别用于疾病例如关节炎、内毒素血症、炎性肠病、牛皮癣、相关疾病等中。
1.关节炎
关节炎包括骨关节炎、类风湿性关节炎、由于损伤的关节炎关节等，是共同炎性病状，其将从抗炎抗体和结合多肽例如本发明的抗IL-31抗体和结合多肽的治疗使用中获益。例如，类风湿性关节炎(RA)是全身性疾病，其影响整个身体并且是最常见的关节炎形式之一。它的特征在于内衬关节的膜的炎症，其引起疼痛、僵硬、温暖、发红和肿胀。炎症细胞释放可以消化骨和软骨的酶。由于类风湿性关节炎，发炎的关节衬里，滑膜，可以侵入且损害骨和软骨，导致关节退化和剧痛等其他生理学效应。所涉及的关节可能丧失其形状和对齐，导致疼痛和运动丧失。
类风湿性关节炎(RA)是特别地特征在于炎症和后续组织损害的免疫介导的疾病，导致严重残废和死亡率增加。各种细胞因子在类风湿性关节中局部产生。众多研究已证实IL-1和TNF-α，2种原型促炎细胞因子，在涉及滑液炎症和进行性关节破坏的机制中起重要作用。事实上，在具有RA的患者中施用TNF-α和IL-1抑制剂已导致炎症的临床和生物学体征的显著改善，以及骨质侵蚀和软骨破坏的放射学体征的减少。然而，尽管这些鼓舞人心的结果，但显著百分比的患者不响应这些试剂，暗示其他介质也涉及关节炎的病理生理学(Gabay，Expert.Opin.Biol.Ther.2(2)：135-149，2002)。这些介质之一可以是IL-31，并且像这样结合或抑制IL-31的分子，例如抗IL-31抗体或结合配偶体，可以充当有价值的治疗，以减少类风湿性关节炎和其他关节炎疾病中的炎症。
存在本领域已知的关于类风湿性关节炎的几种动物模型。例如，在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠发展出紧密类似人类风湿性关节炎的慢性炎症性关节炎。因为CIA与RA共享相似的免疫学和病理学特征，所以这使得它成为用于筛选潜在人抗炎化合物的理想模型。CIA模型是小鼠中众所周知的模型，其依赖于免疫应答和炎症应答而发生。免疫应答包括响应胶原的B细胞和CD4+T细胞的相互作用，所述胶原作为抗原给予，并且导致抗胶原抗体的产生。炎症期是来自炎症介质的组织应答的结果，由于这些抗体中的某些与小鼠的天然胶原交叉反应并且激活补体级联。使用CIA模型中的优点是发病机理的基本机制是已知的。已鉴定在II型胶原上的相关T细胞和B细胞表位，并且已测定涉及免疫介导的关节炎的各种免疫学(例如，迟发型超敏反应和抗胶原抗体)和炎症(例如细胞因子、趋化因子和基质降解酶)参数，并且因此可以用于在CIA模型中评估测试化合物功效(Wooley，Curr.Opin.Rheum.3：407-20，1999；Williams等人，Immunol.89：9784-788，1992；Myers等人，Life Sci.61：1861-78，1997；和Wang等人，Immunol.92：8955-959，1995)。
作为调节免疫和炎症应答的分子，IL-31可以诱导SAA的产生，这牵涉类风湿性关节炎的发病机理。人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以在体外和体内减少SAA活性，IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的全身或局部施用可以有效抑制在RA中的炎症应答。
2.内毒素血症
内毒素血症是通常起因于传染原例如细菌和其他传染病因子、脓毒症、中毒性休克综合征，或在遭受机会致病菌感染的免疫妥协患者中等的严重病状。治疗上有用的抗炎抗体和结合多肽，例如本发明的抗IL-31抗体和结合多肽，可以帮助预防且治疗人和动物中的内毒素血症。其他潜在治疗包括IL-31RA多肽、可溶性异二聚和多聚受体多肽、或本发明的抗IL-31抗体或结合配偶体等，可以充当有价值的治疗，以减少内毒素血症中的炎症和病理学效应。
脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症衔接许多促炎介质，其在传染病中产生病理学效应，并且在啮齿类动物中LPS诱导的内毒素血症是广泛使用和接受的模型用于研究潜在的促炎或免疫调节试剂的药理学效应。在革兰氏阴性菌中产生的LPS是脓毒性休克的发病机理中的主要致病因子(Glausner等人，Lancet 338：732，1991)。休克样状态事实上可以通过将LPS单次注射到动物内在实验上被诱导。通过响应LPS的细胞产生的分子可以直接或间接靶向病原体。尽管这些生物应答保护宿主不受侵入病原体，但它们也可以引起伤害。因此，由于严重革兰氏阴性菌感染发生的先天性免疫的大量刺激，导致细胞因子和其他分子的过量产生，以及致命综合征——脓毒性休克综合征的发展，其特征在于发热、低血压、弥漫性血管内凝血和多器官衰竭(Dumitru等人Cell 103：1071-1083，2000)。
LPS的这些毒性效应大部分与巨噬细胞活化相关，导致多种炎症介质的释放。在这些介质中，TNF看起来起关键作用，如由通过施用中和抗TNF抗体预防LPS毒性显示的(Beutler等人，Science 229：869，1985)。充分确定1ug大肠杆菌LPS注射到C57B1/6小鼠内将导致在注射后约2小时循环IL-6、TNF-α、IL-1和急性期蛋白质(例如SAA)中的显著增加。LPS的毒性看起来被这些细胞因子所介导，因为针对这些介质的被动免疫接种可以导致减少的死亡率(Beutler等人，Science 229：869，1985)。用于预防和/或治疗脓毒性休克的潜在免疫干扰策略包括抗TNF mAb、IL-1受体拮抗剂、LIF、IL-10和G-CSF。因为LPS诱导可能促进内毒素血症病理状态的促炎因子的产生，所以通过拮抗性IL-31多肽而中和IL-31活性、SAA或其他促炎因子可以用于减少内毒素血症的症状，例如如在内毒素休克中可见的。其他潜在治疗包括人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂。
3.炎性肠病.IBD
炎性肠病(IBD)可以影响结肠和直肠(溃疡性结肠炎)或两者、小肠和大肠(克罗恩氏病)。这些疾病的发病机理不明，但它们涉及受累组织的慢性炎症。潜在治疗包括IL-31RA多肽、可溶性异二聚和多聚受体多肽，或本发明的抗IL-31抗体或结合配偶体等，可以充当有价值的治疗，以减少IBD和相关疾病中的炎症和病理学效应。
克罗恩氏病中的慢性炎症和溃疡通常从小肠梗阻或腹痛开始，这可能模拟急性阑尾炎；其他呈现可以涉及其并发症。该疾病的过程是慢性的，并且尽管治疗，也可能恶化和缓解。发作通常在早期成人生命中，其中所有病例中的约一半在20到30岁之间开始，并且90％在10到40岁之间。比女性略微更多的男性受到影响。
显微镜检查反映了肉眼观察。炎症牵涉是不连续的：它是病灶性的或片块状的。淋巴细胞和浆细胞的集合主要在粘膜和粘膜下层中发现，但通常影响所有层(跨粘膜炎症)。克罗恩氏病的典型显微镜特征是由淋巴细胞套囊围绕的粒细胞的存在。特发性炎性肠病的发病率显示相当大的地理变化。这些疾病在北欧和美国具有比西欧、非洲、南美洲和亚洲的国家高得多的发病率，尽管增加的城市化和繁荣导致在部分南欧和日本中更高的发病率(General and SystematicPathology，Churchill Livingstone，第3版2000，JCE Underwood，Ed.)。
在克罗恩氏病中，临床上存在2个主要组，第一组包括其疾病在发作3年内进展至持续缓解的患者，第二组包括具有持续超过3年的疾病的患者。
无论病因学，在具有促炎细胞因子特别是白介素(IL)1、2、6和8，干扰素(IFN)-和肿瘤坏死因子(TNF)的产生增加的克罗恩氏病中，存在持续且不适当的T细胞和巨噬细胞活化的证据。克罗恩氏病的特征在于伴随纤维化的持续(慢性)炎症。成纤维细胞增殖和胶原沉积的过程可以通过转化生长因子介导，这具有特定抗炎作用，即成纤维细胞召募，基质合成和炎症细胞下调，但可能将影响许多其他介质。
溃疡性结肠炎(UC)是大肠通常称为结肠的炎性疾病，特征在于结肠的粘膜层和最里面衬里的炎症和溃疡。这种炎症引起结肠频繁排空，导致腹泻。症状包括粪便松散和伴随的腹部绞痛、发热和体重减轻。尽管UC的确切原因未知，但近期研究暗示身体的天然防御针对身体认为是外源的在身体中的蛋白质起作用(“自身免疫反应”)。可能因为它们类似肠中的细菌蛋白质，所以这些蛋白质可能促使或刺激开始破坏结肠的衬里的炎症过程。因为结肠的衬里被破坏，所以溃疡形成，释放粘液、脓液和血液。该疾病通常在直肠区域中开始，并且最终可以扩展到遍布整个大肠。炎症的反复发作导致肠和直肠壁的增厚伴随瘢痕组织。结肠组织的死亡或脓毒症可以伴随严重疾病而发生。溃疡性结肠炎的症状在严重度中不同，并且它们的发作可以是逐步的或突然的。攻击可以由许多因素包括呼吸道感染或压力引起。
尽管目前不存在关于UC可用的治愈，但治疗集中于抑制结肠衬里中的异常炎症过程。治疗包括皮质类固醇免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤、巯嘌呤和氨甲蝶呤)和氨基水杨酸盐(salicytates)可用于治疗该疾病。然而，免疫抑制剂例如皮质类固醇和硫唑嘌呤的长期使用可以导致严重副作用，包括骨变薄、白内障、感染、以及肝和骨髓效应。在其当前治疗不成功的患者中，手术是一个选择。手术涉及整个结肠和直肠的摘除。
存在可以部分模拟慢性溃疡性结肠炎的几种动物模型。最广泛使用的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱导的结肠炎模型，其诱导在结肠中的慢性炎症和溃疡。当TNBS经由直肠内滴注引入易感小鼠的结肠内时，它诱导在结肠粘膜层中的T细胞介导的免疫应答，在这种情况下导致特征在于T细胞和巨噬细胞遍布整个大肠壁的致密浸润的大量粘膜炎症。此外，这个组织病理学现象伴随进行性重量减轻(消瘦)、血性腹泻、直肠脱垂和大肠壁增厚的临床现象(Neurath等人Intern.Rev.Immunol.19：51-62，2000)。
另一种结肠炎模型使用糖酐酯钠(DSS)，其诱导表现为血性腹泻、体重减轻、结肠缩短和粘膜溃疡形成伴随嗜中性粒细胞浸润的急性结肠炎。DSS诱导的结肠炎的组织学特征在于炎症细胞浸润到粘膜固有层内，具有淋巴样组织增生、病灶性隐窝损害和上皮溃疡形成。这些改变被认为是由于DSS对上皮的毒性作用并且通过粘膜固有层细胞的吞噬作用以及TNF-α和IFN-γ的产生而发展。尽管有它的通常用途，但关于DSS与人疾病的关联性机制的几个问题仍有待解决。DSS被视为T细胞依赖性模型，因为它在T细胞缺陷动物例如SCID小鼠中观察到。
给这些TNBS或DSS模型施用人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以用于评估IL-31拮抗剂改善症状且改变胃肠道疾病过程的用途。IL-31可以在结肠炎中的炎症应答中起作用，并且通过施用人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31活性是用于IBD的潜在治疗方法。
4.牛皮癣
牛皮癣是影响超过七百万美国人的慢性皮肤病状。当新皮肤细胞异常生长时，牛皮癣发生，导致发炎、肿胀和鳞状的皮肤斑，其中旧皮肤仍未足够快地脱落。最常见形式斑块状牛皮癣的特征在于顶部为银白色鳞屑的发炎皮肤斑(“损害”)。牛皮癣可以局限于少数斑或涉及中等至广泛的皮肤区域，最通常在头皮、膝、肘和躯干上出现。尽管它是高度可见的，但牛皮癣不是接触性传染病。该疾病的发病机理涉及受累组织的慢性炎症。人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以充当有价值的治疗，以减少牛皮癣、其他炎症皮肤疾病、皮肤和粘膜变态反应及相关疾病中的炎症和病理学效应。
牛皮癣是T细胞介导的皮肤炎症病症，其可以引起相当大的不适。它是对其无治愈且影响所有年龄的人的疾病。牛皮癣影响约2％的欧洲和北美洲群体。尽管具有轻微牛皮癣的个体通常可以用局部试剂控制其疾病，但全世界超过一百万患者需要紫外线或全身性免疫抑制治疗。不幸的是，紫外线辐射和不便和危险以及许多治疗的毒性限制它们的长期使用。此外，患者通常具有牛皮癣的复发。
IL-31从已知具有重要免疫功能且包含在免疫系统中起作用的细胞的组织中分离。IL-31在CD3+选择的、活化的外周血细胞中表达，并且已显示IL-31表达在T细胞活化后增加。此外，人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以对单核细胞/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞的生长/扩增和/或单核细胞/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞或这些细胞的祖先的分化状态有作用。刺激造血祖细胞增殖且活化成熟细胞的因子一般是已知的，然而，增殖和活化还可能需要另外的生长因子。例如，已显示IL-7和Steel因子(c-kit配体)是NK祖细胞的集落形成所需的。与IL-7和Steel因子组合的IL-15+IL-2是更有效的(Mrózek等人，Blood 87：2632-2640，1996)。然而，未经鉴定的细胞因子可能是NK细胞和/或NK祖细胞的特定子集增殖所需的(Robertson等人，Blood 76：2451-2438，1990)。类似地，IL-31可以单独或与其他细胞因子同时或协同作用，以增强单核细胞/巨噬细胞、T细胞、B细胞或NK细胞的生长、增殖扩增和分化的修饰。
本发明涉及人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂作为拮抗剂在炎症和免疫疾病或病状中的用途，所述疾病或病状例如特应性皮炎、瘙痒疾病、胰腺炎、I型糖尿病(IDDM)、胰腺癌、胰腺炎、格雷夫斯病、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病、结肠和肠癌、憩室病、自身免疫疾病、脓毒症、器官或骨髓移植；由于创伤、手术或感染的炎症；淀粉样变性；脾肿大；移植物抗宿主病；和其中炎症的抑制，免疫抑制，造血、免疫、炎症或淋巴样细胞、巨噬细胞、T细胞(包括Th1和Th2细胞、CD4+和CD8+细胞)增殖的减少，针对病原体或抗原的免疫应答的抑制。此外，在活化的免疫细胞例如活化的CD4+和CD 19+细胞中存在IL-31RA的表达显示IL-31RA受体可以涉及身体针对外来侵入物的免疫防御反应：例如微生物和细胞碎片，并且可以在炎症和癌症形成过程中的免疫应答中起作用。像这样，对于IL-31RA受体功能具有激动性或拮抗性的本发明的抗体和结合配偶体，例如IL-31，可以用于修饰免疫应答和炎症。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂也可以在诊断系统内用于检测IL-31的循环水平。在一个相关实施方案内，与IL-31多肽特异性结合的抗体或其他试剂可以用于检测循环IL-31多肽。升高或降低水平的配体多肽可以指示病理学状况，包括癌症。IL-31多肽可以促进病理过程并且可以是潜在疾病的间接标记。
在粥样硬化病变中，首先的异常之一是单核细胞/巨噬细胞定位至内皮细胞。这些病变可以通过使用针对IL-31的拮抗剂得到阻止。人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以在粥样硬化病变中用作IL-31的拮抗剂。此外，单核母细胞性白血病与各种临床异常相关，所述临床异常反映巨噬细胞的生物制品的释放，例子包括在血清和尿中高水平的溶菌酶以及高热。此外，此类白血病显示单核细胞的异常增加。这些效应可能可以通过针对IL-31的拮抗剂例如本文描述的那些得到阻止。此外，如本文所描述的，人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂可以与分子例如毒性部分和细胞因子缀合，以直接杀死白血病单核细胞。
IL-31已显示在活化的单核细胞中表达，并且可能涉及调节炎症。像这样，本发明的多肽可以就其修饰炎症的能力而言进行测定且使用，或可以用作用于炎症的标记。测定IL-31的促炎和抗炎性质的方法是本领域已知的，并且在本文中讨论。此外，它可能涉及上调急性期蛋白质的产生，例如血清淀粉样蛋白A(SAA)、α1-抗胰凝乳蛋白酶和触珠蛋白，并且IL-31RA受体配体的表达可能在体内注射脂多糖(LPS)后增加，所述脂多糖涉及炎症应答(Dumoutier，L.等人，Proc. Nat′l.Acad.Sci.97：10144-10149.2000)。急性期蛋白质例如SAA的产生被视为其中炎症是有利的短期存活机制；然而，急性期蛋白质更长期的维持促进慢性炎症，并且可以对人健康有害。关于综述，参见Uhlar，CM和Whitehead，AS，Eur.J.Biochem.265：501-523，1999，以及Baumann H.和Gauldie，J.Immunology Today 15：74-80，1994。此外，急性期蛋白质SAA牵涉几种慢性炎症疾病的发病机理，牵涉动脉粥样硬化和类风湿性关节炎，并且是淀粉样变性中沉积的淀粉样蛋白A蛋白质的前体(Uhlar，CM和Whitehead，同上)。因此，当配体例如IL-31充当促炎分子且诱导SAA的产生时，人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂在治疗与通过配体诱导的急性期应答蛋白质相关的炎性疾病和其他疾病中将是有用的。例如，减少炎症的方法包括给具有炎症或发痒的哺乳动物施用一定量的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的组合物，其足以减少炎症或发痒。此外，抑制具有炎症的哺乳动物中的炎症应答的方法可以包括：(1)测定血清淀粉样蛋白质A蛋白质的水平；(2)施用包括在药学上可接受的载体中的如本文所描述的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的组合物；(3)测定血清淀粉样蛋白A蛋白质的施用后水平；(4)使步骤(1)中的血清淀粉样蛋白A蛋白质的水平与步骤(3)中的血清淀粉样蛋白A蛋白质的水平相比较，其中血清淀粉样蛋白A蛋白质水平中的增加或减少的缺乏指示抑制炎症应答。
与其IL-31RA受体cDNA相对应的mRNA的组织分布显示mRNA水平在单核细胞和前列腺细胞中是最高的，并且在活化的单核细胞以及活化的CD4+、活化的CD8+和活化的CD3+细胞中是升高的。因此，IL-31RA受体也牵涉诱导炎症和免疫应答。因此，本发明的特定实施方案涉及人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂在炎症和免疫疾病或病状中的使用，所述疾病或病状例如胰腺炎、I型糖尿病(IDDM)、胰腺癌、胰腺炎、格雷夫斯病、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病、结肠和肠癌、憩室病、自身免疫疾病、脓毒症、器官或骨髓移植；由于创伤、手术或感染的炎症；淀粉样变性；脾肿大；移植物抗宿主病；和其中炎症的抑制，免疫抑制，造血、免疫、炎症或淋巴样细胞、巨噬细胞、T细胞(包括Th1和Th2细胞、CD4+和CD8+细胞)增殖的减少，针对病原体或抗原的免疫应答的抑制。此外，在活化的免疫细胞例如活化的CD3+、单核细胞、CD4+和CD 19+细胞中存在IL-31RA受体和IL-31的表达显示IL-31RA受体可以涉及身体针对外来侵入物的免疫防御反应：例如微生物和细胞碎片，并且可以在炎症和癌症形成过程中的免疫应答中起作用。像这样，对IL-31RA受体功能具有激动性或拮抗性的本发明的抗体和结合配偶体，例如IL-31，可以用于修饰免疫应答和炎症。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂用于：
1)在以下疾病的治疗中拮抗或阻断循环经由包括IL-31RA的受体的信号传导：急性炎症，由于创伤、组织损伤、手术、脓毒症或感染的炎症，以及慢性炎性疾病例如哮喘、炎性肠病(IBD)、慢性结肠炎、脾肿大、类风湿性关节炎、复发性急性炎症发作(例如肺结核)，以及淀粉样变性、和动脉粥样硬化、卡斯尔曼病、哮喘和与急性期应答的诱导相关的其他疾病的治疗中；和
2)在以下自身免疫疾病中拮抗或阻断经由IL-31RA受体的信号：例如IDDM、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎和IBD，以阻止或抑制免疫细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、白细胞)中经由IL-31RA受体的信号传导(HughesC等人，J.Immunol 153：3319-3325，1994)。备选地，针对IL-31的抗体例如单克隆抗体(MAb)也可以用作拮抗剂以耗尽不希望有的免疫细胞，以治疗自身免疫疾病。哮喘、变态反应和其他变应性疾病可以用针对例如抗IL-31抗体、可溶性IL-31RA受体可溶受体或IL-31RA/CRF2-4异二聚体的MAb进行治疗，以抑制免疫应答或耗尽不希望有的细胞。使用本发明的多肽和抗体阻断或抑制经由IL-31RA的信号传导，也可以对胰腺、肾、垂体和神经元细胞的疾病有利。IDDM、NIDDM、胰腺炎和胰腺癌可能是有利的。IL-31RA可以充当用于癌症的MAb治疗的靶，其中拮抗性MAb抑制癌症生长并且靶向免疫介导的杀死。(Holliger P和Hoogenboom，H：Nature Biotech.16：1015-1016，1998)。针对可溶IL-31RA受体单体、同二聚体、异二聚体和多聚体的Mabs也可以用于治疗肾病变例如肾小球硬化，膜性神经病变(membranous neuropathy)，淀粉样变性(在其他组织中其也影响肾)，肾动脉硬化症，各种起源的肾小球肾炎，肾的纤维增生疾病，以及与SLE、IDDM、II型糖尿病(NIDDM)、肾肿瘤和其他疾病相关的肾功能障碍。
一般地，所施用的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的剂量将依赖于此类因素而改变，如患者的年龄、重量、高度、性别、一般医学状况和先前医疗史。一般地，希望给接受者提供约1Pg/kg至10mg/kg(试剂量/患者体重)范围内的IL-31多肽剂量，尽管更低或更高剂量也可以如情况指示的进行施用。本领域技术人员可以容易地确定此类剂量，以及关于其的调整，使用本领域已知的方法。
人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂对受试者的施用可以是局部、吸入、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、经由区域导管通过灌注、或通过直接损伤区内注射。当通过注射施用治疗性蛋白质时，施用可以通过连续输注或通过单次或多次推注。
另外的施用途径包括经口、粘膜、肺和经皮。经口递送适合于聚酯微球体、玉米蛋白微球体、类蛋白质微球体、聚氰基丙烯酸酯微球体、和基于脂质的系统(参见例如，DiBase和Morrel，″Oral Deliveryof Microencapsulated Proteins，″in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(编辑)，第255-288页(Plenum Press 1997))。鼻内递送的可行性通过此类胰岛素施用方式进行例示(参见例如Hinchcliffe和Illum，Adv.Drug Deliv.Rev.35：199(1999))。可以制备包括IL-31的干燥或液体颗粒，并且借助于干粉分配器、液体气溶胶发生器或喷雾器吸入(例如Pettit和Gombotz，TIBTECH 16：343(1998)；Patton等人，Adv.Drug Deliv.Rev.35：235(1999))。这种方法通过AERX糖尿病管理系统举例说明，其是将喷雾化胰岛素递送到肺内的手提式电子吸入器。研究已显示大至48,000kDa的蛋白质已借助于低频超声以治疗浓度递送经过皮肤，这举例说明经皮施用的可行性(Mitragotri等人，Science 269：850(1995))。使用电穿孔的经皮递送提供施用具有IL-31结合活性的分子的另一种方法(Potts等人，Pharm.Biotechnol.10：213(1997))。
包括具有IL-31结合活性的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的药物组合物可以根据已知方法进行配制，以制备药学上有用的组合物，由此治疗性蛋白质在具有药学上可接受的载体的混合物中组合。组合物被说成“药学上可接受的载体”，如果它的施用可以被接受者患者所耐受。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个例子。其他合适的载体是本领域技术人员众所周知的。参见例如，Gennaro(编辑)，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company 1995)。
为了治疗的目的，具有IL-31结合活性的分子和药学上可接受的载体以治疗有效量施用于患者。具有IL-31结合活性的蛋白质、多肽或肽和药学上可接受的载体的组合被说成以“治疗有效量”施用，如果所施用的量是生理学上显著的。试剂是生理学上显著的，如果它的存在导致接受患者的生理学中的可检测改变。例如，用于治疗炎症的试剂是生理学上显著的，如果它的存在减轻至少部分炎症应答。
包括人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的药物组合物可以以液体形式、气溶胶或固体形式提供。液体形式通过可注射溶液、气溶胶、微滴、局部溶液和经口悬浮液举例说明。示例性固体形式包括胶囊、片剂和控制释放形式。后面一种形式通过微型渗透泵和埋植剂举例说明(Bremer等人，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，″Implants in Drug Delivery，″in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(编辑)，第95-123页(CRC Press 1995)；Bremer等人，″Protein Delivery with Infusion Pumps，″in Protein Delivery：PhysicalSystems，Sanders和Hendren(编辑)，第239-254页(Plenum Press1997)；Yewey等人，″Delivery of Proteins from a Controlled ReleaseInjectable Implant，″in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(编辑)，第93-117页(Plenum Press 1997))。其他固体形式包括乳膏、糊剂、其他局部应用等。
本文公开的人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂也可以配制为免疫脂质体。包含抗体的脂质体通过本领域已知的方法进行制备，例如在Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556中。
脂质体提供静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下或经由经口施用、吸入或鼻内施用将治疗性多肽递送给受试者的一种方法。脂质体是由围绕水区室的一个或多个脂质双层组成的微型囊泡(一般参见，Bakker-Woudenberg等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs 46：618(1993)，和Ranade，″Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers，″in DrugDelivery Systems，Ranade和Hollinger(编辑)，第3-24页(CRC Press1995))。脂质体在组成中与细胞膜相似，并且因此，脂质体可以安全施用并且是生物可降解的。依赖于制备方法，脂质体可以是单层或多层的，并且脂质体可以在尺寸上不同，其中直径从0.02μm到超过10μm。各种试剂可以封装在脂质体中：疏水试剂分配在双层中，并且亲水试剂分配在内部水间隔内(参见例如，Machy等人，LiposomesIn Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987)，和Ostro等人，American J.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。此外，通过改变脂质体尺寸、双层数目、脂质组成、以及脂质体的电荷和表面特征，可以控制所封装试剂的治疗可用性。
特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法产生，使用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物。将脂质体挤出具有限定孔径的滤器，以产生具有所需直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段可以经由二硫化物互换反应与脂质体缀合，如Martin等人J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中描述的。化学治疗剂(例如多柔比星)任选包含在脂质体内。参见Gabizon等人J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
制备人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂的治疗性制剂用于贮藏，通过使具有所需纯度的抗体与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980))相混合，以冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精(dextrin)；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂例如Tween.TM.、Pluronics.TM.或聚乙二醇(PEG)。
需要时，本文制剂还可以包含超过一种活性化合物用于待治疗的特定适应症，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些。例如，可能希望进一步提供在一个制剂中的与IL-31结合的抗体。备选地或另外地，组合物可以包括化学治疗剂或细胞因子。此类分子以对于预期目的有效的量适当地存在于组合中。
具有IL-31结合活性的多肽可以封装在脂质体内，使用蛋白质微囊化的标准技术(参见例如，Anderson等人，Infect.Immun.31：1099(1981)，Anderson等人，Cancer Res.50：1853(1990)，和Cohen等人，Biochim.Biophys.Acta 1063：95(1991)，Alving等人″Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies，″inLiposome Technology，第2版，第III卷，Gregoriadis(编辑)，第317页(CRC Press 1993)，Wassef等人，Meth.Enzymol.149：124(1987))。如上所述，治疗上有用的脂质体可以包含各种组分。例如，脂质体可以包括聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等人，Biochim. Biophys.Acta 1150：9(1993)).
待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过经由无菌滤膜过滤容易地完成。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括包含抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质以成形物品例如膜或微胶囊的形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如Lupron Depot.TM.(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)、和聚-D-(-)-3-羟丁酸。尽管聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得分子能够释放超过100天，但特定水凝胶使蛋白质释放较短时间段。当所封装的抗体在体内长时间保留时，由于暴露于在37℃下的湿度，它们可能变性或聚集，导致生物活性的丧失和免疫原性中的可能改变。可以设计合理策略用于稳定，依赖于所涉及的机制。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换的分子间S--S键形成，那么稳定化可以通过修饰巯基残基、来自酸性溶液的冻干、控制湿度含量、使用合适添加剂和开发特异性聚合物基质组成来达到。
其他剂型可以通过本领域技术人员设计，如例如由Ansel和Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第5版(Lea&Febiger 1990)，Gennaro(编辑)，Remington′sPharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company 1995)，以及通过Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(CRC Press1996)显示的。
作为举例说明，药物组合物可以作为包括容器的试剂盒提供，所述容器包括人源化IL-31抗原结合分子或IL-31拮抗剂(例如，结合IL-31多肽的抗体或抗体片段)。治疗性多肽可以以用于单次或多次剂量的可注射溶液的形式提供，或作为将在注射前重构的无菌粉末提供。备选地，此种试剂盒可以包括用于施用治疗多肽的干粉分配器、液体气溶胶发生器或喷雾器。
本发明通过下述非限制性实施例进一步举例说明。
实施例
实施例1
人源化可变区序列的测定
小鼠抗人IL-31单克隆抗体先前已在于2006年5月8日提交的共同未决的美国专利申请序列号11/430,066(美国专利公开号2006-02752960)中得到描述。小鼠抗人IL-31抗体的可变区的氨基酸序列在于2007年9月4日提交的共同未决的美国专利申请序列号11/850,006和于2007年9月4日提交的共同拥有的PCT申请US07/77555中得到描述。这些氨基酸序列用作关于本文描述的人源化序列的原材料。特别地，小鼠抗人IL-31抗体序列来自具有克隆编号292.12.3.1的杂交瘤。
将编码克隆292.12.3.1的CDR区的核苷酸克隆到编码人IgG的cDNA载体内，从而使得产生由具有鼠类CDR区的IgG构架组成的嵌合抗体。在嵌合抗体中的个别氨基酸进行最佳化，以获得高品质(结合亲和力、稳定性和同质性)的单克隆抗体的特征。产生每种抗体的三维模型，并且测定人源化可变区和CDR区。
使包含人源化小鼠抗人IL-31重和轻链可变区的构建体与在位置241(Kabat编号)处具有Ser至Pro突变的人IgG4恒定区融合，以抑制一半抗体的形成。构建体在HEK2923细胞中表达，并且在蛋白质A柱上进行纯化，随后为缓冲液交换到PBS内。通过Biacore测量结合亲和力。效力在BAF增殖测定法和NHK stat3磷酸化测定法中进行测量。评估生物物理学特征例如同质性、聚集和折叠稳定性。
实施例2
人源化IL-31抗原结合分子在HEK293细胞中的表达
所有实验操作根据制造商说明书来执行。抗IL-31抗体cDNA从Geneart(http://www.Geneart.com)定购，并且亚克隆到表达质粒pTT5内。抗体轻链(LC)和重链(HC)保持在独立质粒上。pTT5得到Yves Durocher(Biotechnology Research Institute，NationalResearch Council Canada)的授权。pTT5质粒已在下述出版物中进行表征：Durocher等人NAR 2002；和Pham等人Biotechn.Bioeng.2003。
为了获得用于HEK293-6E转染的质粒，将抗IL-31抗体编码质粒化学转化到TOP10大肠杆菌细胞(目录号C4040-06，Invitrogen，Taastrup，Denmark)内，并且经由质粒纯化柱(目录号27144，Qiagen，Ballerup，Denmark)进行分离。定点氨基酸交换通过PCR执行，其中引物来自DNA technology(http://www.DNA-technology.dk)，和Dpnl消化(目录号200518，Clontech via Medinova Scientific A/S，Glostrup，Denmark)。质粒在MWG-biotech(http://www.mwg-biotech.com/html/all/index.ph)处进行测序。
HEK293-6E细胞如293Fectin方案(目录号12347019，Invitrogen，Taastrup，Denmark)中所述进行转染。简言之，将15μg LC和15μgHC质粒稀释在1ml Opti-MEM(目录号31985-062，Gibco/Invitrogen，Taastrup，Denmark)中，并且与同样在稀释1ml Opti-MEM中的40μl293Fectin相混合。对于标准转染，使30,000,000HEK293-6E细胞形成团块并且重悬浮于28ml Freestyle培养基(目录号12338，Gibco/Invitrogen，Taastrup，Denmark)中，并且随后加入2ml质粒混合物。在形成团块和上清液取样前，细胞其后在37℃、8％CO2下伴随搅拌(125rpm)温育6天。
实施例3
通过Biacore测量的人源化IL-31抗原结合分子的结合亲和力
前言
蛋白质相互作用可以使用表面等离子体共振(SPR)分析进行实时监控。在这个研究中，在Biacore 3000和Biacore T100仪器上执行SRP分析，以便就针对重组人IL-31(hIL-31)的亲和力而言表征抗IL-31单克隆抗体。
使用直接结合操作执行亲和力研究，其中单克隆抗体经由游离胺基与传感器芯片表面上的羧甲基化葡聚糖膜(CM5)共价偶联。重组hIL-31以各种浓度进行注射，随后为用恒定缓冲液流经传感器芯片表面的解离期。使用这种实验设计，hIL-31与经固定的单克隆抗体的结合可以视为1∶1结合，其中一个hIL-31分子与一个抗体结合位点结合。关于相互作用的动力学参数可以使用1∶1相互作用兰米尔拟合模型(languri fitting model)进行计算。
方法
将经纯化的单克隆抗体固定在CM5类型传感器芯片上的个别流动池中。固定使用标准胺偶联操作来执行，旨在500共振单位(RU)的固定水平。抗体在10mM NaAc pH 4.5中稀释至1-5ug/ml。
HPS-EP pH 7.4(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0,005％Polysorbat P20)用作运行缓冲液，以及用于重组hIL-31(hIL-31，BHK产生的，A1277F，zcytor17lig CEE)的稀释剂。hIL-31以从333.3nM到1.4nM的3倍稀释系列进行测试。结合(注射)是4分钟，随后为20分钟解离(洗涤)期。流速是50ul/分钟。实验在25OC下执行。表面的再生通过以30ul/分钟流速注射30秒脉冲的10mM甘氨酸-HCl pH 1.8或1M甲酸来完成。检测在所有流动池中同时进行。流动池#1不包含固定抗体，并且用于本底和容积扣除。所有实验一式三份地执行。
“亲本’’鼠类单克隆抗体包括在所有实验中用于所获得的动力学参数的内部参考。
动力学参数通过数据的总体拟合进行计算，使用1∶1兰米尔结合模型。数据在计算动力学参数前就大量运输(mass-transport)局限性进行检查。在某些实验中，Rmax进行局部拟合，并且RI常数设为0。
实验在Biacore 3000和T100仪器上执行。数据使用Biaeval 4.1和Biacore T100评估软件进行评估。数据显示于表2和下文中。几个克隆在这个测定法中显示与亲本品系相似的亲和力。
表2：
  克隆编号   KD(nM)   Kd(l/s)   Ka(l/Ms)   相对效力丧失(KD)   相对效力丧失(kd)
  292.12.3.1(亲本)   2.2   6.10E-05   2.80E+04
  7   1.9   5.70E-05   3.30E+04   类似于亲本   类似于亲本
  8   1.9   5.40E-05   2.80E+04   类似于亲本   类似于亲本
  9   2.1   9.00E-05   4.30E+04   类似于亲本   与亲本～1.5x
  10   186   1.50E-02   8.80E+05   与亲本～85x   与亲本～245x
  11   1.46   7.60E-05   5.20E+04   类似于亲本   类似于亲本
  13   24   3.00E-03   1.20E+05   与亲本～10x   与亲本～50x
  14   12.5   7.30E-04   5.90E+04   与亲本～5.5x   与亲本～12x
  16   1.2   7.50E-05   6.10E+04   与亲本～0.5x   类似于亲本
  17   0.9   6.50E-05   7.00E+04   与亲本～0.4x   类似于亲本
  18   1.13   6.20E-05   5.50E+04   与亲本～0.5x   类似于亲本
  21   1.4   9.70E-05   6.90E+04   类似于亲本   类似于亲本
  22   1.7   1.10E-04   6.70E+04   类似于亲本   与亲本～2x
  23   1.4   9.00E-05   6.50E+04   与亲本～0.6x   与亲本～1.5x
  25   0.85   7.20E-05   8.50E+04   与亲本～0.5x   类似于亲本
  26   0.68   7.00E-05   1.00E+05   与亲本～0.4x   类似于亲本
  27   0.8   7.90E-05   9.80E+04   与亲本～0.5x   与亲本～1.3x
  28   0.46   5.60E-05   1.20E+05   与亲本～0.25x   类似于亲本
  29   0.99   8.98E-05   9.00E+04   与亲本～0.5x   与亲本～1.5x
  30   1.1   9.00E-05   7.80E+04   与亲本～0.5x   与亲本～1.5x
  31   0.77   7.00E-05   9.20E+04   与亲本～0.4x   类似于亲本
  32   0.64   5.90E-05   9.30E+04   与亲本～0.3x   类似于亲本
  33   1.3   6.80E-05   5.20E+04   与亲本～0.6x   类似于亲本
  34   1.4   6.90E-05   5.20E+04   与亲本～0.6x   类似于亲本
  35   1.6   1.00E-04   6.40E+04   与亲本～0.7x   与亲本～1.5x
  36   1.6   1.08E-04   6.80E+04   与亲本～0.5x   与亲本～1.5x
实施例4
通过BAF增殖测量的人源化IL-31抗原结合分子的效力
A.培养基和缓冲液
培养基：具有Glutamax(SKN，NN)、10％热灭活FBS、1％P/S(BioWhitaker目录号DE17-602E)、0.5mg/ml遗传霉素(GIBCO目录号10131-019)、100μg/ml zeocin(Invitrogen 45-0430)、1ng/ml小鼠IL3(TriChem ApS目录号213-13)、2ug/ml Pyromycin(Sigma-Aldrich P7255)的RPMI 1640。
测定培养基：具有Glutamax(SKN，NN)、10％热灭活FBS、1％P/S(BioWhitaker目录号DE17-602E)、0.5mg/ml遗传霉素(GIBCO目录号10131-019)、100μg/ml Zeocin(Invitrogen 45-0430)、2ug/mlPyromycin(Sigma-Aldrich P7255)的RPMI 1640。
alamarBlue染料(BioScource，Dal1100)用于评估增殖。
B.抗体、细胞和细胞因子
人抗IL-31单克隆抗体在Novo Nordisk处产生，并且在NovoNordisk(Copenhagen，Denmark)处纯化。从ZymoGenetics，Inc.(Seattle，WA)作为KZS134-BAF3细胞系收到的BAF-3(hIL-31R)细胞用关于hIL-31Rα和hOSMRB的基因进行转染。重组人IL-31(C108S，在美国专利公开号2006-0228329中描述)，通过ZymoGenetics，Inc.在大肠杆菌中产生)。MW 18kDa
C.增殖测定法
1.刺激测定法
BAF-3(hIL-31R)细胞在测定培养基中充分洗涤，以去除残留IL3。细胞随后以104细胞/孔种植到96孔微量滴定板内(平孔视图平板Packard目录S00190)。将hIL-31(10-9M至10-15M)的系列稀释物加入孔中，并且具有细胞但无hIL-31的另外孔充当阴性对照。细胞在5％CO2中在37℃下培养3天。对于培养期的最后6小时，将10μl alamarBlue加入每个孔中。在荧光分光光度计(bmg POLARstar+Galaxy)上在激发555-12nm和发射590nm处，细胞就荧光强度进行分析。对于抑制分析，恒定浓度的hIL-31用于刺激细胞。基于在增殖测定法中约90％的最大刺激选择这个浓度，这意指10-10M hIL20。
2.抑制测定法。
将10X104细胞/孔经洗涤的BAF-3(hIL-31R)细胞种植到微量滴定孔在测定培养基中。将10-10M(终浓度)hIL-31加入每个孔中(除仅包含细胞用作阴性对照的某些孔外。将抗体的系列稀释物(即，100μg和2倍)加入已包含细胞和细胞因子的孔中(除应仅包含细胞+hIL-31用于阳性对照的孔外)。细胞、细胞因子和抗体的混合物以100μl/w在5％CO2中在37℃下温育72小时。温育的最后6小时包括10μl/w alamarBlue。在荧光分光光度计(bmg POLARstar+Galaxy)上在激发555-12nm和发射590nm处，细胞就荧光强度进行分析。描绘曲线并且使用Prism 4(GraphPad PRISM software Inc.)计算效力(IC50)。数据显示于表3和下文中。几个克隆在这个测定法中显示与亲本相似的效力。
表3：在1E-10M hIL-31下的人源化mAbs的效力(nM)
  克隆编号   平均效力   相对于292.12.3.1效力中的平均倍数丧失
  292.12.3.1(亲本)   1.6   1.0
  07   4.5   3.3
  08   4.1   2.5
  09   28.5   15.1
  10   ＞＞   ＞＞
  11   22.8   11.6
  12   ＞＞   ＞＞
  13   109.0   99.1
  14   ＞＞   ＞＞
  15   10.4   7.7
  16   10.6   9.8
  17   5.9   5.2
  18   8.1   5.9
  20   ＞＞   ＞＞
  21   4.8   3.5
  22   14.0   13.2
  23   8.6   7.6
  24   6.0   4.0
  25   26.3   16.5
  26   9.3   5.8
  27   29.1   18.7
  28   26.4   17.1
  29   12.9   8.3
  30   57.8   37.1
  31   32.4   25.1
  32   18.9   14.7
  33   3.1   2.3
  35   62.1   75.1
  36   14.1   -
实施例5
通过NHK stat3磷酸化测定法测量的 人源化IL-31抗原结合分子的效力
正常人角化细胞的培养和STAT3磷酸化测定法：
来自腹部皮肤的正常人角化细胞(NHKs)得自Biopredic Int.(Rennes，France)，并且在补充有来自Cascade Biologies(Portland，OR)的HKGS试剂盒的Epilife Medium中生长。包含HBSS、胰蛋白酶-EDTA和胰蛋白酶中和试剂的Detach试剂盒用于收获细胞，并且得自Promocell(Heidelberg，Germany)。NHKs用重组人IL-31在平底96孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)中刺激15分钟，以便测量STAT3磷酸化且测定细胞因子的EC50。NHK裂解物在来自CellSignaling Technology(Danvers，MA)的PathScan Phospho-STAT3Sandwich ELISA Kit中进行测试，根据制造商的说明书。在用重组人IL-31的EC80刺激15分钟前，随后通过将抗体的系列稀释物加入NHKs中测定每种中和抗体的IC50。小鼠IgG1(R&D Systems，Minneapolis，MN)和人IgG4(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO)用作同种型对照抗体。
针对人IL-31的抗体的效力
对于针对人IL-31的每种抗体，IC50值(nM)显示于表4中。对于每次实验，给出如用XL Fit软件测定的Z′因子。显示了用重组人IL-31的EC80获得的刺激指数。几个克隆在这个测定法中显示与亲本类似的效力或可接受的效力。
表4
根据前文，应当理解尽管为了举例说明的目的本文已描述的本发明的具体实施方案，但无需背离本发明的精神和范围即可进行各种修饰。因此，本发明仅受附加权利要求限制。
序列表
<110>ZymoGenetics，Inc.
BONDENSGAARD，KENT
BECKMANN，ROLAND
 
<120>对IL-31特异的人源化抗体分子
 
<130>07-13PC
 
<150>61/012,362
<151>2007-12-07
 
<160>51
 
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
 
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>1
Arg Tyr Trp Met Gln
 1               5
 
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>2
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
 
<210>3
<211>13
<212>PRT
<213>小鼠
<400>3
Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr
 1               5                  10
 
<210>4
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>4
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
 
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>5
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
 1               5                  10
 
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>6
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
 1               5
 
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>7
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
 1                 5
 
<210>8
<211>30
<212>PRT
<213>小鼠
 
<220>
<221>变体
<222>(29)...(29)
<223>Xaa是Leu或Phe
 
<400>8
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Xaa Thr
            20                  25                  30
 
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>9
Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
 1               5                  10
 
<210>10
<211>32
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>10
Gln Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
 1               5                  10                  15
Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe
            20                  25                  30
 
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>11
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
 1               5                  10
 
<210>12
<211>30
<212>PRT
<213>小鼠
 
<220>
<221>变体
<222>(29)...(29)
<223>Xaa是Leu或Phe
 
<400>12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Xaa Thr
            20                  25                  30
 
<210>13
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>13
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
 1               5                  10
 
<210>14
<211>32
<212>PRT
<213>小鼠
 
<220>
<221>变体
<222>(8)...(8)
<223>Xaa是Lys或Thr
<220>
<221>变体
<222>(32)...(32)
<223>Xaa是Phe或Arg
 
<400>14
Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
 1               5                  10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa
            20                  25                  30
 
<210>15
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>15
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
 1               5                  10
 
<210>16
<211>32
<212>PRT
<213>小鼠
 
<220>
<221>变体
<222>(8)...(8)
<223>Xaa是Lys或Thr
 
<220>
<221>变体
<222>(32)...(32)
<223>Xaa是Phe或Arg
 
<400>16
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
 1               5                  10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa
            20                  25                  30
<210>17
<211>23
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
            20
 
<210>18
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>18
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
 1               5                  10                  15
 
<210>19
<211>32
<212>PRT
<213>小鼠
 
<220>
<221>变体
<222>(15)...(15)
<223>Xaa是Phe或Tyr
 
<400>19
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Glu Thr Gln Xaa Ser
 1               5                  10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>20
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>20
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
 1               5                  10
 
<210>21
<211>32
<212>PRT
<213>小鼠
 
<220>
<221>变体
<222>(15)...(15)
<223>Xaa是Tyr或Phe
 
<400>21
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr
 1               5                  10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
 
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<220>
<221>变体
<222>(13)...(13)
<223>Xaa是Gln或Pro
 
<220>
<221>变体
<222>(14)...(14)
<223>Xaa是Ser或Lys
 
<220>
<221>变体
<222>(16)...(16)
<223>Xaa是Gln或Lys
 
<400>22
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Xaa Xaa Phe Xaa
 1               5                  10                  15
Gly
 
<210>23
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>23
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
 1               5                  10                  15
Gly
 
<210>24
<211>164
<212>PRT
<213>人
 
<400>24
Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys
 1               5                  10                  15
Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu
            20                  25                  30
Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu
        35                  40                  45
Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val
    50                  55                  60
Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro
65                  70                  75                  80
Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg
                85                  90                  95
Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp
            100                 105                 110
Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr
        115                 120                 125
Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe
    130                 135                 140
Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln
145                 150                 155                 160
Gln Ala Thr Thr
 
<210>25
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>26
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Glu Thr Gln Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
 
<210>27
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>27
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>28
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
 
<210>29
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
             20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>30
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>31
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>32
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Glu Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
 
<210>33
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
 
<210>34
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Glu Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
 
<210>35
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>35
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>36
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
             20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>37
<211>108
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
 
<210>38
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
<400>38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
             20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>39
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>40
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>41
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                 25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
 
<210>42
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>43
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>44
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>45
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>46
<211>214
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Glu Thr Gln Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
 
<210>47
<211>449
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
    210                 215                 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
         355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435                 440                 445
Lys
 
<210>48
<211>214
<212>PRT
<213>小鼠
<400>48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
                    100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
                115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
            130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
           210
 
<210>49
<211>449
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
    210                 215                 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
        435                 440                 445
Lys
 
<210>50
<211>214
<212>PRT
<213>小鼠
<400>50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Glu Thr Gln Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
 
<210>51
<211>449
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
    210                 215                 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
        435                 440                 445
Lys

Claims (29)

1.与人IL-31结合的经分离的抗体或抗体片段，其包括：
a)包括分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2和3组成或分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、4和3组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化重链可变结构域；和
b)包括分别由SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化轻链可变结构域。
2.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中
a)所述人源化重链可变结构域包括与选自下述的氨基酸序列具有至少90％等同的氨基酸序列的构架区FR1、FR2、FR3和FR4：
i)分别地SEQ ID NO：8(FR1)、9(FR2)、10(FR3)和11(FR4)的氨基酸序列；
ii)分别地SEQ ID NO：12(FR1)、13(FR2)、14(FR3)和15(FR4)的氨基酸序列；
iii)分别地SEQ ID NO：12(FR1)、13(FR2)、16(FR3)和15(FR4)的氨基酸序列；和
b)所述人源化轻链可变结构域包括与选自下述的氨基酸序列具有至少90％等同的氨基酸序列的构架区FR5、FR6、FR7和FR8：
i)分别地SEQ ID NO：17(FR5)、18(FR6)、19(FR7)和20(FR8)的氨基酸序列；和
ii)分别地SEQ ID NO：17(FR5)、18(FR6)、21(FR7)和20(FR8)的氨基酸序列。
3.根据权利要求2的抗体或抗体片段，其中所述人源化重链可变结构域包括分别由SEQ ID NO：8(FR1)、9(FR2)、10(FR3)和11(FR4)的氨基酸序列组成的构架区FR1、FR2、FR3和FR4；并且其中所述人源化轻链可变结构域包括分别由SEQ ID NO：17(FR5)、18(FR6)、19(FR7)和20(FR8)的氨基酸序列组成的构架区FR5、FR6、FR7和FR8。
4.根据权利要求2的抗体或抗体片段，其中所述人源化重链可变结构域包括分别由SEQ ID NO：12(FR1)、13(FR2)、14(FR3)和15(FR4)的氨基酸序列组成的构架区FR1、FR2、FR3和FR4；并且其中所述人源化轻链可变结构域包括分别由SEQ ID NO：17(FR5)、18(FR6)、19(FR7)和20(FR8)的氨基酸序列组成的构架区FR5、FR6、FR7和FR8。
5.根据权利要求2的抗体或抗体片段，其中所述人源化重链可变结构域包括分别由SEQ ID NO：12(FR1)、13(FR2)、14(FR3)和15(FR4)的氨基酸序列组成的构架区FR1、FR2、FR3和FR4；并且其中所述人源化轻链可变结构域包括分别由SEQ ID NO：17(FR5)、18(FR6)、21(FR7)和20(FR8)的氨基酸序列组成的构架区FR5、FR6、FR7和FR8。
6.根据权利要求2-5中任一项的抗体或抗体片段，其中在FR1(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：12)中位置29处的氨基酸是亮氨酸，并且在FR3(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16)中位置32处的氨基酸是苯丙氨酸。
7.根据权利要求6的抗体或抗体片段，其中在FR7(SEQ IDNO：19或SEQ ID NO：21)中位置15处的氨基酸是酪氨酸。
8.根据权利要求7的抗体或抗体片段，其中在FR3(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16)中位置8处的氨基酸是赖氨酸。
9.根据权利要求6的抗体或抗体片段，其中在FR3(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16)中位置8处的氨基酸是赖氨酸。
10.根据任何前述权利要求的抗体或抗体片段，其中所述抗体包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：
a)人IgG1恒定结构域；
b)人IgG2恒定结构域；
c)人IgG3恒定结构域；
d)人IgG4恒定结构域；
e)人IgM恒定结构域；
f)人IgE恒定结构域；和
g)人IgA恒定结构域。
11.根据任何前述权利要求的抗体片段，其中所述片段选自：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
12.根据任何前述权利要求的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括PEG。
13.药物组合物，其包括根据任何前述权利要求的抗体或抗体片段。
14.经分离的抗体，其选自：
a)包括由氨基酸序列SEQ ID NO：46组成的轻链和由氨基酸序列SEQ ID NO：47组成的重链的抗体；
b)包括由氨基酸序列SEQ ID NO：48组成的轻链和由氨基酸序列SEQ ID NO：49组成的重链的抗体；和
c)包括由氨基酸序列SEQ ID NO：50组成的轻链和由氨基酸序列SEQ ID NO：51组成的重链的抗体。
15.与人IL-31结合的经分离的抗体或抗体片段，其包括：
a)包括分别具有SEQ ID NO：1和3的氨基酸序列的CDR1和CDR3以及具有AIYPGDGDTRYSXaa1Xaa2FXaa3G(SEQ ID NO：
22)的氨基酸序列的CDR2的人源化重链可变结构域，其中Xaa1是谷氨酰胺或脯氨酸，Xaa2是丝氨酸或赖氨酸，并且Xaa3是谷氨酰胺或赖氨酸，并且其中所述人源化重链可变结构域包括与选自下述的氨基酸序列具有至少90％等同的氨基酸序列的构架区FR1、FR2、FR3和FR4：
1)分别地SEQ ID NO：8(FR1)、9(FR2)、10(FR3)和11(FR4)的氨基酸序列；
2)分别地SEQ ID NO：12(FR1)、13(FR2)、14(FR3)和15(FR4)的氨基酸序列；和
3)分别地SEQ ID NO：12(FR1)、13(FR2)、16(FR3)和15(FR4)的氨基酸序列；
并且其中在FR1(SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：12)中位置29处的氨基酸是亮氨酸，并且在FR3(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16)中位置32处的氨基酸是苯丙氨酸；和
b)包括分别由SEQ ID NO：5(CDR1)、6(CDR2)和7(CDR3)的氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化轻链可变结构域，所述人源化轻链可变结构域包括分别与SEQ ID NO：17、18、19和20的氨基酸序列具有至少90％等同，或分别与SEQ ID NO：17、18、21和20的氨基酸序列具有至少90％等同的氨基酸序列的构架区FR5、FR6、FR7和FR8；
并且其中在FR7(SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21)中位置15处的氨基酸是酪氨酸。
16.根据权利要求15的抗体或抗体片段，其中SEQ ID NO：22的Xaa1、Xaa2和Xaa3选自：
a)Xaa1谷氨酰胺，Xaa2是赖氨酸，并且Xaa3是赖氨酸；
b)Xaa1是脯氨酸，Xaa2是丝氨酸，并且Xaa3是谷氨酰胺；和
c)Xaa1是谷氨酰胺，Xaa2是赖氨酸，并且Xaa3是谷氨酰胺。
17.根据权利要求15的抗体或抗体片段，其中在FR3(SEQ IDNO：14或SEQ ID NO：16)中位置8处的氨基酸是亮氨酸。
18.根据权利要求15-17中任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：
a)人IgG1恒定结构域；
b)人IgG2恒定结构域；
c)人IgG3恒定结构域；
d)人IgG4恒定结构域；
e)人IgM恒定结构域；
f)人IgE恒定结构域；和
g)人IgA恒定结构域。
19.根据权利要求15-18中任一项的抗体片段，其中所述片段选自：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
20.根据权利要求15-19中任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括PEG。
21.药物组合物，其包括权利要求15-20中任一项的抗体或抗体片段。
22.治疗哺乳动物中的炎症的方法，其包括施用与人IL-31结合的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括
a)包括分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2和3组成或分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、4和3组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化重链可变结构域；和
b)包括分别由SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化轻链可变结构域。
23.治疗哺乳动物中的瘙痒的方法，其包括施用与人IL-31结合的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括
a)包括分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2和3组成或分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、4和3组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化重链可变结构域；和
b)包括分别由SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化轻链可变结构域。
24.与人IL-31结合的经分离的抗体或抗体片段，其包括选自下述的人源化重链可变结构域和人源化轻链可变结构域：
a)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
b)与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
c)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
d)与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
e)与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
f)与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
g)与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
h)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
i)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
j)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
k)与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
l)与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
m)与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
n)与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
o)与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
p)与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；
q)包括SEQ ID NO：38的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；
r)包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列的人源化重链可变结构域和包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列的人源化轻链可变结构域；
s)与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
t)与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
u)与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
v)与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
w)与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
x)与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；
y)与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域；和
z)与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化重链可变结构域和与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的人源化轻链可变结构域。
25.根据权利要求24的抗体或抗体片段，其中所述抗体包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：
a)人IgG1恒定结构域；
b)人IgG2恒定结构域；
c)人IgG3恒定结构域；
d)人IgG4恒定结构域；
e)人IgM恒定结构域；
f)人IgE恒定结构域；和
g)人IgA恒定结构域。
26.根据权利要求24或25的抗体片段，其中所述片段选自：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
27.根据权利要求24-26中任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括PEG。
28.与人IL-31结合的抗体或抗体片段在制备用于治疗哺乳动物中的炎症的药物中的用途，其中所述抗体或抗体片段包括
a)包括分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2和3组成或分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、4和3组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化重链可变结构域；和
b)包括由SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化轻链可变结构域。
29.与人IL-31结合的抗体或抗体片段在制备用于治疗哺乳动物中的瘙痒的药物中的用途，其中所述抗体或抗体片段包括
a)包括分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2和3组成或分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、4和3组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化重链可变结构域；和
b)包括由SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列组成的CDR1、CDR2和CDR3的人源化轻链可变结构域。
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