CN103261224B - 用于肝癌治疗的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用抗前胃泌素抗体治疗肝癌和预防肝癌复发的方法，监测抗前胃泌素疗法对肝癌的治疗功效的方法，及其使用的组合物。

Description

用于肝癌治疗的方法和组合物

1.对相关申请的交叉参考

本申请根据35USC§119(e)条款要求2010年7月26日提交的临时申请号61/367,851和2011年4月15日提交的临时申请号61/476,204的优先权，将所述临时申请的全部内容完整并入本文作为参考。

2.对序列表、表或计算机程序的参考

本申请含有已经通过电子文件以ASCII格式提交的序列表。所述ASCII拷贝创建于2011年7月14日，命名为BR(005WO).txt并且大小为79,913字节。

3.发明领域

本公开涉及通过给具有肝癌或者处于肝癌复发风险中的受试者施用包含对前胃泌素特异的抗体的组合物，来治疗受试者的方法。

4.背景

肝癌是全世界第五最常见的癌症，并且是癌症相关死亡的第三最常见原因。Llovet等人，2003，“Hepatocellular carcinoma，”Lancet362：1907-17。肝癌的最常见形式是肝细胞癌（也称为HCC），并常常在其他潜在的肝损伤（通常为肝炎或肝硬化）的背景下产生。Thorgeirsson等人，2002，“Molecular pathogenesis of humanhepatocellular carcinoma”，Nature Genetics31：339-346。肝癌的其他较不常见形式包括肝母细胞瘤和胆管癌。

肝癌的标准治疗是手术切除（当可行时），当手术不可行时的化学疗法、化疗栓塞（chemoembolisation）或放射疗法。由于肿瘤大小或位置、晚期肝硬化（advanced cirrhosis），手术并非总是可行的，并且即便进行了手术，切除后5年仍有70%的病例出现了肿瘤复发/再发。参见Llovet等人，同上。在肝癌中，化学疗法也似乎具有降低的功效，可能是由于肝癌细胞增加了排出化学治疗剂的能力。因此，存在肝癌的更有效治疗的重要和急迫需求。

5.概述

胃泌素是肠肽激素，其刺激胃酸的分泌。在成体哺乳动物中，它主要由胃窦的G细胞产生，并且在某种程度上在小肠上部和胰脏中产生。参考图1，胃泌素基因被翻译成101个氨基酸的多肽，称作“前胃泌素原”，其包含信号序列（加下划线的），所述信号序列被切割，产生80个氨基酸的多肽：前胃泌素（“PG”）。主要发现了三种形式的胃泌素，G34、G17和G14（未显示），均产生自前胃泌素加工。

已经报道了，在一些肝癌组织样本中存在胃泌素的不完全加工形式，包括PG（参见，例如，Caplin等人，1999，“Expression andprocessing of gastrin in hepatocellular carcinoma,fibrolamellarcarcinoma and choangiocarcinoma，”J.Hepatol.30：519-526）。现在已经发现，可以将抗-前胃泌素方法用于监测、治疗和预防肝癌和/或其复发。如在本文中第一次阐明，胃泌素mRNA在肝癌干细胞中得到增加，并且抗前胃泌素抗体显著降低了肝癌细胞或分离的肝癌干细胞在低粘附生长条件下形成癌球或球状体的能力。尽管不是意在被任一操作理论所束缚，但相信具有结合前胃泌素（“PG”）并中和PG的生物学活性能力的抗前胃泌素抗体干扰了肝癌细胞（特别是肝肿瘤起始起始细胞）或癌干细胞的生长。认为所述抗前胃泌素抗体减小肝癌肿瘤大小和数目，并预防肝癌的复发。这些发现为治疗、预防肝癌和监测肝癌的治疗提供了新的工具。

因此，在一个方面，本公开提供了用于在动物，包括人类中治疗肝癌并预防肝癌复发的方法和组合物。如在下文中所详述，治疗方法涉及对经诊断有肝癌的受试者施用有效地提供治疗益处的量的特异性结合前胃泌素的抗体（“抗PG抗体”）。可以单独地（作为单一疗法）或者联合或者辅助其他治疗形式如肿瘤切除、放射疗法、化学疗法、使用其他抗体的治疗等来施用抗PG抗体。

当联合或者辅助肿瘤切除使用时，可以在去除肿瘤之前和/或之后施用抗PG抗体，并且可以在肿瘤去除后持续特定的一段时间，直到实现了血浆和/或血清前胃泌素水平低于特定的阈值或者直到在特定时期内实现了血浆和/或血清前胃泌素水平的降低。

当联合或者辅助化学疗法使用时，可以在化学疗法前、与化学疗法同时或者在化学疗法之后施用抗PG抗体。此外，可以在特定的时期内施用抗PG抗体，直到实现了血浆和/或血清前胃泌素水平低于指定的阈值水平或者直到实现了血浆和/或血清前胃泌素水平的降低或在特定时期内实现了降低。

本公开的组合物含有特异地结合PG并中和其生物学活性的至少一个抗PG抗体。任一抗PG抗体都可以用于本公开的方法，所述抗PG抗体包括但不限于，多克隆和单克隆抗PG抗体。可用于本文中所公开的治疗和预防方法的有用的抗PG抗体包括在下文的章节7.11中所述的那些抗体。优选地，抗PG抗体是对待治疗的物种的PG特异的抗体。例如，将抗人PG抗体施用给人类受试者。

适合用于本公开的方法的抗PG组合物可以包含可药用载体、赋形剂和/或稀释剂。可以将组合物配制用于如本文中所述的多种施用途径，并且该组合物包括适合于所选择的途径的载体、赋形剂和/或稀释剂。对于治疗目的，可以以单位剂量包装抗PG抗体以便于使用。可以将单位剂量包装到试剂盒中，所述试剂盒含有稀释剂和任选地使用说明。

在另一方面，本公开提供了监测抗PG治疗的功效的方法，该方法通过测量来自患有肝癌且用抗PG组合物治疗的个体的血液（血清、血浆或全血）样品中PG的浓度或水平，并将测量的PG水平与PG的基线水平比较而进行。基线可以是来自较早时间点（例如在治疗开始时）的血液样品中的PG水平。与基线水平比较的测量值可以来自在治疗期间或之后取得的样品。测量的PG水平低于基线水平指示治疗有效，并且测量的PG水平处于或者高于基线的PG水平指示缺少功效。

6.附图简述

图1提供了人前胃泌素原的氨基酸序列（SEQ ID NO:100）（其中信号肽序列处加下划线）、成熟人前胃泌素的氨基酸序列（SEQ IDNO:20）和前胃泌素加工的某些产物，包括G34（SEQ ID NO:102）、G34-Gly（SEQ ID NO:103）、G17（SEQ ID NO:104）、G17-Gly（SEQID NO:105）和CTFP（SEQ ID NO:106）的氨基酸序列。

图2提供了某些示例性鼠抗hPG单克隆抗体的可变轻链和可变重链的多核苷酸和氨基酸序列。在每一情况下，以粗体-加下划线文本显示三个CDR。具体而言；

图2A提供了鼠抗hPG MAb3的V_H链的多肽序列（SEQ IDNO:12）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:16）；

图2B提供了鼠抗hPG MAb3的V_L链的多肽序列（SEQ IDNO:13）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:17）；

图2C提供了鼠抗hPG MAb4的V_H链的多肽序列（SEQ IDNO:14）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:18）；

图2D提供了鼠抗hPG MAb4的V_L链的多肽序列（SEQ IDNO:15）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:19）；

图2E提供了鼠抗hPG MAb8的V_H链的多肽序列（SEQ IDNO:59）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:67）；

图2F提供了鼠抗hPG MAb8的V_L链的多肽序列（SEQ IDNO:63）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:71）；

图2G提供了鼠抗hPG MAb13的V_H链的多肽序列（SEQ IDNO:60）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:68）；

图2H提供了鼠抗hPG MAb13的V_L链的多肽序列（SEQ IDNO:64）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:72）；

图2I提供了鼠抗hPG MAb16的V_H链的多肽序列（SEQ IDNO:61）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:69）；

图2J提供了鼠抗hPG MAb16的V_L链的多肽序列（SEQ IDNO:65）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:73）；

图2K提供了鼠抗hPG MAb19的V_H链的多肽序列（SEQ IDNO:62）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:70）；和

图2L提供了鼠抗hPG MAb19的V_L链的多肽序列（SEQ IDNO:66）和编码它的多核苷酸序列（SEQ ID NO:74）。

图3提供了本文中所述的所选择的抗hPG单克隆抗体的人源化可变重链和轻链的计划的多肽序列。在每一情况下，以粗体-加下划线文本显示3个CDR。具体而言：

图3A提供了人源化MAb3的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQ IDNO:21）；

图3B提供了人源化MAb3的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQ IDNO:22）；

图3C提供了人源化MAb4的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQ IDNO:23）；

图3D提供了人源化MAb4的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQ IDNO:24）；

图3E提供了人源化MAb8(a)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:75）；

图3F提供了人源化MAb8(a)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:76）；

图3G提供了人源化MAb8(b)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:77）；

图3H提供了人源化MAb8(b)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:78）；

图3I提供了人源化MAb8(c)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:79）；

图3J提供了人源化MAb8(c)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:76）；

图3K提供了人源化MAb13(a)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:80）；

图3L提供了人源化MAb13(a)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:81）；

图3M提供了人源化MAb13(b)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:82）；

图3N提供了人源化MAb13(b)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:83）；

图3O提供了人源化MAb16(a)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:84）；

图3P提供了人源化MAb16(a)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:85）；

图3Q提供了人源化MAb16(b)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:86）；

图3R提供了人源化MAb16(b)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:87）；

图3S提供了人源化MAb16(c)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:88）；

图3T提供了人源化MAb16(c)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:89）；

图3U提供了人源化MAb19(a)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:90）；

图3V提供了人源化MAb19(a)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:91）；

图3W提供了人源化MAb19(b)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:92）；

图3X提供了人源化MAb19(b)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:93）；

图3Y提供了人源化MAb19(c)的V_H链的计划的氨基酸序列（SEQ ID NO:94）；

图3Z提供了人源化MAb19(c)的V_L链的计划的氨基酸序列（SEQID NO:95）；

图4提供了相对于收集自14名患肝癌（HCC）个体的健康肝组织中检测到的平均水平，肿瘤中GAST mRNA水平的柱状图。

图5A-B提供了相比于在结直肠癌细胞系SW480（已知具有增加的GAST表达）中观察到的水平，在三种肝癌细胞系-PLC/PRF/5（图5A）、Huh6（图5B）和Huh7（图5B）中GAST mRNA水平的柱状图。

图6A-B提供了与在Huh6或Huh7细胞的未经选择的库中观察到的水平相比，在低粘附培养条件下生长的Huh-6（图6A）和Huh-7（图6B）“侧群(side population)”（SP）细胞中GAST mRNA水平的柱状图。

图7提供了在低粘附培养条件下，在示例性抗PG单克隆抗体或对照抗体存在的情况下生长的PLC/PRL/5细胞每孔生长的球状体的数目的图。

图8提供了在低粘附生长条件下，在阿霉素和二甲基亚砜（DMSO）、单独的DMSO、示例性抗PG多克隆抗体或对照多克隆抗体存在的情况下生长的Huh6“侧群”（SP）细胞每孔生长的球状体的数目的图。

图9提供了在低粘附生长条件下，在阿霉素和二甲基亚砜（DMSO）、单独的DMSO、示例性抗PG多克隆抗体或对照多克隆抗体存在的情况下生长的Huh7“侧群”细胞每孔生长的球状体的数目的图。

图10提供了在低粘附生长条件下，在单独的培养基（“对照”）中或者在具有抗hPG MAb13或抗hPG MAb19的培养基中生长的Huh6细胞每孔生长的球状体的数目的图。

图11提供了在常规粘附条件下在单独的培养基（“对照”）中或者在具有抗hPG MAb8或抗hPG MAb13的培养基中生长之后，在低粘附生长条件下生长的Huh6细胞每孔生长的球状体的中位数的柱状图。

图12A-B提供了在低粘附生长条件下生长的Huh7细胞每孔生长的球状体的数目的图。图12A显示了在单独的培养基中生长的细胞（“对照”）与用抗h PG MAb13处理的细胞比较。图12B显示了用对照单克隆抗体（“对照MAb”）、抗hPG MAb13和抗hPG MAb16之一处理的细胞。

图13A-B提供了与对照单克隆抗体（“对照MAb”）相比，在具有抗hPG MAb8（图13A）或抗hPG MAb16（图13B）的常规粘附条件下生长后，在低粘附生长条件下生长的Huh7细胞每孔生长的球状体的数目的图。

图14提供了在具有单独的培养基（“对照”）或具有抗hPG MAb8或抗hPG MAb13的低粘附生长条件下生长的Huh7“侧群”细胞每孔生长的球状体的数目的图。

图15A-C提供了与对照单克隆抗体（“对照MAb”）相比，经用抗hPG MAb19（图15A）或抗hPG MAb13（图15B）或抗hPGMAb8和MAb13（图15C）处理的PLC/PRL/5细胞每孔生长的球状体的数目的图。

图16提供了在具有对照单克隆抗体（“CT MAb”）、抗hPG MAb8或抗hPG MAb16之一的常规粘附条件下生长后，在低粘附生长条件下生长的PLC/PRL/5细胞每孔生长的球状体的数目的图。

图17提供了在低粘附生长条件下，在单独的培养基（“对照”）中或者在用抗hPG MAb13或抗hPG MAb16的培养基中生长的PLC/PRL/5“侧群”细胞每孔生长的球状体的数目的图。

7.详述

7.1肝癌

肝癌包括肝细胞癌（HCC）、胆管癌和肝母细胞瘤。大多数肝癌为HCC，并且常常在患其他潜在的肝病理学，包括肝炎、肝硬化和/或黄曲酶毒素B1中毒的个体中出现，所述潜在的肝病理学引起肝的炎症和慢性损伤以及肝细胞的再生。肝癌的诊断目前基于超声波检查术、细针活组织检查和检测某些标记蛋白质（包括例如α-甲胎蛋白）的循环水平的组合。基于肿瘤大小、数目和形态学（例如，包囊性的或者侵入性的），以及肝功能，可以将HCC分类成早期、中期、晚期和末期癌。

肝癌的当前治疗包括肝移植、手术切除、经皮消融、化学疗法（包括化疗栓塞）、放射治疗、抗体治疗。由于患者的疾病的阶段和/或缺少可用的移植器官，尽管肝移植可以完全治愈肝癌，但肝移植对于大多数患者是不可用的。对于受乙型或丙型肝炎病毒感染的患者，以及患有酒精中毒的患者移植的可用性也是受限制的。手术切除和经皮消融（去除或者杀死癌组织的方法）可以具有较好的结果，但并非对全部患者可用。由于该方法伴随着器官衰竭的风险，如同肝硬化或者肝功能的其他损失一样，肿瘤位置或大小可能排除了手术切除。即使进行了肝切除，70%的病例在5年内也发生了肿瘤复发。经皮消融破坏赘生性细胞，且适合于具有小于3cm的一个肿瘤的个体，其不是手术切除的候选者。在癌症更晚期或者肝功能受损的个体中，标准治疗是在进行栓塞或者不进行栓塞（阻塞动脉，以截断对肿瘤的血液供应并诱导肿瘤死亡）的情况下的化学疗法和放射疗法。当前可用的治疗不足以处理可用于治疗受肝癌影响的大多数个体的有效治疗的需要。

7.2肝癌复发

复发是肝癌中的特别的问题。癌症复发通常理解为在治疗后和在不能检测到较早期癌症的一段时间后，癌症的恢复。对于肝癌复发的高比率，已经提供了多种解释，包括在手术操作期间没能去除全部癌细胞、经皮消融期间由于手术器械散布了癌细胞，以及对化学治疗剂的抗性。存在减少或者消除复发的肝癌治疗的需要。

7.3癌干细胞

实体瘤并非必定是同质组织。相反，一些肿瘤包含具有不同表型和功能性质的大量异常细胞类型。在这方面上，此类肿瘤类似于异常器官。当将实体瘤包含的细胞移植到相同宿主的新位点或者移植到相同或不同物种的新宿主时，在能起始新肿瘤形成的程度方面，所述细胞是不同的。具有此种性质的细胞称作肿瘤起始细胞或者癌起始细胞，或者备选地，肿瘤干细胞或癌干细胞。参见，例如，Chiba等人，2009，“Cancer stem cells in hepatocellular carcinoma：Recentprogress and perspective，”Cancer Letters286：145-153。当以比在免疫缺陷小鼠上形成肿瘤所需的未经选择的肝癌细胞库的数量更小的数量（1000个“侧群（side population）”肝癌细胞对比1百万个未经分选的肝癌细胞）移植到免疫缺陷小鼠中时，此类细胞能形成肿瘤，参见Chiba等人，同上。

通常，癌干细胞通过两种性质定义：自我更新的能力和能产生分化成非干细胞的子细胞的能力。自我更新指这样的能力，细胞经历细胞分裂，借此一个或两个子细胞都保持为未分化的，保留能产生具有与亲代细胞相似的的增殖能力的另一癌干细胞的能力。这种性质允许癌干细胞最终产生了包含生长肿瘤的大量细胞。癌干细胞还具有产生子细胞的能力，所述子细胞分化，产生许多实体瘤中发现的一系列分化程度更高的非干肿瘤细胞或主体（bulk）肿瘤细胞。因此，当移植时，甚至在多次连续移植后，癌干细胞也能重构其所起源的肿瘤的类型。此外，认为癌干细胞包含导致改变的增殖模式和/或低的凋亡率的基因突变和/或外遗传改变。

可以根据癌干细胞区别于主体肿瘤细胞的许多表型特征来鉴定癌干细胞。首先，如上提到的，当将癌干细胞移植到新的宿主中时，它们具有起始新的肿瘤的能力。相比较，主体肿瘤细胞或不能起始新的肿瘤，或需要比癌干细胞更多的细胞来形成新肿瘤。参见Chiba等人，2009，“Cancer stem cells in hepatocellular carcinoma：Recentprogress and perspective，”Cancer Letters286：145-153。

用于评估肿瘤或细胞系是否含有癌干细胞的方法是本领域技术人员熟知的。作为非限制性实例，如通过手术切除来分离疑似含有癌干细胞的肿瘤或其部分。然后，切碎肿瘤组织并用酶处理，或者一些其他处理，以有效解聚肿瘤并释放其组成细胞。备选地，当将细胞系进行分析时，可以仅需要用酶或者化学处理来分离细胞。或者，可以基于本文中所述的一种或多种表型，例如标记蛋白质的存在或者不存在或排除染料或者其他物质的能力来制备、选择细胞的亚群。可以将缺少标记谱、染料排除或者与癌干细胞相关的其他性质的细胞群制备为对照。

分离相关的细胞亚群后，然后将预定数目的此类细胞移植入到接受动物的一个或多个靶组织中。在一些实施方案中，接受动物是免疫缺陷小鼠，其包括但不限于裸鼠、具有重症联合免疫缺陷（SCID）的小鼠和非肥胖糖尿病SCID（NOD-SCID）小鼠。根据本领域普通技术人员的知识，还可以使用其他物种。

可以将细胞植入皮下或者植入到肝中。还可以把细胞植入到其他组织和器官中。在一些实施方案中，选择靶组织或器官，以复制分析中的肿瘤来源的组织或器官。然而，在其他实施方案中，选择不同的组织或器官以寄生所植入的细胞。

在使用普通技术人员熟知的技术植入细胞后，在一个时期中保持原状，然后评估动物，以确定新的肿瘤是否已经在植入的位点生长。对于皮下植入的细胞，可以通过目测和触诊植入位点来评估肿瘤生长。如果肿瘤是可探测的，那么可以使用卡尺按时间测量其大小。对于植入到内脏器官的细胞，可以在植入后的预定时间处死动物，来确定是否存在一个或多个肿瘤，如果存在肿瘤，那么测定此类肿瘤的数量和大小。备选地，根据普通技术人员的知识，可以使用非侵入性技术来评估肿瘤生长。

其次，还可以通过癌干细胞表达或不表达某些标记物来鉴定癌干细胞，而来自相同肿瘤的主体肿瘤细胞具有标记物表达的不同模式。在一些实施方案中，标记物表达的缺少指示了癌干细胞表型。此类标记物包括细胞内或者细胞表面上表达的蛋白质，并可以使用多种技术，包括但不限于免疫组织化学、免疫荧光和FACS分析来检测所述标记物。已经通过细胞表面标记物鉴定了肝癌干细胞。具有一个或多个细胞表面标记物，包括CD133、CD90和CD44的肝癌细胞似乎具有增加的肿瘤引发性质，并已经将所述肝癌细胞表征为肝癌干细胞。

第三，已经通过肝癌干细胞通过蛋白质转运蛋白排出染料和药物的能力来鉴定肝癌干细胞。基于通过ABC转运蛋白排出Hoechst33342染料的能力，已经鉴定了肿瘤引发的肝癌细胞。此类细胞可以通过将其暴露于荧光染料，并使用FACS分析将吸收此类染料的细胞与排出染料的那些细胞分离来鉴定。这些排出染料的癌细胞称为侧群（SP）细胞。少至1000个细胞的SP细胞都可以引发肿瘤（Chiba等人，2006“Side-population purified from hepatocellular carcinomacells harbors cancer stem cell-like properties”Hepatology44：240-251）。根据本领域普通技术人员的知识，用于检测肝癌干细胞的其他技术也是可以的。

除能在体内引发肿瘤的能力外（而主体肿瘤细胞不能在体内引发肿瘤或者在体内引发肿瘤的能力显著更低），与主体肿瘤细胞相比，癌干细胞还在无血清低粘附培养条件下显示出增加的生长能力，并且取决于癌症的类型，所述癌干细胞可以在低粘附培养条件下形成所谓的球状体。球状体是紧凑的细胞球，其随着以解聚的悬浮物形式接种的某些细胞在培养基中的随后生长而形成。当细胞在无血清培养基中生长时，通常在特定的生长因子（包括但不限于，表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF））的存在下，并且在具有哺乳动物细胞粘附差的表面的组织培养皿中时，此类球状体的形成是受促进的。相似于来自正常组织的干细胞，已经发现，在合适的培养条件下，癌干细胞优先生长为球状体。参见，例如，Rappa，G.，等人，Exp.Cell Res.，314：2110（2008）；Singh,S.K.，等人，Cancer Res.，63：5821（2003）；Fang，D.，等人，Cancer Res.，65：9328（2005）。用于在低粘附培养条件或者球状体生长条件下生长的球状体的测定法描述于下文的实施例中，并且也属于本领域技术人员的知识范围内。

7.4癌干细胞在肝癌复发中的作用

已经鉴定了具有对放射治疗剂和/或化学治疗剂显示出增强的抗性的癌干细胞性质的肿瘤细胞。Eyler，C.E.，等人，2008，J.Clin.Oncol.，26：2839-2845。癌干细胞对放射治法和化学治法的增加的抗性不仅降低了此类治疗的功效，而且甚至在肿瘤不再能检测到，并且在治疗已经成功后仍允许此类细胞存留。在此类患者中，治疗最初是有效的，在诊断扫描中引起了肿瘤的萎缩或消失，但肿瘤在治疗终止后一段时间再次出现。这又可以解释在以前进行了肝癌的治疗的个体中复发的现象。Eyler，同上。因此，可以在以前已经进行了肝癌的治疗的受试者（其中不再存在肝癌的病征）中，抑制肝癌干细胞的生长或者杀死肝癌干细胞来预防复发。

7.5抗PG抗体及其对肝癌干细胞的作用

如在下文实施例中所示，肝癌肿瘤和HCC细胞系显示出编码前胃泌素的胃泌素基因（GAST）的增加的表达。这种表达在两种不同肝癌细胞系中的“侧群”细胞（其具有肝癌干细胞的特征）中进一步提高。尽管不是意在被任一操作理论所束缚，认为治疗肝癌（原发性的或者复发性的）的一种方式是施用抑制肝癌干细胞的生长，以及优选地抑制肿瘤引发细胞形成肿瘤的能力的试剂。

申请人已经发现，抗前胃泌素抗体是此类试剂。如本文中所公开的，令人惊奇地发现，可以通过用特异地识别人前胃泌素（“hPG”）的抗体处理来抑制肝癌干细胞的生长。基于这些令人惊奇的结果，期望对具有含肝癌干细胞的癌症的患者施用在治疗上有效的量的抗hPG抗体，例如但并非以限制的方式通过降低此类细胞促进肝癌或其复发的能力来具有治疗益处。

相信本公开的抗PG抗体通过与前胃泌素结合，从而预防所述前胃泌素与癌干细胞上的其推定受体或甚至未知的受体相互作用，对抑制肝癌干细胞的生长是有效的。因此，阻止了前胃泌素（无论是通过癌干细胞自身产生还是通过健康组织产生）介导的其对此类细胞的生长促进生物学作用。因此，认为中和PG（正如本公开的抗PG抗体所做）阻断了PG与此类细胞上其受体的相互作用，并可能引起细胞死亡（可能是由于细胞凋亡的结果）和/或终止或减缓细胞分裂。抗PG抗体通过其他机制干预癌干细胞存活和/或生长也是可能的，并且所述机制并不意在限制本文中所公开的本发明的范围。可以使用技术人员已知的测定法，包括体外细胞生长抑制测定法如在下文实施例中所述的那些测定法，来测定抗PG抗体中和PG活性的能力。

7.6治疗肝癌的方法

本公开提供了通过施用具有治疗益处的有效量的抗前胃泌素（“抗PG”）抗体，在受试者中治疗肝癌的方法。根据本公开治疗肝癌的方法通过对具有肝癌的个体施用在以下章节7.11中所详述的能中和PG的一种或多种抗PG抗体来实现。可以将中和PG的任一抗体用于本公开的方法，所述抗体包括但不限于多克隆和单克隆（例如，嵌合的、人源化的、全人类、全长、Fab、单链）抗PG抗体。适合的抗PG抗体能在体外抑制肝癌细胞的生长。在一些实施方案中，抗PG抗体能抑制具有肿瘤起始性质的肝癌细胞在低粘附培养条件下的球状体的生长，所述具有肿瘤起始性质的肝癌细胞包括肝癌干细胞、具有选自CD133、CD44和CD90的一个或多个细胞表面标记的肝癌细胞，以及能输出Hoechst33342染料的肝癌细胞。

需要治疗肝癌的受试者是经诊断具有肝癌的个体。肝癌可以首次发生或者复发。合适的受试者包括具有增加的PG血液浓度的个体、通过其他方法不能治疗其肝癌的个体，如具有不宜手术的肿瘤的个体或者其他类型的治疗已经失败的个体，以及接受了肝癌的其他治疗（包括手术切除、化学疗法、化疗栓塞、放射疗法或者用非本公开的抗PG抗体的抗体进行的抗体治疗）的个体。合适的受试者还包括以前进行了肝癌治疗，缓解一段时间后，已经复发肝癌的个体。肝癌可以处于进程的任一阶段。受试者可以是人类或者非人类，包括驯养动物或者非驯养动物。

抗PG治疗可以单独地（作为单一疗法）或者联合或者辅助于肝癌的一种或多种其他治疗施用。如本文中所述，其他治疗包括但不限于，手术切除和用第二治疗剂，如化学治疗剂、辐射剂或如本文描述的抗体的治疗。如本文中所提供的联合治疗涉及将至少两种治疗施用于患者，其中一种是用至少一种抗PG抗体进行的抗PG治疗，并且另一种是用治疗剂或治疗方法进行的治疗。

抗PG治疗可以与手术方法，例如手术切除或经皮消融联合。可以将抗PG抗体施用给患原发性或者复发性肝癌的受试者，与手术切除或者经皮消融肝的受影响部分联合。可以在手术切除之前、同时或者之后起始抗PG治疗。

抗PG治疗可以与放射疗法联合。放射疗法是使用来自x射线、伽马射线、中子、质子和其他来源的高能辐射来杀死癌细胞并使肿瘤萎缩。辐射可以来自机体外的机器（外线术放射疗法）或者其可以来自放置于机体中癌细胞附近的放射性物质（内照射治疗或近距离放射治疗）。例如，已经通过用¹³¹I进行的内照射治疗肝癌。全身放射治疗使用在整个机体的血液至组织中行进的放射性物质，例如经放射性标记的单克隆抗体。还可以将放射疗法称为辐射和放射疗法。其他放射疗法包括三维适形放射疗法（3D-CRT）和调强放射疗法（IMRT）。其他放射疗法也是可以的。

还可以将抗PG抗体治疗与化学治疗剂联合。化学治疗是使用杀死（细胞毒性的或杀细胞的）癌细胞或者阻止癌细胞生长（细胞生长抑制的）的小分子药物。对于肝癌，通常将化学治疗剂与栓塞治疗联合，例如，如将用于栓塞的明胶与作为化学治疗剂的阿霉素、丝裂霉素或顺铂联合。化学治疗剂包括但不限于，毒素（也称为细胞毒素或者细胞毒性剂），其包括对细胞的生存力有害的任一试剂、含有化学治疗化合物的试剂和脂质体或者其他运载体（vesicle）。合适的化学治疗剂的实例包括但不限于1-去氢睾酮、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、放线菌素D、阿霉素、阿地白介素、烷化剂、别嘌醇钠、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、安曲霉素（AMC）、抗有丝分裂剂、顺二氯二氨铂（II）（DDP）顺铂）、双氨双氯铂、蒽环类、抗生素、抗代谢药、天冬酰胺酶、活的BCG（膀胱内的）、倍他米松磷酸钠和醋酸倍他米松、比卡鲁胺、硫酸博来霉素、白消安、calcium leucouorin、卡奇霉素、卡培他滨、卡铂、罗氮芥（CCNU）、卡莫司汀（BSNU）、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、秋水仙碱、共轭雌激素类、环磷酰胺、Cyclothosphamide、阿糖胞苷、细胞松弛素B、环磷酰胺、达卡巴嗪、放线菌素D、更生霉素（以前的放线菌素）、盐酸柔红霉素、柠檬酸柔红霉素、地尼白介素2、右雷佐生、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌素二酮、多西他赛、甲磺酸多拉司琼、盐酸阿霉素、屈大麻酚、大肠杆菌天冬酰胺酶、依米丁、红细胞生成素-α、欧文氏菌属L-天冬酰胺酶、酯化雌激素、雌二醇、雌氮芥磷酸钠、溴化乙锭、炔雌醇、羟乙磷酸、etoposide citrororum factor、磷酸依托泊苷、非格司亭、氟尿苷、氟康唑、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、亚叶酸、盐酸吉西他滨、糖皮质激素、醋酸性瑞林、短杆菌肽D、盐酸格拉司琼、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、干扰素α-2b、盐酸伊立替康、来曲唑、亚叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、盐酸左旋咪唑、利多卡因、罗氮芥、美登醇、盐酸氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、甲睾酮、光辉霉素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、醋酸奥曲肽、盐酸昂丹司琼、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸二钠、喷司他丁、盐酸毛果芸香碱、霉菌素（plimycin）、聚苯丙生20和卡莫司汀植入植物物、卟吩姆钠、普鲁卡因、盐酸丙卡巴肼、普萘洛尔、利妥昔单抗、沙格司亭、索拉非尼、链脲霉素、他莫昔芬、泰素、喃氟啶、替尼泊苷、tenoposide、睾内脂、丁卡因、噻替派、苯丁酸氮芥、硫鸟嘌呤、噻替派、盐酸拓扑特肯、枸橼酸托瑞米芬、曲妥单抗、维甲酸、戊柔比星、硫酸长春碱、硫酸长春新碱和酒石酸长春瑞滨。

还可以将抗PG抗体与化学治疗剂联合一起施用。化学治疗剂的示例性联合包括5-氟尿嘧啶（5FU）与甲酰四氢叶酸（亚叶酸或LV）联合；卡培他滨与尿嘧啶（UFT）和亚叶酸联合；喃氟啶与尿嘧啶（UFT）以及甲酰四氢叶酸联合；奥沙利铂与5FU联合或者与卡培他滨联合；伊立替康与卡培他滨联合；丝裂霉素C与5FU、伊立替康或卡培他滨联合。本文中所公开的化学治疗剂的其他联合的使用也是可能的。

可以将用于具有肝癌的患者的化学治疗剂的标准给药方案用于本公开的方法。如在相关技术领域中所已知，已经在临床试验中标准化了使用不同化学治疗剂的联合进行的肝癌的化学治疗方案。参见Llovet等人，上文，对使用化学治疗剂的临床试验的概述。

还可以将抗PG抗体与其他抗体联合使用，所述抗体包括但不限于，直接地或间接地杀死癌细胞、减缓或阻止癌细胞生长的单克隆抗体。此类抗体可以通过多种不同的机制起作用。例如，某些抗体可以标记癌细胞，以使其受到通过患者免疫系统经抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）或其他机制的攻击。相信结合B细胞上发现的CD20抗原的利妥昔单抗和结合17-1A抗原的依决洛单抗可以以该方式起作用。其他抗体与癌细胞存活或生长所需的抗原结合并改变或抑制所述抗原的功能。相信许多抗体都以这种方式起作用，所述抗体包括例如，都与EGF受体（EGFR）结合的西妥昔单抗和帕尼单抗（panitumumab,）；以及与生长因子VEGF结合的贝伐单抗其他机制也是可能的，并且特定的抗体可能能够通过一种或多种作用机制起作用。然而，其他抗体还可以与放射性或化学毒性部分缀合，并将它们靶向优先表达所述抗体特异地识别的抗原的癌细胞。

可以同时地、连续地或者单独地施用抗PG抗体和第二种试剂。如本文中所用，例如在相同的患者就诊（same patient visit）期间，如果在同一天将抗PG抗体和第二种试剂施用给患者，那么认为它们被连续地施用。连续施用可以相隔1、2、3、4、5、6、7或8小时发生。相反，如果不在同一天将抗PG抗体和第二种试剂施用于患者，那么认为它们被分别地施用，例如，可以以1天、2天或3天、一周、2周或者每月一次的间隔施用抗PG抗体和第二种治疗剂。在本公开的方法中，本公开的抗PG抗体的施用可以先于或者后于第二种试剂施用。作为非限制性实例，可以同时施用抗PG抗体和第二种试剂一段时间，紧接着第二段时间内交替施用抗PG抗体和第二种试剂。

7.7预防肝癌复发的方法

在另一方面，本公开提供了预防肝癌复发的方法，其包括对需要预防的受试者施用有效量的抗PG抗体。根据本公开，预防肝癌复发的方法通过对处于肝癌复发风险的个体施用能中和PG的一种或多种抗PG抗体（详述于下文章节7.11中）实现。

需要预防肝癌复发的受试者是以前进行了肝癌治疗的个体，所述个体处于肝癌复发的风险中，但还没有被再次诊断为肝癌。合适的受试者包括以前通过各种方法，包括手术切除、化学疗法或任意其他治疗进行了肝癌治疗的个体。

肝癌复发的有效预防包括但不限于，完全没有肝癌复发和进行性肝癌复发不存在。在一些实施方案中，通过从处于肝癌复发风险的受试者获得的肝癌肿瘤或肝癌干细胞的缺乏，来测量有效预防。在一些实施方案中，通过在处于肝癌复发风险的受试者中缺少PG的血液浓度的增加，来测定有效预防。

抗PG治疗可以单独地（作为单一疗法）或者联合或辅助于一种或多种其他治疗施用。其他治疗包括但不限于，手术切除，以及用第二种治疗剂，例如如本文中所述的化学治疗剂、放射治疗剂或抗体进行的治疗。如本文中所提供的联合治疗涉及将至少两种治疗施用于患者，其中一种为用至少一种抗PG抗体进行的抗PG治疗，并且另一种为用治疗剂或治疗方法进行的治疗。

可以同时地、连续地或者单独地施用抗PG抗体和第二种试剂。如本文中所用，例如在相同的患者就诊期间，如果在同一天将抗PG抗体和第二种试剂施用于患者，那么认为它们被连续地施用。连续施用可以相隔1、2、3、4、5、6、7或8小时发生。相反，如果不在同一天将抗PG抗体和第二种试剂施用于患者，那么认为它们被分别地施用，例如，可以以1天、2天或3天、一周、2周或者一月的间隔施用抗PG抗体和第二种治疗剂。在本公开的方法中，本公开的抗PG抗体的施用可以先于或者后于第二种试剂的施用。作为限制性实例，可以同时施用抗PG抗体和第二种试剂一段时间，紧接着第二段时间内交替施用抗-PG抗体和第二试剂。

7.8药物组合物

可以将用于本公开的方法中的抗PG抗体配制到组合物中。任选地，该组合物可以包含一种或以上额外的试剂，例如上述的第二种试剂。通常将组合物提供为药物组合物的部分，所述药物组合物是无菌的并且通常包含可药用载体。这种药物组合物可以是任一合适的形式（取决于将它施用于个体的所希望的方法）。

可以通过多种途径将抗-PG抗体施用于个体，所述途径为例如经口地、经皮肤地、皮下地、鼻内地、静脉内地、动脉内地、肌内地、眼内地、局部地、鞘内地和脑室内地施用。在任一给定的情况下的施用，最合适的途径将取决于特定的抗体、受试者，以及疾病的性质和严重性和受试者的身体状况。可以将抗体配制成水溶液，并通过皮下注射施用。用于本公开的可药用载体可以采取多种形式，其取决于例如待治疗的病症或施用的途径。

药物组合物可以以单位剂量形式方便地存在，所述单位剂量形式的每一剂量含有抗PG抗体的的预定量。这种单位可以含有例如每一单位剂量5mg至5g，例如10mg至1g或者20至50mg的抗-PG抗体。药物组合物可以包含能结合一种以上PG表位的抗-PG抗体。备选地，药物组合物可以包含抗-PG抗体的组合，每一抗PG抗体能结合不同的PG表位。

可以通过混合具有所希望程度的纯度的抗体与本领域通常使用的任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂（在本文中全部都称为“载体”），即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型去污剂、抗氧化剂和其他的多种添加剂，将本公开的药物组合物，制备成用于贮存的冻干的制剂或者水溶液。参见例如，Remington’s PharmaceuticalSciences，第16版（Osol，编著1980）。此类添加剂在所使用的剂量和浓度下，必须是对接受者无毒的。

缓冲剂帮助维持pH在近似生理条件的范围内。它们可以以从约2mM至约50mM的浓度存在。用于本公开的合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，如柠檬酸盐缓冲液（例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等）、琥珀酸盐缓冲液（例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等）、酒石酸盐缓冲液（例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等）、延胡索酸盐缓冲液（例如，延胡索酸-延胡索酸单钠混合物，延胡索酸-延胡索酸二钠混合物，延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等）、葡糖酸盐缓冲液（例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等）、草酸盐缓冲液（例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等）、乳酸盐缓冲液（例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等）和乙酸盐缓冲液（例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等）。此外，可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐如Tris。

可以加入防腐剂，以减缓微生物生长，并且可以以0.2%-1%（w/v）的量加入。用于本公开的合适的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八基二甲基苄基氯化铵、苯扎胺（benzalconium）的卤化物（例如，氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六甲双铵和对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇以及3-戊醇。可以加入等渗剂（有时称为“稳定剂”），以确保本公开的液体组合物的等渗性，并且所述等渗剂包括多羟基糖醇，例如三羟基或更高羟基的糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。稳定剂指的是一大类的赋形剂，其在功能上可以是填充剂或者是溶解治疗剂或者帮助防止变性或附着到容器壁上的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟糖醇（上文所列举的）；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌糖醇（myoinisitol）、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇，如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽（例如，10个残基或更少残基的肽）；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖，如棉子糖；以及多糖如葡聚糖。稳定剂可以以活性蛋白质每份重量的0.1至10000重量存在。

可以加入非离子表面活性剂或去污剂（也称为“润湿剂”），以帮助溶解治疗剂，以及保护治疗蛋白质免于搅拌引起的聚集，所述表面活性剂或者去污剂还允许制剂暴露于剪切表面应力（shear surfacestressed）而不会引起蛋白质的变性。合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯（20、80等）、polyoxamer（184、188等）、普流罗尼克多元醇（Pluronic polyol）、聚氧乙烯山梨聚糖单醚（polyoxyethylene sorbitan monoether）（ 等）。非离子型表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml存在。

其他多种赋形剂包括填充剂（例如，淀粉）、螯合剂（例如，EDTA）、抗氧化剂（例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E）和共溶剂。

可以单独地（作为一种或多种抗PG抗体的混合物）、与用于治疗肝癌的其他试剂混合或联合施用抗PG抗体。上文提供了合适的联合和辅助治疗的实例。

7.9有效剂量

本公开的抗PG抗体或其组合物将通常以有效实现预期结果的量使用，例如，在患肝癌的受试者中有效治疗肝癌的量或者在处于肝癌复发风险的受试者中有效预防复发的量。有效量是赋予治疗益处的量。

在治疗肝癌的方法的情况下，治疗益处指的是部分或完全治疗肝癌的任何趋势。治疗益处可以通过以下任一现象（单独地或联合地）证明：肝肿瘤减小的大小、数目或形态（例如包囊性的对侵入性的）；消除肝肿瘤；降低肝癌的严重性；诱导肝癌的缓解；中止或者延迟与肝癌相关的症状和病征的恶化；增加患者舒适度、减少患者痛苦；减少或者消除侧群细胞、具有一个或多个细胞表面标记CD133、CD44或CD90的肝癌细胞或者肝癌干细胞的数目；降低患肝癌的受试者中PG的血液浓度。可以使用多种扫描技术，如但不限于，CT、MRI、功能性MRI、SPECT和PET，以及本领域普通技术人员已知的其他方法测量肿瘤大小、数目和代谢。尽管是所希望的，但对于治疗益处，并不必须存在完全治愈。

在预防肝癌复发的情况下，治疗益处指的是在已经不能检测到癌症后的一段时间，在受试者中部分或完全预防癌症的再出现或者再生长的任何趋势。治疗益处可以通过以下任一现象（单独地或联合地）证明：维持肝癌的缓解；增加受试者的预期寿命；延迟肝肿瘤的生长；抑制肝癌干细胞、侧群细胞或具有一种或多种细胞表面标记CD133、CD44或CD90的肝癌细胞的生长；减少或消除侧群细胞或具有一种或多种细胞表面标记CD133、CD44或CD90的肝癌细胞或肝癌干细胞的数目。

在一些情况下，根据本领域技术人员的知识，治疗益处可以与一个或多个替代终点相关。通过实例但不作为限制，可以在受试者中随时间测量血浆和/或血清PG浓度，PG水平的降低或者低于阈值水平，例如低于约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM或5pM的水平指示具有治疗益处。

在其他实施方案中，可以通过抗PG抗体组合物杀死癌干细胞、抑制癌干细胞生长或增殖或者增加癌干细胞凋亡的能力，来测定所述抗PG抗体组合物的治疗益处。如在本公开中其他地方所讨论，肝癌干细胞可以被鉴定为具有一个或多个与癌干细胞相关的表型特征，其包括但不限于，某些细胞标记的表达、在低粘附培养条件下能生长成球状体，以及能在移植后引发新的肿瘤生长。

实现治疗效果不需要结合全部游离的PG。游离的PG指的是可以被抗PG抗体结合的PG。在一定程度上，将肿瘤、全身，特别是体液或者其他地方中游离PG的浓度降低至更有限的程度也可以是有效的。其中可以通过本文中所述的抗PG抗体组合物的施用降低游离PG浓度的示例性组织和体液包括但不限于，取自患者的癌活组织检检样本、腹水、来自胸腔积液的液体、脑脊液、淋巴液、血液、血浆、血清和其他的组织。可以使用ELISA技术或者本领域技术人员熟悉的其他技术定量这些组织或体液中的一种或多种中的PG浓度。

根据本领域普通技术人员的知识，可以滴定患者中的抗PG抗体的剂量，以便在施用后，在预定时间将目的组织或体液中游离PG浓度降低至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%或约5%-10%、约10%-15%、约15%-20%、约20%-25%、约25%-30%、约30%-35%、约35%-40%、约40%-45%、约45%-50%、约50%-55%、约55%-60%、约60%-65%、约65%-70%、约70%-75%、约75%-80%、约80%-85%、约85%-90%或约90%-95%，或者游离PG浓度的百分数的降低在任一前述值之间。

可以以有效剂量将包含抗PG抗体的组合物施用于个体（例如，人类受试者）。施用的抗PG抗体的量将取决于多种因素，包括待治疗的患者的体量和体重、施用的形式、途径和位点、治疗方案（例如，是否使用第二种治疗剂）、待治疗的特定受试者的年龄和身体状况、个体对抗PG抗体的敏感度。本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量。最终，医师将确定待使用的合适剂量。可以通常适当地重复这种剂量。根据正常的临床实践，如果发生了副作用，那么可以改变或减少剂量的量和/或频率。通过使用本领域技术人员已知的常规技术监测治疗的进程可以确定合适的剂量和治疗方案。

最初可以从体外测定估计有效剂量。例如，可以配制用于动物的起始剂量，以实现抗PG抗体的循环血液或血清浓度，所述抗PG抗体的循环血液或血清浓度处于或高于如在体外所测量的抗体对前胃泌素的结合亲和力。考虑特定抗体的生物利用率，计算可以实现这种循环血液或血清浓度的剂量在本领域技术人员的能力之内。为了指导，读者参见Fingl&Woodbury，“General Principles”in Goodmanand Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics，第一章，最新版，Pagamonon Press，并且在此引用该参考。

可以从体内数据，例如从动物模型中估计起始剂量。用于测试治疗肝癌的化合物的功效和安全性的动物模型是本领域已知的，所述动物模型如但不限于，小鼠和其他动物中人肝细胞癌细胞的异种移植。本领域普通技术人员可以常规地修改这种信息以确定适合于人施用的剂量。

在具体的实施方案中，可以通过在治疗之前几天至几周测量个体的血清或血浆PG浓度几次，并计算将饱和的（即，将足够结合全部PG的量）抗PG抗体的量，可以确定用于个体受试者的静脉内剂量。本领域技术人员将理解，实现对PG的给定的血清或血浆浓度饱和所需的任一特定抗体的量将部分地取决于特定抗体的亲和常数。已知用于计算目的特异抗PG抗体的饱和量的方法。

为了确保饱和，可以施用大于计算的饱和量的量，例如，可以施用比计算的饱和量大至少2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-或者甚至10-倍的量。如本领域已知的，对于除了静脉内以外的施用模式，可以基于药物代谢动力学和生物利用率调整该量。

每单次（例如，快速浓注）施用、多次施用或者连续（例如，灌输）施用本公开抗PG抗体的有效剂量可以从约0.001至约250mg/kg，或者每单次施用、多次施用或连续施用直到实现0.01-5000μg/ml的血清浓度，或者其中施用的任何有效范围或者值取决于待治疗的病症、施用的途径以及受试者的年龄、体重和状况。在某些实施方案中，每次剂量可以从约0.1mg/kg至约0.5mg/kg；约0.25mg/kg至约0.75mg/kg；约0.5mg/kg至约1mg/kg；约1mg/kg至约2mg/kg；约1.5mg/kg至约2.5mg/kg；约2mg/kg至约3mg/kg；约2.5mg/kg至约3.5mg/kg；约3mg/kg至约4mg/kg；约3.5mg/kg至约4.5mg/kg；约4mg/kg至约5mg/kg；约5mg/kg至约7mg/kg；约6mg/kg至约8mg/kg；约7mg/kg至约9mg/kg；约8mg/kg至约10mg/kg；约10mg/kg至约15mg/kg；约12.5mg/kg至约17.5mg/kg；约15mg/kg至约20mg/kg；约17.5mg/kg至约22.5mg/kg；约20mg/kg至约25mg/kg；约22.5mg/kg至约27.5mg/kg；约25mg/kg至约30mg/kg；约30mg/kg至约40mg/kg；约35mg/kg至约45mg/kg；约40mg/kg至约50mg/kg；约45mg/kg至约55mg/kg；约50mg/kg至约60mg/kg；约55mg/kg至约65mg/kg；约60mg/kg至约70mg/kg；约65mg/kg至约75mg/kg。其他的剂量范围也是可能的。

施用的量、频率和持续时间将取决于多种因素，如个体的年龄、体重和疾病状况。具有肝癌，包括HCC和肝母细胞瘤（原发性或复发性）的受试者指示需要抗PG治疗。处于肝癌的任一阶段，并且尤其在移植或手术切除不可用或者不当的个体中指示需要治疗。

实施的治疗方案可以持续1天或以上、2天或以上、3天或以上、4天或以上、5天或以上、6天或以上、1周或以上、2周至长期，2周至6个月、3个月至5年、6个月至1或2年、8个月至18个月等。任选地，该治疗方案提供了重复施用，例如，每日一次、每日两次、每两天、每三天、每五天、每一周、每两周或每个月一次。可以以相同的剂量或者以不同的剂量重复施用。可以重复施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或者以上。可以将抗PG抗体的治疗有效量作为单次剂量施用或者在治疗方案的疗程中施用，例如在一周、两周、三周、一个月、三个月、六个月、一年或更长的时期内施用。

7.10监测治疗功效的方法

本公开还提供了监测用抗PG抗体治疗的受试者以确定治疗是否有效的方法。可以测量接受抗PG治疗的患者中的PG的水平，并基于测量水平是否高于或低于基线PG水平，将所述测量水平用作治疗是否有效的指标。参见，例如，2010年1月8日提交的，题目为“PROGASTRIN AND LIVER PATHOLOGIES”的美国临时专利申请号No.61/293,557和2011年1月4日提交的，题目为“PROGASTRIN AND LIVERPATHOLOGIES”的美国专利申请号12/984,507，将所述每一专利申请全部并入本文作为参考。这些信息可以被医疗服务人员使用，以确定是否继续施用抗PG抗体或者调整治疗。如上所述，这些方法可以用于监测抗PG治疗（单独地或者与其他治疗组合使用的抗PG治疗）。

对于监测治疗功效的目的，可以在特定的时间点测量血液、血浆或血清PG水平。浓度随时间而降低和/或在特定的时间点，测量的水平低于阈值，指示具有功效。阈值可以为上文讨论的值或者为受试者特异的值，所述值在治疗起始之前或者在一轮治疗期间早期的某一点从经治疗的受试者获得。

不期望被任一特定的操作理论所束缚，相信由于一轮治疗减少了患者中肿瘤的数目和/或大小，所以由肿瘤所产生的PG的总量也降低了。相反，一轮治疗完成后，PG水平没有实质的改变或者上升，可以指示治疗无效。医疗服务人员可以使用这些信息，以决定是否应当开始新一轮的治疗。

使用本领域普通技术人员熟悉的技术，如但不限于RIA和ELISA可以测量PG水平。在后面的章节中描述了用于测量人类受试者的PG水平的抗-hPG抗体。用于测量PG水平的测定法的实例描述于美国临时专利申请号61/293,557，上文，实施例1-2中。

在具体的实施方案中，可以使用具有靶向前胃泌素的N-末端的一种抗-PG抗体和靶向前胃泌素的C-末端的第二种抗PG抗体的夹层ELISA，来测量PG水平。用于这种夹层测定的示例性N-末端和C-末端抗PG抗体描述于后面的章节中。在这种测定法中，准备一种表面，如96孔板的孔以结合已知量的第一种“捕获”的N-末端或C-末端抗-PG抗体。然后将测试样品应用于该表面上，之后是孵育期。然后洗涤该表面，并应用含有第二种“检测”的抗-PG抗体的溶液，其中所述检测抗体结合PG的不同表位（例如，如果捕获抗体是C-末端抗PG抗体，那么将N-末端抗PG抗体用作检测抗体，反之亦然）。然后直接地（例如，如果检测抗体与可检测的标记缀合）或者间接地（通过结合检测抗PG抗体的经标记的第二抗体）测量PG水平。为了这种测定，应当过量使用抗体，以使全部PG都被结合并量化。用于测量血浆和/或血清PG水平的具体的夹层测定法提供于实施例1中。

可以以不同间隔进行多次测量，并然后作图，以确定是否存在一种趋势。在一些实施方案中，血液中PG浓度的时间依赖性降低指示对肝癌的治疗是有效的。在非限制性实例中，当患者接受抗PG抗体的同时，可以以每周、每月或者每年的间隔测定PG水平。其他的间隔也是可能的。

在涉及使用抗PG抗体进行的一轮治疗的实施方案中，在疗程期间也可以进行一次或多次测量，以便可以估计抗体对PG水平的效应。在其他此类实施方案中，当取样期间，患者中还存在剩余的抗PG抗体，由于抗体隔离了PG，所以该数据可以显示出PG水平的降低，随着这种效应减退，接着PG水平升高，如果治疗有效，随后PG水平降低。在另一个实施方案中，在估计已经从患者中清除了抗PG抗体后，进行治疗后测量，以使此类抗体对PG的结合不会影响PG浓度测量的准确性。

在本方法的一些实施方案中，可以测量接受了抗PG抗体治疗的受试者的一种或多种体液（例如全血、血浆、血清）中的PG水平，并然后将其与基线水平比较。通常，PG水平为样品中PG的浓度，以摩尔的（M）量或摩尔/升（摩尔/升）表示。高于基线的PG水平指示治疗无效。相反，等于或低于基线水平的PG水平指示治疗有效。

可以使用不同的基线来与患者中检测到的PG水平比较。基线水平可以是单个数值或者数值范围。基线可以基于取自患者的一次或多次测量结果或者基于来自个体的群体的样品的PG的测量结果。在本方法的一些实施方案中，基线是在一个或者多个间隔（例如在抗PG治疗起始之前，在治疗的疗程期间或者已经终止治疗后）从相同患者取得的。在一些实施方案中，基线可以是个体群体的平均PG水平，所述个体具有与经历监测的个体的那些特征相似的特征。此类特征可以包括但不必要限于性别、年龄、肝癌的类型和阶段、手术史、抗PG治疗或者其他治疗。在一些实施方案中，基线是特定的PG水平，如约50pM、约40pM、约30pM、约20pM、约10pM、约5pM、约2pM、约1pM或者甚至更低。在一些实施方案中，基线是一个范围。

在其他实施方案中，基线可以建立自患者群体的平均PG水平，所述患者具有与经历监测的患者的那些特征相似的特征。此类特征可以包括但不必要限于性别、年龄、原发性癌类型、暴露于某些类型的治疗、这些特征的任一联合，以及其它的特征。在其他的实施方案中，可以将一种以上的基线用于监测特定的患者。例如，可以使用患者特异的基线以及群体来源的基线。

在一些实施方案中，当相对于患者所比较的相关群体而言，以前经治疗的癌症患者的平均PG浓度在相关群体的正常范围内，并且保持稳定，该患者应当被评分为没有复发，因此不需要新的治疗。相反，当发现在以前经治疗的癌症患者中的PG浓度在一段时期内上升，并且在某些实施方案中，超过了来源于群体数据的阈值，该患者可以被评分为可能复发，并因此被作为针对癌症复发的新治疗的候选者。

因为进食通常增加胃泌素的合成和分泌，它也可以引起血液PG水平的瞬时升高，其可以干扰被监测患者中PG水平的准确测量。为了避免这种影响，特别地当将要测定血液样品中PG浓度时，样品可以取自禁食后或者进餐后足够长时间后的患者，以使对PG浓度的任一瞬时影响都已经消失。

7.11抗PG抗体

用于本文所公开的方法的抗体是在胃泌素基因的其他产物中特异地结合前胃泌素的那些抗体。参考图1，胃泌素基因被翻译成101个氨基酸的多肽，称为前胃泌素原，其含有信号序列（下划线），信号序列被切割，产生前胃泌素，一种80个氨基酸的多肽。依次地，前胃泌素被切割以产生34个氨基酸的产物，其在序列上相应于前胃泌素的残基38-71，然后所述34个氨基酸的产物在其羧基末端用甘氨酸残基延伸，产生甘氨酸延伸的G34（“G34-Gly”）。这种切割的副产物是6个氨基酸的肽，称为C-末端侧翼肽或CTFP，其在序列上相应于前胃泌素的残基75-80。然后G34-Gly被进一步切割以产生在序列中相应于前胃泌素的残基55到71的17个残基的多肽，并被称为G17-Gly。去除G34-Gly和G17-Gly的C-末端甘氨酸，接着C-末端酰胺化，分别产生G34和G17，它们都被C-末端酰胺化。

如本文中所用，如果抗体与全长的前胃泌素结合，但是根本不结合CTFP、酰胺化胃泌素或者甘氨酸延伸的胃泌素，那么所述抗体对hPG是“高度特异的”或者“高度特异地结合”hPG，并且如果抗体显示与hPG结合比与CTFP以及胃泌素基因的其他产物结合至少强约5-倍（如在标准结合测定法中测量），那么其是“对hPG特异”或者“特异地结合”hPG。在实施例2中提供了可以用于评估特定的抗-hPG抗体的特异性的具体的ELISA测定法。

这种高度特异的和/或特异的抗-hPG抗体（在本文中称为“抗hPG的抗体”）可以是多克隆的(“抗-hPG PAb”)或者单克隆的(“抗-hPGMAb”)，尽管对于治疗应用和在某些情况下，诊断或者其他的体外应用，单克隆抗体是优选的。

抗hPG抗体结合的表位不是关键的。有用的抗hPG抗体可以结合hPG的N-末端区域、hPG的C-末端区域或者hPG的不同区域。最近，已经发现，至少对于单克隆抗hPG抗体，用于产生抗hPG抗体的抗原的选择是重要的（参见，在2010年10月15日提交的国际申请号PCT/EP2010/006329和在2010年10月15日提交的美国申请号12/906,041，将所述国际申请和美国申请的公开和具体公开的抗hPG抗体并入本文作为参考；在下文中其分别称为‘329和‘041申请）。如在‘329和‘041申请中所公开的，并非来源于hPG的所有抗原都刺激产生在生理条件下特异地结合hPG的单克隆抗体。事实上，已经用于成功产生多克隆抗hPG抗体的某些抗原未能产生单克隆抗体，如全长重组hPG（参见，例如，Singh的WO08/076454）和相应于hPG的C-末端的最后十个氨基酸的肽（参见Hollande等人的WO07/135542）。如在‘329和‘041申请中所指出的，已经鉴定了在hPG序列内的抗原性N-末端和C-末端的序列，其可以用于产生特异结合hPG的单克隆抗体。有趣的是，抗原序列并不必限于对hPG序列独特的hPG序列区。具有与胃泌素基因的其他产物，例如G17、G34和CTFP相同的序列区域的肽抗原产生了不仅结合hPG，还特异地结合hPG的单克隆抗体。

使用具有相应于hPG的N-末端区域的序列的肽抗原可获得的抗-hPG抗体和/或与hPG的N-末端区域结合的抗-hPG抗体在本文中称为“N-末端抗-PG抗体”。可以用于构建适合获得特异地针对hPG的多克隆和单克隆抗体的免疫原的具体的示例性hPG抗原区域相应于hPG的残基1至14：SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:25)。在下面的表1A和实施例部分中提供了可用于获得N-末端抗-hPG抗体的示例性免疫原，以及用这些示例性免疫原获得的N-末端抗-hPG单克隆抗体的CDR、V_H以及V_L序列：

在表1A中，所有的氨基酸序列使用常规的N→C方向表示。对于每种免疫原，合成的前胃泌素肽具有一个氨基己酸(Ahx)残基接着是一个半胱氨酸(Cys)残基的C-末端接头，然后所述前胃泌素肽通过Cys接头残基缀合到牛血清白蛋白(“BSA”)或者匙孔血蓝蛋白(“KLH”)载体上

使用具有相应于hPG的C-末端区域的序列的肽抗原可获得的和/或与hPG的C-末端区域结合的抗-hPG抗体在本文称作“C-末端抗-hPG抗体”。可以用于构建可用于获得多克隆和单克隆C-末端抗-hPG抗体的免疫原的具体的示例性hPG抗原区域相应于hPG的残基55至80：QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ IDNO:27)。在下面的表1B和实施例部分中提供了包括可用于获得C-末端抗-hPG抗体的该抗原的示例性免疫原，以及用这些示例性免疫原获得的C-末端抗-hPG单克隆抗体的CDR和V_H以及V_L序列。

在表1B中，所有的氨基酸序列使用常规的N→C方向表示。对于每种免疫原，合成的前胃泌素肽具有一个N-末端的Ahx-Ahx-Cys接头，然后所述前胃泌素肽通过Cys接头残基缀合到匙孔血蓝蛋白(“KLH”)或者白喉毒素(“DT”)载体上。

分别使用在Laune等人，2002，J.Immunol.Methods267:53–70和Laune，1997，J.Biol.Chem.272:30937–30944(也参见,‘329申请的实施例6)中描述的SPOT技术和丙氨酸扫描对在表1A和1B中提供的示例性的抗-hPG的单克隆抗体MAb1-MAb23结合的具体表位作图。

在SPOT技术中，产生了跨越推测表位的15个氨基酸肽并且将其点样到硝酸纤维素膜上，然后用测试抗体探测硝酸纤维素膜以确定抗体识别的最小表位序列。使用丙氨酸扫描确定在表位中对抗体结合关键的残基。将推测的表位中的每个残基一个接一个地突变成丙氨酸，并且然后用测试抗体探测含有丙氨酸的肽。

对于N-末端抗-hPG单克隆抗体MAbs1-4和15-20，表位包含至少以下序列：DAPLG(SEQ ID NO:28)、PDAPLG(SEQ ID NO:29)、PRSQQPD(SEQ ID NO:30)、WKPRSQQPD(SEQ ID NO:31)或者WKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:32)，如下表2A所示。

对于C-末端抗-hPG单克隆抗体MAb5-7,9-12,14和21-23，表位包含至少以下序列：FGRR(SEQ ID NO:33)、MDFGR(SEQ IDNO:34)、AEDEN(SEQ ID NO:35)和GWMDFGRR(SEQ ID NO:36)，如下表2B所示。

表位作图实验显示抗hPG的MAb2和MAb4结合相同的表位；抗hPG的MAb1和MAb3结合近似相同的表位；MAb17、MAb18、MAb19和MAb20结合近似相同的表位；MAb15和MAb16结合近似相同的表位;抗hPG的MAb5、MAb6、MAb7、MAb9和MAb12结合相同的表位，并且其与抗hPG MAb10结合近似相同的表位;并且抗hPG MAb11和MAb14结合近似相同的表位。

在本文描述的方法和试剂盒中有用的N-末端抗PG抗体的具体的实施方案包括与表位结合的抗体，所述表位包括hPG的残基10至14(SEQ ID NO:28)、hPG的残基9至14(SEQ ID NO:29)、hPG的残基4至10(SEQ ID NO:30)、hPG的残基2至10(SEQ ID NO:31)或者hPG的残基2至14(SEQ ID NO:32)。

在本文描述的方法和试剂盒中有用的C-末端抗PG抗体的具体的实施方案包括与表位结合的抗体，所述表位包括hPG的残基71至74(SEQ ID NO:33)、hPG的残基69至73(SEQ ID NO:34)、hPG的残基76至80(SEQ ID NO:35)或者hPG的残基67至74(SEQ IDNO:36)。

除了在表1A&1B中提供的那些抗体之外，在竞争结合测定中可以鉴定在本文公开的方法和试剂盒中有用的N-末端和C-末端抗-hPG抗体，所述竞争结合测定使用示例性的MAb1-23或者用与N-或者C-末端表位结合的其他参考抗体，在后面的章节中将更具体地描述所述竞争结合测定。

如在‘329和‘041申请中也报道了，不是全部抗hPG抗体（甚至是显示出对hPG高度特异性和亲和力的那些抗hPG抗体）可以中和hPG的生物学活性。例如，尽管抗hPG MAb14用约6pM的K_D结合hPG，但在体外测定中抗-hPG MAb14不能抑制结直肠癌细胞的生长，而其他抗hPG单克隆抗体显示出显著的抑制活性（参见，例如‘329申请的实施例7）。尽管特异结合hPG的非中和性和中和性抗体对于本文描述的多种诊断和监测方法都是有用的，但用于治疗方法的抗hPG抗体应当显示出中和活性。

如本文中所用，“中和性抗hPG抗体”是一种抗-hPG抗体，与用非特异的抗体处理的对照样品相比，在用所述抗hPG抗体处理的测试样品中活的Huh7细胞的数量产生了统计学上显著地减少。用于评估任一特定的抗hPG抗体中和hPG的能力的具体测定法描述于实施例3中。尽管预期显示出中和活性的较低水平的抗-hPG抗体，例如，在这种测定法中统计学上显著地减少了40%、30%、20%、15%或者甚至10%的活细胞的数目的抗hPG抗体提供治疗益处，但是相信在这种测定法中显示出减少了至少约50%的活细胞数目的那些抗-hPG抗体在治疗肝癌中是尤其有用的。

因此，在一些实施方案中，例如在治疗的实施方案中，有用的抗hPG抗体是中和性的。如在‘329和‘041申请中所公开，抗hPG单克隆抗体的能力不是表位依赖的，因为在用肝癌细胞进行的测定中，N-末端和C-末端抗hPG单克隆抗体都显示出中和活性。因此，在一些具体的实施方案中，中和性抗hPG抗体是N-末端中和性抗hPG抗体。在其他的实施方案中，中和性抗hPG抗体是C-末端中和性抗hPG抗体。

任一特异的抗hPG抗体的亲和力不是关键的。然而，对于一些用途，显示出至少约1μM的亲和力的抗体可以是优选的。对于治疗用途，至少约90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或者更高的亲和力是所希望的。如下表3中提到的，在表1A&1B中经鉴定的抗hPG单克隆抗体的经测量的亲和力范围为10^-6至10^-12M：

具有尤其适合于特定希望的应用的亲和力的抗PG的单克隆抗体可以容易地选自这些抗体，或者使用多种免疫原、本文描述的抗hPG抗体的互补决定区（CDR）序列、可变重链（V_H）和可变轻（V_L）链序列产生或者设计。使用本领域已知或者本文描述的技术，例如ELISA、等温滴定量热法(ITC)、BIAcore或者荧光极化测定法可以测定任何特定的抗PG单克隆抗体的亲和力。在实施例4中提供了具体的测定法。

如表1A&1B中提到的，已经鉴定了几种N-末端和C-末端单克隆抗-hPG抗体。如通过实施例2中所述的测定法所测量，这些抗体全部对hPG特异，并且在用结直肠癌细胞进行的测试中，除了MAb14之外的全部抗体均显示出中和活性。用肝癌细胞测试的全部抗体（MAb3、8、13、16和19）全部显示中和活性。2010年10月6日依据布达佩斯条约将用于获得抗体的一些杂交瘤保藏在国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganisms(CNCM)，Institut Pasteur，25rue du Docteur Roux，F-75724ParisCedex15，法国)中，获得的保藏编号为CNCM I-4371、CNCM I-4372、CNCM I-4373、CNCM I-4374、CNCM I-4375、CNCM I-4376。表1A&1B中提供了产生抗-hPG MAb1–23的杂交瘤的指定名称和这些经保藏的杂交瘤的保藏登记号。此外，对于几种抗体，已经确定了它们的可变重链(V_H)、可变轻链(V_L)、V_L互补决定区(CDR)和V_H CDR的氨基酸序列。在表1A&1B中也提供了这些氨基酸序列和本公开全文中用于引用它们的缩写命名。简要地，此处将鼠重链和轻链可变结构域称作mV_H和mV_L，接着是相应的单克隆抗体的编号，例如mV_H.3和mV_L.3分别用于抗hPG MAb3的可变重链和可变轻链。相似地，此处将人重链和轻链可变结构域称作hV_H和hV_L，接着是相应的单克隆抗体的编号。三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR在此分别被称作V_H CDR1、2或3和V_L CDR1、2或3，接着是具体的抗hPG的单克隆抗体的编号。例如，MAb3的V_H CDR1表示为V_H CDR1.3，并且MAb3的V_L CDR1表示为V_L CDR1.3。MAb3的V_H CDR2示为V_H CDR2.3，并且MAb3的V_L CDR2表示为V_L CDR2.3。

预期结合近似相同表位的抗hPG单克隆抗体的相应CDR和/或V_H以及V_L链可以被互换以产生在本文描述的方法和试剂盒中有用的新的抗hPG单克隆抗体。例如，如上文提到的，示例性抗hPG的单克隆抗体MAb5和MAb6结合相同的表位。可以设计抗hPG的单克隆抗体，其在它的V_L链中包括这两种抗体的V_L CDR的多种组合，和/或在它的V_H链中包括这两种抗体的V_H CDR的多种组合。作为阐述多种可能组合的一个具体的非限制实例，这种抗体，在它的V_L链中可以包括MAb5的CDR1和2(分别是V_L CDR1.5和V_L CDR2.5)和MAb6的CDR3(V_L CDR3.6)，并且在它的V_H链中，包括MAb6的CDR1(V_H CDR1.6)以及MAb5的CDR2和3(分别是V_H CDR2.5和V_H CDR3.5)。使用常规方法可以获得已经被保藏的杂交瘤产生的抗体的CDR的氨基酸序列（也称为高变区）。

本领域已知，取决于背景和本领域已知的多种定义，划定抗体高变区的氨基酸位置/边界可以不同。可以将在可变结构域中的一些位置看作杂合高变位置，原因在于，在一套标准下，可以认为这些位置在高变区内，然而在一套不同的标准下，认为这些位置在高变区之外。在延伸的高变区中也可以发现这些位置中的一个或者多个。本文中所述的抗PG抗体可以在这些杂合高变位置含有修饰。每种天然重链和轻链的可变结构域包含四种主要采用β-折叠构型的通过三个CDR连接的四个FR区，所述CDR形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。每条链中的CDR通过FR区以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4顺序很接近地结合在一起，并且其与来自其他链的CDR一起有助于形成抗体的靶标结合位点(参见Kabat等人,1987，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,National Institute of Health,Bethesda,Md.)。除非另外指出，根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行本文使用的免疫球蛋白氨基酸残基的编号。

参考表1A，在本文中所述的方法和试剂盒中有用的N-末端抗hPG抗体的具体的实施方案包括，但不限于以下抗体：

(a)抗体，其具有在序列中相应于MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的V_L CDR的V_L CDR，和在序列中相应于MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的V_H CDR的V_H CDR；

(b)抗体，其具有在序列中相应于MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的V_L CDR和V_H CDR的V_L CDR和V_H CDR；

(c)抗体，其中:

(i)V_LCDR1选自QSIVHSNGNTY(“V_L CDR1.3";SEQ IDNO:4),QSLVHSSGVTY(“V_L CDR1.4”；SEQ ID NO:10),QSLLDSDGKTY(“V_L CDR1.16";SEQ ID NO;50),和SQHRTYT(“V_L CDR1.19";SEQ ID NO:51);

(ii)V_L CDR2选自KVS("V_L CDR2.3"or"V_L CDR2.4";SEQ ID NO:5),LVS("V_L CDR2.16"；SEQ ID NO:53),和VKKDGSH(“V_L CDR2.19"；SEQ ID NO:54);

(iii)V_L CDR3选自FQGSHVPFT("V_L CDR3.3";SEQ IDNO:6),SQSTHVPPT("V_L CDR3.4"；SEQ ID NO:11),WQGTHSPYT("V_L CDR3.16";SEQ ID NO:57),和GVGDAIKGQSVFV("V_L CDR3.19"；SEQ ID NO:58);

(iv)V_HCDR1选自GYIFTSYW("V_H CDR1.3";SEQ IDNO:1),GYTFSSSW("V_H CDR1.4";SEQ ID NO:7),GYTFTSYY("V_H CDR1.16";SEQID NO:39),和GYSTTSDYA("V_H CDR1.19";SEQ ID NO:40);

(v)V_H CDR2选自FYPGNSDS("V_HCDR2.3";SEQ IDNO2),FLPGSGST("V_H CDR2.4",SEQ ID NO:8),INPSNGGT("V_H CDR2.16";SEQ IDNO:43),和ISFSGYT("V_H CDR2.19";SEQ ID NO:44),和

(vi)V_H CDR3选自TRRDSPQY(“V_H CDR3.3"；SEQ IDNO:3),ATDGNYDWFAY("V_H CDR3.4"SEQ ID NO:9),TRGGYYPFDY("V_H CDR3.16";SEO ID NO:47),和AREVNYGDSYHFDY("V_H CDR3.19”；SEQ IDNO:48)；

(d)抗体，其具有在序列中相应于MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的V_L的V_L和在序列中相应于MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的V_H的V_H；并且

(e)抗体，其具有在序列中相应于MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的V_L和V_H的V_L和V_H。

参考表1B，在本文所述的方法和试剂盒中有用的C-末端抗hPG抗体的具体的实施方案包括，但不限于以下抗体：

(a)抗体，具有在序列中相应于MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的V_L CDR的V_L CDR，和在序列中相应于MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的V_H CDR的V_H CDR；

(b)抗体，其具有在序列中相应于MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的V_L和V_H CDR的V_L CDR和V_H CDR;

(c)抗体，其中：

(i)V_L CDR1选自KSLRHTKGITF("V_L CDR1.8”；SEQ IDNO:49)和QSLLDSDGKTY("V_L CDR1.13";SEQ ID NO:50);

(ii)V_L CDR2选自QMS("V_L CDR2.8";SEQ ID NO:52)和LVS("V_L CDR2.13";SEQ ID NO:53);

(iii)V_L CDR3选自AQNLELPLT("V_L CDR3.8";SEQ IDNO:55)和WQGTHFPQT(“V_L CDR3.13",SEQ ID NO:56);

(iv)V_H CDR1选自GFTFTTYA("V_H CDR1.8";SEQ IDNO:37)和GFIFSSYG(“V_H CDR1.13"；SEQ ID NO:38);

(V)V_H CDR2选自ISSGGTYT("V_H CDR2.8";SEQ IDNO:41)和INTFGDRT("V_HCDR2.13”;SEQ ID NO:42);和

(vi)V_H CDR3  选自ATQGNYSLDF("V_H CDR3_.8";SEQ IDN0.45)和ARGTGTY(“V_HCDR3.13",SEQIDNO46),

(d)抗体，其具有在序列中相应于MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的V_L的V_L和在序列中相应于MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的V_H的V_H；和

(e)抗体，其具有在序列中相应于MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的V_L和V_H的V_L和V_H。

技术人员将理解，用于诊断方法的抗-hPG抗体可以是任何来源的，所述来源包括例如哺乳动物（例如、人、灵长类、啮齿类动物、山羊或兔）、非哺乳动物或自然界中的嵌合体（来自超过一个物种）。适合在动物（包括人）中治疗应用的抗体优选地来源于预期被治疗的相同物种，或者已经被修饰或者设计成非免疫原性的或者已经降低了在待治疗的动物中的免疫原性。在下面详细讨论了用于在人中治疗应用的抗-hPG抗体的具体类别是人源化抗体类。用于本文中所述的方法和试剂盒的抗hPG抗体还可以是或者来源于任一同种型，包括例如IgA（例如，IgA1或IgA2）、IgD、IgE、IgG（例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）或IgM。为治疗应用设计的抗hPG抗体优选地是IgG型。

在一些实施方案中，用于本文中所述的治疗方法的抗hPG抗体是人源化的。通常，人源化抗体包含至少一种，并且通常两种可变结构域的基本上全部，在所述可变结构域中，全部或基本上全部的CDR区相应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且全部或基本上全部的构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些序列，并且可以称为“CDR-移植”。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，通常包含人免疫球蛋白共有序列的那些序列。本领域也已知用于人源化抗体的方法，包括设计人源化抗体的方法。参见，例如Lefranc等人，2003，Dev.Comp.Immunol.27:55-77;Lefranc等人，2009，Nucl.Acids Res.37:D1006-1012;Lefranc，2008，Mol.Biotechnol.40:101-111;Riechmann等人，1988，Nature332:323-7;Queen等人的美国专利号5,530,101,5,585,089,5,693,761,5,693,762和6,180,370;EP239400;PCT公开WO91/09967;美国专利号5,225,539;EP592106;EP519596;Padlan，1991，Mol.Immunol.28:489-498;Studnicka等人，1994，Prot.Eng.7:805-814;Roguska等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973;以及美国专利号5,565,332，特此将所述公开整体并入本文作为参考。

使用这些已知的方法可以获得抗体的人源化形式，所述抗体具有相应于非人抗hPG抗体的CDR的CDR序列，其包括但不限于，例如在表1A中提供的多种N-末端抗hPG单克隆抗体和表1B中提供的多种C-末端抗hPG单克隆抗体。在表1A和1B中提供了选择的抗hPG抗体的人源化的V_L和V_H链的计划的序列。人源化抗体的具体实例包括抗体，其包含：

(a)本文公开的任意三个V_L CDR和任意三个V_H CDR；

(b)包含相应于SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含相应于SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区；

(c)包含相应于SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区和包含相应于SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区；

(d)包含选自由SEQ ID NO:75、77和79的氨基酸序列组成的组的重链可变区和包含选自由SEQ ID NO:76和78的氨基酸序列组成的组的轻链可变区；

(e)包含选自由SEQ ID NO:80和82的氨基酸序列组成的组的重链可变区和包含选自由SEQ ID NO:81和83的氨基酸序列组成的组的轻链可变区；

(f)包含选自由SEQ ID NO:84、86和88的氨基酸序列组成的组的重链可变区和包含选自由SEQ ID NO:85、87和89的氨基酸序列组成的组的轻链可变区；以及；

(g)包含选自由SEQ ID NO:90、92和94的氨基酸序列组成的组的重链可变区和包含选自由SEQ ID NO:91、93和95的氨基酸序列组成的组的轻链可变区。

如技术人员将认识到，使用本文描述的多种抗原和免疫原并且评估它们与目的参考抗体竞争结合hPG的能力可以容易获得具有特定的结合性质，如能结合特定的目的表位的抗-hPG抗体。在这种竞争测定中，可以利用本文描述的任一抗-hPG抗体作为参考抗体。在实施例5中提供了用于评估抗体与生物素化的参考抗-hPG的目的抗体竞争结合hPG的能力的具体测定法。

在参考抗-hPG抗体和任一测试抗体(不考虑种类或者同种型)之间进行抗体竞争研究中，可以首先用可检测的标记来直接标记（例如放射性同位素或者荧光团）或间接标记（例如生物素（通过结合荧光标记的链酶亲和素检测）或者酶（通过酶反应检测））参考抗体以实现随后的鉴定。在这种情况下，将标记的参考抗-hPG抗体（固定的或者增加的浓度）与已知量的hPG孵育，形成hPG:经标记的抗-hPG抗体复合物。然后将未标记的抗体加入到复合物中。测量经复合的标记的强度。如果测试抗体通过结合重叠表位与经标记的参考抗hPG抗体竞争结合hPG，那么相对于在缺失测试抗体的情况下进行的对照实验，复合的标记的强度将降低。

已知用于进行结合竞争测定的多种方法，并且其可以被改进以产生与上文和实施例5中描述的测定可比较的结果。

如果测试抗体在竞争结合测定中减少了参考抗-PG抗体与hPG的结合，并且特别在实施例5中的竞争结合测定中，测试抗体的浓度在0.01至100μg/mL(例如0.01μg/mL、0.08μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL或100μg/mL或者在所述的范围内的其他浓度)的范围内，所述结合减少至少50%，那么认为测试抗体与参考的抗-hPG抗体竞争结合hPG，并且因此认为所述测试抗体与参考抗-hPG抗体结合hPG的近似相同的或者重叠的表位，尽管可以期望更高水平的减少，例如60%、70%、80%、90%甚至100%的减少。

技术人员将理解，在一些背景下，例如在诊断和监测的背景下，标记抗-PG抗体是所希望的。此类标记用于检测和定量。合适的标记是本领域已知的，并可以是“直接的”（因为所述标记是直接可观察到的或可检测到的（例如，荧光基团或放射性同位素））或是“间接的”（因为所述标记与其他一些产生并可观察到的或可检测到的信号的材料相互作用（例如，酶作用于底物产生可检测到的信号或者结合分子，如结合经标记的链霉抗生物素蛋白分子的生物素）。多种标记系统，以及使用它们标记抗体的方法是本领域已知的，并被本文考虑使用。

尽管已经使用全长抗体示例了用于本文所述方法中的多种抗-hPG抗体，技术人员将理解，还可以使用结合片段或者设计自或衍生自全长抗体或结合片段的替代抗体。合适的片段、替代物等包括但不限于，Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、vIgG、scFv片段和替代抗体（surrobody）。除非另外指明，如本文中所用的术语“抗体”包括抗体和“抗体样”替代分子的全部形式，所述替代分子包括单链抗体、替代抗体和结合片段。在本文中，将具有天然产生的抗体的典型结构的抗体称为“天然抗体”。

7.12产生抗-PG抗体的方法

可以使用标准的已知方法获得用于本文所述方法中的抗PG抗体。为了表达用于本文所述方法中的抗PG抗体，将编码部分或全长轻链和重链的DNA插入到表达载体中，以便将该基因有效连接到转录和翻译调控序列上。在这种背景下，术语“有效地连接”意指将抗体基因连接到载体中以便载体内的转录和翻译调控序列发挥它们预期的调节抗体基因转录和翻译的预定功能。选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达调控序列。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到分别的载体中，或者更典型地，将两个基因都插入到相同的表达载体中。

通过标准方法（例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制酶切位点，或者如果不存在限制酶切位点，则使用平端连接），将抗体基因插入到表达载体中。在插入抗PG抗体轻链或重链序列之前，表达载体可以已经携带了抗体恒定区序列。例如，将抗PG抗体V_H和V_L序列转换成全长的抗体基因的一种方法是将所述抗PG抗体V_H和V_L序列分别插入到已经编码了重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，以便将V_H区段有效地连接到载体内的C_H区段，并且将V_L区段有效地连接到载体内的C_L区段。额外地或备选地，该重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，以便将信号肽在框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者异源的信号肽（即，来自非免疫球蛋白的信号肽）。

除抗体链基因外，本公开的重组表达载体携带了控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意指包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件（例如，多腺苷酸化信号）。此类调节序列描述于，例如Goeddel，GeneExpression Technology:Methods in Enzymology185（AcademicPress，San Diego，CA，1990）中。本领域技术人员将理解，包括调控序列的选择的表达载体的设计可能取决于此类因素，如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒（CMV）的启动子和/或增强子（例如CMV启动子/增强子）、来源于猴肾病毒（SV40）的启动子和/或增强子（例如SV40启动子/增强子）、来源于腺病毒的启动子和/或增强子（例如，腺病毒主要晚期启动子（AdMLP））和来源于多瘤病毒的启动子和/或增强子。为进一步描述病毒调控原件及其序列，参见例如，Stinski的美国专利号5,168,062、Bell等人的美国专利号4,510,245和Schaffner等人的美国专利号4,968,615。

除抗体链基因和调节序列外，重组表达载体可以携带额外的序列，如调节载体在宿主细胞中复制的序列（例如，复制起点）和选择标记基因。选择标记基因有助于已经引入了载体的宿主细胞的选择（参见例如，Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017）。例如，通常选择标记基因赋予了已经引入了载体的宿主细胞赋予对药物（如G418、嘌呤霉素、杀稻瘟素、潮霉素或氨甲喋呤）的抗性。合适的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（用于用氨甲喋呤选择/扩增的宿主DHFR-细胞中）和neo基因（用于G418选择）。为了表达轻链和重链，通过标准技术，将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的多种形式意指包括通常用于将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、脂转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。

有可能在原核或真核宿主细胞中表达本文中所述的抗体。在某些实施方案中，在真核细胞，例如哺乳动物细胞中进行抗体的表达，以用于经适当折叠的和具有免疫活性抗体的最佳分泌。用于表达本公开的重组抗体的示例性的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）（包括描述于Urlaub&Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220中的DHFR-CHO细胞，其使用DHFR选择标记（例如，如Kaufman&Sharp，1982，Mol.Biol.159：601-621中所述））、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、293细胞和SP2/0细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段时间来产生抗体，所述一段时间足以允许抗体在宿主细胞中表达或者足以允许抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。可以使用标准的蛋白质纯化方法，从培养基中回收抗体。宿主细胞也可以用于产生完整抗体的部分，如F_ab片段或scF_v分子。理解在上述方法上的变化是在本公开的范围内。例如，可以希望用编码本文中所述的抗PG抗体的轻链或重链（但不是两条链）的DNA转染宿主细胞。

还可以将重组DNA技术用于去除编码对结合PG不是必需的轻链或重链或者轻链和重链的DNA的部分或全部。由此类截短的DNA分子表达的分子在本文所述的方法中也是有用的。

为了抗PG抗体的重组表达，可以用两种表达载体共转染宿主细胞，其中第一种载体编码重链来源的多肽，并且第二种载体编码轻链来源的多肽。通常，两种载体都含有各自的选择标记。备选地，可以使用编码重链多肽和轻链两种多肽的单个载体。

还可以通过化学合成（例如，通过Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，1984The Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill中所述的方法。）产生抗PG抗体。使用无细胞平台也可以产生不同的抗体（参见，例如，Chu等人，2001，Biochemia No.2（Roche Molecular Biologicals））。

一旦已经通过重组表达或合成方法产生了抗PG抗体，那么所述抗PG抗体可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任一方法纯化，例如通过层析（例如，离子交换层析、亲和层析、特别是在A蛋白或G蛋白选择后通过对PG的亲和层析，以及大小柱层析）、离心、不同的溶解度或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。进一步地，可以将抗PG抗体或其结合片段融合到本文中所述的或者本领域另外已知的异源多肽序列上，以促进纯化。

8.实施例

以下实施例为说明性的，并不意在作为限制。

实施例1：血浆或血清PG水平的定量

使用以下测定法可以方便地测定PG的血浆和/或血清水平。用0.5和10μg/mL之间的C-末端抗-hPG抗体，例如兔的C-末端抗hPG多克隆抗体或者本文中所述的C-末端抗-hPG抗体包被96孔微量滴定板，然后孵育过夜。然后在PBS-Tween(0.05%)中洗涤板三次并用PBS-Tween(0.05%)中的2%(w/v)脱脂奶粉封闭板。在合适的稀释液(例如，PBS-Tween0.05%)中分别制备测试样品，对照样品（空白或者PG-阴性的血浆或者血清样品）以及在约5pM(0.5x10^-11M)和约0.1nM(1x10^-10M)之间的hPG参考标准品（在PG-阴性的血浆或者血清中稀释的冻干的hPG）。在包被的板上在37°C下孵育样品2至4小时，或备选地在21°C下孵育12至16小时。孵育后，用PBS-Tween(0.05%)洗涤板三次并将其与0.001至0.1μg/mL之间的N-末端抗-hPG抗体（例如本文描述的多克隆的N-末端抗-hPG抗体或者N-末端抗hPG单克隆抗体）一起在21°C下孵育30分钟，所述N-末端抗-hPG抗体偶联到辣根过氧化物酶(HRP)上(Nakane等人,1974,J.Histochem.Cytochem.22(12):1084–1091)。然后在PBS-Tween(0.05%)中洗涤板三次并且加入HRP底物在21°C下保持15分钟。通过加入100μL0.5M的硫酸终止反应并且在405nm进行光密度测量。通过与标准曲线比较确定测试样品的hPG水平，所述标准曲线由来自hPG参考标准品的测量值构建。

实施例2：用于评估抗hPG抗体的特异性的ELISA测定

使用以下的ELISA测定可以方便地测定抗-hPG抗体的特异性。用磷酸缓冲盐水(PBS)中的适当浓度的测试多肽(例如25和50ng重组人PG,以及50和250ng CTFP或者其他的胃泌素来源的基因产物)在4°C孵育96孔板过夜，之后用洗涤溶液(PBS和0.1%Tween-20)洗涤孔三次，然后每孔用100μL封闭溶液(PBS，0.1%Tween-20，0.1%牛血清白蛋白或者酪蛋白水解物)在22°C下孵育2小时。封闭后，洗涤孔三次，并且加入待测定的抗体（测试抗体）。将PBS和0.1%Tween-20中的100μL测试抗体(0.3至1ng/mL)加入每孔中。然后将板在22°C孵育2小时，之后丢弃测试抗体溶液，并且在洗涤步骤(3X100μL洗涤溶液,如上面提到的)之后用含有第二抗体的封闭溶液代替，所述第二抗体是偶联到辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Fc)抗体。用第二抗体孵育1小时之后，将100μL底物溶液(例如可从sigma-Aldrich Co得到的FAST OPD,或者邻苯二胺二盐酸盐，根据制造商的说明制备)加入到每孔中并且在22°C下在黑暗中孵育20分钟。通过加入50μL4N的硫酸终止反应并且通过测量在492nm处的光密度(O.D.)确定被催化的底物量。底物转化与结合抗原的一级（测试）抗体的量是成比例的。一式两份进行实验并且将OD测量值作为抗原浓度的函数作图。如果对于hPG，测量的O.D.在0.2和1.5之间，并且使用CTFP或者任何其他胃泌素基因来源的肽，没有高于背景的统计学上显著的信号，那么将测试抗体评分为对PG特异的，其中所述背景是来自只含有PBS的对照孔的平均信号。

实施例3：用于评估抗-hPG抗体的中和活性的测定法

如下进行用于评估特定的抗hPG抗体是否是中和性的具体测试。在无血清M11培养基中，将Huh7肝细胞癌细胞接种到超低粘附24孔板中（500个细胞/孔）。细胞在37℃下生长，并用约5μg/mL的抗体浓度的测试抗hPG抗体或对照非特异的单克隆抗体每天处理所述细胞两次，持续7天。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体数目，并计算中位数和百分率分布。如果与用对照抗体处理的细胞相比，在低粘附培养条件下，由Huh7细胞形成的球体数目显示出至少20%的统计学上的显著下降（当测试一种抗hPG抗体时，使用非配对t-检验，当测试多种抗体时，使用具有Bonferroni post-hoc检验的单因素方差分析）（当p<0.05时，认为差异显著），那么在该测定法中，将测试抗体定义为中和性的。

实施例4：用于评估抗hPG抗体的亲和力的测定法

使用Proteon技术(BioRad),根据Nahshol等人，2008，AnalyticalBiochemistry383:52–60(将其整体并入本文作为参考)可以测量抗-hPG抗体的亲和力常数。简要地，对于鼠抗-PG抗体，首先将抗小鼠IgG抗体(50μg/mL)包被在传感器芯片上，以确保在抗体注射后芯片检测的信号落入在10,000到11,500个响应单位(RU)之间。然后注射目的鼠抗-hPG抗体(测试抗体)（通常是30μg/mL的浓度）。如果测试抗体充分地结合，将观察到至少500RU的额外信号。然后通过注射不同浓度的hPG，例如200nM,100nM,50nM,25nM和12.5nM的hPG，并且检测缔合水平获得测试抗体和hPG之间结合的时程。通常，在单个实验中可获得几个通道来并行地测试多种抗体，使得可能以不同浓度的hPG并行地测定单个测试抗体的结合。应该用对hPG非特异的鼠单克隆抗体注射一个通道作为非特异结合的对照，并且应该仅用稀释缓冲液注射另一个通道作为背景信号的基线。一般，在用非特异的鼠抗体注射的通道中检测不到结合。在此设定中显示高水平缔合的抗体（其可以导致被hPG捕获的单克隆抗体的饱和）可以对较低的hPG浓度(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.125nM)进行测试，允许更精确的测量。

以解离常数(k_d)和缔合常数(k_a)之间的比例计算亲和常数(K_D)。通过分析基于结合测量的实验曲线和理论图谱之间的统计学相关的相似性可以验证实验值。

使用抗-hPG测试抗体的来源物种特异的IgG可以以相似的方式评估非鼠抗-hPG抗体的亲和常数。

实施例5：用于评估与参考抗hPG抗体竞争结合的测定法

可以按照以下进行特异性测定，所述测定用于评估目的抗体（测试抗体）是否与生物素化的参考抗hPG抗体竞争结合hPG。用捕获抗hPG抗体（识别hPG的N-末端或C-末端区域的多克隆或单克隆抗体，所述hPG的N-末端或C-末端区域与生物素化的参考抗hPG抗体识别的表位不同）以选自1–10μg/mL范围的浓度4°C下包被96孔板过夜（0.1至1μg/每孔）。用封闭缓冲液(PBS中的0.1%Tween-20，0.1%BSA)在22°C下封闭2小时后，以10pM至1nM之间的浓度（10-1000pg/孔）加入重组hPG，并在22℃下孵育2小时。之后，将生物素化的参考抗-hPG抗体（或者含有生物素化的参考抗-hPG抗体的混合物），以及增加浓度的未标记的测试抗体一起加入，并且在22℃下孵育1小时。洗涤以去除未结合的抗体后，通过将混合物与50ng/ml的链霉亲和素-HRP一起在22°C下孵育1小时，然后接着在22℃下与辣根过氧化物酶的化学发光底物孵育5分钟，并在发光计中进行相对光单位（RLU）的定量，来进行结合的标记的参考抗hPG抗体的检测。一式两份进行测定。

与参考抗hPG抗体竞争结合的抗体抑制参考抗体与hPG的结合。如通过观察到的RLU的降低证实，与参考抗体结合基本相同的表位或者具有重叠表位的抗体显著地减少了结合的参考抗hPG抗体的量（例如，减少至少50%）。

从通过将标记的参考抗体与重组hPG（无测试抗体）孵育进行的对照实验获得了高的对照值。从通过将标记的参考抗体与重组hPG且在过量浓度的未标记参考抗体的存在下孵育（这样未标记的参考抗体与标记的抗体竞争对hPG的结合）进行的对照试验获得了低的对照值。然后，通过在增加浓度的未标记测试抗体的存在下，将经标记的参考抗体与重组hPG孵育，来确定测试抗体与参考抗hPG抗体竞争的能力。

在测试测定中，在测试抗体的存在下，观察到RLU的显著降低表明测试抗体与参考抗hPG抗体识别基本相同的表位。

结合的抑制可以表示为抑制常数或K_i，其根据以下的公式计算：

K_i=IC₅₀/[1+(参考抗hPG Ab浓度/K_D ^{参考抗hPG Ab})]

其中“IC₅₀”是导致在参考抗体的结合中50%的减少的测试抗体浓度，并且K_D ^{参考抗-hPG Ab}是参考抗-hPG抗体的解离常数，其是所述抗体对hPG的亲和力的一种度量。在本文中所述的测定条件下，与参考抗hPG抗体竞争的有用的测试抗体（例如，本文中所述的抗hPG抗体之一）通常将具有10pM至100nM的K_is值。

实施例6：来自肝癌肿瘤的肝细胞癌显示出升高的GAST基因表达水平

这个实施例描述了这样的观察结果：来自具有肝细胞癌（HCC）的患者的肝肿瘤样品相对于正常组织表达升高的GAST基因水平。

A.方法

从14名患者中手术切除原发性肝肿瘤和正常对照组织。从肿瘤和健康肝组织样品制备RNA，并使用Agilent Bioanalyser控制mRNA的完整性。通过定量反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）测量并用HPRT mRNA的表达归一化GAST mRNA的表达。对于RT-PCR，使用FastRNA Pro Green试剂盒（MP BioMed）根据制造商的方案提取来自HCC样品的总RNA。在随机引物（R&D Systems）存在的情况下，使用Superscript II RT（Invitrogen）反转录RNA。使用Quantifast SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen）和EppendorfMastercycler ep realplex（Eppendorf）进行实时RT-PCR。用于GAST和HPRT基因扩增的引物获自Sigma Life Science。使用以下条件：95℃5分钟，之后总共45个双温度循环（在95℃10秒和在60℃30秒）在一式三份的孔中进行每一PCR扩增。

B.结果

如在图4中显示，相对于正常肝组织，在患肝癌的14名受试者的10名受试者中的HCC肿瘤样品中的GAST mRNA表达增加了。在GAST mRNA表达增加的样品中，与正常组织比较，表达高2-2800倍。

实施例7：在低粘附培养条件下生长的肝癌细胞系显示出升高的GAST基因表达水平

这个实施例描述了这样的观察结果：相对于结直肠癌细胞系，在低粘附培养条件下生长的肝癌细胞系表达提高水平的GAST基因。

A.方法

将两种肝细胞癌细胞系（Huh7和PLC/PRF/5）、肝母细胞瘤细胞系（Huh6）和结直肠癌细胞系（SW480）都接种在超低粘附培养瓶中的M11培养基中，并使所述细胞生长直到实现球体形成。然后处理球体，以用于RNA提取。除根据制造商的方案，使用QIAGENRneasy小型试剂盒提取总RNA外，如实施例1中所述进行RT-PCR。然后，相对于SW480细胞的表达（用作阳性对照），归一化来自肝癌细胞系的GAST mRNA表达水平。

B.结果

如在图5A-5B中所示，与结肠癌肿瘤细胞系SW480相比，当在低粘附培养条件下生长时，经测试的全部肝细胞系（Huh6、Huh7和PLC/PRF/5）都表达提高水平的GAST mRNA。以相对于SW480细胞中的胃泌素基因表达水平表示结果。

实施例8：从肝癌细胞系分离并在低粘附培养条件下生长的侧群细胞显示出升高的GAST基因表达水平

这个实施例描述了这样的观察结果：相比于两种肝癌细胞系（Huh6和Huh7）的一般群体（即，非侧群），在低粘附培养条件下生长的来自Huh6和Huh7的排出染料的“侧群”细胞表达提高水平的GAST mRNA。

A.方法

使用FACS，从Huh6和Huh7肝癌细胞系的一般群体分离来自此类细胞的排出染料的“侧群”细胞。具体而言，通过用胰蛋白酶和EDTA处理来分离细胞。然后，在37℃，在1ml染色培养基（DMEM、2%胎牛血清、2mM EDTA）中孵育细胞10分钟。将1μl的50mM维拉帕米溶液（终浓度50μM）加入到阴性对照样品中。然后，在37℃，将对照和测试样品孵育10分钟。然后将染色溶液加入到测试样品（2.5μl的2mg/ml Hoechst33342；5μg/ml的终染料浓度）中，之后温和混合。然后，在定期温和混合的情况下，在37℃将全部样品孵育50分钟。在冰上孵育样品5-10分钟后，然后将样品在1000rpm离心5分钟。然后，将细胞沉淀重悬1ml的在M11培养基中1:40稀释的25μg/ml碘化丙啶溶液。然后在5ml管中，通过过滤，经滤网去除聚集的细胞。然后将样品储存在冰上，直到使用FACSAria细胞计数器进行细胞计数（在450nm和488nm检测信号）。然后纯化RNA，并如实施例6和7定量GAST mRNA的表达水平，然后将其与来自在低粘附培养条件下生长为球状体的Huh6和Huh7细胞和SW480结肠癌细胞的GAST基因表达水平比较。然后相对于SW480细胞的表达（用作阳性对照），归一化来自肝癌细胞系的GAST mRNA表达水平。

B.结果

如在图6中所示，与在低粘附培养条件下生长成球状体的Huh6和Huh7细胞的一般群体比较，此类细胞的排除染料“侧群”表达提高水平的GAST mRNA（分别为图6A和6B）。与Huh6细胞的侧群相比，Huh7细胞的侧群表达更多的胃泌素mRNA。以相对于SW480细胞中GAST基因表达水平表示结果。

实施例9：当用抗PG抗体处理时，在球状体生长条件下生长的PLC/PRL/5肝细胞癌细胞形成了较少的球状体

这个实施例显示了用抗hPG单克隆抗体处理对PLC/PRL/5肝癌细胞在低粘附培养条件下生长成球状体的影响。

A.方法

将PLC/PRL/5肝细胞癌细胞接种于超低粘附24孔板（220个细胞/孔）中的无血清M11培养基（具有20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM）中。在每天添加对照或抗hPG MAb3单克隆抗体（1μg/ml）的情况下，所述细胞在37℃生长10天。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔球体的数目，并计算平均值和标准差。

B.结果

如图7所示，与对照单克隆抗体相比，用抗hPG单克隆抗体对PLC/PRF/5细胞的处理大大地降低了在低粘附培养条件下生长期间形成的球状体的数目。

实施例10：当用抗PG抗体处理时，从在球状体生长条件下生长的Huh6肝母细胞瘤细胞系纯化的侧群细胞形成了较少的球状体

这个实施例显示了用抗hPG多克隆抗体的处理对Huh6肝癌细胞的排出染料侧群在低粘附培养条件下生长成球状体的影响。

A.方法

如上所述分离Huh6细胞的排出染料侧群细胞。然后，将侧群细胞接种在超低粘附96孔板（200个细胞/孔）中的M11培养基中，并在对照或抗-前胃泌素多克隆抗体（1μg/ml）、5nM阿霉素（用于某些肝癌治疗的化学治疗剂）或DMSO（阿霉素的载体）（每一种条件15个孔）存在的情况下，所述侧群细胞在37℃生长13天。M11培养基的组成如下：DMEM/F12-Glutamax（目录号31331Invitrogen）；20ng/ml EGF（R&D systems）；10ng/ml FGF（R&D systems）；20μg/ml胰岛素（Sigma）；N2补充物（目录号P1510，Gibco）的1/100稀释物；2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并计算平均值和标准差。

B.结果

如图8中所示，与对照抗体、阿霉素和DMSO对照相比，用抗hPG多克隆抗体处理的从Huh6细胞系纯化的侧群细胞大大地降低了在低粘附培养条件下培养期间形成的球状体的数目。

实施例11：当用抗hPG抗体处理时，从在球状体生长条件下生长的Huh7肝母细胞瘤细胞系纯化的侧群细胞形成了较少的球状体

这个实施例显示，用抗hPG多克隆抗体处理对Huh7肝癌细胞的排出染料侧群在低粘附培养条件下生长成球状体的影响。

A.方法

如实施例8中所述分离Huh7细胞的排出染料侧群细胞。然后，将侧群细胞接种在超低粘附96孔板（200个细胞/孔）中的M11培养基中，并在对照或抗前胃泌素多克隆抗体（1μg/ml）、5nM阿霉素（用于某些肝癌治疗的化学治疗剂）或DMSO（阿霉素的载体）存在的情况下，所述侧群细胞在37℃生长9天，每一种处理（condition）15个孔。M11培养基的组成如下：DMEM/F12-Glutamax（目录号31331Invitrogen）；20ng/ml EGF（R&D systems）；10ng/ml FGF（R&D systems）；20μg/ml胰岛素（Sigma）；N2补充物（目录号P1510，Gibco）的1/100稀释物；2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并计算平均值和标准差。

B.结果

如图9中所示，与对照抗体和DMSO对照相比，用抗hPG多克隆抗体处理的从Huh7细胞系纯化的侧群细胞大大地降低了在低粘附培养条件下培养期间形成的球状体的数目。观察到阿霉素也减少了培养中形成的球状体的数目。

实施例12：当用抗hPG单克隆抗体处理时，Huh6肝母细胞瘤细胞在低粘附生长条件下形成了更少的球状体

这个实施例显示了抗hPG单克隆抗体对低粘附生长条件下Huh6球体的生长的影响。

A.方法

将Huh-6肝母细胞瘤细胞接种在超低粘附96孔板（85个细胞/孔）中的无血清M11培养基（具有20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12）中。在37℃，用载体（PBS，对照）或抗hPG MAb13或MAb19单克隆抗体（3μg/ml）每天处理细胞两次，持续7天。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球状体的数目，计算中位数和百分率的分布并作图。

B.结果

如图10中所示，与未处理的对照细胞相比，用抗hPG单克隆抗体处理Huh6细胞大大地降低了低粘附培养条件下培养期间形成的球状体的数目。

实施例13：当在低粘附条件下生长时，用抗hPG单克隆抗体预处理的Huh6细胞形成了更少的球状体

这个实施例阐明了用抗hPG单克隆抗体进行的预处理对随后Huh6肝母细胞瘤细胞在低粘附培养条件下生长成球状体的能力的抑制作用。

A.方法

首先将100,000Huh6肝母细胞瘤细胞/孔接种到6孔板中的具有10%FCS的DMEM中，血清饥饿过夜，并在10μg/mL抗前胃泌素单克隆抗体MAb8或MAb13或对照单克隆抗体（PCX63Ag8，ATCC，Ref TIB-9）的存在下在DMEM中所述细胞生长48个小时。在处理的最后，对于每一处理组，将500个细胞/孔接种于超低粘附24孔板的8个孔中的500μl无血清M11培养基中，所述无血清M11培养基含有bFGF和EGF，并在没有处理的情况下所述细胞再生长5天。在这个时期的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并测量球体表面。在5天“清除（washout）”期（其间来自全部原始处理条件的Huh-6细胞在相同的M11培养基中生长）的最后，进行拍照。此后，对全部孔的特性并不知情的操作者计数球状体。

B.结果

如图11中所示，通过用针对胃泌素的单克隆抗体预处理48小时，显著地降低了Huh6肝母细胞瘤细胞在低粘附平板中生长成球状体的能力。

实施例14：当用抗PG单克隆抗体处理时，Huh7肝母细胞瘤细胞在球状体生长条件下形成了较少的球状体

这个实施例显示了抗hPG单克隆抗体对Huh7细胞在低粘附培养条件下形成球状体的影响。

A.方法

在第一个实验中，将Huh-7肝母细胞瘤细胞接种在超低粘附24孔板（500个细胞/孔）中的无血清M11培养基（具有20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12）中。在37℃，用载体（PBS，对照）或3μg/ml抗hPG MAb13单克隆抗体（抗hPG MAb13）每天处理细胞两次，持续7天。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并计算中位数和百分率分布。

在第二个实验中，将Huh7肝母细胞瘤细胞接种在超低粘附24孔板（500个细胞/孔）中的无血清M11培养基（具有20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12）中。在37℃，用6μg/ml的对照单克隆抗体（对照MAb，P3X63Ag8，ATCC，Ref TIB-9）、抗hPG MAb13或抗hPG MAb16单克隆抗体之一每天处理细胞两次，持续7天。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并计算中位数和百分率分布。

B.结果

在第一个实验中，如图12A中显示的，与未处理的对照细胞相比，用抗hPG单克隆抗体MAb13处理的Huh7细胞大大地降低了在低粘附培养条件下培养期间形成的球状体的数目。

在第二个实验中，如图12B中显示，与用对照单克隆抗体处理的细胞相比，用抗hPG单克隆抗体MAb13或抗体MAb16处理的Huh7细胞大大地降低了在低粘附培养条件下培养期间形成的球状体的数目。

实施例15：当在低粘附条件下生长时，用抗hPG单克隆抗体预处理的Huh7肝细胞癌细胞形成了更少的球状体

这个实施例显示了用抗前胃泌素单克隆抗体进行的预处理对Huh7肝细胞癌细胞在低粘附培养条件下形成球状体的能力的抑制作用。

A.方法

在一个实验中，首先将75,000个Huh7肝细胞癌细胞/孔接种在6孔板中的具有10%FCS的MEMα中、血清饥饿过夜，并在10μg/mL抗前胃泌素单克隆抗体MAb8或对照单克隆抗体（P3X63Ag8，ATCC，Ref TIB-9）存在下在MEMα+0.5%Pannexin H中生长60个小时。在处理的最后，对于每一处理组，将500个细胞/孔接种于超低粘附24孔板的8个孔中的500μl无血清M11培养基中，所述无血清M11培养基含有bFGF和EGF，并在没有处理的情况下再生长5天。在这个时期的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并测量球体表面。在5天“清除（washout）”期（其间来自全部原始处理条件的Huh-7细胞都在相同的M11培养基中生长）的最后，进行拍照。此后，对全部孔的特性并不知情的操作者计数球状体。

在第二个实验中，首先将75,000个Huh7肝细胞癌细胞/孔接种在具有10%FCS的MEMα的6孔板中、血清饥饿过夜，并在10μg/mL抗前胃泌素单克隆抗体MAb16或对照单克隆抗体（P3X63Ag8，ATCC，Ref TIB-9）的存在下在MEMα+0.5%Pannexin H中生长60个小时。在处理的最后，对于每一处理组，将500个细胞/孔接种于超低粘附24孔板的8个孔中的500μl无血清M11培养基中，所述无血清M11培养基含有bFGF和EGF，并在没有处理的情况下再生长5天。在这个时期的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并测量球体表面。在5天“清除（washout）”期（其间来自全部原始处理条件的Huh-7细胞都在相同的M11培养基中生长）的最后，进行拍照。此后，对全部孔的特性并不知情的操作者计数球状体。

B.结果

结果在图13A-B中显示。如图13A中所示，通过用抗hPG MAb8预处理48个小时，Huh7细胞在低粘附平板中生长成球状体的能力显著降低。如图13B中所示，通过用抗hPG MAb16预处理48个小时，Huh7细胞在低粘附平板中生长成球状体的能力显著降低。

实施例16：当用抗PG抗体处理时，Huh7肝细胞癌“侧群”细胞在低粘附培养条件下形成了较少的球状体

这个实施例显示了用抗hPG单克隆抗体进行的处理对来自Huh7肝癌细胞系的排出染料“侧群”细胞在低粘附培养条件下生长成球状体的影响。

A.方法

如实施例8中所述分离Huh7细胞的排出染料侧群细胞。然后，将侧群细胞接种在超低粘附24孔板（1000个细胞/孔）中的M11培养基中，并在对照培养基或抗前胃泌素单克隆抗体MAb8或MAb13（6μg/ml）（每一种处理8个孔）存在的情况下，所述侧群细胞在37℃生长7天。M11培养基的组成如下：DMEM/F12-Glutamax（目录号31331Invitrogen）；20ng/ml EGF（R&D systems）；10ng/ml FGF（R&D systems）；20μg/ml胰岛素（Sigma）；N2补充物（目录号P1510，Gibco）的1/100稀释物；2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并计算平均值和标准差。

B.结果

如图14中所示，与在对照培养基中生长的细胞相比，用抗hPG单克隆抗体处理的从Huh7细胞系纯化的侧群细胞大大地降低了在低粘附培养条件下培养期间形成的球状体的数目。

实施例17：在低粘附生长条件下，用抗PG抗体处理的PLC/PRL/5肝细胞癌细胞形成了较少的球状体

这个实施例显示了抗hPG单克隆抗体对在低粘附培养条件下PLC/PRL/5细胞的球状体的形成的影响。

A.方法

在一个实验中，首先将PLC/PRL/5肝细胞癌细胞接种在超低粘附96孔板（35个细胞/孔）中的无血清M11培养基（具有20ng/mlEGF、10ng/ml FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12）中。在37℃，用3μg/ml的对照单克隆抗体（对照MAb，P3X63Ag8，ATCC，RefTIB-9）或抗hPG MAb19单克隆抗体每天处理细胞两次，持续8天。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并计算中位数和百分率分布。

在另一实验中，将PLC/PRL/5肝细胞癌细胞接种在超低粘附24孔板（200个细胞/孔）中的无血清M11培养基（具有20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12）中。在37℃，用6μg/ml的对照单克隆抗体或抗hPG MAb13单克隆抗体每天处理细胞两次，持续7天。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并计算中位数和百分率分布。

在另一个实验中，将PLC/PRL/5肝细胞癌细胞接种在超低粘附24孔板（200个细胞/孔）中的无血清M11培养基（具有20ng/ml EGF、10ng/ml FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12）中。在37℃，用6μg/ml的对照MAb、抗hPG MAb8或抗hPG MAb13单克隆抗体之一每天处理细胞两次，持续7天。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并计算中位数和百分比分布。

B.结果

结果显示于图15A-C中。如图15A中所示，与用对照MAb处理的细胞相比，用抗hPG MAb19处理显著地降低了PLC/PRL/5细胞在低粘附培养条件下培养期间形成的球状体的数目。如图15B中所示，与用对照MAb处理的细胞相比，用抗hPG MAb13处理显著地降低了在低粘附培养条件下，通过PLC/PRL/5细胞形成的球状体的数目。如图15C中所示，与用对照MAb处理的细胞相比，用抗hPGMAb8或MAb13进行的处理显著地降低了PLC/PRL/5细胞在低粘附培养条件下形成的球状体的数目。

实施例18：当在低粘附条件下生长时，用抗hPG单克隆抗体预处理的PLC/PRF/5细胞形成了更少的球状体

该实施例显示了抗hPG单克隆抗体预处理对肝细胞癌细胞在低粘附条件下形成球状体的能力的抑制效应。

A.方法

将50,000个PLC/PRF/5肝细胞癌细胞/孔接种在具有10%FCS的EMEM的6孔板中、血清饥饿过夜，并在10μg/mL抗hPG MAb8、抗hPG MAb16或对照单克隆抗体（对照MAb，P3X63Ag8，ATCC，Ref TIB-9）存在的EMEM+0.5%Pannexin H中生长72个小时。在处理的最后，对于每一处理组，将200个细胞/孔接种于超低粘附24孔板的8个孔中的500μl无血清M11培养基中，所述无血清M11培养基含有bFGF和EGF，并在没有处理的情况下所述细胞再生长5天。在这个时期的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并测量球状体表面。在5天“清除”期（其间来自全部原始处理条件的PLC/PRF/5细胞都在相同的M11培养基中生长）的最后，进行拍照。此后，对全部孔的特性都并不知情的操作者计数球状体。

B.结果

如图16中所示，与对照MAb相比，通过用针对前胃泌素的两种不同的单克隆抗体在先处理72个小时显著地降低了PLC/PRF/5肝细胞癌细胞在低粘附平板中形成球状体的能力。

实施例19：当用抗hPG抗体处理时，PLC/PRL/5肝细胞癌“侧群”细胞在低粘附培养条件下形成了较少的球状体

该实施例显示了抗hPG单克隆抗体对从PLC/PRL/5肝癌细胞分离的排出染料“侧群”细胞在低粘附培养条件下形成球状体的影响。

A.方法

如实施例8中所述分离PLC/PRL/5细胞的排出染料侧群细胞。然后，将侧群细胞接种到超低粘附24孔板（400个细胞/孔）中的M11培养基中，并在对照培养基或抗前胃泌素单克隆抗体MAb13（6μg/ml）或MAb16（10μg/ml）（每一种处理6个孔）存在的情况下，所述侧群细胞在37℃生长7天。M11培养基的组成如下：DMEM/F12-Glutamax（目录号31331Invitrogen）；20ng/ml EGF（R&D systems）；10ng/ml FGF（R&D systems）；20microg/ml胰岛素（Sigma）；N2补充物（目录号P1510，Gibco）的1/100稀释物；2μg/ml环丙沙星、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖。在实验的最后，进行显微照相，计数每孔的球体的数目，并计算平均值和标准差。

B.结果

如图17中所示，与仅仅在培养基中生长的细胞相比，用抗hPG单克隆抗体对从PLC/PRL/5细胞系分离的侧群细胞的处理大大地降低了在低粘附培养条件下形成的球状体的数目。

在本申请中引用的全部公开、专利、专利申请和其他的文献出于所有目的都在此处以其整体并入本文，就如同每一公开、专利、专利申请或其他的文献出于所有目的被单独地说明被并入本文作为参考一样。

尽管阐述并描述了多种特定的实施方案，将理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行多种改变。

Claims (8)

1.抗人前胃泌素单克隆抗体在制备用于治疗肝癌或预防肝癌复发的药物中的用途，并且其中该抗人前胃泌素单克隆抗体包含：

a.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.3(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR 2.3(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列,以及CDR3包含V_H CDR 3.3(SEQID NO:3)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR 1.3(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.3(SEQ IDNO:5)的氨基酸序列，以及CDR3包含V_L CDR 3.3(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列；

b.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.16(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR2.16(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列,以及CDR3包含V_H CDR 3.16(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列,该轻链可变区的CDR1包含V_LCDR 1.16(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.16(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，以及CDR3包含V_L CDR 3.16(SEQID NO:57)的氨基酸序列；

c.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.19(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR2.19(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列,以及CDR3包含V_H CDR 3.19(SEQ ID NO:48)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR1.19(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.19(SEQID NO:54)的氨基酸序列，以及CDR3包含V_L CDR 3.19(SEQ IDNO:58)的氨基酸序列；

d.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.8(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR 2.8(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列,及CDR3包含V_H CDR 3.8(SEQ IDNO:45)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR 1.8(SEQ ID NO:49)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.8(SEQ IDNO:52)的氨基酸序列，及CDR3包含V_L CDR 3.8(SEQ ID NO:55的氨基酸序列)；或

e.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.13(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR2.13(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列,及CDR3包含V_H CDR 3.13(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR1.13(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.13(SEQID NO:53)的氨基酸序列，及CDR3包含V_L CDR 3.13(SEQ IDNO:56)的氨基酸序列。

2.根据权利要求1的用途,其中该抗人前胃泌素单克隆抗体包含：

(a)SEQ ID NO:12的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变区序列；

(b)SEQ ID NO:61的重链可变区序列和SEQ ID NO:65的轻链可变区序列；

(c)SEQ ID NO:62的重链可变区序列和SEQ ID NO:66的轻链可变区序列；

(d)SEQ ID NO:59的重链可变区序列和SEQ ID NO:63的轻链可变区序列；或

(e)SEQ ID NO:60的重链可变区序列和SEQ ID NO:64的轻链可变区序列。

3.权利要求1的所述用途，其中所述抗人前胃泌素单克隆抗体是人源化单克隆抗体。

4.根据权利要求1的用途，其中所述抗人前胃泌素单克隆抗体与选自下述的参考抗体竞争结合hPG：

(a)包含SEQ ID NO:12的重链可变区序列和SEQ ID NO:13的轻链可变区序列的单克隆抗体；

(b)包含SEQ ID NO:61的重链可变区序列和SEQ ID NO:65的轻链可变区序列的单克隆抗体；

(c)包含SEQ ID NO:62的重链可变区序列和SEQ ID NO:66的轻链可变区序列的单克隆抗体；

(d)包含SEQ ID NO:59的重链可变区序列和SEQ ID NO:63的轻链可变区序列的单克隆抗体；

(e)包含SEQ ID NO:60的重链可变区序列和SEQ ID NO:64的轻链可变区序列的单克隆抗体。

5.根据权利要求1的所述用途，其中所述抗人前胃泌素单克隆抗体辅助于手术切除、化疗或放疗而施用。

6.抗人前胃泌素单克隆抗体在制备用于抑制肝肿瘤细胞或肝癌干细胞增殖的药物中的用途，并且其中该抗人前胃泌素单克隆抗体包含：

a.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_HCDR 1.3(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR 2.3(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列,以及CDR3包含V_H CDR 3.3(SEQID NO:3)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR 1.3(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.3(SEQ IDNO:5)的氨基酸序列，以及CDR3包含V_L CDR 3.3(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列；

b.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.16(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR2.16(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列,以及CDR3包含V_H CDR 3.16(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列,该轻链可变区的CDR1包含V_LCDR 1.16(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.16(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，以及CDR3包含V_L CDR 3.16(SEQID NO:57)的氨基酸序列；

c.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.19(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR2.19(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列,以及CDR3包含V_H CDR 3.19(SEQ ID NO:48)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR1.19(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.19(SEQID NO:54)的氨基酸序列，以及CDR3包含V_L CDR 3.19(SEQ IDNO:58)的氨基酸序列；

d.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.8(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR 2.8(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列,及CDR3包含V_H CDR 3.8(SEQ IDNO:45)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR 1.8(SEQ ID NO:49)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.8(SEQ IDNO:52)的氨基酸序列，及CDR3包含V_L CDR 3.8(SEQ ID NO:55的氨基酸序列；或

e.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.13(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR2.13(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列,及CDR3包含V_H CDR 3.13(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR1.13(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.13(SEQID NO:53)的氨基酸序列，及CDR3包含V_L CDR 3.13(SEQ IDNO:56)的氨基酸序列。

7.根据权利要求1的抗人前胃泌素单克隆抗体在制备用于在受试者中预防肝癌复发的药物中的用途，其中所述受试者已经进行了肝癌治疗和经测量血清前胃泌素水平为500pM或更高。

8.监测受试者血液前胃泌素水平的抗人前胃泌素单克隆抗体在制备用于监测肝癌治疗的有效性的试剂盒中的用途，其中受试者的血清中前胃泌素水平的时间依赖性减少表明治疗是有效的，并且其中该抗人前胃泌素单克隆抗体包含：

a.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_HCDR 1.3(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR 2.3(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列,以及CDR3包含V_H CDR 3.3(SEQID NO:3)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR 1.3(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.3(SEQ IDNO:5)的氨基酸序列，以及CDR3包含V_L CDR 3.3(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列；

b.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.16(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR2.16(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列,以及CDR3包含V_H CDR 3.16(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列,该轻链可变区的CDR1包含V_LCDR 1.16(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.16(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列，以及CDR3包含V_L CDR 3.16(SEQID NO:57)的氨基酸序列；

c.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.19(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR2.19(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列,以及CDR3包含V_H CDR 3.19(SEQ ID NO:48)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR1.19(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.19(SEQID NO:54)的氨基酸序列，以及CDR3包含V_L CDR 3.19(SEQ IDNO:58)的氨基酸序列；

d.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.8(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR 2.8(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列,及CDR3包含V_H CDR 3.8(SEQ IDNO:45)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR 1.8(SEQ ID NO:49)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.8(SEQ IDNO:52)的氨基酸序列，及CDR3包含V_L CDR 3.8(SEQ ID NO:55的氨基酸序列；或

e.重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区的CDR1包含V_H CDR 1.13(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列,CDR2包含V_H CDR2.13(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列,及CDR3包含V_H CDR 3.13(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列，该轻链可变区的CDR1包含V_L CDR1.13(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列,CDR2包含V_L CDR 2.13(SEQID NO:53)的氨基酸序列,及CDR3包含V_L CDR 3.13(SEQ IDNO:56)的氨基酸序列。