ES2548714T3

ES2548714T3 - Anticuerpos monoclonales IL-31 y procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2548714T3
Application number: ES14165476.4T
Authority: ES
Inventors: Anthony W. Siadak; Janine Bilsborough; Shirley Rene
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2006-09-01
Filing date: 2007-09-04
Publication date: 2015-10-20
Anticipated expiration: 2027-09-04
Also published as: AU2007290145A1; CA2660175A1; US9011858B2; WO2008028192A3; BRPI0715660B8; JP2016106105A; US8466262B2; DK2594586T3; JP2014122220A; AU2007290145B2; HK1199047A1; PT2594586E; EP2759549A2; BRPI0715660B1; US20130266562A1; ES2519375T3; US20170182160A1; IL196914A0; BRPI0715660A2; KR20090113818A

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo monoclonal que se une a IL-31 humana, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma depositado ante la American Type Culture Collection que tiene la Designación de depósito de patente ATCC PTA-6815; en donde dicho anticuerpo comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada el cual es una IgG4 humana; en donde dicho dominio constante de IgG4 humana tiene una mutación Ser a Pro en la posición 241 de Kabat.

Description

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reticulada o materiales similares que sean estables bajo las condiciones de uso. Los procedimientos para enlazar polipéptidos a soportes sólidos son bien conocidos en la técnica e incluyen química de amina, activación por bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación de epóxido, activación por sulfhidrilo y activación por hidrazida. El medio resultante generalmente se configurará en forma de una columna y los fluidos que contienen ligando se hacen pasar a través de la columna una o más veces para permitir que el ligando se una al polipéptido receptor. El ligando después se eluye utilizando cambios en la concentración de sal, agentes caotrópicos (clorhidrato de guanidina), o pH para interrumpir la unión ligando-receptor.

Un sistema de análisis que utiliza un ligando-receptor de unión (o un anticuerpo, un miembro de un par complemento/anticomplemento) o un fragmento de unión del mismo y un instrumento biosensor disponible comercialmente (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) se pueden utilizar de manera ventajosa. El receptor, anticuerpo, miembro de un par complemento/anticomplemento o fragmento se inmoviliza sobre la superficie de un chip receptor. El uso de este instrumento se describe por Karlsson, J. Immunol. Methods 145:22940, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento se une covalentemente utilizando química de amina o sulfhidrilo, a fibras de dextrano que se unen a una película de oro dentro de la célula de flujo. Una muestra de prueba se hace pasar a través de la célula. Si un ligando, epítopo o miembro opuesto del par complemento/anticomplemento está presente en la muestra, se unirá al receptor inmovilizado, anticuerpo o miembro, respectivamente, provocando un cambio en el índice de refracción del medio, el cual se detecta como un cambio en la resonancia de plasmón de superficie de la película de oro. Este sistema permite la determinación de tasas de entrada y salida, a partir de las cuales se puede calcular la afinidad de unión y determinación de la estequiometría de unión. De manera alternativa, la unión ligando/receptor se puede analizar utilizando la tecnología SELDIMR (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).

Las moléculas que se unen IL-31 o los antagonistas de IL-31 se pueden utilizar para bloquear la acción biológica de IL-31 proinflamatoria y son útiles como sustancias terapéuticas antiinflamatorias en diversas enfermedades como se describe en el presente documento. Una persona experta en la técnica puede reconocer que los polipéptidos que portan epítopo, antigénicos, contienen una secuencia de por lo menos 6, preferentemente por lo menos 9 y de manera más preferente por lo menos 15 a 30 residuos aminoácidos contiguos de un polipéptido IL-31 (por ejemplo SEC ID Nº.: 2). Los polipéptidos que comprenden una porción más grande de un polipéptido IL-31, es decir, de 30 a 100 residuos hasta la longitud completa de la secuencia de aminoácidos se incluyen. Los antígenos o epítopos inmunogénicos también pueden incluir etiquetas unidas, adyuvantes, vehículos y portadores, como se describe en el presente documento. Los antígenos adecuados incluyen un polipéptido IL-31 codificado por la SEC ID Nº.: 2 del aminoácido número 24 al aminoácido número 164 o un fragmento de 9 a 141 aminoácidos contiguos del mismo. Otros antígenos adecuados incluyen la longitud completa de IL-31 madura, las hélices A-D y las hélices individuales

o múltiples A, B, C o D de la estructura de IL-31 con cuatro conjuntos helicoidales, como se describe en el presente documento. Los péptidos preferentes para uso como antígenos son péptidos hidrofílicos tales como los prelos por aquellos expertos en la técnica a partir de una gráfica de hidrofobicidad, como se describe en el presente documento, por ejemplo, los residuos aminoácidos 114-119, 101-105, 126-131, 113-118 y 158-162 de la SEC ID Nº.: 2; y los residuos aminoácidos 34-39, 46-51, 131-136, 158-163 y 157-162 de la SEC ID Nº.: 4. Además, los epítopos antigénicos IL-31, como se predicen por la gráfica de Jameson-Wolf, por ejemplo, utilizando el programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI) sirven como antígenos preferentes y se determinan con facilidad por una persona experta en la técnica.

Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 se consideran que se unen específicamente si: 1) muestran un nivel umbral de actividad de unión, y 2) no dan reacción cruzada significativa con moléculas polipeptídicas relacionadas. Un nivel umbral de unión se determina si las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 en el presente documento se unen a un polipéptido, péptido o epítopo de IL-31 con una afinidad por lo menos diez veces mayor que la afinidad de unión al polipéptido control (diferente de IL-31). Se prefiere que los anticuerpos muestren una afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o mayor, preferentemente 107 M-1 o mayor, de manera más preferente 108 M-1 mayor y de manera mucho más preferente 109 M-1 o mayor. La afinidad de unión de las moléculas que se unen a IL-31 o los antagonistas de IL-31 se pueden determinar fácilmente por una persona habitualmente experta en la técnica, por ejemplo por análisis Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci.

51: 660-672, 1949).

Aunque las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 no dan reacción cruzada significativa con moléculas polipeptídicas relacionadas y esto se determina, por ejemplo, por las moléculas que se unen a IL-31 o los antagonistas de IL-31 que detectan el polipéptido IL-31 pero no los polipéptidos relacionados conocidos utilizando análisis de transferencia Western estándar (Ausubel et al., ibid.). Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos son aquellos descritos en la técnica anterior tales como ortólogos conocidos y parálogos así como miembros conocidos similares de una familia de proteína. El cribado también se puede realizar utilizando polipéptidos no humanos de IL-31 e IL-31 mutante. Además, las moléculas que se unen a IL-31 o los antagonistas de IL-31 pueden ser “cribados contra” polipéptidos relacionados conocidos para aislar una población que se una específicamente a los polipéptidos IL-31. Por ejemplo, las moléculas que se unen a IL-31 o los antagonistas de IL-31 se absorben a polipéptidos relacionados que se adhieren a la matriz insoluble; las moléculas que se unen a IL-31 o los antagonistas de IL-31 específicas para IL-31 fluirán a través de la matriz bajo condiciones de amortiguador apropiadas. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988;

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Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995.

Los anticuerpos monoclonales purificados a partir de medio de cultivo de tejido se caracterizan por su capacidad para bloquear o reducir la actividad de unión del receptor (“análisis de neutralización”) de huIL-31 recombinante purificado sobre células BaF3/MPL-IL-31.

La afinidad de unión de las moléculas que se unen a IL-31 y el antagonista de IL-31 se pueden determinar. Un anticuerpo específico de chip contra Fc γ de IgG de rata (Jackson) se inmoviliza en un chip CM5 Biacore. Se optimiza el análisis para unión de cada mAb a la superficie de captación anti-Rat y después se inyecta una serie de concentración de IL-31 a través del mAb para determinar la asociación (Ka) y disociación (Kd). Después de cada corrida se regenera la superficie nuevamente para el anticuerpo anti-Rat con dos inyecciones de HCl 20 Mm. Se generan datos para cada uno y se utiliza un programa de evaluación (programa BIAevaluation, versión 3.2, Pharmacia BIAcore, Upssala, Suecia) para determinar la cinética del anticuerpo anti-IL-31 que se une a la proteína IL-31.

La secuencia polinucleotídica y polipeptídica de las regiones variables de la cadena ligera y de la cadena pesada de los clones números 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4, 292.72.3.1 se determina como se muestra en el Ejemplo 1. La secuencia polipeptídica de la parte amino terminal de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los clones números se determina como se muestra en el Ejemplo 2.

Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 en medio de cultivo de tejido se caracterizan por su capacidad para bloquear, inhibir, evitar o reducir la unión de receptor cuando crecen en presencia de las proteínas recombinantes purificadas humanas de IL-31. Por ejemplo, las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL31 se pueden caracterizar de numerosas maneras que incluyen tirado (es decir, determinar si cada anticuerpo puede inhibir la unión de cualquier otra unión), afinidad relativa y neutralización.

Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 generados por los procedimientos descritos en el presente documento se pueden probar para neutralización por diversos procedimientos. Por ejemplo, el análisis de luciferasa como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. publicada (véase número de publicación 20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003) se puede utilizar. Además se puede probar la neutralización al medir una disminución en la producción de quimiocinas proinflamatorias tales como TARC y MDC a partir de cultivos de queratinocitos en presencia de ligando y el anticuerpo monoclonal. La neutralización también se puede medir por modelos in vivo descritos en el presente documento.

En una realización, las moléculas de unión IL-31 o los antagonistas de IL-31 que se divulgan en el presente documento son fragmentos de anticuerpo que unen antígeno humano de la presente divulgación e incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab’ y F(ab’)2, Fd de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos por disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden el dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpo que unen antígeno incluyen anticuerpos de cadena sencilla y pueden comprender una o varias de las regiones variables (es decir, la SEC ID Nº. 1, 2, 3 o 4) sola o en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: región de bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se divulgan en el presente documento fragmentos que unen antígeno que comprenden también cualquier combinación de una o varias regiones variables con una región de bisagra, o los dominios CH1, CH2 y CH3.

En otra realización, las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o con una multiespecificidad mayor. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido de la presente divulgación o pueden ser específicos tanto para un polipéptido de la presente divulgación así como para un epítopo heterólogo tal como un polipéptido heterólogo o un material de soporte sólido. Véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tuft, et al., J. Immunol. 146:60-69 (1991); patentes de EE.UU. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).

La presente divulgación también incluye moléculas de unión de IL-1 o antagonistas de IL-31 alteradas genéticamente que son funcionalmente equivalentes a las moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 descritos en lo anterior. Se prefieren las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 modificados que proporcionen estabilidad y/o eficacia terapéutica mejoradas. Los ejemplos de anticuerpos modificados incluyen aquellos con sustituciones conservadoras de residuos aminoácidos y una o más supresiones o adiciones de aminoácidos las cuales no alteren de manera dañina significativamente la utilidad de unión de antígeno. Las sustituciones pueden variar desde cambiar o modificar uno o más residuos aminoácidos hasta rediseño completo de una región en la medida en que se mantengan la utilidad terapéutica. Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 de la presente divulgación se pueden modificar postraduccionalmente (por ejemplo acetilación y fosforilación) o se pueden modificar sintéticamente (por ejemplo, la unión de un grupo marcador).

Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 también incluyen anticuerpos quiméricos o fragmentos quiméricos que comprenden una región variable como se describe en el presente documento y una región constante

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derivada de un humano de manera que el anticuerpo quimérico o el fragmento quimérico tenga una vida media más prolongada y que se menos inmunogénico cuando se administra a un sujeto humano. Se conoce en la técnica el procedimiento de elaboración de anticuerpos quiméricos y fragmentos quiméricos. Las regiones variables de estas moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 se pueden conectar con una región constante de una IgG humana para formar el anticuerpo quimérico deseado. Una molécula de Fc de IgG se puede fusionar a las moléculas de unión de IL-31. Para evitar la inducción de la función efectora, la molécula Fc de IgG puede ser una molécula Fc de IgG4. De esta manera, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables y las regiones variables como se describen en el presente documento se pueden utilizar para generar anticuerpos quiméricos en donde la región constante es una molécula de IgG humana y la cadena ligera y las regiones variables de cadena pesada se pueden seleccionar de aquellas de los clones 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4 y 292.72.3.1. Los anticuerpos quiméricos pueden tener: a) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 8 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 9; b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 10 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 11; c) y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº.: 12 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 13; d) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 14 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº.: 15; e) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 16 y la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 17; f) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 18 y la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 19; g) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 20 y la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 21; h) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 22 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 23; i) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 24 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 25; o j) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 26 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 27 y que se utiliza junto con una molécula Fc de IgG4 humana.

Dichas regiones variables también se pueden generar con o sin las secuencias de señal. De esta manera, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables y las regiones variables como se describen en el presente documento se pueden utilizar para generar anticuerpos quiméricos en donde la región constante es una molécula de IgG humana y las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada pueden tener una secuencia de señal y se pueden seleccionar de los clones 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 2.92.118.6.4 y 292.72.3.1. Los anticuerpos quiméricos pueden tener: a) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 31 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 32; b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 2 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 4; c) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 35 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 36; d) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 37 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 38; e) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 39 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 40; f) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 41 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 42; g) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 43 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 44; h) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 45 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 46; i) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 47 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 48; o j) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 49 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº. 50 y que se utiliza junto con una molécula Fc de IgG4 humana. Las regiones variables se pueden generar con o sin las secuencias de señal.

Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 incluyen la versión humanizada de las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 descritos en el presente documento. Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 humanizados comprenden las CDR de una inmunoglobulina donante de ratón y las infraestructuras de cadena pesada y de cadena ligera de una inmunoglobulina aceptora humana. El procedimiento de elaboración de anticuerpo humanizado se divulga en las patentes de EE.UU. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762; y 6.180.370. Las CDR de estos anticuerpos se pueden injertar en cualquiera de las infraestructuras

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humanas seleccionadas, las cuales se conocen en la técnica para generar el anticuerpo humanizado deseado.

La divulgación también proporciona moléculas que se unen a IL-31 o antagonistas de IL-31 que inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo monoclonal a un polipéptido de la invención, preferentemente el polipéptido de la SEC ID Nº. 2 o SEC ID Nº. 4. La inhibición competitiva se puede determinar por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, utilizando análisis de unión competitivos descritos en el presente documento. En realizaciones preferentes, el anticuerpo inhibe de manera competitiva la unión de un anticuerpo monoclonal de la invención en por lo menos 90 %, por lo menos 80 %, por lo menos 70 %, por lo menos 60 % o por lo menos 50 % del polipéptido de la SEC ID Nº. 2 o SEC ID Nº. 4.

La divulgación también proporciona moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 que inhiben de manera competitiva la unión de un anticuerpo o un epítopo de la invención, determinado por cualquier procedimiento conocido en la técnica para determinar unión competitiva, por ejemplo, los inmunoanálisis descritos en el presente documento. En realizaciones preferentes, el anticuerpo inhibe de manera competitiva la unión al epítopo en por lo menos 90 %, por lo menos 80 %, por lo menos 70 %, por lo menos 60 % o por lo menos 50 %.

Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 descritos en el presente documento incluyen derivados que son modificados, por ejemplo, pero no a modo de limitación, y el derivado incluye moléculas que se unen a IL-31

o antagonistas de IL-31 que han sido modificados, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivatización (formación de derivados) por grupos protectores/bloqueadores conocidos, separación proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo por técnicas conocidas que incluyen, pero que no se limitan a separación química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. De manera adicional, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 descritos en el presente documento, también abarcan moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 que tienen vidas media (por ejemplo vidas media en suero) en un mamífero, preferentemente un humano, mayor de 15 días, preferentemente mayor de 20 días, mayor de 25 días, mayor de 30 días, mayor de 35 días, mayor de 40 días, mayor de 45 días, mayor de 2 meses, mayor de 3 meses, mayor de 4 meses o mayor de 5 meses. Las vidas media aumentadas de los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos en un mamífero, preferentemente un humano, resultan en un título superior en suero de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en el mamífero y por lo tanto reducen la frecuencia de la administración de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, y/o reducen la concentración de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se administran.

La vida media in vivo de las moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 pueden aumentar modificando (por ejemplo, al sustituir, suprimir o agregar) residuos aminoácidos identificados como se indica en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn (véase, por ejemplo, las publicaciones internacionales Nos. WO 97/34631 y WO 02/060919, las cuales se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad) o por unión de moléculas poliméricas tales como polietilenglicol (PEG) de peso molecular alto. Se puede unir PEG con o sin un enlazador multifuncional ya sea a través de conjugación específica de sitio de PEG a la parte N o C terminal de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o por medio de grupos -amino presentes en residuos lisina. La formación de derivados poliméricos lineales o ramificados que resulte en pérdida mínima de actividad biológica se puede utilizar. El grado de conjugación se vigilará estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar conjugación apropiada de moléculas PEG a los anticuerpos. El PEG que no haya reaccionado se puede separar de los conjugados anticuerpo-PEG, por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño o intercambio iónico.

Se entiende que las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 humanizados diseñados por el presente procedimiento pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadores adicionales, los cuales sustancialmente no tengan efecto sobre la unión de antígeno u otras funciones de inmunoglobulina. Por sustituciones conservadoras se quieren indicar combinaciones tales como gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr.

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, las inmunoglobulinas humanizadas incluyen anticuerpos humanizados que han sido construidos por medio de ingeniería (manipulación) genética. La mayor parte de las inmunoglobulinas humanizadas que han sido descritas previamente (Jones et al., op. cit; Verhoeyen et al., op. cit; Riechmann et al., op. cit) están constituidas de una infraestructura que es idéntica a la infraestructura de una cadena de inmunoglobulina humana particular, el aceptor y tres CDR de una cadena de inmunoglobulina donante no humana. Específicamente, los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de anticuerpo de especie no humana que se unen al antígeno deseado que tiene una o más regiones determinadoras de complementariedad (las CDR) de una especie no humana y regiones de infraestructura de una molécula de inmunoglobulina humana.

La presente divulgación incluye criterios por medio de los cuales un número limitado de aminoácidos en la infraestructura de una cadena de inmunoglobulina humanizada se seleccionan para que sean iguales que los aminoácidos en aquellas posiciones en el donante en vez del aceptor con el fin de incrementar la afinidad de un

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expertos en la técnica. Se pueden utilizar diversas regiones de infraestructura humanas diferentes solas o combinadas, como una base para las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención. En general, las modificaciones de los genes se pueden llevar a cabo fácilmente por diversas técnicas bien conocidas, tales como mutagénesis dirigida a sitio (véase Gillman y Smith, Gene, 8, 81-97 (1979) y S. Roberts et al., Nature, 328, 731-734 (1987).

Los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento incluyen fragmentos así como anticuerpos intactos. Normalmente, estos fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del cual se derivan, por la unión a antígeno. Los fragmentos normalmente se unen con una afinidad de por lo menos 107 M-1, y de manera más habitual 108 o 109 M-1 (es decir, dentro de los mismos intervalos que el anticuerpo intacto). Los fragmentos de anticuerpo humanizados incluyen cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv. Los fragmentos se producen por técnicas de ADN recombinante o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

Para detalles adicionales respecto a los anticuerpos humanizantes véanse las patentes europeas Nos. 239,400, 592,106 y 519,596; las publicaciones internacionales Nos. WO 91/09967 y WO 93/17105; las patentes de EE.UU. Nos. 5.225.539, 5.530.101, 5.565.332, 5.585.089, 5.766.886 y 6.407.213; y Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489 498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7/6): 805 814; Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969 973; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1119 25; Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353 60; Morea et al., 2000, Methods

20: 267 79; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 10678 84; Roguska et al., 1996; Protein Eng. 9: 895 904; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s 5977s; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55: 1717 22; Sandhu, 1994, Gene 150: 409 10; Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235: 959 73; Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Reichamnn et al., 1988, Nature 332: 323-329; y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan vía digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 228:81 (1985)). No obstante, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente por células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, se pueden aislar los fragmentos de anticuerpo a partir de las bibliotecas de fago de anticuerpo descritas en lo anterior. De manera alternativa, los fragmentos Fab’-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y se pueden acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Tehcnology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab’)2 se pueden aislar directamente de un cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para los expertos en la técnica. Además, los ejemplos de técnicas las cuales se pueden utilizar para producir los Fv de cadena sencilla y anticuerpos incluyen aquellos descritos en la patente de EE.UU. 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods en Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

La presente divulgación abarca anticuerpos fusionados de manera recombinante o conjugados químicamente (que incluyen conjugaciones covalentes y no covalentes) a un polipéptido (o una porción del mismo, preferentemente por lo menos 10, 20 o 50 aminoácidos del polipéptido) de la presente invención para generar proteínas de fusión. Por lo tanto, la divulgación también se relaciona con inmunoconjugados que comprende el anticuerpo descrito en el presente documento conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, micótico, vegetal o animal o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (por ejemplo un radioconjugado).

La presente divulgación abarca anticuerpos fusionados de manera recombinante o conjugados químicamente (que incluyen conjugaciones covalentes y no covalentes) a un polipéptido o porción del mismo, preferentemente de por lo menos 10, 20 o 50 aminoácidos del polipéptido) de la presente invención para generar proteínas de fusión. La fusión no necesariamente necesita ser directa sino que se puede llevar a cabo a través de secuencias enlazadoras. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes de polipéptidos (o porciones de los mismos, preferentemente de por lo menos 10, 20 o 50 aminoácidos del polipéptido) de la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden utilizar para dirigir los polipéptidos de la presente invención a tipos de células particulares, in vitro o in vivo, al fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención a anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particulares. Los anticuerpos fusionados o conjugados a los polipéptidos de la presente invención también se pueden utilizar en inmunoanálisis in vitro y procedimientos de purificación que utilicen procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harbor et al., supra y la publicación PCT WO 93/21232; EP 439.095; Naramura e t al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); Patente de EE.UU. número 5.474.981; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452 (1991).

La presente divulgación incluye de manera adicional composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo aquellos que comprenden un epítopo inmunogénico o antigénico) fusionado o conjugado a secuencias polipeptídicas heterólogas (por ejemplo dominios de anticuerpo diferentes de las regiones variables). Por ejemplo, los polipéptidos descritos en el presente documento se pueden fusionar o conjugar a una región Fc de anticuerpo o porción de la misma. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención (que incluyen fragmentos o variantes de los mismos) se pueden fusionar con el dominio constante de inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) o porciones de las mismas (CH1, CH2, CH3 o cualquier combinación de las mismas y porciones de las mismas, que

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resulten en polipéptidos quiméricos. La porción de anticuerpo fusionada a un polipéptido de la presente invención puede comprender la región constante, región de bisagra, dominio CH1, dominio CH2 y dominio CH3 o cualquier combinación de todos los dominios o porciones de las mismas. Los polipéptidos también se pueden fusionar o conjugar a las porciones de anticuerpo anteriores para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fc fusionadas a los polipéptidos de la presente invención pueden formar dímeros a través de unión disulfuro entre las porciones Fc. Se pueden producir formas multiméricas superiores al fusionar los polipéptidos a porciones de IgA e IgM. Los procedimientos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención a porciones de anticuerpo se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851; 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; publicaciones PCT WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995) y Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 (1992). A manera de otro ejemplo no limitante, los polipéptidos y/o anticuerpos descritos en el presente documento (que incluyen fragmentos o variantes de los mismos) se pueden fusionar con albúmina (que incluye pero que no se limita a albúmina sérica humana recombinante o fragmentos o variantes de los mismos (véanse, por ejemplo, patente de EE.UU. número 5.876.969, expedida el 2 de marzo de 1999, la patente EP 0 413 622 y la patente de EE.UU. número 5.766.883 expedida el 16 de junio de 1998). Los polipéptidos y/o anticuerpos descritos en el presente documento (que incluyen fragmentos o variantes de los mismos) se pueden fusionar ya sea al extremo N o C terminal de la proteína heteróloga (por ejemplo el polipéptido Fc de inmunoglobulina o el polipéptido de albúmina sérica humana). Los polinucleótidos que codifican para proteínas de fusión también están descritos en el presente documento.

Como se describe en lo que antecede, los polipéptidos de la presente divulgación se pueden fusionar o conjugar a las porciones de anticuerpo anterior para incrementar la vida media in vivo de los polipéptidos o para uso en inmunoanálisis utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Además, los polipéptidos de la presente divulgación se pueden fusionar o conjugar a las porciones de anticuerpo anteriores para facilitar la codificación. Un ejemplo presentado describe proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios y el polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas de mamífero (véase, por ejemplo EP 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). El suministro mejorado del antígeno a través de la barrera epitelial del sistema inmunitario se ha demostrado por antígenos (por ejemplo insulina) conjugado a un asociado de unión FcRn tal como los fragmentos IgG o Fc (véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 96/22024 y WO 99/04813). Los polipéptidos de la presente divulgación fusionados o conjugados a un anticuerpo que tiene estructuras diméricas unidas a disulfuro (debido a la IgG) también pueden ser más eficaces en la unión y neutralización de otras moléculas, en comparación con la proteína secretada monomérica

o el fragmento proteínico solo (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es benéfica en el tratamiento y diagnóstico y por lo tanto puede resultar, por ejemplo, en propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP A 232.262). De manera alternativa, se puede desear la supresión de la parte Fc después de que la proteína de fusión se ha expresado, detectado y purificado. Por ejemplo, la porción Fc puede impedir el tratamiento y el diagnóstico si la proteína de fusión se utiliza como un antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas tales como hIL-5 con porciones Fc con el propósito de análisis de cribado de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. (Véase D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:94599471 (1995). Las técnicas también incluyen, pero no se limitan al uso de agentes de conjugación bifuncionales (véase por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 5.756.065; 5.714.631; 5.696.239; 5.652.361; 5.505.931; 5.489.425; 5.435.990; 5.428.139; 5.342.604; 5.274.119; 4.994.560 y 5.808.003.

Además, los polipéptidos de la divulgación (por ejemplo anticuerpos o fragmentos de los mismos) se pueden fusionar a secuencias marcadoras tales como un péptido para facilitar su purificación. En una realización adicional los ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos (incluyen, pero no se limitan a ácidos nucleicos que codifican para epítopos inmunogénicos y/o antigénicos) también se pueden combinar con un gen de interés como una etiqueta de epítopo (por ejemplo la etiqueta hamaglutinina (“HA”) o la etiqueta indicadora o de bandera) para ayudar a la detección y purificación del polipéptido expresado. En realizaciones preferentes, la secuencia de aminoácidos marcadora es hexapéptido histidina tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eto Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1998), por ejemplo, la hexahistidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para purificación incluyen, pero no se limitan a la etiqueta “HA”, la cual corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) y la etiqueta “indicadora”.

La presente divulgación abarca además moléculas de unión IL-31 o antagonistas de IL-31 conjugados a un agente de diagnóstico o terapéutico. Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 se pueden utilizar de manera diagnóstica, por ejemplo, para monitorear el desarrollo o progreso de un tumor como parte de un procedimiento de prueba clínica para, por ejemplo, determinar la eficacia de un tratamiento, diagnóstico, detección y/o régimen de prevención, dados. La detección se puede facilitar por acoplamiento de anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones que utilizan diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. número 4.741.900 para iones metálicos los cuales se

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pueden conjugar a anticuerpos para uso como material de diagnóstico, de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de enzimas adecuados incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo prostético adecuado incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y los ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

Además, las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 se pueden conjugar a una porción terapéutica tal como una citotoxina, por ejemplo un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo, Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósito, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen pero no se limitan a antimetabilitos (por ejemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo descarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisplatino de cis-diclorodiamina platino (II) (DDP)), antraciclinas (por ejemplo daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo vincristina y vinblastina).

Los conjugados que se divulgan en el presente documento se pueden utilizar para modificar una respuesta biológica dada, el agente terapéutico o la porción de fármaco no se construye como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Las proteínas pueden incluir, por ejemplo una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pesudomonas o toxina de difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón A, interferón β, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo angiostatina o endostatina; o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucinas-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”), factor estimulador de colonias de granulocitos (“G-CSF”) u otros factores de crecimiento.

Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31 también se pueden unir a soportes sólidos los cuales son particularmente útiles para inmunoanálisis o purificación del antígeno objetivo. Los soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.

Las técnicas para conjugación de la porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Residfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A review”, en Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62:119-58 (1982).

De manera alternativa, las moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 se pueden conjugar a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como se describe por Segal, en la patente de EE.UU. número 4.676.980.

Las moléculas de unión de IL-31 o los antagonistas de IL-31, con o sin una protección terapéutica conjugada al mismo, administrados solos o en combinación con uno o varios factores citotóxicos y/o una o varias citocinas se pueden utilizar como una sustancia terapéutica.

Diversos análisis conocidos por aquellos expertos en la técnica se pueden utilizar para detectar la unión de moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 a proteínas o polipéptidos de IL-31. Los análisis ejemplares se describen con detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de los análisis incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoanálisis, radioinmunoprecipitación, análisis inmunosorbente unido a enzima (ELISA), punto y mancha (dot lot) o análisis de transferencia Western, análisis de inhibición o competencia y análisis de tipo emparedado. Además, los anticuerpos se pueden cribar para unión a una proteína o polipéptido de IL-31 de tipo silvestre, en comparación con un mutante.

Las moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 a IL-31 se pueden utilizar para dirigir células que expresen IL-31; para aislar IL-31 por purificación de afinidad; para análisis de diagnóstico para determinar concentraciones

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CCR6. Véase Moed H., et al., kBr J Dermatol:51, 32 (2004).

En modelos en animales se ha demostrado que la dermatitis de contacto alérgica depende de linfocitos T y que los linfocitos T que responden de manera alérgica se desplazan al sitio de aplicación del alérgeno. Véase de manera general: Engeman T.M., et al., J Immunol: 164, 5207, (200); Ferguson T.A. & Kupper T.S. J Immunol: 150, 1172, (1993); y Gorbachev A.V. & Fairchild R.L. Crit Rev Immunol: 21, 425 (2001). Dado que los linfocitos T CLA+ producen IL-31 y la estimulación de IL-31 de queratinocitos en la piel puede inducir quimiocinas proinflamatorias tales como TARC y MDC, IL-31 puede estar involucrado en la fisiopatología de dermatitis de contacto. Mediante la utilización de un anticuerpo IL-31 neutralizante en un modelo en ratón de hipersensibilidad de contacto. Véase el ejemplo 5.

De esta manera, la neutralización de IL-31 por las moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 descritos en el presente documento se pueden utilizar para mejorar el resultado clínico de hipersensibilidad de contacto por inhibición, reducción, neutralización, prevención o bloqueo de la inflamación y/o el rascado asociado con la enfermedad.

Dermatitis atópica

La dermatitis atópica (AD) es una enfermedad cutánea inflamatoria con recaída crónica, con una incidencia que aumenta de manera perceptible en las últimas décadas. Clínicamente, la AD se caracteriza por placas escoriadas con frecuencia altamente pruríticas y pápulas que muestran un curso de recaída crónica. El diagnóstico de AD se basa principalmente en hallazgos clínicos mayores y menores. Véase Hanifin J.M., Arch Dermatol: 135, 1551 (1999). La histopatología muestra espongiosis, paraqueratosis hiper y focal, en lesiones agudas mientras que la hiperplasia epidérmica marcada con hiper y paraqueratosis, acantosis/hipergranulosis e infiltración perivascular de la dermis con linfocitos y mastocitos abundantes son los factores distintivos de lesiones crónicas.

Los linfocitos T juegan un papel central en el inicio de las respuestas inmunitarias locales en tejidos y las pruebas sugieren que los linfocitos T que se infiltran en la piel, en particular, pueden jugar un papel clave en el inicio y mantenimiento de respuestas inmunitarias no reguladas en la piel. Aproximadamente 90 % de los linfocitos T que se infiltran en sitios inflamatorios cutáneos expresan el Ag asociado a linfocito cutáneo (CLA+) el cual une E-selectina, una molécula de adhesión inducible en el endotelio (revisado en Santamaria-Babi, L.F., et al., Eur J Dermatol: 14, 13, (2004)). Un incremento significativo en los linfocitos T CLA+ circulantes entre pacientes con AD, en comparación con individuos control ya ha sido documentado (Véase Teraki, Y., et al., Br J Dermatol: 143, 373 (2000), mientras que otros han demostrado que los linfocitos T CLA+ de memoria de pacientes con AD responden de manera preferencial a extractos de alérgeno en comparación con una población CLA- (véase Santamaria-Babi, L.F., et al., J Exp Med: 181, 1935, (1995)). En los humanos, la patogénesis de trastornos atópicos de la piel se ha relacionado con incrementos en los linfocitos T CLA+ que expresan niveles aumentados de citocinas tipo Th-2 como IL-5 e IL-13, 9 y

10. Véase Akdis M., et al., Eur J Immunol: 30, 3533 (2000); y Hamid Q., et al., J Allergy Clin Immunol: 98, 225 (1996).

Los ratones NC/Nga desarrollan de manera espontánea lesiones similares a AD que son paralelas a la AD humana en muchos aspectos que incluyen el curso clínico y los signos, la histopatología e inmunopatología cuando se alberga en condiciones libre de patógenos no especificado (no-SPF, ) aproximadamente a las 6-8 semanas de edad. En contraste, los ratones NC/Nga que se mantienen bajo condiciones de SPF no desarrollan lesiones cutáneas. No obstante, el inicio de lesiones cutáneas espontáneas y el comportamiento de rascado se pueden sincronizar en ratones NC/Nga albergados en una instalación SPF mediante inyecciones transdérmicas semanal de antígeno crudo de polvo de ácaro. Véase Matsuoka H., et al., Allergy: 58, 139 (2003). Por lo tanto, el desarrollo de AD en NC/Nga es un modelo útil para la evaluación de sustancias terapéuticas novedosas para el tratamiento de AD.

Además del modelo en NC/Nga de AD espontánea, también se puede utilizar la sensibilización epicutánea de ratones utilizando Ova como un modelo para inducir engrosamiento epidérmico y dérmico, dependiente de antígeno, con un filtrado mononuclear en piel de ratones sensibilizados. Esto habitualmente coincide con concentraciones séricas elevadas de IgE total y específico, no obstante, normalmente no se produce disfunción de la barrera o prurito en este modelo. Véase Spergel J.M., et al., J. Clin Invest, 101:1614 (1998). Este procedimiento se puede modificar con el fin de inducir una falta de regulación en la barrera cutánea y prurito al sensibilizar ratones transgénicos DO11.10 OVA TCR con OVA. Un incremento en el número de linfocitos T específicos para antígeno que pueden reconocer el antígeno sensibilizante puede aumentar el nivel de inflamación en la piel para inducir un comportamiento visible de rascado y formación de liquen/escamas de la piel.

Tanto el modelo de AD espontánea en NC/Nga como el modelo de DO11.10 epicutánea por OVA se utilizan para evaluar la capacidad de las moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 descritos en el presente documento para inhibir, reducir o neutralizar los efectos de IL-31. La administración de moléculas de unión de IL-31 o antagonistas de IL-31 puede resultar en una reducción en el rascado que sea eficaz para tratar enfermedades pruríticas que incluyen, pero que no se limitan a dermatitis atópica, prurito nodular y eczema, dado que el cese del rascado detendrá el progreso de dermatitis, cuyo desarrollo depende del rascado.

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Tabla 2: Números de listados de secuencias para las CDR de las regiones ligera variable y pesada variable

Número declon: CDRl de la región pesada variable CDR2 de la region pesada variable CDR3 de laregion pesada variable CDRl de la región ligera variable CDR2 de la región ligera variable CDR3 de la región ligera variable

292.12.3.1: SEC ID Nº.: 51(CDR1 VH de292.12.3.1)RYWMQ SEC ID Nº.: 52(CDR2 VH de 292.12.3.1):AIYPGDGDTRYSQKFKG SEC ID Nº.: 53: (CDR3 VH de292.12.3.1): PDGYYAAPYGMDY SEC ID Nº.: 54: (CDR1 VL de 292.12.3.1): RASGNIHNYLA SEC ID Nº.:55: (CDR2 VL de292.12.3.1): NAKTLAD SEC ID Nº.: 56:(CDR3 VL de 292.12.3.1): QHFWSTPWT

293.84.1.6: SEC ID Nº.: 51 (CDR1 VH de292.12.3.1): RYWMQ SEC ID Nº.: 57(CDR2 VH de 292.84.1.6:TIYPGDGDTRYSQKFKG SEC ID Nº.: 53: (CDR3VH de 292.12.3.1): PDGYYAAPY GMDY SEC ID Nº.: 54: (CDR1 VL de 292.12.3.1): RASGNIHNYLA SEC ID Nº.: 55:(CDR2 VL de292.12.3.1): NAKTLAD SEC ID Nº.: 56: (CDR3 VL de 292.12.3.1): QHFWSTPWT

292.72.3.1: SEC ID Nº.: 51 (CDR1 VH de292.12.3.1):RYWMQ SEC ID Nº.: 58(CDR2 VH de 292.72.3.1: AIYPRDGDTRYSQKFKG SEC ID NO: 59: (CDR3VH de 292.72.3.1): PDGSYAAPN GMEY SEC ID Nº.: 60: (CDR1VL de 292.72.3.1): RASGSIHNYLA SEC ID Nº.: 61; (CDR2 VL de 292.72.3.1): NAETLAD SEC ID Nº.: 62:(CDR3 VLde 292.72.3.1):QHFWITPWT

292.63.5.3: SEC ID Nº.:63 (CDR1 VH de292.63.5.3): TFIMS SEC ID Nº.: 64 (CDR2 VHde 292.63.5.3: TINSGGYYT FHPDSVKG SEC ID Nº.: 65: (CDR3VH de 292.63.5.3): QEGWSSAYFSY SEC ID Nº.: 66: (CDR1VL de292.63.5.3): KSSQSLLNGSNQKNYLA SEC ID Nº.:67;(CDR2 VL de292.63.5.3): FASTRDS SEC ID Nº.: 68:(CDR3 VL de 292.63.5.3):QQHYDTPYT

292.39.5.3: SEC ID Nº.: 69 (CDR1 VH de292.39.5.3): TYIMS SEC ID Nº.: 70(CDR2 VH de 292.39.5.3: TINSGGYYT LYPDSVKG SEC ID Nº.: 71:(CDR3 VH de 292.39.5.3): QEGWSSAWFAY SEC ID Nº.: 72;(CDR1 VL de 292.39.5.3): NSSQSLLNSS NQKNYLA SEC ID Nº.: 73: (CDR2 VL de292.39.5.3): FASTGES SEC ID Nº.: 74; (CDR3 VL de 292.39.5.3): QQHFSTPYT

292.51.5.2: SEC ID Nº.: 75 (CDR1 VH de292.51. 5.2): SFVMS SEC ID Nº.: 76 (CDR2 VHde 292.51.5.2:TINSGYYSFHPDSVKG SEC ID Nº.: 65: (CDR3VH de 292.63.5.3): QBCWSSAVFSY SEC ID Nº.: 77: (CDR1 VL de292.51.5.2): KSSQSLLNSSNQKNYLA SEC ID Nº.: 78: (CDR2 VLde 292.51.5.2);FTSTRES SEC ID Nº.: 68: (CDR3 VL de 292.63.5.3); QQHYDTPYT

292.64.6.5.5: SEC ID Nº.: 69 (CDR1 VH de292.39.5.3): TYIMS SEC ID Nº.: 70 (CDR2 VHde 292.39.5.3: TINSGGYYT LYPDSVGK SEC ID Nº.: 71: (CDR3VH de 292.39.5.3): QEGWSSAWFAY SEC ID Nº.: 72; (CDR1VL de 292.39.5.3); NSSQSLLNSSN QKNYLA SEC ID Nº.:73:(CDR2 VLde 292.39.5.3):FASTGES SEC ID Nº.: 74: (CDR3 VLde 292.39.5.3):QQHFSTPYT

292.105.4.1: SEC ID Nº.: 69 (CDR1 VH de292.39.5.3): TYIMS SEC ID Nº.: 70 (CDR2 VHde 292.39.5.3; TINSGGYYT LYPDSVKG SEC ID Nº.: 71: (CDR3VH de 292.39.5.3): QEGWSSAWFAY SEC ID Nº.: 72: (CDR1 VL de 292.39.5.3):NSSQSLLNSSNQKNYLA SEC ID Nº.:73:(CDR2 VLde 292.39.5.3):FASTGES SEC ID Nº.: 74: (CDR3 VL dc 292.39.5.3): QQHFSTPYT

42 43

Número de clon: CDRl de la región pesada variable CDR2 de la region pesadavariable CDR3 de laregion pesada variable CDRl de la región ligera variable CDR2 de la región ligera variable CDR3 de la región ligera variable

292.109.4.4: SEC ID Nº.: 69 (CDR1 VH de 292.39.5.3):TYIMS SEC ID Nº.: 70 (CDR2 VH de292.39.5.3; TINSGGYYT LYPDSVKG SEC ID Nº.: 71:(CDR3 VH de 292.39.5.3):QEGWSSAW FAY SEC ID Nº.: 72:(CDR1 VL de 292.39.5.3):NSSQSLLNSSN QKNYLA SEC ID Nº.:73: (CDR2 VL de 292.39.5.3):FASTGES SEC ID Nº.:74: (CDR3 VL de 292.39.5.3):QQHFSTPYT

292.118.6.4: SEC ID Nº.: 69 (CDR1 VHde 292.39.5.3):TYIMS SEC ID Nº.: 79(CDR2 VH de 292.118.6.4): TINSGGYYT lYPDSVKG SEC ID Nº.: 71:(CDR3 VH de 292.39.5.3): QEGWSSAW FAY SEC ID Nº.: 72:(CDR1 VL de 292.39.5.3): NSSQSLLNSSN QKNYLA SEC ID Nº.: 73; (CDR2 VL de 292.39.5.3): FASTGES SEC ID Nº.:74: (CDR3 VL de 292.39.5.3):QQHFSTPYT

292.144.3.5: SEC ID Nº.: 80 (CDR1 VH292.144.3.5): TYWIE SEC ID Nº.: 81 (CDR2 VH de292.144.3.5): EILPGRGTT NYNAKFQG SEC ID Nº.: 82:(CDR3 VH de292.144.3.5); ESKLGDDDY SEC ID Nº.: 83:(CDR1 VL de 292.144.3.5): SASSSVSYMH SEC ID Nº.:84: (CDR2 VL de292.144.3.5): DTTKLAS SEC ID Nº.:85: (CDR3 VL de292.144.3.5): FQGSEHPLT

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Claims

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