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JP5762408B2 - ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｒｓｖ）に対する抗体および使用方法 - Google Patents

ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｒｓｖ）に対する抗体および使用方法 Download PDF

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JP5762408B2
JP5762408B2 JP2012524926A JP2012524926A JP5762408B2 JP 5762408 B2 JP5762408 B2 JP 5762408B2 JP 2012524926 A JP2012524926 A JP 2012524926A JP 2012524926 A JP2012524926 A JP 2012524926A JP 5762408 B2 JP5762408 B2 JP 5762408B2
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クルセル ホランド ベー ヴェー
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Description

関連出願
２００９年８月１３日に出願された「ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＧＡＩＮＳＴ ＨＵＭＡＮ ＲＥＳＰＩＲＡＴＯＲＹ ＳＹＮＣＹＴＩＡＬ ＶＩＲＵＳ（ＲＳＶ）ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ」と題された米国仮特許出願第６１／２７４，３９５号の優先権の利益を主張する。
本願は、同様に米国仮特許出願第６１／２７４，３９５号の優先権を主張する「ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＧＡＩＮＳＴ ＨＵＭＡＮ ＲＥＳＰＩＲＡＴＯＲＹ ＳＹＮＣＹＴＩＡＬ ＶＩＲＵＳ（ＲＳＶ）ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ」と題された対応する米国特許出願第１２／８０６，４９８号と関連している。
上記で参照された出願の各々の主題は、その全文が参照により組み込まれる。
電子形式で提供される配列表の参照による組み込み
配列表の電子版が本明細書とともに出願され、その内容は、その全文において参照により組み込まれる。電子ファイルは６０２キロバイトの大きさであり、１１５２ｓｅｑ．ＰＣ１．ｔｘｔの題名がついている。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質および／もしくはＲＳＶと免疫特異的に結合し、かつ／またはＲＳＶを中和する抗体およびその抗原結合断片が提供される。また、抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片を使用する診断法および治療法が提供される。治療法は、ＲＳＶ感染の予防もしくは治療ならびに／またはＲＳＶ感染、例えば、乳児における感染および臓器移植と関連している感染の１種もしくは複数の症状の寛解のために、提供された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む。本明細書において提供される複数の異なる抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片ならびに／またはその他の抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片との組合せを、併用療法のために使用してもよい。抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片の混合物を含有する組成物も提供される。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、乳児および幼児における重篤な呼吸器疾患の１番の原因であり、小児細気管支炎の主な原因である［Welliver (2003) J Pediatr 143:S112］。世界中で、推定６千４百万の呼吸器疾患の症例および１６０，０００人の死亡が、ＲＳＶ誘発性疾患に起因する。米国単独で、何万件もの乳児の入院が、ＲＳＶおよびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）などのパラミクソウイルスによる感染によるものである［Shay et al. (1999) JAMA 282:1440-1446］。重篤なＲＳＶ感染は、ほとんどの場合、幼児および乳児において、特に、未熟児において生じる。慢性肺疾患または先天性心疾患などの根底にある健康問題は、深刻な病気のリスクを大幅に増大し得る。ＲＳＶ感染はまた、高齢者、慢性肺疾患を有する個人および骨髄移植レシピエントなどの免疫無防備状態の成人において深刻な病気を引き起こし得る。
ワクチン開発、抗ウイルス化合物（リバビリン）、アンチセンス薬物、ＲＮＡ干渉技術ならびに免疫グロブリンまたは静脈内モノクローナル抗体などの抗体製品をはじめ、ＲＳＶ感染を予防および治療するためのいくつかのアプローチが研究されてきた。ドナーから単離された静脈内免疫グロブリン［ＲＳＶ−ＩＧＩＶ；ＲｅｓｐｉＧａｍ（登録商標）］およびモノクローナル抗体、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（商標））が、ハイリスクの幼児におけるＲＳＶ予防のために承認されている。しかし、ＲＳＶのためのワクチンまたは市販の治療は、まだ、利用可能ではない。唯一リバビリンが、ＲＳＶ感染の治療のために承認されている。低い特異性のために、ＲＳＶ感染の治療にとって有効であるには、ＲＳＶ−ＩＧおよびパリビズマブなどの抗体製品の高用量の頻繁な投与および／または容量が必要である。さらに、静脈内免疫グロブリンなどの製品の使用は、ドナーを利用できることに依存している。したがって、ＲＳＶ感染の予防または治療のためのさらなる薬剤の必要性が存在する。
概要
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染およびＲＳＶ媒介性疾患または状態の予防および治療のための単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。また、ＲＳＶ感染を診断および／またはモニタリングするための単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片も本明細書において提供される。ＲＳＶと免疫特異的に結合し、それを中和する、単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。いくつかの例では、本明細書において提供されるポリペプチドは、本明細書において提供されるポリペプチドが抗体またはその抗原結合断片中に含有される場合に、ＲＳＶと免疫特異的に結合し、それを中和する。また、ＲＳＶと免疫特異的に結合し、それを中和する、本明細書において提供されるポリペプチドを含有する抗体および抗原結合断片も本明細書において提供される。本明細書において提供されるポリペプチド、抗体および抗原結合断片は、Ｆタンパク質と特異的に結合し、さらにはＲＳＶを中和し得る。ＲＳＶサブタイプＡおよびＢを中和し得る単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。ＲＳＶのＦタンパク質と免疫特異的結合する単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。いくつかの例では、本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜１６および１６２７〜１６２８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有し、ここで、単離されたポリペプチドは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質と免疫特異的に結合する。いくつかの例では、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質と免疫特異的に結合する単離されたポリペプチドは、配列番号１〜１６のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含有する。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質と免疫特異的に結合し、かつ／またはＲＳＶを中和し、配列番号２または１６２７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する単離された抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。その他の例では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２〜４、６〜８および１６２７のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含有する。配列番号２または１６２７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３または配列番号２〜４、６〜８および１６２７に示されるアミノ酸の配列に対して６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む単離された抗体もしくはその抗原結合断片を含有する抗体またはその抗原結合断片と同一のＲＳＶ Ｆタンパク質上またはＲＳＶウイルス上のエピトープと免疫特異的に結合する単離された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。
いくつかの例では、本明細書において提供される単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離された抗体または抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸１〜１２５として示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離された抗体または抗原結合断片は、配列番号５のアミノ酸１〜１０７として示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含有する。特定の例では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、５８ｃ５である。
配列番号１に示される重鎖と、配列番号５に示される軽鎖とを含有する抗体または抗原結合断片と同一の、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質上のエピトープと免疫特異的に結合する、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含有する単離された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。
いくつかの例では、本明細書において提供される単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２または１６２７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２または１６２７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有する。
いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号７に示されるＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する。
いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号９のアミノ酸１〜１２５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号１３の１〜１０７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含有する。特定の例では、単離抗体または抗原結合断片は、ｓｃ５である。
配列番号９に示される重鎖と、配列番号１３に示される軽鎖とを含有する抗体または抗原結合断片と同一の、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質上のエピトープと免疫特異的に結合する、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含有する単離抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。
いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、ＶＨを含有する。いくつかの例では、単離抗体または抗原結合断片は、配列番号１０または１６２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０または１６２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有する。
いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号１５に示されるＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する。いくつかの例では、本明細書において提供される単離抗体または抗原結合断片は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する。
配列番号２５に示されるアミノ配列を有するＲＳＶ Ｆタンパク質の一部と免疫特異的に結合する単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。また、配列番号１６２９に示されるアミノ配列を有するＲＳＶ Ｆタンパク質と免疫特異的に結合する単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片も本明細書において提供される。
ヒトまたはヒト化抗体またはその抗原結合断片である抗原結合ドメインを含有する単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。いくつかの例では、本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体または抗原結合断片は、キメラ抗体である。いくつかの例では、単離されたポリペプチド、抗体または抗原結合断片は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄまたはＦｄ’断片である。いくつかの例では、本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体または抗原結合断片は、ペプチドリンカーを含有する。いくつかの例では、ペプチドリンカーは、約１〜約５０個のアミノ酸を含有する。
いくつかの例では、本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートしている。いくつかの例では、本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体または抗原結合断片は、治療薬または診断薬を含有する。例示的診断薬としては、それだけには限らないが、酵素、蛍光化合物、電子移動剤および放射標識が挙げられる。
タンパク質トランスダクション(transduction)ドメインを含有する単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。いくつかの例では、タンパク質トランスダクションドメインは、配列番号１５２９〜１６００に示されるアミノ酸配列を有するペプチドの中から選択される。いくつかの例では、タンパク質トランスダクションドメインは、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質トランスダクションドメインである。
多量体化ドメインとコンジュゲートしている、本明細書において提供されるポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片を含有する第１の抗原結合部分と、第２の多量体化ドメインとコンジュゲートしている、抗ウイルス抗体の抗原結合断片を含有する第２の抗原結合部分とを含有する多価抗体が、本明細書において提供される。このような例では、第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインは、相補的であるか、または同一であり、それによって第１の抗原結合部分および第２の抗原結合部分が多価抗体を形成する。いくつかの例では、本明細書において提供される多価抗体は、１、２、３、４または５つのさらなる抗原結合部分を含有する。例示的多価抗体として、二価、三価、四価、五価、六価または七価抗体が挙げられる。本明細書において提供される多価抗体は、ヘテロ二価またはホモ二価抗体を含む。本明細書において提供される多価抗体は、多重特異性抗体を含む。いくつかの例では、多重特異性抗体は、二重特異性、三重特異性または四重特異性抗体である。いくつかの例では、本明細書において提供される多価抗体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄまたはＦｄ’断片である抗原結合断片を含有する。本明細書において提供される多価抗体の第１の抗原結合部分および／または第２の抗原結合部分は、共有結合または非共有結合によって、多量体化ドメインとコンジュゲートし得る。いくつかの例では、抗原結合部分は、化学リンカーまたはポリペプチドリンカーなどのリンカーを介して多量体化ドメインとコンジュゲートしている。いくつかの例では、本明細書において提供される多価抗体の多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域または適合するタンパク質間相互作用ドメインの中から選択される。いくつかの例では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥ Ｆｃドメインである。
いくつかの例では、本明細書において提供される多価抗体は、２種以上の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する。特定の例では、本明細書において提供される多価抗体は、２種以上の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する。
多量体化ドメインとコンジュゲートしている本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する第１の抗原結合部分と；第２の多量体化ドメインとコンジュゲートしている、パリビズマブ、モタビズマブ、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１、ＲＦ−２またはその抗原結合断片の中から選択される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する第２の抗原結合部分とを含有する多価抗体が、本明細書において提供される。
多量体化ドメインとコンジュゲートしている、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する第１の抗原結合部分と；第２の多量体化ドメインとコンジュゲートしている、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）の抗原と免疫特異的に結合する抗ウイルス抗体を含有する第２の抗原結合部分とを含有する多価抗体が本明細書において提供される。
本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供される多価抗体および抗ウイルス薬を含有する組合せが本明細書において提供される。いくつかの例では、抗ウイルス薬は、リバビリンである。単一の組成物として、または別個の組成物として製剤化されている、本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片と、抗ウイルス薬とを含有する組合せが、本明細書において提供される。
本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供される多価抗体および１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体を含有する組合せが本明細書において提供される。いくつかの例では、組合せは、２種以上の異なる抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する。いくつかの例では、組合せは、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片の中から選択される、２種以上の異なる抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片を含有する。いくつかの例では、組合せは、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片と、パリビズマブ、モタビズマブ、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１、ＲＦ−２の中から選択される抗体またはその抗原結合断片とを含有する。いくつかの例では、組合せは、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片と、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）の抗原と免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の中から選択される抗体とを含有する。いくつかの例では、ＰＩＶ抗原は、ヒトＰＩＶ１型、ヒトＰＩＶ２型、ヒトＰＩＶ３型および／またはヒトＰＩＶ４型の抗原である。いくつかの例では、ＰＩＶ抗原は、ＰＩＶヌクレオカプシドホスホプロテイン、ＰＩＶ融合（Ｆ）タンパク質、ＰＩＶホスホプロテイン、ＰＩＶラージ（Ｌ）タンパク質、ＰＩＶマトリックス（Ｍ）タンパク質、ＰＩＶ血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質、ＰＩＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＩＶ Ｙ１タンパク質、ＰＩＶ Ｄタンパク質、ＰＩＶ Ｃタンパク質およびその対立遺伝子変異体の中から選択される。いくつかの例では、ｈＭＰＶ抗原は、ｈＭＰＶ Ａ型またはｈＭＰＶ Ｂ型の抗原である。いくつかの例では、ｈＭＰＶ抗原は、ｈＭＰＶサブタイプＡ１、ｈＭＰＶサブタイプＡ２、ｈＭＰＶサブタイプＢ１またはｈＭＰＶサブタイプＢ２の抗原である。いくつかの例では、ｈＭＰＶ抗原は、ｈＭＰＶ核タンパク質、ｈＭＰＶホスホプロテイン、ｈＭＰＶマトリックスタンパク質、ｈＭＰＶ小疎水性タンパク質、ｈＭＰＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質、ｈＭＰＶ Ｇタンパク質およびその対立遺伝子変異体の中から選択される。
本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供される多価抗体および１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体を含有する組合せが本明細書において提供され、ここで、１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄまたはＦｄ’断片である。
本明細書において提供される任意の単離されたポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、本明細書において提供される任意の多価抗体または本明細書において提供される任意の組合せと、医薬上許容される担体もしくは賦形剤とを含有する医薬組成物が本明細書において提供される。いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、ゲル、軟膏、液体、懸濁液、エアゾール、錠剤、丸剤、散剤または鼻腔スプレーとして製剤化されている。いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、肺投与、鼻腔内投与または非経口投与用に製剤化されている。いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、単回投与用に製剤化されている。いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、徐放用に製剤化されている。
本明細書において提供される単離ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供される多価抗体および１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体を含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。いくつかの例では、医薬組成物は、２種以上の異なる抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する。いくつかの例では、医薬組成物は、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片の中から選択される、２種以上の異なる抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片を含有する。いくつかの例では、医薬組成物は、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片と、パリビズマブ、モタビズマブ、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１、ＲＦ−２の中から選択される抗体またはその抗原結合断片とを含有する。いくつかの例では、医薬組成物は、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片と、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）の抗原と免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の中から選択される抗体とを含有する。いくつかの例では、ＰＩＶ抗原は、ヒトＰＩＶ１型、ヒトＰＩＶ２型、ヒトＰＩＶ３型および／またはヒトＰＩＶ４型の抗原である。いくつかの例では、ＰＩＶ抗原は、ＰＩＶヌクレオカプシドホスホプロテイン、ＰＩＶ融合（Ｆ）タンパク質、ＰＩＶホスホプロテイン、ＰＩＶラージ（Ｌ）タンパク質、ＰＩＶマトリックス（Ｍ）タンパク質、ＰＩＶ血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質、ＰＩＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＩＶ Ｙ１タンパク質、ＰＩＶ Ｄタンパク質、ＰＩＶ Ｃタンパク質およびその対立遺伝子変異体の中から選択される。いくつかの例では、ｈＭＰＶ抗原は、ｈＭＰＶ Ａ型またはｈＭＰＶ Ｂ型の抗原である。いくつかの例では、ｈＭＰＶ抗原は、ｈＭＰＶサブタイプＡ１、ｈＭＰＶサブタイプＡ２、ｈＭＰＶサブタイプＢ１またはｈＭＰＶサブタイプＢ２の抗原である。いくつかの例では、ｈＭＰＶ抗原は、ｈＭＰＶ核タンパク質、ｈＭＰＶホスホプロテイン、ｈＭＰＶマトリックスタンパク質、ｈＭＰＶ小疎水性タンパク質、ｈＭＰＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質、ｈＭＰＶ Ｇタンパク質およびその対立遺伝子変異体の中から選択される。
本明細書において提供される単離ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供される多価抗体および１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体を含有する医薬組成物が、本明細書において提供され、ここで、１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディー、ＦｄまたはＦｄ’断片である。
本明細書において提供される単離されたポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供される多価抗体および抗ウイルス薬を含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。いくつかの例では、抗ウイルス薬は、リバビリンである。
対象に、本明細書において提供される医薬組成物の治療上有効な量を投与することを含む、対象においてウイルス感染を治療する方法が、本明細書において提供される。対象に、本明細書において提供される医薬組成物の治療上有効な量を投与することを含む、対象においてウイルス感染の１種または複数の症状を治療または阻害する方法が、本明細書において提供される。また、対象に、本明細書において提供される医薬組成物の治療上有効な量を投与することを含む、対象においてウイルス感染を予防する方法も、本明細書において提供される。特定の例では、ウイルス感染は、ＲＳＶ感染である。特定の例では、ＲＳＶ感染は、上気道感染である。
投与は、それだけには限らないが、局所的に（topically）、非経口的に、局所的に（locally）もしくは全身に、例えば、鼻腔内に、筋肉内に、皮内に、腹膜内に、静脈内に、皮下に、経口的になど、または肺の投与によってをはじめ、任意の適した経路によって達成され得る。いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、噴霧器または吸入器によって投与される。本明細書において提供される医薬組成物は、哺乳類、例えば、ヒトなどの任意の適した対象に投与してよい。
いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、ヒト乳児、未熟児で生まれたかまたはＲＳＶ感染による入院のリスクのあるヒト乳児、高齢のヒト、嚢胞性線維症、気管支肺異形成症、先天性心疾患、先天性免疫不全症、後天性免疫不全、白血病もしくは非ホジキンリンパ腫を有するヒト対象または例えば、骨髄移植もしくは肝臓移植などの移植を受けたヒト対象に投与される。
いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、ＲＳＶの季節（例えば、１０月から５月）の間に１回、２回、３回、４回または５回投与される。いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、ＲＳＶの季節の前の１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月内に１回、２回、３回、４回または５回投与される。
いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、１種または複数の抗ウイルス薬とともに投与してもよい。いくつかの例では、抗ウイルス薬は、リバビリンである。いくつかの例では、医薬組成物および抗ウイルス薬は、単一の組成物として、または別個の組成物として製剤化されている。本明細書において提供される方法では、医薬組成物および抗ウイルス薬は、逐次、同時または断続的に投与してもよい。
いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、ホルモン療法、免疫療法または抗炎症薬とともに投与してもよい。いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体またはその抗原結合断片とともに投与してもよい。医薬組成物および１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体は、単一の組成物として、または別個の組成物として化されている。医薬組成物および１種または複数のさらなる抗ＲＳＶ抗体は、逐次、同時に、または断続的に投与してもよい。いくつかの例では、抗原結合断片は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄまたはＦｄ’断片である。
いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、例えば、パリビズマブ、モタビズマブ、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１、ＲＦ−２もしくはその抗原結合断片などの抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の中から選択される１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体とともに投与してもよい。
いくつかの例では、本明細書において提供される医薬組成物は、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）の抗原と免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の中から選択される１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体とともに投与してもよい。いくつかの例では、ＰＩＶ抗原は、ヒトＰＩＶ１型、ヒトＰＩＶ２型、ヒトＰＩＶ３型および／またはヒトＰＩＶ４型の抗原である。いくつかの例では、ＰＩＶ抗原は、ＰＩＶヌクレオカプシドホスホプロテイン、ＰＩＶ融合（Ｆ）タンパク質、ＰＩＶホスホプロテイン、ＰＩＶラージ（Ｌ）タンパク質、ＰＩＶマトリックス（Ｍ）タンパク質、ＰＩＶ血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質、ＰＩＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＩＶ Ｙ１タンパク質、ＰＩＶ Ｄタンパク質、ＰＩＶ Ｃタンパク質およびその対立遺伝子変異体の中から選択される。いくつかの例では、ｈＭＰＶ抗原は、ｈＭＰＶ Ａ型またはｈＭＰＶ Ｂ型の抗原である。いくつかの例では、ｈＭＰＶ抗原は、ｈＭＰＶサブタイプＡ１、ｈＭＰＶサブタイプＡ２、ｈＭＰＶサブタイプＢ１またはｈＭＰＶサブタイプＢ２の抗原である。いくつかの例では、ｈＭＰＶ抗原は、ｈＭＰＶ核タンパク質、ｈＭＰＶホスホプロテイン、ｈＭＰＶマトリックスタンパク質、ｈＭＰＶ小疎水性タンパク質、ｈＭＰＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質、ｈＭＰＶ Ｇタンパク質およびその対立遺伝子変異体の中から選択される。
（ａ）本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片を使用して、体液(fluid)、細胞または組織サンプル中のＲＳＶ抗原のレベルをアッセイすることと；（ｂ）アッセイされたＲＳＶ抗原のレベルを対照レベルと比較し、それによって、ＲＳＶ抗原の対照レベルと比較した、アッセイされたＲＳＶ抗原のレベルの増大が、ＲＳＶ感染を示すこととを含む、ＲＳＶ感染を検出する方法が本明細書において提供される。いくつかの例では、細胞または組織サンプルは、ヒト対象から得られる。いくつかの例では、細胞または組織サンプルは、血液、尿、唾液、肺痰、洗浄またはリンパサンプルである。
本明細書において提供されるポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸が本明細書において提供される。本明細書において提供されるポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有するベクターが本明細書において提供される。
本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片、本明細書において提供される核酸または本明細書において提供されるベクターを含有する単離された細胞が本明細書において提供される。本明細書において提供される細胞は、例えば、原核細胞または真核細胞であり得る。また、本明細書において提供される核酸または本明細書において提供されるベクターを含有するトランスジェニック動物が、明細書において提供される。また、本明細書において提供される単離された細胞を、コードされる抗体を発現する条件下で培養することを含む、または本明細書において提供されるトランスジェニック動物からの抗体または抗原結合断片の単離によって、単離された抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法が、本明細書において提供される。いくつかの例では、抗体または抗原結合断片は、トランスジェニック動物の血清または乳から単離される。
１つまたは複数の容器中に、本明細書において提供されるポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、本明細書において提供される多価抗体または本明細書において提供される組合せおよび使用するための説明書を含有するキットが本明細書において提供される。
また、対象におけるウイルス感染の予防および／または治療のための、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片の使用も本明細書において提供される。また、対象におけるウイルス感染の１種または複数の症状の治療または阻害のための、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片の使用が本明細書において提供される。
また、対象におけるウイルス感染の予防および／または治療用医薬の製剤化のための、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片の使用が提供される。また、対象におけるウイルス感染の１種または複数の症状を治療または阻害する医薬の製剤化のための、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片の使用が本明細書において提供される。
詳細な説明
概略
Ａ．定義
Ｂ．概説
１．呼吸器合胞体ウイルス
Ｃ．抗ＲＳＶ抗体
１．一般的な抗体構造および機能ドメイン
ａ．抗体の構造的および機能ドメイン
ｂ．抗体断片
２．例示的抗ＲＳＶ抗体
ａ．誘導抗体
ｉ．一本鎖抗体
ｉｉ．抗イディオタイプ抗体
ｉｉｉ．多重特異性抗体および抗体多量体化
Ｄ．抗ＲＳＶ抗体のさらなる改変
１．免疫原性を低下させるための改変
２．Ｆｃ改変
３．ペグ化
４．検出可能な部分のコンジュゲーション
５．治療部分のコンジュゲーション
６．結合特異性を改善するための改変
Ｅ．抗ＲＳＶ抗体を単離する方法
Ｆ．抗ＲＳＶ抗体およびその改変体または変異体および抗体をコードする核酸を製造する方法
１．核酸
２．ベクター
３．細胞発現系
ａ．原核生物の発現
ｂ．酵母細胞
ｃ．昆虫細胞
ｄ．哺乳類細胞
ｅ．植物
４．抗体の精製
Ｇ．抗ＲＳＶ抗体特性および活性を評価すること
１．結合アッセイ
３．抗体のウイルス中和効果を分析するためのインビトロアッセイ
４．抗ＲＳＶ抗体の有効性を評価するためのインビボ動物モデル
５．抗体有効性を測定するためのインビトロおよびインビボアッセイ
Ｈ．診断的使用
１．病原体感染のインビトロ検出
２．病原体感染のインビボ検出
３．感染のモニタリング
Ｉ．予防的および治療的使用
１．治療の対象
２．投与量
３．投与経路
４．併用療法
ａ．併用療法のための抗ウイルス抗体
ｉ．抗ＲＳＶ抗体
ｉｉ．その他の呼吸器ウイルスに対する抗体
５．遺伝子療法
Ｊ．医薬組成物、組合せおよび製造品／キット
１．医薬組成物
２．製造品／キット
３．組合せ
Ｋ．実施例
Ａ．定義
特に断りのない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明（単数または複数）が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。すべての特許、特許出願、公開出願および刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、データベース、ウェブサイトおよび本明細書において全開示内容を通じて参照されるその他の公開された資料は、特に断りのない限り、その全文が参照により組み込まれる。本明細書において用語について複数の定義がある事象では、この節におけるものが優先する。ＵＲＬまたはその他のこのような識別子またはアドレスが参照される場合には、このような識別子は変わり得ることおよびインターネットに関する特定の情報は移り変わる場合があるが、インターネットを検索することによって同等の情報を見出すことができることは理解される。それに対する参照によって、このような情報の利用の可能性および一般への普及が証明される。
本明細書において、「抗体」とは、天然に産生されたか、部分的にもしくは全体的に合成的に、例えば、組換えによって製造されたかにかかわらず、全長免疫グロブリンの結合特異性能を保持する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有するその任意の断片を含めた、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン断片を指す。したがって、抗体は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン（抗体結合部位）に対して相同または実質的に相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む。抗体は、抗ＲＳＶ抗体断片などの抗体断片を含む。本明細書において、したがって、用語抗体は、合成抗体、組換えによって製造された抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体および抗体断片、例えば、それだけには限らないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体または上記のいずれかの抗原結合断片を含む。本明細書において提供される抗体は、任意の免疫グロブリンのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）のメンバー、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）を含む。
本明細書において、「抗体断片」または抗体の「抗原結合断片」とは、全長未満であるが、抗原と結合する抗体の可変領域の少なくとも一部（例えば、１つまたは複数のＣＤＲおよび／または１つまたは複数の抗体結合部位）を含有し、したがって、結合特異性および全長抗体の特異的結合能の少なくとも一部を保持する全長抗体の任意の部分を指し、抗体断片は、全長抗体の酵素処理によって製造された抗体誘導体、ならびに合成的に、例えば、組換えによって製造された誘導体を含む。抗体断片は、抗体の中に含まれる。抗体断片の例として、それだけには限らないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片および改変断片を含めたその他の断片を含む［例えば、Methods in Moleculer Biology, Vol 207:Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p3-25, Kipriyanov参照のこと］。断片は、例えば、ジスルフィド橋によって、および／またはペプチドリンカーによって一緒に連結している複数の鎖を含み得る。抗体断片は、一般に、少なくともまたは約５０個のアミノ酸、通常、少なくともまたは約２００個のアミノ酸を含有する。
本明細書において、抗原結合断片とは、抗体断片が由来する抗体と同一の抗原と結合する抗原結合部分を含有する抗体断片を指す。本明細書において、抗原結合断片は、抗体フレームワーク中に挿入された場合に（対応する領域を置換することなどによって）、抗原と免疫特異的に結合する（すなわち、少なくともまたは少なくとも約１０７〜１０８Ｍ−１のＫａを示す）抗体をもたらす任意の抗体断片を含む。抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合しているＦｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）などの抗体断片を含み、また、ＣＤＲを含有する断片および抗原と免疫特異的に結合する、または抗体フレームワーク中に挿入された場合に、抗原と免疫特異的に結合する抗体をもたらすポリペプチドなどのその他の断片を含む。
本明細書において、「治療抗体」とは、ヒトをはじめとする動物の治療のために投与される任意の抗体またはその抗原結合断片を指す。このような抗体は、ポリペプチドの製造のための任意の既知法によって調製され得、したがって、それだけには限らないが、組換えによって製造された抗体、合成によって製造された抗体ならびに細胞または組織およびその他の供給源から抽出された治療抗体を含む。任意の供給源から単離され、または製造されるので、治療抗体は、長さが不均一で、グリコシル化（すなわち、炭水化物含量）などの翻訳後修飾が異なり得る。治療抗体の不均一性はまた、治療抗体の供給源に応じて異なり得る。したがって、治療抗体への言及は、製造または単離されるように不均一な集団を指す。均一な製剤が意図される場合には、そのように記載する。本明細書において治療抗体への言及は、必要に応じて、その単量体、二量体またはその他の多量体の形態に対するものである。
本明細書において、「中和抗体」は、病原体と結合し、病原体の対象において細胞に感染する能力および／または疾患を引き起こす能力に干渉する任意の抗体またはその抗原結合断片である。中和抗体の例示として、ウイルス、細菌および真菌病原体と結合する中和抗体がある。通常、本明細書において提供される（provide herein）中和抗体は、病原体の表面と結合する。病原体がウイルスである例では、ウイルスと結合する中和抗体は、通常、ウイルスの表面上のタンパク質と結合する。ウイルスのクラスに応じて、表面タンパク質は、カプシドタンパク質（例えば、エンベロープを持っていないウイルスのカプシドタンパク質）またはウイルスのエンベロープタンパク質（例えば、エンベロープを持ったウイルスのウイルスエンベロープタンパク質）であり得る。いくつかの例では、タンパク質は、糖タンパク質である。ウイルスのウイルス感染性を阻害する能力は、例えば、インビトロ中和アッセイ、例えば、Ｖｅｒｏ宿主細胞を使用するプラーク減少アッセイなどによって測定できる。
本明細書において、「エンベロープを持ったウイルス」とは、ウイルスカプシドの周囲のウイルスタンパク質含有脂質二重層である、外膜またはエンベロープを有する動物ウイルスである。ウイルスのエンベロープタンパク質は、感染粒子の組み立てに関与し、また、宿主細胞上に存在する受容体との結合およびウイルスのエンベロープと宿主細胞の膜間の融合の誘導によるウイルス侵入に関与している。エンベロープを持ったウイルスは、球状または繊維状（桿状）のいずれかであり得る。例示的なエンベロープを持ったウイルスとして、それだけには限らないが、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、トガウイルス科、アレナウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科およびボルナウイルス科のウイルスファミリーのメンバーが挙げられる。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科ファミリー、肺炎ウイルス亜科サブファミリーのネガティブセンス一本鎖ＲＮＡエンベロープを有するウイルスである。
本明細書において、「エンベロープを持っていないウイルス」または「裸のウイルス」とは、ウイルスのエンベロープを欠くウイルスである。宿主細胞の感染のために、エンベロープを持っていないウイルスは、標的細胞との結合のためにウイルスのカプシドのタンパク質を使用する。例示的なエンベロープを持っていないウイルスとして、それだけには限らないが、アデノウイルス科、パパピローマウイルス科（Papillomavirinae）、パルボウイルス科、ポリオーマウイルス科（polyomavirinae）、サーコウイルス科、レオウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科およびアストロウイルス科のウイルスファミリーが挙げられる。
本明細書において、病原体の「表面タンパク質」は、病原体の外表面に位置している任意のタンパク質である。表面タンパク質は、外部環境（すなわち、外表面）に対して部分的に曝されている場合も、完全に曝されている場合もある。表面タンパク質の例示として、膜タンパク質、例えば、ウイルスのエンベロープまたは細菌外膜の表面上に位置するタンパク質（例えば、膜糖タンパク質）などがある。膜タンパク質は、膜貫通タンパク質（すなわち、脂質二重層を横切るタンパク質）または非膜貫通細胞表面結合型タンパク質であるタンパク質（例えば、膜の表面にアンカー固定されたかまたは共有結合によって結合された、例えば、病原体の表面上の別のタンパク質との結合）であり得る。その他の例示的表面タンパク質として、外部環境に対して少なくとも部分的に曝されている、エンベロープを持っていないウイルスのウイルスカプシドタンパク質が挙げられる。
本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、同一抗体の集団を指し、これは、モノクローナル抗体の集団中の個々の抗体分子各々が、他に対して同一であることを意味する。この特性は、複数の異なる配列を有する抗体を含有する抗体のポリクローナル集団のものとは対照的である。モノクローナル抗体は、いくつかの周知の方法によって製造できる［Smith et al.(2004) J. Clin. Pathol. 57, 912-917；およびNelson et al., J Clin Pathol (2000), 53, 111-117］。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞株を作製することによるＢ細胞の不死化によって、またはＥＢＶなどのウイルスによるＢ細胞の感染によって製造できる。また、宿主細胞を、抗体をコードするヌクレオチドの人工配列を保持するプラスミドを用いて形質転換することによって、組換え技術を使用して、インビトロで宿主細胞のクローン集団から抗体を製造してもよい。
本明細書において、「従来の抗体」とは、２種の重鎖（ＨおよびＨ’と表され得る）と、２種の軽鎖（ＬおよびＬ’と表され得る）と、２種の抗体結合性部位とを含有する抗体を指し、これでは、各重鎖が、全長免疫グロブリン重鎖または抗原結合能を保持するその任意の機能領域であり得（例えば、重鎖は、それだけには限らないが、ＶＨ、鎖ＶＨ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３鎖を含む）、各軽鎖が、全長軽鎖またはその任意の機能領域であり得る（例えば、軽鎖は、それだけには限らないが、ＶＬ鎖およびＶＬ−ＣＬ鎖）である。各重鎖（ＨおよびＨ’）は、１種の軽鎖（それぞれ、ＬおよびＬ’）と対を形成する。
本明細書において、全長抗体とは、２種の全長重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３またはＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）と、２種の全長軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）とヒンジ領域とを有する抗体、例えば、抗体を分泌するＢ細胞によって天然に産生されるヒト抗体および合成によって製造される同一ドメインを有する抗体である。
本明細書において、Ｆｖ抗体断片は、非共有結合相互作用によって連結している１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および１つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインからなる。
本明細書において、ｄｓＦｖとは、ＶＨ−ＶＬ対を安定化させる、操作された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖを指す。
本明細書において、Ｆｄ断片は、抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および１つの定常領域ドメイン（ＣＨ１）を含有する抗体の断片である。
本明細書において、Ｆａｂ断片とは、パパインを用いる全長免疫グロブリンの消化に起因する抗体断片または合成によって、例えば、組換え法によって製造される同一構造を有する断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖（ＶＬおよびＣＬを含有する）および重鎖（ＶＨ）の可変ドメインと、重鎖の１つの定常領域ドメイン（ＣＨ１）を含有する別の鎖を含有する。
本明細書において、Ｆ（ａｂ’）２断片とは、ｐＨ４．０〜４．５でのペプシンを用いる免疫グロブリンの消化に起因する抗体断片または合成によって、例えば、組換え法によって製造される同一構造を有する断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、２種のＦａｂ断片を本質的に含有し、これでは、各重鎖部分が、２つの断片を接続するジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むさらなる数個のアミノ酸を含有する。
本明細書において、Ｆａｂ’断片とは、Ｆ（ａｂ’）２断片の１／２（１つの重鎖および１つの軽鎖）を含有する断片である。
本明細書において、Ｆｄ’断片とは、Ｆ（ａｂ’）２断片の１つの重鎖部分を含有する抗体の断片である。
本明細書において、Ｆｖ’断片とは、抗体分子のＶＨおよびＶＬドメインのみを含有する断片である。
本明細書において、ｈｓＦｖとは、Ｆａｂ断片中に通常存在する定常ドメインが、ヘテロ二量体コイルドコイルドメインで置換されている抗体断片を指す［例えば、Arndt et al. (2001) J Mol Biol. 7:312:221-228参照のこと］。
本明細書において、ｓｃＦｖ断片とは、任意の順序でポリペプチドリンカーによって共有結合によって結合されている可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含有する抗体断片を指す。リンカーは、２つの可変ドメインが、実質的な干渉を伴わずに架橋されるような長さのものある。例示的リンカーとして、溶解度を高めるために、いくつかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基が全体に分散されている（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基がある。
本明細書において、用語「誘導体」とは、例えば、アミノ酸残基置換、欠失または付加の導入によって、ポリペプチドへの任意の種類の分子の共有結合によって（例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基（blocking groups）による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質と連結による）改変されている抗ＲＳＶ抗体またはその断片のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを指す。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の誘導体は、それだけには限らないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成をはじめとする、当業者に公知の技術を使用する化学修飾によって改変され得る。さらに、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の誘導体は、１種または複数の非古典的アミノ酸を含有し得る。通常、ポリペプチド誘導体は、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同様のまたは同一の機能を有する（例えば、ＲＳＶの中和）。
本明細書において、語句「に由来する」とは、モノクローナル抗体などの別の抗体に由来する抗体断片に言及する場合、元の抗体の結合特異性を保持する抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片）のエンジニアリングを指す。このような断片は、それだけには限らないが、酵素的切断、化学的架橋、組換え手段またはそれらの組合せをはじめとする当技術分野で公知の種々の方法によって導くことができる。一般に、誘導された抗体断片は、同一または実質的に同一の親抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を共有し、その結果、抗体断片および親抗体が同一のエピトープと結合する。
本明細書において、「親抗体」または「供給源抗体」とは、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片）が由来する抗体を指す。
本明細書において、用語「エピトープ」とは、抗体のパラトープが結合する、抗原上の任意の抗原決定基を指す。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群を含有し、通常、特定の三次元構造特徴ならびに特定の荷電特徴を有する。
本明細書において、キメラポリペプチドとは、少なくとも２つの異なるポリペプチドに由来するか、または単一ポリペプチドの２つの不連続部分に由来する部分を含有するポリペプチドを指す。したがって、キメラポリペプチドは、通常、１種のポリペプチドのすべてまたは一部に由来するアミノ酸残基の配列と、別の異なるポリペプチドのすべてまたは一部に由来するアミノ酸の配列とを含む。２つの部分は直接的に連結している場合も、間接的に連結している場合もあり、平衡条件および生理学的条件下で、例えば、等張ｐＨ７緩衝生理食塩水中で、キメラポリペプチドの実質的な部分の完全性を維持するのに十分な強度の、ペプチド結合、その他の共有結合またはその他の非共有結合相互作用によって連結している場合もある。本明細書における目的上、キメラポリペプチドは、別のポリペプチド、例えば、多量体化ドメイン、異種免疫グロブリン定常ドメインまたはフレームワーク領域または診断用もしくは治療用ポリペプチドなどと連結している抗ＲＳＶ抗体のすべてまたは一部を含有するものを含む。
本明細書において、融合タンパク質とは、例えば、ベクターの長さに沿って互いに近接している、例えば、隣接する、２種のポリペプチドをコードする２種の核酸を含有するベクターから、融合タンパク質を発現させることによって、一緒に結合されている２種の別個のポリペプチドに対応するアミノ酸の配列を含有するよう操作されたポリペプチドである。一般に、本明細書において提供される融合タンパク質とは、抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチドまたはペプチド、例えば、診断用または治療用ポリペプチドなどのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはペプチドとを含有するポリペプチドを指す。したがって、融合タンパク質とは、直接的にまたはペプチド結合を介して間接的に連結している２種以上のタンパク質またはペプチドに由来する２種以上（ｔｗｏ ｏｒ）の部分を含有するキメラタンパク質を指す。２種の分子は、コンストラクト中で隣接している場合も、リンカーもしくはスペーサーポリペプチドによって分離している場合もある。スペーサーは、溶解度または細胞内輸送などのポリペプチドの特性を変更するポリペプチドをコードし得る。
本明細書において、「リンカー」または「スペーサー」ペプチドとは、２種のポリペプチド配列（またはこのようなアミノ酸配列をコードする核酸）を接続するアミノ酸の短い配列を指す。「ペプチドリンカー」とは、２種のポリペプチド配列を接続するアミノ酸の短い配列を指す。ポリペプチドリンカーの例示として、ペプチド形質導入ドメインを抗体と接続するリンカーまたは２種の抗体鎖を、合成抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ断片に接続するリンカーがある。リンカーは、周知であり、任意の公知のリンカーを、提供される方法において使用できる。ポリペプチドリンカーの例示として、溶解度を高めるために、いくつかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基が全体に分散されている（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎアミノ酸配列がある。その他の例示的リンカーは、本明細書に記載されており、これらのいずれかおよびその他の公知のリンカーを、提供される組成物および方法とともに使用できる。
本明細書において、「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジ領域」とは、その他の抗体ドメインと相同性を有さないＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の、γ、δおよびα抗体アイソタイプの重鎖中に天然に存在するポリペプチド領域を指す。この領域は、プロリン残基が豊富であり、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体柔軟性を与え、これによって、Ｆａｂ部分の２つの「アーム」（各々、１つの抗体結合部位を含有する）が、それらが抗原と結合する時に互いに関して種々の角度を想定しながら可動性であることが可能となる。この柔軟性によって、Ｆａｂアームが、抗体結合部位を整列させて細胞表面上のエピトープまたはその他の抗原と相互作用するために動くことが可能となる。ヒンジ領域内の２つの鎖間ジスルフィド結合によって、２つの重鎖間の相互作用が安定化される。本明細書において提供されるいくつかの実施形態では、合成によって製造された抗体断片は、例えば、２つの抗体鎖間の相互作用によって安定性を促進するために、１つまたは複数のヒンジ領域を含有する。ヒンジ領域は、二量体化ドメインの例示である。
本明細書において、ダイアボディとは、二量体のｓｃＦｖであり、ダイアボディは、通常、ｓｃＦｖよりも短いペプチドリンカーを有し、好ましくは、二量体を形成する。
本明細書において、ヒト化抗体とは、ヒトへの投与が免疫応答を誘発しないよう、アミノ酸の「ヒト」配列を含むように改変されている抗体を指す。ヒト化抗体は、通常、非ヒト種免疫グロブリンに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し、抗体分子の残りの部分は、ヒト免疫グロブリンに主に由来する。このような抗体を調製する方法は、公知である。例えば、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づいている抗体をコードするよう、組換えＤＮＡ技術によって変更してもよい。免疫グロブリンの可変および非可変領域を同定するために設計されているコンピュータプログラムをはじめ、このような領域を同定する方法は公知である。
本明細書において、イディオタイプとは、免疫グロブリン分子の可変領域に対して特異的である、１種または複数の抗原決定基のセットを指す。
本明細書において、抗イディオタイプ抗体とは、抗体またはＴ細胞受容体の配列の抗原特異的部分に対する抗体を指す。原則として、抗イディオタイプ抗体は、特異的免疫応答を阻害する。
本明細書において、Ｉｇドメインは、当業者によってそのようなものとして認識され、２つのβプリーツシートを含有し、各々が、ループによって結合されたアミノ酸の逆平行β鎖を含有する免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドと呼ばれる構造によって区別されるドメインである。Ｉｇフォールド中の２つのβシートは、疎水性相互作用および保存された鎖内ジスルフィド結合によって一緒に挟まれている。抗体鎖内の個々の免疫グロブリンドメインは、機能に基づいてさらに区別され得る。例えば、軽鎖は、１種の可変領域ドメイン（ＶＬ）および１種の定常領域ドメイン（ＣＬ）を含有するのに対し、重鎖は、１種の可変領域ドメイン（ＶＨ）および３種または４種の定常領域ドメイン（ＣＨ）を含有する。各ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨドメインは、免疫グロブリンドメインの一例である。
本明細書において、可変ドメインまたは可変領域は、異なる抗体間で変わるアミノ酸の配列を含有する、抗体重鎖または軽鎖の特異的Ｉｇドメインである。各軽鎖および各重鎖は、１つの可変領域ドメイン、ＶＬおよびＶＨをそれぞれ有する。可変ドメインは、抗原特異性を提供し、したがって、抗原認識に関与している。各可変領域は、抗原結合部位ドメインおよびフレームワーク領域（ＦＲ）の一部であるＣＤＲを含有する。
本明細書において、「抗原結合ドメイン（antigen-binding domain）」、「抗原結合部位（antigen-binding site）」、「抗原結合性部位（antigen combining site）」および「抗体結合性部位（antibody combining site）」とは、同族抗原を認識し、物理的に相互作用する抗体内のドメインを指すよう同義的に使用される。天然の従来の全長抗体分子は、２つの従来の抗原結合部位を有し、各々が、重鎖可変領域の部分と、軽鎖可変領域の部分とを含有する。従来の抗原結合部位は、可変領域ドメイン内の逆平行β鎖をつなぐループを含有する。抗原結合性部位は、可変領域ドメインのその他の部分を含有し得る。各従来の抗原結合性部位は、重鎖に由来する３種の超可変領域と、軽鎖に由来する３種の超可変領域とを含有する。超可変領域はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。
本明細書において、「超可変領域」、「ＨＶ」、「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」および「抗体ＣＤＲ」は、抗体の抗原結合部位を一緒に形成する各可変領域内の複数の部分のうち１種を指すよう同義的に使用される。各可変領域ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と名づけられた３種のＣＤＲを含有する。３種のＣＤＲは、直鎖のアミノ酸配列に沿っては不連続であるが、フォールディングされたポリペプチド中で近接している。ＣＤＲは、可変ドメインのβシートの平行な鎖を接続するループ内に位置する。本明細書において記載されるように、当業者ならば、承知しており、ＣＤＲをKabatまたはChothia番号付けに基づいて同定できる［例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917参照のこと］。
本明細書において、フレームワーク領域（ＦＲ）とは、βシート内に位置する、抗体可変領域ドメイン内のドメインであり、ＦＲ領域は、そのアミノ酸配列に関して、超可変領域よりも比較的保存されている。
本明細書において、「定常領域」ドメインとは、可変領域ドメインのものよりも比較的保存されているアミノ酸の配列を含有する抗体重鎖または軽鎖中のドメインである。従来の全長抗体分子では、各軽鎖は、単一の軽鎖定常領域（ＣＬ）ドメインを有し、各重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む、１種または複数の重鎖定常領域（ＣＨ）ドメインを含有する。全長ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧアイソタイプは、ＣＨ１、ＣＨ２ ＣＨ３およびヒンジ領域を含有するが、ＩｇＥおよびＩｇＭは、ＣＨ１、ＣＨ２ ＣＨ３およびＣＨ４を含有する。ＣＨ１およびＣＬドメインは、抗体分子のＦａｂアームを延長し、したがって、抗原との相互作用および抗体アームの回転に関与している。抗体定常領域は、それだけには限らないが、例えば、種々の細胞、生体分子および組織との相互作用による、抗体が特異的に結合する抗原、病原体および毒素のクリアランスなどのエフェクター機能を果たし得る。
本明細書において、抗体の機能領域とは、抗体の少なくともＶＨ、ＶＬ、ＣＨ（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）、ＣＬもしくはヒンジ領域ドメインまたは少なくともその機能領域を含有する抗体の部分である。
本明細書において、ＶＨドメインの機能領域とは、全長ＶＨドメインの結合特異性の少なくとも一部を保持する（例えば、全長ＶＨドメインの１つまたは複数のＣＤＲを保持することによって）全長ＶＨドメインの少なくとも一部であり、その結果、ＶＨドメインの機能領域は、単独または、別の抗体ドメイン（例えば、ＶＬドメイン）またはその領域と組み合わせて、抗原と結合する。ＶＨドメインの例示的機能領域として、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含有する領域がある。
本明細書において、ＶＬドメインの機能領域は、全長ＶＬドメインの結合特異性の少なくとも一部を保持する（例えば、全長ＶＬドメインの１つまたは複数のＣＤＲを保持することによって）全長ＶＬドメインの少なくとも一部であり、その結果、ＶＬドメインの機能領域は、単独または、別の抗体ドメイン（例えば、ＶＨドメイン）またはその領域と組み合わせて、抗原と結合する。ＶＬドメインの例示的機能領域として、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含有する領域がある。
本明細書において、抗体またはその抗原結合断片に関して「特異的に結合する」または「免疫特異的に結合する」は、本明細書において同義的に使用され、抗体または抗原結合断片の、抗体の抗体結合部位（単数または複数）と抗原の間の非共有結合相互作用によって、同族抗原と１つまたは複数の非共有結合を形成する能力を指す。抗原は、単離抗原であっても、ウイルス中で提示されてもよい。通常、ウイルス抗原またはウイルスと免疫特異的に結合する（または特異的に結合する）抗体は、約１×１０７Ｍ−１もしくは１×１０８Ｍ−１もしくはそれ以上または１×１０７Ｍ−１もしくは１×１０８Ｍ−１もしくはそれ以上の親和性定数Ｋａ（または１×１０−７Ｍもしくは１×１０-８Ｍもしくはそれ以下の解離定数（Ｋｄ））でウイルス抗原と（またはウイルス中の抗原と、もしくはウイルスと）結合するものである。親和性定数は、抗体反応の標準動態方法論、例えば、イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）［Rich and Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11:54；Englebienne (1998) Analyst. 123:1599］、等温滴定熱量測定法（ITC）または当技術分野で公知のその他の動態相互作用アッセイによって決定することができる［例えば、Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, pages 332-336 (1989)参照のこと；抗ＲＳＶ抗体の結合親和性を算出するための例示的ＳＰＲおよびＩＴＣ法の説明については、米国特許第７，２２９，６１９号も参照のこと］。結合速度のリアルタイム検出およびモニタリングのための計測手段および方法は公知であり、市販されている［例えば、BiaCore 2000、Biacore AB、Upsala、Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335］。ウイルス抗原（またはウイルス）と免疫特異的に結合する抗体は、その他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質またはウイルスと、同等または低い結合親和性で結合し得る。通常、ＲＳＶ Ｆタンパク質（またはＲＳＶウイルス）と免疫特異的に結合する本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片は、その他の抗原と交差反応しないか、または実質的に（少なくとも１０〜１００倍）低い親和性でこのような抗原と交差反応する。特定のウイルス抗原（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質）と免疫特異的に結合する抗体または抗原結合断片は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴または当業者に公知のその他の技術によって同定できる。ＲＳＶ Ｆタンパク質上のエピトープと免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、通常、それだけには限らないが、イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴または当業者に公知のその他の技術などの実験技術を使用して決定される、任意の交差反応性エピトープとよりも高い結合親和性で、エピトープ（タンパク質またはウイルス中で提示される）と結合するものである。単離されたＲＳＶタンパク質（すなわち、組換えによって製造されたタンパク質）、例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質との免疫特異的結合は、抗体が、同じ免疫特異的結合および／またはウイルスの中和を示すことを必ずしも意味しない。このような測定値と特性は別個のものである。ウイルスまたはウイルス中で提示される抗原に対する抗体または抗原結合断片の親和性は、決定できる。本明細書における目的上、親和性または関連用語を説明する場合、標的、例えば、単離されたタンパク質またはウイルスは、同定される。
本明細書において、用語「表面プラズモン共鳴」とは、例えば、ＢｉａＣｏｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することよって、リアルタイム相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
本明細書において、「多価」抗体とは、２つ以上の抗原結合部位を含有する抗体である。多価抗体は、二価、三価、四価、五価、六価、七価またはより高い結合価の抗体を包含する。
本明細書において、「単一特異性」とは、各抗原結合部位が、同一エピトープと免疫特異的に結合する、２つ以上の抗原結合部位を含有する抗体である。
本明細書において、「多重特異性」抗体とは、抗原結合部位のうち少なくとも２つが、異なるエピトープと免疫特異的に結合する、２つ以上の抗原結合部位を含有する抗体である。
本明細書において、「二重特異性」抗体とは、２つ以上の抗原結合部位を含有し、２種の異なるエピトープと免疫特異的に結合し得る多重特異性抗体である。「三重特異性」抗体とは、３つ以上の抗原結合部位を含有し、３種の異なるエピトープと免疫特異的に結合し得る多重特異性抗体であり、「四重特異性」抗体とは、４つ以上の抗原結合部位を含有し、４種の異なるエピトープと免疫特異的に結合し得る多重特異性抗体であるなど。
本明細書において、「ヘテロ二価」抗体とは、各抗原結合部位が、異なるエピトープと免疫特異的に結合する、２つの抗原結合部位を含有する二重特異性抗体である。
本明細書において、「ホモ二価」抗体とは、各抗原結合部位が、同一エピトープと免疫特異的に結合する、２つの抗原結合部位を含有する単一特異性抗体である。ホモ二価抗体として、それだけには限らないが、従来の全長抗体、操作された全長抗体または合成全長抗体、２つの同一抗原結合断片の任意の多量体または同一の抗原結合ドメインを含有する２つの抗原結合断片の任意の多量体が挙げられる。
本明細書において、多量体化ドメインとは、ポリペプチド分子と、１種または複数のさらなるポリペプチド分子との安定な相互作用を促進するアミノ酸の配列を指し、各々は、第１のドメインと安定な多量体を形成する同一の多量体化ドメインであっても、異なる多量体化ドメインであってもよい、相補的な多量体化ドメインを含有する。一般に、ポリペプチドは、多量体化ドメインと直接的にまたは間接的に接続される。例示的多量体化ドメインとして、免疫グロブリン配列またはその一部、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域および適合するタンパク質間相互作用ドメインが挙げられる。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプをはじめとするＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭに由来するＦｃドメインまたはその一部などの免疫グロブリン定常領域またはドメインならびにその改変体であり得る。
本明細書において、二量体化ドメインとは、２つのポリペプチド配列（例えば、それだけには限らないが、抗体鎖）間の相互作用を容易にする多量体化ドメインである。二量体化ドメインとして、それだけには限らないが、２つのポリペプチド配列間のジスルフィド結合の形成を促進するシステイン残基を含有するアミノ酸配列、例えば、全長抗体ヒンジ領域のすべてもしくは一部またはポリペプチド間の相互作用を促進するとわかっているアミノ酸の配列である１種または複数の二量体化配列（例えば、ロイシンジッパー、ＧＣＮ４ジッパー）が挙げられる。
本明細書において、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、抗体重鎖の定常領域を含有し、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除外するポリペプチドを指す。したがって、Ｆｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインまたはＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指す。所望により、Ｆｃドメインは、これらのドメインの柔軟なヒンジＮ末端のすべてまたは一部を含み得る。ＩｇＡおよびＩｇＭについては、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの例示的Ｆｃドメインについては、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３、および所望により、Ｃγ１およびＣγ２間のヒンジのすべてまたは一部を含有する。Ｆｃ領域の境界は、変わり得るが、通常、ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。さらに、Ｆｃはまた、任意の対立遺伝子もしくは種変異体またはＦｃＲとの結合を変更するか、もしくはＦｃによって媒介されるエフェクター機能を変更する任意の変異体もしくは改変体などの任意の変異体もしくは改変体も含み得る。
本明細書において、「Ｆｃキメラ」とは、１つまたは複数のポリペプチドが、Ｆｃ領域またはその誘導体と直接的にまたは間接的に連結されているキメラポリペプチドを指す。通常、Ｆｃキメラは、免疫グロブリンのＦｃ領域を、例えば、抗ＲＳＶ抗体断片などの別のポリペプチドと組み合わせる。改変されたＦｃポリペプチドの誘導体は、当業者に公知である。
本明細書において、「タンパク質トランスダクション(transduction)ドメイン」すなわち「ＰＴＤ」は、標的細胞へのタンパク質の結合および／または取り込みを促進するために、本明細書において提供される抗体などのタンパク質にコンジュゲートされ得るペプチドドメインである。
本明細書において、「タグ」または「エピトープタグ」とは、本明細書において提供される抗体などのポリペプチドのＮ−またはＣ−末端に通常加えられるアミノ酸の配列を指す。ポリペプチドに融合されたタグを含むことによって、ポリペプチド精製および／または検出が容易になり得る。通常、タグまたはタグポリペプチドとは、抗体によって認識されるエピトープを提供するのに十分な残基を有する、または検出もしくは精製に役立ち得るが、連結されているキメラポリペプチドの活性に干渉しないよう十分に短いポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、通常、十分に独特であるので、それに特異的に結合する抗体は、それに連結しているポリペプチド中のエピトープと実質的に交差反応しない。適したタグポリペプチドは、一般に、少なくとも５または６個のアミノ酸残基、普通、約８〜５０個のアミノ酸残基、通常、９〜３０個の残基を有する。多量体では、タグは、１つまたは複数のキメラポリペプチドと連結され得、多量体の検出またはサンプルもしくは混合物からのその回収が可能となる。このようなタグは、周知であり、容易に合成および設計できる。例示的タグポリペプチドとして、アフィニティー精製に使用されるものが挙げられ、Ｈｉｓタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５、［Field et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165］；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［例えば、Evan et al. (1985) Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616参照のこと］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Paborsky et al. (1990) Protein Engineering 3:547-553 (1990)］が挙げられる。エピトープタグが付いた抗体を検出するために使用される抗体は、通常、本明細書において、二次抗体と呼ばれる。
本明細書において、「ポリペプチド」とは、共有結合によって接続している２個以上のアミノ酸を指す。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用される。
本明細書において、「ペプチド」とは、２〜約４０個または４０個のアミノ酸長のポリペプチドを指す。
本明細書において、「アミノ酸」とは、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２個以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的上、提供される抗体中に含有されるアミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸（表１）、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（例えば、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。本明細書において、本明細書中に現れる、ポリペプチドの種々のアミノ酸配列中に生じるアミノ酸は、その周知の三文字または一文字略語に従って同定される（表１参照）。種々の核酸分子および断片中に生じるヌクレオチドは、当技術分野で日常的に使用される標準的な一文字名称を用いて命名される。
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、そのペプチド結合でのポリペプチドの化学消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸を指す。本明細書において記載されるアミノ酸残基は、通常「Ｌ」異性体の形態にある。「Ｄ」異性体の形態の残基は、所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、任意のＬ−アミノ酸残基と置換してもよい。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968)に記載され、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２２で採用された標準ポリペプチド命名法を踏まえて、アミノ酸残基の略語が表１に示されている。
Figure 0005762408
式によって本明細書において表されるアミノ酸残基のすべての配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の従来の向きで左から右の方向を有する。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応表（表１）に列挙されるアミノ酸、改変された、非天然アミノ酸および稀なアミノ酸を含むように定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは最後のダッシュは、１個もしくは複数のアミノ酸残基のさらなる配列との、またはＮＨ２などのアミノ末端基との、またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基とのペプチド結合を示す。
ペプチドまたはタンパク質では、アミノ酸の適した保存的置換は、当業者に公知であり、通常、得られる分子の生物活性を変更することなく行われ得る。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変更しないということを認識するであろう（例えば、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition、1987、The Benjamin/Cummings Pub. co.、p.224参照のこと）。
このような置換は、以下の表２に示されるものに従って行われ得る。
Figure 0005762408
その他の置換も許容され、経験的にか、またはその他の公知の保存的もしくは非保存的置換に従って決定され得る。
本明細書において、「天然に存在するアミノ酸」とは、ポリペプチド中に生じる２０種のＬ−アミノ酸を指す。
本明細書において、用語「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸と類似の構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するよう構造的に修飾されている有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸は、例えば、２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、それだけには限らないが、アミノ酸のＤ−イソステレオマー（isostereomers）を含む。例示的非天然アミノ酸は、当業者に公知であり、それだけには限らないが、２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、３−アミノアジピン酸（Ｂａａｄ）、β−アラニン／β−アミノ−プロピオン酸（Ｂａｌａ）、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−アミノ酪酸／ピペリジン酸（４Ａｂｕ）、６−アミノカプロン酸（Ａｃｐ）、２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３−アミノイソ酪酸（Ｂａｉｂ）、２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、デスモシン（Ｄｅｓ）、２，２’−ジアミノピメリン酸（Ｄｐｍ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、Ｎ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）、Ｎ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、アロ−ヒドロキシリシン（Ａｈｙｌ）、３−ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、４−ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、イソデスモシン（Ｉｄｅ）、アロ−イソロイシン（Ａｉｌｅ）、Ｎ−Ｍエチルグリシン、サルコシン（ＭｅＧｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、６−Ｎ−メチルリシン（ＭｅＬｙｓ）、Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）およびオルニチン（Ｏｒｎ）が挙げられる。
本明細書において、「天然(native)ポリペプチド」または「天然(native)核酸」分子とは、それぞれ、天然に見出すことができるポリペプチドまたは核酸分子である。天然ポリペプチドまたは核酸分子は、ポリペプチドまたは核酸分子の野生型であり得る。天然ポリペプチドまたは核酸分子は、ポリペプチドの優勢な形態またはその任意の対立遺伝子または天然変異体であり得る。本明細書において提供される変異体ポリペプチドおよび核酸分子は、天然ポリペプチドおよび核酸分子と比較して改変を有し得る。
本明細書において、ポリペプチドまたは核酸分子の野生型の形態は、遺伝子によって、または遺伝子によってコードされるコード配列によってコードされる形態である。通常、遺伝子、またはそれによってコードされる分子の野生型の形態は、機能または構造を変更する突然変異またはその他の改変を含有しない。用語野生型はまた、種の中、種間で生じるので対立遺伝子変異を有する形態も包含する。本明細書において、ポリペプチドまたは核酸分子の優勢な形態とは、遺伝子から生じた主要な形態である分子の形態を指す。「優勢な形態」は、供給源毎に変わる。例えば、異なる細胞または組織種は、例えば、選択的スプライシングによって、および／または選択的タンパク質プロセシングによって異なる形態のポリペプチドを生じ得る。各細胞または組織種では、異なるポリペプチドが、「優勢な形態」であり得る。
本明細書において、「対立遺伝子変異体」または「対立遺伝子変異」とは、同一の染色体遺伝子座を占める遺伝子の２種以上の代替形態のいずれかについて言及する。対立遺伝子変異は、突然変異によって天然に生じ、集団内に表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異は、サイレントであり得る（コードされるポリペプチドに変化はない）か、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。用語「対立遺伝子変異体」はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を示すよう、本明細書において使用される。通常、遺伝子の参照形態は、野生型形態および／または集団からのポリペプチドの優勢な形態または種の単一の参照メンバーをコードする。通常、種の中および種間の変異体を含む対立遺伝子変異体は、通常、同一種からの野生型および／または優勢な形態と少なくともまたは約(at least or about)８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有し、同一性の程度は、遺伝子および比較が種間であるか種内であるかに応じて変わる。一般に、種内対立遺伝子変異体は、野生型および／または優勢な形態と、少なくともまたは約８０％、８５％、９０％または９５％の同一性またはそれ以上、例えば、ポリペプチドの野生型および／または優勢な形態と、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を有する。本明細書において対立遺伝子変異体への言及は、一般に、同一種のメンバー内のタンパク質中の変異を指す。
本明細書において、本明細書において「対立遺伝子変異体」と同義的に使用される「対立遺伝子」とは、遺伝子またはその一部の代替形態を指す。対立遺伝子は、同じ遺伝子座または相同染色体上の位置を占める。対象が２つの同一の対立遺伝子の遺伝子を有する場合、対象は、その遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合体であるといわれる。対象が２つの異なる対立遺伝子の遺伝子を有する場合、対象は、その遺伝子についてヘテロ接合体であるといわれる。特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチドまたはいくつかのヌクレオチドにおいて互いに異なる可能性があり、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、突然変異を含有する遺伝子の形態であり得る。
本明細書において、「種変異体」とは、異なる種、例えば、マウスおよびヒトなどの異なる哺乳類種ならびにウイルスおよび細菌などの微生物の種の中のポリペプチドにおける変異体を指す。
本明細書において、ポリペプチド「ドメイン」とは、構造的におよび／または機能的に識別可能かまたは定義可能であるポリペプチドの一部（３個以上の、通常、５個、１０個またはそれ以上のアミノ酸の配列）である。ポリペプチドドメインの例示として、１つまたは複数の構造モチーフ（例えば、ループ領域によってつながれているαヘリックスおよび／またはβ鎖）で構成されているポリペプチド内に独立にフォールディングされる構造を形成し得るポリペプチドの一部ならびに／または酵素活性、二量体化または抗原結合などの特定の機能活性によって認識されるポリペプチドの一部がある。ポリペプチドは、１つまたは複数の、通常、２以上の別個のドメインを有し得る。例えば、ポリペプチドは、１つまたは複数の構造ドメインおよび１つまたは複数の機能ドメインを有し得る。単一のポリペプチドドメインは、構造および機能に基づいて区別され得る。ドメインは、アミノ酸の連続する直鎖配列を包含し得る。あるいは、ドメインは、ポリペプチドのアミノ酸の直鎖配列に沿って不連続である、複数の不連続なアミノ酸部分を包含し得る。通常、ポリペプチドは、複数のドメインを含有する。例えば、抗体分子の各重鎖および各軽鎖は、各約１１０個のアミノ酸長である、複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含有する。
当業者ならば、ポリペプチドドメインに精通しており、その他のこのようなドメインとの構造的および／または機能的相同性によってそれらを同定できる。本明細書における例示のために、定義が提供されるが、名前で個々のドメインを認識することは、十分に当業者の範囲内であることは理解される。必要に応じて、ドメインを同定するために適当なソフトウェアを使用してもよい。
本明細書において、ポリペプチドの機能領域は、少なくとも１つの機能ドメイン（例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合または二量体化を介して、または酵素活性、例えば、キナーゼ活性もしくはタンパク質分解活性によって生体分子と相互作用する能力などの特定の機能を付与する）を含有するポリペプチドの領域であり、ポリペプチドの機能領域の例示として、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬなどの抗体ドメインおよびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３をはじめとするＣＤＲなどのその一部または抗体結合部位などの抗原結合部分がある。
本明細書において、ポリペプチドの構造的領域とは、少なくとも１つの構造的ドメインを含有するポリペプチドの領域である。
本明細書において、ポリヌクレオチドの領域は、ポリヌクレオチドの２以上の、通常、少なくとも６以上の、通常１０以上の連続するヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、８、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上のヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの一部であるが、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの必ずしもすべてではない。
本明細書において、抗体などのポリペプチドの「特性」とは、それだけには限らないが、結合特異性、構造配置またはコンホメーション、タンパク質安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、コンホメーションの安定性、熱耐性およびｐＨ条件に対する耐性をはじめとするポリペプチドによって示される任意の特性を指す。特性の変化は、ポリペプチドの「活性」を変更し得る。例えば、抗体ポリペプチドの結合特異性における変化は、抗原と結合する能力および／または親和性もしくはアビディティーなどの種々の結合活性またはポリペプチドのインビボ活性を変更し得る。
本明細書において、抗体などのポリペプチドの「活性」または「機能活性」とは、ポリペプチドによって示される任意の活性を指す。このような活性は経験的に決定できる。例示的活性として、それだけには限らないが、例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合または二量体化、酵素活性、例えば、キナーゼ活性もしくはタンパク質分解活性を介して生体分子と相互作用する能力が挙げられる。抗体（抗体断片を含む）、活性として、それだけには限らないが、特定の抗原と特異的に結合する能力、抗原結合の親和性（例えば、高親和性または低親和性）、抗原結合のアビディティー（例えば、高アビディティーまたは低アビディティー）、結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、エフェクター機能、例えば、抗原中和またはクリアランス、ウイルス中和を促進する能力およびインビボ活性、例えば、感染もしくは病原体の侵入を防ぐ能力またはクリアランスを促進する能力または身体中の特定の組織もしくは体液もしくは細胞に浸透する能力が挙げられる。活性は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴または結合速度もしくは解離速度を測定する同等のアッセイ、免疫組織化学および免疫蛍光組織学および顕微鏡検査、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーおよび結合アッセイ（例えば、パニングアッセイ）などの認識されるアッセイを使用して、インビトロまたはインビボで評価できる。例えば、抗体ポリペプチドについては、結合親和性、アビディティーおよび／または結合係数（例えば、結合速度／解離速度について）およびインビトロでのその他の活性を測定することによって、または免疫効果、例えば、抗原クリアランス、抗体の組織への浸透もしくは局在性、疾患、例えば、感染からの保護、血清もしくはその他の体液抗体力価など、インビボで種々の効果を測定することまたは当技術分野で周知のその他のアッセイによって、活性を評価してもよい。ポリペプチドが活性を示すことを示すこのようなアッセイの結果は、インビボでのポリペプチドの活性と相関があり得、これでは、インビボ活性は、治療活性または生物活性と呼ばれることもある。改変されたポリペプチドの活性は、改変されていないポリペプチドの任意のレベルのパーセンテージ、例えば、それだけには限らないが、改変されていないポリペプチドと比較して、活性の１％、活性の２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上であり得る。改変された（例えば、変異体）抗体の機能性または活性を測定するためのアッセイは、当技術分野で周知である。
本明細書において、「治療活性」とは、治療用ポリペプチドのインビボ活性を指す。一般に、治療活性とは、疾患または状態を治療するために使用される活性である。改変されたポリペプチドの治療活性は、改変されていないポリペプチドの治療活性の任意のレベルのパーセンテージ、例えば、それだけには限らないが、改変されていないポリペプチドと比較して、活性の１％、治療活性の２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上であり得る。
本明細書において、「少なくとも１つの活性を示す」または「少なくとも１つの活性を保持する」とは、改変を含有しない標的ポリペプチドまたは改変されていないポリペプチドと比較して、改変されたポリペプチド、例えば、提供される方法に従って生じた変異体ポリペプチド、改変抗体、例えば、変異体抗体またはその他の治療用ポリペプチド（例えば、改変された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片）などによって示される活性を指す。標的ポリペプチドの活性を保持する改変ポリペプチドまたは変異体ポリペプチドは、改善された活性を示し得るか、または改変されていないポリペプチドの活性を維持し得る。いくつかの例では、改変されたポリペプチドまたは変異体ポリペプチドは、標的ポリペプチドまたは改変されていないポリペプチドと比較して増大している活性を保持し得る。いくつかの場合には、改変されたポリペプチドまたは変異体ポリペプチドは、改変されていないポリペプチドまたは標的ポリペプチドと比較して低減している活性を保持し得る。改変されたポリペプチドまたは変異体ポリペプチドの活性は、改変されていないポリペプチドまたは標的ポリペプチドの活性の任意のレベルのパーセンテージ、例えば、それだけには限らないが、改変されていないポリペプチドまたは標的ポリペプチドと比較して、活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の活性であり得る。その他の実施形態では、活性の変化は、改変されていないポリペプチドまたは標的ポリペプチドの少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上の倍数である。活性の保持についてのアッセイは、保持される活性に応じて変わる。このようなアッセイは、インビトロまたはインビボで実施できる。活性は、例えば、それだけには限らないが、ＥＬＩＳＡおよびパニングアッセイなどの、当技術分野で公知であり、以下の実施例に記載されるアッセイを使用することによって測定できる。改変されていないポリペプチドまたは標的ポリペプチドと比較した、改変されたポリペプチドまたは変異体ポリペプチドの活性はまた、インビボ治療活性もしくは生物活性またはポリペプチドの投与後の結果の点で評価できる。
本明細書において、用語「評価すること」とは、サンプル中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性の絶対値を得るという意味の、また活性のレベルを示す指標、比率、パーセンテージ、視覚的価値またはその他の価値を得るという意味の定量的および定性的決定を含むものとする。評価は、直接的または間接的であり得、実際に検出される化学種は、もちろん、そのタンパク質分解生成物でなくともよいが、例えば、その誘導体または何らかのさらなる物質であり得る。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルーを用いるタンパク質染色などによる、補体タンパク質の切断生成物の検出。
本明細書において、用語「核酸」とは、通常、ホスホジエステル結合によって一緒に接続している、少なくとも２つの連結しているヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。また、用語「核酸」中には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡなどの核酸の類似体およびその他のこのような類似体および誘導体またはそれらの組合せも含まれる。核酸はまた、例えば、ヌクレオチド類似体またはリン酸ジエステル結合以外の「骨格」結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホルアミダート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含有するＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体も含む。この用語はまた、同等なものとして、ヌクレオチド類似体でできているＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの誘導体、変異体および類似体、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖核酸も含む。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡについては、ウラシル塩基は、ウリジンである。
核酸は、例えば、核酸分子の質量区別（mass differentiation）を可能にする質量が改変されたヌクレオチド；核酸分子の検出を可能にする検出可能な標識、例えば、蛍光、放射活性、発光または化学発光標識を含有するヌクレオチド；または核酸分子の固相支持体への固定化を容易にする反応性基、例えば、ビオチンもしくはチオール基を含有するヌクレオチドをはじめとするヌクレオチド類似体を含有し得る。核酸はまた、選択的に切断可能な、例えば、化学的に、酵素的にまたは光分解的に切断可能な１つまたは複数の骨格結合を含有し得る。例えば、核酸は、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドと、それに続く１つまたは複数のリボヌクレオチドを含む場合があり、これに、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドが続く場合があり、このような配列は、塩基加水分解によってリボ核酸配列で切断可能である。核酸はまた、切断に対して比較的抵抗性である１つまたは複数の結合を含み得る、例えば、ペプチド核酸結合によって連結しているヌクレオチドと、リン酸ジエステル結合またはその他の適した結合によって連結しており、ポリメラーゼによって伸長され得る、３’末端の少なくとも１つのヌクレオチドとを含み得るキメラオリゴヌクレオチドプライマー。ペプチド核酸配列は、周知の方法を使用して調製できる［例えば、Weiler et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:2792-2799参照のこと］。
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」とは、通常、ホスホジエステル結合によって一緒に接続している、少なくとも２つの連結しているヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含有するオリゴマーまたはポリマー、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドはまた、例えば、ヌクレオチド類似体またはリン酸ジエステル結合以外の「骨格」結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホルアミダート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含有するＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体も含む。ポリヌクレオチド（核酸分子）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）ならびにＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの類似体または誘導体などの一本鎖および／または二本鎖ポリヌクレオチドを含む。この用語はまた、同等なものとして、ヌクレオチド類似体でできているＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの誘導体、変異体および類似体、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡについては、ウラシル塩基は、ウリジンである。ポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの質量区別を可能にする質量が改変されたヌクレオチド；ポリヌクレオチドの検出を可能にする検出可能な標識、例えば、蛍光、放射活性、発光または化学発光標識を含有するヌクレオチド；またはポリヌクレオチドの固相支持体への固定化を容易にする反応性基、例えば、ビオチンもしくはチオール基を含有するヌクレオチドをはじめとするヌクレオチド類似体を含有し得る。ポリヌクレオチドはまた、選択的に切断可能な、例えば、化学的に、酵素的にまたは光分解的に切断可能な１つまたは複数の骨格結合を含有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドと、それに続く１つまたは複数のリボヌクレオチドを含む場合が有り、これに、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドが続く場合があり、このような配列は、塩基加水分解によってリボ核酸配列で切断可能である。ポリヌクレオチドはまた、切断に対して比較的抵抗性である１つまたは複数の結合を含み得る、例えば、ペプチド核酸結合によって連結しているヌクレオチドと、リン酸ジエステル結合またはその他の適した結合によって連結しており、ポリメラーゼによって伸長され得る、３’末端の少なくとも１つのヌクレオチドを含み得るキメラオリゴヌクレオチドプライマー。ペプチド核酸配列は、周知の方法を使用して調製できる［例えば、Weiler et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:2792-2799参照のこと］。本明細書において提供される核酸分子（ポリヌクレオチド）の例示として、合成オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド二本鎖、フィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）プライマーを含めたプライマーおよびオリゴヌクレオチド二本鎖カセットをはじめとするオリゴヌクレオチドがある。
本明細書において、「ＤＮＡコンストラクト」とは、天然には見られない方法で組み合わされている、および並んでいるＤＮＡのセグメントを含有する一本鎖または二本鎖、直鎖または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよびその他のコピーを含む。
本明細書において、「ＤＮＡセグメント」とは、特定の特質を有する大きなＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５’から３’方向に読むと、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードするプラスミドまたはプラスミド断片などのより長いＤＮＡ分子の一部である。
本明細書において、正鎖ポリヌクレオチドとは、負鎖または「アンチセンス」鎖と相補的である「センス鎖」またはポリヌクレオチド二本鎖を指す。遺伝子をコードするポリヌクレオチドの場合には、センス鎖は、ポリペプチドに翻訳されるｍＲＮＡ鎖と同一である鎖であり、一方で、アンチセンス鎖は、その鎖と相補的である。二本鎖の正鎖および負鎖は、互いに相補的である。
本明細書において、遺伝因子とは、ポリペプチドまたはタンパク質またはその領域をコードする遺伝子またはその任意の領域を指す。いくつかの例では、遺伝因子は、融合タンパク質をコードする。
本明細書において、核酸分子の調節領域とは、機能的に連結している遺伝子の発現に正または負に影響を及ぼすシス作用核酸配列を意味する。調節領域は、遺伝子の誘導性（すなわち、転写の増大のために物質または刺激を必要とする）発現を付与するヌクレオチドの配列を含む。誘導物質が存在するか、高濃度である場合には、遺伝子発現が増大され得る。調節領域はまた、遺伝子発現の抑制を付与する（すなわち、物質または刺激が転写を低減する）配列も含み得る。レプレッサーが存在するか、または高濃度である場合には、遺伝子発現が低減され得る。調節領域は、細胞増殖、細胞成長および細胞死、細胞分化および免疫調節をはじめとする多数のインビボ生物活性に影響を及ぼす、調節する、または制御することがわかっている。調節領域は、通常、１種または複数の(one or more)トランス作用性タンパク質と結合し、遺伝子の転写の増大または低減のいずれかをもたらす。
遺伝子調節領域の特定の例として、プロモーターおよびエンハンサーがある。プロモーターは、転写または翻訳開始部位の周囲に位置する、通常、翻訳開始部位の５’に位置する配列である。プロモーターは、普通、翻訳開始部位の１ｋｂ内に位置するが、さらに、例えば、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂまたは最大１０ｋｂを含めてそれ以上離れて位置する場合もある。エンハンサーは、遺伝子の５’または３’に位置する場合に、またはエキソンもしくはイントロン中に位置するかもしくはその一部である場合に、遺伝子発現に影響を及ぼすと分かっている。エンハンサーはまた、遺伝子から相当な距離で、例えば、約３Ｋｂ、５Ｋｂ、７Ｋｂ、１０Ｋｂ、１５Ｋｂまたはそれ以上の距離で機能し得る。
調節領域はまた、プロモーター領域に加えて、翻訳を容易にする配列、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、停止コドン、リーダー配列および融合パートナー配列、多重遺伝子またはポリシストロン性メッセージの作製のための内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメント、注目する遺伝子の転写物の適切なポリアデニル化を提供するためのポリアデニル化シグナルおよび停止コドンも含み、所望により、発現ベクター中に含まれ得る。
本明細書において、核酸配列、領域、エレメントまたはドメインに関して「機能し得る形で連結されている」とは、核酸領域が、互いに機能的に関連していることを意味する。例えば、リーダーペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸と機能し得る形で連結され得、それによって、核酸は、転写および翻訳されて、機能的融合タンパク質を発現することができ、ここで、リーダーペプチドは、融合ポリペプチドの分泌を達成する。いくつかの例では、第１のポリペプチド（例えば、リーダーペプチド）をコードする核酸は、第２のポリペプチドをコードする核酸に機能し得る形で連結され、核酸は、単一のｍＲＮＡ転写物として転写されるが、ｍＲＮＡ転写物の翻訳は、２種のポリペプチドのうち１種が発現されることをもたらし得る。例えば、アンバー停止コドンは、第１のポリペプチドをコードする核酸および第２のポリペプチドをコードする核酸の間に位置する場合があり、その結果、部分アンバーサプレッサー細胞中に導入されると、得られた単一のｍＲＮＡ転写物が翻訳され、第１のおよび第２のポリペプチドを含有する融合タンパク質が産生され得るか、翻訳されて第１のポリペプチドのみが産生され得るのいずれかとなる。別の例では、プロモーターは、ポリペプチドをコードする核酸と機能し得る形で連結され、それによって、プロモーターが核酸の転写を調節または媒介し得る。
本明細書において、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関して「合成」とは、組換え法によって、および／または化学合成法によって産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
本明細書において、組換えＤＮＡ法を使用することによる組換え手段による製造とは、クローニングされたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の周知の方法の使用を意味する。
本明細書において、「発現」とは、ポリヌクレオチドの転写および翻訳によってポリペプチドが産生されるプロセスを指す。ポリペプチドの発現のレベルは、例えば、宿主細胞から産生されるポリペプチドの量を決定する方法をはじめとする当技術分野で公知の任意の方法を使用して評価できる。このような方法として、それだけには限らないが、ＥＬＩＳＡ、ゲル電気泳動後のクマシーブルー染色、ローリータンパク質アッセイおよびブラッドフォードタンパク質アッセイによる細胞溶解物中のポリペプチドの定量化が挙げられる。
本明細書において、「宿主細胞」とは、ベクターを受け取り、維持し、複製（reproduce）し、増幅するために使用される細胞である。宿主細胞はまた、ベクターによってコードされるポリペプチドを発現させるためにも使用できる。ベクター中に含有される核酸は、宿主細胞が分裂するときに複製され、それによって核酸を増幅する。一例では、宿主細胞は、変異体ポリペプチドをその表面に発現させるために導入され得る遺伝子パッケージである。別の例では、宿主細胞は、遺伝子パッケージに感染する。例えば、宿主細胞は、ファージディスプレイ適合宿主細胞であり得、これは、ファージまたはファージミドベクターを用いて形質転換され得、変異体ポリペプチドを含有する融合タンパク質を発現するファージのパッケージングを提供する。
本明細書において、「ベクター」は、ベクターが適当な宿主細胞に形質転換される場合に、それから１種または複数の異種タンパク質が発現され得る複製可能な核酸である。ベクターへの言及は、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸が、通常、制限消化およびライゲーションによって導入され得るそれらのベクターを含む。ベクターへの言及はまた、ポリペプチドをコードする核酸を含有するそれらのベクターも含む。ベクターは、核酸の増幅のために、または核酸によってコードされるポリペプチドの発現／ディスプレイのために、ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入するために使用される。ベクターは、通常、エピソーム性のままであるが、ゲノムの染色体への遺伝子またはその一部の組み込みを達成するよう設計してもよい。また、酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考慮される。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者に周知である。
本明細書において、ベクターはまた、「ウイルスベクター（virus vectors）」または「ウイルスベクター（viral vectors）」を含む。ウイルスベクターとは、外因性遺伝子を細胞に移行させるよう（ビヒクルまたはシャトルとして）外因性遺伝子と機能し得る形で連結されている操作されたウイルスである。
本明細書において、「発現ベクター」は、このようなＤＮＡ断片の発現を達成できるプロモーター領域などの調節配列と機能し得る形で連結しているＤＮＡを発現できるベクターを含む。このようなさらなるセグメントは、プロモーターおよび転写終結配列を含み得、また、所望により、１種または複数の複製起点、１種または複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、通常、プラスミドまたはウイルスＤＮＡから導かれ、両方の要素を含有し得る。したがって、発現ベクターとは、適当な宿主細胞への導入の際に、クローニングされているＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたはその他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを指す。適当な発現ベクターは、当業者には周知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能であるものおよびエピソーム性のままであるものまたは宿主細胞ゲノムに組み込むものを含む。
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴ」は、同義的に使用される。オリゴヌクレオチドとは、制限された数のヌクレオチドの長さを含有するポリヌクレオチドである。当業者ならば、オリゴヌクレオチドは、一般に、２５０未満または約２５０未満、通常、２００未満または約２００未満、通常、１００未満または約１００未満のヌクレオチド長であることは認識している。通常、本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドである。合成オリゴヌクレオチドは、２５０もしくは２００未満または約２５０もしくは約２００未満のヌクレオチド長、例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００未満のヌクレオチド長を含有する。通常、オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。末尾の「マー（ｍｅｒ）」を使用して、オリゴヌクレオチドの長さを表すことができる。例えば、「１００マー」は、１００ヌクレオチド長を含有するオリゴヌクレオチドを指すために使用され得る。本明細書において提供される合成オリゴヌクレオチドの例示として、正鎖および負鎖オリゴヌクレオチド、無作為化オリゴヌクレオチド、参照配列オリゴヌクレオチド、鋳型オリゴヌクレオチドおよびフィルインプライマーがある。
本明細書において、合成オリゴヌクレオチドとは、化学合成によって製造されたオリゴヌクレオチドである。化学的オリゴヌクレオチド合成法は、周知である。既知合成法のいずれかを使用して、提供される方法において設計され、使用されるオリゴヌクレオチドを製造してよい。例えば、合成オリゴヌクレオチドは、通常、保護基を含有する単一ヌクレオチドモノマーまたはヌクレオチドトリマーを化学的に接続することによって製造される。通常、ホスホルアミダイト、保護基を含有する単一のヌクレオチドが１つずつ加えられる。合成は、通常、オリゴヌクレオチドの３’末端を用いて始まる。最も３’のホスホルアミダイトが、固相支持体と結合しており、最後の５’末端に各ホスホルアミダイトを加えることによって合成が進行する。各付加の後に、最も直近に付加された塩基上の５’リン酸基から保護基を除去し、これによって別のホスホルアミダイトの付加が可能になる。自動化シンセサイザーは、一般に、オリゴヌクレオチドを最大約１５０〜約２００ヌクレオチド長まで合成できる。通常、提供される方法において設計され、使用されるオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイトモノマーから標準シアノエチル化学を使用して合成される。この標準法によって製造された合成オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）またはＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入できる。
本明細書において、「プライマー」とは、適当なバッファー中の適当な条件下（例えば、４種の異なるヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合剤の存在下で）、適した温度で、鋳型による（template-directed）核酸合成の開始点として作用し得る核酸分子を（より通常は、配列同一性を共有するこのような分子のプールを）指す。当然のことではあるが、特定の核酸分子は、「プローブ」として、および「プライマー」として役立ち得る。しかし、プライマーは、伸長のための３’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ ＰＣＲ、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、キャプチャーＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’および５’ＲＡＣＥ、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ、ライゲーション介在ＰＣＲおよびその他の増幅プロトコールをはじめとする種々の方法で使用できる。
本明細書において、「プライマー対」とは、増幅される（例えば、ＰＣＲによって）配列の５’末端と特異的にハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅される配列の３’末端の相補体と特異的にハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含むプライマーのセット（例えば、２種のプライマーのプール）を指す。「プライマー」は、同一核酸分子のプールを指す場合もあるので、プライマー対は、通常、２種のプライマーのプールの対である。
本明細書において、「単一プライマー」および「単一プライマープール」とは、同義的に、プール中の各プライマーが、その他のプライマーメンバーと配列同一性を含有するプライマーのプール、例えば、メンバーが、少なくともまたは約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を共有するプライマーのプールを指す。単一のプライマープール中のプライマー（すべて配列同一性を共有する）は、５’（上流）プライマー［増幅される（例えば、ＰＣＲによって）配列の５’末端と特異的にハイブリダイズする］として、また、３’（下流）プライマー（増幅される配列の３’末端の相補体と特異的にハイブリダイズする）として作用する。したがって、その他のプライマーを伴わずに、単一のプライマーを使用して、相補鎖の合成をプライムし、ポリメラーゼ増幅反応において核酸を増幅できる。
本明細書において、２種のヌクレオチドに関して相補性とは、２種のヌクレオチドの、２種の核酸分子のハイブリダイゼーションの際に互いに塩基対を形成する能力を指す。相補性を共有する２種の核酸分子は、相補的核酸分子と呼ばれ、例示的な相補的核酸分子として、ポリヌクレオチド二本鎖中の正鎖および負鎖がある。本明細書において、核酸分子またはその領域が、別の核酸分子またはその領域と相補的である場合、２種の分子または領域は、互いに特異的にハイブリダイズする。２種の相補的核酸分子は、相補性％の観点で記載され得る。例えば、互いと特異的にハイブリダイズするが、互いに関して５つのミスマッチを含有する各１００ヌクレオチド長の２種の核酸分子は、９５％相補的であると言われる。２種の核酸分子について、１００％の相補性でハイブリダイズするには、両分子の全長に沿って相補性が存在することが必要であるわけではない。例えば、２０の連続ヌクレオチド長を含有する核酸分子は、５００の連続ヌクレオチド長を含有する核酸分子のうち連続する２０ヌクレオチドの部分と特異的にハイブリダイズする。この２０ヌクレオチドの部分に沿ってミスマッチが生じない場合は、２０ヌクレオチド分子は、１００％の相補性でハイブリダイズする。通常、相補的核酸分子は、相補的ヌクレオチド間で２５％、２０％、１５％、１０％、５％４％、３％、２％または１％未満のミスマッチ（言い換えれば、少なくともまたは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相補性）を有してアラインする。別の例では、相補的核酸分子は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％もしくは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、または少なくとももしくは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相補性を含有する。一例では、相補的核酸分子は、５、４、３、２または１つ未満のミスマッチしたヌクレオチドを含有する。一例では、相補的ヌクレオチドは、１００％相補的である。必要に応じて、相補性のパーセンテージは、指定される。通常、２種の分子は、それらがハイストリンジェンシーの条件下で特異的にハイブリダイズするよう選択される。
本明細書において、核酸分子の相補鎖とは、ポリヌクレオチド二本鎖中の核酸分子の反対の鎖などの分子と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド、例えば、核酸分子の配列を指す。例えば、ポリヌクレオチド二本鎖中では、正鎖オリゴヌクレオチドの相補鎖は、二本鎖中の正鎖オリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする負鎖オリゴヌクレオチドである。提供された方法の一例では、二本鎖を形成するポリヌクレオチドの相補鎖を合成するために、通常、ポリヌクレオチドにオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズすることによって始まるポリメラーゼ反応が使用される。
本明細書において、「特異的にハイブリダイズする」とは、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）の、別の核酸分子との相補的塩基対形成によるアニーリングを指す。当業者ならば、個々の分子の長さおよび組成などの特定のハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロおよびインビボパラメータに精通している。インビトロハイブリダイゼーションに特に関連しているパラメータとして、さらに、アニーリングおよび洗浄温度、バッファー組成および塩濃度が挙げられる。２種の核酸分子が、互いに特異的にハイブリダイズするために１００％の相補性を示すことは必要ではない。例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％もしくは５０％の相補性または約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％もしくは５０％の相補性または少なくとももしくは約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％もしくは５０％の相補性などの配列相補性を共有する２種の相補的核酸分子が、互いに特異的にハイブリダイズできる。本明細書において提供されるインビトロハイブリダイゼーション法において使用されるパラメータ、例えば、バッファー成分、時間および温度は、２種の核酸分子の特定のハイブリダイゼーションに必要な相補性パーセントを変更するようストリンジェンシーにおいて調整できる。当業者ならば、これらのパラメータを、核酸分子の、特定の適用にとって適当な標的核酸分子との特定のハイブリダイゼーションを達成するよう容易に調整できる。
本明細書において、「一次配列」とは、ポリペプチド中のアミノ酸残基の配列または核酸分子中のヌクレオチドの配列を指す。
本明細書において、２種のタンパク質または核酸間の「類似性」とは、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列間の関連性を指す。類似性は、残基の配列およびそれに含有される残基の同一性の程度に基づき得る。タンパク質または核酸間の類似性の程度を評価する方法は、当業者に公知である。例えば、配列類似性を評価する一方法では、２種のアミノ酸またはヌクレオチド配列を配列間で最大レベルの同一性を生じる方法でアラインする。「同一性」とは、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列およびある程度までは、ヌクレオチド配列のアラインメントも、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存的相違および／または頻繁な置換を考慮し得る。保存的相違とは、関与する残基の物理化学的特性を保つものである。アラインメントは、グローバル（配列の全長にわたり、すべての残基を含む比較される配列のアラインメント）またはローカル（最も類似した領域または複数の領域のみを含む配列の一部のアラインメント）であり得る。
本明細書において、ポリペプチドまたは核酸分子またはその領域が、別のポリペプチドまたは核酸分子または領域と「同一性」または「相同性」を含有するか、または有する場合、２種の分子および／または領域は、４０％または約４０％以上の配列同一性、通常、５０％または約５０％以上の配列同一性、例えば、少なくともまたは約(at least or about)６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を共有し、同一性の正確なパーセンテージは、必要に応じて指定することができる。第２の核酸分子または領域に対して同一または相同である核酸分子またはその領域は、第２の核酸分子または領域と１００％相補的である核酸分子または領域と特異的にハイブリダイズできる。あるいは、同一性を２種の理論上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間または核酸もしくはポリペプチド分子および理論上の配列間で比較できる。
配列「同一性」は、それ自体、技術分野で認識された意味を有し、２種の核酸またはポリペプチド分子または領域間の配列同一性のパーセンテージは、公開された技術を使用して算出できる。配列同一性は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に沿って、または分子の領域に沿って測定できる（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991参照のこと）。２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、用語「同一性」は、当業者には周知である［Carrillo, H. & Lipman, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)］。
２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に沿って比較される配列同一性とは、分子の全長に沿った同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを指す。例えば、ポリペプチドＡが、１００個のアミノ酸を有し、ポリペプチドＡのアミノ酸１〜９５と同一であるポリペプチドＢが９５個のアミノ酸を有する場合には、配列同一性が、ポリペプチドＢの全長と比較して、ポリペプチドＡの全長に沿って比較される場合には、ポリペプチドＢは９５％の同一性を有する。あるいは、ポリペプチドＡおよびポリペプチドＢ間の配列同一性は、各ポリペプチドの領域、例えば、２０個のアミノ酸類似体領域に沿って比較できる。この場合には、ポリペプチドＡおよびＢが、その領域に沿って２０個の同一のアミノ酸を有する場合には、領域の配列同一性は、１００％である。あるいは、配列同一性は、別の分子の領域と比較して、分子の長さに沿って比較できる。あるいは、ポリペプチドＡおよびポリペプチドＢ間の配列同一性は、同じ長さであるが、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換などのアミノ酸置換を有するポリペプチドに沿って比較できる。以下に論じられ、当業者には公知であるように、同一性を評価するための種々のプログラムおよび方法が当業者には公知である。９０％または９５％の同一性などの高レベルの同一性は、ソフトウェアを用いずに容易に決定できる。
任意の２種の核酸分子が、少なくともまたは約(at least or about)６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一である」ヌクレオチド配列を有するかどうかは、例えば、Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444におけるようなデフォルトパラメータを使用する「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知コンピュータアルゴリズムを使用して決定できる［その他のプログラムとして、ＧＣＧプログラムパッケージ｛Devereux, J. et al. (1984) Nucleic Acids Research 12(I):387｝、BLASTP、BLASTN、FASTA｛Altschul, S.F. et al. (1990) J. Molec. Biol. 215:403；Guide to Huge Computers、Martin J. Bishop、ed.、Academic Press、San Diego、1994およびCarrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073｝が挙げられる］。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースのＢＬＡＳＴ関数を使用して同一性を決定できる。その他の市販の、または公的に入手可能なプログラムとして、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））が挙げられる。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラム［例えば、SmithおよびWaterman｛(1981) Adv. Appl. Math. 2:482｝によって修正されたようなNeedleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443］を使用して配列情報を比較することによって決定できる。手短には、ＧＡＰプログラムは、２種の配列のうち短いほうの記号の総数によって除された、類似であるアラインされた記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を規定する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータとして：（１）単項比較マトリックス（同一性に対して１および非同一性に対して０の値を含有する）およびSchwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE、National Biomedical Research Foundation、pp. 353-358 (1979)によって記載される、Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対して３．０のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号に対してさらなる０．１０のペナルティーおよび（３）末端ギャップに対するペナルティーなしが挙げられる。
一般に、配列同一性パーセンテージの決定のためには、最高次のマッチが得られるよう配列をアラインする［例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin、H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer、Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press,New York, 1991；Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照のこと］。配列同一性のために、標準アラインメントアルゴリズムプログラムによって保存されたアミノ酸の数を決定し、各供給者によって確立されたデフォルトギャップペナルティーを用いて使用できる。実質的に相同な核酸分子は、通常、注目する核酸の長さすべてに沿って、中程度のストリンジェンシーで、または高ストリンジェンシーで特異的にハイブリダイズする。また、核酸分子のハイブリダイズにおいて、コドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子も考慮される。
したがって、用語「同一性」とは、特定の数と関連している場合は、第１および第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはその領域の配列間および／または理論的ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の比較を示す。本明細書において、用語少なくとも「と９０％同一である」とは、第１の核酸またはポリペプチドのアミノ酸配列に対する９０〜９９．９９の同一性パーセントを指す。９０％以上のレベルでの同一性は、例示目的で１００個のアミノ酸の長さの第１および第２のポリペプチドが比較されると仮定すると、第１のポリペプチド中のアミノ酸のわずか１０％（すなわち、１００個のうちの１０個）しか、第２のポリペプチドのものと異ならないという事実を示す。同様の比較を、第１および第２のポリヌクレオチド間で行うことができる。第１および第２の配列間のこのような相違は、ポリペプチドの全長にわたって無作為に分配されたか、または最大の許容可能な、例えば、１０個／１００個のアミノ酸の相違（約９０％の同一性）までで変動する長さの１つまたは複数の位置に密集している場合もある点突然変異として表され得る。相違は、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基置換、挿入、付加または欠失として定義される。約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルで、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットと無関係であり、このような高レベルの同一性は、ソフトウェアに頼らず手作業でのアラインメントによって容易に評価できることが多い。
本明細書において、配列のアラインメントとは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の２種以上の配列をアラインするための相同性の使用を指す。通常、５０％以上の同一性によって関連している２種以上の配列がアラインされる。アラインされた配列のセットとは、対応する位置でアラインされている２種以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列とアラインされた、ＥＳＴおよびその他のｃＤＮＡなどのＲＮＡに由来するアラインしている配列を含み得る。
関連ポリペプチドまたは変異体ポリペプチドまたは核酸分子は、当業者に公知の任意の方法によってアラインできる。このような方法は、通常、マッチを最大にし、手作業によるアラインメントを使用することおよび利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）および当業者に公知のその他のものを使用することによるなどの方法を含む。ポリペプチドまたは核酸の配列をアラインすることによって、当業者ならば、ガイドとして保存されたおよび同一のアミノ酸残基を使用して類似の部分または位置を同定することができる。さらに、当業者ならばまた、ガイドとして保存されたアミノ酸またはヌクレオチド残基を使用して、ヒトおよび非ヒト配列間の対応するアミノ酸またはヌクレオチド残基を見出すことができる。例えば、コンピュータシミュレーションしたタンパク質構造のアラインメントを使用することによって、対応する位置も構造アラインメントに基づくことができる。その他の例では、対応する領域も同定できる。当業者ならば、ガイドとして保存されたアミノ酸残基を使用して、ヒトおよび非ヒト配列間の対応するアミノ酸残基を見出すこともできる。
本明細書において、「類似の」および「対応する」部分、位置または領域は、マッチを最大する当業者に公知のアラインメント法を使用して、最高次のマッチが得られるよう、２種以上の関連するポリペプチドまたは核酸配列（分子の配列、分子および／または理論上の配列の領域を含む）をアラインすると、互いにアラインされる部分、位置または領域である。言い換えれば、２種の類似の位置（または部分または領域）は、２種以上のポリペプチドまたは核酸配列のベストフィットアラインメントの際にアラインする。類似の部分／位置／領域は、２種以上の配列がアラインされる場合、直鎖核酸またはアミノ酸配列に沿った位置に基づいて同定される。類似の部分は、互いに任意の配列類似性を必ずしも共有するわけではない。例えば、各１００のヌクレオチド長の２種の相同核酸分子の配列のアラインメント（マッチを最大にするような）は、１００ヌクレオチドのうち７０が同一であると示し得る。他の同一でない３０個のアミノ酸のうち一部またはすべてを含有するこれらの核酸分子の部分は、配列同一性を共有しない類似部分である。あるいは、類似の部分は、互いに対していくらかのパーセンテージの配列同一性、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはその一部(fraction)または約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはその一部を含有し得る。一例では、類似部分は、１００％同一である。
本明細書において、「改変」とは、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子中のヌクレオチドの配列の改変に関して、アミノ酸およびヌクレオチド、それぞれの欠失、挿入および置換を含む。組換えＤＮＡ法を使用することによってなどのポリペプチドを改変する方法は、当業者には日常的である。
本明細書において、「欠失」とは、核酸またはポリペプチド配列に言及する場合には、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは天然もしくは野生型配列などの配列と比較して、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失を指す。
本明細書において、「挿入」とは、核酸またはアミノ酸配列に言及する場合には、標的、天然、野生型またはその他の関連配列内に１つまたは複数のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸を含めることを説明する。したがって、野生型配列と比較して１つまたは複数の挿入を含有する核酸分子は、配列の直線の長さ内に１つまたは複数のさらなるヌクレオチドを含有する。本明細書において、核酸およびアミノ酸配列への「付加」とは、別の配列と比較した、いずれかの末端へのヌクレオチドまたはアミノ酸の付加を説明する。
本明細書において、「置換」とは、天然、標的、野生型またはその他の核酸またはポリペプチド配列中の１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を、分子の長さ（残基の数で記載される）を変更することなく、代替のヌクレオチドまたはアミノ酸と置き換えることを指す。したがって、分子中の１つまたは複数の置換は、分子のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を変更しない。特定のポリペプチドと比較した置換突然変異は、ポリペプチド配列の長さに沿ったアミノ酸残基の数で表すことができる。例えば、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）のシステイン（Ｃｙｓ；Ｃ）との置換である、アミノ酸配列の１９番目の位置のアミノ酸に改変を有する改変されたポリペプチドは、Ｉ１９Ｃ、Ｉｌｅ１９Ｃまたは簡単にＣ１９と表し、改変された１９番目の位置のアミノ酸がシステインであることを示すことができる。この例では、置換を有する分子は、改変されていないポリペプチドのＩｌｅ１９に改変を有する。
本明細書において、結合特性とは、１種または複数の結合パートナーと結合するか否か、どのように結合するかに関する、分子、例えば、ポリペプチドの特徴である。結合特性として、結合パートナー（単数または複数）と結合する能力、結合パートナーと結合する親和性（例えば、高親和性）、結合パートナーと結合するアビディティー、結合パートナーとの結合の強度および結合パートナーとの結合についての特異性が挙げられる。
本明細書において、親和性とは、結合パートナーなどの２種以上の分子間の相互作用の強度、通常、２種の結合パートナー間の非共有結合相互作用の強度を説明する。抗体またはその抗原結合断片の、抗原エピトープに対する親和性は、単一の抗体結合部位およびエピトープ間の総非共有結合相互作用の強度の尺度である。低親和性抗体抗原相互作用は弱く、分子は、迅速に解離する傾向があるが、高親和性抗体抗原結合は強く、分子は長期間結合しているままである。結合定数／解離定数を決定する方法など、親和性を算出する方法は周知である。親和性は、経験的に推定でき、親和性は、例えば、特定の抗原に対するある種の抗体と別の抗体の親和性を比較することによって比較的に決定できる。
本明細書において、抗体アビディティーとは、反復エピトープまたはエピトープアレイを有する抗原と結合している複数の結合部位を含有する抗体に関してなど、多価抗体およびその同族抗原間の複数の相互作用の強度を指す。高アビディティー抗体は、低アビディティー抗体と比較して、高強度のこのような相互作用を有する。
本明細書において、「結合する」とは、２種の分子が、互いに極接近している安定な結合をもたらす、別の分子との任意の引力相互作用における分子の関与を指す。結合として、それだけには限らないが、非共有結合、共有結合（例えば、可逆的および不可逆的共有結合）が挙げられ、それだけには限らないが、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質および薬物を含めた化学化合物などの小分子などの分子間の相互作用を含む。例示的な結合として、抗体抗原相互作用および受容体リガンド相互作用がある。抗体が、特定の抗原と「結合する」場合には、結合するとは、抗体結合部位での同族抗体抗原相互作用による抗体による抗原の特異的認識を指す。結合はまた、ジスルフィド結合によって相互作用する抗体鎖などのポリペプチドの複数の鎖の結合を含み得る。
本明細書において、「親和性定数」とは、抗体の抗原に対する親和性を測定するために使用される結合定数（Ｋａ）を指す。親和性定数が高いほど、抗体の抗原に対する親和性が大きい。親和性定数は、モル濃度の逆数（すなわち、Ｍ−１）の単位で表され、抗体反応（例えば、イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴または当技術分野で公知のその他の動力学的相互作用アッセイ）の標準の動力学的方法によって測定される結合解離反応の速度定数から算出できる。
本明細書において、用語「同一の」とは、抗体結合親和性に関して使用される場合、結合定数（Ｋａ）が、参照抗体の約１〜１００倍または１〜１０倍であることを意味する（参照抗体よりも１〜１００倍高い親和性または１〜１００倍低い親和性、または任意の数値もしくは範囲またはこのような範囲内の値）。
本明細書において、「実質的に同一の」とは、結合定数（Ｋａ）に関して使用される場合、結合定数が、参照抗体の結合定数、Ｋａよりも約５〜５０００倍高いかまたは低い範囲内にあることを意味する（参照抗体よりも５〜５０００倍高いかまたは５０００倍低い）。抗体の結合親和性はまた、解離定数、Ｋｄとして表される場合もある。解離定数は、結合定数、Ｋｄの逆数＝１／Ｋａである。
本明細書において、語句「同一の結合特異性を有する」とは、別の抗体に関して抗体を説明するために使用される場合は、抗体が参照抗体と同一の抗原エピトープのすべてまたは一部と特異的に結合する（ウイルスと免疫特異的に結合するか、または特異的に結合する）ことを意味する。したがって、５８ｃ５として示される抗体と同一の結合特異性を有する抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、５８ｃ５として示される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同一のエピトープのすべてまたは一部と特異的に結合する。エピトープは、単離されたタンパク質中か、またはウイルス中のタンパク質中にあり得る。２種の抗体の同一エピトープと結合する能力は、例えば、表面プラズモン共鳴アッセイおよび抗体競合アッセイなどの当技術分野で公知のアッセイによって調べることができる。通常、同一エピトープと免疫特異的に結合する抗体は、エピトープとの結合について競合し得、これは、例えば、当技術分野で公知の技術を使用するインビトロ結合競合アッセイ（例えば、競合ＥＬＩＳＡ）によって測定できる。通常、第２の抗体と同一のエピトープと免疫特異的に結合する第１の抗体は、エピトープとの結合について３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％競合し得、これでは、競合パーセンテージは、第２の抗体の、エピトープとの第１の抗体の結合を置き換える測定された能力である。例示的競合アッセイでは、抗原は、標識された抗体の所定の制限希釈（例えば、５０〜７０％飽和濃度）および標識されていない競合抗体の段階希釈の存在下でインキュベートされる。競合は、標識された抗体の抗原との結合を、競合抗体の存在下での結合の任意の低減について測定することによって決定される。種々の標識技術および例えば、放射測定検出、蛍光検出、酵素検出および比色検出を含めた検出法をはじめとするこのようなアッセイの変動は、当技術分野で公知である。第１の抗体の、第２の抗体と同一のエピトープと結合する能力はまた、例えば、モノクローナル抗体耐性突然変異体（Monoclonal Antibody-Resistant Mutatnts）（ＭＡＲＭ）を使用するウイルス中和アッセイによっても決定できる。例えば、第１の抗ＲＳＶ抗体が、野生型ＲＳＶを中和するが、特定の突然変異体ＲＳＶを中和しない場合、野生型ＲＳＶを中和するが、特定の突然変異体ＲＳＶを中和しない第２の抗体は、通常、第１の抗体と同一のＲＳＶ上のエピトープと結合する。第１の抗ＲＳＶ抗体が野生型ＲＳＶを中和するが、特定の突然変異体ＲＳＶを中和しない場合、野生型ＲＳＶを中和し特定の突然変異体ＲＳＶを中和する第２の抗体は、通常、第１の抗体と同一のＲＳＶ上のエピトープとは結合しない。
本明細書において、「モノクローナル抗体エスケープ突然変異体」とも呼ばれる「モノクローナル抗体耐性突然変異体」（ＭＡＲＭ）は、野生型ＲＳＶウイルスを中和するモノクローナル抗体による中和に対して増大した耐性を示す突然変異体呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である。ＭＡＲＭは、ウイルス複製の各連続ラウンド後に、ウイルス中和作用を生じるのに漸増濃度の抗体が必要であるように、抗体の存在下でのウイルス複製の連続ラウンドにわたってモノクローナル抗体の存在下で野生型ＲＳＶを培養することによって作製する。細胞変性作用（ＣＰＥ）は、もはや抗体によって効率的に中和されない突然変異体ウイルスが生じるまで漸増濃度の抗体の存在下でのみ観察される。ＭＡＲＭの出現のために、第２の抗体と比較して、第１の抗体の存在下で、複製のより多くのラウンドが必要である場合には、第１の抗体は、第２の抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープと結合すると結論づけることができる。第１の抗体が、第２の抗体に対して生じたＭＡＲＭを中和できる場合は、抗体は異なるエピトープと特異的に結合するか、または相互作用すると結論づけることができる。ＭＡＲＭは、競合結合アッセイと比較して、抗体の抗原結合エピトープをより精密にマッピングでき、その結果、ある抗体は、抗原との結合について別のものと競合し得るが、その競合者のＭＡＲＭを依然として中和できる。
本明細書において、ＥＣ５０とは、例えば、本明細書において記載されるウイルスプラーク減少アッセイ（例えば、感染のためにＶｅｒｏ宿主細胞またはその他の宿主細胞を使用するプラーク減少アッセイ）または当技術分野で公知のその他のウイルス中和アッセイなどのインビトロ中和アッセイにおいて、抗体が、ウイルス感染を５０％阻害し得る有効な濃度を指す。通常、中和ウイルスとは、ウイルスプラーク減少アッセイなどのインビトロ中和アッセイにおけるウイルスの阻害について、２ｎＭ以下のＥＣ５０を有するものである。
本明細書において、「結合パートナー」とは、別の分子が、例えば、共有結合的または非共有結合的相互作用、例えば、抗体の同族抗原との相互作用によって特異的に相互作用する分子（ポリペプチド、脂質、糖脂質、核酸分子、炭水化物またはその他の分子など）を指す。結合パートナーは、天然にまたは合成によって生じ得る。一例では、所望の変異体ポリペプチドは、例えば、インビトロまたはインビボ法を使用して、１種または複数の結合パートナーを使用して選択される。例示的なインビトロ法として、固相支持体、例えば、ビーズ、プレート、カラム、マトリックスまたはその他の固相支持体とカップリングしている結合パートナーを使用する選択または別の選択可能な分子、例えば、ビオチン分子とカップリングしている結合パートナーを使用する選択と、それに続く、その他の選択可能な分子と固相支持体とのカップリングによるその後の選択が挙げられる。通常、インビトロ法は、結合していないポリペプチドを除去するための洗浄ステップと、それに続く、選択された変異体ポリペプチド（単数または複数）の溶出を含む。このプロセスは、選択されたポリペプチドの中から変異体ポリペプチドを選択するための反復性のプロセスにおいて１回または複数回反復され得る。
本明細書において、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合またはジスルフィド橋とも呼ばれる）は、チオール基のカップリングに由来する共有単結合である。タンパク質中のジスルフィド結合は、システイン残基のチオール基間に形成され、抗体ドメインなどのポリペプチドドメイン間の相互作用を安定化する。
本明細書において、「カップリングされた」かまたは「コンジュゲートされた」とは、共有結合的または非共有結合的相互作用によって結合していることを意味する。
本明細書において、語句「抗体にコンジュゲートされた」かまたは「抗体に連結している」またはその文法的変異は、診断用または治療用部分などの部分の、抗体またはその抗原結合断片との結合に関する場合、部分が、ペプチドを結合するための任意の公知の手段によって、例えば、組換え手段による融合タンパク質の製造によって、または翻訳後に化学的手段などによって、抗体またはその抗原結合断片と結合していることを意味する。コンジュゲーションは、コンジュゲーションを達成するために種々の連結剤、例えば、それだけには限らないが、ペプチドまたは化合物リンカーまたは化学的架橋剤のいずれも使用してよい。
本明細書において、「ファージディスプレイ」とは、繊維状バクテリオファージの表面でのポリペプチドの発現を指す。
本明細書において、「ファージディスプレイ適合細胞」または「ファージディスプレイ適合宿主細胞」とは、ファージに感染し得、したがって、ポリペプチド、例えば、変異体ポリペプチドを含有するファージがディスプレイする融合タンパク質の産生を支持することができ、したがって、ファージディスプレイのために使用できる宿主細胞である、通常、細菌宿主細胞である。例示的なファージディスプレイ適合細胞として、それだけには限らないが、ＸＬ１−ブルー細胞が挙げられる。
本明細書において、「パニング」とは、結合パートナー、例えば、捕獲分子（例えば、抗原）またはアミノ酸もしくはヌクレオチドの配列またはその中のエピトープ、領域、部分もしくは遺伝子座に対して特異性を有する、ファージがディスプレイする分子の単離のための親和性ベースの選択手順を指す。
本明細書において、「ディスプレイタンパク質」または「遺伝子パッケージディスプレイタンパク質」とは、ディスプレイタンパク質が注目するポリペプチド（例えば、発現の低減が望まれるポリペプチド）と融合している（例えば、融合タンパク質の一部として含まれる）場合には、ポリペプチドが、遺伝子パッケージの外表面上にディスプレイされるような、遺伝子パッケージ上にポリペプチドをディスプレイするための任意の遺伝子パッケージポリペプチドを意味する。ディスプレイタンパク質は、通常、遺伝子パッケージ、例えば、ファージなどのウイルスの遺伝子パッケージの、遺伝子パッケージの外表面または外コンパートメント（例えば、膜、細胞壁、コートまたはその他の外表面またはコンパートメント）上もしくは内に存在し、その結果、注目するポリペプチドへの融合の際に、ポリペプチドが遺伝子パッケージ上にディスプレイされる。
本明細書において、コートタンパク質は、少なくとも一部が遺伝子パッケージの外表面に存在するディスプレイタンパク質であり、その結果、注目するポリペプチドと融合されると、ポリペプチドが遺伝子パッケージの外表面上にディスプレイされる。通常、コートタンパク質は、ファージコートタンパク質などのウイルスコートタンパク質である。ファージコートタンパク質などのウイルスコートタンパク質は、宿主細胞におけるアセンブリーの間ウイルス粒子と会合する。一例では、コートタンパク質は、本明細書において、遺伝子パッケージ上でのポリペプチドのディスプレイのために使用され、コートタンパク質は、アミノ酸のコートタンパク質配列およびディスプレイされるポリペプチドのアミノ酸の配列を含有する融合タンパク質の一部として発現される。コートタンパク質は、全長コートタンパク質であっても、遺伝子パッケージの表面上のポリペプチドのディスプレイを達成できるその任意の一部であってもよい。
例示的なコートタンパク質として、ファージコートタンパク質、例えば、それだけには限らないが、（ｉ）遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇＩＩＩｐ、ｃｐ３）などの繊維状ファージのマイナーコートタンパク質、（ｉｉ）遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｇＶＩＩＩｐ、ｃｐ８）などの繊維状ファージのメジャーコートタンパク質（１０コピー以上、例えば、数十、数百または数千のコピーでウイルスコート中に存在する）；遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質または遺伝子ＩＸタンパク質（例えば、ＷＯ００／７１６９４参照のこと）などのその他のファージコートタンパク質との融合物；およびそれだけには限らないが、例えば、ｇＩＩＩｐまたはｇＶＩＩＩｐのアンカードメインなどのファージ粒子中に安定に組み込まれているドメインなどのこれらのタンパク質の一部（例えば、ドメインまたは断片）などがある。さらに、突然変異体ｇＶＩＩｐなどの改善された表面ディスプレイ特性を有する突然変異体などの、大きなペプチドの発現のために最適化されているｇＶＩＩＩｐの突然変異体を使用してもよい［例えば、Sidhu et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:487-495参照のこと］。
本明細書において、「疾患または障害」とは、それだけには限らないが、感染症、後天的な状態、遺伝的状態をはじめとする原因または状態に起因する生物における病状を指し、同定可能な症状を特徴とする。本明細書において注目する疾患および障害として、ＲＳＶ感染を含むものまたはＲＳＶ感染のリスクを高めるものがある。
本明細書において、「感染」および「ＲＳＶ感染」とは、宿主におけるＲＳＶ生活環のすべての段階（それだけには限らないが、細胞または身体組織におけるＲＳＶによる侵入およびＲＳＶの複製を含む）ならびにＲＳＶによる侵入およびＲＳＶの複製に起因する病的状態を指す。ＲＳＶによる侵入およびＲＳＶの増殖は、それだけには限らないが、以下のステップ：ＲＳＶ粒子を細胞とドッキングするステップ、ウイルスを細胞膜と融合するステップ、ウイルスの遺伝情報を細胞に導入するステップ、ＲＳＶタンパク質を発現するステップ、新規ＲＳＶ粒子を製造し、細胞からＲＳＶ粒子を放出するステップを含む。ＲＳＶ感染は、上気道ＲＳＶ感染（ＵＲＩ）、下気道ＲＳＶ感染（ＬＲＩ）またはそれらの組合せであり得る。いくつかの例では、ＲＳＶによる侵入およびＲＳＶの複製に起因する病的状態は、急性ＲＳＶ疾患である。
本明細書において、「急性ＲＳＶ疾患」とは、ＲＳＶ感染の結果として肺または下気道における臨床的に重要な疾患を指し、これは、肺炎および／または細気管支炎として現れることがあり、これではこのような症状として、例えば、低酸素症、無呼吸、呼吸困難、速い呼吸、喘鳴音およびチアノーゼが挙げられる。急性ＲＳＶ疾患は、罹患個体に入院、酸素の投与、挿管および／または人工呼吸などの医学的介入を受けるように求める。
本明細書において、疾患または状態を有する対象を「治療すること」とは、治療後、対象の症状が部分的または完全に軽減されるか、または変化しないままであることを意味する。したがって、治療は、予防、治療および／または治癒を包含する。予防とは、潜在的な疾患の防止および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の防止を指す。治療とは、本明細書において提供される任意の抗体またはその抗原結合断片の、または提供される組成物の任意の薬剤使用も包含する。
本明細書において、「防止」または予防およびその文法的に同等の形態とは、疾患または状態を発症するリスクが低減される方法を指す。
本明細書において、「治療的に有効な薬剤」とは、それだけには限らないが、例えば、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、従来の治療薬物、例えば、小分子薬および治療用タンパク質をはじめとする任意の治療薬または生物活性剤を含む。
本明細書において、「治療効果」とは、疾患もしくは状態の症状を変更、通常、改善または寛解させるか、または疾患もしくは状態を治癒する、対象の治療に起因する効果を意味する。
本明細書において、「治療上有効な量」または「治療上有効な用量」とは、少なくとも、対象への投与後に治療効果を生じさせるのに十分である、薬剤、化合物、物質または化合物を含有する組成物の量を指す。したがって、疾患または障害の症状を予防、治癒、寛解、停止または部分的に停止するのに必要な量である。
本明細書において、「治療効力」とは、薬剤、化合物、物質または化合物を含有する組成物の、薬剤、化合物、物質または化合物を含有する組成物が投与された対象において治療効果を生じさせる能力を指す。
本明細書において、「予防的に有効な量」または「予防的に有効な用量」とは、対象に投与された場合に、意図される予防効果、例えば、疾患もしくは症状の発症もしくは再発の防止もしくは遅延、疾患もしくは症状の発症もしくは再発の可能性の低減またはウイルス感染の罹患率の低減を有する、薬剤、化合物、物質または化合物を含有する組成物の量を指す。完全な予防効果は、１用量の投与によって必ずしも起こるわけではなく、一連の用量の投与後にのみ起こる場合もある。したがって、予防的に有効な量は、１回または複数回の投与で投与され得る。
本明細書において、用語「免疫療法的に」または「免疫療法」とは、提供される抗体と併用して、予防的投与ならびに治療的投与を示す。したがって、提供される治療用抗体は、疾患の可能性および／または重篤度を減らすためにウイルス感染（例えば、ＲＳＶ感染）に罹患するリスクのある対象へ投与され得るか、または活性なウイルス感染（例えば、ＲＳＶ感染）をすでに証明している対象に投与される。
本明細書において、医薬組成物またはその他の治療薬の投与などによる特定の疾患または障害の症状の寛解とは、組成物または治療薬の投与に起因し得るか、またはそれと関連している、永久的または一時的、持続性または一過性に関わらない症状の任意の低減を指す。
本明細書において、用語「診断上有効な」量とは、少なくとも、対象への投与後の化合物の検出にとって十分である、薬剤、化合物、物質または検出可能な化合物を含有する組成物の量を指す。一般に、検出可能に標識された抗体もしくはその抗原結合断片または検出のために対象に投与される、第２の薬剤によって検出され得る抗体もしくはその抗原結合断片などの抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の診断上有効な量とは、それに対して抗体またはその抗原結合断片が特異的である、ＲＳＶ抗原を有する部位の検出を可能にするのに十分である抗体またはその抗原結合断片の量である。抗原のインビボ検出のために本明細書において提供される抗体を使用することでは、検出可能に標識された抗体またはその抗原結合断片は、診断上有効な用量で与えられる。
本明細書において、標識または検出可能な部分は、分子（例えば、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片）と直接的または間接的に結合または連結され得るか、それと会合され得、インビボおよび／またはインビトロで検出され得る検出可能なマーカー［例えば、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、造影剤（例えば、金属）、放射性核種、発色団、検出可能なペプチドまたは検出可能な生成物の形成を触媒する酵素］である。検出法は、既知インビボおよび／またはインビトロ検出法［例えば、目視検査、磁気共鳴（ＭＲ）分光法、超音波シグナル、Ｘ線、γ線分光法（例えば、陽電子放射型断層撮影（法）（ＰＥＴ）スキャニング、単一光子放出コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ））、蛍光分光法または吸収によるイメージング］をはじめとする当技術分野で公知の任意の方法であり得る。間接検出とは、検出可能な部分と直接的または間接的に結合する原子、分子または組成物の、エネルギーまたは粒子放出または吸収などの物理現象の測定（例えば、一次抗体と結合する標識された二次抗体またはその抗原結合断片（例えば、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の検出）を指す。
本明細書において、用語「対象」とは、ヒトなどの哺乳類を含めた動物を指す。
本明細書において、患者とは、ヒト対象を指す。
本明細書において、動物とは、それだけには限らないが、ヒト、ゴリラおよびサルをはじめとする霊長類；マウスおよびラットなどのげっ歯類；ニワトリなどの家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物；ブタおよびその他の動物などのヒツジなどの任意の動物を含む。非ヒト動物は、考慮される動物としてヒトを除外する。本明細書において提供されるポリペプチドは、任意の供給源、動物、植物、原核生物および真菌に由来するものである。ほとんどのポリペプチドは、哺乳類起源をはじめ、動物起源のものである。
本明細書において、「高齢の」とは、年齢のために免疫応答が低減した、ワクチン接種に対する応答が減少した対象を指す。通常、高齢の対象とは、６５歳以上の、より一般には、７０歳以上のヒトである。
本明細書において、「ヒト乳児」とは、約２４ヶ月以下のヒト（例えば、約１６ヶ月以下、約１２ヶ月以下、約６ヶ月以下、約３ヶ月以下、約２ヶ月以下または約１ヶ月以下の年齢）を指す。通常、ヒト乳児は、３８週を超える妊娠期間で誕生する。
本明細書において、「未熟児で生まれたヒト乳児」とは、約４０週以下の妊娠期間、通常、約３８週以下の妊娠期間で生まれたヒトを指す。
本明細書において、「単位用量形態」とは、ヒトおよび動物対象にとって適した、当技術分野で公知のように個々にパッケージングされている物理的に別個の単位を指す。
本明細書において、「単回投与製剤」とは、直接投与のための製剤を指す。
本明細書において、「製造品」とは、製造され、販売されている製品である。本出願を通じて使用されるように、この用語は、パッケージング品に含有される本明細書において提供される組成物のいずれも包含するよう意図される。
本明細書において、「流体(fluid)」とは、流れることができる任意の組成物を指す。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよびその他のこのような組成物の形態にある組成物を包含する。
本明細書において、単離または精製されたポリペプチドまたはタンパク質（例えば、単離された抗体またはその抗原結合断片）またはその生物学的に活性な部分（例えば、単離された抗原結合断片）は、タンパク質が由来する細胞もしくは組織に由来する細胞物質もしくはその他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、このような純度を評価するために当業者によって使用される、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分析の標準法によって決定されるように、容易に検出可能な不純物を含まないと思われる場合は、実質的に含まないと決定され得るか、またはさらなる精製が、物質の、酵素活性および生物活性などの物理的および化学的特性を検出可能に変更しないよう十分に純粋であると決定され得る。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製方法は、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。このような例では、さらなる精製は、化合物の比活性を増大し得る。本明細書において、「細胞抽出物」または「溶解物」とは、溶解されたか、または破壊された細胞から製造した調製物または画分を指す。
本明細書において、単離された核酸分子とは、核酸分子の天然供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されているものである。ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術によって製造される場合には、その他の細胞性物質もしくは培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。本明細書において提供される例示的な単離された核酸分子として、提供される抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸分子が挙げられる。
本明細書において、「対照」とは、試験パラメータで処理されていないか、または血漿サンプルである場合には、注目する状態に冒されていない正常なボランティアから得たものであり得る点を除いて、試験サンプルと実質的に同一であるサンプルを指す。対象はまた、内部対照でもあり得る。
本明細書において、「組成物」とは、任意の混合物を指す。溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組合せであり得る。
本明細書において、「組合せ」とは、２種以上の品目の間の任意の関連を指す。組合せは、２種の組成物または２種の収集物などの２種以上の別個の品目であり得、２種以上の品目の単一の混合物またはその任意の変動などのそれらの混合物であり得る。組合せの要素は、一般に、関連または関係している。
本明細書において、併用療法とは、２種以上の異なる抗ＲＳＶ抗体および／または抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片などの２種以上の異なる治療薬の投与を指す。異なる治療薬は、別個に、逐次、断続的に提供および投与してもよく、単一の組成物中で提供してもよい。
本明細書において、キットとは、それだけには限らないが、生物活性または特性の活性化、投与、診断および評価をはじめとする目的のために、所望により、さらなる試薬および組合せまたはその要素を使用するための説明書などのその他の要素を含んでもよい、パッケージングされた組合せである。
本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、明確に別に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「免疫グロブリンドメイン」を含むポリペプチドへの言及は、１つまたは複数の(a plurality of)免疫グロブリンドメインを有するポリペプチドを含む。
本明細書において、用語「または」は、代替物のみを指すよう明確に示されない限り、または代替物が互いに排他的でない限り、「および／または」を意味するよう使用される。
本明細書において、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表され得る。約はまた、正確な量も含む。したがって、「約５個のアミノ酸」とは、「約５個のアミノ酸」および「５個のアミノ酸」も意味する。
本明細書において、「所望の」または「所望により」とは、続いて記載される事象または状況が生じるか、または生じないことおよび記載が前記事象または状況が生じる例および生じない例を含むこと意味する。例えば、所望により変異体部分とは、部分が変異体または非変異体であることを意味する。
本明細書において、任意の保護基、アミノ酸およびその他の化合物の略語は、別に示されない限り、その一般的な用法、認識されている略語またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに一致している［Biochem. (1972) 11(9):1726-1732参照のこと］。
Ｂ．概説
呼吸器合胞体ウイルスと結合し、それを中和する、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が提供される。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体は、ＲＳＶの表面上の１種または複数のエピトープを認識する中和抗体である。特に、本明細書において提供される抗体は、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質と結合する。本明細書において提供される抗体は、予防治療において使用され得る。本明細書において提供される抗体はまた、治療薬として使用され得る。
例えば、提供される抗体は、それだけには限らないが、対象間のウイルス伝達の阻害、宿主におけるウイルス感染の確立の阻害および対象中のウイルス量の低減をはじめとする、病原性疾患の予防および／または伝播のために使用され得る。抗体はまた、ＲＳＶ感染の１種または複数の症状を予防、治療および／または軽減するためにか、またはＲＳＶ感染期間の低減のために使用され得る。したがって、本明細書において提供される抗体での患者の治療は、ＲＳＶ感染と関連している死亡率および／または罹患率を低減し得る。
ＲＳＶ残留性は、抗体によって中和され得ないエスケープ突然変異体の生成と関連している。したがって、治療用抗ウイルス抗体の開発への主な課題は、１）種々の株または血清型にわたって保存されている中和エピトープおよび２）エスケープ突然変異体を作製するためにウイルスを進化させることが困難な中和エピトープを有する抗体の作製または同定である。本明細書において提供される抗体は、種々のＲＳＶサブグループおよび株と結合する。本明細書において提供される抗体はまた、先行技術における既存の抗体と比較して、改善されたウイルス中和活性を示す。提供される抗体は、複製の連続ラウンドにわたってウイルスを有効に中和し、これでは、ＲＳＶは、通常、中和に抵抗するエスケープ突然変異体を作製する。ＭＡＲＭの作製を制限する能力とは、本明細書において提供される抗体が、作製されたエスケープ突然変異体の形態における変動に対して感受性が低いエピトープと結合することを意味する。したがって、このエピトープは、その他の既知抗ＲＳＶ抗体のエピトープとは異なる。したがって、提供される抗ＲＳＶ抗体は、予防治療に加えて、ＲＳＶ感染の治療にとっても有用である。現在、ＲＳＶ感染に対する、公知の承認された抗体治療薬はない。そのようなものとして、本明細書において提供される抗体は、高齢の患者、例えば、近接によって、患者間のウイルス伝播のリスクが高まるグループホームまたは老人ホームの人の間でＲＳＶ感染の治療にとって特に重要である。パリビズマブを用いるＲＳＶの予防治療におけるノンコンプライアンスが、ウイルス耐性を引き起こすことに次第につながっているので、本明細書において提供される抗体での治療はまた、投与計画に対するノンコンプライアンスがウイルスエスケープのリスクを高める状況において重要である［例えば、Adams et al.、(2010) Clin Infect Dis. 51(2):185-188］。
一般に、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体は、高親和性でＲＳＶ Ｆタンパク質と結合する。既存の承認された抗ＲＳＶ抗体（例えば、パリビズマブ；Ｓｙｎａｇｉｓ）と比較して、本明細書において提供される高親和性抗ＲＳＶ抗体によって、ＲＳＶ感染を予防および／または治療するための、ＲＳＶ感染の１種または複数の症状を治療および／または軽減するための、またはＲＳＶ感染期間を低減するためのあまり頻繁ではない投与が可能になる。したがって、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体は、治療用抗体として、すなわちＲＳＶ感染の治療のために有用である。あまり頻繁でない投与によって、投与計画に対する容易なコンプライアンスが可能となり、したがって、抗ＲＳＶ抗体に対するウイルス耐性の増大につながる飲み忘れた投与量の可能性が少なくなる。ＲＳＶと免疫特異的に結合する低用量の抗体はまた、免疫グロブリン療法の有害作用の可能性も低減し得る。
一般に、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体は、例えば、ウイルスの標的細胞膜との会合、ウイルスの標的細胞膜との融合および／または細胞侵入、新規ウイルス粒子の製造などのウイルスの１つまたは複数の活性を阻害または低減する能力、例えば、ウイルス複製または感染細胞の別の細胞の細胞間融合（すなわち、合胞体形成）の阻害を有する。提供される抗ＲＳＶ抗体はまた、ＲＳＶ感染に対する免疫応答を増大するために使用され得る。
１．呼吸器合胞体ウイルス
ヒトＲＳＶは、パラミクソウイルス科のニューモウイルスサブファミリーのメンバーである。ヒトＲＳＶの２種の別個のサブグループ、グループＡおよびグループＢがある。さらに、各サブタイプは２種の株、Ａ１およびＡ２ならびにＢ１およびＢ２にさらに分けられる。ＲＳＶは、１１種のウイルスタンパク質をコードする約１５，０００のヌクレオチドからなるゲノムを有する、エンベロープ型の、非分割型の、ネガティブセンスＲＮＡウイルスである。
ＲＳＶは、２種の主要な表面糖タンパク質、糖タンパク質Ｇおよび糖タンパク質Ｆをコードする。糖タンパク質Ｇすなわち、結合タンパク質が、細胞受容体とのウイルス結合を媒介するのに対し、糖タンパク質Ｆ、すなわち、融合タンパク質は、ウイルスおよび細胞膜の融合を促進し、ウイルスのリボ核タンパク質の細胞の細胞質への浸透を可能にする［Lopez et al. (1998) J. Virology 72:6922-6928］。糖タンパク質Ｆはまた、感染細胞の膜の、隣接する細胞のものとの融合も促進し、これは、合胞体の形成につながる。Ｆタンパク質は、不活性の、Ｎ−グリコシル化前駆体のタンパク質分解切断によって生じる、２種のジスルフィド結合されたサブユニットＦ１およびＦ２を含有する。Ｇタンパク質は、３２ｋＤａの前駆体タンパク質と結合しているＮ−結合型およびＯ−結合型オリゴ糖を含有する８０〜９０ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。
ＲＳＶ ＦまたはＧ糖タンパク質に対して調製された抗体は、ＲＳＶをインビトロで高効率に中和し、インビボで予防効果を有することがわかっている［例えば、Walsh et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 67:505；Beeler et al. (1989) J. Virol. 63:2941-2950、Garcia-Borreno et al. (1989) J. Virol. 63:925-932、Taylor et al. (1984) Immunology 52:137-142および米国特許第５，８２４，３０７号および同６，８１８，２１６号参照のこと］。ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する抗体はまた、ＲＳＶ感染細胞の、隣接する非感染細胞との融合の阻害においても有効である。
ＲＳＶ Ｆタンパク質と免疫特異的に結合する種々のモノクローナル抗体の分析は、３つの重複しない抗原部位、Ａ、ＢおよびＣおよび１つの架橋部位、ＡＢの同定につながった［Beeler et al. (1989) J. Virol. 63:2941-2950］。抗原部位の各々は、別個のエピトープを含有する。１つの研究では、１８種のモノクローナル抗体のパネルの１つの研究において、抗原部位Ａの５種のエピトープ、抗原部位Ｂの４種のエピトープおよび抗原部位Ｃの４種のエピトープが、モノクローナル抗体エスケープ突然変異体（ＭＡＲＭ）に基づいて同定された［例えば、Beeler et al. (1989) J. Virol. 63:2941-2950参照のこと］。これらの抗ＲＳＶ抗体のエスケープを達成するＲＳＶ Ａ２株Ｆタンパク質突然変異は、アミノ酸残基Ｎ２６２、Ｋ２７２、Ｓ２７５、Ｎ２７６、Ｐ３８９またはＲ４２９の単一のアミノ酸突然変異またはＦ３２およびＫ２７２またはＡ２４１およびＫ４２１の二重アミノ酸突然変異を含む［例えば、Crowe et al. (1998) Virology 252:373-375；Zhao et al.、(2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946およびLiu et al.、(2007) Virology Journal 4:71参照のこと］。抗原部位Ａエピトープ４と結合するモノクローナル抗体１１２９［Beeler et al. (1989) J. Virology 63(7):2841-2950］は、それからヒト化パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））が作製された親抗体である［Johnson et al. (1997) J. Infect. Diseases 176:1215-1224および米国特許第５，８２４，３０７号参照のこと］。ＲＳＶ Ｆタンパク質の残基Ｎ２６２、Ｎ２６８またはＫ２７２での単一アミノ酸突然変異は、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））からのエスケープを達成することがこれまでに分かっている［Zhao et al.、(2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946参照のこと］。さらなるＲＳＶ Ｆタンパク質エピトープも同定されている。例えば、ヒト抗ＲＳＶ Ｆａｂ断片Ｆａｂ１９［Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10164-10168およびCrowe et al., (1994) Proc. Natl. Acad Sci USA 91:1386-1390参照のこと］は、Beelerらによって同定されたエピトープとは異なる抗原部位Ａ中のエピトープと結合する［Crowe et al. (1998) Virology 252:373-375およびBarbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10164-10168参照のこと］。
ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶ ＡおよびＢサブグループにわたって９１％を超える類似性を示すのに対し、ＲＳＶ Ｇタンパク質は、ＲＳＶ ＡおよびＲＳＶ Ｂサブグループ間で５３％のアミノ酸類似性しか示さない［Sullender (2000) Clin. Microbiol. Rev. 13:1-15］。ＡおよびＢウイルスサブタイプは、ほとんどのＲＳＶ伝染病において同時に循環するので、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片などのＲＳＶのＡおよびＢサブタイプを中和する抗体が望ましい。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染は、乳児および小児における下気道疾患の主な原因である。ＲＳＶ感染はまた、米国では、細気管支炎または肺中の小さい気道の炎症および１歳未満の幼児における肺炎の最も一般的な原因である。さらに、ＲＳＶ感染はまた、高齢者における呼吸器疾患の重要な原因としても認識されている。ＲＳＶ感染と関連している症状および状態として、例えば、喘息、喘鳴音、反応性気道疾患（ＲＡＤ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が挙げられる。したがって、本明細書において記載されるように、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体は、ＲＳＶの予防のために、治ＲＳＶ感染の治療のためにおよび／またはこのようなＲＳＶ媒介性疾患の１種または複数の症状の軽減のために使用され得る。
Ｃ．抗ＲＳＶ抗体
治療用、予防用および診断用に使用され得る抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が本明細書において提供される。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ＲＳＶに対する対象の受動免疫のために、またはウイルス感染を有する対象の治療のために使用され得る。一例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、予防、すなわち、ＲＳＶ感染の防止のために使用される。別の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、治療用抗体として、すなわち、ＲＳＶウイルス感染の治療のために使用される。さらに別の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、ＲＳＶに対する対象の受動免疫のために使用される。提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、インビトロおよびインビボでのＲＳＶ感染の検出のために、またはＲＳＶ感染のモニタリングのために使用され得る。
１．一般的な抗体構造および機能ドメイン
抗体は、膜結合型および分泌型でＢ細胞によって天然に産生される。抗体は、同族相互作用によって、抗原エピトープを特異的に認識し、結合する。同族抗原と結合する抗体は、毒素、病原体およびその他の感染性病原体の中和およびクリアランスを引き起こす複数のエフェクター機能を開始できる。
抗体特異性における多様性は、Ｂ細胞発達の間の組換え事象によって天然に生じる。これらの事象を通じて、抗体分子の可変領域をコードする、複数の抗体Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子、セグメントの種々の組合せが、定常領域遺伝子と接続されて、多数の多様な抗体を有する天然抗体レパートリーが生じる。ヒト抗体レパートリーは、１０１０を超える種々の抗原特異性を含有し、したがって、理論的には、あらゆる外来抗原を特異的に認識することができる。抗体は、このような天然に産生された抗体ならびに合成によって、すなわち、組換えによって製造された抗体、例えば、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片をはじめとする抗体断片を含む。
フォールディングされた抗体ポリペプチドでは、結合特異性は、重鎖および／または軽鎖可変領域ドメインの部分を含有する抗原結合部位ドメインによって付与される。抗体分子上のその他のドメインは、シグナル伝達ならびにその他の細胞、ポリペプチドおよび生体分子との相互作用などの事象に参加することによってエフェクター機能を果たす。これらのエフェクター機能は、抗体によって認識される感染性病原体の中和および／またはクリアランスを引き起こす。抗体ポリペプチドのドメインは、特定の特性を変更するために本明細書における方法に従って変化させることができる。
ａ．抗体の構造的および機能ドメイン
全長抗体は、複数の鎖、ドメインおよび領域を含有する。全長の従来の抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含有し、その各々が、複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含有する。Ｉｇドメインは、各々、ループによってつながれている逆平行β鎖を含有するβプリーツシートを含有する、Ｉｇフォールドと呼ばれる構造を特徴とする。Ｉｇフォールド中の２つのβシートは、疎水性相互作用および保存された鎖内ジスルフィド結合によって一緒に挟まれている。抗体鎖中のＩｇドメインは、可変（Ｖ）および定常（Ｃ）領域ドメインである。各重鎖は、ジスルフィド結合によって軽鎖と連結されており、２つの重鎖は、ジスルフィド結合によって互いに連結されている。重鎖の連結は、ヒンジ領域として知られる重鎖の可動性領域によって媒介される。
各全長の従来の抗体軽鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＬ）および１つの定常領域ドメイン（ＣＬ）を含有する。各全長の従来の重鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＨ）および３または４つの定常領域ドメイン（ＣＨ）およびいくつかの場合には、ヒンジ領域を含有する。上記で論じられた組換え事象のために、可変領域ドメインをコードする核酸配列は、抗体間で異なっており、個々の抗体に抗原特異性を付与する。他方、定常領域は、抗体間でより保存された配列によってコードされている。これらのドメインは、抗体に機能特性、例えば、免疫系の細胞および血清タンパク質と相互作用して、感染性病原体のクリアランスを引き起こす能力を付与する。種々のクラスの抗体、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＡが、種々の定常領域を有し、これによって、それらが別個のエフェクター機能を果たすことが可能となる。
各可変領域ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変（ＨＶ）領域と呼ばれる３つの部分を含有し、これらは、高度に可変の核酸配列によってコードされている。ＣＤＲは、可変領域Ｉｇドメインのβシートをつなぐループ内に位置する。３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、一緒になって、抗体の従来の抗原結合部位（抗体結合部位）を構成し、これは、同族抗原と物理的に相互作用し、抗体の特異性を提供する。全抗体は、各々、１つの重鎖および１つの軽鎖に由来するＣＤＲで構成される、２つの同一の抗体結合部位を含有する。それらは、β鎖をつなぐループ内に含有されるので、３つのＣＤＲは、可変領域の直鎖アミノ酸配列に沿って不連続である。抗体ポリペプチドのフォールディングの際には、ＣＤＲループは極接近し、抗原結合部位を構成する。可変領域ドメインのβシートは、フレームワーク領域（ＦＲ）を形成し、これは、抗体のその他の特性、例えば、安定性にとって重要である、より保存された配列を含有する。
ｂ．抗体断片
本明細書において提供される抗体は、全長抗体の全配列未満を含有するが、少なくとも全長抗体の部分特異的結合能を保持する、全長抗体の誘導体である抗体断片を含む。抗体断片はまた、親抗体の結合親和性を保持するために、抗体フレームワーク中に挿入してもよい（例えば、キメラ抗体）抗体の抗原結合部分も含み得る。抗体断片の例として、それだけには限らないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片ならびに改変された断片を含むその他の断片が挙げられる［例えば、Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25、Kipriyanov参照のこと］。抗体断片は、例えば、ジスルフィド橋によって一緒に連結されている複数の鎖を含み得、組換えによって製造できる。抗体断片はまた、合成リンカー、例えば、２つ以上のドメインを連結するためのペプチドリンカーを含有し得る。抗原結合断片を作製する方法は、当技術分野では周知であり、本明細書において提供される任意の抗体を改変するために使用してよい。抗体分子の断片は、例えば、酵素的切断などによって製造できる。例えば、パパインによるプロテアーゼ切断の際には、重鎖定常領域の二量体、Ｆｃドメインが、２つのＦａｂ領域（すなわち、可変領域を含有する部分）から切断される。
一本鎖抗体は、特定の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を接続することによって組換えによって操作され得る。可変領域の特定の核酸配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその他の組換え核酸技術などの標準の分子生物学法によってクローニングできる。ｓＦｖｓを製造する方法は、例えば、Whitlow and Filpula (1991) Methods、2:97-105；Bird et al. (1988) Science 242:423-426；Pack et al. (1993) Bio/Technology 11:1271-77；および米国特許第４，９４６，７７８号、同５，８４０，３００号、同５，６６７，９８８号、同５，６５８，７２７号、同５，２５８，４９８号）によって記載されている。一本鎖抗体はまた、標的抗原との結合について一本鎖抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。このようなライブラリーを構築およびスクリーニングする方法は、当技術分野で周知である。
２．例示的抗ＲＳＶ抗体
ＲＳＶと結合し、それを中和する抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。特に、抗体または抗原結合断片は、ＲＳＶ Ｆタンパク質と免疫特異的に結合する。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体または上記のいずれかの抗原結合断片を含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体または上記のいずれかの抗原結合断片を含む形態で、治療および診断法において使用できる。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
ＲＳＶ Ｆタンパク質と免疫特異的に結合する本明細書において提供される例示的抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片として、本明細書において他の部分で詳細に記載されるＦａｂ断片である５８ｃ５およびｓｃ５が挙げられる。本明細書において提供される例示的抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、５８ｃ５またはｓｃ５の重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）を含有する重鎖ならびに／または軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）を含有する軽鎖を含有する、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書において提供される例示的抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１もしくは９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および／または配列番号５もしくは１３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含有する、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の例では、抗ＲＳＶ抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含有するＦａｂ断片である。特定の例では、抗ＲＳＶ抗体は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含有するＦａｂ断片である。
本明細書において提供される抗体は、５８ｃ５またはｓｃ５の全長抗体の形態を含む。本明細書において提供される抗体はまた、５８ｃ５またはｓｃ５の抗原結合部位（例えば、ＣＤＲ）を含有する全長抗体の形態も含む。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、当技術分野で公知の任意の定常領域、例えば、それだけには限らないが、ヒト軽鎖カッパ（κ）、ヒト軽鎖ラムダ（λ）、ＩｇＧ１の定常領域、ＩｇＧ２の定常領域、ＩｇＧ３の定常領域またはＩｇＧ４の定常領域をはじめとする当技術分野で公知の任意のヒト定常領域を含有し得る。本明細書において提供される抗体または抗原結合断片は、当技術分野で公知である任意の定常領域を含有し得る。いくつかの例では、抗体の１つまたは複数の定常領域は、ヒトである。
本明細書において提供される抗体は、ＲＳＶ Ｆタンパク質と免疫特異的に結合する５８ｃ５およびｓｃ５のその他の抗体断片の形態を含む。このような断片として、ＲＳＶ Ｆタンパク質と結合する能力を保持する、５８ｃ５もしくはｓｃ５の抗原結合断片（単数または複数）を含有する任意のその抗原結合断片または操作された抗体が挙げられる。このような抗体は、例えば、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体または上記のいずれかの抗原結合断片を含む。特定の例では、抗体は、Ｆａｂ断片５８ｃ５またはｓｃ５である。
本明細書において提供される例示的抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、５８ｃ５またはｓｃ５の、それぞれ、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインのアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび／または軽鎖可変ＶＬドメインを含有する抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１もしくは９のアミノ酸１〜１２５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび／または配列番号５もしくは１３のアミノ酸１〜１０７に示されるアミノ酸配列を有すＶＬドメインを含有し得る。一例では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸１〜１２５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸１〜１０７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含有する。別の例では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９のアミノ酸１〜１２５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号１３のアミノ酸１〜１０７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含有する。
本明細書において提供される例示的抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、５８ｃ５またはｓｃ５のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインそれぞれと少なくともまたは約８０％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含有する抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１もしくは９のアミノ酸１〜１２５に示されるアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび／または配列番号５もしくは１３のアミノ酸１〜１０７に示されるアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含有し得る。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１もしくは９のアミノ酸１〜１２５に示されるアミノ酸配列と少なくとももしくは約(at least or about)８１％、少なくとももしくは約８２％、少なくとももしくは約８３％、少なくとももしくは約８４％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８６％、少なくとももしくは約８７％、少なくとももしくは約８８％、少なくとももしくは約８９％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９１％、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９３％、少なくとももしくは約９４％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９６％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９８％または少なくとももしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび／または配列番号５もしくは１３のアミノ酸１〜１０７に示されるアミノ酸配列と、少なくとももしくは約８１％、少なくとももしくは約８２％、少なくとももしくは約８３％、少なくとももしくは約８４％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８６％、少なくとももしくは約８７％、少なくとももしくは約８８％、少なくとももしくは約８９％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９１％、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９３％、少なくとももしくは約９４％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９６％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９８％または少なくとももしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含有し得る。
したがって、配列番号１のアミノ酸１〜１２５に示されるアミノ酸配列と、少なくとももしくは約８０％〜９９％同一である、例えば、９０％〜９９％または少なくとも９５％同一である、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含有する、ならびに配列番号５のアミノ酸１〜１０７に示されるアミノ酸配列と、少なくとももしくは約８０％〜９９％同一である、例えば、９０％〜９９％または少なくとも９５％同一である、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含有する抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。
別の例では、配列番号９のアミノ酸１〜１２５に示されるアミノ酸配列と、少なくとももしくは約８０％〜９９％同一である、例えば、９０％〜９９％または少なくとも９５％同一である、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含有する、ならびに配列番号１３のアミノ酸１〜１０７に示されるアミノ酸配列と、少なくとももしくは約８０％〜９９％同一である、例えば、９０％〜９９％または少なくとも９５％同一である、例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含有する抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。
また、５８ｃ５またはｓｃ５のＣＤＲの中から選択される１つまたは複数のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片も提供される。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２、１６２７、１０または１６２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１を含有し得る。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＡＳＩＮＳＤＮＹＹＷＴ（配列番号２）、ＳＤＮＹＹＷＴ（配列番号１６２７）、ＧＤＳＩＳＧＳＮＷＷＮ（配列番号１０）またはＧＳＮＷＷＮ（配列番号１６２８）を有するＶＨ ＣＤＲ１を含有し得る。
別の例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３または１１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２を含有し得る。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＨＩＳＹＴＧＮＴＹＹＴＰＳＬＫＳ（配列番号３）またはＥＩＹＹＲＧＴＴＮＹＫＳＳＬＫＧ（配列番号１１）を有するＶＨ ＣＤＲ２を含有し得る。
別の例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４または１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有し得る。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＣＧＡＹＶＬＩＳＮＣＧＷＦＤＳ（配列番号４）またはＧＧＲＳＴＦＧＰＤＹＹＹＹＭＤＶ（配列番号１２）を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有し得る。
１つの特定の例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有する。
別の特定の例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有する。
また、５８ｃ５またはｓｃ５のＣＤＲの中から選択される１つまたは複数のＶＬ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片も提供される。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６または１４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含有し得る。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＳＴＹＬＮ（配列番号６）またはＲＡＳＱＮＩＫＮＹＬＮ（配列番号１４）を有するＶＬ ＣＤＲ１を含有し得る。
別の例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７または１５に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含有し得る。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＡＳＮＬＥＴ（配列番号７）またはＡＡＳＴＬＱＳ（配列番号１５）を有するＶＬ ＣＤＲ２を含有し得る。
別の例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８または１６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有し得る。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＱＹＱＹＬＰＹＴ（配列番号８）またはＱＱＳＹＮＮＱＬＴ（配列番号１６）を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有し得る。
１つの特定の例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する。
別の特定の例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する。
本明細書において提供されるＣＤＲの任意の組合せは、抗体または抗原結合断片が、ＲＳＶ Ｆタンパク質と免疫特異的に結合する能力を保持するという条件で、抗体またはその抗原結合断片の作製のために選択できる。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、当技術分野で公知の抗体フレームワーク領域を含有し得る。例示的フレームワーク領域として、ヒトフレームワーク領域をはじめとする、単離された天然に存在するフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域が挙げられる［例えば、Chothia et al. (1998) J. Mol. Biol. 278:457-479参照のこと］。いくつかの例では、抗体フレームワーク領域は、ヒト抗体フレームワーク領域である。いくつかの例では、抗原結合断片は、５８ｃ５またはｓｃ５のフレームワーク領域を含有する。
本明細書において提供される例示的な単離された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片として、本明細書において提供される抗体のいずれかと同一の、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質上のエピトープと免疫特異的に結合する任意の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。一例では、配列番号１に示される重鎖および配列番号５に示される軽鎖を含有する抗体である５８ｃ５と同一のエピトープと結合する抗体が、本明細書において提供される。別の例では、配列番号９に示される重鎖および配列番号１３に示される軽鎖を含有する抗体であるｓｃ５と同一のエピトープと結合する抗体が、本明細書において提供される。通常、このような抗体は、重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）またはその抗原結合断片を含有する。
本明細書において提供される抗体または抗原結合断片は、少なくとももしくは約(at least or about)１×１０８Ｍ−１、少なくとももしくは約２．５×１０８Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０８Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０９Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０９Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１０Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１０Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１１Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１１Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１２Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１２Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１３Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１３Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１４Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１４Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１５Ｍ−１または少なくとももしくは約５×１０１５Ｍ−１というＲＳＶ Ｆタンパク質エピトープの結合親和性定数（Ｋａ）を示す。本明細書において提供される抗体は、配列番号２５に示されるＲＳＶ Ａ２株Ｆタンパク質の細胞外ドメインなどの組換えによって精製されたＦタンパク質に対して結合親和性を示し得る。本明細書において提供される抗体はまた、細胞におけるＲＳＶの感染および発現によって生じるものなどの天然ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して結合親和性を示し得る。本明細書において提供される抗体は、組換えによって精製されたＦタンパク質対天然ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して、同一または異なっている結合親和性を有し得る。例えば、実施例４は、５８ｃ５が、組換えによって精製されたＦタンパク質よりも、天然ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して高い結合親和性を有することを示す。対照的に、ｓｃ５は、ＲＳＶ Ｆタンパク質が天然であろうと、組換えによって発現されようと類似の結合親和性を示す。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片は、約１×１０-８Ｍまたはそれ未満、約４×１０−９Ｍまたはそれ未満、約２×１０−９Ｍまたはそれ未満、約１×１０−９Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１０Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１０Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１１Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１１Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１２Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１２Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１３Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１３Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１４Ｍまたはそれ未満、約１×１０-１４Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１５Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１５Ｍまたはそれ未満または約２×１０-１６Ｍまたはそれ未満というＲＳＶ Ｆタンパク質エピトープに対する解離定数（Ｋｄ）を有する。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片は、ＲＳＶの中和についてのインビトロマイクロ中和アッセイにおいて、約０．００５ｎＭまたはそれ未満、約０．０１ｎＭまたはそれ未満、約０．０２５ｎＭまたはそれ未満、約０．０５ｎＭまたはそれ未満、約０．０７５ｎＭまたはそれ未満、約０．１ｎＭまたはそれ未満、約０．５ｎＭまたはそれ未満、約０．７５ｎＭまたはそれ未満、約１ｎＭまたはそれ未満、約１．２５ｎＭまたはそれ未満、約１．５ｎＭまたはそれ未満、約１．７５ｎＭまたはそれ未満、約２ｎＭまたはそれ未満のＥＣ５０を有する。特定の例では、本明細書において提供される単離された抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片は、ＲＳＶの中和についてのインビトロプラーク減少アッセイにおいて、約０．００５ｎＭもしくはそれ未満〜約２ｎＭもしくはそれ未満；約０．００５ｎＭもしくはそれ未満〜約１ｎＭもしくはそれ未満；約０．００５ｎＭもしくはそれ未満〜約０．５ｎＭもしくはそれ未満；約０．０１ｎＭもしくはそれ未満〜約１ｎＭもしくはそれ未満；約０．０５ｎＭもしくはそれ未満〜約１ｎＭもしくはそれ未満；約０．０５ｎＭもしくはそれ未満〜約０．５ｎＭもしくはそれ未満；または約０．１ｎＭもしくはそれ未満〜約０．５ｎＭもしくはそれ未満のＥＣ５０を有する。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、ＲＳＶの中和についてのインビトロマイクロ中和において、種々の抗ＲＳＶ抗体に対するモノクローナル抗体エスケープ突然変異体（ＭＡＲＭ）を中和する。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、それからＭＡＲＭが作製された親ＲＳＶ株の中和のＥＣ５０であるか、またはほぼ同一であるＥＣ５０でＭＡＲＭを中和する。第１の抗体が、第２の抗体に対して作製されたＭＡＲＭを中和できる場合には、抗体は、異なるエピトープと特異的に結合するか、または相互作用すると結論づけることができる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、ＲＳＶの、その宿主細胞受容体との結合を、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の不在下でのＲＳＶのその宿主細胞受容体との結合と比較して、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％阻害する。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片は、ＲＳＶ複製を、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の不在下でのＲＳＶ複製に対して少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％阻害する。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片は、１５日以上、２０日以上、２５日以上、３０日以上、４０日以上、４５日以上、５０日以上、５５日以上、６０日以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上または５ヶ月以上の半減期を有する。本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片の半減期を延長する方法は、当技術分野で公知である。このような方法として、例えば、本明細書において他の部分で記載されるようなペグ化、グリコシル化およびアミノ酸置換が挙げられる。
ａ．誘導抗体
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を使用して、キメラ抗体またはその他の抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片などといった誘導抗体を作製できる。一般に、親抗体に由来する誘導抗体または抗原結合断片は、親抗体の結合特異性を保持する。抗体断片は、当業者に公知の任意の技術によって作製できる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を製造するための）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を製造するための）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって製造できる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。さらに、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して作製できる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の抗原結合可変領域を、当技術分野で公知の１つまたは複数の定常領域と組換えによって融合して、キメラ全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはその他の抗原結合断片を作製できる。抗体断片から全長抗体を作製するための例示的方法は、当技術分野で公知であり、本明細書において提供される。キメラ抗体を製造する方法は、当技術分野で公知である［例えば、Morrison (1985) Science 229:1202；Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214；Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202;ならびに米国特許第５，８０７，７１５号、同４，８１６，５６７号および同４，８１６，３９７号を参照のこと］。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲと、異種免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを含むキメラ抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９６７；および米国特許第５，２２５，５３９号、同５，５３０，１０１号および同５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（veneering）または再表面形成（resurfacing）［ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Padlan (1991) Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et al. (1994) Protein Engineering 7(6):805-814；およびRoguska et al. (1994) PNAS 91:969-973］および鎖シャッフリング（chain shuffling）（米国特許第５，５６５，３３２号）をはじめとする当技術分野で公知の種々の技術を使用して製造できる。
いくつかの例では、抗体は、５８ｃ５の１つまたは複数のＣＤＲ（例えば、配列番号２〜４、１６２７および６〜８に示される１つまたは複数のＣＤＲ）と、異種フレームワーク領域とを含有する。いくつかの例では、抗体は、ｓｃ５の１つまたは複数のＣＤＲ（例えば、配列番号１０〜１２、１６２８および１４〜１６に示される１つまたは複数のＣＤＲ）と、異種フレームワーク領域とを含有する。フレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合性を変更、例えば、改善するために、ＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基と置換してもよい。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合性にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される［例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；およびRiechmann et al. (1988) Nature 332:323参照のこと］。
いくつかの例では、誘導抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、少なくとももしくは約１×１０８Ｍ−１、少なくとももしくは約２．５×１０８Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０８Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０９Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０９Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１０Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１０Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１１Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１１Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１２Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１２Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１３Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１３Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１４Ｍ−１、少なくとももしくは約５×１０１４Ｍ−１、少なくとももしくは約１×１０１５Ｍ−１または少なくとももしくは約５×１０１５Ｍ−１の、ＲＳＶ Ｆタンパク質エピトープの結合親和性定数（Ｋａ）を有する。
いくつかの例では、誘導抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、約１×１０-８Ｍまたはそれ未満、約４×１０−９Ｍまたはそれ未満、約２×１０−９Ｍまたはそれ未満、約１×１０−９Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１０Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１０Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１１Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１１Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１２Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１２Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１３Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１３Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１４Ｍまたはそれ未満、約１×１０-１４Ｍまたはそれ未満、約２×１０−１５Ｍまたはそれ未満、約１×１０−１５Ｍまたはそれ未満または約２×１０-１６Ｍまたはそれ未満の、ＲＳＶ Ｆタンパク質エピトープに対する解離定数（Ｋｄ）を有する。
いくつかの例では、誘導(derivative)抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、ＲＳＶの中和についてのインビトロマイクロ中和アッセイにおいて、約０．００５ｎＭまたはそれ未満、約０．０１ｎＭまたはそれ未満、約０．０２５ｎＭまたはそれ未満、約０．０５ｎＭまたはそれ未満、約０．０７５ｎＭまたはそれ未満、約０．１ｎＭまたはそれ未満、約０．５ｎＭまたはそれ未満、約０．７５ｎＭまたはそれ未満、約１ｎＭまたはそれ未満、約１．２５ｎＭまたはそれ未満、約１．５ｎＭまたはそれ未満、約１．７５ｎＭまたはそれ未満、約２ｎＭまたはそれ未満のＥＣ５０を有する。特定の例では、誘導抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、ＲＳＶの中和についてのインビトロプラーク減少アッセイにおいて、約０．００５ｎＭもしくはそれ未満〜約２ｎＭもしくはそれ未満；約０．００５ｎＭもしくはそれ未満〜約１ｎＭもしくはそれ未満；約０．００５ｎＭもしくはそれ未満〜約０．５ｎＭもしくはそれ未満；約０．０１ｎＭもしくはそれ未満〜約１ｎＭもしくはそれ未満；約０．０５ｎＭもしくはそれ未満〜約１ｎＭもしくはそれ未満；約０．０５ｎＭもしくはそれ未満〜約０．５ｎＭもしくはそれ未満；または約０．１ｎＭもしくはそれ未満〜約０．５ｎＭもしくはそれ未満のＥＣ５０を有する。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の任意の誘導体は、治療レジメン、予防療法および／または診断技術において、例えば、提供される方法において使用できる。例えば、誘導抗体またはその抗原結合断片は、ＲＳＶ感染の治療、予防および／もしくは検出またはＲＳＶ感染の１種もしくは複数の症状の軽減のためにＲＳＶと結合するために使用できる。
ｉ．一本鎖抗体
特定の例では、抗ＲＳＶ抗体は、一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片のいずれかの抗原結合ドメインから作製できる。組換え技術を使用して一本鎖抗体を作製する方法は、例えば、Marasco et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:7889-7893、Whitlow and Filpula (1991) Methods、2: 97-105；Bird et al. (1988) Science 242:423-426；Pack et al. (1993) Bio/Technology 11:1271-77；および米国特許第４，９４６，７７８号、同５，８４０，３００号、同５，６６７，９８８号、同５，６５８，７２７号に記載されるものなど、当技術分野で公知である。
一本鎖抗体は、本明細書において提供される任意の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインまたはその機能領域および重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたはその機能領域を含有し得る。いくつかの例では、一本鎖抗体のＶＬドメインまたはその機能領域は、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および／または相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含有する。いくつかの例では、一本鎖抗体のＶＨドメインまたはその機能領域は、本明細書において提供される任意の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含有する。いくつかの例では、一本鎖抗体は、ペプチドリンカーをさらに含有する。このような例では、ペプチドリンカーは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の間に位置し得る。
一本鎖抗体は、抗体の１つまたは複数のドメインの間にペプチドスペーサーまたはリンカーを含有し得る。例えば、抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、可動性リンカーペプチドを介して重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とカップリングされ得る。種々のペプチドリンカーが、当技術分野で周知であり、提供される方法において使用され得る。ペプチドリンカーは、一連のグリシン残基（Ｇｌｙ）またはセリン（Ｓｅｒ）残基を含み得る。ポリペプチドリンカーの例示として、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、（ＧｌｙｍＳｅｒ）ｎまたは（ＳｅｒｍＧｌｙ）ｎを有するペプチドがあり、ここで、ｍは、１〜６、通常、１〜４、通常、２〜４であり、ｎは、１〜３０または１〜１０、通常、１〜４であり、溶解度を高めるために、一部のグルタミン酸（Ｇｌｕ）またはリシン（Ｌｙｓ）残基がいたるところに分散されている（例えば、コンジュゲートにおいて使用するための例示的リンカーを提供する国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／０６６４１参照のこと）。例示的ペプチドリンカーとして、それだけには限らないが、配列ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１５１２）、ＧＳＧＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５１３）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号１５１４）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＱ（配列番号１５１５）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号１５１６）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１５１７）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１５１８）およびＥＳＧＳＶＳＳＥＥＬＡＦＲＳＬＤ（配列番号１５１９）を有するペプチドが挙げられる。一般に、リンカーペプチドは、およそ１〜５０個のアミノ酸長である。本明細書において使用されるリンカーはまた、細胞内利用能、血清安定性、特異性および溶解度を高めるか、または増大した柔軟性を提供するか、または立体障害を軽減し得る。連結部分は、例えば、Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883、Whitlow et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995およびNewton et al., (1996) Biochemistry 35:545-553に記載されている。その他の適したペプチドリンカーとして、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７５１，１８０または同４，９３５，２３３号に記載されるもののいずれかが挙げられる。
ｉｉ．抗イディオタイプ抗体
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を利用し、当業者に周知の技術を使用して、抗体が免疫特異的に結合するＲＳＶ Ｆタンパク質抗原を「摸倣する」抗イディオタイプ抗体を作製できる［例えば、Greenspan & Bona (1989) FASEB J. 7(5):437-444；およびNissinoff (1991) J. Immunol. 147(8):2429-2438参照のこと］。例えば、当技術分野で周知のアッセイによって決定されるように、その宿主細胞受容体と結合し、ＲＳＶのその宿主細胞受容体との結合を競合的に阻害する、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を使用して、ＲＳＶ抗原を「摸倣し」、ＲＳＶ受容体と結合する、すなわち、宿主細胞との結合についてウイルスと競合し、したがって、ウイルスへの宿主細胞の感染率を低下させる抗イディオタイプを作製できる。いくつかの例では、抗抗イディオタイプは、当業者に周知の技術によって作製できる。抗抗イディオタイプは、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の結合ドメインを摸倣し、結果として、ＲＳＶと結合し、それを中和する。
ｉｉｉ．多重特異性抗体および抗体多量体化
本明細書において提供される２種以上の抗体またはその抗原結合断片を操作して、二価、三価、四価、五価、六価、七価またはそれ以上の結合価（すなわち、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の抗原結合部位を含有する）の誘導抗体などの多価誘導抗体または多量体を形成できる。このような多価誘導抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多重特異性のものであり得る。いくつかの例では、多価誘導抗体は、単一特異性であり、同一のエピトープと免疫特異的に結合する２以上の抗原結合ドメインを含有する。いくつかの例では、多価誘導抗体は、多重特異性であり、２種以上の異なるエピトープと免疫特異的に結合する２以上の抗原結合ドメインを含有する。いくつかの特定の例では、多価誘導抗体は、二価であり、２つの抗原結合ドメインを含有する。このような二価抗体は、それぞれ、同一または異なるエピトープと免疫特異的に結合するホモ二価またはヘテロ二価抗体であり得る。
いくつかの例では、多重特異性抗体は、ＲＳＶの２種以上の異なるエピトープと免疫特異的に結合し得る。多重特異性抗体を操作する技術は、当技術分野で公知であり、これとして、例えば、共有結合、非共有結合または化学結合による２種以上の抗原結合断片の連結が挙げられる。いくつかの例では、多価誘導抗体は、２以上の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の二量体化によって形成され得る。２種の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片間の多量体化は、自発的である場合も、２以上のポリペプチドの強制的な連結によって起こる場合もある。一例では、抗ＲＳＶ抗体の多量体は、異なる抗ＲＳＶ抗体上のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合によって連結され得る。別の例では、多価誘導抗体は、抗体またはその抗原結合断片と融合しているペプチド部分と、共有結合または非共有結合相互作用によって接続される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含み得る。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）または多量体化を促進する特性を有するペプチドであり得る。いくつかの例では、多価誘導抗体は、化学結合によって、例えば、ヘテロ二官能性リンカーを使用することなどによって、２つの抗体間で形成され得る。
任意の多重特異性および／または多価誘導抗体は、抗体が、生体適合性であり（例えば、ヒトをはじめとする動物への投与のために）、１つまたは複数のエピトープとの結合および／またはＲＳＶの中和などのその活性を維持するという条件で、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片から作製され得る。本明細書において提供される多重特異性および多価誘導抗体について、誘導抗体は、少なくとも５８ｃ５またはｓｃ５によって認識されるエピトープに対して免疫特異的である。
いくつかの例では、多重特異性および／または多価抗体は、配列番号２または１０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３または１１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４または１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号６または１４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７または１５に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、配列番号８または１６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３またはそれらの任意の組合せを含有する。
いくつかの例では、ＲＳＶ Ｆタンパク質（例えば、配列番号１５２７、１６２９または１６３０に示されるアミノ酸配列を有するＲＳＶ Ｆタンパク質）の２種以上のエピトープと免疫特異的に結合する多重特異性抗体を作製できる。例えば、多重特異性抗体は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＡ、ＢまたはＣ抗原領域中の２種以上の異なるエピトープと免疫特異的に結合し得る。いくつかの例では、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエピトープと、別のＲＳＶエピトープと免疫特異的に結合する多重特異性抗体を作製できる。例えば、多重特異性抗体は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエピトープと、別のＲＳＶ表面糖タンパク質のエピトープと免疫特異的に結合し得る。いくつかの例では、多重特異性抗体は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエピトープと、ＲＳＶ結合タンパク質（例えば、配列番号１５２０に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶ ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットラージ構造タンパク質（Ｌタンパク質）（例えば、配列番号１５２１に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質（例えば、配列番号１５２２に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶ核タンパク質（Ｎ）（例えば、配列番号１５２３に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶホスホプロテインＰ（例えば、配列番号１５２４に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶマトリックスタンパク質（例えば、配列番号１５２５に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶ小疎水性（ＳＨ）タンパク質（例えば、配列番号１５２６に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶ ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ、ＲＳＶ Ｇタンパク質（例えば、配列番号１５２８に示されるアミノ酸配列を有する）または上記のいずれかの対立遺伝子変異体の中から選択されるＲＳＶタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合し得る。いくつかの例では、多重特異性抗体は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエピトープと、ＲＳＶ Ｇタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合し得る。
いくつかの例では、多重特異性抗体は、５８ｃ５またはｓｃ５に由来する抗ＲＳＶ抗原結合断片と、別の抗ＲＳＶ抗体に由来する抗ＲＳＶ抗原結合断片とを含有する。いくつかの例では、多重特異性抗体は、５８ｃ５またはｓｃ５に由来する抗ＲＳＶ抗原結合断片と、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））およびそれだけには限らないが、モタビズマブ（ＮＵＭＡＸ（登録商標））、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ（例えば、米国特許第５，８２４，３０７号および同６，８１８，２１６号参照のこと）などのその誘導体の中から選択される抗ＲＳＶ抗体に由来する抗ＲＳＶ抗原結合断片とを含有する。いくつかの例では、多重特異性抗体は、５８ｃ５またはｓｃ５に由来する抗ＲＳＶ抗原結合断片と、それだけには限らないが、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９（すなわち、Ｆａｂ１９）、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１およびＲＦ−２（例えば、米国特許第６，６８５，９４２号および同５，８１１，５２４号参照のこと）などのヒト抗ＲＳＶ抗体に由来する抗ＲＳＶ抗原結合断片とを含有する。いくつかの例では、多重特異性抗体は、５８ｃ５またはｓｃ５に由来する抗ＲＳＶ抗原結合断片と、それだけには限らないが、ＭＡｂ１１５３、１１４２、１２００、１２１４、１２３７、１１２９、１１２１、１１０７、１１１２、１２６９、１２６９、１２４３［Beeler et al. (1989) J. Virology 63(7):2841-2950］、ＭＡｂ１５１［Mufson et al. (1987) J. Clin. Microbiol. 25:1635-1539］、ＭＡｂ４３−１および１３−１［Fernie et al. (1982) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 171:266-271］、ＭＡｂ１４３６Ｃ、１３０２Ａ、１３０８Ｆおよび１３３１Ｈ［Anderson et al. (1984) J. Clin. Microbiol. 19:934-936］などの抗ＲＳＶマウスモノクローナル抗体およびそのヒト化誘導体に由来する抗ＲＳＶ抗原結合断片とを含有する。５８ｃ５またはｓｃ５に由来する抗ＲＳＶ抗原結合断片を含有する多重特異性抗体を作製するために使用できるさらなる例示的抗体またはその抗原結合断片として、それだけには限らないが、例えば、米国特許第６，４１３，７７１号、同５，８４０，２９８号、同５，８１１，５２４号、同６，６５６，４６７号、同６，５３７，８０９号、同７，３６４，７４２号、同７，０７０，７８６号、同５，９５５，３６４号、同７，４８８，４７７号、同６，８１８，２１６号、同５，８２４，３０７号、同７，３６４，７３７号、同６，６８５，９４２号および同５，７６２，９０５号および米国特許出願公開第２００７−００８２００２号、同２００５−０１７５９８６号、同２００４−０２３４５２８号、同２００６−０１９８８４０号、同２００９−０１１０６８４号、同２００６−０１５９６９５号、同２００６−００１３８２４号、同２００５−０２８８４９１号、同２００５−００１９７５８号、同２００８−０２２６６３０号、同２００９−０１３７００３号および同２００９−００９２６０９号に記載されている抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
いくつかの例では、多重特異性抗体または抗原結合断片は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエピトープおよび別の異種ポリペプチドのエピトープまたは例えば、固相支持体物質などのその他の抗原物質と免疫特異的に結合し得る（例えば、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／０５７９３；米国特許第４，４７４，８９３号、同４，７１４，６８１号、同４，９２５，６４８号、同５，５７３，９２０号および同５，６０１，８１９号；Tutt、et al., (1991) J. Immunol. 147:60-69およびKostelny et al., (1992) J. Immunol. 148:1547-1553参照のこと。
（１）ペプチドリンカーによる多量体化
ペプチドリンカーを使用して、例えば、１種の多量体化パートナーが、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片である多量体などの多価抗体を製造できる。一例では、ペプチドリンカーは、第１のポリペプチドのＣ末端および第２のポリペプチドのＮ末端に融合され得る。この構造は、少なくとも１つの、例えば、２、３、４またはそれ以上の可溶性ポリペプチドが、そのそれぞれの末端でペプチドリンカーによって互いに連結されるように多数回反復され得る。例えば、多量体ポリペプチドは、配列Ｚ１−Ｘ−Ｚ２｛式中、Ｚ１およびＺ２は、各々、抗ＲＳＶ抗原結合断片の配列（例えば、抗ＲＳＶ一本鎖抗体；例えば、一本鎖抗体の多量体化を記載する米国特許第６，７５９，５１８号参照のこと）であり、Ｘは、ペプチドリンカーの配列である｝を有し得る。いくつかの例では、Ｚ１および／またはＺ２は、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗原結合断片である。別の例では、Ｚ１およびＺ２は、異なる抗ＲＳＶ抗原結合断片（ここで、少なくともＺ１またはＺ２は、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片に由来する）である。いくつかの例では、多量体ポリペプチドは、Ｚ１−Ｘ−Ｚ２−（Ｘ−Ｚ）ｎの配列（式中、「ｎ」は任意の整数、すなわち、一般に、１または２である）を有する。通常、ペプチドリンカーは、各抗ＲＳＶ抗原結合断片が、抗体の結合特異性に干渉することなく、そのそれぞれのエピトープと結合するのを可能にするよう十分な長さのものである。
（２）ヘテロ二官能性連結物質による多量体化
多価抗体を作製するための、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の、別の抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片との連結は、直接的である場合も、間接的である場合もある。例えば、２種以上の抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片の連結は、化学結合によって達成され得るか、または当技術分野で公知のいずれかもしくは本明細書において提供されるいずれかなどのヘテロ二官能性リンカーによって容易にされ得る。
アミノ基およびチオール基間に共有結合を形成するために、また、タンパク質にチオール基を導入するために使用される多数のヘテロ二官能性架橋試薬は、当業者に公知である［例えば、このような試薬の調製および使用を記載し、このような試薬の商業的供給源を提供するPIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993参照のこと；例えば、Cumber et al., (1992) Bioconjugate Chem. 3:397-401；Thorpe et al., (1987) Cancer Res. 47:5924-5931;Gordon et al., (1987) Proc. Natl. Acad Sci. 84:308-312；Walden et al., (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197;Carlsson et al., (1978) Biochem. J. 173: 723-737；Mahan et al., (1987) Anal. Biochem. 162:163-170；Wawryznaczak et al., (1992) Br. J. Cancer 66:361-366；Fattom et al., (1992) Infection & Immun. 60:584-589も参照のこと］。これらの試薬を使用して、２種の抗体間または各抗体とリンカー間に共有結合を形成できる。例示的試薬として、それだけには限らないが：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ；ジスルフィドリンカー）；スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノアート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルファート（ＳＭＢＴ、ヒンダードジスルファートリンカー）；スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］−ヘキサノアート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）ブチラート（ＳＰＤＢ；ヒンダードジスルフィド結合リンカー）；スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオナート（ＳＡＥＤ）；スルホ−スクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセタート（ＳＡＭＣＡ）；スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］−ヘキサノアート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオン−アミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ、ヒンダードジスルファートリンカー）；スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリミルジ（ｐｙｒｉｍｉｙｌｄｉ）−チオ）トルアミド］ヘキサノアート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ；チオエーテルリンカー）；スルホスクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）；スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）およびアジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）が挙げられる。いくつかの例では、リンカーは、柔軟性または溶解度を高めるものまたは立体障害を提供するものもしくは排除するものなどのペプチドリンカーと組み合わせて使用してよい。ポリペプチド分子を別の分子と連結するための当業者に公知の任意のその他のリンカーを使用してよい。
（３）ポリペプチド多量体化ドメイン
多価および／または多重特異性誘導抗体を形成するための２種以上の抗原結合断片の相互作用は、それ自体が相互作用して安定な構造を形成できる、任意の部分またはその他のポリペプチドとの直接的または間接的いずれかのその連結によって容易にされ得る。例えば、多量体化によって別個のコードされたポリペプチド鎖を接続してもよく、それによって、ポリペプチドの多量体化は、多量体化ドメインによって媒介される。通常、多量体化ドメインは、第１のキメラポリペプチドと第２のキメラポリペプチド間の安定なタンパク質間相互作用の形成を提供する。キメラポリペプチドは、例えば、抗体またはその抗原結合断片の１つの鎖（例えば、可変重鎖ドメインまたは可変軽鎖ドメイン）の、多量体化ドメインとの連結（直接的または間接的）を含む。通常、多量体化ドメインは、抗体またはその抗原結合断片の重鎖ドメインと連結される。このようなキメラポリペプチドは、抗体鎖をコードする核酸を多量体化ドメインをコードする核酸と融合するための組換え技術を使用して融合タンパク質として作製され得る。
本明細書において提供される多価および／または多重特異性誘導抗体にとって、少なくとも１種の多量体化パートナーは、多量体化ドメインと直接的または間接的に連結している抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片である。ホモまたはヘテロ多量体ポリペプチドは、別個のキメラポリペプチドの同時発現から作製され得る。第１および第２のキメラポリペプチドは、同一であっても異なっていてもよい。
一般に、多量体化ドメインは、別のポリペプチドと、安定なタンパク質間相互作用を形成できる任意のポリペプチドを含む。多量体化ドメインは、例えば、免疫グロブリン配列（例えば、Ｆｃドメイン）、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域またはホモまたはヘテロ多量体のキメラ分子間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用し得る。さらに、多量体化ドメインは、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号に記載されるものなどの、孔またはポケットを含むアミノ酸配列に対して相補的である突出部分を含むアミノ酸配列を含み得る。このような多量体化領域は、立体的相互作用が安定な相互作用を促進するだけでなく、キメラモノマーの混合物からホモ二量体を上回るヘテロ二量体の形成をさらに促進するように操作され得る。
いくつかの例では、多価および／または多重特異性抗体は、多量体化ドメインを介した２つの抗ＲＳＶ抗原結合断片の連結によって作製される。このような例では、抗原結合断片のうち少なくとも１つは、例えば、５８ｃ５またはｓｃ５などの本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片に由来する。
キメラポリペプチドを形成するために、例えば、抗ＲＳＶ抗原結合断片などの抗原結合ポリペプチドを、多量体化ドメインにコンジュゲートできる。２種以上の鎖（例えば、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン）を含有する抗ＲＳＶ抗原結合断片については、多量体化ドメインが、鎖、通常、重鎖の一方にコンジュゲートされ得る。抗原結合断片は、通常、多量体化ドメインのＮまたはＣ末端のそのＮまたはＣ末端を介して多量体化ドメインに通常連結される。通常、多量体化ドメインは、抗原結合断片のＣ末端（例えば、一本鎖抗体のＣ末端または抗原結合断片の一方の鎖のＣ末端）にコンジュゲートされる。連結は、直接的である場合も、リンカーを介して間接的である場合もある。また、キメラポリペプチドは、融合タンパク質である場合も、共有結合または非共有結合相互作用などによる化学結合によって形成される場合もある。例えば、多量体化ドメインを含有するキメラポリペプチドを調製する場合には、抗ＲＳＶ抗原結合断片のすべてまたは一部をコードする核酸は、多量体化ドメイン配列をコードする核酸に、直接的にか、または間接的に、または所望により、リンカードメインを介して機能し得る形で連結され得る。通常、コンストラクトは、抗ＲＳＶ抗原結合断片（または抗原結合断片の一本鎖）のＣ末端が、多量体化ドメインのＮ末端と接続しているキメラタンパク質をコードする。
本明細書において提供される多価抗体は、２つの同一または異なる抗ＲＳＶ抗原結合断片を、直接的または間接的に、多量体化ドメインに直接的または間接的に連結することによって作製された、２種のキメラタンパク質を含有する。多量体化ドメインがポリペプチドであるいくつかの例では、抗ＲＳＶ抗原結合断片（または抗原結合断片の一本鎖）多量体化ドメインキメラポリペプチドをコードする遺伝子融合物が、適当な発現ベクター中に挿入される。得られた抗ＲＳＶ抗原結合断片多量体化ドメインキメラタンパク質は、組換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞中で発現され、多量体に組み立てることが可能となり得、ここで、多量体化ドメインが相互作用して、多価抗体を形成する。多量体化ドメインの、抗ＲＳＶ抗原結合断片との化学結合はまた、上記で論じられるヘテロ二官能性リンカーを使用して達成され得る。いくつかの例では、多価抗体は、異なるエピトープと結合する２種以上の抗ＲＳＶ抗原結合断片に由来する多重特異性抗体である。
得られたキメラポリペプチドおよびそれから形成される多価抗体は、当技術分野で公知の任意の適した方法によって、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製され得る。異なる抗ＲＳＶ抗原結合キメラポリペプチドをコードする２種の核酸分子が、細胞中に形質転換される場合には、ホモおよびヘテロ二量体の形成が起こる。発現のための条件は、ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体形成を上回って好まれるよう調整され得る。
（ａ）免疫グロブリンドメイン
多量体化ドメインは、さらなるアミノ酸配列の多量体化ドメインと、分子間ジスルフィド結合を形成するよう反応できる遊離チオール部分を含むものを含む。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリン分子の一部、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥに由来するものを含み得る。一般に、多量体化ドメインとして使用するために選択される免疫グロブリンの一部は、定常領域（Ｆｃ）である。Ｆｃドメインをはじめとする抗体由来ポリペプチドの種々の部分と融合しているポリペプチドを含有する融合タンパク質の調製は、記載されている［例えば、Ashkenazi et al. (1991) PNAS 88: 10535；Byrn et al. (1990) Nature、344:677およびHollenbaugh and Aruffo, (1992)「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」, in Currentprotocols in Immunology、Suppl. 4、pp. 10.19.1-10.19.11参照のこと］。
ヒトでは、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）として示される、その重鎖に基づいて分類された５種の抗体アイソタイプがあり、それぞれ、抗体のＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥクラスを生じさせる。ＩｇＡおよびＩｇＧクラスは、サブクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含有する。免疫グロブリン重鎖間の配列の相違のために、種々のアイソタイプは、例えば、定常（Ｃ）ドメインの数、ヒンジ領域の存在ならびに鎖間ジスルフィド結合の数および位置において異なる。例えば、ＩｇＭおよびＩｇＥ重鎖は、ヒンジ領域に取って代わる余分のＣドメイン（Ｃ４）を含有する。ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡのＦｃ領域は、そのＣγ３、Ｃδ３およびＣα３ドメインによって互いに対を形成するが、ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃ領域は、そのＣμ４およびＣε４ドメインによって二量体化する。ＩｇＭおよびＩｇＡは、それぞれ、１０および４の抗原結合部位を有する多価構造を形成する。
本明細書において提供される抗原結合キメラポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む（すなわち、全長免疫グロブリンのすべてのドメインを含む）。いくつかの例では、抗原結合キメラポリペプチドは、全長未満である（例えば、キメラポリペプチドは、抗原結合ドメインと、多量体化のための１つまたは複数の免疫グロブリンドメインを含有し得、キメラポリペプチドは、全長免疫グロブリンではない）。いくつかの例では、抗ＲＳＶ抗原結合キメラポリペプチドは、一価またはヘテロもしくはホモ多価抗体、例えば、二価、三価、四価、五価、六価、七価またはそれ以上の結合価の抗体として組み立てられる。変動する構造の鎖または基本単位（例えば、もう１つの異種定常領域またはドメイン）を利用して、一価ならびにヘテロおよびホモ多価抗体を組み立てることができる。抗ＲＳＶ抗原結合キメラポリペプチドは、適当な核酸分子を用いて形質転換された哺乳類細胞によって容易に産生され、分泌され得る。いくつかの例では、１または２以上の核酸融合分子を宿主細胞中に形質転換して、多価抗体を製造でき、多価抗体の抗ＲＳＶ抗原結合部分は、同一であるか、または異なっている。通常、多価抗体の少なくとも１つの抗ＲＳＶ抗原結合部分は、例えば、５８ｃ５またはｓｃ５などの本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片に由来する。
（ｉ）Ｆｃドメイン
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗原結合断片を含有する多価および／または多重特異性抗体を作製するために使用できる例示的多量体化ドメインとして、選択された免疫グロブリン分子の重鎖定常領域またはドメインに由来するポリペプチドが挙げられる。ヒトＩｇＧサブタイプの重鎖定常領域の例示的配列は、配列番号１６０１（ＩｇＧ１）、配列番号１６０２（ＩｇＧ２）、配列番号１６０３（ＩｇＧ３）および配列番号１６０４（ＩｇＧ４）に示されている。例えば、配列番号１６０１に示される例示的重鎖定常領域について、ＣＨ１ドメインは、アミノ酸１〜１０３に対応し、ヒンジ領域は、アミノ酸１０４〜１１９に対応し、ＣＨ２ドメインは、アミノ酸１２０〜２２３に対応し、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸２２４〜３３０に対応する。
一例では、免疫グロブリンポリペプチドキメラタンパク質は、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含み得る。通常、このような融合物は、少なくとも１つの機能的に活性なヒンジ、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。例えば、ＩｇＧ１の全長Ｆｃ配列は、配列番号１６０１に示される配列のアミノ酸１０４〜３３０を含む。ｈＩｇＧ１の例示的Ｆｃ配列は、配列番号１６０５に示されており、配列番号１６０１のアミノ酸１０４〜１１９に対応するヒンジ配列ならびに配列番号１６０１に示されるＣＨ２およびＣＨ３ドメインの完全配列を含有する。別の例示的Ｆｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に示されており、Ｎ末端ヒンジ領域からヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の天然Ｃ末端に延びる一本鎖ポリペプチド（配列番号１６０６）である。連結が作製される正確な部位は、決定的なものではなく、特定の部位が当技術分野で周知であり、抗ＲＳＶ抗原結合キメラポリペプチドの生物活性、分泌または結合特徴を最適化するよう選択され得る。例えば、その他の例示的Ｆｃポリペプチド配列は、配列番号１６０１に示される配列のアミノ酸Ｃ１０９またはＰ１１３で始まる（例えば、ＵＳ２００６／００２４２９８参照のこと）。
ｈＩｇＧ１ Ｆｃに加えて、その他のＦｃ領域もまた、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗原結合キメラポリペプチド中に含まれ得る。例えば、Ｆｃ融合物は、それだけには限らないが、ＩｇＧ（ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭクラスの抗体をはじめとするいずれかの抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる免疫グロブリン配列を含有し得る。
いくつかの例では、Ｆｃドメインは、例えば、免疫応答の媒介におけるＦｃドメインのエフェクター機能などのドメインの機能特性に基づいて選択され得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用によって媒介されるエフェクター機能が最小化される場合には、補体またはエフェクター細胞を不十分にしか動員しないＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃとの融合物が使用され得る。
抗ＲＳＶ抗原結合断片とのキメラにおいて使用するために、改変されたＦｃドメインもまた、本明細書において考慮される。例示的改変については、例えば、米国特許第７，２１７，７９７号および米国特許出願公開第２００６／０１９８８４０号、同２００６／００２４２９８号および同２００８／０２８７６５７号および国際特許公開番号ＷＯ２００５／０６３８１６参照のこと。Ｆｃドメインの例示的アミノ酸改変はまた、本明細書において他の部分で提供される。
通常、二価抗体は、２つの同一または異なる抗ＲＳＶ抗原結合断片をＦｃポリペプチドと直接的または間接的に連結することによって作製された２種のキメラタンパク質の二量体である。いくつかの例では、キメラタンパク質をコードする遺伝子融合物は、適当な発現ベクター中に挿入される。得られたキメラタンパク質は、組換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞中で発現され得、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成する場合には、組み立てて、二価抗ＲＳＶ抗体を得ることが可能となる。通常、宿主細胞および発現系は、キメラタンパク質のグリコシル化を可能にする哺乳類発現系である。Ｆｃ部分を含有する得られたキメラポリペプチドおよびそれから形成される多価抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製され得る。Ｆｃドメインを保持する抗ＲＳＶキメラ分子がジスルフィド結合されたホモ二量体として同様に発現されるので、異なる抗ＲＳＶキメラポリペプチドをコードする２種の核酸が細胞中に形質転換される場合には、ヘテロ二量体の形成が生化学的に達成されるはずである。したがって、鎖間ジスルフィドの破壊に有利に働くが、鎖内ジスルフィドは達成しない条件下では、ホモ二量体は低減され得る。通常、異なる細胞外部分を有するキメラモノマーを等モル量で混合し、酸化してホモおよびヘテロ二量体の混合物を形成する。この混合物の成分は、クロマトグラフィー技術によって分離される。
あるいは、ヘテロ二量体の形成は、抗ＲＳＶ抗原結合断片と、それに続くｈＩｇＧのＦｃドメインと、それに続くｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓロイシンジッパーのいずれかを含有する抗ＲＳＶ抗原結合融合分子を遺伝子操作することおよび発現させることによって偏らせることができる。ロイシンジッパーはヘテロ二量体を主に形成するので、必要な場合には、それらを使用してヘテロ二量体の形成を駆動することができる。Ｆｃ領域を含有する抗ＲＳＶキメラポリペプチドはまた、金属キレートまたはその他のエピトープを含むタグを含むよう操作できる。金属キレートクロマトグラフィーによる、および／または抗体による迅速な精製のためにタグのついたドメインを使用して、ウエスタンブロットの検出、免疫沈降またはバイオアッセイにおける活性枯渇／ブロッキングが可能となる。
Ｄ．抗ＲＳＶ抗体のさらなる改変
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、さらに改変してもよい。抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片の改変によって、それだけには限らないが、タンパク質分解に対する感受性を低減することおよび／または酸化に対する感受性を低減することおよび抗体またはその抗原結合断片の結合特性を変更または改善することなど、抗体または抗原結合断片の免疫原性の低減、抗体または抗原結合断片の半減期の改善をはじめとする抗体の１つまたは複数の特性が改善され得る。例示的改変として、それだけには限らないが、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の一次アミノ酸配列の改変および抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の翻訳後修飾の変更が挙げられる。例示的翻訳後修飾として、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、保護基／ブロッキング基（blocking group）を用いる誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質との連結が挙げられる。その他の例示的改変として、抗体またはその抗原結合断片の１つまたは複数の特性を変更または改善するための、１種もしくは複数の異種ペプチドの、抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片との結合が挙げられる。
一般に、改変は、抗体またはその抗原結合断片の免疫原性の増大をもたらさないか、または抗体またはその抗原結合断片のＲＳＶとの結合に大きく悪影響を与えない。改変された抗体またはその抗原結合断片の、ＲＳＶ Ｆタンパク質との結合を評価する方法は、本明細書において提供され、当技術分野で公知である。例えば、改変された抗体またはその抗原結合断片は、ＲＳＶ Ｆタンパク質との結合について、それだけには限らないが、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの方法によってか、またはインビトロマイクロ中和アッセイによってアッセイされ得る。
提供された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の半減期を改善する方法が、本明細書において提供される。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の半減期を増大することによって、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の治療的有効性を増大し、予防および／または治療のための、例えば、ＲＳＶ感染を防止もしくは治療する、ＲＳＶ感染の１種または複数の症状を予防、治療および／もしくは軽減する、またはＲＳＶ感染期間を低減するための、抗体またはその抗原結合断片のあまり頻繁でない投与が可能となる。
本明細書において製造される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の改変は、親抗体からの天然突然変異またはヒトの操作のいずれかからの１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。抗体などのポリペプチドを改変する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書において提供される任意の抗体またはその抗原結合断片の改変のために使用できる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の薬物動態特性は、当業者に公知の技術によるＦｃ改変によって、増強できる。当業者に公知の標準技術を使用して、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片をコードするヌクレオチド分子中に突然変異を導入して、１つまたは複数のアミノ酸置換を有するポリペプチドを製造できる。突然変異を導入するための例示的技術として、それだけには限らないが、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発が挙げられる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片は、精製を容易にするために、異種ペプチドの結合によって改変できる。一般に、このようなペプチドは、抗体またはその抗原結合断片のＣまたはＮ末端でペプチドと融合している抗体を含有する融合タンパク質として発現される。精製のためによく使用される例示的ペプチドとして、それだけには限らないが、ヘキサヒスチジンペプチド、血球凝集素（ＨＡ）ペプチドおよびｆｌａｇタグペプチドが挙げられる［例えば、Wilson et al. (1984) Cell 37:767；Witzgall et al. (1994) Anal Biochem 223:2、291-8参照のこと］。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカーペプチドを介して生じる場合もある。いくつかの例では、リンカーペプチドは、プロテアーゼ切断部位を特異的に認識するプロテアーゼでの切断による、精製後の精製ペプチドの除去を可能にするプロテアーゼ切断部位を含有する。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片はまた、インビトロまたはインビボいずれかでの、抗体または抗原結合断片をターゲッティングする異種ポリペプチドの、特定の細胞種（例えば、呼吸上皮細胞）との結合によって改変できる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体または特異的細胞受容体と相互作用するその他のポリペプチドと融合またはコンジュゲートすることによって、抗体またはその抗原結合断片を特定の細胞種にターゲッティングできる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、抗体またはその抗原結合断片を、タンパク質トランスダクションドメイン（例えば、ＴＡＴペプチド）などの細胞表面糖タンパク質と結合するペプチドと融合またはコンジュゲートすることによって、標的細胞表面にターゲッティングできる、および／または標的細胞によって取り込まれる。例示的タンパク質トランスダクション(transduction)ドメインとして、それだけには限らないが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）ＴＡＴなどのタンパク質に由来するＰＴＤ［Ruben et al. (1989) J. Virol. 63:1-8；例えば、配列番号１５７１〜１５８２、例えば、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＴＡＴ４８〜５７）配列番号１５７５）など］、ヘルペスウイルステグメントタンパク質ＶＰ２２［Elliott and O’Hare (1997) Cell 88:223-233；例えば、配列番号１５８７］、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のホメオティックタンパク質アンテナペディア（Ａｎｔｐ）タンパク質（Penetratin PTD; Derossi et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:18188-18193；例えば、配列番号１５５６〜１５５９）、プロテグリン１（ＰＧ−１）抗菌ペプチドＳｙｎＢ［例えば、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３およびＳｙｎＢ４；Kokryakov et al. (1993) FEBS Lett. 327:231-236；例えば、それぞれ、配列番号１５６８〜１５７０］および塩基性線維芽細胞増殖因子［Jans (1994) FASEB J. 8:841-847；例えば、配列番号１５５２］が挙げられる。ＰＴＤはまた、それだけには限らないが、ポリアルギニンペプチド［Futaki et al. (2003) J. Mol. Recognit. 16:260-264；Suzuki et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840；例えば、配列番号１５６０〜１５６１］、トランスポータン［Pooga et al. (1988) FASEB J. 12:67-77；Pooga et al. (2001) FASEB J. 15:1451-1453；例えば、配列番号１５８３〜１５８６］、ＭＡＰ［Oehlke et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414:127-139；例えば、配列番号１５５０］、ＫＡＬＡ［Wyman et al. (1997) Biochemistry 36:3008-3017；例えば、配列番号１５４８］およびその他のカチオン性ペプチド、例えば、種々のβ−カチオン性ペプチド［Akkarawongsa et al. (2008) Antimicrob. Agents and Chemother. 52(6):2120-2129］などといった合成ＰＴＤも含む。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片は、抗体またはその抗原結合断片に診断用および／または治療用部分を結合することによって改変できる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片は、共有結合が、抗体またはその抗原結合断片がその対応するエピトープと結合するのを妨げないように、抗体またはその抗原結合断片に、任意の種類の分子、例えば、診断用または治療用分子を共有結合することによって改変できる。例えば、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、共有結合が、抗体またはその抗原結合断片がＲＳＶと結合するのを妨げないように、分子を共有結合することによってさらに改変できる。いくつかの例では、抗体またはその抗原結合断片は、Ｎ末端またはＣ末端で異種ポリペプチドと組換えによって融合できるか、または異種ポリペプチドもしくはその他の組成物と、共有結合および非共有コンジュゲーションを含めて、化学的にコンジュゲートできる。例えば、異種ポリペプチドまたは組成物は、診断用ポリペプチドもしくはその他の診断用部分または治療用ポリペプチドもしくはその他治療用部分であり得る。例示的診断用および治療用部分として、それだけには限らないが、薬物、放射性ヌクレオチド、毒素、蛍光分子が挙げられる（例えば、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号およびＥＰ３９６，３８７を参照のこと）。診断用ポリペプチドまたは診断用部分は、例えば、インビボまたはインビトロ検出のための標識として使用できる。治療用ポリペプチドまたは治療用部分は、例えば、ＲＳＶ感染などのウイルス感染の治療のために、またはウイルス感染の１種もしくは複数の(one or more)症状の治療のために使用できる。
遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリングおよび／またはコドンシャッフリング（まとめて「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術によって、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片のさらなる融合タンパク質を作製できる。ＤＮＡシャッフリングを使用して、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の活性を変更、例えば、高い親和性および低い解離速度を有する抗体またはその抗原結合断片を製造できる［概して、米国特許第５，６０５，７９３号；同５，８１１，２３８号；同５，８３０，７２１号；同５，８３４，２５２号および同５，８３７，４５８号およびPatten et al. (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76；およびLorenzo and Blasco (1998) Biotechniques 24(2):308-13参照のこと］。
提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製にとって有用である固相支持体と結合させてもよい。例示的固相支持体として、それだけには限らないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
１．免疫原性を低下するための改変
いくつかの例では、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片は、ヒト対象などの対象において免疫原性を低下させるようにさらに改変できる。例えば、抗体またはその抗原結合断片中の１個または複数のアミノ酸は、対象の免疫系に対して曝された場合に、抗体またはその抗原結合断片の免疫原性を排除または低下させるために、ヒトＴ細胞の潜在的なエピトープを変更するように改変できる。例示的改変として、抗体またはその抗原結合断片の免疫原性を排除または低下させる、１個または複数のアミノ酸の置換、欠失および挿入が挙げられる。一般に、このような改変は、抗体またはその抗原結合断片の、そのそれぞれの抗原に対する結合特異性を変更しない。抗体またはその抗原結合断片の免疫原性を低下させることは、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片の治療効力を改善することおよび／またはインビボでの抗体もしくはその抗原結合断片の半減期を増大することなど、抗体またはその抗原結合断片の１つまたは複数の特性を改善し得る。
２．Ｆｃ改変
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、野生型または改変されたＦｃ領域を含有し得る。本明細書において他の部分で記載されるように、Ｆｃ領域を、例えば、５８ｃ５もしくはｓｃ５などの本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗原結合断片または５８ｃ５もしくはｃ５に由来する抗原結合断片に連結してもよい。いくつかの例では、Ｆｃ領域を改変して、Ｆｃポリペプチドの１つまたは複数の特性を変更できる。例えば、Ｆｃ領域を改変して、エフェクター機能を、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能と比較して変更（すなわち、多くまたは少なく）できる。抗体のＦｃ領域は、いくつかのＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる数々の重要な機能を付与する。Ｆｃエフェクター機能として、例えば、Ｆｃ受容体結合、補体結合およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号参照のこと）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能および抗体安定性をアッセイする方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃ領域は、ＦｃγＲと相互作用する。これらの受容体は、例えば、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびγδＴ細胞をはじめとする種々の免疫細胞において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を、結合している抗原の部位に動員し、通常、細胞内のシグナル伝達事象ならびに炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用および細胞傷害性攻撃などの重要なその後の免疫応答をもたらす。細胞傷害性および食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的とされる細胞を破壊する潜在的機序である。ＦｃγＲを発現する細胞傷害性細胞による、標的細胞上に結合している抗体の認識および溶解は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。種々の抗体アイソタイプのその他のＦｃ受容体として、Ｆｃ(Ｒ（ＩｇＥ）、Ｆｃ(Ｒ（ＩｇＡ）およびＦｃμＲ（ＩｇＭ）が挙げられる。
したがって、改変されたＦｃドメインは、それだけには限らないが、Ｆｃ受容体の増大した親和性または低い親和性または親和性がないことを含めた変更された親和性を有し得る。例えば、異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、通常、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に良好に受容体と結合する。さらに、異なるＦｃγＲは、異なるエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ／ｃおよびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とする免疫複合体によって誘発される活性化の正の制御因子である。しかし、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、したがって、阻害性である。したがって、受容体のＦｃ領域の親和性を変更することによって、Ｆｃドメインによって誘発されるエフェクター機能を調節できる。
一例では、例えば、抗体依存性細胞傷害、ＡＤＣＣなどのエフェクター機能を良好に媒介するよう、特定のＦｃγＲとの最適化された結合のために改変されているＦｃ領域が使用される。このような改変されたＦｃ領域は、それだけには限らないが、アミノ酸位置２４９、２５２、２５９、２６２、２６８、２７１、２７３、２７７、２８０、２８１、２８５、２８７、２９６、３００、３１７、３２３、３４３、３４５、３４６、３４９、３５１、３５２、３５３および４２４をはじめとする１個または複数のアミノ酸残基での改変を含有し得る［Ｋａｂａｔの番号付けスキームに従って、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Department of Health and Human Services］。例えば、Ｆｃ領域中の改変は、配列番号１６０１に示される例示的ＩｇＧ１配列のＧ１１９Ｓ、Ｇ１１９Ａ、Ｓ１２２Ｄ、Ｓ１２２Ｅ、Ｓ１２２Ｎ、Ｓ１２２Ｑ、Ｓ１２２Ｔ、Ｋ１２９Ｈ、Ｋ１２９Ｙ、Ｄ１３２Ｙ、Ｒ１３８Ｙ、Ｅ１４１Ｙ、Ｔ１４３Ｈ、Ｖ１４７Ｉ、Ｓ１５０Ｅ、Ｈ１５１Ｄ、Ｅ１５５Ｙ、Ｅ１５５Ｉ、Ｅ１５５Ｈ、Ｋ１５７Ｅ、Ｇ１６４Ｄ、Ｅ１６６Ｌ、Ｅ１６６Ｈ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｄ、Ｓ１８７Ｔ、Ｓ２０７Ｇ、Ｓ３０７Ｉ、Ｋ２０９Ｔ、Ｋ２０９Ｅ、Ｋ２０９Ｄ、Ａ２１０Ｄ、Ａ２１３Ｙ、Ａ２１３Ｌ、Ａ２１３Ｉ、Ｉ２１５Ｄ、Ｉ２１５Ｅ、Ｉ２１５Ｎ、Ｉ２１５Ｑ、Ｅ２１６Ｙ、Ｅ２１６Ａ、Ｋ２１７Ｔ、Ｋ２１７Ｆ、Ｋ２１７ＡおよびＰ２７９Ｌのうちいずれか１種または複数またはそれらの組合せに対応して行うことができる。これらの突然変異を含有する改変されたＦｃは、例えば、活性化受容体ＦｃγＩＩＩａなどのＦｃＲとの増強された結合を有し得る、および／または阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂとの減少した結合を有し得る（例えば、ＵＳ２００６／００２４２９８参照のこと）。ＦｃＲとの増大した結合を有するよう改変されたＦｃ領域は、患者におけるウイルス（例えば、ＲＳＶ）感染細胞の破壊の促進においてより有効であり得る。
いくつかの例では、抗体またはその抗原結合断片のインビボ半減期および薬物動態を増大するために、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片を、抗体またはその抗原結合断片の、ＦｃＲｎ受容体との相互作用を改善するようさらに改変できる（例えば、米国特許第７，２１７，７９７号、米国特許出願公開第２００６／０１９８８４０および同２００８／０２８７６５７号参照のこと）。ＦｃＲｎは、新生児ＦｃＲであり、その結合によって、エンドサイトーシスされた抗体またはその抗原結合断片がエンドソームから血流へ戻って再利用される。このプロセスは、全長分子の大きな大きさによる腎臓濾過の妨害と相まって、１〜３週間の範囲の好都合な抗体血清半減期をもたらす。Ｆｃの、ＦｃＲｎとの結合は、抗体輸送において役割を果たす。Ｆｃ領域の例示的改変として、それだけには限らないが、米国特許第７，２１７，７９７号；米国特許出願公開第２００６／０１９８８４０号、同２００６／００２４２９８号および同２００８／０２８７６５７号ならびに国際特許公開番号ＷＯ２００５／０６３８１６に記載されるＦｃの突然変異、Ｆｃ重鎖定常領域の、ＣＨ２ドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸残基［Ｋａｂａｔ番号付け、Kabat et al. (1991)］２５１〜２５６、２８５〜９０、３０８〜３１４および／またはＣＨ３ドメイン中のアミノ酸残基３８５〜３８９および４２８〜４３６での突然変異などが挙げられ、これでは、改変は、改変されていない抗体またはその抗原結合断片に対して、Ｆｃ受容体結合親和性および／または血清半減期を変更する。いくつかの例では、ＩｇＧ定常ドメインは、ＩｇＧ重鎖定常領域の、ＣＨ２ドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸位置２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２６３、３０８、３０９、３１１、３１２および３１４および／またはＣＨ３ドメイン中のアミノ酸位置３８５、３８６、３８７、３８９、４２８、４３３、４３４、４３６および４５９でＦｃ領域において改変される。このような改変は、配列番号１６０１に示される例示的ＩｇＧ１配列中の、ＣＨ２ドメイン中のアミノ酸Ｇｌｙ１２０、Ｐｒｏ１２１、Ｓｅｒ１２２、Ｐｈｅ１２４、Ｌｅｕ１２５、Ｐｈｅ１２６、Ｔｈｒ１３３、Ｐｒｏ１７４、Ａｒｇ１７５、Ｇｌｕ１７７、Ｇｌｎ１７８およびＡｓｎ１８０ならびにＣＨ３ドメイン中のアミノ酸Ｇｌｎ２４５、Ｖａｌ２４６、Ｓｅｒ２４７、Ｔｈｒ２４９、Ｓｅｒ２８３、Ｇｌｙ２８５、Ｓｅｒ２８６、Ｐｈｅ２８８およびＭｅｔ３１１に相当する。いくつかの例では、改変は、１個または複数の表面に曝露された残基においてであり、改変は、置換される残基と同様の荷電、極性または疎水性の残基を用いる置換である。
特定の例では、Ｆｃ重鎖定常領域は、１つまたは複数のアミノ酸位置２５１、２５２、２５４、２５５および２５６（Ｋａｂａｔ番号付け）で改変され、これでは、位置２５１は、ＬｅｕまたはＡｒｇで置換され、位置２５２は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＴｈｒで置換され、位置２５４は、ＴｈｒまたはＳｅｒで置換され、位置２５５は、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＡｒｇで置換され、および／または位置２５６は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＴｈｒで置換される。いくつかの例では、Ｆｃ重鎖定常領域は、１つまたは複数のアミノ酸位置３０８、３０９、３１１、３１２および３１４で改変され、これでは、位置３０８は、ＴｈｒまたはＩｌｅで置換され、位置３０９は、Ｐｒｏで置換され、位置３１１は、セリンまたはＧｌｕで置換され、位置３１２は、Ａｓｐで置換され、および／または位置３１４は、Ｌｅｕで置換される。いくつかの例では、Ｆｃ重鎖定常領域は、１つまたは複数のアミノ酸位置４２８、４３３、４３４および４３６において改変され、これでは、位置４２８は、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＳｅｒで置換され、位置４３３は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＨｉｓで置換され、位置４３４は、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＨｉｓで置換され、および／または位置４３６は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ＭｅｔまたはＴｈｒで置換される。いくつかの例では、Ｆｃ重鎖定常領域は、１つまたは複数のアミノ酸位置２６３および４５９において改変され、ここで、位置２６３は、ＧｌｎまたはＧｌｕで置換され、および／または位置４５９は、ＬｅｕまたはＰｈｅで置換される。
いくつかの例では、Ｆｃ重鎖定常領域は、補体タンパク質Ｃ１ｑとの結合を増強するように改変できる。ＦｃＲと相互作用することに加えて、Ｆｃはまた、補体タンパク質Ｃ１ｑと相互作用し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。Ｃ１ｑは、セリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓとの複合体を形成して、Ｃ１複合体を形成する。Ｃ１ｑは、６種の抗体と結合できるが、２種のＩｇＧとの結合が、補体カスケードを活性化するのに十分である。ＦｃＲとのＦｃ相互作用と同様に、異なるＩｇＧサブクラスは、Ｃ１ｑに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、通常、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に良好に結合する。したがって、Ｃ１ｑとの増大された結合を有する改変されたＦｃは、増強されたＣＤＣを媒介し得、ウイルス（例えば、ＲＳＶ）感染細胞の破壊を増強し得る。Ｃ１ｑとの結合を増大するＦｃ領域における例示的改変として、それだけには限らないが、位置３４５および３５３（Ｋａｂａｔ番号づけ）でのアミノ酸の改変が挙げられる。例示的改変として、配列番号１６０１に示される例示的ＩｇＧ１配列中のＫ２０９Ｗ、Ｋ２０９ＹおよびＥ２１６Ｓに相当するものが挙げられる。
別の例では、ＦｃγＲとの結合を低減または切断するための置換を含む種々のＦｃ突然変異体も知られている。このような突然変異体は、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能の低減または排除が必要である場合には有用である。これは、拮抗作用が望ましいが、標的抗原を保有する細胞の死滅は望ましくない場合にはよくある。このようなＦｃの例示として、アミノ酸位置２４８、２４９および２５１（Ｋａｂａｔ番号づけ）で改変されている、米国特許第５，４５７，０３５号に記載されるＦｃムテインがある。配列番号１６０１に示される例示的ＩｇＧ１配列では、アミノ酸１１７は、ＬｅｕからＡｌａに改変され、アミノ酸１１８は、ＬｅｕからＧｌｕに改変され、アミノ酸１２０は、ＧｌｙからＡｌａに改変される。同様の突然変異は、例えば、例示的Ｆｃ配列などの任意のＦｃ配列において行われ得る。このムテインは、Ｆｃ受容体に対する親和性の低減を示す。
本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片は、改変されたＦｃ領域を含有するよう操作され得る。例えば、ポリペプチドを、抗体の定常領域と融合またはコンジュゲートする（すなわち、Ｆｃ融合タンパク質を製造する）方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同５，６２２，９２９号、同５，３５９，０４６号、同５，３４９，０５３号、同５，４４７，８５１号、同５，７２３，１２５号、同５，７８３，１８１号、同５，９０８，６２６号、同５，８４４，０９５号および同５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＥＰ３９４，８２７；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６５７０、ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９６／２２０２４、ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９９／０４８１３；Ashkenazi et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539；Traunecker et al. (1988) Nature 331:84-86；Zheng et al. (1995) J. Immunol. 154:5590-5600；およびVil et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 (1992)に記載されており、本明細書において他の部分で記載されている。いくつかの例では、ＦｃＲｎ結合親和性を増大する、および／または半減期を改善する、１つまたは複数の改変を有する改変されたＦｃ領域を、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と融合できる。
３．ペグ化
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子とコンジュゲートして、半減期を増大および／またはその薬物動態プロフィールを改善できる。コンジュゲーションは、当業者に公知の技術によって行うことができる。治療用抗体の、ＰＥＧとのコンジュゲーションは、機能に干渉しないで、薬動力学を増強することがわかっている（例えば、Deckert et al.、Int. J. Cancer 87: 382-390, 2000；Knight et al., Platelets 15: 409-418,2004；Leong et al., Cytokine 16: 106-119, 2001；およびYang et al., Protein Eng. 16: 761-770、2003参照のこと）。ＰＥＧを抗体または抗原結合断片と、抗体または抗原結合断片のＮ−またはＣ−末端へのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションによってか、またはリシン残基上に存在するεアミノ基を介して、多機能性リンカーを用いてか、または用いずに、結合できる。生物活性の最小の喪失しかもたらさない直鎖または分岐ポリマー誘導体化を使用できる。コンジュゲーションの程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によってモニタリングし、ＰＥＧ分子の、抗体との適切なコンジュゲーションを確実にすることができる。未反応のＰＥＧを、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧコンジュゲーションから分離できる。ＰＥＧ誘導体化された抗体またはその抗原結合断片は、当業者に公知の方法を使用して、例えば、本明細書に記載されるイムノアッセイによって、ＲＳＶ抗原との結合活性について、ならびにインビボ有効性について試験できる。
４．検出可能な部分のコンジュゲーション
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体および抗体断片を、検出可能な部分とのコンジュゲーションによってさらに改変できる。検出可能な部分は、直接的にまたは間接的に検出され得る。選択された検出可能な部分に応じて、検出可能な部分をインビボおよび／またはインビトロで検出できる。検出可能な部分は、例えば、ＲＳＶに対する曝露もしくはＲＳＶの局在性を検出するための診断法または抗ＲＳＶ抗体もしくはその抗原結合断片のＲＳＶに対する結合親和性を調べるための結合アッセイにおいて使用できる。検出可能な部分はまた、例えば、抗体またはその抗原結合断片の精製などの抗ＲＳＶ抗体を調製する方法において使用できる。通常、検出可能な部分は、検出可能な部分のコンジュゲーションが、抗体またはその抗原結合断片の標的エピトープとの結合に干渉しないように選択される。一般に、検出可能な部分の選択は、必要な感度、化合物とのコンジュゲーションの容易さ、安定性必要条件、利用可能な計測手段および処分規定に応じて変わる。当業者ならば、標識に精通しており、使用されるアッセイに適した、適合する検出可能な標識を同定できる。検出可能な部分を用いて抗体を標識する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、組換えおよび化学法が挙げられる。
検出可能な部分は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分に開発されており、一般に、このような方法において有用なほとんどのいずれの標識も、適用される方法において適用できる。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。有用な標識として、それだけには限らないが、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、特にガンマおよび陽電子放出放射性同位体（例えば、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅ）、金属イオン（例えば、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒおよび２０１Ｔｌ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいてよく使用されるその他のもの）、電子移動剤（例えば、金属結合性タンパク質および化合物を含む）、発光および化学発光標識（例えば、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノール）、磁性ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））およびコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色分析標識が挙げられる。使用できる種々の標識またはシグナル生成システムの概説については、例えば、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
５．治療用成分のコンジュゲーション
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体および抗原結合断片を、治療用部分とのコンジュゲーションによってさらに改変できる。例示的治療用部分として、それだけには限らないが、細胞毒素（例えば、細胞分裂阻害剤または細胞破壊剤）、治療薬または放射性金属イオン（例えば、α−エミッター）が挙げられる。例示的細胞毒素または細胞傷害性薬剤として、それだけには限らないが、細胞にとって有害である任意の薬剤、例えば、それだけには限らないが、パクリタキソール（paclitaxol）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。例示的治療薬として、それだけには限らないが、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）および抗ウイルス剤、例えば、それだけには限らないが、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル（gangcyclovir）、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジンおよびリバビリンなどのヌクレオシド類似体；ホスカメット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビルおよびα−インターフェロンが挙げられる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体および抗原結合断片を、治療用ポリペプチドである治療用部分とのコンジュゲーションによってさらに改変できる。例示的治療用ポリペプチドとして、それだけには限らないが、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒素などの毒素またはサイトカイン、例えば、それだけには限らないが、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、β、γ、ω）、リンホカイン、造血増殖因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などといった免疫刺激薬が挙げられる。
６．結合特異性を改善するための改変
提供される抗ＲＳＶ抗体および抗体断片の結合特異性を、ファージディスプレイなどの技術によって変更または改善できる。ファージディスプレイのための方法は、一般に、ライブラリーの抗体種をクローニングおよび発現するために、繊維状ファージ（ファージミド）表面発現ベクター系の使用を含む。コンビナトリアルライブラリーを製造するための種々のファージミドクローニング系が他者によって記載されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Kang et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., USA、88:4363-4366；Barbas et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., USA、88:7978-7982；Zebedee et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3175-3179; Kang et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:11120-11123；Barbas et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4457-4461；およびGram et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580によって記載されるようなファージミドでのコンビナトリアル抗体ライブラリーの調製を参照のこと。
特定の例では、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅する。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣＲによって、ｓｃＦｖリンカーと一緒に組換え、ファージミドベクター（例えば、ｐ ＣＡＮＴＡＢ ６またはｐＣｏｍｂ ３ ＨＳＳ）中にクローニングする。ベクターを、大腸菌にエレクトロポレーションし、大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法において使用されるファージは、通常、ｆｄおよびＭ１３をはじめとする繊維状ファージであり、普通、ＶＨおよびＶＬドメインを、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかと組換えによって融合する。ＲＳＶ抗原、例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原を用いて、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズと結合しているか、もしくは捕獲されている抗原を使用して、選択または同定できる。ファージディスプレイによって抗体を製造するために使用できるファージディスプレイ法の例として、例えば、その各々が、その全文が参照によって本明細書に組み込まれる、Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic et al. (1997) Gene 187:9-18；Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１およびＷＯ９７／１３８４４；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同５，２２３，４０９号、同５，４０３，４８４号、同５，５８０，７１７号、同５，４２７，９０８号、同５，７５０，７５３号、同５，８２１，０４７号、同５，５７１，６９８号、同５，４２７，９０８号、同５，５１６，６３７号、同５，７８０，２２５号、同５，６５８，７２７号、同５，７３３，７４３号および同５，９６９，１０８号に開示されるものが挙げられる。
上記の参考文献に記載のとおり、ファージ選択後、ファージから抗体コーディング領域を単離し、ヒト抗体をはじめとする全抗体または任意のその他の所望の抗原結合断片を作製するために使用でき、例えば、本明細書において記載されるような哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌をはじめとする任意の所望の宿主において発現させることができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えによって製造する技術も、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２４；Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6):864-869；Sawai et al. (1995) AJRI 34:26-34；およびBetter et al. (1988) Science 240: 1041-1043に開示されるものなどの当技術分野で公知の方法を使用して使用できる。
得られたファージミドライブラリーを、抗体または抗原結合断片の免疫特異性を増大および／または変更するよう操作し、標的抗原との増大した結合などの特性の改善されたさらなる抗体を製造し、続いて、同定できる。例えば、重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡを、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）において突然変異誘発し、続いて、所望の免疫反応および中和能についてスクリーニングしてもよい。次いで、得られた抗体を、中和能を決定するために本明細書において記載される１つまたは複数のアッセイにおいてスクリーニングできる。
ヒトおよびインビボ検出アッセイにおける、抗体のインビボ使用をはじめとするいくつかの使用については、ヒトまたはキメラ抗体を使用する。完全ヒト抗体は、ヒト対象の治療的処理にとって特に望ましい。ヒト抗体は、上記のファージディスプレイ法をはじめとする、ヒト免疫グロブリン配列またはヒト免疫グロブリン配列と相同である合成配列に由来する抗体ライブラリーを使用する当技術分野で公知の種々の方法によって製造できる。その各々がその全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４４４，８８７号および同４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１参照のこと。
Ｅ．抗ＲＳＶ抗体を単離する方法
抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、それだけには限らないが、マウスハイブリドーマ［例えば、Olsson and Kaplan (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:5429-5431参照のこと；このような抗体は、ヒトにおける使用について本明細書において他の部分で記載されるようにヒト化できる］、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウス［例えば、Kellerman and Green (2000) Curr. Opin Biotechnol. 13:593-597参照のこと］、ファージディスプレイ［例えば、Mancini (2004) New Microbiol. 27:315-28参照のこと］およびＢ細胞などの成熟ヒト免疫細胞からの単離物［例えば、Banchereau and Rousset (1992) Adv Immunol. 52: 125-262、Crotty and Ahmed (2004) Semin Immunol. 16: 197-203、Carsetti (2004) Methods Mol Biol. 271: 25-35.、McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams (2005) Annu Rev Immunol. 23:487-513参照のこと］をはじめとする当技術分野で周知の種々の技術によって同定および単離できる。本明細書において提供される例示的方法では、本明細書において提供されるヒト抗ＲＳＶ抗体およびその抗原結合断片は、ヒトＢ細胞から同定および単離される。
ヒト抗体分泌細胞から安定なハイブリドーマを得ることにおける難しさを考えると、ヒト抗体分泌細胞を製造および単離するために広く使用されてきた例示的方法として、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を用いるヒトＢ細胞の不死化があり、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、ポリクローナルＢ細胞活性化および増殖も誘導することがわかっている［例えば、Sugimoto et al.、(2004) Cancer Res. 64:3361-3364；Bishop and Busch (2002) Microbes Infect. 4:853-857参照のこと］。抗体分泌細胞は、例えば、患者または抗原に曝露された可能性のあるその他の個体または標識された抗原を使用して事前に選択された健常な被験体から得た、末梢血、リンパ節、脾臓、扁桃腺または胸腔液などのヒトＢ細胞のＥＢＶ不死化によって製造されている［例えば、Casali et al. (1986) Science 234:476-9、Yamaguchi et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:2416-2420、Posner et al. (1991) J Immunol. 146:4325-4332、Raff et al. (1988) J Exp Med. 168:905-917、Steenbakkers et al. (1993) Hum Antibod Hybrid. 4:166-173、Steenbakkers et al. (1994) Mol Biol Rep. 19:125-134、Evans et al. (1988) J Immunol 140:941-943およびWallis R et al. (1989) J Clin Invest 84:214-219参照のこと］。
ＥＢＶ感染ヒトＢ細胞の低い形質転換性、低いクローン化性および固有の不安定性および不均一性のために［Chan M et al. (1986) J Immunol 136:106-112およびJames and Bell (1987) J Immunol Methods. 100:5-40］、例えば、骨髄腫細胞株を用いるといった細胞融合などの既知技術を使用してもよい［例えば、Bron et al. (1984) PNAS 81:3214-3217；Yamaguchi et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:2416-2420；Posner et al. (1991) J Immunol. 146:4325-4332、Niedbala and Stott (1998) Hybridoma 17:299-304；Li et al. (2006) Proc Natl Aacd Sci USA 103:3557-62参照のこと］。ＥＢＶ不死化を改善するためのさらなる技術として、例えば、腫瘍ウイルスを用いる不死化、癌遺伝子を用いる形質転換、ミニ電気融合および単一プロセスでのマウス−ヒトヘテロ融合が挙げられる［例えば、米国特許第４，９９７，７６４号；Steenbakkers et al. (1993) Hum Antibod Hybrid. 4:166-173；Dessain et al. (2004) J Immunol Methods. 291:109-22参照のこと］。ヒトモノクローナル抗体は、当技術分野で記載されるように、細胞培養物において種々の操作を組み合わせることによって、抗原の存在下または不在下で活性化および不死化されているＢ細胞から単離できる［例えば、Borrebaeck C et al. (1988) Proc Natl Aacd Sci USA 85: 3995-3999、Davenport et al. (1992) FEMS Microbiol Immunol. 4:335-343、Laroche-Traineau et al. (1994) Hum Antib Hybrid. 5:165-177、Morgenthaler et al. (1996) J. Clin Endocrinology. 81:3155-3161、Niedbala and Kurpisz (1993) Immunol Lett. 35:93-100、Mulder et al. (1993) Hum Immunol. 36:186-192、Hur et al. (2005) Cell Prolif. 38:35-45、Traggiai et al. (2004) Nat Med 10:871-875、Tsuchiyama et al. (1997) Hum Antibodies 8:43-47；およびPＣＴ公開番号ＷＯ９１１０９１１５、ＷＯ０４１０７６６７７、ＷＯ８８１０１６４２、ＷＯ９０１０２７９５、ＷＯ９６１４０２５２およびＷＯ０２１４６２３３参照のこと］。
成熟Ｂ細胞からヒト抗体を単離する方法は、一般に、成熟Ｂ細胞集団の単離および特定の抗原に対してＢ細胞によって発現された抗体をスクリーニングすることを含む。抗体分泌細胞の種々の異なる集団を、特定のプロフィールを有するヒトドナー（例えば、ナイーブ、ワクチン接種された、程度の差はあるが最近感染した、および血清陽性の個体）から、およびＢ細胞が存在し、その活性を発揮する種々の組織（例えば、血液、扁桃腺、脾臓、リンパ節）から単離してもよい［Viau and Zouali (2005) Clin Immunol. 114:17-26］。本明細書において提供される例示的方法では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体は、ヒトドナーから、および／または医療従事者などのＲＳＶに曝露されている高い可能性を有していたか、もしくは有する健常なヒトから単離された、Ｂ細胞を含有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルから単離できる。
生体サンプルからＰＢＭＣを単離した後、当技術分野で記載されている種々の方法のうち１種を使用して、その表面上の細胞表面マーカーの、必要に応じて、その他のタンパク質の発現ならびに増殖活性、細胞の代謝状態および／または形態学的状態に基づいて、抗体分泌細胞の特定の選択を実施できる。特に、ヒトサンプルから抗体分泌細胞を精製するための種々の技術は、正または負の選択のために異なる手段および状態を使用する。これらの細胞は、抗体を発現および分泌する細胞（例えば、ヒトＢ細胞）に特異的な細胞表面マーカーを発現するものを物理的に分離することによって、より容易に、より効率的に選択される。特定のプロトコールが知られており、文献中に見出すことができる［例えば、Callard and Kotowicz 「Human B-cell responses to Cytokines」 in Cytokine Cell Biology:A practical Approach. Balkwill F. (ed.) Oxford University Press,2000, 17-31参照のこと］。
Ｂ細胞などの特定の免疫細胞の選択は、通常、Ｂ細胞特異的細胞表面タンパク質と特異的に結合し、固相支持体（例えば、マイクロビーズまたはプラスチックプレート）に連結され得るか、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して検出され得る蛍光色素で標識され得る抗体を使用して実施される。例えば、ヒトＢ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２２マイクロビーズを結合している支持体（マイクロビーズなど）に対するその親和性に基づいて、または特定のアイソタイプに対して特異的な抗体に対して結合親和性がないことについて選択され、その後ＥＢＶ不死化する［例えば、Li et al. (1995) Biochem Biophys Res Commun 207:985-993、Bernasconi et al. (2003) Blood 101:4500-4504およびTraggiai et al. (2004) Nat Med 10:871-875参照のこと］。精製のための細胞マーカーの選択は、例えば、選択プロセスによって誘発され、細胞成長および生存力を変更し得る細胞内シグナルのために、不死化プロセスの効率に影響を及ぼし得る。例えば、抗原認識およびＢ細胞活性化と関連しているシグナル伝達経路を制御するＢ細胞に限定された膜貫通タンパク質であるＣＤ２２は、最初のＢ細胞選択のための例示的分子である。ＣＤ２２陽性集団は、異なるアイソタイプおよび特異性を有する抗体を発現する細胞を含有するので、刺激相の前または後のいずれかで細胞を選択するために、その他の細胞表面マーカーも使用してよい。
いくつかの例では、ＣＤ２２に基づいた選択に加えてＣＤ２７に基づいた選択を適用することによって、抗体分泌細胞の特異的濃縮物を得ることができる。ＣＤ２７は、体細胞突然変異された可変領域遺伝子を有するヒトＢ細胞のマーカーであることがわかっている［Borst J et al. (2005) Curr Opin Immunol. 17:275-281］。ＣＤ５、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ８６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７０またはＣＤ６９などのさらなるマーカーも、細胞の所望の集団の枯渇または濃縮のいずれかのために使用できる。したがって、ドナーの抗原（例えば、ＲＳＶ抗原）に対する曝露歴および抗体力価などの因子に応じて、総ＣＤ２２濃縮されたＢ細胞、またはＣＤ２７陽性Ｂ細胞などのさらに濃縮されたＢ細胞亜集団を選択できる。
細胞選択後、細胞の不死化前に、細胞の集団を適当な刺激物質に曝露してもよい。例示的刺激物質として、例えば、ポリクローナルＢ細胞アクチベーター、例えば、それだけには限らないが、自然免疫応答のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどのＴｏｌｌ様受容体アゴニスト［Bernasconi et al. (2003) Blood 101:4500-4504、Bernasconi et al. (2002) Science 298:2199-2202、Bourke et al. (2003) Blood 102:956-63；例えば、ＣｐＧヌクレオチド、例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡから入手可能なＣｐＧ２００６、ＣｐＧ２３９５およびＣｐＧ２３９５など］およびサイトカインなどの免疫調節性分子（例えば、免疫賦活活性を有するとわかっているインターロイキン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３［Callard and Kotowicz 「Human B-cell responses to cytokines」 in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F (ed.) Oxford University Press, 2000, 17-31参照のこと］およびＴＮＦ受容体ファミリーの細胞膜受容体のアゴニスト、特に、ＮＦ−κＢ経路およびＢ細胞における増殖を活性化するもの、例えば、それだけには限らないが、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）［例えば、Schneider (2005) Curr Opin Immunol. 17:282-289、He et al. (2004) J Immunol. 172:3268-79、Craxton et al. (2003) Blood 101:4464-4471およびTangye et al. (2003) J Immunol.170:261-269参照のこと］が挙げられる。ＥＢＶ不死化を、１種もしくは複数のポリクローナルアクチベーターと組み合わせて、または逐次使用してＢ細胞を刺激する例示的方法は、当技術分野で公知である［例えば、Traggiai et al. (2004) Nat Med 10:871-875、Tsuchiyama et al. (1997) Hum Antibodies 8:43-47, Imadome et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:7836-7840およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０６８７５８、ＷＯ０４／７６６７７、ＷＯ９１／０９１１５およびＷＯ９４／２４１６４参照のこと］。刺激物質の組合せを、不死化相の前に、同時または逐次（例えば、最初の細胞選択の直後に第１の刺激物質を加え、第２の刺激物質を数時間または数日後に加える）細胞培養培地に加えることができる。刺激物質は、希釈された保存溶液から細胞培養培地中に直接加えてもよく、または例えば、リポソームもしくはその取り込みおよび免疫賦活活性を改善し得るその他の化合物を使用して適宜製剤化された後に加えてもよい［Gursel et al. (2001) J Immunol. 167:3324-3328］。刺激物質はまた、固体マトリックス（マイクロビーズまたは直接、細胞培養プレート上に）と結合させてもよく、これによって、その物質（単数または複数）の有効な除去が可能となり得る。細胞は、新鮮な培地で１回または複数回洗浄してもよく、所望により、刺激物質のあらゆる残存する効果をさらに希釈または排除するために正常な細胞培養培地で維持してもよい（例えば、１日から最大６日）。また、細胞培養物中に特定の化合物を加えることによって、刺激物質（単数または複数）を阻害してもよい。
細胞を、細胞を刺激した後および前記の選択された、刺激された細胞を、不死化物質に曝露する前（すなわち、刺激相と不死化相の間）に、発現された抗体のアイソタイプに基づいてさらに選択してもよい。細胞のアイソタイプベースの選択は、正の（特定の細胞の単離を可能にする）または負の（不要の細胞の排出を可能にする）選択のいずれかのための手段を適用することによって実施できる。例えば、刺激されたＩｇＧ陽性細胞の集団は、正に（ＦＡＣＳまたは磁気細胞分離装置によって）、または細胞の集団からＩｇＭを発現する細胞を枯渇させ、結果としてＩｇＧを発現する細胞を濃縮することによって選択できる。蛍光活性化分離装置または磁気細胞分離装置を使用する抗体分泌細胞の分離技術が、文献において知られている［例えば、Li et al. (1995) Biochem Biophys Res Commun 207:985-93、Traggiai et al. (2004) Nat Med 10:871-875参照のこと］。抗体分泌細胞の供給源および最終用途に応じて、ＩｇＤまたはＩｇＡ発現細胞などの、その他のアイソタイプを発現する細胞の枯渇（または濃縮）も実施できる。このような正確な選択が望まれる場合（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体を発現するヒトＢ細胞の選択）には、特定のサブクラスに基づいて細胞を単離するために、同様のアプローチを使用できる。
種々のウイルス不死化物質が当技術分野で公知であり、抗体分泌細胞で使用して、不死化抗体分泌細胞を得ることができる。抗体分泌細胞に感染し、不死化するウイルスは、リンパ球向性ウイルスとして一般に知られている。このようなウイルスの例示として、ヘルプスウイルスのγクラス中に含まれるものがある。このウイルスファミリーのメンバーは、種特異的にリンパ球に感染し、リンパ球増殖性障害および重篤な悪性腫瘍の発生と関連している［Nicholas (2000) J. Mol Pathol. 53:222-237およびRickinson (2001) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356:595-604］。提供される方法において不死化物質として使用するための例示的ウイルスとして、ヒトリンパ球に関連し、不死化し得るＥＢＶ（ヘルペスウイルス４としても知られるエプスタイン−バーウイルス）およびＨＨＶ−８（ＫＳＨＶ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスとしても知られるヒトヘルペスウイルス８）が挙げられる。本方法において使用するためのその他の例示的ウイルスとして、それだけには限らないが、ＭＨＶ−６８（ネズミヘルペスウイルス６８）、ＨＶＳ（ヘルペスウイルスサミリ（Samiri））、ＲＲＶ（アカゲザルラジノウイルス）、ＬＣＶ（霊長類リンホクリプトウイルス）、ＥＨＶ−２（ウマヘルペスウイルス２）ＨＶＡ（ヘルペスウイルスアテレス）およびＡＨＶ−１（アルセラフィン（Alcelaphine）ヘルペスウイルス１）が挙げられ、これらは、それらの中で保存されたいくつかの共通の遺伝的特徴および種々の哺乳類宿主細胞において同様の病原性効果を有する、発癌性、リンパ球向性ヘルペスウイルスである。
不死化に使用されるウイルスに由来する特定のウイルスタンパク質を含有する組換えＤＮＡコンストラクトもまた、Ｂ細胞を不死化するために使用されてきた［Damania (2004) Nat Rev Microbiol. 2:656-668 and Kilger et al. (1998) EMBO J. 17:1700-1709参照のこと］。提供される方法において、ウイルス遺伝子を含有する同様のベクターを細胞中に形質導入できる。このようなコンストラクトを製造する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、レトロウイルス系またはウイルス様粒子およびこのような粒子の形成にトランスに必要な因子をすべて提供するパッケージング細胞株の使用が挙げられる。
不死化相は１時間から数時間の間、最大２〜４日持続し得る。不死化相の長さは、細胞生存力および不死化の効率などの種々の因子に応じて調整してよい。いくつかの例では、ＥＢＶを用いて、約４〜約２４時間の期間、細胞を不死化する。特定の例では、ＥＢＶを用いて、約１６時間の期間、細胞を不死化する。
Ｂ細胞のＥＢＶによって媒介される不死化は、主要なＥＢＶ受容体と考えられている細胞表面受容体ＣＤ２１の発現を必要とする。ＣＤ２１は、ほとんどのＢ細胞亜集団上に存在し、ＣＤ１９およびＢ細胞抗原受容体と複合体を形成することによって、Ｂ細胞反応を調節する［Fearon and Carroll (2000) Ann Rev Immun. 18:393-422］。ＥＢＶを用いて細胞を形質転換する能力は、Ｂ細胞刺激物質の添加によって増強できるが、条件は、ＣＤ２１が細胞表面上で維持され、高効率でのＥＢＶ不死化を可能にすることを確実にしなければならない。
不死化相後、不死化された細胞をフィーダー細胞層上で低密度で培養できる。フィーダー層は、照射された非同種異系の末梢血細胞調製物、リンパ芽球様または線維芽細胞細胞株、臍帯血リンパ球または異なる種類の胚細胞によって構成され得る。このような特性を有する細胞株の一例として、Ｂ細胞の成長および増殖を効率的に支持する、ＥＬ４−Ｂ５、突然変異ＥＬ４胸腺腫細胞株がある。その他の例示的フィーダー細胞として、本明細書において他の部分で記載される、照射されたＢ細胞枯渇ＰＭＢＣフィーダー細胞が挙げられる。Ｂ細胞集団を刺激するために使用されるものなどの成長促進剤も、不死化後に不死化されたＢ細胞集団を維持するために使用してよい。
不死化された細胞の集団を、特に、抗体単離、特性決定および製造と関連している、一連の適用に使用してよい。いくつかの例では、細胞によって発現される抗体またはこのような抗体の断片をコードするＤＮＡライブラリーは、一般的な組換え技術を使用して、細胞のバルク集団から単離されたＤＮＡから構築できる。いくつかの例では、本明細書において記載されるように、不死化された細胞をさらに培養し、抗体分泌細胞のプールに分割できる。細胞のプールは、例えば、フィード細胞層上で培養できる。
いくつかの例では、細胞のプールから得た細胞培養上清を、特定の抗原特異性を有する抗体（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質と免疫特異的に結合する抗体）を発現する細胞を同定するために、１回または複数回のラウンドでスクリーニングする。抗体をスクリーニングし、結合特異性を測定するための例示的方法は、本明細書において他の部分で記載されており、当技術分野で公知である。特定の抗体が同定されると、周知の組換え法を使用して、細胞のプールから抗体またはその抗原結合部分をコードするＤＮＡを単離できる。本明細書において記載されるように、細胞のプールから単離されたＤＮＡを、次いで、発現させることができ（例えば、原核生物または真核細胞の宿主細胞において）、所望の抗体またはその抗原結合断片を発現する個々のクローンを同定するために再スクリーニングできる。
本明細書において記載されるいくつかの例では、不死化される細胞は、標識された抗原を使用し、セルソーター（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して選別された単細胞であり得る。特定の例では、抗ＲＳＶ抗体を発現する細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を用いて標識されたＲＳＶ Ｆ抗原を使用して単離し、所望細胞を標識できる。選別後、次いで、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡを、周知の組換え法を使用して単離できる。細胞のプールから単離されたＤＮＡは、発現させ（例えば、原核細胞または真核細胞の宿主細胞において）、ＲＳＶ抗原との結合を確認できる。
通常、特定の抗原と結合する個々の抗体の同定のために使用されるスクリーニング法は、このような抗体の抗原結合部分の同定をもたらす。抗原結合断片から全長またはその他の誘導抗体を作製するために、ＶＨおよび／またはＶＬ鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を単離し、それぞれ、ＶＨ定常領域（例えば、ヒトγ１定常領域）、ＶＬ定常領域（例えば、ヒトκまたはλ定常領域）を発現するベクター中にクローニングできる。ＶＨおよびＶＬドメインはまた、選択された定常領域を発現するベクター中にクローニングしてもよい。次いで、当業者に公知の技術を使用して、重鎖転換ベクターおよび軽鎖転換ベクターを、細胞株中に同時トランスフェクトして、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する、安定な、または一時的な細胞株を作製する。
Ｆ．抗ＲＳＶ抗体およびその改変体または変異体および抗体をコードする核酸を製造する方法
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、化学合成および組換え発現技術をはじめとする、抗体の調製のための当技術分野で公知の任意の適した方法によって作製できる。宿主細胞およびベクターの種々の組合せを使用して、核酸（例えば、提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片などの抗体をコードする核酸）を、授受、維持、複製および増幅でき、核酸によってコードされるポリペプチドを発現できる。一般に、宿主細胞およびベクターの選択は、増幅、ポリペプチド発現および／またはファージなどの遺伝子パッケージ上のディスプレイが望ましいかどうかに応じて変わる。宿主細胞を形質転換する方法は周知である。任意の既知形質転換法（例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーション）を使用し、核酸を用いて宿主細胞を形質転換できる。モノクローナル抗体および抗体断片などの抗体、例えば、それだけには限らないが、Ｆａｂ断片および一本鎖抗体の製造のための手順は、当技術分野で周知である。
モノクローナル抗体は、それだけには限らないが、ハイブリドーマの使用、組換え発現、ファージディスプレイ技術またはそれらの組合せをはじめとする当技術分野で公知のさまざまな技術を使用して調製できる。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、2nd ed. 1988)；Hammerling, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 5630681 (Elsevier N.Y. 1981)において教示される、当技術分野で公知のものをはじめとするハイブリドーマ技術を使用して製造できる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片をはじめとする、本明細書において示される任意のものなどのポリペプチドは、インビボおよびインビトロ法を含めた当業者に公知の任意の方法によって製造できる。所望のポリペプチドを、例えば、分析、投与および治療のために必要とされるなど、必要な量および形態のタンパク質を製造するのに適した任意の生物において、発現させることができる。発現宿主として、原核生物ならびに大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物（例えば、ウサギ、マウス、ラットおよび家畜、例えば、それだけには限らないが、ヤギ、ヒツジおよびウシ）をはじめとする哺乳類細胞などの真核生物が挙げられ、血清、乳および卵中での産生を含む。発現宿主は、そのタンパク質産生レベルならびに発現されたタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類が異なり得る。発現宿主の選択は、これらおよび法的考察および安全性考察、製造コストおよびニーズおよび精製方法などのその他の因子に基づいて行うことができる。
１．核酸
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子が、本明細書において提供される。いくつかの例では、単離された核酸分子は、５８ｃ５である抗体をコードする。いくつかの例では、単離された核酸分子は、５８ｃ５の抗原結合断片である抗原結合断片をコードする。
いくつかの例では、提供される単離された核酸分子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含有する抗体またはその抗原結合断片をコードする。いくつかの例では、提供される単離された核酸分子は、配列番号１８に示されるヌクレオチドの配列を有する核酸を含有する。
いくつかの例では、提供される単離核酸分子は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含有する抗体またはその抗原結合断片をコードする。いくつかの例では、提供される単離核酸分子は、配列番号１７に示されるヌクレオチドの配列を有する核酸を含有する。
いくつかの例では、提供される単離核酸分子は、配列番号２または１６２７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１を含有する抗体またはその断片をコードする。いくつかの例では、提供される単離核酸分子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２を含有する抗体またはその断片をコードする。いくつかの例では、提供される単離核酸分子は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有する抗体またはその断片をコードする。
いくつかの例では、提供される単離核酸分子は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含有する抗体またはその断片をコードする。いくつかの例では、提供される単離核酸分子は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含有する抗体またはその断片をコードする。いくつかの例では、提供される単離核酸分子は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する抗体またはその断片をコードする。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子は、核酸分子の操作のための周知の組換え技術を使用して調製できる［例えば、Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel et al., eds. (1998) Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、NYに記載されている技術を参照のこと］。いくつかの例では、それだけには限らないが、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法を使用して、異なるアミノ酸配列を有する改変された抗体またはその抗原結合断片を作製できる、例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を作製できる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の１つまたは複数のＣＤＲを、日常的な組換えＤＮＡ技術を使用してフレームワーク領域内に挿入する。フレームワーク領域は、ヒトフレームワーク領域をはじめとする、天然に存在するフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域から選択できる［例示的フレームワーク領域については、例えば、Chothia et al. (1998) J. Mol. Biol. 278:457-479参照のこと］。一般に、フレームワーク領域およびＣＤＲの組合せによって作製されたポリヌクレオチドは、親の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の抗原結合特異性を維持する抗体またはその抗原結合断片をコードする。コードされる抗体またはその抗原結合断片の１つまたは複数の特性を改善するために、ポリヌクレオチドへの変更を行うことができ、その変更は当業者の範囲内である。いくつかの例では、フレームワーク領域内でポリヌクレオチドの１つまたは複数の改変を行って、アミノ酸置換を引き起こし、これは、例えば、抗体またはその抗原結合断片の、その抗原との結合を改善してもよい。さらに、このような方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関与している１個または複数の可変領域システインのアミノ酸置換または欠失を行って、１つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作製することができる。
２．ベクター
抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有するベクターが、本明細書において提供される。多数の発現ベクターが、利用可能であり、当業者に公知であり、ポリペプチドの発現のために使用できる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響を受ける。このような選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび所望により、エンハンサー、翻訳シグナルならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換に使用される発現ベクターは、通常、形質転換された細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを有する。いくつかの場合には、複製起点を使用して、細胞中のベクターのコピー数を増幅できる。
ベクターはまた、連結される核酸分子と機能し得る形で連結されているさらなるヌクレオチド配列、例えば、局在性などのためのエピトープタグ、例えば、ヘキサｈｉｓタグもしくはｍｙｃタグまたは精製のためのタグ、例えば、ＧＳＴ融合ならびにタンパク質分泌および／または膜結合に向けさせるための配列などを含有し得る。
抗体またはその抗原結合断片の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーによって制御され得る。適した細菌プロモーターは、当技術分野で周知であり、本明細書において以下に記載されている。哺乳類細胞、酵母細胞および昆虫細胞のためのその他の適したプロモーターが、当技術分野で周知であり、一部が以下に例示されている。異種核酸の直接発現のために使用されるプロモーターの選択は、特定の適用に応じて変わり、当業者の技術のレベルの範囲内である。使用できるプロモーターとして、それだけには限らないが、ＳＶ４０初期プロモーターを含有する真核生物の発現ベクター［Bernoist and Chambon, (1981) Nature 290:304-310］、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復配列中に含有されるプロモーター［Yamamoto et al. (1980) Cell 22:787-797］、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター［Wagner et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445］、メタロチオネイン遺伝子の調節配列［Brinster et al., (1982) Nature 296:39-42］；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物の発現ベクター［Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543］またはｔａｃプロモーター［DeBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25］；Scientific American 242:79-94 (1980)中の「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」も参照のこと；ノパリンシンセターゼプロモーターを含有する植物発現ベクター［Herrera-Estrella et al., (1984) Nature 303:209-213］またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター［Gardner et al., (1981) Nucleic Acids Res. 9:2871］および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター［Herrera-Estrella et al., (1984) Nature 310:115-120］；酵母およびその他の真菌に由来するプロモーターエレメント、例えば、Ｇａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターおよび組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されている以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域［Swift et al., (1984) Cell 38:639-646；Ornitz et al., (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonald, (1987) Hepatology 7:425-515］；膵β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域［Hanahan et al., (1985) Nature 315:115-122］、リンパ球細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域［Grosschedl et al., (1984) Cell 38:647-658；Adams et al., (1985) Nature 318:533-538；Alexander et al., (1987) Mol. Cell Biol. 7:1436-1444］、精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞において活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域［Leder et al., (1986) Cell 45:485-495］、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域［Pinckert et al., (1987) Genes and Devel. 1:268-276］、肝臓において活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域［Krumlauf et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648；Hammer et al., (1987) Science 235:53-58］、肝臓において活性であるα−１アンチトリプシン遺伝子制御領域［Kelsey et al., (1987) Genes and Devel. 1:161-171］、骨髄系細胞において活性であるβグロビン遺伝子制御領域［Magram et al., (1985) Nature 315:338-340；Kollias et al., (1986) Cell 46:89-94］、脳の乏突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域［Readhead et al., (1987) Cell 48:703-712］、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域［Shani (1985) Nature 314:283-286］および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞において活性である性腺刺激ホルモン（gonadotrophic）放出ホルモン遺伝子制御領域［Mason et al., (1986) Science 234:1372-1378］が挙げられる。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、通常、宿主細胞における抗体またはその一部の発現のために必要なさらなるエレメントのすべてを含有する転写ユニットまたは発現カセットを含有する。通常の発現カセットは、生殖系列抗体鎖をコードする核酸配列と機能し得る形で連結されているプロモーターおよび転写物の効率的なポリアデニル化に必要なシグナル、リボソーム結合部位および翻訳終結を含有する。カセットのさらなるエレメントは、エンハンサーを含み得る。さらに、カセットは、通常、効率的な終結を提供するために構造遺伝子の下流に転写終結領域を含有する。終結領域は、プロモーター配列と同一の遺伝子から得てもよく、または異なる遺伝子から得てもよい。
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼおよびジヒドロホレートレダクターゼなどの遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。あるいは、多角体プロモーターまたはその他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示に従って生殖系列抗体鎖をコードする核酸配列とともに、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用するものなどの遺伝子増幅を含まない高収率発現系も適している。
ベクターへのＤＮＡ断片の挿入のための当業者に公知の任意の方法を使用して、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組換え体（遺伝子組換え）を含み得る。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的な突出末端を有するクローニングベクター中にＤＮＡ断片を連結することによって達成できる。ＤＮＡを断片化するために使用される相補的制限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に改変してもよい。あるいは、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することによって所望の任意の部位を製造でき、これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成された核酸を含有し得る。
本明細書において提供される抗体または抗原結合断片を製造するために有用な例示的プラスミドベクターは、ＨＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーターまたはＭＨＣクラスＩプロモーターなどの強力なプロモーター、ＨＣＭＶ前初期遺伝子イントロンＡなどの転写物のプロセシングを増強するためのイントロンおよび後期ＳＶ４０ポリＡシグナルなどのポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含有する。プラスミドは、抗体の全長重鎖および軽鎖、一本鎖Ｆｖ断片またはその他の免疫グロブリン断片の発現を可能にするようマルチシストロン性であり得る。
３．細胞発現系
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、適した宿主において発現させることができる。ベクターおよび本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含有する細胞が提供される。一般に、異種ＤＮＡを発現するよう操作され得る、分泌経路を有する任意の細胞種が適している。発現宿主として、原核生物および真核生物、例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌）、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞を含めた動物細胞が挙げられる。発現宿主は、タンパク質産生レベルならびに発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾の種類において異なり得る。さらに、発現宿主の選択は、使用されるベクターならびに転写および翻訳エレメントの選択と関連していることが多い。例えば、発現宿主の選択は、使用される前駆体配列の選択に応じて変わることが多いが、常にではない。例えば、多数の異種シグナル配列は、同一種の宿主細胞においてのみ発現され得る（すなわち、昆虫細胞シグナル配列は、昆虫細胞において最適に発現される）。対照的に、例えば、酵母、昆虫または哺乳類宿主細胞において良好に働くヒト血清アルブミン（ｈＨＳＡ）シグナル配列ならびに昆虫および哺乳類細胞において機能的であると実証されている組織プラスミノーゲン活性化因子プレ／プロ配列［Tan et al., (2002) Protein Eng. 15:337］などのその他のシグナル配列は、異種宿主において使用できる。発現宿主の選択は、これらおよび法的考察および安全性考察、製造コストおよびニーズおよび精製方法などのその他の因子に基づいて行うことができる。したがって、ベクター系は、使用される宿主細胞と適合しなくてはならない。
真核生物宿主における発現は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピチア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、ショウジョウバエ（Drosophila）細胞および鱗翅目細胞などの昆虫細胞、タバコ、トウモロコシ、コメ、藻類およびアオウキクサ属などの植物および植物細胞における発現を含み得る。発現のための真核細胞としてまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などの哺乳類細胞株が挙げられる。真核細胞発現宿主としてまた、例えば、血清、乳および卵における製造を含めた、トランスジェニック動物における製造が挙げられる。
組換え分子は、遺伝子配列の多数のコピーが生じるように、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションによって宿主細胞中に導入できる。一般に、標準トランスフェクション法を使用して、多量の抗体鎖を発現する、細菌、哺乳類、酵母または昆虫細胞株を製造し、次いで、これを標準技術を使用して精製する［例えば、Colley et al. (1989) J. Biol. Chem., 264:17619-17622；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed.), 1990参照のこと］。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準技術に従って実施する［例えば、Morrison (1977) J. Bact. 132:349-351；Clark-Curtiss and Curtiss (1983) Methods in Enzymology, 101, 347-362参照のこと］。例えば、宿主細胞中に外来ヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のいずれかを使用してよい。これらとして、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター（plasma vector）、ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびその他のウイルス）および任意のその他の、宿主細胞にクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはその他の外来遺伝物質を導入するためのその他の周知の方法の使用が挙げられる。
ａ．原核生物の発現
原核生物、特に、大腸菌は、多量のタンパク質を製造するための系および提供された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を発現するために使用できる系を提供する。通常、提供された変異体ポリペプチドの増幅および発現のために、大腸菌宿主細胞が使用される。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の簡単で、迅速な技術である。大腸菌の発現ベクターは、誘導プロモーターを含有する場合があり、このようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を導入するのに、また、宿主細胞に対して幾分かの毒性を示すタンパク質を発現するのに有用である。誘導プロモーターの例として、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターおよび温度調節性λＰＬプロモーターが挙げられる。
本明細書において提供される任意のものなどのタンパク質は、大腸菌の細胞質環境中に発現させることができる。いくつかのポリペプチドには、細胞質環境は、タンパク質の凝集物を含有する不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールおよび変性剤、例えば、グアニジン−ＨＣｌおよび尿素などの還元剤を使用して、タンパク質を再可溶化し、それに続いて、可溶性タンパク質を続いて再折りたたみできる。代替アプローチとして、酸化環境およびシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生につながり得る細菌の細胞膜周辺腔におけるタンパク質の発現がある。例えば、タンパク質のファージディスプレイのために、タンパク質は、それらがファージに組み立てられ得るよう周辺質に輸送される。通常、リーダー配列が、発現されるタンパク質と融合され、これが、タンパク質を周辺質へ方向付ける。次いで、リーダーは、周辺質の内側でシグナルペプチダーゼによって除去される。周辺質をターゲッティングするリーダー配列の例として、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーが挙げられる。いくつかの場合には、周辺質の発現によって、発現されたタンパク質の培養培地への漏出が可能となる。タンパク質の分泌によって、培養上清からの迅速かつ簡単な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によって周辺質から得ることができる。細胞質発現と同様に、いくつかの場合には、タンパク質は不溶性になる場合があり、変性剤および還元剤を使用して、可溶化および再折りたたみを促進できる。誘導および成長の温度も、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼす場合があり、通常、２５℃から３７℃の間の温度が使用される。通常、細菌は、非グリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が、機能のためにグリコシル化を必要とする場合には、宿主細胞からの精製後、インビトロでグリコシル化を加えてもよい。
ｂ．酵母細胞
サッカロミセス・セレベシエ（Saccharomyces cerevisae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母は、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を発現させるために使用できる、周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製するベクターを用いてか、または相同組換えによる安定な染色体組込みによって形質転換できる。通常、誘導プロモーターを使用して、遺伝子発現を調節する。このようなプロモーターの例として、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５ならびにＣＵＰ１、ＡＯＸ１などのメタロチオネインプロモーターまたはその他のピキアもしくはその他の酵母プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、形質転換されたＤＮＡの選択および維持のために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３などの選択マーカーを含むことが多い。酵母中で発現されるタンパク質は、可溶性であることが多い。Ｂｉｐなどのシャペロニンおよびプロテインジスルフィドイソメラーゼとの同時発現によって、発現レベルおよび溶解度を改善できる。さらに、酵母中で発現されるタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ由来の酵母接合型α−因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合およびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合を使用して、分泌に向けることができる。それらは、分泌経路から出て行くので、Ｋｅｘ−２プロテアーゼに対するものなどのプロテアーゼ切断部位を操作して、発現されたポリペプチドから融合した配列を除去してもよい。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化できる。
ｃ．昆虫細胞
特に、バキュロウイルス発現を使用する昆虫細胞を使用して、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を発現させることができる。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用されるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、安全性を改善し、真核生物発現の法的懸念を低減する限定された宿主域を有する。通常の発現ベクターは、バキュロウイルスなどのポリヘドリンプロモーターなどの高レベル発現のためのプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系として、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）などのバキュロウイルスを含む。カイコ（Bombyx mori）核多核体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）およびヨトウガ（Spodoptera frugiperda）に由来するＳｆ９などの昆虫細胞株、シューダレチア・ユニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（Danaus plexippus）（ＤｐＮ１）が挙げられる。高レベル発現のために、発現される分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳類分泌シグナルは、昆虫細胞において正確にプロセシングされ、これを使用して、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌させることができる。さらに、細胞株シューダレチア・ユニプンクタ（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）は、哺乳類細胞系と同様のグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。
昆虫細胞における代替発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ ２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ）およびＣ７細胞［ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）］などの細胞株を発現のために使用できる。ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターを使用して、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導できる。発現ベクターは、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーの使用によって維持する。
ｄ．哺乳類細胞
哺乳類発現系を使用して、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を発現させることができる。発現コンストラクトは、それだけには限らないが、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスなどのウイルス感染によってか、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランなどの直接ＤＮＡ移行によって、およびエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段によって、哺乳類細胞に移行することができる。哺乳類細胞の発現ベクターは、通常、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。このようなベクターは、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多数の細胞種において活性である。組織および細胞種プロモーターおよびエンハンサー領域もまた、発現のために使用できる。例示的プロモーター／エンハンサー領域は、それだけには限らないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子に由来するものを含む。選択マーカーを使用して、発現コンストラクトを有する細胞を選択し、維持できる。選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロホレートレダクターゼおよびチミジンキナーゼが挙げられる。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合によって、細胞表面で活性状態のタンパク質の発現を指示することができる。
多数の細胞株を、マウス、ラット ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞をはじめとする哺乳類発現のために利用可能である。例示的細胞株として、それだけには限らないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）およびその他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、ＨＳ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ、２９３Ｓ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞が挙げられる。細胞培養培地から分泌されたタンパク質の精製を容易にする血清不含培地に適応した細胞株もまた、利用可能である。１つのこのような例として、血清不含ＥＢＮＡ−１細胞株が挙げられる［Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42］。
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞および植物は、本明細書に記載される任意のものなどのポリペプチドを発現するためのものであり得る。発現コンストラクトは、通常、プロトプラストへの微粒子銃およびＰＥＧによって媒介される移行などの直接ＤＮＡ移行を使用して、また、アグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて植物に移行される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、普通、シロイヌナズナ（Arabidopsis）およびタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシおよびコメなどの単子葉植物宿主の間に分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーターならびにユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。形質転換された細胞の選択および維持を容易にするために、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーが使用されることが多い。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養物中で維持されるか、または全植物に再生され得る。トランスジェニック植物細胞としてまた、プロテアーゼまたは改変されたプロテアーゼを産生するよう操作された藻類も挙げられる［例えば、Mayfield et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:438-442参照のこと］。植物は、哺乳類細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主において産生されたタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。
４．抗体の精製
宿主細胞から、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含めたポリペプチドを精製する方法は、選択された宿主細胞および発現系に応じて変わる。分泌された分子については、タンパク質は、通常、細胞を除去した後に培養培地から精製される。細胞内発現については、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製すればよい。一例では、ポリペプチドを、遠心分離および細胞溶解（例えば、ドライアイス／エタノール浴中での反復される凍結−解凍によって）と、それに続く、遠心分離およびポリペプチドを含有する上清の保持によって、宿主細胞から単離する。トランスジェニック植物および動物などのトランスジェニック生物が、発現のために使用され、組織または臓器を、溶解された細胞抽出物を作製するための出発物質として使用できる。さらに、トランスジェニック動物製造は、乳または卵におけるポリペプチドの製造を含み得、これを集めることができ、必要に応じて、当技術分野における標準法を使用して、さらなるタンパク質を抽出し、さらに精製できる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片などのタンパク質を、それだけには限らないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿および陰イオン交換などのイオン交換クロマトグラフィーをはじめとする当技術分野で公知の標準タンパク質精製技術を使用して、例えば、溶解した細胞抽出物から精製できる。また、アフィニティー精製技術を使用して、調製物の効率および純度を改善できる。アフィニティー精製では、例えば、プロテアーゼと結合する、抗体、受容体およびその他の分子を使用できる。発現コンストラクトはまた、タンパク質に、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ６などの親和性タグを付加するよう操作でき、それぞれ、ｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂を用いてアフィニティー精製できる。純度は、ゲル電気泳動および染色および分光光度的技術をはじめとする当技術分野で公知の任意の方法によって評価できる。
次いで、例えば、ゲル（例えば、ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル）での分離、サイズ分画（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−２００ ＨｉＰｒｅｐ（商標）１６ｘ６０サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｆｒｏｍ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）での分離によって、単離されたポリペプチドを分析できる。単離されたポリペプチドはまた、結合アッセイ、通常、固相支持体、例えば、プレート（例えば、ＥＬＩＳＡをベースとする結合アッセイ）またはビーズと結合している結合パートナーを使用する結合アッセイにおいて分析して、その所望の結合パートナーと結合する能力を調べることができる。沈殿した、ポリペプチドをディスプレイするファージを評価するために使用される、以下の節に記載される結合アッセイはまた、宿主細胞溶解物から直接単離されたポリペプチドを評価するために使用できる。例えば、結合アッセイを実施して、例えば、アッセイプレートのウェルなどの固相支持体上に抗原をコーティングすることと、固相支持体上の単離されたポリペプチドをインキュベートすることと、それに続いて洗浄することおよび二次試薬、例えば、酵素標識抗体および基質を用いて検出することによって、抗体ポリペプチドが１種または複数の抗原と結合するかどうかを調べることができる。
Ｇ．抗ＲＳＶ抗体特性および活性を評価すること
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、当業者に周知の種々の方法で特性決定できる。例えば、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質と免疫特異的に結合する能力についてアッセイできる。このようなアッセイは、例えば、溶液中で［例えば、Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421］、ビーズ上で［Lam (1991) Nature 354:82-84］、チップ上で［Fodor (1993) Nature 364:555-556］、細菌で（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子で（米国特許第５，５７１，６９８号；同５，４０３，４８４号；および同５，２２３，４０９号）、プラスミドで［Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869］またはファージで［Scott and Smith (1990) Science 249:386-390；Devlin (1990) Science 249:404-406；Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382；およびFelici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310］実施できる。ＲＳＶ抗原またはその断片と免疫特異的に結合すると同定されている抗体またはその抗原結合断片はまた、ＲＳＶ抗原に対するその特異性および親和性についてアッセイできる。結合特異性またはエピトープは、例えば、その他の抗ＲＳＶ抗体との競合アッセイおよび／またはモノクローナル抗体耐性突然変異体（ＭＡＲＭ）を使用するウイルス中和アッセイによって決定できる。さらに、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の接触または投与によって達成されるＲＳＶ中和のレベルを測定するために、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を使用するインビトロアッセイおよびインビボ動物モデルを使用してもよい。
１．結合アッセイ
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、当業者に公知の任意の方法によって、選択された標的（例えば、ＲＳＶウイルスまたは単離されたＲＳＶ Ｆタンパク質）と結合するその能力およびこのような標的に対する特異性について評価できる。例示的アッセイは、以下の実施例５および８において提供され、本明細書において以下に記載されている。結合アッセイは、溶液、懸濁液中、または固相支持体上で実施してよい。例えば、標的抗原を、固相支持体（例えば、炭素またはプラスチック表面、組織培養ディッシュまたはチップ）へと固定化し、抗体またはその抗原結合断片と接触させてもよい。結合していない抗体または標的タンパク質を洗浄除去し、次いで、結合している複合体を検出してもよい。結合アッセイは、非イオン性界面活性剤（例えば、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｗｅｅｎ ２０）および／またはブロッキングタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはゼラチン）を含む高イオン強度バッファー（例えば、０．３〜０．４Ｍ ＮａＣｌ）を使用するなどによって、非特異的結合を低減する条件下で実施してもよい。このようなアッセイ中に、バックグラウンド結合の尺度として陰性対照も含めることができる。結合親和性は、スキャッチャード解析法［Munson et al., (1980) Anal. Biochem., 107:220］、表面プラズモン共鳴、等温熱量測定または当業者に公知のその他の方法を使用して決定できる。
免疫特異的結合および交差反応性を分析するために使用できる例示的イムノアッセイとして、それだけには限らないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、メソスケールディスカバリー（Meso Scale Discovery）（ＭＳＤ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する、それだけに限らないが、競合および非競合アッセイ系が挙げられる。このようなアッセイは、日常的なものであって、当技術分野で周知である（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ausubel et al, eds, 1994, Currentprotocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York参照のこと）。その他のアッセイ形式として、特定の分子（例えば、抗体）と結合し、封入された試薬またはマーカーを放出するよう設計されたリポソームを使用するリポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられる。次いで、放出された化学物質を、標準技術に従って検出する［Monroe et al., (1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41参照のこと］。制限によって意図されない例示的イムノアッセイを、以下に簡単に記載する。
免疫沈降プロトコールは、一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を補給した、ＲＩＰＡバッファー（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％トラジロール）などの溶解バッファー中に細胞の集団を溶解することと、細胞溶解物に、注目する抗体またはその抗原結合断片を加えること、４０℃で一定期間（例えば、１〜４時間）インキュベートすること、細胞溶解物にプロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを加えること、４０℃で、約１時間またはそれ以上インキュベートすること、溶解バッファー中でビーズを洗浄することおよびＳＤＳ／サンプルバッファー中にビーズを再懸濁することとを含む。注目する抗体またはその抗原結合断片の、特定の抗原を免疫沈降させる能力を、例えば、ウエスタンブロット解析によって評価できる。当業者は、抗原に対する抗体またはその抗原結合断片の結合を増大し、バックグラウンドを低減する（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前に清澄化する）ように改変できるパラメータについての知識が豊富である。免疫沈降プロトコールに関するさらなる考察については、例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1参照のこと。
ウエスタンブロット解析は、一般に、タンパク質サンプルを調製することと、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）におけるタンパク質サンプルの電気泳動と、ポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどのメンブレンへタンパク質サンプルを転写することと、ブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは脱脂乳を含むＰＢＳ）中でメンブレンをブロッキングすることと、メンブレンを洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄することと、ブロッキングバッファーで希釈された、一次抗体またはその抗原結合断片（すなわち、注目する抗体またはその抗原結合断片）を用いてメンブレンをブロッキングすることと、メンブレンを洗浄バッファーで洗浄することと、メンブレンを、ブロッキングバッファーで希釈された、酵素の基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射活性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）とコンジュゲートしている二次抗体（一次抗体、例えば、抗ヒト抗体を認識する）を用いてブロッキングすることと、メンブレンを洗浄バッファーで洗浄することと、抗原の存在を検出することとを含む。当業者は、検出されるシグナルを増大し、バックグラウンドノイズを低減するように改変され得るパラメータについての知識が豊富である。ウエスタンブロットプロトコールに関するさらなる考察については、例えば、Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1参照のこと。
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製することと、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、抗原を用いてコーティングすることと、ウェルに酵素の基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物とコンジュゲートしている注目する抗体またはその抗原結合断片を加えることと、一定期間インキュベートすることと、抗原の存在下で検出することとを含む。ＥＬＩＳＡでは、注目する抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な化合物とコンジュゲートされなくてもよく、代わりに、検出可能な化合物とコンジュゲートしている第２の抗体（注目する抗体を認識する）をウェルに加えてもよい。さらに、抗原を用いてウェルをコーティングする代わりに、ウェルに抗体をコーティングしてもよい。この場合には、コーティングされたウェルに注目する抗原を添加した後、検出可能な化合物とコンジュゲートしている第２の抗体を加えてもよい。当業者は、検出されるシグナルを増大するように改変できるパラメータならびに当技術分野で公知のＥＬＩＳＡのその他の変法について知識が豊富である。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ausubel et al, eds, 1994、Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1参照のこと。実施例５および８は、ＲＳＶ Ｆタンパク質との抗ＲＳＶ抗体の結合についての結合アッセイを例示する。
抗原に対する抗体またはその抗原結合断片の結合親和性および抗体−抗原相互作用の解離速度は、例えば、競合結合アッセイによって決定できる。競合結合アッセイの一例として、漸増量の標識されていない抗原の存在下で、注目する抗体またはその抗原結合断片とともに、標識された抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）をインキュベートすることと、標識された抗原と結合している抗体またはその抗原結合断片を検出することとを含む、ラジオイムノアッセイがある。ＲＳＶ抗原に対する、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の親和性および結合解離速度は、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定できる。第２の抗体との競合も、ラジオイムノアッセイを使用して決定できる。この場合には、ＲＳＶ抗原を、漸増量の標識されていない第２の抗体の存在下、標識された化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）とコンジュゲートしている本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片とともにインキュベートする。いくつかの例では、表面プラズモン共鳴［例えば、ＢｉａＣｏｒｅ ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335］動態解析を使用して、ＲＳＶ抗原との、抗体またはその抗原結合断片の結合速度および解離速度を決定できる。表面プラズモン共鳴動態解析は、その表面に抗体またはその断片が固定化されたチップからのＲＳＶ抗原の結合および解離を分析することを含む。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、当業者に公知の技術を使用して、ＲＳＶの、その宿主細胞受容体との結合を阻害するその能力についてアッセイできる。例えば、抗体またはその抗原結合断片の存在下または不在下で、ＲＳＶの受容体を発現する細胞を、ＲＳＶと接触させることができ、抗体またはその断片の、ＲＳＶの結合を阻害する能力を、例えば、フローサイトメトリーまたはシンチレーションアッセイによって測定できる。ＲＳＶ（例えば、Ｆ糖タンパク質またはＧ糖タンパク質などのＲＳＶ抗原）または抗体もしくは抗体断片を、ＲＳＶおよびその宿主細胞受容体間の相互作用の検出を可能にする、放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓおよび１２５Ｉ）または蛍光標識［例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（o-phthaldehyde）およびフルオレサミン］などの検出可能な化合物を用いて標識できる。
抗体またはその抗原結合断片の、ＲＳＶを、その受容体との結合から阻害する能力はまた、細胞不含アッセイにおいて決定できる。例えば、ＲＳＶまたはＦ糖タンパク質などのＲＳＶ抗原を、抗体またはその断片と接触させることができ、抗体または抗体断片の、ＲＳＶまたはＲＳＶ抗原を、その宿主細胞受容体との結合から阻害する能力を決定できる。いくつかの例では、抗体または抗原結合断片を、固相支持体上に固定化し、ＲＳＶまたはＲＳＶ抗原を、検出可能な化合物を用いて標識する。いくつかの例では、ＲＳＶまたはＲＳＶ抗原を、固相支持体上に固定化し、抗体またはその断片を、検出可能な化合物を用いて標識する。ＲＳＶまたはＲＳＶ抗原は、部分的にまたは完全に精製できる（例えば、その他のポリペプチドまたは細胞溶解物の一部を部分的にまたは完全に含まない）。いくつかの例では、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ抗原と、グルタチオニン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのドメインとを含む融合タンパク質であり得る。いくつかの例では、ＲＳＶ抗原を、当業者に周知の技術を使用してビオチン化できる（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）。
２．結合特異性
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の結合特異性またはエピトープを、それだけには限らないが、表面プラズモン共鳴アッセイ、競合アッセイおよびモノクローナル抗体耐性突然変異体（ＭＡＲＭ）を使用するウイルス中和アッセイをはじめとする当業者に公知の任意のアッセイによって決定できる。エピトープは、単離されたタンパク質、すなわち、単離されたＦタンパク質またはウイルス中のタンパク質中にあり得る。２種の抗体の、同一エピトープと結合する能力は、例えば、表面プラズモン共鳴アッセイおよび抗体競合アッセイなどの当技術分野で公知のアッセイによって決定できる。通常、同一のエピトープと免疫特異的に結合する抗体は、エピトープとの結合について競合し得、これは、例えば、当技術分野で公知の技術を使用して、インビトロ結合競合アッセイ（例えば、競合ＥＬＩＳＡ）によって測定できる。通常、第２の抗体と同一のエピトープと免疫特異的に結合する第１の抗体は、約または３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％までエピトープとの結合について競合し得、ここで、競合パーセンテージは、第１の抗体の結合を、エピトープと置換する第２の抗体の測定された能力である。例示的競合アッセイでは、抗原を、標識された抗体の所定の制限希釈（例えば、５０〜７０％飽和濃度）および標識されていない競合抗体の段階希釈の存在下でインキュベートする。競合は、競合抗体の存在下での結合の任意の低減について、標識された抗体の、抗原との結合を測定することによって決定する。種々の標識技術および例えば、放射測定、蛍光、酵素および比色分析検出を含めた検出法をはじめとするこのようなアッセイの変法は、当技術分野で公知である。例えば、以下の実施例１０において例示されるように、抗体ＩｇＧ５８ｃ５およびモタビズマブは、ＲＳＶ Ｆタンパク質との結合について競合せず、したがって、抗体ＩｇＧ ５８ｃ５は、モタビズマブとは異なるエピトープと結合することを示す。
第１の抗体の、第２の抗体と同一のエピトープと結合する能力もまた、例えば、モノクローナル抗体耐性突然変異体を使用するウイルス中和アッセイによって決定できる。ＭＡＲＭは、野生型ＲＳＶウイルスを中和するモノクローナル抗体によって中和されない突然変異体呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である。すなわち、ＭＡＲＭは、ＲＳＶエスケープ突然変異体である。ＭＡＲＭは、ウイルス複製の各連続ラウンド後に、抗体によって中和されない突然変異体ウイルスが生じるまで、漸増濃度の抗体の存在下で細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されるよう、抗体の存在下でのウイルス複製の連続ラウンドの間、モノクローナル抗体の存在下で野生型ＲＳＶを培養することによって作製する。第１の抗体が、第２の抗体に対して作製したＭＡＲＭを中和できる場合には、抗体は、異なるエピトープと特異的に結合するか、または相互作用すると結論づけることができる。例えば、第１の抗ＲＳＶ抗体が、野生型ＲＳＶを中和するが、特定の突然変異体ＲＳＶ（すなわち、ＭＡＲＭ）を中和しない場合には、野生型ＲＳＶを中和するが、特定の突然変異体ＲＳＶを中和しない第２の抗体は、通常、第１の抗体と同一のＲＳＶ上のエピトープと結合する。第１の抗ＲＳＶ抗体が、野生型ＲＳＶを中和するが、特定の突然変異体ＲＳＶを中和しない場合には、野生型ＲＳＶおよび特定の突然変異体ＲＳＶを中和する第２の抗体は、通常、第１の抗体と同一のＲＳＶ上のエピトープと結合しない。
例えば、以下の実施例９において例示されるように、本明細書において提供されるＩｇＧ ５８ｃ５は、ＭＡｂ１１２９に対して作製したＭＡＲＭ１１２９、パリビズマブおよびモタビズマブの親抗体［Johnson et al. (1997) J. Infect. Diseases 176:1215-1224および米国特許第５，８２４，３０７号参照のこと］、Ｆａｂ１９に対して作製したＭＡＲＭ１９［Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10164-10168参照のこと］およびＭＡｂ１５１に対して作製したＭＡＲＭ１５１［Mufson et al., (1985) J. Gen. Virol, 66:2111-2124参照のこと］をはじめ、種々の抗ＲＳＶ抗体に対して予め作製したＭＡＲＭを中和できる。したがって、ＩｇＧ ５８ｃ５は、抗体Ｆａｂ１９、ＭＡｂ１５１およびＭＡｂ１１２９とは異なるＦタンパク質上のエピトープと結合する。
以下の実施例１１において例示されるように、ＭＡＲＭを、モタビズマブおよびＩｇＧ ５８ｃ５に対して作製した。５〜７ラウンドの選択後に作製されたモタビズマブＭＡＲＭは、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質と比較して、単一のアミノ酸突然変異（Ｋ２７２Ｅ、配列番号１６４２）を含有する。アミノ酸Ｋ２７２での突然変異は、モタビズマブの親抗体の結合を乱す公知の突然変異と一致する［Zhao et al., (2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946参照のこと］。１０ラウンドの選択後に作製されたＩｇＧ ５８ｃ５ ＭＡＲＭは、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質と比較して、３つのアミノ酸突然変異（Ｎ６３Ｋ、Ｍ１１５ＫおよびＥ２９５Ｇ、配列番号１６４３）を含有する。ＩｇＧ ５８ｃ５ ＭＡＲＭ中のエスケープを達成する突然変異は、ＲＳＶ Ｆタンパク質と免疫特異的に結合する種々のモノクローナル抗体の抗原部位としては、これまで同定されていない［例えば、Beeler et al. (1989) J. Virology 63(7):2841-2950、Crowe et al. (1998) Virology 252:373-375；Zhao et al., (2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946；Liu et al., (2007) Virology Journal 4:71参照のこと］。さらに、以下の実施例１１に示されるように、ＩｇＧ ５８ｃ５は、モタビズマブＭＡＲＭを中和し、モタビズマブは、ＩｇＧ ５８ｃ５ ＭＡＲＭを中和する。したがって、ＩｇＧ ５８ｃ５は、モタビズマブとは異なる、ＲＳＶ Ｆタンパク質のエピトープと結合する。
３．抗体のウイルス中和効果を分析するためのインビトロアッセイ
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、ウイルス中和の検出のための当技術分野で公知の任意の適した方法によって分析できる。ウイルス中和の検出法として、それだけには限らないが、プラークアッセイおよび合胞体形成の阻害についてのアッセイが挙げられる。このようなアッセイを使用して、例えば、ウイルス結合、ウイルス侵入およびウイルスの細胞間伝播の阻害を評価できる［例えば、Burioni et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:355-359；Sanna et al. (2000) Virology 270:386-396l；およびDe Logu et al., (1998) J Clin Microbiol 36:3198-3204参照のこと］。当業者ならば、ウイルス中和を測定できる任意のアッセイを同定できる。
標準プラークアッセイとして、例えば、プラーク減少アッセイ、プラークサイズ減少アッセイ、中和アッセイおよび中和動態アッセイが挙げられる。これらのアッセイは、ウイルスによる標的細胞単層の感染後の、ウイルスプラークの形成（すなわち、溶解した細胞の面積）を測定する。プラーク減少アッセイにおいて使用できる例示的標的細胞株として、それだけには限らないが、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＲＣ−３７細胞、ＢＨＫ−２１／Ｃ１３細胞およびＨＥｐ−２細胞が挙げられる。当業者ならば、プラークアッセイにおいて使用するための適当な標的細胞株を同定できる。プラークアッセイのための適当な細胞株の選択は、公知の因子、例えば、細胞感染力およびウイルスの、標的細胞において増殖し、標的細胞を溶解する能力などに応じて変わり得る。実施例６および９には、インビトロ中和アッセイが例示されている。
プラーク減少アッセイを使用して、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の、溶液中でウイルス中和を達成する能力を測定できる。例示的プラーク減少アッセイでは、抗体またはその抗原結合断片およびウイルスを、プレインキュベートし、その後、標的細胞を加える。次いで、標的細胞を抗体／ウイルス混合物に感染させ、所定の感染期間後にプラークアッセイを実施する。当業者ならば、当技術分野で公知の例に基づいて、必要なインキュベーション時間を決定できる。標的細胞の感染後に生じたウイルスプラークの数の減少が、標的細胞との抗体またはその抗原結合断片の結合および／または抗体、もしくはその抗原結合断片、内部移行とは無関係に、抗体またはその抗原結合断片の、ウイルスの標的細胞との結合を防ぐ能力を示す。
プラークサイズ減少アッセイを使用して、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の、ウイルスの細胞間伝播を阻害する能力を測定できる。例示的プラークサイズ減少アッセイでは、標的細胞をまずウイルスに、所定の感染期間、感染させ、次いで、感染細胞に、抗体またはその抗原結合断片を加える。当業者ならば、当技術分野で公知の例に基づいて、必要なインキュベーション時間を決定できる。ウイルスプラークのサイズ（すなわち、直径）の減少が、抗体またはその抗原結合断片が、ウイルスの細胞間伝播を防ぐことができることを示す。
ウイルス中和アッセイを使用して、ウイルス曝露に先立つ、抗体またはその抗原結合断片の標的細胞との結合によって、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の、標的細胞表面でウイルスの中和を達成する能力を測定できる。例示的ウイルス中和アッセイでは、抗体またはその抗原結合断片および標的細胞を所定の期間プレインキュベートし、抗体またはその抗原結合断片の、標的細胞との結合を可能にする。プレインキュベーション期間の後、結合していない抗体を除去し、標的細胞をウイルスに感染させる。このアッセイにおけるプラークの数の減少は、抗体またはその抗原結合断片の、標的細胞との結合および／または内部移行に依存して、抗体またはその抗原結合断片の、ウイルス感染を防ぐ能力を示す。このアッセイを使用して、抗体または抗原結合断片濃度およびプレインキュベーション時間を変更することによって中和動態を測定できる。
合胞体形成の阻害のための例示的アッセイを使用して、融合性ウイルス株を使用する場合に合胞体の形成を妨げることによる、ウイルスの細胞変性効果の抗体媒介性阻害を測定できる。当業者ならば、アッセイにおいて使用するための適当な融合性ウイルス株を同定できる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、当業者に公知の技術を使用して、ＲＳＶ複製を阻害またはダウンレギュレートするその能力についてアッセイできる。例えば、ＲＳＶ複製を、例えば、Johnson et al. (1997) Journal of Infectious Diseases 176:1215-1224などによって記載されるプラークアッセイによってアッセイできる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、ＲＳＶポリペプチドの発現を阻害またはダウンレギュレートするその能力についてアッセイできる。それだけには限らないが、ウエスタンブロット解析、ノーザンブロット解析およびＲＴ−ＰＣＲをはじめとする当業者に公知の技術を使用して、ＲＳＶポリペプチドの発現を測定できる。
４．抗ＲＳＶ抗体の有効性を評価するためのインビボ動物モデル
動物モデルを使用するインビボ研究を実施して、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の有効性を評価できる。動物モデルを使用するインビボ研究を実施して、このような抗体またはその抗原結合断片の投与の任意の毒性を評価できる。インビボ動物モデルを使用するものなどの種々のアッセイが、抗ＲＳＶ抗体の、ＲＳＶウイルス感染を阻害または治療する能力を評価するために、また、任意の毒性をアッセイするために当業者にとって利用可能である。抗ＲＳＶ抗体の治療効果は、ウイルス感染の動物モデルをはじめとする病原体感染の動物モデルを使用して評価できる。このような動物モデルは、当技術分野で公知であり、それだけには限らないが、ＲＳＶ感染の動物モデル、それだけには限らないが、コットンラット、近交系マウス、ウシ、フェレット、ハムスター、モルモット、チンパンジー、ヨザル、アカゲザル、アフリカミドリザル、フサオマキザル、リスザル、ボンネットモンキー、ヒヒなどが挙げられる［ＲＳＶ感染の例示的モデルについては、例えば、Prince et al. (1978) Am. J. Pathol. 93:771-791；Prince et al. (1979) Infect. Immunol. 26:764-766；Byrd and Prince (1997) Clinical Infectious Diseases 25:1363-1368（それに引用される参考文献を含む）参照のこと］。抗体または抗原結合断片または組成物の毒性のインビボ試験には、それだけには限らないが、ラット、マウス、ウシ、サルおよびウサギをはじめとする当技術分野で公知の任意の動物モデル系を使用できる。
５．抗体有効性を測定するためのインビトロおよびインビボアッセイ
ウイルス感染の治療または予防における有効性は、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の、ウイルスの複製を阻害し、感染を阻害するか、もしくはウイルスがその宿主において自身を確立するのを防ぎ、ＲＳＶ感染の罹患率を低下させ、またはＲＳＶ感染と関連している１つもしくは複数の症状を予防、寛解もしくは軽減する能力を検出することによって実証できる。治療は、例えば、ウイルス量の低減、１種または複数の症状の寛解、ＲＳＶ感染期間の低減または本明細書において提供される抗体または組成物の投与後の死亡率および／または罹病率の低下がある場合に、治療的であると考えられる。さらに、治療は、１種または複数のＲＳＶ抗原と免疫特異的に結合する１種または複数の抗体またはその抗原結合断片の投与後に、免疫応答の増大がある場合に、治療的であると考えられる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などのサイトカインの発現を誘導する能力について、インビトロおよびインビボで試験できる。当業者に公知の技術を使用して、サイトカインの発現のレベルを測定できる。例えば、サイトカインの発現のレベルを、サイトカインのＲＮＡのレベルを分析することによって、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット分析によって、サイトカインのレベルを分析することによって、例えば、免疫沈降とそれに続くウエスタンブロット解析またはＥＬＩＳＡによって測定できる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ヒト免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞）をはじめとする免疫細胞の生物活性を調節するその能力について、インビトロおよびインビボで試験できる。抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片の、免疫細胞の生物活性を調節する能力は、抗原の発現を検出すること、免疫細胞の増殖を検出すること、シグナル伝達分子の活性化を検出すること、免疫細胞のエフェクター機能を検出することまたは免疫細胞の分化を検出することによって評価できる。これらの活性を測定するために、当業者に公知の技術を使用できる。例えば、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイおよびトリパンブルー細胞カウントによって細胞増殖をアッセイできる。抗原発現は、例えば、それだけには限らないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイおよびＦＡＣＳ分析などの技術を使用する競合および非競合アッセイ系をはじめとするイムノアッセイによってアッセイできる。シグナル伝達分子の活性化は、例えば、キナーゼアッセイおよび電気泳動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によってアッセイできる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、ウイルス複製を阻害するか、またはインビトロ、エキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）およびインビボアッセイにおいてウイルス量を低減するその能力について試験できる。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、ＲＳＶ感染の経時的推移を低減するその能力についてアッセイできる。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、ＲＳＶ感染を患っているヒトの生存期間を、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８５％、少なくともまたは約９５％または少なくとももしくは約９９％増大するその能力についてアッセイできる。さらに、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶ感染を患っているヒトの入院期間を、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９５％または少なくとももしくは約９９％減少させるその能力についてアッセイできる。当業者に公知の技術を使用して、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の機能をインビボで分析できる。
本明細書において提供される方法および使用に一致して、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の予防的および／または治療的効力を実証するために、ヒト対象を用いる臨床試験が実施される必要はない。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を使用するインビトロおよび動物モデル研究を、ヒトに外挿でき、抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片の予防的および／または治療的有用性を実証するのに十分である。
Ｈ．診断的使用
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶの検出、精製および／または中和のための診断アッセイにおいて使用できる。例示的診断アッセイとして、ＲＳＶのインビトロおよびインビボ検出が挙げられる。例えば、単離された生体サンプル（例えば、痰）において、またはインビボでＲＳＶのレベルを定性的および定量的に測定するための、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を使用するアッセイが提供される。
本明細書において記載されるように、インビトロまたはインビボ検出のために、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、検出可能な部分にコンジュゲートしてよい。このような抗体を使用して、例えば、粘膜部位などのインビボ部位での、例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の局在性および／または残留性を評価できる。検出可能な部分にカップリングされている抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、当技術分野で公知の任意の適した方法によってインビボで検出できる。検出可能な部分にカップリングされている抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、抗体またはその抗原結合断片の投与後に対象から得られた組織または体液サンプルなどの単離された生体サンプルにおいて検出できる。
１．病原体感染のインビトロ検出
一般に、ＲＳＶは、対象または患者から得た生体サンプル（例えば、血液、血清、痰尿および／またはその他の適当な細胞もしくは組織）における、１種または複数のＲＳＶタンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて、対象または患者において検出できる。このようなタンパク質を、対象または患者におけるＲＳＶの有無を示すマーカーとして使用できる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、生体サンプルにおいて薬剤と結合する抗原および／またはエピトープのレベルの検出のために使用できる。
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を使用するための種々のアッセイ形式が、当業者に公知である（例えば、Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照のこと）。一般に、対象または患者におけるＲＳＶの有無は、対象または患者から得られた生体サンプルを本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と接触させることおよびサンプルにおいて抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と結合するポリペプチドのレベルを検出することによって決定できる。
いくつかの例では、アッセイは、標的ポリペプチドと結合し、サンプルの残部から標的ポリペプチドを回収するための、固相支持体上に固定化されている本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の使用を含む。次いで、リポーター基を含有し、抗体／ポリペプチド複合体と特異的に結合する検出試薬を使用して、結合しているポリペプチドを検出できる。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体または結合剤と特異的に結合するその他の薬剤と特異的に結合する結合剤を含有し得る。
いくつかの例では、ポリペプチドが、リポーター基で標識され、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片をサンプルとともにインキュベートした後に、固定化された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と結合することが可能となる競合アッセイを利用できる。サンプルの成分が標識されたポリペプチドの、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片との結合を阻害する程度は、サンプルの固定化された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片との反応性を示す。このようなアッセイ内で使用するための適したポリペプチドとして、上で記載される、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が結合する、全長ＲＳＶ ＦプロテインおよびＲＳＶ Ｆタンパク質の細胞外ドメインをはじめとするその一部が挙げられる。
固相支持体は、タンパク質が結合され得る、当業者に公知の任意の物質であり得る。例えば、固相支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースもしくはその他の適したメンブレンであり得る。支持体はまた、ガラス、グラスファイバー、ラテックスまたはポリスチレンもしくはポリビニルクロリドなどのプラスチック物質などのビーズまたはディスクであり得る。支持体はまた、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるものなどの磁性粒子または光ファイバーセンサーであり得る。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、当業者に公知の種々の技術を使用して固相支持体上に固定化してもよい。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、マイクロタイタープレート中のウェルに、またはメンブレンに、吸着によって固定化してもよい。このような場合には、吸着は、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、適したバッファー中で、固相支持体と適した時間量、接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度につれて変わるが、通常、約１時間から約１日の間である。一般に、プラスチックマイクロタイタープレート（ポリスチレンまたはポリビニルクロリドなど）のウェルを、約１０ｎｇから約１０μｇ、通常、約１００ｎｇから約１μｇの範囲の量の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と接触させることが、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の適当な量を固定化するのに十分である。
抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の固相支持体との共有結合は、一般に、まず支持体を、支持体および抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片上のヒドロキシルまたはアミノ基などの官能基と反応する二官能性試薬と反応させることによって達成できる。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ベンゾキノンを使用して、または支持体上のアルデヒド基の、結合パートナー上のアミンおよび活性水素との縮合によって、適当なポリマーコーティングを有する支持体と共有結合によって結合できる（例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13参照のこと）。
いくつかの例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が、ニトロセルロースなどのメンブレン上に固定化されている、フロースルーまたはストリップ試験形式においてアッセイを実施する。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルがメンブレンを通過するときに、固定化された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と結合する。第２の標識された結合剤は、次いで、第２の結合剤を含有する溶液がメンブレンを流れるときに、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片−ポリペプチド複合体と結合する。
提供されるＲＳＶタンパク質または抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片とともに使用するのに適しているさらなるアッセイプロトコールが、当技術分野に存在する。上記の説明は、単に例示的なものであると意図される。例えば、当業者には、上記のプロトコールを、生体サンプル中のこのようなポリペプチドと結合する抗体を検出するためにＲＳＶポリペプチドを使用するために、容易に改変できることは明らかであろう。このようなタンパク質に特異的な抗体の検出によって、ＲＳＶ感染の同定が可能となり得る。
感受性を改善するために、複数のＲＳＶタンパク質マーカーを所与のサンプル内でアッセイできる。異なるＲＳＶポリペプチドに対して特異的な抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、単一のアッセイ内で組み合わせることができることは明らかであろう。さらに、複数のプライマーまたはプローブを同時に使用できる。最適の感受性をもたらす組合せを決定するための、ＲＳＶタンパク質マーカーの選択は、日常的な実験に基づいたものであり得る。さらに、またはあるいは、本明細書において提供されるＲＳＶタンパク質のアッセイを、その他の公知のＲＳＶ抗原のアッセイと組み合わせてもよい。
２．病原体感染のインビボ検出
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、インビボ診断薬として使用できる。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、例えば、磁気共鳴イメージング、Ｘ線イメージング、コンピュータ化放射トモグラフィーおよびその他のイメージング技術などの検出法を使用して感染組織（例えば、肺におけるＲＳＶ感染）の像を提供できる。ＲＳＶ感染組織のイメージングには、例えば、抗ＲＳＶ抗体の抗体部分は、一般に、ＲＳＶと結合し（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質エピトープと結合する）、造影剤は、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片とカップリングされる常磁性物質、放射活性物質または蛍光物質などのイメージングの際に検出可能な物質となる。一般に、診断薬として使用するには、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、造影剤と直接的または間接的にカップリングする。
多数の適当な造影剤が、当技術分野で公知であり、抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片とのそれらの結合のための方法も同様である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号および同４，４７２，５０９号参照のこと）。例示的結合法は、例えば、抗体またはその抗原結合断片と結合しているＤＴＰＡのような有機キレート化剤を使用する、金属キレート複合体の使用を含む（米国特許第４，４７２，５０９号）。抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸などのカップリング剤の存在下で酵素と反応させることができる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、このようなカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製する。
インビボ画像診断法には、所与の放射性同位元素を選択する場合に利用可能な検出機器の種類が考慮される。選択される放射性同位元素は、所与の種類の機器にとって検出可能である減衰の種類を有する。インビボ診断のための放射性同位元素の選択におけるもう１つの因子は、放射性同位元素の半減期が、標的による最大の取り込み時間で依然として検出可能であるよう十分に長いが、宿主に対する有害な放射が最小にされるよう十分短いことである。通常、インビボイメージングに使用される放射性同位元素は、粒子放出を欠くが、１４０〜２５０ｋｅＶの範囲で多数の光子を生じ、これは、従来のガンマカメラによって容易に検出できる。
インビボ診断には、放射性同位元素を、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片と直接的または中間体官能基を使用することによって間接的にのいずれかで結合できる。金属イオンとして存在する放射性同位元素を抗体と結合するために使用できる例示的中間体官能基として、二官能性キレート化剤、例えば、ジエチレンジアミン五酢酸（diehylene-riaminepentaacetic acid）（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および同様の分子が挙げられる。提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と結合できる金属イオンの例として、それだけには限らないが、７２ヒ素、２１１アスタチン、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、６７銅、１５２ユーロピウム、６７ガリウム、６８ガリウム、３水素、１２３ヨウ素、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、１１１インジウム、５９鉄、３２リン、１８６レニウム、１８８レニウム、９７ルテニウム、７５セレン、３５硫黄、９９ｍテクニシウム、２０１タリウム（Thalium）、９０イットリウムおよび８９ジルコニウムが挙げられる。
磁気共鳴画像（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるように、インビボ診断の目的のために、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、常磁性同位元素を用いて標識できる。一般に、画像診断を可視化するための任意の従来法を利用できる。一般に、カメライメージングには、γおよび陽電子放出放射性同位元素が、ＭＲＩには常磁性同位元素が使用される。このような技術において特に有用である元素として、それだけには限らないが、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅが挙げられる。
例示的常磁性イオンとして、それだけには限らないが、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられる。例えば、Ｘ線イメージングにおいて有用なイオンとして、それだけには限らないが、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）およびビスマス（ＩＩＩ）が挙げられる。
投与される検出可能に標識された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の濃度は、ＲＳＶとの結合が、バックグラウンドと比較して検出可能であるよう十分である。さらに、検出可能に標識された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が、最良の標的対バックグラウンドシグナル比を得るよう、循環系から迅速に除去されることが望ましい。
インビボ診断のための検出可能に標識された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与量は、個体の年齢、性別および疾患の程度といった因子に応じて変わる。ヒトモノクローナル抗体の投与量は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２、０．１ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２または約０．１ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２で変わり得る。このような投与量は、例えば、複数の注射が与えられるかどうか、組織および当業者に公知のその他の因子に応じて変わり得る。
３．感染のモニタリング
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、インビトロおよびインビボで使用して、病原性疾患の治療の経過をモニタリングできる。したがって、例えば、ＲＳＶに感染した細胞数の増大もしくは減少または身体もしくは種々の体液中に存在するＲＳＶウイルス粒子の濃度の変化を測定できる。このような方法を使用して、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を使用して、病原性疾患を寛解することを目的とする特定の治療レジメンが有効であるかどうかを決定できる。
Ｉ．予防的および治療的使用
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片および本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する医薬組成物は、予防および治療のために対象に投与できる。例えば、提供される抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶ感染などの疾患または状態の治療のために投与できる。いくつかの例では、提供される抗体またはその抗原結合断片を、それだけには限らないが、宿主におけるＲＳＶ感染の確立の阻害または対象間のＲＳＶ伝染の阻害をはじめとするＲＳＶ感染の防止および／または伝播などの予防的使用のために対象に投与できる。いくつかの例では、提供される抗体またはその抗原結合断片を、対象におけるＲＳＶウイルス量の低減のために対象に投与できる。抗体またはその抗原結合断片はまた、ＲＳＶ感染の１種または複数の症状の予防、治療および／もしくは軽減またはＲＳＶ感染期間の低減のために対象に投与できる。
いくつかの例では、本明細書で提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与は、ＲＳＶ感染の罹患率を、抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片の不在下でのＲＳＶ感染の罹患率に対して、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％阻害する。いくつかの例では、本明細書で提供される抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片の投与は、ＲＳＶ感染の１種または複数の症状の重篤度を、抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片の不在下でのＲＳＶ感染の１種または複数の症状の重篤度に対して、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％低下させる。
１．治療の対象
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる治療のための対象または候補として、それだけには限らないが、ＲＳＶウイルスに曝露されたヒト患者などの対象、ＲＳＶ感染の１種または複数の症状を示すヒト患者などの対象およびＲＳＶ感染のリスクがあるヒト患者などの対象が挙げられる。例示的ＲＳＶウイルス感染症として、それだけには限らないが、例えば、細気管支炎および肺炎をはじめとする急性ＲＳＶ疾患、ＲＳＶ上気道感染（ＵＲＩ）および／またはＲＳＶ下気道感染（ＬＲＩ）などのＲＳＶウイルスによって引き起こされたものが挙げられる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる治療のための対象は、哺乳類である。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる治療のための対象は、霊長類である。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる治療のための対象は、ヒトである。
提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、任意のＲＳＶ媒介性疾患の治療のためにヒト患者などの対象に投与できる。例えば、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、対象に投与して、それだけには限らないが、喘息、喘鳴音、反応性気道疾患（ＲＡＤ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）をはじめとする、ＲＳＶウイルス感染と関連している１種または複数の症状または状態を軽減できる。このような疾患および状態は、医師または当業者に周知であり、容易に診断される。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、再発性ＲＳＶウイルス媒介性疾患の維持または抑制治療のために、ＲＳＶウイルス感染を有するヒト患者のような対象に投与できる。
提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、それだけには限らないが、未熟児で生まれた（早産）乳児（例えば、３８週の妊娠期間未満、例えば、２９週、３０週、３１週、３２週、３３週、３４週、３５週、３６週または３７週の妊娠期間などで生まれたヒト乳児）；乳児（例えば、３７週を超える妊娠期間で生まれたヒト乳児）、嚢胞性線維症、気管支肺異形成症、先天性心疾患、先天性免疫不全症または後天性免疫不全（例えば、ＡＩＤＳ患者）、白血病、非ホジキンリンパ腫を有する対象、免疫抑制された患者、例えば、移植（例えば、骨髄移植または腎臓移植）のレシピエントなど、または老人ホームもしくはリハビリテーションセンターにいる個人を含めた高齢の対象をはじめとする、ＲＳＶウイルス感染のリスクにあるヒト患者などの対象に投与できる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、それだけには限らないが、デイケアに参加すること、学齢のきょうだいを有すること、環境的大気汚染物質に対する曝露、先天性気道異常および／または重篤な神経筋疾患などの１種または複数の環境的危険因子に対して曝露された早産乳児または乳児などの対象に投与できる。いくつかの例では、提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、慢性肺疾患または鬱血性心不全、肺高血圧症およびチアノーゼ性心疾患をはじめとする先天性心疾患を有する、乳児または２歳未満の小児などの対象に投与できる。
種々の病原体および病原体感染についての試験は、当技術分野で公知であり、対象が、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる治療の候補であるかどうかを評価するために使用できる。例えば、ＲＳＶウイルス感染についての試験は公知であり、これとして、例えば、ウイルス培養プラークアッセイ、抗原検出試験、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験および種々の抗体血清学的試験が挙げられる。ウイルス感染についての試験は、組織から得られたサンプルまたは髄液、血液または尿などの体液サンプルで実施できる。さらなる試験として、それだけには限らないが、肺炎の徴候を示し得る胸部Ｘ線、化学スクリーニング、全血球計算または動脈血ガス（ＡＢＧ）分析などのその他の血液試験および血液中の酸素量を測定するための酸素測定が挙げられる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、１年の特定の時間の間、ＲＳＶ感染のリスクが高い対象に投与できる。ＲＳＶの季節は、通常、１０月から５月に及ぶ。乳児、高齢者または免疫不全の患者などのこの時間の間にウイルス感染に対する感受性の増大を示す対象は、ＲＳＶの季節の直前および／またはその間に、ＲＳＶ感染の予防および／または治療のために、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を投与されてもよい。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶの季節の間に１回、２回、３回、４回または５回投与する。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶの季節の前、１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月以内に、１回、２回、３回、４回または５回投与する。
２．投与量
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、治療される患者に対する望ましくない副作用の不在下で、治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で投与する。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な濃度は、本明細書において提供されるか、または当技術分野で公知のアッセイを使用することなどによって、公知のインビトロおよびインビボ系においてポリペプチドを試験することによって経験的に決定できる。
治療的に投与される有効量の抗体またはその抗原結合断片は、例えば、治療目的、投与経路および患者の状態に応じて変わる。さらに、主治医は、疾患の重篤度および種類、患者の健康、体重、性別、食事、投与時間および投与経路、その他の投薬治療およびその他の関連臨床因子をはじめとする、薬物の作用を改変すると分かっている種々の因子を考慮する。したがって、治療専門家にとって、抗体またはその抗原結合断片の投与量を滴定することおよび最適な治療効果を得るために必要に応じて投与経路を改変することが必要となる。通常、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで、抗体またはその抗原結合断片を投与する。この治療の進捗は、従来のアッセイによって容易にモニタリングされる。ウイルス感染の治療をモニタリングするための例示的アッセイは、当技術分野で公知であり、これとして、例えば、ウイルス力価アッセイが挙げられる。
一般に、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与の投与量範囲は、病原体媒介性疾患（例えば、ウイルス疾患）の症状（単数または複数）が寛解されるか、またはウイルス感染の可能性が低下する所望の効果を引き起こすのに十分に多いものである。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、対象において免疫応答を誘導するための有効な量で投与される。投与量は、過粘稠度症候群、肺水腫または鬱血性心不全などの有害な副作用を引き起こすほど多量ではない。一般に、投与量は、患者における年齢、状態、性別および疾患の程度によって変わり、当業者によって決定できる。有害な副作用が出現した場合には、投与量は、個々の医師によって調整できる。ＲＳＶ感染の予防もしくは治療および／またはＲＳＶ感染の１種もしくは複数の症状の寛解のための例示的投与量として、それだけには限らないが、約０．０１もしくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００もしくは３００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１もしくは０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１もしくは０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５もしくは０．５ｍｇ／ｋｇ、約１もしくは１ｍｇ／ｋｇ、約５もしくは５ｍｇ／ｋｇ、約１０もしくは１０ｍｇ／ｋｇ、約１５もしくは１５ｍｇ／ｋｇ、約２０もしくは２０ｍｇ／ｋｇ、約２５もしくは２５ｍｇ／ｋｇ、約３０もしくは３０ｍｇ／ｋｇ、約３５もしくは３５ｍｇ／ｋｇ、約４０もしくは４０ｍｇ／ｋｇ、約４５もしくは４５ｍｇ／ｋｇ、約５０もしくは５０ｍｇ／ｋｇ、約１００もしくは１００ｍｇ／ｋｇ、約１５０もしくは１５０ｍｇ／ｋｇ、約２００もしくは２００ｍｇ／ｋｇ、約２５０もしくは２５０ｍｇ／ｋｇまたは約３００もしくは３００ｍｇ／ｋｇなどが挙げられる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、所望の血清力価を達成するのに有効な投与量で対象に投与する。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、抗体またはその抗原結合断片の第１の用量の投与後、１日もしくは約１日、２日もしくは約２日、３日もしくは約３日、４日もしくは約４日、５日もしくは約５日、６日もしくは約６日、７日もしくは約７日、８日もしくは約８日、９日もしくは約９日、１０日もしくは約１０日、１５日もしくは約１５日、２０日もしくは約２０日、２５日もしくは約２５日、３０日もしくは約３０日、３５日もしくは約３５日または４０日もしくは約４０日および抗体またはその抗原結合断片のその後の用量の前に、少なくともまたは約１μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約２μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約３μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約４μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約５μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約６μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約７μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約８μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約９μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約１０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約１５μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約２０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約２５μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約３０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約４０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約５０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約６０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約７０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約８０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約９０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約１００μｇ／ｍｌの血清力価を達成するのに有効な量で、ＲＳＶ感染の予防もしくは治療および／またはＲＳＶ感染の１種もしくは複数の症状の寛解のために投与する。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、挿管サンプル、痰または肺から得た洗浄において所望の力価を達成するのに有効な投与量で肺デリバリーによって対象に投与する。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶ感染の予防もしくは治療および／またはＲＳＶ感染の１種もしくは複数の症状の寛解のために、抗体またはその抗原結合断片の第１の用量の投与後１０日もしくは約１０日、１５日もしくは約１５日、２０日もしくは約２０日、２５日もしくは約２５日、３０日もしくは約３０日、３５日もしくは約３５日または４０日もしくは約４０日および抗体またはその抗原結合断片のその後の用量の前に、挿管サンプルまたは肺から得た洗浄において１０ｎｇ／ｍｇ（肺タンパク質１ｍｇあたり、ｎｇの抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片）もしくは約１０ｎｇ／ｍｇ、１５ｎｇ／ｍｇもしくは約１５ｎｇ／ｍｇ、２０ｎｇ／ｍｇもしくは約２０ｎｇ／ｍｇ、２５ｎｇ／ｍｇもしくは約２５ｎｇ／ｍｇ、３０ｎｇ／ｍｇもしくは約３０ｎｇ／ｍｇ、４０ｎｇ／ｍｇもしくは約４０ｎｇ／ｍｇ、５０ｎｇ／ｍｇもしくは約５０ｎｇ／ｍｇ、６０ｎｇ／ｍｇもしくは約６０ｎｇ／ｍｇ、７０ｎｇ／ｍｇもしくは約７０ｎｇ／ｍｇ、８０ｎｇ／ｍｇもしくは約８０ｎｇ／ｍｇ、９０ｎｇ／ｍｇもしくは約９０ｎｇ／ｍｇ、１００ｎｇ／ｍｇもしくは約１００ｎｇ／ｍｇ、１１０ｎｇ／ｍｇもしくは約１１０ｎｇ／ｍｇ、１２０ｎｇ／ｍｇもしくは約１２０ｎｇ／ｍｇ、１３０ｎｇ／ｍｇもしくは約１３０ｎｇ／ｍｇ、１４０ｎｇ／ｍｇもしくは約１４０ｎｇ／ｍｇまたは１５０ｎｇ／ｍｇもしくは約１５０ｎｇ／ｍｇの力価を達成するのに有効な量で投与する。
ウイルス感染の治療については、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与量は、疾患の種類および重篤度に応じて変わり得る。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、単回用量、複数の別個の投与で、または連続注入によって投与できる。数日にわたるか、またはそれより長い反復投与については、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるか、または患者の状態において所望の改善が達成されるまで治療を反復してよい。反復投与は、治療の進捗に応じて、増大または減少した量の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含み得る。その他の投与レジメンも考慮される。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、１日あたり、または数日にわたって、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上投与する。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶ感染の予防もしくは治療および／またはＲＳＶ感染の１種もしくは複数の症状の寛解のために、抗体またはその抗原結合断片の第１の用量、第２の用量、第３の用量、第４の用量、第５の用量、第６の用量、第７の用量、第８の用量、第９の用量、第１０の用量の投与後１日もしくは約１日、２日もしくは約２日、３日もしくは約３日、４日もしくは約４日、５日もしくは約５日、６日もしくは約６日、７日もしくは約７日、８日もしくは約８日、９日もしくは約９日、１０日もしくは約１０日、１５日もしくは約１５日、２０日もしくは約２０日、２５日もしくは約２５日、３０日もしくは約３０日、３５日もしくは約３５日または４０日もしくは約４０日および抗体またはその抗原結合断片のその後の用量の前に、少なくともまたは約１μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約２μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約３μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約４μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約５μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約６μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約７μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約８μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約９μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約１０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約１５μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約２０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約２５μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約３０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約４０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約５０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約６０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約７０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約８０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約９０μｇ／ｍｌ、少なくともまたは約１００μｇ／ｍｌの血清力価を達成するのに有効な量で、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上投与する。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶ感染の予防もしくは治療および／またはＲＳＶ感染の１種もしくは複数の症状の寛解のために、抗体またはその抗原結合断片の第４の用量の投与後１日もしくは約１日、２日もしくは約２日、３日もしくは約３日、４日もしくは約４日、５日もしくは約５日、６日もしくは約６日、７日もしくは約７日、８日もしくは約８日、９日もしくは約９日、１０日もしくは約１０日、１５日もしくは約１５日、２０日もしくは約２０日、２５日もしくは約２５日、３０日もしくは約３０日、３５日もしくは約３５日または４０日もしくは約４０日および抗体またはその抗原結合断片のその後の用量の前に、少なくともまたは約７２μｇ／ｍｌの血清力価を達成するのに有効な量で、４回投与する。
いくつかの例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、一連の２回以上の投与において投与し、ここで、投与は、選択された期間、間隔を置いている。いくつかの例では、選択された期間は、少なくとももしくは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月である。
いくつかの例では、本明細書において提供される予防的に有効な量の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶの季節の直前に１回または複数回投与する。いくつかの例では、本明細書において提供される予防的に有効な量の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶの季節の直前に１回または複数回および／またはＲＳＶの季節の間に１回または複数回投与する。
特定の投与量または投与レジメンの治療効力も、例えば、１回または複数回用量の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与の前後の対象におけるウイルス力価の測定によって評価できる。投与量および／または投与の頻度は、所望の、対象におけるウイルスのクリアランスの速度に応じて改変してよい。
当業者には理解されるであろうが、最適治療レジメンは変動し、１回または複数回の治療サイクルの前後に、治療中の疾患の状態および患者の全身の健康を評価して、最適治療投与量および投与の頻度を決定することは治療法の範囲内である。任意の特定の対象には、特定の投与レジメンを、個々の必要性および医薬製剤の投与を施しているか、または監督している人の専門家としての判断に応じて経時的に調整できること、および本明細書に示される投与量は、単に例示的なものであり、その範囲を制限しようとするものではないということはさらに理解されるべきである。疾患または状態、例えば、ウイルス感染（例えば、ＲＳＶウイルス感染）の治療のために投与される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の量は、標準臨床技術によって決定できる（例えば、ウイルス力価または抗原検出アッセイ）。さらに、インビトロアッセイおよび動物モデルを使用して、最適投与量範囲の同定を補助できる。このようなアッセイは、ヒトなどの対象への投与に外挿できる投与量の範囲を提供し得る。動物モデルに基づいて最適投与量範囲を同定する方法は、当業者に周知である。
３．投与経路
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、例えば、全身投与または局所投与を含めた、ポリペプチドの投与のための当技術分野で公知の任意の方法によって対象に投与してよい。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、非経口（例えば、皮内、筋肉内の、腹腔内、静脈内の、皮下または腔内）、局所、硬膜外または粘膜に（例えば、鼻腔内または経口）などの経路によって投与できる。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、局所または経皮作用の発揮のために疾患の部位で対象に外部から投与してもよい。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物は、任意の都合のよい経路、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮もしくは皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜）を通る吸収によって投与してよい。抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物は、その他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してよい。投与様式は、ＲＳＶウイルスなどのウイルスに感染している、それで汚染されているまたはそれと関連している体液、細胞または組織と身体の領域中または領域の周囲への組成物の局所投与またはその他の投与を含み得る。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、肺などの標的臓器へ直接デリバリーするための局所経路またはエアゾール経路によって（例えば、肺のエアゾールによって）投与してよい。いくつかの例では、提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、ポンプによって［例えば、Langer (1990) Science 249:1527-1533；Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507；およびSaudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574参照のこと］または当技術分野で公知であり、本明細書において他の部分で記載される種々のポリマーの使用などによるような放出制御製剤として投与できる。いくつかの例では、放出制御または徐放系を治療標的、例えば、肺の近くに配置してもよく、したがって、全身用量のごく一部しか必要としない［例えば、Goodson、in Medical Applications of Controlled Release, 前掲, vol. 2, pp. 115-138(1984)参照のこと］。
特定の例では、提供された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、肺デリバリーによって投与する（例えば、米国特許６，０１９，９６８号、同５，９８５，３２０号、同５，９８５，３０９号、同５，９３４，２７２号、同５，８７４，０６４号、同５，８５５，９１３号、同５，２９０，５４０号および同４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３）。肺デリバリーの例示的方法は、当技術分野で公知であり、これとして、それだけには限らないが、吸入器などのエアゾール法（例えば、加圧定量吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、噴霧器（例えば、ジェットまたは超音波噴霧器）およびその他の単回呼吸液体系）、気管内点滴および吹送が挙げられる。いくつかの例では、肺デリバリーは、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する共製剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）ならびに、例えば、界面活性剤などの透過促進剤、脂肪酸、糖類、キレート化剤およびプロテアーゼ阻害剤などの酵素阻害剤の同時投与または投与によって増強できる。
当業者ならば、肺デリバリーなどの適当なデリバリー方法を、抗ＲＳＶ抗体もしくはその抗原結合断片または抗体もしくはその抗原結合断片を含有する医薬組成物の投与量の特性に基づいて選択できる。このような特性として、それだけには限らないが、溶解度、吸湿性、結晶化特性、融点、密度、粘度、流動、安定性および分解プロフィールが挙げられる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、ウイルスに対する粘膜免役化有効性を増大する。したがって、特定の例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、粘膜表面に投与する。例えば、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、経口（例えば、口内、舌下）、眼への（例えば、角膜、結膜、硝子体内、眼房内（intra-aqueous）注射）、鼻腔内への、生殖器への（例えば、膣への）、直腸への、肺への、胃へのまたは腸管への経路などによってデリバリーできる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、非経口的になど、全身に、例えば、注射によって、もしくは漸進的注入によって経時的に、または経腸的に（すなわち、消化管）投与できる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、例えば、液体溶液、ゲル、軟膏、散剤の局所設置または適用（例えば、気管支鏡またはその他の人工気道を使用する気管内点滴および吹送）によって、または吸入｛例えば、鼻腔スプレー、吸入器（例えば、加圧定量吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、噴霧器（例えば、ジェットまたは超音波噴霧器）およびその他の単回呼吸液体系｝によってなど、局所的に投与できる。投与は、ウイルスに対する曝露に先立って、またはウイルスに対する曝露に続いて達成してよい。
４．併用療法
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、疾患または状態の予防および／または治療のために、単独で、または１種もしくは複数の治療薬または治療と組み合わせて投与できる。例えば、提供された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、呼吸器ウイルス感染などのウイルス感染の予防および／または治療のために、１種または複数の抗ウイルス薬と組み合わせて投与できる。いくつかの例では、呼吸器ウイルス感染は、ＲＳＶ感染である。抗ウイルス薬は、病原体感染を低減および／または排除するための薬剤または病原体感染の１種または複数の症状を軽減する薬剤を含み得る。いくつかの例では、少なくとも１種の抗体が、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片である、複数の抗体またはその抗原結合断片（例えば、１種または複数の抗ウイルス抗体）も、組み合わせて投与できる。いくつかの例では、少なくとも１種の抗体が、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片である、複数の抗体を、ＲＳＶ感染または複数のウイルス感染症の予防および／または治療のために組み合わせて投与できる。いくつかの例では、提供される抗ＲＳＶ抗体を、ＲＳＶなどのウイルスと結合し、それを中和する１種または複数の抗ウイルス抗体と組み合わせて投与できる。いくつかの例では、提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶ感染などのウイルス感染の１種または複数の症状を阻害または軽減できる１種または複数の抗体と組み合わせて投与できる。いくつかの例では、本明細書において提供される２種以上の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、組み合わせて投与する。
１種または複数の(one or more)さらなる薬剤を、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同時に、逐次または断続的に投与してもよい。薬剤は、例えば、同一医薬組成物または同一デリバリー方法の一部として、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同時投与してもよい。いくつかの例では、薬剤を、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同時であるが、異なるデリバリー手段によって、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同時投与してもよい。薬剤はまた、組み合わせた予防上または治療上の効果を有するよう、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与とは異なる時間であるが、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与と十分に近い時間で投与してもよい。いくつかの例では、１種または複数のさらなる薬剤を、選択された時間、間隔を置いて、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与に続いて、またはそれに先だって投与する。いくつかの例では、時間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月また３ヶ月である。いくつかの例では、１種または複数のさらなる薬剤を複数回投与し、かつ／または本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体もしくはその抗原結合断片を複数回投与する。
いくつかの例では、組合せの投与は、ＲＳＶ感染の罹患率を、組合せの不在下でのＲＳＶ感染の罹患率に対して、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％阻害する。いくつかの例では、組合せの投与は、ＲＳＶ感染の１種または複数の症状の重篤度を、組合せの不在下でのＲＳＶ感染の１種または複数の症状の重篤度に対して、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％低下させる。
いくつかの例では、組合せは、ＲＳＶの、その宿主細胞受容体との結合を、組合せの不在下でのＲＳＶのその宿主細胞受容体との結合と比較して、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％阻害する。いくつかの例では、組合せは、ＲＳＶ複製を、組合せの不在下でのＲＳＶ複製に対して、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％阻害する。
ＲＳＶ感染もしくはその１種もしくは複数の症状の予防、管理、治療もしくは寛解にとって、有用であると分かっているか、または使用されるか、もしくは使用されている任意の治療を、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用できる［ＲＳＶ感染またはその１種もしくは複数の症状を予防、治療、管理または寛解するために使用されてきた治療（例えば、予防薬または治療薬）に関する情報については、例えば、Gilman et al., Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001；The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、Berkow, M. D. et al. (eds.), 17th Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, N.J.、1999；Cecil Textbook of Medicine, 20th Ed., Bennett and Plum (eds.), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996参照のこと］。このような薬剤の例として、それだけには限らないが、免疫調節薬、抗炎症薬［例えば、アドレノコルチコイド、副腎皮質ステロイド（例えば、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン，ヒドロコルチゾン）、グルココルチコイド、ステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナクおよびＣＯＸ−２阻害剤）］、鎮痛剤、ロイコトリエンおよびアゴニスト（例えば、モンテルカスト、メチルキサンチン、ザフィルルカストおよびジレウトン）、β２−アゴニスト［例えば、バンブテロール、ビトルテロール、クレンブテロール、フェノテロール、フォルモテロール、インダカテロール、イソエタリン、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、レプロテロール、リミテロール、サルブタモール（アルブテロール、ベントリン）、レボサルブタモール、サルメテロール、ツロブテロールおよびテルブタリン］などの気管支拡張剤および抗コリン作用薬（例えば、臭化イプラトロピウムおよび臭化オキシトロピウム）、スルファサラジン、ペニシラミン、ダプソン、抗ヒスタミン薬、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）および抗ウイルス薬が挙げられる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、ＲＳＶ感染の治療のために、それだけには限らないが、免疫グロブリンの静脈内注入を施すこと、酸素および液体補給または補助された呼吸を施すことをはじめとする１種または複数の治療と組み合わせて投与できる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、それだけには限らないが、グルココルチコイド、ＰＰＡＲγリガンドおよび血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などの肺成熟および肺サーファクタントタンパク質発現を調節する１種または複数の薬剤と組み合わせて投与できる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片との併用療法のために選択できる例示的抗ウイルス薬として、それだけには限らないが、抗ウイルス化合物、抗ウイルス性タンパク質、抗ウイルス性ペプチド、抗ウイルス性タンパク質コンジュゲートおよび抗ウイルス性ペプチドコンジュゲートが挙げられ、それだけには限らないが、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド類似体、免疫調節物質（例えば、インターフェロン）および免疫賦活薬を含む。抗体ならびに／または本明細書とともに提供される抗ＲＳＶ抗体および抗原結合断片を使用する併用療法は、その他の抗ＲＳＶ抗体ならびに抗ＲＳＶ抗体および抗原結合断片を用いる、抗体ならびに／または本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体および抗原結合断片との組合せと同様に考慮される。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて投与できる、ウイルス感染症の治療のための例示的抗ウイルス薬として、それだけには限らないが、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、バルガンシクロビル、イドクスウリシン、トリフルリジン、ブリブジン、シドホビル、ドコサノール、ホミビルセン、ホルカルネット、トロマンタジン、イミキモド、ポドフィロトキシン、エンテカビル、ラミブジン、テルビブジン、クレブジン、アデホビル、テノホビル、ボセプレビル（boceprevir）、テラプレビル、プレコナリル、アルビドール（arbidol）、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、イノシン、インターフェロン（例えば、インターフェロンα−２ｂ、Ｐｅｇインターフェロンα−２ａ）、リバビリン／タリバビリン（taribavirin）、アバカビル、エムトリシタビン、ラミブジン、ジダノシン、ジドブジン、アプリシタビン（apricitabine）、スタンピジン（stampidine）、エルブシタビン（elvucitabine）、ラシビル（racivir）、アムドキソビル、スタブジン、ザルシタビン、テノホビル、エファビレンツ、ネビラピン、エトラビリン、リルピビリン（rilpivirine）、ロビリド（loviride）、デラビルジン、アタザナビル、ホスアンプレナビル、ロピナビル、ダルナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、チプラナビル、アンプレナビル、インジナビル、エンフビルチド、マラビロク、ビクリビロック、ＰＲＯ１４０、イバリズマブ、ラルテグラビル、エルビテグラビル（elvitegravir）、ベビリマット（bevirimat）、ビベコン（vivecon）が挙げられ、その互変異性形態、類似体、異性体、多形、溶媒和物、誘導体または塩を含む。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて投与できる、ＲＳＶ感染症の予防および／または治療のための例示的抗ウイルス薬として、それだけには限らないが、リバビリン、ＮＩＨ−３５１（Ｇｅｍｉｎｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、組換えＲＳＶワクチン（Ａｖｉｒｏｎ）、ＲＳＶｆ−２（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）、Ｆ−５００４２（Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ）、Ｔ−７８６（Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）、ＶＰ−３６６７６（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）、ＲＦＩ−６４１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＶＰ−１４６３７（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ）、ＰＦＰ−１およびＰＦＰ−２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＲＳＶワクチン（Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、Ｆ−５００７７（Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ）およびその他の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片はまた、細胞粘膜免疫などの１種または複数の細胞性免疫を刺激できる薬剤と組み合わせて投与できる。細胞性免疫を刺激できる任意の薬剤を使用してよい。例示的免疫刺激薬として、それだけには限らないが、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、β、γ、ω）などのサイトカイン、リンホカインおよび例えば、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）などの造血成長因子、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。
抗病原体剤との併用療法のための、このような化合物の投与のための投与量は、当技術分野で公知であり、公知の臨床因子（例えば、対象の種、大きさ、体表面積、年齢、性別、免疫能力および全身の健康、投与期間および投与経路、疾患の種類および段階およびその他の抗病原体剤などのその他の治療が同時に投与されているかどうか）に従って当業者によって決定され得る。
ａ．併用療法のための抗ウイルス抗体
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、１種または複数のさらなる抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて投与できる。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体は、抗ウイルス抗体である。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体は、ウイルス抗原と結合する。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体は、ウイルスカプシドタンパク質またはウイルスエンベロープタンパク質などの表面タンパク質であるウイルス抗原と結合する。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体は、感染細胞の表面に発現されるウイルス抗原と結合する。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体は、細胞内（すなわち、感染細胞内）に発現されるウイルス抗原と結合する。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体は、呼吸器疾患を引き起こすウイルス、それだけには限らないが、ＲＳＶ、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）と結合する。抗体の混合物を含有する組成物もまた、本明細書において提供される。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用するための抗体として、それだけには限らないが、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書において提供される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）および上記のいずれかのエピトープと結合する断片が挙げられる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断と組み合わせて使用するための抗体は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用するための抗体は、鳥類および哺乳類（例えば、ヒト、ネズミ、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリ）をはじめとする任意の動物に由来するものであり得る。通常、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用するための抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用するための抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより高い多重特異性であり得る。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用するための抗体は、例えば、共有結合などによる抗体またはその抗原結合断片への任意の種類の分子の結合によって改変されている誘導抗体を含み得る。例示的抗体またはその抗原結合断片誘導体として、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドもしくはその他のタンパク質との連結によって改変されており、ＦｃＲＮ受容体に対して高い親和性を有する異種Ｆｃドメインを含有する抗体が挙げられる（例えば、米国特許第７，０８３，７８４号参照のこと）。それだけには限らないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化またはツニカマイシンの存在下での合成をはじめとする公知の技術によって任意の数の化学修飾を実施できる。さらに、誘導体は、１個または複数の非古典的アミノ酸を含有し得る。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用するための１種または複数のさらなる抗体は、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同時に、逐次または断続的に投与できる。１種または複数のさらなる抗体は、例えば、同一医薬組成物または同一デリバリー方法の一部として、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同時投与してよい。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体は、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同時であるが、異なるデリバリー手段によって、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と同時投与してもよい。１種または複数のさらなる抗体はまた、組み合わせた予防上または治療上の効果を有するよう、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与とは異なる時間であるが、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与と十分に近い時間で投与してもよい。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体を、選択された時間で分離された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の投与に続いて、またはそれに先だって投与する。いくつかの例では、時間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月また３ヶ月である。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体を複数回投与し、かつ／または本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体もしくはその抗原結合断片を複数回投与する。
ｉ．抗ＲＳＶ抗体
いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体は、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を、ＲＳＶ感染の予防および／または治療のために、１種または複数のさらなる抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて投与する。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための例示的抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片として、ＲＳＶと免疫特異的に結合し、それを中和する抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片として、ＲＳＶ Ａサブタイプおよび／またはＲＳＶ Ｂサブタイプと免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、ＲＳＶ結合タンパク質（例えば、配列番号１５２０に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶ ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットラージ構造タンパク質）（Ｌタンパク質）（例えば、配列番号１５２１に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質（例えば、配列番号１５２２に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶ核タンパク質（Ｎ）（例えば、配列番号１５２３に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶホスホプロテインＰ（例えば、配列番号１５２４に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶマトリックスタンパク質（例えば、配列番号１５２５に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶ小疎水性（ＳＨ）タンパク質（例えば、配列番号１５２６に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶ ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ、ＲＳＶ Ｆタンパク質（例えば、配列番号１５２７に示されるアミノ酸配列を有する）、ＲＳＶ Ｇタンパク質（例えば、配列番号１５２８に示されるアミノ酸配列を有する）または上記のいずれかの対立遺伝子変異体と結合する抗ＲＳＶ抗体が挙げられる。特定の例では、１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、ＲＳＶ Ｆタンパク質と結合する抗ＲＳＶ抗体が挙げられる。特定の例では、ＲＳＶ Ｆタンパク質と結合する１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体は、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩ抗原部位と結合する［例えば、Lopez et al. (1998) J. Virol. 72:6922-6928参照のこと］。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、それだけには限らないが、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、モタビズマブ（ＮＵＭＡＸ（登録商標））、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、（米国特許第５，８２４，３０７号および同６，８１８，２１６号参照のこと）、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３（米国特許第６，６８５，９４２号参照のこと）、ＲＦ−１、ＲＦ−２（米国特許第５，８１１，５２４号参照のこと）またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、モタビズマブ（ＮＵＭＡＸ（登録商標））、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１またはＲＦ−２のＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、モタビズマブ（Ｎｕｍａｘ（登録商標））、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１またはＲＦ−２の１種または複数のＣＤＲを含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、それだけには限らないが、ＭＡｂ１１５３、１１４２、１２００、１２１４、１２３７、１１２９、１１２１、１１０７、１１１２、１２６９、１２６９、１２４３［Beeler et al. (1989) J. Virology 63(7):2841-2950］、ＭＡｂ１５１［Mufson et al. (1987) J. Clin. Microbiol. 25:1635-1539］、ＭＡｂ４３−１および１３−１［Fernie et al. (1982) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 171:266-271］、ＭＡｂ１４３６Ｃ、１３０２Ａ、１３０８Ｆおよび１３３１Ｈ［Anderson et al. (1984) J. Clin. Microbiol. 19:934-936］などの抗ＲＳＶマウスモノクローナル抗体に由来する１種または複数のＣＤＲを含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片を用いる併用療法のために使用できるさらなる例示的抗体またはその抗原結合断片として、それだけには限らないが、例えば、米国特許第６，４１３，７７１号、同５，８４０，２９８号、同５，８１１，５２４号、同６，６５６，４６７号、同６，５３７，８０９号、同７，３６４，７４２号、同７，０７０，７８６号、同５，９５５，３６４号、同７，４８８，４７７号、同６，８１８，２１６号、同５，８２４，３０７号、同７，３６４，７３７号、同６，６８５，９４２号および同５，７６２，９０５号ならびに米国特許出願公開第２００７−００８２００２号、同２００５−０１７５９８６号、同２００４−０２３４５２８号、同２００６−０１９８８４０号、同２００９−０１１０６８４号、同２００６−０１５９６９５号、同２００６−００１３８２４号、同２００５−０２８８４９１号、同２００５−００１９７５８号、同２００８−０２２６６３０号、同２００９−０１３７００３号および同２００９−００９２６０９号に記載される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１０３、１１３、１２２、１３１、１３７、１４４、１４９、１５５、１６１、１６７、１７２、１７６、１７９、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０１、２０５、２１０、２１５、２２２、３５６、３６３、３６９、３７６、３８２、３８７、１６０７および１６１１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１０４、１１４、１２３、１３２、１３８、１４５、１５０、１５６、１６２、１６８、１７３、１８７、２０６、３５７、３６２、３６４、３７０、３７７、３８３、および３８８のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１０５、１１５、１２４、１６０８および１６１２のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、アミノ酸配列ＴＳＧＭＳＶＧ（配列番号１０５）、ＴＡＧＭＳＶＧ（配列番号１１５）、ＡＹＡＭＳ（配列番号１６０８）またはＧＹＴＭＨ（配列番号１６１２）を有するＶＨ ＣＤＲ１を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１０６、１２５、１３３、１５７、２２６〜２３５、３６５、３８９、３９７〜４０８、１６０９および１６１３のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、アミノ酸配列ＤＩＷＷＤＤＫＫＤＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１０６）、ＤＩＷＷＤＤＫＫＨＹＮＰＳＬＫＤ（配列番号１２５）、ＧＩＳＧＳＧＤＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１６０９）またはＳＩＴＧＧＳＮＦＩＮＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号１６１３）を有するＶＨ ＣＤＲ２を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１０７、１１６、１２６、１３９、１８８、２３６〜２３８、３７１、１６１０および１６１４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、アミノ酸配列ＳＭＩＴＮＷＹＦＤＶ（配列番号１０７）、ＤＭＩＦＮＦＹＦＤＶ（配列番号１２６）、ＨＬＰＤＹＷＮＬＤＹＴＲＦＦＹＹＭＤＶ（配列番号１６１０）またはＡＰＩＡＰＰＹＦＤＨ（配列番号１６１４）を有するＶＨ ＣＤＲ３を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１０８、１１７、１２７、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１６９、１７４、１７７、１８０、１８３、１９１、１９５、１９９、２０２、２０７、２１１、２１６、２２０、２２３、３５８、３６６、３７２、３７８、３８４、３９０、３９３、１６１５、１６１９および１６２３のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１０９、１１８、１２８、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、１６５、１７０、１７５、１７８、１８１、１８４、１９２、１９６、２００、２０３、２０８、２１２、２１７、２２１、２２４、３５９、３６７、３７３、３７９、３８５、３９１および３９４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１１０、１１９、１２９、１４２、１５４、１６６、２３９〜２５５、２５７〜２９７、２９９〜３１４、３７４、３８０、３９５、４０９〜５４４、１６１６、１６２０および１６２４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、アミノ酸配列ＫＣＱＬＳＶＧＹＭＨ（配列番号１１０）、ＳＡＳＳＲＶＧＹＭＨ（配列番号１５４）、ＲＡＴＱＳＩＳＳＮＹＬＡ（配列番号１６１６）、ＫＡＳＱＮＩＮＤＮＬＡ（配列番号１６２０）またはＲＡＴＱＳＶＳＮＦＬＮ（配列番号１６２４）を有するＶＬ ＣＤＲ１を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１１１、１２０、１３６、１４３、１６０、１７１、１８５、２１８、２２５、３１５〜３５５、３６０、３６８、３７５、３８１、３８６、３９２、３９６、５４５〜１５０９、１６１７、１６２１および１６２５のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１１１）、ＤＴＬＬＬＤＳ（配列番号２１８）、ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号１６１７）、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１６２１）またはＤＡＳＴＳＱＳ（配列番号１６２５）を有するＶＬ ＣＤＲ２を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、配列番号１１２、１２１、１９３、１５１０〜１５１１、１６１８、１６２２および１６２６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。特定の例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、アミノ酸配列ＦＱＧＳＧＹＰＦＴ（配列番号１１２）、ＱＱＹＤＩＳＰＹＴ（配列番号１６１８）、ＱＱＹＧＧＳＰＹＴ（配列番号１６２２）、またはＱＡＳＩＮＴＰＬ（配列番号１６２６）を有するＶＬ ＣＤＲ３を含有する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ＲＳＶ過免疫グロブリン［ＲＳＶ ＩＶＩＧ；ＲｅｓｐｉＧａｍ（登録商標）；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ；例えば、Groothius et al. (1993) New Eng. J. Med 329:1524-1530参照のこと］などの、抗ＲＳＶ抗体に対して濃縮された過免疫血清または免疫グロブリンと組み合わせて投与できる。
ｉｉ．その他の呼吸器ウイルスに対する抗体
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体として、例えば、抗ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）抗体、抗パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）抗体、抗鳥類ニューモウイルス（ＡＰＶ）抗体または当技術分野で公知のその他の抗ウイルス抗体の中から選択されるＲＳＶ以外の呼吸器ウイルスに対する抗体もしくはその抗原結合断片が挙げられる。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体は、抗ＰＩＶ抗体、すなわち、例えば、ＰＩＶヌクレオカプシドホスホプロテイン、ＰＩＶ融合（Ｆ）タンパク質、ＰＩＶホスホプロテイン、ＰＩＶラージ（Ｌ）タンパク質、ＰＩＶマトリックス（Ｍ）タンパク質、ＰＩＶ血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質、ＰＩＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＩＶ Ｙ１タンパク質、ＰＩＶ Ｄタンパク質、ＰＩＶ Ｃタンパク質または上記のいずれかの対立遺伝子変異体などのＰＩＶ抗原と免疫特異的に結合する抗体である。特定の例では、ＰＩＶ抗原は、ＰＩＶ Ｆタンパク質である。いくつかの例では、抗ＰＩＶ抗体は、ヒトＰＩＶ１型、ヒトＰＩＶ２型、ヒトＰＩＶ３型および／またはヒトＰＩＶ４型の抗原と免疫特異的に結合する抗体である。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を用いる併用療法のための１種または複数のさらなる抗ウイルス抗体は、抗ｈＭＰＶ抗体、すなわち、例えば、ｈＭＰＶ核タンパク質、ｈＭＰＶホスホプロテイン、ｈＭＰＶマトリックスタンパク質、ｈＭＰＶ小疎水性タンパク質、ｈＭＰＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質、ｈＭＰＶ Ｇタンパク質または上記のいずれかの対立遺伝子変異体などのｈＭＰＶ抗原と免疫特異的に結合する抗体である。特定の例では、ｈＭＰＶ抗原は、ＰＩＶ Ｆタンパク質である。いくつかの例では、抗ｈＭＰＶ抗体は、ｈＭＰＶ Ａ型および／またはｈＭＰＶ Ｂ型の抗原と免疫特異的に結合する抗体である。いくつかの例では、抗ｈＭＰＶ抗体は、ｈＭＰＶサブタイプＡ１および／またはＡ２および／またはｈＭＰＶサブタイプＢ１および／またはＢ２の抗原と免疫特異的に結合する抗体である。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて投与される抗体は、任意の種類の当技術分野で公知の抗体または抗原結合断片であり得る。例えば、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて投与される抗体またはその抗原結合断片として、それだけには限らないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、非ヒト抗体、組換えによって製造された抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、細胞内抗体およびそれだけには限らないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体または上記のいずれかの抗原結合断片などの抗体断片が挙げられる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体と組み合わせて投与される抗体として、任意の免疫グロブリン種（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）のメンバーを挙げることができる。
いくつかの例では、抗ウイルス抗体または抗原結合断片の組合せの投与は、ＲＳＶ感染の罹患率を、抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片の不在下でのＲＳＶ感染の罹患率に対して少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％阻害する。いくつかの例では、抗ウイルス抗体または抗原結合断片の組合せの投与は、ＲＳＶ感染の１種または複数の症状の重篤度を、抗ウイルス抗体または抗原結合断片の組合せの存在下でのＲＳＶ感染の１種または複数の症状の重篤度に対して少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％低下させる。
いくつかの例では、抗ウイルス抗体または抗原結合断片の組合せは、ＲＳＶの、その宿主細胞受容体との結合を、抗ウイルス抗体または抗原結合断片の組合せの不在下でのＲＳＶのその宿主細胞受容体との結合と比較して、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％阻害する。いくつかの例では、抗ウイルス抗体または抗原結合断片の組合せは、ＲＳＶ複製を、抗ウイルス抗体または抗原結合断片の組合せの不在下でのＲＳＶ複製に対して少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約１５％または少なくとももしくは約１０％阻害する。
５．遺伝子療法
いくつかの例では、抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体をコードする配列を含む核酸を投与して、遺伝子療法によって、ＲＳＶ感染と関連している１種または複数の症状を治療、予防または寛解する。遺伝子療法とは、発現された核酸または発現可能な核酸の対象への投与によって実施される治療を指す。この例では、核酸は、そのコードされる抗体またはその抗原結合断片を生成し、これが予防的または治療的効果を媒介する。
当技術分野で利用可能な遺伝子療法のための方法のいずれも、抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体をコードする核酸の投与のために使用できる。例示的方法を以下に記載する。
遺伝子療法の方法の一般的な概説については、例えば、Goldspiel et al. (1993) Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu (1991) Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan (1993) Science 260:926-932；Morgan and Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；およびTIBTECH 11(5):155-215を参照のこと。使用できる組換えＤＮＡ技術の技術分野で一般に知られる方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual、Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
いくつかの例では、本明細書において提供される組成物は、抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体をコードする核酸を含有し、これでは、核酸は、適した宿主において、抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸は、抗体コーディング領域と機能し得る形で連結されている異種プロモーターなどのプロモーターを有し、前記プロモーターは誘導可能か、または構成的であり、所望により、組織特異的である。別の特定の実施形態では、抗体コード配列および任意のその他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域によってフランキングされており、したがって、抗体をコードする核酸の染色体内発現を提供する核酸分子を使用する［Koller and Smithies (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstra et al. (1989) Nature 342:435-438］。いくつかの例では、発現された抗体分子は、一本鎖抗体である。いくつかの例では、核酸配列は、抗体の重鎖および軽鎖またはその断片をコードする配列を含む。特定の例では、核酸配列は、抗ＲＳＶ Ｆａｂ断片をコードする配列を含む。特定の例では、核酸配列は、全長抗ＲＳＶ抗体をコードする配列を含む。いくつかの例では、コードされる抗ＲＳＶ抗体は、キメラ抗体である。
対象への核酸のデリバリーは、対象が、核酸または核酸を保持するベクターに対して直接的に曝露される直接、または細胞を、インビトロで核酸を用いて、まず形質転換し、次いで、対象に移植する間接のいずれかであり得る。これら２つのアプローチは、それぞれ、インビボまたはエキソビボ遺伝子療法として知られている。
いくつかの例では、核酸配列は、インビボで直接的に投与され、そこで、発現され、コードされた生成物を生成する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかによって、例えば、それらを適当な核酸発現ベクターの一部として構築することおよびそれを、例えば、欠陥のある、または弱毒化されたレトロウイルスまたはその他のウイルスベクターを使用する感染によって（米国特許第４，９８０，２８６号）、または裸のＤＮＡの直接注射によって、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体を用いてコーティングすることもしくは薬剤をトランスフェクトすること、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセル中へのカプセル封入の使用によって、またはそれらを、核に入ることが分かっているペプチドと連結して投与することによって、受容体媒介性エンドサイトーシス［例えば、Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照のこと］を受けるリガンドと連結して、例えば、受容体を特異的に発現する標的細胞種に投与することによって、それらが細胞内になるように投与することによって達成できる。いくつかの例では、リガンドが、融合性ウイルスペプチドを含有し、エンドソームを破壊する核酸−リガンド複合体が形成され、核酸がリソソーム分解を避けることが可能となり得る。いくつかの例では、特定の受容体をターゲッティングすることによって、細胞特異的取り込みおよび発現のために、インビボで核酸をターゲッティングできる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；ＷＯ９３／１４１８８およびＷＯ９３／２０２２１参照のこと）。あるいは、核酸を、細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込んでもよい［Koller and Smithies (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；およびZijlstra et al. (1989) Nature 342:435-438］。
いくつかの例では、抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用できる［例えば、Miller et al. (1993) Meth. Enzymol. 217:581-599参照のこと］。レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みのために必要な成分を含有する。遺伝子療法において使用される抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸配列を、１種または複数のベクター中にクローニングし、これによって、対象への遺伝子のデリバリーが容易になる。レトロウイルスベクターについてのより詳細は、例えば、Boesen et al. (1994) Biotherapy 6:291-302において見出すことができる。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を示すその他の参考文献として、例えば、Clowes et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:644-651；Klein et al. (1994) Blood 83:1467-1473；Salmons and Gunzberg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141；およびGrossman and Wilson (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114が挙げられる。
アデノウイルスもまた、遺伝子療法において使用できるウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸器上皮へ遺伝子をデリバリーするための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、呼吸器上皮に天然に感染し、そこで、軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースのデリバリー系のその他の標的として、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉が挙げられる。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できるという利点を有する。Kozarsky and Wilson (1993) Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503に、アデノウイルスベースの遺伝子療法の概説が示されている。Bout et al. (1994) Human Gene Therapy 5:3-10は、アカゲザルの呼吸器上皮へ遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用のその他の例は、例えば、Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434；Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155； Mastrangeli et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:225-234；ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９；およびWang et al. (1995) Gene Therapy 2:775-783に見出すことができる。特定の例では、アデノウイルスベクターを使用して、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体をコードする核酸をデリバリーする。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子療法において使用できる［Walsh et al. (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300；および米国特許第５，４３６，１４６号］。特定の例では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体をコードする核酸をデリバリーする。
遺伝子療法の別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションまたはウイルス感染といった方法によって、組織培養において遺伝子を細胞に移入することを含む。一般に、移入する方法は、細胞への選択マーカーの移入を含む。次いで、細胞を選択下におき、取り上げられ、移入された遺伝子を発現する細胞を単離する。次いで、遺伝子を発現する細胞を対象にデリバリーする。
いくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体をコードする核酸を、細胞に導入し、その後、得られた組換え細胞をインビボで投与する。このような導入は、それだけには限らないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロセル媒介性遺伝子導入およびスフェロプラスト融合をはじめとする当技術分野で公知の任意の方法によって実施できる。外来遺伝子を細胞に導入するための多数の技術が当技術分野で公知であり［例えば、Loeffler and Behr (1993) Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohen et al. (1993) Meth. Enzymol. 217:618-644； Cline (1985) Pharmacol. Ther. 29:69-92参照のこと］、レシピエント細胞の必要な発達および生理学的機能が破壊されないならば、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体をコードする核酸の投与のために使用できる。技術は、細胞への核酸の安定な移入を提供し、その結果、核酸は、細胞によって発現可能であり、通常、遺伝的であり、その細胞後代によって発現可能である。
得られた組換え細胞は、当技術分野で公知の種々の方法によって対象にデリバリーできる。組換え血液細胞（例えば、造血幹または前駆細胞）を、静脈内に投与してよい。投与のための細胞量は、例えば、所望の予防的および／または治療的効果および患者の状態をはじめとする種々の因子に応じて変わり、当業者によって決定され得る。
遺伝子療法を目的として、核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の利用可能な細胞種を包含し、これとして、それだけには限らないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；種々の幹または前駆細胞、特に、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血および胎児肝臓から得られるような造血幹または前駆細胞が挙げられる。特定の例では、遺伝子療法のために使用される細胞は、対象にとって自己である。
遺伝子療法において組換え細胞を使用するいくつかの例では、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体、その抗原結合断片および／または誘導体をコードする核酸配列を、それらが細胞またはその後代によって発現可能であるように細胞に導入し、次いで、治療効果のために組換え細胞をインビボで投与する。特定の例では、幹または前駆細胞を使用する。インビトロで単離および維持できる任意の幹および／または前駆細胞を使用できる［例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０８５９８；Stemple and Anderson (1992) Cell 7 1:973-985；Rheinwald (1980) Meth. Cell Bio. 21A:229；およびPittelkow and Scott (1986) Mayo Clinic Proc. 61:771参照のこと］。
特定の例では、遺伝子療法を目的として導入される核酸は、核酸の発現が、適当な転写の誘導物質の有無を制御することによって制御可能であるようにコーディング領域と機能し得る形で連結されている誘導プロモーターを含有する。
Ｊ．医薬組成物、組合せおよび製造品／キット
１．医薬組成物
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。医薬組成物は、治療的、予防的および／または診断的適用に使用できる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、医薬上許容される担体または希釈液とともに製剤され得る。一般に、このような医薬組成物は、抗体またはその抗原結合断片の生物学的特性、例えば、その特異的エピトープとの結合（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質上のエピトープとの結合）を大幅に損なわない成分を利用する。各成分は、その他の成分と適合しており、患者にとって有害ではないという意味で医薬上および生理学上許容される。製剤は、それだけには限らないが、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁液（例えば、注射用、摂取用および局所製剤（例えば、点眼薬、ゲルまたは軟膏）を含む）、エアゾール（例えば、鼻腔スプレー）、リポソーム、坐剤、注射用および不溶解性溶液および徐放形態をはじめとする、単位投与形で提示され得、薬学の技術分野で周知の方法によって調製され得ることが好都合である。例えば、Gilman、et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press；およびRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990)、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.；Avis、et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications, Dekker, NY；Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY；およびLieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems, Dekker, NY参照のこと。全身に投与される場合には、治療用組成物は、無菌であり、発熱物質不含であり、一般に、微粒子状物質を含まず、ｐＨ、等張性および安定性を十分に考慮した非経口的に許容される溶液中にある。これらの条件は、当業者には公知である。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は、当業者には周知であるか、明らかとなり、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Formerly Remington's Pharmaceutical Sciences)」, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)により詳細に記載されている。
本明細書において提供される医薬組成物は、種々の形態で、例えば、固体、半固体、液体、粉末、水性または凍結乾燥した形態であり得る。適した薬剤担体の例は、当技術分野で公知であり、中でも、それだけには限らないが、水、緩衝剤、生理食塩水溶液、リン酸緩衝生理食塩水溶液、種々の種類の湿潤剤、滅菌溶液、アルコール、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール、ゼラチン、グリセリン、炭水化物、例えば、ラクトース、スクロース、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、粉末が挙げられる。本明細書において提供される医薬組成物は、例えば、抗酸化剤、保存料、抗菌薬、鎮痛薬、結合剤、崩壊剤、着色剤、希釈剤、賦形剤、増量剤、流動促進剤、可溶化剤、安定化剤、等張化剤、媒体(vehicle)、粘性剤、香味剤、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、乳化剤および沈殿防止剤、溶媒および結晶性セルロース、微晶質セルロース、クエン酸、デキストリン、デキストロース、液状グルコース、乳酸、ラクトース、塩化マグネシウム、メタリン酸カリウム、デンプンなどの種々の成分をはじめとするその他の添加物を含有し得る［一般に、Alfonso R. Gennaro (2000) Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore、MD: Lippincott Williams & Wilkins参照のこと］。このような担体および／または添加剤は、従来の方法によって製剤でき、適した用量で対象に投与できる。脂質などの安定化剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマーおよびキレート化剤は、組成物を身体内での分解から保存し得る。
使用するのに適した医薬組成物として、１種または複数の抗ＲＳＶ抗体が、その意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物が挙げられる。治療上有効な量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。治療上有効な投与量は、本明細書において記載されるインビトロおよびインビボ法を使用することによって決定できる。したがって、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、医薬品中では、投与のために単位用量形態で存在し得る。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適した担体中で再構成してもよい。この技術は、従来の免疫グロブリンおよびタンパク質調製物に関して有効であることがわかっており、当技術分野で公知の凍結乾燥および再構成技術を使用できる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、制御放出または徐放組成物として提供できる。本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片の制御放出または徐放を達成できる丸剤およびカプセル剤の製剤用のポリマー材料は、当技術分野で公知である［例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)； Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley、New York (1984)； Ranger and Peppas (1983) J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61参照のこと；Levy et al. (1985) Science 228:190； During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351；Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 7 1:105；米国特許第５，６７９，３７７号、同５，９１６，５９７号、同５，９１２，０１５号、同５，９８９，４６３号、同５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１５１５４およびＷＯ９９／２０２５３も参照のこと］。徐放製剤において使用されるポリマーの例として、それだけには限らないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセタート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが挙げられる。一般に、徐放製剤において使用されるポリマーは、不活性であり、浸出可能な不純物を含まず、保存に対して安定であり、無菌であり、生分解性である。徐放製剤の製造のための当技術分野で公知の任意の技術を使用して、本明細書において提供される１種または複数の抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片を含有する徐放製剤を製造できる。
いくつかの例では、医薬組成物は、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と、１種または複数のさらなる抗体とを含有する。いくつかの例では、１種または複数のさらなる抗体として、それだけには限らないが、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））およびその誘導体、例えば、それだけには限らないが、モタビズマブ（ＮＵＭＡＸ（登録商標））、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８ＲおよびＡ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ（米国特許第５，８２４，３０７号および同６，８１８，２１６号参照のこと）、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３（例えば、米国特許第５，８２４，３０７号、同６，６８５，９４２号および同６，８１８，２１６号）、ヒト抗ＲＳＶ抗体、例えば、それだけには限らないが、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９（すなわち、Ｆａｂ１９）、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１、ＲＦ−２（例えば、米国特許第６，６８５，９４２号および同５，８１１，５２４号参照のこと）、抗ＲＳＶマウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、例えば、それだけには限らないが、ＭＡｂ１１５３、１１４２、１２００、１２１４、１２３７、１１２９、１１２１、１１０７、１１１２、１２６９、１２６９、１２４３［Beeler et al. (1989) J. Virology 63(7):2841-2950］、ＭＡｂ１５１［Mufson et al. (1987) J. Clin. Microbiol. 25:1635-1539］、ＭＡｂ４３−１および１３−１［Fernie et al. (1982) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 171:266-271］、ＭＡｂ１４３６Ｃ、１３０２Ａ、１３０８Ｆおよび１３３１Ｈ［Anderson et al. (1984) J. Clin. Microbiol. 19:934-936］またはそれらのその抗原結合断片が挙げられる。本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する医薬組成物において使用され得るさらなる例示的抗体またはその抗原結合断片として、それだけには限らないが、例えば、米国特許第６，４１３，７７１号、同５，８４０，２９８号、同５，８１１，５２４号、同６，６５６，４６７号、同６，５３７，８０９号、同７，３６４，７４２号、同７，０７０，７８６号、同５，９５５，３６４号、同７，４８８，４７７号、同６，８１８，２１６号、同５，８２４，３０７号、同７，３６４，７３７号、同６，６８５，９４２号および同５，７６２，９０５号ならびに米国特許出願公開第２００７−００８２００２号、同２００５−０１７５９８６号、同２００４−０２３４５２８号、同２００６−０１９８８４０号、同２００９−０１１０６８４号、同２００６−０１５９６９５号、同２００６−００１３８２４号、同２００５−０２８８４９１号、同２００５−００１９７５８号、同２００８−０２２６６３０号、同２００９−０１３７００３号および同２００９−００９２６０９号に記載される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
２．製造品／キット
抗ＲＳＶ抗体または抗ＲＳＶ抗体をコードする核酸またはその誘導体もしくは生物学的に活性な部分の医薬組成物を、パッケージング物質と、ＲＳＶ媒介性疾患もしくは障害の予防（すなわち、ワクチン接種、受動免疫）および／または治療にとって有効である医薬組成物と、抗体もしくは核酸分子が、疾患もしくは障害のワクチン接種および／または治療のために使用されることを示す標識とを含有する製造品としてパッケージングできる。医薬組成物は、単回用量または複数回用量のための一定量の医薬組成物を含有する単位投与形でパッケージングできる。パッケージングされた組成物は、提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含有する医薬組成物の凍結乾燥粉末を含有してもよく、これは、投与の前に再構成できる（例えば、水または生理食塩水を用いて）。
本明細書において提供される製造品は、パッケージング物質を含有する。医薬製剤のパッケージングにおいて使用するためのパッケージング物質は、当業者に周知である。薬剤パッケージング物質の例として、それだけには限らないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、吸入器（例えば、加圧定量吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、噴霧器（例えば、ジェットまたは超音波噴霧器）およびその他の単回呼吸液体系）、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトルおよび選択された製剤および意図される投与様式および治療様式に適した任意のパッケージング物質が挙げられる。医薬組成物はまた、感染からの避妊のために使用されるバリアまたはその他の保護装置に組み込むことができる、それに適用できる、またはそれにコーティングできる。
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片、その抗体をコードする核酸分子、医薬組成物または組合せはまた、キットとして提供され得る。キットは、所望により、使用のための説明書、装置およびさらなる試薬（例えば、組成物の希釈および／または凍結乾燥タンパク質の再構成のための滅菌水または生理食塩水溶液）などの１種または複数の成分と、方法を実施するための、チューブ、容器およびシリンジなどの成分とを含み得る。例示的キットは、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含むことができ、所望により、使用のための説明書、対象に抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を投与するための装置、対象において、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を検出するための装置、対象から得られたサンプルにおいて、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を検出するための装置および対象にさらなる治療薬を投与するための装置を含み得る。
キットは、所望により、説明書を含み得る。説明書は、通常、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片、所望により、キットに含まれるその他の成分および抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を投与するための、対象の適切な状態、適切な投与量、投与レジメンおよび適切な投与法を決定する方法を含めた投与する方法を説明する有形の表現を含む。説明書はまた、治療時間の期間にわたって対象をモニタリングするためのガイダンスを含み得る。
キットはまた、診断のための本明細書に記載される医薬組成物および品目を含み得る。例えば、このようなキットは、対象において選択された抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の濃度、量または活性を測定するための品目を含み得る。
いくつかの例では、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、単離された生体サンプル（例えば、対象から得られた血液、痰、洗浄、肺挿管サンプル、唾液、尿またはリンパなどの液体サンプル）においてＲＳＶを検出するための診断キットにおいて提供される。いくつかの例では、診断キットは、１種または複数の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片および／または１種または複数の対照抗体（すなわち、非ＲＳＶ結合抗体）のパネルを含有し、これでは、パネル中の１種または複数の抗体は、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体または抗原結合断片である。
本明細書において提供されるキットはまた、対象に抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を投与する装置も含み得る。対象に医薬を投与するための当技術分野で公知の種々の装置のいずれも、本明細書において提供されるキットに含まれ得る。例示的装置として、それだけには限らないが、吸入器（例えば、加圧定量吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、噴霧器（例えば、ジェットまたは超音波噴霧器）およびその他の単回呼吸液体系）、皮下針、静脈針、カテーテルおよび点眼器などの液体ディスペンサーが挙げられる。通常、キットの抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を投与するための装置は、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の所望の投与方法と適合する。例えば、肺投与によってデリバリーされる抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片は、吸入器または噴霧器とともに、または吸入器または噴霧器中に含有されてキット中に含まれ得る。
３．組合せ
本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と、第２の抗ＲＳＶ抗体もしくはその抗原結合断片またはその他の治療薬または診断薬などの第２の薬剤との組合せが提供される。組合せは、本明細書において提供される方法に従って、その治療を達成するための任意の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片または試薬を含み得る。例えば、組合せは、任意の抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片と、抗ウイルス薬とを含み得る。組合せはまた、１種または複数のさらなる治療用抗体とともに、本明細書において提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含み得る。提供される抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片の組合せはまた、抗ＲＳＶ抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において記載される抗ＲＳＶ抗体もしくはその抗原結合断片をコードする核酸を含有する宿主細胞を含有する医薬組成物を含有し得る。本明細書において提供される組合せは、単一組成物として、または別個の組成物において製剤できる。
Ｋ．実施例
以下の実施例は、単に例示目的で含まれるものであって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現
この実施例では、呼吸器合胞体ウイルスＡ２株由来のＲＳＶ融合タンパク質（Ｆタンパク質）を発現させ、融合糖タンパク質のＦ０およびＦ１サブユニットの両方を認識する抗ＲＳＶモノクローナル抗体クローン２Ｆ７を使用してＥＬＩＳＡプレート上で捕獲することによって精製した。第１の実施例では、細胞外ドメインのみを含有する組換えＲＳＶ Ｆタンパク質（配列番号２５）をクローニングし、２９３Ｆ細胞において発現させた。第２の実施例では、ＨＥｐ−２細胞をＲＳＶ Ａ２株に感染させることによって、天然ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現させた（配列番号１６２９）。
Ａ．組換えＲＳＶ Ｆタンパク質
この実施例では、Ａ２ ＲＳＶ株由来のＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、発現させた。細胞外ドメイン（全長ＲＳＶ Ａ２ Ｆタンパク質は、配列番号１６３０に示されている）のみを含有するＲＳＶ Ａ２ Ｆ遺伝子（配列番号２１）を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）によって標準ＤＮＡ合成プロトコールに従って合成した。ＲＳＶ Ａ２ Ｆ遺伝子を、Ｋｏｚａｋ配列（配列番号２１のヌクレオチド７〜１６）、ｃ−ｍｙｃ配列（配列番号２１のヌクレオチド１６００〜１６２９）および６Ｘ−Ｈｉｓタグ（配列番号２１のヌクレオチド１６４５〜１６６２）を含有するよう操作した。さらに、発現ベクターへのクローニングを可能にするために、ＮｈｅＩ（配列番号２２）およびＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号２３）制限部位を、それぞれ、５’および３’末端に操作した。標準分子生物学技術を使用してＤＮＡを消化し、同様に消化した哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ｃ（配列番号２４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にライゲーションした。ＲＳＶ Ａ２ Ｆ遺伝子を含有するベクターを、エレクトロコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）中に形質転換した。個々のコロニーを選択し、増殖させ、プラスミドＤＮＡを精製した。単離されたベクター中のＲＳＶ Ａ２ Ｆ遺伝子インサートの存在を、ＤＮＡ塩基配列決定法によって確認し、インサートを含有するクローンを使用して、ＤＮＡの大規模調製物を製造した（Ｍｅｇａｐｒｅｐキット、Ｑｉａｇｅｎ）。
ＲＳＶ Ａ２ Ｆタンパク質を、製造業者の説明書に従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して哺乳類細胞において発現させた。手短には、３×１０７個の細胞を、３０μｇのＲＳＶ Ａ２ Ｆ／ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）ＣプラスミドＤＮＡおよび５μｇのｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに同時トランスフェクトし、３７℃で７２時間インキュベートした。細胞を、遠心分離によってペレットにし、３ｍＬの冷溶解バッファー（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害薬カクテル（カタログ番号ｓｃ−２９１３１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐＨ８）を、３×１０７個のＲＳＶ Ｆ−トランスフェクトされた２９３−Ｆ細胞ごとに加えた。混合物を、４℃で３０分間振盪させ、続いて、１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。清澄化された上清を、新しいチューブに移し、使用の準備まで−８０℃で凍結させた。ＥＬＩＳＡプレート上での捕獲に先立って、上清を解凍し、短時間遠心分離し、０．８％脱脂粉乳（０．４％脱脂粉乳の終濃度）を含有するＰＢＳを用いて１：１ｖ／ｖ希釈した。
Ｂ．天然(native)ＲＳＶ Ｆタンパク質
この実施例では、ＲＳＶ Ａ２株由来の天然ＲＳＶ Ｆタンパク質（配列番号１６２９に示されるアミノ酸）を、以下のように、ＲＳＶに感染したＨＥｐ−２細胞から精製した。手短には、ＨＥｐ−２細胞を、完全ＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ３０−２００３；１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含有）を使用して１０層細胞培養スタッカー（Ｃｏｒｎｉｎｇ３２７０）に播種し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞が８０％コンフルエンスに達すると、ＨＥｐ−２単層を、ＲＳＶ Ａ２ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−１５４０）に、０．０１〜０．１の多重感染度（ＭＯＩ）で感染させた。感染細胞を、明らかな細胞合胞体が観察されるまで、３〜５日間培養した。感染細胞をＰＢＳで１回洗浄し、培養スタッカーに、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５００ｍＬのＰＢＳを加えることによって細胞を採取し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を５０ｍＬのコニカルチューブ（チューブあたり５×１０７個細胞）に回収し、遠心分離によってペレットにした。細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。さらに処理されるまで、細胞ペレットを−２０℃で保存した。凍結細胞を解凍し、各細胞ペレットに、３ｍＬの冷溶解バッファー［３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害薬カクテル（カタログ番号ｓｃ−２９１３１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐＨ８］を加えた。細胞を、４℃で３０分間振盪し、続いて、超音波処理（１０％出力で各１０秒間に３パルス）し、最後に、４℃、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。清澄化された上清を、新しいチューブに移し、使用の準備まで−８０℃で凍結させた。ＥＬＩＳＡプレート上での捕獲に先立って、上清を解凍し、短時間遠心分離し、１：２０００希釈した。
Ｃ．抗ＲＳＶ ｍＡｂを用いる捕獲
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中、抗ＲＳＶ ｍＡｂ（カタログ番号ＮＢ１１０−３７２４６、クローン２Ｆ７、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の１：４００希釈の５０μＬ／ウェルを使用して、コーティングした。結合していない抗体を除去し、プレートを直ちにＥＬＩＳＡに使用した（実施例２および４参照のこと）。あるいは、プレートを−２０℃で最大２週間凍結した。使用の直前に、プレートを、１×ＰＢＳ中の、４％脱脂粉乳を用いて、３７℃で２時間ブロッキングした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（洗浄バッファー）で２回洗浄し、その後、溶解物を加えた。ＲＳＶ Ｆタンパク質（組換えまたは天然のいずれか）の捕獲は、抗ＲＳＶ ｍＡｂ ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、上記の調製した溶解物のいずれか５０μＬを加えることおよび３７℃で２時間インキュベートすることによって達成する。
ＥＢＶによって形質転換されたＢ細胞からの抗ＲＳＶ Ｆａｂ抗体の単離
この実施例では、ＲＳＶ Ｆタンパク質との結合、続いて、インビトロ抗体生成についてスクリーニングされた、刺激されたエプスタイン・バーウイルスによって形質転換されたドナー記憶Ｂ細胞から抗ＲＳＶ抗体を単離した。
Ａ．ドナー末梢血単核細胞の精製
末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を、小児との接触を介してＲＳＶに曝露されている可能性がある保育者から入手した。ＰＢＭＣを、製造業者の説明書に従って、フィコールハイパックでの密度遠心分離によって単離した。
１．ＣＤ２２＋単離およびＣＤ２２＋Ｂ細胞の活性化
３．２×１０６個ＣＤ２２＋Ｂ細胞を、ＣＤ２２磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４６−４０１）およびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）を使用してドナーＰＢＭＣから単離した。単離されたＣＤ２２＋Ｂ細胞を、１０％熱不活化低ＩｇＧウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６２５０−０７８）、１％抗生物質（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＶ３００１０）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２３９．０１）および１％Ｌ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００３４．０１）を含有するＲＰＭＩ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００９６．０１）中、４８ウェルプレートで、ウェルあたり１×１０６個細胞で培養した。単離されたＢ細胞を、ポリクローナルＢ細胞刺激物質の選択によって活性化して、増殖および抗体産生を誘導した。
２．ＩｇＧ＋Ｂ細胞のＥＢＶ媒介性不死化
４．５×１０６個の活性化されたＣＤ２２＋Ｂ細胞を洗浄し、４０μＬのＦＩＴＣがコンジュゲートされている抗ＩｇＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５７８２）、４０μＬのＦＩＴＣがコンジュゲートされている抗ＩｇＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５７７８）および４μＬのＦＩＴＣがコンジュゲートしている抗ＩｇＡ（Ｊａｃｋｓｏｎｓ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ３０９−０９６−０４３）抗体とともに、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ（０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ含有）で１回洗浄し、９０μＬの同バッファーに再懸濁した。ＩｇＧ＋Ｂ細胞を、１０μＬの抗ＦＩＴＣ磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４８−７０１）およびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）を使用し、製造業者の説明書に従って、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ発現細胞の負の選択によって濃縮した。
Ｂ細胞のバルク不死化を、１．８７×１０６個のＩｇＧ＋、ＣＤ２２＋濃縮Ｂ細胞を、０．５ｍｌ ＥＢＶ上清（１０％ＦＣＳを含むＲＭＰＩ−１６４０中、５０％ｖ／ｖ、Ｂ９５−８細胞由来のＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１４９２）とともに１６時間インキュベートすることによって実施した。感染させた後、細胞を洗浄し、２４ウェルプレートのウェルあたり０．５×１０６個の照射したフィーダー細胞とともに、１０％熱不活化低ＩｇＧウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６２５０−０７８）、１％抗生物質（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＶ３００１０）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２３９．０１）および１％Ｌ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００３４．０１）、２００ＩＵ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号２０２−ＩＬ−５０）を含有するＲＰＭＩ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００９６．０１）中で、２ウェルのうち各々において１０６個／ｍＬで、さらに９日間培養した。
３．Ｂ細胞クローニング
ａ．Ｂ細胞のクローニングのための、照射されたＢ細胞が枯渇したフィーダー細胞の調製
照射されたＢ細胞が枯渇したフィーダー細胞を使用して、ＥＢＶによって形質転換されたＢ細胞の増殖を維持するのを補助した。３人の健常ドナーの混合物に由来するＰＢＭＣを、フィコール分離によって得、３２５０ラドで照射し（ＵＣＳＤ Ｍｏｏｒｅ’ｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒにて）、抗ＣＤ１９磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０５０−３０１）およびＬＤカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９１−５０９）を使用してＢ細胞を枯渇させた。手短には、フィコール分離から得られた、凍結され、照射されたＰＭＢＣを解凍し、２回洗浄し、カウントした。次いで、細胞を、３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞ペレットを、１０７個の細胞ごとに８０μｌ ＭＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、２０μｌのＣＤ１９マイクロビーズ（１０７個の細胞ごとに）を加えた。完全に混合した後、細胞を４℃で１５分間インキュベートした。次いで、１〜２ｍＬのバッファー（１０７個の細胞ごとに）を加えることによって細胞を洗浄し、続いて、３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を吸引した。次いで、最大１０８個の細胞を５００μｌのバッファーに再懸濁した。磁性分離は、ＭＡＣＳ分離装置の磁場においてＬＤカラム（細胞の迅速で穏やかな分離を可能にするよう、プラスチックコーティングで覆われた強磁性球からなる）を設置することによって達成した。ＬＤカラムを２ｍＬのバッファーで洗浄し、細胞懸濁液をカラムの頂部にアプライした。非Ｂ細胞は、２×１ｍＬのバッファーを添加した後にそれらがカラムを通過するので回収した。
ｂ．Ｂ細胞クローニング
約２０個のＥＢＶによって形質転換されたＢ細胞を、ポリクローナルＢ細胞刺激物質および９６ウェルプレート中のウェルあたり、５０，０００個の照射されたＢ細胞が枯渇したフィーダー細胞とともに同時培養し、１３日間増殖させた。合計１２０枚の９６ウェルプレートを作製した。
４．ＲＳＶ Ｆタンパク質との結合についてのＢ細胞上清のスクリーニング
各ウェルから得た上清を、新規９６ウェルプレートに移し、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、１０μＬ／ｍＬ２−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９２１６）１００μＬ中、−８０℃で凍結した。上清をＥＬＩＳＡにおいて使用し、どのウェルが、ＲＳＶ Ｆタンパク質と結合できる抗体を産生しているかを決定した。手短には、ＥＬＩＳＡを以下のとおりに実施した。（１）ＲＳＶ Ｆタンパク質ＥＬＩＳＡプレートを、以下の修飾を加えて、９６ウェルハーフエリアプレートを使用し、実施例１に記載されるように調製した。抗ＲＳＶ ｍＡｂ（クローン２Ｆ７、マウス腹水、カタログ番号ａｂ４３８１２、Ａｂｃａｍ）を、捕獲抗体として使用し、ＲＳＶ Ｆタンパク質を、捕獲抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。（２）９６ハーフウェルＥＬＩＳＡプレートに、２つのウェルの各々から得た１０μＬのＢ細胞上清（合計プールされた２０μＬ）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。血液バンクドナーのプールから得た血漿（フィコールハイパック分離後に回収され、凍結され、１：１０００希釈された）を、陽性対照として使用した。（３）プレートを上記のように４回洗浄し、各ウェルに５０μＬのヤギ抗ヒトＦｃ ＩｇＧ ＨＲＰがコンジュゲートしている抗体（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１：１０００希釈した）を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。（４）プレートを、上記のように６回洗浄し、５０μＬの１：１ｖ／ｖ ＴＭＢ：過酸化物溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０２１）基質を使用して発展させ、７分間発展させた。５０μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を直ちに停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。０．５を超える（０．５〜０．９は中程度の結合、＞１は強い結合）ＯＤ４５０およびバックグラウンドを３倍上回る反応によって正の結合が示された。
２種のプールされたウェルのうちどちらが、抗ＲＳＶ抗体を含有していたかを調べるために、各ウェルから２０μＬのＢ細胞上清（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて１：２ ｖ／ｖ希釈した）を、捕獲されたＲＳＶ Ｆタンパク質に対して個々に再試験した。
合計１８プレート（すなわち１０８０ウェル）を、ＲＳＶ Ｆ溶解物（実施例１において精製したような）との結合についてスクリーニングした。６種のウェルを、ＲＳＶ Ｆ溶解物との結合剤として同定した。６種のウェルのうち５種が、さらなるＥＬＩＳＡによって再確認され、これらを使用して、ＰＣＲによって抗ＲＳＶ抗体を作製した（以下に記載する）。
Ｂ．ＰＣＲによる抗ＲＳＶ抗体の作製
ＥＢＶによって形質転換されたＢ細胞の、ＲＳＶ Ｆタンパク質と結合する抗体の産生についての最初のスクリーニング後、個々の抗体をコードする遺伝子を、Ｂ細胞ＲＮＡからＰＣＲによって増幅した。節Ａにおいてヒットとして同定された５種のウェルを、クローニングのために選択した。
１．ＲＮＡ抽出
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１４０２−２４０８）を、製造業者の説明書に従い、以下の修飾を加えて使用して、Ｂ細胞（ＲＳＶ Ｆタンパク質との正の結合剤に対応する各ウェルの）から抽出した。１）Ｂ細胞を、β−メルカプトエタノール（バッファー１ｍＬあたり１０μＬ）を含むＲＬＴバッファー１００μＬ中で凍結し、２）細胞はホモジナイズせず、３）細胞を７０％エタノール（ＲＮアーゼ不含水中）で洗浄し、４）ＤＮアーゼ処理を、製造業者の補足プロトコールに従って「カラム中」で実施した。ＲＮＡを、最終容量２６μＬに溶出した。
２．第１鎖ｃＤＮＡ合成
ＲＮＡ抽出後、ｃＤＮＡを、スーパースクリプトＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１９０９０−０５１）第１鎖合成プロトコールに従って作製した。手短には、８μＬ ＲＮＡ（上記のように単離された）、１μＬオリゴｄＴプライマーおよび１μＬ ｄＮＴＰを、滅菌０．２ｍＬチューブ中で組み合わせ、６５℃で５分間インキュベートし、続いて、氷上で１分間インキュベートした。続いて、チューブに、２μＬ ０．１ｍＭ ＤＴＴ、４μＬ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ２μＬ ＲＴバッファー、１μＬ ＲＮａｓｅＯｕｔおよび１μＬスーパースクリプトＩＩＩ ＲＴを加え、反応混合物を５０℃で５０分間インキュベートし、続いて、８０℃で１５分間インキュベートした。ｃＤＮＡは直ちに使用するか、または長期間保存のために−８０℃で凍結した。
３．ＰＣＲ増幅によるＩｇＧ重鎖ならびにκおよびλ軽鎖遺伝子の単離
ＩｇＧ重鎖ならびにκおよびλ軽鎖を、Ｂ細胞第１鎖ｃＤＮＡ合成反応からＰＣＲ増幅によって作製した（上記参照のこと）。κ軽鎖遺伝子は一段階ＰＣＲによって増幅したが、重鎖遺伝子およびλ軽鎖遺伝子は、二段階、ネステッドＰＣＲアプローチを使用して増幅した。続いて、増幅した重鎖および軽鎖遺伝子を、「オーバーラップＰＣＲ」を使用して単一カセットに連結した。
工程Ｉ．ＩｇＧ重鎖遺伝子およびλ軽鎖遺伝子の増幅
工程Ｉでは、２μＬの第１鎖合成によって作製したｃＤＮＡ（上記参照のこと）を鋳型として使用して、ＰＣＲによってＩｇＧ重鎖を個々に増幅した。この工程では、工程Ｉプライマーのプールを利用した（表３Ａ参照のこと）。反応条件は以下のとおりとした。
ＰＣＲ工程Ｉ：重鎖：
試薬 μＬ
Ｈ２Ｏ １６
１０×バッファー ２．５
１０×エンハンサーバッファー ２．５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） ０．７５
ｃＤＮＡ ２．０
ＶＨプールリーダー（各９μＭ） ０．５
ＶＨリバースプール（２０μＭ） ０．２５
Ｐｆｘ５０ ０．５
２５
工程Ｉでは、λ軽鎖、２．５μＬの第１鎖合成によって作製したｃＤＮＡ（上記参照のこと）を鋳型として使用して、ＰＣＲによってＩｇＧ重鎖を個々に増幅した。この工程では、フォワードプライマーのために工程Ｉプライマーのプールを利用し、リバースプライマーとしてｐＣＡＬＣＬ（Ｔ）−Ｒを使用した（以下の表３Ｂ参照のこと）。反応条件は以下のとおりとした。
ＰＣＲ工程Ｉ：λ軽鎖：
試薬 μＬ
Ｈ２Ｏ １６
１０×バッファー ２．５
１０×エンハンサーバッファー ２．５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） ０．７５
ｃＤＮＡ ２．０
Ｖλプール（各１４．２μＭ） ０．５
ｐＣＡＬＣＬ（Ｔ）−Ｒ（２０μＭ） ０．２５
Ｐｆｘ５０ ０．５
２５
ＰＣＲ反応のために、反応増幅に特異性を加えるためにタッチダウンアプローチを実行した。各タッチダウン工程で、どのサイクルでもアニーリング温度を１℃低下させる。ＰＣＲサーモサイクラー条件は以下のとおりとした。
１）９４℃で２分間
２）９４で１５秒；６２℃で２０秒（タッチダウン）；６８℃で１分間の１０サイクル
３）９４℃で１５秒；５２℃で２０秒；６８℃で１分間の２５サイクル
４）６８℃で３分間
５）４℃で維持
得られた反応混合物を、いかなるさらなる精製も行わずに工程ＩＩの鋳型ＤＮＡとして使用した（以下参照のこと）。
Figure 0005762408
Figure 0005762408
工程ＩＩ．ＩｇＧ重鎖およびλ軽鎖遺伝子の増幅
工程ＩＩでは、工程Ｉから得た重鎖およびλ軽鎖反応混合物を、各鎖のフレームワーク１領域から第１の定常領域（重鎖のＣＨ１、軽鎖のＣＬ）の最後まで増幅する、フォワードおよびリバースプライマーのプールとともに第２ラウンドＰＣＲ反応の鋳型として使用した。
重鎖フォワードプライマー（表４参照のこと）は、ＳｆｉＩ制限部位を導入するよう設計した（配列番号４１）。反応条件は、以下のとおりとした。
ＰＣＲＩＩ：重鎖
試薬 μＬ
Ｈ２Ｏ １２．７５
１０×バッファー ２．５
１０×エンハンサー ２．５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） ０．７５
工程Ｉ反応物 ２．５
ｐＣＡＬ２４ＶＨ−Ｆプール（２μＭ） ２．５
ＣＨ１−Ｒプール−Ｓｆｉ（２０μＭ） １
Ｐｆｘ５０ ０．５
２５
λ軽鎖フォワードプライマー（表６参照のこと）は、ＳｆｉＩ制限部位を導入するよう設計した（配列番号４１）。反応条件は、以下のとおりとした。
ＰＣＲＩＩ：ラムダ軽鎖
試薬 μＬ
Ｈ２Ｏ １５．５
１０×バッファー ２．５
１０×エンハンサー ２．５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） ０．７５
工程Ｉ反応物 ２．５
Ｖλプライマープール（２μＭ） ０．５
ｐＣＡＬＣＬ（Ｔ）Ｒ（２０μＭ） ０．２５
Ｐｆｘ５０ ０．５０
２５
工程ＩＩ反応のＰＣＲサーモサイクラー条件は、以下のとおりとした。
１）９４℃で２分間
２）９４℃で１５秒；５２℃で２０秒；６８℃で１分間の３０サイクル
３）６８℃で３分間
４）４℃で維持
軽鎖遺伝子の増幅のために、２μＬの第１鎖合成（上記参照のこと）によって作製したｃＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲによってＩｇＧκおよびλ軽鎖を個々に増幅した。軽鎖κフォワードプライマー（表５参照のこと）をプライマープールとして使用し、ＳｆｉＩ制限部位を導入するよう設計した（配列番号４１）。
反応条件は以下のとおりとした。
ＰＣＲＩＩ：κ軽鎖
試薬 μＬ
Ｈ２Ｏ １６
１０×バッファー ２．５
１０×エンハンサー ２．５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） ０．７５
第１鎖ｃＤＮＡ ２
Ｖκプライマープール（９．１μＭ） ０．５
ｐＣＡＬＣＫ（Ｇ）Ｌ（２０μＭ） ０．２５
Ｐｆｘ５０ ０．５０
２５
工程ＩＩ反応のＰＣＲサーモサイクラー条件は以下のとおりとした。
１）９４℃で２分間
２）９４℃で１５秒；５４℃で２０秒；６８℃で１分間の３５サイクル
３）６８℃で３分間
４）４℃で維持
増幅後、ＰＣＲ反応生成物を、１％アガロースゲルで分離し、重鎖（６７５ｂｐ）および軽鎖（６５０ｂｐ）に対応するバンドを、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット；カタログ番号２８７０６）によって精製した。ＰＣＲ産物は、３０μｌに溶出した。
Figure 0005762408
Figure 0005762408
Figure 0005762408
工程ＩＩＩ．オーバーラップＰＣＲ
工程ＩＩＩでは、工程ＩＩで作製した重鎖および軽鎖ＤＮＡセグメントを、１）オーバーラップ反応において、軽鎖の３’末端および重鎖の５’末端とアニーリングするＦａｂリンカー（以下の表７参照のこと）と連結し、２）Ｓｆｉフォワードおよびリバースプライマー（以下の表７参照のこと）を用いて増幅し、それによって、軽鎖−リンカー−重鎖を含有する１２００塩基対（ｂｐ）の抗体断片の増幅が可能となった。
Ｆａｂκリンカーを、２ｇ１２／ｐＣＡＬベクター（配列番号８１）から増幅した。Ｆａｂリンカーの形成のＰＣＲ反応条件は、以下のとおりとした。
Ｆａｂκリンカー
Ｈ２Ｏ １９．７５
１０×バッファー ２．５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） ０．７５
２ｇ１２／ｐＣＡＬベクター（１０ｎｇ） １
Ｆａｂリンカー−Ｆｗｄ（２０μＭ） ０．２５
Ｆａｂリンカー−Ｒｅｖ（２０μＭ） ０．２５
Ｐｆｘ５０ ０．５
２５μＬ
Ｆａｂλリンカーを、２８ｄ１１／ｐＣＡＬベクター（配列番号１６３８）から増幅した。Ｆａｂλリンカーの形成のＰＣＲ反応条件は以下のとおりとした。
Ｆａｂλリンカー
試薬 μＬ
Ｈ２Ｏ ３５．５
１０×バッファー ５
１０×エンハンサー ５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） １．５
２８ｄ１１／ｐＣＡＬベクター（１０ｎｇ） １
ＦａｂリンカーＣλ−Ｆｗｄ（２０μＭ） ０．５
Ｆａｂリンカー−Ｒｅｖ ＩＴ＊（２０μＭ） ０．５
Ｐｆｘ５０ ０．５
２５
Ｆａｂリンカーの形成のＰＣＲサーモサイクラー条件は、以下のとおりとした。
１）９４℃で２分間
２）９４℃で１５秒；５４℃で２０秒；６８℃で１分間の３０サイクル
３）６８℃で３分間
４）４℃で維持
ＰＣＲ反応を１％アガロースゲルで実施し、１２０ｂｐのリンカーを、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出プロトコールに従ってゲル抽出した。各オーバーラップ反応に２μｌの精製リンカーを使用した。
オーバーラップのＰＣＲ反応条件は以下のとおりとした（最初の１５サイクルの後にＰＣＲ反応物にＳｆｉ Ｆ／Ｒプライマーを加えた）。
ＰＣＲＩＩＩ：オーバーラップ
試薬 μＬ
Ｈ２Ｏ ２４．５
１０×バッファー ５
１０×エンハンサー ５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） １．５
軽鎖生成物 ５
重鎖生成物 ５
リンカー ２
Ｓｆｉ Ｆ／Ｒプライマー（２０μＭ） １
Ｐｆｘ５０ １
５０
ＰＣＲサーモサイクラー条件は以下のとおりとした。
１）９４℃で２分間
２）９４℃で１５秒；６８℃で１分間の１５サイクル
Ｓｆｉ Ｆ／Ｒプライマー（１μＬ）を加え、次いで
３）９４℃で２分間
４）９４℃で１５秒；６０℃で２０秒；６８℃で２分間の３０サイクル
５）６８℃で３分間
６）４℃で維持
増幅後、１０μｌの全５０μｌのＰＣＲオーバーラップ反応生成物軽鎖−リンカー−重鎖を、１％アガロースゲルで分離して、サイズを決定し、ＰＣＲ産物の残りの４０μｌを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；カタログ番号２８１０６）によって精製し、３０μｌの総容量とした。手短には、ＰＢＩバッファーの５倍のＰＣＲ反応容量をＰＣＲ産物に加える。混合物をＱＩＡ Ｓｐｉｎカラムと結合させ、ＰＥバッファーで２回洗浄した。サンプルを３０μｌに溶出し、最高速度で１．５分間回転させて、３０μｌすべてを溶出した。約１μｇのオーバーラップ産物が、５０μｌのオーバーラップ反応あたりの通常の収量であった。
Figure 0005762408
工程ＩＶ．Ｓｆｉを用いる消化およびｐＣＡＬ発現ベクターまたはｐＣＡＬ ＩＴ＊発現ベクターへのクローニング
オーバーラップＰＣＲ反応およびＰＣＲ産物の精製後、反応生成物をＳｆｉＩを用いて消化した。３０μｌの溶出液（上記参照のこと）に、消化のために以下を加えた。
４μｌ 反応バッファー２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
０．４μｌ ＢＳＡ
１．６μｌ ＳｆｉＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
４μｌ Ｈ ２ Ｏ
４０μｌ 総容量
反応物を、３７℃で１時間インキュベートした。消化後、消化したオーバーラップ産物を１％アガロースゲルで分離し、抗体に対応するバンド（約１．４５ｋＢ）を、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎゲル抽出精製キットカタログ番号２８７０６）によって精製した。手短には、ゲル切片を、５００μｌのバッファーＱＣ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて消化した。１５０μｌのイソプロパノールを加えて消化し、サンプルをＱｉａＳｐｉｎカラムにアプライした。カラムをバッファーＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２回洗浄し、サンプルを３０μｌのＥＢバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）に溶出する。約１５ｎｇ／μｌの消化されたサンプルが、約１μｇのＰＣＲオーバーラップ産物から回収される。
最後に、消化されたオーバーラップ産物を、ｐＣＡＬ細菌発現ベクター（配列番号８６）またはｐＣＡＬ ＩＴ＊（配列番号１６４１）細菌発現ベクター中にライゲーションした。ライゲーション反応条件は、以下のとおりとした。
２５ｎｇ ＳｆｉＩ消化されたｐＣＡＬまたはｐＣＡＬ ＩＴ＊ベクター
２５ｎｇ 消化されたオーバーラップ産物
１μｌ Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢカタログ番号ＭＣ２０２Ｌ、４００，０００ユニット／ｍｌ）
Ｈ２Ｏを用いて２０μｌ総容量に調整
サンプルを、室温で１時間ライゲーションした。ライゲーションの１μｌを、４μｌのＨ２Ｏで希釈し、その後、形質転換に進んだ。
工程Ｖ．大腸菌への形質転換
ライゲーション後、ライゲーション産物を、ＤＨ５α最大効率細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１８２５８；遺伝子型：Ｆ−φ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１）に形質転換した。手短には、１μｌのライゲーション産物（１／５希釈）を５０μｌのＤＨ５αに加え、氷上で３０分間インキュベートした。形質転換は、４２℃で４５秒の熱ショックと、それに続く、氷上で２分間によって達成した。０．９ｍＬのＳＯＣ培地を加え、細胞を、振盪しながら３７℃で１時間回復させた。細胞を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）および２０ｍＭグルコースを補給したＬＢプレート上に播種した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。
工程ＶＩ．個々のコロニーの選択
各抗体増幅のために、合計８８の個々のコロニーを選択し、９６ウェルプレート中の１カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を補給したＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）１ｍＬ中、３７℃で２時間増殖させた。各培養物の５００μｌを、４０ｍＭグルコース（最終２０ｍＭ）および１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補給したＳＢ５００μｌとともに、別の９６ウェル形式細菌プレートに移すことによって娘プレートを作製した。元のプレートすなわち母プレートに、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを補給したＳＢ５００μｌを供給した。元のプレートを、３０℃で一晩増殖させ、娘プレート（グルコースを含有する）を３７℃で一晩増殖させた。３０℃のプレートから得た細胞溶解物を、細菌ＥＬＩＳＡに使用し（以下の実施例４を参照のこと）、３７℃のプレート培養物を、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐＤＮＡ調製（Ｑｉａｇｅｎ）に使用した。
要約
ヒットと同定された５種のウェルを、κ軽鎖プライマーを使用して、増幅させ、ｐＣＡＬ発現ベクター中にクローニングした。
単細胞選別による抗ＲＳＶ Ｆａｂ抗体の単離
この実施例では、抗ＲＳＶ抗体をＣＤ１９／ＣＤ２７／ＩｇＧ陽性細胞から単離した。ＣＤ１９／ＣＤ２７／ＩｇＧ陽性細胞は、１）Ｂ細胞単離および２）ＦＡＣＳ単細胞選別によって得た。次いで、選別された細胞を使用して、ＲＮＡを単離し、これはＦａｂ抗体のインビトロ製造のための鋳型としての役割を果たした。
Ｂ細胞単離
Ｂ細胞をＰＢＭＣ（匿名の血液バンクドナーから採取した）からＢ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９１−１５１）を使用して単離した。キットを使用して、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ４３およびＣＤ２３５ａ発現細胞（活性化されたＢ細胞、血漿細胞およびＣＤ５＋Ｂ−１ａ細胞）および非Ｂ細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、顆粒球および赤血球細胞）を磁性標識することおよび枯渇させることによって高度に純粋なＢ細胞を単離した。製造業者のプロトコールに従って、非Ｂ細胞を、一次標識試薬としてビオチンがコンジュゲートしているモノクローナル抗体のカクテル（ビオチン−抗体カクテル）および二次標識試薬としてマイクロビーズとコンジュゲートしている抗ビオチンモノクローナル抗体（抗ビオチンマイクロビーズ）を使用することによって、間接的に磁性標識した。次いで、磁性分離によって非Ｂ細胞を純粋な休止Ｂ細胞から除去した。
手短には、フィコール分離から得られた凍結ＰＭＢＣを解凍し、２回洗浄し、カウントした。次いで、細胞を３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞ペレットを４０μｌのＭＡＣＳバッファーに再懸濁し（１０７個の細胞ごとに）、１０μｌのビオチン−抗体カクテル（１０７個の細胞ごとに）を加えた。完全に混合した後、細胞を４℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション期間の後、３０μｌのバッファー（１０７個の細胞ごとに）および２０μｌの抗ビオチンマイクロビーズ（１０７個の細胞ごとに）を加えた。完全に混合した後、細胞を４℃で１５分間インキュベートした。次いで、１〜２ｍＬのバッファーを加えることによって細胞を洗浄し（１０７個の細胞ごとに）、続いて、３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を吸引した。次いで、最大１０８個の細胞を５００μｌのバッファーに再懸濁した。
磁性分離は、ＭＡＣＳ分離装置の磁場においてＬＳカラム（細胞の迅速で穏やかな分離を可能にするよう、プラスチックコーティングで覆われた強磁性球からなる）を設置することによって達成した。ＬＳカラムを３ｍＬのバッファーで洗浄し、細胞懸濁液をカラムの頂部にアプライした。非標識Ｂ細胞は、３×３ｍＬのバッファーを添加した後にそれらがカラムを通過する時に回収した。
単細胞選別
この実施例では、ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、抗原特異性によって単離されたＢ細胞を選別した。選択された細胞は、ＣＤ１９／ＣＤ２７／ＩｇＧ陽性であった。ＲＳＶ−Ｆ抗原を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を用い、製造業者の説明書に従って（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ−２０１８６）標識した。
手短には、単離されたＢ細胞を１６本の別個のチューブ中に分注した。１４本のチューブには、１×１０５個の細胞を与え、これらを使用して、ＦＡＣＳＡｒｉａでの光電子増倍管設定およびソートパラメータを決定した。残存する１．８×１０６個の細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７／ＲＳＶ−Ｆを、２０ｎＭの終濃度で用いて標識した。標識されたタンパク質をサンプルに１５分間加え、その後、抗体を加えた。ＣＤ１９およびＣＤ２７抗体を１：２０の希釈で使用したのに対し、ＩｇＧ抗体は１：５０の希釈で使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７／ＲＳＶ−Ｆタンパク質および抗体を添加した後、チューブを氷上で３０分間インキュベートし、続いて、２回洗浄した。単細胞選別は、ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して達成した。標識は、ＰＥ−Ｃｙ５（抗ヒトＣＤ１９）、ＰＥ−Ｃｙ７（抗ヒトＣＤ２７）、ＰＥ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（マウス抗ヒトＣＤ３）、ＦＩＴＣ（マウス抗ヒトＩｇＤ、マウス抗ヒトＩｇＭ、マウス抗ヒトＩｇＡおよびマウス抗ヒトＣＤ１４）、ヨウ化プロピジウムおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（標識されたＲＳＶ−Ｆタンパク質）を含んでいた。
まず、死細胞を排除することと、それに続いて、ＣＤ３陽性細胞を排除することによって細胞選別を実施した。ＣＤ１９およびＣＤ２７陽性細胞をさらに同定し、この集団内で、細胞をＩｇＧ Ｆｃγ発現についてゲート開閉した。ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＡを発現する細胞を、残存する細胞から排除した。最後に、ＣＤ１９／ＣＤ２７／ＩｇＧ Ｆｃγ陽性細胞をＲＳＶ−Ｆ結合について選別し、各陽性Ｂ細胞を、２μｌのｃＤＮＡ反応バッファー（スーパースクリプトＩＩＩ １０×バッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１９０９０−０５１）、０．５μｌ ＲＮａｓｅＯＵＴおよび７．５μｌ滅菌水を含有する９６ウェルプレートの個々のウェル中に入れた。プレートをさらに処理されるまで−８０℃で保存した。
第１鎖ｃＤＮＡ合成
選別後、ｃＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ第１鎖合成プロトコールに従って、各ウェル中で個々に作製した。手短には、各ウェルに、０．５μｌ １０％ＮＰ−４０、１μｌオリゴｄＴプライマーおよび１μｌ ｄＮＴＰを加え、プレートを６５℃で５分間インキュベートし、続いて、氷上で１分間インキュベートした。続いて、２μｌ ＤＴＴ、４μｌ ＭｇＣｌ２および１μｌスーパースクリプトＩＩＩ ＲＴを加え、反応混合物を５０℃で１時間インキュベートし、続いて、８５℃で５分間インキュベートした。ｃＤＮＡは直ちに使用するか、または長期間保存のために−８０℃で凍結した。
ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖増幅
ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖を、続いて、ＰＣＲの４つの連続工程によって作製した。
工程Ｉ．増幅
工程Ｉにおいて、第１鎖合成（上記を参照のこと）によって作製した２．５μＬのｃＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲによってκ軽鎖およびＩｇＧ重鎖を個別に増幅した。この工程では、工程Ｉプライマーのプールを利用した（以下の表８および９を参照のこと）。反応条件は以下のとおりとした。
ＰＣＲ工程Ｉ：
Ｈ２Ｏ １６
１０×バッファー ２．５
１０×エンハンサーバッファー ２．５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） ０．７５
ｃＤＮＡ ２．５
工程Ｉプール（各２０μＭ） ０．２５
リバースプライマー（２０μＭ） ０．２５
Ｐｆｘ５０ ０．２５
２５μＬ
ＰＣＲサーモサイクラー条件は以下のとおりとした。
１）９４℃で２分間
２）９４℃で１５秒；６２℃で２０秒（タッチダウン）；６８℃で１分間の１０サイクル
３）９４℃で１５秒；５２℃で２０秒；６８℃で１分間の４０サイクル
４）６８℃で３分間
５）４℃で維持
反応混合物を、いかなるさらなる精製も行わずに工程ＩＩの鋳型ＤＮＡとして使用した（以下参照のこと）。
Figure 0005762408
Figure 0005762408
工程ＩＩ．増幅
工程ＩＩでは、工程Ｉから得た反応混合物を、それぞれ、軽鎖または重鎖いずれかのフォワードおよびリバースプライマーのプールとともに、第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。これらの反応によって、各鎖のフレームワーク１領域からＤＮＡを増幅した。軽鎖フォワードプライマー（表１０参照のこと）をＳｆｉＩ制限部位（配列番号４１）を導入するよう設計した。反応条件は以下のとおりとした。
ＰＣＲＩＩ：軽鎖
Ｈ２Ｏ １５．７５
１０×バッファー ２．５
１０×エンハンサー ２．５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） ０．７５
工程Ｉ反応 ２．５
Ｖｋプライマープール（９．１μＭ） ０．５
ｐＣＡＬＣＫ（Ｇ）Ｌ（２０μＭ） ０．２５
Ｐｆｘ５０ ０．２５
２５μＬ
重鎖フォワードプライマー（表１１参照のこと）を、ＳａｌＩ制限部位（配列番号９６）を導入するよう設計した。反応条件は以下のとおりとした。
ＰＣＲＩＩ：重鎖
Ｈ２Ｏ １４．２５
１０×バッファー ２．５
１０×エンハンサー ２．５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） ０．７５
工程Ｉ反応 ２．５
ｐＣＡＬ２４ＶＨ−Ｆプール（２μＭ） ２
ＳａｌＩ ＪＨ−Ｒｅｖプール（２０μＭ） ０．２５
Ｐｆｘ５０ ０．２５
２５μＬ
ＰＣＲサーモサイクラー条件は以下のとおりとした。
１）９４℃で２分間
２）９４℃で１５秒；５４℃で２０秒；６８℃で１分間の５０サイクル
３）６８℃で３分間
４）４℃で維持
増幅後、ＰＣＲ反応生成物を、１％アガロースゲルで分離し、重鎖（４００ｂｐ）および軽鎖（６５０ｂｐ）に対応するバンドを、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。
Figure 0005762408
Figure 0005762408
工程ＩＩＩ．オーバーラップＰＣＲ
工程ＩＩＩでは、工程ＩＩで作製した重鎖および軽鎖ＤＮＡセグメントを、１）オーバーラップ反応において、軽鎖の３’末端および重鎖の５’末端とアニーリングするＦａｂリンカー（以下の表１２参照のこと）と連結し、２）軽鎖の５’末端とアニーリングするＳｆｉフォワードプライマー（以下の表１２参照のこと）および重鎖の３’末端とアニーリングするＪＨリバースプライマー（上記の表１１参照のこと）を用いて増幅し、それによって、軽鎖−リンカー−重鎖を含有する１２００塩基対（ｂｐ）の抗体断片の増幅が可能となった。反応条件は以下のとおりとした（リンカーは、上記の実施例２に記載されるように作製した）。
Ｈ２Ｏ ２４．５
１０×バッファー ５
１０×エンハンサー ５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） １．５
軽鎖 ５
重鎖 ５
リンカー ２
Ｓｆｉ Ｆ／ＪＨ−Ｒプライマー（２０μＭ） １
Ｐｆｘ５０ １
５０μＬ
ＰＣＲサーモサイクラー条件は以下のとおりとした。
リンカーを用いるオーバーラップ
１）９４℃で２分間
２）９４℃で１５秒；６８℃で１分間の１５サイクル
プライマーを加える
３）９４℃で２分間
４）９４℃で１５秒；６０℃で２０秒；６８℃で１分間の３０サイクル
５）６８℃で３分間
６）４℃で維持
増幅後、ＰＣＲ反応生成物軽鎖−リンカー−重鎖を、１％アガロースゲルで分離し、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。
工程ＩＶ．ＣＨ１領域の導入
オーバーラップ後、増幅された軽鎖−リンカー−重鎖を、ＳａｌＩを用いて消化し、ＳａｌＩ消化された重鎖定常領域１（ＣＨγ１領域）とライゲーションし、重鎖定常領域の３’末端にＳｆｉＩ制限部位を導入した。ライゲーション反応条件は以下のとおりとした。
２μｌのライゲーション反応バッファー
２μｌのＣＨ１
５μｌの、工程ＩＩＩから得られた１．２ｋＢのゲル精製された生成物
１０μｌの水
１μｌのＴ４リガーゼ
ライゲーション反応混合物を、室温で３０分間インキュベートした。
ライゲーション後、ＳｆｉＩフォワードおよびリバースプライマー（以下の表１２参照のこと）を用いてＰＣＲによって全長Ｆａｂを増幅し、その結果、１．４５ｋｂの断片が得られた。反応条件は以下のとおりとした。
Ｈ２Ｏ ３１．５
１０×バッファー ５
１０×エンハンサー ５
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ） １．５
ライゲーション反応混合物 ５
Ｓｆｉ Ｆ／Ｒプライマー（２０μＭ） １
Ｐｆｘ５０ １
５０μＬ
ＰＣＲサーモサイクラー条件は以下のとおりとした。
１）９４℃で２分間
２）９４℃で１５秒；６０℃で２０秒；６８℃で１分間の３０サイクル
３）６８℃で３分間
４）４℃で維持
反応生成物は、軽鎖および重鎖が単一カセット中に一緒に連結した１．４５ｋＢの断片であった。
Figure 0005762408
工程Ｖ．Ｓｆｉを用いる消化およびｐＣＡＬ発現ベクターへのクローニング
オーバーラップＰＣＲ反応およびＰＣＲ産物の精製後、反応生成物をＳｆｉＩを用いて消化した。３０μｌの溶出液（上記を参照のこと）に、消化のために以下を加えた。
４μｌ 反応バッファー２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
０．４μｌ ＢＳＡ
１．６μｌ ＳｆｉＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
４μｌ Ｈ ２ Ｏ
４０μｌ 総容量
反応物を３７℃で１時間インキュベートした。消化後、消化されたオーバーラップ産物を１％アガロースゲルで分離し、抗体（約１．４５ｋＢ）に対応するバンドを、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎゲル抽出精製キットカタログ番号２８７０６）によって精製した。手短には、ゲル切片を、５００μｌのバッファーＱＣ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて消化した。１５０μｌのイソプロパノールを加えて消化し、サンプルをＱｉａＳｐｉｎカラムにアプライした。カラムをバッファーＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２回洗浄し、サンプルを３０μｌのＥＢバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）に溶出する。約１５ｎｇ／μｌの消化されたサンプルが、約１μｇのＰＣＲオーバーラップ産物から回収される。
最後に、消化されたオーバーラップ産物を、ｐＣＡＬ細菌発現ベクター（配列番号８６）中にライゲーションした。ライゲーション反応条件は、以下のとおりとした。
２５ｎｇ ＳｆｉＩ消化されたｐＣＡＬベクター
２５ｎｇ 消化されたオーバーラップ産物
１μｌ Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢカタログ番号ＭＣ２０２Ｌ、４００，０００ユニット／ｍｌ）
２０μｌ総容量
サンプルを室温で１時間ライゲーションした。ライゲーションの１μｌを、４μｌのＨ２Ｏで希釈し、その後形質転換に進んだ。
工程ＶＩ．大腸菌への形質転換
ライゲーション後、ライゲーション産物を、ＤＨ５α最大効率細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１８２５８；遺伝子型：Ｆ−φ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１）に形質転換した。手短には、１μｌのライゲーション産物（１／５希釈）を５０μｌのＤＨ５αに加え、氷上で３０分間インキュベートした。形質転換は、４２℃で４５秒の熱ショックと、それに続く、氷上で２分間によって達成した。０．９ｍＬのＳＯＣ培地を加え、細胞を、振盪しながら３７℃で１時間回復させた。細胞を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）および２０ｍＭグルコースを補給したＬＢプレート上に播種した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。
工程ＶＩＩ．個々のコロニーの選択
合計８８の個々のコロニーを選択し、９６ウェルプレート中の１カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を補給したＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）１ｍＬ中、３７℃で２時間増殖させた。各培養物の５００μｌを、４０ｍＭグルコース（最終２０ｍＭ）および１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補給したＳＢ５００μｌとともに、別の９６ウェル形式細菌プレートに移すことによって娘プレートを作製した。元のプレートすなわち母プレートに、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを補給したＳＢ５００μｌを供給した。元のプレートを、３０℃で一晩増殖させ、娘プレート（グルコースを含有する）を３７℃で一晩増殖させた。３０℃のプレートから得た細胞溶解物を、細菌ＥＬＩＳＡに使用し（以下の実施例４を参照のこと）、３７℃のプレート培養物を、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐＤＮＡ調製（Ｑｉａｇｅｎ）に使用した。
ＲＳＶ Ｆタンパク質との抗体結合
この実施例では、実施例２および３で作製したＦａｂ抗体を、精製ＲＳＶ Ｆ１溶解物と結合するその能力についてＥＬＩＳＡによって試験した。手短には、５０μＬの、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて１容量を合計３容量に希釈した、細菌細胞溶解物を、ＲＳＶ Ｆ１溶解物を用いて予めコーティングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えた（上記の実施例１参照のこと）。プレートを３７℃で２時間、あるいは、４℃で一晩インキュベートし、続いて、洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。５０μＬの、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で１：１０００希釈した、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ）−ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓカタログ番号１０９−０３６−０９７）を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。洗浄バッファーで６回洗浄した後、５０μＬの１：１ｖ／ｖ ＴＭＢ：過酸化物溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０２１）を加え、７分間発展させた。５０μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を直ちに停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。０．５を超える（０．５〜０．９は中程度の結合、＞１は強い結合）ＯＤ４５０およびバックグラウンドを３倍上回る反応によって正の結合が示された。
ＲＳＶ Ｆ１溶解物との結合に加えて、いくつかの陽性および陰性対照抗原も使用した。血液バンクドナーのプールから得た血漿（フィコールハイパック分離後に回収および凍結され、１：１０００希釈された）を、ＲＳＶ Ｆ１溶解物結合の陽性対照として使用した。各細菌細胞溶解物が無傷のＦａｂを含有することを調べるための陽性対照として、Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）２抗体（１μｇ／ｍｌ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９−００６−０９７）を使用して、無傷のＦａｂを捕獲するために９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。この抗体は、ＩｇＧ抗体のＦ（ａｂ）部分とのみ結合する。次いで、抗ＨＡペルオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１２０１３８１９００１；細菌性発現されたＦａｂは、ＨＡ−タグを有する）を使用することによってＦａｂ発現を検出した。任意のタンパク質とのＦａｂ結合の陰性対照としてアクチン（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３６５３）を使用し、ＥＬＩＳＡ反応の陽性対照として、マウス抗アクチン抗体（１．２５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３８５３）およびヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ）−ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号ＳＣ３６９７）を使用した。マウス抗ＲＳＶ ｍＡｂ（クローン２Ｆ７、マウス腹水、カタログ番号ａｂ４３８１２、Ａｂｃａｍ）も、ＥＬＩＳＡプレートにＲＳＶ Ｆタンパク質を結合するためにこの抗体が使用され、したがって、ヒト抗ＲＳＶ抗体のスクリーニングの際にＥＬＩＳＡプレート上に存在したので、ＲＳＶ Ｆタンパク質との結合の特異性についての陰性対照として含めた。
Ａ．ＥＢＶによって形質転換されたＢ細胞（実施例２参照のこと）から作製されたＦａｂに対する細胞溶解物の結合
上記の実施例２において作製した８８種の細胞溶解物を、その１）抗Ｆａｂ抗体と結合する能力および２）ＲＳＶ Ｆ１溶解物と結合する能力についてＥＬＩＳＡによって試験した。ＥＬＩＳＡによって、８８種の細胞溶解物のうち７６種が、Ｆａｂ産生について陽性であるのに対し、８８種の細胞溶解物のうち５９種がＲＳＶ Ｆ溶解物と結合することが確認された。確認ＥＬＩＳＡによって、７６種の細胞溶解物のうち７２種が実際にＦａｂを産生しており、最初の５９種の陽性ヒットのうち４６種が、ＲＳＶ Ｆ溶解物との結合剤として再確認されることが示された。
陽性結合剤のうち３種を、対応するＤＮＡ調製物のＤＮＡ塩基配列決定によって同定した。配列決定によって、それらはすべて、以下の軽鎖および重鎖を有するＦａｂ ５８ｃ５として同定された同一配列を有することが示された。
Ｆａｂ ５８ｃ５
軽鎖
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号５）
重鎖
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC（配列番号１）
Ｂ．単細胞選別（実施例３参照のこと）から作製されたＦａｂに対する、細胞溶解物の結合
結果は、実施例３において作製した８８種の細胞溶解物のうち６４種が、ＲＳＶ Ｆ１タンパク質と結合することを示した。対応するＤＮＡ調製物のＤＮＡ塩基配列決定によって２４種の陽性結合剤を同定した。
同定された陽性結合剤のうち１種が、以下の軽鎖および重鎖を有するＦａｂ ｓｃ５であった。
Ｆａｂ ｓｃ５
軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIKNYLNWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYSCQQSYNNQLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１３）
重鎖
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCTVSGDSISGSNWWNWVRQPPGKGLEWIGEIYYRGTTNYKSSLKGRVTMSVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGGRSTFGPDYYYYMDVWGRGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC（配列番号９）
単離された５８ｃ５およびｓｃ５ Ｆａｂの抗体ドメインおよびＣＤＲ領域が、以下の表１３Ａ〜１３Ｂに提供されている。
Figure 0005762408
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単離Ｆａｂの発現および精製
この実施例では、ＲＳＶ Ｆ溶解物と結合すると、細胞溶解物を使用するＥＬＩＳＡによって決定された個々のＦａｂ抗体を、続いて、発現させ、カラムクロマトグラフィーを使用して細菌細胞から精製した。
個々のＦａｂ抗体各々をコードするＤＮＡを、発現のためにＴｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。各Ｆａｂ抗体を、２ＬのＳＢ中、３７℃で０．８のＯＤ６００まで増殖させた。１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導し、３０℃で一晩生じさせた。発現後、細菌培養物を遠心分離し、細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤（完全プロテアーゼ阻害薬カクテル、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ｓｃ−２９１３１）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬに再懸濁した。再懸濁した細胞にリゾチーム（０．２ｍｇ）を加え、混合物を室温で１５分間インキュベートした。細胞を２回の凍結／解凍サイクルによって溶解した。手短には、再懸濁した細菌細胞を、エタノール／ドライアイス浴中で凍結し、続いて、３７℃の水浴中で解凍した。溶解すると、細菌溶解物を１８０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を濾過し、０．４ミクロンフィルターを通すことによって滅菌した。
次いで、各個々のＦａｂ抗体を、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製した。手短には、濾過した上清を、抗Ｆａｂ／プロテインＡカラム上をゆっくりと通し、Ｆａｂタンパク質が結合するのを可能にした。５０ｍＬ ＰＢＳを用いて洗浄した後、９ｍＬの０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２を用いて結合しているＦａｂを溶出し、１ｍＬの２Ｍ Ｔｒｉｓを含有するコニカルチューブに回収し、それによって、溶出されたタンパク質を中和した。次いで、溶出したＦａｂを、１０Ｋ ＭＷＣＯ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して４ＬのＰＢＳに対して透析した。タンパク質を４℃で一晩保存し、続いて、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して容量１ｍＬに濃縮した。次いで、精製Ｆａｂ抗体各々の、ＲＳＶ Ｆ溶解物（組換え供給源、実施例１Ａ）およびＨＥｐ２溶解物（天然供給源、実施例１Ｂ）との結合をＥＬＩＳＡによって再確認した（上記の実施例４参照のこと）。さらに、精製Ｆａｂ抗体各々を、ＲＳＶを中和するその能力について、実施例６に記載されるアッセイを使用して試験した。
Ｆａｂ５８ｃ５およびｓｃ５の、ＲＳＶ Ｆ溶解物および精製ＲＳＶ Ｆタンパク質との結合
抗体５８Ｃ５およびｓｃ５の、トランスフェクトされた２９３細胞から得られた捕獲されたＲＳＶ Ｆタンパク質（組換え型）またはＲＳＶ Ａ２感染Ｈｅｐ２細胞から得られた精製ＲＳＶ Ｆタンパク質（天然）のいずれかとの結合を、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、Ｆａｂ ５８ｃ５およびＦａｂ ｓｃ５は、ＲＳＶ Ｆタンパク質（組換え型）と用量依存的に結合するが、ｓｃ５だけが、精製Ｆタンパク質（天然）を認識できたことを示す（以下の表１４〜１５参照のこと）。
Figure 0005762408
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ＲＳＶ中和アッセイ
この実施例では、抗ＲＳＶ抗体を、プラーク減少アッセイによって評価される、溶液中でＲＳＶウイルスと結合し、中和するその能力について分析した。この実験では、ＲＳＶウイルスおよび抗体を標的細胞の不在下でプレインキュベートした。次いで、細胞に混合物を加え、本明細書に記載される標準プラーク減少アッセイによってウイルス感染を測定した。抗ＲＳＶ抗体を、ＲＳＶ Ａ２（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１５４０）、ＲＳＶ Ｂ−ｗａｓｈ（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１５８０、１８５３７株）およびＲＳＶ Ｂ−１（ＡＴＣＣカタログ番号１４００）を含めたＲＳＶウイルスの数種の株を中和するその能力について分析した。
Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−８１；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、宿主細胞感染に使用した。Ｖｅｒｏ細胞を、１％Ｌ−グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００３４．０１）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＶ３００１０）を補給した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）を含むＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２８５．０１）で増殖させた。Ｖｅｒｏ細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中で維持し、週に２回継代した。
実験の１日目に、２４ウェル細胞培養プレートにおいてＶｅｒｏ細胞を培養した。細胞を、２日目までに細胞単層の形成（＞９０％コンフルエンス）を可能にする密度（ウェルあたり、およそ１×１０６個の細胞）で播種した。２日目に、各抗体を簡素なＥａｇｌｅの最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００３）で段階希釈した（試験した最終抗体濃：２０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．１６μｇ／ｍｌ、０．０３２μｇ／ｍｌおよび０．００６μｇ／ｍｌ）。ＲＳＶウイルスはまた、簡素なＥＭＥＭで、２×１０３ｐｆｕ／ｍｌ（１００ｐｆｕ／５０ｕｌ）の濃度に希釈し、希釈したＲＳＶウイルスの１１０μｌを、１１０μｌの希釈した抗体溶液各々に加え、ピペッティングによって混合した。ウイルス対照サンプルについては、１１０μｌの希釈したＲＳＶウイルスを、１１０μｌの簡素なＥＭＥＭに加えた。抗体−ウイルスまたはウイルス対照混合物を、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｖｅｒｏ宿主細胞を含有する２４ウェル細胞培養プレートから培養培地をデカントし、次いで、１００μｌのプレインキュベートしたウイルス−抗体またはウイルス対照混合物を各ウェルに移した。各試験および対照サンプルは３連で調製した。次いで、細胞を、１５分ごとに混合しながら、３７℃で１時間インキュベートした。
インキュベーション期間の後、ウイルス−抗体またはウイルス対照混合物を含有する培養培地を吸引し、各ウェルに１ｍｌのオーバーレイ培地を加えた（オーバーレイ培地は、ＥＭＥＭ、２％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、０．７５％メチルセルロースを含有していた）。次いで、２４ウェル細胞培養プレートを、３７℃で（５％ＣＯ２を用いて）約７２時間インキュベートした。細胞プレートを、１０％ホルマリンを用いて室温で１時間固定し、ｄｄＨ２Ｏを用いて１０回洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中、５％脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）を用いて３７℃で１時間ブロッキングした。
インキュベーション後、ブロッキング溶液をデカントし、各ウェルに２００μＬのマウス抗ＲＳＶ抗体（ａｂ１００１８、Ａｂｃａｍ、５％ＮＦＤＭで１：１０００希釈）を加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、ｄｄＨ２Ｏで１０回洗浄し、各ウェルに２００μＬのヤギ抗マウスＨＲＰがコンジュゲートしているＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１４３２、５％ＮＦＤＭで１：１０００希釈）を加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートをｄｄＨ２Ｏで１０回洗浄し、各ウェルに２００μＬのＴｒｕｅＢｌｕｅ（商標）ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬカタログ番号５０−７８−０２）を加えた。プレートを室温で１０分間発展させた。プレートをｄｄＨ２Ｏで２回洗浄し、ペーパータオル上で乾燥させ、青色プラークの数をカウントした。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してＥＤ５０（５０％中和の有効希釈）を算出した。次式に従ってプラーク減少率を算出した。
プラーク減少率（パーセンタイル）＝（１−各抗体希釈における平均プラーク数／ウイルス対照ウェルにおける平均プラーク数）×１００
データは、以下の表１６〜１８に示されている。表１６には、種々のＲＳＶ株の各ＦａｂのＥＤ５０が列挙されている。表１７には、Ｆａｂ ５８ｃ５の変動する濃度での、種々のＲＳＶ株のプラーク数が列挙されている。表１８には、Ｆａｂ ５８ｃ５のプラーク減少率が列挙されている。結果は、Ｆａｂ ５８ｃ５が、ＲＳＶの３種の株すべてを中和できるが、Ｆａｂ ｓｃ５は、かなり高い抗体濃度であってもＲＳＶ Ａ２およびＲＳＶ Ｂ−１のみを中和することを示す。中和アッセイにおいて得られたデータおよびＦａｂ ５８ｃ５断片の分子量（約５０ｋＤａ）に基づいて、ＲＳＶのインビトロ中和についてのＦａｂ ５８ｃ５のＥＣ５０を約３２０ｐＭであると推定した。
Figure 0005762408
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ＩｇＧのクローニングおよび発現
この実施例では、ＲＳＶを中和する可能性を示したＦａｂ抗体を、ｐＣＡＬＭ哺乳類発現ベクター（配列番号１０２）へのクローニングによってＩｇＧに変換した。各抗体に対して特異的なプライマーを作製し、最初はｐＣＡＬベクター（実施例２参照のこと）にクローニングされたような各Ｆａｂの重鎖および軽鎖を、ＰＣＲによって増幅した。軽鎖増幅の結果、６５０ｂｐの断片が得られ、重鎖増幅の結果、４００ｂｐの断片が得られた。さらに、重鎖および軽鎖のオーバーラップを可能にするリンカーを作製した。リンカーにはまた、標準の重鎖定常領域を含めた。重鎖および軽鎖のオーバーラップの結果、その両端にＳｆｉＩ制限部位（配列番号４１）を有する各抗体の２．１ｋＢのカセットが得られた。各カセットを、ＳｆｉＩを用いて消化し、ｐＣＡＬＭベクター中にクローニングした。細菌における正しい配列を確認した後、Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して哺乳類トランスフェクションのためのＤＮＡを単離した。
各ＩｇＧを発現させるために、各ｐＣＡＬＭベクターを使用して、約２億個の２９３Ｆ細胞に感染させた結果、約２００マイクログラムのＩｇＧが得られた。２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号５１−００３１）を用いて、２９３Ｆ細胞をトランスフェクトし、ＩｇＧを７２時間産生させた。トランスフェクションの７２時間後、細胞培地を採取し、遠心分離して細胞を除去し、０．４ミクロンフィルターユニットによって濾過滅菌した。精製は、プロテインＡカラムを使用してカラムクロマトグラフィーによって達成した。発現されたＩｇＧを含有する濾過された培地を、プロテインＡカラムを２回通過させた。５０ｍＬのＰＢＳで洗浄した後、ＩｇＧを、９ｍＬのｐＨ２．２の０．２Ｍグリシンを用いて溶出し、２Ｍ Ｔｒｉｓに回収し、中和を達成した。溶出物を、１０ｋＤａ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して４リットルのＰＢＳに対して透析した。サンプルを、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１ｍＬに濃縮した。
ＩｇＧ結合実験
この実施例では、上記の実施例７に記載されるように作製した５８ｃ５のＩｇＧ形態および抗ＲＳＶ抗体モタビズマブ［Wu et al. (2007) J. Mol. Biol. 368(3):652-665］を、ＲＳＶ Ｆタンパク質（組換え型）またはＲＳＶ Ｆタンパク質（天然）溶解物と結合するその能力についてＥＬＩＳＡによって試験した（上記の実施例４を参照のこと）。結合の推定ＥＣ５０（各ＩｇＧを滴定することによって決定される）が、以下の表１９に示されている。５８ｃ５のＩｇＧ形態は、モタビズマブとほぼ同様のＲＳＶ Ａ２株Ｆタンパク質に対する親和性を有する。
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５８ｃ５のＩｇＧ形態ＲＳＶ中和アッセイ
この実施例では、上記の実施例７において作製した５８ｃ５のＩｇＧ形態およびモタビズマブを、ＲＳＶの種々の株を中和するその能力について試験した。さらに、５８ｃ５のＩｇＧ形態を、種々のモノクローナル抗体耐性ＲＳＶエスケープ突然変異体（ＭＡＲＭ）を中和するその能力について分析した。ＭＡＲＭは、それに対して作製された抗体によってはもはや中和され得ない突然変異体ＲＳＶ株である。したがって、５８ｃ５のＩｇＧ形態の、特定のＭＡＲＭを中和する能力は、５８ｃ５の結合エピトープが、ＭＡＲＭが生じた抗体のものとは異なっていることを示す。
Ａ．ＲＳＶの中和
５８ｃ５のＩｇＧ形態およびモタビズマブを、ＲＳＶを中和するその能力について試験した（上記の実施例６に記載されるような）。以下の表１９〜２１にデータを示す。表２０には、各ＲＳＶ株のＥＤ５０（５０％中和のための有効希釈）が列挙されている。表２１には、変動する抗体濃度での種々のＲＳＶ株のプラーク数が列挙されている。表２２には、変動する抗体濃度での種々のＲＳＶ株のプラーク減少率が列挙されている。結果は、５８ｃ５のＩｇＧ形態が、ＲＳＶの３種の株すべてを中和できることを示す。中和アッセイにおいて得られたデータおよび５８ｃ５断片のＩｇＧ形態の分子量（約１５０ｋＤａ）に基づいて、ＲＳＶのインビトロ中和の５８ｃ５のＩｇＧ形態のＥＣ５０が、約１３３ｐＭであると推定した。モタビズマブは、３６０ｐＭの対応するＥＣ５０を有している。
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Ｂ．ＲＳＶモノクローナル抗体耐性ＲＳＶエスケープ突然変異体の中和
５８ｃ５のＩｇＧ形態をまた、上記の実施例６に記載されるような、いくつかのモノクローナル抗体耐性ＲＳＶエスケープ突然変異体（Ｄｒ．Ｊａｍｅｓ Ｃｒｏｗｅ，Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって提供された）を中和するその能力について試験した。以下の表２３に列挙されるＭＲＭＳは、ＲＳＶ野生型Ａ２株から誘導された。ヒトＦａｂ１９に対して作製されたＭＡＲＭ１９［例えば、Crowe et al., Virology, 252:373-375 (1998)参照のこと］は、イソロイシン２６６のメチオニンへのアミノ酸突然変異を含有する。マウスｍＡｂ１５１に対して作製されたＭＡＲＭ１５１は、リシン２７２からアスパラギンへのアミノ酸突然変異を含有する。パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ）の親抗体であるマウスｍＡｂ１１２９に対して作製されたＭＡＲＭ１１２９は、セリン２７５からフェニルアラニンへのアミノ酸突然変異を含有する。
５８ｃ５のＩｇＧ形態をまた、いくつかのＲＳＶモノクローナル抗体耐性突然変異体（ＭＡＲＭ）を中和するその能力について試験した。データを、以下の表２３〜２４に示す。表２３には、変動する抗体濃度での種々のＭＡＲＭに対する中和のプラーク数が列挙されている。表２４には、変動する抗体濃度での種々のＭＡＲＭに対する中和のプラーク減少率が列挙されている。結果は、ＩｇＧ ５８ｃ５が３種のＲＳＶ ＭＡＲＭすべてを中和できることを示す。したがって、５８ｃ５は、Ｆａｂ１９、マウスｍＡｂ１１２９およびマウスｍＡｂ１５１とは異なるＲＳＶ Ａ２株のエピトープと結合する。
Figure 0005762408
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競合アッセイ
この実施例では、モタビズマブＩｇＧ［Wu et al. (2007) J. Mol. Biol. 368(3):652-665］を、ＲＳＶ Ｆタンパク質との結合についてＦａｂ ５８ｃ５に対して競合するその能力について試験した競合アッセイを実施した。競合の陽性対照として、５８ｃ５のＩｇＧ形態を５８ｃ５ Ｆａｂに対して競合させた。
手短には、組換え型または天然ＲＳＶ Ａ２株Ｆタンパク質のいずれかを含むＥＬＩＳＡプレートを、上記の実施例１に記載されるように調製した。プレートを、１×ＰＢＳ中の４％脱脂粉乳を用いて、３７℃で２時間ブロッキングし、続いて、洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて４回洗浄した。Ｆａｂ ５８ｃ５を、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０中、９μｇ／ｍＬ〜０．０００１μｇ／ｍＬ（試験された実際の濃度：９、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３、０．００１、０．０００３、０．０００１μｇ／ｍＬ）で滴定した。５８ｃ５のＩｇＧ形態およびモタビズマブは、０．５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬおよび０．０１μｇ／ｍＬのいずれかの固定濃度で加えた（以下の表２５に示されるように）。以下の表２６に示されるように、プレートの各ウェルに、希釈されたＦａｂおよび固定濃度のＩｇＧの各５０μＬを、２連で同時に加え、プレートを３７℃で２時間インキュベートし、続いて、洗浄バッファーを用いて４回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−γＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−０９８、１：１０００希釈を加え、プレートを、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄バッファーを用いて６回洗浄した後、５０μＬの１：１ｖ／ｖ ＴＭＢ：過酸化溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０２１）を加え、７分間発展させた。５０μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を直ちに停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
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結果は、以下の表２６に要約されている。モタビズマブは、天然または組換えＲＳＶ Ａ２株Ｆタンパク質のいずれかとの結合について、Ｆａｂ ５８Ｃ５に対して競合しない。
Figure 0005762408
ＲＳＶ ＭＡＲＭ作製および中和アッセイ
この実施例では、モタビズマブおよび５８ｃ５のＩｇＧ形態のモノクローナル抗体耐性ＲＳＶエスケープ突然変異体（ＭＡＲＭ）を作製した。モタビズマブおよび５８ｃ５のＩｇＧ形態を新規に作製されたＭＡＲＭを中和するその能力についてさらに分析した。
Ａ．ＭＡＲＭ作製
１．モタビズマブ
ＲＳＶウイルス力価を３ｌｏｇ低減する（中和アッセイによるＲＳＶ Ａ２ウイルスの９９．９％阻害に相当する）モタビズマブＩｇＧの濃度を、３．２μｇ／ｍＬであると予め決定した。ＲＳＶ Ａ２ウイルス粒子（２×１０６）を、モタビズマブＩｇＧの希釈物とともにプレインキュベートし、この混合物を使用して、Ｖｅｒｏ細胞単層（上記の実施例６に記載されるような）に感染させた。依然として細胞傷害性効果を示す最高抗体濃度を有するウェルを、選択のさらなるラウンドのために選択した。１０ラウンドの選択後、８μｇ／ｍＬモタビズマブの存在下で増殖させたウイルスからプラークを得た。これらのプラークに由来するウイルス粒子を、中和アッセイ（上記の実施例６に記載されるような）において試験し、ＲＮｅａｓｙ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して陽性粒子からＲＮＡを調製した。６種のエスケープ突然変異体を選択し、ＰＣＲによってＦ遺伝子を増幅させた。ＤＮＡを配列決定し、６種のクローンすべてが、親ＲＳＶ Ａ２株（配列番号１６２９に示される）と比較して、位置２７２でのグルタミン酸のリシンとの単一のアミノ酸置換（Ｋ２７２Ｅ、配列番号１６４２）をコードしていた。
以下の表２７には、選択の各ラウンドの細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す最高抗体濃度が示されている。以下の表２７に示されるように、モタビズマブエスケープ突然変異体は、中和アッセイによって決定されるＲＳＶ Ａ２ウイルスの９９．９％阻害に相当するモタビズマブの濃度より高いＣＰＥ（すなわち、＞３．２μｇ／ｍＬ）を示す抗体濃度によって同定されるように、７ラウンドの選択後に同定された。
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２．５８ｃ５のＩｇＧ形態
ＲＳＶウイルス力価を３ｌｏｇ低減する（中和アッセイによるＲＳＶ Ａ２ウイルスの９９．９％阻害に相当する）５８ｃ５のＩｇＧ形態の濃度を、０．８μｇ／ｍＬであると決定した。ＲＳＶ Ａ２ウイルス粒子（２×１０６）を、５８Ｃ５ ＩｇＧの希釈物とともにプレインキュベートし、この混合物を使用して、Ｖｅｒｏ細胞単層（上記の実施例６に記載されるような）に感染させた。依然として細胞傷害性効果を示す最高抗体濃度を有するウェルを、選択のさらなるラウンドのために選択した。１２ラウンドの選択後、２μｇ／ｍＬの５８ｃ５のＩｇＧ形態の存在下で増殖させたウイルスからプラークを得た。これらのプラークに由来するウイルス粒子を、中和アッセイ（上記の実施例６に記載されるような）において試験し、ＲＮｅａｓｙ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して陽性粒子からＲＮＡを調製した。５種のエスケープ突然変異体を選択し、ＰＣＲによってＦ遺伝子を増幅させた。ＤＮＡを配列決定し、５種のクローンすべてが、親ＲＳＶ Ａ２株（配列番号１６２９に示される）と比較して、３つのアミノ酸置換（Ｎ６３Ｋ、Ｍ１１５ＫおよびＥ２９５Ｇ；配列番号１６４３）をコードしていた。
以下の表２８には、選択の各ラウンドの細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す最高抗体濃度が示されている。以下の表２８に示されるように、５８ｃ５のＩｇＧ形態のエスケープ突然変異体は、中和アッセイによって決定されるＲＳＶ Ａ２ウイルスの９９．９％阻害に相当する５８ｃ５のＩｇＧ形態の濃度より高いＣＰＥ（すなわち＞０．８μｇ／ｍＬ）を示す抗体濃度によって同定されるように、１０ラウンドの選択後に同定された。
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Ｂ．中和アッセイ
モタビズマブおよび５８ｃ５のＩｇＧ形態を、ＲＳＶ Ａ２親ウイルス株、モタビズマブＭＡＲＭおよび５８ｃ５のＩｇＧ形態のＭＡＲＭを中和するその能力について試験した。中和アッセイ手順は、上記の実施例６に記載されている。データは、以下の表２９〜３２に示されている。表２９には、ＲＳＶ Ａ２親ウイルスに対する中和のプラーク減少率が列挙されている。表３０には、モタビズマブＭＡＲＭに対する中和のプラーク減少率が列挙されている。表３１には、５８ｃ５のＩｇＧ形態のＭＡＲＭに対する中和のプラーク減少率が列挙されている。表３２は、中和データ（ＥＤ５０値）の要約である。
結果は、両抗体が、親ＲＳＶ Ａ２株を中和でき、ＩｇＧ ５８Ｃ５が最強の活性を示すことを示す（表２９を参照のこと）。５８ｃ５のＩｇＧ形態は、モタビズマブＭＡＲＭを強力に中和し、親株と比較して相違がない（表３０参照のこと）。予想されるように、モタビズマブは、試験された濃度のいずれでもモタビズマブＭＡＲＭを中和できない。モタビズマブは、５８ｃ５のＩｇＧ形態のＭＡＲＭを強力に中和し、中和効力に相違はない（表３１を参照のこと）。予想されるように、５８ｃ５のＩｇＧ形態は、試験された濃度のいずれでも５８ｃ５のＩｇＧ形態のＭＡＲＭを中和できない。結果は、両方の５８ｃ５のＩｇＧ形態が、モタビズマブＭＡＲＭを中和し、競合を示さないことを示す。
Figure 0005762408
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改変は、当業者には明らかであろうから、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるものとする。

Claims (20)

  1. 配列番号２に示されるアミノ酸残基の配列を含むＶＨ ＣＤＲ１と、
    配列番号３に示されるアミノ酸残基の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２と、
    配列番号４に示されるアミノ酸残基の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３と、
    配列番号６に示されるアミノ酸残基の配列を含むＶＬ ＣＤＲ１と、
    配列番号７に示されるアミノ酸残基の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２と、
    配列番号８に示されるアミノ酸残基の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３と
    を含む抗体またはその抗原結合断片であって、
    呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質と免疫特異的に結合し、かつＲＳＶを中和する抗体またはその抗原結合断片。
  2. 配列番号１に示される重鎖および配列番号５に示される軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. ＶＨドメインを含み、ＶＨドメインのアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸１〜１２５として示される、請求項１又は２に記載の抗体または抗原結合断片。
  4. 重鎖を含み、重鎖のアミノ酸配列が配列番号１に示される、請求項１から３のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
  5. ＶＬドメインを含み、ＶＬドメインのアミノ酸配列が配列番号５のアミノ酸１〜１０７として示される、請求項１から４のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
  6. 軽鎖を含み、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号５に示される、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
  7. 多量化ドメインと直接的にまたはリンカーを介して連結しているか、またはポリペプチドリンカーと連結している、請求項１から６のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
  8. タンパク質トランスダクションドメインをさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片。
  9. タンパク質トランスダクションドメインが、配列番号１５２９〜１６００のいずれか１つに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項８に記載の抗体または抗原結合断片。
  10. 多量体化ドメインとコンジュゲートしている、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む第１の抗原結合部分と、
    第２の多量体化ドメインとコンジュゲートしている、抗ウイルス抗体の抗原結合断片を含む第２の抗原結合部分と
    を含む多価抗体であって、
    第１の多量体化ドメインおよび第２の多量体化ドメインが、補完的(complementary)であるか、または同一であり、それによって第１の抗原結合部分および第２の抗原結合部分が多価抗体を形成し、
    第１および第２の抗原結合部分が、同一であるか、または異なっている、多価抗体。
  11. 第２の抗原結合部分が、抗ＲＳＶ抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１０に記載の多価抗体。
  12. 抗ＲＳＶ抗体が、パリビズマブ、モタビズマブ、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１、ＲＦ−２およびそれらの抗原結合断片または下記に記載の５８ｃ５もしくはｓｃ５を含む抗体の中から選択されるか、またはその抗原結合断片である、請求項１１に記載の多価抗体。
    ５８ｃ５：配列番号１で表される重鎖、及び配列番号５で表される軽鎖を含む抗体又は抗体断片
    ｓｃ５：配列番号９で表される重鎖、及び配列番号１３で表される軽鎖を含む抗体又は抗体断片
  13. 第２の抗原結合部分が、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）の抗原と免疫特異的に結合する、請求項１２に記載の多価抗体。
  14. 多量体化ドメインが、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、ロイシンジッパー、相補的(complementary)疎水性領域、相補的親水性領域および適合する(compatible)タンパク質間相互作用ドメインの中から選択される、請求項１０から１３のいずれかに記載の多価抗体。
  15. 請求項１から９のいずれかに記載の単離された抗体もしくは抗原結合断片または請求項１０から１４のいずれかに記載の多価抗体と、
    抗ウイルス薬および第１の抗体とは異なるもう１種類のさらなる抗ウイルス抗体のうち一方または両方と
    を含む組合せ。
  16. １種または複数のさらなる抗ウイルス抗体が、パリビズマブ、モタビズマブ、ＡＦＦＦ、Ｐ１２ｆ２、Ｐ１２ｆ４、Ｐ１１ｄ４、Ａ１ｅ９、Ａ１２ａ６、Ａ１３ｃ４、Ａ１７ｄ４、Ａ４Ｂ４、Ａ８ｃ７、１Ｘ−４９３Ｌ１、ＦＲ Ｈ３−３Ｆ４、Ｍ３Ｈ９、Ｙ１０Ｈ６、ＤＧ、ＡＦＦＦ（１）、６Ｈ８、Ｌ１−７Ｅ５、Ｌ２−１５Ｂ１０、Ａ１３ａ１１、Ａ１ｈ５、Ａ４Ｂ４（１）、Ａ４Ｂ４Ｌ１ＦＲ−Ｓ２８Ｒ、Ａ４Ｂ４−Ｆ５２Ｓ、ｒｓｖ６、ｒｓｖ１１、ｒｓｖ１３、ｒｓｖ１９、ｒｓｖ２１、ｒｓｖ２２、ｒｓｖ２３、ＲＦ−１、ＲＦ−２およびそれらの抗原結合断片の中から選択され、かつ／または
    １種または複数のさらなる抗ウイルス抗体が、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）の抗原と免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の中から選択される、
    請求項１５に記載の組合せ。
  17. １または複数の請求項１から９のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片をコードする核酸分子。
  18. 請求項１から９のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片、または請求項１７に記載の核酸分子を含む、単離された細胞。
  19. 請求項１８に記載の細胞を、コードされる抗体または抗原結合断片が発現される条件下で培養することを含む、抗体またはその抗原結合断片を製造する方法。
  20. ウイルス感染の治療または予防において使用するための請求項１から９のいずれかに記載の抗体もしくは抗原結合断片または請求項１０から１４のいずれかに記載の多価抗体。
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