NL8902087A - Niet-natuurlijk voorkomend pseudorabiesvirus en vaccins die dit bevatten. - Google Patents

Description

Niet-natuurlijk voorkomend pseudorabiesvirus en vaccins die dit bevatten

De uitvinding betreft een niet-natuurlijk voorkomend pseudorabiesvirus (PRV) waarvan het genoom één of meer mutaties bezit.

Pseudorabies is een ziekte van alle huisdieren met uitzondering van het paard en veroorzaakt zware schade, in het bijzonder bij varkens en runderen. Het varken is de natuurlijke gastheer van pseudorabiesvirus, een herpesvirus, dat ook wordt aangeduid als het virus van de ziekte van Aujesky. Bij varkens kan een infectie met PRV een ziekte van de ademhalingsorganen en encephalitis veroorzaken, en kan uiteindelijk tot de dood leiden.

Dieren worden met PRV via de nasale weg geïnfecteerd. Na een aanvankelijke vermeerdering van het virus in de slijmvliezen van het bovenste deel van de ademhalings- en spijsverteringskanalen verspreidt het virus zich via de zenuwen naar de hersenen. De ernst van de infectie kan variëren van acuut tot subklinisch en is voornamelijk afhankelijk van de virulentie van het virus en van de leeftijd van het geïnfecteerde dier.

Om de economische schade, die door sterfte en groeivertraging bij geïnfecteerde dieren optreedt te beperken, worden vaccinaties uitgevoerd. Voor dit doel zijn vaccins op basis van verzwakt levend virus en op basis van geïnactiveerd virus beschikbaar. Verzwakte levende virus-vaccins verdienen in het algemeen de voorkeur, daar ze gemakkelijker bereid kunnen worden en daarom minder kostbaar zijn dan geïnactiveerd virus.

De aanvankelijk ontwikkelende vaccins op basis van verzwakt levend virus bezaten verschillende nadelen. Zo werden deze vaccins in het algemeen geproduceerd door seriële passages van virulente stammen in weefselcultures (50-900 passages) waardoor ongecontroleerde mutaties in het virus werden geïnduceerd. Ten gevolge hiervan was de samenstelling van dergelijke vaccins niet homogeen. De mengsels bevatten virus van varianten van onbekende virulentie en onbekend beschermend vermogen. Bovendien bestond bij dergelijke vaccins het risico van terugkeer tot virulentie.

De ontwikkeling van de technieken voor de manipulatie van genetisch materiaal heeft de mogelijkheid geopend vaccins met verzwakt levend virus te verkrijgen onder vermijding van deze nadelen. De structuur van het PRV-genoom is in de literatuur beschreven (Virology 97» 151-163 (1979)· Het PRV-genoom bevat ongeveer 150.000 nucleotideparen. Het bevat twee omgekeerde herhalingen (inverted repeats) en twee unieke sequenties, een kleine en een grote, die aangeduid worden als Us en UI. Op de basis van de desbetreffende DNA-sequentie is PRV geclassificeerd als een D-herpesvirus.

Het genoom van de virulente PRV-stam NIA-3 is schematisch weergegeven in fig. 1, waarin de restrictie plaatsen van HindlII en BamHI zijn aangegeven. De omgekeerde herhalingen (inverted repeats) zijn aangeduid als IR1 en IRr. Tevens zijn de lange en korte unieke sequenties, UI en Us aangegeven.

In J. gen. Virol. 68, 523~53^ (1987) zijn PRV-deletiemutanten beschreven, die van NIA-3 zijn afgeleid. Deze mutanten hebben een sterk verminderde virulentie, maar induceren toch voldoend hoge neutraliserende anti-lichaamtiters, waardoor de mutanten geschikt zijn voor toepassing in vaccins. De deleties liggen in het MluI-BglII-fragment van BamHI-fragment 7· Thans is gebleken dat door deze mutaties de voor glycoproteinen gl en gp63 coderende genen gedefunctionaliseerd zijn. De beschreven mutanten bezitten ook deleties rond de uiteinden van HindlII-fragment B, die op zichzelf een slechts weinig verminderde virulentie tot gevolg hebben.

Gevonden werd nu, dat PRV-mutanten, waarvan het genoom in vergelijking met het genoom van PRV van het wilde type een door middel van genetische manipulatie gedefunctionaliseerd proteinekinase- en/of 28K gen bezit, repliceerbare virussen zijn.

Verder werd gevonden dat PRV-mutanten, waarvan het genoom een gedefunctionaliseerd proteinekinase-gen bevat een ten opzichte van stammen van het wilde type verminderde virulentie vertonen en daarbij een goede immunogeniciteit bezitten. Defunctionalisering van het 28K-gen heeft daarentegen geen aantoonbare invloed op de virulentie en de immunogeniciteit .

Het feit dat het proteinekinase-gen en het 28K-gen van PRV geen essentiële functie bezitten bij de replicatie van het virus opent de moglijkheid in de regio's van deze genen nuttige mutaties aan te brengen. De uitvinding betreft daarom een niet-natuurlijk voorkomend pseudo-rabies-virus waarvan het genoom een mutatie bezit in de proteinekinase-gen-regio en/of in de 28K-gen-regio, op vaccins die een dergelijk virus bevatten, alsmede op een werkwijze ter bereiding van een vaccin ter bescherming van varkens tegen ziekteverwekkers, waarbij een pseudora-bies-virus volgens de uitvinding tot een farmaceutisch preparaat met immuniserende eigenschappen wordt gevormd.

Onder een mutatie wordt verstaan een verandering van de genetische informatie in bovengenoemde regio's ten opzichte van de genetische informatie die in deze regio's van het genoom van natuurlijk voorkomend pseudorabiesvirus aanwezig is. De mutatie is bijvoorbeeld een nucleine-zuursubstitutie, -deletie, -insertie of -inversie of een combinatie hiervan. In het bijzonder bezit een pseudorabiesvirus volgens de uitvinding een deletie en/of een insertie in één der of beide bovengenoemde regio's.

Het proteinekinasegen is gelocaliseerd in BamHI-fragment 10, dat wil zeggen stroomopwaarts van de sequentie die voor glycoproteine gX codeert. De sequentie die codeert voor het 28K-eiwit ligt stroomafwaarts van het ΙΙΚ-gen (overgang van BamHI-fragment 7 naar fragment 12).

De DNA-sequentie van het proteinekinase (PK)-gen is bepaald en is weergegeven in figuur 2. Daarin zijn de startplaatsen voor de transcriptie aangegeven met horizontale pijlen. TATA-box consensussequenties zijn onderstreept. IR betekent inverted repeat. Het initiatiecodon van het gX-gen is gelegen op positie 1395·

De DNA-sequentie van het 28K-gen is weergegeven in figuur 3· Daarin is de startplaats van de transcriptie eveneens met een horizontale pijl aangegeven. De TATA-box consensussequentie is onderstreept. De poly-A-plaats is dubbel onderstreept. De inverted repeat is weer aangeduid met IR. DR duidt een direct repeat aan (26 bp). Het terminatiecodon van het ΙΙΚ-gen ligt op positie 7·

De positie van de thans bekende, zeven genen in het Us-gebied van PRV blijkt uit figuur 4. In figuur 4A is het HindlII-fragment B van een hieronder nader te beschrijven insertiemutant met gedefunctionaliseerd PK-gen schematisch weergegeven. Figuur 4B toont schematisch het HindlII-fragment B van een hieronder verder te beschrijven deletiemutant met gedefunctionaliseerd 28K-gen.

In figuur 4 zijn de restrictieplaatsen van BamHI met B, die van BglII met Bg en die van HindlII met H aangeduid.

De posities van de DNA-sequenties, die voor PK en het 28K-eiwit coderen zijn als volgt bepaald.

Proteinekinase

Het open leesraam (hierna aangeduid met ORF) van 1170 nucleotiden stroomopwaarts van gX is geheel in het Us-gebied gelegen (figuur 2). In een vitro transcriptie/translatie-experiment is de aanwezigheid van dit ORF bevestigd. Wanneer men aanneemt, dat het eerste ATG-codon op positie I63 als translationeel startcodon fungeert, levert dat een eiwit van 390 aminozuren (43K) op. mRNA-mapping experimenten tonen echter aan dat waarschijnlijk het derde ATG-codon op positie 325 de belangrijkste start start van de translatie vormt. Het eiwit zou dan een lengte van 336 aminozuren (37K) hebben.

In met PRV geïnfecteerde weefselcellen kunnen reeds twee uur na infectie transcripten uit dit gebied aangetoond worden. Met behulp van primer extension experimenten is het 5'-uiteinde van deze 2,7 kb mRNA's nauwkeurig bepaald. Daarbij werden twee transcriptiestartplaatsen gevonden: meer dan 95# van de mRNA's start op positie 258, 260 of 26l (resp. met C, U of A), daarmee coderend voor het 37K-produkt. Het overige deel van de mRNA's start op positie 99 (met A), daarmee coderend voor het 43K-produkt.

Het eiwit bevat geconserveerde domeinen van een serine/threonine-proteinekinase (Science 241, 42-52 (1988)) en is homoloog met het pro-teinekinase dat gecodeerd wordt door Us3 van herpes simplex virus type-1 (HSV-1) (J. Mol. Biol. 181, 1-13 (1985))· Het is daarom aannemelijk, dat dit PRV-eiwit het 38K-proteinekinase (PRV-PK) is, dat gevonden is in met PRV geïnfecteerde cellen (Eur. J. Biochem. 152. 57-65 (1985) en Eur. J. Biochem. 16£, 507-512 (1987))· 28K-eiwit

Het ORF van 768 nucleotiden stroomafwaarts van 11K codeert voor een eiwit van 256 aminozuren (28K) (fig.3) · Ook het bestaan van dit ORF is bevestigd in een in vito transcriptie/translatie-experiment. Het 28K-eiwit is (in geringe mate) homoloog aan het Us2-eiwit van HSV-1 (J. Mol. Biol. 1281, 1-13 (1985)).

Voor 28K specifieke mRNA's zijn reeds waarneembaar 2 uur na infectie van weefselkweekcellen. Het transcriptieniveau is 5 uur na infectie echter aanzienlijk toegenomen. Het 5'-uiteinde van dit 1,15 kb mRNA is bepaald met behulp van primer extension experimenten. De mRNA's starten op positie 146, 147, 148 of 149 (met C, A, C resp. A). In figuur 3 is tevens een klein deel van de sequentie van de inverted repeat weergegeven. Hierin zijn 5 identieke direct repeats aanwezig van 26 bp (en een kortere van 24 bp).

De regio's van het PRV volgens de uitvinding, waarin zich een mutatie kan bevinden worden gekenmerkt door een nucleinezuursequentie die het voor het PK-eiwit of 28K-eiwit coderende gen bevat, alsmede nucleinezuursequenties aan de 5'“ en 3'-zijde van deze genen, waarbij deze flankerende sequenties niet voor een polypeptide coderen. De regio's omvatten derhalve mede de sequenties die van belang zijn voor de regulatie en expressie van de betrokken genen.

Volgens de uitvinding kan een derglijke mutatie aanwezig zijn in de PK-gen-regio en/of in de 28K-gen-regio, welke regio's gekenmerkt zijn door de nucleinezuursequentie 1-139^t zoals afgebeeld in figuur 2, respectievelijk de nucleinezuursequentie 7”1725 zoals afgebeeld in figuur 3·

Bij voorkeur bevindt de mutatie zich in het voor het PK-eiwit coderende en/of in het voor het 28K-eiwit coderende gen. Een zeer geschikte regio voor de insertie is de nucleinezuursequentie 163-1332 weergegeven in figuur 2 en de nucleinezuursequentie 232-999 weergegeven in figuur 3·

Een geschikte mutatie is bijvoorbeeld de insertie van een nucleinezuursequentie van een gen dat afkomstig is van één of meer bij varkens voorkomende ziekteverwekkers, verschillend van PRV. Dit zijn met name nucleinezuursequenties die de voor het induceren van een beschermende immuunrespons relevante genetische informatie bevatten. Na vaccinatie van een dier met een dergelijk recombinant virus volgens de uitvinding kan het virus zich in de geïnfecteerde targetcellen vermenigvuldigen, waardoor een groot aantal vectorpartikels vrijkomt, die de vreemde genetische informatie bevatten. Vervolgens kan dit virus opnieuw targetcellen infecteren waardoor een nieuwe vermenigvuldigingsronde start. Hierdoor wordt bereikt dat grotere doses van het vreemde genpro-dukt aan het immuunapparaat van de gastheer worden aangeboden dan in het algemeen bereikbaar zijn na vaccinatie met een subunit-vaccin.

Hoewel een insertie van een gen van een van PRV verschillende ziekteverwekker zowel in de regio van het proteinekinase-gen als in die van het 28K-gen, of in beide regio's aanwezig kan zijn, verdient de regio van het 28K-gen in het geval van insertie in het genoom van een voor gebruik in vaccins geschikte PRV-stam de voorkeur, omdat defunctio-nalisering van voor het 28K-gen produkt coderende nucleinezuursequenties geen invloed heeft op de replicatie, de virulentie en het immunogeen vermogen van het mutante PRV.

Bij voorkeur is de PRV-vector, in het genoom waarvan vreemde nucleinezuursequenties in het 28K-gen en/of het proteinekinase-gen zijn geïntroduceerd, een PRV dat geattenueerd is door een deletie in het glycoproteine-gl-gen en/of in het thymidinekinasegen.

Insertie van vreemde nucleinezuursequenties kan geschieden op een willekeurige plaats binnen de genoemde regio's, waarbij het PK-gen en/of het 28K-gen geheel of gedeeltelijk gedeleteerd kan zijn.

De genetische informatie, die in aanmerking komt voor insertie in een PRV-vector kan bijvoorbeeld afkomstig zijn van virussen, zoals varkenspestvirus, parvovirus, transmissible gastroenteritisvirus, por- cine endemic diarrhoea-virus en influenzavirus, dan wel van bacteriële ziekteverwekkers, zoals Pasteurella multocida, Bordetella bronchisepti-ca, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteria, Escherichia coli en Leptóspira, dan wel Mycoplasmata, zoals M. hyopneumoniae en M. Lyorhinis en dergelijke.

De technieken om nucleinezuursequenties van ziekteverwekkers in PRV-subgenoomfragmenten te kloneren en vervolgens te integreren in het genoom van een PRV zijn algemeen bekend. Bij wijze van voorbeeld wordt in dit verband verwezen naar de methode, waarbij gebruik gemaakt van de regeneratie van recombinant PRV uit subgenoomfragmenten, beschreven door M. van Zijl et al. in J. Virol. 62, 2191-2195 (1988).

Bij het onderzoek naar de invloed van het defunctionaliseren van het proteinekinase- resp. het 28K-gen van PRV op de replicatie en de virologische eigenschappen werd gebruik gemaakt van insertie, in de desbetreffende genoomregio's, van een oligonucleotide met translatie-stopsignalen dat tevens een restrictieplaats voor een enzym omvat, welke restrictieplaats niet voorkomt in NIA-3. Het toegepaste oligonucleotide heeft de formule 5'-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3' 3'-ATCCGATCTTAAGATCGGAT-5'

Dit oligonucleotide omvat drie translationele stopcodons, TAG, in elk van de mogelijke drie leesramen, in beide richtingen. Bovendien bevat het een EcoRI-herkenningsplaats, GAATTC, en voorts is het oligonucleotide een palindroom. Insertie van dit dubbelstrengs oligonucleotide in elk voor een eiwit coderend gen in elke oriëntatie in elk leesraam leidt tot beëindiging van de translatie van het mRNA van dat gen. De aanwezigheid van de EcoRI-herkenningsplaats (die niet aanwezig is in het NIA-3 genoom) in het oligonucleotide vergemakkelijkt zowel bepaling van de insertieplaats van het oligonucleotide als ook verdere manipulatie van de kloon waarin het oligonucleotide is geïnsereerd.

Het bovengenoemde oligonucleotide kan op bekende wijze worden verkregen door synthese met behulp van de fosforamidiet-methode.

Hierna worden de constructie en de biologische eigenschappen van enige mutanten volgens de uitvinding nader beschreven.

1. Constructie van een kloon van het HindlII-fragment B van PRV stam NIA-3.

Een derivaat van de plasmidevector pBR322 werd geconstrueerd, waarin de EcoRI-plaats gedeleteerd is door behandeling met het Klenow- fragment van DNA-polymerase I in de aanwezigheid van dATP en dTTP. Het 27 kbp HindlII-fragment B van PRV-stam NIA-3 (figuur 1) werd gekloneerd in de HindlII-plaats van de laatstgenoemde vector.

2. Linearisatie van de kloon op quasi-willekeurige plaatsen.

Covalent gesloten circulair DNA (25 pg) van de HindIII-B kloon werd partieel gedigereerd door incubatie, gedurende 15 minuten bij een temperatuur van 37 °C in aanwezigheid van telkens één van de volgende restrictie-enzymen: FnuDII, HaelII en Rsal. De digesties werden uitgevoerd in een oplossing met een volume van 125 μΐ, die naast het DNA ofwel 2 U FnuDII in 20 mM Tris-HCl, pH 7.5. 8 mM MgCl2, 50 pg ethidium-bromide (EtBr), dan wel 1 U HaelII in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 8 M MgCl2, 5 pg/ml EtBr, dan wel 0,5 U Rsal in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5« 50 mM NaCl, 8 M MgCl2, 0,5 pg/ml EtBr bevatte.

Deze partiële digesties resulteerden in het ontstaan van ongeveer 30% lineaire DNA-fragmenten met een volledige lengte, als geschat met behulp van agarose-gel-electroforese. Aangezien de gebruikte restrictie-enzymen herkenningsplaatsen hebben die verspreid liggen over het hele DNA-fragment, kan deze fractie beschouwd worden als zijnde gelineari-seerd op quasi-willekeurige plaatsen binnen de kloon. Dit lineaire DNA werd gezuiverd door middel van centrifugeren in een dichtheidsgradient van cesiumchloride/EtBr ter eliminatie van ongedigereerd gesloten circulair DNA gevolgd door preparatieve agarose-gel-electroforese ter eliminatie van moleculen met enkelstrengs-breuken en van moleculen die meer dan eens geknipt zijn.

3. Insertie van het oligonucleotide in de gelineariseerde HindlII-B kloon.

Van elk van deze 3 partiële digesties werd 1 pg van het gelineariseerde DNA geligeerd met 0,03 Pg van het gekineerde oligonucleotide (een 50-voudige molaire overmaat) in een volume van 15 pl.

Concatemeren van geligeerd HindIII-B fragment en oligonucleotides werden met EcoRI gedigereerd tot fragmenten van volle lengte met oligonucleoti-de-helften aan elk uiteinde. Deze fragmenten werden geïsoleerd door preparatieve agarose-gel-electroforese en electroelutie. Daarna werden de drie DNA-preparaten, resulterend uit de drie partiële digesties, samengevoegd. Van dit DNA werd 0,5 pg gerecirculariseerd door middel van ligatie van de EcoRI halve herkenningsplaatsen aan beide einden van de lineaire HindiII-B fragmenten, in een volume van 400 pl. Uit dit liga-tiemengsel werd DNA geprecipiteerd, opgelost in 10 pl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA. Met dit DNA werd de E. coli stam DH5 getransformeerd, gebruik makend van de methode van Hanahan (DNA Cloning, a Practical

Approach, I.R.L. Press Ltd., U.K., vol. 1, blz. 119-135 (1985))· Dit resulteerde in een serie mutante HindiII-B klonen, elk met het oligonu-cleotide geïnsereerd op een quasi-willekeurige plaats.

4. Analyse van de recombinante klonen.

De integriteit van de recombinante klonen werd onderzocht met behulp van een digestie met de restrictie-enzymen BamHI en HindlII, gevolgd door agarose-gel-electroforese. De plaats van insertie van het oligonucleotide in elk van deze recombinante klonen werd bepaald met behulp van dubbel-digesties met de restrictie-enzymen BamHI + EcoRI en BglII + EcoRI, gevolgd door agarose-gel-electroforese.

5. Reconstructie van mutant pseudorabiesvirus.

De klonering van virale subgenoomfragmenten in de cosmidevector pJBF en de regeneratie van PRV uit subgenoomfragmenten werd uitgevoerd als beschreven door Van Zijl et al., J. Virol. 62, 2191-2195 (1988). De clonering van het Us-bevattende HindlII B-fragment van PRV-stam NIA-3 is beschreven door Quint et al., J. Gen. Virol. 68, 523"534 (1987)·

Teneinde virale inserts vrij van vectorsequenties te verkrijgen, werd het cosmide-DNA gedigereerd met EcoRI en het plasmide-DNA met HindlII, waarna de virale inserts werden gezuiverd met behulp van glyce-rol-gradient-centrifugatie. Voor de constructie van het wildtype PRV cosNIA-3 werden de virale inserts uit de cosmideklonen C-179» C-27 en C-443. alsmede het HindIII-B-fragment gebruikt. Deze gecombineerde fragmenten bevatten de gehele genetische informatie van PRV.

Voor de constructie van de mutant-virussen werd gebruikt gemaakt van de cosmide-klonen C-179. C-27, tevens hetzij C-443 voor de constructie van de 428K mutant of C-447 (cosmide met een deletie van 8 kbp, waardoor de overlap met het HindlII-B-fragment gereduceerd is) voor de constructie van de PK-mutant en tenslotte de mutante HindlII-B-fragmen-ten.

In figuur 5 zijn deze constructies schematisch weergegeven in relatie met de restrictiekaart van NIA-3· De verticale pijltjes geven de plaatsen van insertie van het oligonucleotide weer.

Co-transfectie van PK15-cellen met deze fragmenten gaf, na in vivo homologe recombinatie tussen de overlappende uiteinden van de fragmenten, infectieus virus met de geïntroduceerde mutatie in het HindIII-B fragment. Op deze manier verkregen mutant virus werd 3 maal aan plaque-zuivering op SK6-cellen onderworpen. Vervolgens werd uit met deze mutanten geïnfecteerde SK6-cellen DNA geïsoleerd, waarna dit DNA gedigereerd werd met BamHI en BamHI + EcoRI. Deze DNA-preparaten, alsmede op dezelfde wijze gedigereerd, uit met NIA-3 geïnfecteerde cellen geïsoleerd DNA, werden geanalyseerd door middel van agarose-electroforese.

6. Constructie van NIA-3 PK" en Δ28Κ mutanten.

Gebruik makend van de boven beschreven techniek werd door recombi-natie van fragmenten C-179» C-27, C-447 en HindIII-B-fragment 549 met een insertie van het translatie-terminatie-oligonucleotide in het 5'~ einde van het proteïnekinasegen (figuur 4A) het mutante virus M110 (PK-) verkregen. Door de aanwezigheid van het oligonucleotide wordt de translatie van het PK“m RNA vroegtijdig beëindigd.

De integriteit van het oligonucleotide en van de omliggende virale DNA-sequenties, alsook de exacte plaats van insertie van het oligonucleotide binnen het PK-gen werden bepaald door middel van DNA-sequentie-analyse volgens de methode van Sanger en Coulson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA J4, 5463-5467 (1977)).

Hiertoe werd DNA van de betreffende HindIII-B kloon gedigereerd met de restrictie-enzymen Sau3A + EcoRI en geïnsereerd in de vector M13mpll, die was gedigereerd met BamHI + EcoRI. Uit deze sequentie-analyse bleek, dat geen deleties opgetreden waren ter weerszijden van de plaats van insertie van het oligonucleotide. De plaats van insertie van het oligonucleotide lag tussen baseparen 457 en 458 ten opzichte van het 5'-einde van het PK-transcript, zoals weergegeven in figuur 2A door middel van een verticale pijl.

Oligonucleotide-insertie-mutagenese van het HindIII-B fragment leverde ook twee klonen op met het oligonucleotide geïnsereerd op twee posities in het 28K-gen (HindIII-B-351 en 357)· Deze werden gebruikt om een mutant te verkrijgen waarin het 28K-gen voor het grootste gedeelte is gedeleteerd. Hiertoe werden zowel het mutante HindIII-B fragment 351 alsook 357 gedigereerd met BglII + EcoRI. Beide enzymen knippen eenmaal in de klonen (BglII in het gp50-gen en EcoRI in het geïnsereerde oligonucleotide, figuur 4B), resulterend in twee DNA-fragmenten na digestie. Het 4,9 kbp BglII-EcoRI-fragment van de mutante kloon 357 werd vervangen door het 4,4 kbp BglII-EcoRI-fragment van kloon 351. resulterend in een mutant HindlII-B-fragment met een deletie van ongeveer 0,5 kbp, tussen de oligonucleotide-insertieplaatsen van 351 en 357· Hierdoor is het grootste gedeelte van het 28K-gen gedeleteerd (figuur 4B). Met behulp van de onder 5 beschreven techniek werd met kloon 351-357 mutant virus verkregen, dat verder wordt aangeduid als stam M113 (Δ28Κ).

7. Groei van PK" en 28K-mutanten in weefselkweekcellen.

De 28K-mutante PRV-stam vertoonde in SK6-cellen een met die van NIA-3 vergelijkbare groei. De PK“-mutant groeide langzamer dan NIA-3.

Pathogenitei t en immunogeniciteit

De pathogeniteit en immunogeniciteit van de insertiemutanten M110 (PK-), en de deletiemutant M113 (428K), zijn onderzocht in 10 weken oude biggen, die vrij waren van antilichamen tegen PRV. Er werd ΐΦ PFU intranasaal toegediend. De groepsgrootte bedroeg 8-9 biggen. In experiment 1 werd mutant M110 onderzocht, in experiment 2 mutant M113. In ieder experiment werden twee controlegroepen meegenomen, dat wil zeggen een groep (C) besmet met stam M209 (cosNIA-3) en een onbesmette groep (A). Acht weken na de inenting werden alle biggen ter bepaling van de immunogeniciteit besmet met stam NIA-3· De 18-weken oude, niet besmette groep (A) fungeerde als controle.

Stam M209 (cosNIA-3) is een virulent PRV, dat geregenereerd is uit de cosmidefragmenten C-179» C-27, C-443 en het HindlII-B-fragment van NIA-3.

Pathogeniteit

Na "vaccinatie" met M209 (cosNIA-3) werden de normale klinische symptomen, zoals geen of sterk verminderde eetlust, sloomheid, braken, niezen, neusuitvloeiing en koorts waargenomen. Enkele dieren vertoonden op het moment van observatie tevens neurologische verschijnselen. In beide experimenten stierven 2 van de 6 dieren.

In de volgende tabel zijn de virulentie-gegevens samengevat.

Tabel A Experiment 1.

N.S.*) Mortaliteit MTD Gewichtstoename (kg)

Groep dag 18 - dag 1 A Controle - 0/6 12.5 B M110 (PK-) - 0/7 12.0 C M209 (cosNIA-3) + 2/6 8.0 4.6

Experiment 2.

A Controle - 0/6 13.8 B M113 (Λ28K) + 5/7 7.4 -4.0 C M209 + 2/6 10.0 6.1 ) Neurologische symptomen (ataxie, paralyse, tremor)

In de groep geïnoculeerd met de mutant M110 (PK") bleven de klinische symptomen na vaccinatie beperkt tot sloomheid, verlies van eetlust bij enkele dieren en een verhoging van de lichaamstemperatuur. De lichaamstemperaturen die na inoculatie met M110 (PK-) werden waargenomen, waren duidelijk lager dan na een besmetting met M209 (cosNIA-3)·

Ernstige ziekteverschijnselen, waaronder neurologische verschijnselen, traden op na besmetting met stam M113 028K). In de M113~groep stierven 5 van de 7 biggen. Drie op de dag 7 en twee op dag 8. Van de resterende biggen bleef één chronisch ziek.

De gemiddelde gewichtstoename van de groep besmet met M110 (PK-) bleek vergelijkbaar met die van de onbesmette controlegroep A. Dit stemt overeen met de milde klinische bevindingen na inoculatie met deze mutant.

Gewichtsverlies werd wel waargenomen na infectie met mutant M113 (A28K). Het gewichtsverloop van de M113~groep vanaf dag 9 na besmetting is de resultante van het gewichtsverloop van de twee biggen die de infectie hebben overleefd. Een van deze biggen bleef chronisch ziek en nam geleidelijk in gewicht af, de andere big nam vanaf dag 9 weer in gewicht toe.

Een reductie in de hoeveelheid uitgescheiden virus werd waargenomen na inoculatie met M110 {PK").

Vier dagen na inoculatie werden 2 biggen uit elke groep gedood en werden diverse weefsels/organen (totaal 19 per big) bemonsterd voor virusisolatie. Een samenvatting van de resultaten is weergegeven in onderstaande tabel B.

Uit de resultaten blijkt derhalve dat stam M110 (PK-) een ten opzichte van het oudervirus aanzienlijk gereduceerde virulentie vertoont. Stam M113 (Δ28Κ) heeft daarentegen een met die van de ouderstam vergelijkbare virulentie.

Tabel B

Virusreplicatie in organen (4 dagen na inoculatie)

Experiment 1.

Groep Neus-/keelgebied C.Z.S Long B M110 (PK-) + + + C M209 (cosNIA-3) + + +

Experiment 2.

B M113 (A28K) + + + C M209 (cosNIA-3) + + +

Immunogeniciteit

Biggen "gevaccineerd" met M110 (PK-) en M209 (cosNIA-3) bleken 8 weken na "vaccinatie" zeer goed beschermd tegen een challenge-infectie met NIA-3. Er werden geen groeivertraging, klinische symptomen, significante verhoging van de lichaamstemperatuur en reductie in de voedselop-name waargenomen. De controlebiggen gaven na challenge de normale klinische symptomen, zoals verminderde eetlust, sloomheid, braken, niezen, neusuitvloeiing en koorts te zien. Alle controlebiggen overleefden de challenge-infectie.

De groeivertraging bij de controlebiggen bedroeg 15 dagen.

Opmerkelijk is dat de biggen gevaccineerd met mutantvirus M110 (PK“) na challenge gedurende 7 dagen virus uitscheidden. De zeer hoge neutralise rende antilichaamtiters (hoger dan 1000) in het bloed reduceerden weliswaar de periode en hoogte van virusuitscheiding, maar konden deze niet volledig voorkomen. De waargenomen virusreplicatie vind bevestiging in de toename in serumneutralisatie-titer na challenge.

Claims (8)

1. Een niet-natuurlijk voorkomend pseudorabiesvirus waarvan het genoom een mutatie bezit in de proteinekinase-gen-regio en/of in de 28K-gen-regio.

2. Pseudorabiesvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de mutatie in het proteinekinase-gen en/of in het 28K-gen aanwezig is.

3. Pseudorabiesvirus volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de mutatie een deletie en/of een insertie is.

4. Pseudorabiesvirus volgens conclusie 3» met het kenmerk, dat de insertie een nucleinezuursequentie bevat die codeert voor een antigeen polypeptide karakteristiek voor een bij varkens voorkomende ziekteverwekker.

5- Pseudorabiesvirus volgens conclusie 1-4, met het kenmerk, dat het virus geen functioneel gl-eiwit en/of geen functioneel thymidineki-nase produceert.

6. Pseudorabiesvirus volgens conclusie 1-5, met het kenmerk, dat het virus afgeleid is van de stam NIA-3.

7· Vaccin voor de bescherming van varkens tegen ziekteverwekkers, met het kenmerk, dat het een pseudorabiesvirus volgens conclusies 1-6 bevat.

8. Werkwijze voor de bereiding van een vaccin ter bescherming van varkens tegen ziekteverwekkers, met het kenmerk, dat een pseudorabiesvirus volgens conclusies 1-6 tot een farmaceutisch preparaat met immuniserende eigenschappen wordt gevormd.