JPH09267A - チミジンキナーゼ遺伝子に変異を有する組換えネコヘルペスウイルス１型及びそれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 弱毒化が安定的且つ充分になされ、in vitro
の培養細胞及びネコの生体内での増殖能がいずれにおい
ても充分保持され、免疫原性が優れ、野外株と区別しう
る生物学的及び遺伝的マーカーを明確に有する組換えネ
コヘルペスウイルス１型、及びそれを含むワクチンを提
供することができる。更に、異種免疫原等の外来遺伝子
の産物であるタンパクが安定且つ適度に発現され、且つ
その発現のために外来異種由来のプロモーターを敢えて
挿入する必要性がない組換えネコヘルペスウイルス１
型、及びそれを含むワクチンを提供できる。 【構成】 ネコヘルペスウイルス１型のゲノム中のチミ
ジンキナーゼをコードする遺伝子の少なくともＥｃｏＲ
Ｖ−ＳｍａＩ部位が欠損するか、あるいはＳｍａＩ部位
に、外来遺伝子を挿入させたことを特徴とする組換えネ
コヘルペスウイルス１型及びそれを含むワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ネコのウイルス性疾患
に対するワクチンとして安全で且つ有用な組換えネコヘ
ルペスウイルス１型（以下、ＦＨＶ−１ともいう）およ
びＦＨＶ−１をベクターとして用いた組換え多価ワクチ
ンの開発、並びにそのウイルスを含む培養細胞及び細胞
培養物、該ウイルスを含むワクチン並びにそのワクチン
を用いた免疫感作方法に関するものであり、詳しくはネ
コヘルペスウイルス１型の弱毒化が充分で、該ウイルス
の増殖能力が保持され、且つ免疫原性が優れ、更に明確
な生物学的及び遺伝学的マーカーを有した組換えネコヘ
ルペスウイルス１型、そのウイルスを含む培養細胞及び
細胞培養物、該ウイルスを含むワクチン並びにそのワク
チンを用いた免疫感作方法に関する。

【０００２】

【従来技術】ネコの重要な感染性病原体として、種々の
ウイルスがある。その一つとして、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒ
ｉｄａｅのＡｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ亜科
に属するネコヘルペスウイルス１型がある。ネコヘルペ
スウイルス１型は、ネコのウイルス性鼻気管炎（ＦＶ
Ｒ）を引き起こす病原体として知られ、主として上部呼
吸器疾患を引き起こす最も重要なネコに対する病原体の
一つである。特に、新生あるいは衰弱したネコに対して
のＦＨＶ−１の感染は、重篤な全身性の疾患を生じ、高
い死亡率を示す[Povey, R. C.1979. A review of felin
e rhinotracheitis(feline herpesvirus I infection)C
omp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2 : 373-38
7.] 。

【０００３】多くのＦＨＶ−１株が、世界の種々の地域
で分離されて、幾つかの血清学的な手段により抗原性に
ついて比較検討されてきた。その結果、その種々のＦＨ
Ｖ−１分離株は、各々抗原性における区別がつかなかっ
た〔Bittle, J.L., York, C.J., Newberne, J.W. and M
artin, M. 1960. Serologic relationship of new feli
ne cytopathogenic viruses. Am. J. Vet. Res. 21: 54
7-550 、Crandel, R.A., Genaway, J.R., Niemann, W.
H. and Maurer, F.D. 1960. Comparative studyof thre
e isolates with the original feline viral rhinotra
cheitis virus.Am. J. Vet. Res. 21: 504-506.、Johns
on, R.H. and Thomas, R.G. 1966. Feline Viral rhino
tracheitis in Britain. Vet. Rec. 79: 188-190.、Moc
hizuki,M., Konishi, S. and Ogata, M. 1977. Sero-di
agnostic aspects of feline herpesvirus infection.
Jpn. J. Vet. Sci. 39: 191-194.、Studdert, M.J. and
Martin, M.C. 1970. Virus diseases of the respirato
ry tract of cats: 1.Isolation of feline rhinotrach
eitis virus. Aust. Vet. J. 46: 99-104.、Tan, R.J.
S. 1970. Serological comparisons of feline respira
tory viruses. Jpn. J. Med. Sci.Biol. 23: 419-42
4.〕。

【０００４】しかし、上記種々のＦＨＶ−１のＤＮＡの
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）の切断パターンに
ついては、一部の断片において電気泳動の移動性に僅か
な変化があったものの、著しい変化は見出されていなか
った〔Grail, A. and Harbour, D.A. 1990. Restrictio
n endonuclease analysis of DNA from isolates felin
e herpesvirus type 1. Jpn. J. Vet. Sci. 52: 1007-1
013.、Herrmann, S.C., Gaskell, R.M., Ehlers, B. an
d Ludwig, H. 1984. Characterization of thefeline h
erpesvirus genome and molecular epidemiology of is
olates from natural outbreaks and latent infection
s. pp 321-326. In: Latent herpesvirus infection in
veterinary medicine(Wittmann, A., Gaskell, R.M.,
Ehlers,B. and Rziha, H.J. eds.), Martinus Nijihof
f, Boston. 〕。これらのデータから、ＦＨＶ−１は、
他のα−ヘルペスウイルスと比較して、相同の集団であ
ることが判る。

【０００５】その一方で、野外において毒性の少ないＦ
ＨＶ−１株が存在し、これらの株は弱毒化生ワクチンと
して使用するために選択、及び開発されてきた。これら
のことは、Bittle, J.L., and Rubic, W.J. 1974. Stud
ies of feline viral rhinotracheitis vaccine. Vet.
Med. Small. Anim. Clin. 69:1503-1505. 、Bittle,J.
L., and Rubic, W.J. 1975. Immunogenic and protecti
ve effects of the F-2 strain of feline viral rhino
tracheitis virus. Am. J. Vet. Res. 36: 89-91.、Bi
ttle, J.L. and Rubic, W. J. 1975. A feline caliciv
irus vaccine combined with feline viral rhinotrach
eitis and feline panleukopenia vaccine. Feline. Pr
ac. 5: 13-15. 、Davis, E.V. and Beckenbauer, W.H.
1976. Studies on the safety and efficacy of an int
ranasal feline rhinotracheitis-calici virus vaccin
e. Vet. Med. Small Anim. Clin.71: 1405-1410.、Edwa
rds, B.G., Buell, D.J. and Acree, W.M. 1977. Evalu
ation of a new feline rhinotracheitis virus vaccin
e. Vet. Med Small Anim. Clin. 72: 205-209.、

【０００６】Edwards, B.G., Buell, D.J., Acree, W.
M. and Payne, J.B. 1977. Evaluationof feline rhino
tracheitis / feline panleukopenia combination vacc
ines by consecutive virulent challenge. Feline Pla
c. 7: 45-50.、Orr, C.M., Gaskell, C.J. and Gaskel
l, R.M. 1980. Interaction of an intranasal combine
dfeline viral thinotracheitis, feline calicivirus
vaccine and the FVR carrier state. Vet. Rec. 23: 1
64-166. 、Povey, R.C. and Wilson, M.R. 1978.A comp
arison of inactivated feline viral rhinotracheitis
and feline caliciviral disease vaccines with live
-modified viral vaccines. Feline. Prac. 8: 35-4
2.、37. Scott, F.W. 1975. Evaluation of a feline v
iral rhinotracheitis vaccine. Feline Prac. 5: 17-2
2.、Scott, F.W. 1977. Evaluation of a feline viral
Rhinotracheitis-feline calicivirus disease vaccin
e. Am.J. Vet. Res. 38: 229-234.、Slater, E. and Yo
rk, C. 1976. Comparative studies on parental and i
ntranasal inoculation of an attenuated feline herp
esvirus. Dev. Biol. Standard. 33: 410-416. 、Wilso
n, J.H.G. 1978. Intranasal vaccination against upp
er respiratory tract disease(URD) in the cat. II.
Results of field studies under enzootic conditions
in the Netherlands with a combined vaccine contai
ning live attenuated calici- and herpesvirus. Com
p. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1: 43-48. 等に
記載されている。しかしながら、上記ワクチンには、生
物学的マーカーがなかった。

【０００７】病原性微生物によるネコへの感染を防御す
る方法として、上記のような弱毒化された生ワクチンま
たは不活性化ワクチンを投与する方法がある。しかし、
これらのワクチンには、種々の欠点があった。弱毒化さ
れた生ワクチンは、弱毒化処理が不充分となる場合があ
り、そのためワクチン接種後にウイルスがビルレント状
態になり、接種された動物が発病したり、更に他の個体
に伝染して極めて深刻な問題が起こる。現行の生ワクチ
ンの一つとしてＦ２株がある。このＦ２株は低温継代に
より弱毒化させたものである。前田らは、Ｆ２株のイム
ノブロット解析、ＭｌｕＩによる切断パターン解析等が
マーカーとなりうる可能性を報告してきた。しかし、現
行ワクチン株には、弱毒化を証明できる生物学的、遺伝
学的根拠がなく、更に確立したマーカーもなかった。

【０００８】また、不活性化ワクチンは、不活性化処理
により、中和抗体誘導のための抗原決定基が変性してし
まい、低レベルの免疫原性しか持たない。従って、ワク
チンとして機能を果たさなかったり、２回以上の免疫感
作する必要があった。更に、従来の生ワクチンまたは不
活性化ワクチンでは、生物学的マーカーがなく、感染ま
たはウイルスキャリアーである動物が、野外ウイルス株
によるものなのか、ワクチン投与されたものなのか不明
となる。これにより、野外株である強毒ウイルスの拡散
の状態が把握できなくなり、強毒ウイルスの拡散を防止
できるような対策を講じることができなくなる等の問題
が生じる。

【０００９】一方、多くのα−ヘルペスウイルスのゲノ
ムにおいてコードされているチミジンキナーゼ（ＴＫ）
遺伝子は、活発に分裂している組織培養細胞において、
ウイルスの増殖には必須のものではないことが知られて
いる。しかしながら、α−ヘルペスウイルスにより合成
されたＴＫは、分裂していない細胞におけるウイルスの
増殖を促進するようである〔Field, H.J. and Wildy,
P. 1978. The pathogenicity of thymidine kinase-def
icient mutants of herpes simplex virus. J.Hyg. 81:
267-277.〕。

【００１０】最近、このようなＴＫ遺伝子に変異を起こ
すと、弱毒化することが数多く研究されている。即ち、
ヒト単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus, Ｈ
ＳＶ）、オーエスキー病ウイルス（pseudorabies viru
s, ＰＲＶ）〔Kit, S., Kit,M. and Pirtle, E.C. 198
5. Attenuated properties of thymidine kinase-negat
ive deletion mutant of pseudorabies virus. Am. J.
Vet. Res. 46: 1359-1367. 、Tenser, R.B., Ressel,
S., J., Fralish, F.A. and Jones, J.C. 1983.The rol
e of pseudorabies virus thymidine kinase expressio
n in tregeminalgenglion infection. J. Gen. Virol.
64: 1396-1373.〕、ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ
−１）〔Kit, S., Qavi, H., Gaines, J.D., Billingsl
ey, P. and McConnell, S. 1985. Thymidine kinase-ne
gative bovine herpesvirus type1 mutant is stable a
nd highly attenuated in calves. Arch. Virol. 86: 5
3-83.〕、及びウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−
１）〔Slater, J.D., Gibson, J.S. and Field, H.J. 1
993. Pathogenicity of a thymidine kinase-deficient
mutant of equine herpesvirus 1 in mice and specif
ic pathogen-free foals. J. Gen. Virol 74: 819-82
3.〕のＴＫ遺伝子欠損突然変異体が、それらの自然宿主
あるいはマウスに対して、著しく弱毒化され、更に神経
細胞に潜伏した後の再活性化が起こりにくいようである
〔Efstathiou, S., Kemp, S., Darby, G.and Minson,
A.C. 1989. The role of herpes simplex virus type 1
thymidinekinase in pathogenesis. J.Gen.Virol. 70:
869-879.〕。このようなＴＫ遺伝子突然変異体は、ワ
クチン製造の基礎として提案されてきた。

【００１１】特表平６−５１１３９２号公報には、ＦＨ
ＶのゲノムのＵｓ領域の右側に位置するオープンリーデ
ィングフレーム１〜６のセクションに突然変異を有する
ＦＨＶ−１突然変異体を開示している。しかしながら、
このＦＨＶ−１突然変異体では、ウイルスの弱毒化がい
まだ不充分な場合があり、該ウイルスを接種した場合に
発病してしまう場合がある。更に、上記公報に記載の株
は、弱毒化された株に明確な生物学的マーカーを敢えて
挿入して作成する必要があり、操作が煩雑である。更
に、上記公報に記載の技術では、上記セクションに異種
遺伝子を挿入し発現させる場合、外来プロモーターを外
来遺伝子上流に挿入する必要があり、操作が更に煩雑で
あった。外来のプロモーターを用いた場合には、挿入遺
伝子の適度の発現が異常をきたす場合があり、組換え多
価ワクチンとしての安全性に問題がある。

【００１２】また、上記公報には、ネコ病原体の抗原を
コードする異種ＤＮＡを挿入した組換えＦＨＶ−１を開
示してはいるが、その抗原が in vitro 及び in vivo
で発現するかどうかを明記しておらず、且つその組換え
ＦＨＶ−１をネコに接種した場合の組換え多価ワクチン
としての実際の有用性は不明である。

【００１３】Ｎｕｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．らは（Nunberg,
J.K., Wright, D.K., Cole G.E.,Petrovskis, E.A., P
ost, L.E., Compton, T. and Gilbert, J.H. 1989. Ide
ntification of the thymidine kinase gene of feline
herpesvirus : Use of degenerate oligonucleotides
in the polymerase chain reaction to isolate herpes
virus gene homologus. J. Virol. 63: 3240-324
9.）、ＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子のＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、あるいはＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠
損させた組換えネコヘルペスウイルス１型を報告してい
る。Nunberg らは、前述の文献において、最初に、アメ
リカで分離されたＦＨＶ−１のＵＣ−Ｄ株を用いてＦＨ
Ｖ−１のＴＫ遺伝子を同定した。そのＴＫ遺伝子は、３
４３個のアミノ酸で構成される推定ＴＫタンパク質をコ
ードする１０２９ｂｐ（塩基対）の長さのものであっ
た。かれらは、ＴＫ遺伝子内のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片を欠損させ、ＴＫ^- の表現型を示す組換えＦＨ
Ｖ−１を作出した。

【００１４】一方、Ｃｏｌｅらは、（Cole, G.E., Stac
y-Phipps, S. and Nunberg, J.H. 1990. Recombinant f
eline herpesvirus expressing feline leukemia virus
envelope and gag proteins. J. Virol. 64: 4930-493
7.）において、ＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子のＥｃｏＲＶ−
ＨｉｎｄＩＩＩ、あるいはＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
による部位を欠損させた部分に、ネコ白血病ウイルスの
エンベロープおよびギャグタンパクをコードする遺伝子
の発現カセットを挿入して、それらタンパクが培養細胞
で発現することを報告している。ここでは、ヒトのサイ
トメガロウイルスの最初期プロモーターを利用した発現
カセットをＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子内に挿入している。

【００１５】上記以外にも、〔Kit, S., Kit, M. and P
irtle, E.C. 1985. Attenuated properties of thymidi
ne kinase-negative deletion mutant of pseudorabies
virus. Am. J. Vet. Res. 46: 1359-1367. 、Kit, S.,
Kit, M. and McConnell, S.1986. Intramuscular and
intravaginal vaccination of pregnant cows withthym
idine kinase-negative, temperature-resistant infec
tious bovine rhinotracheitis virus(bovine herpesvi
rus 1). Vaccine. 4: 55-61. 〕において、α−ヘルペ
スウイルス亜科のオーエスキー病ウイルスやウシヘルペ
スウイルス１型のＴＫの不活性化（ＴＫ^- ）は、ウイル
スの病原性と再活性化を軽減することが示された。ＴＫ
遺伝子の突然変異体もしくは組換え欠損体は、免疫防御
のための有効な薬剤、あるいは異種免疫抗原を発現させ
る組換えワクチンのウイルスベクターとして提案されて
いる。

【００１６】しかしながら、Ｃｏｌｅらの技術によれ
ば、ネコ白血病ウイルスのエンベロープおよびギャグタ
ンパクをコードする遺伝子の発現カセットを挿入する部
分が、制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ等による切断末端を有するものであるので、挿入する
外来遺伝子は、その切断末端と一致させるか、あるいは
挿入可能な末端の配列に再構成する必要があり、極めて
煩雑な操作を伴う。また、挿入遺伝子の発現のためにヒ
トのサイトメガロウイルス由来のプロモーターを使用し
ているため、挿入遺伝子の適度の発現が異常をきたす場
合があり、組換え多価ワクチンとしての安全性に問題が
ある。更に、上記文献には組換えウイルスが実際的なワ
クチンとしての特性、即ちネコの生体内での増殖能、免
疫原性及び弱毒性（安全性）を有していることを実証さ
れておらず、果してワクチンとして有用かどうか疑問で
あった。

【００１７】また、Wardley, R. C.らは、上記Ｃｏｌｅ
らによる組換えウイルス（ＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子にネ
コ白血病ウイルスのエンベロープおよびギャグタンパク
をコードする遺伝子の発現カセットを挿入したもの）を
用いて、ネコに対する感染実験を報告している（Wardle
y, R. C. et al, 1992, J. Gen. Virol. 73 : 1811-181
8 ）。しかし、この技術では、ＴＫ欠損ＦＨＶ−１株の
ネコに対する病原性、増殖性に関する詳細な報告はな
い。更に、上記２価ワクチンとともに、バキュロウイル
ス発現タンパクを投与して、１００％防御を成功してい
るのであって、上記組換えＦＨＶ−１株のみの投与では
ない。従って、上記組換えＦＨＶ−１株は、免疫原性に
不十分なところがあった。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】従って、上記のような
種々の従来の技術では、組換えウイルスが生ワクチンと
しての特性が不充分であったり、製造するのに煩雑な操
作が伴ったり、更に実際に生ワクチンとして実用可能な
ことが開示されていないのが実情であり、これら全ての
特性を満足する組換えウイルスがなかった。

【００１９】従って、本発明の目的は、遺伝子操作によ
って弱毒化が安定的且つ充分になされ、in vitroの培養
細胞における増殖能及びネコの生体内での増殖能がいず
れにおいても充分保持され、且つ免疫原性が優れ、更に
野外株と区別しうる生物学的及び遺伝的マーカーを明確
に持っている組換えネコヘルペスウイルス１型、及びそ
れを含むワクチンを提供することである。本発明の別の
目的は、遺伝子操作によって弱毒化が安定的且つ充分に
なされ、in vitroの培養細胞における増殖能及びネコの
生体内での増殖能がいずれにおいても充分保持され、且
つＦＨＶ−１の免疫原性が優れ、更に野外株と区別しう
る生物学的及び遺伝学的マーカーを明確に有し、更に異
種免疫原等の外来遺伝子の産物であるタンパクが安定且
つ適度に発現され、且つその発現のために外来異種由来
のプロモーターを敢えて挿入する必要性がない組換えネ
コヘルペスウイルス１型、及びそれを含むワクチンを提
供することである。本発明の他の目的は、以下の記載か
ら明らかになるであろう。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来
の技術の有する問題点を解決し、本発明の目的を達成す
るため、種々検討を繰り返した。その結果下記構成によ
り、上記目的を達成することを見出した。 （１） ＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅのＡｌｐｈａｈｅ
ｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ亜科に属するネコヘルペスウイ
ルス１型のゲノム中のチミジンキナーゼをコードする遺
伝子の少なくともＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ部位が欠損した
ことを特徴とする組換えネコヘルペスウイルス１型。 （２） ＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅのＡｌｐｈａｈｅ
ｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ亜科に属するネコヘルペスウイ
ルス１型のゲノム中のチミジンキナーゼをコードする遺
伝子内のＳｍａＩ部位に、外来遺伝子を挿入させたこと
を特徴とする組換えネコヘルペスウイルス１型。 （３） 前記ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼ
をコードする遺伝子の少なくともＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ
部位が欠損し、且つ該ＳｍａＩ部位に外来遺伝子を挿入
させたことを特徴とする上記（２）に記載の組換えネコ
ヘルペスウイルス１型。

【００２１】（４） 前記チミジンキナーゼをコードす
る遺伝子が、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列と
少なくともハイブリダイズできるＤＮＡ配列を有し、且
つＥｃｏＲＶ切断部位及びＳｍａＩ切断部位を有するも
のであることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載
の組換えネコヘルペスウイルス１型。 （５） 前記チミジンキナーゼをコードする遺伝子が、
配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列と少なくともハ
イブリダイズできるＤＮＡ配列を有し、且つ配列番号１
の第６１８番目にＥｃｏＲＶ切断部位及び配列番号１の
第１０７４番目にＳｍａＩ切断部位を有するものである
ことを特徴とする上記（４）に記載の組換えネコヘルペ
スウイルス１型。 （６） 前記ネコヘルペスウイルス１型が、Ｃ７３０１
株であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載
の組換えネコヘルペスウイルス１型。 （７） 前記外来遺伝子が外来免疫原をコードする遺伝
子の少なくとも１つであることを特徴とする上記（２）
又は（３）に記載の組換えネコヘルペスウイルス１型。

【００２２】（８） 前記外来免疫原をコードする遺伝
子が、ネコカリシウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ
パルボウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネココロナウ
イルス、ネコロタウイルス及びネコクラミジアのうち少
なくとも１種の病原体に対する免疫原となるタンパク質
をコードする遺伝子の少なくとも１つであることを特徴
とする上記（７）に記載の組換えネコヘルペスウイルス
１型。 （９） 前記外来免疫原をコードする遺伝子が、ネコカ
リシウイルスのカプシド蛋白をコードする遺伝子である
ことを特徴とする上記（８）に記載の組換えネコヘルペ
スウイルス１型。 （１０） 前記ネコヘルペスウイルス１型のゲノム中に
ネコカリシウイルスに対する免疫原を発現しうる外来遺
伝子を発現可能なように挿入させたことを特徴とする上
記（１）又は（２）に記載の組換えネコヘルペスウイル
ス１型。 （１１） 前記外来遺伝子が医薬用または診断用ポリペ
プチドをコードする遺伝子の少なくとも１つであること
を特徴とする上記（２）又は（３）に記載の組換えネコ
ヘルペスウイルス１型。 （１２） 医薬用または診断用ポリペプチドが、リンホ
カイン、インターロイキン、インターフェロン又はサイ
トカインである上記（１１）に記載の組換えネコヘルペ
スウイルス１型。 （１３） 前記外来遺伝子が、ネコヘルペスウイルス１
型由来のプロモーターで発現されることを特徴とする上
記（２）又は（３）に記載の組換えネコヘルペスウイル
ス１型。

【００２３】（１４） 上記（１）〜（１３）のいずれ
か１つに記載の組換えネコヘルペスウイルス１型ＤＮＡ
でトランスフェクトされた培養細胞。 （１５） 上記（１）〜（１３）のいずれか１つに記載
の組換えネコヘルペスウイルス１型の作出に必要なトラ
ンスファーベクターとネコヘルペスウイルス１型のゲノ
ムＤＮＡとをコトランスフェクトされた培養細胞。 （１６） 上記（１）〜（１３）のいずれか１つに記載
の組換えネコヘルペスウイルス１型に感染した細胞培養
物。 （１７） 上記（１）〜（１３）のいずれか１つに記載
の組換えネコヘルペスウイルス１型を少なくとも含むこ
とを特徴とするワクチン。 （１８） 上記（１７）に記載のワクチンを、ネコの
眼、鼻及び口経由又は筋肉内、静脈内あるいは皮下注射
により投与することを特徴とする感染性疾患に対するネ
コの免疫感作方法。

【００２４】本発明においては、遺伝子操作（組換え技
術）を用いて、ＦＨＶ−１のゲノム中のチミジンキナー
ゼをコードする遺伝子内の少なくともＥｃｏＲＶ−Ｓｍ
ａＩ部位を欠損させるか、あるいは該ＳｍａＩ部位に外
来遺伝子を挿入することにより、他の増殖特性をつかさ
どる遺伝子及び免疫原をコードする遺伝子等を変異させ
ることなく、in vitroのウイルス増殖能を保持し、且つ
見事にネコに対する弱毒化が安定的且つ充分になされて
いた。これら組換えウイルスはネコの生体内においても
増殖能が充分保持され、且つネコ生体内での免疫原性が
優れていた。更に、ＴＫ遺伝子に上記の組換えを起こす
ことにより、ワクチン株としての生物学的及び遺伝学的
マーカーを明確に含有させ、ＴＫ⁺ の表現型を有する野
外株と区別することが可能となった。前述の如く、ＴＫ
活性の欠損と、他のα−ヘルペスウイルスにおける弱毒
化との関係が示唆されているが、in vivo においてＴＫ
遺伝子を欠損した組換えＦＨＶ−１の増殖特性及び弱毒
化が詳細には報告されていなかった。本発明において
は、ＴＫ遺伝子内のＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ部位を欠損さ
せた組換えＦＨＶ−１は、実際にネコに対してのワクチ
ンとしての有用性が明確に実証された。

【００２５】ＦＨＶ−１のゲノムのＴＫ遺伝子には、ユ
ニークなＳｍａＩ部位を有し、それは外来遺伝子のＤＮ
Ａ断片を挿入することができる効果的な部位である。そ
れゆえ、ＳｍａＩ部位に外来免疫原をコードする遺伝子
等の外来遺伝子を挿入した組換えＦＨＶ−１は、弱毒
化、増殖特性、ＦＨＶ−１の免疫原性が充分保持され、
且つ生物学的及び遺伝的マーカーを有するばかりでな
く、培養細胞あるいは宿主生体内において外来遺伝子
を、安定的且つ充分に発現させることができ、安全で極
めて有用な組換え多価生ウイルスワクチンである。本発
明のワクチンでは、挿入された外来遺伝子が、培養細胞
で安定的に発現し、且つ該ワクチンとしての組換えウイ
ルスをネコの生体内に投与することにより、該生体内で
外来遺伝子の産物に対する中和抗体の誘導が明確に示さ
れた。

【００２６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて用いることができるＦＨＶ−１としては、公知の
いずれの株でも用いることができる。具体的には、配列
表の配列番号１に記載のチミジンキナーゼ（以下、ＴＫ
ともいう）の遺伝子配列（ＴＫをコードする遺伝子；配
列番号１の第２６９番目〜第１３００番目）とハイブリ
ダイズできるＴＫの遺伝子配列を有し、ＥｃｏＲＶ及び
／又はＳｍａＩによる切断部位を有するＦＨＶ−１であ
ることが好ましい。そのような株としては、例えば、Ｆ
２株〔Bittle, J.L., and Rubic, W.J. 1975. Immunoge
nic and protective effects of the F-2 strainof fel
ine viral rhinotracheitis virus. Am. J. Vet. Res.
36: 89-91.〕、標準株であるＣ２７株〔Crandell, R.
A. and Maurer, F.D. 1958. Isolation ofa associated
with intranuclear inclusion bodies. Proc. Soc. Ex
p. Biol.Med. 97: 487-490.〕、日本における分離体で
あるＣ７３０１およびＣ７８０５〔Mochizuki, M., Kon
ishi, S. and Ogata, M. 1977. Studies on cytopathog
enic viruses from cats with respiratory infection
s. III. Isolation and certain properties of feline
herpesviruses. Jpn. J. Vet. Sci. 39: 27-37. 〕、
ＵＣ−Ｄ株等を挙げることができる。この中で、Ｃ７３
０１株及びＵＣ−Ｄ株が好ましく、より好ましくはＣ７
３０１株を用いることができる。

【００２７】ＦＨＶ−１のゲノムは、図１のＡに示すよ
うに、長さ約１２６ｋｂｐを有し、ＵL として表される
約９９ｋｂｐの領域と、ＵS として表される約２７ｋｂ
ｐの領域から構成され、ＴＫの遺伝子は、図１のＢに記
載のように、ＵL 領域のほぼ中央に位置すると報告され
ている。また、本発明者らは、ＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子
はｇＨに相同の遺伝子の上流に位置すると、文献〔Maed
a, K., Kawaguchi, Y., Kamiya, N., Ono, M., Tohya,
Y., Kai, C. and Mikami, T. 1993. Identification an
d nucleotide sequenceof a gene in feline herpesvir
us type 1 homologous to the herpes simplexvirus ge
ne encoding the glycoprotein H. Arch. Virol. 132:
183-191.〕において報告した。

【００２８】本発明の組換えネコヘルペスウイルスは、
１つの態様として、ＴＫ遺伝子中の少なくともＥｃｏＲ
Ｖ−ＳｍａＩ部位を欠損させたＦＨＶ−１であり、上記
本発明の組換えウイルスの特性を満足すれば、他の部分
が欠損、置換、挿入等の変異を有していてもよい。好ま
しくは、配列番号１に記載のＴＫ遺伝子のＥｃｏＲＶ−
ＳｍａＩ部位の４５０ｂｐを欠損させたものが好まし
い。

【００２９】本発明の組換えネコヘルペスウイルスは、
別の態様として、ＴＫ遺伝子中の少なくともＳｍａＩ部
位に外来遺伝子を挿入させたＦＨＶ−１であり、上記本
発明の組換えウイルスの特性を満足すれば、他の部分が
欠損、置換、挿入等の変異を有していてもよい。好まし
くは、配列番号１に記載のＴＫ遺伝子内のＥｃｏＲＶ−
ＳｍａＩ部位の４５０ｂｐの断片を欠損させ、且つ該Ｓ
ｍａＩ部位に外来遺伝子を挿入させたものである。これ
により、ＦＨＶ−１の弱毒化がより良好になり、且つ外
来遺伝子を発現させる場合には、その発現が保持され
る。

【００３０】本発明においては、配列番号１に記載のよ
うに、ＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子内に本来有するＥｃｏＲ
Ｖ及び／又はＳｍａＩによる切断部位を利用した組換え
ウイルスでもよいが、遺伝子操作により、人為的にそれ
らの切断部位及び他の種々の制限酵素による切断部位を
設けてもよい。しかし、本来有するＥｃｏＲＶ及び／又
はＳｍａＩによる切断部位を利用した組換えウイルス
が、操作上好ましい。

【００３１】上記のようにＴＫ遺伝子を欠損させる際
に、遺伝子組換え技術の操作上僅かなＤＮＡ配列が欠損
部位に挿入される場合を本発明は含む。

【００３２】ここで、上記外来遺伝子とは、上記チミジ
ンキナーゼをコードする遺伝子とは異なるＤＮＡ配列で
あり、その挿入により適正なチミジンキナーゼの発現を
妨げるものである。そのようなＤＮＡ配列としては、ウ
イルス、原核細胞、真核細胞由来のもの、あるいは合成
されたもののいずれでもよい。外来遺伝子としては、外
来免疫原をコードする遺伝子、医薬用または診断用ポリ
ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子等を挙げる
ことができる。外来免疫原をコードする遺伝子として
は、例えば、ネコカリシウイルス、ネコ白血病ウイル
ス、ネコパルボウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ
コロナウイルス、ネコクラミジア、及びネコロタウイル
スのうち少なくとも１種の病原体に対する免疫原となる
タンパク質をコードする遺伝子の単独あるいはそれらの
２種以上を挙げることができる。外来免疫原をコードす
る遺伝子として好ましくはネコカリシウイルスのカプシ
ド蛋白をコードする遺伝子、ネコ免疫不全ウイルスのエ
ンベロープ及び／又はギャグ蛋白をコードする遺伝子で
あり、より好ましくはネコカリシウイルスのカプシド蛋
白をコードする遺伝子である。

【００３３】医薬用または診断用ポリペプチドまたはタ
ンパク質としては、リンホカイン、ネコのＩＬ−６等の
インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン等
を挙げることができる。

【００３４】本発明の別の態様として、前記組換えＴＫ
遺伝子欠損ネコヘルペスウイルス１型のゲノム中にネコ
カリシウイルスに対する免疫原を発現しうる外来遺伝子
を発現可能なように挿入させた組換えネコヘルペスウイ
ルス１型がある。ネコカリシウイルスに対する免疫原を
発現しうる外来遺伝子とは、好ましくはカプシド蛋白を
コードする遺伝子である。この遺伝子の挿入可能なＦＨ
Ｖ−１の遺伝子領域は、ウイルス増殖に非必須領域で発
現可能な部位であれば、いずれの部分でもよい。その領
域として具体的には、ＦＨＶ−１のｇＩ、ｇＥ等をコー
ドする遺伝子領域が挙げられる。

【００３５】上記外来遺伝子を発現させるために、外来
のプロモーターを挿入してもよい。そのようなプロモー
ターとしては、公知のいずれのプロモーターを用いても
よいが、例えばレトロウイルスのＬＴＲのプロモータ
ー、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス由来
のプロモーター等を挙げることができる。本発明におい
ては、配列番号１に示すＴＫ遺伝子のＳｍａＩ部位に挿
入することにより、ＦＨＶ−１由来の発現プロモーター
を使用でき、外来プロモーターを敢えて挿入する必要が
なくなり、遺伝子操作がより簡単にできる。更に、ＦＨ
Ｖ−１由来の発現プロモーターを使用できることから、
外来遺伝子の発現がより安定的となる。遺伝子操作の
際、外来プロモーターを挿入して、遺伝子の発現を行っ
た場合にその遺伝子の発現が安定的に行われない場合が
ある。更に、外来プロモーターを用いた組換え多価ワク
チンが宿主に接種された場合、宿主遺伝子内に該外来プ
ロモーターが挿入されたり、該遺伝子が他の種の宿主に
広がるといった、予期せぬ重大な悪影響を及ぼす可能性
がある。本発明においてＦＨＶ−１由来の発現プロモー
ターを使用できる場合には、この懸念がなくなる。

【００３６】上記のように、外来免疫原をコードする遺
伝子を導入した組換えウイルスをネコの生体内に接種す
ることにより、生体内で連続的に外来免疫原をコードす
る遺伝子が安定的に発現できる。そのため、ネコ生体内
でＦＨＶ−１に対する感染免疫防御応答を誘発するばか
りでなく、その外来免疫原を有する特定の病原体に対し
ても感染免疫防御応答を誘発できる。それにより、その
ウイルス接種後に、それら病原体が感染したとしても、
発症せず、完全且つ確実に防御できるようになる。即
ち、本発明の組換えウイルスは多価ワクチンとして極め
て有効なものである。

【００３７】本発明の組換えネコヘルペスウイルス１型
の作製方法としては、上記構成となれば、いずれの公知
の遺伝子組換え技術を用いることができる。そのような
方法としては、トランスファーベクターを作製し、ウイ
ルスＤＮＡとともに培養細胞へコトランスフェクトし、
相同組換えを起こさせるコトランスフェクション（Ｃｏ
−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法やトランスファーベク
ターのみ培養細胞にトランスフェクトし、後に親ウイル
スを感染させる手法等の方法が挙げられる。好ましく
は、コトランスフェクション法である。

【００３８】コトランスフェクション法としては、具体
的には、まず組換えを受けるＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子を
含むゲノムＤＮＡ断片をプラスミド、コスミド、ファー
ジ等のベクターに導入してクローニングする。そのベク
ターをＳｍａＩとＥｃｏＲＶといった種々の制限酵素で
切断し、公知の遺伝子組換え技術を用いてＴＫ遺伝子内
を欠損させたり、あるいはリガーゼ等の結合酵素により
外来遺伝子を組み込むことで目的のトランスファーベク
ターを作製する。ここで、用いることのできるベクター
としては、公知のプラスミド、コスミド、ファージ等を
用いることができる。好ましくはマルチクローニングサ
イトを有するものが好ましい。

【００３９】上記トランスファーベクターとＦＨＶ−１
のゲノムＤＮＡとを、ＣＲＦＫ細胞等のネコ由来の培養
細胞にコトランスフェクションしたのち、相同組換えを
起こし増殖した組換えウイルスを、チミジンアラビノシ
ド（以下、ａｒａＴともいう）の存在下で培養細胞中で
増殖させる。ａｒａＴを加えた培養下では、ＴＫ^- 表現
型を有する組換えウイルスのみが選択的に増殖させるこ
とができる。本発明の場合には、敢えてβ−ガラクトシ
ダーゼといった組換えを示すマーカー遺伝子を挿入した
り、組換え体の遺伝子解析をせずとも、ａｒａＴを用い
れば本発明のウイルスを容易に選択できる。

【００４０】また、外来遺伝子を有する組換えウイルス
を作製する方法も、上記と同様に行うことができる。即
ち、上記のように少なくともＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子を
含むクローニングプラスミドのゲノムＤＮＡ断片を挿入
部位に応じてＳｍａＩ等の制限酵素で切断し、その部位
に１種以上の外来遺伝子を導入したトランスファーベク
ターを作製し、以下は上記と同様にして、外来遺伝子を
含む組換えＦＨＶ−１を作製できる。また、ＳｍａＩ−
ＥｃｏＲＶ断片が欠失した上記トランスファーベクター
のＳｍａＩ部位に、１種以上の外来遺伝子を導入したト
ランスファーベクターを作製し、以下は上記と同様にし
て、外来遺伝子を含む組換えＦＨＶ−１を作製できる。
本発明において、外来遺伝子を導入する部位が独特なＳ
ｍａＩ部位が理想とする特徴とは、その切断面が平滑末
端であることによる。粘着末端を有する場合と比べ、外
来遺伝子を容易に導入できる。多くの制限酵素による切
断末端は特異的で、挿入遺伝子はその末端に結合できる
ように末端配列を操作する必要があり、極めて煩雑な操
作を伴う。挿入部位としてＳｍａＩ部位を設定したこと
は極めて理想的といえる。上記で得られた組換えウイル
スは、遺伝子の塩基配列の解析、制限酵素地図の作製に
よる解析、あるいはハイブリダイゼーションおよびＰＣ
Ｒ法による解析技術による解析を行うことにより、正確
な欠損あるいは挿入を確認することができる。

【００４１】本発明において、上記の組換えウイルスを
含むワクチンの製造方法としては、上記の組換えウイル
スをその培養細胞で増殖させ、その細胞培養物、あるい
は培養細胞を分離し、その中から組換えウイルスを回収
して、懸濁液あるいは凍結乾燥されたものに、必要によ
り添加物を加えて、ワクチンとして使用できる。上記添
加物としては、炭水化物（ソルビトール、マンニトー
ル、澱粉、シュークロース、グルコース、デキストラン
等）、安定剤、アルブミンやカゼイン等のタンパク質、
ウシ血清、脱脂乳、燐酸緩衝液等のバッファー、水酸化
アルミニウム、燐酸アルミニウム、酸化アルミニウム、
油エマルジョン、サポニン、ビタミン類等の任意のアジ
ュバント等の単独あるいはその２種以上を挙げることが
できる。

【００４２】本発明において、組換えウイルスの投与量
としては、ネコの年齢、体重、投与法、挿入された外来
遺伝子の種類により、適宜設定される。具体的な目安と
しては、１０³ 〜１０⁷ ＰＦＵ／ネコ１匹である。本発
明のワクチンをネコに投与して免疫感作する場合には、
ネコの眼、鼻及び口経由又は筋肉内、静脈内、皮下、腹
腔内注射により行うことができる。本発明の組換えワク
チンが、鼻気管炎等の気道感染に関わる場合には、眼、
鼻及び口経由で投与されることが好ましい。これによ
り、自然感染経路である眼、鼻及び口の粘膜上皮で局所
的に免疫が早期に付与されて、野外強毒病原体による発
症を即座に防御できる。

【００４３】本発明は、上記組換えウイルスにより外来
遺伝子の産物を発現させることで成立する組換え多価ワ
クチン、医薬製剤、あるいは診断用製剤をも包含する。
外来遺伝子の産物を発現させるには、上記の本発明の組
換えネコヘルペスウイルス１型ＤＮＡでトランスフェク
トされた培養細胞を用いたり、上記本発明の組換えネコ
ヘルペスウイルス１型の作出に必要なトランスファーベ
クターとネコヘルペスウイルス１型のゲノムＤＮＡとを
コトランスフェクトされた培養細胞を用いることができ
る。また、上記の本発明の組換えネコヘルペスウイルス
１型に感染した細胞培養物も上記種々の製剤に用いるこ
とができる。ここで、細胞培養物は、培養細胞、その培
養上澄み等を含む。また、上記組換えウイルスあるいは
上記外来タンパク質により、所定の方法により誘導され
た抗血清、ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル
抗体を用いて、その病原体に感染したネコを治療した
り、診断したり、抗イディオタイプ抗体を製造したりで
きる。

【００４４】本発明の組換えウイルス及びワクチンが用
いることができる動物としては、該ウイルスが増殖でき
る動物であればいずれの動物にも用いることができる。
好ましくはネコ科の種に用いる。より好ましくは、所謂
家畜あるいは愛玩用のネコに用いる。

【００４５】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するために実
施例を示すが、これは本発明を限定するものではない。

【００４６】実施例１ ウイルス、細胞、及び培養液 日本において１９７３年に呼吸器の疾患を有するネコか
ら分離されたＦＨＶ−１のＣ７３０１株〔Mochizuki,
M., Konishi, S. and Ogata, M. 1977. Studieson cyto
pathogenic viruses from cats with respiratory infe
ctions. III. Isolation and certain properties of f
eline herpesviruses. Jpn. J. Vet. Sci. 39: 27-37.
〕が、組換えＦＨＶ−１の構築のための親株として使
用された。親ウイルスと組換えウイルスはＣＲＦＫ細胞
（Crandell feline kidney cell ）の中で増殖させた。
その細胞の培養液としては、８％の非働化された牛胎児
血清（ＦＣＳ）と抗生物質を添加されたＤＭＥＭ（Dulb
ecco's modified Eagle's medium）（シグマケミカル社
製、ミズーリ、ＵＳＡ）を用いた。感染後、細胞はＦＣ
Ｓを除く以外上記と同様の培養液で維持された（維持培
養液）。

【００４７】ＦＨＶ−１のＣ７３０１株のＴＫ遺伝子の
配列の解析 本発明者らは、以前、６．６キロベースペアー（ｋｂ
ｐ）のＥｃｏＲＩ断片をクローニングし、マッピングを
行い、そして該断片内の３７４６ｂｐのＳａｃＩ断片を
配列決定した〔Maeda, K., Kawaguchi, Y., Kamiya,
N., Ono, M., Tohya, Y., Kai, C. and Mikami, T. 199
3. Identification and nucleotide sequence of a gen
e in feline herpesvirus type 1 homologous to the h
erpes simplex virus gene encoding the glycoprotein
H. Arch. Virol. 132: 183-191.〕。この文献におい
て、ＦＨＶ−１のＣ７３０１株のＴＫ遺伝子は、ｇＨと
相同な遺伝子の上流に位置していることが報告されてい
る。該株のＴＫ遺伝子の配列決定をするために、プラス
ミドブルースクリプト（pBluescript)ＳＫ＋のマルチク
ローニングサイトに、各々１．８ｋｂｐのＢａｍＨＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片、０．５ｋｂｐのＢａｍＨＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片と０．８ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片をサブクローニングした。ＤＮＡの配列決定
は、ＡＢＩ社製（Applied Biosystems, Foster City Ca
nada) のＤｙｅ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ配列決定方
法を使用し、ＡＢＩ社製３７０Ａ型オートシーケンサー
で分析して行った。

【００４８】ＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子の全配列は、アメ
リカのＦＨＶ−１株ＵＣ−Ｄにおいて決定されている
〔Nunberg, J.K., Wright, D.K., Cole G.E., Petrovsk
is, E.A., Post, L.E., Compton, T. and Gilbert, J.
H. 1989. Identification of the thymidine kinase ge
ne of feline herpesvirus : Use of degenerate oligo
nucleotides in the polymerase chain reaction to is
olate herpesvirus genehomologs. J. Virol. 63: 324
0-3249. 〕。ここで、上記のように日本での分離標準株
であるＣ７３０１株のＴＫ遺伝子の配列を決定した。こ
れらのＵＣ−Ｄ株とＣ７３０１株とでは、ＴＫ遺伝子の
ヌクレオチド配列に違いはなく、ＦＨＶ−１のＴＫ遺伝
子の著しい相同性を示した。

【００４９】ＴＫ遺伝子を欠損させた組換えＦＨＶ−１
の作出 （トランスファーベクターの構築）プラスミドｐＵＣ１
９にＦＨＶ−１Ｃ７３０１株の１９ｋｂｐのＳａｌＩ断
片（図１ＡにおけるＡ断片）〔Rota, P.R., Maes, R.K.
and Ruyechan, W.T. 1986. Physical characterizatio
n of the genome of feline herpesvirus-1. Virolog
y. 154: 168-179. 〕からＴＫ遺伝子を含む５．５ｋｂ
ｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をクローニングし、５．
５ｋｂｐの断片（図２Ｂ）のマッピングを行った。その
プラスミドは、ｐｆＴＫ−ＳＢと称し、トランスファー
ベクターの作製のために使用した。ｐｆＴＫ−ＳＢはＥ
ｃｏＲＶとＳａｌＩで切断し、３．３ｋｂｐのＥｃｏＲ
Ｖ−ＳａｌＩ断片をアガロースゲル電気泳動で分離し
た。３．３ｋｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ断片は、プラ
スミドブルースクリプト（pBluescript)ＳＫ−のＥｃｏ
ＲＶ−ＳａｌＩ部位にサブクローニングし、ｐｆＴＫ
（Ｅｖ−Ｓａ）とした。更に、ｐｆＴＫ−ＳＢはＢａｍ
ＨＩとＳｍａＩで切断し、分離した１．７ｋｂｐのＢａ
ｍＨＩ−ＳｍａＩ断片をｐｆＴＫ（Ｅｖ−Ｓａ）のＢａ
ｍＨＩ−ＳｍａＩ部位にサブクローニングした。そのプ
ラスミドは、ｐｆＴＫ−ＳＢΔＳＥ（図１Ｃ）と称し、
トランスファーベクターとして用いられた。

【００５０】（組換えＦＨＶ−１の作出と選択）Ｃ７３
０１株によるＣＲＦＫ感染細胞より抽出されたウイルス
ＤＮＡとトランスファーベクターｐｆＴＫ−ＳＢΔＳＥ
は、リン酸カルシウム沈澱法〔Graham,F.L. and van de
r Eb, A.J. 1973. A new technique for the assay of
infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 5
2: 456-467.〕によりＣＲＦＫ細胞にコトランスフェク
ションされた。増殖したウイルスの中から目的の組換え
ウイルスを、１００μｇ／mlのチミジンアラビノシド
（ａｒａＴ）の存在下で選択した。選択されたウイルス
は後述するように３回プラーク純化を行った。

【００５１】ＴＫ遺伝子を欠損した組換えウイルスを作
出するために、ＣＲＦＫ細胞の中にＣ７３０１のウイル
スＤＮＡとトランスファーベクターｐｆＴＫ−ＳＢΔＳ
Ｅとをコトランスフェクションして、感染細胞を得た。
ＴＫ遺伝子欠損のウイルスは、ＴＫ⁺ 表現型を示すウイ
ルスの複製を阻害するａｒａＴを培養液に加えることで
その感染細胞より選択された〔Schinazi, R.F., Willia
ms, C.C., Fritz, M.E. and Nahmias, A.J. 1981. The
effect of pyrimidine and purine nucleosides on the
feline(herpes) rhinotracheitis virus in feline to
ngue cells. pp681-682. In : The human herpesviruse
s(Nahmias, A.J., Dowdle, W.R. and Schinazi, R.F. e
ds), Elsevier/North-Holland Publishing Co., New Yo
rk.〕。これらのａｒａＴ耐性のウイルスの一つを用
い、３回プラーク純化し、それをＣ７３０１ｄｌＴＫと
称する。Ｃ７３０１ｄｌＴＫがＴＫ遺伝子の中の予定さ
れた欠損を有するかどうかを検査するために、組換え体
（Ｃ７３０１ｄｌＴＫ）と親株（Ｃ７３０１）のＤＮＡ
を抽出して、サザンブロット法及びＰＣＲ法を用いたＴ
Ｋ遺伝子の解析を行った。

【００５２】（感染細胞からのウイルスＤＮＡの抽出）
ＣＲＦＫ細胞の単層培養に、１細胞あたり３プラーク形
成単位（ＰＦＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）でＣ７３０１
株あるいは組換えウイルス（Ｃ７３０１ｄｌＴＫ）を感
染させた。細胞変性効果（ＣＰＥｓ）が充分に進行した
後、感染細胞は燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で一度洗浄され、
ＤＮＡ抽出バッファー〔１％ＳＤＳ、０．１ＭトリスＨ
Ｃｌ（ｐＨ９．０）、０．１ＭのＮａＣｌ及び１ｍＭの
ＥＤＴＡ〕で溶解し、その後３７℃で一晩、１mg／mlの
プロナーゼＥで処理された。ウイルスＤＮＡは、〔Hira
i, K., Nakajima, K., Ikuta, K., Kirisawa, R., Kawa
kami, Y., Mikami, T. and Kato, S. 1986. Similariti
es and dissimilarities in the structure and expres
sion of viral genomes of various virus strainsimmu
nologically related to marek's desease virus. Arc
h. Virol. 89: 113-130.〕に記載の方法により、フェノ
ール抽出及びエタノール沈澱させ、蒸留水で３回透析し
た。

【００５３】（サザンブロット解析）上記のようにウイ
ルス感染細胞から抽出されたＤＮＡはＳａｌＩあるいは
ＥｃｏＲＩで消化したあと、０．５％のアガロースゲル
電気泳動を行い、分離された切断断片をナイロン膜（バ
イオダイン、Pall Biosupport 社製、ニューヨーク、Ｕ
ＳＡ）に、製品の説明に従って転写した。ＴＫをコード
する領域（図１Ｂ）を含む５．５ｋｂｐのＢａｍＨＩ−
ＳａｌＩ断片を、ニックトランスレーションのキット
（ベーリンカー社製、ドイツ）を用いて〔³²Ｐ〕α−Ｃ
ＴＰでラベルし、それをプローブとして用いた。ハイブ
リダイゼーションは、ハイブリダイゼーション溶液（５
０％ホルムアミド、０．６ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍのト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０２ＭのＥＤＴＡ、
０．５％のＳＤＳ、及び１００μｇ／mlの変性させたサ
ケの精子ＤＮＡ）中、４２℃で一晩行われた。その膜
は、０．１％のＳＤＳを含むＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣ
ｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム二水和物）×０．
２で４２℃、３０分間、３回洗浄された。その後、その
膜は−７０℃でＸ線フイルムに感光させた。

【００５４】感光後、現像したフィルムを図２に示す。
図２のＡに示すように、ＴＫ遺伝子を含む、親のＣ７３
０１のＤＮＡにおいて観察される１９ｋｂｐ（レーン
１）のＳａｌＩ断片のサイズが、Ｃ７３０１ｄｌＴＫで
はわずかに小さかった（レーン２）。一方、図２のＢに
示すように、ＥｃｏＲＩ断片による大きいサイズの断片
については、親株Ｃ７３０１では６．６ｋｂｐ断片（レ
ーン１）であるのに対して、Ｃ７３０１ｄｌＴＫでは
５．７ｋｂｐであった（レーン２）。それらの間に見ら
れるサイズの相違は、ＥｃｏＲＶとＳｍａＩ部位に起こ
った４３８ｂｐの欠損と、ＥｃｏＲＶとＳｍａＩの切断
部の間に挿入されたpBluescript ＫＳ−のマルチクロー
ニングサイト由来の１２ヌクレオチド中にＥｃｏＲＩ切
断部が付加されていることにより生じた新しい４２４ｂ
ｐによるものである（図１のＣ）。その４２４ｂｐ断片
はあまりに小さいので、この解析では検出できなかった
けれども、ＴＫ遺伝子の直上流に位置する、両方の株の
３．６ｋｂｐ断片は予想どおり検出された（図２の
Ｂ）。

【００５５】Ｃ７３０１ｄｌＴＫの配列の減少は、ＰＣ
Ｒ法によっても確認された。その結果を図３に示す。プ
ライマーのための配列は、本発明者らの研究とＦＨＶ−
１のＴＫ遺伝子の公知の配列〔Nunberg, J.K., Wright,
D.K., Cole G.E., Petrovskis, E.A., Post, L.E., Co
mpton, T. and Gilbert, J.H. 1989. Identification o
f the thymidine kinase gene of feline herpesvirus
: Use of degenerate oligonucleotides in the polym
erase chain reaction to isolate herpesvirus gene h
omologs. J. Virol. 63: 3240-3249. 〕に由来する。
その使用されたプライマーの配列は、９２２ｂｐの目的
のＤＮＡ断片を増幅できるＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子内の
１１番目〜３０番目の ５’−ＧＡＡＣＣＡＴＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＡＡＴ−３’（ＴＫの上流） と９３２番目〜９１３番目の ５’−ＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣ−３’（ＴＫの下流） である。

【００５６】ＰＣＲ〔Saiki, R.K., Gelfand, D.H., St
offel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T.,
Mullis, K.B. and Erlich, H.A. 1988. Primer-directe
d enzymatic amplification of DNA with a thermostab
le DNA polymerase. Science. 239: 487-491. 〕は総容
量５０μｌで、０．５mlの微小遠沈管内で行われた。１
μｇの各ウイルスＤＮＡ（Ｃ７３０１株もしくはＣ７３
０１ｄｌＴＫ株）が、１μＭの各々のプライマー、各々
２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴ
Ｐ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍ
ＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、０．００１％の
ゼラチン、並びに１ＵのＡｍｐｌｉＴａｑのＤＮＡポリ
メラーゼ（パーキンエルマー社製、コネチカット、アメ
リカ）を含む反応混合物に添加された。すべての反応サ
ンプルは、ミネラルオイル（シグマケミカル社製）で被
覆された。次に、２５サイクルの変性（９４℃；１
分）、アニーリング（６０℃；１分）、伸長（７２℃；
２分）が行われた。増幅後、ＰＣＲ産物は２％のアガロ
ースによる電気泳動により解析された。

【００５７】上記のＰＣＲの産物のアガロースゲル電気
泳動の分析結果を図３に示す。レーン１は、Ｃ７３０１
株であり、レーン２はＣ７３０１ｄｌＴＫ株の感染細胞
より抽出したＤＮＡを供試した電気泳動像である。これ
らのバンドのサイズを見ると、上記と同様の４３８ｂｐ
の欠損が起こっていることが判る。トランファーベクタ
ーｐｆＴＫ−ＳＢΔＳＥを用いてコトランスフェクショ
ン法を行えば、Ｃ７３０１のＴＫ遺伝子内の４５０ｂｐ
の配列が欠損し、その欠損部位に１２ｂｐのヌクレオチ
ドが挿入された。ここで、この挿入された１２ｂｐのヌ
クレオチドとは、ＴＫ遺伝子上流側から、 −ＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧ− で、pBluescript ＫＳ−のマルチクローニングサイト由
来の配列である。これらのデータは、予定した欠損（組
換え）が親ウイルスのＴＫ遺伝子に導入され、ＴＫ活性
の欠損を予期できることを示す。

【００５８】（イムノブロット解析及び間接蛍光抗体法
（ＩＦＡ））更に、Ｃ７３０１ｄｌＴＫにおける他の免
疫抗原のタンパク質に変異が認められないことを確認す
るために、Ｃ７３０１株感染ネコ血清を使用してイムノ
ブロット分析、及びｇｐ１４３／１０８、ｇｐ１１３、
ｇｐ６０を認識する各々モノクローナル抗体２２Ｆ４、
１７Ｃ１１、４１Ｇ４を用いた間接蛍光抗体法分析を行
った〔Horimoto, T., Limcumpao, J.A., Tohya, Y, Tak
ahashi, E. and Mikami, T. 1990. Feline herpesvirus
type 1 glycoproteins eliciting virus neutralizing
and hemagglutination-inhibiting antibodies. Arch.
Virol. 111: 127-132. 〕。イムノブロット解析及び間
接蛍光抗体法分析（ＩＦＡ）は、公知の文献、例えば
〔Horimoto, T., Limcumpao, J.A., Xuan, X., Ono,
M., Maeda, K., Kawaguchi, Y., Kai, C., Takahashi,
E., and Mikami, T. 1992. Heterogeneity of feline h
erpesvirus type 1 strains. Arch. Virol. 126: 283-2
92. 、Limcumpao,J.A., Horimoto, T., Xuan, X., Taka
hashi, E. and Mikami, T. 1990. Immunological relat
ionship between feline herpesvirus type 1(FHV-1) a
nd canineherpesvirus(CHV) as revealed by polyvalen
t and monoclonal antibodies.Arch. Virol. 111: 165-
176.〕に記載の方法を用いて行った。これらのモノクロ
ーナル抗体はＦＨＶ−１におけるウイルス中和に関する
抗原決定基と結合する。Ｃ７３０１とＣ７３０１ｄｌＴ
Ｋとの間に、それらの反応性に相違は見られなかった。

【００５９】（組換えＦＨＶ−１であるＣ７３０１ｄｌ
ＴＫの in vitro での増殖性状）次に、Ｃ７３０１ｄｌ
ＴＫと親株のＣ７３０１のＣＲＦＫ細胞における増殖性
状を比較した。各ウイルスをＣＲＦＫ細胞に接種させ、
感染後の時間、０、６、１２、２４、４８及び７２時間
で生産された細胞内及び細胞外のウイルスの量を決定し
た。その具体的方法として、ＣＲＦＫ細胞の単層培養が
６穴プレートのウエル上で調製され、３ＰＦＵ／細胞の
ＭＯＩでウイルスサンプルを接種された。９０分間の吸
着後、その単層培養は、ＤＭＥＭで３回洗浄され、１ウ
エルあたり維持培養液２mlで３７℃でインキュベートし
た。感染後、種々の間隔で感染細胞を培養液とともにラ
バーポリスマンでかき集めて、低速度で遠心し、感染細
胞を沈降させた。その時の培養上澄みを細胞外サンプル
として用いた。沈降物である感染細胞は、ＤＭＥＭで２
回洗浄され、その後２mlの維持培養液に懸濁し、３回の
凍結−解凍処理を行い、更に４０００ｒｐｍで１０分間
遠心して細胞破片を除去した。その結果生じた上澄みが
細胞内サンプルとして用いられた。細胞内及び細胞外サ
ンプルはウイルスの感染力価をＴＣＩＤ₅₀として測定し
た（log ＴＣＩＤ₅₀ per５０μｌ）。

【００６０】図４ＡとＢは、各々細胞内ウイルスと細胞
外ウイルスの増殖の時間的変化を示す。図４において、
○及び□はＣ７３０１株を表し、●及び■はＣ７３０１
ｄｌＴＫ株を表す。Ａは、細胞内ウイルスのウイルス力
価、Ｂは細胞外ウイルスのウイルス力価を各々表す。親
のＣ７３０１あるいはＣ７３０１ｄｌＴＫを感染させた
ＣＲＦＫ細胞から回収した細胞内あるいは細胞外のウイ
ルスの力価は、急速に増加し、各々感染後２４時間、４
８時間で最大に達した。両ウイルスの増殖パターンは細
胞内、細胞外において殆ど同一であった。上記と同様に
して、ＦＨＶ−１のＦ２株においてＴＫ遺伝子欠損組換
えウイルスを作製したところ、上記と同様の良好な結果
が得られた。

【００６１】親株と組換えＣ７３０１ｄｌＴＫ株を用い
たネコの強制感染実験 実験動物としては、約３カ月齢のネコ（８匹）を用い
た。これらの実験動物のネコは、ワクチン未接種で、呼
吸器症状を示さず、ＦＨＶ−１、ＦＣＶ等の中和抗体価
またはＥＬＩＺＡ抗体価が陰性で、更にウイルスが分離
されないものである。また、各飼育ゲージで１週間以上
飼育し、体温等が安定するのを待って実験に供試する。

【００６２】感染実験に用いるウイルスは、親株である
Ｃ７３０１株と前述のＣ７３０１ｄｌＴＫ株である。こ
れらのウイルスを、各ネコ４匹の眼窩、鼻腔及び口腔内
に計１０⁶ ＰＦＵの量で強制感染させ、約３週間観察し
た。Ｃ７３０１株を感染させたネコを（Ｃ−１）〜（Ｃ
−４）とし、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株を感染させたネコを
（Ｔ−１）〜（Ｔ−４）とした。

【００６３】観察の検査項目とそれらの結果 〔体重及び体温（直腸）〕：各々の個体の体重及び体温
（直腸）を毎日測定し、観察した。その結果を図５に示
した。図５のＡに体温の結果を示したが、Ｃ７３０１株
を接種したネコの体温は接種（０日）後、３日目以降に
著しく上昇しているのに対して、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株
を接種したネコは、殆ど体温の著しい変化は見られなか
った。図５のＢに示すように、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株を
接種したネコは、殆ど一定に体重が増加しているのに対
して、Ｃ７３０１株を接種したネコは、接種後に約９日
に渡って、体重が増加せず、減少傾向になってしまっ
た。

【００６４】〔中和抗体価〕：３日おきにそれぞれのネ
コの血清を採取し、その血清中の中和抗体価を測定し、
抗体の推移を観察した。その結果を図６に示した。図６
に示すように、Ｃ７３０１株ほどではないが、Ｃ７３０
１ｄｌＴＫ株においてもＦＨＶ−１に対する中和抗体価
が充分上昇しているのが判る。

【００６５】〔ウイルスの分離〕：ウイルスの排泄を観
察するために、各々のネコの眼窩、鼻腔及び口腔より経
時的に拭い液を採取し、ＣＲＦＫ細胞でのプラーク形成
単位（ＰＦＵ）に基づいて分離ウイルス量を測定した。
ウイルス接種７日前より毎日もしくは最低３日おきに採
材及び測定した。その結果を図７に示した。図７に示す
ように、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ接種ネコの眼、鼻、口より
排泄されるウイルス分離量は、Ｃ７３０１株接種ネコと
ほとんど同等であることが判る。また、上記において、
Ｔ−１〜Ｔ−４、及びＣ−１〜Ｃ−４の各々のネコから
分離されたウイルスのゲノム中のＴＫ遺伝子より、前記
プライマー・ペアーを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡ断片
を増幅させ、前述と同様に分析した。その結果を図８に
示す。図８の結果から、Ｃ７３０１ｄｌＴＫを接種した
ネコＴ−１〜Ｔ−４から分離したウイルスは、図３の結
果と同様にＴＫ遺伝子が欠損していた。このことは、接
種したＣ７３０１ｄｌＴＫ株が、ネコ生体内で充分増殖
した後も接種ウイルスと同様の欠損を保持し、且つこの
手法を用いればＴＫ遺伝子を有する野外株Ｃ７３０１と
簡便に区別できうる可能性を明確に示唆している。

【００６６】〔臨床症状〕：各々のウイルスを接種した
ネコの臨床症状を、接種後から観察した。臨床症状とし
ては、脱水状態、食欲、元気、鼻水、くしゃみ、流涎、
結膜炎、呼吸様式であり、それらを毎日観察し、下記表
１に示す評価基準に基づいて採点した。その結果を下記
表２〜表５に示した。

【００６７】

【表１】

【００６８】

【表２】

【００６９】

【表３】

【００７０】

【表４】

【００７１】

【表５】

【００７２】表２〜表５の結果から、Ｃ７３０１株を接
種したネコＣ−１〜Ｃ−４は、著しく臨床評価の数字が
高い（１日〜２１日までのトータルのポイント；６５〜
１３１）のに対して、Ｃ７３０１ｄｌＴＫを接種したネ
コＴ−１〜Ｔ−４は、臨床評価の数字がかなり小さく
（１日〜２１日までのトータルのポイント；２〜１
８）、ほとんど臨床症状がないことが判る。以上の結果
から、Ｃ７３０１ｄｌＴＫを接種しても、体重及び体温
に殆ど変化がなく、且つ臨床症状も殆ど皆無に等しいこ
とから、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株は、弱毒化が充分になさ
れていることが判る。更に、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株にお
いても、ネコ生体内において中和抗体価が充分上昇して
いること、および眼、鼻、口のいずれにおいても、ウイ
ルス分離量がＣ７３０１株とほとんど同等であったこと
から、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株は、十分な免疫原性を有
し、且つネコ生体内で増殖能が保持されているが判る。
また、各々接種されたネコから分離されたウイルスのＴ
Ｋ遺伝子を分析することにより、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株
と野外株とを明確に区別できる。従って、本発明に従う
Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株は、弱毒性、免疫原性、およびネ
コ生体内での増殖能、遺伝的マーカーの保持のすべてが
満足されるものであった。

【００７３】実施例２ 上記実施例１と同様のネコを用い、図９に示すスケジュ
ールで強制感染実験を行った。即ち、グループＡは、３
匹のネコに弱毒化されたＣ７３０１ｄｌＴＫ株を３週間
間隔で、１０⁵ ＰＦＵ／１mlの量で２回筋肉内に投与し
て接種し、更に４週間後に強毒株Ｃ７３０１株を１０⁶
ＰＦＵ／１mlの量で経鼻、口、眼から投与して接種し
た。グループＢは、３匹のネコに、上記グループＡにお
いてＣ７３０１ｄｌＴＫ株の投与の代わりにＣＲＦＫ細
胞（ウイルス感染していない）の培養上清のみを筋肉内
に投与する以外は、上記グループＡと同様に接種した。
グループＣは、２匹のネコに、上記グループＡの場合と
同様にＣ７３０１ｄｌＴＫ株を２回接種し、その後のＣ
７３０１株の接種は行わなわず、代わりにＣＲＦＫ細胞
（ウイルス感染していない）の培養上清を経鼻、口、眼
から投与した。

【００７４】上記３つのグループにおいて、上記実施例
１と同様に、体温（直腸）、体重、中和抗体価、及び臨
床症状を評価した。 〔体温（直腸）〕体温の結果を図１０に示す。予めＣ７
３０１ｄｌＴＫ株をワクチンとして接種しないグループ
Ｂは、Ｃ７３０１株を攻撃接種したときに、体温が４０
℃以上に上がり、それ以後も体温の上昇傾向は暫く継続
した。それに対して予めＣ７３０１ｄｌＴＫ株を接種し
たグループＡは、Ｃ７３０１株を接種したときに、体温
は一時的に少々上昇したものの、上記グループＢと比較
するとその上昇程度は低く、その後は直ちに定常状態の
体温に戻った。一方、グループＣにおいては、Ｃ７３０
１ｄｌＴＫ株を２回接種しても全く体温上昇は、見られ
なかった。

【００７５】〔体重〕体重の変化を図１１に示す。グル
ープＡ及びＣのいずれにおいても、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ
株を接種したことによる体重の異常な変化は、見られな
かった。更に、Ｃ７３０１株を接種した際には、グルー
プＢでは、著しく体重減少した。それに対して、予めＣ
７３０１ｄｌＴＫ株をワクチンとして接種したグループ
Ａは、殆ど体重変化は見られなかった。

【００７６】〔中和抗体価〕攻撃用ＦＨＶ−１のＣ７３
０１株を接種する前は、１週間に１度、該株接種後は最
低３日おきにそれぞれのネコの血清を採取し、その血清
中のＦＨＶ−１に対する中和抗体価を測定し、その推移
を観察した。その結果を図１２に示した。Ｃ７３０１株
を接種後の抗体価は、予めＣ７３０１ｄｌＴＫ株を接種
したグループＡが約３日後に著しく上昇した。それに対
して、予めＣ７３０１ｄｌＴＫ株を接種していないグレ
ープＢは、免疫応答がグループＡより遅くなり、Ｃ７３
０１株を接種後約９日で比較的緩やかに抗体価が上昇し
た。従って、グループＡは、予めＣ７３０１ｄｌＴＫ株
を２回筋肉内接種することにより、免疫感作が充分行わ
れていたことを示し、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株が生体内で
ＦＨＶ−１に対する免疫原として有効なことを示した。

【００７７】〔臨床症状〕：上記グループＡ及びＢにお
いて、Ｃ７３０１株を攻撃接種した後のネコの臨床症状
を、その株の接種後から４週間観察した。臨床症状とし
ては、脱水状態、食欲、元気、鼻水、くしゃみ、流涎、
結膜炎、流涙、呼吸様式であり、それらを毎日観察し、
上記表１に示す評価基準に基づいて採点した。その結果
を下記表６〜表８に示した。ここで、グループＡのネコ
は（ＴＣ−１）〜（ＴＣ−３）で、グループＢのネコは
（ＣＣ−１）〜（ＣＣ−３）である。

【００７８】

【表６】

【００７９】

【表７】

【００８０】

【表８】

【００８１】表６〜表８の結果から、予めＣ７３０１ｄ
ｌＴＫ株を接種されたネコは、著しく臨床評価の数字が
低く（１日〜２８日までのトータルのポイント；７〜１
７）、ほとんど臨床症状がないのが判る。それに対し
て、予めＣ７３０１ｄｌＴＫを接種していないネコは、
臨床評価の数字がかなり高く（１日〜２８日までのトー
タルのポイント；６３〜８６）、臨床症状が著しいこと
が判る。また、グループＣのネコは、全てにおいて０で
あった。

【００８２】実施例３ ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）のカプシド蛋白をコード
する遺伝子を含むトランスファーベクターの作成 文献Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（１９９３）
１７〜２６頁に記載の、ＦＣＶのカプシド蛋白をコード
する遺伝子（カプシド遺伝子）のオープンリーディング
フレーム（２００７ｂｐ）を含むｐＭＣＶＩＩより、Ｅ
ｃｏＲＩ部位の断片を切りだした。その断片のＤＮＡ配
列を配列番号２に示す。その断片をブラント化（平滑
化）し、アルカリホスファターゼ処理（ＣＩＡＰ処理）
後、上記で作成したｐｆＴＫ−ＳＢΔＳＥのＳｍａＩ部
位に組み込み、トランスファーベクターｐＴＫ−Ｃａ
ｐ．を作成した。このｐＴＫ−Ｃａｐ．の構成の概略図
を図１３のＣに示した。

【００８３】カプシド遺伝子を含むＣ７３０１ｄｌＴＫ
−Ｃａｐ株の作成 前記実施例１と同様に、トランスファーベクターｐＴＫ
−Ｃａｐ．と親株Ｃ７３０１株のＣＲＦＫ感染細胞抽出
のＤＮＡとを、ＣＲＦＫ細胞にコトランスフェクション
して、実施例１と同様に組換えウイルスを作製した。得
られた組換えウイルスはａｒａＴを含む選択培養液によ
りスクリーニングし、カプシド遺伝子を含む組換えＣ７
３０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株を選択した。

【００８４】上記で得られたＣ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａ
ｐ株の１つを選択して、目標とするカプシド遺伝子を含
むかどうかを確認するために、前記と同様にサザンブロ
ット及びイムノブロット解析を行った。 〔サザンブロット〕前記実施例１と同様に操作して、Ｃ
７３０１株、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株及びＣ７３０１ｄｌ
ＴＫ−Ｃａｐ株を各々ＳａｌＩ（図１４のレーン〜
）とＥｃｏＲＩ（図１４のレーン〜）で切断した
ものを電気泳動し、それをナイロン膜に転写した。プロ
ーブとして、ニックトランスレーションにより、
〔³²Ｐ〕α−ＣＴＰでラベルされたｐｆＴＫ−ＳＢ（図
１４のＡ）およびｐＭＣＶＩＩ（図１４のＢ）を用い、
該膜上でハイブリダイゼーションさせた。その後、その
膜は−７０℃でＸ線フイルムを感光させた。その結果を
図１４に示す。

【００８５】図１４のＡに示すように、Ｃ７３０１ｄｌ
ＴＫ−Ｃａｐ株（レーンと）では、他のレーンに比
べて、移動距離が短いバンドがある。これは、２０３４
ｂｐのカプシド遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片の挿入によ
るものである。また、図１４のＢに示すように、Ｃ７３
０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株（レーンと）では、ｐＭＣ
ＶＩＩ中のカプシド遺伝子とハイブリダイズするバンド
が上記バンドと同位置で観察された。従って、Ｃ７３０
１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株中には、正確に２００７ｂｐのカ
プシド遺伝子が挿入されたことが判る。

【００８６】〔イムノブロット〕前記実施例１と同様
に、イムノブロット解析を行った。その結果を図１５に
示す。ＣＲＦＫ細胞のみ（レーン１）、ＣＲＦＫ細胞に
Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株を接種したもの（レーン２）、Ｃ
７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株を接種したもの（レーン
３）、ｐＭＣＶＩＩ中のカプシド遺伝子をＣＯＳ−７細
胞で発現させたもの（レーン４）、ＦＣＶを４５℃でＣ
ＲＦＫ細胞に感染させたもの（レーン５）およびＦＣＶ
を３７℃でＣＲＦＫ細胞に感染させたもの（レーン６）
からタンパク質を抽出し、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。それらをニトロセルロース膜に転写し、
ＦＨＶ−１のｇＣを認識するモノクローナル抗体（図１
５のＡ）１７ｃ１１と、ＦＣＶのＦ４タンパクを認識す
るモノクローナル抗体（図１５のＢ）４Ｂ１を用いて、
イムノブロットを行った。

【００８７】図１５のＡに示すように、ＦＨＶ−１のｇ
Ｃを認識するモノクローナル抗体により、Ｃ７３０１ｄ
ｌＴＫ株とＣ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株がＦＨＶ−１
の抗原を発現していることが判る。図１５のＢに示すよ
うに、ＦＣＶのＦ４株のタンパク（カプシドタンパク）
を認識するモノクローナル抗体により、ＦＣＶのＦ４株
のタンパクを発現しているのは、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ−
Ｃａｐ株のみであった。また、そこで反応したバンドの
大きさは、レーン４、５及び６との比較から、８．８ｋ
ＤａのＴＫ−カプシドの融合タンパク（明確なバンドを
示しいる）と、７．４ｋＤａのカプシド（前駆体）タン
パク（不明瞭であるが、明らかにバンドが存在してい
る）に相当した。これは、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ
株内の組換えを起こさせた遺伝子の塩基配列から予想さ
れる発現タンパク質に相当する。Ｃ７３０１ｄｌＴＫ−
Ｃａｐ株は、７．４ｋＤａのカプシド（前駆体）タンパ
クをも発現していた。

【００８８】従って、サザンブロット及びイムノブロッ
ト解析の結果により、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株
は、ＴＫ遺伝子内にカプシド遺伝子を含み、且つ培養細
胞中でＦＣＶのカプシド蛋白に対するモノクローナル抗
体と反応しうる２種の蛋白が発現しているのが明らかと
なった。 〔間接蛍光抗体法分析〕上記イムノブロット分析と同様
に、ＣＲＦＫ細胞のみ、ＣＲＦＫ細胞にＣ７３０１ｄｌ
ＴＫ株を接種したもの、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株
を接種したものから、タンパク質を精製し、下記表９に
示すＦＣＶのカプシド蛋白上のウイルス中和に関する抗
原決定基を認識する数種のモノクローナル抗体を用い
て、間接蛍光抗体法分析を行った。その結果を下記表９
に示す。ここで、−；全く反応せず、＋；明らかに反応
したことを各々表す。

【００８９】

【表９】

【００９０】表９の結果から、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃ
ａｐ株を接種したもののみが、各モノクローナル抗体全
てに反応し、ＦＣＶの中和エピトープが十分に保存され
ていることが判る。従って、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａ
ｐ株はＦＣＶの免疫原を発現できる組換えウイルスであ
ることが明らかとなった。

【００９１】Ｃ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株のネコへの
強制感染実験 ＳＰＦネコを用い、強制感染実験を行った。即ち、１匹
のＳＰＦネコにＣ７３０１ｄｌＴＫ株、２匹のＳＰＦネ
コにＣ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株（Ｎｏ１とＮｏ２）
を１２日間隔で、１０⁶ ＰＦＵ／１mlの量で２回鼻内及
び口内に投与して接種した。接種後２４日間に渡って、
実施例１と同様に体温、体重、臨床症状及び中和抗体価
を観察した。その結果、体温、体重、臨床症状は、接種
した全てのネコにおいて全く異常な変化はなかった。ま
た、実施例１と同様に３日置きに血清を採取し、中和抗
体価を測定した結果を図１６に示す。図１６のＡに示す
ように、ＦＣＶの中和抗体価は、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ−
Ｃａｐ株を接種したＮｏ１とＮｏ２のみで上昇した。ま
た、ＦＨＶに対する中和抗体価は、１５日目から２４日
目において、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株を接種したネコとＮ
ｏ１のＣ７３０１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株を接種したネコに
ついてのみ上昇した。また、Ｎｏ２のＣ７３０１ｄｌＴ
Ｋ−Ｃａｐ株を接種したネコは、２４日目には上昇は見
られなかったが、それ以後次第に中和抗体価が上昇した
事を確認している。従って、これらの結果からＣ７３０
１ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株は、ＦＨＶ−１及びＦＣＶの両方
に対して、中和抗体価を誘導でき、弱毒性が充分で、組
換え２価ワクチンとして有用であることが判る。

【００９２】

【発明の効果】遺伝子操作によって弱毒化が安定的且つ
充分になされ、in vitroの培養細胞における増殖能及び
ネコの生体内での増殖能がいずれにおいても充分保持さ
れ、且つ免疫原性が優れ、更に野外株と区別しうる生物
学的及び遺伝的マーカーを明確に持っている組換えネコ
ヘルペスウイルス１型、及びそれを含むワクチンを提供
することができる。更に、遺伝子操作によって弱毒化が
安定的且つ充分になされ、in vitroの培養細胞における
増殖能及びネコの生体内での増殖能がいずれにおいても
充分保持され、且つＦＨＶ−１の免疫原性が優れ、更に
野外株と区別しうる生物学的及び遺伝学的マーカーを明
確に有し、更に異種免疫原等の外来遺伝子の産物である
タンパクが安定且つ適度に発現され、且つその発現のた
めに外来異種由来のプロモーターを敢えて挿入する必要
性がない組換えネコヘルペスウイルス１型、及びそれを
含むワクチンを提供できる。

【００９３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１６１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：ネコヘルペスウイルス１型 配列の特徴 特徴を表す記号：ｖｉｒｉｏｎ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTGTATAG TACATACACA ATCAGGTCGG CGACGACCCA AGTTAACCTA ACATGCTAGG 60 TACACGCCCT TAGCCTTTTT AAGAGACTCT GCGGATACAG AGCCGCCCAA TAAACACTCG 120 AGTCGGTCGG TATATACTCC ACTCGCAGAG GTCGAGGATA TATCGCGCTT GAGGACAGCA 180 TAAAAGCGAT TGTGGCATCG AATTCCAGCC CGGAGCCTCA ATCCGACACT GCGTCGTTGT 240 TCACGTTTCA TCATACACAG ATCAGACG ATG GCG AGT GGA ACC ATC CCC GTT 292 CAG AAT GAA GAG ATT ATT AAA TCA CAG GTG AAT ACT GTC CGC ATT TAC 340 ATA GAT GGT GCC TAT GGA ATA GGT AAG AGT TTA ACG GCG AAG TAC CTG 388 GTC AGA GCG GAT GAA AAT CGA CCG GGA TAT ACT TAC TAC TTC CCA GAA 436 CCA ATG CTA TAC TGG CGT AGT CTC TTT GAA ACT GAT GTT GTC GGT GGT 484 ATC TAT GCC GTC CAG GAC CGG AAA CGA CGT GGT GAA TTA TCA GCT GAA 532 GAT GCT GCC TAT ATC ACC GCC CAC TAT CAA GCA AGA TTT GCC GCA CCA 580 TAC CTT CTT TTA CAT TCC AGA CTA TCC ACA ATA ACA GGA TAT CAG AAA 628 GTT GTA TGT GAG GAA CAC CCC GAC GTG ACC CTA ATC ATA GAT AGA CAC 676 CCT CTC GCC TCT CTG GTC TGT TTC CCA CTC GCA AGA TAT TTT GTG GGT 724 GAT ATG ACT CTT GGG TCT GTA CTT AGT CTA ATG GCA ACA CTT CCA CGA 772 GAA CCT CCT GGT GGA AAT CTA GTT GTA ACA ACC TTG AAT ATC GAG GAA 820 CAT TTG AAG CGT CTC AGG GGA CGC TCA AGA ACC GGA GAA CAG ATA GAC 868 ATG AAG CTA ATT CAC GCA CTA CGC AAT GTA TAT ATG ATG TTG GTA CAT 916 ACT AAG AAA TTT TTA ACA AAA AAT ACT AGT TGG CGT GAT GGG TGG GGG 964 AAG CTT AAA ATT TTC TCC CAC TAT GAA CGG AAT AGG CTC GTG GAA ACT 1012 ACA ATA GTT TCC GAT TCG ACG GAG TCA GAT TTA TGT GAC ACA TTA TTC 1060 AGT GTT TTC AAA GCC CGG GAG CTC TCC GAC CAA AAT GGA GAT CTA CTT 1108 GAC ATG CAT GCA TGG GTC CTC GAT GGA CTT ATG GAA ACC CTC CAA AAT 1156 TTA CAG ATC TTT ACT TTA AAT CTG GAA GGA ACC CCT GAT GAA TGT GCC 1204 GCC GCC TTG GGA GCA CTG AGA CAA GAT ATG GAT ATG ACA TTT ATA GCC 1252 GCA TGT GAT ATG CAC CGT ATA AGT GAA GCC TTG ACG ATA TAC CAT TAA 1300 ACATTAGTGG TGTTCCCTAT TACCCCCCTG TGGTGAATGT GTGGAGGTCA GGGGATAATT 1360 GTATAATGAC CATCGTTTCA TGAATAAAAT AACCGTGTGT GATGTGGATG TATTCATTAA 1420 TTGAATTTCT CTTCCGGTTT TAGATCTTTA TAAGCGTAAA ACTGGTGTTT TAAATCCAAG 1480 AGCCGGGTTC TTTGGAGGTT GGTCACATCA TCGCCACAGC CCGTGGATTC AAGCAATCTT 1540 ATGATGTGTT TGATAATATA CCTATCGATA TTCCTGATCA TTGTATCGAG GATGTTGACT 1600 GGTTTACCGA TGATGGATA 1619

【００９４】配列番号：２ 配列の長さ：２０３４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：ネコカリシウイルス 配列の特徴 特徴を表す記号：ｖｉｒｉｏｎ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GAATTCCGAA GTTTGAGC ATG TGC TCA ACC TGC GCT AAC GTG CTT AAA TAC 51 TAT GAT TGG GAT CCC CAC TTT AGG TTG ATC ATC AAT CCT AAC AAA TTT 99 CTC CCT ATT GGC TTC TGT GAC AAC CCC CTT ATG TGT TGC TAT CCA GAC 147 TTG CTT CCT GAA TTT GGA ACA GTG TGG GAC TGT GAC CAG TCA CCA CTG 195 CAA ATT TAT CTG GAA TCT ATC CTT GGA GAT GAT GAG TGG GCT TCA ACT 243 CAC GAG GCC ATC GAC CCC AGT GTA CCT CCA ATG CAC TGG GAC AGT GCT 291 GGC AAG ATC TTT CAG CCA CAC CCC GGT GTT TTG ATG CAT CAT CTC ATT 339 GGA GAG GTT GCA AAG GCT TGG GAC CCA AAC CTA CCG CTC TTC CGA TTG 387 GAG GCC GAT GAT GGA TCC ATC ACG ACA CCC GAA CAG GGA ACT GCG GTT 435 GGT GGG GTT ATC GCT GAG CCT AGT GCC CAG ATG TCA ACT GCT GCT GAC 483 ATG GCC TCG GGG AAA AGC GTT GAC TCT GAG TGG GAG GCG TTT TTC TCT 531 TTC CAC ACT AGC GTC AAC TGG AGT ACA TCG GAA ACC CAA GGT AAG ATT 579 CTC TTC AAA CAA TCC CTA GGA CCT CTC CTT AAC CCT TAT CTC GAG CAC 627 TTG TCA AAG CTT TAC GTC GCA TGG TCT GGC TCT ATT GAA GTT AGG TTC 675 TCT ATT TCT GGC TCT GGT GTG TTC GGG GGT AAG CTT GCT GCC ATT GTT 723 GTG CCA CCA GGG GTT GAC CCT GTT CAG AGC ACG TCA ATG CTG CAA TAC 771 CCC CAT GTT CTG TTT GAC GCT CGT CAG GTG GAA CCT GTC ATC TTC ACT 819 ATC CCC GAT CTA AGG AGC ACA CTG TAT CAC GTT ATG TCT GAC ACT GAT 867 ACC ACG TCT TTG GTT ATT ATG GTG TAT AAC GAT CTA ATC AAC CCA TAT 915 GCT AAT GAC TCA AAC TCT TCT GGG TGT ATT GTC ACT GTA GAA ACC AAA 963 CCT GGA CCC GAT TTC AAA TTC CAC TTG TTG AAA CCC CCT GGT TCT GTG 1011 TTA ACT CAT GGC TCG ATT CCT TCG GAC CTG ATC CCC AAA TCA TCA TCC 1059 CTT TGG ATT GGT AAT CGC TAC TGG ACT GAC ATA ACC GAT TTT GTA ATT 1107 CGA CCC TTT GTG TTC CAA GCA AAC CGT CAT TTC GAC TTT AAC CAA GAA 1155 ACA GCT GGC TGG AGC ACA CCA AGA TTC AGG CCC ATC ACC ATT ACA ATT 1203 AGT GAA AAG AAT GGT TCA AAG TTA GGA ATT GGC GTT GCA ACC GAT TAC 1251 ATT ATC CCA GGG ATT CCT GAT GGC TGG CCA GAT ACT ACA ATT GCT GAT 1299 AAA TTG ATT CCC GCG GGC GAC TAT TCA ATT ACC ACG GGG GAG GGG AAT 1347 GAC ATC AAA ACG GCT CAG GCC TAT GAC ACT GCA GCT GTG GTA AAG AAC 1395 ACC ACA AAT TTC CGA GGG ATG TAT ATC TGT GGT TCA TTG CAA CGG GCT 1443 TGG GGC GAT AAG AAG ATT TCA AAT ACT GCC TTC ATA ACC ACC GCC ATC 1491 AGG GAC GGC AAC GAA ATC AAA CCA TCT AAC ACA ATT GAC ATG ACA AAG 1539 CTC GCC GTG TAC CAA GAT ACT CAT GTA GAG CAG GAA GTC CAA ACA TCT 1587 GAT GAC ACG CTT GCC CTC CTT GGT TAC ACT GGG ATT GGC GAG GAG GCA 1635 ATT GGC TCA AAT AGG GAC AGG GTA GTG CGC ATT AGC GTG CTA CCA GAA 1683 GCT GGG GCC CGT GGT GGC AAT CAC CCC ATC TTT TAC AAA AAC TCA ATT 1731 AAA TTG GGC TAT GTA ATT AGA TCT ATC GAT GTG TTC AAT TCT CAA ATC 1779 TTG CAC ACA TCC AGA CAA CTG TCA CTT AAC CAC TAT CTG TTA CCT CCT 1827 GAC TCC TTT GCT GTT TAT AGA ATA ATT GAC TCA AAT GGC TCT TGG TTT 1875 GAC ATT GGT ATT GAT AGT GAA GGG TTC TCT TTT GTT GGT GTT TCT GAT 1923 ATT GGT AAA TTA GAA TTT CCT CTT TCA GCC TCC TAC ATG GGA ATA CAA 1971 TTG GCA AAA ATT CGC CTT GCC TCA AAC ATT AGG AGC AGA ATG ACT AAA 2019 TTA TGA ATTGAATTC 2034

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＫ遺伝子とトランスファーベクターの構成を
示す概略図である。

【図２】サザンブロット分析の結果を示す電気泳動の図
である。

【図３】ＦＨＶ−１のＴＫ遺伝子のＰＣＲ増幅の結果を
示す電気泳動の図である。

【図４】ＣＲＦＫ細胞におけるウイルスの増殖の時間的
経過を示す図である。

【図５】ネコにＣ７３０１株又はＣ７３０１ｄｌＴＫ株
を接種した時の体温、体重の時間的変化を示す図であ
る。

【図６】ネコにＣ７３０１株又はＣ７３０１ｄｌＴＫ株
を接種した時の中和抗体価の時間的変化を示す図であ
る。

【図７】Ｃ７３０１株又はＣ７３０１ｄｌＴＫ株を接種
したネコから分離できるウイルス量の時間的変化を示す
図である。

【図８】Ｃ７３０１株又はＣ７３０１ｄｌＴＫ株を接種
したネコから分離されたウイルスのＴＫ遺伝子のＰＣＲ
増幅の結果を示す電気泳動の図である。

【図９】ネコにウイルスを接種するスケジュールを示す
図である。

【図１０】ネコにＣ７３０１株、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株
を順次接種した時の体温の時間的変化を示す図である。

【図１１】ネコにＣ７３０１株、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株
を順次接種した時の体重の時間的変化を示す図である。

【図１２】ネコにＣ７３０１株、Ｃ７３０１ｄｌＴＫ株
を順次接種した時の中和抗体価の時間的変化を示す図で
ある。

【図１３】カプシド遺伝子を挿入したトランスファーベ
クターの構成を示す概略図である。

【図１４】カプシド遺伝子の挿入を確認するためのサザ
ンブロット分析の結果を示す電気泳動の図である。

【図１５】カプシド遺伝子の挿入を確認するためのイム
ノブロット分析の結果を示す電気泳動の図である。

【図１６】ネコにＣ７３０１ｄｌＴＫ株又はＣ７３０１
ｄｌＴＫ−Ｃａｐ株を接種した時のＦＨＶとＦＣＶに対
する中和抗体価の時間的変化を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅのＡｌｐｈ
   ａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ亜科に属するネコヘルペ
   スウイルス１型のゲノム中のチミジンキナーゼをコード
   する遺伝子の少なくともＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ部位が欠
   損したことを特徴とする組換えネコヘルペスウイルス１
   型。
2. 【請求項２】 ＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅのＡｌｐｈ
   ａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ亜科に属するネコヘルペ
   スウイルス１型のゲノム中のチミジンキナーゼをコード
   する遺伝子内のＳｍａＩ部位に、外来遺伝子を挿入させ
   たことを特徴とする組換えネコヘルペスウイルス１型。
3. 【請求項３】 前記ヘルペスウイルス１型のチミジンキ
   ナーゼをコードする遺伝子の少なくともＥｃｏＲＶ−Ｓ
   ｍａＩ部位が欠損し、且つ該ＳｍａＩ部位に外来遺伝子
   を挿入させたことを特徴とする請求項２に記載の組換え
   ネコヘルペスウイルス１型。
4. 【請求項４】 前記チミジンキナーゼをコードする遺伝
   子が、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列と少なく
   ともハイブリダイズできるＤＮＡ配列を有し、且つＥｃ
   ｏＲＶ切断部位及びＳｍａＩ切断部位を有するものであ
   ることを特徴とする請求項１又は２に記載の組換えネコ
   ヘルペスウイルス１型。
5. 【請求項５】 前記チミジンキナーゼをコードする遺伝
   子が、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列と少なく
   ともハイブリダイズできるＤＮＡ配列を有し、且つ配列
   番号１の第６１８番目にＥｃｏＲＶ切断部位及び配列番
   号１の第１０７４番目にＳｍａＩ切断部位を有するもの
   であることを特徴とする請求項４に記載の組換えネコヘ
   ルペスウイルス１型。
6. 【請求項６】 前記ネコヘルペスウイルス１型が、Ｃ７
   ３０１株であることを特徴とする請求項１又は２に記載
   の組換えネコヘルペスウイルス１型。
7. 【請求項７】 前記外来遺伝子が外来免疫原をコードす
   る遺伝子の少なくとも１つであることを特徴とする請求
   項２又は３に記載の組換えネコヘルペスウイルス１型。
8. 【請求項８】 前記外来免疫原をコードする遺伝子が、
   ネコカリシウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコパルボ
   ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネココロナウイル
   ス、ネコロタウイルス及びネコクラミジアのうち少なく
   とも１種の病原体に対する免疫原となるタンパク質をコ
   ードする遺伝子の少なくとも１つであることを特徴とす
   る請求項７に記載の組換えネコヘルペスウイルス１型。
9. 【請求項９】 前記外来免疫原をコードする遺伝子が、
   ネコカリシウイルスのカプシド蛋白をコードする遺伝子
   であることを特徴とする請求項８に記載の組換えネコヘ
   ルペスウイルス１型。
10. 【請求項１０】 前記ネコヘルペスウイルス１型のゲノ
    ム中にネコカリシウイルスに対する免疫原を発現しうる
    外来遺伝子を発現可能なように挿入させたことを特徴と
    する請求項１又は２に記載の組換えネコヘルペスウイル
    ス１型。
11. 【請求項１１】 前記外来遺伝子が医薬用または診断用
    ポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つであ
    ることを特徴とする請求項２又は３に記載の組換えネコ
    ヘルペスウイルス１型。
12. 【請求項１２】 医薬用または診断用ポリペプチドが、
    リンホカイン、インターロイキン、インターフェロン又
    はサイトカインである請求項１１に記載の組換えネコヘ
    ルペスウイルス１型。
13. 【請求項１３】 前記外来遺伝子が、ネコヘルペスウイ
    ルス１型由来のプロモーターで発現されることを特徴と
    する請求項２又は３に記載の組換えネコヘルペスウイル
    ス１型。
14. 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載
    の組換えネコヘルペスウイルス１型ＤＮＡでトランスフ
    ェクトされた培養細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載
    の組換えネコヘルペスウイルス１型の作出に必要なトラ
    ンスファーベクターとネコヘルペスウイルス１型のゲノ
    ムＤＮＡとをコトランスフェクトされた培養細胞。
16. 【請求項１６】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載
    の組換えネコヘルペスウイルス１型に感染した細胞培養
    物。
17. 【請求項１７】 請求項１〜１３のいずれか１項に記載
    の組換えネコヘルペスウイルス１型を少なくとも含むこ
    とを特徴とするワクチン。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のワクチンを、ネコ
    の眼、鼻及び口経由又は筋肉内、静脈内あるいは皮下注
    射により投与することを特徴とする感染性疾患に対する
    ネコの免疫感作方法。