CN102648273A - 枯草蛋白酶变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白酶变体。本发明还涉及编码所述变体蛋白酶变体的多核苷酸，并涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用所述变体酶的方法，如用于洗衣和去污剂组合物。

Description

枯草蛋白酶变体

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。

技术领域

本发明涉及新型枯草杆菌酶变体，其相对于亲本枯草杆菌酶在一个或多个性质中呈现改变，所述性质包括：洗涤性能，热稳定性，储藏稳定性或催化活性。本发明的变体适用于例如清洁或去污剂组合物，如洗衣去污剂组合物和洗碟组合物，包括自动洗碟组合物。本发明还涉及编码所述变体的分离的DNA序列，表达载体，宿主细胞，和用于产生和使用本发明的变体的方法。此外，本发明涉及包含本发明变体的清洁和去污剂组合物。

背景技术

在去污剂工业中，酶应用于在洗涤制剂中已超过30年。用于此类制剂的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其他酶，或其混合物。商业上，最重要的酶是蛋白酶。

越来越多数量的商业上使用的蛋白酶是天然出现的野生型蛋白酶的蛋白质工程变体，例如DURAZYM(R)、

RELASE(R)和(Novozymes A/S)、AXAPEM(R)(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT(R)(Genencor International、Inc.)、MAXATASE^TM、MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、PROPERASE^TM、PURAFECT^TM、PURAFECT OxP^TM、FN2^TM、FN3^TM和FN4^TM(Genencor International、Inc.)。

此外，本领域中描述了许多变体，如WO 04/041979(NOVOZYMES A/S)中描述了相对于亲本枯草杆菌酶在例如洗涤性能、热稳定性、储藏稳定性或催化活性中呈现改变的枯草杆菌酶变体。所述变体适用于例如清洁或去污剂组合物。

已描述了许多有用的蛋白酶变体，其中许多在不同去污剂中提供了改善的活性、稳定性和溶解性。然而，多种因素使得蛋白酶的进一步改善是有利的。洗涤条件一直在改变，例如，考虑到温度和pH，以及在常规洗涤条件下许多污迹仍难以完全去除。因此，尽管在蛋白酶开发中进行了深入研究，仍有对于新型改善的蛋白酶的需要。

因此本发明的一个目标是提供相对于其亲本酶具有改善的性质的枯草杆菌酶的变体。

发明内容

本发明涉及亲本枯草杆菌蛋白酶的变体，所述亲本枯草杆菌蛋白酶可为如SEQ ID NO:1中所示的枯草杆菌蛋白酶。

在一个方面，本发明的变体与亲本枯草杆菌蛋白酶，如SEQ ID NO:1中所示的枯草杆菌蛋白酶相比具有至少一个改善的性质，其中所述改善的性质可为改善的洗涤性能，如改善的污迹去除能力，在硬表面洗涤中改善的洗涤性能，如改善的洗碟性能，改善的稳定性，如储藏或热稳定性，或者改善的催化活性。在本发明的一个方面，所述变体具有改善的蛋去除能力，如改善的将煮熟的蛋黄从硬表面去除的能力。

因此，本发明的一个方面涉及亲本枯草杆菌蛋白酶的变体，其包含取代9{R,K,H}、15{G，A,S,T,M}、68{G，A,S,T,M}、218{D,S,G，V}和245{R,K,H}，其中所述变体进一步包含至少一种下述的修饰：61{D,E}、62{D,E}、76{D,E}、*97aG、98{G，S}、99G、101G、120{V，Q,D}、131{T,S}、137H、194P、228V、230V、261D，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2[BPN’]的成熟多肽的位置。

在一个方面，本发明的变体进一步包含取代G61E。

在一个方面，本发明的变体进一步包含取代A98S。

在一个方面，本发明的变体进一步包含取代S99G。

在一个方面，本发明的变体进一步包含下述取代：S9R、A15T、G61E、V68A、A98S、S99G、N218D和Q245R。

在一个方面，所述亲本枯草杆菌蛋白酶是包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽。

在另一个方面，所述变体相对于亲本枯草杆菌蛋白酶具有一种或多种改善的性质，其中所述改善的性质包括洗涤性能、稳定性、催化活性和洗碟性能。

在进一步的方面，所述改善的性质包括改善的洗涤性能，如改善的污迹去除能力，在硬表面洗涤如洗碟中改善的洗涤性能，改善的稳定性，如储藏或热稳定性，或者改善的催化活性。在本发明的一个方面，所述变体具有改善的蛋去除能力，如改善的将煮熟的蛋黄从硬表面去除的能力。

另一个方面涉及通过导入亲本枯草杆菌蛋白酶下述取代而产生变体的方法：

i.在位置9用{R,K,H}的取代

ii.在位置15用{G，A,S,T,M}的取代

iii.在位置68用{G，A,S,T,M}的取代

iv.在位置245用{R,K,H}的取代，和

v.在位置218用{D,S,G或V}的取代

和一种或多种下述修饰：在位置61用{D,E}取代，在位置62用{D,E}取代，在位置76用{D,E}取代，在位置97插入G，在位置98用{G，S}取代，在位置99用G取代，在位置101用G取代，在位置120用{V，Q,D}取代，在位置131用{T,S}取代，在位置137用H取代，在位置194用P取代，在位置228用V取代，在位置230用V取代，在位置261用D取代，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2[BPN’]的成熟多肽的位置。

本发明的另一个方面涉及编码所述变体枯草杆菌蛋白酶的分离的多核苷酸，和包含所述多核苷酸的核酸构建体，载体和宿主细胞。

本发明的另一个方面涉及包含本发明的变体的清洁或去污剂组合物，优选洗衣或洗碟组合物。本发明的一个方面涉及变体在例如用于洗衣或洗碟的去污剂中的用途。

发明详述

定义

蛋白酶解活性：该术语在本文中定义为能够通过蛋白酶解降解蛋白，其为通过水解在多肽链中将氨基酸连接在一起形成蛋白的肽键而进行的蛋白分解代谢。因此，蛋白由具有蛋白酶解活性的蛋白酶降解为氨基酸。术语“蛋白酶活性”和“蛋白酶解活性”可互换使用。亦参见下文中对“蛋白酶”的定义。

变体：术语“变体”在本文中定义为在一个或多个(几个)特定位置包含改变或修饰，如取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基的多肽。经改变的多核苷酸经过人为干预通过修饰多核苷酸序列而得到。所述变体可为枯草杆菌蛋白酶变体，即枯草杆菌蛋白酶的变体，例如SEQ ID NO:1中公开的多核苷酸序列或其同源序列。术语“蛋白酶变体”和“枯草杆菌蛋白酶变体”可互换使用。本发明的变体优选具有蛋白酶活性或蛋白酶解活性。术语“一个或多个”，“一个或几个”和“至少一个”可互换使用。

修饰：本文中使用的术语“修饰”定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及编码亲本蛋白酶的DNA的遗传操作。所述修饰可为在感兴趣的氨基酸处或感兴趣的氨基酸中进行的氨基酸侧链的替代、取代、缺失和/或插入。

野生型酶：术语“野生型”蛋白酶变体表示由天然存在的微生物如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌表达的蛋白酶变体，即，编码蛋白酶变体的多肽并不是经过人为干预通过修饰多核苷酸序列而得到的。

亲本酶：术语“亲本”蛋白酶变体，如“亲本”枯草杆菌蛋白酶变体用于本文指一种蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶，本发明中的酶变体是对其进行修饰，例如，取代、插入、缺失和/或截短(truncation)而产生的。该术语亦指变体用以比较和比对的多肽。所述亲本可为天然存在(野生型)多肽或变体。举例而言，所述亲本多肽可为天然存在的多肽的变体，其氨基酸序列经修饰或改变。亲本亦可为等位基因变体，其为由占据相同染色体基因座的基因的两种或更多可选形式中的任一种所编码的多肽。

分离的变体或多肽：术语“分离的变体”或“分离的多肽”用于本文指一种自来源分离的变体或多肽。在一个方面，该变体或多肽至少是1%纯的，优选至少是5%纯的，更优选至少是10%纯的，更优选至少是20%纯的，更优选至少是40%纯的，更优选至少是60%纯的，甚至更优选至少是80%纯的，且最优选至少是90%纯的，其纯度由SDS-PAGE确定。

基本上(substantially)纯的变体或多肽：术语“基本上纯的变体”或“基本上纯的多肽”在本文中指一种多肽制备物，其包含至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，且甚至最优选至多0.5%以重量计的与其天然或重组结合的其他多肽物质。因此，优选地，所述基本上纯的变体或多肽是以存在于该制备物中的总多肽物质重量计至少92%纯的，优选至少94%纯的，更优选至少95%纯的，更优选至少96%纯的，更优选至少96%纯的，更优选至少97%纯的，更优选至少98%纯的，甚至更优选至少99%纯的，最优选至少99.5%纯的，且甚至最优选100%纯的。本发明的变体和多肽优选为基本上纯的形式。其可通过，例如，以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该变体或多肽而达成。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为具有蛋白酶变体活性的多肽，其为经翻译和任何翻译后修饰，如N末端加工、C末端截短、糖化、磷酸化等之后的其最终形式。在一个方面，所述成熟多肽是SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的多肽。信号程序SignalIP3.0程序可用于预测成熟多肽。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有蛋白酶变体活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个方面，所述成熟多肽编码序列是编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸。

同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数”同一性”所描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等，2000，Trends inGenetics 16:276-277；http://emboss.org)的Needle程序，优选为3.0.0版或之后的版本中执行的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定，如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(The European MolecularBiology Open Software Suite)，Rice等，2000，见上；http://emboss.org)的Needle程序，优选为3.0.0版或之后的版本中执行的。所用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度–比对中缺口总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用白小羊蹄菌(Microdochium nivale)蛋白酶变体CBS 100236在tfasty检索(Pearson,W.R.,1999,于Bioinformatics Methods and Protocols,S.Misener和S.A.Krawetz编,185-219页)中给出小于0.001的E值(或期望分数)的预测的多肽。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有蛋白酶变体活性。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从成熟多肽编码序列或其同源序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有蛋白酶变体活性的多肽片段。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述分离的多核苷酸为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%，并且甚至最优选至少95%纯。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合在遗传工程多肽生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%，并且甚至最优选至少99.5%纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸物质。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括编码本发明多肽的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。

改善的性质：术语“改善的性质”在本文中定义为与相对于亲本蛋白酶变体而改善的变体相关的特征。此类改善的性质包括但不限于：洗涤性能如污迹性能，例如对含有蛋白的污物的性能，污迹去除例如蛋污迹的去除，稳定性例如热稳定性、pH稳定性或在粉末、液体或凝胶去污剂制剂或洗碟组合物中的稳定性，改变的温度依存性活性概貌，pH活性，底物特异性，产物特异性和化学稳定性。在一个实施方案中，改善的性质包括改善的洗涤或洗碟性能，例如蛋白性污物如蛋污迹的污迹去除。

洗涤性能：在本文的语境中，术语“洗涤性能”用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中去除存在于待清洁的目标上的蛋白性或有机的污迹的能力。洗涤性能的改善可通过计算本文实施例3中定义的所谓的强度值(Int)来定量。亦参见本文实施例3中的洗涤性能测试。

改善的洗涤性能：术语“改善的洗涤性能”在本文中定义为的变体酶相对于亲本蛋白酶变体的洗涤性能展示蛋白酶变体的洗涤性能的改变，例如，增加的污迹去除。术语“洗涤性能”包括洗衣中的，但亦包括例如洗碟中的洗涤性能。

硬表面清洁：该术语包括“洗碟”，且为清洁硬物体，如用于洗碟的典型物体，包括但不限于：盘、杯、玻璃杯(glasses)、碗和餐具如勺、刀、叉、餐皿(serving utensils)、陶瓷制品、塑料制品、金属制品、瓷器、玻璃和聚丙烯酸酯。

洗碟组合物：术语“洗碟组合物”指所有形式的用于清洁硬表面的组合物。本发明并不限于任何具体类型的洗碟组合物或任何具体的去污剂。

蛋白酶

在蛋白底物中切割酰胺连接的酶归类为蛋白酶，或(可互换使用)肽酶(参见Walsh,1979,Enzymatic Reaction Mechanisms.W.H.Freeman and Company，San Francisco,Chapter 3)。

氨基酸位置/残基的编号

如果没有提及其他，则本文中使用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN’(BASBPN)序列的编号。对于BPN’序列的进一步描述，参见SEQ ID NO:2或Siezen等,Protein Engng.4(1991)719-737。

丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解且其中在活性位点有一个必需丝氨酸残基的酶(White,Handler和Smith,1973"Principles of Biochemistry,"Fifth Edition,McGraw-Hill Book Company,NY，pp.271-272)。

细菌丝氨酸蛋白酶具有20000至45000道尔顿范围的分子量。它们受二异丙基氟磷酸抑制。它们水解简单的末端酯，并在活性上类似于也是丝氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶。一个涵盖亚组的更狭窄的术语，碱性蛋白酶，反映了一些丝氨酸蛋白酶的高最适pH，为pH9.0至11.0(关于综述，参见Priest(1977)Bacteriological Rev.41711-753)。

枯草杆菌酶

Siezen等,Protein Engng.4(1991)719-737和Siezen等Protein Science 6(1997)501-523提出了暂时命名为枯草杆菌酶的丝氨酸蛋白酶的亚组。它们通过之前称作枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的超过170个氨基酸序列的同源性分析而定义。枯草杆菌蛋白酶之前常常定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而根据Siezen等，现在为枯草杆菌酶的亚组。已鉴定了广泛种类的枯草杆菌酶，并且已确定了许多枯草杆菌酶的氨基酸序列。对于此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更加具体的描述，参照Siezen等(1997)。

枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或“真性”枯草杆菌蛋白酶，包括“经典”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)，枯草杆菌蛋白酶BPN′，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(

NOVOZYMES A/S)，和枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。

枯草杆菌酶的另一个亚组，I-S2或高碱性枯草杆菌蛋白酶，由Siezen等(见上)认定。亚组I-S2蛋白酶描述为高度碱性的枯草杆菌蛋白酶，并包括酶如枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(Genencor International Inc.)，枯草杆菌蛋白酶309(NOVOZYMES A/S)，枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(

NOVOZYMES A/S)，和碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。

由NOVOZYMES A/S出售。其为来自迟缓芽孢杆菌(B.Lentus)的枯草杆菌蛋白酶309，并仅在一个位置与BAALKP不同(N87S)。

具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

亲本枯草杆菌酶

术语“亲本枯草杆菌酶”描述由Siezen等(1991和1997)定义的枯草杆菌酶。对于进一步细节，参见上文对“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶亦可为从天然来源分离的枯草杆菌酶，其中进行了后续修饰但保留了枯草杆菌酶的特征。此外，亲本枯草杆菌酶可为通过DNA改组技术制备的枯草杆菌酶，如描述于J.E.Ness等,Nature Biotechnology,17,893-896(1999)。

或者，术语“亲本枯草杆菌酶”也可命名为“野生型枯草杆菌酶”。

作为参考，提供了在本文中提及的多种枯草杆菌酶的缩写的表，对于其他缩写，参见Siezen等,Protein Engng.4(1991)719-737和Siezen等ProteinScience 6(1997)501-523。

表III

枯草杆菌酶的修饰

术语“修饰”用于本文中定义为包括对枯草杆菌酶的化学修饰，以及对编码枯草杆菌酶的DNA的遗传操作，所述修饰可为在感兴趣的氨基酸处或感兴趣的氨基酸中进行的氨基酸侧链的替代、取代、缺失和/或插入。

枯草杆菌酶变体

术语“变体”和术语“枯草杆菌酶变体”如上文中所定义。

同源枯草杆菌酶序列

就本发明而言，在本文语境下，两个氨基酸序列之间的同源性通过参数“同一性”描述。两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如上所述的Needleman-Wunsch算法确定。常规输出在氨基酸比对旁边给出两个序列之间的“百分比同一性”的计算结果。

基于本说明书，本领域技术人员可常规地鉴定合适的同源枯草杆菌酶，可对其根据本发明进行修饰。

在一个方面，所述亲本蛋白酶包含与SEQ ID NO:1具有优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，更优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%或甚至100%的氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列。

基本上同源的亲本蛋白酶变体可具有一个或多个(几个)氨基酸取代、缺失和/或插入，在本文的语境下，术语“一个或多个”可与术语“几个”互换使用。这些变化优选为次要性质的，其为如上所述的保守氨基酸取代或其他不显著影响蛋白或多肽三维折叠或活性的取代；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；和小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或促进纯化的小延伸(亲和标记)，如多组氨酸序列(polyhistidine tract)或蛋白A(Nilsson等,1985,EMBO J.4:1075;Nilsson等,1991,Methods Enzymol.198:3；亦一般性参见Ford等,1991,Protein Expression andPurification 2:95-107)。

尽管如上所述的变化优选为次要性质的，此种变化亦可是巨大性质的，如多至300个或更多个氨基酸的较大多肽作为氨基或羧基末端延伸的融合。

所述亲本蛋白酶可包含或组成为(consist of)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有蛋白酶活性的片段。在一个方面，所述亲本蛋白酶包含或组成为SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

枯草杆菌酶变体

本发明涉及相对于亲本枯草杆菌酶呈现在一个或多个性质上的改变的新型枯草杆菌酶变体，所述性质包括：洗涤性能，如改善的污迹去除能力，在硬表面洗涤如洗碟中的洗涤性能，稳定性如储藏或热稳定性，以及催化活性。在本发明的一个方面，所述变体具有改善的蛋去除能力，如改善的将煮熟的蛋黄从硬表面去除的能力。

本发明的枯草杆菌酶变体的去污剂组合物的洗涤性能可在洗涤实验中确定。可使用实施例3中具体描述的Automatic Mechanical Stress Assay(AMSA)测试酶变体。

本发明的变体的催化活性可使用如实施例中具体描述的“Kinetic SucAAPF-pNA”测定来确定。

在一个实施方案中，考虑为本发明一部分的变体为下述变体，当将其与亲本枯草杆菌酶相比较时，具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或插入，所述变体包括下述亲本枯草杆菌蛋白酶的变体，其包含取代9{R,K,H}、15{G，A,S,T，M}、68{G，A,S,T，M}、218{D,S,G，V}和245{R,K,H}，其中所述变体进一步包含至少一个下述修饰：61{D,E}、62{D,E}、76{D,E}、*97aG、98{G，S}、99G、101G、120{V，Q,D}、131{T，S}、137H、194P、228V、230V、261D，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2[BPN’]的成熟多肽的位置。

在本发明的一个实施方案中，所述变体进一步包含至少一个下述改变：G61E、A98S或S99G。

在本发明的一个具体实施方案中，所述变体包含取代S9R、A15T、G61E、V68A、A98S、S99G、N218D和Q245R。

优选亲本枯草杆菌酶属于亚组I-S1或I-S2，特别是亚组I-S2，两者均可为来自自然界或来自人工构建多样性的酶，并用于从亲本枯草杆菌酶设计和产生变体。

关于来自亚组I-S1的变体，优选亲本枯草杆菌酶选自下组：BSS168(BSSAS、BSAPRJ、BSAPRN、BMSAMP)、BASBPN、BSSDY、BLSCAR(BLKERA、BLSCA1、BLSCA2、BLSCA3)、BSSPRC(丝氨酸蛋白酶C)、和BSSPRD (丝氨酸蛋白酶D)，或其保留了亚组I-S1特征的功能变体。

关于来自亚组I-S2的变体，优选亲本枯草杆菌酶选自下组：BSAPRQ、BLS147(BSAPRM、BAH101)、BLSAVI(BSKSMK、BAALKP、BLSUBL)、BYSYAB、BAPB92、TVTHER和BSAPRS，或其保留了亚组I-S2特征的功能变体。

具体而言，所述亲本枯草杆菌酶为BLSAVI(

NOVOZYMESA/S)，且本发明的一种优选的枯草杆菌酶变体相应地为

(SEQ ID NO1)的变体。

变体命名规则：

就本发明而言，公开于SEQ ID NO:2中的BPN’的氨基酸序列用于确定在其他蛋白酶或蛋白酶变体中对应的氨基酸残基。将其他蛋白酶或蛋白酶变体的氨基酸序列与公开于SEQ ID NO:2中的蛋白酶氨基酸序列进行比对，并基于该比对，可以确定SEQ ID NO:2所公开的蛋白酶变体的氨基酸序列中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。

多肽序列的比对可使用，例如，“ClustalW”(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.,1994,CLUSTAL W:Improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting,positions-specific gappenalties and weight matrix choice,Nucleic Acids Research22:4673-4680)得到。DNA序列的比对可以使用所述多肽比对作为模板，将氨基酸用来自所述DNA序列的对应密码子替代来进行。

通常使用的逐对序列比较算法(pairwise sequence comparison algorithm)足以检测未分歧超越大约20-30%序列同一性的点的多肽序列之间的相似性(Doolittle,1992,Protein Sci.1:191-200;Brenner等,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,6073-6078)。然而，具有相同折叠(fold)和相似生物学功能的真正同源的多肽经常分歧到传统的基于序列的比较无法检测出其关系的点(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表现(probabilistic representation)(序型)来搜索数据库的搜索程序获得。举例而言，PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物(Atschul等,1997,NucleicAcids Res.25:3389-3402)。当目标多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个(几个)代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones 1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)使用来自多个来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondary structure prediction)、结构比对序型(structural alignment profile)以及溶解势(solvation potential))的信息作为向预测查询序列(query sequence)的结构折叠(structural fold)的神经网络的输入。类似地，Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对继而能够用于生成关于目标多肽的同源性模型，且上述模型可就准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。

对于已知结构的蛋白质，可用数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。举例而言，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distance alignment matrix)(Holm和Sander,1998,Proteins 33:88-96)或组合延伸(combinatorial extension)(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Eng.11:739-747)进行比对，且这些算法的执行可另外用于查询具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如Holm和Park,2000,Bioinformatics16:566-567)。这些结构比对可用于在相同结构超家族内的蛋白质中预测结构和功能上对应的氨基酸残基。该信息，连同来源于同源性建模与序型搜索的信息，可用于在将目标突变从一个蛋白质移到一个接近的或较远的同源物时预测哪个残基要突变。

在描述本发明的不同蛋白酶变体时，为了参照方便起见，采用了下述的命名法。在所有情况下，使用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

在描述本发明所考虑或产生的多种枯草杆菌酶变体时，为了参照方便起见，采用了下述命名法。

首先通过将分离的酶或亲本酶与如上所述的SEQ ID NO:2的枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)进行比对来定义参照框。

亲本蛋白酶变体

取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别代表在205和411位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)的突变。或者，多重突变可由空格分开，例如G205R S411F，或它们可由逗号(,)分开，例如G205R,S411F。

缺失。对于氨基酸缺失，使用了如下命名法：初始氨基酸，位置*。相应地，在位置195缺失甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失可如上所述对于取代那样分开，例如由逗号(,)分开，“Gly195*,Ser411*”或“G195*,S411*”。

插入。对于氨基酸插入，使用了如下的命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G 195GK”或“*195aK”。多个氨基酸插入命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新插入的氨基酸#1，新插入的氨基酸#2；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此情况下，通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为：

亲本:	变体:
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

亲本蛋白酶变体可从任何合适的来源获得，如微生物来源，如真菌，例如丝状真菌或酵母，或可为从已知的核酸或氨基酸序列信息制备的人工序列。

公众可容易地在培养物保藏中心(culture collection)，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH，DSM)和荷兰真菌培养物保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)中获得此类菌株。

在本发明的一个方面，所述亲本枯草杆菌蛋白酶为包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽。

在本发明的一个方面，所述亲本蛋白酶包含与SEQ IDNO:1具有优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%或甚至100%同一性的氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列。

在另一个方面，所述亲本蛋白酶包含与SEQ ID NO:1具有优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%或甚至100%同一性的氨基酸序列同一性程度，并具有蛋白酶活性的氨基酸序列。

在本发明的一个方面，所述变体具有与SEQ ID NO:1相差三十个氨基酸，二十九个氨基酸、二十八个氨基酸、二十七个氨基酸、二十六个氨基酸、二十五个氨基酸、二十四个氨基酸、二十三个氨基酸、二十二个氨基酸、二十一个氨基酸、二十个氨基酸、十九个氨基酸、十八个氨基酸、十七个氨基酸、十六个氨基酸、十五个氨基酸、十四个氨基酸、十三个氨基酸、十二个氨基酸、十一个氨基酸、十个氨基酸，九个氨基酸，八个氨基酸，七个氨基酸，六个氨基酸，五个氨基酸，四个氨基酸，三个氨基酸，两个氨基酸，或一个氨基酸的氨基酸序列。

在本发明一个具体方面，本发明的变体具有与SEQ ID NO:1相差十二个氨基酸，更优选十一个氨基酸，更优选十个氨基酸，甚至更优选九个氨基酸，并且甚至更优选八个氨基酸的氨基酸序列。

在一个方面，本发明的变体中相对于亲本(例如，具有SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的亲本蛋白酶变体)的氨基酸改变的数量包括或为(consist of)：20个改变，19个改变，18个改变，17个改变，16个改变，15个改变，14个改变，13个改变，12个改变，11个改变，10个改变，9个改变，8个改变，7个改变，6个改变，5个改变，4个改变，更优选3个改变，甚至更优选2个改变，并且最优选1个改变。在另一个方面，本发明的变体中氨基酸改变的数量为优选20个改变，19个改变，18个改变，17个改变，16个改变，15个改变，14个改变，13个改变，12个改变，11个改变，10个改变，9个改变，8个改变，7个改变，6个改变，5个改变，4个改变，3个改变，2个改变，或1个改变。

在一个方面，本发明的变体中相对于亲本(例如，具有SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的亲本蛋白酶变体)的氨基酸改变的数量包括或为：20个取代，19个取代，18个取代，17个取代，16个取代，15个取代，14个取代，13个取代，12个取代，11个取代，10个取代，9个取代，8个取代，7个取代，6个取代，5个取代，4个取代，更优选3个取代，甚至更优选2个取代，并且最优选1个取代。在另一个方面，本发明的变体中氨基酸取代的数量为20个取代，19个取代，18个取代，17个取代，16个取代，15个取代，14个取代，13个取代，12个取代，11个取代，10个取代，9个取代，8个取代，7个取代，6个取代，5个取代，4个取代，3个取代，2个取代，或1个取代。

在一个方面，所述变体包含与SEQ ID NO:1具有优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%或甚至100%同一性的氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列。

在一个方面，所述变体包含与SEQ ID NO:1具有优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%或甚至100%同一性的氨基酸序列同一性程度，且具有蛋白酶活性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明涉及变体的用途，所述变体可包含或组成为SEQ IDNO:3或其等位变体，或它们具有蛋白酶变体活性的片段的氨基酸序列。在一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及变体在硬表面清洁中的用途，所述变体可包含或组成为SEQ IDNO:3或其等位变体的氨基酸序列。此外，本发明还涉及从硬表面或从衣物去除蛋白性污迹，特别是煮沸的蛋污迹的方法，所述方法包括将含有蛋污迹的硬表面或含有蛋污迹的衣物纺织品与包含枯草杆菌蛋白酶变体的清洁或去污剂组合物相接触，优选所述组合物为衣物纺织品或洗碟组合物，所述变体可包含或组成为SEQ ID NO:3或其等位变体的氨基酸序列。在一个方面，所述变体包含具有与SEQ ID NO:3优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%或甚至100%同一性的氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列。

在一个方面，所述变体包含具有与SEQ ID NO:3优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%或甚至100%同一性的氨基酸序列同一性程度，并具有蛋白酶活性的氨基酸序列。

在本发明的一个方面，所述变体具有与SEQ ID NO:3相差三十个氨基酸，二十九个氨基酸、二十八个氨基酸、二十七个氨基酸、二十六个氨基酸、二十五个氨基酸、二十四个氨基酸、二十三个氨基酸、二十二个氨基酸、二十一个氨基酸、二十个氨基酸、十九个氨基酸、十八个氨基酸、十七个氨基酸、十六个氨基酸、十五个氨基酸、十四个氨基酸、十三个氨基酸、十二个氨基酸、十一个氨基酸、十个氨基酸，九个氨基酸，八个氨基酸，七个氨基酸，六个氨基酸，五个氨基酸，四个氨基酸，三个氨基酸，两个氨基酸，或一个氨基酸的氨基酸序列。

在一个方面，本发明涉及变体的用途，所述变体可包含或组成为SEQ IDNO:4或其等位变体，或它们具有蛋白酶变体活性的片段的氨基酸序列。在一个方面，所述变体包含或组成为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及变体在硬表面清洁中的用途，所述变体可包含或组成为SEQ IDNO:4或其等位变体的氨基酸序列。此外，本发明还涉及从硬表面或从衣物纺织品去除蛋白性污迹，特别是煮沸的蛋污迹的方法，所述方法包括将含有蛋污迹的硬表面或含有蛋污迹的衣物纺织品与包含枯草杆菌蛋白酶变体的清洁或去污剂组合物相接触，优选所述组合物为衣物纺织品或洗碟组合物，所述变体可包含或组成为SEQ ID NO:4或其等位变体的氨基酸序列。

在一个方面，所述变体包含与SEQ ID NO:4具有优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%或甚至100%同一性的氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列。

在一个方面，所述变体包含与SEQ ID NO:4具有优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%或甚至100%同一性的氨基酸序列同一性程度，且具有蛋白酶活性的氨基酸序列。

在本发明的一个方面，所述变体具有与SEQ ID NO:4相差三十个氨基酸，二十九个氨基酸、二十八个氨基酸、二十七个氨基酸、二十六个氨基酸、二十五个氨基酸、二十四个氨基酸、二十三个氨基酸、二十二个氨基酸、二十一个氨基酸、二十个氨基酸、十九个氨基酸、十八个氨基酸、十七个氨基酸、十六个氨基酸、十五个氨基酸、十四个氨基酸、十三个氨基酸、十二个氨基酸、十一个氨基酸、十个氨基酸，九个氨基酸，八个氨基酸，七个氨基酸，六个氨基酸，五个氨基酸，四个氨基酸，三个氨基酸，两个氨基酸，或一个氨基酸的氨基酸序列。

基本上同源的变体可具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。这些变化优选为次要性质的，其为如上所述的保守氨基酸取代或其他不显著影响蛋白或多肽三维折叠或活性的取代；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；和小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或促进纯化的小延伸(亲和标记)，如多组氨酸序列(poly histidinetract)或蛋白A(Nilsson等,1985,EMBO J.4:1075;Nilsson等,1991,MethodsEnzymol.198:3；亦一般性参见Ford等,1991,Protein Expression andPurification 2:95-107)。

尽管如上所述的变化优选为次要性质的，此种变化亦可是巨大性质的，如多至300个或更多个氨基酸的较大多肽作为氨基或羧基末端延伸的融合。

变体的制备

亲本蛋白酶变体的变体可根据本领域任何已知的任何诱变方法，如定点诱变、合成基因构建(synthetic gene construction)、半合成基因构建(semisynthetic gene construction)、随机诱变、改组(shuffling)等来制备。

定点诱变是在编码亲本蛋白酶变体的多核苷酸分子上的确定位点创建一个或几个突变的技术。所述技术可在体外或体内进行。

合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标多肽分子的多核苷酸分子。基因合成可使用多种技术进行，如由Tian等所述基于多路微芯片(multiplex microchip-based)的技术(Tian等,Nature 432:1050-1054)，以及类似的技术，其中合成寡核苷酸并在可用光编程(photo-programmable)的微流芯片(microfluidic chip)上组装。

定点诱变可在体外通过PCR达成，涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物。定点诱变亦可在体外通过表达盒诱变进行，涉及用限制酶在包含编码亲本蛋白酶变体的多核苷酸的质粒中的位点进行剪切，然后将含有突变的寡核苷酸连接于所述多核苷酸中。通常在质粒上和在寡核苷酸上进行消化的限制酶是相同的，使所述质粒和插入物的粘性末端能够彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；以及Barton等,1990,Nucleic Acids Research 18:7349-7355。

定点诱变可在体内通过本领域已知方法达成。参见，例如，美国专利申请公开2004/0171154；Storici等,2001,Nature Biotechnology 19:773-776;Kren等,1998,Nat.Med.4:285-290;以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。

任何定点诱变方法可用于本发明。有许多可用的商业试剂盒可用于制备亲本蛋白酶变体的变体。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57;Bowie和Sauer，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156;WO 95/17413;或者WO 95/22625所公开的那些，来进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO 92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等,1986,Gene 46:145;等,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序。这些方法使快速确定目标多肽中单个氨基酸残基的重要性成为可能。

半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的方面达成。半合成构建通常为使用合成的多核苷酸片段与PCR技术组合的方法。基因的确定区域可因而从头开始合成，而其他区域可使用定点诱变引物扩增，还可对另外的其他区域进行易错PCR或非易错PCR(non-error prone PCR)扩增。然后多核苷酸片段可进行改组。

本发明的另一个方面涉及通过将下述取代导入亲本枯草杆菌蛋白酶以产生变体的方法：

i.在位置9用{R,K,H}的取代

ii.在位置15用{G.A,S,T,M}的取代

iii.在位置68用{G.A,S,T,M}的取代

iv.在位置245用{R,K,H}的取代，和

v.在位置218用{D,S,G或V}的取代

和一种或多种下述修饰：在位置61用{D,E}取代，在位置62用{D,E}取代，在位置76用{D,E}取代，在位置97插入G，在位置98用{G，S}取代，在99位置用G取代，在位置101用G取代，在位置120用{V，Q,D}取代，在位置131用{T，S}取代，在位置137用H取代，在位置194用P取代，在位置228用V取代，在位置230用V取代，在位置261用D取代，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2[BPN’]的成熟多肽的位置。

在一个方面，所述方法包括在对应于位置9，15，68，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述方法包括在对应于9，15，68，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述方法包括分别在对应于位置9，15，68，218和245的位置取代为R，T，A，D和R。在另一个方面所述方法包括在SEQ ID NO:1的成熟多肽中取代S9R，A15T，V68A，N218D和Q245R。

在一个方面，所述方法包括在对应于位置9，15，68，120，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述方法包括在对应于9，15，68，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述方法包括分别在对应于位置9，15，68，120，218和245的位置取代为R，T，A，V，D和R。在另一个方面所述方法包括在SEQ ID NO:1的成熟多肽中取代S9R，A15T，V68A，H120V，N218D和Q245R。

在一个方面，所述方法包括在对应于位置9，15，68，120，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述方法包括在对应于9，15，68，120，218和245的位置用Q，R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述方法包括分别在对应于位置9，15，68，120，218和245的位置取代为R，T，A，Q，D和R。在另一个方面所述方法包括在SEQ IDNO:1的成熟多肽中取代S9R，A15T，V68A，H120Q，N218D和Q245R。

在一个方面，所述方法包括在对应于位置9，15，68，76，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述方法包括在对应于9，15，68，76，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述方法包括分别在对应于位置9，15，68，76，218和245的位置取代为R，T，A，D，D和R。在另一个方面所述方法包括在SEQ ID NO:1的成熟多肽中取代S9R，A15T，V68A，N76D，N218D和Q245R。

在一个方面，所述方法包括在对应于位置9，15，61，68，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述方法包括在对应于9，15，61，68，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述方法包括分别在对应于位置9，15，61，68，218和245的位置取代为R，T，E，A，D和R。在另一个方面所述方法包括在SEQ ID NO:1的成熟多肽中取代S9R，A15T，G61E，V68A，N218D和Q245R。

在一个方面，所述方法包括在对应于位置9，15，61，68，98218和245的位置的取代。在另一个方面，所述方法包括在对应于9，15，61，68，98，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述方法包括分别在对应于位置9，15，61，68，98，218和245的位置取代为R，T，E，A，S，D和R。在另一个方面所述方法包括在SEQ ID NO:1的成熟多肽中取代S9R，A15T，G61E，V68A，A98S，N218D和Q245R。

在一个方面，所述方法包括在对应于位置9，15，61，68，9899，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述方法包括在对应于9，15，61，68，98，99，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述方法包括分别在对应于位置9，15，61，68，98，99，218和245的位置取代为R，T，E，A，S，G，D和R。在另一个方面所述方法包括在SEQ ID NO:1的成熟多肽中取代S9R，A15T，G61E，V68A，A98S，S99G，N218D和Q245R。

一个具体的方面涉及方法，其中将下述取代导入亲本枯草杆菌蛋白酶：

i.在位置9用R取代S；

ii.在位置15用T取代A；

iii.在位置68用A取代V；

iv.在位置245用R取代Q；

v.在位置218用D，S，G或V取代N

和一种或多种下述修饰：在位置61用E取代G，在位置62用D取代N，在位置76用D取代N，在位置97插入G，在位置98用S取代A，在位置99用G取代S，在位置101用G取代S，在位置120用D，V或Q取代H，在位置131用T取代P，在位置137用H取代Q，在位置194用P取代A，在位置228用V取代A，在位置230用V取代A，在位置261用D取代N。

变体

在一个方面，本发明涉及亲本枯草杆菌蛋白酶的变体，所述变体包含取代9{R,K,H}，15{G，A,S,T,M}，68{G，A,S,T,M}，218{D,S,G，V}和245{R,K,H}，其中所述变体进一步包含至少一种下述修饰:61{D,E}，62{D,E}，76{D,E}，*97aG，98{G，S}，99G，101G，120{V，Q,D}，131{T,S}，137H，194P，228V，230V，261D，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2[BPN’]的成熟多肽的位置。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9的位置用R，K或H的取代。在另一个方面，所述变体包含R作为在对应于位置9的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置15的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于15的位置用G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含T作为在对应于位置15的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代A15T。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置61的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于61的位置用E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含E作为在对应于位置61的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代G61E。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置62的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于62的位置用E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含D作为在对应于位置62的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N62D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置68的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于68的位置用G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含A作为在对应于位置68的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代V68A。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置76的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于76的位置用E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含D作为在对应于位置76的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N76D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置97的位置的插入。在另一个方面，所述变体包含在对应于97的位置用G的插入。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的插入*97aG。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置98的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于98的位置用G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含S作为在对应于位置98的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代A98S。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置99的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于99的位置用G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于99的位置用G的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S99G。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置101的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于101的位置用G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于101的位置用G的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S 101G。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置120的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于120的位置用Q，V，N，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含D作为在对应于位置120的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代H120D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置120的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于120的位置用Q，V，N，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含N作为在对应于位置120的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代H120N。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置120的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于120的位置用Q，V，N，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含V作为在对应于位置120的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代H120V。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置120的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于120的位置用Q，V，N，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含Q作为在对应于位置120的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代H120Q。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置131的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于131的位置用T或S的取代。在另一个方面，所述变体包含S作为在对应于位置131的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代P131S。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置137的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于137的位置用R，K或H的取代。在另一个方面，所述变体包含H作为在对应于位置137的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代Q137H。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置194的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于194的位置用P的取代。在另一个方面所述变体包含取代A194PSEQ ID NO:1的成熟多肽的。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置218的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于218的位置用E，D，L，I，V，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含V作为在对应于位置218的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N218D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置228的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于228的位置用L，I或V的取代。在另一个方面，所述变体包含V作为在对应于位置228的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代A228V。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置230的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于230的位置用L，I或V的取代。在另一个方面，所述变体包含V作为在对应于位置230的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代A230V。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于245的位置用R，K或H的取代。在另一个方面，所述变体包含R作为在对应于位置245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置261的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于261的位置的用E或D取代。在另一个方面，所述变体包含D作为在对应于位置261的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N261D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9和15的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9和15的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R和T作为分别在对应于位置9和15的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R和A15T。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9和68的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9和68的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R和A作为分别在对应于位置9和68的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R和V68A。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9和218的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9和218的位置用R，K，H，E，D，L，I，V，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R和D作为分别在对应于位置9和218的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQID NO:1的成熟多肽的取代S9R和N218D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9和245的位置的用R，K或H取代。在另一个方面，所述变体包含R作为分别在对应于位置9和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置15和68的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于15和68的位置用G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含T和A作为分别在对应于位置15和68的位置的取代。在另一个方面所述变体包含取代A15T和V68ASEQ ID NO:1的成熟多肽的。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置15和218的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于15和218的位置用E，D，L，I，V，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含T和D作为分别在对应于位置15和218的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代A15T和N218D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置15和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于15和245的位置用G，A，S，T，R，K或H的取代。在另一个方面，所述变体包含T和R作为分别在对应于位置15和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代A15T和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置68和218的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于68和218的位置用E，D，L，I，V，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含A和D作为分别在对应于位置68和218的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代V68A和N218D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置68和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于68和245的位置用G，A，S，T，R，K或H的取代。在另一个方面，所述变体包含A和R作为分别在对应于位置68和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代V68A和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于218和245的位置用E，D，R，K，H的取代。在另一个方面，所述变体包含D和R作为分别在对应于位置218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代N218D和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和61的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和61的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，D或E的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和E作为分别在对应于位置9，15和61的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和G61E。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和62的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和62的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，D或E的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和D作为分别在对应于位置9，15和62的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和N62D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和68的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和68的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和A作为分别在对应于位置9，15和68的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，V68A。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和76的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和76的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，D或E的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和D作为分别在对应于位置9，15和76的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和N76D。

在一个方面，所述变体包含包含在对应于位置9，15和97的位置的修饰。在另一个方面，所述变体包含在对应于9和15的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代和在对应于97的位置的插入。在另一个方面，所述变体包含R和T作为分别在对应于位置9和15的位置的取代和在位置97用G的插入。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的修饰S9R，A15T和*97aG。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和98的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和98的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和S作为分别在对应于位置9，15和98的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和A98S。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和99的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和99的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和G作为分别在对应于位置9，15和99的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和S99G。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和120的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和120的位置用R，K，H，G，A，S，T，N，Q，V，D，E或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和D作为分别在对应于位置9，15和120的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和H120D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和120的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和120的位置用R，K，H，G，A，S，T，N，Q，V，D，E或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和D作为分别在对应于位置9，15和120的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和H120N。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和120的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和120的位置用R，K，H，G，A，S，T，N，Q，V，D，E或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和D作为分别在对应于位置9，15和120的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和H120Q。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和120的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和120的位置用R，K，H，G，A，S，T，N，Q，V，D，E或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和D作为分别在对应于位置9，15和120的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和H120V。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和131的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和131的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和{S，T}作为分别在对应于位置9，15和131的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和P131{S，T}。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和137的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和137的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和H作为分别在对应于位置9，15和137的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ IDNO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和Q137H。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和194的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和194的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和P作为分别在对应于位置9，15和194的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ IDNO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和A194P。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和218的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和218的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和D作为分别在对应于位置9，15和218的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，N218D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和228的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和228的位置用R，K，H，G，A，S，T，L，I，V或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和V作为分别在对应于位置9，15和228的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和A228V。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和230的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和230的位置用R，K，H，G，A，S，T，L，I，V或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和V作为分别在对应于位置9，15和230的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和A230V。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和245的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和R作为分别在对应于位置9，15和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ IDNO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15和261的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15和261的位置用R，K，H，G，A，S，T，D，E或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T和D作为分别在对应于位置9，15和261的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T和N261D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置15，68和218的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于15，68和218的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含T，A和D作为分别在对应于位置15，68和218的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代A15T，V68A和N218D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置15，68和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于15，68和245的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含T，A和R作为分别在对应于位置15，68和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ IDNO:1的成熟多肽的取代A15T，V68A和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置68，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于68，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含A，D和R作为分别在对应于位置68，218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代V68A，N218D和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15，68和218的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15，68和218的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T，A和D作为分别在对应于位置9，15，68和218的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，V68A和N218D。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15，68和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15，68和245的位置用R，K，H，G，A，S，T或M的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T，A和R作为分别在对应于位置9，15，68和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，V68A和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置15，68，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于15，68，218的位置和245用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含T，A，D和R作为分别在对应于位置15，68，218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代A15T，V68A，N218D和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15，68，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15，68，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T，A，D和R作为分别在对应于位置9，15，68，218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，V68A，N218D和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15，68，120，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15，68，120，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，Q，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T，A，Q，D和R作为分别在对应于位置9，15，68，218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，V68A，H120Q，N218D和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15，68，120，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15，68，120，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，Q，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T，A，V，D和R作为分别在对应于位置9，15，68，218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，V68A，H120V，N218D和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15，68，76，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15，68，76，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T，A，D，D和R作为分别在对应于位置9，15，68，76，218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，V68A，H76D，N218D和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15，61，68，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15，61，68，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T，E，A，D和R作为分别在对应于位置9，15，61，68，218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，G61E，V68A，N218D和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15，61，68，98218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15，61，68，98，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T，E，A，S，D和R作为分别在对应于位置9，15，61，68，98218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，G61E，V68A，A98S，N218D和Q245R。

在一个方面，所述变体包含在对应于位置9，15，61，68，98，99，218和245的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含在对应于9，15，61，68，98，99，218和245的位置用R，K，H，G，A，S，T，M，L，I，V，E或D的取代。在另一个方面，所述变体包含R，T，E，A，S，G，D和R作为分别在对应于位置9，15，61，68，98，99218和245的位置的取代。在另一个方面所述变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S9R，A15T，G61E，V68A，A98S，S99G，N218D和Q245R。

在进一步的实施方案中，本文中所述的枯草杆菌酶变体可有利地与下述任何位置的一个或多个修饰组合：

27，36，56，87，95，96，100，102，103，104，123，159，167，170，206，222，224，232，235，236，245，248，252和274。

具体而言，认为下述BLSAVI，BLSUBL，BSKSMK和BAALKP修饰适于组合：

K27R，*36D，S56P，S87N，S103A，V104A，V104I，V104N，V104Y，S106A，N123S，G159D，Y167A，R170S，R170L，N204D，V205I，Q206E，L217D，M222S，M222A，T224S，A232V，K235L，Q236H，N248D，N252K和T274A。

此外，包含下述任何修饰：S101G+V104N，S87N+S101G+V104N，K27R+V104Y+N123S+T274A，N76D+S103A+V104I，S99D+S101R+S103A+V104I+G160S，S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V199M+V205I+L217D，S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217D，S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V205I或N76D+V104A，或者下述修饰的其他组合：K27R，*36D，S56P，S87N，G97N，S99SE，S101G，S103A，V104A，V104I，V104N，V104Y，S106A，N123S，G159D，Y167A，R170S，R170L，N204D，V205I，Q206E，L217D，M222S，M222A，T224S，A232V，K235L，Q236H，N248D，N252K和T274A，与上文提及的一个或多个修饰的组合的变体呈现改善的性质。

在某个方面，所述变体包含SEQ ID NO:3的成熟多肽的对应于下述一个或多个位置的位置的修饰：61{E,D}，62{D,E}，76{D,E}，*97aG，98{G，S}，99G，101G，120{N,V，Q,D}，131{T，S}，137H，194P，228V，230V，261D。

在某个方面，所述变体包含SEQ ID NO:4的成熟多肽的对应于下述一个或多个位置的位置的修饰：61{E,D}，62{D,E}，76{D,E}，*97aG，98{G，S}，99G，101G，120{N,V，Q,D}，131{T，S}，137H，194P，228V，230V，261D。

而且，本发明主要方面的枯草杆菌酶变体优选与下述任何位置的一个或多个修饰组合：61，62，76，97，98，99，101，120，131，137，194，228，230和261，优选为61{D,E}，62{D,E}，76{D,E}，*97aG，98{G，S}，99G，101G，120{V，Q,N,D}，131{T，S}，137H，194P，228V，230V，261D修饰。甚至更优选为61E，62D，76D，*97aG，98S，99G，101G，120D，131T，137H，194P，228V，230V，261D。期待任何这些修饰提供更高表达水平的枯草杆菌酶变体以供其产生。

特别感兴趣的变体为除了本发明的修饰之外，含有下述取代的变体：

S9R，A15T，G61E，V68A，A98S，S99G，N218D和Q245R。

特别感兴趣的变体包括下述：

S9R,V68A,S99G，Q245R,N261D
	S9R,A15T,*97aG，P131S,Q137H
S9R，A15T,V68A,Q245R
	S9R,A15T,H120N,P131T,N218D
S9R,A15T,V68A,H120N,N218D,Q245R
	S9R,A15T,V68A,S99G，Q245R,N261D
S9R,A15T,G61E,V68A,A98S,S99G，Q245R
	S9R,A15T,V68A,H120D,P131S,Q137H,Q245R
S9R,A15T,V68A,S99G，A194P，Q245R,N261D
	S9R,A15T,V68A,S99G，A228V，Q245R,N261D
S9R,A15T,V68A,N76D,S99G，Q245R,N261D
	S9R,A15T,*97aG，S101G，P131S,Q137H
S9R,A15T,*97aG，P131S,Q137H，N218D
	S9R,A15T,S101G，H120N,P131T,N218D
S9R,A15T,V68A,S101G，Q245R
	S9R,A15T,V68A,N218S,Q245R
S9R,A15T,V68A,N218D,Q245R
	S9R,A15T,V68A,N218G，Q245R
S9R,A15T,V68A,N218V，Q245R

S9R,A15T,V68A,N76D,Q245R
	S9R,A15T,V68A,Q245R,N261D
S9R,A15T,N62D,*97aG，P131S,Q137H
	S9R,A15T,N62D,V68A,Q245R
S9R,A15T,V68A,A194P，Q245R
	S9R,A15T,V68A,A228V，Q245R
S9R,A15T,V68A,A230V，Q245R
	S9R,A15T,G61E,V68A,A98S,S99G，N218D,Q245R
S9R,A15T,G61E,N76D,V68A,A98S,S99G，Q245R
	S9R,A15T,V68A,S99G，A194P，N218D,Q245R,N261D
S9R,A15T，V68A,S99G，N218D,A228V，Q245R,N261D
	S9R,V68A,S99G，N218G，Q245R,N261D
S9R,V68A,S99G，N218V，Q245R,N261D
	S9R,A15T,V68A,S99G，A194P，N218S,Q245R,N261D
S9R,A15T,V68A,S99G，A194P，N218G，Q245R,N261D
	S9R,A15T,V68A,S99G，A194P，N218V，Q245R,N261D
S9R,A15T,V68A,H120V，N218D,Q245R
	S9R,A15T,V68A,H120Q,N218D,Q245R
S9R,A15T,V68A,N76D,N218D,Q245R

本发明的选定变体的洗涤性能可在本文实施例3中公开的洗涤性能测试中进行测试。可采用所述洗涤性能测试来评价变体当掺入标准的或商用的去污剂组合物时，与参照系统，即亲本枯草杆菌酶或类似的枯草杆菌酶(掺入相同的去污剂系统并在相同的条件下测试)相比时，在从标准的纺织品去除蛋白性污迹方面呈现甚至更佳洗涤性能的能力。本申请的酶变体使用AutomaticMechanical Stress Assay(AMSA)测试。使用AMSA测试可迅速检查大量数量的小体积酶-去污剂溶液的洗涤性能。使用该测试，可首先调查选定变体的洗涤性能，其理由在于如果选定变体不在测试中显示相对于亲本枯草杆菌酶的显著改善，通常无需进行进一步的测试实验。

因此，就本发明所述的目的而言，特别令人感兴趣的变体，为当在商用去污剂组合物如欧洲类型的洗碟去污剂，美国类型的洗碟去污剂，亚洲类型的洗衣去污剂，欧洲类型的洗衣去污剂，或拉丁美洲洗衣去污剂类型(一些实例描述于洗涤性能测试(实施例3))中测试时，在相同条件下与亲本枯草杆菌酶相比显示改善的洗涤性能的变体。

显然，优选本发明的变体至少在所述的最低水平上，更优选在所述的最高水平上满足上述标准。

核酸构建体

本发明还涉及包含编码本发明的蛋白酶变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明的变体蛋白酶变体的分离的多核苷酸以供变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其由表达多核苷酸的宿主细胞识别。启动子序列含有介导变体蛋白酶变体的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinant bacteria"于Scientific American,1980,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码变体蛋白酶变体的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C (CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它终止子由Romanos等,1992,见上描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码变体蛋白酶变体的多核苷酸的5’末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多肽编码序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Molecular Cellular Biology 15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体蛋白酶变体的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，该信号肽编码区与编码分泌的变体蛋白酶变体的编码区的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强变体蛋白酶变体的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列描述于Romanos等，1992，见上。

调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于变体蛋白酶变体氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过从前多肽催化或自催化切割所述前肽而转化为成熟活性多肽。可以从酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。

当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，使前肽区的位置紧接着(next to)多肽的氨基末端，并且使信号肽区的位置紧接着前肽区的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节变体蛋白酶变体的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节系统包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体蛋白酶变体的多核苷酸与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明编码变体蛋白酶变体的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。上述的多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码变体的多核苷酸。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体来表达多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加蛋白酶变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有该多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知用于获得基本上纯的蛋白酶变体变体的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含编码变体蛋白酶变体的多核苷酸，将所述重组宿主细胞有利地用于变体的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体引入宿主细胞从而将所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可为任何可用于变体蛋白酶变体的重组产生的细胞。宿主细胞亦可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个方面，所述宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby′s Dictionaryof The Fungi,第八版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)。

在另一个方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，会将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

在另一个方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。

在另一个方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa或虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、杂色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,182-187页,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,Journal ofBacteriology 153:163；和Hinnen等,1978,Proceedings of the National Academyof Sciences USA 75:1920。

用于产生枯草杆菌酶变体的方法

本发明提供了产生本发明的分离的酶的方法，其中在允许所述酶产生的条件下培养用编码所述酶的DNA序列转化的合适宿主细胞，并从培养回收所得酶。

当将包含编码酶的DNA序列的表达载体转化入异源宿主细胞时，可以使得本发明的酶能够异源重组产生。由此，可制备高度纯化的枯草杆菌酶组合物，其特征为不含同源的杂质。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可为任何适于生长所述宿主细胞的任何常规培养基。可将表达的枯草杆菌酶方便地分泌入培养基，并可通过公知的方法从其回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基分离细胞，通过盐如硫酸铵的方式沉淀培养基的蛋白性组分，然后进行层析步骤如离子交换层析，亲和层析等。

清洁和去污剂组合物

本发明的酶可添加至去污剂组合物并因此成为其成分。一般而言，清洁和去污剂组合物在本领域得到充分描述,对于合适的清洁和去污剂组合物的进一步描述可参见WO 96/34946；WO 97/07202；WO 95/30011。

本发明的去污剂植物可例如配制为手洗或机洗洗衣去污剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的去污剂组合物，或配制为供手洗或机洗的洗碟操作。

在一个具体方面，本发明提供了包含本发明的酶的去污剂添加剂。所述去污剂添加剂以及所述去污剂组合物可包含一种或多种其他酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。

一般而言所选酶的性质应与选定的去污剂相容(即，最优pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，且该酶应以有效量存在。

蛋白酶：所述蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。所述蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是那些来源于芽孢杆菌属的，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，和描述于WO 89/06270和WO94/25583的镰孢属蛋白酶。

可用的蛋白酶的实例为描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946的变体，特别是在一个或多个下述位置具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。优选的商业上可获得的蛋白酶包括

和

(Novozymes A/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、Purafect OxP、FN2、FN3和FN4^TM(GenencorInternational,Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。可用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(同义词Thermomyces)，例如来自如描述于EP 258 068和EP 305 216的疏棉状腐质霉(T.Lanuginosus)或来自如描述于WO 96/13580的特异腐质霉的脂肪酶，假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，萤光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)，芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993),Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。

其他实例为那些描述于WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202的脂肪酶变体。

优选的商业上可获得的脂肪酶包括

和Lipolase

(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括，例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如，从GB 1,296,839更具体描述的地衣芽孢杆菌的特别菌株获得。

可用的淀粉酶的实例为描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424的变体，特别是在一个或多个下述位置具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上可获得的淀粉酶为

和

(Novozymes A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(来自Genencor InternationalInc.)。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶为具有颜色保护效益的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例为描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO 98/08940的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体如描述于WO94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299的那些。

商业上可获得的纤维素酶包括

和

(NovozymesA/S)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)、和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如灰盖鬼伞(C.cinerius)及其变体的过氧化物酶，如描述于WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257的那些。商业上可获得的过氧化物酶包括(Novozymes A/S)。

所述去污剂酶可通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂而包含于去污剂组合物中。本发明的去污剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可例如配制为颗粒、液体、浆料等等。优选的去污剂添加剂剂型为颗粒，特别是无尘颗粒，液体，特别是稳定化的液体，或浆料。

无尘颗粒可例如如US 4,106,991和4,661,452中所公开而产生，并可任选地通过本领域已知方法涂覆。蜡状涂覆材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚环氧乙烷产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基酚(ethoxylated nonylphenol)；乙氧化脂族醇，其中所述醇含有12至20个碳原子，且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。适用于通过流化床技术施用的形成薄膜的涂覆材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制备物可例如通过根据已确立的方法添加多元醇如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可根据EP 238,216中公开的方法制备。

本发明的去污剂组合物可为任何便利的形式，例如条、片、粉末、颗粒、糊、液体、泛用的(all-purpose)颗粒状或粉末状形式或“重质(heavy-duty)”洗剂，特别是洗衣去污剂；液体、凝胶或糊形式的泛用洗剂，特别是所谓重质液体类型；液体精细织物(fine-fabric)去污剂；手洗洗碟剂或轻质(light duty)洗碟剂，特别是高泡沫类型的那些；机洗洗碟剂，包括多种片、颗粒、液体和漂洗辅助(rinse-aid)型以供家用或机构使用。所述组合物亦可为单位剂量包装，包括本领域已知的那些和水溶性、水不溶性和/或水渗透性的那些。液体去污剂可为水性的，通常含有高至70%的水和0-30%的有机溶剂，或可为非水性的。

本发明的去污剂组合物可进一步包含表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白激活剂、漂白催化剂、着色剂、漂白增强剂(bleach booster)、螯合剂、染料转移剂(dye transfer agent)、助沉剂(deposition aid)、分散剂、其他酶，和酶稳定剂、催化材料、漂白激活剂、过氧化氢、过氧化氢源、光学增亮剂、光活化剂(photoactivator)、荧光剂、织物调理剂(fabric conditioner)、预先形成的过酸、聚合分散剂、粘土污迹去除/抗再沉积剂(clay soil removal/anti-redepositionagent)、填充盐、水溶助剂、增亮剂、抑泡剂、结构弹性剂(structure elasticizingagent)、植物软化剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩剂(anti-shrinkage agent)、杀细菌剂、杀真菌剂、抗晦暗剂(anti-tarnish)、抗腐蚀剂、碱源、助溶剂、载体、助加工剂(processing aid)、色素、染料、香料和pH控制剂、其他酶、酶稳定系统。

因此，所述去污剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可为非离子型的，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型和/或两性的和/或半极性非离子型表面活性剂和/或其混合物。所述表面活性剂通常以按重量计0.1%至60%的水平存在，而在其他实施方案中，该水平为约1%至约50%，而在还进一步的实施方案中，该水平为约5%至约40%，按去污剂组合物的重量计。

当其中包含阴离子型表面活性剂时，所述去污剂通常含有约1%至约40%的阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐，α-烯基磺酸盐，烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)，醇乙氧基硫酸盐，仲烷磺酸盐，α-磺基脂肪酸甲基酯，烷基或烯基琥珀酸或皂类。

更加合适的阴离子型表面活性剂为皂类和含有硫酸或磺酸基团的那些。可考虑的磺酸类型的表面活性剂为(C9-C13烷基)苯磺酸盐和烯基磺酸盐，后者被理解为亚烷基磺酸盐和羟亚烷基磺酸盐以及二磺酸盐的混合物，如例如通过具有位置在末端或内部的双键的C12-C18单烯的磺酸化获得。(C12-C18)烷基磺酸盐和α-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)也是合适的，例如氢化椰子油、棕榈仁油或动物脂脂肪酸的α-磺基化甲基酯，可使用来自MES皂化的α-硫代羧酸。

更加合适的阴离子型表面活性剂是磺酸化的脂肪酸甘油酯，包括单酯、二酯和三酯及其混合物。

提及的烷(烯)基硫酸盐为C12-C18脂肪醇(例如来自椰子脂肪醇、动物脂脂肪醇，月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇或硬脂醇)，或C10-C20氧代醇的硫酸单酯和具有该链长度的仲醇的硫酸单酯的碱金属盐和钠盐。从洗涤技术的视点来看，特别优选C12-C16烷基硫酸盐和C12-C15烷基硫酸盐，亦优选C14-C15烷基硫酸盐。合适的阴离子型表面活性剂还包括烷基-2,3-二基二硫酸盐，其依照例如US3,234,258或US5,075,041制备。

用1至6摩尔的环氧乙烷乙氧化的直链或支化的C7-C21醇，如具有平均3.5摩尔的环氧乙烷(EO)的2-甲基支化C9-C11醇，或具有1至4EO的C12-C18脂肪醇的硫酸单酯也是合适的。由于其高度起泡的特征，它们通常仅以相对较低水平，例如按重量计1%至5%的水平用于洗涤和清洁组合物。

阴离子型表面活性剂亦可包括硫代琥珀酸与C8-C18脂肪醇残基的二酯和/或单酯的盐，或其混合物。特别优选其中脂肪醇残基具有较窄的链长度分布的硫代琥珀酸。同样亦可使用在烷(烯)基链上具有优选8至18个碳原子的烷(烯)基硫代琥珀酸酯，或其盐。

还可考虑的阴离子型表面活性剂为氨基酸的脂肪酸衍生物，例如甲基牛磺酸(牛磺酸盐)和/或甲基甘氨酸(肌氨酸盐)。还可考虑的阴离子型表面活性剂为皂类。饱和脂肪酸皂类如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、氢化芥酸和山嵛酸和衍生自天然脂肪酸(例如椰子、棕榈仁和动物脂的脂肪酸)的皂类混合物。阴离子型表面活性剂，包括皂类，可以以其钠、钾或铵盐的形式和以有机碱如单乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺的可溶性盐形式存在。阴离子型表面活性剂可以以其钠或钾盐的形式存在。

作为非离子型表面活性剂，使用优选烷氧化，有利地为乙氧化和/或丙氧化的，特别是具有8至18个碳原子和平均每摩尔醇1至12摩尔的环氧乙烷(EO)和/或1至10摩尔环氧丙烷(PO)的伯醇。特别优选C8-C16醇烷氧化物，有利地为乙氧化和/或丙氧化的C10-C15醇烷氧化物，特别是C12-C14醇烷氧化物，具有2至10或3至8的乙氧化度，和/或1至6或1.5至5的丙氧化度。醇残基可优选为直链的，或特别是在2位，具有甲基支链，或可包含直链和甲基支链的混合物，如通常存在于氧代醇中的。然而，特别优选衍生自含有12至18个碳原子(例如椰子、棕榈和动物脂脂肪醇或油醇)，和平均每摩尔醇2至8个EO的天然来源的直链醇的醇乙氧化物。乙氧化醇包括，例如具有3个EO或4个EO的C12-C14醇，具有7个EO的C9-C11醇，具有3、5、7或8个EO的C13-C15醇，具有3、5或7个EO的C12-18醇，其混合物，如具有3个EO的C12-C14醇和具有5个EO的C12-C18醇的混合物。提及的乙氧化度和丙氧化度代表统计平均值，对于特定产物，可为整数或分数。优选的醇乙氧化物和丙氧化物具有有限的同系物分布(窄范围乙氧化物/丙氧化物，NRE/NRP)。除了这些非离子型表面活性剂，亦可使用具有超过12个EO的脂肪醇乙氧化物。其实例为具有14、25、30或40个EO的动物脂脂肪醇乙氧化物。

亦适用的是烷氧化的胺，其为乙氧化和/或丙氧化的，特别是具有每烷基链1至18个碳原子和每摩尔胺平均1至12摩尔的环氧乙烷(EO)和/或1至10摩尔环氧丙烷(PO)的伯胺或仲胺。

此外作为其他非离子型表面活性剂，亦可使用通式R₁O(G)_x的烷基聚糖苷(alkyl polyglycoside)，其中R₁是具有8至22，优选12至18个碳原子的直链或甲基支化(特别是2位具甲基支化)的伯烷基，而符号‘G’表示具有5或6个碳原子的单糖(glycose)(单糖，monosaccharide)单元，优选G是葡萄糖。表示单糖单元平均数值的寡聚度x，通常为1至10；x优选为1.2至1.4。

作为单独的非离子型表面活性剂或与其他非离子型表面活性剂组合的另一类非离子型表面活性剂，包括烷氧化的，优选在烷基链上具有1至4个碳原子的乙氧化或乙氧化和丙氧化的脂肪酸烷基酯，特别是如例如描述于JP58/217598的脂肪酸甲基酯。

亦可适用氧化胺类型的非离子型表面活性剂，例如N-(可可烷基)-N，N-二甲基胺氧化物(N-(coco alkyl)-N，N-dimethylamine oxide)和N-(动物脂-烷基)-N，N-二(2-羟乙基)胺氧化物(N-(tallow-alkyl)-N，N-bis(2-hydroxyethyl)amineoxide)，和脂肪酸烷醇酰胺(faty acid alkanolamide)或乙氧化脂肪酸烷醇酰胺类型的非离子型表面活性剂。

在一个更优选的方面，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，季铵盐化合物，烷基吡啶碘化物，Tween80，Tween85、Triton X-100、Brij56、生物表面活性剂、鼠李糖脂、surfactin、visconsin或磺酸酯。

当其中包含非离子型表面活性剂时，所述去污剂通常含有约0.2%至约40%的非离子型表面活性剂如醇乙氧化物，壬基苯酚乙氧化物，烷基聚糖苷，烷基二甲基胺氧化物，乙氧化脂肪酸单乙醇胺，脂肪酸单乙醇胺，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

在一些实施方案中，本发明涉及其中至少一种表面活性剂的浓度为每克纺织品0至500，0.00001至100，0.0001至50，0.0001至40，0.001至30，0.01至20，0.1至15，1至10毫克的方法。

在一些实施方案中，本发明涉及其中至少一种表面活性剂的浓度为每L溶液0至50，0.0001至40，0.001至30，0.01至20，0.1至10或1至5g的方法。

所述去污剂可含有0-65%去污剂助洗剂或络合剂如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙二胺三氨基五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐例如MGDA(甲基甘氨酸二乙酸)或者GLDA(L-谷氨酸N,N-二乙酸四钠盐)。所述去污剂组合物亦可为非助洗的(unbuilt)，即基本上不含去污剂助洗剂。

去污剂助洗剂的量可为高于5%，高于10%，高于20%，高于30%，高于40%或高于50%，且可低于80%，65%。在洗碟去污剂中，助洗剂水平通常为40-65%，特别是50-65%。

所述助洗剂可具体为与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合剂。在助洗剂与Ca⁺⁺和/或Mg⁺⁺之间形成的络合物的强度，表示为log K值(在给定pH作为平衡或稳定常数，或作为条件稳定常数给出)，可为范围3-8，特别是5-8。所述稳定常数可在25℃和离子强度0.1M测量，且所述条件稳定常数可在相同条件下在pH8.5或9测量。

所述助洗剂可含有氨基基团，且可为，例如氨基羧酸盐，氨基多羧酸盐或膦酸盐。其可为包含一个、两个或三个氨基基团的单体分子(通常为仲胺或叔胺基团)，且其可含有两个、三个、四个或五个羧基基团。合适的助洗剂的实例为甲基甘氨酸二乙酸(methyl glycine diacetic acid，MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧甲基谷氨酸四钠盐(dicarboxymethyl glutamic acid tetrasodiumsalt)，GLDA)，氨三乙酸(NTA)，二亚甲基三胺五乙酸(diethylene triaminepentaacetic acid，DTPA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二胺-N,N’-二琥珀酸(Ethylenediamine-N，N′-disuccinic acid，EDDS)，N-(1,2-二羧乙基)-D,L-天冬氨酸(N-(1,2-dicarboxyethyl)-D,L-aspartic acid，IDS)和N-(2-羟乙基)亚胺基二乙酸(N-(2-hydroxyethyl)iminodiacetic acid，EDG)，及其盐。

所述助洗剂优选具有大于4的缓冲容量(亦称作储备碱度(reservealkalinity))(维持缓冲液中酸和盐的总量恒定，将一升缓冲溶液的pH改变一个单位所需的强酸的当量数)。

所述助洗剂可为对环境友好，例如如WO09/102854中所述的多价螯合剂(sequesterant)。合适的对环境友好的多价螯合剂包括一种或多种基于氨基酸的多价螯合剂，基于琥珀酸的多价螯合剂，柠檬酸及其盐。

合适的基于氨基酸的化合物的实例包括MGDA(甲基甘氨酸二乙酸)，及其盐和衍生物，和GLDA(谷氨酸-N,N’-二乙酸(glutamic-N,N-diacetic acid))，及其盐和衍生物。其他合适的助洗剂描述于US6426229。特别合适的助洗剂包括：例如天冬氨酸-N-一乙酸(aspartic acid-N-monoacetic acid，ASMA)，天冬氨酸-N,N-二乙酸(aspartic acid-N,N-diacetic acid，ASDA)，天冬氨酸-N-一丙酸(aspartic acid-N-monopropionic acid，ASMP)，亚胺基二琥珀酸(iminodisuccinic acid，IDA)，N-(2-磺甲基)天冬氨酸(N-(2-sulfomethyl)asparticacid，SMAS)，N-(2-磺乙基)天冬氨酸(N-(2-sulfoethyl)aspartic acid，SEAS)，N-(2-磺甲基)谷氨酸(N-(2-sulfomethyl)glutamic acid，SMGL)，N-(2-磺乙基)谷氨酸(N-(2-sulfoethyl)glutamic acid，SEGL)，N-甲基亚胺基二乙酸(N-methyliminodiacetic acid，MIDA)，α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-alanine-N,N-diaceticacid，α-ALDA)，丝氨酸-N,N-二乙酸(serine-N,N-diacetic acid，SEDA)，异丝氨酸-N,N-二乙酸(isoserine-N,N-diacetic acid，ISDA)，苯丙氨酸-N,N-二乙酸(phenylalanine-N,N-diacetic acid，PHDA)，邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(anthranilic acid-N,N-diacetic acid，ANDA)，对氨基苯磺酸-N,N-二乙酸(sulfanilic acid-N,N-diacetic acid，SLDA)，牛磺酸-N,N-二乙酸(taurine-N,N-diacetic acid，TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(sulfomethyl-N,N-diacetic acid，SMDA)，及其碱金属盐或铵盐。在一个方面，可采用GLDA盐及其衍生物。在一个方面，可采用GLDA的四钠盐。

合适助洗剂的进一步实例包括N-(羟乙基)乙叉二胺三乙酸(N-(hydroxyethyl)-ethylidenediaminetriacetate，HEDTA)，二乙醇甘氨酸(diethanolglycine，DEG)，1-羟基乙叉-1,1-二膦酸(1-HydroxyEthylidene-1,1-Diphosphonic Acid，HEDP)，二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(Diethylenetriamine Penta(Methylene Phosphonic acid)，DTPMP)，乙二胺四(亚甲基膦酸)(Ethylene diamine tetra(methylene phosphonic acid)，EDTMPA)和氨基三(亚甲基膦酸)(aminotris(methylenephosphonic acid)，ATMP)。

合适的琥珀酸盐化合物的实例描述于US5977053。在一个方面，合适的琥珀酸盐化合物包括亚氨基琥珀酸四钠(tetrasodium immino succinate)。

可通过Nagarajan等,JAOCS,Vol.61,no.9(September 1984),pp.1475-1478所述的测试将助洗剂分类以确定在剂量为百分之0.200的假想的去污剂溶液中将pH10.5处的水硬度从200ppm(作为CaCO₃)降低至10ppm所需的最低助洗剂水平，作为假想的去污剂中助洗剂重量百分比给出。或者，所述测定可在pH8.5进行以反映通常的现代洗衣去污剂的更低pH。在任一pH处使用该方法，所需的水平可为0-25%(强)，25-35%(中等)或>35%(弱)。更优选的是含有强和中等助洗剂的组合物，最优选的是含有强助洗剂的组合物。

所述助洗剂可为强助洗剂，如甲基甘氨酸二乙酸(“MGDA”)或N,N-二羧甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)；其可为中等助洗剂如三聚磷酸钠(sodiumtri-poly-phosphate，STPP)，或其可为弱助洗剂如柠檬酸钠。更优选的是含有强和中等助洗剂的组合物，最优选的是具有强助洗剂的组合物。助洗剂的其他实例为沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基柠檬酸、可溶性硅酸盐和层状硅酸盐(layered silicate)(例如来自Hoechst的SKS-6)。

所述去污剂可包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯基吡啶-N-氧化物，聚乙烯基咪唑，聚羧酸酯如聚丙烯酸酯，延胡索酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

去污剂可含有漂白系统，或一种或多种漂白剂，其可包含H₂O₂源如过硼酸或过碳酸，其可与形成过酸的漂白增强剂如四乙酰基乙二胺(tetraacetylethylenediamine)或壬酰氧基苯磺酸(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，所述漂白系统可包含例如酰胺，酰亚胺或砜类型的过氧酸。其他合适的漂白剂包括其他光漂白剂(photobleach)、预制的(pre-formed)过酸，过氧化氢源，漂白激活剂，过氧化氢，漂白催化剂，及其组合。一般而言，当使用漂白剂时，本发明的组合物可包含按主题清洗组合物的重量计约0.1%至约50%或甚至约0.1%至约25%漂白剂。

所述去污剂还可含有其他常规的去污剂成分如例如织物调理剂(fabricconditioner)包括黏土、增泡剂(foam boosters)、抑泡剂(suds suppressors)、抗腐蚀剂(anti-corrosion agents)、悬污剂(soil-suspending agents)、抗污物再沉积剂(anti-soil redeposition agents)、染料(dyes)、杀细菌剂(bactericides)、光学增亮剂(optical brighteners)、助水溶剂(hydrotropes)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors)或香料(perfumes)。

当地和区域条件如水硬度和洗涤温度的差异，要求区域性去污剂组合物。去污剂实施例1和2分别提供了用于典型的欧洲自动洗碟(ADW)去污剂和典型的欧洲粉末去污剂的组分的范围。

去污剂组合物1：典型的欧洲ADW去污剂组合物

去污剂实施例2：典型的欧洲粉末去污剂组合物

本发明的去污剂组合物的酶可使用常规稳定剂和蛋白酶抑制剂，例如多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，不同的盐如NaCl；KCl；乳酸、甲酸、硼酸或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲基苯基硼酸，或肽醛如二、三或四肽醛或醛类似物(形式B1-B0-R，其中R是H、CH3、CX3、CHX2或CH2X(X=卤素)，B0是单个氨基酸残基(优选具有任选取代的脂族或芳族侧链)；和B1由一个或多个氨基酸残基组成(优选一个、两个或三个)，任选包含N端保护基团，或如WO09118375，WO98/13459中所述的)或蛋白类型的蛋白酶抑制剂如RASI、BASI、WASI (稻、大麦和小麦的双功能性α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)或CI2或SSI来稳定化。所述组合物可如例如WO 92/19709、WO 92/19708和US6,472,364中所述配制。在一些实施方案中，本文中使用的酶通过提供下述离子给所述酶的完成的组合物中的水溶性来源的锌(II)，钙(II)和/或镁(II)离子，以及其他金属离子(例如钡(II)，钪(II)，铁(II)，锰(II)，铝(III)，锡(II)，钴(II)，铜(II)，镍(II)和氧钒(IV))的存在而稳定化。

目前考虑了在去污剂组合物中可将任何单个酶，特别是本发明的酶，以对应于每升洗涤液0.01-200mg的酶蛋白，优选每升洗涤液0.05-50mg的酶蛋白，特别是每升洗涤液0.1-10mg的酶蛋白的量添加。

通常而言，本发明的去污剂组合物包含至少0.0001重量百分比，约0.0001至约10，约0.001至约1或约0.01至约0.1，或约0.05至约15%重量，或约0.05至约20%，或约1至约20%，或约1至约15%百分比的至少一种本发明提供的酶。在一些优选实施方案中，本文中提供的去污剂组合物通常配制为使得在水性清洁操作中使用中，洗涤水具有约5.0至约11.5的pH，或在其他实施方案中，甚至为约6.0至约10.5的pH。在一些优选实施方案中，将颗粒状或液体洗衣产品配制为具有约6至约8的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，并对于本领域技术人员是公知的。

本发明的酶还可掺入WO 97/07202中公开的去污剂配方中，其通过提述并入本文。

材料和方法

用于确定蛋白酶变体活性的方法

纺织品：

标准纺织品片从EMPA St.Gallen,Lerchfeldstrasse 5,CH-9014St.Gallen,Switzerland获得。特别是类型EMPA117(用血液、牛乳和墨水玷污的聚酯/棉纺织品)。标准的纺织品片从Center For Testmaterials BV，P.O.Box 120,3133KT Vlaardingen,the Netherlands获得，特别是类型C-10(用油/牛乳/色素玷污的棉)和PC-03(用巧克力牛乳/烟灰玷污的聚酯/棉纺织品)。

三聚氰胺瓦：

标准的三聚氰胺瓦从Center For Testmaterials BV，P.O.Box 120,3133 KTVlaardingen,the Netherlands获得，特别是类型DM-21(蛋黄)。

菌株和质粒：

迟缓芽孢杆菌菌株309保藏于NCIB，并赋予登录号NCIB 10309，并描述于美国专利号3,723,250，其通过提述并入本文。亲本枯草杆菌酶309或可从菌株309获得。表达宿主生物为枯草芽孢杆菌。

将质粒pSX222用作大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体和枯草芽孢杆菌表达载体(如WO 96/34946中所述)。

一般分子生物学方法：

除非另行提及，DNA操纵和转化使用分子生物学的标准方法进行(Sambrook等(1989)Molecular cloning:A laboratory manual,Cold SpringHarbor lab.,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.等(eds.)"Current protocolsin Molecular Biology".John Wiley and Sons,1995;Harwood,C.R.,and Cutting,S.M.(eds.)"Molecular Biological Methods for Bacillus".John Wiley and Sons,1990。

用于DNA操作的酶：

除非另行提及，所有用于DNA操作的酶，如例如限制性内切核酸酶，连接酶等，从New England Biolabs,Inc.获得。用于DNA操作的酶根据供应商的说明书使用。

发酵：

用于产生枯草杆菌酶的发酵在pH7.3和37℃在旋转摇床上在含有15ml双重TY培养基的50ml试管中以225rpm进行2-3日。

对于TY培养基的描述，参见Media Preparation and Bacteriological Tools in"Current protocols in Molecular Biology".John Wiley and Sons,1995;Harwood,C.R.,and Cutting,S.M.(eds.)第1.1.3页。

纯化

分泌自宿主细胞的枯草杆菌酶变体可从培养基通过公知的方法方便地回收，所述方法包括从培养基通过离心或过滤来分离细胞，然后通过盐如硫酸铵的方式沉淀培养基的蛋白性组分，接着使用层析方法如离子交换层析、亲和层析等。

催化活性

本发明的变体的催化活性可使用下述“Kinetic Suc AAPF-pNA”测定来确定。

pNA底物：Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)。

温度：室温

测定缓冲液：50mM Tris/HCl,1mM CaCl2,pH9.0。

将20ml蛋白酶(稀释于0.01%Triton X-100)与100ml测定缓冲液混合。测定通过添加100ml pNA底物(将50mg溶解于1.0ml DMSO，并进一步用0.01%Triton X-100稀释45x)来起始。监视OD₄₀₅的增加作为蛋白酶活性的量度。

洗涤性能测试

为了评价去污剂组合物中选定枯草杆菌酶变体的洗涤性能，进行了洗涤实验。使用Automatic Mechanical Stress Assay(AMSA)测试本申请的酶变体。使用AMSA测试，可检查大量数量的小体积酶-去污剂溶液的洗涤性能。关于进一步的描述，参见实施例3。

去污剂

用于本发明的酶的洗涤性能测试的去污剂可通过在市场上购买完全配方的商用去污剂，然后通过热处理(在水溶液中在85℃进行5分钟)使酶组分失活来获得。而且，可直接从生产商购买不含酶的商用去污剂。此外，可根据本文第19-24页的条款来制成合适的模式去污剂，并用于洗涤性能测试。

实施例1

酶变体的构建和表达

本发明的变体可通过本领域技术人员已知的方法构建和表达。下面是一个如何制备本发明的变体的可能实例：

定向诱变：

包含特定插入/缺失/取代的本发明的枯草杆菌蛋白酶309

定向变体通过用含有所需突变的寡聚物的PCR产生的DNA片段的传统克隆(Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold SpringHarbor,1989)来制备。

所述模板质粒DNA可为pSX222，或其含有枯草杆菌蛋白酶309的变体的类似物。突变通过寡聚物定向诱变导入变体构建中。

将枯草杆菌蛋白酶309变体转化入大肠杆菌。将从这些转化体的过夜培养纯化的DNA通过限制性内切核酸酶消化、DNA片段的纯化、连接、枯草芽孢杆菌的转化而转化入枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌的转化如Dubnau等,1971,J.Mol.Biol.56,pp.209-221所述进行。

用于在特定区域导入突变的定向诱变

合成诱变引物，其对应于由限定所述插入/缺失/取代的DNA碱基对间隔的突变位点侧翼的DNA序列。

随后，在用修饰的质粒pSX222的PCR反应中使用所得的诱变引物。纯化所得的PCR片段并在第二PCR反应中延伸，纯化所得的PCR产物，并在第三PCR反应中延伸，然后用内切核酸酶消化并克隆入大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSX222。在正常条件下进行PCR反应。将质粒DNA通过公知的技术转化入大肠杆菌，并对一个大肠杆菌菌落进行测序以确证设计的突变。

为了纯化本发明的枯草杆菌酶变体，将包含本发明的变体的pSX222表达质粒转化入感受态枯草芽孢杆菌菌株，并如上所述进行发酵。

实施例2

酶的纯化和酶浓度的评价

在发酵之后，使用Hydrophobic Charge Induction Chromatography(HCIC)和后续的真空过滤完成枯草杆菌蛋白酶变体的纯化。

为了捕获酶，HCIC使用结合4-巯基乙基吡啶(4-MEP)的纤维素基质。

将大小为80-100μm的纤维素基质的珠与含有酵母提取物和能够分泌枯草杆菌蛋白酶变体的转化的枯草芽孢杆菌的培养基混合，并在

微板中在pH9.5温育。

因为4-MEP在pH>7具疏水性，而枯草杆菌蛋白酶变体在pH9.5具疏水性，在珠上分泌的酶和4-MEP之间产生疏水连接。在温育之后，通过真空过滤去除培养基和细胞碎片，而珠和酶留在过滤器上。

为了从珠洗脱酶，此时通过用洗脱缓冲液(pH5)洗涤过滤器将pH降低。由此，可使得酶与珠分开，并可从缓冲液回收。

纯化的枯草杆菌蛋白酶变体的浓度通过活性位点滴定(AST)来评价。

将纯化的酶用高亲和力抑制剂CI-2A以不同浓度温育以抑制不同量的活性位点。蛋白酶和抑制剂以1:1比例相互结合，并相应地酶浓度可直接与使得所有蛋白酶失活的抑制剂浓度相关。为了测量剩余蛋白酶活性，在用抑制剂温育之后添加底物(Tris/HCl  缓冲液中的0.6mMSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA)，并在接下来4分钟内在Elisa Reader上定期在405nm测量降解产物pNA(对硝基苯酚)的显色。

实施例3

就在AMSA中对硬表面的洗涤性能测试本发明的变体。方法和结果在下文中给出。

枯草杆菌蛋白酶变体对硬表面的洗涤性能

AMSA测试方法的描述：

进行了洗涤实验以评价选定的蛋白酶变体在洗碟去污剂组合物，即含MGDA的ADW模式去污剂和含STPP的ADW模式去污剂中的洗涤性能。使用Automatic Mechanical Stress Assay(AMSA)测试本申请的蛋白酶。使用AMSA，可检查大量数量的小体积酶-去污剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有多个用于测试溶液的槽，和严密挤压洗碟样品，待洗涤的三聚氰胺瓦至所有槽开口的盖。在洗涤时，将平板，测试溶液，三聚氰胺瓦和盖激烈振荡以使得测试溶液与玷污的三聚氰胺瓦相接触，并以规则、定期、振荡的方式施加机械应力。对于进一步描述参见WO 02/42740，特别是第23-24页的段落“Special method embodiments”。

实验在如下特定的实验条件下进行：

*MGDA：甲基甘氨酸二乙酸，或者GLDA：L-谷氨酸N,N-二乙酸四钠盐

*三聚磷酸钠

对于不同变体的ADW测试的结果如下所示。在结果中，指数为1。

Savinase的性能结果指定值为1，并将变体的结果与该值相比较。

在蛋黄三聚氰胺瓦(煮过的)上测试MGDA去污剂中的变体

在蛋黄三聚氰胺瓦(煮过的)上测试STPP去污剂中的变体

结果明显地阐明本发明的变体对于蛋白性污迹如煮蛋污迹性能良好。

其他枯草杆菌蛋白酶变体对于硬表面的洗涤性能

在如上所述的相同条件下就在AMSA中对硬表面的洗涤性能测试本发明的其他变体。

在蛋黄三聚氰胺瓦(煮过的)测试MGDA去污剂中的变体

变体	平均RP洗涤(参照Savinase)
		Savinase	1.00
S9R A15T V68A N218D Q245R	1.67
		S9R A15T V68A H120V N218D Q245R	1.47
S9R A15T V68A H120Q N218D Q245R	1.62
		S9R A15T V68A N76D Q245R	1.55
S9R A15T V68A N76D N218D Q245R	1.57

在蛋黄三聚氰胺瓦(煮过的)测试STPP去污剂中的变体

变体	平均RP洗涤(参照Savinase)
		Savinase	1.00
S9R A15T V68A N218D Q245R	1.53
		S9R A15T V68A H120V N218D Q245R	1.47
S9R A15T V68A H120Q N218D Q245R	1.58
		S9R A15T V68A N76D Q245R	1.55
S9R A15T V68A N76D N218D Q245R	1.62

结果明显地阐明本发明的变体对于蛋白性污迹如煮蛋污迹性能良好。

枯草杆菌蛋白酶变体对纺织品的洗涤性能

为了评价选定的枯草杆菌酶变体在商业性去污剂基础组合物中的洗涤性能，进行了洗涤实验。将本申请的酶变体使用Automatic Mechanical StressAssay (AMSA)测试。使用AMSA测试，可检查大量数量的小体积酶-去污剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有多个用于测试溶液的槽，和严密挤压纺织物样品至所有槽开口的盖。在洗涤时，将平板，测试溶液，纺织品和盖激烈振荡以使得测试溶液与纺织品相接触，并施加机械应力。

AMSA测试方法的描述：

进行了洗涤实验以评价选定的蛋白酶变体在洗衣去污剂组合物中的洗涤性能。使用Automatic Mechanical Stress Assay(AMSA)测试本申请的蛋白酶。使用AMSA，可检查大量数量的小体积酶-去污剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有多个用于测试溶液的槽，和严密挤压洗衣样品，即所述纺织品至所有槽开口的盖。在洗涤时，将平板，测试溶液，纺织品和盖激烈振荡以使得测试溶液与纺织品相接触，并以规则、定期、振荡的方式施加机械应力。对于进一步描述参见WO 02/42740，特别是第23-24页的段落“Special methodembodiments”。

实验在如下特定的实验条件下进行：

通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+=4:1:7.5)添加至测试系统将水硬度调整至15°dH。在洗涤之后，将纺织品在自来水中冲洗并干燥。

酶变体的性能测量为用该特定蛋白酶洗涤的纺织品的颜色的亮度。亮度亦可表示为当用白光照射时，从样品反射的光的强度。当样品被玷污时，反射光的强度与干净样品相比较低。因此，反射光的强度可用于测量蛋白酶的洗涤性能。

颜色测量用职业平台式扫描仪进行(Kodak iQsmart,Kodak,Midtager 29,DK-2605

Denmark)，其用于捕获经洗涤的纺织品的图像。

为了从扫描的图像提取光强度的值，例如，使用了特别设计的软件应用(Novozymes Color Vector Analyzer)，将来自图像的24bit像素值换算为红、绿和蓝的值(RGB)。强度值(Int)通过将RGB值作为矢量加合，然后取所得矢量的长度来计算：

$\mathrm{Int}=\sqrt{r^2+g^2+b^2}.$

纺织品：

C-10和PC-03从Center For Testmaterials BV，P.O.Box 120,3133 KTVlaardingen,the Netherlands获得，而EMPA 117从EMPA Testmaterials AG

12,CH-9015St.Gallen,Switzerland.获得。

对于不同变体的AMSA洗衣测试的结果如下所示。Savinase的性能结果指定值为1，而将变体的结果与该值相比较。

对不同变体的AMSA洗衣测试的其他结果如下所示。亲本(即，不含取代N218D)的性能结果指定值为1，并将变体的结果与该值相比较。

结果明显地阐明本发明的变体与亲本相比在洗衣纺织物中具有增加的洗涤性能。

Claims (15)

1.一种亲本枯草杆菌蛋白酶的变体，其包含取代9{R,K,H}、15{G，A,S,T,M}、68{G，A,S,T,M}、218{D,S,G，V}和245{R,K,H}，其中所述变体进一步包含至少一种下述的修饰：61{D,E}、62{D,E}、76{D,E}、*97aG、98{G，S}、99G、101G、120{V，Q,D}、131{T,S}、137H、194P、228V、230V、261D，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2[BPN’]的成熟多肽的位置。

2.权利要求1的变体，其中所述变体包含取代G61E。

3.权利要求1或2的变体，其中所述变体包含取代A98S。

4.权利要求1-3任一项的变体，其中所述变体包含取代S99G。前述任一项权利要求的变体，其中所述变体包含下述取代：S9R、A15T、G61E、V68A、A98S、S99G、N218D和Q245R。

5.前述任一项权利要求的变体，其中所述亲本枯草杆菌蛋白酶是包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽。

6.前述任一项权利要求的变体，其中所述亲本枯草杆菌蛋白酶属于亚组I-S2。

7.前述任一项权利要求的变体，其中所述变体与亲本枯草杆菌蛋白酶相比具有一个或多个改善的性质，其中所述改善的性质包括洗涤性能、稳定性、催化活性和洗碟性能。

8.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-7任一项的变体。

9.一种核酸构建体，其包含权利要求8的多核苷酸。

10.一种表达载体，其包含权利要求9的核酸构建体。

11.一种宿主细胞，其包含权利要求10的核酸构建体。

12.一种清洁或去污剂组合物，优选地洗衣或洗碟组合物，其包含权利要求1-8任一项的变体。

13.一种产生权利要求1的变体的方法，其通过将下述取代导入亲本枯草杆菌蛋白酶：

i.在位置9用{R,K,H}的取代；

ii.在位置15用{G，A,S,T,M}的取代；

iii.在位置68用{G，A,S,T,M}的取代；

iv.在位置245用{R,K,H}的取代，和

v.在位置218用{D,S,G或V}的取代

和一种或多种下述修饰：在位置61用{D,E}取代，在位置62用{D,E}取代，在位置76用{D,E}取代，在位置97插入G，在位置98用{G，S}取代，在位置99用G取代，在位置101用G取代，在位置120用{V，Q,D}取代，在位置131用{T,S}取代，在位置137用H取代，在位置194用P取代，在位置228用V取代，在位置230用V取代，在位置261用D取代，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2[BPN’]的成熟多肽的位置。

14.权利要求13的方法，其中将下述取代导入所述亲本枯草杆菌蛋白酶：

i.在位置9用R取代S；

ii.在位置15用T取代A；

iii.在位置68用A取代V；

iv.在位置245用R取代Q，和

v.在位置218用{D,S,G或V}取代N

和一种或多种下述修饰：在位置61用E取代G，在位置62用D取代N，在位置76用D取代N，在位置97插入G，在位置98用S取代A，在位置99用G取代S，在位置101用G取代S，在位置120用D取代H，在位置131用T取代P，在位置137用H取代Q，在位置194用P取代A，在位置228用V取代A，在位置230用V取代A，在位置261用D取代N。

15.权利要求13或14的方法，其中所述亲本枯草杆菌蛋白酶属于I-S2亚组，优选其中所述亲本枯草杆菌蛋白酶包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列。