DE69635700T2

DE69635700T2 - Neue endoglukanase

Info

Publication number: DE69635700T2
Application number: DE1996635700
Authority: DE
Inventors: Martin Schülein; Nonboe Lene ANDERSEN; Flensted Soren LASSEN; Sakari Markus KAUPPINEN; Lene Lange; Ilum Ruby NIELSEN; Michiko Novo Nordisk Bioindustry Ltd Ihara; Shinobu Novo Nordisk Bioindustry Ltd Takagi
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1996-03-18
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2016-03-19
Also published as: AU715423B2; JP3360830B2; US20030054539A1; US20080145912A1; BRPI9607646B1; EP2431462A3; AR030675A2; AU4939496A; WO1996029397A1; EP1683860A2; EP1683860B1; ATE315083T1; CN102080070B; US8642730B2; CN102146362A; CN101173263A; BR9607646A; MX9706974A; US6855531B2; CA2214116C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Enzymzubereitungen, die ein Enzym umfassen, das Endoglucanase-Aktivität zeigt, das eine sehr gute Wirksamkeit bei industriellen Anwendungen, so wie Waschmittelzusammensetzungen, bei dem Biopolishing von neu hergestellten Textilien, um Zellulose-Textilerzeugnissen oder -Kleidungsstücken ein abgenutztes Aussehen zu verleihen, und bei der Behandlung von Papierbrei zeigt. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf DNA-Konstrukte, die solche Enzyme kodieren, ein Verfahren zur Bereitstellung eines Gens, das für solche Enzyme kodiert, ein Verfahren zur Herstellung der Enzyme, Enzymzubereitungen, die solche Enzyme enthalten, und die Verwendung dieser Enzyme für eine Anzahl von industriellen Anwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zellulasen oder zellulytische Enzyme sind Enzyme, die an Hydrolysen von Zellulose beteiligt sind. Es ist bekannt, dass an der Hydrolyse von nativer Zellulose drei Haupttypen von Zellulaseenzymen beteiligt sind, nämlich die Cellobiohydrolyse (1,4-β-D-Glucancellobiohydrolase, EC 3.2.1.91), die endo-β-1,4-Glucanase (endo-1,4-β-D-Glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4) und die β-Glucosidase (EC 3.2.1.21).
Zellulasen werden von einer großen Anzahl von Mikroorganismen, die Pilze, Actinomyceten, Myxobakterien und echte Bakterien einschließen, aber auch von Pflanzen synthetisiert. Es wurden besonders Endoglucanasen mit einer breiten Vielfalt von Spezifitäten identifiziert.
Eine sehr wichtige industrielle Anwendung von zellulytischen Enzymen ist die Verwendung zur Behandlung einer Zellulosetextilie oder -Textilerzeugnisses, z. B. als Bestandteile in Waschmittelzusammensetzungen oder Textilerzeugnis-Weichmacherzusammensetzungen, für das Biopolishing eines neuen Textilerzeugnisses (Ausrüstung von Kleidungsstücken) und um ein „stonewashed"-Aussehen eines Zellulose enthaltendem Textilerzeugnis, speziell Denim, zu erhalten, und es wurden mehrere Verfahren für solch eine Behandlung vorgeschlagen, z. B. in GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 und EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, WO 95/24471 und WO 95/26398.
Eine weitere wichtige industrielle Anwendung von zellulytischen Enzymen ist die Verwendung für die Behandlung von Papierbrei, z. B. für die Verbesserung der Entwässerung oder des De-inken von wieder verwendetem Papier.
Speziell die Endoglucanasen (EC-Nr. 3.2.1.4) bilden eine interessante Gruppe von Hydrolasen für die erwähnten industriellen Anwendungen. Endoglucanasen katalysieren die Endohydrolyse von 1,4-β-D-glycosidischen Bindungen in Zellulose, Zellulosederivaten (so wie Carboxymethylzellulose und Hydroxyethylzellulose), Lichenin, β-1,4-Bindungen in gemischten β-1,3-Glucanen, so wie Getreide-β-D-Glucanen oder Xyloglucanen, und anderem Pflanzenmaterial, das Zelluloseteile enthält. Der zugelassene Name ist endo-1,4-β-D-Glucan-4-glucanhydrolase, aber der abgekürzte Ausdruck Endoglucanase wird in der vorliegenden Anmeldung verwendet. Als Referenz können T.-M. Enveri, „Microbial Zellulases" in W.M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, S. 183–224 (1983); Methods in Enzymology, (1988) Bd. 160, S. 200–391 (herausgegeben von Wood, W.A. und Kellogg, S.T.); Béguin, P., „Molecular Biology of Cellulose Degradation", Annu. Rev. Microbiol. (1990), Bd. 44, S. 219–248; Béguin, P. und Aubert, J-P., „The biological degradation of cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) S. 25–58; Henrissat, B., "Cellulases and their interaction with cellulose", Cellulose (1994), Bd. 1, S. 169–196, zitiert werden.
Pilzendoglucanasen, speziell diejenigen, die von Spezies wie z. B. Fusarium oxysporum, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Aspergillus aculeatus, Neocallimastix patriciarum und z. B. von Spezies der Gattungen Piromyces, Humicola, Myceliophthora, Geotricum, Penicillium, Irpex, Coprinus abgeleitet sind, wurden in zahlreichen Publikationen beschrieben.
Pilzendoglucanasen wurden zum Beispiel in: Sheppard, P.O., et al., "The use of conserved cellulase family-specific sequences to clone cellulase homologue cDNAs from Fusarium oxysporum, Gene, (1994), Bd. 15, S. 163–167, Saloheimo, A., et al., "A novel, small endoglucanase gene, egI5, from Trichoderma reesei isolated by expression in yeast", Molecular Microbiology (1994), Bd. 13(2), S. 219–228; van Arsdell, J. N. et al., (1987), Cloning, characterization, and expression in Saccharomyces cerevisiae of endoglucanase I from Trichoderma reesei, Bio/Technology 5:60–64; Penttilä, M. et al., (1986), "Homology between zellulase genes of Trichoderma reesei: complete nucleotide sequence of the endoglucanase I gene", Gene 45:253–263, Saloheimo, M. et al., (1988), "EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme", Gene 63:11–21; Gonzáles, R., et al., "Cloning, sequence analysis and yeast expression of the egll gene from Trichoderma longibrachiatum", Appl. Microbiol. Biotechnol., (1992), Bd. 38, S. 370–375; Ooi, T. et al. "Cloning and sequence analysis of a cDNA for zellulase (FI-CMCase) from Aspergillus aculeatus", Curr. Genet., (1990), Bd. 18, S. 217–222; Ooi, T. et al, "Complete nucleotide sequence of a gene coding for Aspergillus aculeatus zellulase (FI-CMCase)", Nucleic Acids Research, (1990), Bd. 18, Nr. 19, S. 5884; Xue, G. et al., "Cloning and expression of multiple zellulase cDNAs from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix patriciarum in E. coli", J. Gen. Microbiol., (1992), Bd. 138, S. 1413–1420; Xue, G. et al., "A novel polysaccharide hydrolase cDNA (celD) from Neocallimastix patriciarum encoding three multi-functional catalytical domains with high endoglucanase, cellobiohydrolase and xylanase activities", J. Gen. Microbiol., (1992), Bd. 138, S. 2397–2403; Zhou, L. et al., "Intronless celB from the anaerobic fungus Neocallimastix patriciarum encodes a modular family A endoglucanase", Biochem. J., (1994), Bd. 297, S. 359–364; Dalbøge, H. und Heldt-Hansen, H. P., "A novel method for efficient expression cloning of fungal enzyme genes", Mol. Gen. Genet., (1994), Bd. 243, S. 253–260; Ali, B. R. S. et al., "Cellulases and hemicellulases of the anaerobic fungus Piromyces constitute a multiprotein cellulose-binding complex and are encoded by multigene families", FEMS Microbiol. Lett., (1995), Bd. 125, Nr. 1, S. 15–21 beschrieben. Außerdem umfasst die DNA-Datenbank von Japan (DDBJ-Datenbank, im Internet öffentlich zugänglich) zwei aus Penicillium janthinellum klonierte DNA-Sequenzen, die Endoglucanasen kodieren (von A. Koch bzw. G. Mernitz kloniert) und eine aus Humicola grisea var.thermoidea klonierte DNA-Sequenz, die eine Endoglucanase kodiert (von T. Uozumi kloniert). Zwei Endoglucanasen aus Macrophomina phaseolina wurden kloniert und sequenziert, siehe Wang, H. Y. und Jones, R. W.: "Cloning, characterization and functional expression of an endoglucanase-encoding gene from the phytopathogenic fungus Macrophomina phaseolina" in Gene, 158:125–128, 1995, und Wang, H. Y. und Jones, R. W.: "A unique endoglucanase-encoding gene cloned from the phytopathogenic fungus Macrophomina phaseolina" in Applied And Environmental Microbiology, 61:2004–2006, 1995. Eine dieser Endoglucanasen zeigt eine hohe Homologie zu der egl3-Endoglucanase aus dem Pilz Trichoderma reesei, die andere zeigt Homologie zu dem egl1 aus dem mikrobiellen Phytopathogen Pseudomonas solanacearum, was darauf hindeutet, das beide Endoglucanasen zu der Familie 5 der Glycosylhydrolasen gehören (B. Henrissat, Biochem J 280:309–316 (1991)). Die Filament-spezifische Expression eines Zellulasegens in dem dimorphen Pilz Ustilago maydis ist in Schauwecker, F. et al. (1995) offenbart.
WO 91/17243 (Novo Nordisk A/S) offenbart eine Zellulasezubereitung, die aus einem homogenen Endoglucanase-Bestandteil besteht, der mit einem Antikörper immunreaktiv ist, der gegen eine hochgradig gereinigte 43-kDa-Endoglucanase erzeugt wurde, die von Humicola insolens, DSM 1800, abgeleitet wurde; WO 91/17244 (Novo Nordisk A/S) offenbart ein neues, (Hemi)Zellulose-abbauendes Enzym, so wie eine Endoglucanase, eine Cellobiohydrolase oder eine β-Glucosidase, das von anderen Pilzen als Trichoderma und Phanerochaete abgeleitet werden kann; WO 93/20193 offenbart eine Endoglucanase, die von Aspergillus aculeatus ableitbar ist; WO 94/21801 (Genencor Inc.) betrifft ein Zellulasesystem, das aus Trichoderma longibrachiatum isoliert wurde, das Endoglucanase-Aktivität zeigt; WO 94/26880 (Gist Brocades N.V.) offenbart ein isoliertes Gemisch von Zellulose-abbauenden Enzymen, die vorzugsweise aus Trichoderma, Aspergillus oder Disporotrichum erhalten werden, das Endoglucanase-, Cellobiohydrolase- und Xyloglucanase-Aktivität aufweist; und WO 95/02043 (Novo Nordisk A/S) beschreibt ein Enzym mit Endoglucanase-Aktivität, das von Trichoderma harzianum abgeleitet ist, das für eine Anzahl von Zwecken verwendet werden kann, die z. B. den Abbau oder die Modifizierung von Pflanzenzellwänden einschließen.
Es ist auch bekannt, dass Zellulasen eine Zellulose-Bindungsdomäne (eine CBD) aufweisen oder nicht aufweisen können. Die CBD verstärkt die Bindung des Enzyms an eine Zellulose-enthaltende Faser und erhöht die Wirksamkeit des katalytisch wirksamen Teils des Enzyms.
Es besteht ein stets vorhandener Bedarf an der Bereitstellung neuer Zellulase-Enzymzubereitungen, die für Anwendungen verwendet werden können, in denen eine Zellulase-, vorzugsweise eine Endoglucanase-Aktivität wünschenswert ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue Enzymzubereitungen, die eine erhebliche zellulytische Aktivität unter sauren, neutralen oder alkalischen Bedingungen und eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verarbeitung von Papierbrei, der Textilbehandlung, in Wäschereiverfahren oder in Tierfutter aufweisen, vorzugsweise neue Zellulasen, mehr bevorzugt gut wirksame Endoglucanasen, die mittels rekombinanter Techniken herstellbar oder hergestellt sein sollen, bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine Gruppe von Endoglucanasen, die bestimmte einzigartige Merkmale aufweisen, bei denjenigen industriellen Anwendungen, für die Endonukleasen üblicherweise verwendet werden, eine sehr gute Wirksamkeit aufweisen. Diese einzigartigen Merkmale können als konservierte Regionen der Aminosäuresequenz des Enzymproteins beschrieben werden, und die Erfinder haben gefunden, dass zellulytische Enzyme, d. h. Enzyme, die eine zellulytische Aktivität aufweisen, bestimmte konservierte Regionen aufweisen, die, z. B. bei der Behandlung von Wäsche, bei der Behandlung von neu hergestellten Textilien, bei der Behandlung von Papierherstellungsbrei, sehr wirksam sind.
Somit bezieht sich die Erfindung in ihrem ersten Aspekt auf eine Enzymzubereitung, die im Wesentlichen aus einem Enzym besteht, das zellulytische Aktivität aufweist und eine wie in der SEQ ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Die Erfinder haben experimentell bestätigt, dass die Kopplung einer CBD-Region an ein Coreregion-Enzym (das die katalytisch aktive Region oder Domäne des Enzyms umfasst) der vorliegenden Erfindung zu einer signifkant verbesserten Wirksamkeit, z. B. einer 50fach höheren Wirksamkeit, des Enzyms mit mehreren Domänen führt.
Somit stellt die vorliegende Erfindung neue Zellulasen, speziell Endoglucanasen, bereit, die eine verbesserte Wirksamkeit bei industriellen Anwendungen, entweder in ihrer nativen Form, oder in homo- oder heterolog produzierter Form, aufweisen.
In weiteren Aspekten bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue zellulytische Enzymzubereitungen, die von taxonomisch spezifischen Familien, Gattungen und Spezies, z. B. von der Familie Chaetomiaceae, ableitbar sind, speziell auf solche, die im Wesentlichen aus einem Enzym bestehen, das die wie in SEQ ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
In noch weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung DNA-Konstrukte bereit, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanase-Aktivität zeigt, wobei die DNA-Sequenz die in der SEQ ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz oder Analoga davon umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen rekombinanten Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt umfasst; auf eine Zelle, die ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektor umfasst; auf ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, z. B. eines erfindungsgemäßen rekombinanten Enzyms; auf ein Verfahren zur Bereitstellung einer Farbklärung von Wäsche unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms; auf eine Waschmittelzusammensetzung, die das erfindungsgemäße Enzym umfasst; auf Verwendungen des erfindungsgemäßen Enzyms für den Abbau oder die Modifizierung von Pflanzenmaterial, z. B. Zellwänden, für die Behandlung eines Textilerzeugnisses, einer Textilie oder von Kleidung, für die Behandlung von Papierbrei, und auf eine Enzymzubereitung, die mit einem erfindungsgemäßen Enzym angereichert ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In dem vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck „die 20 natürlicherweise vorkommenden Aminosäurereste" die 20 Aminosäurereste, die gewöhnlich in Proteinen gefunden werden und üblicherweise als Alanin (Ala oder A), Valin (Val oder V), Leucin (Leu oder L), Isoleucin (Ile oder I), Prolin (Pro oder P), Phenylalanin (Phe oder F), Tryptophan (Trp oder W), Methionin (Met oder M), Glycin (Gly oder G), Serin (Ser oder S), Threonin (Thr oder T), Cystein (Cys oder C), Tyrosin (Tyr oder Y), Asparagin (Asn oder N), Glutamin (Gln oder Q), Asparaginsäure (Asp oder D), Glutaminsäure (Glu oder E), Lysin (Lys oder K), Arginin (Arg oder R) und Histidin (His oder H) bekannt sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue, gut wirksame Endoglucanasen bereitgestellt, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 9 umfassen.
In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel weist das erfindungsgemäße Enzym eine erste Sequenz auf, die die Aminosäuresequenz
umfasst.
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Enzymzubereitung bereit, die im Wesentlichen aus einem Enzym besteht, das zellulytische Aktivität aufweist und die wie in SEQ ID Nr. 9 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Das Enzym ist auch aus einem Stamm erhältlich, der zu der Gattung Thielavia gehört, speziell aus einem Stamm, der zu der Spezies Thielavia terrestris gehört, spezifischererweise aus Thielavia terrestris, NRRL 8126.
In weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt bereit, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanase-Aktivität zeigt, wobei die DNA-Sequenz

a) die in SEQ ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältliche DNA-Sequenz umfasst oder
b) ein Analog der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältliche DNA-Sequenz umfasst, die
i) homolog mit der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder der aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältlichen DNA-Sequenz ist,
ii) mit der gleichen Oligonukleotidsonde wie die in SEQ ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältliche DNA-Sequenz hybridisiert,
iii) ein Polypeptid kodiert, das homolog mit dem Polypeptid ist, das von einer DNA-Sequenz kodiert ist, die die in SEQ ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältliche DNA-Sequenz umfasst,
iv) ein Polypeptid kodiert, das immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen die gereinigte Endoglucanase erzeugt wurde, die von der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder der aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältlichen DNA-Sequenz kodiert ist.

Escherichia coli DSM 10571 wurde nach dem Budapester Vertrag am 6. März 1996 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
Saccharomyces cerevisiae DSM 9770 wurde nach dem Budapester Vertrag am 24. Februar 1995 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
Saccharomyces cerevisiae DSM 10082 wurde nach dem Budapester Vertrag am 30. Juni 1995 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 wurde nach dem Budapester Vertrag am 30. Juni 1995 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt, das sich auf SEQ ID Nr. 8 bezieht, kann auf der Basis einer DNA-Bibliothek eines Stamms von Thielavia, insbesondere eines Stammes von Thielavia terrestris, speziell Thielavia terrestris, NRRL 8126, hergestellt oder daraus isoliert werden.
In dem vorliegenden Zusammenhang soll das „Analog" zu der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz jede beliebige DNA-Sequenz bezeichnen, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanase-Aktivität zeigt, das jede beliebige oder alle der Eigenschaften i)-iv) aufweist.
Die analoge DNA-Sequenz

a) kann aus einem anderen oder verwandten (z. B. demselben) Organismus, der das Enzym mit Endoglucanase-Aktivität produziert, auf der Basis der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz, z. B. unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren, isoliert werden; das Homolog kann eine allelische Variante der DNA-Sequenz, die die hierin gezeigten DNA-Sequenzen umfasst, d. h. eine alternative Form eines Gens, die durch Mutation entsteht, sein; die Mutationen können still (keine Veränderung in dem kodierten Enzym) sein, oder sie können Enzyme kodieren, die eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen; das Homolog der vorliegenden DNA-Sequenz kann auch ein Gattungs- oder Spezieshomolog sein, d. h. das ein Enzym mit einer ähnlichen Aktivität, das von einer anderen Spezies abgeleitet ist, kodiert,
b) kann auf der Basis der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz, z. B. durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz der von der DNA-Sequenz kodierten Enduglucanase führen, aber die dem Kodongebrauch des Wirtsorganismus entsprechen, der für die Produktion des Enzyms vorgesehen ist, oder durch Einführen von Nukleotidsubstitionen, die zur einer anderen Aminosäuresequenz führen können, konstruiert sein. In dem letzteren Fall sind die Aminosäureänderungen jedoch vorzugsweise von einer untergeordneten Natur, d. h. konservative Aminosäuresubstitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinflussen, kleine Deletionen, typischerweise von einer bis in etwa 30 Aminosäuren; kleine amino- oder carboxyterminale Verlängerungen, so wie ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu in etwa 20–25 Resten oder eine kleine Verlängerung, die die Reinigung erleichtert, so wie ein poly-Histidin-Abschnitt, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne. Siehe im Allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991. Beispiele von konservativen Substitutionen finden sich innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (so wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (so wie Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (so wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (so wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (so wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (so wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).

Es wird für Fachleute offnsichtlich sein, dass solche Substitutionen außerhalb der Regionen, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind, durchgeführt werden können und immernoch zu einem aktiven Polypeptid führen. Aminosäuren, die essentiell für die Aktivität des Polypeptids sind, das von dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodiert wird, und die deshalb vorzugsweise keiner Substitution unterliegen, können mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren, so wie ortsspezifischer Mutagenese oder Alanin-Scanningmutagenese (Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085, 1989), identifiziert werden. Bei der letztgenannten Technik werden Mutationen bei jedem Rest in dem Molekül eingeführt, und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf ihre biologische (d. h. Endoglucanase-) Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Orte der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können auch durch die Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, die durch Techniken wie kernmagnetische Resonanz, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung bestimmt wurde. Siehe zum Beispiel de Vos et al., Science 255: 306–312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59–64, 1992.
Die von der DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts kodierte Endoglucanase kann eine Zellulose-Bindungsdomäne (CBD) umfassen, die als ein integraler Teil des kodierten Enzyms vorliegt, oder eine CBD von einem anderen Ursprung kann in das Endoglucanase-Enzym eingeführt werden, wobei ein Enzymhybrid erzeugt wird. In diesem Zusammenhang soll der Ausdruck „Zellulose-Bindungsdomäne" so, wie er von Peter Tomme et al., „Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" in „Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler und Michael H. Penner (Hrsg.), ACS-Symposium Series, Nr. 618, 1996, definiert wurde, verstanden werden. Diese Definition klassifiziert mehr als 120 Zellulose-Bindungsdomänen (CBDs) in l0 Familien (I-X), und sie zeigt, dass CBDs in verschiedenen Enzymen, so wie Zelluasen, Xylanasen, Mannanasen, Arabinofuranosidasen, Acetylesterasen und Chitinasen, gefunden werden. CBDs wurden auch in Algen, z. B. der Rotalge Porphyra purpurea, als ein nichthydrolytisches Polysaccharid-bindendes Protein gefunden, als Referenz siehe Peter Tomme et al., supra. Jedoch stammen die meisten CBDs aus Zellulasen und Xylanasen. CBDs werden an den N- oder C-Termini von Proteinen gefunden oder befinden sich im Inneren. Enzymhybride sind in der Technik bekannt, siehe z. B. WO 90/00609 und WO 95/16782, und können hergestellt werden, indem ein DNA-Konstrukt, das wenigstens ein DNA-Fragment, das die Zellulose-Bindungsdomäne kodiert, die mit oder ohne einen Linker an eine DNA-Sequenz ligiert ist, die das Enzym von Interesse kodiert, umfasst, in eine Wirtszelle transformiert wird und die Wirtszelle zum Wachstum gebracht wird, um das fusionierte Gen zu exprimieren. Enzymhybride können durch die folgende Formel beschrieben werden:
CBD-MR-X,
worin CBD die N-terminale oder die C-terminale Region einer Aminosäuresequenz ist, die wenigstens der Zellulose-Bindungsdomäne entspricht; MR ist die mittlere Region (der Linker) und kann eine Bindung oder eine kurze Kopplungsgruppe, vorzugsweise von in etwa 2 bis in etwa 100 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt von 2 bis 40 Kohlenstoffatomen, sein, oder besteht vorzugsweise aus in etwa 2 bis in etwa 100 Aminosäuren, mehr bevorzugt aus von 2 bis 40 Aminosäuren; und X ist eine N-terminale oder C-terminale Region eines Polypeptids, das von der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz kodiert ist.
Die in i), oben, genannte Homologie wird als der Grad der Identität zwischen den beiden Sequenzen bestimmt, der eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten anzeigt. Die Homologie kann zweckmäßigerweise mittels in der Technik bekannter Computerprogramme, so wie GAP, das in dem GCG-Programmpaket (Needleman, S.B. und Wunsch, C.D., Journal of Molecular Biology, 48: 443–453, 1970) bereitgestellt wird, bestimmt werden. Bei der Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenzvergleich: GAP-Creation-Penalty von 5,0 und GAP-Extension-Penalty von 0,3 zeigt die kodierende Region der DNA-Sequenz einen Grad an Identität von vorzugsweise wenigstens 60 %, mehr bevorzugt wenigstens 65 %, mehr bevorzugt wenigstens 70 %, noch mehr bevorzugt wenigstens 80 %, besonders wenigstens 90 %, wobei die kodierende Region der DNA-Sequenz in SEQ ID Nr. 8 gezeigt ist oder die DNA-Sequenz aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081, erhältlich ist.
Die in ii), oben, erwähnte Hybridisierung soll zeigen, dass die analoge DNA-Sequenz unter bestimmten spezifizierten Bedingungen, die hierin im Einzelnen in dem Abschnitt Material und Methoden, unten, beschrieben sind, an die gleiche Sonde bindet wie die DNA-Sequenz, die das Endoglucanaseenzym kodiert. Die zu verwendende Oligonukleotidsonde ist die DNA-Sequenz, die dem die Endoglucanase kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081, erhältlich ist, entspricht.
Die in iii), oben, erwähnte Homologie wird als der Grad der Identität zwischen den beiden Sequenzen bestimmt, der eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten Sequenz anzeigt. Die Homologie kann zweckmäßigerweise mittels in der Technik bekannter Computerprogramme, so wie GAP, das in dem GCG-Programmpaket bereitgestellt wird (Needleman, S.B. und Wunsch, C.D., Journal of Molecular Biology, 48: 443–453, 1970), bestimmt werden. Bei der Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den Polypeptid-Sequenzvergleich: GAP-Creation-Penalty von 3,0 und GAP-Extension-Penalty von 0,1, zeigt das von einer analogen DNA-Sequenz kodierte Polypeptid einen Grad an Identität von vorzugsweise wenigstens 55 %, mehr bevorzugt wenigstens 60 %, mehr bevorzugt wenigstens 65 %, noch mehr bevorzugt wenigstens 70 %, mehr bevorzugt wenigstens 80 %, besonders wenigstens 90 %, wobei das Enzym von einem DNA-Konstrukt kodiert ist, das die in SEQ ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz oder die DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081, erhältlich ist, umfasst.
In Verbindung mit der Eigenschaft iv), oben, soll eine Endoglucanase, die von einer DNA-Sequenz kodiert ist, die aus dem Stamm Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081, isoliert ist, und in einem Wirtsorganismus produziert wird, der mit dieser DNA-Sequenz transformiert ist, oder die korrespondierende Endoglucanase, die natürlicherweise von Thielavia terrestris produziert wird, angegeben werden. Die immunologische Reaktivität kann mittels des in dem Abschnitt Material und Methoden, unten, beschriebenen Verfahrens bestimmt werden.
In weiteren Aspekten bezieht sich die Erfindung auf einen Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthält, eine Zelle, die das DNA-Konstrukt oder den Expressionsvektor umfasst, und ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das Endoglucanase-Aktivität zeigt, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das Gewinnen des Enzyms aus der Kultur umfasst.
In einem noch weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Enzym, das Endoglucanase-Aktivität zeigt, wobei das Enzym

a) von einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodiert ist,
b) zu wenigstens 70 % homolog zu der in SEQ ID Nr. 9 gezeigten Aminosäuresequenz ist,
c) durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt ist, und/oder
d) immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen eine gereinigte Endoglucanase erzeugt wurde, die von der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder der aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081, erhältlichen DNA-Sequenz kodiert ist.

Die in d), oben, erwähnte Endoglucanase kann von der aus dem Stamm Saccharomyces cerevisiae, DSM 10081, isolierten DNA-Sequenz kodiert und in einem Wirtsorganismus, der mit der besagten DNA-Sequenz transformiert ist, hergestellt sein oder kann die natürlicherweise von Thielavia terrestris hergestellte, korrespondierende Endoglucanase sein.
Im Allgemeinen wird in dem vorliegenden Zusammenhang der Ausdruck „Enzym" so verstanden, dass er ein reifes Protein oder eine Vorläuferform davon, sowie ein funktionelles Fragment davon, dass im Wesentlichen die Aktivität des Enzyms mit der vollen Länge aufweist, umfasst. Außerdem soll der Ausdruck „Enzym" Homologe dieses Enzyms einschließen.
Homologe des vorliegenden Enzyms können eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen aufweisen. Diese Änderungen sind vorzugsweise von untergeordneter Natur, das heißt konservative Aminosäuresubstitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinflussen, kleine Deletionen, typischerweise von einer bis in etwa 30 Aminosäuren; kleine amino- oder carboxyterminale Verlängerungen, so wie ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu in etwa 20–25 Resten oder eine kleine Verlängerung, die die Reinigung erleichtert, so wie ein Polyhistidin-Abschnitt, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne. Siehe im Allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991. Beispiele von konservativen Substitutionen finden sich innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (so wie Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (so wie Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (so wie Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (so wie Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (so wie Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (so wie Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin).
Es wird für Fachleute offensichtlich sein, dass solche Substitutionen außerhalb der Regionen, die kritisch für die Funktion des Moleküls sind, durchgeführt werden können und immernoch zu einem aktiven Enzym führen. Aminosäuren, die essentiell für die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms sind, und deshalb vorzugsweise keiner Substitution unterliegen, können gemäß Verfahren, die in der Technik bekannt sind, so wie ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Scanningmutagenese (Cunningham, 1989), identifiziert werden. Bei der letztgenannten Technik werden Mutationen bei jedem Rest in dem Molekül eingeführt, und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf zellulytische Aktivität getestet, um die Aminosäurereste zu identifizieren, die kritisch für die Aktivität des Moleküls sind. Orte der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen können auch durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, die durch Techniken wie kernmagnetische Resonanz, Kristallographie oder das Photoaffinitätslabelling bestimmt wurde. Siehe zum Beispiel de Vos et a., 1992; Smith et al., 1992, Wlodaver et al., 1992.
Das Homolog kann eine allelische Variante, d. h. eine alternative Form eines Gens, die durch eine Mutation entsteht, oder ein verändertes Enzym, das von einem mutierten Gen kodiert ist, aber im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie das erfindungsgemäße Enzym aufweist, sein. Somit können Mutationen still sein (keine Veränderung in dem kodierten Enzym), oder sie können Enzyme kodieren, die veränderte Aminosäuresequenzen aufweisen.
Das Homolog des vorliegenden Enzyms kann auch ein Gattungs- oder Spezieshomolog sein, d. h. ein Enzym mit einer ähnlichen Aktivität, das von einer anderen Spezies abgeleitet ist.
Ein Homolog des Enzyms kann unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren isoliert werden.
Molekulares Screening und Klonierung mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR)
Das molekulare Screening auf erfindungsgemäße DNA-Sequenzen kann mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von genomischer DNA oder von doppelsträngiger cDNA, die aus einer geeigneten Quelle, so wie jedem beliebigen der hierin erwähnten Organismen, isoliert wurde, und von synthetischen Oligonukleotidprimern, die auf der Basis der hierin offenbarten DNA-Sequenzen oder Aminosäuresequenzen hergestellt wurden, durchgeführt werden. Zum Beispiel können geeignete Oligonukleotidprimer die in dem Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Primer sein.
Das bei dem molekularen Screening erzeugte PCR-Fragment kann in Übereinstimmung mit wohlbekannten Verfahren isoliert und in einen geeigneten Vektor subkloniert werden. Das PCR-Fragment kann für das Screenen von DNA-Bibliotheken, z. B. durch Kolonie- oder Plaquehybridisierung, verwendet werden.
Expressionsklonierung in Hefe
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanase-Aktivität aufweist, kann durch ein allgemeines Verfahren isoliert werden, das

– Klonieren einer DNA-Bibliothek aus einer geeigneten Quelle, so wie jedem beliebigen der hierin erwähnten Organismen, in geeignete Vektoren,
– Transformieren geeigneter Hefe-Wirtszellen mit den Vektoren,
– Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um jedes beliebige Enzym von Interesse, das von einem Klon in der DNA-Bibliothek kodiert ist, zu exprimieren,
– Screenen auf positive Klone durch Bestimmen einer möglichen Endoglucanase-Aktivität des von solchen Klonen produzierten Enzyms, und
– Isolieren der das Enzym kodierenden DNA aus solchen Klonen einschließt, isoliert worden.

Das allgemeine Verfahren ist weiter in WO 94114953 offenbart. Eine detailliertere Beschreibung des Screeningverfahrens ist in dem Beispiel 1, unten, angegeben.
Die DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, kann zum Beispiel durch Screenen einer cDNA-Bibliothek von Macrophomina phaseolina, Crinipellis scabella, Sordaria fimicola oder Volutella colletotrichoides und Selektieren auf Klone, die die passende Enzymaktivität (d. h. Endoglucanase-Aktivität) exprimieren, oder aus Escherichia coli DSM 10512, das nach dem Budapester Vertrag am 2. Februar 1996 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt wurde, oder aus Escherichia coli DSM 10511, das nach dem Budapester Vertrag am 2. Februar 1996 bei der DSM hinterlegt wurde, oder aus Escherichia coli DSM 10576, das nach dem Budapester Vertrag am 12. März 1996 bei der DSM hinterlegt wurde, oder aus Escherichia coli DSM 10571, das nach dem Budapester Vertrag am 6. März 1996 bei der DSM hinterlegt wurde, oder durch Screenen einer cDNA-Bibliothek von Myceliophthora thermophila, CBS 117.65, Acremonium sp., CBS 478.94 oder Thielavia terrestris, NRRL 8126, und Selektieren auf Klone, die die passende Enzymaktivität (d. h. Endoglucanase-Aktivität) exprimieren, oder aus Saccharomyces cerevisiae DSM 9770, das nach dem Budapester Vertrag am 24. Februar 1995 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Deutschland) hinterlegt wurde, oder aus Saccharomyces cerevisiae DSM 10082, das nach dem Budapester Vertrag am 30. Juni 1995 bei der DSM hinterlegt wurde, aus Saccharomyces cerevisiae DSM 10080, das nach dem Budapester Vertrag am 30. Juni 1995 hinterlegt wurde, oder aus Saccharomyces cerevisiae DSM 10081, das nach dem Budapester Vertrag am 30. Juni 1995 bei der DSM hinterlegt wurde, isoliert werden. Die passende DNA-Sequenz kann dann aus dem Klon mittels Standardverfahren, z. B. wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert werden.
Nukleinsäurekonstrukt
Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck „Nukleinsäurekonstrukt" jedes beliebige Nukleinsäuremolekül von cDNA-, genomische DNA-, synthetische DNA- oder von RNA- Ursprung bezeichnen. Der Ausdruck „Konstrukt" soll ein Nukleinsäuresegment bezeichnen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann, und das auf einer vollständigen oder teilweisen, natürlicherweise vorkommenden Nukleotidsequenz basiert, die ein Enzym von Interesse kodiert. Das Konstrukt kann wahlweise andere Nukleinsäuresegmente enthalten.
Das Nukleinsäurekonstrukt, das das Enzym von Interesse kodiert, kann zweckmäßigerweise von genomischem oder cDNA-Ursprung sein, zum Beispiel kann es durch Herstellen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Screenen auf DNA-Sequenzen, die für das gesamte oder einen Teil des Enzyms kodieren, mittels Hybridisierung unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden in Übereinstimmung mit Standardtechniken (vgl. Sambrook et al., 1989) gewonnen werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt, das das Enzym kodiert, kann auch auf synthetische Weise mittels etablierter Standardverfahren, z. B. des von Beaucage und Caruthers (1981) beschriebenen Phosphoamidit-Verfahrens oder des von Matthes et al. (1984) beschriebenen Verfahrens hergestellt werden. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonukleotide z. B. in einem automatischen DNA-Synthesizer synthetisiert, gereinigt, annealiert („annealed"), ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
Außerdem kann das Nukleinsäurekonstrukt von gemischt synthetischem und genomischem, gemischt synthetischem und cDNA- oder gemischt genomischem und cDNA-Ursprung und durch Ligieren von Fragmenten von synthetischem, genomischem oder cDNA-Ursprung (wie zutreffend) in Übereinstimmung mit Standardtechniken hergestellt werden, wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des gesamten Nukleinsäurefragments entsprechen.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann auch durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung spezifischer Primer, zum Beispiel wie in US 4,683,202 oder Saiki et al. (1988) beschrieben, hergestellt werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt ist vorzugsweise ein DNA-Konstrukt, wobei dieser Ausdruck in dieser Beschreibung und den Ansprüchen ausschließlich verwendet werden wird.
Rekombinanter Vektor
Ein rekombinanter Vektor, der ein DNA-Konstrukt umfasst, das das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann jeder beliebige Vektor sein, der zweckmäßigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Auswahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle abhängen, in die er eingeführt werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, deren Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid, sein. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert wird und gemeinsam mit dem (den) Chromosom(en), in das (die) er integriert wurde, repliziert wird.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in dem die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, mit zusätzlichen Segmenten funktionell verbunden ist, die für die Transkription der DNA erforderlich sind. Im Allgemeinen ist der Expressionsvektor von Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet oder kann Elemente von beiden enthalten. Der Ausdruck „funktionell verbunden" zeigt an, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie gemeinsam für ihre beabsichtigten Zwecke funktionieren, z. B. beginnt die Transkription in einem Promotor und setzt sich durch die DNA-Sequenz fort, die für das Enzym kodiert.
Der Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, die eine transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind.
Beispiele geeigneter Promotoren für die Verwendung in Hefe-Wirtszellen schließen Promotoren der glycolytischen Gene der Hefe (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073–12080; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419–434) oder der Alkoholdehydrogenasegene der Hefe (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., Hrsg.), Plenum Press, New York, 1982) oder die TPI1- ( US 4,599,311 ) oder ADH2-4c-Promotoren (Russell et al., Nature 304 (1983), 652–654) ein.
Beispiele geeigneter Promotoren für die Verwendung in filamentösen Pilz-Wirtszellen sind zum Beispiel der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093–2099) oder der tpiA-Promotor. Beispiele anderer nützlicher Promotoren sind diejenigen, die von dem Gen, das die TAKA-Amylase von A. oryzae, die Aspartatproteinase von Rhizomucor miehei, die neutrale α-Amylase von A. niger, die säurestabile α-Amylase von A. niger, die Glucoamylase (gluA) von A. niger oder A. awamori, die Lipase von Rhizomucor miehei, die alkalische Protease von A. oryzae, die Triosephosphatisomerase von A. oryzae oder die Acetamidase von A. nidulans kodiert, abgeleitet sind. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase- und gluA-Promotoren.
Beispiele geeigneter Promotoren für die Verwendung in bakteriellen Wirtszellen schließen den Promotor des Gens der maltogenen Amylase von Bacillus stearothermophilus, das alpha-Amylase-Gens von Bacillus licheniformis, des Gens der BAN-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens, des Gens der alkalischen Protease von Bacillus subtilis oder des Xylosidase-Gens von Bacillus pumilus, oder die p_R- oder p_L-Promotoren des Phagen Lambda oder die lac-, trp- oder tac-Promotoren von E. coli, ein.
Die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann auch nötigenfalls mit einem geeigneten Terminator funktionell verbunden sein.
Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor kann außerdem eine DNA-Sequenz umfassen, die den Vektor in die Lage versetzt, in der betreffenden Wirtszelle zu replizieren.
Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, so wie das Gen, das für die Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert, oder das TPI-Gen von Schizosaccharomyces pombe (beschrieben von P.R. Russell, Gene 40, 1985, S. 125–130), umfassen. Für filamentöse Pilze schließen selektierbare Macker amdS, pyrG, argB, niaD, sC ein.
Um ein erfindungsgemäßes Enzym in den sekretorischen Stoffwechselweg der Wirtszelle zu lenken, kann eine sekretorische Signalsequenz (auch als Leadersequenz, Präprosequenz oder Präsequenz bekannt) in dem rekombinanten Vektor bereitgestellt sein. Die sekretorische Signalsequenz ist mit der DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, in dem korrekten Leserahmen verbunden. Sekretorische Signalsequenzen sind häufig 5' zu der DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, angeordnet. Die sekretorische Signalsequenz kam diejenige sein, die normalerweise mit dem Enzym verbunden ist, oder kann von einem Gen stammen, das ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
Für die Sekretion aus Hefezellen kann die sekretorische Signalsequenz jedes beliebige Signalpeptid kodieren, das ein wirksames Dirigieren des exprimierten Enzyms in den sekretorischen Stoffwechselweg der Zelle sicherstellt. Das Signalpeptid kann ein natürlicherweise vorkommendes Signalpeptid oder ein funktioneller Teil davon sein, oder es kann ein synthetisches Peptid sein. Es wurde gefunden, dass geeignete Signalpeptide das α-Faktor-Signalpeptid (vgl. US 4,870,008 ), das Signalpeptid der Speichelamylase aus Maus (vgl. O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, S. 643–646), ein modifiziertes Carboxypeptidase-Signalpeptid (vgl. L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, S. 887–897), das Hefe-BAR1-Signalpeptid (vgl. WO 87/02670) oder das Signalpeptid der Aspartatprotease 3 (YAP3) aus Hefe (vgl. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, S. 127–137) sind.
Für die wirksame Sekretion in Hefe kann eine Sequenz, die ein Leaderpeptid kodiert, auch stromabwärts der Signalsequenz und stromaufwärts der DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, insertiert sein. Die Funktion des Leaderpeptids besteht darin, es dem exprimierten Enzym zu ermöglichen, aus dem endoplasmatischen Retikulum in den Golgi-Apparat und weiter in ein sekretorisches Vesikel für die Sekretion in das Kulturmedium (d. h. den Export des Enzyms über die Zellwand oder zumindest durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum der Hefezelle) gelenkt zu werden. Das Leaderpeptid kann der Hefe-α-Faktor-Leader sein (dessen Verwendung in z. B. US 4,546,082 , EP 16 201 , EP 123 294 , EP 123 544 und EP 163 529 beschrieben ist). Alternativ kann das Leaderpeptid ein synthetisches Leaderpeptid sein, das heißt ein Leaderpeptid, das in der Natur nicht vorkommt. Synthetische Leaderpeptide können, zum Beispiel wie in WO 89/02463 oder WO 92/11378 beschrieben, konstruiert werden.
Für die Verwendung in filamentösen Pilzen kann das Signalpeptid zweckmäßigerweise von einem Gen, das eine Amylase oder Glucoamylase von Aspergillus sp. kodiert, einem Gen, das eine Lipase oder Protease von Rhizomucor miehei, eine Lipase von Humicola lanuginosa kodiert, abgeleitet sein. Das Signalpeptid ist vorzugsweise von einem Gen, das die TAKA-Amylase von A. oryzae, die neutrale α-Amylase von A. niger, die säurestabile Amylase von A. niger oder die Glucoamylase von A. niger kodiert, abgeleitet.
Die Verfahren, die verwendet werden, um die DNA-Sequenzen, die für das vorliegende Enzym kodieren, den Promotor und wahlweise den Terminator und/oder beziehungsweise die sekretorische Signalsequenz zu ligieren, und sie in geeignete Vektoren zu insertieren, die die notwendige Information für die Replikation enthalten, sind Fachleuten wohlbekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., zitiertes Werk).
Wirtszellen
Die in die Wirtszelle eingeführte DNA-Sequenz, die das vorliegende Enzym kodiert, kann entweder homolog oder heterolog zu dem betreffenden Wirt sein. Falls sie homolog zu der Wirtszelle, d. h. von der Wirtszelle in der Natur produziert, ist, wird sie typischerweise mit einer anderen Promotorsequenz, oder, falls zutreffend, einer anderen sekretorischen Signalsequenz und/oder Terminatorsequenz funktionell verbunden sein, als sie es in ihrer natürlichen Umgebung ist. Der Ausdruck „homolog" soll eine cDNA-Sequenz einschließen, die ein Enzym kodiert, das in dem betreffenden Wirtsorganismus beheimatet ist. Der Ausdruck „heterolog" soll eine DNA-Sequenz einschließen, die von der Wirtszelle in der Natur nicht exprimiert wird. Somit kann die DNA-Sequenz aus einem anderen Organismus stammen, oder sie kann eine synthetische Sequenz sein.
Die Wirtszellen, in die das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt oder der erfindungsgemäße rekombinante Vektor eingeführt wird, kann jede beliebige Zelle sein, die fähig ist, das vorliegende Enzym zu produzieren, und schließt Bakterien, Hefe, Pilze und höhere eukaryontische Zellen ein.
Beispiele von bakteriellen Wirtszellen, die bei der Kultivierung fähig sind, das erfindungsgemäße Enzym zu produzieren, sind Gram-positive Bakterien, so wie Stämme von Bacillus, so wie Stämme von B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis, oder Stämme von Streptomyces, so wie S. lividans oder S. murinus, oder Gram-negative Bakterien, so wie Escherichia coli. Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation oder unter Verwendung kompetenter Zellen in einer an sich bekannten Weise durchgeführt werden (vgl. Sambrook et al., supra).
Bei der Expression des Enzyms in Bakterien, so wie E. coli, kann das Enzym im Cytoplasma festgehalten werden, typischerweise als unlösliche Granula (als Einschlusskörper „inclusion bodies" bekannt), oder kann durch eine bakterielle Sekretionssequenz in den periplasmatischen Raum gelenkt werden. In dem ersten Fall werden die Zellen lysiert, und die Granula werden gewonnen und denaturiert, wonach das Enzym durch Verdünnen des Denaturierungsmittels zurückgefaltet wird. In letzterem Fall kann das Enzym aus dem periplasmatischen Raum gewonnen werden, indem die Zellen, z. B. durch Ultraschallbehandlung oder osmotischen Schock, aufgebrochen werden, um den Inhalt des periplasmatischen Raums freizusetzen, und das Enzym gewonnen wird.
Beispiele von geeigneten Hefezellen schließen Zellen von Saccharomyces spp. oder Schizosaccharomyces spp., insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces kluyveri, ein. Verfahren zur Transformation von Hefezellen mit heterologer DNA und zur Herstellung von heterologen Enzymen davon sind z. B. in US 4,599,311 , US 4,931,373 , US 4,870,008 , 5,037,743 und US 4,845,075 beschrieben. Transformierte Zellen werden mittels eines Phänotyps selektiert, der durch einen selektierbaren Marker, häufig eine Arzneimittelresistenz oder die Fähigkeit, in der Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffs, z. B. Leucin, zu wachsen, bestimmt ist. Ein bevorzugter Vektor für die Verwendung in Hefe ist der POT1-Vektor, der in US 4,931,373 offenbart ist. Der DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann eine Signalsequenz und wahlweise eine Leadersequenz, z. B. wie oben beschrieben, vorangehen. Weitere Beispiele von geeigneten Hefezellen sind Stämme von Kluyveromyces, so wie K. lactis, Hansenula, z. B. H. polymorpha, oder Pichia, z. B. P. pastoris (vgl. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, S. 3459–3465; US 4,882,279 ).
Beispiele von anderen Pilzzellen sind Zellen von filamentösen Pilzen, z. B. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. oder Trichoderma spp., insbesondere Stämme von A. oryzae, A. nidulans, A. niger oder Fusarium graminearum. Die Verwendung von Aspergillus spp. für die Expression von Proteinen ist z. B. in EP 272 277 , EP 230 023 beschrieben. Die Transformation von F. oxysporum kann zum Beispiel wie von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156, beschrieben, durchgeführt werden.
Wenn ein filamentöser Pilz als die Wirtszelle verwendet wird, kann er mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt transformiert werden, zweckmäßiger Weise, indem das DNA-Konstrukt in das Wirtschromosom integriert wird, um eine rekombinante Wirtszelle zu erhalten. Diese Integration wird im Allgemeinen als ein Vorteil angesehen, da es wahrscheinlicher ist, dass die DNA-Sequenz stabil in der Zelle bewahrt wird. Die Integration der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlicher Verfahren, z. B. mittels homologer oder heterologer Rekombination, durchgeführt werden.
Die oben beschriebene, transformierte oder transfizierte Wirtszelle wird dann in einem geeigneten Nährmedium unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des vorliegenden Enzyms erlauben, wonach das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen wird. Das Medium, das verwendet wird, um die Zellen zu kultivieren, kann jedes beliebige herkömmliche Medium sein, das geeignet ist, um die Wirtszellen wachsen zu lassen, so wie ein Minimal- oder Komplexmedium, das geeignete Supplemente enthält. Geeignete Medien sind von kommerziellen Anbietern verfügbar oder können gemäß veröffentlichter Rezepte (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden. Das von den Zellen produzierte Enzym kann dann mittels herkömmlicher Verfahren aus dem Kulturmedium gewonnen werden, die das Abtrennen der Wirtszellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, das Ausfällen der Proteinbestandteile aus dem Überstand oder Filtrat mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, die Reinigung durch eine Vielzahl von chromatographischen Verfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen, abhängig von dem Typ des betreffenden Enzyms, einschließen.
In einem noch weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms, wobei eine geeignete Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die das Enzym kodiert, unter Bedingungen kultiviert wird, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen wird.
Durch die Taxonomie sowie die Ökologie angetriebenes Enzymscreening:
Ein wirkungsvolles Werkzeug wie das hierin offenbarte molekulare Screening, das darauf ausgerichtet ist, den besagten Typ des Enzyms von Interesse nachzuweisen und zu selektieren, reicht dennoch nicht alleine aus. Um die Chancen, interessante Entdeckungen zu machen, zu maximieren, wurde die Herangehensweise des molekularen Screenings in der vorliegenden Untersuchung mit der sorgfältigen Auswahl der zu screenenden Pilze kombiniert. Die Auswahl beruhte auf einem profunden Wissen über die Identifizierung von Pilzen, die taxonomische Klassifizierung und die phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse.
Ein taxonomischer Hotspot für die Produktion von zellulytischen Enzymen kann außerdem nur vollständig erforscht werden, wenn auch die ökologische Herangehensweise eingeschlossen wird. Profunde Kenntnisse über die Anpassung an verschiedene Substrate (speziell der saprotrophe, nekrotrophe oder biotrophe Abbau von Pflanzenmaterialien) sind Voraussetzungen für den Entwurf eines intelligenten Screenings und für die Steuerung einer erfolgreichen Auswahl von Stämmen und ökologischen Nischen, die untersucht werden sollen.
Sowohl die Taxonomie als auch der ökologische Herangehensweise, die hierin offenbart sind, zielen darauf ab, die Entdeckung der besagten Enzyme in dem molekularen Screeningprogramm zu maximieren. Jedoch wurden immer noch mehrere hundert (oder, falls alle Vorarbeiten einbezogen werden) mehrere tausend Pilze in Kultur gebracht, um die 53 Treffer des besagten Typs von zellulytischem Enzym, über den hier berichtet wird, aufzufinden.
Das Screening und das Klonieren können unter Verwendung des Folgenden durchgeführt werden:
MATERIAL UND METHODEN
Liste der Organismen:

Saccharomyces cerevisiae, DSM 9770, DSM 10082, DSM 10081, bzw. Escherichia coli, DSM 10571, die das Plasmid, das die DNA-Sequenz mit der vollen Länge, die für die erfindungsgemäße Endoglucanase kodiert, in dem Shuttlevektor pYES 2.0 enthalten.

Acremonium sp

Hinterlegung des Stammes, Zugangs-Nr.: CBS 478.94
Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales, Hypocreaceae.

Volutella colletotrichoides

Zugangs-Nr. des Stammes: CBS 400.58
Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales (unklassifiziert).

Thielavia terrestris (Appinis) Malloch et Cain

Zugangs-Nr. des Stammes: NRRL8126
Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Sordariales, Chaetomiaceae.

Myceliophthora thermophila (Apinis) Oorschot

Hinterlegung des Stammes, Zugangs-Nr.: CBS 117.65
Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Sordariales, Chaetomiaceae.

Andere Stämme:
Escherichia coli MC1061 und DH10B.

Hefestamm: Der verwendete Stamm von Saccharomyces cerevisiae war W3124 (MATα; ura 3–52; leu 2–3, 112; his 3-D200; pep 4–1137; prc1::HIS3; prb1::LEU2; cir+).

Plasmide:

Der Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 ist ein Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in EP 238 023 ). Die Konstruktion von pHD414 ist weiter in WO 93/11249 beschrieben.

pYES 2.0 (Invitrogen)

pA2C477, pA2C193, pA2C357, pA2C371, pA2C385, pA2C475, pA2C488, pA2C502 (siehe Beispiel 1).

Isolierung der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz:
Die DNA-Sequenz mit der vollen Länge, die die in SEQ ID Nr. 8 gezeigte cDNA-Sequenz, die für die erfindungsgemäße Endoglucanase kodiert, umfasst, kann aus dem hinterlegten Organismus S. cerevisiae, DSM 10081, mittels Extraktion von Plasmid-DNA durch in der Technik bekannte Verfahren (Sambrook et al. (1981) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) gewonnen werden.
PCR-Primer für das molekulare Screening der erfindungsgemäßen Zellulasen:
Die vier degenerierten, Desoxyinosin-enthaltenden Oligonukleotidprimer (Sinn, s, und Antisense, as1, as2 und as3), die den vier hochkonservierten Aminosäureregionen entsprechen, die in den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Zellulase von Thielavia terrestris, der Zellulase von Myceliophthora thermophilum und zwei Zellulasen von Acremonium sp. gefunden werden. Die Reste sind gemäß der Sequenz von Myceliophthora thermophilum nummeriert. Die Desoxyinosine sind durch ein I in den Primersequenzen dargestellt, und die Restriktionsstellen sind unterstrichen.
Molekulares Screening mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR):
In-vitro-Amplifizierung von genomischer DNA und doppelsträngiger cDNA:
Direktionale, doppelsträngige cDNA wurde ausgehend von 5 μg poly(A)⁺-RNA, wie unten beschrieben, synthetisiert. Genomische DNA wurde nach Yelton et al. isoliert.
Etwa 10 bis 20 ng doppelsträngige, Zellulase-induzierte cDNA oder 100 bis 200 ng genomische DNA aus einer Auswahl von Pilzzellen wurde in PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % (gew/vol) Gelatine), der 200 μM jedes dNTPs und 100 pmol jedes degenerierten Primers in drei Kombinationen enthielt, PCR-amplifiziert:

1) Sinn, 5'-CCCCAAGCTTACI^A/_CGITA^C/_TTGGGA^C/_TTG^C/_TTG^C/_TAA^A/_G ^A/_CC-3' Antisense 1, 5'-CTAGTCTAGATA^A/_GCAIGC^A/_GCA^A/_GCACC-3'; oder
2) Sinn, 5'-CCCCAAGCTTACI^A/_CGITA^C/_TTGGGA^C/_TTG^C/_TTG^C/_TAA^A/_G ^A/_CC-3' Antisense 2, CTAGTCTAGAAAIA^A/_G/^TICCIA^A/^C/^GICCICCICCIGG-3'; oder
3) Sinn, 5'-CCCCAAGCTTACI^A/_CGITA^C/_TTGGGA^C/_TTG^C/_TTG^C/_TAA^A/_G ^A/_CC-3' Antisense 3, 5'-CTAGTCTAGAIAACCA^A/_GTCA^A/_G ^A/_TAIC^G/_TCC-3; ein DNA-Thermocycler (Landgraf, Deutschland) und 2,5 Units Taq-Polymerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA). Dreißig PCR-Zyklen wurden unter Verwendung eines Zyklusprofils von Denaturierung bei 94 °C für 1 min, Annealing bei 64 °C für 2 min und Verlängerung bei 72 °C für 3 min durchgefüht. Zehn-μl-Aliquots des Amplifikationsprodukts wurden mittels Elektrophorese in 3-%-Agarosegelen (NuSieve, FMC) mit HaeIII-gespaltener φX174-RF-DNA als Größenmarker analysiert.

Direkte Sequenzierung der PCR-Produkte.
Achtzig-μl-Aliquots der PCR-Produkte wurden unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen, USA) nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Nukleotidsequenzen der amplifizierten PCR-Fragmente wurden direkt an den gereinigten PCR-Produkten mittels des Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens bestimmt, wobei 50-150 ng Vorlage („template"), der Taq-Deoxy-Terminal-Cycle-Sequencing-Kit (Perkin Elmer, USA), fluoreszierend markierte Terminatoren und 5 pmol des Sinnprimers: 5'-CCCCAAGCTTACI^A/_CGITA^C/_TTGGGA^C/_TT-G^C/_TTG^C/_TAA^A/_G ^A/_CC-3' verwendet wurden. Die Analyse der Sequenzdaten wurde gemäß Devereux et al. durchgeführt.
Klonierung mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR):
Subklonierung von PCR-Fragmenten.
Fünfundzwanzig-μl-Aliquots der, wie oben beschrieben, erzeugten PCR-Produkte wurden in Gelen mit 0,8 % Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur (SeaPlaque GTG, FMC) elektrophoretisiert, die relevanten Fragmente wurden aus den Gelen ausgeschnitten und durch eine Agarase-Behandlung gewonnen, wobei 0,1 vol 10× Agarasepuffer (New England Biolabs) und 2 Units pro 100 μl geschmolzener Agarose zu der Probe zugegeben wurden, gefolgt von Inkubation bei 45 °C für 1,5 stdn. Die Probe wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und durch Zugabe von 2 vol 96 % EtOH und 0,1 von 3 M NaAc, pH 5,2, präzipitiert. Die PCR-Fragmente wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 70 % EtOH gewaschen, getrocknet und in 20 μl Restriktionsenzympuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM DTT) resuspendiert. Die Fragmente wurden mit HindIII und XbaI gespalten, mit Phenol und Chloroform extrahiert, durch Ausfällung mit 2 vol von 96 % EtOH und 0,1 von 3 M NaAc, pH 5,2 gewonnen und in den HindIII/XbaI-geschnittenen Vektor pYES 2.0 subkloniert.
Screenen von cDNA-Bibliotheken und Charakterisierung der positiven Klone.
cDNA-Bibliotheken in S. cerevisiae oder E. coli, die wie oben konstruiert waren, wurden mittels Koloniehybridisierung (Sambrook, 1989) unter Verwendung der entsprechenden, random-geprimten („random-priming") (Feinberg und Vogelstein), ³²P-markierten (>1 × 10⁹ cpm/μg) PCR-Produkten als Sonden gescreent. Die Hybridisierungen wurden in 2× SSC (Sambrook, 1989), 5× Denhardtslösung (Sambrook, 1989), 0,5 % (gew/vol) SDS, 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA für 20 stdn bei 65 °C durchgeführt, gefolgt von Waschschritten in 5× SSC bei 25 °C (2 × 15 min), 2× SSC, 0,5 % SDS bei 65 °C (30 min), 0,2× SSC, 0,5 % SDS bei 65 °C (30 min) und schließlich in 5× SSC (2 × 15 min) bei 25 °C. Die positiven cDNA-Klone wurden durch Sequenzieren der Enden der cDNA-Inserts mit pYES-2.0-Polylinkerprimern (Invitrogen, USA) und durch Bestimmen der Nukleotidsequenz der längsten cDNA von beiden Strängen mittels des Didesoxy- Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al.) unter Verwendung fluoreszierend markierter Terminatoren charakterisiert. Qiagen-gereinigte Plasmid-DNA (Qiagen, USA) wurde mit dem Taq-Deoxy-Terminal-Cycle-Sequencing-Kit (Perkin Elmer, USA) und entweder pYES-2.0-Polylinkerprimern (Invitrogen, USA) oder synthetischen Oligonukleotidprimern sequenziert, wobei ein automatischer Applied-Biosystems-373A-Sequenzer nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Die Analyse der Sequenzdaten wurden gemäß Devereux et al. durchgeführt.
Die Extraktion von Gesamt-RNA wurde mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt von Ultrazentrifugation durch ein 5,7-M-CsCl-Kissen, durchgeführt, und die Isolierung von poly(A)⁺-RNA wurde mitels Oligo(dT)-Zellulose-Affinitätschromatographie unter Verwendung der in WO 94/14953 beschriebenen Vorgehensweisen durchgeführt.
cDNA-Synthese:
Doppelsträngige cDNA wurde aus 5 μg poly(A)⁺-RNA mittels des RNase-H-Verfahrens (Gubler und Hoffman (1983) Gene 25:263–269; Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) unter Verwendung der von F. S. Hagen entwickelten Haarnadelmodifikation (pers. Mitt.) synthetisiert. Die poly(A)⁺-RNA (5 μg in 5 μl DEPC-behandeltem Wasser) wurde bei 70 °C für 8 min in einem vorsilikonisierten, RNase-freien Eppendorph-Röhrchen erhitzt, auf Eis abgekühlt und in einem Endvolumen von 50 μl mit Reverse-Transkriptase-Puffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, Bethesda Research Laboratories), der 1 mM dATP, dGTP und dTTP und 0,5 mM 5-Methyl-dCTP (Pharmacia) enthielt, 40 Units humanem plazentalen Ribonukleaseinhibitor (RNasin, Promega), 1,45 μg Oligo(dT)₁₈-Not-I-Primer (Pharmacia) und 1000 Units SuperScript-II-Rnase-H-Reverser-Transkriptase (Bethesda Research Laboratories) zusammengegeben. Die Erststrang-cDNA wurde durch Inkubieren des Reaktionsgemisches bei 45 °C für 1 Stunde synthetisiert. Nach der Synthese wurde das mRNA:cDNA-Hybrid-Gemisch durch eine MicroSpin-S-400-HR-Zentrifugationssäule (Pharmacia) nach den Anweisungen des Herstellers gelfiltriert.
Nach der Gelfiltration wurden die Hybride in 250 μl Zweitstrangpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,16 mM β NAD⁺) verdünnt, der 200 μl jedes dNTPs, 60 Units E. coli-DNA-Polymerase-I (Pharmacia), 5,25 Units RNase H (Promega) und 15 Units E. coli-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) enthielt. Die Zweitstrang-cDNA-Synthese wurde durch Inkubieren des Reaktionsröhrchens bei 16 °C für 2 Stunden und zusätzliche 15 min bei 25 °C durchgeführt. Die Reaktion wurde Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM, gefolgt von Phenol- und Chloroform-Extraktionen, abgestoppt.
Behandlung mit Mungbohnen-Nuklease:
Die doppelsträngige cDNA wurde bei –20 °C für 12 Stunden durch Zugabe von 2 vol 96 % EtOH, 0,2 vol 10 M NH₄Ac gefällt, durch Zentrifugation gewonnen, in 70 % EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 μl Mungbohnen-Nuklease-Puffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 0,35 mM DTT, 2 % Glycerin), der 25 Units Mungbohnen-Nuklease (Pharmacia) enthielt, resuspendiert. Die einzelsträngige Haarnadel-DNA wurde durch Inkubieren der Reaktion bei 30 °C für 30 min gespalten, gefolgt von der Zugabe von 70 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Ausfällung mit 2 vol 96 % EtOH und 0,1 vol 3 mM NaAc, pH 5,2, auf Eis für 30 min.
Erzeugen von stumpfen Enden mit der T4-DNA-Polymerase:
Die doppelsträngigen cDNAs wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 30 μl T4-DNA-Polymerasepuffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT), der 0,5 mM jedes dNTPs und 5 Units T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs) enthielt, mit stumpfen Enden versehen, indem das Reaktionsgemisch bei 16 °C für 1 Stunde inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA bis zu einem Endvolumen von 20 mM abgestoppt, gefolgt von Phenol- und Chloroformextraktionen und Fällen für 12 Stunden bei –20 °C durch Zugabe von 2 vol 96 % EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc pH 5,2.
Adapterligation, Not-I-Spaltung und Größenauswahl:
Nach der Auffüllreaktion wurden die cDNAs durch Zentrifugation gewonnen, in 70 % EtOH gewaschen und getrocknet. Das cDNA-Sediment wurde in 25 μl Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) resuspendiert, der 2,5 μg nicht-palindromische BstXI-Adapter (Invitrogen) und 30 Units T4-Ligase (Promega) enthielt, und bei 16 °C für 12 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen bei 65 °C für 20 min und dann Abkühlen auf Eis für 5 min abgestoppt. Die mit Adaptern versehene cDNA wurde mit dem Restriktionsenzym Not I durch Zugabe von 20 μl Wasser, 5 μl 10× Not-I-Restriktionsenzympuffer (New England Biolabs) und 50 Units NotI (New England Biolabs), gefolgt von einer Inkubation für 2,5 Stunden bei 37 °C gespalten. Die Reaktion wurde durch Erhitzen bei 65 °C für 10 min abgestoppt. Die cDNAs wurden durch Gelelektrophorese auf einem Gel mit 0,8 % SeaPlaque-GTG-Agarose mit niedriger Schmelztemperatur (FMC) in 1× TBE, um nicht ligierte Adapter und kleine cDNAs abzutrennen, der Größe nach aufgetrennt. Die cDNA wurde mit einem Ausschluss von 0,7 kb ihrer Größe nach ausgewählt und aus dem Gel unter Verwendung von β-Agarase (New England Biolabs) nach den Anweisungen des Herstellers isoliert und für 12 Stunden bei –20 °C durch Zugeben von 2 vol 96 % EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc pH 5,2 gefällt.
Konstruktion von Bibliotheken:
Die direktionale cDNA mit ausgewählter Größe wurde durch Zentrifugation gewonnen, in 70 % EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, resuspendiert. Die cDNAs wurden mittels Gelfiltration durch eine MicroSpin-S-300-HR-Zentrifugationssäule (Pharmacia) nach den Anweisungen des Herstellers entsalzt. Drei Testligationen wurden in 10 μl Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) durchgeführt, der 5 μl doppelsträngige cDNA (Reaktionsröhrchen #1 und #2), 15 Units T4-Ligase (Promega) und 30 ng (Röhrchen #1), 40 ng (Röhrchen #2) und 40 ng (Röhrchen #3, die Vektor-Hintergrundkontrolle) von BstXI-NotI-gespaltenem Vektor pYES 2,0 enthielt. Die Ligationsreaktionen wurden durch Inkubation bei 16 °C für 12 Stunden, Erhitzen bei 70 °C für 20 min und Zugabe von 10 μl Wasser zu jedem Röhrchen durchgeführt. 1 μl jedes Ligationsgemisches wurde in 40 μl elektrokompetente E-coli-DH10B-Zellen (Bethesda Research Laboratories), wie beschrieben (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY), elektroporiert. Unter Verwendung der optimalen Bedingungen wurde eine Bibliothek in E. coli etabliert, die aus Pools bestand. Jeder Pool wurde erzeugt, indem transformierte E. coli auf LB+Ampicillin-Agarplatten ausgestrichen wurden, was 15.000–30.000 Kolonien/Platte nach Inkubation bei 37 °C für 24 Stunden ergab. 20 μl LB+Ampicillin wurden zu der Platte zugegeben, und die Zellen wurden darin suspendiert. Die Zellsuspension wurde in einem 50-ml-Röhrchen für 1 Stunde bei 37 °C geschüttelt. Die Plasmid-DNA wurde aus den Zellen unter Verwendung des QIAGEN-Plasmid-Kits nach den Anweisungen des Herstellers isoliert und bei –20 °C gelagert.
1-μl-Aliquots gereinigter Plasmid-DNA (100 ng/μl) aus einzelnen Pools wurde in S. cerevisiae W3124 mittels Elektroporation (Becker und Guarante (1991) Methods Enzymol. 194:182–187) transformiert, und die Transformanten wurden auf SC-Agar plattiert, der 2 % Glucose enthielt, und bei 30 °C inkubiert.
Identifizierung positiver Kolonien:
Nach 3–5 Tagen Wachstum wurden die Agarplatten auf einen Satz von SC + Galactose-Uracil-Agarplatten replikaplattiert, die 0,1 % AZCL-HE-Zellulose enthielten. Diese Platten wurden für 3–7 Tage bei 30 °C inkubiert. Endoglucanase-positive Kolonien wurden als Kolonien identifiziert, die von einem blauen Hof umgeben waren.
Zellen von Enzym-positiven Kolonien wurden für die Einzelkolonie-Isolierung auf Agar ausplattiert, und eine Enzym-produzierende Einzelkolonie wurde für jede der identifizierten, Endoglucanase-produzierenden Kolonien ausgewählt.
Charakterisierung von positiven Klonen:
Die positiven Klone wurden als Einzelkolonien erhalten, die cDNA-Inserts wurden direkt aus der Hefekolonie unter Verwendung biotinylierter Polylinker-Primer ampliziert, mittels des magnetischen Kugelsystems (Dynabead M-280, Dynal) gereinigt und einzeln durch Sequenzieren des 5'-Endes jedes cDNA-Klons, unter Verwendung des Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463–5467) und des Sequenase-Systems (Unites States Biochemical), charakterisiert.
Die Nukleotidsequenz der längsten cDNA wurde von beiden Strängen mittels des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens (Sanger et al.) bestimmt, wobei fluoreszierend markierte Terminatoren verwendet wurden. Die Plasmid-DNA wurde durch Transformation in E. coli, wie unten beschrieben, gerettet. Qiagen-gereinigte Plasmid-DNA (Qiagen, USA) wurde mit dem Taq-Deoxy-Terminal-Cycle-Sequencing-Kit (Perkin Elmer, USA) und entweder pYES-2.0-Polylinkerprimern (Invitrogen, USA) oder synthetischen Oligonukleotidprimern unter Verwendung eines automatisierten Applied-Biosystems-373A-Sequencers nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Die Analyse der Sequenzdaten wurde gemäß Devereux et al. durchgeführt.
Isolierung eines cDNA-Gens für die Expression in Aspergillus:
Eine Endoglucanase-produzierende Hefekolonie wurde in 20 ml YPD-Brühe in einem 50-ml-Glasreagensröhrchen inokuliert. Das Röhrchen wurde für 2 Tage bei 30 °C geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 3.000 upm geerntet.
Die DNA wurde gemäß WO 94/14953 isoliert und in 50 μl Wasser gelöst. Die DNA wurde mittels Standardverfahren in E. coli transformiert. Die Plasmid-DNA wurde aus E. coli unter Verwendung von Standardverfahren isoliert und mittels Restriktionsenzym-Analyse analysiert. Das cDNA-Insert wurde unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme ausgeschnitten und in einen Aspergillus-Expressionsvektor ligiert.
Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger
Protoplasten können, wie in WO 95/02042, S. 16, Zeile 21-Seite 17, Zeile 12 beschrieben, hergestellt werden.
100 μl Protoplastensuspension wird mit 5–25 μg der entsprechenden DNA in 10 μl STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl₂) gemischt. Die Protoplasten werden mit p3SR2 (einem Plasmid, das das A. nidulans-amdS-Gen trägt) gemischt. Das Gemisch wird für 25 min bei Raumtemperatur belassen. 0,2 ml 60 % PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, werden zugegeben und sorgfältig gemischt (zweimal), und schließlich werden 0,85 ml der gleichen Lösung zugegeben und sorgfältig gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 25 Minuten belassen, bei 2500 g für 15 Minuten zentrifugiert, und das Sediment wird in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf Minimalplatten ausplattiert (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56), die 1,0 M Saccharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl, um das Hintergrundwachstum zu inhibieren, enthalten. Nach einer Inkubation für 4–7 Tage bei 37 °C werden die Sporen gepickt und ausgestrichen, um einzelne Kolonien zu erhalten. Dieses Verfahren wird wiederholt, und die Sporen einer Einzelkolonie nach der zweiten Reisolierung werden als eine definierte Transformante aufbewahrt.
Test von Transformanten von A. oryzae
Jede der Transformanten wurde in 10 ml YPM inokuliert und weitergeführt. Nach 2–5 Tagen der Inkubation bei 37 °C wurden 10 ml Überstand entnommen. Die Endoglucanase-Aktivität wurde, wie oben beschrieben, mittels AZCL-HE-Zellulose identifiziert.
Hybridisierungsbedingungen (die bei der Bewertung der Eigenschaft ii) des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts verwendet werden sollen):
Geeignete Bedingungen für die Bestimmung der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz schließen das Voreinweichen des Filters, der die zu hybridisierenden DNA-Fragmente oder RNA enthält, in 5× SSC (Standard-Salinecitrat) für 10 min und die Prähybridisierung des Filters in einer Lösung von 5× SSC (Sambrook et al. 1989), 5× Denhardtslösung (Sambrook et al. 1989), 0,5 % SDS und 100 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA (Sambrook et al. 1989), gefolgt von einer Hybridisierung in der gleichen Lösung, die eine random-geprimte (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6–13), mit ³²P-dCTP markierte Sonde (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) enthält, für 12 Stunden bei ca. 45 °C ein. Der Filter wird dann zweimal für 30 Minuten in 2× SSC, 0,5 % SDS, bei vorzugsweise nicht höher als 50 °C, mehr bevorzugt nicht höher als 55 °C, mehr bevorzugt nicht höher als 60 °C, mehr bevorzugt nicht höher als 65 °C, noch mehr bevorzugt nicht höher als 70 °C, besonders nicht höher als 75 °C, gewaschen.
Die bei der Hybridisierung zu verwendende Nukleotidsonde ist die DNA-Sequenz, die dem die Endoglucanase kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz und/oder der aus dem Plasmid in S. cerevisiae DSM 10081 erhältlichen DNA-Sequenz entspricht.
Immunologische Kreuzreaktivität:
Antikörper, die bei der Bestimmung der immunologischen Kreuzreaktivität verwendet werden sollen, können unter Verwendung einer gereinigten Zellulase hergestellt werden. Genauer gesagt, kann ein Antiserum gegen die erfindungsgemäße Zellulase erzeugt werden, indem Kaninchen (oder andere Nagetiere) gemäß dem von N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (genauer S. 27–31) beschriebenen Verfahren immunisiert werden. Gereinigte Immunglobuline können aus den Antiseren z. B. durch Salzfällung ((NH₄)₂SO₄) gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex, gewonnen werden. Die immunchemische Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Outcherlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, S. 655–706), durch Kreuzimmunelektrophorese (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4), oder durch Raketenimmunoelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
Medien

YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O ad 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20 % Glucose (sterilfiltriert) zugegeben.
YPM: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O ad 900 ml. Autoklaviert, 100 ml 20 % Maltodextrin (sterilfiltriert) zugegeben.
10× Basalsalz: 75 g Hefe-Stickstoff-Base, 113 g Bernsteinsäure, 68 g NaOH, H₂O ad 1000 ml, sterifiltriert.
SC-URA: 100 ml 10× Basalsalz, 28 ml 20 % Casamino-Acids ohne Vitamine, 10 ml 1 % Tryptophan, H₂O ad 900 ml, autoklaviert, 3.6 ml 5 % Threonin und 100 ml 20 % Glucose oder 20 % Galactose zugegeben.
SC-URA-Agar: SC-URA, 20 g/l Agar zugegeben.
PD-Agar: 39 g Kartoffel-Dextrose-Agar, DIFCO 0013; entionisiertes Wasser bis zu 1000 ml zugeben; autoklavieren (121 °C für 15–20 min).
PC-Agar: Kartoffeln und Karotten (zerrieben, jeweils 20 g) und Wasser, zugegeben bis zu 1000 ml, werden für 1 std gekocht; Agar (20 g/l Merck 1614); autoklaviere (121 °C für 20 min).
PC-Flüssigbrühe: wie PC-Agar, aber ohne Agar.
PD-Flüssigbrühe: 24 g Kartoffel-Dextrose-Brühe, Difco 0549, entionisiertes Wasser bis zu 1000 ml; autoklaviere (121 °C für 15–20 min).
PC- und PD-Flüssigbrühe ohne Zellulose: gebe 30 g Solcafloc (Dicacel, erhältlich von Dicalite-Europe-Nord, 9000 Gent, Belgien) je 1000 ml zu.
PB-9-Flüssigbrühe: 12 g Rofec (Roquette 101–0441) und 24 g Glucose warden zu 1000 ml Wasser zugegeben; der pH wird auf 5,5 eingestellt; 5 ml Mineralöl und 5 g CaCo₃ werden je 1000 ml zugegeben. Autoklaviere (121 °C für 40 min).
YPG-Flüssigbrühe: 4 g Hefeextrakt (Difco 0127), 1 g KH₂PO₄ (Merck 4873), 0,5 g MgSO₄ × 7H₂O, Merck 5886, 15 g Dextrose, Roquette 101–0441, 0,1 ml Pluronic (101–3088); entionisiertes Wasser bis zu 1000 ml; autoklaviere (20 min bei 121 °C).
Verdünnte Salzlösung (DS): Stelle zwei Stammlösungen her:
P-Stammlösung: 13,61 g KH₂PO₄, 13,21 g (NH₄)₂PO₄, 17,42g KH₂PO₄, entionisiertes Wasser bis zu 100 ml.
Ca/Mg-Stammlösung: 7,35 g CaCl₂ × 2H₂O, 10,17 g MgCl₂ × 6H₂O, entionisiertes Wasser bis zu 100 ml; pH eingestellt auf 7,0; Autoklavieren (121 °C, 20 min).
Mische 0..5 ml P-Stammlösung mit 0,1 ml Ca/Mg-Stammlösung, gebe entionisiertes Wasser bis zu 1000 ml zu.
AZCL-HE-Zellulose (Megazyme, Australia).

Verwendungen
Während des Waschens und Tragens wird Farbstoff aus gefärbten Textilerzeugnissen oder Kleidung normalerweise ausbluten, die dann verblasst und getragen aussieht. Die Entfernung von Oberflächenfasern aus dem Textilerzeugnis wird die ursprünglichen Farben und das ursprüngliche Aussehen des Textilerzeugnisses zum Teil wiederherstellen. Mit dem Ausdruck „Farbklärung", wie er hierin verwendet wird, ist die teilweise Wiederherstellung der anfänglichen Farben des Textilerzeugnisses oder der Kleidung während mehrerer Waschzyklen gemeint.
Der Ausdruck „Depilling" bezeichnet das Entfernen von Knötchen von der Stoffoberfläche.
Der Ausdruck „Einweichflüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in die die Wäsche eingetaucht werden kann, bevor sie einem herkömmlichen Waschverfahren unterzogen wird. Die Einweichflüssigkeit kann einen oder mehrere Bestandteile enthalten, die üblicherweise in einem Wasch- oder Wäschereiverfahren verwendet werden.
Der Ausdruck „Waschflüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in der die Wäsche einem Waschverfahren, d. h. normalerweise einer kombinierten chemischen und mechanischen Einwirkung, entweder manuell oder in einer Waschmaschine, unterzogen wird. Üblicherweise ist die Waschflüssigkeit eine wässrige Lösung einer Pulver- oder Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung.
Der Ausdruck „Spülflüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in die die Wäsche eingetaucht und darin behandelt wird, gewöhnlicherweise unmittelbar nachdem sie einem Waschverfahren unterzogen wurde, um die Wäsche zu spülen, d. h. im Wesentlichen die Waschmittellösung aus der Wäsche zu entfernen. Die Spülflüssigkeit kann eine Textilerzeugnis-Ausrüstungs- oder -Weichmacherzusammensetzung enthalten.
Die Wäsche, die dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen wird, kann eine gewöhnliche waschbare Wäsche sein. Vorzugsweise besteht der Hauptteil der Wäsche aus genähten oder ungenähten Textilerzeugnissen, einschließlich Strickerzeugnissen, Webwaren, Denims, Garnen und Handtuchstoffen, die aus Baumwolle, Baumwollgemischen oder natürlichen oder künstlichen Zellulosematerialien (d. h. die von Xylan-enthaltenden Zellulosefasern, so wie von Holzschliff, abstammen) oder Mischungen davon hergestellt sind. Beispiele von Mischungen sind Mischungen von Baumwolle oder Rayon/Viskose mit einem oder mehreren Begleitmaterialien, so wie Wolle, Kunstfasern (z. B. Polyamidfasern, Acrylfasern, Polyesterfasern, Polyvinylalkoholfasern, Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstoff-Fasern,. Aramidfasern) und Zellulose enthaltende Fasern (z. B. Rayon/Viskose, Ramie, Flachs/Leinen, Jute, Zelluloseacetatfasern, Lyocell).
Waschmittelzusammensetzungen
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die vorliegenden Endoglucanasen typischerweise Bestandteile einer Waschmittelzusammensetzung sein. Als solche können sie in der Waschmittelzusammensetzung in der Form eines nicht- staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms enthalten sein. Nicht-staubende Granulate können, z. B. wie in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide für Novo Industri A/S) beschrieben, hergestellt sein und können wahlweise mittels in der Technik bekannter Verfahren beschichtet sein. Beispiele von wachsartigen Beschichtungsmaterialien sind Polyethylenoxid-Produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit einem mittleren Molekulargewicht von 1.000 bis 20.000; ethoxylierte Nonylphenole, die 16 bis 50 Ethylenoxid-Einheiten aufweisen; ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in denen 15 bis 80 Ethylenoxid-Einheiten vorliegen; Fettalkohole; Fettsäuren und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele von filmbildenden Beschichtungsmaterialien, die für die Aufbringung mittels Flüssigbettverfahren geeignet sind, sind in dem Patent GB 1483591 angegeben. Flüssige Enzymzubereitungen können zum Beispiel durch das Zugeben eines Polyols, so wie Propylenglycol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure oder Borsäure gemäß etablierten Verfahren, stabilisiert sein. Andere Enzymstabilisatoren sind in der Technik wohlbekannt. Geschützte Enzyme können gemäß des in EP 238,216 offenbarten Verfahrens hergestellt werden.
Die erfindungsgemäße Waschmittelzusammensetzung kann in jeder beliebigen zweckmäßigen Form, z. B. als Pulver, Granula, Paste oder Flüssigkeit, vorliegen. Ein Flüssigwaschmittel kann wässrig sein, typischerweise bis zu 70 % Wasser und 0–30 % organisches Lösungsmittel enthalten, oder nicht-wässrig sein.
Die Waschmittelzusammensetzung umfasst ein oder mehrere Tenside, von denen jedes anionisch, nichtionisch, kationisch oder zwitterionisch sein kann. Das Waschmittel wird typischerweise 0–50 % anionisches Tensid, so wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkohol-Ethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäre Alkansulfonate (SAS), alpha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure oder Seife, enthalten. Es kann auch 0 bis 40 % nichtionisches Tensid, so wie Alkoholethoxylat (AEO oder AE), carboxylierte Alkoholethoxylate, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglycosid, Alkyldimethylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäuremonoethanolamid, Fettsäuremonoethanolamid oder Polyhydroxyalkylfettsäureamid (z. B. wie in WO 92/06154 beschrieben), enthalten.
Die Waschmittelzusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere Enzyme, so wie Amylase, Lipase, Cutinase, Protease, Peroxidase und Oxidase, z. B. Laccase, enthalten.
Das Waschmittel kann 1–65 % eines Waschmittel-Builders oder Komplexbildners, so wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), Alkyl- oder Alkenylbernsteinsäure, lösliche Silikate oder Schichtsilikate (z. B. SKS-6 von Hoechst), enthalten. Das Waschmittel kann auch „unbuilt", d. h. im Wesentlichen frei von Waschmittel-Builder, sein.
Das Waschmittel kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylzellulose (CMC), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenglykol (PEG), Polyvinylalkohol (PVA), Polycarboxylate, so wie Polyacrylate, Malein-/Acrylsäure-Copolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymere.
Das Waschmittel kann ein Bleichsystem enthalten, das eine H₂O₂-Quelle, so wie ein Perborat oder Percarbonat, enthält, die mit einem Persäure-bildenden Bleichaktivator, so wie Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS), kombiniert sein kann. Alternativ kann das Bleichsystem Peroxysäuren von z. B. dem Amid-, Imid- oder Sulfontyp umfassen.
Die Enzyme der erfindungsgemäßen Waschmittelzusammensetzung können unter Verwendung konventioneller Stabilisierungsmittel, z. B. eines Polyols, so wie Propylenglykol oder Glycerin, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure, Borsäure oder eines Borsäurederivats, so wie z. B. eines aromatischen Boratesters, stabilisiert sein, und die Zusammensetzung kann, wie z. B. in WO 92/19709 und WO 92/19705 beschrieben, formuliert sein.
Das Waschmittel kann auch andere herkömmliche Waschmittelbestandteile, so wie z. B. Textilerzeugnis-Ausrüstungen, einschließlich Tonen, schaumbildenden Zusätzen, Schaumunterdrückern, Korrosionsschutzmitteln, Schmutz-Suspendiermitteln, Anti-Schmutzablagerungsmitteln, Farbstoffen, Bakteriziden, optischen Aufhellern oder Parfum, enthalten.
Der pH (in wässriger Lösung bei Gebrauchskonzentration gemessen) wird gewöhnlich neutral oder alkalisch, z. B. in dem Bereich von 7–11, sein.
Besondere Formen der Waschmittelzusammensetzungen innerhalb des Umfangs der Erfindung schließen ein:

1) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
2) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
3) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von mindestens 600 g/l aufweist, umfassend
4) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
5) Eine wässrige Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung, umfassend
6) Eine wässrige, strukturierte Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung, umfassend
7) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
8) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, umfassend
9) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, umfassend
10) Eine wässrige Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung, umfassend
11) Eine wässrige Flüssigwaschmittel-Zusammensetzung, umfassend
12) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
13) Wie in 1)-12) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen, worin das gesamte oder ein Teil des linearen Alkylbenzolsulfonats durch C₁₂-C₁₈-Alkylsulfat ersetzt ist.
14) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
15) Eine Waschmittelzusammensetzung, die als ein Granulat formuliert ist, das eine Schüttdichte von wenigstens 600 g/l aufweist, umfassend
16) Wie in 1)-15) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen, die eine stabilisierte oder eingekapselte Persäure entweder als einen zusätzlichen Bestandteil oder als einen Ersatz für bereits angegebene Bleichsysteme enthalten.
17) Wie in 1), 3), 7), 9) und 12) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen, worin Perborat durch Percarbonat ersetzt ist.
18) Wie in 1), 3), 7), 9), 12), 14) und 15) beschriebene Waschmittelzusammensetzungen, die zusätzlich einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann z. B. eine der in „Efficient manganese catalysts for lowtemperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639 beschriebenen Verbindungen sein.
19) Waschmittelzusammensetzung, die als eine nicht-wässrige Waschmittelflüssigkeit formuliert ist, die ein flüssiges, nichtionisches Tensid, so wie z. B. linearen, alkoxylierten, primären Alkohol, ein Builder-System (z. B. Phosphat), Enzym und Alkali umfasst. Das Waschmittel kann auch ein anionisches Tensid und/oder ein Bleichsystem umfassen.

Die Endoglucanase kann in Konzentrationen enthalten sein, die üblicherweise in Waschmitteln verwendet werden. Gegenwärtig wird erwartet, dass die Zellulase in der erfindungsgemäßen Wäschereizusammensetzung in einer Menge zugesetzt werden kann, die 0,0001–10 mg (berechnet als reines Enzymprotein) der Zellulase pro Liter Waschflüssigkeit entspricht.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Endoglucanase typischerweise ein Bestandteil einer Textilerzeugnis-Ausrüstungs- oder -Weichmacherzusammensetzung sein. Beispiele von üblichen Weichmacherzusammensetzungen sind z. B. in EP 0 233 910 offenbart.
Textilanwendungen
Gemäß einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase in dem Biopolishing-Verfahren. Das Biopolishing ist die spezifische Behandlung der Garnoberfläche, die die Qualität des Textilerzeugnisses im Hinblick auf die Handhabung und das Aussehen ohne Verlust der Benetzbarkeit des Textilerzeugnisses verbessert. Die wichtigsten Wirkungen des Biopolishings können als weniger Fussel- und Knötchenbildung, verstärkter Glanz/Schimmer, verbesserte Handhabung des Textilprodukts, verbessert dauerhafte Weichheit und veränderte Wasseraufnahme charakterisiert werden. Das Biopolishing findet typischerweise während der Nassverarbeitung der Herstellung gestrickter und gewebter Textilerzeugnisse statt. Die Nassverarbeitung umfasst solche Schritte wie z. B. Entschlichten, Spülen, Bleichen, Waschen, Färben/Drucken und Ausrüsten. Während jedes dieser Schritte wird das Textilerzeugnis in stärkerem oder geringerem Maße einer mechanischen Einwirkung unterzogen. Im Allgemeinen wird das Textilerzeugnis, nachdem die Textilerzeugnisse gestrickt oder gewoben wurden, einem Entschlichtungsschritt unterzogen, dem ein Spülschritt folgt, usw.. Das Entschlichten ist der Vorgang, bei dem die Größe der Textilien verringert wird. Vor dem Weben auf mechanischen Webstühlen werden Webgarne häufig mit Schlichtstärke oder Stärkederivaten beschichtet, um ihre Zugstärke zu erhöhen. Nach dem Weben muss die Schlichtbeschichtung entfernt werden, bevor das Textilerzeugnis weiter verarbeitet wird, um ein homogenes und waschfestes Ergebnis sicher zu stellen. Es ist bekannt, dass eine Kombination einer zellulytischen und mechanischen Einwirkung erforderlich ist, um die Wirkungen des Biopolishings zu erreichen. Es ist auch bekannt, dass eine „Superweichheit" erreicht werden kann, wenn die Behandlung mit einer Zellulase mit einer herkömmlichen Behandlung mit Weichmachern kombiniert wird. Es wird erwartet, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase für das Biopolishing von Zellulose-Textilerzeugnissen vorteilhaft ist, z. B. kann ein gründlicheres Polishing erreicht werden. Das Biopolishing kann erreicht werden, indem das z. B. in WO 93/20278 beschriebene Verfahren angewendet wird.
Stone-Washing
Es ist bekannt, ein „stonewashed„-Aussehen (örtliches Abtragen der Farbe) bei gefärbten Textilerzeugnissen, speziell bei Denim-Textilerzeugnissen oder Jeans, durch Waschen von entweder dem Denim oder der aus solche einem Textilerzeugnis hergestellten Jeans in der Anwesenheit von Bimsstein, um die gewünschte, örtliche Aufhellung der Farbe des Textilerzeugnisses zu erzeugen, oder durch enzymatische Behandlung des Textilerzeugnisses, insbesondere mit zellulytischen Enzymen, bereit zu stellen. Die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Endoglucanase kann entweder alleine, so wie in US 4,832,864 offenbart, gemeinsam mit einer geringeren Menge an Bimsstein als in dem herkömmlichen Verfahren erforderlich, oder gemeinsam mit Perlit, so wie in WO 95/09225 offenbart, durchgeführt werden.
Zellstoff- und Papieranwendungen
In der Papier herstellenden Zellstoffindustrie kann die erfindungsgemäße Endoglucanase vorteilhafterweise z. B. wie folgt angewendet werden:

– Für das Entrinden: die Vorbehandlung mit der Endoglucanase kann die Kambiumschicht vor dem Entrinden in mechanischen Trommeln abbauen, was zu vorteilhaften Energieeinsparungen führt.
– Für den Holzaufschluss: die Behandlung eines Materials, das Zellulosefasern enthält, mit der Endoglucanase vor dem Refiner-Mahlen oder dem Mahlen kann zu einer Verringerung des Energieverbrauchs auf Grund der hydrolysierenden Wirkung der Zellulase an den Zwischenfaser-Oberflächen führen. Die Verwendung der Endoglucanase kann zu verbesserten Energieeinsparungen im Vergleich zu der Verwendung von bekannten Enzymen führen, weil angenommen wird, dass die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung eine höhere Fähigkeit, die Faserwände zu durchdringen, besitzen kann.
– Für die Fasermodifizierung, d. h. die Verbesserung der Fasereigenschaften, sofern eine teilweise Hydrolyse über die Faserwand erforderlich ist, die tiefer eindringende Enzyme erfordert (z. B. um grobe Fasern flexibler zu machen). Die tiefe Behandlung von Fasern war bisher für Hochausbeute-Zellstoffe, z. B. mechanische Zellstoffe oder Mischungen von recyled-Zellstoffen nicht möglich. Dies wurde der Natur der Faserwandstruktur zugeschrieben, die den Durchtritt der Enzymmoleküle auf Grund der physikalischen Begrenzung der Porenmatrix der Faserwand verhindert. Es wird erwartet, dass die vorliegende Endoglucanase fähig ist, in die Faserwand einzudringen.
– Für die Verbesserung der Entwässerung. Die Entwässerbarkeit der Papierherstellungs-Zellstoffen kann durch die Behandlung des Zellstoffs mit hydrolysierenden Enzymen, z. B. Zellulasen, verbessert werden. Die Verwendung der vorliegenden Endoglucanase kann effektiver sein, z. B. zu einem höheren Grad der Lockerung von Bündeln stark hydratisierter Mikrofibrillen in der Feinanteil-Fraktion (die aus Fasertrümmern besteht) führen, die die Entwässerungsgeschwindigkeit durch Blockieren der Hohlräume zwischen den Fasern und dem Drahtnetzgeflecht der Papiermaschine begrenzt. Der Kanadische Standardmahlgrad (CSF) nimmt zu, und der Schopper-Riegler-Entwässerungsindex nimmt ab, wenn der Zellstoff einer Zellulasebehandlung unterzogen wird, siehe z. B. US-Patent 4,923,565; TAPPI T227, SCAN C19:65.ence.
– Für die Zwischenfaserbindung. Hydrolytische Enzyme werden bei der Herstellung von Papierherstellungs-Zellstoffen für die Verbesserung der Zwischenfaserbindung eingesetzt. Die Enzyme spülen Verunreinigungen, z. B. Zellulosetrümmer, von den Faseroberflächen ab und vergrößern somit die Fläche der exponierten Zellulose, die an der Faserwand anhaftet, wodurch die Wasserstoffbindungskapazität zwischen den Fasern verbessert wird. Dieses Verfahren wird auch als Enthornung („dehornification") bezeichnet. Papier und Karton, die mit einer Zellulase enthaltenden Enzymzubereitung hergestellt werden, können eine verbesserte Stärke oder ein verringertes Quadratmetergewicht, eine glattere Oberfläche und eine verbesserte Bedruckbarkeit aufweisen.
– Für das enzymatische De-inken. Die teilweise Hydrolyse von wieder gewonnenem Papier während oder nach dem Holzaufschluss unter Verwendung von hydrolysierenden Enzymen, sowie Zellulasen, erleichtert bekanntlich das Entfernen und das Zusammenballen von Tintenpartikeln. Die Verwendung der vorliegenden Endoglucanase kann auf Grund eines besseren Eindringens der Enzymmoleküle in die fibrilläre Matrix der Faserwand, wobei die Oberfläche weicher gemacht wird, wodurch die Tintenpartikel wirksamer gelöst werden, zu einer wirksameren Ablösung der Tinte von der Oberflächenstruktur führen. Das Zusammenballen der gelösten Tintenpartikel wird auf Grund einer wirksameren Hydrolyse von Zellulosefragmenten, von den gefunden wird, dass sie an Tintenpartikeln anhaften, die von den Fasern abstammen, ebenfalls verbessert.

Die Behandlung der Lignozellulose-Zellstoff kann z. B. wie in WO 91/14819, WO 91/14822, WO 92/17573 und WO 92/18688 beschrieben, durchgeführt werden.
Abbau von Pflanzenmaterial
In einer noch weiteren Ausführung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase und/oder Enzymzubereitung für den Abbau von Pflanzenmaterial, z. B. Zellwänden.
Es wird erwartet, dass die neue, erfindungsgemäße Endoglucanase und/oder Enzymzubereitung bei der Herstellung von Wein, Frucht- oder Gemüsesaft nützlich ist, um die Ausbeute zu erhöhen. Erfindungsgemäße Endoglucanasen können auch für die enzymatische Hydrolyse verschiedener von Pflanzenzellwänden abgeleiteter Materialien oder Abfallmaterialien, z. B. landwirtschaftlicher Rückstände, so wie Weizenstroh, Maiskolben, gesamte Maispflanzen, Nussschalen, Gras, Pflanzenhüllen, Bohnenhülsen, Treber, Zuckerrübenpulpe und dergleichen, verwendet werden. Das Pflanzenmaterial kann abgebaut werden, um verschiedene Arten der Verarbeitung zu verbessern, die Reinigung oder Extraktion von anderen Bestandteilen, wie die Reinigung von beta-Glucan oder beta-Glucan-Oligomeren aus Getreiden, zu erleichtern, den Nährwert zu verbessern, die Wasserbindungskapazität zu verringern, die Abbaubarkeit in Kläranlagen zu verbessern, die Umwandlung von z. B. Gras und Mais in Silage zu verbessern, etc.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
BEISPIEL 1
Zellulytische Enzyme aus 4 Pilzen, die zu 3 Familien aus zwei Ordnungen innerhalb der Ascomycetes gehören, wurden durch Expressionsklonierung entdeckt; entsprechende DNA-Sequenzen wurden bestimmt; die Enzyme wurden heterolog exprimiert und durch Flüssigfermentation produziert, charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass sie in Farbklärungstests eine gute Wirksamkeit zeigen.
Die Isolate CBS 117.65, CBS 478.94, NRRL 8126 und ATCC 10523 wurden in Schüttelflaschenkulturen mit mit Kartoffel-Dextrose-Brühe angereicherter Zellulose wachsen gelassen, die für 5 Tage bei 26 °C (Schüttelbedingungen 150 upm) inkubiert wurden.
A. Klonierung und Expression einer Endoglucanase von Myceliophthora thermophila, Acremonium sp. und Thielavia terrestris und Volutella colletotrichoides
mRNA wurde aus Myceliophthora thermophila, Acremonium sp., Thielavia terrestris bzw. Volutella colletotrichoides isoliert, die in einem Zellulose enthaltenden Fermentationsmedium unter Bewegung, um eine ausreichende Belüftung sicher zu stellen, wachsen gelassen wurden. Die Mycelien wurden nach 3–5 Tagen Wachstum geerntet, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert. Bibliotheken von Myceliophthora thermophila, Acremonium sp., Thielavia terrestris bzw. Volutella colletotrichoides, die jeweils aus in etwa 10⁶ Einzelklonen bestanden, wurden in E. coli, wie beschrieben, mit einem Vektorhintergrund von 1 % konstruiert.
Die Plasmid-DNA aus einigen der Pools aus jeder Bibliothek wurden in Hefe transformiert, und 50–100 Platten, die 25000 Hefekolonien enthielten, wurden aus jedem Pool erhalten.
Endoglucanase-positive Kolonien wurden auf SC-Agar-Platten mit dem AZCL-HE-Zellulosetest identifiziert und isoliert. Die cDNA-Inserts wurden, wie in dem Abschnitt Material und Methoden, oben, beschrieben, direkt aus den Hefekolonien amplifiziert und charakterisiert.
Die DNA-Sequenz der cDNA, die die Endoglucanase aus Myceliophthora thermophia kodiert, ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz ist ebenfalls in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die cDNA ist aus dem Plasmid in DSM 9770 erhältlich.
Die DNA-Sequenz der cDNA, die die Endoglucanase aus Acremonium sp. kodiert, ist in SEQ ID Nr. 4 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 5 gezeigt. Die cDNA ist aus dem Plasmid in DSM 10082 erhältlich.
Die DNA-Sequenz der cDNA, die die Endoglucanase aus Thielavia terrestris kodiert, ist in SEQ ID Nr. 8 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 9 gezeigt. Die cDNA ist aus dem Plasmid in DSM 10081 erhältlich.
Die DNA-Sequenz der cDNA, die die Endoglucanase aus Volutella colletotrichoides kodiert, ist in SEQ ID Nr. 16 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 17 gezeigt. Die cDNA ist aus dem Plasmid in DSM 10571 erhältlich.
Die Gesamt-DNA wurde aus einer Hefekolonie isoliert, und die Plasmid-DNA wurde durch Transformation von E. coli, wie oben beschrieben, gerettet. Um die Endoglucanase in Aspergillus zu exprimieren, wurde die DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten, der Größe nach auf einem Gel fraktioniert, und ein Fragment, das dem Endoglucanasegen von Myceliophthora thermophila, Acremonium sp., Thielavia terrestris bzw. Volutella colletotrichoides entsprach, wurde gereinigt. Die Gene wurden nachfolgend an pHD414 ligiert, mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten, was zu den Plasmiden pA2C193, pA2C357, pA2C385 bzw. pA2C488 führte.
Nach der Amplifizierung der DNA in E. coli wurden die Plasmide, wie oben beschrieben, in Aspergillus oryzae transformiert.
Test von Transformanten von A. oryzae
Jede der Transformanten wurde, wie oben beschrieben, auf Endoglucanase-Aktivität getestet. Einige der Transformanten wiesen eine Endoglucanase-Aktivität auf, die signifikant höher als der Hintergrund von Aspergillus oryzae war. Dies zeigte eine effiziente Expression der Endoglucanasen in Aspergillus oryzae. Die Transformanten mit der höchsten Endoglucanase-Aktivität wurden ausgewählt und in eine 500-ml-Schüttelflasche mit YPM-Medien inokuliert. Nach 3–5 Tagen der Fermentation unter ausreichender Bewegung, um eine gute Belüftung sicherzustellen, wurde die Kulturbrühe für 10 min bei 2000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde gewonnen.
B. Bestimmung der Endoglucanase-Aktivität
Die zellulytische Aktivität der Endoglucanase kann im Vergleich zu einem analytischen Standard bestimmt und in der Einheit S-CEVU ausgedrückt werden.
Zellulytische Enzyme hydrolysieren CMC, wodurch sie die Viskosität des Inkubationsgemisches verringern. Die resultierende Abnahme der Viskosität kann mittels eines Scheibenviskosimeters (z. B. MIVI 3000 von Sofraser, Frankreich) bestimmt werden.
Die Bestimmung der zellulytischen Aktivität, die als S-CEVU gemessen wird, kann gemäß des Analyseverfahrens AF 301.1 bestimmt werden, das von dem Anmelder auf Anfrage erhältlich ist.
Der S-CEVU-Test quantifiziert die Menge der katalytischen Aktivität, die in der Probe vorhanden ist, wobei die Fähigkeit der Probe, die Viskosität einer Lösung von Carboxymethylzellulose (CMC) zu verringern, gemessen wird. Der Test wird bei 40 °C, pH 7,5, unter Verwendung eines relativen Enzymstandards für die Verringerung der Viskosität des CMC-Substrats durchgeführt.
Test für die Bestimmung der Endoglucanase-Aktivität in Form von SAVI-Einheiten unter Verwendung von in Phosphorsäure geschwollener Zellulose (PASC):
Definition:

1 SAVI-U ist die Menge an Enzym, die eine Menge an reduzierenden Kohlenhydraten bildet, die 1 μmol Glucose pro Minute entspricht.

Versuchsbedingung:

Enzymlösung: 0,5 ml
4 g/l PASC in 0,1 M Puffer: 2,0 ml
20 min., 40 °C

Empfindlichkeit:

Max 0,1 SAVIU/ml = in etwa 1 S-CEVU/ml (CMC-Viskosität)
Min 0,01 SAVIU/ml = in etwa 0,1 S-CEVU/ml

Bestimmung der Bildung von reduzierenden Zuckern:
Der Test auf reduzierende Gruppen wurde nach Lever, M., A new reaction for colormetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. 1972, Bd. 47 (273–279) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde hergestellt, indem 1,5 g p-Hydroxybenzoesäure-Hydrazid (PHBAH) mit 5 g Natriumtartrat in 100 ml 2 % Natriumhydroxid gemischt wurden.
Substrat:
Die PASC-Stammlösung wurde auf die folgende Weise hergestellt, wobei eiskaltes Aceton und Phosphorsäure verwendet wurden. 5 g Zellulose (Avicel^®) wurden mit Wasser angefeuchtet, und 150 ml eiskalte 85%ige ortho-Phosphorsäure wurden zugegeben. Die Mischung wurde unter langsamem Rühren für 1 std in ein Eisbad gestellt. Dann wurden 100 ml eiskaltes Aceton unter Rühren zugegeben. Die Aufschlämmung wurde in einen Buchnerfilter mit einer gesinterten Pyrexfritte Nr. 3 gegeben und dann dreimal mit 100 ml eiskaltem Aceton gewaschen und nach jedem Waschen so trocken wie möglich gesaugt. Schließlich wurde der Filterkuchen zweimal mit 500 ml Wasser gewaschen und nach jedem Waschen so trocken wie möglich gesaugt. Das PASC wurde mit entionisiertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 300 ml gemischt, bis zur Homogenität (unter Verwendung des Ultra-Turrax-Homogenisators) gemixt und im Kühlschrank gelagert (bis zu einem Monat).

Substratäquilibrierung mit Puffer: 20 g Stammlösung der in Phosphorsäure geschwollenen Zellulose, PASC, wurden für 20 min bei 5000 upm zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen, das Sediment wurde in 30 ml Puffer resuspendiert und für 20 min bei 5000 upm zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen, und das Sediment wurde in Puffer bis zu einem Gesamtgewicht von 60 g resuspendiert, was einer Substratkonzentration von 5 g Zellulose/Liter entsprach.
Puffer für die pH-8,5-Bestimmung: 0,1 M Barbital.
Puffer für die pH-10-Bestimmung: 0,1 M Glycin.

Verfahren:
1. Verdünnung von Enzymproben
Die Enzymlösung wird in dem gleichen Puffer wie das Substrat verdünnt.
2. Enzymreaktion
Die Lösung des Substrats in dem Puffer wird für 5 min bei 40 °C erhitzt (2 ml).
Dann werden 0,5 ml der Enzymlösung (verdünnt auf zwischen 0,2 und 1 S-CEVU/ml) zugegeben und für 5 sek. gemischt. Enzymleerwerte werden erhalten, indem das Stoppreagens vor der Enzymlösung zugegeben wird. Für 20 min bei 40 °C inkubieren. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml 2 % NaOH-Lösung und Mischen für 5 sek abgestoppt.
Die Proben werden für 20 min bei 5000 upm zentrifugiert. 1 ml Überstand wird mit 0,5 ml PHBAH-Reagens gemischt und für 10 min gekocht. Die Teströhrchen werden in einem Eiswasserbad abgekühlt.
3. Bestimmung von reduzierenden Endgruppen:
Die dekadische Extinktion bei 410 nm wird unter Verwendung eines Spektralphotometers gemessen. Leerwerte werden durch Zugabe von Natriumhydroxid vor der Zugabe der Enzymlösung hergestellt.
Eine Standard-Glucosekurve wurde unter Verwendung von Glucosekonzentrationen von 5, 10, 15 und 25 mg/l in dem gleichen Puffer und durch Zugabe von PHBAH-Reagens vor dem Kochen erhalten. Die Freisetzung von reduzierendem Glucoseäquivalent wird unter Verwendung dieser Standardkurve berechnet.
4. Berechnung der katalytischen Aktivität:
Messen der dekadischen Extinktion bei 410 nm

1) Standardkurve (Glucose) – (H₂O) gegen Konzentration der Glucose
2) Enzymprobe (Probe) – (Leerwert)

Berechne die Glucosekonzentration gemäß einer Standardkurve
C. Reinigung und Charakterisierung der Endoglueanase aus M. thermophila
Aspergillus oryzae, das mit pA2C193 transformiert war, wurde auf YPM-Medium für 4 Tage wachsen gelassen. Die Flüssigkeit wurde dann zentrifugiert und sterilfiltriert.
Die Probe wurde mittels Ultrafiltration in AMICON-Zellen unter Verwendung einer DOW-Membran GR61PP mit einem Ausschluss von 20 kD konzentriert. Das Uf-Konzentrat wurde bezüglich S-CEVU/ml und SaviU/ml mit dem folgenden Ergebnis analysiert:
Reinigung:
2 ml des UF-Konzentrats wurde 5fach verdünnt, um die Ionenstärke zu verringern, und durch einen 0,22-μm-Scheibenfilter filtriert. Diese Probe wurde auf eine Mono Q^® HR5/5 Pharmacia-Säule aufgetragen, die mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5, (Puffer A) und einem Fluss von 1 ml/min äquilibriert war. Nach dem Waschen mit dem Puffer A bis zur Grundlinie wurde die Säule mit einem Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 1 M NaCl enthielt (Puffer B) eluiert, der Eluierungsgradient betrug 0–50 % Puffer B in 1 Stunde.
Nach 36 min zeigte sich ein Peakkomplex, 1-ml-Fraktionen wurden aufgefangen, und die ersten 10 Fraktionen zeigten eine Zellulaseaktivität auf CMC/Agarose/Kongorot-Platten.
Diese Fraktionen wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration in AMICON-Zellen, unter Verwendung einer DOW-Membran GR61PP mit einem Ausschluss von 20 kD auf 3 ml konzentriert.
Diese Probe wurde auf eine HiLoad-26/60-Superdex-75^TM-Prep-Grad-Pharmacia-Säule, die mit 100 mM Na-Acetat-Puffer, pH 6,35, äquilibriert war, und mit einer Flussrate von 1 ml/min aufgetragen.
Nach 82 min zeigte sich ein Peak, 1-ml-Fraktionen wurden aufgefangen, und die ersten 10 Fraktionen zeigten eine Zellulaseaktivität auf CMC/Agarose/Kongorot-Platten.
Diese Fraktionen wurden vereinigt, und die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
A₂₈₀ = 0,15
A₂₈₀/A₂₆₀ = 1,62
M_r(SDS) = 22 kD
pI = 3,5–5
Reinheit in SDS-PAGE = 100 %
S-CEVU/ml = 28,5
S-CEVU/A₂₈₀ = 188
S-CEVU/mg = 436
Extinktionskoeffizient = 54880 (berechnet)
M_r(berechnet) = 22 kD
Der Extinktionskoeffizient beruht auf dem Gehalt an Tyrosin, Tryptophan und Cystein, der anhand der beiliegenden SEQ ID Nr. 1 (der Aminosäuresequenz) berechnet wurde. Die SDS-Page wurde auf vorgegossenen NOVEX-Gelen, 4–20 % Tris-Glycin-Gel, 1,0 mm × 10 Vertiefungen, durchgeführt.
Die IEF wurde auf der Pharmacia PAGplate pH 3,5–9,5 durchgeführt, die Aktivität wurde durch Überschichtung mit CMC-Kongorot sichtbar gemacht.
Bestimmung von K_M & k_cat:
k_m und k_cat wurde in der gleichen Weise wie die Bestimmung der SAVI-Units bei pH 8,5 mit einer Substratkonzentration bis zu 8 g/l bestimmt.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
k_cat 38 pro sek,
k_m 5 g/l,
in Phosphorsäure geschwollene Zellulose, pH 8,5.
Spezifische Aktivität auf CMC bei pH 7,5:
436 S-CEVU pro mg Protein.
D. Bestimmung des pH- und Temperaturprofils der Endoglucanase von M. thermophila
Das pH-Profil wurde unter den folgenden Bedingungen bestimmt:
Puffer mit pH-Werten zwischen 2,5 und 10,0 wurden hergestellt, indem 0,1 M Tri-Natriumphosphat mit 0,1 M Zitronensäure gemischt wurde. Die gereinigte Endoglucanase wurde verdünnt, um sicherzustellen, dass die Testantwort sich innerhalb des linearen Bereichs des Tests befindet. Das Substrat war eine 0,4%ige Suspension von AZCL-HE-Zellulose (MegaZyme), die 1:1 mit dem Citrat/Phosphatpuffer bis zu einer Substratendkonzentration von 0,2 % AZCL-HE-Zellulose gemischt wurde. Zu 1 ml Substrat in Eppendorf^®-1,5-ml-Polypropylenröhrchen wurde 10 μl Enzymlösung zugegeben und für 15 Minuten in temperaturkontrollierten Thermomixern von Eppendorf^® inkubiert, bevor die Enzyme für 20 Minuten bei 95 °C in einem separaten Thermomixer hitzeinaktiviert wurden. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, und 200 μl jedes Überstands wurden in eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen überführt, und die OD wurde bei 620 nm in einem ELISA-Reader (Labsystems Multiskan^® MCC/340) gemessen.
Für das pH-Optimum wurden die Inkubationen bei 30 °C durchgeführt. Für jeden pH-Wert wurde zu 3 Röhrchen Enzym zugegeben, und sie wurden vor der Hitzeinaktivierung inkubiert, wogegen zu einem Röhrchen (dem Leerwert) Enzym zugegeben wurde und es sofort hitzeinaktiviert wurde. Der Durchschnittswert der drei inkubierten Proben wurde berechnet, und der Leerwert wurde abgezogen.
Die folgenden pH-Profile wurden bestimmt:
Es wird beobachtet, dass die Endoglucanase mehr als 60 % Aktivität zwischen pH 4,0 und 8,0 und die optimale Aktivität bei pH 5,0–6,0 aufweist.
Temperaturprofil:
Das Temperaturoptimum wurde in der gleichen Weise bei pH 5,5 bestimmt. Die Temperaturen betrugen in dem Bereich von 30 °C bis 80 °C. Für jede Temperatur wurden drei Inkubation durchgeführt und der Durchschnitt berechnet. Drei Leerwerte wurden durch sofortige Hitzeinaktivierung des Enzyms hergestellt, und der Durchschnitt wurde von den Werten der inkubierten Proben abgezogen.
Es wird beobachtet, dass die Endoglucanase die optimale Aktivität bei 50–70 °C aufweist.

Die Temperaturstabilität wurde in der gleichen Weise bei pH 5,5 und 30 °C bestimmt, und außerdem wurden die Enzymlösungen für 1 Stunde auf die eigentliche Temperatur erhitzt und auf Eis abgekühlt. Die Restaktivität ist unten in % der Aktivität einer nicht vorerhitzten Enzymprobe gezeigt:

E. Farbklärung der Myceliophthora-Zellulase (SEQ ID Nr. 1), gemessen als Entfernen von Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Cellulosefasern enthält

Gerät:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	100 ml
Bewegung:	150 Bewegungen/min in einem Vertikalrührer
Spülzeit:	5 min in Leitungswasser
Waschtemp.:	40°
Waschflüssigkeit:	0,05 M Phosphatpuffer
pH:	7,0
Waschzeit:	30 min
Wiederholung:	2
Enzyme:	Myceliophthora SEQ ID Nr. 1B
Dosierung:	500 und 2500 S-CEVU/1
Textilie:	2 Musterabschnitte von gealterter, schwarzer 100 % Baumwolle, 5 × 6 cm (0,9 g)
Trocknung:	Trockenautomat
Auswertung:	Die Lichtremission wird mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers gemessen. Die Remission wird als delta-L gemessen (Hunter Lab-Werte). Wenn die Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, durch die Zellulare entfernt werden, erscheint die Oberfläche des schwarzen Textilerzeugnisses als dunkler, und niedrigere L-Werte werden erhalten.

Die Probe wird mit einer Leerprobe verglichen, d. h. die ohne Enzym gewaschen wurde:
delta-L-Werte verglichen mit der Leerprobe.
Die Daten zeigen, dass die Myceliophthora-Zellulase ohne CBD unter den getesteten Bedingungen eine gute Farbklärung ergibt.
F. Konstruktion der Genfusionen zwischen der Endoglucanase von Myceliophthora thermophila und der 43-kD-Endoglucanase von Humicola insolens
Der Zweck der beiden Konstrukte war die Herstellung von Derivaten der Endoglucanase von M. thermophila mit dem Linker und der CBD der 43-kD-Endoglucanase von H. insolens (offenbart in WO 91/17243). Die native Endoglucanase von M. thermophila weist keinen Linker und/oder keine Zellulose-Bindungsdomäne, CBD, auf.
CM1: Das Konstrukt 1 besteht aus der Endoglucanase von M. thermophila (225 Aminosäuren) und den 72 C-terminalen Aminosäuren der 43-kD-Endoglucanase von H. insolens.
CM2: Das Konstrukt 2 besteht aus der Glucanase von M. thermophila (225 Aminosäuren) und den 83 C-terminalen Aminosäuren der 43-kD-Endoglucanase von H. insolens.
Die cDNA der 43-kD-Endoglucanase von H. insolens wurde auf solch eine Weise in pHD414 kloniert, dass das Endoglucanasegen von dem Taka-Promotor transkribiert wurde. Das resultierende Plasmid wurde pCaHj418 genannt.
Auf eine ähnliche Weise wurde die cDNA, die die Endoglucanase von M. thermophila kodiert, in pHD414 kloniert, und das resultierende Plasmid wurde pA2C193 genannt.
Primer:

Primer 1: 5'- CGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTGCTCCCGTCCCTCCAGCAGCACCAGCTCT CCGG-3'
Primer 2: 5'-CCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAG CTCCG-3'
Primer 3: 5'-CGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTGCTCCCGTAACGACGACGGCAACTTCCCT GCCG-3'
Primer 4: 5'- CGGCAGGGAAGTTGCCGTCGTCGTTACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAGC TCCG-3'
Taka-Pro-Primer: 5' CAACATCACATCAAGCTCTCC-3'
AMG-Term.-Primer: 5' CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3'

Die Endoglucanasefusionen wurden mittels des von Higuchi et al. 1988 beschriebenen PCR-Überlapp-Verlängerungsverfahrens konstruiert.
Konstrukt 1:

Reaktion A: Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um das Fragment von pCaHj418 zwischen dem Primer 1 und dem AMG-Term.-Primer zu amplifizieren (den Linker und die CBD der 43-kD-Endoglucanase von H. insolens).
Reaktion B: PCR-Amplifizierung des Fragments zwischen dem Taka-Pro.-Primer und dem Primer 2 in pA2C193, des Endoglucanasegens von M. thermophila.
Reaktion C: Die beiden gereinigten Fragmente wurden in einer dritten PCR in der Anwesenheit der Primer, die die Gesamtregion flankieren, d. h. des Taka-Pro.-Primers und des AMG-Term.-Primers, verwendet.

Konstrukt 2:
Das gleiche Verfahren wurde verwendet, wobei der Primer 3 bzw. der Primer 4 den Primer 1 und den Primer 2 ersetzten.
Das in der Reaktion C amplifizierte Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsenzymen XbaI und BsstEII gespalten. Das gereinigte, gespaltene Fragment wurde in pA2C193 ligiert, das mit den Restriktionsenzymen XbaI und BsstEII gespalten war.
Kompetente Zellen des Stamms DH5αF' von E. coli (New England Biolabs.) wurden mit dem ligierten Plasmid transformiert, und Kolonien, die die Genfusion enthielten, wurden isoliert. Die Sequenz des klonierten Teils wurde mitels DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die Sequenz des Gens in den beiden Konstrukten ist in SEQ ID Nr. 2A und SEQ ID Nr. 3A gezeigt.
Die Polymerasekettenreaktionen wurden unter Standardbedingungen, wie von Perkin-Elmer empfohlen, durchgeführt.
Die Reaktionen A und B begannen mit 2 min bei 94 °C, gefolgt von 20 Zyklen von (30 sek bei 94 °C, 30 sek bei 50 °C und 1 min bei 72 °C) und endeten mit 4 min bei 72 °C.
Die Reaktion C startete mit (2 min bei 94 °C, 1 min bei 52 °C und 2 min bei 72 °C), gefolgt von 15 Zyklen von (30 sek bei 94 °C, 30 sek bei 52 °C und 90 sek bei 72 °C) und endete mit 4 min bei 72 °C.
Die beiden Konstrukte wurden, wie oben beschrieben, in Aspergillus oryzae transformiert.
G. Reinigung und Charakterisierung von klonierten Zellulasen mit Cellulose-Bindungsdomänen:
Das klonierte Produkt wird nach der Fermentation durch Abtrennen der extrazellulären Flüssigkeit von dem Produktionsorganismus gewonnen. In etwa 1 g Zellulase wird dann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von 150 g Avicel in einer Aufschlämmung mit 20 mm Natriumphosphat, pH 7,5, hochgradig gereinigt.
Das Avicel wird mit der rohen Fermentationsbrühe gemischt, die insgesamt in etwa 1 g Zellulose enthält. Nach dem Mischen bei 4 °C für 20 min wird das Avicel-Enzym in eine Säule mit einer Größe von 50 mal 200 mm (insgesamt in etwa 400 ml) gepackt.
Die Säule wird mit den 200 ml Puffer gewaschen, anschließend mit 0,5 M NaCl in dem gleichen Puffer gewaschen, bis kein weiteres Protein eluiert. Dann wird mit 500 ml 20 mm Tris, pH 8,5, gewaschen. Schließlich wird das reine Protein mit der vollständigen Länge mit 1 % Triethylamin, pH 11,8, eluiert.
Die Lösung des eluierten Enzyms wird auf pH 8 eingestellt und unter Verwendung einer Amicon-Zelleinheit mit einer DOW-GR6IPP-Membran (Polypropylen mit einem Ausschluss von 20 KD) auf über 5 mg Protein pro ml konzentriert. Die gereinigten Zellulasen wurden wie folgt charakterisiert:
Die gereinigten Zellulasen wurden mittels SDS-PAGE bezüglich ihrer M_r analysiert, und die M_r für die Zellulase wurde unter Verwendung des Standard-LMW-Protein-Markerkits von Pharmacia berechnet. Die M_r ist anscheinend höher als die M_r der Zusammensetzung der kodierenden Aminosäuren, und dies auf dem Umstand, dass die Linkerregion Oglycosyliert ist, was zu dieser höheren M_r führt. Der pI wurde unter Verwendung von Pharmacia-Ampholin-PAG-Platten, pH 3,5 bis 9,5, und erneut unter Verwendung eines Pharmacia-Kits mit Proteinen mit bekanntem pI bestimmt.
Der molare Extinktionskoeffizient wurde auf der Basis der Aminosäurezusammensetzung berechnet, wobei die bekannte dekadische Extinktion von Tryptophan, Tyrosin und Cystein verwendet wurde.
Das pH-Aktivitätsprofil wurde unter Verwendung von CMC-Substrat, Inkubation für 20 min bei 40 °C in einem 0,5-pH-Intervall und Messen der Bildung von reduzierenden Zuckern erhalten. Die relative Aktivität bei den verschiedenen pHs wurde berechnet, und die Tabelle enthält das Intervall, in dem mehr als 50 % relative Aktivität gemessen wurde.
Der N-Terminus wurde für die gereinigte Zellulase unter Verwendung eines Applied-Biosystems-Model-473A-Sequencers bestimmt. Der Proteinsequencer wurde nach den Anweisungen des Herstellers betrieben.
Zwei der Zellulasen waren blockiert, dies beruht auf dem N-terminalen Glutamin, das ein Pyroglutamat bildet, das nicht nachgewiesen werden kann und das die weitere Sequenzierung blockiert. Die DSC-Differentialscanning-Kalorimetrie wurde bei neutralem pH (7,0) unter Verwendung eines MicroCalc-Inc.-MC-Kalorimeters mit einer konstanten Scangeschwindigkeit und unter Anhebung der Temperatur von 20 auf 90 °C mit einer Rate von 90 °C pro Stunde durchgeführt.
Erzeugung von Antikörpern. Die Zellulasen von Myceliophthora, Acremonium und Thielavia wurde verwendet, um Antikörper in Kaninchen zu erzeugen. 0,1 mg der gereinigten Zellulase in 0,9 % NaCl-Lösung wurde unmittelbar vor der Injektion mit Freunds Adjuvans gemischt. Die Kaninchen wurden 10 Mal in einwöchigen Intervallen immunisiert. Die Immunglobulin-G-Fraktion (IgG) wurde mittels Ammoniumsulfat-Fällung (25 % Sättigung) gereinigt. Das Präzipitat wurde in Wasser gelöst und dann gründlich gegen Natriumacetat-Puffer (pH 5,0, 50 mM) und alternierend mit entionisiertem Wasser dialysiert. Nach der Filtration wurde die IgG-Fraktion mit Natriumazid (0,01 %) stabilisiert.

Bei der Verwendung der Immundiffusion in Agarplatten bilden alle drei Zellulasen ein einziges Immunpräzipitat mit ihrem homologen Antiserum, und kein Präzipitat wurde zwischen den drei klonierten Zellulasen und den gegen die anderen beiden Zellulasen erzeugten Seren beobachtet. H-I. Wirksamkeit der Endoglucanase von Konstrukt 1 (SEQ ID Nr. 2), gemessen in Puffer als das Entfernen von Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern enthält

Gerät:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	100 ml
Bewegung:	150 Bewegungen/min (upm)
Spülzeit:	5 min in Leitungswasser
Waschtemp.:	40 °C
Wasserhärte:	1 mM CaCl₂
Waschflüssigkeit:	0,05 M Phosphatpuffer
pH:	7,0
Waschzeit:	30 min
Wiederholungen:	2
Textilie:	2 Musterabschnitte von gealterter, schwarzer, 100 % Baumwolle, 5 × 6 cm

Trocknung:

Maschinentrocknung

Auswertung:
Die Lichtremission wurde mittels eines Macbeth-Color-Eye-7000-Remissions-Spektralphotometers gemessen. Die Remission wird als delta-L (Hunter-Lab-Werte) berechnet. Wenn die Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, durch die Zellulase entfernt werden, erschien die Oberfläche als heller, und niedrigere L-Werte wurden erhalten.
Ergebnisse:

Die Daten zeigen, dass das erfindungsgemäße Enzym unter den getesteten Bedingungen eine sehr gute Farbklärung ergibt. H-II. Wirksamkeit der klonierten Endoglucanase von Thielavia terrestris (SEQ ID Nr. 9), gemessen in Puffer als das Entfernen von Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern enthält

Gerät:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	100 ml
Bewegung:	150 Bewegungen/min mit einem Vertikalrührer
Spülzeit:	10 min in Leitungswasser
Waschtemp.:	40 °C
Waschflüssigkeit:	0,05 M Phosphatpuffer
pH:	7,0
Waschzeit:	30 min
Wiederholungen:	2
Textilie:	2 Musterabschnitte von gealterter, schwarzer, Baumwolle, 5 × 6 cm (etw. 150 g/m²)
Trocknung:	Maschinentrocknung

Auswertung:
Die Lichtremission wurde mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers gemessen. Die Remission wird als delta-L (Hunter-Lab-Werte) berechnet. Wenn Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, durch die Zellulase entfernt wurden, erschien die Oberfläche des schwarzen Textilerzeugnisses als dunkler und schöner, und niedrigere L-Werte wurden erhalten.
Ergebnisse:

Diese Daten zeigen, dass das erfindungsgemäße Enzym unter den getesteten Bedingungen eine gute Farbklärung ergibt. H-III. Wirksamkeit der Endoglucanase von Volutella colletrichoides (SEQ ID Nr. 17), gemessen in Puffer als das Entfernen von Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern enthält

Gerät:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	100 ml
Bewegung:	150 Bewegungen/min mit einem Vertikalrührer
Spülzeit:	5 min in Leitungswasser
Waschtemp.:	40 °C
Waschflüssigkeit:	0,05 M Phosphatpuffer
pH:	7,0
Waschzeit:	30 min
Wiederholungen:	2
Dosierung:	2,5 S-CEVU/ml
Textilie:	2 Musterabschnitte von gealterter, schwarzer, 100 % Baumwolle, 5 × 6 cm (0,9 g)
Trocknung:	Maschinentrocknung

Auswertung:
Die Lichtremission wurde mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers gemessen. Die Remission wird als delta-L (Hunter-Lab-Werte) berechnet. Wenn die Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, von der Zellulase entfernt werden, erscheint die Oberfläche des schwarzen Textilerzeugnisses als dunkler, und niedrigere L-Werte werden erhalten.
Die Probe wird mit einer Leerprobe, d. h. ohne Enzym gewaschen, verglichen

Keine Zellulase Mit Zellulase

0,00 –0,57
Remissionswerte delta-L, verglichen mit der Leerprobe.

Die Daten zeigen, dass die Zellulase von Volutella colletrichoides unter den getesteten Bedingungen eine gute Farbklärung liefert. H-IV. Wirksamkeit der klonierten Zellulasen von Thielavia terrestris und Acremonium sp. CBS 478.94 in starkem Waschmittel mit hohem pH, gemessen als das Entfernen von Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern enthält

Gerät:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	150 ml
Bewegung:	150 Bewegungen/min mit einem Vertikalrührer
Spülzeit:	10 min in Leitungswasser
Waschtemp.:	35 °C
Waschflüssigkeit:	1,0 g/l US-Typ HDG (Zeolit/Soda-built, Gewichtsverhältnis anionisch/nichtionisch > 2,5)
pH:	10,0
Härte:	1,0 mM CaCl₂, 0,34mM MgCl₂
Waschzeit:	12 min
Wiederholungen:	6
Textilie:	2 Musterabschnitte von gealterter, schwarzer Baumwolle, 5 × 6 cm (etw. 150 g/m²) 2 Musterabschnitte schwerer, gestrickter Baumwolle, 5 × 6 cm (etw. 600 g/m²)
Trocknung:	Maschinentrocknung

Auswertung:
Die Lichtremission wurde mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers gemessen. Die Remission wird als delta-L (Hunter-Lab-Werte) berechnet. Wenn die Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, von der Zellulase entfernt werden, erscheint die Oberfläche der schwarzen Textilie als dunkler und schöner, und niedrigere L-Werte werden erhalten. Verschiedene Dosierungen von klonierten Zellulasen aus Thielavia terrestris (SEQ ID Nr. 9) bzw. Acremonium sp. CBS 478.94 (SEQ ID Nr. 5) (mit A bzw. B bezeichnet) wurden getestet.
Ergebnisse:

Die Daten zeigen, dass beide Zellulasen unter den getesteten Bedingungen eine gute Farbklärung ergeben. H-V. Wirksamkeit der aus Thielavia terrestris und Acremonium sp. CBS 478.94 klonierten Zellulasen, sowie von Konstrukt 1 (SEQ ID Nr. 2), gemessen als das Entfernen von Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn einer Textilie hervorstehen, die Zellulosefasern enthält

Gerät:	Terg-o-tometer
Flüssigkeitsvolumen:	150 ml
Bewegung:	150 Bewegungen/min mit einem Vertikalrührer
Spülzeit:	10 min in Leitungswasser
Waschtemp.:	35 °C
Härte:	1,0 mM CaCl₂, 0,34 mM MgCl₂
Waschflüssigkeit:	2,0 g/l HDL (neutrales Citrat-built HDL, mit einem Gewichtsverhältnis nichtionisch/ionisch > 0,5)
pH:	7,5
Waschzeit:	30 min
Wiederholungen:	2
Textilerzeugnis:	2 Musterabschnitte von gealterter, schwarzer Baumwolle, 5 × 6 cm (etw. 150 g/m²) 2 Musterabschnitte von schwerer, gestrickter Baumwolle, 4 × 7 cm (etw. 600 g/m²)
Trocknung:	Maschinentrocknung

Auswertung:
Die Lichtremission wird mittels eines Datacolor-Elrepho-Remissions-Spektralphotometers gemessen. Die Remission wird als delta-L berechnet (CIE-Lab-Werte). Wenn die Oberflächenfibrillen und -fasern, die aus dem Garn hervorstehen, von der Zellulase beseitigt werden, erscheint die Oberfläche des schwarzen Textilerzeugnisses als dunkler und schöner, und niedrigere L-Werte werden erhalten. Drei verschiedene Dosierungen von klonierten Zellulasen aus Thielavia terrestris (SEQ ID Nr. 9), Acremonium sp. CBS 478.94 (SEQ ID Nr. 5) bzw. des Konstrukts 1 (SEQ ID Nr. 2) (als A, B bzw. C bezeichnet) wurden getestet.
Ergebnisse:
Die Daten zeigen, dass alle Zellulasen unter den getesteten Bedingungen eine sehr gute Farbklärung ergeben.
I. Anwendung der Endoglucanasen von Thielavia terrestris, Acremonium sp. und des Konstrukts 1 (SEQ ID Nr. 2) bei der Denim-Ausrüstung
Experimentell

Gerät: Waschmaschine Wascator FL 120,
Flüssigkeitsvolumen: 201,
Stoff: 1,1 kg Denim-Textilerzeugnis, 14 ½ oz 100 % Baumwolle,
Entschlichten: 10 min, 55 °C, pH 7, 50 ml Aquazym 120L, 2,5 g/l Phosphatpuffer,
Abrag: 2 Stunden; der pH und die Temperatur variierten gemäß der folgenden Tabelle:

Enzymaktivität pH/Temp. Puffersystem

SEQ ID
Nr. 21400 S-CEVU/g 6/55°C 2,5 g/l Phosphatpuffer
Nr. 9292 S-CEVU/g 5/65°C 1 g/l Citratpuffer
Nr. 5782 S-CEVU/g 7/45°C 2,5 g/l Phosphatpuffer
Inaktivierung: 15 min, 80 °C, 1 g/l Natriumcarbonat
Spülungen: Drei Spülzyklen von 5 min in kaltem Leitungswasser

Auswertung:
Abtragt Die Remission des Textilerzeugnisses wurde bei 420 nm unter Verwendung eines Texflash 2000 als ein Maß für den Abtragsspiegel bestimmt.
Die Ergebnisse der Behandlung des Denim-Textilerzeugnisses mit verschiedenen erfindungsgemäßen Endoglucanasen sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Alle getesteten Zellulasen zeigen eine hervorragende Wirsamkeit bei der Denim-Ausrüstung, obwohl jedes Enzym auf seine eigene Weise einzigartig ist. Wenn das Enzym gemäß SEQ ID Nr. 2 für die Denim-Ausrüstung verwendet wird, ist es möglich, einen hohen Abtragsspiegel mit einem Minimum an Stärkeverlust zu erreichen. Wenn Denim mit dem Enzym gemäß SEQ ID Nr. 9 behandelt wird, kann ein sehr starkes Auswaschen erreicht werden, das dem Stoff ein fast gebleichtes Aussehen verleiht. Die Denim-Ausrüstung mit dem Enzym, das SEQ ID Nr. 5 entspricht, ergibt einen hohen Abtragsspiegel bei einem niedrigen Temperaturoptimum, das es ermöglicht, die Verarbeitungstemperatur zu verringern und Energie zu sparen.
J. Verwendung von klonierten Zellulasen aus Acremonium sp. und Thielavia terrestris für das Biopolishing von Lyocellfasern
Lyocellfasern, die unter dem Handelsnamen Tencel verkauft werden, werden aus Holzzellstoff-Zellulose in einem umweltverträglicheren, wasserbasierten Lösungsmittel gesponnen, als im Fall der normalen Viskoseherstellung. Allerdings weisen die Fasern eine Neigung zum Fibrillieren auf, wenn sie zu Textilien verarbeitet werden, was auf der Oberfläche sichtbar ist und als „Fusseln" bezeichnet wird. Durch die Verwendung von Zellulasen ist es möglich, die exponierten und fusseligen Fasern dauerhaft zu beseitigen und das Aussehen des ausgerüsteten Textilerzeugnisses signifikant zu verbessern, wobei die Behandlung im Allgemeinen als Biopolishing bekannt ist. Die Endoglucanasen der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignet für das Entfernen von Oberflächenfasern von Lyocell.
MATERIAL UND METHODEN
Das Textilsubstrat war entweder 100 % gewobenes oder auf verschiedene Weisen als Jersey gestricktes dunkelblaues Tencel. Die dunkle Farbe und die Jersey-Strickart waren bevorzugt, um die sichtbaren Effekte zu verstärken, was die Auswirkung erleichterte. Ein gewebtes 70/30-Tencel/Rayon-Gemisch wurde ebenfalls in geringerem Umfang verwendet.
Die Tests wurden entweder in einem 200-ml-Maßstab unter Verwendung eines Launder-o-meters oder in einem 20-l-Maßstab unter Verwendung eines Wascators durchgeführt. Die Behandlungszeit betrug 60 min bei 55 °C in dem Wascator und 60 bis 90 min in dem LOM. Der Puffer war 2g/l Natriumacetat, das mit Essigsäure auf pH 5 eingestellt war. Das Textilerzeugnis-zu-Flüssigkeit-Verhältnis betrug 1:10, aber in dem Launder-o-meter wurden 20 Stahlbälle mit einem Durchmesser von 14 mm (jeweils 11 g) verwendet, um einen ausreichenden mechanischen Abtrag zu erhalten. Dem Biopolishing folgte unmittelbar die Inaktivierung unter Verwendung von 2 g/l Natriumcarbonat bei 80 °C für 15 min, gefolgt von Spülen in kaltem Wasser.
Die Ergebnisse wurden unter Verwendung einer Fussel-Notenskala von 1–5 ausgewertet, wobei 1 einem fibrillierten Aussehen des Ausgangsmaterials entspricht und 5 einem qualitativ hochwertigen Aussehen ohne sichtbare Fasern auf der Oberfläche entspricht. Da die Wirksamkeit der Endozellulasen spezifisch für eine Oberflächenbehandlung ist, beträgt der Gewichtsverlust unter 2 % und wird deshalb in der Auswertung nicht eingeschlossen. Zwei Zellulasen wurden bewertet: die aus Acremonium sp. (SEQ ID Nr. 5) und aus Thiellavia terrestris (SEQ ID Nr. 9) klonierten Zellulasen.
Die beiden Zellulasen sind fähig, sowohl Tencel- als auch mit Tencel gemischte Textilerzeugnisse zu entfibrillieren. Bei der Verwendung einer erfindungsgemäßen Endoglucanase werden nur kleine Fibrillen anstelle gesamter Fasern entfernt, wie dies der Fall ist, wenn saure Zellulasegemische aus Trichoderma verwendet werden. Der Stärkeverlust des behandelten Textilerzeugnisses wird deshalb bei einem Minimum gehalten, wenn die erfindungsgemäßen Endoglucanasen verwendet werden.
Die folgenden Dosierungen ergaben eine überlegene Entfibrillierung, d. h. die Fusselnote 4 oder höher:
15 S-CEVU/g-Textilerzeugnis an Zellulase aus Acremonium sp (SEQ ID Nr. 5) und
10 S-CEVU/g-Textilerzeugnis an Zellulase aus Thielavia terrestris (SEQ ID Nr.9).
SEQUENZPROTOKOLL
REFERENZEN
Hintergrund der Erfindung:

GB-A-1368599
EP-A-0 307 564
EP-A-0 435 876
WO 91/17243
WO 91/10732
WO 91/17244
WO 95/24471
WO 95/26398
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ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (Regel 13^bis PCT)
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Claims

DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das Endoglucanase-Aktivität zeigt, wobei die DNA-Sequenz a) die in SEQ ID Nr. 8 gezeigte DNA-Sequenz oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältliche DNA-Sequenz umfasst, oder b) ein Analog der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten DNA-Sequenz oder der aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältlichen DNA-Sequenz umfasst, das i) wenigstens 75 % Identität mit der in SEQ ID Nr. 8 gezeigeten DNA-Sequenz oder der aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältlichen DNA-Sequenz aufweist, oder ii) ein Polypeptid kodiert, das wenigstens 70 % Identität mit dem Polypeptid aufweist, das von einer DNA-Sequenz kodiert ist, die die in SEQ ID Nr. 8 gezeigete DNA-Sequenz oder die aus dem Plasmid in Saccharomyces cerevisiae DSM 10081 erhältliche DNA-Sequenz umfasst.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, in dem die DNA-Sequenz auf der Basis einer DNA-Bibliothek eines Stammes, der zu der Familie Chaetomiaceae, vorzugsweise zu der Gattung Thielavia, insbesondere einem Stamm von Thielavia terrestris, speziell Thielavia terrestris NRRL 8126 gehört, hergestellt oder daraus isoliert ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, das außerdem einen DNA-Sequenz umfasst, die eine Zellulose-Bindungsdomäne kodiert.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 3, das außerdem eine DNA-Sequenz umfasst, die eine Zellulose-Bindungsdomäne (CBD) kodiert, wobei die Zellulose-Bindungsdomäne und das Enzymcore (katalytisch aktive Domäne) des Enzyms, die von der DNA-Sequenz des DNA-Konstrukts kodiert sind, funktionell verbunden sind.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4.
Zelle, umfassend ein DNA-Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4 oder einen rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 5.
Zelle nach Anspruch 6, die eine eukaryontische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle, so wie eine Hefezelle oder eine filamentöse Pilzzelle, oder eine endogene Zelle, aus der das Gen stammt, ist.
Zelle nach Anspruch 7, wobei die Zelle zu einem Stamm von Aspergillus, Fusarium oder Trichoderma, insbesondere einem Stamm von Fusarium graminearum, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae, gehört.
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das Endoglucanase-Aktivität zeigt, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Zelle nach einem beliebigen der Ansprüche 6–8 unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das Gewinnen des Enzyms aus der Kultur umfasst.
Enzym, das Endoglucanase-Aktivität zeigt, wobei das Enzym a) von einem DNA–Konstrukt nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4 kodiert ist, oder b) zu wenigstens 70 % homolog zu der in SEQ ID Nr. 9 gezeigten Aminosäuresequenz ist.
Enzymzubereitung, die mit einem Enzym angereichert ist, das die zellulytische Aktivität nach Anspruch 10 aufweist.
Verfahren zur Bereitstellung einer Farbklärung von Wäsche, wobei das Verfahren die Behandlung der Wäsche mit einer Einweich-, Wasch- oder Spülflüssigkeit, die eine Enzymzubereitung nach Anspruch 11 umfasst, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Wäsche in einer Waschmaschine behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Endoglucanase in der Einweich-, Wasch- oder Spülflüssigkeit in einer wirksamen Menge von zwischen 1 und 1000 S-CEVU, vorzugsweise zwischen 5 und 200 S-CEVU, pro Liter Flüssigkeit während der Maschinenzyklus-Anwendungsbedingungen vorhanden ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12–14, wobei der pH der Einweich-, Wasch- oder Spülflüssigkeit zwischen 4 und 11, vorzugsweise zwischen 6 unds 10,5, beträgt.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12–15, wobei die Temperatur zwischen 15 °C und 60 °C beträgt.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12–16, wobei die Einweich-, Wasch- oder Spülflüssigkeit außerdem eine oder mehrere Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Cellulasen, Xylanasen, Amylasen, Lipasen, Peroxidasen und Laccasen, umfasst.
Waschmittelzusammensetzung, umfassend die Enzymzubereitung nach Anspruch 11 und eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Tensid, einer Builder-Verbindung und einem Weichmacher für ein Textilerzeugnis.
Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 18, die außerdem ein oder mehrere Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Amylasen, Lipasen, Cellulasen, Xylanasen, Peroxidasen und Laccasen, umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das Tensid ein nichtionisches, anionisches, kationisches, zwitterionisches, ampholytisches oder amphoteres Tensid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei der Weichmacher für das Textilerzeugnis ein kationischer oder nichtionischer Weichmacher, vorzugsweise eine quartäre Ammoniumverbindung, ist und die wahlweise außerdem eine oder mehrere Verbindungen, ausgewählt aus einem Tensid, einem Elektrolyt, einem Puffer, einem Antioxidans und einem flüssigen Träger, umfasst.
Verwendung des Enzyms nach Anspruch 10 für den Abbau oder die Modifizierung von Pflanzenmaterial, z. B. Zellwänden.
Verwendung des Enzyms nach Anspruch 10 für die Behandlung eines Textilerzeugnisses oder einer Textilie, vorzugsweise für das Verhindern des Abfärbens, für das Biopolishing oder für das „Stonewashing" von Zellulose-Textilerzeugnissen.
Verwendung des Enzyms nach Anspruch 10 bei der Behandlung von Papierbrei, vorzugsweise für das Entrinden, den Holzaufschluss („defibration"), die Fasermodifizierung, das enzymatische De-inken oder die Verbesserung der Entwässerung.
Zubereitung nach Anspruch 11, die zusätzlich ein oder mehrere Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Galactanasen, Xylanasen, Arabinanasen, Pektin-Acetylesterasen, Polygalacturonasen, Rhamnogalacturonasen, Pektinlyasen, Pektatlyasen, Endoglucanasen, Pektin-Methylesterasen, Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cutinasen, Peroxidasen, Laccasen, Cellobiohydrolasen und Transglutaminasen, umfasst.