CN103429736A

CN103429736A - 用内切葡聚糖酶处理纺织品的方法

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Publication number: CN103429736A
Application number: CN2011800688730A
Authority: CN
Inventors: 赖伟坚; 吴桂芳; 刘晔; 周玉成; 韩杨
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明涉及用于制造纺织品的方法，即用具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽处理纺织品，特别是在生物石洗和生物抛光工艺中。

Description

用内切葡聚糖酶处理纺织品的方法

对序列表的援引

本发明包含计算机可读形式的序列表，所述计算机可读形式通过提述并入本文。

技术领域

本发明涉及用于制造纺织品的方法，通过用具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽处理纺织品，特别是在生物石洗和生物抛光工艺中。

背景技术

纤维素酶有广泛的产业用途。在纺织品工业上，使用纤维素进行粗斜棉布(denim)整理(finishing)以使用生物石洗(biostoning)工艺对粗斜棉布创造时髦的石洗(stone wash)外观。亦将纤维素酶用于，例如使用生物抛光工艺在棉制衣物(cotton garment)的表面清除起毛(fuzz)和防止起球形成(formation ofpill).

与酶石洗相关的一个普遍问题是在磨蚀(abrasion)之中或之后由去除的靛蓝染料重新沉积导致的返沾色(backstaining)。靛蓝染料的“返沾色”或称“再沉积”(redeposition)导致白色和靛蓝染色的纱线之间理想的反差减小，这最容易在粗斜棉布的反面和内部口袋处分辨出来(表现为蓝色变深)。在粗斜棉布的正面，这可以表现为染色区域与生物石洗过程中去除染料的区域之间的反差减小。为了去除再沉积的染料，粗斜棉布制造商在皂洗工艺中使用大量表面活性剂使得再沉积的部分重新变白，例如为了增加粗斜棉布磨蚀部分和非磨蚀部分之间的反差。重度洗涤条件可导致经整理的粗斜棉布产品的变色或褪色问题。而且，在后续的皂洗工艺中必须使用额外的水。亦有通过将抗再沉积化学品(如表面活性剂或其它试剂)加入纤维素酶洗涤液来应对在石洗过程中再沉积或返沾色的问题。

WO97/09410描述了将某种类型的纤维素酶添加至具有磨蚀活性的另一种纤维素酶可减少返沾色。添加的纤维素酶属于糖基水解酶家族5或7，但其自身不具有显著的磨蚀活性。WO01/92453公开了通过用角质酶处理纺织品可减少返沾色。

单个内切葡聚糖酶极少同时提供粗斜棉布的高磨蚀并控制靛蓝返沾色至可接受的水平。WO91/17243和WO95/09225描述了使用一种称为EGV的单组分内切葡聚糖酶的工艺，其分子量为43kD，来源于特异腐质霉(Humicolainsolens)菌株DSM1800。WO94/21801描述了称为EGIll、来源于长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)的单组分内切葡聚糖酶在“石洗”中的用途。WO95/16782提示了其它来源于木霉属(Trichoderma)的单组分内切葡聚糖酶在“石洗”中的应用。WO2009/103237公开了来源于烟曲霉(Aspergillus fumigates)的内切葡聚糖酶在“石洗”中的用途。

本领域中存在对于新型内切葡聚糖酶，以及用于获得具有磨蚀作用良好但返沾色水平低的纤维素性纺织品织物，用于特别是在低温获得具有磨蚀作用良好但返沾色水平低的纤维素性纺织品织物的方法的需求。

生物抛光是对纱线表面的特殊处理，改善织物的手感和外观方面的品质。生物抛光最重要的作用可表征为较少的起毛和起球，增加的光泽(gloss/luster)，改善的织物手感，增加的可持续柔软性(durable softness)，和/或改善的水吸收性。生物抛光通常在针织和织造织物的制造的湿加工中进行。湿加工包括下述步骤如例如退浆、煮炼、漂白、洗涤、染色/印花和整理。

本领域中仍存在对于新型内切葡聚糖酶和用于获得具有起球形成趋势大大降低的纤维素性纺织品、但在生物抛光工艺中不实质导致织物重量损失(特别是在低温下)的方法。在纺织品加工如退浆、煮炼和皂化过程中，广泛使用表面活性剂特别是阳离子性表面活性剂。因此，在生物抛光工艺过程中会有一些量的表面活性剂遗留在织物中。非常重要的是，内切葡聚糖酶与表面活性剂具有良好的相容性，同时达到相同水平的生物抛光作用。

本发明旨在满足这些需求。

发明内容

本发明涉及用于处理纺织品的方法，即用具有内切葡聚糖酶活性但不包含功能性CBM的分离的多肽处理纺织品，所述多肽选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；

(b)多肽，其由在中等严格条件下与以下杂交的多核苷酸编码：(i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多肽，其由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80%序列同一性的多核苷酸编码；或

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的包含一个或多个(例如几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。

在一个实施方案中，所述方法可应用于生物石洗工艺以在经染色的纤维素性纺织品或含纤维素纺织品的表面形成颜色密度的局部差异。优选地，经染色的纤维素性织物或含纤维素织物是粗斜棉布织物，更优选靛蓝染色的粗斜棉布织物。优选地，所述生物石洗工艺显示至少0.5ΔL*单位，优选至少1，更优选1.5，更优选2，甚至更优选2.5ΔL*单位的磨蚀作用。

在一些实施方案中，所述生物石洗工艺可还包含一种或多种选自下组的酶：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶。

在一些实施方案中，所述方法可应用于生物抛光工艺。优选地，所述生物抛光工艺显示至少3，更优选至少3.4，更优选至少3.8，和最优选至少4的起球度(pilling note)。更优选地，所述生物抛光工艺进一步显示小于10%，优选小于5%，更优选小于4%，更优选小于3.5%，和最优选小于3%的重量损失。

在一些实施方案中，提供了用于制造纺织品的方法。在一些实施方案中，所述纺织品从织物制造为衣物。

在一些实施方案中，所述纺织品是含纤维素或纤维素性纺织品。在一些实施方案中，所述纺织品是粗斜棉布。

在纺织品制造中，本发明的多肽当单独使用，即不与其它酶，特别是不与其它纤维素酶一起使用时，可在生物石洗工艺过程中同时提供增加的磨蚀作用和低的返沾色水平。本发明的方法在生物抛光工艺中，特别是在表面活性剂存在下，可获得起球形成大大减少的纤维素性纺织品织物，但不导致织物实质的重量损失。本发明的进一步的优点在于所述方法可在低温，例如低于50℃进行，从而在纺织品制造工艺中节约能量。

附图说明

图1显示pRenoCBD的限制性酶切图。

图2显示pRenoCore的限制性酶切图。

发明详述

本发明在此通过对使用下述定义和实施例的引用进行详细描述。所有在本文中提及的专利和公开，包括在这些专利和公开中披露的所有序列，明确地通过提述并入本文。

如用于本文，除非语境明确地作出相反提示，单数形式“一个/一种(“a”，“an”)”和“该/所述(“the”)”亦意指复数。

定义

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的第264页中的部分VI的方法，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。

通常，所述内切葡聚糖酶具有至少两个功能域，即糖结合模块(CBM)和催化模块。催化模块定义为能够酶切割纤维素，例如具有内切葡聚糖酶活性的氨基酸序列。催化模块不视为糖结合模块。“接头序列”连接这两个功能域。

糖结合模块：术语“糖结合模块”(CBM)定义为结合于底物的氨基酸序列。CBM例如描述于Boraston等,Biochem.J.(2004)382,769–781和Tomme等,John N.Saddler和Michael H.Penner(编),ACS Symposium Series,No.618,1995。认为CBM结合于底物，这增加酶的催化活性部分的效力。

术语CBM是现在通用的；然而，还使用术语“纤维素结合域”(CBD)来描述特异性结合于纤维素底物的CBM的子集。根据语境，具有内切葡聚糖酶活性的多肽的CBM或CBD可互换使用。

结合活性可例如通过结合于微晶纤维素如Avicel并显示该推定的结合模块从溶液去除来确定。

在本发明中，具有内切葡聚糖酶活性但缺乏功能性CBM的多肽可完全缺乏CBM序列，或者可含有经修饰而摧毁了纤维素结合活性的残余CBM序列，所述修饰为通过缺失、添加和/或取代一个或多个氨基酸残基，或通过对完整蛋白的任何化学或酶修饰；这样的经修饰的序列亦称作带有非功能性CBM的具备内切葡聚糖酶活性的多肽。

就本发明的目的而言，具备内切葡聚糖酶活性但缺乏功能性CBM的多肽可使用例如下文实施例6中所述的方法来鉴定，所述方法涉及将酶与纤维素底物Avicel温育以允许结合，接着离心并检测上清中的蛋白含量。通常，具有内切葡聚糖酶活性但缺乏功能性CBM的多肽在该测定中对Avicel的亲和度低，这导致上清中遗留的蛋白含量高。在本发明中，具有内切葡聚糖酶活性但缺乏功能性CBM的多肽显示不超过15%如实施例6中定义的吸收，更优选不超过14%吸收，更优选不超过13%吸收，更优选不超过12%吸收，更优选不超过11%吸收，甚至更优选不超过10%吸收。

在一些实施方案中，具有内切葡聚糖酶活性但完全缺乏CBM序列的多肽可为天然(野生型)内切葡聚糖酶。

在一些实施方案中，具有内切葡聚糖酶活性但缺乏功能性CBM的多肽是这样的多肽：其带有通过多种技术(包括生物化学或遗传工程技术)中的任何一种截短的CBM，且具备内切葡聚糖酶活性。

分离的多肽：术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然地相结合的至少一种组分分开的多肽或多核苷酸。举例而言，多肽通过SDS-PAGE确定可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳确定，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，基于SignalP(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6)程序，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22-237，而SEQ ID NO:2的氨基酸1至21是信号肽。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有内切葡聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，基于SignalP(Nielsen et al.,1997,Protein Engineering10:1-6)程序，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至858，而SEQ ID NO:1的核苷酸1至63编码信号肽。

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序中所实现的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开启罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：

(相同的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序中所实现的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开启罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有内切葡聚糖酶活性。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽片段。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

编码序列：术语“编码序列”意指直接规定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”意指可通过逆转录从自真核细胞获得的成熟的、经剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。该起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其经历一系列步骤，最后作为成熟的、剪接的mRNA出现。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或所述核酸构建体是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的子代，其由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同。

变体：术语“变体”意指具有内切葡聚糖酶活性的多肽，其在一个或多个(几个)位置包含改变，即一个或多个(几个)氨基酸的取代、插入和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；和插入意指紧接着占据某位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

纺织品：本文中使用的术语“纺织品”意在包括纤维、纱线、织物和衣物。

织物可通过织造(weaving)、针织(knitting)或无纺(non-woven)操作从纤维构建。织造和针织需要纱线作为输入，而无纺织物是纤维随机键合的结果(纸可视为无纺的)。在本文的语境中，术语“织物”亦旨在包括纤维和其它类型的经加工的织物。

根据本发明，本发明的方法可适用于任何本领域中已知的纺织品(织造的、针织的或无纺的)。具体而言，本发明的工艺可适用于含纤维素或纤维素性纺织品，如棉、纤维胶、人造丝、苎麻、亚麻、lyocell(例如由Courtaulds Fibers生产的Tencel)，或其混合物，或任何这些纤维与合成纤维(例如聚酯、聚酰胺、尼龙)或其它天然纤维如羊毛和丝一同的混合物，如纤维胶/棉混纺纱(blend)，lyocell/棉混纺纱，纤维胶/羊毛混纺纱，lyocell/羊毛混纺纱，棉/羊毛混纺纱；亚麻(flax/linen)、苎麻和其它基于纤维素纤维的织物，包括所有纤维素性织物与其它纤维如羊毛、聚酰胺、丙烯酸和聚酯纤维的混纺纱，例如纤维胶/棉/聚酯混纺纱，羊毛/棉/聚酯混纺纱，亚麻/棉混纺纱等等。

发明详述

具有内切葡聚糖酶活性但不含功能性CBM的多肽

本发明涉及处理纺织品的方法，通过用具有内切葡聚糖酶活性但不包含功能性CBM的分离的多肽处理纺织品，所述多肽选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；

(d)可从SEQ ID NO:2通过一个或多个(或几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入而获得的多肽。

在本发明中，所述具有内切葡聚糖酶活性但不含功能性CBM的分离的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。在一个方面，所述多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差十个氨基酸，九个氨基酸，八个氨基酸，七个氨基酸，六个氨基酸，五个氨基酸，四个氨基酸，三个氨基酸，两个氨基酸，或一个氨基酸。优选地，上述鉴定的多肽当与SEQ ID NO:2比对时在对应于位置141的位置具有组氨酸。更优选地，所述分离的多肽是内切葡聚糖酶的催化模块。甚至更优选地，本发明的分离的多肽是SEQ ID NO:2的成熟多肽。

本发明亦涉及具有内切葡聚糖酶活性的多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NewYork)。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以供检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。

可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有内切葡聚糖酶的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ IDNO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。

就本发明的目的而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于下述：SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；包含于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，以及对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺，对于中等和中-高严格性为35%的甲酰胺，或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS优选在45℃(非常低严格性)，在50℃(低严格性)，在55℃(中等严格性)，在60℃(中等-高严格性)，在65℃(高严格性)，和在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy的计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09MTris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

本发明亦涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。

在本发明中，所述多肽可为SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列包含一个或多个(或几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(polyhistidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。优选地，对应于SEQ ID NO:2的位置141的氨基酸残基是组氨酸。SEQ ID NO:2可通过在野生型土生梭孢霉(Thielavia terrestris)内切葡聚糖酶的催化模块中在对应于SEQID NO:2的位置141的位置用组氨酸(H)取代谷氨酰胺(Q)来获得。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸变化可为这样的性质，其使得所述多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸变化可改善多肽的热稳定性，改善其底物特异性，改变最适pH等。

可将一个或多个突变，如GH43K，N71E和Q168R引入本发明的SEQ IDNO:2。对于氨基酸取代，使用下述命名法：起始氨基酸，位置，取代的氨基酸。相应地，在位置43用赖氨酸取代甘氨酸命名为“Gly43Lys”或“G43K”。

可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的内切葡聚糖酶活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。也可以从与亲本多肽的近缘多肽的同一性分析来推断必需氨基酸的身份(identity)。

在本发明中，SEQ ID NO:2的D33和D143是必需氨基酸，为了维持其内切葡聚糖酶活性，不能改变这些氨基酸。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145；Ner等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

优选地，SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个。

所述多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的部分融合于另一个多肽的部分的N端或C端。

所述多肽可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合于本发明的多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。

融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。

本发明的多肽的来源

本发明的具有内切葡聚糖酶活性但不含功能性CBM的多肽可获得自任何属的微生物。就本发明的目的而言，在本文中使用的、与给定的来源联用的术语“获得自”，意思应为由多核苷酸编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。在一个方面，获得自给定来源的多肽分泌至胞外。

所述多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可为革兰氏阳性细菌多肽如具有内切葡聚糖酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、网球菌属(Dictyoglomus)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。

在一个方面，所述多肽是嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)或Dictyoglomus turgidum多肽。

所述多肽可为古菌(Archaea)肽。例如，所述多肽可为火球菌属(Pyrococcus)多肽。在一个方面，所述多肽是激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，Pyrococcusabyssi，Pyrococcus endeavori，Pyrococcus glycovorans，Pyrococcus horikoshii，沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)多肽。所述多肽可为真菌多肽，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽。或丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。

在另一个方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielaviaperuviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。

亦可使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物，或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。然后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码多肽的多核苷酸。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员已知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

其他组分

在本发明的一些实施方案中，含有具有内切葡聚糖酶活性的多肽的总体溶液(bulk solution)进一步包含其它增强生物抛光和/或生物石洗工艺，和/或提供涉及例如可染色性(dyeability)和/或可润湿性(wettability)方面的较佳作用的组分，包括但不限于其它酶，以及表面活性剂、漂白剂、消泡剂、洗涤助剂系统(builder system)等中的一种或多种。所述水溶液亦可含有染色剂。

适用于本发明的酶包括但不限于蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶和纤维素酶。

蛋白酶

在一个优选实施方案中，本发明中使用蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。所述蛋白酶可例如为金属蛋白酶(EC3.4.17或EC3.4.24)或丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21)，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)，特别是来源于芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO89/06270和WO94/25583的镰孢属蛋白酶。

优选的可商购的蛋白酶包括

和

(Novozymes A/S)，

FN2^TM，和FN3^TM(Genencor InternationalInc.)。

脂肪酶

在本发明的其它实施方案中，本发明中使用脂肪酶。合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。就此而言，包括此类脂肪酶化学或遗传修饰的变体。所述脂肪酶可例如为三酰基甘油脂肪酶(EC3.1.1.3)，磷脂酶A2(EC3.1.1.4)，溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)，甘油一酯脂肪酶(EC3.1.1.23)，半乳糖脂肪酶(EC3.1.1.26)，磷脂酶A1(EC3.1.1.32)，脂蛋白脂肪酶(EC3.1.1.34)。可用的脂肪酶的实例包括疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶，如公开于EP258068和EP305216；曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶，例如公开于EP238023，或来自特异腐质霉，如公开于WO96/13580；假丝酵母属(Candida)脂肪酶，如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶，例如描述于EP214761的南极假丝酵母脂肪酶A或B；假单胞菌属脂肪酶，如描述于EP721981(例如，可从具有保藏登录号FERM BP-4772的假单胞菌属菌种SD705菌株获得的脂肪酶)，PCT/JP96/00426，PCT/JP96/00454(例如P.solanacearum脂肪酶)，EP571982或WO95/14783(例如门多萨假单胞菌(P.mendocina)脂肪酶)的那些之一，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶，例如描述于EP218272，洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶，例如描述于EP331376，施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶，例如描述于GB1372034，或萤光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶，例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等(1993)Biochemica et Biophysica Acta1131:253-260),嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂肪酶(JP64/744992)和微小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶(WO91/16422)。

合适的可商购的脂肪酶包括

和Lipolase

(可从Novozymes A/S获得)，M1Lipase^TM和Lipomax^TM(可从Genencor Inc.获得)和Lipase P"Amano"(可从Amano Pharmaceutical Co.Ltd.获得)。可商购的角质酶包括来自Genencor Inc.的Lumafast^TM。

角质酶

在其他实施方案中，本发明中使用角质酶。潜在可用类型的脂肪分解酶包括角质酶(EC3.1.1.74)，例如如WO88/09367中所述的来源于门多萨假单胞菌的角质酶，或来源于豌豆腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)(描述于，例如WO90/09446)。由于角质酶的脂肪分解酶活性，其与脂肪酶对于相同的污迹可为有效的。可商购的角质酶包括来自Genencor Inc.的Lumafast^TM。

淀粉酶

在其它实施方案中，本发明中使用淀粉酶。淀粉酶包括例如细菌或真菌来源的α-淀粉酶(EC3.2.1.1)，β-淀粉酶(EC3.2.1.2)和/或葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)。就此而言包括此类淀粉酶的化学或遗传修饰的突变体。对于本发明α-淀粉酶是优选的。相关的α-淀粉酶包括，例如可从芽孢杆菌属菌种，特别是地衣芽孢杆菌的特定菌株获得的α-淀粉酶，其在GB1296839中更详细描述。

可用的淀粉酶的进一步实例是来源于芽孢杆菌属菌种菌株WO95/26397(通过提述并入本文)的SEQ ID NO:1和2中所示的α-淀粉酶；来源于芽孢杆菌属菌种DSM12649、作为WO00/60060(通过提述并入本文)中的SEQ IDNO:2公开的AA560α-淀粉酶，和AA560α-淀粉酶的变体，包括实施例7和8(通过提述并入本文)中公开的AA560变体。

相关的可商购的淀粉酶包括

Termamyl^TMUltra，

和

(均可从from NovozymesA/S，Bagsvaerd，Denmark获得)，以及和

P(可从DSM，Holland获得)以及Purastar OxAm和Powerase^TM(可从Danisco A/S获得)。

其它可用的淀粉酶为CGT酶(环糊精葡聚糖转移酶，EC2.4.1.19)，例如可从芽孢杆菌属、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobactor或Thermoanaerobacterium)的菌种获得的那些。

半纤维素酶

在其他实施方案中，本发明中使用半纤维素酶。半纤维素酶是植物细胞壁中最复杂的一类非淀粉多糖。它们由木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和/或葡萄糖的聚合物组成，通常高度支化，并与其它细胞壁结构相连。本发明的半纤维素酶因此包括具有木聚糖分解活性，阿拉伯糖分解活性，半乳糖分解活性和/或甘露糖分解活性的酶。本发明的半纤维素酶可例如选自木聚糖酶(EC3.2.1.8，EC3.2.1.32，和EC3.2.1.136)，木葡聚糖酶(EC3.2.1.4和EC3.2.1.151)，阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)，乙酰木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)，葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.31，EC3.2.1.56，EC3.2.1.128和EC3.2.1.139)，葡聚糖水解酶(EC3.2.1.11，EC3.2.1.83和EC3.2.1.73)，阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)，香豆酸酯酶(EC3.1.1.73)，甘露聚糖酶(EC3.2.1.25;EC3.2.1.78和EC3.2.1.101)，阿拉伯糖苷酶(EC3.2.1.88)，阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)，半乳聚糖酶(EC3.2.1.89，EC3.2.1.23和EC3.2.1.164)和苔聚糖酶(lichenases)(EC3.2.1.73)。然而，这不应认为是穷举性的列表。

甘露聚糖酶对于本发明是优选的半纤维素酶。甘露聚糖酶水解由半乳甘露聚糖构成的生物聚合物。含有甘露聚糖的污迹常常包括瓜尔胶和刺槐豆胶，它们在食品和化妆品中广泛用作稳定剂。合适的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。在一个优选实施方案中，所述甘露聚糖酶来源于芽孢杆菌属的菌株特别是芽孢杆菌属菌种I633，公开于WO99/64619(通过提述并入本文)的SEQ ID NO:2的位置31至330或SEQ IDNO:5，或来源于Bacillus agaradhaerens，例如来自模式株DSM8721。合适的可商购的甘露聚糖酶是由Novozymes A/S生产的或Genencor(Danisco的一个部门)生产的Purabrite^TM。

木聚糖酶对于本发明是优选的半纤维素酶。合适的可商购的木聚糖酶是

HC(可从Novozymes A/S获得)。

果胶酶

在其他实施方案中，本发明中使用果胶酶。术语果胶酶或果胶分解酶旨在包括任何根据本领域定义的果胶酶，其中果胶酶是一组催化糖苷键切割的酶。基本上存在三种类型的果胶分解酶：果胶酯酶，其仅从果胶去除甲氧基残基，多种解聚酶，和原果胶酶，其溶解原果胶以形成果胶(Sakai等,(1993)Advances in Applied Microbiology vol.39pp213-294)。可用于本发明的果胶酶或果胶分解酶的实例是果胶酸裂合酶(EC4.2.2.2和EC4.2.2.9)，多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15和EC3.2.1.67)，多聚甲基半乳糖醛酸酶，果胶裂合酶(EC4.2.2.10)，半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)，阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)和/或果胶酯酶(EC3.1.1.11)。

合适的果胶分解酶包括描述于WO99/27083，WO99/27084，WO00/55309和WO02/092741的那些。

合适的果胶酸裂合酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。在一个优选实施方案中，所述果胶酸裂合酶来源于芽孢杆菌属的菌株，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)的菌株，特别是在WO02/092741的实施例6中公开的SEQ ID NO:2或其变体所公开的枯草芽孢杆菌DSM14218(通过提述并入本文)或WO03/095638中公开的变体(通过提述并入本文)。或者，所述果胶酸裂合酶来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株，特别是WO99/27083中作为SEQ ID NO:8公开的果胶酸裂合酶(通过提述并入本文)或如WO02/06442中所述的其变体。

合适的可商购的果胶酸裂合酶为Novozymes A/S生产的或X

纤维素酶

本发明的方法可进一步包括与本发明中定义的具有内切葡聚糖酶活性的多肽不同的其它纤维素酶。在本文的语境中，术语“纤维素酶”或“纤维素分解酶”指催化纤维素降解为葡萄糖、纤维二糖、三糖和其它纤维寡糖的的酶，该酶理解为包括成熟蛋白或其前体形式或其功能片段，例如催化活性模块，其基本上具有全长酶的活性。此外，术语“纤维素分解”酶旨在包括所述酶的同源物或类似物。合适的纤维素酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源的。纤维素分解酶可以是存在于由给定微生物产生的纤维素酶系统中的组分，这样的纤维素酶系统大多包括几种不同的纤维素酶组分，包括通常被鉴定为例如纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶，和β-葡糖苷酶的那些。在一个优选实施方案中，所述纤维素酶是内切葡聚糖酶。

可用于本发明的方法中的商业上可获得的纤维素酶产品的实例为：

Novoprime A(均来自Novo Nordisk A/S，DK-2880Bagsvaerd，Denmark)；Indiage^TM，Primafast^TM(两者均来自GenencorInternational Inc.，U.S.A.)；Powerstone^TM(来自Iogen，Canada)；Ecostone^TM(来自Alko，Finland)；Rocksoft^TM(来自CPN，U.S.A.)，和Sanko Bio^TM(来自Meiji/Rakuto Kasei Ltd.，Japan)。

纺织品制造工艺

将织物如纤维素材料的织物加工就绪以供衣物制造涉及数个步骤：将纤维纺(spin)至纱线上，从纱线构建织造或针织织物；和后续的前处理(preparation)工艺，染色/印花，和整理操作。前处理工艺对于在例如染色/印花和整理之前，从织物去除天然和人为诱导的杂质和改善其美学外观和可加工性是必需的。常见的前处理工艺包括退浆(对于织造物)，煮炼(scouring)和漂白，产生适于染色或整理的织物。

通过将在织机的纵向伸展的经纱(warp yarn)之间织造“纬纱”(fillingyarn/weft yarn)来构建织造织物。经纱在织造之前必须经上浆(size)，以使其润滑并保护其不在制造过程中受纬纱的高速插入而磨蚀。常见的上浆剂(sizeagent)是淀粉(或淀粉衍生物和修饰的淀粉)，聚乙烯醇，羧甲基纤维素(即CMC)，其中主要是淀粉。上浆混合物中经常包含石蜡、丙烯酸粘合剂(acrylicbinder)和多种润滑剂。可将纬纱以“一上-一下(over one-under next)”的方式(平纹组织(plain weave))或通过“一上-二下(over one-under two)”的方式(斜纹(twill))或任何多种其它排列来穿过经纱织造。一般而言，外套(dresses)、衬衫、短裤(pants)、被单(sheeting)、毛巾、绸缎(drapery)等从织造织物生产。在制造了织物之后，必需再次去除织物上的浆(即退浆)。

针织是通过将咬合的纱线线圈连接在一起来形成织物。与从两种类型的纱线构建并具有许多“末端”的织造相对，针织的织物从单根连续的纱线股产生。与织造一样，存在许多不同方法来将纱线环绕(loop)在一起，且最终织物性质取决于纱线以及针织类型。内衣、针织套衫(sweater)、袜子、运动衫(sportshirt/sweat shirt)等来源于针织织物。

退浆

退浆是在织成的织物中从经纱降解和/或去除上浆化合物。淀粉通常通过酶退浆步骤去除。此外，有时使用氧化退浆和用酸或用碱的化学退浆。

在一些实施方案中，所述退浆酶是淀粉分解酶，如α-淀粉酶，β-淀粉酶，甘露聚糖酶，葡糖淀粉酶，或其组合。

合适的α-和β-淀粉酶包括细菌或真菌来源的那些，以及此类淀粉酶的化学或遗传修饰的突变体和变体。合适的α-淀粉酶包括可从芽孢杆菌属种获得的α-淀粉酶。合适的商业性淀粉酶包括但不限于

NEXT，FLEX and

COOL(均来自Genencor International Inc.)，以及DURAMYL^TM，ERMAMYL^TM，FUNGAMYL^TM TERMAMYL^TM，AUQAZYME^TM和BAN^TM(均可从Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark获得)。

其它合适的淀粉分解酶包括CGT酶(环糊精葡聚糖转移酶(cyclodextringlucanotransferase)，EC2.4.1.19)，例如从芽孢杆菌属、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobactor或Thermoanaero-bacterium)获得的那些。

煮炼

煮炼用于从纤维去除杂质，溶胀纤维，和去除种皮(seed coat)。它是最关键的步骤之一。煮炼的主要目的是a)均匀地清洁织物；b)软化尘屑(mote)和其它杂质(trash)，c)改善织物吸收性，d)皂化和溶解脂肪、油和蜡，和e)最大程度地减少未成熟的棉。在大约沸腾温度进行的氢氧化钠煮炼对于100%棉是确立的处理方法，而氢氧化钙和碳酸钙使用较少。合成的纤维在更加温和的条件下煮炼。表面活性剂和螯合剂对于碱性煮炼是必需的。已引入了酶法煮炼，其中纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、脂肪酶和蛋白酶均报道为具有煮炼作用。

漂白

漂白是对色素颜色和/或有色杂质的破坏以及种皮碎片去除。它是最关键的化学处理，因为必须维持白度(degree of whiteness)与纤维损伤之间的平衡。漂白通过使用氧化或还原化学进行。氧化剂可进一步细分为采用或生成：a)次氯酸根(OCl^-)，b)二氧化氯(ClO₂)，和过氧化氢种类(OOH^-和/或

)的那些。还原剂通常为二氧化硫，亚硫酸氢盐/连二亚硫酸盐(hydrosulfite salt)等。已报道了使用葡糖氧化酶的酶法漂白。传统上，在该工艺中使用过氧化氢。

印花和染色

纺织品的印花或染色通过将染料以任何将染色物质(dyestuff)结合于纺织品中纤维的合适方法施于纺织品来进行。纺织品的染色例如通过将织物经过染料的浓缩溶液，接着将湿织物储藏于蒸汽密封的容器(vapour tight enclosure)以给予染料扩散和与织物物质反应的时间，接着将未反应的染料漂洗去来进行。或者，可将染料通过在漂洗之前纺织品的后续蒸煮来固定。染料包括合成和天然染料。通常的染料是具有阴离子型官能团者(例如酸性染料，直接染料，Mordant染料和活性染料(reactive dye))，具有阳离子型基团者(例如碱性染料)，在施用之前需要化学反应者(例如瓮染料(vat dye)，硫染料和偶氮染料)，分散染料，和溶剂染料。

过量的、未结合于纤维的可溶性染料在染色之后必须去除，以确保经染色的纺织品的色牢度(fastness)，并防止在消费者洗涤纺织品过程中不希望的染料转移。一般地，需要大量水以供完全去除过量的染料。在常规工艺中，将经印花或染色的纺织品首先用冷水漂洗，然后在高温添加用于减少返沾色的合适的添加剂(如聚乙烯基吡咯烷酮(PVP))洗涤。

用于从经染色的织物用漂洗液去除过量染料的酶法工艺公开于WO99/34054，所述液包含至少一种过氧化氢酶，氧化剂和至少一种介导物，如包含过氧化物酶，过氧化氢和如1-羟基-苯并三唑(1-hydroxy-benzotriazole)的介导物的液。

生物抛光

如用于本文中，术语“生物抛光”，“去球(depilling)”和“抗起球(anti-pilling)”可互换使用。

若不施用整理组分，大多数棉织物和棉混纺织物的手感(handleappearance)相当硬(hard)和僵(stiff)。织物表面也并平滑，因为有小的绒状微纤维从该表面突出。此外，在相对较短时间的磨损之后，在织物表面出现起球，因此给予其无吸引力的、穿旧的(worn)外观。

生物抛光是在纤维素性织物的制造过程中通过酶如纤维素酶对其进行处理的方法，改善织物“起球形成减少”方面的品质。生物抛光最重要的作用可表征为较少的起毛和起球，增加的光泽(gloss/luster)，改善的织物手感，增加的可持续柔软性(durable softness)，和/或改善的水吸收性。生物抛光通常在针织和织造织物或衣物的制造的湿加工中进行。湿加工包括下述步骤例如退浆、煮炼、漂白、洗涤、染色/印花和整理等步骤。生物抛光可在任何湿法步骤之后作为单独步骤，或与任何这些湿法步骤组合进行。

用于制造本发明的纺织品的方法，通过用本文中定义的具有内切葡聚糖酶活性但不含功能性CBM的分离的多肽处理纺织品，可应用于生物抛光工艺。

在一个实施方案中，本发明提供了用于获得起球形成减少的纤维素性纺织品或含纤维素纺织品的方法，所述方法包括在水溶液中用具有内切葡聚糖酶活性的多肽处理纺织品。在该实施方案中，生物抛光方法可应用于纱线、织物或衣物。

在本文的语境中，术语“减少的起球形成”意指在根据本发明的方法处理(生物抛光)过的织物表面的表面上，与未经酶处理的织物相比，对起球形成的抗性。就本发明的目的而言，所述起球形成可根据材料和方法部分中的“起球度测试(pilling notes test)”来加以测试。该测试的结果表示为“起球度”的形式，其为从起球度1(严重起球形成)至起球度5(无起球形成)的量度的等级，允许1/4单位的起球度。

由于本发明的酶催化纤维素性纤维表面的水解，酶作用最终会导致纤维或织物的重量损失。在一个优选实施方案中，尽管以获得纤维表面受控的部分水解的方式进行生物抛光，现已获得不具有过分的织物强度损失的合适抛光作用。

就本发明的目的而言，在实施例5中指明的条件下测量生物抛光作用，即将本发明的多肽在Launder-O-Meter(LOM)中在55℃，pH6.5处理1小时，其中酶剂量为0.63mg/g织物，而LAS浓度为0.5g/L。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的多肽显示至少3，优选至少3.2，更优选至少3.4，更优选至少3.6，更优选至少3.7，更优选至少3.8，更优选至少3.9，最优选至少4的起球度，而同时优选显示少于10%，优选少于8%，更优选少于7%，更优选少于6%，更优选少于5%，更优选少于4%，更优选少于3.8%，更优选少于3.6%，更优选少于3.5%，更优选少于3.4%，更优选少于3.3%，更优选少于3.2%，更优选少于3.1%，最优选少于3%的重量损失。

应理解的是本发明的方法可在任何常规的湿法纺织品处理步骤中，优选在纺织品织物的退浆或漂白之后，与常规的工艺步骤同时进行或作为附加的工艺进行。本方法通常在高速循环系统如溢流喷射染色机(jet-overflow dyeingmachine)，高速卷扬机(high-speed winch)和卷染机(jigger)中完成。可用的高速系统的实例是由Biancalani,Italy制造的“Aero1000”。本发明的方法可在分批、连续或半连续装置如J-Box中，在轧卷机(Pad-Roll)上，或在轧浴(Pad-Bath)中进行。。

粗斜棉布织物的制造

一些染色的织物，如粗斜棉布织物，需要纱线在织造之前染色。对于粗斜棉布织物，经纱例如用靛蓝染色，并在织造之前上浆。优选地，粗斜棉布纱线的染色是环染。本发明的一个优选实施方案是用瓮染料如靛蓝，或与靛蓝相近的染料如硫靛蓝，或硫染料，或直接染料，或活性染料，或萘酚对纱线进行环染。亦可用超过一种染料对纱线染色，例如首先用硫染料，然后用瓮染料染色，或反之。

优选地，在对纱线进行染色之前对其进行煮炼和/或漂白，以取得更高品质的粗斜棉布织物。一般而言，在织造为染色织物如粗斜棉布之后，对染色的织物或衣物继续进行至退浆阶段，优选随后进行生物石洗步骤和/或颜色调整步骤。

本文中所用的退浆工艺是与在本文语境中上文提及的相同的工艺。

在退浆之后，经染色的织物进行生物石洗步骤。生物石洗步骤可用酶和/或浮石进行。如用于本文，术语“生物石洗”，“石洗”和“磨蚀”可互换使用，意指在含有机械磨蚀剂如浮石，磨蚀纤维素酶、或其组合的水性介质中搅拌粗斜棉布，以提供“经石洗的”外观(即在粗斜棉布表面中局部的颜色密度的差异)。在所有情况下，去除染料都需要机械作用，且该处理通常在洗衣机如转筒洗衣机(drum washer)、滚筒洗衣机(belly washer)中进行。作为不均匀的染料去除的结果，在染色区和染料去除区之间存在反差，这表现为局部的颜色密度差异。用纤维素酶处理可完全替代用浮石处理。然而，纤维素酶处理亦可与浮石处理组合，当需要产生高度磨蚀的整理(finish)时。

就本发明的目的而言，使用磨蚀水平以指示颜色密度的局部差异，其在如实施例4中指明的条件下测量，通过用本发明的多肽在Launder-O-Meter(LOM)中在30℃，pH6.5处理2小时，其中酶剂量为0.05mg/g织物。在本发明的一个优选实施方案中，所述具有磨蚀作用的内切葡聚糖酶显示至少0.5ΔL*单位，优选至少1，更优选至少1.2，更优选至少1.3，更优选至少1.5，更优选至少1.6，更优选至少1.7，更优选至少1.8，更优选至少1.9，更优选至少2，更优选至少2.1，更优选至少2.2，更优选至少2.3，更优选至少2.4，更优选至少2.5，更优选至少2.6，甚至更优选至少2.7，甚至最优选至少2.8ΔL*单位。ΔL*单位在材料和方法部分“颜色测量”下定义。

在用纤维素酶处理或通过常规洗涤工艺之后从粗斜棉布去除的染料可导致靛蓝在粗斜棉布材料上“返沾色”或“再沉积”，例如蓝线的重新着色或白线着上蓝色，导致蓝线和白线之间的反差减少。一般而言，磨蚀水平越高会导致返沾色水平越高，因为更多染料被去除并重新沉积至织物。导致高磨蚀水平但低返沾色水平的工艺对于纺织品制造是理想的。为了测量工艺是否能够实现低返沾色水平，应在当两个工艺均达到类似的磨蚀水平(即类似的ΔL*单位)时，将来自一个工艺的ΔL*单位与对照工艺相比，因为类似的磨蚀水平一般意指由工艺去除类似量的染料。

就本发明的目的而言，低返沾色水平是在如实施例4中规定的条件下测量的，通过在LOM中用本发明的多肽在30℃，pH6.5处理2小时，其中酶剂量为0.025-0.1mg/g织物，以实现当与如实施例4中所述使用对照酶(TtCel45a(CBM+)的成熟多肽)的结果相比较时，以纺织品表面上的ΔL*表示的同等的磨蚀水平。应针对在本发明和对照工艺中获得的数据，分别使用ΔL*单位作为水平坐标，Δb*单位作为垂直坐标画曲线。应将本发明的返沾色水平(Δb*)与对照工艺在曲线上相同ΔL*单位下的返沾色水平进行比较。在本发明的一个优选实施方案中，为了获得在纺织品表面上相同的磨蚀水平，当与如实施例4中来自使用对照酶(Tt Cel45a(CBM+)的成熟多肽)的结果相比较时，具有低返沾色作用的内切葡聚糖酶显示至少0.1Δb*单位增加，优选至少0.2，更优选至少0.3，甚至更优选至少0.4Δb*单位增加。Δb*单位在本发明的材料和方法部分中定义。

磨蚀通常继以第三步骤，即后处理(after-treatment)，其一般包括洗涤和漂洗步骤，在此过程中，可使用去污剂、光学增亮剂、漂白剂或软化剂。

用于制造本发明的纺织品的方法，通过用本文中定义的具有内切葡聚糖酶活性但不含功能性CBM的分离的多肽处理纺织品，可应用于生物石洗工艺。

在一个实施方案中，本发明提供了用于向经染色的织物或衣物导入颜色密度中的局部差异的方法，其中所述方法包括将织物或衣物与本发明中定义的具有内切葡聚糖酶活性的多肽相接触的步骤。优选地，经染色的织物或衣物是纤维素性或含纤维素的织物或衣物。更优选地，经染色的织物是粗斜棉布织物，甚至更优选地，是经靛蓝染色的粗斜棉布织物。

在另一个实施方案中，本发明提供一种粗斜棉布制造工艺，其包括：a)将粗斜棉布织物退浆；b)用具有内切葡聚糖酶活性但不含功能性CBM的多肽将粗斜棉布生物石洗；c)漂洗。

本发明的工艺可在常规条件下在常规地用于石洗的洗衣机例如洗衣机-脱水机(washer-extractor)、滚筒洗衣机等中进行。本发明的酶应以有效量添加。

用于纺织品的酶组合物

本发明进一步涉及用于纺织品的酶组合物，其包含一种或多种本发明中定义的多肽。

所述纺织品组合物可适于特定用途，如生物石洗或生物抛光。其可提供至少一种纺织品益处，例如起球形成减少，织物重量损失减少，增加的磨蚀水平和低返沾色水平。

所述纺织品组合物可进一步包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶、氧还酶、过氧化物酶、漆酶和转移酶。

所述纺织品组合物通常包含常规成分，包括但不限于其它酶，以及表面活性剂、稳定剂、润湿剂、分散剂、消泡剂、润滑剂、洗涤助剂系统(builder system)等，或其混合物，其提供涉及例如强度、对起球的抗性、水吸收性和可染色性(dyeability)的较佳作用。

所述纺织品组合物可为任何形式，如固体、液体、糊、凝胶或其任意组合。

工艺条件

优选地，在本发明中，将用具有内切葡聚糖酶活性但不含功能性CBM的分离的多肽处理纺织品的方法应用于生物石洗或生物抛光工艺。所有下述工艺条件均适用于生物石洗和生物抛光工艺两者。

目前建议在本发明中使用的合适的液/纺织品比例可为约20:1至约1:1的范围，优选约15:1至约3:1的范围，更优选15:1至5:1的范围(体积/重量，ml/mg)。

在常规“生物石洗”或“生物抛光”工艺中，反应时间通常在约10分钟至约8小时的范围，优选所述反应时间在约20分钟至约180分钟的范围，更优选反应时间在约30分钟至约120分钟的范围。

反应介质的pH在很大程度上取决于所讨论的酶。优选地，本发明的工艺在约pH3至约pH11的范围，优选约pH4至约pH8的范围，或约pH4.5至约pH7.5的范围的pH进行。

本发明的工艺能够在低于90℃，优选低于75℃，更优选低于65℃，更优选低于50℃，更优选低于40℃，甚至更优选低于30℃的温度起作用。

在一些实施方案中，本发明的工艺在5至90℃，优选10至80℃，更优选10至75℃，更优选15至65℃，更优选20至50℃，更优选20至40℃，和甚至更优选20至30℃的温度范围进行。

酶剂量在很大程度上取决于酶反应时间和酶活性，即相对较短的酶反应时间或低酶活性需要相对增加的酶剂量，反之亦然。一般而言，酶剂量可依照可能的反应时间而规定。

根据本发明的方法要使用的具有内切葡聚糖酶活性但不含功能性CBM的多肽的量取决于许多因素。根据本发明水性介质中本发明的多肽的浓度可为约0.001至约10毫克(mg)酶蛋白每克(g)织物，优选0.02-5毫克酶蛋白每克织物，更优选0.05-2毫克酶蛋白每克织物。

本发明的方法可提供下述对纺织品的益处：在生物石洗工艺过程中增加的磨蚀作用和/或减少的返沾色水平。

本发明的方法可提供下述对纺织品的益处：在生物抛光工艺过程中在阴离子型表面活性剂存在下的起球形成低，但不导致实质的织物重量损失。

实施例

材料和方法

Novoprime A(具有CBM截短的单组分特异腐质霉(Humicolainsolens)GH45内切葡聚糖酶产品，商业上可从Novozymes A/S获得)

颜色测量

粗斜棉布的磨蚀水平和返沾色水平通过用预校正的DataColor SF450X测量反射率来确定，或者可使用等效的装置。对于每个样品取四个读数，并使用读数的平均值。用CIE L*指标在样品的蓝色面(正面)上评价磨蚀水平，而用CIE b*指标在样品的背面上评价返沾色水平。

L*表示黑白(white/black)在0至100的尺度上的变化，L*的减少意味着黑色的增加(白色的减少)，而L*的增加意味着白色的增加(黑色的减少)。ΔL*单位=用某种纤维素酶处理过的样品(swatch)的L*-在纤维素酶处理之前样品的L*。ΔL*单位越大，粗斜棉布的磨蚀水平越高，例如ΔL*单位为4的磨蚀水平比ΔL*单位为3更高。

b*表示蓝/黄的变化，b*的减少意味着蓝色的增加(黄色的减少)，而b*的增加意味着黄色的增加(蓝色的减少)。Δb*单位=用某种纤维素酶处理过的样品的b*-在纤维素酶处理之前样品的b*。Δb*单位越大对应的返沾色水平越低，例如Δb*单位为-1.5的返沾色水平比Δb*单位为-2.5更低。

重量损失确定

将样品置于经调理的房间中(65%+/-5%湿度，20+/-1℃)24小时，然后将它们编号，用分析天平(对于低于100g的样品)或精密天平(对于高于100g的样品)称重并记录。在处理之后，将所有样品滚筒烘干(AEG,LAVATHERM37700,Germany)1小时，并在与上述相同的经调理的房间中调理24小时。对于每个样品，重量损失定义如下：

重量损失=(处理之前的重量-处理之后的重量)/处理之前的重量X(100%)

起球度测试

对将在标准气氛(65%湿度，20℃)中预调理至少24小时的织物(包括经处理和未经处理的)用Nu-Martindale Tester(James H.Heal Co.Ltd,England)测试起球度，其中未经处理的织物与经磨蚀的织物的类型相同。在2000个回转(Revolutions)之后进行标准起球测试(Swiss Norm(SN)198525)，按1-5打分，其意义定义如下，其中1显示抗起球差，而5显示抗起球性质优异。因此Martindale起球度得分越高，内切葡聚糖酶生物抛光处理就越有效。

5度：无起球

4度：略微起球

3度：中等起球

2度：明显起球

1度：严重起球

允许1/2，1/4度。

为了使得测试结果更可靠，每个样品由不同的人进行三次单独读数，并采用3次读数的平均值作为起球度的最终结果。

蛋白含量

酶产物中的酶蛋白可用BCA^TM蛋白质测定试剂盒(产品号23225，商业上可从Thermo Fisher Scientific Inc.获得)根据产品说明书来测量。

实施例1：从基因组DNA克隆Tt Cel45a(CBM+)和Tt Cel45a(CBM-)

从如WO96/29397(通过提述并入本文)的实施例1A中所述的土生梭孢霉NRRL8126的基因组DNA克隆野生型GH45内切葡聚糖酶基因。

使土生梭孢霉在PDA琼脂平板中37℃生长4至5日。将菌丝体直接从琼脂平板收集到经灭菌的研钵中，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体用研钵和杵磨碎成细微粉末，并使用

植物迷你试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)分离基因组DNA。

然后根据WO98/12307(通过提述并入本文)的实施例1进行突变，其中根据WO98/12307的表1中的土生梭孢霉纤维素酶序列(e)将位置119处的谷氨酰胺(Q)用组氨酸(H)取代。该突变对应于本发明的SEQ ID NO:2中的Q141H。将PCR片段连接入pGEM-T(Promega Corporation,Madison,WI,USA)。这样得到一个质粒DNA，命名为Plasmid1。

设计了寡核苷酸引物，有义引物1和反义引物1，来扩增TtCel45a(CBM+)，并设计了有义引物1和反义引物2来扩增Tt Cel45a(CBM-)基因。使用In-fusion CF干式(Dry-down)克隆试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA,USA)将片段直接克隆入表达载体pPFJO355，而无需限制性消化和连接。

有义引物1(SEQ ID NO:5)：5’acacaactggggatcC ACCatgcgctctactcccgttcttc3’

反义引物1(SEQ ID NO:6)：5’GTCACCCTCTAGATCTGACGAAGTTGACGGT CTCCTTG3’

反义引物2(SEQ ID NO:7)：5’GTCACCCTCTAGATCTCACCTCGTGCGAAAA GCTGTTTAGA3’

下划线粗体字母代表编码序列(有义引物1和反义引物2)或编码区的下游序列(反义引物2)。在所得的克隆中应包含终止密码子。剩余序列与pPFJO355的插入位点相同。

表达载体pPFJO355含有来源于米曲霉的TAKA-淀粉酶启动子和黑曲霉葡糖淀粉酶终止子元件。此外，pPFJO355具有用于在大肠杆菌中选择和繁殖的pUC18来源的序列，和pyrG基因，其编码来源于构巢曲霉、用于选择pyrG突变体曲霉属菌株的转化体的乳清苷脱羧酶。

对于Tt Cel45a(CBM-)基因：

将各20皮摩尔的有义引物1和反义引物2用于PCR反应，所述反应包含质粒DNA Plasmid1，10μl的5X GC缓冲液，1.5ul的DMSO，1.5ul的10mMdNTP和0.6单位的Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)，最终体积为50μl。扩增使用Peltier Thermal Cycler(M J Research Inc.,South San Francisco,CA,USA)进行，其编程如下：在98℃变性1分钟；8个循环，每个循环在98℃变性15秒，在68℃退火30秒，其中每个循环增加1℃，和在72℃延伸75秒；和另外22个循环，每个循环在98℃进行15秒，在65℃进行30秒和在75℃进行75秒；在72℃最终延伸5分钟。然后加热块进入4℃浸泡循环。

将反应产物通过使用90mM Tris-硼酸和1mM EDTA(TBE)缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，其中从凝胶切出～0.8kb产物条带，并使用GFXPCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)根据生产商的指示进行纯化。

对于Tt Cel45a(CBM+)基因：

将各20皮摩尔的有义引物1和反义引物1用于PCR反应，所述反应包含质粒DNA Plasmid1，10μl的5X GC缓冲液，1.5ul的DMSO，1.5ul的10mMdNTP和0.6单位的Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)，最终体积为50μl。扩增使用Peltier Thermal Cycler(M J Research Inc.,South San Francisco,CA,USA)进行，其程序如下：在98℃变性40秒；8个循环，每循环在98℃变性15秒，在70℃退火30秒，其中每个循环增加1℃，和在72℃延伸80秒；和另外23个循环，每个循环在98℃进行15秒，在62℃进行30秒和在72℃进行80秒；在72℃最终延伸5分钟。加热块然后进入4℃浸泡循环。

将反应产物通过使用90mM Tris-硼酸和1mM EDTA(TBE)缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，其中从凝胶切出～1.0kb产物条带，并使用GFXPCRDNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)根据生产商的指示纯化。

将质粒pPFJO355用Bam I和Bgl II消化，通过使用TBE缓冲液的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒根据生产商的指示纯化。

将基因片段Tt Cel45a(CBM+)或Tt Cel45a(CBM-)，以及经消化的载体使用In-fusion CF干式PCR克隆试剂盒连接在一起，得到pRenoCBD和pRenoCore(分别见图1和2)。Tt Cel45a(CBM+)和Tt Cel45a(CBM-)基因的转录在来自米曲霉α-淀粉酶的TAKA-淀粉酶启动子调控下。克隆操作根据生产商的指示进行。简言之，将30ng的用Bam I和Bgl II消化的pPFJO355和100ng的Tt Cel45a(CBM+)或Tt Cel45a(CBM-)基因纯化的PCR产物添加至反应小瓶，并添加去离子水将粉末重悬于10ul的最终体积。将反应在37℃温育15分钟，然后在50℃温育15分钟。使用3μl的反应物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司，中国北京)。通过菌落PCR检测含有pRenoCBD或pRenoCore的大肠杆菌转化体，并使用QIAprep Spin小提试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)制备质粒DNA。通过使用3730XLDNA分析仪(Applied Biosystems Inc,Foster City,CA,USA)的DNA测序确认插入pRenoCBD的Tt Cel45a(CBM+)基因和插入pRenoCore的TtCel45a(CBM-)。Tt Cel45a(CBM-)和Tt Cel45a(CBM+)基因的基因组DNA序列分别示于SEQ ID NO:1和3。Cel45a(CBM-)基因的推导的氨基酸序列示于SEQID NO:2，其中氨基酸1-21构成信号肽，而氨基酸22至237构成催化模块的成熟多肽。Cel45a(CBM+)基因的推导的蛋白序列示于SEQ ID NO:4，其中氨基酸1-21构成信号肽而氨基酸22至299构成具有催化模块、接头(氨基酸238至261)和CBM(氨基酸262至299)的成熟多肽。

实施例2：Tt Cel45a(CBM+)和Tt Cel45a(CBM-)基因在米曲霉中的表达

米曲霉HowB101(描述于WO9535385实施例1，通过提述并入本文)原生质体根据Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中所述的方法制备。使用3μg的pRenoCBD或pRenoCore转化米曲霉HowB101。

用pRenoCBD或pRenoCore转化米曲霉HowB101均产生了约50个转化体。将四个转化体分离至单独的基本培养基平板。

将四个转化体分别接种入24孔板中3ml的YPM培养基(1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%麦芽糖)，并在30℃，150rpm温育。在温育3日之后，将来自每个培养物的20μl的上清在NuPAGE Novex4-12%Bis-Tris Gel w/MES(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)上根据生产商的指示进行分析。将所得的凝胶用Instant Blue(Expedeon Ltd.,Babraham Cambridge,UK)染色。培养物的SDS-PAGE概貌显示大多数转化体具有大约38kDa(对于TtCel45a(CBM+))和25kDa(对于Tt Cel45a(CBM-))的主要条带。表达菌株分别命名为菌株-1和菌株-2。

将一个转化体(命名为菌株-1的转化体-2)的斜面培养物，和一个转化体(亦命名为菌株-2的转化体-2)的斜面培养物各用10ml的YPM洗涤，并分别接种入8个各含有400ml的YPM培养基的2升烧瓶，以生成用于表征酶的培养液。在第3日通过将培养物对

(CALBIOCHEM,Inc.LaJolla,CA,USA)过滤来收获培养物。然后将经过滤的培养液再次使用0.45μmDURAPORE膜(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤。

实施例3：Tt Cel45a(CBM+)和Tt Cel45a(CBM-)的成熟多肽的纯化

将实施例2中所述的菌株-1的转化体-2的3000ml上清用硫酸铵(80%饱和)沉淀，并重新溶解于100ml25mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0，然后针对相同缓冲液进行透析，并通过0.45nm过滤器进行过滤，最终体积为200ml。将溶液加载于在25mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0中平衡的50ml Q FF柱，并用线性NaCl梯度(0–0.4M)洗脱蛋白。汇集具有针对AZCL-β-葡聚糖(对于内切葡聚糖酶的底物，可从Megazyme获得)的活性的级分。然后将汇集的溶液通过超滤浓缩。Tt Cel45a(CBM+)的纯化的成熟多肽根据SDS-PAGE分析判断为至少95%纯。

将实施例2中所述的菌株-2的转化体-2的3000ml上清用硫酸铵(80%饱和)沉淀并重新溶解于100ml25mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0，然后针对相同缓冲液进行透析，并通过0.45nm过滤器进行过滤，最终体积为200ml。将溶液加载于在25mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0中平衡的40ml Q FF柱(Phamacia)，并用线性NaCl梯度(0–0.4M)洗脱蛋白。仅将对AZCL-β-葡聚糖(Megazyme)显示活性的蛋白通过超滤来浓缩，并施于在25mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0中平衡的S-100柱(Phamacia)。汇集具有针对AZCL-β-葡聚糖(Megazyme)的活性的级分。然后将汇集的溶液通过超滤浓缩。Tt Cel45a(CBM-)的纯化的成熟多肽根据SDS-PAGE分析判断为至少95%纯。

实施例4：在Launder-O-Meter中用Tt Cel45a(CBM+)和Tt Cel45a(CBM-)的成熟多肽进行的粗斜棉布磨蚀

将实施例3中获得的Tt Cel45a(CBM+)的成熟多肽(即SEQ ID NO:4的氨基酸22至299)和Tt Cel45a(CBM-)的成熟多肽(即SEQ ID NO:2的氨基酸22至237)在Launder-O-Meter(LOM,SDL-Atlas LP2)中在两个温度30℃和50℃下进行了测试。比较了磨蚀水平和返沾色水平。

将生粗斜棉布退浆并切割为12.5cm高和23cm长。对粗斜棉布进行剪切和缝纫，形成高12.5cm、重约14g的管。将管置于经调理的房间(65%相对湿度，20℃)24小时，然后将它们编号，用分析天平称重，并记录。在每个500ml烧杯中放置一根经调理的管，蓝色面向内。对于每个烧杯，使用30个大螺母(M10M6M-SR-A4-80，耐酸的)，10个小螺母(M6M6M-SR-A4-80，耐酸的)，7个大的星形磁铁(直径17mm，产品号3-CO-411117,Cowie,Schweizvia Bie&Berntsen)，和3个小的星形磁铁(直径14mm，产品号3-CO-11117,Cowie,Schweiz via Bie&Berntsen)提供机械协助。然后根据表1基于实际织物重量的计算添加缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH=6.5)和酶溶液，以使总体积为大约50ml，可构成大约3.8:1(v/w ml/g)的液体对织物比。

同时，将Launder-O-Meter(LOM)机器在选择所需程序之后启动，该机器当温度达到预设的温度(30℃或50℃)时会保持。给每个烧杯盖上内衬有2个氯丁橡胶(neoprin)垫圈的盖，并用金属卡装装置(clamping device)紧密封闭。将烧杯加载入经预热的LOM。使用金属架容纳6个烧杯并将它们以水平姿势固定于4个筒(drum)位置的每一个中。封闭LOM盖，并继续洗涤程序，并开始计时。2小时之后，移出所有烧杯，并将粗斜棉布样品转移至灭活溶液(2g/L碳酸钠)在85℃保持10分钟。然后将样品在热水中漂洗2次，并在冷水中漂洗2次。将粗斜棉布样品滚筒烘干(tumble dry)(AEG,LAVATHERM37700,Germany)，然后在20℃，65%相对湿度调理24小时，再进行评估。

粗斜棉布样品的磨蚀和返沾色水平通过用预校正的DataColor SF450X测量内切葡聚糖酶处理前和处理后的反射率来确定。对于L*和b*两者，对于每个织物进行4次读数，并使用四次读数的平均值。磨蚀水平通过样品的蓝色面的指标CIE L*的变化来反映，而返沾色水平通过样品的背面的指标CIE b*的变化来反映。

如表1中所示，Tt Cel45a(CBM-)，即不含CBM的内切葡聚糖酶，与含CBM的内切葡聚糖酶(Tt Cel45a(CBM+))相比，当加载相同量的蛋白时，显示更高的粗斜棉布磨蚀水平ΔL*。且当在更低的温度30℃进行比较时，该性能差异变得更为显著。

Tt Cel45a(CBM-)亦在同等磨蚀水平下返沾色较低的方面显示优势，如表1所示。例如，当在50℃使用Tt Cel45a(CBM+)达到4.7的ΔL*和在50℃使用Tt Cel45a(CBM-)达到5.3的ΔL*时，使用Tt Cel45a(CBM-)(-2.3)显示的返沾色水平比Tt Cel45a(CBM+)(-2.9)更低。若用ΔL*单位作为水平坐标而用Δb*单位作为垂直坐标对表1中获得的数据画曲线，该结论愈加明显，即在相同的磨蚀水平下，Tt Cel45a(CBM-)与Tt Cel45a(CBM+)相比显示较低的返沾色水平。

表1：在pH6.5在LOM中进行2小时的粗斜棉布磨蚀

实施例5：在LOM中用Tt Cel45a(CBM-)和Hi Cel45a(CBM-)的成熟多肽进行的生物抛光

对于Tt Cel45a(CBM-)的成熟多肽的CBM截短的分子和Novoprime A

(具有CBM截短的单组分特异腐质霉GH45内切葡聚糖酶产品)以不同量的LAS(线性烷基苯磺酸，Linear Alkylbenzene Sulfonate)(一种广泛用于纺织品、去污剂等的阴离子型表面活性剂)在Launder-O-Meter中进行生物抛光试验。

将针织的100%棉双罗纹组织织物切割为16.5cm*16.5cm,作为标准样品。将样品置于经调理的房间(65%湿度，20℃)中20小时，然后将它们编号，通过分析天平称重，并记录。每个500ml烧杯中放入两个经调理的样品。对于每个烧杯，在每个烧杯中使用20个大钢球(总重量220g)提供机械协助。然后基于酶溶液的计算添加缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH6.5)，总体积大约为100ml，其可构成约10:1(v/w)的液体对织物比。

在选择所需程序之后起始LOM机器，并当温度达到55℃时使其维持。为了比较类似的起球度下的重量损失，以不同剂量添加Tt Cel45a(CBM-)和来自Novoprime A的酶蛋白以达到类似的起球度。根据表2将不同量的LAS与63mg/L Tt Cel45a(CBM-)或21mg/L Novoprime A

中的酶蛋白一同加载至每个烧杯中。将烧杯密封并置于LOM，并在LOM中起始酶处理1小时。当时间到时，移出所有烧杯，并将样品转移至灭活溶液(2g/L碳酸钠)在85℃进行10分钟。然后将样品在热水中漂洗2次并在冷水中漂洗2次。将这些样品滚筒烘干，然后在20℃，65%相对湿度调理20小时，再进行评估。

如表2所示，Tt Cel45a(CBM-)与来自Novoprime A

的对应物相比显示好得多的与LAS的相容性：Tt Cel45a(CBM-)在0.5g/L LAS存在下(就重量损失性能而言)或高至0.8g/L LAS存在下(就起球度而言)保持了其原始性能。来自Novoprime A

的酶当LAS浓度为0.5g/L或更高时显著损失了其性能，在0.5g/l LAS浓度重量损失的下降暗示酶的失活。在同等的抗起球作用下，Tt Cel45a(CBM-)亦显示了重量损失较少的优势：例如，当达到4.4的起球度时，Tt Cel45a(CBM-)导致2.8%的重量损失，而Novoprime A

导致3.1%的重量损失。

Novoprime A

中的酶蛋白可通过BCA^TM蛋白质测定试剂盒测量。

表2：用不同量的LAS在pH6.5，55℃进行1小时的生物抛光

实施例6：功能性CBM的鉴定

使用下述方法测量多肽的功能性CBM，以鉴定具有内切葡聚糖酶活性但缺乏功能性CBM的多肽。

将200微升的酶溶液(酶浓度在约1mg/ml，样品O1)与200微升的10%Avicel(Remazol染色的Avicel，Sigmacell类型20)悬液(在0.1M Tris缓冲液，pH7.5中制成)混合，并使用1.5ml Eppendorf管混合15分钟。将混合物置于4℃温育1小时。在温育之后，酶对Avicel的结合可通过将Avicel在Eppendorf离心机中在室温以5000rpm旋转5分钟来检测，并将上清保存作为样品S1。对于样品O1和S1两者均用BCA试剂盒测试蛋白含量。酶吸收定义如下：

吸收=(O1-S1X2)/O1X(100%).

O1：通过BCA试剂盒测试的样品O1的蛋白浓度

S1：通过BCA试剂盒测试的样品S1的蛋白浓度

不含功能性CBM的多肽显示的如上定义的吸收不超过15%。

所有本文中提及的专利、专利申请和参考文献通过全文提述并入本文。本领域技术人员根据上述详细描述会理解许多本发明的变体。此类明显变体落在所附权利要求所意欲的完整范围内。

Claims

1.一种处理纺织品的方法，通过用具有内切葡聚糖酶活性但不包含功能性CBM的分离的多肽处理纺织品，其中所述多肽选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；

(b)多肽，其由在中等严格条件下与以下杂交的多核苷酸编码：(i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)包含于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

2.权利要求1的方法，其中所述多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。

3.权利要求1的方法，其中多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性的多核苷酸编码。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:2的位置141的位置含有组氨酸残基。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述方法是生物石洗工艺，导致在纺织品表面中颜色密度的局部差异。

6.权利要求5的方法，其中所述纺织品是经染色的纤维素性或含纤维素织物，优选粗斜棉布织物，更优选经靛蓝染色的粗斜棉布织物。

7.权利要求5或6的方法，其中所述生物石洗工艺达到至少0.5ΔL*单位，优选至少1，更优选1.5，和更优选2和甚至更优选2.5ΔL*单位的磨蚀水平。

8.权利要求5-7任一项的方法，其中所述生物石洗工艺取得至少0.1Δb*单位增加，优选至少0.2，更优选至少0.3，甚至更优选至少0.4Δb*单位增加的返沾色水平。

9.权利要求1-4任一项的方法，其中所述方法应用于生物抛光工艺。

10.权利要求1-4任一项的方法，其中所述生物抛光工艺导致至少3，更优选至少3.4，更优选至少3.8，和最优选至少4的起球度。

11.权利要求10的方法，其中所述生物抛光工艺显示小于10%，优选小于5%，更优选小于4%，更优选小于3.5%，和最优选小于3%的重量损失。

12.权利要求1至11任一项的方法，其中所述方法在低于90℃，优选低于75℃，更优选低于65℃，更优选低于50℃，更优选低于40℃，甚至更优选低于30℃的温度进行。

13.权利要求1至12任一项的方法，其中所述方法在pH3至pH11的pH范围，优选pH4至pH8的范围，或pH4.5至pH7.5的范围内进行。

14.权利要求1至13任一项的方法，其中所述多肽以0.001至约10毫克酶蛋白每克纺织品，优选0.02-5毫克酶蛋白每克纺织品，更优选0.05-2毫克酶蛋白每克纺织品的范围施用。

15.权利要求5至8任一项的方法，其中所述方法还包括一种或多种选自下组的酶：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶。

16.前述任一项权利要求的方法，其中所述处理纺织品是制造所述纺织品。