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KR20200006061A - 항 cdh6 항체 및 항 cdh6 항체-약물 콘주게이트 - Google Patents

항 cdh6 항체 및 항 cdh6 항체-약물 콘주게이트 Download PDF

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KR20200006061A
KR20200006061A KR1020197033607A KR20197033607A KR20200006061A KR 20200006061 A KR20200006061 A KR 20200006061A KR 1020197033607 A KR1020197033607 A KR 1020197033607A KR 20197033607 A KR20197033607 A KR 20197033607A KR 20200006061 A KR20200006061 A KR 20200006061A
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KR
South Korea
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amino acid
antibody
acid sequence
seq
light chain
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KR1020197033607A
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English (en)
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KR102768694B1 (ko
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아츠코 사이토
츠요시 히라타
겐스케 나카무라
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority to KR1020257004599A priority Critical patent/KR20250025511A/ko
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Abstract

본 발명의 과제는, CDH6 에 결합하는 내재화 활성을 갖는 항체, 그 항체와 항종양 활성을 갖는 약물의 항체-약물 콘주게이트, 그 항체-약물 콘주게이트를 사용한 종양에 대한 치료 효과를 갖는 의약품, 및 그 항체, 그 항체-약물 콘주게이트 또는 그 의약품을 사용한 종양의 치료 방법 등을 제공하는 것이다. 본 발명에 의해, 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체, 그 항체와 항종양 활성을 갖는 약물의 항체-약물 콘주게이트, 이들을 사용하는 의약품 및 종양의 치료 방법이 제공된다.

Description

항 CDH6 항체 및 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트
본 발명은 CDH6 에 결합하여, 내재화 작용을 갖는 항 CDH6 항체, 그 항 CDH6 항체의 제조 방법, 그리고 그 항체를 포함하는 항체-약물 콘주게이트, 그 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 항종양제 등에 관한 것이다.
카드헤린 (Cadherin) 은, 세포막 표면에 존재하는 당단백질로, 칼슘 이온 의존적으로 N 말단측의 세포 외 도메인끼리가 결합함으로써, 세포간 접착 분자로서, 또 세포간 상호 작용을 담당하는 시그널 분자로서 기능한다. 카드헤린 슈퍼 패밀리 중, 클래식 카드헤린으로 분류되는 분자군은, 5 개의 세포 외 도메인 (extracellular domain, EC 도메인) 과 1 개의 막관통 영역, 및 세포 내 도메인으로 구성되는 1 회 막관통 단백질이다. 클래식 카드헤린은 아미노산 서열의 상동성으로부터, E-카드헤린이나 N-카드헤린으로 대표되는 타입 I 패밀리와, 타입 II 패밀리로 분류된다.
카드헤린 6 (Cadherin-6, CDH6) 은, 타입 II 카드헤린 패밀리로 분류되는, 790 아미노산으로 이루어지는 1 회 막관통 단백질이고, N 말단측을 세포 외, C 말단측을 세포 내에 갖는다. 인간 CDH6 유전자는 1995년에 처음으로 클로닝되고 (비특허문헌 1), NM_004932, NP_004923 (NCBI) 등의 액세션 번호에 의해 참조 가능하다.
CDH6 은 발생기에 있어서 뇌나 신장에서 특이적으로 발현하고 있고, 중추 신경계의 회로 형성 (비특허문헌 2, 비특허문헌 3) 이나 신장의 네프론 발생시 (비특허문헌 4, 비특허문헌 5) 에 중요한 역할을 담당하는 것이 보고되고 있다. 성인의 정상 조직에서는, CDH6 의 발현은 신뇨세관이나 담관 상피 세포 등에 국한되어 있다.
한편, 성인의 몇 가지 암종에 있어서, 종양부에서 특이적으로 CDH6 의 발현이 항진되는 것이 알려져 있으며, 인간 신세포암, 특히 신염 명세포암에서는, CDH6 발현과 예후 불량의 상관이나, 종양 마커로서의 이용 가능성이 보고되고 있다 (비특허문헌 6, 비특허문헌 7). 인간 난소암에서도 CDH6 의 고발현이 보고되고 있고 (비특허문헌 8), 인간 갑상선암의 상피 간엽 변환과 전이에 CDH6 이 관여한다는 보고도 있다 (비특허문헌 9). 또, CDH6 은, 인간 담관암 및 인간 소세포 폐암에서도 발현하고 있는 것이 보고되고 있다 (비특허문헌 12, 13).
암은 사망 원인의 상위를 차지하고, 그 이환수는 인구의 고령화와 함께 증가하는 것이 예상되고 있지만, 여전히 치료 요구는 충분히 채워지지 않았다. 종래의 화학 요법제는, 그 선택성의 낮음에서 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 대하여서도 상해성을 가지는 것에 의한 부작용이나, 충분한 약제량을 투여할 수 없음으로써 약제의 효과를 충분히 얻을 수 없는 것이 문제가 되고 있다. 이 때문에 최근에는, 암세포에 특징적인 변이나 고발현을 나타내는 분자, 세포의 암화에 관여하는 특정한 분자를 표적으로 한 보다 선택성이 높은 분자 표적약이나 항체 의약의 개발이 이루어지고 있다.
항체는 혈중 안정성이 높고, 표적 항원에 특이적으로 결합하므로 부작용의 경감이 기대되어 있고, 암세포 표면에 고발현하고 있는 분자에 대한 항체 의약이 다수 개발되고 있다. 항체의 항원 특이적인 결합능을 이용한 기술의 하나로서, 항체-약물 콘주게이트 (Antibody-Drug Conjugate ; ADC) 를 들 수 있다. ADC 는, 암세포 표면에 발현하고 있는 항원에 결합하고, 그 결합에 의해 항원을 세포 내에 내재화할 수 있는 항체에, 세포 상해 활성을 갖는 약물을 결합시킨 것이다. ADC 는, 암세포에 효율적으로 약물을 송달할 수 있음으로써, 암세포 내에 약물을 축적시켜, 암세포를 사멸시키는 것을 기대할 수 있다 (비특허문헌 10, 특허문헌 1 및 2). ADC 로서 예를 들어, 항 CD30 모노클로날 항체에 모노메틸아우리스타틴 E 를 결합시킨 애드세트리스 (상표) (브렌툭시맙 베도틴) 가 호지킨 림프종과 미분화 대세포 림프종의 치료약으로서 인가되고 있다. 또, 항 HER2 모노클로날 항체에 엠탄신을 결합시킨 캐싸일라 (상표) (트라스투주맙 엠탄신) 가 HER2 양성의 진행, 재발 유방암의 치료에 사용되고 있다.
항종양약으로서의 ADC 에 적합한 표적 항원의 특징으로는, 암세포 표면에서 특이적으로 고발현하고, 정상 세포에서는 저발현 또는 발현하고 있지 않은 것, 세포 내에 내재화할 수 있는 것, 항원이 세포 표면으로부터 분비되지 않는 것 등을 들 수 있다. 또, ADC 에 적합한 항체의 중요한 특징으로는, 표적이 되는 항원에 특이적으로 결합하는 것에 더하여, 높은 내재화능을 갖는 것을 들 수 있다. 항체의 내재화능은 표적 항원과 항체의 양방의 성질에 의존하는 것이고, 표적의 분자 구조로부터 내재화에 적합한 항원 결합 부위를 추정하거나, 항체의 결합 강도나 물성 등으로부터 용이하게 내재화능이 높은 항체를 추측하거나 하는 것은 곤란하다. 이 때문에, 표적 항원에 대하여 높은 내재화능을 갖는 항체를 취득하는 것은, 유효성이 높은 ADC 를 개발하는 데에 있어서 중요한 과제가 되고 있다 (비특허문헌 11).
CDH6 을 표적으로 한 ADC 로는, CDH6 의 EC 도메인 5 (EC5) 에 특이적으로 결합하는 항 CDH6 항체에 DM4 를 결합시킨 ADC 가 알려져 있다 (특허문헌 3).
WO2014/057687 US2016/0297890 WO2016/024195
Shimoyama Y, et al., Cancer Research, 2206-2211, 55, May 15, 1995 Inoue T, et al., Developmental Biology, 183-194, 1997 Osterhout J A, et al., Neuron, 632-639, 71, Aug 25, 2011 Cho E A, et al., Development, 803-812, 125, 1998 Mah S P, et al., Developmental Biology, 38-53, 223, 2000 Paul R, et al., Cancer Research, 2741-2748, July 1, 57, 1997 Shimazui T, et al., Cancer, 963-968, 101(5), Sep.1, 2004 Koebel M, et al., PLoS Medicine, 1749-1760, 5(12), e232, Dec.2008 Gugnoni M, et al., Oncogene, 667-677, 36, 2017 Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016 Peters C, et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015 Goeppert B, et al., Epigenetics, 780-790, 11(11), 2016 Yokoi S, et al., American Journal of Pathology, 207-216, 161, 1, 2002
본 발명의 과제는, CDH6 에 대하여 특이적으로 결합하는 높은 내재화 활성을 갖는 항체, 그 항체를 포함하는 높은 항종양 활성을 갖는 항체-약물 콘주게이트, 그 항체-약물 콘주게이트를 사용한 종양에 대한 치료 효과를 갖는 의약품, 및 당해 항체, 항체-약물 콘주게이트 또는 의약품을 사용한 종양의 치료 방법 등을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 달성하기 위해 예의 검토한 결과, 놀랍게도 CDH6 의 세포 외 도메인 3 (본 명세서 중, EC3 이라고도 칭한다) 에 특이적으로 결합하는 항체가, CDH6 을 발현하는 세포에 있어서 매우 높은 내재화 활성을 갖고 ADC 항체로서 유용한 것을 알아내었다. 또한, 당해 항 CDH6 항체에, 세포 내에서 독성을 발휘하는 약제를 특정한 구조의 링커를 통하여 결합시킨 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트는, 종래의 CDH6 약물 복합체보다 강한 항종양 활성을 나타내는 것을 알아내었다.
본원 발명은 이하의 발명을 포함한다 ;
[1] 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[2] 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열에 대한 결합에 대하여, 이하의 (1) ∼ (5) :
(1) 서열 번호 53 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 56 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
(2) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
(3) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
(4) 서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체, 및
(5) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체
로 이루어지는 군에서 선택되는 항체 중 적어도 어느 하나와 경합 저해 활성을 갖는 [1] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[3] 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
(2) 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
(3) 서열 번호 32 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 34 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및
(4) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3
으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고
이하의 (5) ∼ (9) :
(5) 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(6) 서열 번호 27 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(7) 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(8) 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및
(9) 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는,
[1] 또는 [2] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[4] 이하의 (1) ∼ (5) :
(1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(2) 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 27 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(3) 서열 번호 32 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 34 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(4) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및
(5) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
으로 이루어지는 군에서 선택되는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는,
[1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[5] 인간화되어 있는 [1] ∼ [4] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[6] 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(3) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및
(4) (1) ∼ (3) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역, 그리고, 이하의 (5) ∼ (9) :
(5) 서열 번호 71 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(6) 서열 번호 75 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(7) 서열 번호 79 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(8) (5) ∼ (7) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및
(9) (5) ∼ (8) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역
을 갖는 [1] ∼ [5] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[7] 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 71 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 75 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(3) 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 75 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 또는
(4) 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 79 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
중 어느 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역
을 포함하는 [1] ∼ [6] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[8] 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(2) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(3) 서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 또는
(4) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
중 어느 것을 갖는 [1] ∼ [7] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[9] 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 [8] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[10] 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 [8] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[11] 서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 [8] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[12] 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 [8] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[13] 기능성 단편이 Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는 [1] ∼ [12] 중 어느 한 항에 기재된 항체의 기능성 단편 ;
[14] [1] ∼ [13] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
[15] 이하의 (1) ∼ (5) :
(1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(2) 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 27 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(3) 서열 번호 32 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 34 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(4) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 그리고
(5) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 [14] 에 기재된 폴리뉴클레오티드 ;
[16] 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 [14] 또는 [15] 에 기재된 폴리뉴클레오티드 ;
[17] 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 [14] 또는 [15] 에 기재된 폴리뉴클레오티드 ;
[18] 서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 [14] 또는 [15] 에 기재된 폴리뉴클레오티드 ;
[19] 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 [14] 또는 [15] 에 기재된 폴리뉴클레오티드 ;
[20] [14] ∼ [19] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터 ;
[21] [20] 에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포 ;
[22] 숙주 세포가 진핵 세포인 [21] 에 기재된 숙주 세포 ;
[23] [21] 또는 [22] 에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편의 제조 방법 ;
[24] 중사슬 또는 경사슬이, N-결합에 대한 당 사슬 부가, O-결합에 대한 당 사슬 부가, N 말의 프로세싱, C 말의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말 글루타민 혹은 N 말 글루탐산의 피로글루탐산화, 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 받은, [1] ∼ [13] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[25] 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 [24] 에 기재된 항체 ;
[26] 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는 [25] 에 기재된 항체 ;
[27] 중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는 [24] ∼ [26] 중 어느 한 항에 기재된 항체 ;
[28] 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키기 위해 당 사슬 수식이 조절되어 있는 [1] ∼ [13] 및 [24] ∼ [27] 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 ;
[29] [1] ∼ [13] 및 [24] ∼ [28] 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편에 약물이 결합하고 있는 항체-약물 콘주게이트 ;
[30] 약물이 항종양성 화합물인, [29] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[31] 항종양성 화합물이 다음 식 :
[화학식 1]
Figure pct00001
으로 나타내는 항종양성 화합물인 [30] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[32] 항체와 약물이, 다음 식 (a) ∼ (f) :
Figure pct00002
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 구조의 링커를 통하여 결합하고 있는, [29] ∼ [31] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, 항체는, -(숙신이미드-3-일-N) 의 말단에 있어서 결합한다. 항종양성 화합물은, 1 위치의 아미노기의 질소 원자를 결합 부위로서, (a), (b), (e) 또는 (f) 의 -CH2CH2CH2-C(=O)- 부분, (c) 의 CH2-O-CH2-C(=O)- 부분 또는 (d) 의 CH2CH2-O-CH2-C(=O)- 부분의 카르보닐기에 결합한다. 상기 식 중 GGFG 는, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신으로 이루어지는 펩티드 결합으로 연결되어 있는 아미노산 서열을 나타낸다.
-(숙신이미드-3-일-N)- 은 다음 식 :
[화학식 2]
Figure pct00003
으로 나타내는 구조이고, 이것의 3 위치에서 항체와 결합하고, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합한다) ;
[33] 링커가 이하의 (c), (d) 및 (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 식으로 나타내는 [29] ∼ [32] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트 :
Figure pct00004
[34] 링커가 이하의 (c) 또는 (e) 의 식으로 나타내는 [29] ∼ [33] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트 :
Figure pct00005
[35]
이하의 식 :
[화학식 3]
Figure pct00006
으로 나타내는 구조를 갖는, [29] ∼ [34] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트 :
여기서, AB 는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타낸다. n 은 항체와 결합하고 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 통하여 결합하고 있다 ;
[36] 이하의 식 :
[화학식 4]
Figure pct00007
으로 나타내는 구조를 갖는, [29] ∼ [34] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트 :
여기서, AB 는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타낸다. n 은 항체와 결합하고 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 통하여 결합하고 있다 ;
[37] 항체가 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(2) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(3) 서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 또는
(4) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 및 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편인, [29] ∼ [36] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[38] 항체가, 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편인, [37] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[39] 항체가, 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편인, [37] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[40] 중사슬 또는 경사슬이, N-결합에 대한 당 사슬 부가, O-결합에 대한 당 사슬 부가, N 말의 프로세싱, C 말의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말 글루타민 혹은 N 말 글루탐산의 피로글루탐산화 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 받은, [29] ∼ [39] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[41] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 1 ∼ 10 개의 범위인 [29] ∼ [40] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[42] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 2 ∼ 8 개의 범위인 [41] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[43] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 5 ∼ 8 개의 범위인 [42] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[44] 선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 7 ∼ 8 개인 [43] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트 ;
[45] [29] ∼ [44] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물 ;
[46] 항종양약인 것을 특징으로 하는, [45] 에 기재된 의약 조성물 ;
[47] 종양이 CDH6 을 발현하는 종양인 것을 특징으로 하는, [46] 에 기재된 의약 조성물 ;
[48] 종양이, 신세포암, 신염 명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성 선암, 갑상선암, 담관암, 폐암, 소세포 폐암, 신경 교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종인 것을 특징으로 하는, [46] 또는 [47] 에 기재된 의약 조성물 ;
[49] [29] ∼ [44] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 어느 것을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법 ;
[50] 종양이 CDH6 이 발현하고 있는 종양인 것을 특징으로 하는, [49] 에 기재된 치료 방법 ;
[51] 종양이, 신세포암, 신염 명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성 선암, 갑상선암, 담관암, 폐암, 소세포 폐암, 신경 교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종인 것을 특징으로 하는, [49] 또는 [50] 에 기재된 치료 방법 ;
[52] [29] ∼ [44] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 의약 조성물 및 적어도 하나의 항종양약을, 동시에, 따로따로 또는 연속해서 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법 ;
[53] [1] ∼ [13] 및 [24] ∼ [28] 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 혹은 [23] 에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편과, 약물-링커 중간 화합물을 반응시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법 ; 또는
[54] [21] 또는 [22] 에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 채취하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편과 약물-링커 중간 화합물을 반응시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법.
본 발명의 항 CDH6 항체는, CDH6 의 EC 도메인 3 (EC3) 을 특이적으로 인식하여, 높은 내재화 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 항 CDH6 항체에, 세포 내에서 독성을 발휘하는 약제를 특정한 구조의 링커를 통하여 결합시킨 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트는, CDH6 을 발현하는 암세포를 갖는 환자에게 투여함으로써, 우수한 항종양 효과 및 안전성을 달성하는 것을 기대할 수 있다. 즉, 본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트는, 항종양제로서 유용하다.
도 1 은, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종 (클론 번호는 rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 래트 IgG 컨트롤의, 컨트롤 세포 또는 hCDH6 도입 293T 세포에 대한 결합을 조사한 플로우 사이토메트리의 결과를 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 2a 는, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종 (rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 음성 컨트롤 항체 래트IgG2b (RatIgG2b) 의, 컨트롤 세포 또는 전체 길이 hCDH6 도입 293 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 2b 는, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종 (rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 래트 IgG 컨트롤의, 컨트롤 세포 또는 EC1 결실 hCDH6 도입 293 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 2c 는, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종 (rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 래트 IgG 컨트롤의, 컨트롤 세포 또는 EC2 결실 hCDH6 도입 293 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 2d 는, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종 (rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 래트 IgG 컨트롤의, 컨트롤 세포 또는 EC3 결실 hCDH6 도입 293 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 2e 는, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종 (rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 래트 IgG 컨트롤의, 컨트롤 세포 또는 EC4 결실 hCDH6 도입 293 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 2f 는, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종 (rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 래트 IgG 컨트롤의, 컨트롤 세포 또는 EC5 결실 hCDH6 도입 293 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 3 은, 4 종류의 인간 종양 세포주 (인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3, PA-1, ES-2 및 인간 신세포 종양 세포주 786-O) 의 세포막 표면에서의 CDH6 의 발현을 평가한 플로우 사이토메트리의 결과를 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 4 는, 4 종류의 래트 항 CDH6 항체 (rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 래트 IgG 컨트롤의 내재화 활성을, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항래트 IgG 시약 래트-ZAP 또는 음성 컨트롤로서 독소를 결합하지 않은 염소 항-래트 IgG, Fc(gamma) Fragment Specific 을 사용하여, NIH : OVCAR-3 세포 및 786-O 세포에 있어서 평가한 그래프를 나타낸다. 그래프의 세로축은, ATP 활성 (RLU) 을 나타낸다. 각 그래프의 아래에, 래트-ZAP 대신에 음성 컨트롤을 첨가한 웰의 생존 세포수를 100 ％ 로 한 상대 생존율로서 산출된 세포 생존율 (％) 을 나타낸다.
도 5 는, 인간 키메라 항 CDH6 항체 chG019 의 인간 CDH6 및 원숭이 CDH6 에 대한 결합을 나타낸다. 가로축은 항체 농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다.
도 6a 및 도 6b 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02) 또는 음성 컨트롤 항체 인간 IgG1 의 인간 CDH6, 원숭이 CDH6, 마우스 CDH6, 래트 CDH6 에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다.
도 6a 및 도 6b 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02) 또는 음성 컨트롤 항체 인간 IgG1 의 인간 CDH6, 원숭이 CDH6, 마우스 CDH6, 래트 CDH6 에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다.
도 7a 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 항체 hIgG1 의 컨트롤 세포 또는 전체 길이 hCDH6 도입 293α 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 7b 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 항체 hIgG1 의 컨트롤 세포 또는 EC1 결실 hCDH6 도입 293α 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 7c 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 항체 hIgG1 의 컨트롤 세포 또는 EC2 결실 hCDH6 도입 293α 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 7d 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 항체 hIgG1 의 컨트롤 세포 또는 EC3 결실 hCDH6 도입 293α 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 7e 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤의 hIgG1 의 컨트롤 세포 또는 EC4 결실 hCDH6 도입 293α 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 7f 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤의 hIgG1 의 컨트롤 세포 또는 EC5 결실 hCDH6 도입 293α 세포에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 8 은, 786-O/hCDH6 안정 발현 세포주 및 친세포주 786-O 에 있어서의 인간 CDH6 의 발현을 조사한 플로우 사이토메트리의 결과를 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 Alexa Fluor 647 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 9 는, (a) 라벨화 NOV0712 또는 (b) 라벨화 H01L02 를 사용한, 라벨화되지 않은 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤의 hIgG1 과의 결합 경합 어세이를 나타낸다. 가로축은 라벨화되지 않은 항체의 첨가시의 종농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다.
도 10a 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 및 음성 컨트롤 항체의 내재화 활성을, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항인간 IgG 시약 Hum-ZAP 또는 음성 컨트롤로서 독소를 결합하지 않은 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc(gamma) Fragment Specific 을 사용하여, NIH : OVCAR-3 세포에 있어서 평가한 그래프를 나타낸다. 그래프의 세로축은, ATP 활성 (RLU) 을 나타낸다. 각 그래프의 아래에, Hum-ZAP 대신에 음성 컨트롤을 첨가한 웰의 생존 세포수를 100 ％ 로 한 상대 생존율로서 산출된 세포 생존율 (％) 을 나타낸다.
도 10b 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 및 음성 컨트롤 항체의 내재화 활성을, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항인간 IgG 시약 Hum-ZAP 또는 음성 컨트롤로서 독소를 결합하지 않은 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc(gamma) Fragment Specific 을 사용하여, 786-O 세포에 있어서 평가한 그래프를 나타낸다. 그래프의 세로축은, ATP 활성 (RLU) 을 나타낸다. 각 그래프의 아래에, Hum-ZAP 대신에 음성 컨트롤을 첨가한 웰의 생존 세포수를 100 ％ 로 한 상대 생존율로서 산출된 세포 생존율 (％) 을 나타낸다.
도 10c 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 및 음성 컨트롤 항체의 내재화 활성을, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항인간 IgG 시약 Hum-ZAP 또는 음성 컨트롤로서 독소를 결합하지 않은 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc(gamma) Fragment Specific 을 사용하여, PA-1 세포에 있어서 평가한 그래프를 나타낸다. 그래프의 세로축은, ATP 활성 (RLU) 을 나타낸다. 각 그래프의 아래에, Hum-ZAP 대신에 음성 컨트롤을 첨가한 웰의 생존 세포수를 100 ％ 로 한 상대 생존율로서 산출된 세포 생존율 (％) 을 나타낸다.
도 11 은, 인간화 hG019-약물 콘주게이트 4 종 (H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd 및 H04L02-DXd), 또는 NOV0712-DM4 의 PA-1 세포에 대한 in vitro 세포 증식 억제 활성 평가를 나타낸다. 가로축은 항체-약물 콘주게이트의 농도를 나타내고, 세로축은 세포 생존율 (％) 을 나타낸다.
도 12 는, 인간화 hG019-약물 콘주게이트 4 종 (H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd 및 H04L02-DXd), 또는 NOV0712-DM4 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 신세포 종양 세포주 786-O 를 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 표준 오차 (SE) 값을 나타낸다.
도 13 은, 인간화 hG019-약물 콘주게이트 H01L02-DXd 또는 NOV0712-DM4 또는 NOV0712-DXd 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 PA-1 을 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
도 14 는, 인간화 hG019-약물 콘주게이트 H01L02-DXd 또는 NOV0712-DM4 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3 을 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
도 15 는, 인간화 hG019-약물 콘주게이트 H01L02-DXd 또는 NOV0712-DM4 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 신세포 종양 세포주 786-O 를 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
도 16 은, 인간화 hG019-약물 콘주게이트 H01L02-DXd 또는 NOV0712-DM4 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 음성 인간 난소 종양 세포주 ES-2 를 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태에 대해 도면을 참조하면서 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시형태는, 본 발명의 대표적인 실시형태의 일례를 나타낸 것이고, 이에 의해 본 발명의 범위가 좁게 해석되는 일은 없다.
본 명세서 중, 「암」 과 「종양」 은 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서 중, 「유전자」 라는 단어에는, DNA 뿐만 아니라 그 mRNA, cDNA 및 그 cRNA 도 포함된다.
본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」 또는 「뉴클레오티드」 는, 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있고, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함된다. 본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」 와「뉴클레오티드」 는, 특별히 지정되지 않는 한, 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서 중, 「폴리펩티드」 와 「단백질」 은 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서 중, 「세포」 에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함한다.
본 명세서 중, 「CDH6」 는, CDH6 단백질과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 본 명세서 중, 인간 CDH6 을 「hCDH6」 이라고 기재하는 경우가 있다.
본 명세서 중, 「세포 상해 활성」 이란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 일으키는 것을 말하고, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 2 량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능상의 손상을 일으키는 것을 말한다.
본 명세서 중, 「세포 내에서 독성을 발휘한다」 란, 어떠한 형태로, 세포 내에서 독성을 나타내는 것을 말하고, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 2 량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하, 세포 증식 인자의 작용의 억제 등 모든 세포의 구조나 기능, 대사에 영향을 가져오는 것을 말한다.
본 명세서 중, 「항체의 기능성 단편」 이란, 「항체의 항원 결합 단편」 이라고도 불리고, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선상 항체 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들 분자에 한정되지 않는다. 또, 이들 항원 결합 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것 뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
본 명세서 중, 「에피토프」 란, 특정한 항 CDH6 항체가 결합하는 CDH6 의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조를 의미한다. 상기의 CDH6 의 부분 펩티드인 에피토프는 면역 어세이법 등 당업자에게는 잘 알려져 있는 방법에 의해 결정할 수 있다. 먼저, 항원의 여러 가지 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조에 있어서는, 공지된 올리고 뉴클레오티드 합성 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, CDH6 의 C 말단 또는 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조한 후, 그것들에 대한 항체의 반응성을 검토하고, 대략적인 인식 부위를 결정한 후에, 또한 짧은 펩티드를 합성하여 그들 펩티드와의 반응성을 검토함으로써, 에피토프를 결정할 수 있다. 또, 복수의 세포 외 도메인으로 이루어지는 막단백질에 결합하는 항체가, 복수의 도메인으로 이루어지는 입체 구조를 에피토프로 하고 있는 경우에는, 특정한 세포 외 도메인의 아미노산 서열을 개변함으로써, 입체 구조를 개변함으로써 어느 도메인과 결합하는가를 결정할 수 있다. 특정한 항체가 결합하는 항원의 부분 입체 구조인 에피토프는, X 선 구조 해석에 의해 항체와 인접하는 항원의 아미노산 잔기를 특정함으로써도 결정할 수 있다.
본 명세서 중, 「동일한 에피토프에 결합한다」 란, 공통된 에피토프에 결합하는 항체를 의미하고 있다. 제 1 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 제 2 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 혹은, 제 1 항체의 항원에 대한 결합에 제 2 항체가 경합하는 (즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 항원의 결합을 방해한다) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 제 1 항체와 제 2 항체의 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 본 명세서 중, 「동일한 에피토프에 결합한다」 란, 제 1 항체와 제 2 항체가, 당해 판정 방법 중 어느 일방 또는 양방에 의해, 공통된 에피토프에 결합한다고 판정되었을 경우를 말한다. 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합하고, 또한 제 1 항체가 항종양 활성이나 내재화 활성 등의 특수한 효과를 갖는 경우, 제 2 항체도 동일한 활성을 갖는 것을 기대할 수 있다.
본 명세서 중, 「CDR」 이란, 상보성 결정 영역 (CDR ; Complementarity Determining Region) 을 의미한다. 항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 지점의 CDR 이 있는 것이 알려져 있다. CDR 은, 초가변 영역 (hypervariable region) 이라고도 불리고, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있고, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이고, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조 상에 있어서, 각각 3 지점으로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 CDR 에 대하여, 중사슬의 CDR 을 중사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경사슬의 CDR 을 경사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하여, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.
본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」 란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론텍사) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 DNA 를 고정시킨 필터를 사용하여 0.7 ∼ 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 ∼ 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하고, 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 말한다.
본 명세서 중, 「1 ∼ 수 개」 란, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 9 개, 1 ∼ 8 개, 1 ∼ 7 개, 1 ∼ 6 개, 1 ∼ 5 개, 1 ∼ 4 개, 1 ∼ 3 개 또는 1 ∼ 2 개를 의미한다.
1. CDH6
카드헤린은, 세포막 표면에 존재하는 당단백질로, 칼슘 이온 의존적으로 N 말단측의 세포 외 도메인끼리가 결합함으로써, 세포간 접착 분자로서, 또 세포간 상호 작용을 담당하는 시그널 분자로서 기능한다. 카드헤린 슈퍼 패밀리 중, 클래식 카드헤린으로 분류되는 분자군은, 세포 외에 5 개의 세포 외 도메인 (EC 도메인) 과 1 개의 막관통 영역, 및 세포 내 도메인으로 구성되는 1 회 막관통 단백질이다.
CDH6 (Cadherin-6) 은, 타입 II 카드헤린 패밀리로 분류되는, 790 아미노산으로 이루어지는 1 회 막관통 단백질이고, N 말단측을 세포 외, C 말단측을 세포 내에 갖는다. 인간 CDH6 유전자는 1995년에 처음으로 클로닝되고 (비특허문헌 1), NM_004932, NP_004923 (NCBI) 등의 액세션 번호에 의해 참조 가능하다.
본 발명에서 사용하는 CDH6 단백질은, 인간, 비인간 포유 동물 (래트, 마우스, 원숭이 등) 의 CDH6 발현 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 당해 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또, CDH6 을 in vitro 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, CDH6 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 CDH6 을 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다. 또, 상기의 유전자 조작에 의한 CDH6 발현 세포, 혹은 CDH6 을 발현하고 있는 세포주를 CDH6 단백질로서 사용할 수도 있다. 또, CDH6 의 cDNA 를 삽입한 발현 벡터를 직접 피면역 동물에 투여하여 피면역 동물의 체내에서 CDH6 을 발현시킬 수도 있다.
또, 상기 CDH6 의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 당해 단백질과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 CDH6 에 포함된다.
인간 CDH6 단백질은, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 인간 CDH6 단백질의 세포 외 영역은, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 54 ∼ 159 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포 외 도메인 1 (본 명세서 중, EC1 이라고도 칭한다), 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 160 ∼ 268 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포 외 도메인 2 (본 명세서 중, EC2 라고도 칭한다), 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 269 ∼ 383 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포 외 도메인 3 (본 명세서 중, EC3 이라고도 칭한다), 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 384 ∼ 486 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포 외 도메인 4 (본 명세서 중, EC4 라고도 칭한다), 및 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 487 ∼ 608 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포 외 도메인 5 (본 명세서 중, EC5 라고도 칭한다) 로 구성된다. EC1 ∼ EC5 의 아미노산 서열을, 각각, 서열 번호 2 ∼ 6 으로 한다 (표 1).
2. 항 CDH6 항체의 제조
본 발명의 항 CDH6 항체의 일례로서, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항 CDH6 항체의 일례로서, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 특이적으로 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항 CDH6 항체의 일례로서, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열을 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항 CDH6 항체의 일례로서, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열을 특이적으로 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체를 들 수 있다. 항체가 「서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 특이적으로 인식」 하는 또는 「EC3 도메인을 특이적으로 인식」 하는이란, 항체가 CDH6 의 EC3 도메인을 CDH6 의 다른 세포 외 도메인과 비교하여 강하게 인식하거나 또는 강하게 결합하는 것을 말한다.
본 발명의 항 CDH6 항체는, 어느 종에서 유래해도 되지만, 바람직하게는, 인간, 원숭이, 래트, 마우스 또는 토끼를 예시할 수 있다. 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지된 기술을 사용하여, 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체이어도 되고, 모노클로날 항체이어도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다.
본 발명의 항 CDH6 항체는 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이고, 즉 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 및/또는 종양 세포 내에 도입되어 내재화되는 특성 등을 구비하고 있다. 따라서, 본 발명의 항 CDH6 항체와 항종양 활성을 갖는 화합물을, 링커를 통하여 결합시켜 항체-약물 콘주게이트로 할 수 있다.
항체의 종양 세포에 대한 결합성은, 플로우 사이토메트리를 사용하여 확인할 수 있다. 종양 세포 내로의 항체의 도입은, (1) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 도입된 항체를 형광 현미경으로 가시화하는 어세이 (Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761), (2) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 도입된 형광량을 측정하는 어세이 (Molecular Biology of the Cell Vol.15, 5268-5282, December 2004) 또는 (3) 치료 항체에 결합하는 이뮤노톡신을 사용하여, 세포 내에 도입되면 독소가 방출되어 세포 증식이 억제된다는 Mab-ZAP 어세이 (Bio Techniques 28 : 162-165, January 2000) 를 사용하여 확인할 수 있다. 이뮤노톡신으로는, 디프테리아 독소의 촉매 영역과 프로테인 G 의 리컴비넌트 복합 단백질 단백질도 사용할 수 있다.
본 명세서에서 말하는 「높은 내재화능」 이란, 당해 항체와 사포린 표지 항래트 IgG 항체를 투여한 CDH6 발현 세포의 생존율 (항체 미첨가시의 세포 생존율을 100 ％ 로 한 상대율로 나타낸 것) 이, 바람직하게는 70 ％ 이하, 보다 바람직하게는 60 ％ 이하인 것을 의미한다.
항체-약물 콘주게이트는 항종양 효과를 발휘하는 화합물을 결합시키고 있으므로, 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것은 바람직하지만, 필수는 아니다. 항종양성 화합물의 세포 상해성을 종양 세포에 있어서 특이적 및/또는 선택적으로 발휘시키는 목적에서는, 항체가 내재화되어 종양 세포 내로 이행하는 성질이 있는 것이 중요하고, 바람직하다.
항 CDH6 항체는, 이 분야에서 통상 실시되는 방법을 사용하여, 항원이 되는 폴리펩티드를 동물에 면역하고, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있지만, 바람직하게는, 입체 구조를 유지한 CDH6 을 항원으로서 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 방법으로서, DNA 면역법을 들 수 있다.
항원의 유래는 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 항원을 동물에 면역할 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, 항원에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
이하, 구체적으로 CDH6 에 대한 항체의 취득 방법을 설명한다.
(1) 항원의 조제
항원은 항원 단백질을 코드하는 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는, 항원 유전자를 발현 가능한 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현한 항원을 정제하면 된다. 상기의 유전자 조작에 의한 항원 발현 세포, 혹은 항원을 발현하고 있는 세포주를 동물에 면역하는 방법을 사용하는 것에 의해서도 항체를 취득할 수 있다.
또, 항원 단백질을 사용하지 않고, 항원 단백질의 cDNA 를 발현 벡터에 삽입하여 피면역 동물에 투여하고, 피면역 동물의 체내에서 항원 단백질을 발현시키고, 항원 단백질에 대한 항체를 산생시킴으로써도 항체를 취득할 수 있다.
(2) 항 CDH6 모노클로날 항체의 제조
본 발명에서 사용되는 항 CDH6 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 본원의 서열표로 나타낸 아미노산 서열로 특정되는 항체를 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 항 CDH6 항체로는, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 ;
(a) CDH6 에 특이적으로 결합한다
(b) CDH6 과 결합함으로써 CDH6 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다
(2) CDH6 이 인간 CDH6 인 상기 (1) 에 기재된 항체 또는 당해 항체.
(3) 인간 CDH6 의 EC3 을 특이적으로 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는다
본 발명의 CDH6 에 대한 항체의 취득 방법은, 항 CDH6 항체를 취득할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않지만, 고차 구조를 유지한 CDH6 을 항원으로서 사용하는 것이 바람직하다.
바람직한 항체의 취득 방법의 일례로서 DNA 면역법을 들 수 있다. DNA 면역법이란, 항원 발현 플라스미드를 마우스나 래트 등의 동물 개체에 유전자 도입하여, 항원을 개체 내에서 발현시킴으로서, 항원에 대한 면역을 유도하는 수법이다. 유전자 도입의 수법에는, 직접 플라스미드를 근육에 주사하는 방법이나, 리포솜이나 폴리에틸렌이민 등의 도입 시약을 정맥 주사하는 방법, 바이러스 벡터를 사용하는 수법, 플라스미드를 부착시킨 금 입자를 유전자 총 (Gene Gun) 에 의해 쏘아넣는 수법, 급속히 대량의 플라스미드 용액을 정맥 주사하는 하이드로다이나믹 법 (Hydrodynamic 법) 등이 존재한다. 발현 플라스미드의 근주 (筋注) 에 의한 유전자 도입법에 관해, 발현량을 향상시키는 수법으로서, 플라스미드를 근주 후, 동일한 부위에 일렉트로포레이션을 가하는 in vivo electroporation 이라는 기술이 알려져 있다 (Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep ; 16(9) : 867-70 또는 Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Apr 13 ; 96(8) : 4262-7.). 본 수법은 플라스미드의 근주 전에 히알루로니다아제로 근육을 처리함으로써, 더욱 발현량이 향상된다 (McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ. Gene Ther. 2001 Aug ; 8(16) : 1264-70). 또, 하이브리도마의 제조는 공지된 방법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들어, Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences 사) 을 사용하여 실시할 수도 있다.
구체적인 모노클로날 항체 취득의 예로는, 이하를 들 수 있다.
(a) CDH6 의 cDNA 를 발현 벡터 (예를 들어, pcDNA3.1 : Thermo Fisher Scientific) 에 삽입하고, 일렉트로포레이션이나 유전자총 등의 방법에 의해, 그 벡터를 직접 피면역 동물 (예를 들어, 래트나 마우스) 에 투여함으로써, 동물 체내에 있어서 CDH6 을 발현시킴으로서, 면역 반응을 야기시킬 수 있다. 일렉트로포레이션 등에 의한 벡터의 투여는 항체가를 높이기 위해서 필요하다면, 1 회이어도 되고 복수회이어도 되고, 바람직하게는 복수회이다 ;
(b) 면역 반응을 야기한 상기 서술한 동물로부터, 항체 산생 세포를 포함하는 조직 (예를 들어 림프절) 을 채취한다 ;
(c) 골수종 세포 (이하 「미엘로마」 라고 한다) (예를 들어, 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포) 의 조제 ;
(d) 항체 산생 세포와 미엘로마의 세포 융합 ;
(e) 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마군의 선별 ;
(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝) ;
(g) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육 ; 및/또는
(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성 (내재화 활성), 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정.
여기서 사용되는 항체값의 측정법으로는, 예를 들어, 플로우 사이토메트리 또는 Cell-ELISA 법을 들 수 있지만 이들 방법에 제한되지 않는다.
이와 같이 하여 수립된 하이브리도마주의 예로는, 항 CDH6 항체 산생 하이브리도마 rG019, rG055, rG056 및 rG061 을 들 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서는, 항 CDH6 항체 산생 하이브리도마 rG019 가 산생하는 항체를, 「rG019 항체」 또는 간단히 「rG019」 로 기재하고, 하이브리도마 rG055 가 산생하는 항체를, 「rG055 항체」 또는 간단히 「rG055」 로 기재하고, 하이브리도마 rG056 이 산생하는 항체를, 「rG056 항체」 또는 간단히 「rG056」 으로 기재하고, 하이브리도마 rG061 이 산생하는 항체를, 「rG061 항체」 또는 간단히 「rG061」 로 한다.
rG019 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG019 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 11 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. rG019 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 12 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. rG019 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG019 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 16 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. rG019 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 17 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. rG019 항체의 서열을 표 1 에 나타낸다.
rG055 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 20 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG055 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 21 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. rG055 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 22 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 23 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 24 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. rG055 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 25 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG055 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 26 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. rG055 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 27 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 28 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 29 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. rG055 항체의 서열을 표 1 에 나타낸다.
rG056 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 30 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG056 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 31 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. rG056 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 32 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 33 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 34 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. rG056 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 35 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG056 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 36 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. rG056 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 37 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 38 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 39 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. rG056 항체의 서열을 표 1 에 나타낸다.
rG061 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 40 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG061 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 41 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. rG061 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 42 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 43 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 44 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. rG061 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 45 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG061 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 46 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. rG061 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 47 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 48 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 49 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. rG061 항체의 서열을 표 1 에 나타낸다.
또한 「2. 항 CDH6 항체의 제조」 (a) 내지 (h) 의 공정을 다시 실시하여 별도로 독립적으로 모노클로날 항체를 취득했을 경우나 다른 방법에 의해 별도로 모노클로날 항체를 취득했을 경우에 있어서도, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체와 동등한 내재화 활성을 갖는 항체를 취득하는 것이 가능하다. 이와 같은 항체의 일례로서, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다. 새롭게 제조된 모노클로날 항체가 rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 모노클로날 항체가 rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체의 CDH6 에 대한 결합에 대하여 그 모노클로날 항체가 경합하는 (즉, 그 모노클로날 항체가 rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체와 CDH6 의 결합을 방해한다) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 모노클로날 항체가 항 CDH6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일하다는 것이 확인되었을 경우, 그 모노클로날 항체가 rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체와 동등한 항원 결합능, 생물 활성 및/또는 내재화 활성을 가지고 있는 것이 강하게 기대된다.
(3) 그 밖의 항체
본 발명의 항체에는, 상기 CDH6 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체 또는 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는, 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).
래트 항인간 CDH6 항체 유래의 키메라 항체의 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체) 의 각 경사슬 가변 영역과 인간 유래의 정상 영역을 포함하는 경사슬, 및 각 중사슬 가변 영역과 인간 유래의 정상 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
래트 항인간 CDH6 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체) 의 각 경사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 각 중사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
래트 항인간 CDH6 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체 또는 rG061 항체) 의 각 경사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 개의 CDR 중의 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 각 중사슬 가변 영역 중 어느 1 ∼ 3 개의 CDR 중의 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체로는, 예를 들어, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 개의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 개의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 58 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다. 서열 번호 58 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열 중의 CDRH2 중의 시스테인 잔기를 프롤린 잔기로 치환한 서열이다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체의 구체예로는, 서열 번호 53 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및 서열 번호 56 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 키메라 항인간 CDH6 항체를 본 명세서 중, 「키메라 G019 항체」, 「chG019 항체」 또는 「chG019」 라고 칭한다. chG019 항체의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열은 서열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드되고, chG019 항체의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열은 서열 번호 57 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다.
chG019 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열은, rG019 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열과 동일하고, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. chG019 항체의 경사슬은, 서열 번호 12 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖고, 각각, rG019 의 경사슬의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 과 동일하다. chG019 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산은, 서열 번호 55 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다.
chG019 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, 서열 번호 58 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. chG019 항체의 중사슬은, 서열 번호 17 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 60 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. 서열 번호 58 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열 중의 CDRH2 중의 시스테인 잔기를 프롤린 잔기로 치환한 서열이다. 서열 번호 60 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 는, 서열 번호 18 에 나타내는 rG019 CDRH2 중의 시스테인 잔기를 프롤린 잔기로 치환한 서열이다. chG019 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, 서열 번호 59 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다.
chG019 항체의 서열을 표 1 에 나타낸다.
래트 항인간 CDH6 항체 rG055 항체 유래의 키메라 항체로는, 예를 들어, 서열 번호 20 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 25 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 키메라 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
래트 항인간 CDH6 항체 rG056 항체 유래의 키메라 항체로는, 예를 들어, 서열 번호 30 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 35 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 키메라 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
래트 항인간 CDH6 항체 rG061 항체 유래의 키메라 항체로는, 예를 들어, 서열 번호 40 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 45 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 키메라 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; Complementarity Determining Region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해, CDR 의 서열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제 공개 제90/07861호), 또한, 항원에 대한 결합능을 유지하면서, 일부의 CDR 의 아미노산 서열을 개변한 항체를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체, rG061 항체 또는 chG019 항체 유래의 인간화 항체란, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체, rG061 항체 또는 chG019 항체 중 어느 것에 대하여, 각각에 고유의 6 개의 CDR 서열을 모두 유지하고, 또한 내재화 활성을 갖는 인간화 항체이면 되고, 특정한 인간화 항체에 한정되지 않는다. 당해 인간화 항체는, 내재화 활성을 갖는 한, 또한 일부의 CDR 의 일부의 아미노산 서열이 개변되어 있어도 된다.
chG019 항체의 인간화 항체의 실례로는, (1) 서열 번호 63 또는 67 에 기재된 아미노산 서열, (2) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (3) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 그리고 (4) 서열 번호 71, 75 또는 79 에 기재된 아미노산 서열, (5) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (6) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬의 임의의 조합을 들 수 있다.
또, 중사슬 또는 경사슬의 일방을 인간화하고, 타방을 래트 항체나 키메라 항체의 경사슬 또는 중사슬로 한 항체도 사용할 수 있다. 그러한 항체의 예로는, (1) 서열 번호 63 또는 67 에 기재된 아미노산 서열, (2) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (3) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 그리고 (4) 서열 번호 15, 25, 35, 45 또는 58 에 기재된 아미노산 서열, (5) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (6) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬의 임의의 조합을 들 수 있다. 다른 예로는, (1) 서열 번호 10, 20, 30 또는 40 에 기재된 아미노산 서열, (2) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (3) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 그리고 (4) 서열 번호 71, 75 또는 79 에 기재된 아미노산 서열, (5) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (6) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬의 임의의 조합을 들 수 있다.
또, 본 명세서 중에 있어서의 아미노산의 치환으로는 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측사슬에 관련이 있는 아미노산 그룹 내에서 발생하는 치환이다. 바람직한 아미노산 그룹은, 이하와 같다 : 산성 그룹 = 아스파르트산, 글루탐산 ; 염기성 그룹 = 리신, 아르기닌, 히스티딘 ; 비극성 그룹 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 ; 및 비대전 극성 패밀리 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 다른 바람직한 아미노산 그룹은 다음과 같다 : 지방족 하이드록시 그룹 = 세린 및 트레오닌 ; 아미드 함유 그룹 = 아스파라긴 및 글루타민 ; 지방족 그룹 = 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신 ; 그리고 방향족 그룹 = 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 이러한 아미노산 치환은 원래의 아미노산 서열을 갖는 물질의 특성을 저하시키지 않는 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.
상기 경사슬 및 중사슬의 바람직한 조합의 항체로는, 서열 번호 63 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hL02 경사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 경사슬 또는 서열 번호 67 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hL03 경사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 경사슬, 및 서열 번호 71 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH01 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 중사슬, 서열 번호 75 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH02 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 중사슬 또는 서열 번호 79 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH04 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 바람직한 예로는, 서열 번호 63 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 71 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 63 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 75 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 63 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 79 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 67 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 71 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 67 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 75 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 또는 서열 번호 67 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 79 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 보다 바람직한 예로는, 서열 번호 63 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 71 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 63 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 75 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 63 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 79 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 또는 서열 번호 67 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 75 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
상기 경사슬 및 중사슬의 바람직한 조합의 항체의 다른 예로는, 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열 (본 명세서 중, hL02 경사슬 전체 길이 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 또는 서열 번호 65 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열 (본 명세서 중, hL03 경사슬 전체 길이 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH01 중사슬 전체 길이 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 서열 번호 73 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH02 중사슬 전체 길이 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 또는 서열 번호 77 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH04 중사슬 전체 길이 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 바람직한 예로는, 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 65 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 65 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 또는 서열 번호 65 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 보다 바람직한 예로는, 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H01L02 항체」 또는 「H01L02」 라고도 칭한다) ; 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H02L02 항체」 또는 「H02L02」 라고도 칭한다) ; 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H04L02 항체」 또는 「H04L02」 라고도 칭한다) ; 또는 서열 번호 65 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H02L03 항체」 또는 「H02L03」 이라고도 칭한다) 를 들 수 있다. H01L02 항체, H02L02 항체, H02L03 항체 또는 H04L02 항체의 서열을 표 1 에 나타낸다.
상기의 중사슬 아미노산 서열 및 경사슬 아미노산 서열과 높은 동일성을 나타내는 서열을 조합함으로써, 상기의 각 항체와 동등한 생물 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 이와 같은 동일성은, 일반적으로는 80 ％ 이상의 동일성이고, 바람직하게는 90 ％ 이상의 동일성이고, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성이고, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성이다. 또, 중사슬 또는 경사슬의 아미노산 서열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 조합하는 것에 의해서도, 상기의 각 항체와 동등한 생물 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다.
2 종류의 아미노산 서열간의 동일성은 ClustalW version2 (Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ and Higgins DG (2007), 「Clustal W and Clustal X version 2.0」, Bioinformatics. 23(21) : 2947-2948) 의 디폴트 파라미터를 사용하여 서열을 정렬시킴으로써 결정할 수 있다.
또한, 서열 번호 61 에 나타내는 hL02 경사슬 전체 길이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 21 ∼ 128 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 129 ∼ 233 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 62 에 나타내는 hL02 경사슬 전체 길이 뉴클레오티드 서열 중, 1 ∼ 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 코드하고, 61 ∼ 384 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 가변 영역을 코드하고, 385 ∼ 699 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.
서열 번호 65 에 나타내는 hL03 경사슬 전체 길이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 21 ∼ 128 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 129 ∼ 233 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 66 에 나타내는 hL03 경사슬 전체 길이 뉴클레오티드 서열 중, 1 ∼ 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 코드하고, 61 ∼ 384 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 가변 영역을 코드하고, 385 ∼ 699 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.
서열 번호 69 에 나타내는 hH01 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 70 에 나타내는 hH01 중사슬 전체 길이 뉴클레오티드 서열 중, 1 ∼ 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 코드하고, 58 ∼ 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 가변 영역을 코드하고, 424 ∼ 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.
서열 번호 73 에 나타내는 hH02 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 74 에 나타내는 hH02 중사슬 전체 길이 뉴클레오티드 서열 중, 1 ∼ 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 코드하고, 58 ∼ 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 가변 영역을 코드하고, 424 ∼ 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.
서열 번호 77 에 나타내는 hH04 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 78 에 나타내는 hL04 중사슬 전체 길이 뉴클레오티드 서열에서, 1 ∼ 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열이고, 58 ∼ 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 가변 영역을 코드하고 있고, 424 ∼ 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.
[표 1-1]
Figure pct00008
[표 1-2]
Figure pct00009
[표 1-3]
Figure pct00010
[표 1-4]
Figure pct00011
[표 1-5]
Figure pct00012
[표 1-6]
Figure pct00013
[표 1-7]
Figure pct00014
[표 1-8]
Figure pct00015
[표 1-9]
Figure pct00016
[표 1-10]
Figure pct00017
[표 1-11]
Figure pct00018
[표 1-12]
Figure pct00019
[표 1-13]
Figure pct00020
[표 1-14]
Figure pct00021
[표 1-15]
Figure pct00022
(본 명세서 중, 표 1-1 ∼ 표 1-15 를 표 1 이라고 총칭하는 경우가 있다)
본 발명의 항체로는, 추가로, CDH6 에 결합하는 인간 항체를 들 수 있다. 항 CDH6 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 CDH6 인간 항체는, 인간 항체의 중사슬과 경사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143, ; Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 ; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999. ; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 등을 참조.) 에 의해 취득할 수 있다.
이와 같은 인간 항체 산생 마우스는, 구체적으로는, 내재성 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌 (遺傳子座) 가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 통하여 인간 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 도입된 유전자 재조합 동물로서, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제조 및 이들 동물끼리를 교배시킴으로써 만들어 낼 수 있다.
또, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환하고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 산생하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중에서 얻을 수도 있다.
여기서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미엘로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.
또, 인간 항체 라이브러리로부터 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science. (2002) 43(7), p.2301-2308 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), p.189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109(3), p.427-431 등 참조.) 도 알려져 있다.
예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 본쇄 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116) 을 사용할 수 있다.
항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
항원에 결합하는 scFv 의 DNA 서열이 명확해지면, 당해 서열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로서 인간 항체를 취득할 수 있다 (국제 공개 제92/01047호, 동 92/20791호, 동 93/06213호, 동 93/11236호, 동 93/19172호, 동 95/01438호, 동 95/15388호, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23(9), p.1105-1116).
새롭게 제조된 인간 항체가, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체, rG061 항체, chG019 항체, H01L02 항체, H02L02 항체, H02L03 항체 또는 H04L02 항체) 중 어느 하나가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 인간 항체가 당해 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 혹은, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체, rG061 항체, chG019 항체, H01L02 항체, H02L02 항체, H02L03 항체 또는 H04L02 항체) 의 CDH6 에 대한 결합에 대하여 그 인간 항체가 경합하는 (예를 들어, 그 인간 항체가 rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체, rG061 항체, chG019 항체, H01L02 항체, H02L02 항체, H02L03 항체 또는 H04L02 항체와 CDH6, 바람직하게는, CDH6 의 EC3 에 대한 결합을 방해한다) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 인간 항체가 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 당해 판정 방법의 적어도 어느 일방의 방법에 의해 「동일한 에피토프에 결합한다」 라고 판정되었을 경우, 새롭게 제조된 인간 항체가, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체와 「동일한 에피토프에 결합한다」 고 할 수 있다. 에피토프가 동일하다는 것이 확인되었을 경우, 그 인간 항체가 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체, rG055 항체, rG056 항체, rG061 항체, chG019 항체, H01L02 항체, H02L02 항체, H02L03 항체 또는 H04L02 항체) 와 동등한 생물 활성을 가지고 있는 것이 기대된다.
이상의 방법에 의해 얻어진 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체는, 공지된 방법 등에 의해 항원에 대한 결합성을 평가하여, 바람직한 항체를 선발할 수 있다.
항체의 성질을 비교할 때의 다른 지표의 일례로는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 는, 단백의 상대적 구조 안정성이 양호한 지표가 되는 열변성 중점 (Tm) 을 재빠르게, 또 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. DSC 를 사용하여 Tm 값을 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은, 항체의 열안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있고 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273), 열안정성을 지표로, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량이 높은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 가장 높은 열안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에 서술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하여, 인간에 대한 투여에 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.
본 발명의 항체에는 항체의 수식체도 포함된다. 당해 수식체란, 본 발명의 항체에 화학적 또는 생물학적인 수식이 실시되어 이루어지는 것을 의미한다. 화학적인 수식체에는, 아미노산 골격에 대한 화학 부분의 결합, N- 결합 또는 O- 결합 탄수화물 사슬의 화학 수식체 등이 포함된다. 생물학적인 수식체에는, 번역 후 수식 (예를 들어, N- 결합 또는 O- 결합에 대한 당 사슬 부가, N 말 또는 C 말의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, 또는 N 말 글루타민 혹은 N 말 글루탐산의 피로글루탐산화) 된 것, 원핵 생물 숙주 세포를 사용하여 발현시킴으로서 N 말에 메티오닌 잔기가 부가된 것 등이 포함된다. 또, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 가능하게 하기 위해서 표지된 것, 예를 들어, 효소 표지체, 형광 표지체, 어피니티 표지체도 이러한 수식물의 의미에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 항체의 수식물은, 항체의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
또, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당 사슬 수식을 조절하는 것 (글리코실화, 탈푸코오스화 등) 에 의해, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항체의 당 사슬 수식의 조절 기술로는, 국제 공개 제1999/54342호, 동 2000/61739호, 동 2002/31140호 등이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체에는 당해 당 사슬 수식이 조절된 항체도 포함된다.
항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주과 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 서열을 코드하는 유전자, 및 경사슬 서열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중사슬 서열 유전자와 경사슬 서열 유전자는, 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 각각의 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다.
진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 특히 동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220), FreeStyle 293F 세포 (invitrogen 사) 를 들 수 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다.
이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 당해 배양에 있어서는 항체의 서열에 의해 수량이 상이한 경우가 있고, 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 항체에는, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체도 포함된다.
또한, 포유류 배양 세포에서 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705 : 129-134 (1995)), 또, 동일하게 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실되고, 새롭게 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 : 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중사슬 서열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 및 이펙터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 상해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 관련된 항체에는, 당해 수식을 받은 항체 및 당해 항체의 기능성 단편도 포함되고, 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실된 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중사슬) 등도 포함된다. 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되어 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 결실체는 상기의 종류에 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중사슬은, 완전 길이 및 상기의 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 중 어느 1 종이어도 되고, 어느 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양비는 본 발명에 관련된 항체를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로는 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단의 하나의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.
본 발명의 항체의 아이소 타입으로는, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 를 들 수 있다.
항체의 생물 활성으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원과 결합함으로써 그 항원을 발현하는 세포에 내재화되는 활성, 항원의 활성을 중화시키는 활성, 항원의 활성을 증강시키는 활성, 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 매개 식작용 (ADCP) 을 들 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체가 갖는 기능은, CDH6 에 대한 결합 활성이고, 바람직하게는 CDH6 과 결합함으로써 CDH6 발현 세포에 내재화되는 활성이다. 또한 본 발명의 항체는, 세포 내재화 활성에 더하여, ADCC 활성, CDC 활성 및/또는 ADCP 활성을 겸비하고 있어도 된다.
얻어진 항체는 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.
이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.
어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (파르마시아) 등을 들 수 있다.
또 항원을 고정화시킨 담체를 사용하고, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.
3. 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트
(1) 약물
상기 「2. 항 CDH6 항체의 제조」 에서 취득된 항 CDH6 항체는 링커 구조 부분을 통하여 약물을 결합시킴으로써, 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트로 할 수 있다. 약물로는, 링커 구조에 결합할 수 있는 치환기, 부분 구조를 갖는 것이면 특별히 제한은 없다. 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트는 결합하는 약물에 따라 여러 가지 용도에 사용할 수 있다. 그러한 약물의 예로는, 항종양 활성을 갖는 물질, 혈액 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 자기 면역 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 항염증 물질, 항균 물질, 항진균 물질, 항기생충 물질, 항바이러스 물질, 항마취 물질 등을 들 수 있다.
(1)-1 항종양 화합물
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트에 결합되는 화합물로서 항종양성 화합물을 사용하는 예에 대하여 이하에 서술한다. 항종양성 화합물로는, 항종양 효과를 갖는 화합물로서, 링커 구조에 결합할 수 있는 치환기, 부분 구조를 갖는 것이면 특별히 제한은 없다. 항종양성 화합물은, 링커의 일부 또는 전부가 종양 세포 내에서 절단되어 항종양성 화합물 부분이 유리되어 항종양 효과가 발현된다. 링커가 약물과의 결합 부분에서 절단되면 항종양성 화합물이 본래의 구조에서 유리되어, 그 본래의 항종양 효과가 발휘된다.
상기 「2. 항 CDH6 항체의 제조」 에서 취득된 항 CDH6 항체는 링커 구조 부분을 통하여 항종양성 화합물을 결합시킴으로써, 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항종양성 화합물의 하나의 예로서, 캠토테신 유도체인 엑사테칸 ((1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온 ; 다음 식 :)
[화학식 5]
Figure pct00023
을 바람직하게 사용할 수 있다. 동 화합물은, 예를 들어, 미국 특허공개공보 US2016/0297890호에 기재된 방법이나 그 밖의 공지된 방법으로 용이하게 취득할 수 있고, 1 위치의 아미노기를 링커 구조에 대한 결합 부위로서 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 엑사테칸은 링커의 일부가 결합한 상태에서 종양 세포 내에서 유리되는 경우도 있지만, 이와 같은 상태에서도 우수한 항종양 효과가 발휘되는 화합물이다.
엑사테칸은 캠토테신 구조를 가지므로, 산성 수성 매체 중 (예를 들어 pH3 정도) 에서는 락톤 고리가 형성된 구조 (폐환체) 로 평형이 치우치고, 한편, 염기성 수성 매체 중 (예를 들어 pH10 정도) 에서는 락톤 고리가 개환된 구조 (개환체) 로 평형이 치우치는 것이 알려져 있다. 이와 같은 폐환 구조 및 개환 구조에 대응하는 엑사테칸 잔기를 도입한 약물 콘주게이트이어도 동등한 항종양 효과가 기대되고, 어느 것도 본 발명의 범위에 포함되는 것은 말할 필요도 없다.
다른 항종양성 화합물로서 예를 들어, 문헌 (Pharmacological Reviews, 68, p3-19, 2016) 에 기재된 항종양 화합물을 들 수 있고, 그 일례로서, 독소루비신 (Doxorubicin), 칼리케마이신 (Calicheamicine), 도라스타틴 (Dorastatin) 10, 모노메틸아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F (MMAF) 등의 아우리스타틴류 (Auristatins), DM1, DM4 의 메이탄시노이드류 (Maytansinoids), 피롤로벤조디아제핀 (Pyrrolobenzodiazepine) 2 량체의 SG2000 (SJG-136), 캠토테신의 유도체인 SN-38, CC-1065 의 듀오카르마이신류 (Duocarmycins), 아마니틴 (Amanitin), 다우노루비신, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 시클로시티딘, 빈크리스틴, 빈블래스틴, 메토트렉세이트, 백금계 항종양제 (시스플라틴 혹은 그 유도체), 택솔 혹은 그 유도체 등을 들 수 있다.
항체-약물 콘주게이트에 있어서, 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는, 그 유효성, 안전성에 영향을 미치는 중요 인자이다. 항체-약물 콘주게이트의 제조는, 약물의 결합수가 일정한 수가 되도록, 반응시키는 원료·시약의 사용량 등의 반응 조건을 규정하여 실시되지만, 저분자 화합물의 화학 반응과는 상이하고, 상이한 수의 약물이 결합한 혼합물로서 얻어지는 것이 통상이다. 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는 평균값, 즉, 평균 약물 결합수로서 특정되고, 표기된다. 본 발명에서도 원칙적으로 언급이 없는 한, 즉, 상이한 약물 결합수를 갖는 항체-약물 콘주게이트 혼합물에 포함되는 특정한 약물 결합수를 갖는 항체-약물 콘주게이트를 나타내는 경우를 제외하고, 약물의 결합수는 평균값을 의미한다. 항체 분자에 대한 엑사테칸의 결합수는 컨트롤 가능하고, 1 항체당 약물 평균 결합수로서, 1 ∼ 10 개 정도의 엑사테칸을 결합시킬 수 있지만, 바람직하게는 2 ∼ 8 개, 3 ∼ 8 개, 4 ∼ 8 개, 5 ∼ 8 개, 6 ∼ 8 개, 7 ∼ 8 개이고, 보다 바람직하게는 5 ∼ 8 개이고, 더욱 바람직하게는 7 ∼ 8 개이고, 더욱 더 바람직하게는 8 개이다. 또한, 당업자이면 본원의 실시예의 기재로부터 항체에 필요한 수의 약물을 결합시키는 반응을 설계할 수 있어, 엑사테칸의 결합수를 컨트롤한 항체-약물 콘주게이트를 취득할 수 있다.
(2) 링커 구조
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트에 있어서 약물을 항 CDH6 항체에 결합시키는 링커 구조에 대하여 서술한다.
본원의 항체-약물 콘주게이트에 있어서, 항 CDH6 항체와 약물을 결합하는 링커 구조는, 항체-약물 콘주게이트로서 사용할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 사용 목적에 따라 적절히 선택하여 사용할 수도 있다. 링커 구조의 일례로는, 공지 문헌 (Pharmacol Rev 68 : 3 - 19, January 2016, Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0 등) 에 기재된 링커를 들 수 있고, 더욱 구체적인 예로는, VC (발린-시트룰린 : valine-citrulline), MC (말레이미도카프로일 : maleimidocaproyl), SMCC (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 : succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), SPP (N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜탄산 : N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)pentanoate, SS (디술파이드 : disulfide), SPDB (N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부티레이트) N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)butyrate, SS/하이드라존, 하이드라존, 카르보네이트를 들 수 있다.
다른 일례로는, 예를 들어, 미국 특허공개공보 US2016/0297890 에 기재된 링커 구조 (일례로서, 단락 [0260] ∼ [0289] 에 기재된 것) 를 들 수 있고, 이하의 구조의 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한 이하에 나타내는 구조의 좌단이 항체와의 결합 부위이고, 우단이 약물과의 결합 부위이다. 또, 하기의 링커 구조 중의 GGFG 는, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 (GGFG) 으로 이루어지는 펩티드 결합으로 연결되어 있는 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00024
보다 바람직하게는, 다음의 것을 들 수 있다.
Figure pct00025
더욱 더 바람직하게는,
Figure pct00026
를 들 수 있다.
항체는 -(숙신이미드-3-일-N) 의 말단, (예를 들어, 『-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-』 에 있어서는, (-CH2CH2CH2CH2CH2-) 가 결합하는 것과는 반대측의 말단 (좌측 말단)) 에서 결합하고, 항종양성 화합물은 -(숙신이미드-3-일-N) 과는 반대측의 말단 (상기 예에서는 우측 말단의 CH2-O-CH2-C(=O)- 의 카르보닐기에서 결합한다. 『-(숙신이미드-3-일-N)-』 는, 다음 식 :
[화학식 6]
Figure pct00027
으로 나타내는 구조를 갖는다. 이 부분 구조에 있어서의 3 위치가 항 CDH6 항체에 대한 결합 부위이다. 이 3 위치에서의 그 항체와의 결합은, 티오에테르를 형성하여 결합하는 것이 특징이다. 이 구조 부분의 1 위치의 질소 원자는, 이 구조가 포함되는 링커 내에 존재하는 메틸렌의 탄소 원자와 결합한다.
약물을 엑사테칸으로 하는 본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 있어서는, 하기 구조의 약물-링커 구조 부분을 항체에 결합시킨 것이 바람직하다. 이들 약물-링커 구조 부분은, 1 항체당 평균 결합수로서, 1 내지 10 을 결합시키면 되지만, 바람직하게는 2 내지 8 이고, 보다 바람직하게는 5 내지 8 이고, 더욱 바람직하게는 7 내지 8 이고, 더욱 더 바람직하게는 8 이다.
Figure pct00028
보다 바람직하게는, 다음의 것이다.
Figure pct00029
또한, 보다 바람직하게는, 다음의 것을 들 수 있다.
Figure pct00030
또, -(NH-DX) 는 다음 식 :
[화학식 7]
Figure pct00031
으로 나타내는 구조이고, 엑사테칸의 1 위치의 아미노기의 수소 원자 1 개가 제거되어 생성되는 기를 나타낸다.
(3) 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 사용할 수 있는 항체는, 상기 「2. 항 CDH6 항체의 제조」 의 항 및 실시예에 기재된 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체 및 그 항체의 기능성 단편이면 특별히 제한이 없다.
다음으로, 본 발명의 항체-약물 콘주게이트의 대표적인 제조 방법에 대해 설명한다. 또한, 이하에 있어서, 화합물을 나타내기 위해, 각 반응식 중에 나타내는 화합물의 번호를 사용한다. 즉, 『식 (1) 의 화합물』, 『화합물 (1)』 등이라고 칭한다. 또, 이 이외의 번호의 화합물에 대해서도 동일하게 기재한다.
(3)-1 제조 방법 1
하기 식 (1) 로 나타내는 항체-약물 콘주게이트 중, 티오에테르를 통하여 항 CDH6 항체와 링커 구조가 결합하고 있는 것은 항 CDH6 항체를 환원하여 디술파이드 결합을 술프하이드릴기로 변환한 항체에 대하여, 이미 알려진 방법에 의해 입수할 수 있는 화합물 (2) (예를 들어, US2016/297890호 공개특허공보에 기재된 방법 (예를 들어 단락 [0336] ∼ [0374] 에 기재된 방법) 으로 입수 가능) 를 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어 하기 방법에 의해 제조할 수 있다.
Figure pct00032
[식 중, AB 는, 술프하이드릴기를 갖는 항체를 나타낸다.
여기서, L1 은,
-(숙신이미드-3-일-N)- 의 구조로 나타낸다.
L1' 는 다음 식으로 나타내는 말레이미딜기를 나타낸다.]
[화학식 8]
Figure pct00033
-L1-LX 는, 이하의 식으로 나타내는 어느 구조를 갖는다.
Figure pct00034
이들 중에서 보다 바람직하게는, 다음의 것이다.
Figure pct00035
또한, 바람직하게는, 다음의 것을 들 수 있다.
Figure pct00036
또, 상기의 반응식에 있어서 항체-약물 콘주게이트 (1) 에서는, 약물로부터 링커 말단까지의 구조 부분 1 개가 1 개의 항체에 대해 결합한 구조로서 기재되어 있지만, 이것은 설명을 위한 편의적인 기재로서, 실제로는 당해 구조 부분이 1 개의 항체 분자에 대해 복수개가 결합하고 있는 경우가 많다. 이 상황은 이하의 제조 방법의 설명에 있어서도 동일하다.
즉, 이미 알려진 방법에 의해 입수할 수 있는 화합물 (2) (예를 들어, US2016/297890호 공개특허공보에 기재된 방법 (예를 들어 단락 [0336] ∼ [0374] 에 기재된 방법) 으로 입수 가능) 으로 입수 가능) 과, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 반응시킴으로써, 항체-약물 콘주게이트 (1) 을 제조할 수 있다.
술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 는, 당업자에게 주지된 방법으로 얻을 수 있다 (Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, pp.56-136, pp.456-493, Academic Press (1996)). 예를 들어, Traut's 시약을 항체의 아미노기에 작용시킨다 ; N-숙신이미딜S-아세틸티오알카노에이트류를 항체의 아미노기에 작용시킨 후, 하이드록실아민을 작용시킨다 ; N-숙신이미딜3-(피리딜디티오)프로피오네이트를 작용시킨 후, 환원제를 작용시킨다 ; 디티오트레이톨, 2-메르캅토에탄올, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염 (TCEP) 등의 환원제를 항체에 작용시켜 항체 내 사슬간부의 디술파이드 결합을 환원하여 술프하이드릴기를 생성시킨다 ; 등의 방법을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
구체적으로는, 환원제로서 TCEP 를, 항체 내 사슬간부 디술파이드 1 개당에 대하여 0.3 내지 3 몰당량 사용하고, 킬레이트제를 포함하는 완충액 중에서, 항체와 반응시킴으로써, 항체 내 사슬간부 디술파이드가 부분적 혹은 완전히 환원된 항체를 얻을 수 있다. 킬레이트제로는, 예를 들어 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 이나 디에틸렌트리아민 5 아세트산 (DTPA) 등을 들 수 있다. 이것 등을 1 mM 내지 20 mM 의 농도로 사용하면 된다. 완충액으로는, 인산나트륨이나 붕산나트륨, 아세트산나트륨 용액 등을 사용할 수 있다. 구체적인 예에 있어서, 항체는 4 ℃ 내지 37 ℃ 에서 1 내지 4 시간 TCEP 와 반응시킴으로써 부분적 혹은 완전히 환원된 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 얻을 수 있다.
또한, 여기서 술프하이드릴기를 약물-링커 부분에 부가시키는 반응을 실시시킴으로써 티오에테르 결합에 의해 약물-링커 부분을 결합시킬 수 있다.
다음으로, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 1 개당, 2 내지 20 몰당량의 화합물 (2) 을 사용하여, 항체 1 개당 2 개 내지 8 개의 약물이 결합한 항체-약물 콘주게이트 (1) 을 제조할 수 있다. 구체적으로는, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 포함하는 완충액에, 화합물 (2) 를 용해시킨 용액을 첨가하여 반응시키면 된다. 여기서, 완충액으로는, 아세트산나트륨 용액, 인산나트륨이나 붕산나트륨 등을 사용하면 된다. 반응시의 ph 는 5 내지 9 이고, 보다 바람직하게는 pH7 부근에서 반응시키면 된다. 화합물 (2) 를 용해시키는 용매로는, 디메틸술폭사이드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피리돈 (NMP) 등의 유기 용매를 사용할 수 있다. 화합물 (2) 를 용해시킨 유기 용매 용액을, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 포함하는 완충액에 1 내지 20 ％v/v 를 첨가하여 반응시키면 된다. 반응 온도는, 0 내지 37 ℃, 보다 바람직하게는 10 내지 25 ℃ 이고, 반응 시간은, 0.5 내지 2 시간이다. 반응은, 미반응의 화합물 (2) 의 반응성을 티올 함유 시약에 의해 실활시킴으로써 종료할 수 있다. 티올 함유 시약은 예를 들어, 시스테인 또는 N-아세틸-L-시스테인 (NAC) 이다. 보다 구체적으로는, NAC 를, 사용한 화합물 (2) 에 대하여, 1 내지 2 몰당량 첨가하고, 실온에서 10 내지 30 분 인큐베이트함으로써 반응을 종료할 수 있다.
(4) 항체-약물 콘주게이트의 동정
제조한 항체-약물 콘주게이트 (1) 은, 이하의 공통 조작에 의해 농축, 버퍼 교환, 정제, 항체 농도 및 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정을 실시하여, 항체-약물 콘주게이트 (1) 의 동정을 실시할 수 있다.
(4)-1 공통 조작 A : 항체 혹은 항체-약물 콘주게이트 수용액의 농축
Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation) 의 용기 내에 항체 혹은 항체-약물 콘주게이트 용액을 넣고, 원심기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용한 원심 조작 (2000G 내지 3800G 로 5 내지 20 분간 원심) 으로, 항체 혹은 항체-약물 콘주게이트 용액을 농축하였다.
(4)-2 공통 조작 B : 항체의 농도 측정
UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) 를 사용하여, 메이커 규정의 방법에 따라, 항체 농도의 측정을 실시하였다. 그 때, 항체마다 상이한 280 ㎚ 흡광 계수 (1.3 ㎖㎎-1㎝-1 내지 1.8 ㎖㎎-1㎝-1) 를 사용하였다.
(4)-3 공통 조작 C : 항체의 버퍼 교환
Sephadex G-25 담체를 사용한 NAP-25 칼럼 (Cat.No.17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) 을, 메이커 규정의 방법에 따라, 염화나트륨 (50 mM) 및 EDTA (2 mM) 를 포함하는 인산 완충액 (50 mM, pH6.0) (본 명세서에서 PBS6.0/EDTA 라고 칭한다) 으로 평형화시켰다. 이 NAP-25 칼럼 1 개에 대하여, 항체 수용액 2.5 ㎖ 를 올린 후, PBS6.0/EDTA 3.5 ㎖ 로 용출시킨 획분 (3.5 ㎖) 을 분취하였다. 이 획분을 공통 조작 A 에 의해 농축하고, 공통 조작 B 를 사용하여 항체 농도의 측정을 실시한 후에, PBS6.0/EDTA 를 사용하여 20 ㎎/㎖ 로 항체 농도를 조정하였다.
(4)-4 공통 조작 D : 항체-약물 콘주게이트의 정제
시판되는 소르비톨 (5 ％) 을 포함하는 아세트산 완충액 (10 mM, pH5.5 ; 본 명세서에서 ABS 라고 칭한다) 중 어느 완충액으로 NAP-25 칼럼을 평형화시켰다. 이 NAP-25 칼럼에, 항체-약물 콘주게이트 반응 수용액 (약 2.5 ㎖) 을 올리고, 메이커 규정의 양의 완충액으로 용출시킴으로써, 항체 획분을 분취하였다. 이 분취 획분을 다시 NAP-25 칼럼에 올리고 완충액으로 용출시키는 겔 여과 정제 조작을 합계 2 내지 3 회 반복함으로써, 미결합의 약물 링커나 저분자 화합물 (트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염 (TCEP), N-아세틸-L-시스테인 (NAC), 디메틸술폭사이드) 을 제거한 항체-약물 콘주게이트를 얻었다.
(4)-5 공통 조작 E : 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정
항체-약물 콘주게이트에 있어서의 결합 약물 농도는, 항체-약물 콘주게이트 수용액의 280 ㎚ 및 370 ㎚ 의 2 파장에 있어서의 UV 흡광도를 측정한 후에 하기의 계산을 실시함으로써, 산출할 수 있다.
어느 파장에 있어서의 전체 흡광도는 계 내에 존재하는 모든 흡수 화학종의 흡광도의 합과 동일한 [흡광도의 가성성 (加成性)] 이므로, 항체와 약물의 콘주게이션 전후에 있어서, 항체 및 약물의 몰 흡광 계수에 변화가 없다고 가정하면, 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 농도 및 약물 농도는, 하기의 관계식으로 나타낸다.
Figure pct00037
여기서, A280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체-약물 콘주게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, A370 은 370 ㎚ 에 있어서의 항체-약물 콘주게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, AA,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AA,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AD,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 콘주게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, AD,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 콘주게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, εA,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 콘주게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 콘주게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA 는 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 농도를 나타내고, CD 는 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 약물 농도를 나타낸다.
여기서, εA,280, εA,370, εD,280, εD,370 은, 사전에 준비한 값 (계산 추정값 혹은 화합물의 UV 측정으로부터 얻어진 실측값) 이 사용된다. 예를 들어, εA,280 은, 항체의 아미노산 서열로부터, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해 추정할 수 있다. εA,370 은, 통상, 제로이다. εD,280 및 εD,370 은, 사용하는 콘주게이트 전구체를 어느 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정함으로써, 람베르트·비어의 법칙 (흡광도 = 몰 농도 × 몰 흡광 계수 × 셀 광로 길이) 에 의해 얻을 수 있다. 항체-약물 콘주게이트 수용액의 A280 및 A370 을 측정하고, 이들 값을 식 (1) 및 (2) 에 대입하여 연립 방정식을 푸는 것에 의해, CA 및 CD 를 구할 수 있다. 또한 CD 를 CA 로 나눔으로써 1 항체당 약물 평균 결합수를 구할 수 있다.
(4)-6 공통 조작 F : 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정 (2)
항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수는, 전술한 「(4)-5 공통 조작 E」 에 더하여, 이하의 방법을 사용하는 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해서도 구할 수 있다. 이하에, 항체와 약물 링커가 디술파이드 결합하고 있는 경우의 HPLC 에 의한 약물 평균 결합수의 측정 방법을 기재한다. 당업자는, 이 방법을 참조하여, 항체와 약물 링커의 결합 양식에 의존하여 적절히, HPLC 에 의해 약물 평균 결합수를 측정할 수 있다.
F-1. HPLC 분석용 샘플의 조제 (항체-약물 콘주게이트의 환원)
항체-약물 콘주게이트 용액 (약 1 ㎎/㎖, 60 ㎕) 을 디티오트레이톨 (DTT) 수용액 (100 mM, 15 ㎕) 과 혼합한다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이트함으로써, 항체-약물 콘주게이트의 경사슬 및 중사슬간의 디술파이드 결합을 절단한 샘플을, HPLC 분석에 사용한다.
F-2. HPLC 분석
HPLC 분석을 하기의 측정 조건으로 실시한다.
HPLC 시스템 : Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 ㎚)
칼럼 : ACQUITY UPLC BEH Phenyl (2.1 × 50 ㎜, 1.7 ㎛, 130 Å ; Waters, P/N 186002884)
칼럼 온도 : 80 ℃
이동상 A : 0.10 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA), 15 ％ 2-프로판올을 포함하는 수용액
이동상 B : 0.075 ％ TFA, 15 ％ 2-프로판올을 포함하는 아세토니트릴 용액
그래디언트 프로그램 : 14 ％ - 36 ％ (0 분 - 15 분), 36 ％ - 80 ％ (15 분 - 17 분), 80 ％ - 14 ％ (17 분 - 17.01 분), 14 ％ (17.01 분 - 25 분)
샘플 주입량 : 10 ㎕
F-3. 데이터 해석
F-3-1 약물이 결합하고 있지 않은 항체의 경사슬 (L0) 및 중사슬 (H0) 에 대하여, 약물이 결합한 경사슬 (약물이 i 개 결합한 경사슬 : Li) 및 중사슬 (약물이 i 개 결합한 중사슬 : Hi) 은, 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 증가하여 유지 시간이 커지므로, 예를 들어, L0, L1, H0, H1, H2, H3 의 순서로 용출된다. L0 및 H0 의 유지 시간 비교에 의해 검출 피크를 L0, L1, H0, H1, H2, H3 중 어느 것에 할당할 수 있다. 약물 결합수는, 당업자에 의해 정의될 수 있지만, 바람직하게는, L0, L1, H0, H1, H2, H3 이다.
F-3-2 약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, 약물 링커의 결합수에 따라, 경사슬, 중사슬 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 식에 따라 피크 면적값의 보정을 실시한다.
Figure pct00038
Figure pct00039
여기서, 각 항체에 있어서의 경사슬 및 중사슬의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해, 각 항체의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열로부터 추정되는 값을 사용할 수 있다. H01L02 의 경우, 그 아미노산 서열에 따라, 경사슬의 몰 흡광 계수로서 31710 을, 중사슬의 몰 흡광 계수로서 79990 을 추정값으로서 사용하였다. 또, 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 각 약물 링커를 메르캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인으로 반응시키고, 말레이미드기를 숙신이미드티오에테르로 변환한 화합물의 실측의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 를 사용하였다. 흡광도를 측정하는 파장은, 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있지만, 바람직하게는, 항체의 피크가 측정될 수 있는 파장이고, 보다 바람직하게는 280 ㎚ 이다.
F-3-3 피크 면적 보정값 합계에 대한 각 사슬 피크 면적비 (％) 를 하기 식에 따라 계산한다.
Figure pct00040
F-3-4 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수를 하기 식에 따라 계산한다.
약물 평균 결합수 = (L0 피크 면적비 x 0 + L1 피크 면적비 x 1 + H0 피크 면적비 x 0 + H1 피크 면적비 x 1 + H2 피크 면적비 x 2 + H3 피크 면적비 x 3)/100 x 2
또한, 항체-약물 콘주게이트의 양을 확보하기 위해, 동일한 조건으로 제조하여 얻어진 평균 약물수가 동일한 정도의 복수의 항체-약물 콘주게이트 (예를 들어 ±1 정도) 를 혼합하여 새로운 로트로 할 수 있다. 그 경우, 평균 약물수는 혼합 전의 평균 약물수의 사이에 들어간다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트의 하나의 구체예로는 다음 식 :
[화학식 9]
Figure pct00041
또는 다음 식 :
[화학식 10]
Figure pct00042
으로 나타내는 구조를 갖는 것을 들 수 있다.
여기서, AB 는 본 명세서에서 개시되는 항 CDH6 항체를 나타내고, 항체 유래의 술프하이드릴기를 통하여 결합 링커와 결합하고 있다. 여기서, n 은 말하자면 DAR (Drug-to-Antibody Ratio) 과 동일한 의미이고, 1 항체당 약물 항체비를 나타낸다. 즉, 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수를 나타내지만, 이것은 평균값, 즉, 평균 약물 결합수로서 특정되고, 표기되는 수치이다. 본 발명의 [화학식 9] 및 [화학식 10] 으로 나타내는 항체-약물 콘주게이트의 경우, 공통 조작 F 에 의한 측정으로, n 은 2 내지 8 이면 되고, 바람직하게는 5 내지 8 이고, 더욱 바람직하게는 7 내지 8 이고, 더욱 더 바람직하게는 8 이다.
본 발명의 항체 약물-콘주게이트의 일례로서, 상기 식 [화학식 9] 또는 [화학식 10] 으로 나타내는 구조에 있어서, AB 로 나타내는 항체가, 이하의 (a) 내지 (g) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1 항에 기재된 중사슬 및 경사슬의 항체 또는 그 기능성 단편을 포함하는, 항체-약물 콘주게이트 또는 그 약리학상 허용되는 염을 들 수 있다 :
(a) 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
(b) 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
(c) 서열 번호 61 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
(d) 서열 번호 65 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
(e) 서열 번호 65 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
(f) 서열 번호 65 에 나타내는 경사슬 전체 길이 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 에 나타내는 중사슬 전체 길이 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 또는
(g) 중사슬 또는 경사슬이 N-결합에 대한 당 사슬 부가, O-결합에 대한 당 사슬 부가, N 말의 프로세싱, C 말의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말 글루타민이나 N 말 글루탐산의 피로글루탐산화 등으로 대표되는 번역 후 수식, 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는, (a) ∼ (f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체.
4. 의약
상기 「2.항 CDH6 항체의 제조」 의 항 및 실시예에 기재된 본 발명의 항 CDH6 항체 및 당해 항체의 기능성 단편은, 종양 세포 표면의 CDH6 에 결합하여, 내재화 활성을 가지므로, 단독으로 혹은 다른 약제와 조합하여, 의약으로서, 신세포 종양 및 난소 종양 등의 암, 예를 들어, 신세포암, 신염 명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성 선암, 갑상선암, 담관암, 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암), 신경 교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종의 치료제로서 사용할 수 있다.
또, CDH6 을 발현하고 있는 세포의 검출에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 항 CDH6 항체 및 당해 항체의 기능성 단편은, 내재화 활성을 가지므로, 항체-약물 콘주게이트에 사용하는 항체로서 제공할 수 있다.
상기 「3. 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트」 의 항 및 실시예에 기재된 본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트 중에서 약물로서 세포 상해 활성 등의 항종양 활성을 갖는 약물이 사용되고 있는 것은, 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체 및/또는 당해 항체의 기능성 단편과 세포 상해 활성 등의 항종양 활성을 갖는 약물의 콘주게이트이고, CDH6 을 발현하고 있는 암세포에 대하여 항종양 활성을 나타내므로, 의약으로서, 특히 암에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트는, 대기 중에 방치하거나, 또는 재결정이나 정제 조작을 하거나 함으로써, 수분을 흡수하거나, 혹은 흡착수가 부착되는 등을 하여, 수화물이 되는 경우가 있고, 그러한 물을 포함하는 화합물 또는 약리학적으로 허용될 수 있는 염도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트가 아미노기 등의 염기성기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라 약리학적으로 허용될 수 있는 산 부가염을 형성할 수 있다. 그러한 산 부가염으로는, 예를 들어 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염 등의 할로겐화 수소산염 ; 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염 등의 저급 알칸술폰산염 ; 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염 등의 아릴술폰산염 ; 포름산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 또는 오르니틴산염, 글루탐산염, 아스파르트산염 등의 아미노산염 등을 들 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트가 카르복시기 등의 산성기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라 약리학적으로 허용될 수 있는 염기 부가염을 형성할 수 있다. 그러한 염기 부가염으로는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 ; 암모늄염 등의 무기염 ; 디벤질아민염, 모르폴린염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 시클로헥실아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 디에탄올아민염, N-벤질-N-(2-페닐에톡시)아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염 등의 유기 아민염 등을 들 수 있다.
본 발명은 또, 항체-약물 콘주게이트를 구성하는 원자의 1 이상이, 그 원자의 동위체로 치환된 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트를 포함할 수 있다. 동위체에는 방사성 동위체 및 안정 동위체의 2 종류가 존재하고, 동위체의 예로는, 예를 들어, 수소의 동위체 (2H 및 3H), 탄소의 동위체 (11C, 13C 및 14C), 질소의 동위체 (13N 및 15N), 산소의 동위체 (15O, 17O 및 18O), 불소의 동위체 (18F) 등을 들 수 있다. 동위체로 표지된 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 조성물은, 예를 들어, 치료제, 예방제, 연구 시약, 어세이 시약, 진단제, 인비보 화상 진단제 등으로서 유용하다. 동위체로 표지된 항체-약물 콘주게이트, 및 동위체로 표지된 항체-약물 콘주게이트의 임의의 비율의 혼합물도 모두 본 발명에 포함된다. 동위체로 표지된 항체-약물 콘주게이트는, 당해 분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 후술하는 본 발명의 제조 방법에 있어서의 원료 대신에 동위체로 표지된 원료를 사용함으로써, 제조할 수 있다.
in vitro 에서의 살세포 활성은 예를 들어, 세포의 증식 억제 활성으로 측정할 수 있다. 예를 들어, CDH6 을 과잉 발현하고 있는 암 세포주를 배양하고, 배양계에 여러 가지 농도로 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트를 첨가하고, 포커스 활성, 콜로니 형성 및 스페로이드 증식에 대한 억제 활성을 측정할 수 있다. 여기서, 예를 들어, 신세포 종양 및 난소 종양 유래 암세포주 등을 사용함으로써, 신세포 종양 및 난소 종양에 대한 세포 증식 억제 활성을 조사할 수 있다.
in vivo 에서의 실험 동물을 사용한 암에 대한 치료 효과는, 예를 들어, CDH6 을 고발현하고 있는 종양 세포주를 이식한 누드 마우스에 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트를 투여하고, 암세포의 변화를 측정할 수 있다. 여기서, 예를 들어, 신세포암, 신염 명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성 선암 또는 갑상선암 유래의 세포를 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용함으로써, 신세포암, 신염 명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성 선암 또는 갑상선암에 대한 치료 효과를 측정할 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트가 적용되는 암의 종류로는, 치료 대상이 되는 암세포에 있어서 CDH6 을 발현하고 있는 암이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 신세포암 (예를 들어, 신염 명세포암 또는 유두상 신세포암), 난소암, 난소 장액성 선암, 갑상선암, 담관암, 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암), 신경 교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종을 들 수 있지만, CDH6 을 발현하고 있는 한 이들에 제한되지 않는다. 보다 바람직한 암의 예로는, 신세포암 (예를 들어, 신염 명세포암, 유두상 신세포암) 또는 난소암을 들 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트는, 포유 동물에 대하여 바람직하게 투여할 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트가 포함되는 의약 조성물에 있어서 사용되는 물질로는, 투여량이나 투여 농도에 있어서, 이 분야에 있어서 통상 사용되는 제제 첨가물 그 외로부터 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트는, 1 종 이상의 약학적으로 적합성의 성분을 포함하는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은, 대표적으로는, 1 종 이상의 약학적 캐리어 (예를 들어, 멸균한 액체 (예를 들어, 물 및 기름 (석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 기름 (예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등) 을 포함한다)) 을 포함한다. 물은, 상기 약학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우에, 보다 대표적인 캐리어이다. 식염수 용액, 그리고 덱스트로오스 수용액 및 글리세롤 수용액도 또한, 액체 캐리어로서 특히, 주사용 용액을 위해 사용될 수 있다. 적절한 약학적 부형제는, 당해 분야에서 공지되어 있다. 상기 조성물은 또, 원하면, 미량의 습윤제 혹은 유화제, 또는 pH 완충화제를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 캐리어의 예는, E. W. Martin 에 의한 「Remington's Pharmaceutical Sciences」 에 기재된다. 그 처방은 투여의 양태에 대응한다.
여러 가지 송달 시스템이 공지되어 있고, 본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트를 투여하기 위해서 사용될 수 있다. 도입 방법으로는, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 및 피하의 경로를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 투여는, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의한 것일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 항체-약물 콘주게이트의 투여는 주입에 의한 것이다. 비경구적 투여는, 바람직한 투여 경로이다.
대표적 실시형태에 있어서, 상기 약학적 조성물은, 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서, 상습적 순서에 따라 처방된다. 대표적으로는, 정맥내 투여를 위한 조성물은, 멸균의 등장성의 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 의약은 또, 가용화제 및 주사 부위에서의 동통을 완화시키기 위한 국소 마취제 (예를 들어, 리그노카인) 를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은, (예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등에 밀봉하여 시일된 용기 중의 건조 동결 건조 분말 또는 무수의 농축물로 하여, 별개로, 또는 단위 제형 중에서 함께 혼합하는 것 중 어느 것으로 공급된다. 상기 의약이 주입에 의해 투여될 예정인 경우, 그것은, 예를 들어, 멸균의 제약 그레이드의 물 또는 식염수를 포함하는 주입 보틀로 투약될 수 있다. 상기 의약이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은, 예를 들어, 상기 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에는 본원의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트만을 포함하는 의약 조성물이어도 되고, 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트 및 적어도 하나의 이 이외의 암 치료제를 포함하는 의약 조성물이어도 된다. 본 발명의 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트는, 다른 암 치료제와 함께 투여할 수도 있고, 이로써 항암 효과를 증강시킬 수 있다. 이와 같은 목적으로 사용되는 다른 항암제는, 항체-약물 콘주게이트와 동시에, 따로따로, 혹은 연속해서 개체에 투여되어도 되고, 각각의 투여 간격을 바꾸어 투여해도 된다. 이와 같은 암 치료제로서, Imatinib, Sunitinib, Regorafenib 등을 포함하는 티로신키나아제 저해제, Palbociclib 등을 포함하는 CDK4/6 저해제, TAS-116 등을 포함하는 HSP90 저해제, MEK162 등을 포함하는 MEK 저해제, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙 등을 포함하는 면역 체크 포인트 저해제 등을 들 수 있지만, 항종양 활성을 갖는 약제이면 한정되지 않는다.
이와 같은 의약 조성물은, 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 제제로서, 동결 건조 제제 혹은 액상 제제로서 제제화하면 된다. 동결 건조 제제로서 제제화할 때에는, 이 분야에 있어서 사용되는 적당한 제제 첨가물이 포함되는 제제이어도 된다. 또 액제에 있어서도 동일하게 하여, 이 분야에 있어서 사용되는 각종 제제 첨가물을 포함하는 액상 제제로서 제제화할 수 있다.
의약 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라서도 변화하지만, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항 CDH6 항체-약물 콘주게이트는, 항체-약물 콘주게이트의 항원에 대한 친화성, 즉, 항원에 대한 해리 정수 (定數) (Kd 값) 의 점에 있어서, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록, 소량의 투여량으로서도 약효를 발휘시킬 수 있다. 따라서, 항체-약물 콘주게이트의 투여량의 결정에 있어서는, 항체-약물 콘주게이트와 항원의 친화성의 상황에 기초하여 투여량을 설정할 수도 있다. 본 발명의 항체-약물 콘주게이트를 인간에 대하여 투여할 때에는, 예를 들어, 약 0.001 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 회 혹은 1 ∼ 180 일간에 1 회의 간격으로 복수회 투여하면 된다. 바람직하게는, 0.1 ∼ 50 ㎎/㎏ 을, 더욱 바람직하게는, 1 ∼ 50 ㎎/㎏, 1 ∼ 30 ㎎/㎏, 1 ∼ 20 ㎎/㎏, 1 ∼ 15 ㎎/㎏, 2 ∼ 50 ㎎/㎏, 2 ∼ 30 ㎎/㎏, 2 ∼ 20 ㎎/㎏ 또는 2 ∼ 15 ㎎/㎏ 을 1 ∼ 4 주에 1 회, 바람직하게는 2 ∼ 3 주에 1 회의 간격으로 복수회 투여하면 된다.
실시예
이하에 나타내는 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또, 이들은 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning) 」 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold SpringHarbor Laboratory Press 로부터 1989년 발간) 에 기재된 방법 및 그 밖의 당업자가 사용하는 실험서에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 실시하였다. 또, 본 명세서에 있어서, 특별히 기재가 없는 시약, 용매 및 출발 재료는, 시판되는 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다.
[실시예 1 : 내재화 활성을 갖는 래트 항인간 CDH6 항체의 취득]
1)-1 인간, 마우스, 래트 및 필리핀 원숭이 CDH6 발현 벡터의 구축
인간 CDH6 단백질 (NP_004923) 을 코드하는 cDNA 발현 벡터 (OriGene 사, RC217889) 를 사용하여, 당업자에게 공지인 방법에 따라 포유 동물 발현용 벡터에 삽입함으로써 인간 CDH6 발현 벡터 pcDNA3.1-hCDH6 이 제조되었다. 인간 CDH6 ORF (Open Reading Frame) 의 아미노산 서열을 서열 번호 1 에 나타낸다.
마우스 CDH6 단백질 (NP_031692) 을 코드하는 cDNA 발현 벡터 (OriGene 사, MC221619) 를 사용하여, 당업자에게 공지된 방법에 따라 포유 동물 발현용 벡터에 삽입함으로써 마우스 CDH6 발현 벡터 pcDNA3.1-mCDH6, 및 p3xFLAG-CMV-9-mCDH6 이 제조되었다. 마우스 CDH6 ORF 의 아미노산 서열을 서열 번호 7 에 나타낸다.
래트 CDH6 단백질 (NP_037059) 을 코드하는 cDNA 발현 벡터 (OriGene 사, RN211850) 의 각 cDNA 부분을 사용하여, 당업자에게 공지된 방법에 따라 포유 동물 발현용 벡터에 삽입함으로써 인간 CDH6 발현 벡터 pcDNA3.1-rCDH6, 및 p3xFLAG-CMV-9-rCDH6 이 제조되었다. 래트 CDH6 ORF 의 아미노산 서열을 서열 번호 8 에 나타낸다.
필리핀 원숭이 CDH6 단백질을 코드하는 cDNA 는, 필리핀 원숭이 신장의 총 RNA 로부터 합성한 cDNA 를 주형에 프라이머 1 (5'-CACCATGAGAACTTACCGCTACTTCTTGCTGCTC-3') (서열 번호 85) 및 프라이머 2 (5'-TTAGGAGTCTTTGTCACTGTCCACTCCTCC-3') (서열 번호 86) 를 사용하여 클로닝을 실시하였다. 얻어진 서열이, 필리핀 원숭이 CDH6 (NCBI, XP_005556691.1) 의 세포 외 영역과 일치하는 것을 확인하였다. 또, EMBL 에서 등록된 필리핀 원숭이 CDH6 (EHH54180.1) 과 전체 길이 서열이 일치하는 것을 확인하였다. 당업자에게 공지된 방법에 따라 포유 동물 발현용 벡터에 삽입함으로써 필리핀 원숭이 CDH6 발현 벡터 pcDNA3.1-cynoCDH6 이 제조되었다. 필리핀 원숭이 CDH6 ORF 의 아미노산 서열을 서열 번호 9 에 나타낸다.
제조한 플라스미드 DNA 의 대량 조제는, EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN) 를 사용하여 실시하였다.
1)-2 면역
면역에는 WKY/Izm 래트의 암컷 (닛폰 SLC 사) 을 사용하였다. 먼저 래트 양다리 하퇴부를 Hyaluronidase (SIGMA-ALDRICH 사) 로 전처리 후, 동일한 부위에 실시예 1)-1 에서 제조한 인간 CDH6 발현 벡터 pcDNA3.1-hCDH6 을 근육내 주사하였다. 계속해서, ECM830 (BTX 사) 을 사용하고, 2 니들 전극을 사용하여, 동일한 부위에 인비보 일렉트로포레이션을 실시하였다. 약 2 주에 한 번, 동일한 인비보 일렉트로포레이션을 반복한 후, 래트의 림프절 또는 비장을 채취하고 하이브리도마 제조에 사용하였다.
1)-3 하이브리도마 제조
림프절 세포 혹은 비장 세포와 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포 (ATCC, No.CRL-1 581) 를 LF301 Cell Fusion Unit (BEX 사) 을 사용하여 전기 세포 융합한 후, ClonaCell-HY 선택 배지 D (StemCell Technologies 사) 에 현탁하고, 희석시켜 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 배양하였다. 출현한 각각의 하이브리도마 콜로니는, 모노클론으로서 회수되고, ClonaCell-HY 선택 배지 E (StemCell Technologies 사) 에 현탁하고 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 배양하였다. 적당히 세포가 증식된 후, 각각의 하이브리도마 세포의 동결 스톡을 제조함과 함께, 얻어진 하이브리도마 배양 상청을 항인간 CDH6 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝에 사용하였다.
1)-4 Cell-ELISA 법에 의한 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝
1)-4-1 Cell-ELISA 용 항원 유전자 발현 세포의 조제
293α 세포 (인테그린 αv 및 인테그린 β3 을 발현하는 HEK293 유래의 안정 발현 세포주) 를 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중 5 x 105 세포/㎖ 가 되도록 조제하였다. Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scienftific 사) 를 사용한 형질 이입 순서에 따라, 이 293α 세포에 대하여, pcDNA3.1-hCDH6 혹은 pcDNA3.1-cynoCDH6 또는 음성 컨트롤로서 pcDNA3.1 의 DNA 를 도입하고, 96-웰 플레이트 (Corning 사) 에 100 ㎕ 씩 분주 후, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 24 내지 27 시간 배양하였다. 얻어진 형질 이입 세포를 접착 상태인 채로, Cell-ELISA 에 사용하였다.
1)-4-2 Cell-ELISA
실시예 1)-4-1 에서 조제한 발현 벡터 도입 293α 세포의 배양 상청을 제거 후, pcDNA3.1-hCDH6 혹은 pcDNA3.1-cynoCDH6 또는 pcDNA3.1 도입 293α 세포의 각각에 대하여 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 1 회 세정 후, 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 500 배로 희석시킨 래빗에서 생산된 항-래트 IgG-페록시다아제 항체 (SIGMA 사) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 3 회 세정한 후, OPD 발색액 (OPD 용해액 (0.05 M 시트르산 3 나트륨, 0.1 M 인산수소 2 나트륨·12 물 pH4.5) 에 o-페닐렌디아민 2 염산염 (와코우 순약사), H2O2 를 각각 0.4 ㎎/㎖, 0.6 ％ (v/v) 가 되도록 용해) 을 100 ㎕ /웰로 첨가하였다. 때때로 교반하면서 발색 반응을 실시하고, 1M HCl 을 100 ㎕/웰로 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더 (ENVISION : PerkinElmer 사) 로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 컨트롤의 pcDNA3.1 도입 293α 세포와 비교하여, pcDNA3.1-hCDH6 그리고 pcDNA3.1-cynoCDH6 발현 벡터 도입 293α 세포쪽에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청을 산생하는 하이브리도마를 인간, 또한 필리핀 원숭이 CDH6 에 결합하는 항체 산생 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-5 플로우 사이토메트리에 의한 필리핀 원숭이 CDH6 에 대한 선택적 결합 항체의 스크리닝
1)-5-1 플로우 사이토메트리 해석용 항원 유전자 발현 세포의 조제
293T 세포를 5 × 104 세포/㎠ 가 되도록 225 ㎠ 플라스크 (스미토모 베이클라이트사) 에 파종하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 이 293T 세포에, pcDNA3.1-cynoCDH6, 또는 음성 컨트롤로서 pcDNA3.1 을 Lipofectamine 2000 을 사용하여 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 추가로 하룻밤 배양하였다. 각 벡터를 도입한 293T 세포를 TrypLE Express (Thermo Fisher Scienftific 사) 로 처리하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 으로 세포를 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 에 현탁하였다. 얻어진 세포 현탁액을 플로우 사이토메트리 해석에 사용하였다.
1)-5-2 플로우 사이토메트리 해석
실시예 1)-4 의 Cell-ELISA 에서 선택된 인간, 또한 필리핀 원숭이 CDH6 에 결합하는 항체 산생 하이브리도마가 산생하는 항체의 필리핀 원숭이 CDH6 에 대한 결합 특이성을 플로우 사이토메트리법에 의해 추가로 확인하였다. 실시예 1)-5-1 에서 조제한 일과성 발현 293T 세포의 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 각각에 대하여 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 항-래트 IgG FITC 콘주게이트 (SIGMA 사) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 2 ㎍/㎖ 7-아미노액티모머이신 D (7-aminoactinomycin D (Molecular Probes 사)) 를 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500 : BeckmanCoulter 사) 로 검출하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar 사) 로 실시하였다. 7-아미노액티모머이신 D 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하였다. 컨트롤인 pcDNA3.1 도입 293T 세포의 형광 강도 히스토그램에 대하여 pcDNA3.1-cynoCDH6 도입 293T 세포의 히스토그램이 강형광 강도측으로 시프트되어 있는 항체를 산생하는 하이브리도마를 세포막 표면 상에 발현하는 필리핀 원숭이 CDH6 에 특이적으로 결합하는 항체 산생 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-6 래트 모노클로날 항체의 아이소 타입의 결정
실시예 1)-5 에서 선택한 래트 항 CDH6 항체 산생 하이브리도마 중에서, 인간 그리고 원숭이 CDH6 에 강하고 특이적으로 결합하는 것이 시사된 클론 rG019, rG055, rG056, rG061 을 선발하고, 각 항체의 아이소 타입을 동정하였다. 항체의 중사슬의 서브 클래스, 경사슬의 타입은, RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT (DS 파마 바이오메디컬사) 에 의해 결정되었다. 그 결과, rG019, rG055, rG056, rG061 의 4 클론 모두 서브 클래스는, IgG2b, 타입은 κ사슬인 것이 확인되었다.
1)-7 래트 항 CDH6 항체의 조제
1)-7-1 배양 상청 제조
래트 항인간 CDH6 모노클로날 항체는, 하이브리도마 배양 상청으로부터 정제하였다. 먼저, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 ClonaCell-HY 선택 배지 E (StemCell Technologies 사) 로 충분량까지 증식시킨 후, Ultra Low IgG FBS (Thermo Fisher Scienftific 사) 를 20 ％ 첨가한 Hybridoma SFM (Thermo Fisher Scienftific 사) 에 배지 교환하고, 4 - 5 일간 배양하였다. 본 배양 상청을 회수하고, 0.8 ㎛ 의 필터에 통과시킨 후, 추가로 0.2 ㎛ 의 필터에 통과시켜 불용물을 제거하였다.
1)-7-2 래트 항 CDH6 항체의 정제
실시예 1)-7-1 에서 제조한 하이브리도마의 배양 상청으로부터 항체 (래트 항 CDH6 항체 (rG019, rG055, rG056, rG061)) 를 Protein G 어피니티 크로마토그래피로 정제하였다. Protein G 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사) 에 항체를 흡착시키고, PBS 로 칼럼을 세정 후에 0.1 M 글리신/염산 수용액 (pH2.7) 으로 용출하였다. 용출액에 1 M Tris-HCl (pH9.0) 을 첨가하여 pH7.0 ∼ 7.5 로 조정한 후에, Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF30K, Sartorius 사) 으로 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH6.0) 에 대한 버퍼 치환을 실시함과 함께 항체의 농축을 실시하여, 항체 농도를 1 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
[실시예 2 : 래트 항 CDH6 항체의 in vitro 평가]
2)-1 플로우 사이토메트리에 의한 래트 항 CDH6 항체의 결합능 평가
실시예 1)-7 에서 제조한 래트 항 CDH6 항체의 인간 CDH6 결합성을 플로우 사이토메트리법에 의해 평가하였다. 실시예 1)-1 에서 제조한 pcDNA3.1-hCDH6 을 293T 세포 (ATCC) 에 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 세포 현탁액을 조제하였다. 유전자 도입한 293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 실시예 1)-7 에서 조제한 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종 (클론 번호는 rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 래트 IgG 컨트롤 (R ＆ D Systems) 을 종농도 10 ng/㎖ 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 50 배로 희석시킨 래빗에서 생산된 항-래트 IgG (전체 분자)-FITC 항체 (Anti-Rat IgG (whole molecule)-FITC antibody produced in rabbit (SIGMA)) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (FC500 : Beckman Coulter) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 hCDH6 을 도입하고 있지 않은 음성 컨트롤 293T 세포를 사용한 경우를 나타내고, 백색 실선으로 나타내는 히스토그램은, hCDH6 도입 293T 세포를 사용한 경우를 나타낸다. 세포 표면의 hCDH6 에 항체가 결합함으로써 형광 강도가 증강된 것을 나타낸다. 래트 IgG 컨트롤은 어느 세포에도 결합하지 않는다. 이 결과, 제조한 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종은 pcDNA3.1-hCDH6 도입 293T 세포에 결합하는 것을 확인하였다.
2)-2 플로우 사이토메트리에 의한 래트 항 CDH6 항체의 CDH6 결합 부위의 해석
2)-2-1 인간 CDH6 각 도메인 결실체 발현 벡터의 구축
인간 CDH6 의 세포 외 전체 길이에는 5 개의 세포 외 도메인, EC1 (서열 번호 2), EC2 (서열 번호 3), EC3 (서열 번호 4), EC4 (서열 번호 5), EC5 (서열 번호 6) 가 존재한다. 인간 CDH6 전체 길이로부터, 5 개의 EC 도메인을 각 1 지점씩 결실 발현한 유전자를 GeneArt 사에서 합성하고, 당업자에게 공지인 방법에 따라 포유 동물 발현용 벡터 p3xFLAG-CMV-9 벡터 (SIGMA-ALDRICH 사) 에 삽입하고, EC1 내지 EC5 를 각각 결실한, 각 도메인 결실체 발현 벡터를 제조하였다.
2)-2-2 플로우 사이토메트리에 의한 도메인 결실체를 사용한 래트 항 CDH6 항체의 에피토프 해석
각 EC 도메인 결실 벡터를 도입한 293α 세포주를 사용한 플로우 사이토메트리 해석에 의해, 래트 항인간 CDH6 항체의 결합 에피토프를 동정하였다. 인테그린 αv 및 인테그린 β3 발현 벡터를 HEK293 세포 내에 안정 형질 이입한 세포주 293α 세포주에 대하여, 실시예 2)-2-1 에서 작성한 각 도메인 결실체 발현 벡터, 및 전체 길이 인간 CDH6 을 발현하는 pcDNA3.1-hCDH6 을 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 세포 현탁액을 조제하였다. 도입 293α 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 실시예 1)-7 에서 조제한 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종 (클론 번호는 rG019, rG055, rG056 및 rG061) 또는 래트 IgG 컨트롤 (R ＆ D Systems) 을 종농도 20 nM 으로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 50 배로 희석시킨 래빗에서 생산된 항-래트 IgG (전체 분자)-FITC 항체 (Anti-Rat IgG (whole molecule)-FITC antibody produced in rabbit (SIGMA)) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 2a ∼ 도 2f 에 나타낸다. 도 2a ∼ 도 2f 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 유전자를 도입하고 있지 않은 음성 컨트롤 293α 세포를 사용한 경우를 나타내고, 백색 실선으로 나타내는 히스토그램은, 전체 길이 hCDH6 또는 각 EC 도메인 결실 293 세포를 사용한 경우를 나타낸다. 세포 표면의 전체 길이 hCDH6 또는 각 EC 도메인 결실체에 항체가 결합한 경우에는, 형광 강도가 증강된다. 래트 IgG 컨트롤은 어느 도입 세포에도 결합하지 않는다. 제조한 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종은, 전체 길이 hCDH6, EC1 결실체, EC2 결실체, EC4 결실체, 및 EC5 결실체에는 결합하지만, EC3 결실체에는 결합하지 않는다. 이 결과로부터, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종은 hCDH6 의 EC3 을 에피토프로 하여 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
2)-3 래트 항 CDH6 항체의 내재화 활성
2)-3-1 인간 종양 세포주에 있어서의 CDH6 의 발현 확인
취득 항체의 평가에 사용하는 CDH6 양성 인간 종양 세포주를 선발하기 위해, 공지 데이터베이스로부터 CDH6 발현 정보를 검색하고, 플로우 사이토메트리법에 의해 세포막 표면에서의 CDH6 의 발현을 평가하였다. 인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3, PA-1, ES-2 및 인간 신세포 종양 세포주 786-O (모두 ATCC 로부터 입수) 를 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 배양한 후, 세포 현탁액을 조제하였다. 세포를 원심하고, 상청을 제거한 후, 시판 항인간 CDH6 항체 (MABU2715, R ＆ D Systems) 또는 음성 컨트롤로서 마우스 IgG1 (BD Pharmingen) 을 종농도 50 ug/㎖ 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 50 배로 희석시킨 FITC-콘주게이트된 염소 항-마우스 면역글로블린의 F(ab')2 단편 (F(ab')2 Fragment of FITC-conjugated Goat Anti-mouse immunoglobulins (Dako)) 을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 3 에 나타낸다. 도 3 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 음성 컨트롤 mIgG1 로 염색했을 경우를 나타내고, 백색 실선으로 나타내는 히스토그램은 항인간 CDH6 항체로 염색했을 경우를 나타낸다. 세포 표면의 hCDH6 에 항체가 결합함으로써 형광 강도가 증강된 것을 나타낸다. mIgG1 컨트롤은 어느 세포에도 결합하지 않는다. 이 결과, NIH : OVCAR-3, PA-1 및 786-O 세포주는, 내재적으로 CDH6 을 세포 표면 상에 발현하는 것이 나타났다. 한편, ES-2 세포주는 CDH6 을 전혀 발현하지 않는 것이 나타났다.
2)-3-2 래트 항 CDH6 항체의 내재화 활성 평가
래트 항 CDH6 항체의 내재화 활성은, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항래트 IgG 시약 래트-ZAP (ADVANCED TARGETING SYSTEMS) 을 사용하여 평가하였다. 즉, 인간 CDH6 양성 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3 (ATCC) 을 4 x 103 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 인간 CDH6 양성 신세포 종양 세포주 786-O (ATCC) 는 1 x 103
세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고 하룻밤 배양하였다. 다음날, 래트 항 CDH6 항체 (종농도 : 1 nM), 또는 음성 컨트롤 항체로서 래트 IgG2b 항체 (R ＆ D Systems) 를 첨가하였다. 또한 래트-ZAP (종농도 : 0.5 nM), 또는 음성 컨트롤로서 독소를 결합하고 있지 않은 염소 항-래트 IgG, Fc(gamma) Fragment Specific (JACKSON IMMUNORESEARCH)) (종농도 : 0.5 nM) 을 첨가하고, 3 일간 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 배양하였다. 생존 세포수는, CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 에 의한 ATP 활성 (RLU) 의 정량으로 측정하였다. 이 평가에서는, 래트 항 CDH6 항체의 내재화 활성에 의존하여 래트-ZAP 이 세포 내에 도입되고, 단백 합성을 저해하는 사포린이 세포 내에 방출됨으로써, 세포 증식이 억제된다. 항 CDH6 항체 첨가에 의한 세포 증식 억제 작용은, 래트-ZAP 대신에 음성 컨트롤을 첨가한 웰의 생존 세포수를 100 ％ 로 한 상대 생존율로 표기하였다. 도 4 에 그래프 및 세포 생존율의 표를 나타낸다. 이 결과, 래트 항 CDH6 항체는 CDH6 에 결합하여 내재화를 일으키는 것이 나타났다.
[실시예 3 : 래트 항 CDH6 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정]
3)-1 rG019 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 유전자 단편의 증폭 및 서열 결정
3)-1-1 G019 로부터의 총 RNA 의 조제
rG019 의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭시키기 위해 G019 로부터 TRIzol 시약 (Ambion 사) 을 사용하여 총 RNA 를 조제하였다.
3)-1-2 5'-RACE PCR 에 의한 rG019 의 중사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 뉴클레오티드 서열의 결정
중사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭은, 실시예 3)-1-1 에서 조제한 총 RNA 의 약 1 ㎍ 과 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다. rG019 의 중사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 공지된 래트 중사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭시킨 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 플라스미드에 클로닝하고, 다음으로 중사슬의 가변 영역의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
결정된 rG019 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 16 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 15 에 나타냈다.
3)-1-3 5'-RACE PCR 에 의한 rG019 의 경사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 3)-1-2 과 동일한 방법으로 실시하였다. 단, rG019 의 경사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 공지된 래트 경사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
결정된 rG019 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 11 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 10 에 나타냈다.
3)-2 rG055 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 유전자 단편의 증폭 및 서열 결정
실시예 3)-1 과 동일한 방법으로 서열을 결정하였다.
결정된 rG055 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 26 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 25 에 나타냈다. 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 21 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 20 에 나타냈다.
3)-3 rG056 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 유전자 단편의 증폭 및 서열 결정
실시예 3)-1 과 동일한 방법으로 서열을 결정하였다.
결정된 rG056 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 36 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 35 에 나타냈다. 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 31 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 30 에 나타냈다.
3)-4 rG061 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 유전자 단편의 증폭 및 서열 결정
실시예 3)-1 과 동일한 방법으로 서열을 결정하였다.
결정된 rG061 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 46 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 45 에 나타냈다. 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 41 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 40 에 나타냈다.
[실시예 4 : 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 제조]
4)-1 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 발현 벡터의 구축
4)-1-1 키메라 및 인간화 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (invitrogen 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 50 에 나타내는 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하여, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다.
pcDNA3.3/LK 로부터 네오마이신 발현 유닛을 제거함으로써 pCMA-LK 를 구축하였다.
4)-1-2 키메라 및 인간화 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 서열 번호 51 로 나타내는 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하여, pCMA-G1 을 구축하였다.
4)-1-3 chG019 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 57 에 나타내는 chG019 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, pCMA-G1 을 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 chG019 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 또한, chG019 중사슬은 예기치 않은 디술파이드 결합을 방지하기 위해, CDR 중의 시스테인을 프롤린으로 치환한 서열을 사용하였다.
4)-1-4 chG019 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 52 에 나타내는 chG019 경사슬을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, 합성한 DNA 단편과 pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 없앤 DNA 단편을 결합함으로써, chG019 경사슬 발현 벡터를 구축하였다.
4)-2 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 생산 및 정제
4)-2-1 chG019 의 생산
FreeStyle 293F 세포 (invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 1.2 × 109 개의 FreeStyle 293F 세포 (invitrogen 사) 를 3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle293 발현 배지 (invitrogen 사) 으로 희석시켜 2.0 × 106 세포/㎖ 로 조제하였다. 40 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (invitrogen 사) 에 0.24 ㎎ 의 중사슬 발현 벡터와 0.36 ㎎ 의 경사슬 발현 벡터와 1.8 ㎎ 의 폴리에틸렌이민 (Polyscience #24765) 을 첨가하고 조심스럽게 교반하고, 또한 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터로 4 시간, 90 rpm 으로 진탕 배양 후에 600 ㎖ 의 EX-CELL VPRO 배지 (SAFC Biosciences 사), 18 ㎖ 의 GlutaMAX I (GIBCO 사), 및 30 ㎖ 의 Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO 사) 를 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터로 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec #CCS-045-E1H) 로 여과하였다.
4)-2-2 chG019 의 정제
실시예 4)-2-1 에서 얻어진 배양 상청을 rProtein A 어피니티 크로마토그래피의 1 단계 공정으로 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2M 아르기닌염산염 용액 (pH4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH6.0) 로의 버퍼 치환을 실시하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사) 으로 항체를 농축하고, IgG 농도를 5 ㎎/㎖ 이상으로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.
4)-3 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 결합성 평가
4)-2 에서 정제한 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 CDH6 결합성을 플로우 사이토메트리법에 의해 확인하였다. 실시예 1)-1 에서 제조한 pcDNA3.1-hCDH6, 또는 pcDNA3.1-cynoCDH6, 또는 pcDNA3.1 을 각각 293α 세포에 Lipofectamine 2000 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 세포 현탁액을 조제하였다. 이들 세포 현탁액에 chG019 를 첨가하고 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시킨 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정하고, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 PE 표지 F(ab')2 Fragment 항인간 IgG, Fcγ 항체 (JACKSON IMMUNORESEARCH) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, chG019 는 음성 컨트롤인 pcDNA3.1 도입 293T 세포에는 결합하지 않고, pcDNA3.1-hCDH6 및 pcDNA3.1-cynoCDH6 도입 293T 세포에 항체 농도 의존적으로 결합하였다. 도 5 에 있어서 가로축은 항체 농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다. 이 결과로부터, chG019 가 인간 및 필리핀 원숭이 CDH6 에 대하여 특이적으로 결합하고, 결합 활성은 거의 동등하다는 것을 알 수 있다.
[실시예 5 : 인간화 항 CDH6 항체의 제조]
5)-1 항 CDH6 항체의 인간화체 디자인
5)-1-1 chG019 의 가변 영역의 분자 모델링
chG019 의 가변 영역의 분자 모델링은, 호몰로지 모델링으로서 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 을 이용하였다. chG019 의 중사슬과 경사슬의 가변 영역에 대해 높은 서열 동일성을 갖는 Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) 에 등록되어 있는 구조 (PDB ID : 2I9L) 를 주형으로, 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 BioLuminate (Schrodinger 사 제조) 를 사용하여 실시하였다.
5)-1-2 인간화 hG019 에 대한 아미노산 서열의 설계
chG019 는, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 인간화되었다. KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 에 있어서 기정되는 인간의 감마 (gamma) 사슬 서브 그룹 1 및 카파 (kappa) 사슬 서브 그룹 1 의 콘센서스 서열이, chG019 의 프레임 워크 영역에 대하여 높은 동일성을 가지므로, 각각, 중사슬과 경사슬의 억셉터로서 선택되었다. 억셉터 상에 이입해야 할 도너 잔기는, Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준 등을 참고로 삼차원 모델을 분석함으로써 선택되었다.
5)-2 chG019 중사슬의 인간화
설계된 3 종의 중사슬을 hH01, hH02 및 hH04 로 명명하였다. hH01 의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열을 서열 번호 69 에 기재한다. 서열 번호 69 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 70 에 기재한다. hH02 의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열을 서열 번호 73 에 기재한다. 서열 번호 73 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 74 에 기재한다. hH04 의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열을 서열 번호 77 에 기재한다. 서열 번호 77 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 78 에 기재한다.
5)-3 chG019 경사슬의 인간화
설계된 2 종의 경사슬을 hL02 및 hL03 으로 명명하였다. hL02 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을 서열 번호 61 에 기재한다. 서열 번호 61 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 62 에 기재한다. hL03 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을 서열 번호 65 에 기재한다. 서열 번호 65 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 66 에 기재한다.
5)-4 중사슬 및 경사슬의 조합에 의한 인간화 hG019 의 설계
hH01 및 hL02 로 이루어지는 항체를 「H01L02 항체」 또는 「H01L02」 라고 칭한다. hH02 및 hL02 로 이루어지는 항체를 「H02L02 항체」 또는 「H02L02」 라고 칭한다. hH02 및 hL03 으로 이루어지는 항체를 「H02L03 항체」 또는 「H02L03」 이라고 칭한다. hH04 및 hL02 로 이루어지는 항체를 「H04L02 항체」 또는 「H04L02」 라고 칭한다.
5)-5 인간화 항 CDH6 항체의 발현
5)-5-1 인간화 hG019 의 중사슬 발현 벡터의 구축
5)-5-1-1 인간화 hG019-H01 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 70 에 나타내는 인간화 hG019-H01 타입 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 4)-1-3 과 동일한 방법으로 인간화 hG019-H01 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-1-2 인간화 hG019-H02 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 74 에 나타내는 인간화 hG019-H02 타입 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 4)-1-3 과 동일한 방법으로 인간화 hG019-H02 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-1-3 인간화 hG019-H04 타입 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 78 에 나타내는 인간화 hG019-H04 타입 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 4)-1-3 과 동일한 방법으로 인간화 hG019-H04 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-2 인간화 hG019 의 경사슬 발현 벡터의 구축
5)-5-2-1 인간화 hG019-L02 타입 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 62 에 나타내는 인간화 hG019-L02 타입 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 399 에 나타내는 인간화 hG019-L02 타입 경사슬의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 인간화 hG019-L02 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-2-2 인간화 hG019-L03 타입 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 66 에 나타내는 인간화 hG019-L03 타입 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 399 에 나타내는 인간화 hG019-L03 타입 경사슬의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 5)-5-2-1 과 동일한 방법으로 인간화 hG019-L03 타입 경사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-3 인간화 hG019 의 조제
5)-5-3-1 H01L02, H02L02, H02L03, H04L02 의 생산
실시예 4)-2-1 과 동일한 방법으로 생산하였다. 실시예 5)-4 에 나타낸 중사슬과 경사슬의 조합에 의해, H01L02, H02L02, H02L03, H04L02 를 생산하였다.
5)-5-3-2 H01L02, H02L02, H02L03, H04L02 의 2 스텝 정제
실시예 5)-5-3-1 에서 얻어진 배양 상청을 rProtein A 어피니티 크로마토그래피와 세라믹 하이드록시아파타이트의 2 단계 공정으로 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2M 아르기닌염산염 용액 (pH4.0) 으로 항체를 용출하였다. 항체가 포함되는 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로의 버퍼 치환을 실시하고, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH7.0 의 버퍼로 5 배 희석시킨 후에, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH7.0 의 버퍼로 평형화한 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼 (닛폰 바이오래드, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH6.0) 로의 버퍼 치환을 실시하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사) 으로 항체를 농축하고, IgG 농도를 20 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus 필터 (Sartorius 사) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.
[참고예 1 : 항 CDH6 항체 NOV0712 의 제조]
실시예에서 사용한 항 CDH6 항체 NOV0712 는, 국제 공개 제2016/024195호에 기재된 NOV0712 의 경사슬 전체 길이, 및 중사슬 전체 길이의 아미노산 서열 (각각, 국제 공개 제2016/024195 의 서열 번호 235 및 서열 번호 234) 을 참조하여 제조하였다.
참고예 1)-1 항 CDH6 항체 NOV0712
참고예 1)-1-1 항 CDH6 항체 NOV0712 의 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 84 에 나타내는 NOV0712 의 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 428 에 나타내는 NOV0712 의 중사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 4)-1-3 과 동일한 방법으로 NOV0712 의 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 당해 NOV0712 의 중사슬 발현 벡터에 의해 발현하는 NOV0712 의 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 83 에 나타낸다. 서열 번호 83 에 나타내는 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이다.
참고예 1)-1-2 항 CDH6 항체 NOV0712 의 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 82 에 나타내는 NOV0712 의 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 405 에 나타내는 NOV0712 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 5)-5-2-1 과 동일한 방법으로 NOV0712 의 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 당해 NOV0712 의 경사슬 발현 벡터에 의해 발현하는 NOV0712 의 경사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 81 에 나타낸다. 서열 번호 81 에 나타내는 아미노산 서열 중, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이다.
참고예 1)-2 항 CDH6 항체 NOV0712 의 조제
참고예 1)-2-1 항 CDH6 항체 NOV0712 의 생산
실시예 4)-2-1 과 동일한 방법으로 NOV0712 를 생산하였다.
참고예 1)-2-2 항 CDH6 항체 NOV0712 의 1 스텝 정제
참고예 1)-2-1 에서 얻어진 배양 상청으로부터 실시예 4)-2-2 와 동일한 방법으로 항 CDH6 항체 NOV0712 를 정제하였다 (항체 농도 HBSor 로 5 ㎎/ℓ).
[실시예 6 : 인간화 hG019 및 NOV0712 의 in vitro 평가]
6)-1 인간화 hG019 의 결합성 평가
6)-1-1 인간화 hG019 의 인간 CDH6 항원 결합능
항체와 항원 (Recombinant Human CDH6 Fc His chimera, R ＆ D Systems) 과의 해리 정수 측정은, Biacore T200 (GE 헬스케어 바이오사이언스) 을 사용하여, 고정화시킨 항 His 항체에 항원을 리간드로서 포착 (캡처) 하고, 항체를 아날라이트로서 측정하는 캡처법으로 실시하였다. 항히스티딘 항체 (His capture kit, GE 헬스케어 바이오사이언스) 는, 센서 칩 CM5 (GE 헬스케어 바이오사이언스) 에, 아민 커플링법으로 약 1000 RU 공유 결합시켰다. 레퍼런스 셀에도 동일하게 고정화시켰다. 런닝 버퍼로서 1 mM CaCl2 를 첨가한 HBS-P+ (10 mM HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.05 ％ Surfactant P20) 를 사용하였다. 항히스티딘 항체를 고정화시킨 칩 상에, 항원을 60 초간 첨가한 후, 항체의 희석 계열 용액 (0.391 - 100 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 300 초간 첨가하고, 계속해서 600 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서, 5M MgCl2 를 첨가한 글리신 (Glycine) 용액 pH1.5 를 유속 10 ㎕/분으로 30 초간, 2 회 첨가하였다. 데이터의 해석은, 분석 소프트웨어 (BIAevaluation software, version 4.1) 의 Steady State Affinity 모델을 사용하여, 해리 정수 (KD) 를 산출하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00043
6)-1-2 인간, 원숭이, 마우스, 래트 CDH6 에 대한 결합성
실시예 1)-1 에서 제조한 pcDNA3.1-hCDH6, pcDNA3.1-cynoCDH6, p3xFLAG-CMV-9-mCDH6, p3xFLAG-CMV-9-rCDH6 을, 293α 세포에 Lipofectamine 2000 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 세포 현탁액을 조제하였다. 음성 컨트롤로서, 유전자 도입하고 있지 않은 293α 세포를 사용하였다. 상기에서 제조한 293α 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 실시예 5)-5-3 에서 조제한 인간화 hG019 항체 4 종 (클론 번호는 H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 또는 인간 IgG1 컨트롤 (Calbiochem) 을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 anti-human Fcg PE goat F(ab') (Jackson laboratory) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 도 6a 및 도 6b 에 있어서 가로축은 항체 농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다. 도 6a 및 도 6b 에 나타내는 바와 같이, 음성 컨트롤인 인간 IgG1 컨트롤은, 어느 CDH6 유전자 도입 세포에 대해서도 결합하지 않는다. 인간화 hG019 항체 4 종 (클론 번호는 H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02) 은 인간 및 필리핀 원숭이 CDH6 에 결합하지만, 마우스 및 래트 CDH6 에는 결합하지 않는다. 어느 항체도, 음성 컨트롤인 빈 벡터 pcDNA3.1 도입 세포에는 결합하지 않는다. 한편, NOV0712 항체는 인간, 필리핀 원숭이, 마우스, 및 래트 CDH6 모두에 결합 활성을 나타내는 것이 국제 공개 제2016/024195호에 나타나 있다. 이 결과, 본 명세서에서 취득한 인간화 hG019 항체 4 종은, NOV0712 항체와 상이한 결합 성질을 나타내는 항 CDH6 항체인 것이 나타났다.
6)-2 인간화 hG019 및 NOV0712 의 CDH6 결합 부위의 해석
6)-2-1 도메인 결실체를 사용한 에피토프 해석
실시예 2)-2-1 에서 작성한 각 도메인 결실체 발현 벡터, 및 전체 길이 hCDH6 을 발현하는 pcDNA3.1-hCDH6 을 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 세포 현탁액을 조제하였다. 유전자 도입한 293α 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 실시예 5)-5-3 에서 조제한 인간화 hG019 항체 4 종 (클론 번호는 H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 또는 참고예 1 에서 조제한 항 CDH6 항체 NOV0712, 또는 음성 컨트롤로서 인간 IgG1 (Calbiochem) 을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 APC-항-인간 IgG 염소 F(ab')2 (APC-anti-human IgG goat F(ab')2 (Jackson laboratory)) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 7a ∼ 도 7f 에 나타낸다. 도 7a ∼ 도 7f 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 유전자를 도입하고 있지 않은 음성 컨트롤 293α 세포를 사용한 경우를 나타내고, 백색 실선으로 나타내는 히스토그램은, 전체 길이 hCDH6 또는 각 EC 도메인 결실 293α 세포를 사용한 경우를 나타낸다. 세포 표면의 전체 길이 hCDH6 또는 각 EC 도메인 결실체에 항체가 결합한 경우에는, 형광 강도가 증강된다. 인간 IgG1 컨트롤은 어느 도입 세포에도 결합하지 않는다. 인간화 hG019 항체 4 종 (클론 번호는 H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02) 은, 전체 길이 hCDH6, EC1 결실체, EC2 결실체, EC4 결실체, 및 EC5 결실체에는 결합하지만, EC3 결실체에는 결합하지 않는다. 즉, 인간화 hG019 항체 4 종은 hCDH6 의 EC3 을 에피토프로 하여 특이적으로 결합하는 것이 나타났다. 한편, 항 CDH6 항체 NOV0712 는, 전체 길이 hCDH6, EC1 결실체, EC2 결실체, EC3 결실체, 및 EC4 결실체에는 결합하지만, EC5 결실체에는 결합하지 않는다. 즉, 항 CDH6 항체 NOV0712 항체는 hCDH6 의 EC5 를 에피토프로 하여 특이적으로 결합하는 것이 나타나고, 국제 공개 제2016/024195호에 기재되어 있는 NOV0712 의 에피토프 정보와 일치한다. 이 결과로부터, NOV0712 와 본 명세서에서 취득한 인간화 hG019 항체 4 종은, 상이한 성질을 나타내는 항 CDH6 항체인 것이 나타났다.
6)-2-2 항체의 결합 경합 어세이
6)-2-2-1 786-O/hCDH6 안정 발현 세포주의 제조
786-O/hCDH6 안정 발현 세포주는, 786-O 세포 (ATCC) 에 인간 CDH6 전체 길이 발현용 재조합 레트로바이러스를 감염시킴으로써 제조하였다. 인간 CDH6 발현 레트로바이러스 벡터 (pQCXIN-hCDH6) 는, 인간 CDH6 단백질 (NP_004923) 을 코드하는 cDNA 발현 벡터 (OriGene 사 RC217889) 를 사용하여, 당업자에게 공지된 방법에 따라 레트로바이러스 벡터 pQCXIN (CLONTECH) 에 삽입함으로써 제조되었다. FuGene HD (Promega) 를 사용하여 레트로바이러스 패키징 세포 RetroPack PT67 (CLONTECH) 에 pQCXIN-hCDH6 을 일과성으로 도입하고, 48 시간 후에 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수하고, 786-O 세포 배양계에 첨가함으로써 동 세포에 감염시켰다. 감염 3 일 후부터, G418 (Gibco) 를 종농도 50 ㎎/㎖ 로 첨가한 배지에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 배양을 실시하여 감염 세포의 약제 선발을 실시함으로써, 인간 CDH6 을 안정적으로 발현하는 세포주 786-O/hCDH6 을 수립하였다. 실시예 2)-3-1 과 동일하게 플로우 사이토메트리로 안정 발현주에서의 인간 CDH6 의 고발현을 확인하였다 (도 8). 검출용 항체에는 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 염소 항-마우스 IgG1 2 차 항체 Alexa Fluor 647 (Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific)) 을 사용하였다. 그 결과를 도 8 에 나타낸다. 도 8 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 Alexa Fluor 647 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 음성 컨트롤 mIgG1 로 염색했을 경우를 나타내고, 백색 실선으로 나타내는 히스토그램은 항인간 CDH6 항체로 염색했을 경우를 나타낸다. 세포 표면의 hCDH6 에 항체가 결합함으로써 형광 강도가 증강된 것을 나타낸다. mIgG1 컨트롤은 어느 세포에도 결합하지 않는다. 이 결과, 786-O/hCDH6 안정 발현 세포주에서는 친주 (親株) 786-O 세포와 비교하여, 인간 CDH6 을 고발현하는 것이 나타났다.
6)-2-2-2 라벨화 H01L02 및 라벨화 NOV0712 를 사용한 결합 경합 어세이
Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody Labeling Kit (Thermo Fisher) 를 사용하여, 라벨화 H01L02 및 라벨화 NOV0712 를 제조하였다. 7)-2-2-1 에서 제조한 786-O/hCDH6 안정 발현 세포주의 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 라벨화 NOV0712 또는 라벨화 H01L02 를 종농도 5 nM 으로 첨가하고, 또한 실시예 5)-5-3 에서 조제한 인간화 hG019 항체 4 종 (클론 번호는 H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 또는 참고예 1 에서 조제한 항 CDH6 항체 NOV0712, 또는 음성 컨트롤로서 인간 IgG1 (Calbiochem) 을 도 9 의 가로축으로 나타내는 종농도로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 9 에 나타낸다. 가로축은 라벨화되어 있지 않은 항체의 첨가시의 종농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다. 라벨화 NOV0712 를 첨가한 세포에 라벨화되어 있지 않은 NOV0712 를 첨가한 경우에는, 동일한 에피토프를 가져 결합이 경합하기 때문에, 첨가 농도 의존적으로 라벨화되어 있지 않은 항체로 치환되어 라벨화 항체의 결합량이 감소한다. 한편, 라벨화 NOV0712 를 첨가한 세포에 인간화 hG019 항체 4 종, 또는 음성 컨트롤로서 인간 IgG1 을 첨가해도, 라벨화 항체의 결합량에 변화는 없으므로, 이들 항체는 에피토프가 상이하여 결합이 경합하지 않는 것이 나타난다. 동일하게, 라벨화 H01L02 를 첨가한 세포에 라벨화되어 있지 않은 인간화 hG019 항체 4 종을 첨가한 경우에는, 동일한 에피토프를 가져 결합이 경합하기 때문에, 첨가 농도 의존적으로 라벨화되어 있지 않은 항체로 치환되어 라벨화 항체의 결합량이 감소한다. 한편, 라벨화 H01L02 를 첨가한 세포에 NOV0712, 또는 음성 컨트롤로서 인간 IgG1 을 첨가해도, 라벨화 항체의 결합량에 변화는 없으므로, 이들 항체는 에피토프가 상이하여 결합이 경합하지 않는 것이 나타난다.
6)-3 인간화 hG019 및 NOV0712 의 내재화 활성 평가
인간화 hG019 및 NOV0712 의 내재화 활성은, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항인간 IgG 시약 Hum-ZAP (ADVANCED TARGETING SYSTEMS) 을 사용하여 평가하였다. 즉, 인간 CDH6 양성 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3 (ATCC) 을 4 x 103 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 인간 CDH6 양성 신세포 종양 세포주 786-O (ATCC) 는 1 x 103 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고 하룻밤 배양하였다. 인간 CDH6 양성 난소 종양 세포주 PA-1 (ATCC) 을 1 x 103 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 항 CDH6 항체 (종농도 : 1 nM), 또는 음성 컨트롤 항체로서 인간 IgG1 항체 (Calbiochem) 를 첨가하였다. 또한 Hum-ZAP (종농도 : 0.5 nM), 또는 음성 컨트롤로서 독소를 결합하고 있지 않은 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc(gamma) Fragment Specific (JACKSON IMMUNORESEARCH) (종농도 : 0.5 nM) 을 첨가하고, 3 일간 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 배양하였다. 생존 세포수는, CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay 에 의한 ATP 활성 (RLU) 의 정량으로 측정하였다. 이 평가에서는, 인간화 항 CDH6 항체의 내재화 활성에 의존하여 Hum-ZAP 이 세포 내에 도입되고, 단백 합성을 저해하는 사포린이 세포 내에 방출됨으로써, 세포 증식이 억제된다. 항 CDH6 항체 첨가에 의한 세포 증식 억제 작용은, Hum-ZAP 대신에 음성 컨트롤을 첨가한 웰의 생존 세포수를 100 ％ 로 한 상대 생존율로 표기하였다. 도 10a ∼ 도 10c 에 그래프 및 세포 생존율의 표를 나타낸다. 본 실험에 있어서 내재화 활성이 강한 항체는 낮은 세포 생존율을 나타내는 것으로 생각된다. 이 결과, NOV0712 는 인간화 hG019 항체 4 종은 3 종의 세포주 중 어느 것에 있어서도 세포 생존율로부터 예측되는 내재화율은 약 50 ∼ 75 ％ 로, 매우 높은 내재화 활성을 나타내고, NOV0712 와 비교하여, 더욱 높은 내재 활성을 나타낸다. ADC 의 약효 메커니즘으로부터, 높은 내재화 활성을 갖는 항체는, ADC 화 항체를 하여, 보다 적합한 것으로 생각된다.
[실시예 7 : 인간화 hG019-약물 콘주게이트의 제조]
7)-1 항체-약물 콘주게이트의 제조 H01L02-DXd
공정 1 : 항체-약물 콘주게이트 (1)
[화학식 11]
Figure pct00044
항체의 환원 : 실시예 5 에서 제조한 H01L02 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.53 ㎖㎎-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 9.85 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (5.7 ㎖) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.231 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0855 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬간부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭사이드 용액 (0.386 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0347 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 9 당량) 를 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트 「H01L02-ADC」 를 함유하는 용액을 19 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5440, εD,370 = 21240 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.26 ㎎/㎖, 항체 수량 : 42.9 ㎎ (76 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 5.9 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.7.
7)-2 항체-약물 콘주게이트의 제조 H02L02-DXd
공정 1 : 항체-약물 콘주게이트 (2)
[화학식 12]
Figure pct00045
항체의 환원 : 실시예 5 에서 제조한 H02L02 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.51 ㎖㎎-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 9.95 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (5.7 ㎖) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.234 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0855 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬간부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭사이드 용액 (0.389 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0350 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 9 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트 「H02L02-ADC」 를 함유하는 용액을 19 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5440, εD,370 = 21240 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.61 ㎎/㎖, 항체 수량 : 49.6 ㎎ (87 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 5.9 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.6.
7)-3 항체-약물 콘주게이트의 제조 H02L03-DXd
공정 1 : 항체-약물 콘주게이트 (3)
[화학식 13]
Figure pct00046
항체의 환원 : 실시예 5 에서 제조한 H02L03 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.53 ㎖㎎-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 9.86 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (5.7 ㎖) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.270 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 7.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0855 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬간부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭사이드 용액 (0.386 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0347 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 9 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트 「H01L02-ADC」 를 함유하는 용액을 19 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5440, εD,370 = 21240 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.71 ㎎/㎖, 항체 수량 : 51.4 ㎎ (91 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 5.7 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.6.
7)-4 항체-약물 콘주게이트의 제조 H04L02-DXd
공정 1 : 항체-약물 콘주게이트 (4)
[화학식 14]
Figure pct00047
항체의 환원 : 실시예 5 에서 제조한 H04L02 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.53 ㎖㎎-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 9.86 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (5.7 ㎖) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.232 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0855 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬간부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭사이드 용액 (0.386 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0347 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 9 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트 「H04L02-ADC」 를 함유하는 용액을 19 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5440, εD,370 = 21240 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.56 ㎎/㎖, 항체 수량 : 48.7 ㎎ (87 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 5.8 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.6.
[참고예 2 : NOV0712-약물 콘주게이트의 제조]
참고예 2)-1 항체-약물 콘주게이트의 제조 NOV0712-DM4
항체-약물 콘주게이트 (5)
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 참고예 1 에서 제조한 NOV0712 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.51 ㎖㎎-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, 20 mM HEPES8.1 (LIFE TECHNOLOGIES 사 제조 HEPES, 1 M 완충 용액 (20 ㎖) 을 1 M 수산화나트륨으로 pH8.1 로 한 후, 증류수로 1 ℓ 로 하였다) 로 9.7 ㎎/㎖ 로 조제하고, 20 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 WO2016/024195호 공개특허공보에 기재된 10 mM 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시)-1-옥소-4-(피리딘-2-일디술파닐)부탄-2-술폰산의 DMA 용액 (0.366 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 5.2 당량), 10 mM N2-데아세틸-데아세틸-N2-(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM4) 의 DMA 용액 (0.366 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 6.8 당량), 및 0.243 ㎖ 의 DMA 를 첨가하고, 20 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 1 M 아세트산 수용액을 첨가하여 pH5.0 으로 하고, 또한 실온에서 20 분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트 「NOV0712-DM4」 를 함유하는 용액을 28 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εA,280 = 200500, εA,252 = 76295, εD,280 = 43170 및 εD,252 = 23224 를 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.58 ㎎/㎖, 항체 수량 : 72.2 ㎎ (93 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 3.0.
참고예 2)-2 항체-약물 콘주게이트의 제조 NOV0712-DXd
공정 1 : 항체-약물 콘주게이트 (6)
[화학식 15]
Figure pct00048
항체의 환원 : 참고예 1 에서 제조한 NOV0712 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.51 ㎖㎎-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 9.26 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 본 용액 (6.6 ㎖) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.254 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0990 ㎖) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬간부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭사이드 용액 (0.381 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 9 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0381 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 9 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트 「NOV0712-ADC」 를 함유하는 용액을 23.5 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5440, εD,370 = 21240 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.26 ㎎/㎖, 항체 수량 : 56.4 ㎎ (92 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 6.4 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.8.
[참고예 3 : H01L02-DM4 의 제조]
참고예 3)-1 항체-약물 콘주게이트의 제조 H01L02-DM4
항체-약물 콘주게이트 (7)
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 실시예 5 에서 제조한 H01L02 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.53 ㎖㎎-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, 20 mM HEPES8.1 (LIFE TECHNOLOGIES 사 제조 HEPES, 1 M 완충 용액 (20 ㎖) 을 1 M 수산화나트륨으로 pH8.1 로 한 후, 증류수로 1 ℓ 로 하였다) 로 9.8 ㎎/㎖ 로 조제하고, 20 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 WO2016/024195호 공개특허공보에 기재된 10 mM 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시)-1-옥소-4-(피리딘-2-일디술파닐)부탄-2-술폰산의 DMA 용액 (0.062 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 11.5 당량), 10 mM N2-데아세틸-N2-(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM4) 의 DMA 용액 (0.082 ㎖ ; 항체 1 분자에 대하여 15.1 당량) 을 첨가하고, 20 ℃ 에서 18 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 1 M 아세트산 수용액을 첨가하여 pH5.0 으로 하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트 「H01L02-DM4」 를 함유하는 용액을 3.5 ㎖ 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εA,280 = 223400, εA,252 = 85646, εD,280 = 4317 및 εD,252 = 23224 를 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.97 ㎎/㎖, 항체 수량 : 6.90 ㎎ (88 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 3.6.
[실시예 8 : 항체-약물 콘주게이트의 in vitro 활성 평가]
8)-1 CDH6 양성 인간 종양 세포주에 대한 항체-약물 콘주게이트의 in vitro 세포 증식 억제 활성 평가
CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 PA-1 을 10 ％ FBS 함유 MEM 배지 중 2 x 103 세포/100 ㎕ /웰이 되도록 96 웰 플레이트에 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 실시예 7 에서 제조한 인간화 hG019-약물 콘주게이트 4 종 (클론명은 H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd 및 H04L02-DXd), 또는 참고예 2 에서 제조한 NOV0712-약물 콘주게이트 (NOV0712-DM4) 를 종농도 0.0001 (nM) 내지 100 (nM) 이 되도록 첨가하였다. 4 일간 배양 후에 생존 세포수를 CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 에 의한 ATP 의 정량으로 측정하였다. 도 11 에 항체-약물 콘주게이트를 각각 첨가했을 때의 농도 의존적인 세포 증식 억제 활성을 나타낸다. 이 결과, 인간화 hG019-약물 콘주게이트 4 종은, NOV0712-약물 콘주게이트와 비교하여, 보다 낮은 첨가 농도에서 종양 세포의 증식 억제 활성을 나타내고, 항종양 활성이 높은 것이 나타난다.
[실시예 9 : 항체-약물 콘주게이트의 in vivo 항종양 효과]
항체-약물 콘주게이트의 항종양 효과는, CDH6 양성 인간 종양 세포주의 세포를 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 4 - 5 주령의 BALB/c 누드 마우스 (CAnN.Cg-Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu], 닛폰 찰스·리버), 및 SCID 마우스 (CB17/Icr-Prkdc[scid]/CrlCrlj, 닛폰 찰스·리버) 를 실험 사용 전에 SPF 조건화에서 3 일간 이상 순화 (馴化) 시켰다. 마우스에는 멸균한 고형 사료 (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) 를 급이하고, 멸균한 수돗물 (5 - 15 ppm 차아염소산나트륨 용액을 첨가하여 조제) 을 부여하였다. 이식한 종양의 장경 및 단경을 전자식 디지털 노기스 (CD-15CX, Mitutoyo Corp.) 로 1 주에 2 회 측정하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.
종양 체적 (㎣) = 1/2 × 장경 (㎜) × [단경 (㎜)]2
항체-약물 콘주게이트는 모두 ABS 완충액 (10 mM-아세테이트 완충액, 5 ％ 소르비톨, pH5.5) (NACALAI) 으로 희석시키고, 각 실시예에 나타내는 용량으로 미정맥내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다. 1 군당 6 마리의 마우스를 실험에 사용하였다.
9)-1 항종양 효과 (1)
실시예 2)-3-1 에서 CDH6 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 신세포 종양 세포주 786-O (ATCC) 를 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 5 × 106 세포를 수컷 SCID 마우스의 우측 복부에 피하 이식하고 (Day0), Day18 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 7 에서 제조한 항체-약물 콘주게이트 4 종 (클론명은 H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd 및 H04L02-DXd), 또는 참고예 2 에서 제조한 NOV0712-DM4 를 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 12 에 나타낸다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
NOV0712-DM4 는 본 종양 모델에 있어서 현저한 항종양 효과를 나타내지 않았다. 실시예 7 에서 작성한 항체-약물 콘주게이트 4 종은 모두 투여 후 종양 체적이 감소하여, 현저한 종양의 퇴축이 관찰되고, 투여 후 24 일간, 종양 퇴축 효과가 지속되었다 (도 12).
9)-2 항종양 효과 (2)
실시예 2)-3-1 에서 CDH6 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 PA-1 (ATCC) 을 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 8.5 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 복부에 피하 이식하고 (Day0), Day11 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 7 에서 제조한 항체-약물 콘주게이트 H01L02-DXd 또는 참고예 2 에서 제조한 NOV0712-DM4 혹은 NOV0712-DXd 를, 1 및 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 13 에 나타낸다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
NOV0712-DM4 는 본 종양 모델에 있어서 1 및 3 ㎎/㎏ 중 어느 용량에서도 항종양 효과를 나타내지 않았다. 한편, H01L02-DXD 는 1 및 3 ㎎/㎏ 중 어느 용량에서도 투여 후 종양 체적이 현저하게 감소하여, 종양을 축퇴시키는 효과를 발휘하였다 (도 13). 또, 본 명세서에서 취득한 H01L02 항체 혹은 NOV0712 항체에 동일한 약물 DXd 를 콘주게이트한 검체의 약효를 비교한 결과, H01L02-DXD 는, 1 및 3 ㎎/㎏ 중 어느 용량에서도 NOV0712-DXd 에 비해 강한 항종양 효과를 발휘하였다. 즉, 본 발명의 H01L02 항체는, NOV0712 항체에 비해, 항종양제로서의 항체-약물 콘주게이트의 항체로서 보다 우수한 항체인 것이 나타났다 (도 13).
9)-3 항종양 효과 (3)
실시예 2)-3-1 에서 CDH6 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3 (ATCC) 을 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 1 × 107 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 복부에 피하 이식하고 (Day0), Day22 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 7 에서 제조한 항체-약물 콘주게이트 H01L02-DXd 또는 참고예 2 에서 제조한 NOV0712-DM4 를, 1 및 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 14 에 나타낸다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
NOV0712-DM4 는, 1 ㎎/㎏ 에서는 전혀 항종양 효과를 나타내지 않고, 3 ㎎/㎏ 에서는 항종양 효과를 나타내지만, 투여 2 주 후부터 종양의 재증식이 관찰되었다. 한편, H01L02-DXd 는 1 및 3 ㎎/㎏ 중 어느 용량에서도, 투여 후 종양 체적의 증가를 현저하게 억제하고, 특히 3 ㎎/㎏ 에서는 투여 후 31 일간의 장기에 걸쳐 종양 증식 억제 효과가 지속되었다 (도 14).
또, PA-1 세포를 사용하여 동일하게, 참고예 2 에서 제조한 NOV0712-DM4 혹은 참고예 3 에서 작성한 H01L02-DM4 의 종양 증식 억제 효과를 평가하였다. H01L02-DM4 는 NOV0712-DM4 보다 종양 체적을 축퇴시키고, 본 발명의 H01L02 항체는, NOV0712 항체에 비해, 항종양제로서의 항체-약물 콘주게이트의 항체로서 보다 우수한 항체였다.
9)-4 항종양 효과 (4)
실시예 2)-3-1 에서 CDH6 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 신세포 종양 세포주 786-O (ATCC) 를 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 5 × 106 세포를 수컷 SCID 마우스의 우측 복부에 피하 이식하고 (Day0), Day20 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 7 에서 제조한 항체-약물 콘주게이트 H01L02-DXd 또는 참고예 2 에서 제조한 NOV0712-DM4 를, 1 및 3 ㎎/㎏의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 15 에 나타낸다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
NOV0712-DM4 는 본 종양 모델에 있어서 1 및 3 ㎎/㎏ 중 어느 용량에서도 현저한 항종양 효과를 나타내지 않았다. 한편, H01L02-DXd 는 1 및 3 ㎎/㎏ 중 어느 용량에서도 투여 후 종양 체적이 감소하고, 특히 3 ㎎/㎏ 에서는 현저한 종양의 퇴축이 관찰되고, 투여 후 20 일간, 종양 퇴축 효과가 지속되었다 (도 15).
9)-5 항종양 효과 (5)
실시예 2)-3-1 에서 CDH6 을 발현하지 않는 것을 확인한, CDH6 음성 인간 난소 종양 세포주 ES-2 (ATCC) 를 생리 식염수에 현탁하고, 1 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 복부에 피하 이식하고 (Day0), Day7 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 7 에서 작성한 항체-약물 콘주게이트 H01L02-DXd 또는 참고예 2 에서 제조한 NOV0712-DM4 를, 1 및 3 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 16 에 나타낸다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
CDH6 을 발현하지 않는 본 종양 모델에서는, H01L02-DXd 및 NOV0712-DM4 는 어느 용량에서도 항종양 효과를 전혀 나타내지 않았다. 이 결과로부터, 실시예 9)-1, 9)-2, 9)-3, 9)-4 로 나타낸 CDH6 양성 종양 모델에서의 항체-약물 콘주게이트의 항종양 효과는, 종양 세포의 CDH6 발현에 의존하여 일어나는 효과이고, CDH6 양성의 종양에 특이적으로 항종양 효과를 나타내고, CDH6 음성의 정상 조직에는 세포 장해를 일으키지 않는 선택적으로 안전한 항종양 약제라고 생각된다 (도 16).
산업상 이용가능성
본 발명에 의해, 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체 및 그 항체를 포함하는 항체-약물 콘주게이트가 제공되었다. 그 항체-약물 콘주게이트는 암에 대한 치료약 등으로서 사용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Anti CDH6 antibodies and anti CDH6 antibody drug conjugates <130> DSPCT-FP1814 <150> JP2017-096749 <151> 2017-05-15 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 790 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Thr Tyr Arg Tyr Phe Leu Leu Leu Phe Trp Val Gly Gln Pro 1 5 10 15 Tyr Pro Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro 20 25 30 Ala Lys Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Asn Glu Leu 35 40 45 Asn Arg Ser Lys Arg Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Tyr Thr Gly Ser Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp 65 70 75 80 Gln Asp Arg Gly Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly 85 90 95 Ala Gly Asp Leu Phe Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala 100 105 110 Thr Lys Arg Leu Asp Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala 115 120 125 Gln Ala Ile Asn Arg Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu 130 135 140 Phe Ile Ile Lys Ile His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe 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cagcacctga actcctgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 71 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequesnce of hH01 heavy chain variable region <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val 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ttttggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360 agctca 366 <210> 73 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequesnce of hH02 heavy chain full-length <400> 73 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Asn Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 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cttcgatttt tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 75 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequesnce of hH02 heavy chain variable region <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequesnce of hH02 heavy chain variable region <400> 76 gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc cggaacttca tgcactgggt gcgccaggct 120 ccaggccagg gactggaatg gatgggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180 aaccagaaat tccagggcag agtgaccatc accgccgaca gaagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaggcgtg 300 tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360 agctca 366 <210> 77 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequesnce of hH04 heavy chain full-length <400> 77 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Asn Phe Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 78 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequesnce of hH04 heavy chain full-length <400> 78 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacac ctttacccgg aacttcatgc actggatccg gcaggcccct 180 ggacagggcc tggaatggat gggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacgcc 240 cagaaattcc agggcagagt gaccctgacc gccgacagaa gcaccagcac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag aggcgtgtac 360 ggcggcttcg ctggcggcta cttcgatttt tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 79 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequesnce of hH04 heavy chain variable region <400> 79 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequesnce of hH04 heavy chain variable region <400> 80 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc cggaacttca tgcactggat ccggcaggcc 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccctg accgccgaca gaagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcgtg 300 tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360 agctca 366 <210> 81 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequesnce of NOV0712 light chain full-length <400> 81 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly 100 105 110 Thr Phe Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 82 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequesnce coding for amino acid sequence of sequence number 81 <400> 82 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120 atcacctgta gagccagcca gagcatcagc agctacctga actggtatca gcagaagccc 180 ggcaaggccc ccaaactgct gatctacgcc gtgtccacac tgcagagcgg cgtgcccagc 240 agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag tccggcacct tcccccccac cacatttggc 360 cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggccgccc cctccgtgtt catcttcccc 420 ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtgg tgtgcctgct gaataacttc 480 taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cgggaactcc 540 caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcaccctg 600 accctgagca aagccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 660 ggcctgagct cccccgtcac caagagcttc aacagggggg agtgt 705 <210> 83 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequesnce of NOV0712 heavy chain full-length <400> 83 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Trp Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ser Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 84 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequesnce coding for amino acid sequence of sequence number 83 <400> 84 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gtgcagctgc tggaatctgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctctct gagactgtct 120 tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcagc cacggaatgc actgggtgcg ccaggcccct 180 ggaaagggac tggaatgggt gtccgtgatc agcggcagcg gctccaatac cggctacgcc 240 gatagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaaca gcctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag acagtggggc 360 agctacgcct tcgattcttg gggccagggc accctcgtga ccgtcagctc agcctccacc 420 aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaac tcctgggggg accctcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380 ctctccctgt ctcccggcaa a 1401 <210> 85 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 caccatgaga acttaccgct acttcttgct gctc 34 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 ttaggagtct ttgtcactgt ccactcctcc 30

Claims (53)

  1. 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열에 대한 결합에 대하여, 이하의 (1) ∼ (5) :
    (1) 서열 번호 53 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 56 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
    (2) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
    (3) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
    (4) 서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체, 및
    (5) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 항체 중 적어도 어느 하나와 경합 저해 활성을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (4) :
    (1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
    (2) 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
    (3) 서열 번호 32 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 34 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및
    (4) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고
    이하의 (5) ∼ (9) :
    (5) 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (6) 서열 번호 27 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (7) 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (8) 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및
    (9) 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (5) :
    (1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (2) 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 27 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (3) 서열 번호 32 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 34 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (4) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및
    (5) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화되어 있는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (4) :
    (1) 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (2) 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (3) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및
    (4) (1) ∼ (3) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역, 그리고
    이하의 (5) ∼ (9) :
    (5) 서열 번호 71 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (6) 서열 번호 75 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (7) 서열 번호 79 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (8) (5) ∼ (7) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및
    (9) (5) ∼ (8) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (4) :
    (1) 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 71 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (2) 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 75 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (3) 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 75 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 또는
    (4) 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 79 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중 어느 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (4) :
    (1) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (2) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (3) 서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 또는
    (4) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 중 어느 것을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  9. 제 8 항에 있어서,
    서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  10. 제 8 항에 있어서,
    서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  11. 제 8 항에 있어서,
    서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  12. 제 8 항에 있어서,
    서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기능성 단편이 Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는, 항체의 기능성 단편.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  15. 제 14 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (5) :
    (1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (2) 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 27 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (3) 서열 번호 32 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 34 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (4) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 그리고
    (5) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  17. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  18. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  19. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
  21. 제 20 항에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
  22. 제 21 항에 있어서,
    숙주 세포가 진핵 세포인, 숙주 세포.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편의 제조 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중사슬 또는 경사슬이, N-결합에 대한 당 사슬 부가, O-결합에 대한 당 사슬 부가, N 말의 프로세싱, C 말의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말 글루타민 혹은 N 말 글루탐산의 피로글루탐산화, 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 받은, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  25. 제 24 항에 있어서,
    중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 항체.
  26. 제 25 항에 있어서,
    2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는 항체.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는 항체.
  28. 제 1 항 내지 제 13 항 및 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키기 위해서 당 사슬 수식이 조절되어 있는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
  29. 제 1 항 내지 제 13 항 및 제 24 항 내지 제 28 항으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편에 약물이 결합하고 있는 항체-약물 콘주게이트.
  30. 제 29 항에 있어서,
    약물이 항종양성 화합물인, 항체-약물 콘주게이트.
  31. 제 30 항에 있어서,
    항종양성 화합물이 다음 식 :
    Figure pct00049

    으로 나타내는 항종양성 화합물인, 항체-약물 콘주게이트.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체와 약물이, 다음 식 (a) ∼ (f) :
    Figure pct00050

    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 구조의 링커를 통하여 결합하고 있는, 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, 항체는 -(숙신이미드-3-일-N) 의 말단에 있어서 결합한다. 항종양성 화합물은, 1 위치의 아미노기의 질소 원자를 결합 부위로 하여, (a), (b), (e) 또는 (f) 의 -CH2CH2CH2-C(=O)- 부분, (c) 의 CH2-O-CH2-C(=O)- 부분 또는 (d) 의 CH2CH2-O-CH2-C(=O)- 부분의 카르보닐기에 결합한다. 상기 식 중 GGFG 는, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신으로 이루어지는 펩티드 결합으로 연결되어 있는 아미노산 서열을 나타낸다.
    -(숙신이미드-3-일-N)- 은 다음 식 :
    Figure pct00051

    으로 나타내는 구조이고, 이것의 3 위치에서 항체와 결합하여, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합한다.).
  33. 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    링커가 이하의 (c), (d) 및 (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 식으로 나타내는, 항체-약물 콘주게이트 :
    Figure pct00052
  34. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    링커가 이하의 (c) 또는 (e) 의 식으로 나타내는, 항체-약물 콘주게이트 :
    Figure pct00053
  35. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 식 :
    Figure pct00054

    으로 나타내는 구조를 갖는, 항체-약물 콘주게이트 :
    여기서, AB 는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타낸다. n 은 항체와 결합하고 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 통하여 결합하고 있다.
  36. 제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 식 :
    Figure pct00055

    으로 나타내는 구조를 갖는, 항체-약물 콘주게이트 :
    여기서, AB 는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타낸다. n 은 항체와 결합하고 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 통하여 결합하고 있다.
  37. 제 29 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 이하의 (1) ∼ (4) :
    (1) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (2) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (3) 서열 번호 65 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 73 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 또는
    (4) 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 및 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편인, 항체-약물 콘주게이트.
  38. 제 37 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편인, 항체-약물 콘주게이트.
  39. 제 37 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 61 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 77 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편인, 항체-약물 콘주게이트.
  40. 제 29 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중사슬 또는 경사슬이, N-결합에 대한 당 사슬 부가, O-결합에 대한 당 사슬 부가, N 말의 프로세싱, C 말의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말 글루타민 혹은 N 말 글루탐산의 피로글루탐산화 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 받은, 항체-약물 콘주게이트.
  41. 제 29 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 1 ∼ 10 개의 범위인, 항체-약물 콘주게이트.
  42. 제 41 항에 있어서,
    선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 2 ∼ 8 개의 범위인, 항체-약물 콘주게이트.
  43. 제 42 항에 있어서,
    선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 5 ∼ 8 개의 범위인, 항체-약물 콘주게이트.
  44. 제 43 항에 있어서,
    선택된 1 종의 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 7 ∼ 8 개인, 항체-약물 콘주게이트.
  45. 제 29 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  46. 제 45 항에 있어서,
    항종양약인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서,
    종양이 CDH6 을 발현하는 종양인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,
    종양이, 신세포암, 신염 명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성 선암, 갑상선암, 담관암, 폐암, 소세포 폐암, 신경 교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  49. 제 29 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 어느 것을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    종양이 CDH6 이 발현하고 있는 종양인 것을 특징으로 하는, 종양의 치료 방법.
  51. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서,
    종양이, 신세포암, 신염 명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성 선암, 갑상선암, 담관암, 폐암, 소세포 폐암, 신경 교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종인 것을 특징으로 하는, 종양의 치료 방법.
  52. 제 29 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 의약 조성물 및 적어도 하나의 항종양약을, 동시에, 따로따로 또는 연속해서 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
  53. 제 1 항 내지 제 13 항 및 제 24 항 내지 제 28 항으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편 혹은 제 23 항에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편과, 약물-링커 중간 화합물을 반응시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법.
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