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CN105999263B - 用于治疗或预防人表皮生长因子受体-3(her-3)相关疾病的材料和方法 - Google Patents

用于治疗或预防人表皮生长因子受体-3(her-3)相关疾病的材料和方法 Download PDF

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CN105999263B CN201610373755.5A CN201610373755A CN105999263B CN 105999263 B CN105999263 B CN 105999263B CN 201610373755 A CN201610373755 A CN 201610373755A CN 105999263 B CN105999263 B CN 105999263B
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Abstract

本发明描述通过施用第一剂与第二剂的组合以治疗患有人表皮生长因子受体‑3(HER‑3)相关疾病的受治疗者的材料和方法，该第一剂与HER‑3结合且该第二剂与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员。该第一剂和第二剂可为生物制剂，诸如举例来说抗原结合蛋白或小分子酪氨酸激酶抑制剂。

Description

用于治疗或预防人表皮生长因子受体-3(HER-3)相关疾病的 材料和方法
本申请是国际申请日为2010年11月12日，中国国家申请号为201080052236.X，发明名称为“用于治疗或预防人表皮生长因子受体-3(HER-3)相关疾病的材料和方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及通过施用第一剂与第二剂的组合以治疗患有人表皮生长因子受体-3(HER-3)相关疾病的受治疗者的材料和方法，该第一剂与HER-3结合且该第二剂与人表皮生长因子受体(HER)家族的另一成员结合和/或抑制该成员。该第一剂和第二剂可能为分别与HER-3结合或与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员的任何种类的分子，包括但不限于生物性化合物，诸如抗原结合蛋白、小分子酪氨酸激酶抑制剂、siRNA或天然物质。
现有技术
HER-3(也称为Erb3)是一种受体蛋白酪氨酸激酶，其属于受体蛋白酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGF-R)家族，该家族也包括HER-1(也称为EGF-R或erbB)、HER-2(也称为erbB2)和HER-4(也称为erbB4)(Plowman等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.US.87:4905-4909；Kraus等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.US.86:9193-9197；和Kraus等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.US.90:2900-2904)。与原型表皮生长因子受体一样，该跨膜受体HER-3是由胞外配体-结合结构域(ECD)、ECD内的二聚化结构域、跨膜结构域(TMD)、胞内蛋白酪氨酸激酶结构域(TKD)和C端磷酸化结构域组成。
HER-3的配体又称为人表皮生长因子受体调节蛋白(heregulin)(HRG)，其与HER-3的胞外结构域结合，并通过促进与其他人表皮生长因子受体(HER)家族成员的二聚化、随后使该胞内HER-3结构域转磷酸化并活化下游信号级联放大以活化受体介导的信号传递。与多个HER家族成员形成二聚体扩大HER-3的信号传递潜力，且是一种使信号多样化和使信号放大的方式。
发明内容
本发明涉及通过施用第一剂与第二剂的组合以治疗患有人表皮生长因子受体-3(HER-3)相关疾病的受治疗者的材料和方法，该第一剂与HER-3结合且该第二剂与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员。该第一剂和第二剂可能为分别与HER-3结合或与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员的任何种类的分子，包括但不限于生物性化合物，诸如抗原结合蛋白、小分子酪氨酸激酶抑制剂、siRNA或天然物质。
在一个方面中，本发明特征在于一种治疗或预防受治疗者的HER-3相关疾病的方法，该方法包含对该受治疗者施用第一剂和第二剂，其中该第一剂与HER-3结合且该第二剂与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员的活性。该第一剂可为与HER-3结合的小分子化合物或抗原结合蛋白。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列；该重链氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO:236、251、252和256组成的组的CDRH1、选自由SEQ ID NO:258、278、280和282组成的组的CDRH2和选自由SEQ ID NO:283、285、309、313和315组成的组的CDRH3；且该轻链氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO:320、334、337和340组成的组的CDRL1、选自由SEQ ID NO:343、356、351和344组成的组的CDRL2和选自由SEQ ID NO:360、381、385和387组成的组的CDRL3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的CDR中的至少一种：(a)如SEQ ID NO:236、251、252和256中所示的CDRH1；(b)如SEQ ID NO:258、278、280和282中所示的CDRH2；和(c)如SEQ ID NO:283、285、309、313和315所示的CDRH3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的CDR中的至少一种：(d)如SEQ ID NO:320、334、337和340所示的CDRL1；(e)如SEQ ID NO:343、356、351和344所示的CDRL2；和(f)如SEQ ID NO:360、381、385和387所示的CDRL3。
该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的CDR中的至少一种：(a)如SEQ ID NO:236、251、252和256所示的CDRH1；(b)如SEQ ID NO:258、278、280和282所示的CDRH2；和(c)如SEQ ID NO:283、285、309、313和315所示的CDRH3；且该轻链氨基酸序列包含选自由下列组成的组CDR中的至少一种：(d)如SEQ ID NO:320、334、337和340所示的CDRL1；(e)如SEQ ID NO:343、356、351和344所示的CDRL2；和(f)如SEQ ID NO:360、381、385和387所示的CDRL3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含重链氨基酸序列或轻链氨基酸序列；该重链氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO:236、251、252和256组成的组的CDRH1、选自由SEQ ID NO:258、278、280和282组成的组的CDRH2和选自由SEQ ID NO:283、285、309、313和315组成的组的CDRH3；且该轻链氨基酸序列包含选自由SEQID NO:320、334、337和340组成的组的CDRL1、选自由SEQ ID NO:343、356、351和344组成的组的CDRL2和选自由SEQ ID NO:360、381、385和387组成的组的CDRL3。
该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含选自由SEQID NO:42、54、70、92和96组成的组的重链氨基酸序列。该抗原结合蛋白可包含选自由SEQID NO:44、56、72、94和98组成的组的轻链氨基酸序列。
该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含选自由SEQID NO:42、54、70、92和96组成的组的重链氨基酸序列和选自由SEQ ID NO:44、56、72、94和98组成的组的轻链氨基酸序列。
该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:42的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:44的轻链氨基酸序列。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:54的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:56的轻链氨基酸序列。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含SEQ IDNO:70的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:72的轻链氨基酸序列。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含选自由SEQ ID NO:283、285、309、313和315组成的组的CDRH3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含选自由SEQID NO:360、381、385和387组成的组的CDRL3。
该抗原结合蛋白可定向抗HER-3的胞外结构域。该抗原结合蛋白与HER-3的结合可减少HER-3介导的信号传导、减少HER-3的磷酸化、减少细胞增殖、减少细胞迁移和/或增加HER-3的下调。
与HER-3结合的所述抗原结合蛋白可为抗体。该抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人源抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段(例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双价抗体(diabody)或单链抗体分子)。该抗体可为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。
该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白可与效应基团偶合。该效应基团可为放射性同位素或放射性核素、毒素、或治疗性或化学治疗性基团(例如选自由刺孢霉素(calicheamicin)、耳抑素-PE(auristatin-PE)、格尔德霉素(geldanamycin)、美登素(maytansine)及其衍生物组成的组的治疗性或化学治疗性基团)。
该第二剂可为小分子化合物或抗原结合蛋白。该第二剂可为，例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、帕尼单抗(panitumumab)、埃罗替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)和T-DM1。
在另一个方面中，本发明特征在于一种治疗或预防受治疗者的HER-3相关疾病的方法，该方法包含对该受治疗者施用第一剂和第二剂，其中该第一剂是与HER-3结合的抗原结合蛋白且包含重链氨基酸序列SEQ ID NO:42和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:44，且其中该第二剂是选自由埃罗替尼、拉帕替尼和来那替尼组成的组。此外，本发明特征在于治疗或预防受治疗者的HER-3相关疾病的方法，该方法包含对该受治疗者施用第一剂和第二剂，其中该第一剂是与HER-3结合的抗原结合蛋白且包含重链氨基酸序列SEQ ID NO:54和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:56，或与HER-3结合的抗原结合蛋白且包含重链氨基酸序列SEQ ID NO:70和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:72，且其中该第二剂选自由埃罗替尼、拉帕替尼和来那替尼组成的组。
本发明特征还在于一种治疗或预防受治疗者的HER-3相关疾病的方法，该方法包含对该受治疗者施用第一剂和第二剂，其中该第一剂是与HER-3结合的抗原结合蛋白且包含重链氨基酸序列SEQ ID NO:42和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:44，且其中该第二剂选自由曲妥珠单抗、T-DM1、帕尼单抗和西妥昔单抗组成的组。
本发明所提供的方法可任选地包含施用第三剂或其他治疗剂和/或放射性治疗。该第三剂或其他治疗剂可为抗肿瘤剂(例如抗肿瘤抗体或化学治疗剂，诸如卡培他滨(capecitabine)、蒽环类(anthracycline)、多柔比星(doxorubicin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他奇(docetaxel)、顺铂(cisplatin)、吉西他滨(gemcitabine)或卡铂(carboplatin))。
该第一剂和该第二剂可经静脉、皮下、肌肉或口服施用。该疾病可为过度增殖性疾病(例如选自由乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、胰癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌和鳞状细胞癌组成的组的疾病)。
本文所提供的方法可包括以每6周至少一次的频率施用约1至约20mg/kg体重剂量的该第一剂。该方法可包括以每6周至少一次的频率施用约1至约20mg/kg体重剂量的该第二剂。所述方法还可包含在施用前使用包含分析预测性标志以选择患有HER-3相关疾病的受治疗者的方法。所述方法还可包含在施用后监测治疗结果。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明的相关领域的一名普通技术人员通常所理解的相同的意义。虽然与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料都可被用于实行本发明，但将适当的方法和材料描述于下文。本文所提及的出版物、申请、专利及其他参考文献中的每一个通过引用全文并入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实例仅为示例性的而非意图限制。
本发明的一个或多个实施方案的细节在下文所附的附图和说明中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将是由详细说明、图式及由权利要求而显而易见的。
附图简述
图1说明单独使用人源抗-HER-3抗体和帕尼单抗或组合使用二者对非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植肿瘤(Calu-3)生长的影响。
图2说明单独使用人源抗-HER-3抗体和埃罗替尼或组合使用二者对Calu-3生长的影响。
图3说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4(HER2二聚化抑制剂)或曲妥珠单抗对SkBr-3乳癌细胞的基底非贴壁依赖性生长的影响。
图4说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或西妥昔单抗对SkBr-3乳癌细胞的经HRG刺激的非贴壁依赖性生长的影响。
图5说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或西妥昔单抗对MDA-MB-435卵巢癌细胞的基底非贴壁依赖性生长的影响。
图6A至6D说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与曲妥珠单抗(图6A)、拉帕替尼(图6B)、吉西他滨(图6C)或顺铂(图6D)对MDA-MB-175VII乳癌细胞的增殖的影响。
图7说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或拉帕替尼对ZR-75-30乳癌细胞的经HRG刺激的增殖的影响。
图8说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或拉帕替尼对BT474乳癌细胞的经HRG刺激的增殖的影响。
图9说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、c2C4或曲妥珠单抗对经HRG刺激的DLD-1结肠癌细胞的增殖的影响。
图10说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4或曲妥珠单抗或拉帕替尼对HCC-1569乳癌细胞的经HRG刺激的增殖的影响。
图11说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或拉帕替尼对SkBr-3乳癌细胞的经HRG刺激的增殖的影响。
图12说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与帕尼单抗对FaDu头颈癌细胞的增殖的影响。
图13的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、c2C4或曲妥珠单抗对MDA-MB-175VII乳癌细胞中HER-3(上图)、Akt(中图)和ERK(下图)的磷酸化的影响。
图14的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、c2C4、曲妥珠单抗或拉帕替尼对经HRG刺激的SkBr-3乳癌细胞中HER-3(上图)、Akt(中图)和ERK(下图)的磷酸化的影响。
图15的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、帕妥珠单抗(c2C4)或曲妥珠单抗对经HRG刺激的Ls174T结肠癌细胞中HER-3(上图)或Akt(下图)的磷酸化的影响。
图16的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、c2C4或曲妥珠单抗对经HRG刺激的HCC1569乳癌细胞中HER-3(上图)、Akt(中图)和ERK(下图)的磷酸化的影响。
图17的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与帕尼单抗对A549肺泡上皮细胞中Akt、PGFR、HER-2、HER-3、HER-4和ERK的磷酸化的影响。第1行，IgG对照组；第2行，单独使用帕尼单抗；第3行，单独使用U1-59；第4行，组合使用U1-59与帕尼单抗。微管蛋白被用来作为相同上样的对照。
图18的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与帕尼单抗或拉帕替尼对Calu3NSCLC细胞中HER-3、Akt、HER-2、ERK和EGF-R的磷酸化的影响。第1行，IgG对照组；第2行，单独使用帕尼单抗；第3行，单独使用U1-59；第4行，单独使用拉帕替尼；第5行，组合使用U1-59与帕尼单抗；第6行，组合使用U1-59与拉帕替尼。
图19说明单独使用人源抗-HER-3抗体和拉帕替尼或组合使用二者对乳癌异种移植肿瘤(HCC-1569)生长的影响。
图20显示以U1-59治疗A549NSCLC细胞抑制HER3磷酸化和减少吉非替尼(gefitinib)治疗后的再活化。A549细胞经吉非替尼、U1-59或二者治疗，HER3的磷酸化由ELISA分析评估。以吉非替尼治疗1小时导致HER磷酸化的部分抑制，但在24小时后逆转到对照量。相反地，以U1-59治疗导致24小时后持续的HER磷酸化的较大抑制。组合两种剂的治疗防止在以吉非替尼单独治疗24小时后的细胞中所见到的该抑制作用的逆转。实验于一式三份的孔中进行，并重复至少二次。结果以平均值±标准偏差表示。
发明详述
本文使用的段落标题仅供组织的目的，不可被视为限制所描述的主题。
除非本文另外加以定义，关于本申请所使用的科学和技术术语应具有本领域的一般技术人员通常所理解的意义。另外，除非上下文中另外要求，单数术语应包括复数意义且复数术语应包括单数意义。
一般来说，本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学以及蛋白质和核酸化学和杂交的相关使用的命名法和技术是本领域熟知且经常使用的那些。本申请的方法和技术通常根据本领域中熟知的常规方法进行，并且除非另外说明否则如同本说明书各处引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献所述。见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),第三版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001),Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学的现有程序),GreenePublishing Associates(1992)和Harlow和Lane Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，每个参考文献的内容通过引用全文并入本文。酶反应和纯化技术是根据制造商说明书，以本领域通常完成或本文所描述的方式进行的。本文所述的分析化学、合成有机化学、医学和制药化学的相关使用的术语以及实验室方法和技术是本领域熟知且经常使用的那些。标准技术可被用于化学合成、化学分析、药物制剂、配制和递送及患者治疗。
应理解的是，本发明并不限于本文所描述的特定方法、程序和试剂等，因此可以变化。本文所使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，并不意图限制仅由该权利要求所定义的范围。
除了在操作实施例或另外说明的处以外，应理解所有表示本文所使用的成分的量或反应条件的数字在所有情况下由术语“约”所修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可表示+/-1％。
1.一般概况
本发明提供涉及使用第一剂与第二剂的组合以治疗或预防HER-3相关疾病的材料和方法，该第一剂与HER-3结合且该第二剂与HER家族的其他成员结合和/或抑制该成员的活性。该第一剂和第二剂可以为生物性化合物，诸如抗原结合蛋白或小分子酪氨酸激酶抑制剂。举例来说，本发明提供与HER家族的单个或多个成员(诸如HER-3、HER-2、EGF-R、HER-4和/或HER家族的任何其他成员)结合和/或抑制该成员的分离的多肽(例如结合蛋白诸如抗体)和/或小分子酪氨酸激酶抑制剂。本发明还提供包含第一剂和第二剂的组合物及使用其治疗或预防HER-3相关疾病的方法，该第一剂与HER-3结合且该第二剂与其他HER家族成员中的一个或多个结合和/或抑制该成员的活性。
本发明所描述的某些第一剂和/或第二剂为生物制剂，诸如抗原结合蛋白。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白的多肽结构分别基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、迷你抗体(minibody)、结构域抗体、合成抗体(有时称为“抗体拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人源抗体、抗体融合物(有时称为“抗体轭合物”)及其片段。不同的结构进一步描述于下文。在其他实施方案中，该第一剂和/或第二剂是小分子酪氨酸激酶抑制剂。在还有另外的实施方案中，该第一剂和/或第二剂是siRNA。在还有另外的实施方案中，该第一剂和/或第二剂是天然物质。
本发明所描述的组合物及使用其的方法已被证实对表达HER-3和HER家族的至少一种其他成员的实体肿瘤的生长的增加的抑制。特别是相较于单独施用与HER-3结合的第一剂或结合和/或抑制HER家族的至少一种其他成员的第二剂，施用该第一剂与第二剂的组合已在本发明中证实在抑制各种肿瘤生长上的增加的功效。因此，本发明所公开的组合物和方法已证实于治疗和预防肿瘤疾病诸如癌的改进方法中的效用。
2.HER-3结合剂
如本发明所述，与HER-3结合的剂可为生物性化合物，包括但不限于抗原结合蛋白，诸如抗体或小分子酪氨酸激酶抑制剂。本发明所使用的“抗原结合蛋白”或本文所使用的“结合蛋白”是指与特定目标抗原诸如HER家族的成员(例如HER-3)特异性结合的蛋白。当抗原结合蛋白与其目标抗原的解离常数(KD)为≤10-8M时，被称为“特异性结合”。当KD为≤5×10-9M时，该抗体以“高亲和性”与抗原结合，当KD为≤5×10-10M时则为“非常高亲和性”的结合。在一个实施方案中，该抗体具有≤10-9M的KD并具有约1×10-4/秒的解离速率。在一个实施方案中，该解离速率为约1×105/秒。在其他实施方案中，该抗体将以约10-8M至10-10M之间的KD与HER家族的特定成员结合，并且在还有另一个实施方案其将以KD≤2×10-10结合。另外，如本文所使用的，小分子化合物是化学合成的以抑制一种或多种蛋白激酶(包括丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸激酶)的酶活性的低分子量化合物。
在一些实施方案中，当该HER-3结合剂为生物性化合物时，该剂为抗原结合蛋白，诸如可与HER-3结合的抗体。因此本发明提供用于治疗HER-3相关疾病的组合物和方法中的HER结合蛋白，包括抗-HER-3抗体。在一些实施方案中，靶向HER-3的抗体可以定向抗HER-3的胞外结构域(ECD)。举例来说，如本文所描述的，抗-HER-3抗体可与HER-3的胞外部分的至少一个表位相互作用。该表位可位于氨基末端的L1结构域(氨基酸19至184)、S1(氨基酸185至327)和S2(氨基酸500至632)富含半胱氨酸的结构域以及在两侧为富含半胱氨酸的结构域的L2结构域(328至499)或HER-3各结构域的组合中。该表位也可能位于各结构域的组合中，诸如但不限于包含L1和S1的部分的表位。
HER-3结合蛋白的另一项表征在于，其与HER-3的结合减少HER-3介导的信号传导。HER-3介导的信号传导减少可能是因为例如HER-3下调导致至少部分的HER-3分子从细胞表面消失，或是因为细胞表面上HER-3以基本上无活性的形式(也就是相较于非稳定形式呈现较低的信号传导的形式)的稳定化所致。可选择地，HER-3介导的信号传导减少也可能是因为影响(例如减少或抑制)配体或HER家族的另一成员与HER-3的结合所致。举例来说，HER-3介导的信号传导减少也可通过减少与其他HER家族成员(例如EGF-R)形成含HER-3的二聚体所致。
HER-3结合剂可为具有类抗体结合活性(例如具有类似抗-HER-3抗体的活性)的支架蛋白或抗体(意即抗-HER-3抗体)。本文所使用的术语“支架蛋白”是指具有对氨基酸插入、取代或缺失高度耐受的暴露的表面区域的多肽或蛋白。可用于本发明的支架蛋白的实例包括来自金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A、来自大菜粉蝶(Pierisbrassicae)的胆素结合蛋白或其他脂质运载蛋白(lipocalin)、锚蛋白(ankyrin)重复蛋白和人纤维粘连蛋白(fibronectin)(于Binz和Pluckthun(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16:459-69中综述)。支架蛋白的工程化可被视为移植或嵌入亲和性功能至稳定折叠的蛋白的结构骨架之上或之中。亲和性功能是指如本发明所述的蛋白结合亲和性。支架在构造上可与赋予结合特异性的氨基酸序列分开。一般来说，看上去适用于发展这类人造亲和性试剂的蛋白质可能通过合理或最常见的组合式蛋白工程技术获得，诸如在体外展示的人造支架库中筛选抗HER-3(不论是经纯化的蛋白或在细胞表面展示的蛋白)的结合剂，该技术为本领域已知的(见例如Skerra(2000)J.Mol.Recog.13:167-87；和Binz和Pluckthun，同上)。此外，具有类抗体结合活性的支架蛋白可源自包含该支架结构域的受体(acceptor)多肽，该受体多肽可接受供体多肽的结合结构域的移植以将该供体多肽的结合特异性赋予包含支架结构域的该受体多肽。该插入的结合结构域可为例如抗体，特别是抗-HER-3抗体，的互补决定区(CDR)。插入可通过本领域的那些技术人员已知的各种方法完成，包括例如多肽合成、编码氨基酸的核酸合成以及本领域的那些技术人员熟知的各种形式的重组方法。
术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体(Jones等人(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等人.(1988)Nature 332:323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596)、嵌合抗体(Morrison等人.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.US.81:6851-6855)、由至少二个抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)或其抗体片段。术语“抗体片段”包含前述抗体的任何部分，诸如它们的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段、双价抗体(Hollinger等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.US 90:6444-6448)、单链抗体分子(Pluckthun in:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)113,Rosenburg和Moore编辑,Springer Verlag,N.Y.(1994),269-315)和能表现出与HER-3结合的所期望能力的其他片段。
此外，本文所使用的术语“抗体”包括含有抗体的工程化亚结构域的类抗体分子或天然存在的抗体变体。这些类抗体分子可能为单结构域抗体，诸如来源于天然来源如骆驼(Muyldermans等人.(2001)Rev.Mol.Biotechnol.74:277-302)或经由人、骆驼或其他物种的体外展示文库(Holt等人(2003)Trends Biotechnol.21:484-90)获得的仅VH或仅VL的结构域。
“Fv片段”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区是由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域以紧密、非共价的连接形成的二聚体组成。在这种构型下，各可变结构域的三个CDR相互作用以界定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。这六个CDR赋予该抗体抗原结合特异性。然而，即使是单一可变结构域(或仅包含3个对抗原特异的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常以低于完整的结合位点的亲和性。“Fab片段”也包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。“Fab片段”与“Fab’片段”的不同处在于Fab’片段的重链CH1结构域的羧基端增加数个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。“F(ab’)2片段”最初被产生为之间具有铰链半胱氨酸的一对“Fab’片段”。制备这类抗体片段的方法(诸如木瓜酶或胃蛋白酶消化)是本领域的技术人员已知的。
抗体可为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类型，包括IgG或IgM类型，诸如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1和IgM2类型。举例来说，在某些情况中，该抗体是IgG1、IgG2或IgG4类型。
在某些方案中(例如关于作为抗HER-3的治疗候选物的抗体的产生)，能够固定补体并参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体是所期望的。有一些具有相同作用的同种型的抗体，包括例如小鼠IgM、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、人源IgM、人源IgG1、人源IgG3和人源IgA。应理解的是所产生的抗体最初不必然具备该同种型，所产生抗体反而可具有任何同种型且所述抗体可以通过利用本领域熟知的常规分子生物技术于适当的表达载体中通过将分子克隆的V区基因或cDNA添加至分子克隆的恒定区基因或cDNA，接着利用本领域已知的技术于宿主细胞中表达该抗体而被同种型转换。该同种型转换的抗体也可具备经分子工程化以具有相较于天然存在的变体较强CDC(Idusogie等人.(2001)J.Immunol.166:2571-2575)并利用本领域已知的技术于宿主细胞中重组表达的Fc区。这类技术包括使用直接重组技术(见例如美国专利第4,816,397号)、细胞-细胞融合技术(见例如美国专利第5,916,771和6,207,418号)等。在细胞-细胞融合技术中，制备具有带有任何所期望的同种型的重链的骨髓瘤或其他细胞系诸如CHO并制备具有轻链的另一骨髓瘤或其他细胞系诸如CHO。该细胞之后可被融合并分离表达完整抗体的细胞系。举例来说，具有与HER-3抗原的所期望的结合的人源抗-HER-3IgG4抗体可被轻易地同种型转换以产生人源IgM、人源IgG1或人源IgG3同种型，同时仍具有该相同的可变区(该区界定抗体的特异性和部分的亲和性)。该分子接着可能能够固定补体并参与CDC。
另外，抗体也可以能够与效应细胞诸如单核细胞和自然杀伤(NK)细胞上的Fc受体结合并参与抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。有一些抗体同种型具有相同作用，包括但不限于下列：小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、人源IgG1和人源IgG3。应了解的是所产生的抗体最初不必然具备该同种型，所述抗体反而可具备任何同种型且所述抗体可以通过利用本领域熟知的常规分子生物技术于适当的表达载体中通过将分子克隆的V区基因或cDNA添加至分子克隆的恒定区基因或cDNA，接着利用本领域已知的技术于宿主细胞中表达该抗体而被同种型转换。该同种型转换的抗体也可具备经分子工程化以具有相较于天然存在的变体较强ADCC(Shields等人.(2001)J.Biol.Chem.276:6591-604)并利用本领域已知的技术于宿主细胞中重组表达的Fc区。这类技术包括使用直接重组技术(见例如美国专利第4,816,397号)、细胞-细胞融合技术(见例如美国专利第5,916,771和6,207,418号)等。在细胞-细胞融合技术中，制备具有带有任何所期望的同种型的重链的骨髓瘤或其他细胞系诸如CHO并制备具有轻链的另一骨髓瘤或其他细胞系诸如CHO。该细胞之后可被融合并分离表达完整抗体的细胞系。举例来说，具有与HER-3抗原的所期望的结合的人源抗-HER-3IgG4抗体可被轻易地同种型转换以产生人源IgG1或人源IgG3同种型，同时仍具有该相同的可变区(该区界定抗体的特异性和部分的亲和性)。该分子接着可能能够效应细胞上的FcγR结合并参与ADDC。
本文的表10提供抗HER-3的抗体中可包括的多种CDR的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的靶向HER-3的结合蛋白可包括重链氨基酸序列和/或轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的至少一种CDR：(a)如SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRH1；(b)如SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRH2；和(c)如SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所示的CDRH3；且该轻链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的至少一种CDR：(d)如SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所示的CDRL1；(e)如SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所示的CDRL2；和(f)如SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所示的CDRL3，如本文随本申请一起提交的序列表所示。
在一些实施方案中，分离的靶向HER-3的结合蛋白可包含选自由SEQ ID NO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226和230所组成的组的重链氨基酸序列和/或选自由SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228和232所组成的组的轻链氨基酸序列，如本文随本申请一起提交的序列表所示。
在一些实施方案中，抗-HER-3抗体可包含如SEQ ID NO:2和4、6和8、10和12、14和16、18和20、22和24、26和28、30和32、36和38、42和44、46和48、50和52、54和56、60和58、62和64、66和68、70和72、74和76、78和82、80和82、84和86、88和90、92和94、96和98、100和102、104和106、108和110、112和114、116和118、122和124、126和128、130和132、134和136、138和140、142和144、146和148、150和152、154和156、158和160、162和164、166和168、170和172、174和176、178和180、182和184、186和188、190和192、194和196、198和200、202和204、206和208、210和212、214和216、218和220、222和224、226和228、230和232中所示的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，或如SEQ ID NO:34、40、60、62或120中的任一个所示的重链氨基酸序列，或如SEQ ID NO:58或64所示的轻链氨基酸序列，如本文随本申请一起提交的序列表所示。
在一些实施方案中，靶向HER-3的蛋白可为具有类抗体结合活性的支架蛋白(例如具有类似抗-HER-3抗体的活性)或抗体(例如抗-HER-3抗体)。该抗-HER-3抗体可选自由命名为U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61和U1-62的抗体所组成的组，或者是具有前述抗体中的一个的至少一个重链或轻链的抗体。命名为U1-49(SEQ ID NO:42/44)、U1-53(SEQ ID NO:54/56)和U1-59(SEQ ID NO:70/72)的抗体或具有所述抗体中的一个的至少一个重链或轻链的抗体可为特别有用的。
应了解的是本发明所提供的HER-3结合蛋白的氨基酸序列不限于20个常规氨基酸(见Immunology-A Synthesis(免疫学-合成)(第二版,Golub和Gren编辑.,SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991)，其通过引用全文并入本文)。举例来说，所述氨基酸可能包含所述20个常规氨基酸的立体异构物(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸。非常规氨基酸(其也可能为本发明所提供的结合蛋白的适合成份)的实例包括4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨酸，例如4-羟基脯氨酸。
另外，在SEQ ID NO:1至390(列示于本申请一起提交的附件中)所示的氨基酸序列中的轻微变异被认为包含于本发明中，条件是所述氨基酸序列中的变异维持至少75％(例如至少80％、90％、95％或99％)的SEQ ID NO:1至390所示序列。变异可发生在框架区内(即CDR之外)、CDR之内或在框架区和CDR之内。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1至390所示的氨基酸序列中的变异，即至少一个氨基酸的缺失、插入和/或取代，可发生在靠近功能性结构域的边界处。结构性和功能性结构域可通过将该核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或专用序列数据库比较来确认。计算机比较法可被用来确定存在于已知结构和/或功能的其他结合蛋白中的序列基序或预测的蛋白质构形结构域。确定折叠为已知的三维结构的蛋白序列的方法是本本领域已知的。(见例如Bowie等人.(1991)Science 253:164；Proteins,Structures and Molecular Principles(蛋白质、结构和分子原理)(Creighton编辑,WH.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(蛋白质结构介绍)(Branden和Tooze编辑,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991)；和Thornton等人.(1991)Nature 354:105，所述参考文献通过引用全文并入本文。)因此，本领域的技术人员能识别可用来界定本文所述的蛋白的结构性和功能性结构域的序列基序和结构构形。
在SEQ ID NO:1至390所示的氨基酸序列中的变异可包括那些导致对蛋白水解或氧化的感受性降低、改变糖基化模式或改变结合亲和性或者赋予或修饰该结合蛋白的其他物理化学或功能性特性的变异。特别是可考虑保守性氨基酸取代。保守性取代是指那些发生于侧链相关的氨基酸家族内的取代。氨基酸家族包括下列：酸性家族＝天冬氨酸、谷氨酸；碱性家族＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；非极性家族＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；及不带电的极性家族＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。可选择地家族包括：脂肪族羟基家族＝丝氨酸和苏氨酸；含酰胺家族＝天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族家族＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；及芳香性家族＝苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。举例来说，我们可以合理期待以异亮氨酸或缬氨酸独立取代亮氨酸、以谷氨酸独立取代天冬氨酸、以丝氨酸独立取代苏氨酸或以结构相关的氨基酸类似地取代氨基酸将不会对所形成的结合蛋白的结合或特性产生重大影响，特别是如果该取代并未牵涉在框架区内的氨基酸。然而，所有其他可能的氨基酸取代也被包含于本发明中。氨基酸改变是否产生减少HER-3信号传导的功能性的HER-3结合蛋白，可容易地通过ELISA或FACS测定所形成的结合蛋白的特定HER-3结合活性或者体外或体内的功能性测定来确定。
在一些实施方案中，HER-3结合蛋白可与效应基团偶合。该结合蛋白特别适用于治疗应用。本发明所使用的术语“效应基团”是指细胞毒性基团诸如放射性同位素或放射性核素、毒素、治疗性基团或其他本领域已知的效应基团。适当效应基团的实例为放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)或非放射性同位素(例如2D)、刺孢霉素、多拉司他汀类似物诸如耳抑素和化学治疗剂诸如格尔德霉素和美登素衍生物包括DM1。因此在一些情况中，基团可为标示基团和效应基团。各种连接效应基团与多肽或糖多肽(诸如抗体)的方法是本领域本领域已知的，且可能被用于制备并进行本发明描述的组合物和方法。在一些实施方案中，通过不同长度的间隔臂连接效应基团与结合蛋白可有用地减少例如潜在的空间位阻。
本发明也涉及制备分离的HER-3结合蛋白的方法，该方法包含自表达该蛋白的宿主细胞制备该蛋白的步骤。可被使用的宿主细胞包括但不限于杂交瘤、真核细胞(例如哺乳动物细胞如仓鼠、兔、大鼠、猪或小鼠细胞)、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如啤酒酿母菌(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞)、原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)及其他用于产生结合蛋白的细胞。多种自宿主细胞制备和分离结合蛋白(诸如支架蛋白或抗体)的方法是本领域已知的且可能被用于实施本文所描述的方法。另外，制备结合蛋白片段(例如支架蛋白片段或抗体片段)的方法，诸如木瓜酶或胃蛋白酶消化、现代克隆技术、制备单链抗体分子(Pluckthun，同上)和双价抗体(Hollinger等人，同上)的技术也为本领域的技术人员已知的且可被用于实施本文所描述的方法。
在一些实施方案中，HER-3结合蛋白可自分泌该蛋白的杂交瘤制备。见例如Kohler等人.(1975)Nature 256:495。
在一些实施方案中，HER-3结合蛋白可通过将该结合蛋白于宿主细胞中的表达优化和/或放大并自该宿主细胞分离该结合蛋白来重组制备。为达此目的，宿主细胞可由编码HER-3结合蛋白的DNA(例如载体)的转化或转染，并于产生该结合蛋白的适当条件下培养。见例如美国专利第4,816,567号。可用的宿主细胞包括例如CHO细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚胎肾293细胞、大肠杆菌细胞和啤酒酿母菌细胞。
为抗体的HER-3结合蛋白可自经基因工程化以产生完全人源的抗体的动物制备，或自噬菌体、酵母、核糖体或大肠杆菌的抗体展示库制备。见例如Clackson等人.(1991)Nature 352:624-628；Marks等人.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597；Feldhaus和Siegel(2004)J.Immunol.Methods 290:69-80；Groves和Osbourn(2005)ExpertOpin.Bioi.Ther.5:125-135；和Jostock和Dubel(2005)Comb.Chem.High ThroughputScreen 8:127-133。
在一些实施方案中，本文所提供的抗体可为完全人源或人源化的抗体。人源抗体避免了与异种抗体，诸如具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体，有关的某些问题。异种源性蛋白的存在可导致患者产生抗该抗体的免疫反应，接着导致快速清除该抗体、经由该抗体的中和而丧失治疗效用和/或严重、甚至致命的过敏反应。为了避免使用小鼠或大鼠源性抗体，完全人源的抗体可经由将功能性人源抗体基因座引入啮齿动物或其他哺乳动物或动物以使该啮齿动物、其他哺乳动物或动物产生完全人源的抗体来产生。
一种产生完全人源的抗体的方法是利用
Figure BDA0001005164300000171
品系的小鼠，该小鼠经工程化以包含人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段。其他
Figure BDA0001005164300000184
品系小鼠包含人重链基因座和κ轻链基因座的980kb和800kb大小的种系构型片段。还有其他
Figure BDA0001005164300000181
品系小鼠包含人重链基因座和κ轻链基因座的980kb和800kb大小的种系构型片段以和740kb大小的种系构型的完全人源的λ轻链基因座。见Mendez等人.(1997)Nature Genetics 15:146-156和Green和Jakobovits(1998)J.Exp.Med.188:483-495。
Figure BDA0001005164300000182
品系可得自加州千橡市(Thousand Oaks,CA)安进(Amgen)公司。
Figure BDA0001005164300000183
小鼠的产生被进一步讨论和描述于美国专利公开案2003/0217373(2002年11月20日提交)、美国专利第5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584、6,162,963、6,673,986、6,833,268和7,435,871号和日本专利第3068180B2、3068506B2和3068507B2号中。也见欧洲专利第EP 0463151号、PCT公开号WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893和WO 00/76310。上文引用的各项专利、申请和参考文献的公开内容通过引用全文并入本文。
另外，可使用”小基因座(minilocus)”法。在小基因座法中，经由纳入来自Ig基因座的片段(个别基因)以模拟外源性Ig基因座。因此，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、mu恒定区和第二恒定区(例如γ恒定区)形成用于插入动物体内的构建体。此法被描述于美国专利第5,545,806、5,545,807、5,569,825、5,591,669、5,612,205、5,625,126、5,625,825、5,633,425、5,643,763、5,661,016、5,721,367、5,770,429、5,789,215、5,789,650、5,814,318、5,874,299、5,877,397、5,981,175、6,023,010、6,255,458号，其公开内容通过引用全文并入本文。也见欧洲专利第0546073号、PCT公开号WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884，其公开内容通过引用全文并入本文。
人源抗体也可自已经由微细胞融合引入染色体的大型片段或整个染色体的小鼠产生。见欧洲专利申请案第773288和843961号，其公开内容通过引用全文并入本文。此外，已培育出KMTM小鼠，该小鼠为麒麟(Kinrin)公司的Tc小鼠与梅达莱克斯(Medarex)公司的小基因座(Humab)小鼠杂交的结果。这些小鼠具有麒麟小鼠的HC转染色体和Medarex小鼠的κ链转基因(Ishida等人.(2002)Cloning Stem Cells 4:91-102)。
人源抗体也可源自体外方法。适当实例包括但不限于噬菌体展示(如剑桥抗体技术(Cambridge Antibody Technology)公司、莫菲西斯(Morphosys)公司、戴克斯(Dyax)公司、博适(Biosite)公司/梅达莱克斯(Medarex)公司、索玛(Xoma)公司、赛门弗镇(Symphogen)公司、亚力兄(Alexion)公司(前身普利弗龙(Proliferon)公司)和阿菲姆德(Affimed)公司所商业化的)、核糖体展示(剑桥抗体技术公司所商业化的)、酵母展示和类似技术。
本发明所描述的抗体是利用下述的
Figure BDA0001005164300000191
技术制备的。该小鼠可产生人源免疫球蛋白分子和抗体，但无法产生小鼠源免疫球蛋白分子和抗体。用来达成相同目的的技术被公开于本文所公开的专利、申请和参考文献中。举例来说，转基因产生的小鼠和自该小鼠产生的抗体公开于美国专利申请第08/759,620号(1996年12月3日提交)和国际专利申请WO 98/24893(1998年6月11日公开)和WO 00/76310(2000年12月21日公开)，其公开内容通过引用全文并入本文。也见Mendez等人.(1997)Nature Genetics15:146-156，其公开内容通过引用全文并入本文。
使用本文描述的技术，可产生各种抗原的全长人源单克隆抗体。举例来说，可利用感兴趣的HER-3抗原(例如HER-3或其片段)免疫
Figure BDA0001005164300000192
小鼠，可自表达抗体的小鼠收集淋巴细胞(诸如B细胞)，并所收集的细胞系可与骨髓细胞系融合以制备永生化杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞系可经筛选和选择以确定产生对感兴趣的抗原具特异性的抗体的杂交瘤细胞系。本发明提供用于产生多重杂交瘤细胞系的方法，所述细胞系可产生对HER-3具特异性的抗体。本发明另外提供表征所述细胞系所产生的抗体的方法，包括所述抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
一般来说，由以下描述的经融合的杂交瘤所产生的抗体为人源IgG1重链和完全人源的κ轻链，虽然本文所描述的一些抗体具有人源IgG4重链以及IgG1重链。抗体也可为其他人源同种型，包括IgG2和IgG3。所述抗体通常具有高度亲和性，当以固相和细胞基底技术测量时通常具有约10-6至约10-13M或更低的KD。
本发明也提供编码如本文所述的HER-3结合蛋白的分离的核酸分子。本文所使用的术语“分离的核酸分子”是指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某些组合，其(1)不与在天然中与该“分离的多核苷酸”一起被发现的多核苷酸的全部或部分相连，(2)可操作地与在天然中不连接的多核苷酸连接，或(3)不以更大序列的部分在天然中存在。另外，本文所使用的术语“核酸分子”是指长度至少10个碱基的核苷酸的聚合的形式，不论是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰的形式，诸如具修饰或取代的糖基和类似物的核苷酸。该术语也包括单链和双链形式的DNA。
在一些实施方案中，核酸分子可与控制序列可操作地连接。本文所使用的术语“控制序列”是指影响其所连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。所述控制序列的性质依宿主生物而异。在原核生物中，所述控制序列通常包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在真核生物中，所述控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期至少包括其存在为表达和加工所必需的所有成份，且也可包括其存在具有好处的另外的成份，例如前导序列和融合头(fusion partner)序列。另外，本文所使用的术语“可操作地连接”是指所描述的成份的位置的关系允许其以预定方式发挥功能。另外，与编码序列可操作地连接的表达控制序列是以编码序列的表达在与表达控制序列相容的条件下实现的方式连接。
本发明也提供载体，所述载体包含编码如本文所公开的结合蛋白的核酸分子。该核酸分子可与控制序列可操作地连接。另外，该载体可另外包含复制起点或筛选标志基因。可被使用的载体的实例包括例如质粒、粘粒(cosmid)、噬菌体和病毒。
本发明也提供经本文所述的核酸分子或载体转化的宿主细胞。转化可利用将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法进行，包括例如将多核苷酸包装进病毒(或病毒载体)中并用该病毒(或载体)转导宿主细胞，或通过本领域已知的转染方法进行，如美国专利第4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455号所示，其公开内容通过引用全文并入本文。将异源性多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域熟知的，包含但不限于经葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、经凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封至脂质体并直接显微注射DNA至细胞核。可使用的宿主细胞的实例包括杂交瘤、真核细胞(例如哺乳动物细胞诸如仓鼠、兔、大鼠、猪、小鼠或其他动物细胞)、植物细胞(例如玉米和烟草细胞)、真菌细胞(例如啤酒酿母菌或巴斯德毕赤酵母细胞)、原核细胞诸如大肠杆菌和本领域用于产生抗体的其他细胞。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞是本领域熟知的，包括例如得自美国菌种保存中心(American Type Culture Collection；ATCC)(弗吉尼亚州马纳萨斯市)的许多永生化细胞系。这些包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉(HeLa)细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(COS)、人肝细胞性癌细胞(例如Hep G2细胞)和一些其他细胞系。
在其他实施方案中，与HER-3结合的剂是小分子化合物。所述化合物可利用例如小分子的实体或虚拟分子库鉴别。在一些实施方案中，举例来说，有用的小分子化合物可利用以已知的HER-3抑制剂和HER-3活化和无活性状态结构的模型为基础的共通虚拟筛选(consensus virtual screening)方法来鉴别。可能感兴趣的化合物可进一步分析结构新颖性和所期望的物理化学性质。经虚拟筛选鉴别的候选化合物可于体外测试例如抑制过度表达HER-3的细胞生长的能力。在其他实施方案中，有用的小分子化合物可利用高通量方法筛选大量化合物与HER-3结合和/或抑制HER-3活性的能力(例如在过度表达HER-3的细胞中)而自小分子化合物库鉴别。小分子HER-3抑制剂可利用例如标准化学合成方法合成。
在另一个实施方案中，与HER-3结合的剂可能为干扰HER-3表达的siRNA。siRNA的实例为EZN-3920(反义靶向erbB3mRNA)(丹麦赫斯霍尔姆(Hoersholm,Denmark)桑塔里斯制药(Santaris Pharma)公司)。
在又一个实施方案中，与HER-3结合的剂可能为天然物质。举例来说，一种海洋生物来源的卡哈拉肽F(Kahalalide F)已被指出能通过下调HER-3蛋白表达和AKT信号传递(Janmaat等人.(2005)Mol.Pharmacol.68:502-510)来抑制HER-3致癌信号传递(Jimeno等人.(2006)J.Translational Med.4:3)。
在其他实施方案中，与HRE-3结合的剂可为人工合成或天然存在的支架，该支架并非抗-HER-3抗体，但是具有类抗体活性(例如具有类似抗-HER-3抗体的活性)。
3.与其他HER家族成员结合的剂
如上概述，本文所提供的用于治疗HER-3相关疾病的组合物和方法包括第一剂与第二剂的组合，该第一剂与HER-3结合且该第二剂结合和/或抑制HER家族的至少一个其他成员，包括但不限于EGF-R、HER-2、HER-4。该第二剂可为但不限于生物性药物，例如结合蛋白(诸如与HER家族的成员特异性结合的抗体)、与除HER-3以外的HER家族的至少一个成员结合和/或改变(例如抑制)该成员的活性的小分子化合物、siRNA或天然物质。本文所使用的术语“其他HER家族成员”和“另一HER家族成员”是指非HER-3的HER家族成员。实例为EGF-R、HER-2和HER-4，但“HER家族成员”也包括尚未被鉴别的家族成员。
该第二剂可改变(例如增加或降低)其他HER家族成员的活性，不论经由直接影响或间接影响该HER家族成员。然而应注意的是，本文所提供的所有第二剂将对HER家族的功能和活性具有影响。
在一些情况中，举例来说，该第二剂可为可与另一个HER家族成员(例如EGF-R、HER-2或HER-4)结合的抗体，或可与另一分子结合转而影响其他HER家族成员的活性的抗体。该抗体可以例如其他HER家族成员的胞外结构域或与其任何其他适当的结构域(例如激酶结构域或二聚化结构域)为目标。
第二剂还可被进一步表征为为其对另一HER家族成员的影响减少HER介导的信号传导。HER介导的信号传导减少可能是因为例如所靶向的HER家族成员的下调导致至少部分的该HER分子自细胞消失，或经由实质上无活性的形式的该HER家族成员的稳定。另外，HER介导的信号传导减少可能是因为影响(例如减少或抑制)配体与该HER家族成员的结合、该HER家族成员与HER-3的结合或GRB2与HER-2或GRB2与SHC的结合，或是因为抑制受体酪氨酸磷酸化、AKT磷酸化、PYK2酪氨酸磷酸化或ERK2磷酸化或任何其他影响HER家族介导的信号传导途径的细胞成份所致。举例来说，HER介导的信号传导减少可通过减少包含HER-3与另一HER家族成员(例如EGF-R、HER-2或HER-4)的二聚体形成所致。无论该功能背后的机制如何，应注意的是该第二剂可用来放大靶向HER-3的第一剂的效用。
在一些实施方案中，与另一HER家族成员结合或与反过来影响另一HER家族成员的另一蛋白结合的活性的剂可为具有类抗体结合活性(例如具有类似抗-HER-3抗体的活性)的支架蛋白或抗体(例如抗-EGF-R、抗-HER-2或抗-HER-4抗体)。在本上下文中的支架蛋白和抗体如上文对于靶向HER-3的剂的定义和描述。该支架可为人工合成或天然存在的。
应注意在一些实施方案中，该与HER-3结合的第一剂和结合和/或抑制另一HER家族成员的第二剂是组合于一个化合物诸如双特异性抗体中。
同样如上文所述的，与其他HER家族成员结合或与反过来影响另一HER家族成员的活性的其他蛋白结合的蛋白的氨基酸序列并不限于20个常规氨基酸。另外，如本文所述的HER-3结合蛋白，与另一HER家族成员结合或以其他方式影响该成员的活性的剂可与效应基团偶合。
本发明也涉及制备例如可与其他HER家族成员结合的分离的蛋白(例如抗体)的方法。所述方法包括上文以HER-3结合蛋白的上下文中描述的那些。在一些实施方案中，抗体(例如分别为抗-HER、抗-HER-2或抗-HER-4抗体)可自经工程化以产生完全人源的抗体的动物制备，或自噬菌体、酵母、核糖体或大肠杆菌的抗体展示库制备。另外，直接或间接靶向另一HER家族成员的抗体可为完全人源或人源化的抗体，如上文所述。
本文也提供分离的核酸分子(例如载体)，所述核酸分子表达可与其他HER家族成员结合的蛋白和可影响其他HER家族成员的活性的其他蛋白。在所述核酸分子内的蛋白编码序列可与一个或多个如上文所述的控制序列可操作地连接。另外，核酸分子可转化或转染至如上文所述的宿主细胞中。
在一些实施方案中，该第二剂是小分子酪氨酸激酶抑制剂，条件是所述剂可(直接或间接)影响除HER-3以外的HER家族成员的活性。所述抑制剂可利用例如小分子的实体或虚拟分子库鉴别。在一些实施方案中，举例来说，有用的小分子化合物可利用以已知的酪氨酸激酶抑制剂和HER家族成员活化和无活性状态结构的模型为基础的共通虚拟筛选方法来鉴别。初步经鉴别为可能感兴趣的化合物可进一步分析结构新颖性和所期望的物理化学性质。经虚拟筛选鉴别的候选化合物可于体外测试例如抑制过度表达除HER-3以外的HER家族成员的细胞生长的能力。在其他实施方案中，有用的小分子酪氨酸激酶抑制剂可自小分子化合物库鉴别和利用高通量方法筛选大量化合物与除HER-3以外的一个或多个HER家族成员结合和/或抑制该成员活性的能力(例如在过度表达该HER蛋白的细胞中)。小分子酪氨酸激酶抑制剂可利用例如标准化学合成方法合成。
可影响EGF-R(HER)的活性的剂包括AEE-788(瑞士巴赛尔(Basel,Switzerland)诺华(Novartis)公司)、BIBW-2992(N-[4-(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(德国殷格翰(Ingelheim,Germany)百龄佳殷格翰(Boehringer Ingelheim)公司)、BMS-599626(纽约州纽约市(New York,NY)必治妥施贵宝(Bristol-Myers Squibb)公司)、BMS-690514(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、二盐酸卡耐替尼(canertinib dihydrochloride)(N-[4-[N-(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-喹唑啉-6-基]丙烯酰胺二盐酸盐)(纽约州纽约市辉瑞(Pfizer)公司)、CNX-222(麻州瓦尔珊(Waltham,MA)阿维拉治疗(Avila Therapeutics)公司)、CUDC-101(克里斯(Curis)公司，美国专利第7,547,781号)、戴默赛特(Dimercept)(加州帕罗奥图(Palo Alto,CA)受体生物逻辑(Receptor Biologix)公司)、拉帕替尼二甲苯磺酸水合物(N-[3-氯-4-[(3-氟苄基)氧基]苯基]-6-[5-[[[2-(甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]呋喃-2-基]喹唑啉-4-胺二(4-甲基苯磺酸)单水化物(英国伦敦葛兰素史克药厂(GlaxoSmithKline))、MP-412(日本大阪三菱田边制药公司(Mitsubishi Tanabe PharmaCo.))、来那替尼((2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]]-3-氰-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺)(纽泽西州麦迪逊(Madison,NJ)惠氏药厂(Wyeth))、S-222611(日本大阪盐野义药厂(Shionogi))、伐利替尼(varlitinib)(4-N-[3-氯-4-(噻唑-2-基甲氧基)苯基]-6-N-[(4R)-4-甲基-4,5-二氢噁唑-2-基]喹唑啉-4,6-二胺二(4-甲基苯磺酸盐))(科罗拉多州博尔德(Boulder,CO)数组生物制药(ArrayBioPharma)公司)、AGT-2000(加州圣莫尼卡(Santa Monica,CA)阿姆基科技(ArmeGenTechnologies)公司)、AZD-4769(英国伦敦阿斯特捷利康(AstraZeneca)公司)、BIBX-1382(德国殷格翰百龄佳殷格翰公司)、CGP-52411(4,5-二(苯基氨基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)(瑞士巴赛尔诺华公司)、CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁酰胺)(纽泽西州麦迪逊惠氏药厂)、CP-292597(纽约州纽约市辉瑞公司)、DAB-1059(日本大阪三菱田边制药公司)、埃罗替尼盐酸盐(4-(3-乙炔基苯基氨基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-喹唑啉盐酸盐(纽约州长岛OSI制药公司，美国专利第5,747,498号)、吉非替尼(gefitinib)(4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]喹唑啉)(英国伦敦阿斯特捷利康公司，美国专利第5,821,246号)、HMPL-813(香港和黄中国医药科技(HutchisonChina MediTech)公司)、MDP-01(瑞士日内瓦州(Plan-Les-Ouates,Switzerland)医学发现(Med Discovery)公司)、MT-062(明尼苏达州明尼亚波利(Minneapolis,MN)麦迪逊科技(Medisyn Technologies)公司)、ONC-101(瑞士苏黎世(Schlieren,Switzerland)昂卡利斯(Oncalis)公司)、PD-153035(4-(3-溴苯基氨基)-6,7-二甲氧基喹唑啉)(英国伦敦阿斯特捷利康公司)、PD-169540(纽约州纽约市辉瑞公司)、培利替尼(pelitinib)(纽泽西州麦迪逊惠氏药厂)、PF-299804(纽约州纽约市辉瑞公司)、PKI-166(4-(R)-苯乙基氨基-6-(羟基)苯基-7H-吡咯并[2.3-d]嘧啶)((瑞士巴赛尔诺华公司)、凡德他尼(vandetanib)(N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺)(英国伦敦阿斯特捷利康公司)、VGA-1102(日本东京大正制药(Taisho Pharmaceuticals))、WHI-P154(4-(3'-溴-4'-羟基苯基)-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉)、ZD-1838(英国伦敦阿斯特捷利康公司)、西妥昔单抗(纽约州纽约市英克隆系统(ImClone Systems)公司)、帕尼单抗(加州千橡市(Thousand Oaks,CA)安进(Amgen)公司)。
可影响HER2活性的剂包括AEE-788(瑞士巴赛尔诺华公司)、ARRY-333786(科罗拉多州博尔德数组生物制药公司)、ARRY-380(科罗拉多州博尔德数组生物制药公司)、BIBW-2992(N-[4-(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(德国殷格翰百龄佳殷格翰公司)、BMS-599626(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、BMS-690514(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、二盐酸卡耐替尼(N-[4-[N-(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-喹唑啉-6-基]丙烯酰胺二盐酸盐)(纽约州纽约市辉瑞公司)、CNF-201(加州圣地亚哥(San Diego,CA)生物基因(BiogenIdec)公司)、CNX-222(麻州瓦尔珊阿维拉治疗公司)、CP-654577(纽约州长岛OSI制药公司)、CP-724714(2-甲氧基-N-[3-[4-[3-甲基-4-(6-甲基-吡啶-3-基氧基)苯基氨基]喹唑啉-6-基]-E-烯丙基]乙酰胺)(纽约州长岛OSI制药公司)、CUDC-101(麻州剑桥(Cambridge,MA)克里斯公司，美国专利第7,547,781号)、D-69491(伊利诺伊州迪尔菲尔德(Deerfield,IL)贝克斯特国际(Baxter International)公司)、戴默赛特(加州帕罗奥图受体生物逻辑公司)、EH-102(法国巴黎艾克松以特医疗公司(ExonHit Therapeutics))、HER2拮抗剂(加州圣地亚哥圣基医疗公司(Centgent Therapeutics))、HER/neu疫苗(华盛顿州西雅图(Seattle,WA)科里沙(Corixa)公司)、赫赛姆(Herzyme)(加州旧金山小干扰RNA医疗公司(Sirna Therapeutics))、HuMax-Her2(丹麦哥本哈根Genmab公司)、INSM-18(弗吉尼亚州里奇蒙(Richmond,VA)英士美(Insmed)公司)、拉帕替尼二甲苯磺酸水合物(N-[3-氯-4-[(3-氟苄基)氧基]苯基]-6-[5-[[[2-(甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]呋喃-2-基]喹唑啉-4-胺二(4-甲基苯磺酸)单水化物(英国伦敦葛兰素史克药厂)、MP-412(日本大阪三菱田边制药公司)、mu-4-D-5(加州海边市(Oceanside,CA)基因科技(Genentech)公司)、木利替尼(mubritinib)(1-[4-[4-[[2-[(E)-2-[4-(三氟甲基)苯基]乙烯基]噁唑-4-基]甲氧基]苯基]丁基]-1H-1,2,3-三唑)(伊利诺伊州迪尔菲尔德武田制药(TakedaPharmaceuticals))、来那替尼((2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]]-3-氰-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺)(纽泽西州麦迪逊惠氏药厂)、帕妥珠单抗(加州海边市基因科技公司)、PX-103.1(丹麦哥本哈根法梅沙(Pharmexa)公司)、PX-103.2(丹麦哥本哈根法梅沙公司)、PX-104.1(丹麦哥本哈根法梅沙公司)、S-222611(日本大阪盐野义药厂)、TAK-285(伊利诺伊州迪尔菲尔德武田制药)、曲妥珠单抗(加州海边市基因科技公司)、曲妥珠单抗-DM1(麻州瓦尔珊免疫基因(ImmunoGen)公司)、伐利替尼(4-N-[3-氯-4-(噻唑-2-基甲氧基)苯基]-6-N-[(4R)-4-甲基-4,5-二氢噁唑-2-基]喹唑啉-4,6-二胺二(4-甲基苯磺酸盐))(科罗拉多州博尔德数组生物制药公司)、VM-206(明尼苏达州明尼亚波利病毒医学(ViroMed)公司)。
可影响HER4活性的剂包括戴默赛特(加州帕罗奥图受体生物逻辑公司)、来那替尼((2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]氨基]-3-氰-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺)(纽泽西州麦迪逊惠氏药厂)。
可与其他HER家族成员结合和/或改变所述成员的活性且可被用于本发明所提供的组合物和方法的剂的特定非限制性实例包括但不限于帕尼单抗(加州千橡市安进公司)、埃罗替尼(加州南旧金山基因科技公司；纽约州长岛OSI制药公司；瑞士巴赛尔罗氏(Roche)药厂)、拉帕替尼(英国伦敦葛兰素史克药厂)、帕妥珠单抗(加州南旧金山基因科技公司)、曲妥珠单抗(加州南旧金山基因科技公司)、西妥昔单抗(纽约州纽约市英克隆(ImClone)公司和纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、来那替尼(纽约州纽约市辉瑞公司)和T-DM1(加州南旧金山基因科技公司；瑞士巴赛尔罗氏药厂)、吉非替尼(英国伦敦阿斯特捷利康公司和以色列佩克提克瓦市(Petah Tikva)迪瓦(Teva)公司)。这些药物在下文更详细地描述。
帕尼单抗的商品名为
Figure BDA0001005164300000261
其是对EGF-R具特异性的完全人源的单克隆抗体。在一些实施方案中，用于治疗HER3相关疾病的组合可为U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62与帕尼单抗的组合，或U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62与帕尼单抗的组合，用于治疗肿瘤疾病诸如癌。可利用所述组合治疗的癌类型的实例为乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌和鳞状细胞癌。
埃罗替尼(商品名得舒缓TM(TARCEVATMTM))是用于治疗NSCLC、胰癌和数种其他类型的癌的药物。埃罗替尼特异性地靶向EGF-R酪氨酸激酶，与该受体的ATP结合位点可逆地结合。在一些实施方案中，用于治疗HER-3相关疾病的组合物可为U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与埃罗替尼的组合、或U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与埃罗替尼和其他药剂的组合，用于治疗肿瘤疾病诸如癌，包括但不限于乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌或鳞状细胞癌。在一些优选的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与埃罗替尼的组合可在至少一种先前的化学治疗方案失败后用于治疗患有癌症的患者，包括局部晚期非小细胞肺癌(NSCLC)、局部晚期NSCLC和转移性NSCLC。
拉帕替尼(商品名泰嘉锭(Tykerb))是用于治疗实体肿瘤诸如乳癌的口服活性小分子。拉帕替尼是双重酪氨酸激酶抑制剂，其抑制与EGF-R和HER2/neu(人第2型EGF-R)有关的酪氨酸激酶活性。在一些实施方案中，用于治疗HER-3相关疾病的组合物可为U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与拉帕替尼的组合、或U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与拉帕替尼和其他药剂诸如卡培他滨的组合，用于治疗肿瘤疾病诸如癌，其中所述癌为例如乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌或鳞状细胞癌。在一些优选的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与拉帕替尼的组合或与拉帕替尼和卡培他滨的组合可被用于治疗患有癌包括乳癌和转移性乳癌的患者，所述患者的肿瘤表达或过度表达HER-2蛋白且该患者先前接受化学治疗包括蒽环类(例如多柔比星(doxorubicin)或相关药剂)和/或紫杉烷(taxane)(例如紫杉醇或多西紫杉醇(docetaxel))和曲妥珠单抗。
曲妥珠单抗(又名贺癌平
Figure BDA0001005164300000291
(
Figure BDA0001005164300000292
))是干扰HER2/neu受体的人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，用于治疗HER-3相关疾病的组合物可为U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与曲妥珠单抗的组合、或U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与曲妥珠单抗和其他药剂诸如多西紫杉醇或紫杉醇的组合以治疗肿瘤疾病诸如癌，诸如乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌或鳞状细胞癌。在一些优选的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与曲妥珠单抗和紫杉醇的组合或与曲妥珠单抗和多西紫杉醇的组合可被用于治疗患有癌包括乳癌和转移性乳癌的患者，所述患者的肿瘤表达或过度表达HER-2蛋白且该患者的(转移性)疾病先前未接受化学治疗。
T-DM1是一种抗体-药物的轭合物，该轭合物包括曲妥珠单抗和经化学连接的源自美登素的强效抗微管药物(DM1)。美登素已被当作游离药物使用，并在例如乳癌和肺癌病患中显示疗效。抗还原的硫醚MCC连接剂被用于T-DM1，以提供曲妥珠单抗与DM1间的稳定的键，延长暴露和减少T-DM1的毒性同时维持活性。在一些实施方案中，用于治疗HER-3相关疾病的方法可包括施用U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与T-DM1的组合(例如同时或分别)、或U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与T-DM1和其他药剂诸如多西紫杉醇或紫杉醇的组合以治疗肿瘤疾病诸如癌，包括癌症诸如胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌包括非小细胞肺癌、结直肠癌和/或乳癌包括转移性乳癌。在一些优选的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与T-DM1和紫杉醇的组合或与T-DM1和多西紫杉醇的组合可被用于治疗患有癌包括乳癌和转移性乳癌的患者，该患者的肿瘤表达或过度表达HER-2蛋白且该患者的(转移性)疾病先前未接受化学治疗。
帕妥珠单抗(2C4)(商品名或可能的商品名为奥密塔克(OMNITARGTMTM))是抑制HER2与其他HER受体二聚化的单克隆抗体。在一些实施方案中，用于治疗HER-3相关疾病的组合物可为U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与帕妥珠单抗的组合、或U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与帕妥珠单抗和其他药剂的组合，用于治疗肿瘤疾病诸如癌，包括例如乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌和鳞状细胞癌。
西妥昔单抗(商品名为尔必得舒
Figure BDA0001005164300000331
)是与EGF-R结合和抑制EGF-R的嵌合性(小鼠/人源)单克隆抗体。在一些实施方案中，用于治疗HER-3相关疾病的组合物可为U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与西妥昔单抗的组合、或U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与西妥昔单抗的组合，用于治疗肿瘤疾病诸如癌，包括例如乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌和鳞状细胞癌。在一些优选的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与西妥昔单抗和伊立替康(irinotecan)的组合可在5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)基础的化学治疗失败后被用于治疗患有癌症包括结直肠癌和转移性结直肠癌的患者。
吉非替尼(商品名为艾瑞莎
Figure BDA0001005164300000341
)是作用方式与埃罗替尼类似的药物。吉非替尼选择性地抑制EGF-R的酪氨酸激酶结构域。在一些实施方案中，用于治疗HER-3相关疾病的组合物可为U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与吉非替尼的组合、或U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与吉非替尼和其他药剂的组合，用于治疗肿瘤疾病诸如癌，包括例如乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌和鳞状细胞癌。
来那替尼是HER-2受体酪氨酸激酶的抑制剂。来那替尼明显地通过靶向该受体的ATP结合袋中的半胱氨酸残基不可逆地与HER-2受体结合由此减少细胞的自体磷酸化。以来那替尼治疗细胞导致下游信号传导事件和细胞周期调节通路的抑制，使细胞周期停止于G1-S-转换期，并最终减少细胞的增殖。此外，来那替尼抑制EGF-R激酶和EGF-R依赖性细胞的增殖。在一些实施方案中，用于治疗HER-3相关疾病的方法可包括施用U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与来那替尼的组合(例如同时或分别)、或U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、U1-14、U1-15、U1-16、U1-17、U1-18、U1-19、U1-20、U1-21、U1-22、U1-23、U1-24、U1-25、U1-26、U1-27、U1-28、U1-29、U1-30、U1-31、U1-32、U1-33、U1-34、U1-35、U1-36、U1-37、U1-38、U1-39、U1-40、U1-41、U1-42、U1-43、U1-44、U1-45、U1-46、U1-47、U1-48、U1-49、U1-50、U1-51、U1-52、U1-53、U1-55.1、U1-55、U1-57.1、U1-57、U1-58、U1-59、U1-61.1、U1-61或U1-62、U1-49、U1-53或U1-59与来那替尼和其他药剂的组合以治疗肿瘤疾病诸如癌，包括例如胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌包括非小细胞肺癌、结直肠癌和/或乳癌包括转移性乳癌。
4.可用于本文所公开的组合物和方法中的其他剂
其他药剂可被添加至如本文所公开的分别与HER-3结合和与另一HER家族成员结合和/或抑制该成员的第一剂和第二剂。在一些实施方案中，这些药剂将为化学治疗药物。可用于本文所公开的组合物和方法中的其他药剂也可被用来作为第二剂以代替本发明中与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员的药剂。换句话说，与HER-3结合的第一剂在某些治疗中可与下列所述的其他药剂中的任何一种组合使用，而不使用或取代与另一HER家族成员结合和/或抑制该成员的所述第二剂。
举例来说，作用为微管刺激剂的药物包括NK-105(紫杉醇)[(-)-(1S,2R,3S,4S,5R,7S,8S,10R,13S)-4,10-二乙酰氧基-2-苯甲酰氧基-5,20-环氧基-1,7-二羟基-9-氧代紫杉-11-烯-13-基(2R,3S)-3-苯甲酰基氨基-2-羟基-3-苯基丙酸酯](日本千叶县纳米载体(NanoCarrier)株式会社)、米拉紫杉醇(milataxel)(1,10β-二羟基-9-氧代-5β,20-环氧基-3ζ-紫杉-11-烯-2α,4,7β13α-四基4-醋酸酯2-苯甲酸酯13-[(2R,3R)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(呋喃-2-基)-2-羟基丙酸]7-丙酸酯)(纽泽西州费尔菲尔德(Fairfield,NJ)泰森洛克(Taxolog)公司)、洛利玛内酯(laulimalide)(加州海沃德市(Hayward,CA)柯森生物科技(Kosan Biosciences)公司(必治妥施贵宝公司))、珊瑚素A(sarcodictyin A)(3-(1-甲基咪唑-4-基)-2(E)-丙烯酸(1R,4aR,6S,7S,10R,12aR)-11-甲氧基羰基-7,10-环氧基-10-羟基-1-异丙基-4,7-二甲基-1,2,4a,5,6,7,10,12a-八氢苯并环十二烯-6-基酯)(纽约州纽约市辉瑞药厂)、司莫紫杉醇(simotaxel)((2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-4,11-二羟基-4a,8,13,13-四甲基-5-氧代-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-十二氢-7,11-甲撑-1H-环癸[3,4]苯并[1,2-b]氧杂环丁烯-6,9,12,12b-四基12b-醋酸酯12-苯甲酸酯6-环戊烷羰酸酯9-[(2R,3R)-2-羟基-3-[[(1-甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-(苯硫-2-基)丙酸酯])(纽泽西州费尔菲尔德泰森洛克公司)、SYN-2001(法国尼斯(Nice,France)CLL制药(CLL Pharma)公司)、TL-310(纽泽西州费尔菲尔德泰森洛克公司)、TL1836(纽泽西州费尔菲尔德泰森洛克公司)、泰丝紫杉醇(tesetaxel)(2'-[(二甲基氨基)甲基]-1-羟基-5β,20-环氧基-9α,10α-二氢[1,3]二噁唑[4',5':9,10]紫杉-11-烯-2α,4,13α-三基4-醋酸酯2-苯甲酸酯13-[(2R,3S)-3-[(三级-丁氧基羰基)氨基]-3-(3-氟吡啶-2-基)-2-羟基丙酸酯)(日本东京第一三共(Daiichi Sankyo)株式会社)、TL-1892(纽泽西州费尔菲尔德泰森洛克公司)、TPI-287((2'R,3'S)-2'-羟基-N-羧基-3'-氨基-5'-甲基-己酸，N-叔丁酯，13酯5β-20-环氧基-1,2α,4,7β,9α,10α,13α-庚羟基-4,10-二醋酸酯-2-苯甲酸酯-7,9-丙烯醛缩醛-紫杉-11-烯(科罗拉多州博尔德泰琵翠(Tapestry)制药公司)、欧塔紫杉醇(ortataxel)(2aR-[2aα,4β,4aβ,6β,9α(2R,3S),10β,11β,12α,12aα,12bα]-3-(叔丁氧基羰基氨基)-2-羟基-5-甲基-己酸6,12b-二乙酰氧基-12-苯甲酰氧基-10,11-羰基二氧基-4-羟基-4a,8,13,13-四甲基-5-氧代-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-十二氢-1H-7,11-甲撑环癸-[3,4]苯并[1,2-b]氧杂环丁-9-基酯)(意大利米兰意迪那(Indena)公司)、聚谷氨酸紫杉醇(palitaxel poliglumex)(L-焦谷氨酰聚-L-谷氨酰基-L-谷氨酸，用(1R,2S)-2-(苯甲酰氨基)-1-[[[(2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-二(乙酰氧基)-12(苯甲酰氧基)-4,11-二羟基-4a,8,13,13-四甲基-5-氧代-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-十二氢-7,11-甲撑-1H-环癸[3,4]苯并[1,2-b]氧杂环丁-9-基]氧基]羰基]-2-苯基乙基部分γ-酯化)(华盛顿州西雅图市细胞治疗(Cell Therapeutics)公司)、紫杉醇蛋白结合颗粒(太平洋紫杉醇：(-)-(1S,2R,3S,4S,5R,7S,8S,10R,13S)-4,10-二乙酰氧基-2-苯甲酰氧基-5,20-环氧基-1,7-二羟基-9-氧代紫杉-11-烯-13-基(2R,3S)-3-苯甲酰基氨基-2-羟基-3-苯基丙酸酯)(加州洛杉矶阿博利斯生物科学(AbraxisBioScience)公司)、紫杉醇(NCI)((-)-(1S,2R,3S,4S,5R,7S,8S,10R,13S)-4,10-二乙酰氧基-2-苯甲酰氧基-5,20-环氧基-1,7-二羟基-9-氧代紫杉-11-烯-13-基(2R,3S)-3-苯甲酰基氨基-2-羟基-3-苯基丙酸酯)(NCI(NIH))、紫杉醇(伊利诺伊州布勒夫湖(Lake Bluff,IL)尼奥制药(NeoPharm)公司)((-)-(1S,2R,3S,4S,5R,7S,8S,10R,13S)-4,10-二乙酰氧基-2-苯甲酰氧基-5,20-环氧基-1,7-二羟基-9-氧代紫杉-11-烯-13-基(2R,3S)-3-苯甲酰基氨基-2-羟基-3-苯基丙酸酯)(伊利诺伊州布勒夫湖尼奥制药公司)、帕土匹龙(patupilone)((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)-7,11-二羟基-8,8,10,12,16-五甲基-3-[(1E)-1-(2-甲基-1,3-噻唑-4-基)丙-1-烯-2-基]-4,17-二氧杂双环[14.1.0]十七烷-5,9-二酮)(美国专利公开号2003/0104625，瑞士巴赛尔诺华公司)、PEG-紫杉醇(纽约州长岛恩佐制药(Enzo Pharmaceuticals))、多西紫杉醇水合物((-)-(1S,2S,3R,4S,5R,7S,8S,10R,13S)-4-乙酰氧基-2-苯甲酰氧基-5,20-环氧基-1,7,10-三羟基-9-氧代紫杉-11-烯-13-基(2R,3S)-3-叔丁氧基羰基氨基-2-羟基-3-苯基丙酸酯三水合物)(纽泽西州博利巨瓦特(Bridgewater,NJ)赛诺菲安万特(Sanofi-Aventis))、艾榴塞洛素(eleutherobin)(3-(1-甲基咪唑-4-基)-2(E)-丙烯酸(1R,4aR,6S,7S,10R,12aR)-11-(2-O-乙酰基-β-D-吡喃阿拉伯糖基氧基甲基)-7,10-环氧基-1-异丙基-10-甲氧基-4,7-二甲基-1,2,4a,5,6,7,10,12a-八氢苯并环十二烯-6-基酯)(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、IDN-5390(意大利米兰意迪那公司)、伊莎匹龙(ixabepilone)((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)-7,11-二羟基-8,8,10,12,16-五甲基-3-[(1E)-1-甲基-2-(2-甲基噻唑-4-基)乙烯基]-17-氧杂-4-吖双环[14.1.0]十七烷-5,9-二酮)(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、KOS-1584(加州海沃德市柯森生物科技公司(必治妥施贵宝))、KOS-1803(17-异-噁唑26-三氟-9,10-去氢-12,13-脱氧-埃博霉素(epothilone)B)(加州海沃德市柯森生物科技公司(必治妥施贵宝))、KOS-862(加州海沃德市柯森生物科技公司(必治妥施贵宝)；美国专利第6204388和6303342号)、拉罗紫杉醇(larotaxel)(1-羟基-9-氧代-5β,20-环氧基-7β,19-环紫杉-11-烯-2α,4,10β,13α-四基4,10-二醋酸酯2-苯甲酸酯13-[(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)氨基]-2-羟基-3-苯基丙酸酯]去水物)(纽泽西州博利巨瓦特赛诺菲安万特，PCT公开号WO 95/26961和WO 96/1259)、ANG-1005(血管肽素(Angiopep)-2/太平洋紫杉醇轭合物)(加拿大蒙特娄血管化学(AngioChem)公司，美国专利第7557182号)、BMS-184476(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司，EP公开号639577)、BMS-188797(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、BMS-275183(3'-叔丁基-3'-N-叔丁基氧基羰基-4-去乙酰基-3'-去苯基-3'-N-去苯甲酰基-4-O-甲基氧基羰基-紫杉醇)(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、BMS-310705(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、BMS-753493(纽约州纽约市必治妥施贵宝公司)、卡巴西紫杉醇(cabazitaxel)(1-羟基-7β,10β-二甲氧基-9-氧代-5β,20-环氧基紫杉-11-烯-2α,4,13α-三基4-醋酸酯2-苯甲酸酯13-[(2R,3S)-3-[(叔丁氧基)羰基]氨基]-2-羟基-3-苯基丙酸酯])(纽泽西州博利巨瓦特赛诺菲安万特)、DHA-太平洋紫杉醇(宾州普鲁士王市(King of Prussia,PA)普塔加(Protarga)公司，
Figure BDA0001005164300000391
)、盘皮海绵内酯(disermolide)([3S[3α,4β,5β,6α(2R*,3Z,5R*,6R*,7S*,8Z,11R*,12S*,13S*,14S*,15R*,16E)]]-6[14[(氨基羰基)氧基]-2,6,12-三羟基-5,7,9,11,13,15-六甲基-3,8,16,18-十九碳四烯基]四氢-4-羟基-3,5-二甲基-2H-哌喃-2-酮)(瑞士巴赛尔诺华，美国专利第4939168和5681847号)。这些微管刺激剂当中有些的化学结构具有紫杉烷环；所述具有紫杉烷环的化合物在本文称为“紫杉烷”。
蒽环类包括放线菌素诸如放线菌素D(达克霉素(dactinomycin)：2-氨基-N,N'-双[(6S,9R,10S,13R,18aS)-6,13-二异丙基-2,5,9-三甲基-1,4,7,11,14-五氧代十六氢-1H-吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13]恶四氮杂环十六炔-10-基]-4,6-二甲基-3-氧代-3H-吩噁嗪-1,9-二甲酰胺)、博来霉素(bleomycin)(盐酸博来霉素：(3-{[(2'-{(5S,8S,9S,10R,13S)-15-{6-氨基-2-[(1S)-3-氨基-1-{[(2S)-2,3-二氨基-3-氧代丙基]氨基}-3-氧代丙基]-5-甲基嘧啶-4-基}-13-[{[(2R,3S,4S,5S,6S)-3-{[(2R,3S,4S,5R,6R)-4-(胺甲酰基氧基)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-哌喃-2-基]氧基}-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-哌喃-2-基]氧基}(1H-咪唑-5-基)甲基]-9-羟基-5-[(1R)-1-羟基乙基]-8,10-二甲基-4,7,12,15-四氧代-3,6,11,14-四氮杂十五-1-基}-2,4'-二-1,3-噻唑-4-基)羰基]氨基}丙基)(二甲基)锍)、盐酸正定霉素(daunorubicin)(正定霉素：8S-顺)-8-乙酰基-10-((3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-己吡喃糖基)氧基)-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-稠四苯二酮盐酸盐)、多柔比星(doxorubicin)盐酸盐(多柔比星：(8S,10S)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧基-α-L-来苏-己吡喃糖基)氧基]-8-乙醇酰-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-稠四苯二酮盐酸盐)(加州山景城(Mountain View,CA)艾尔莎(Alza)公司)、伊达比星(idarubicin)盐酸盐((7S,9S)-9-乙酰基-7,8,9,10-四氢-6,7,9,11-四羟基-7-O-(2,3,6-三脱氧-3-氨基-α-L-来苏-己吡喃糖基)-5,12-稠四苯二酮盐酸盐)(纽约州纽约市辉瑞，美国专利第4046878和4471052号)和丝裂霉素(mitomycin)((1aS,8S,8aR,8bR)-6-氨基-4,7-二氧代-1,1a,2,8,8a,8b-六氢-8a-甲氧基-5-甲基吖丙啶并[2,3:3,4]吡咯并[1,2-α]吲哚-8-基甲基氨基甲酸酯)(日本东京协和酦酵麒麟(Kyowa-Hakko-Kirin)公司)。
顺铂和吉西他滨为化学治疗剂。顺铂或顺-二氨二氯铂(II)是用于治疗各种类型的癌的铂基药物。顺铂铂复合物在体内反应，与DNA结合并造成DNA的交联，最后引发细胞凋亡。吉西他滨是核苷类似物，其中在脱氧胞苷的2'碳上的氢原子被氟原子取代。如同氟尿嘧啶和其他嘧啶类似物，吉西他滨在DNA复制时取代胞苷，这停止肿瘤生长，因为其他核苷无法与该“错误”的核苷连接，导致细胞凋亡。吉西他滨是以健泽
Figure BDA0001005164300000401
的商品名由礼来公司(Eli Lilly and Company)上市(印第安纳州印第安纳波利斯市)。在一些实施方案中，用于治疗HER3-相关疾病的组合可为U1-49、U1-53或U1-59与本文所述的第二剂和顺铂或吉西他滨及其他剂的组合，用于治疗为胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌包括非小细胞肺癌、结直肠癌和/或乳癌包括转移性乳癌的癌。
卡培他滨(戊基[1-(3,4-二羟基-5-甲基-四氢呋喃-2-基)-5-氟-2-氧代-1H-嘧啶-4-基]氨基甲酸酯，截瘤达(Xeloda)，罗氏(Roche)药厂)是口服施用的化学治疗剂。卡培他滨是于肿瘤中被酶转换成5-氟尿嘧啶的前药，其抑制DNA合成并推迟肿瘤组织的生长。在一些实施方案中，用于治疗HER3-相关疾病的组合可为U1-49、U1-53或U1-59与本文所述的第二剂(例如拉帕替尼)和卡培他滨的组合，用于治疗癌，其中该癌是胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌包括非小细胞肺癌、结直肠癌和/或乳癌包括转移性乳癌的癌。在一些情况中，该组合可在例如蒽环类或紫杉烷的先前治疗失败后施用。在一些优选的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与拉帕替尼及卡培他滨的组合可被用于治疗患有癌包括乳癌及转移性乳癌的患者，所述患者的肿瘤表达或过度表达HER-2蛋白且该患者先前接受化学治疗包括蒽环类(例如多柔比星或相关药剂)和/或紫杉烷(例如紫杉醇或多西紫杉醇)及曲妥珠单抗。
多西紫杉醇((2R,3S)-N-羧基-3-苯基异丝氨酸，N-叔丁基酯，13-酯及5,20-环氧基-1,2,4,7,10,13-六羟基紫杉-11-烯-9-酮4-醋酸酯2-苯甲酸酯，三水合物)及紫杉醇(paclitaxel)((2α,4α,5β,7β,10β,13α)-4,10-二(乙酰氧基)-13-{[(2R,3S)-3-(苯甲酰氨基)-2-羟基-3-苯基丙酰基]氧基}-1,7-二羟基-9-氧代-5,20-环氧基紫杉-11-烯-2-基)是化学治疗剂。多西紫杉醇以克癌易(Taxotere)的商品名由赛诺菲安万特上市。紫杉醇以汰癌胜(Taxol)的商品名由必治妥施贵宝上市。在汰癌胜的制剂中，紫杉醇溶解于作为递送剂的Cremophor EL和乙醇中。其中紫杉醇与白蛋白结合的制剂以阿布艾西(abraxane)上市。在一些实施方案中，用于治疗HER3-相关疾病的组合可为U1-49、U1-53或U1-59与本文所述的第二剂(例如曲妥珠单抗)及多西紫杉醇或紫杉醇及其他剂诸如曲妥珠单抗的组合，用于治疗癌，其中该癌为胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌包括非小细胞肺癌、结直肠癌和/或乳癌包括转移性乳癌的癌。在一些优选的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与曲妥珠单抗及紫杉醇的组合、与T-DM1及紫杉醇的组合、与曲妥珠单抗及多西紫杉醇的组合、或与T-DM1及多西紫杉醇的组合可被用于治疗患有癌包括乳癌及转移性乳癌的患者，所述患者的肿瘤表达或过度表达HER-2蛋白且该患者的(转移性)疾病先前未接受化学治疗。
多柔比星盐酸盐脂质体注射液以多喜(Doxil)上市，其为包含多柔比星氯化物的脂质体制剂。在一些实施方案中，HER-3-相关疾病的组合治疗可包括施用U1-49、U1-53或U1-59与本文所述的第二剂及多柔比星盐酸盐脂质体注射液的组合，其含有或不含一种或多种其他剂诸如紫杉醇或铂基化学治疗剂，用于治疗癌诸如乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌及鳞状细胞癌。在一些优选的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与多柔比星HCl脂质体注射液(多喜)的组合可用于治疗患有癌包括卵巢癌的患者，该患者的疾病已进行或在铂基的化学治疗后复发。
伊立替康盐酸盐水合物(伊立替康：(+)-(4S)-4,11-二乙基-4-羟基-9-[(4-哌啶基哌啶基)羰基氧基]-1H-哌喃[3',4':6,7]氮茚[1-2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮盐酸三水合物)(养乐多公司，EP公开号137145及56692)以抗癌妥(Campto)、坎普士沙(Camptosar)及艾肯(Ircan)上市。在一些实施方案中，HER-3-相关疾病的组合治疗可包括施用U1-49、U1-53或U1-59与本文所述的第二剂及伊立替康盐酸水合物的组合，或U1-49、U1-53或U1-59与本文所述的第二剂、伊立替康盐酸水合物及一种或多种其他剂诸如5-FU(5'-脱氧-5-氟尿苷或5-氟-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮)、甲酰四氢叶酸钙(N-[4-[[(2-氨基-5-甲酰基-1,4,5,6,7,8-六氢-4-氧代-6-喋啶基)甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸钙盐(1:1))或左甲酰四氢叶酸钙((-)-钙N-[4-[[[(6S)-2-氨基-5-甲酰基-1,4,5,6,7,8-六氢-4-氧代-6-喋啶基]甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸盐)及其组合的组合，用于治疗癌诸如乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌及鳞状细胞癌。
在一些优选的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与5-氟尿嘧啶基的化学治疗的组合可在5-氟尿嘧啶基的化学治疗失败后被用于治疗患有癌症包括结直肠癌及转移性结直肠癌的患者。在一些其他的实施方案中，U1-49、U1-53或U1-59与西妥昔单抗及伊立替康的组合可在5-氟尿嘧啶基的化学治疗失败后被用于治疗患有癌症包括具有野生型K-RAS的结直肠癌及转移性结直肠癌的患者。
在一些实施方案中，用于本文所公开的组合物及方法中的另外的剂可与本文公开的第二剂交换，其可为不是抗体但具有类抗体活性(例如具有类似抗体的活性)的人工合成或天然存在的支架。
在一些其他实施方案中，可与本文所公开的第二剂交换的另外的剂可为抑制、阻断或减少(如拮抗剂的作用)或活化、刺激或增进(如激动剂的作用)其他靶的活性的剂，所述靶包括但不限于影响细胞生长和/或存活途径的那些，诸如PI3K抑制剂、AKT抑制剂、mTOR抑制剂、RAF/B-RAF抑制剂、RAS抑制剂、MEK抑制剂、死亡受体抑制剂包括DR4及DR5激动剂诸如抗-DR4或DR5激动抗体(例如西利珠单抗(cedelizumab)、提卡珠单抗(tigatuzumab)、多西路单抗(drozirumab)、康纳土单抗(conatumumab))、PPARγ激动剂(例如伊夫塔酮(efatutazone)、曲格列酮(troglitazone)、匹格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone))、c-MET抑制剂、Hsp-90抑制剂及端粒酶抑制剂。
在一些其他实施方案中，可与本文所公开的第二剂交换的另外的剂可为抗血管生成剂，包括但不限于VEGF拮抗剂/抑制剂(例如贝伐珠单抗(bevacizumab)、凡德他尼(vandetanib))。
在一些其他实施方案中，可与本文所公开的第二剂交换的另外的剂可为免疫治疗剂诸如疫苗或细胞治疗剂。
如以下进一步说明，这些及其他剂可被包含于本文所提供的组合物，且可以各种不同形式、组合及剂量被施用。
5.组合物
本发明也提供包含如本文所述的HER-3结合剂与第二剂的组合以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂的药物组合物，该第二剂定向抗另一HER家族蛋白或为化学治疗化合物。本文所使用的术语“药物组合物”是指当适当地施用至患者可引发所期望的治疗效果的化学化合物或组合物(The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (化学术语的McGraw-Hill字典),Parker编辑,McGraw-Hill,San Francisco(1985))。本发明所提供的药物组合物的效价通常根据至少一种结合蛋白与HER-3的结合而定。在一些实施方案中，此结合可导致HER-3介导的信号传导减少。
“药学上可接受的载体”(本文又名“赋形剂”或“载体”)是指药学上可接受的溶剂、悬浮剂、稳定剂或任何其他用于递送一种或多种治疗化合物(例如HER结合蛋白)至受治疗者的药理惰性载体，该剂对于暴露在其使用剂量和浓度下的细胞或哺乳动物无毒性。药学上可接受的载体可为液体或固体，可根据预先计划的施用方式选择，以在与一种或多种治疗化合物及给定药物组合物的任何其他成份组合时提供所期望的体积、稠度及其他有关的运送及化学性质。不与氨基酸有害地反应的典型药学上可接受的载体包括，例如但不限于：水、盐水溶液、结合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮或羟基丙基甲基纤维素)、填料(例如乳糖及其他糖类、明胶或硫酸钙)、润滑剂(例如淀粉、聚乙二醇或醋酸钠)、崩解剂(例如淀粉或乙醇酸淀粉钠)及润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。药学上可接受的载体也包括水性pH缓冲溶液或脂质体(由各种类型的脂肪、磷脂质和/或界面活性剂组成的囊胞，其可被用于递送药物至哺乳动物)。药学上可接受的载体的其他实例包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂诸如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、双醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露醇或山梨醇；成盐反离子诸如钠；和/或非离子性表面活性剂诸如吐温(TWEENTMTM)、聚乙二醇(PEG)及普卢兰尼克(PLURONICSTMTM)。
脂质体是具有自亲脂性物质形成的膜及可包含有待递送的组合物的水性内部空间的囊胞。脂质体可因为其特异性及它们从药物递送的立场而言所提供的作用持续时间而特别有用。脂质体组合物可自例如磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油或二油酰基磷脂酰乙醇胺形成。各种亲脂性剂可自商业途径获得，包括
Figure BDA0001005164300000441
(加州卡斯巴德市英维特基(Invitrogen)公司/生命技术)及EFFECTENETMTM(加州瓦伦西亚(Valencia,CA)凯杰(Qiagen)公司)。
在一些实施方案中，至少一种包含在药物组合物中的剂(例如HER-3结合剂或与另一HER家族成员结合和/或抑制该成员的剂)可与效应子诸如刺孢霉素、双联霉素(duocarmycin)、耳抑素、类美登素(maytansinoid)、放射性同位素或毒性化学治疗剂诸如格尔德霉素及美登素偶合。所述轭合物可特别有用地以表达HER-3的细胞(例如癌细胞)为靶。
使结合蛋白与放射性同位素连接可提供肿瘤治疗的好处。与化学治疗及其他形式的癌治疗不同的是，放射性免疫治疗或施用放射性同位素-结合蛋白的组合可直接以癌细胞为靶，因此对周围正常健康组织的伤害最小。利用这种”神奇子弹”，患者可以远少于目前可用的其他形式的治疗的放射性同位素的量治疗。适当的放射性同位素包括例如钇90(90Y)、铟111(111In)、131碘、99锝、放射性银-111、放射性银-199及铋213。放射性同位素与结合蛋白的连接可利用例如常规双官能性螯合剂进行。由于银为单价，因此在连接放射性银-111及放射性银-199时可使用硫基的连接剂(Hazra等人.(1994)Cell Biophys.24-25:1-7)。银放射性同位素的连接可能涉及用抗坏血酸还原免疫球蛋白。另外，替坦(tiuxetan)是一种与伊莫单抗连接以形成替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(泽娃灵(Zevalin))的MX-DTPA连接螯合剂(Witzig(2001)Cancer Chemother.Pharmacol.48(增刊1):91-95)。替伊莫单抗可分别与放射性同位素诸如铟111(111In)或90Y反应以形成111In-替伊莫单抗及90Y-替伊莫单抗。
本文所描述的结合蛋白特别是用于治疗癌时可与毒性化学治疗剂轭合，诸如类美登素(Hamann等人.(2002)Bioconjug.Chem.13:40-46)、格尔德霉素(Mandler等人.(2000)J.Natl.Cancer Inst.92:1549-1551)及类美登素例如类美登素药物DM1(Liu等人.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.US 93:8618-8623)。在酸性或还原条件下或暴露至特定蛋白酶时释放该药物的连接剂可被用于此技术。结合蛋白可如本领域中所描述的来轭合。
在一些实施方案中，结合蛋白可与耳抑素-PE轭合。耳抑素-PE是一种抗微管剂，其为海洋无壳软件动物肽组份多拉司他汀10的结构修饰物。耳抑素-PE具有抗肿瘤及抗肿瘤血管两种活性(Otani等人.(2000)Jpn.J.Cancer Res.91:837-44)。举例来说，耳抑素-PE抑制胰癌细胞系的细胞生长并诱发细胞周期停止及细胞凋亡(Li等人.(1999)Int.J.Mol.Med.3:647-53)。因此，为了使耳抑素-PE的抗肿瘤活性及抗肿瘤血管活性特异性地靶向特定肿瘤，耳抑素-PE可与本发明所提供的结合蛋白轭合。
本文所提供的药物组合物也可包含至少一种其他活性剂。其他活性剂的实例包括其他受体蛋白激酶诸如IGFR-1及c-met，受体配体诸如血管内皮生长因子(VEGF)的抗体或低分子量抑制剂，细胞毒性剂诸如多柔比星、顺铂或卡铂，细胞因子或抗癌剂。许多抗癌剂为本领域已知的。在一些实施方案中，抗癌剂可选自治疗性蛋白，包括但不限于抗体及免疫调节蛋白。在一些实施方案中，抗癌剂可选自小分子抑制剂及化学治疗剂，包括有丝分裂抑制剂、激酶抑制剂、烷基化剂、抗代谢剂、嵌合抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓朴异构酶抑制剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂、抗存活剂、生物反应调节剂、抗激素剂(例如抗雄激素剂)、微管刺激剂、蒽环类及抗血管生成剂。当该抗癌剂为放射线时，治疗可经体内来源(例如近距离治疗)或体外来源(例如体外放射线治疗)实现。该一种或多种其他活性剂与该HER-3结合剂和第二剂可以单一制剂或以每种活性剂的个别(分别)制剂同时或分别施用。
本文提供的药物组合物特别适合用于诊断、预防或治疗过度增殖性疾病。该过度增殖性疾病可能与HER家族信号传导增加有关。特别是该疾病可与HER-3磷酸化增加、HER-3与其他HER家族成员之间复合物形成增加、PI3激酶活性增加、c-jun末端激酶活性和/或AKT活性增加、ERK2和/或PYK2活性增加或其任何组合有关。该过度增殖性疾病可为例如选自乳癌、胃肠癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤或其他HER-3表达或过度表达的癌及肿瘤转移的形成。
药物组合物可通过混合一种或多种活性剂与一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂及通常被包含在制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性和类似性质的可任意选择的其他剂来配制。药物组合物可被配制成例如冷冻干燥制剂、水溶液、分散液或固体制剂诸如锭剂、糖衣锭或胶囊。许多适当的制剂可见于所有药剂化学师所熟知的药典：Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药学)(第18版,Mack PublishingCompany,Easton,PA(1990))，特别是其中由Block,Lawrence所著的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊料、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)囊胞(诸如LIPOFECTINTMTM)、DNA轭合物、无水吸收糊料、水包油和油包水乳液、乳液碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡的半固体混合物。前述混合物中的任一种可适用于本文所述的治疗及疗法，条件是该制剂中的活性剂不会被该制剂失活且该制剂与施用途径是生理上可相容且可耐受的。也见Baldrick(2000)Regul.Toxicol.Pharmacol.32:210-218；Wang(2000)Int.J.Pharm.203:1-60；Charman(2000)J.Pharm.Sci.89:967-978；及Powell等人.(1998)PDA J.Pharm.Sci.Technol.52:238-311；以及药剂化学师所熟知的关于制剂、赋形剂及载体的其他信息的引用文献。
本发明还涉及本文所描述的至少一种剂(例如分离的HER-3结合蛋白)和至少一种其他活性剂(例如与另一HER家族成员结合的剂或化学治疗化合物)与药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂混合用于制造用于诊断、预防或治疗过度增殖性疾病(例如与HER-3有关的疾病)的药物组合物的用途。该药物组合物可为如本文描述的药物组合物且该过度增殖性疾病可为本文所描述的过度增殖性疾病。
用于配制及后续施用治疗性组合物的方法是本领域的技术人员熟知的。剂量通常取决于有待治疗的疾病状态的严重性及反应性，治疗疗程持续数天至数月或直到达到治愈或获得该疾病状态的减轻。本领域的一般技术人员常规地决定最佳剂量、给药方法及重复速率。最佳剂量可取决于各个多肽的相对效力而变化，通常可以在体外和体内动物模型中发现有效的EC50为基础来估计。通常，剂量是从0.1μg每kg体重至100mg每kg体重，并且可每天一次或多次、每周二次、每周一次、每月一次或甚至更不经常地给药。在成功治疗后，使患者继续维持治疗以预防该疾病状态的复发可能是所期望的。
药物组合物可利用多种方法施用，取决于希望采取局部还是系统治疗一级有待治疗的区域。施用可为例如局部(例如经皮、舌下、经眼或鼻内)、经肺(例如经吸入或喷入粉末或气雾剂)、口服或胃肠外途径(例如经皮下、脊椎鞘内、心室内、肌肉内或腹膜内注射或经静脉点滴)。施用可为快速(例如经注射)或可在一段时间内发生(例如通过缓慢输注或施用缓释制剂)。为了治疗中枢神经系统的组织，HER-3结合蛋白可通过注射或输注至脑脊髓液加以施用，通常伴随一种或多种可促进该多肽穿透通过血脑屏障的剂。
用于胃肠外、脊椎鞘内或心室内施用的组合物及制剂可包括无菌水溶液，该溶液也可包含缓冲液、稀释剂及其他适当的添加物(例如穿透增进剂、载体化合物及其他药学上可接受的载体)。
药物组合物包括但不限于溶液、乳液、水性悬浮液及含脂质体的制剂。这些组合物可从各种成份产生，包括例如预先形成的液体、半乳化固体及半乳化半固体。乳液通常为双相系统，其包含二种不互溶但密切混合且彼此分散的液体相；通常，乳液不是油包水(w/o)就是水包油(o/w)的类型。乳液制剂已被广泛地用于口服递送治疗剂，因为它们易于配制和溶解、吸收的效率及生物利用率。
HER结合剂可另包含任何药学上可接受的盐、酯或该酯的盐、或当施用至动物包括人时可(直接或间接)提供其生物活性代谢物或残余物的任何其他化合物。因此，举例来说，本申请提供小分子及多肽的药学上可接受的盐、前药及该前药的药学上可接受的盐及其他生物等效物。术语“前药”是指以无活性形式制备且在身体或其细胞内通过内源性酶或其他化学物和/或条件的作用而被转换成活性形式(即药物)的治疗剂。术语“药学上可接受的盐”是指本文所提供的多肽的生理上及药学上可接受的盐(即保留亲代多肽的所期望的生物活性但不给予不期望的毒性效应的盐)。药学上可接受的盐的实例包括但不限于由阳离子(例如钠、钾、钙或多胺诸如精胺)形成的盐、由无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸或硝酸)形成的酸加成盐及由有机酸(例如醋酸、柠檬酸、草酸、棕榈酸或反丁烯二酸)形成的盐。
本文所提供的一些实施方案包括含有下列的药物组合物：(a)一种或多种HER-3结合剂、(b)与另一HER家族成员结合的一种或多种剂及(c)以不同机制作用的一种或多种其他剂。举例来说，(c)中的一种或多种剂可与(b)中的剂交换；抗发炎药物包括但不限于非固醇抗发炎药物及皮质类固醇与抗病毒药物包括但不限于利巴韦林(ribavirin)、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛韦(acyclovir)及更昔洛韦(ganciclovir)可被包括于组合物中。其他非多肽剂(例如化学治疗剂)也在本发明的范围内。所述组合的化合物可一起或依序使用。
组合物可另外包含其他常规存在于药物组合物的添加成份。因此，该组合物也可包含可相容的药学活性材料，诸如举例来说止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗发炎剂，或有助于物理配制本文所提供的组合物的各种剂型的其他材料，诸如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂及稳定剂。另外，该组合物可与助剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、颜料、调味剂及芳香物质。然而添加时，这些材料不应过度地干扰本文所提供的组合物中的多肽成份的生物活性。需要时该制剂可被灭菌。
可常规以单位剂量形式存在的药物制剂可根据制药工业熟知的常规技术制备。所述技术包括使活性成分(例如本文所提供的HER家族结合剂)与所期望的药学载体或赋形剂相关的步骤。一般来说，所述制剂可通过使该活性成分均匀地并与液体载体或精细分割的固体载体或二者紧密相关并且之后如果需要塑形该产物来制备。需要时制剂可经灭菌，条件是灭菌方法不干扰该制剂中包含的多肽的有效性。
本文所描述的组合物可被配制成许多可能的剂型中的任一种，诸如但不限于锭剂、胶囊、液体糖浆、软胶、栓剂及灌肠剂。该组合物也可被配制成于水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可另包含增加该悬浮液的粘度的物质，包括例如羧基甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可包含稳定剂。
HER结合蛋白可与包装材料组合并作为用于治疗HER-3相关疾病的套件出售。用于产生制品的成份及方法是熟知的。该制品可组合一种或多种上文阐述的多肽和化合物。此外，该制品还可包括例如缓冲剂或其他控制试剂以减少或监测减少的免疫复合物形成。描述所述多肽如何有效地治疗HER-3相关疾病的说明书可包括于该套件中。该第一剂、第二剂及其他药剂中的任一种可以纳米粒子或脂质体或任何其他适当的形式递送。
6.方法
本文也提供治疗或预防与HER-3表达有关的疾病及病况的方法。举例来说，方法可包括将受治疗者(例如哺乳动物诸如人)或来自受治疗者的生物样品与如本文所述的HER-3结合蛋白和第二剂的组合接触。该样品可为显示HER-3表达的细胞，诸如肿瘤细胞、血液样品或另一适当样品。在一些实施方案中，该接触发生于体内，诸如将包含HER-3结合剂和与另一HER家族成员结合的第二剂的组合物施用于需要其的受治疗者时。可利用本文所描述的方法治疗的与HER-3表达有关的疾病或病况包括例如过度增殖性疾病诸如乳癌、胃肠道癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、肾癌、转移性乳癌、非小细胞肺癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌及鳞状细胞癌及其他HER-3阳性、HER-3表达或HER-3过度表达的癌。
本文所使用的术语“预防或治疗”是指治疗性治疗及预防性(prophylactic)或预防性(preventive)措施，二者皆可被用于预防、减缓或减轻该目标病理状况或疾病的影响。需要预防或治疗的那些可包括已经患有疾病的那些，以及可能容易发展该疾病的那些或其中该疾病有待预防的那些。需要预防或治疗的患者可为哺乳动物患者(也就是分类上属于哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物以及动物园、竞赛或宠物动物，诸如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等)。在一些实施方案中，需要治疗的患者为人类患者。
用于预防或治疗需要其的患者的HER-3表达相关疾病或状况的方法可包括对该患者施用有效量的至少一种本文所述的HER-3结合剂及至少一种抗另一HER家族成员的其他剂或者化学治疗性化合物(例如至少一种上述的“另外/其他”剂，该剂可与结合和/或抑制另一HER家族的第二剂交换)。该治疗可例如抑制异常的细胞生长、移动或侵入。抗HER-3的剂和该至少一种其他剂可同时施用(例如其包含于相同的组合物中或通过混合至同一静脉输液袋)或分别(例如依序)施用。可利用本文所提供的方法治疗的与HER-3表达相关的疾病或病况包括例如本文列举的过度增殖性疾病。需要预防或治疗的病患可为哺乳动物(例如人、家畜或农场动物、或者动物园动物、竞赛动物、宠物动物，诸如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊或兔)。在一些情况中，患者为人类患者。
本文所使用的术语“有效量”是导致被治疗的HER-3相关病况的一种或多种症状或临床表征减少或稳定的剂的量。举例来说，施用有效量的本文所述的组合物可导致减缓的肿瘤生长进行、减少的肿瘤大小或减少的HER-3的活化或HER-3-反应性生物标记(例如Akt、HER-2、ERK或EGF-R)。该减缓或减少可为相较于先前值的任何减少(例如症状或表征减少5％、10％、20％、25％或超过25％)。在一些实施方案中，“有效量”可导致稳定疾病。
除了潜在结合蛋白治疗剂的传统施用模式例如经由上述的制剂以外，新开发的施用方法也可能有用。举例来说，在手术切除后局部施用经131I-标记的单克隆抗体以治疗原发性脑肿瘤曾被报告。此外，直接立体定位脑内注射单克隆抗体及其片段也于临床及临床前试验中研究。颈动脉高渗透压灌流是一种以药物轭合人源单克隆抗体靶向原发性脑恶性肿瘤的实验策略。
如上所述，所施用的剂的剂量可取决于多种因素。这些因素包括例如所述剂的性质、肿瘤类型及施用途径。应强调的是本发明的方法不限于任何特定剂量。决定适当剂量的方法是本领域已知的，包括本文的实施例中所描述的那些。
取决于有待治疗的病况的类型及严重性，最高约20mg/kg的每种HER结合蛋白可通过例如一次或多次分别施用或通过连续输注施用至需要其的患者。典型的每日剂量可在约1μg/天至约100mg/天或更多的范围内取决于上文提及的因素。重复施用数天或更久，取决于有待治疗的病况，该治疗可持续到发生所期望的疾病症状的抑制。
在一些实施方案中，本文所提供的方法可包括分析来自受治疗者的生物样品中的特定标志(例如HER-3)以确定该受治疗者是否患有与HER-3表达有关的疾病。所述方法可被用于筛选患有HER-3相关疾病的受治疗者。在所述方法中，该分析步骤可在施用步骤之前进行，因为该患者筛选可避免可能无效的治疗。因此在一些情况中，本文所提供的方法可另外包括检测细胞内或细胞上的HER-3抗原，以测定患有如上所述的过度增殖性疾病的患者的HER-3抗原浓度或为病患的过度增殖性疾病分期。为了将所研究的受治疗者的过度增殖性疾病的进行分期，或为了表征受治疗者对治疗疗程的反应，可从该受治疗者采集血液样品并测定存在于该样品中的HER-3抗原的浓度。如此获得的浓度可被用于确定该值落在哪一个浓度范围。如此确定的范围可与在不同的已诊断的受治疗者群中所确定的进行阶段或治疗阶段相互关联，藉此提供所研究的受治疗者的分期。从患者取得的疾病(例如癌性)组织的活体样品也可被用于检测HER-3抗原的存在量。存在于疾病组织中的HER-3抗原的量可通过例如免疫组织化学、ELISA或使用本文所述的HER-3抗体的抗体阵列测定。诊断感兴趣的其他参数为HER-3蛋白的二聚化状态和其二聚化配体(patner)以及HER-3蛋白与其配体的活化状态。测定这些参数的蛋白质分析方法是本领域中熟知的，其中包括蛋白质印迹及免疫沉淀技术、FACS分析、化学交联作用、生物发光共振能量转移(BERT)、荧光共振能量转移(FRET)及类似技术(例如Price等人.(2002)Methods Mol.Biol.218:255-268，或eTag技术(WO05/03707、WO04/091384及WO04/011900))。
在一些情况中，本文所提供的方法可包括一个或多个用于监测该治疗的治疗结果的步骤。举例来说，可监测受治疗者的疾病的症状，以确定是否发生症状的减少。也可监测该受治疗者是否发生例如治疗的潜在不良反应。该监测可于施用步骤之后进行，在一些实施方案中可进行多次监测(例如若给药超过一次时可在施用之间)。所述方法可被用于评估例如本文所述的治疗方法的效力和安全性。
本发明将在下列实施例中进一步说明，所述实施例并不限制权利要求范围中所述的本发明范围。
实施例
实施例1：HER-3抗原及细胞系制备
制备重组HER-3蛋白。该HER-3的胞外结构域(ECD)的cDNA通过聚合酶连锁反应(PCR)以基于HER-3序列(基因库(GeneBank)登录号NM_001982)的引物从pcDNA3-HER-3(包含全长人类HER-3的表达质粒，Wallasch等人.(1995)EMBO J.14:4267-4275)克隆：正向引物：5'-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3'(SEQ ID NO:233)；反向引物：5'-GCTCTAGATTAAT GATGATGATGATGATGTTGTCCTAAACAGTCTTG-3'(SEQ ID NO:234)。
该PCR产物用BamH1和XbaI消化，并与用BamH1和XbaI消化的pcDNA3(英维特基(Invitrogen)公司)连接。利用磷酸钙(CaPO4)法将质粒转染至HEK293细胞。该HER-3-HIS融合蛋白经Ni-NTA亲和性层析从所收获的条件培养基纯化。
利用反转录病毒基因转移产生Ratl HER-3细胞。简单地说，GP+E 86细胞(3×105)被接种于60毫米培养盘上，并利用磷酸钙法以2微克/毫升的plXSN载体或plXSN-HER-3cDNA转染(C.Wallasch的博士论文，德国马丁雷德(Martinsried)马克斯普朗克生化研究所(MaxPlanck Institute of Biochemistry)。24小时后更换培养基为新鲜培养基，使GP+E86细胞孵育4至8小时。接着在聚凝胺存在下(4毫克/毫升；奥德里奇(Aldrich)公司)，与释放高效价pLXSN或pLXSN-HER-3的GP+E 86细胞上清液和p病毒(>1×106G418集落形成单位/毫升；感染复数为10)一起孵育亚融合(subconfluent)的Rat1细胞(2×105细胞/6公分培养皿)达4至12小时。更换培养基后，开始以G418筛选Ratl细胞。通常在筛选21天后可挑选出稳定克隆。
实施例2：HER-3于人癌细胞系的表达
在一组人类癌细胞系中定量HER-3的表达以说明HER-3于人类癌症形成中的作用。依ATCC所建议的方式培养癌细胞系。详细地说，用含10毫摩尔EDTA的PBS收集105个细胞，以FACS缓冲液(PBS、3％FCS、0.4％叠氮化物)清洗一次并接种于96孔圆底孔板上。所述细胞以每分钟1000转离心3分钟以去除上清液，然后用a-HER-3抗体2D1D12重新悬浮(WO03013602)(3微克/毫升)。细胞悬浮液于冰上孵育1小时，以FACS缓冲液清洗二次，以经FACS缓冲液1:50稀释的二级抗体(100微升/孔)驴-抗-人-PE(杰克森(Jackson)公司)重新悬浮。使所述细胞悬浮液于冰上及黑暗中孵育30分钟，以FACS缓冲液清洗二次并进行分析(FACS，贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司)。HER-3在多种人癌细胞系中表达，包括多种乳癌、结肠癌、表皮样癌、黑色素瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰癌及前列腺癌细胞系。见已公开的美国专利公开号20080124345的附图，其通过引用全文并入本文。
实施例3：免疫及滴定
将如实施例1所述制备的HER-3ECD蛋白及C32细胞(人类黑色素瘤；ATCC#CRL-1585)用作抗原。抗HER-3的单克隆抗体利用连续免疫
Figure BDA0001005164300000521
小鼠(XMG1及XMG4品系，加州费利蒙市(Fremont,CA)艾比基因(Abgenix)公司)获得。
Figure BDA0001005164300000522
动物均经足垫注射来免疫。每次注射的总体积为每只小鼠50微升，每个足垫25微升。
在第一组中(10只XMG1小鼠)，每只小鼠用与TITERMAX
Figure BDA0001005164300000523
(安大略省奥克维(Oakville,ON)西格玛(Sigma)公司)的10微克的HER-3ECD蛋白的进行初次免疫。接下来的5次增强免疫用与100微克明矾胶(安大略省奥克维西格玛公司)于无热原的D-PBS中1:1(v/v)混合的10微克的HER-3ECD蛋白混合来进行。第6次增强免疫由与TITERMAX
Figure BDA0001005164300000531
1:1(v/v)混合的10微克的HER-3ECD蛋白组成。第7次注射由与100微克明矾胶1:1(v/v)混合的10微克的HER-3ECD蛋白组成。最后一次增强免疫用10微克的HER-3ECD蛋白于不含佐剂的无热原DPBS中进行。此程序中的
Figure BDA0001005164300000532
小鼠于第0、4、7、11、15、20、24及29天被免疫，于第33天进行融合。使用后眼窝采血法于第13天第4次增强免疫后及第19天第6次增强免疫后进行二次采血。无第二组。在第三组(10只XMG1小鼠)及第四组(10只XMG4小鼠)中，每只小鼠用107个C32细胞于无热原的达尔柏克(Dulbecco)PBS(DPBS)中与TITERMAX
Figure BDA0001005164300000533
1:1(v/v)混合进行初次免疫。接下来的4次增强免疫为每只小鼠用107个C32细胞于无热原的DPBS中与25微克的Adju-Phos和10微克的CpG混合。第6次增强免疫为每只小鼠107个C32细胞于无热原的DPBS中，与TITERMAX
Figure BDA0001005164300000534
1:1(v/v)混合。第7、8及9次增强免疫为每只小鼠用107个C32细胞于无热原的DPBS中与25微克的Adju-Phos及10微克的CpG混合。第10至14次增强免疫为每只小鼠用5微克的HER-3ECD蛋白于无热原的DPBS中与25微克Adju-Phos及10微克CpG混合。最后一次增强免疫为由不含佐剂的无热原DPBS中的5微克的HER-3ECD蛋白组成。第3及第4组的小鼠均于第0、3、7、11、14、17、21、24、28、33、35、38、42及45天接受免疫，于第49天进行融合。使用后眼窝采血法于第12天第4次增强免疫后、第19天第6次增强免疫后及第40天第12次增强免疫后进行三次采血。
以效价筛选收获动物：在第1组中，通过针对HER-3ECD蛋白的ELISA测定来自免疫小鼠的血清中的抗-HER-3抗体效价。每个
Figure BDA0001005164300000535
动物的特定效价是以650纳米处的光密度决定的且显示于以下的表1。该效价的值为光密度读数为背景的2倍的血清最大稀释倍数的倒数。因此，该数值越高，对HER-3ECD的体液免疫反应越强。
表1
第1组,XMG1
Figure BDA0001005164300000541
在第3及第4组中，免疫小鼠的血清中的抗-HER-3抗体效价通过使用Rat1/HER-3细胞(抗原阳性细胞系)及Rat1/pLSXN细胞(抗原阴性细胞系)的FACS测定。数据显示于表2及表3，并表示为连续稀释血清检体的细胞抗-HER-3细胞染色的几何平均(GeoMean)荧光强度。
表2
第3组,XMG1
Figure BDA0001005164300000551
表3
第4组,XMG4
Figure BDA0001005164300000561
实施例4：淋巴细胞回收、B细胞分离、杂交瘤融合及产生
将免疫小鼠处死并从每一组收获及合并淋巴结。通过在DMEM中磨碎组织以从组织释出细胞并将细胞悬浮于DMEM中分离淋巴样细胞的。将计数细胞，将每1亿个淋巴细胞0.9毫升的DMEM加入细胞团中以轻轻但充分地重新悬浮细胞。使用每1亿个细胞100微升的CD90+磁珠，通过将细胞与磁珠在4℃下孵育15分钟来标记细胞。将含有高达108阳性细胞(或高达2×109总细胞)的磁标记细胞悬浮液装入LS+柱并以DMEM清洗柱。收集总洗脱液作为CD90-阴性部分(这些细胞大多被认为是B细胞)。
通过以1:1的比例混合上述经清洗的富集的B细胞和购自ATCC的非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(产品编号CRL 1580)来进行融合(Kearney等人.(1979)J.Immunol.123:1548-1550)。细胞混合物通过800g离心轻柔成团。完全移除上清液后，以2至4毫升的链霉蛋白酶(pronase)溶液(卡尔生化(CalBiochem)公司，产品编号53702；0.5毫克/毫升于PBS中)处理细胞不超过2分钟。然后加入3至5毫升的FBS以停止酶活性，利用电细胞融合液(ECFS)(0.3摩尔蔗糖，西格玛(Sigma)公司产品编号S7903，0.1毫摩尔醋酸镁，西格玛公司产品编号M2545，0.1毫摩尔醋酸钙，西格玛公司产品编号C4705)将该悬浮液的总体积调整至40毫升。离心后移除上清液，将细胞重新悬浮于40毫升的ECFS中。重复此清洗步骤，并且将细胞以2×106细胞/毫升的浓度重新悬浮于ECFS中。
电细胞融合利用融合产生器(型号ECM2001，加州圣地亚哥(San Diego,CA)基因创力(Genetronic)公司)进行。融合室的大小为2.0毫升，使用下列仪器设置：校准条件：电压：50伏特，时间：50秒；膜破裂：电压：3000伏特，时间：30微秒；融合后保持时间：3秒。
经电细胞融合后，在无菌条件下将细胞悬浮液自融合室中移出并转移至含相同体积的杂交瘤培养基(DMEM(JRH生物科学(JRH Biosciences)公司)，15％FBS(海克隆(Hyclone)公司)，添加L-谷氨酰胺、青/链霉素、OPI(草酰乙酸、丙酮酸、牛胰岛素)(均来自西格玛(Sigma)公司)及IL-6(百龄佳曼海姆(Boehringer Mannheim)公司)的无菌试管中。细胞于37℃下孵育15至30分钟，接着以400g离心5分钟。以少量的杂交瘤筛选培养基(添加0.5倍HA(西格玛公司产品编号A9666)的杂交瘤培养基)轻轻重悬细胞，以更多的杂交瘤筛选培养基适当地调整体积，基于每个96孔板最终接种共5×106个B细胞并且每孔200微升。轻轻混合细胞并以微量移液管移至96孔板并使细胞生长。在第7或10天除去一半的培养基，重新加入杂交瘤筛选培养基以再喂养细胞。
实施例5：利用ELISA筛选候选抗体
培养14天后，通过使用经纯化的具his标签的HER-3ECD的ELISA初步筛选第1组(第1组的小鼠被任意分成融合1及融合2)具有HER-3特异性抗体的杂交瘤上清液，通过使用山羊抗-huIgGFc-HRP(卡泰克(Caltag)公司产品编号H10507，使用浓度为1:2000稀释)的ELISA反筛选不相关的具his标签的蛋白以检测与固定在ELISA板上的HER-3ECD结合的人源IgG。移除基于初步筛选的阳性杂交瘤细胞生长孔中旧的培养上清液，将该HER-3阳性杂交瘤细胞以新鲜杂交瘤培养基悬浮并转移至24孔板。培养2天后，将这些上清液用于第二次确认筛选。在第二次确认筛选HER-3特异性完全人源IgGk抗体时，初次筛选呈阳性的通过具有二组检测抗体的ELISA筛选：用于人γ链检测的山羊抗-huIgGFc-HRP(卡泰克公司产品编号H10507，使用1:2000稀释)及检测人κ轻链的山羊抗-hIgκ-HRP(南方生技(SouthernBiotechnology)公司产品编号2060-05)。第1组产生91株完全人源IgG/κHER-3特异性单克隆抗体。
实施例6：利用FMAT/FACS筛选候选抗体
培养14天后，利用FMAT筛选第3及第4组中(融合3及融合4)具有HER-3特异性单克隆抗体的杂交瘤上清液。在初步筛选中，将杂交瘤上清液于室温下以1:10终稀释度与表达人源HER-3的Rat1-HER-3细胞及400纳克/毫升的Cy5轭合的山羊F(ab’)2抗-人IgG Fc特异性抗体(杰克森免疫研究(Jackson ImmunoResearch)公司产品编号109-176-098)一起孵育6小时。抗体及检测抗体与细胞的结合由FMAT测量(应用生物系统(Applied Biosystems)公司)。抗体与细胞的非特异性结合则通过它们与亲代Rat1细胞的结合确定。从融合3的初步筛选选出总共420株产生HER-3特异性抗体的杂交瘤。利用相同的FMAT程序再次检测来自这些扩增培养的上清液，其中262株被确认与HER-3表达细胞特异性地结合。从融合4的初步筛选选出总共193株产生HER-3特异性抗体的杂交瘤。利用FACS检测来自这些扩增培养的上清液，其中138株被确认与表达HER-3的细胞特异性地结合。在FACS确认测定中，Rat1-XHER-3细胞及亲代Rat1细胞(阴性对照)与杂交瘤上清液以1:2稀释度于40℃在含2％FBS的PBS中孵育1小时。经PBS清洗后，抗体与细胞的结合通过2.5微克/毫升Cy5轭合的山羊F(ab’)2抗-人IgG Fc特异性抗体(JIR#109-176-098)及5微克/毫升PE轭合的山羊F(ab’)2抗-人κ特异性抗体(SB#2063-09)检测。用PBS清洗以去除未结合的抗体后，细胞用cytofix(BD#51-2090KZ)以1:4稀释度固定并用FACSCalibur分析。
实施例7：筛选供克隆的杂交瘤
筛选来自第1组的抗体经以用于杂交瘤克隆，以在使用纯化的重组胞外结构域(得自例如明尼苏达州明尼亚波利(Minneapolis,MN)R&D生物系统(R&D Biosystems)公司)的ELISA中对HER-3的特异性超过对HER1(EGF-R)、HER-2及HER-4的特异性。表达不同HER家族成员的人类肿瘤细胞系的FACS分析及HER-3阳性细胞的FACS染色的平均荧光强度相较背景增加超过5倍为基础。根据这些标准，共有23株杂交瘤细胞被选择用于有限稀释细胞接种的克隆。
将来自第3及第4组的抗体基于对HER-3的特异性超过HER-1(EGF-R)、HER-2及HER-4以及其他三项标准筛选用于杂交瘤克隆。第一项标准是以ELISA筛选具有包含在HER-3的L2结构域内的表位的抗体(见以下的实施例8)。
第二项标准是在基于FACS的测定中中和生物素化的人表皮生长因子受体调节蛋白(heregulin)-α与HER-3表达细胞的结合。收获SKBR-3细胞、在培养基中清洗、离心成团并以培养基重新悬浮。重新悬浮的细胞被等分至96孔板。孔板离心以使细胞成团。在耗尽杂交瘤上清液中的测试抗体以25微升/孔加入并于冰上孵育1小时以允许抗体结合。在每孔中加入50微升的10纳摩尔人表皮生长因子受体调节蛋白-α(R&D生物系统公司)溶液使终浓度成为5纳摩尔，于冰上孵育1.5小时。用150微升PBS清洗细胞，藉离心成团并移除上清液。以50微升的10微克/毫升山羊抗-HRG-α多克隆抗体重新悬浮细胞，于冰上孵育45分钟。用200微升PBS清洗细胞，藉离心成团并移除上清液。加入50微升的5微克/毫升兔Cy5标记的抗山羊多克隆抗体溶液及10微克/毫升7AAD，于冰上孵育15分钟。用200微升PBS清洗细胞，藉离心成团并移除上清液。使细胞重新悬浮于100微升的FACS缓冲液，读取FACS值。减少人表皮生长因子受体调节蛋白-α的结合的HER-3测试抗体为具有最低的荧光强度的那些。作为阳性对照，使用自10000纳克/毫升至16纳克/毫升的1:5连续稀释的小鼠HER-3单克隆抗体(105.5)或人源IgG1HER-3单克隆抗体U1-49。阴性对照为仅人表皮生长因子受体调节蛋白-α、仅细胞、仅山羊抗-人表皮生长因子受体调节蛋白-α多克隆抗体及仅兔Cy5标记的抗-山羊多克隆抗体。
第三项标准是亲和性相对排序和/或在使用HER-3表达细胞系的FACS中较高的相对平均荧光强度。亲和性的相对排序是如下文利用将HER-3特异性抗体的浓度归一化并对来自有限抗原ELISA的数据作图来进行的。
利用高抗原ELISA的抗原特异性抗体浓度归一化：利用ELISA的方法，上清液中抗原特异性抗体的浓度被归一化。利用已知浓度的来自第1组的二个抗-HER-3人源IgG1抗体进行平行滴定以绘制标准曲线，并将来自第3及第4组的测试杂交瘤上清液中的抗原特异性抗体的量与该标准比较。利用这种方式，估计每个杂交瘤培养基中人源HER-3IgG抗体的浓度。
将中性亲和素(Neutravidin)(8微克/毫升于1X PBS/0.05％叠氮化钠中)以50微升/孔的量于4℃过夜孵育包被于Costar 3368培养基结合板上制备中性亲和素板。隔天加入1X PBS/1％脱脂奶以封闭该板。使光生物素化的带有his-标签的HER-3ECD(500纳克/毫升于1X PBS/1％脱脂牛奶中)于室温中反应1小时以结合在中性亲和素板上。杂交瘤上清液用1X PBS/1％脱脂奶/0.05％叠氮化物从1:31的起始稀释度以1:2.5连续稀释至1:7568的最终稀释度，在每孔加入50微升然后于室温中反应20小时。采用连续稀释是为了确保获得测定线性范围内每个未知浓度的OD读数。接着加入50微升/孔的二级检测抗体山羊抗人IgGFc HRP(400纳克/毫升于1X PBX/1％脱脂奶中)。在室温中作用1小时后，再次用水清洗该板5次，并于每孔中加入50微升的单成份TMB底物。30分钟后于每孔加入50微升的1摩尔盐酸以停止反应，在波长450纳米处读取该板。从来自第1组的二个IgG1HER-3单克隆抗体绘制标准曲线，所述抗体从1000纳克/毫升经1:2连续稀释至0.06纳克/毫升并使用上文程序以ELISA测定。对于每个未知样品，利用该测定的线性范围内的OD读数估计每个样品中人源HER-3IgG的浓度。
有限抗原分析是一种在B细胞培养基上清液中制备的抗原特异性抗体相对于所有其他抗原特异性抗体的亲和性排序的方法。当以非常低的抗原包被存在，应只有最高亲和性的抗体可在平衡时以任何可检测的量结合。(见例如PCT公开号WO/03048730A2。)在此情况下，来自第1组的二个已知浓度并已知KD的单克隆抗体被用来作为该测定的标准物。
将中性亲和素(8微克/毫升于1X PBS/0.05％叠氮化钠中)以50微升/孔的量于4℃过夜孵育包被于Costar 3368培养基结合板上制备中性亲和素板。隔天加入1X PBS/1％脱脂奶以封闭该板。使生物素化的带有his标签的HER-3ECD(50微升/孔)以5种浓度：125、62.5、31.2、15.6及7.8纳克/毫升于1X PBS/1％脱脂奶中于室温1小时以结合在96孔中性亲和素板上。每块板用水清洗5次。以50微升/孔加入经1X PBS/1％脱脂奶/0.05％叠氮化物以1:31稀释的杂交瘤上清液。于室温中在震荡器上孵育20小时后，再用蒸馏水清洗该板5次。接着加入50微升/孔的400纳克/毫升溶于1X PBS/1％脱脂奶中的二级检测抗体山羊抗人IgG Fc HRP(辣根过氧化酶)。在室温中作用1小时后，再次用蒸馏水清洗该板5次，并于每孔中加入50微升的单成份TMB底物。30分钟后于每孔加入50微升的1摩尔盐酸以停止反应，在波长450纳米处读取该板。在线性范围内产生OD值的抗原浓度的OD读数被用来进行数据分析。
将高抗原数据(其比较性地估计特定抗体浓度；详见上文)对有限抗原OD值作图显示相对较高亲和性的抗体，例如于有限抗原分析中具有较高OD但于上清液中具有较少量IgG HER-3抗体结合者的那些。将在这些组的测定中表现最佳的来自第3及第4组的33株杂交瘤抗体通过有限稀释杂交瘤接种进行进一步克隆。
另外可选择地，Rat1/pLXSN及Rat1/HER-3细胞的HER-3表达的FACS分析显示类似结果(与内源性大鼠表位无交叉反应)。详细地说，用含10毫摩尔EDTA的PBS收获1×105个细胞，以FACS缓冲液(PBS、3％FCS、0.4％叠氮化物)冲洗一次并接种于96孔圆底孔板上。所述细胞以每分钟1000转离心3分钟以去除上清液，然后用特定HER-家族抗体重新悬浮(3微克/毫升)。细胞悬浮液于冰上孵育45分钟，以FACS缓冲液清洗二次，用以FACS缓冲液稀释50倍的二级抗体(100微升/孔)驴-抗-人-PE(杰克森免疫研究公司，宾州)重新悬浮。使所述细胞悬浮液于冰上及黑暗中孵育30分钟，以FACS缓冲液清洗二次并进行分析(FACS，贝克曼库尔特公司)。
实施例8：抗-HER-3抗体的结构分析
下列讨论提供关于根据本发明制备的抗体的结构数据。为了分析所述抗体的结构，从特定杂交瘤扩增编码重链及轻链片段的基因。测序按照下述方式进行：
利用反转录酶聚合酶连锁反应(RT-PCR)，于96孔板中扩增各个杂交瘤克隆的VH及VL转录物。使用Fast-Track套件(英维特基(Invitrogen)公司)，从约2×105杂交瘤细胞分离poly(A)+-mRNA。每个杂交瘤均进行四次PCR反应：κ轻链(κ)二次，γ重链(γ)二次。QIAGEN单步骤室温PCR套件被用于扩增(凯杰(Qiagen)公司产品编号210212)。在成对的室温PCR反应中，cDNA的合成利用对应C-κ或对应Cγ基因的CH1区的共同序列的反义序列特异引物及室温酶的混合物(Omniscript及Sensiscript)进行。反转录于50℃进行1小时，之后用具有高度特异性及敏感性的HotStarTaq DNA聚合酶进行cDNA的PCR扩增。每个PCR反应使用5’正义引物的混合物；引物序列以Vbase网站中可获得的VH及VK的前导序列为基础(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。
PCR反应为于94℃进行15分钟的初次热启动，之后94℃30秒(变性)、60℃30秒(退火)及72℃1分钟(延长)的40个循环。
将PCR产物纯化，并使用正向及反向PCR引物和ABI PRISM测速套件(BigDyeterminator cycle sequencing ready reaction kit)(珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司)直接测序。二条链均利用Prism染料终止测序套件及ABI 377测序仪测序。
序列分析：利用艾比基因(Abgenix)公司内部软件(5AS)，比对HER-3序列与人类种系V重链及Vκ序列以完成HER3抗体的人源V重链及VκcDNA序列分析。该软件找出V基因、D基因及J基因的使用，以及在重组连接处及体细胞突变处的核苷酸插入情形。也于计算机上产生氨基酸序列以确认体细胞突变。类似结果可用商业上可获得的序列分析软件及公众可得的人类V、D及J基因序列的信息，例如Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)获得。
单克隆抗体U1-59的分子克隆：从包含多个杂交瘤细胞系的组织培养提取总RNA，包括分泌抗体U1-59的杂交瘤细胞系。重链可变区利用5’前导序列VH家族特异性引物及3’-C-γ引物扩增。主带利用VH4引物扩增，并未见其他条带。该VH4-34γ片段被克隆至pCDNA表达载体符合读框地与人源γ1恒定区基因相连。
IgM重链可变区利用5’VH家族特异性引物及3’mμ恒定区引物扩增。主带利用VH2引物扩增，未见其他条带。该VH2-5mμ片段被克隆至pCDNA表达载体符合读框地与人源mμ恒定区基因相连。Vκ链被扩增并测序。4个κ链RT-PCR产物被确定。所述产物测序并且经由计算机翻译的序列分析后，它们中只有三个具有开放阅读框。这三个功能性κ链根据Vκ基因的使用如(1)VK1A3-JK2、(2)VK1A20-JK3及(3)B3-JK1而从充分确定的寡克隆的U1-59杂交瘤克隆出来。所有V-κ被克隆至pCDNA表达载体符合读框地与人源κ轻链恒定区基因相连。
转染：将每条重链与每条κ链一起以瞬时转染的方式转染以得到总共6对重链/κ轻链对。与A20κ链一起转染γ链产生不良的抗体表达，然而A20κ链与μ链共转染时无抗体被分泌或检测。可获得总共有三种IgG上清液及二种IgM上清液用于HER-3结合测试。
链 VH D J 恒定区 ORF
重链 VH4-34 D1-20 JH2 γ 是
重链 VH2-5 D6-6 JH4b μ 是
轻链 A3 JK2 κ 是
轻链 A20 JK3 κ 是
轻链 B3 JK1 κ 是
轻链 A27 JK3 κ 否
由VH4-34及B3κ链所组成的IgG1单克隆抗体与HER-3+细胞系的结合活性于FACS中检测。没有其他VH/Vk的组合在使用HER-3+细胞系的FACS中产生高于背景值的荧光信号。
抗-HER-3抗体的结合竞争：如Jia等人.(2004)J Immunol Methods.288，91-98所公开的进行多重竞争抗体分型(Multiplexed competitive antibody binning)以检测竞争结合HER-3的HER-3抗体群集。来自第1组的测试HER-3抗体根据结合竞争性群集成5类。
第1类 第2类 第3类 第4类 第5类
U1-42 U1-48 U1-52 U1-38 U1-45
U1-44 U1-50 U1-39 U1-40
U1-62 U1-51 U1-41
U1-46 U1-43
U1-47 U1-49 U1-61
U1-58 U1-53
U1-55
抗-HER-3抗体的表位表征化：人源抗-HER-3抗体的表位被表征化。首先还原、变性的HER-3-带His标签的纯化ECD蛋白的点印迹分析显示没有所测试的抗-HER-3抗体(U1-59、U1-61、U1-41、U1-46、U1-53、U1-43、U1-44、U1-47、U1-52、U1-40、U1-49)的结合，证明所有抗体具有对二硫键还原敏感的表位，表明所有抗体都具有不连续的表位。接着，通过将不同的人-鼠HER-3嵌合分子工程化将所述抗体作图至HER-3分子中已定义的结构域，根据被分成4个结构域的HER-3胞外结构域：
1)L1(D1)：次要配体-结合结构域，
2)S1(D2)：第一半胱氨酸富集结构域，
3)L2(D3)：主要配体-结合结构域，及
4)S2(D4)：第二半胱氨酸富集结构域。
从RAT1-HER-3细胞扩增人源HER-3cDNA的胞外结构域(ECD)。通过RT-PCR从大鼠肝脏RNA扩增并通过测序确认大鼠HER-3cDNA。表达人和大鼠HER-3的ECD的cDNA被克隆至哺乳动物表达载体以作为V5-His融合蛋白。人源HER-3ECD的结构域通过使用Mfe1、BstX1及DraIII内部限制酶位点被交换至由大鼠HER-3ECD所提供的支架蛋白中。通过此种方式，各种嵌合性大鼠/人HER-3ECD HIS融合蛋白(氨基酸1至160、161至358、359至575、1至358或359至604)被构建并经由HEK 293T细胞的瞬时转染来表达。构建体的表达利用抗人源HER-3的鼠多克隆抗体确认。在ELISA中测试人单克隆抗体与分泌的嵌合性ECD的结合。
二种人源抗体(包括抗体U1-59)与大鼠HER-3交叉反应。为了分配结合结构域，利用由L1-S1-V5带his标签的蛋白所组成的截短形式的HER-3测试这些单克隆抗体，L1-S1-V5带his标签的蛋白从用编码HER-3的L1-S1胞外结构域的表达的质粒DNA转染的HEK 293T细胞的上清液纯化的。单克隆抗体U1-59在ELISA中与该L1-S1蛋白结合，表示其表位位于L1-S1中。单克隆抗体2.5.1不与L1-S1蛋白结合，表示其表位位于L2-S2中。抗体U1-59的进一步作图是使用SELDI飞行时间质谱仪用单克隆抗体-HER-3ECD复合物的芯片上的蛋白水解消化进行的。
用SELDI定位U1-59的表位：抗体U1-59的进一步作图是使用SELDI飞行时间质谱仪用单克隆抗体-HER-3ECD复合物的芯片上的蛋白水解消化进行的。蛋白A与PS20蛋白芯片阵列共价结合且被用于捕捉单克隆抗体U1-59。接着该PS20蛋白芯片与该单克隆抗体的复合物与HER-3-His纯化抗原一起孵育。接着该抗体-抗原复合物被高浓度的Asp-N消化。清洗芯片，结果只留下与芯片上的抗体结合的HER-3肽。该表位利用SELDI测定并由该片段的质量鉴定。鉴定的6814道尔顿的片段对应由HER-3-his ECD的部分消化所产生的二个可能的预期的肽。二个重叠的肽被作图至结构域S1。通过将SELDI的结果与HER-3的缺失构建体结合，该表位被作图至残基251至325。
表4概述由人源抗-HER-3单克隆抗体所识别的HER-3的胞外部份中结合结构域的位置。所述表位结构域的作图结果与抗体竞争结合竞争分型的结果一致，其中彼此交叉竞争与HER-3结合的抗体也被作图至该HER-3上的相同结构域。
表4
根据ELISA试验结果的单克隆抗体结合结构域概述
MAb 大鼠XR 结合结构域 mAb 大鼠XR 结合结构域
U1-59 是 S1 U1-2 否 L2
U1-61 否 L2 U1-7 否 L2
U1-41 否 L2 U1-9 否 L2
U1-46 否 S1 U1-10 否 L2
U1-53 否 L2 U1-12 否 L2
U1-43 否 L2 U1-13 否 L2
U1-44 否 S1 U1-14 否 L2
U1-47 否 S1 U1-15 否 L2
U1-52 是 L2S2 U1-19 否 L2
U1-40 否 L2 U1-20 否 L2
U1-49 否 L1 U1-21 否 L2
U1-21 否 L2 U1-28 否 L2
U1-22 否 L2 (U1-31) 否 L2
U1-23 否 L2 U1-32 否 L2
U1-24 否 L2 (U1-35) 否 L2
U1-25 否 L2 U1-36 否 L2
U1-26 否 L2 (U1-37) 否 L2
U1-27 否 L2
XR＝交叉反应性
实施例9：决定抗体的标准类型
抗体结构已经按照每种免疫球蛋白链的高变异区(Chothia等人.(1987)J.Mol.Biol.196：901-17)的“标准类型”来描述。分析不同免疫球蛋白的Fab及VL片段的原子结构以决定它们的氨基酸序列与它们的抗原结合位点的三维构造之间的关系。Chothia等人发现有相对少数的残基，通过它们的包装、氢键结合或采取不常见的
Figure BDA0001005164300000651
ψ或ω构形的能力，是造成该高变异区的主链构形的主要原因。这些残基被发现位于高变异区内和保守性β-折叠框架中的位点。通过检查具有未知结构的免疫球蛋白的序列，Chothia等人显示许多免疫球蛋白具有和已知结构中的一种的大小类似的高变异区且在形成所观察到的构形的位点包含相同的残基。
他们的发现暗示这些高变异区具有和已知结构者类似的构形。在5个高变异区中，构形变化似乎被限制于相对少数的不相关的结构类型。这些经常出现的高变异区主链构形被称为“标准结构”。Chothia等人(Nature(1989)342：877-83)及他人(Martin，等人.(1996)J.Mol.Biol.263：800-15)的其他研究证实抗体的6个高变异区中的至少5个的主链构形变化不大。
分析上文每种抗体的CDR以测定它们的标准类型。已知的是，标准类型仅被分配至抗体重链的CDR1和CDR2以及抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3。下表概述该分析的结果。标准类型的数据以HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3的形式呈现，其中“HCDR”指重链CDR而“LCDR”指轻链CDR。因此，举例来说，1-3-2-1-5的标准类型是指抗体的HCDR1属于标准类型1、HCDR2属于标准类型3、LCDR1属于标准类型2、LCDR2属于标准类型1及LCDR3属于标准类型5。
当抗体中的氨基酸每种各标准类型所定义的氨基酸具有70％或更高的同一性时，可被分配至所述特定标准类型。每种抗体所定义的氨基酸可见例如上文的Chothia,等人的文献。表5及表6报告HER-3抗体中的每一种的标准类型数据。当一致性低于70％时，该标准类型分配以星号(“*”)标示以标明根据每个CDR的长度及整体数据进行对适当的标准类型的最佳推测。若没有相同CDR长度的标准类型可供相配，该标准类型分配以字母s及数字标示，诸如s18，这表示该CDR的大小为18。若重链或轻链中的一种没有序列数据，该标准类型以“Z”标示。
表5
Figure BDA0001005164300000661
表6为各类型中抗体的数目的分析。具有左栏显示的特定标准类型的抗体数目显示于右栏。有4个单克隆抗体缺乏一条链的序列数据并因此在标准类型中具有“Z”者而不包含于此计算中。
最常见的结构为3-1-2-1-1：41个单克隆抗体中的21个具有这一组合的重链及轻链序列。
表6
H1-H2-L1-L2-L3 数量
1-1-3-1-1 2
1-1-4-1*-1 1
1-2-2-1-1 4
1-2-8-1-1 1
1-3-2-1-1 3
1-3-4-1-1 1
3-1-2-1-1 21
3-1-4-1-1 5
3-1-8-1-1 2
3-s18-2-1-1 1
实施例10：测定抗体亲和性
抗-HER-3抗体的亲和性测定利用间接FACS斯卡乍得(Scatchard)分析进行。因此，将105个感兴趣的细胞或SK-Br 3细胞收集于含10毫摩尔EDTA的PBS中，以FACS缓冲液(PBS、3％FCS、0.4％叠氮)冲洗一次并接种于96孔圆底孔板上。所述细胞以每分钟1000转离心3分钟以除去上清液，然后用α-HER-3抗体(3微克/毫升)重新悬浮或用以FACS缓冲液以1∶2稀释步骤从20微克/毫升开始稀释的人单克隆抗体的抗体稀释液(100微升/孔)重新悬浮。细胞悬浮液于冰上孵育1小时，以FACS缓冲液清洗二次，以用FACS缓冲液稀释50倍的二级抗体(100微升/孔)驴-抗-人-PE(杰克森公司)重新悬浮。使所述细胞悬浮液于冰上及黑暗中孵育30分钟，以FACS缓冲液清洗二次并进行分析(FACS，贝克曼库尔特公司)。根据FACS斯卡乍得分析，计算各次测量值的荧光平均值。将各次荧光平均值减掉背景染色值(＝无一次抗体)。绘制x轴为荧光平均值耳y轴为荧光平均值/单克隆抗体浓度(nM)的斯卡乍得图。KD以线性方程式的1/斜率(m)的绝对值计算。以这一方式筛选的某些抗体的亲和性测量值提供于表7。
表7
克隆 KD(nm)
U1-38 无数据
U1-39 102
U1-40 6.7
U1-41 0.18
U1-42 无数据
U1-43 0.57
U1-44 4
U1-52 16.8
U1-61 0.13
U1-62 20.4
U1-46 13.8
U1-47 9.38
U1-49 1
U1-50 39.3
U1-51 131.6
U1-53 0.082
U1-55.1 3.7
U1-58 6.4
U1-59 3.69
U1-24 0.06
U1-7 0.02
实施例11：抗-HER-3抗体诱发HER-3受体胞饮作用
HER-3已经被鉴定为可通过作为HER家族介导的细胞信号传递的重要看守分子起作用来影响过度增殖性疾病的开始及进展的因子。因此，若通过受体内化作用将细胞表面/膜上的HER-3有效地清除，最终可减少或抑制细胞信号传递和因此的恶性肿瘤中细胞的转化和/或维持。
为了研究抗-HER-3抗体是否可诱发HER-3的加速的胞饮作用，在细胞和抗-HER-3抗体一起孵育0.5及4小时后，比较所述细胞表面上的HER-3分子的相对量。3×105个细胞被接种于24孔板中的正常生长培养基，使细胞生长过夜。在37℃以10微克/毫升的抗-HER-3单克隆抗体于正常生长培养基中预先孵育细胞所示的时间。用10毫摩尔EDTA将细胞脱附，并于4℃以10微克/毫升抗-HER-3单克隆抗体于冲洗缓冲液(PBS、3％FCS、0.04％叠氮化物)中孵育45分钟。用冲洗缓冲液冲洗细胞二次，于4℃以1：100稀释的驴-抗-人-PE二级抗体(杰克森公司)孵育45分钟，用冲洗缓冲液冲洗二次，并以FACS分析(贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)公司，EXPO)。根据经抗-HER-3处理的样品相对于对照处理样品的平均荧光强度的下降，计算百分比内化。这些实验显示用抗-HER-3抗体处理细胞导致受体内化。见美国专利公开号20080124345的图5。
实施例12：人抗-HER-3抗体抑制配体与人癌细胞SKBr3的结合
进行放射性配体竞争试验以将抗-HER-3抗体于细胞基础的试验中抑制配体与HER-3结合的能力定量。因此，HER-3受体结合试验用4×105个SK-BR-3细胞与不同浓度的抗体于冰上孵育30分钟进行。每孔加入1.25纳摩尔的[碘125]-α-HRG/[125碘]-β-HRG，在冰上继续孵育2小时。孔板清洗5次、风干，并于闪烁计数器中计数。所述抗体可特异性地减少[125碘]-α-HRG/[125碘]-β-HRG与表达内源性HER-3细胞的结合。见美国专利公开号20080124345的图6a至6e。
实施例13：人抗-HER-3抗体抑制配体诱发的HER-3磷酸化
进行ELISA试验以研究所述抗体是否可阻断配体β-HRG介导的HER-3活化。配体介导的HER-3活化通过增加的受体酪氨酸磷酸化检测。
第1天：以20微克/毫升胶原蛋白I于0.1摩尔醋酸中于37℃包被1X96孔板4小时。将2.5×105个细胞接种于正常生长培养基。
第2天：将细胞于100微升不含血清的培养基中饥饿24小时。
第3天：将细胞用10微克/毫升抗-HER-3单克隆抗体于37℃预先孵育1小时，然后以30纳克/毫升β-HRG-EGF结构域(R&D系统公司)处理10分钟。轻弹出培养基并在室温中用4％甲醛PBS溶液固定细胞1小时。移除甲醛溶液，用冲洗缓冲液(PBS/0.1％吐温(Tween)20)冲洗细胞。加入含1％过氧化氢、0.1％叠氮化钠的冲洗缓冲液淬灭细胞，于室温中孵育20分钟，接着在4℃以NET-明胶封闭5小时。加入初级抗体磷酸化-HER-3(Tyr1289)(兔多克隆抗体；细胞信号(Cell signaling)公司#4791；1:300)于4℃过夜反应。
第4天：用冲洗缓冲液清洗所述板3次，接着以经PBS稀释3000倍的抗-兔-POD孵育，于每孔加入0.5％BSA在室温中孵育1.5小时。所述板用冲洗缓冲液清洗3次及PBS清洗1次。加入四甲基联苯胺(TMB，卡尔生化(Calbiochem)公司)并于650纳米处监测。加入100微升的250纳摩尔HCl以停止该反应，使用Vmax孔板读取仪(赛默实验室系统(Thermo LabSystems))于450纳米处读取吸亮度，参照波长为650纳米。
这些实验显示抗-HER-3抗体可减少配体介导的HER-3活化，如受体酪氨酸磷酸化下降所表明的。见美国专利公开号20080124345的图7a。
为了测试单克隆抗体U1-53抑制配体诱导的HER-3活化的效价，使MCF-7细胞饥饿24小时，与单克隆抗体U1-53于37℃孵育1小时，并用10纳摩尔的HRG-β刺激10分钟。溶解物被转移至1B4(小鼠抗-HER-3单克隆抗体)ELISA板，并以抗体4G10分析HER-3的磷酸化。HER-3的磷酸化几乎以剂量依赖方式被完全抑制，IC50为0.14纳摩尔。见美国专利公开号20080124345的图7b。
实施例14：人抗-HER-3抗体抑制配体诱发的p42/p44 MAP-激酶磷酸化
进行接下来的ELISA试验以研究所述抗体是否可阻断配体β-HRG介导的p42/p44MAP激酶活化。配体介导的HER-3活化由增加的蛋白(Thr202/Tyr204)磷酸化检测。
第1天：以20微克/毫升胶原蛋白I于0.1摩尔醋酸中于37℃包被1X96孔板4小时。3×105个细胞被接种于正常生长培养基。
第2天：将细胞于100微升不含血清的培养基中饥饿24小时。
第3天：将细胞用5微克/毫升抗-HER-3单克隆抗体于37℃预先孵育1小时，然后以20纳克/毫升β-HRG-EGF结构域(R&D系统公司)处理10分钟。轻弹出培养基并在室温中用4％甲醛PBS溶液固定细胞1小时。移除甲醛溶液，用冲洗缓冲液(PBS/0.1％吐温20)冲洗细胞。加入含1％过氧化氢、0.1％叠氮化钠的冲洗缓冲液以淬灭细胞，于室温中孵育20分钟，接着在4℃以PBS/0.5％BSA封闭5小时。加入初级抗体磷酰基-p44/p42MAP激酶(Thr202/Tyr204)(兔多克隆抗体；细胞信号公司#9101；1:300)于4℃过夜反应。
第5天：用冲洗缓冲液清洗所述板3次，接着以经PBS稀释5000倍的抗-兔-HRP孵育，于每孔加入0.5％BSA在室温中孵育1.5小时。所述板用冲洗缓冲液清洗3次并用PBS清洗1次。加入四甲基联苯胺(TMB，卡尔生化(Calbiochem)公司)并于650纳米处监测。加入100微升的250纳摩尔HCl以停止该反应，使用Vmax孔板读取仪(赛默实验室系统(Thermo LabSystems))于450纳米处读取吸亮度，参照波长为650纳米。这些实验显示所述抗体可减少配体介导的p42/p44MAP-激酶活化，以磷酸化下降表示。见美国专利公开号20080124345的图8。
实施例15：人抗-HER-3抗体抑制β-HRG诱发的磷酰基-AKT磷酸化
在下列ELISA试验中，我们研究所述抗-HER-3抗体是否可以阻断配体β-HRG介导的AKT激酶活化。配体介导的AKT活化由蛋白质(Ser473)磷酸化增加检测。
天：以20微克/毫升胶原蛋白I于0.1摩尔醋酸中于37℃包被1X 96孔板4小时。3×105个细胞被接种于正常生长培养基。
第2天：将细胞于100微升不含血清的培养基中饥饿24小时。
第3天：将细胞用5微克/毫升抗-HER-3单克隆抗体于37℃预先孵育1小时，然后以20纳克/毫升β-HRG-EGF结构域(R&D系统公司)处理10分钟。轻弹出培养基，在室温中用4％甲醛PBS溶液固定细胞1小时。移除甲醛溶液，用冲洗缓冲液(PBS/0.1％吐温(Tween)20)冲洗细胞。加入含1％过氧化氢、0.1％叠氮化钠的冲洗缓冲液以淬灭细胞，于室温中孵育20分钟，接着在4℃以PBS/0.5％BSA封闭5小时。加入初级抗体磷酰基-Akt(Ser473)(兔多克隆抗体；细胞信号公司#9217；1:1000)于4℃过夜反应。
第4天：用冲洗缓冲液清洗所述板3次，接着以经PBS稀释5000倍的抗-兔-HRP孵育，于每孔加入0.5％BSA在室温中孵育1.5小时。所述板用冲洗缓冲液清洗3次并用PBS清洗1次。加入四甲基联苯胺(TMB，卡尔生化(Calbiochem)公司)并于650纳米处监测。加入100微升的250纳摩尔HCl以停止该反应，使用Vmax孔板读取仪(赛默实验室系统(Thermo LabSystems))于450纳米处读取吸亮度，参照波长为650纳米。所述抗-HER-3抗体可减少β-HRG介导的AKT的活化，其以磷酸化下降表示。见美国专利公开号20080124345的图9。
实施例16：人抗-HER-3抗体抑制α-HRG/β-HRG介导的MCF7细胞增殖
进行体外试验以测定所述抗体抑制HRG刺激的细胞增殖的能力。2000个MCF7细胞被接种于96孔板上含FCS的培养基中过夜。一式四份于37℃以抗体预先孵育细胞1小时，该抗体经含0.5％FCS的培养基稀释。直接将配体30纳克/毫升α-或20纳克/毫升β-HRG(R&D系统公司)加入抗体溶液以刺激细胞，接着使细胞静置生长72小时。添加阿尔玛蓝(ALAMAREBLUETMTM)(生物来源(BIOSOURCE)公司)并于37℃黑暗中孵育。每30分钟以590纳米波长测量一次吸亮度。该数据于添加阿尔玛蓝后90分钟测量。这些试验显示所述代表性的抗体可抑制人癌细胞中HRG诱导的细胞生长。见美国专利公开号20080124345的图10。
实施例17：人抗-HER-3抗体抑制β-HRG诱发的MCF7细胞迁移
进行细胞移行试验以研究所述抗体是否能阻断细胞迁移。通过添加所示量的抗体至细胞悬浮液以预先孵育经血清饥饿的MCF7细胞，使二者于37℃孵育45分钟。接着取500微升的细胞悬浮液(50,000个细胞)置于包被胶原蛋白I的插入式培养板(Trenswell)(BD费肯(BD Falcon)公司，8微米孔径)的上室中。下室使用仅含750微升的培养基(MEM、氨基酸、丙酮酸钠、青/链霉素、0.1％BSA、不含胎牛血清)或添加配体β-HRG-EGF结构域(R&D系统公司)的培养基。静置于37℃以使细胞迁移8小时并以DAPI染色。手动计算经染色的细胞核；抑制百分比以相对于对照抗体的抑制表示。这些试验显示所述代表性的抗-HER-3抗体可减少HRG诱发的细胞迁移。见美国专利公开号20080124345的图11。
实施例18：集落形成试验(软琼脂试验)
进行软琼脂试验以研究所述抗-HER-3抗体抑制非贴壁依赖性细胞生长的能力。软琼脂集落形成试验是测试转化细胞的标准体外试验，因为只有所述经转化的细胞可生长于软琼脂。
750至2000个细胞(依细胞系而定)以含10微克/毫升标示抗体的IMDM培养基(吉布可(Gibco)公司)预先孵育30分钟，并重悬于0.4％琼脂(狄菲克(Difco)公司的诺布尔琼脂(noble agar))。细胞悬浮液以一式四份接种于96孔板中含20％FCS的0.75％洋菜糖下层。在14天内允许集落形成，接着用50微升MTT(0.5毫克/毫升于PBS中)染色过夜，以Scanalyzer HTS相机系统(莱纳泰克(Lemnatec)公司，乌尔瑟伦(Wuerselen))计算。抗-HER-3抗体可减少MDA-MB361及NCI-ADR乳癌细胞、MKN-28胃癌细胞、HT144黑色素瘤细胞、Skov3卵巢癌细胞、PPC-1前列腺癌细胞、BX-PC3胰脏癌细胞、A431表皮样癌细胞及肺癌细胞的非贴壁依赖性细胞生长。见美国专利公开号20080124345的图12a至12i。
实施例19：人抗-HER-3抗体抑制裸鼠体内人乳癌的生长
治疗性抗体的抗肿瘤疗效通常于人异种移植肿瘤试验中评估。在这些试验中，人类肿瘤以异种移植在免疫不全小鼠体内生长，通过肿瘤生长抑制的程度测量治疗效果。为了测定所述抗-HER-3抗体是否能干扰人乳癌细胞于裸鼠体内的肿瘤生长，5×106个T47D细胞被植入母NMRI裸/裸小鼠。肿瘤生长于小鼠背部的皮下部位。当肿瘤的平均体积达20毫米3开始治疗，此时为植入后8天。在第一次治疗前，小鼠经随机分组及进行统计测试以确定各治疗组间的起始肿瘤体积(平均值、中位数及标准偏差)的一致性。治疗以50毫克/公斤的起始剂量开始，之后为25毫克/公斤腹腔注射每周一次。对照组接受多柔比星(医药级)治疗。所有动物补充0.5毫克/公斤/周的雌激素腹腔注射。治疗组的详细资料如下表8所示。这些试验显示施用抗-HER-3抗体导致肿瘤生长减少。见美国专利公开号20080124345的图13。
表8
Figure BDA0001005164300000731
多柔比星治疗如Boven等人Cancer Research，1992中所述。
实施例20：人抗-HER-3抗体抑制SCID小鼠体内人胰肿瘤的生长
为了测试抗-HER-3抗体对其他实体肿瘤类型的治疗效果，将抗-HER-3抗体U1-53及U1-59于具有已建立源自人胰肿瘤细胞系BxPC3的肿瘤的小鼠中测试。对照组的小鼠接受包括载体对照剂PBS或已确立的治疗性抗体尔必得舒(Erbitux)的治疗。5×106个BxPC3细胞以不含基质胶(matrigel)经皮下接种至CB17SCiD小鼠。已建立的肿瘤的平均体积达140毫米2的小鼠接受50毫克/公斤的U1-53、U1-59、尔必得舒或等体积的PBS腹膜内注射治疗。之后的试验期间小鼠接受每周一次25毫克/公斤注射。
U1-53及U1-59以抑制细胞静止的方式减少人胰肿瘤的生长。见美国专利公开号20080124345的图14。在本试验中特别的是，U1-53及U1-59在延迟肿瘤生长方面比EGF-R靶向性抗体尔必得舒更为有效。这些试验显示抗-HER-3抗体的治疗效果可与指标治疗剂相比。
实施例21：人抗-HER-3抗体与抗-EGF-R抗体的组合增加抗肿瘤活性
过度增殖性疾病的靶向性抗体的单一治疗通常会遭遇一些问题，诸如，一方面发生对药物的抗药性而另一方面抗原性改变。举例来说，长期治疗后失去抗原性可能使肿瘤细胞对治疗性抗体不敏感，因为这些不表达或失去该靶向抗原的肿瘤细胞具有选择性生长的好处。利用抗体与靶向肿瘤细胞上不同受体的治疗性抗体或其他抗肿瘤剂的组合可能可以避免这些问题。干扰多重信号传递通路或以多重干预步骤干扰甚至相关的通路途径也可能提供治疗好处。这些组合的治疗方案可能更为有效，因为它们结合二种抗癌剂，其每一种经由不同的作用机制作用。
为了证实抗-HER-3抗体U1-53及U1-59作为适当的组合药剂的可行性，我们比较U1-53或U1-59单一治疗与其中U1-53或U1-59与抗-EGR特异性抗体尔必得舒组合的疗法。5×106个BxPC3细胞与基质胶(matrigel)被皮下接种至CB17SCID小鼠。当肿瘤体积达200毫米3时，小鼠被随机分配至各治疗组。每周经腹腔注射施用单一药剂U1-53、U1-59及尔必得舒或任一抗-HER-3抗体与尔必得舒的的组合或二种抗-HER-3抗体的鸡尾酒治疗。所有抗体以50毫克/公斤/周的单次起始剂量施用，之后每周注射25毫克/公斤共6周。对照组接受吉西他滨(gemcitabine)每二周一次(120毫克/公斤)、混合人源IgG每周一次或载体(PBS)每周一次注射。这些治疗配方详列于下表9。
表9
Figure BDA0001005164300000741
抗体U1-53及U1-59以单一药剂施用时可达到与吉西他滨相同程度的人胰肿瘤的生长的延迟，吉西他滨通常被用来作为标准的抗胰癌化学治疗。尔必得舒与U1-53或U1-59的共同施用相较于U1-53、U1-59或尔必得舒中的任一种剂的单一疗法导致更显著的肿瘤生长减少。因此，通过组合抗-HER-3抗体与靶向不同的肿瘤抗原的适当抗体可达到有利的治疗反应。见美国专利公开号20080124345的图15。
总结来说，所述抗-HER-3抗体具有体内抗人类肿瘤的有效治疗效果。它们可与其他抗肿瘤治疗剂有效地组合以增加抗肿瘤活性。
实施例22：人抗-HER-3抗体抑制nu/nu小鼠体内人黑色素瘤的肿瘤生长
erbB受体家族的成员(包括HER-3)在各种上皮癌中异常地表达，已知它们对许多这类实体肿瘤的生长及存活非常重要。这些肿瘤包括黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、胃癌、乳癌、结直肠癌、胰癌及卵巢癌。为了证实抗-HER-3抗体的抗癌活性并不限于单一肿瘤类型例如胰癌(见实施例21)，而可被用于治疗许多HER-3依赖性肿瘤，我们在其他异种移植试验中测试U1-53及U1-59。人黑色素瘤细胞HT144(5×105)经皮下注射至CB17SCID小鼠，随后立即腹腔注射50毫克/公斤的U1-53及U1-59、等体积的PBS或200毫克/公斤的达卡巴嗪(dacarbazine)(DITC)。之后，小鼠接受25毫克/公斤的U1-53或U1-59每周注射一次，然而DITC以200毫克/公斤每二周注射一次。
计算每个治疗组的平均肿瘤体积。施用所述抗体导致该人黑色素瘤的生长相较于经载体对照治疗的肿瘤减少。见美国专利公开号20080124345的图16。这些结果证实本发明的抗体的治疗活性并不受限，可靶向各种各样的HER-3表达癌。
实施例23：人抗-HER-3抗体抑制小鼠体内结肠癌异种移植的生长
HT-29人结肠癌细胞被悬浮于含有2:1比例的基质胶的培养基中至终浓度10×106细胞/毫升。0.2毫升的细胞悬浮液经皮下注射至4至5周大的CD1nu/nu小鼠的右侧腹。共使用95只小鼠。
小鼠经随机分配至对照及治疗组。治疗从同一天开始。治疗期为29天。试验将结束时，在施用治疗后3小时自每组收集3个肿瘤。肿瘤经急速冷冻及储存于-80℃。
进行下列治疗程序：
-对照组：非特异性人源IgG 25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组：抗体U1-53，25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组：抗体U1-7，25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组：抗体U1-59，25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组5-FU：5-氟尿嘧啶，50毫克/公斤，9天×5，腹腔内
计算各组的平均肿瘤体积。施用所述抗体导致该HT-29结肠癌肿瘤的生长相较于经非特异性人源IgG1治疗的肿瘤减少。见美国专利公开号20080124345的图17。
实施例24：人抗-HER-3抗体抑制小鼠体内肺癌的生长
Calu-3人非小细胞肺癌细胞被悬浮于含有1:1比例的基质胶的培养基至终浓度5×106细胞/毫升。0.05毫升的细胞悬浮液经皮下注射至9周大的母CB17scid小鼠的右侧腹。共使用60只小鼠。
小鼠经随机选择至对照及治疗组。治疗从同一天开始。治疗期为32天。
进行下列治疗程序：
PBS载体组
-hG对照组：非特异性人源IgG：25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组抗体U1-53：25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组抗体U1-7：25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组抗体U1-59：25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
计算每个对照及治疗组中的平均肿瘤体积。施用所述抗体导致该人非小细胞肺癌异种移植的生长相较于经PBS载体对照或非特异性人源IgG治疗的肿瘤减少。见美国专利公开号20080124345的图18。
实施例25：人抗-HER-3抗体抑制Balb/C-小鼠体内人胰肿瘤的生长
人胰脏BxPC3肿瘤细胞被悬浮于含有2:1比例的基质胶的培养基中至终浓度5×106细胞/毫升。0.2毫升的细胞悬浮液经皮下注射至5至7周大的母BalbC nu/nu小鼠的右侧腹。共使用100只小鼠。
小鼠经随机分配至对照及治疗组。治疗从同一天开始。治疗期为27天。
进行下列治疗程序：
-hIgG对照组：非特异性人源IgG2，25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组抗体U1-53：25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组抗体U1-7：25毫克/公斤，每周二次，腹腔内
-治疗组抗体U1-59：25毫克/公斤，每周一次，腹腔内
-健泽治疗组：吉西他滨，80毫克/公斤，每周一次，腹腔内
计算每个对照及治疗组中的平均肿瘤体积。施用所述抗体导致该人胰脏肿瘤的生长相较于经非特异性人源IgG或健泽治疗的肿瘤减少。见美国专利公开号20080124345的图19。
人胰脏肿瘤中HER-3的抑制也可于药物药效学实验中显示。如上文培养BxPC3肿瘤异种移植。3只小鼠接受500微克的IgG1对照抗体治疗，3只小鼠接受500微克的抗-HER-3抗体U1-59治疗。小鼠于第1及第4天治疗，接着在第5天被处死以测量抗体依赖性抑制HER-3的磷酸化(pHER-3)。
肿瘤于含蛋白酶抑制剂的标准RIPA缓冲液中均质化。50微克清澈溶解物在4至20％Tris-甘氨酸胶体上分离，转移至硝化纤维素膜并以3％牛血清白蛋白(BSA)封闭。利用抗-pHER-3抗体(抗体21D3，细胞信号技术(Cell signaling technology)公司)进行免疫印迹。抗-肌动蛋白抗体(AB a-2066，西格玛(Sigma)公司)被用来作为对照。
表达是利用增强的化学发光剂检测的(纽泽西州皮斯卡塔威(Piscataway,NJ)安玛西亚生物科技(Amersham Biosciences)公司)。影像利用Versadoc 5000显影系统(加州赫克利斯市(Hercules,CA)伯乐(BioRad)公司)捕捉。施用人抗-HER-3-抗体U1-59后，无法检测到HER-3的磷酸化。见美国专利公开号20080124345的图20。因此，所述抗体可显著地减少人胰脏肿瘤细胞中的HER-3活化。
实施例26：U1-59与第二剂的组合抑制异种移植试验中的肿瘤生长
Calu-3NSCLC肿瘤异种移植模型被用来评估抗-HER-3抗体(U1-59)单独使用或与帕尼单抗或埃罗替尼组合时的疗效。为了测定活体内疗效，负荷～200毫米3Calu-3NSCLC异种移植的小鼠以抗-HER家族的抑制剂或对照剂治疗每周二次。其他试验以A549细胞进行。在与帕尼单抗的组合试验中，IgG1被用来作为U1-59的阴性对照，IgG2被用来作为帕尼单抗的阴性对照。如图1所示，虽然仅使用100微克的U1-59或100微克的帕尼单抗相对于对照组大幅减少肿瘤生长，但这两种二剂每一种100微克的组合完全抑制肿瘤生长(组合治疗对比每种剂单独治疗的p<0.0001)。在与埃罗替尼的组合试验中，IgG1被用来作为U1-59的阴性对照，埃罗替尼载体被用来作为埃罗替尼的阴性对照。如图2所示，100微克U1-59与25微克埃罗替尼的组合比每种剂单独使用具有更高的抑制效应。U1-59与埃罗替尼的组合比单独使用U1-59显著地更为有效(p＝0.0376)。
实施例27：U1-59与HER抑制剂的组合抑制乳癌及卵巢癌细胞的非贴壁依赖性生长
进行实验以评估U1-59与HER抑制剂帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或西妥昔单抗的组合对于SkBr-3(基底或经HRG刺激)及MDA-MB-435(基底)癌细胞的非贴壁依赖性生长的效应。IgG被用来作为所有试验的阴性对照。肿瘤细胞在有或无HRG存在时经6至10天形成集落，以MTT染色4至6小时后加以定量。U1-59作为单一治疗时不抑制MDA-MB 435细胞的集落生长，但抑制50％的SkBr-3细胞集落生长(p<0.001)，与其他HER抑制剂组合时抑制高达95％(p<0.05)。举例来说，5微克/毫升帕妥珠单抗或曲妥珠单抗与5微克/毫升U1-59的组合相较于单独使用任一剂显著减少基底SkBr-3乳癌细胞的非贴壁依赖性生长(图3)，帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或西妥昔单抗与U1-59的组合(p<0.006)比单独使用U1-59显著地更为有效地减少经HRG刺激的SkBr-3细胞生长(图4)。类似地，U1-59与帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或西妥昔单抗的组合抑制基底卵巢癌细胞(MDA-MB-435)的集落形成显著地优于(p<0.002)单独使用U1-59的效果(图5)。
实施例28：U1-59与HER-2抑制剂或化学治疗剂的组合减少癌细胞增殖
进行试验以评估U1-59与HER-2抑制剂或化学治疗剂的组合对癌细胞增殖的影响。特别地进行下列MDA-MB-175VII乳癌细胞的试验：
U1-59与曲妥珠单抗
对照＝DMSO+75微克/毫升IgG1+PBS
10微克/毫升U1-59
75微克/毫升曲妥珠单抗
10微克/毫升U1-59+75微克/毫升曲妥珠单抗
U1-59与拉帕替尼
对照＝DMSO+150微克/毫升IgG1
73.5微克/毫升U1-59
0.1微摩尔拉帕替尼
73.5微克/毫升U1-59+0.1微摩尔拉帕替尼
U1-59与吉西他滨
对照＝DMSO+75微克/毫升IgG1+PBS
10微克/毫升U1-59
1微克/毫升吉西他滨
10微克/毫升U1-59+1微克/毫升吉西他滨
U1-59与顺铂
对照＝DMSO+75微克/毫升IgG1+PBS
10微克/毫升U1-59
1微克/毫升顺铂
10微克/毫升U1-59+1微克/毫升顺铂
MDA-MB-175VII乳癌细胞在经HRG刺激之前与U1-59和/或其他药剂一起孵育1小时。4天后，经处理的细胞的生长由阿尔玛蓝(ALOMAR BLUETMTM)测量。在这些试验中，U1-59以单一药剂使用时减少经HRG刺激的MDA-MB-175VII增殖高达40％(p<0.05)，且当与曲妥珠单抗或拉帕替尼组合时减少高达80％的细胞增殖(p<0.05)(图6A和6B)。值得注意的是，当U1-59与标准治疗的化学治疗剂组合(吉西他滨和顺铂；p<0.05对比单独使用任一种剂)时，也于MDA-MB-175VII细胞观察到增加的活性(图6C和6D)。在这些试验中的任一项中，U1-59与HER-2抑制剂的组合相较于单独使用任一种剂更有效地减少MDA-MB175VII细胞的增殖。
类似试验是在经HRG刺激的ZR-75-30乳癌细胞和经HRG刺激的BT474乳癌细胞中用U1-59与帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或拉帕替尼进行的(分别为图7和图8)。在每个实例中，U1-59与拉帕替尼的组合对于细胞增殖具有最高的抑制效果。相较于单独使用单一药剂治疗，U1-59与帕妥珠单抗或曲妥珠单抗或拉帕替尼的组合显著地(p<0.004)比单独使用U1-59更为有效。组合U1-59与帕妥珠单抗、曲妥珠单抗及西妥昔单抗中的一种或多中在经HRG刺激的DLD-1结肠癌细胞和经HRG刺激的HCC-1569乳癌细胞中具有类似效应，如图9和图10所示。此外，U1-59与曲妥珠单抗或拉帕替尼的组合在经HRG刺激的SkBr-3乳癌细胞中也比单独使用U1-59更为有效(p<0.004)(图11)。
在其他试验中，头颈癌细胞(FaDu)于生长培养基(MEM+10％FBS+1X PSG)中孵育并以IgG对照、U1-59、帕尼单抗或U1-59与帕尼单抗的组合治疗。于37℃孵育5天后，以阿尔玛蓝(ALOMAR BLUETMTM)测量增殖。以单一药剂使用时，U1-59减少15％至20％的FaDu细胞增殖，然而U1-59与帕尼单抗的组合导致大于80％的减少。U1-59与帕尼单抗的组合导致显著(p＝0.001相较于最佳单一药剂活性)改善单独使用任一种剂的用途(图12)。
实施例29：U1-59与其他HER抑制剂的组合抑制信号传导
单独使用U1-59或使用U1-59与西妥昔单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或拉帕替尼的组合对信号传导的影响在未经刺激的MDA-MB-175VII乳癌细胞、经HRG刺激的SkBr-3乳癌细胞、经HRG刺激的Ls174T结肠癌细胞及经HRG刺激的HCC-1569乳癌细胞中测量。细胞经图13至16所示的剂处理，以磷酰基特异性抗体进行蛋白质印迹法以评估HER-3、Akt及ERK的磷酸化。U1-59与不论帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或拉帕替尼的组合都在所有测试的细胞类型中相较于单一药剂治疗进一步减少HER-3、Akt及ERK的磷酸化。U1-59与西妥昔单抗的组合在这些试验中似乎较不具有效的协同性。
类似的试验在经U1-59单独治疗或经U1-59与帕尼单抗或拉帕替尼组合治疗的A549肺泡上皮细胞(图17)及Calu3NSCLC细胞(图18)中进行，使用蛋白质印迹法评估Akt、EGF-R、HER-2、HER-3、HER-4及ERK的磷酸化。U1-59与帕尼单抗的组合对于A549细胞中HER-3的磷酸化具有最明显的效应，然而该组合在Calu3细胞中对于Akt及EGF-R的磷酸化较为有效。
进行其他试验以评估含血清培养基中经10微克/毫升U1-59、其他HER家族抗体或对照单克隆抗体治疗的A549细胞的体外疗效及非贴壁依赖性生长。肿瘤细胞集落在无外源性配体存在的条件下经10天形成，以MTT染色及使用Scanalyzer HTS相机显影系统定量。U1-59在A549细胞系中抑制50％的集落生长(p<0.001)且对比IgG对照或其他HER单克隆抗体(p<0.05)导致A549NSCLC异种移植模型中的肿瘤停滞。
这些结果证实U1-59抑制体外乳房细胞系的近端及远端HER-3致癌信号传递，且乳癌细胞对于U1-59的单一剂治疗和与抗-HER药剂的组合治疗敏感。
实施例30：U1-59将拉帕替尼的体内活性敏感化
为了评估U1-59与拉帕替尼的体内组合效应，在小鼠植入人乳癌细胞(HCC-1569)并以U1-59或拉帕替尼单独治疗或组合治疗。允许肿瘤生长超过或等于100毫米3的体积，接着以对照剂、拉帕替尼、U1-59或U1-59与拉帕替尼的组合治疗小鼠。如图19所示，单独使用U1-59并不抑制HCC-1569肿瘤生长，单独使用拉帕替尼造成相较于对照组某种程度但无显著性的肿瘤生长抑制(p＝0.16)。然而，拉帕替尼与U1-59的组合导致显著抑制肿瘤生长(p<0.02对比对照组或p<0.05对比拉帕替尼)。
这些结果显示U1-59与拉帕替尼的组合导致协同性抑制体内HCC-1569肿瘤生长。这一结果是特别令人感兴趣和令人振奋的，因为其显示即使对单独使用U1-59或拉帕替尼可能无反应的肿瘤类型也可以二者的组合非常有效地治疗。
实施例31：抗-HER-3抗体作为诊断剂的用途
抗-HER-3单克隆抗体可被用于诊断恶性疾病。HER-3在肿瘤细胞上以相对于正常组织非常不同的方式表达，因此，分析HER-3的表达有助于初步诊断实体肿瘤、分期及分级实体肿瘤、评估增殖性疾病及肿瘤的预后标准及患有HER-3阳性肿瘤的患者的风险管理。
A.检测样品中的HER-3抗原
开发了检测样品中的HER-3抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)。在此试验中，使微滴定板(如96孔微滴定板或384孔微滴定板)的孔槽用定向抗HER-3抗原的一级完全人源单克隆抗体吸附数小时。经固定的抗体被当成捕捉抗体以捕捉可能存在测试样品中的任何HER-3抗原。将孔清洗并用封闭剂如奶蛋白或白蛋白处理以避免分析物的非特异性吸附。
随后用怀疑含有HER-3抗原的测试样品或含有标准量的HER-3抗原的溶液处理孔。这样的样品为例如来自循环HER-3抗原的量疑似被认为可为病理学诊断的受治疗者的血清样品。将该测试样品或标准物润洗移除之后，用经生物素轭合来标记的二级完全人源抗-HER-3单克隆抗体处理孔。该经标记的抗-HER-3抗体作为检测抗体。将多余的二级抗体润洗移除后，用经抗生物素蛋白轭合的辣根过氧化酶(HRP)和适当的发色底物处理孔。测试样品中的HER-3抗原的浓度通过与得自标准样品的标准曲线比较来确定。
B.利用免疫组织化学(IHC)侦测HER-3抗原
为了确定IHC测定组织切片中的HER-3抗原，先将石蜡包埋的组织于二甲苯中脱蜡2×5分钟，然后以100％乙醇2×3分钟、95％乙醇1分钟水合并用蒸馏水润洗。因福尔马林固定及石蜡包埋所遮蔽的抗原表位利用抗原表位去遮蔽、酶消化或皂苷加以暴露。对于抗原表位去遮蔽，于表位修复溶液例如2N HCl溶液(pH1.0)中将石蜡切片于蒸炉、水浴或微波炉中加热20至40分钟。在酶消化方面，使组织切片于不同的酶溶液(诸如蛋白酶K、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、胃蛋白酶等)中以37℃孵育10至30分钟。
在润洗移除抗原表位修复溶液或多余的酶后，组织切片以封闭缓冲液处理以防止非特异性相互作用。加入在稀释缓冲液中适当稀释的初级抗体，于室温中孵育1小时或过夜孵育。润洗移除多余的初级抗体，将组织切片置于过氧化酶封闭溶液中于室温孵育10分钟。在另一清洗步骤后，组织切片与用可作为酶的作用点的基团标记的二级抗体一起孵育。所述实例为用生物素标记的二级抗体，其可被与链霉抗生物素蛋白偶合的辣根过氧化酶识别。抗体/酶复合物的检测通过与适当的发色底物一起孵育来完成。
C.测定病患血清中的HER-3抗原浓度
开发三明治ELISA以定量人血清中的HER-3浓度。用于三明治ELISA中的二中完全人源单克隆抗-HER-3抗体识别HER-3分子的不同结构域且不竞争结合(见例如实施例8)。ELISA如下述进行：将包被缓冲液中(0.1摩尔重碳酸钠，pH9.6)中2微克/毫升的浓度的50微升的捕捉抗-HER-3抗体包被于ELISA板上(飞世尔(Fisher)公司)。经4℃过夜孵育，用200微升的封闭缓冲液(0.5％BSA、0.1％吐温20、0.01％硫柳汞于PBS中)于25℃处理所述板1小时。用溶于PBS中0.05％吐温20的(冲洗缓冲液，WB)清洗该板(3次)。正常或患者血清(临床体学(Clinomics)，生物改良(Bioreclaimation)公司)以含50％人血清的封闭缓冲液稀释。将所述板加入血清样品于4℃过夜孵育，以冲洗缓冲液清洗，然后加入100微升/孔的生物素基化检测抗-HER-3抗体于25℃孵育1小时。清洗后，用HRP-链霉抗生物素蛋白将板孵育15分钟，和先前一样清洗，接着用100微升/孔的溶于过氧化氢中的邻苯二胺(西格玛(Sigma)公司发色溶液)处理以供发色。该反应以50微升/孔的硫酸(2摩尔)终止，利用ELISA孔板读取仪于492纳米处分析。血清样品中的HER-3抗原浓度利用四参数曲线拟合程序，通过与经纯化的HER-3抗原的稀释液比较来计算。
将患者的癌症分期：根据前述结果及A、B及C项的讨论，根据该HER-3抗原的表达量将受治疗者的癌症分期是可能的。在给定类型的癌中，从被诊断为处于该疾病进行中的不同阶段和/或处于该癌症的治疗处理的不同时间点的受治疗者采集血液样品。血液样品中的HER-3抗原的浓度利用特异性确定存在的抗原的量的方法测定。该方法包括ELISA方法，诸如在A及B项中描述的方法。利用提供进行或治疗的每个阶段中统计学上显著的结果的样品群，可定义被认为是每个阶段的表征的HER-3抗原的浓度范围。
为了将所研究的受治疗者的癌的进行分期，或为了表征受治疗者对治疗疗程的反应，从该受治疗者采集血液样品并测定存在于该样品中的HER-3抗原的浓度。所获得的浓度被用于确定该值落在哪一个浓度范围。所确定的范围与在已诊断的受治疗者的不同族群中所确定进行阶段或治疗阶段相关联，藉此提供所研究的受治疗者的分期。
根据多种因素例如HER-3的表达，本文所述的抗-HER-3抗体被用于治疗某些过度增殖性或HER-3相关疾病。肿瘤类型诸如乳癌、胃肠癌、胰癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤及其他HER-3表达或过度表达的癌是以本文所描述的组合疗法治疗的适应症实例，不过适应症并不限于上述疾病。此外，下列病患族群可能得益于本文所述的治疗：
·不符合抗-HER-2单克隆抗体治疗资格的患者
·对抗-HER-1单克隆抗体或小分子抗-EGF-R抑制剂产生抗药性的患者
·对埃罗替尼或吉非替尼产生抗药性的NSCLC病患
抗-HER-3抗体在所谓的“组合疗法”中与一种或多种其他剂组合使用。所述组合疗法包括但不限于本文公开的药剂。抗-HER-3抗体与其他剂的组合疗法可延长病患的存活、增加至肿瘤进行时间或增进病患的生活质量。程序及给药方案将探讨治疗效果及减少标准治疗诸如化学治疗或放射线治疗的常用剂量的能力。
以抗-HER-3抗体治疗人类：为了测定抗-HER-3抗体治疗于人类肿瘤病患的体内效果，所述人类患者在一段时间内接受有效量的抗-HER-3抗体的注射。在治疗期间的周期性时间点，监测人类患者以测定他们的肿瘤进性，特别是肿瘤是否生长和转移。
相较于以现行标准医疗治疗的肿瘤病患的肿瘤生长和转移的量，以抗-HER-3抗体治疗的肿瘤病患的肿瘤生长和/或转移的量较低。
以抗-HER-3抗体轭合物治疗：为了测定抗-HER-3抗体轭合物的体内效果，展现肿瘤的人类病患或动物在一段时间内接受有效量的抗-HER-3抗体轭合物的注射。举例来说，所施用的抗-HER-3抗体轭合物为DM1-抗-HER-3抗体轭合物、耳抑素-抗-HER-3抗体轭合物或放射性同位素-抗-HER-3抗体轭合物。在治疗期间的周期性时间点，监测人类患者或动物以测定他们的肿瘤进行，特别是肿瘤是否生长和转移。
相较于展现肿瘤及接受替代疗法治疗的对照病患或动物，展现肿瘤及接受例如DM1-抗-HER-3抗体或放射性同位素-抗-HER-3抗体轭合物治疗的人类患者或动物的肿瘤生长的转移的量较低。可用于动物的对照DM1-抗体包括含有与该抗-HER-3抗体的相同同种型的但更具体地不具有与HER-3肿瘤抗原结合的能力的抗体连接的DM1的轭合物。可用于动物试验的对照放射性同位素-抗体包括含有与该抗-HER-3抗体的相同同种型的但更具体地不具有与HER-3肿瘤抗原结合的能力的抗体连接的放射性同位素的轭合物。注意：该对照轭合物不施用于人类。
实施例33：根据临床前药物动力学、药物药效学及疗效资料识别抗-HER-3单克隆 抗体的人体首次使用剂量及计划
进行研究以利用临床前模型中的临床前药物动力学(PK)、BxPC3异种移植小鼠抗肿瘤疗效及药物药效学(PD)数据，预测目标反应的最小有效剂量配方。
负载约200毫米3的已建立的BxPC3胰异种移植的小鼠每周接受二次25、100、200、500微克/小鼠的U1-59治疗。BxPC3异种移植肿瘤中的pHER抑制由蛋白质印迹法分析。PK/PD/疗效模型(根据Simeoni等人(2004)Cancer Res.64:1094-1101)用于前瞻性地选择后续试验的剂量及给药时间。为了确认该PK/PD/疗效模型，BxPC3胰肿瘤负荷小鼠经400微克/小鼠每二周一次及200微克/小鼠每二周一次、每周一次及每周二次的治疗。基于体重(BW)的跨物种质量度被用于根据在小鼠、大鼠及猴中得到的血清浓度预测U1-59在人类中的PK参数。动物中的药物浓度、pHER-3抑制及跨物种PK质量度之间的关系被用于选择人类首次使用研究的最小有效剂量。
以U1-59治疗BxPC3异种移植导致以剂量及给药时间依赖性地统计学上显著地抑制肿瘤生长及pHER-3的量(p<0.05)。相较于IgG对照治疗组，U1-59 400微克/小鼠每二周一次及200微克/小鼠每二周一次、每周一次及每周二次的治疗分别导致50％、33％、74％及70％的肿瘤生长抑制(p<0.05)及30％、58％、23％及20％的pHER-3抑制(定量性蛋白质印迹分析)。每个剂量组于尸体剖检时的U1-59血清浓度分别为(平均值(标准偏差))2.07(0.97)、0.45(0.21)、3.08(0.82)及34.9(9.1)微克/毫升。要达到90％最大pHER-3抑制(IC90)所需的预估最低浓度经估计为约3微克/毫升。所开发的PK/PD/疗效模型预测平均肿瘤体积(R2＝0.925)。人类中的清除率(CL)及起始分布体积(Vd)据估计为11毫升/天/公斤及28毫升/公斤。比较模拟的人类PK概况表明应展现线性PK的每二周>3毫克/公斤的剂量可能在二周投药期间导致>90％的pHER-3抑制。
考虑到PK/PD/疗效关系的发展，在BxPC3胰异种移植模型中的抗肿瘤疗效与增加的U1-59血清浓度及减少的pHER-3量有关。此关系被用于决定在人类首次使用(FIH)研究中的U1-59剂量及给药时间。
实施例34：再活化试验
A549细胞被接种至Ham's F-12培养基(吉布可(Gibco)公司)，所有培养基均添加10％FBS(犹他州罗根市(Logan,UT)海克隆(Hyclone)公司)及1倍L-谷氨酰胺(吉布可公司)。细胞经血清饥饿过夜。将培养基更换成新鲜不含血清的培养基，使细胞于37℃经50微克/毫升U1-59或5微摩尔吉非替尼的单独处理或经U1-59与吉非替尼的组合处理1或24小时。细胞的个别处理时间点后以冷PBS清洗细胞，利用含200微摩尔苯甲基磺酰氟(PMSF)(福卢卡生化(Fluka Biochemica)公司)、200微摩尔暂停蛋白酶抑制剂鸡尾酒套件(皮尔斯(Pierce)生技公司)及200微摩尔原钒酸钠(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO)西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)公司)的RIPA缓冲液(20毫摩尔Tris-HCI pH 7.5，1％Igepal，1％脱氧胆酸钠，150毫摩尔NaCl，0.1％SDS，1％Triton X-100)溶解细胞。使溶解物通过QIAshredder柱(凯杰(Qiagen)公司)，洗脱组分利用分光亮度计(加州富勒顿(Fullerton,CA)贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司)定量。根据制造商的说明，使用ELISA Duoset(R&D系统公司)一式两份(duplicate)分析每孔50微克的蛋白质中的pHER3。结果显示于图20。
其他实施方案
应理解的是虽然本发明已连同其详细说明一起描述，但前述说明预期为说明性的而非限制由所附的权利要求所界定的本发明的范围。其它方面、优点及修饰包含在以下权利要求的范围内。
表10：CDR序列
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Claims (27)

1.第一剂与第二剂在制备用于治疗或预防受治疗者的HER-3相关疾病的药物或套件中的用途，其中所述第一剂是与HER-3结合的抗原结合蛋白，且所述抗原结合蛋白包含SEQ IDNO:70的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:72的轻链氨基酸序列；并且
其中所述第二剂选自由帕尼单抗、拉帕替尼、埃罗替尼组成的组。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗原结合蛋白针对HER-3的胞外结构域。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗原结合蛋白与HER-3的结合减少HER-3介导的信号转导。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗原结合蛋白与HER-3的结合减少HER-3的磷酸化。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗原结合蛋白与HER-3的结合减少细胞增殖。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗原结合蛋白与HER-3的结合减少细胞迁移。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗原结合蛋白与HER-3的结合增加HER-3的下调。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人源抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述抗体片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。
10.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述抗原结合蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。
11.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述第一剂为与HER-3结合的抗原结合蛋白，并且其中所述抗原结合蛋白与效应基团偶合。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述效应基团为放射性同位素、毒素、或治疗性部分。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述治疗性部分选自由刺孢霉素、耳抑素-PE、格尔德霉素、美登素及其衍生物组成的组。
14.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述第二剂为帕尼单抗。
15.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述第二剂为拉帕替尼。
16.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述第二剂为埃罗替尼。
17.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述药物或套件还包含其他治疗剂和/或放射性疗法。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述其他治疗剂为抗肿瘤剂。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述抗肿瘤剂为抗肿瘤抗体或化学治疗剂。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述化学治疗剂选自由卡培他滨、蒽环类、多柔比星、环磷酰胺、紫杉醇、多西他奇、顺铂、吉西他滨或卡铂组成的组。
21.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述第一剂和所述第二剂通过静脉、皮下、肌肉或口服施用。
22.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述疾病为过度增殖性疾病。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述疾病选自由乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌和鳞状细胞癌组成的组。
24.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其包含以每6周至少一次的频率施用1至20mg/kg体重剂量的所述第一剂。
25.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其包含以每6周至少一次的频率施用1至20mg/kg体重剂量的所述第二剂。
26.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其还包含在施用前使用包含分析预测性标志以选择患有HER-3相关疾病的受治疗者的方法。
27.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其还包含在施用后监测治疗结果。
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