ES2294193T3 - Identificacion de moleculas de alta afinidad mediante deteccion con dilucion limitada. - Google Patents
Identificacion de moleculas de alta afinidad mediante deteccion con dilucion limitada. Download PDFInfo
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Abstract
Método de determinación de las afinidades de unión relativas de anticuerpos para un antígeno, que comprende: proporcionar un anticuerpo de referencia que se une a un antígeno diana; determinar la concentración limitante del antígeno diana para el anticuerpo de referencia, en el que la concentración limitante maximiza el intervalo detectable de afinidades de anticuerpo dentro de un intervalo de concentración predeterminado para un conjunto de disoluciones de anticuerpo de prueba; proporcionar un conjunto de disoluciones de anticuerpo de prueba, en el que la concentración de anticuerpos en cada disolución de anticuerpo de prueba está dentro del intervalo de concentración predeterminado; incubar la concentración limitante de antígeno con cada disolución de anticuerpo de prueba en el conjunto de disoluciones de anticuerpo de prueba; medir el grado relativo con el que los anticuerpos en cada disolución de anticuerpo de prueba se unen a la concentración limitante de antígeno; y clasificar los anticuerpos en cada disolución de anticuerpo de prueba basándose en su afinidad de unión para dicha concentración limitada de antígeno con el fin de determinar la afinidad de unión relativa de cada anticuerpo de prueba para dicho antígeno.
Description
Identificación de moléculas de alta afinidad
mediante detección con dilución limitada.
Las realizaciones de la invención se refieren a
técnicas para determinar las afinidades de unión de moléculas para
un componente de unión a molécula. Más específicamente, las
realizaciones de la invención se refieren a métodos de
determinación de la afinidad de unión relativa de anticuerpos a un
antígeno diana poniendo en contacto cada anticuerpo con diluciones
limitadas de antígeno.
Durante una respuesta inmunitaria se estimulan
las células B para generar anticuerpos que se unen específicamente
a moléculas que activan el sistema inmunitario. Los acontecimientos
de recombinación genética implicados en la síntesis de anticuerpos
permiten que los animales creen una inmensa diversidad de
anticuerpos cada uno con sus propias características tales como
especificidad de unión y afinidad de unión. Actualmente están
usándose anticuerpos para diversas aplicaciones de diagnóstico, de
formación de imágenes o terapéuticas. Los anticuerpos que pueden
usarse de manera satisfactoria para las aplicaciones de diagnóstico,
de formación de imágenes o terapéuticas a menudo requieren
características especiales. En particular, las propiedades cinéticas
del anticuerpo establecen a menudo su utilidad. En general, la
eficacia o idoneidad de un anticuerpo muestra una fuerte correlación
positiva con la afinidad del anticuerpo para su diana. Puesto que
los anticuerpos de mayor afinidad pueden unirse a su diana más
rápido y permanecen unidos a la diana durante más tiempo,
generalmente son eficaces a concentraciones más bajas. Pueden
generarse anticuerpos monoclonales (AcM) mediante una diversidad de
técnicas incluyendo la tecnología de hibridoma, que implica
fusionar las células B que producen anticuerpos con células
cancerosas de mieloma (Kohler & Milstein (1975) Nature 256:
52-53). La célula de hibridoma resultante es una
célula "inmortalizada" que secreta un anticuerpo de
especificidad única (anticuerpo monoclonal). Un método alternativo
para la generación de anticuerpos monoclonales se denomina método de
anticuerpos de linfocitos seleccionados (SLAM), descrito en la
patente estadounidense número 5.627.052 titulada "Methods for the
production of proteins with a desired function" (Métodos para la
producción de proteínas con una función deseada) y en "A novel
strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated
lymphocytes producing antibodies of defined specificities"
Babcook et al. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A.
93:7843-8. Este método permite identificar en
primer lugar células B que están produciendo anticuerpos con
características deseadas tales como especificidad de unión, función
y cinética óptima. Entonces se aíslan las células B seleccionadas y
los genes de dominio variable de anticuerpo que codifican para la
parte de unión del anticuerpo se rescatan mediante técnicas
moleculares, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
y se clonan en vectores de expresión que tienen un dominio de
región constante de anticuerpo. Después se transfectan los vectores
de expresión en células, tales como células CHO o NS0, para
producir moléculas de anticuerpos secretadas. Este procedimiento
permite la producción prácticamente ilimitada del anticuerpo
deseado. También se han usado satisfactoriamente en la generación
de anticuerpos monoclonales otras metodologías tales como
presentación en fago o la inmortalización viral (incluyendo el
virus de Epstein Barr (VEB)) de células B.
Durante el procedimiento SLAM, se examinan
millones de células B para determinar las características cinéticas,
de especificad y de función de los anticuerpos que producen. Para
una diana seleccionada pueden identificarse miles de células B
específicas para la diana. Ejemplos de métodos conocidos de
detección incluyen examinar para detectar anticuerpos que (1) se
unen a antígeno expresados de manera nativa en la superficie
celular, (2) se unen a líneas celulares e inducen apoptosis, (3) se
unen a células y o bien inducen la proliferación o bien bloquean la
proliferación y (4) se unen a ligandos y bloquean la unión del
ligando al receptor y viceversa. Para determinar la afinidad formal
las mediciones de paneles grandes de anticuerpos es un procedimiento
ineficaz, caro y que lleva mucho tiempo para identificar
anticuerpos óptimos. Por consiguiente, lo que se necesita es un
mecanismo sencillo, rápido y preciso para examinar anticuerpos para
determinar sus características de unión relativas.
Watkins et al. han descrito la
determinación de las afinidades relativas de fragmentos de
anticuerpos expresados en Escherichia coli mediante ensayo
de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA). (Watkins et al.
(1997) Anal Biochem 253:37-45). La patente
estadounidense número 5.800.815 se refiere a composiciones y
métodos para tratar la inflamación y otros estados patológicos
usando anticuerpos frente a P-selectina bloqueantes
novedosos.
La presente invención incluye un método para
clasificar cinéticamente cada anticuerpo en un conjunto de
anticuerpos preparando un conjunto de preparaciones de antígeno
diluidas y después de eso midiendo la unión de cada anticuerpo en
el conjunto de anticuerpos a las preparaciones de antígeno diluidas.
Durante el ensayo de unión, se combinan anticuerpo y antígeno, se
deja que la reacción de unión vaya hasta el equilibrio y después de
conseguir el equilibrio se marca preferiblemente cada anticuerpo
con un marcador detectable y se relaciona la intensidad de la señal
del marcador de cada anticuerpo con la afinidad de unión del
anticuerpo para una preparación de antígeno diluida. Puede
realizarse así una comparación de la afinidad relativa de cada
anticuerpo para cada preparación de antígeno particular. Los
anticuerpos que se unen a las preparaciones de antígeno más diluidas
tienen una mayor afinidad relativa para el antígeno mientras que
los anticuerpos que se unen solamente a las preparaciones de
antígeno más concentradas tienen una afinidad de unión relativamente
inferior para el antígeno.
Una realización de la invención es un método de
determinación de las afinidades de unión relativas de anticuerpos
para un antígeno. Esta realización incluye: determinar la
concentración limitante de un antígeno que maximiza el intervalo
detectable de las afinidades del anticuerpo para dicho antígeno;
proporcionar un conjunto de disoluciones de anticuerpo, en el que
se conoce la concentración de anticuerpos en cada disolución de
anticuerpo; incubar la concentración limitante de antígeno con cada
miembro del conjunto de disoluciones de anticuerpo; medir el grado
relativo con el que los anticuerpos en cada miembro del conjunto de
disoluciones de anticuerpo se unen a la concentración limitante de
antígeno; y clasificar los anticuerpos en cada miembro de dicho
conjunto de disoluciones de anticuerpo basándose en su afinidad de
unión para dichas diluciones diferentes con el fin de determinar
las afinidades de unión relativas de cada uno de los diferentes
anticuerpos para dicho antígeno.
Otra realización de la invención es un método de
determinación de las afinidades de unión relativas de un conjunto
de anticuerpos para un antígeno que incluye: proporcionar una
disolución de antígeno que comprende una primera dilución del
antígeno, en la que dicho antígeno está marcado con un primer
marcador, y una segunda dilución de antígeno, en la que dicho
antígeno está marcado con un segundo marcador; proporcionar un
conjunto de disoluciones de anticuerpo, en el que cada disolución
de anticuerpo tiene sustancialmente la misma concentración relativa
de dicho anticuerpo; medir la unión del anticuerpo a la primera
dilución de dicho antígeno; medir la unión del anticuerpo a la
segunda dilución del antígeno; y clasificar el anticuerpo en el
conjunto de disoluciones de anticuerpo que se une a una preparación
de antígeno relativamente más diluida como que tiene una afinidad
relativa superior y el anticuerpo que sustancialmente sólo se une a
preparaciones de antígeno relativamente más concentradas como que
tiene una afinidad de unión relativamente inferior para el
antígeno.
Todavía otra realización es un método de
determinación de las afinidades de unión relativas de un conjunto
de moléculas para un componente de unión a molécula. Este método
incluye: determinar la concentración limitante de un componente de
unión a molécula que maximiza el intervalo detectable de las
afinidades de la molécula para dicho componente de unión a
molécula; proporcionar un conjunto de disoluciones de molécula, en
el que se conoce la concentración de moléculas en cada disolución
de molécula; incubar la concentración limitante de componentes de
unión a molécula con cada miembro del conjunto de disoluciones de
molécula; medir el grado relativo con el que las moléculas en cada
miembro del conjunto de disoluciones de molécula se unen a la
concentración limitante de componentes de unión a molécula; y
clasificar las moléculas en cada miembro de dicho conjunto de
disoluciones de molécula basándose en su afinidad de unión para
dichas diluciones diferentes con el fin de determinar las
afinidades de unión relativas de cada una de dichas diferentes
moléculas para dichos componentes de unión a molécula.
Las realizaciones de la invención se refieren a
métodos para determinar rápidamente las propiedades de unión
diferenciales dentro de un conjunto de anticuerpos. Por
consiguiente, puede determinarse la rápida identificación de
anticuerpos óptimos para la unión a una diana. Cualquier conjunto de
anticuerpos producidos frente a un antígeno diana particular puede
unirse a una variedad de epítopos en el antígeno. Además, los
anticuerpos podrían unirse a un epítopo particular con afinidades
variables. Las realizaciones de la invención proporcionan métodos
para determinar cómo de fuerte o cómo de débil se une un anticuerpo
a un epítopo particular en relación con otros anticuerpos generados
frente al antígeno.
Se proporciona una realización de la invención
preparando un conjunto de preparaciones de antígeno diluidas y
después de eso midiendo la unión de cada anticuerpo en un conjunto
de anticuerpos a las preparaciones de antígeno diluidas. Puede
realizarse así una comparación de la afinidad relativa de cada
anticuerpo para una concentración de antígeno particular. Por
consiguiente, este método distingue qué anticuerpos se unen a la
concentración más diluida de antígeno, o a las preparaciones de
antígeno más concentradas, como parte de un ensayo comparativo para
determinar la afinidad relativa de cada anticuerpo en un
conjunto.
Se proporciona otra realización de la invención
preparando un conjunto de preparaciones de anticuerpo diluidas y
después de eso midiendo la unión de un antígeno a cada una de las
preparaciones de anticuerpo diluidas. Puede realizarse así una
comparación de la afinidad relativa de cada anticuerpo para un
antígeno particular. Por consiguiente, este método distingue si una
concentración particular de un antígeno se une a la concentración
más diluida de preparaciones de anticuerpo, o a las preparaciones de
anticuerpo más concentradas, como parte de un ensayo comparativo
para determinar la afinidad relativa de cada anticuerpo en un
conjunto.
Aunque se da a conocer un procedimiento en el
que puede determinarse la afinidad relativa de un anticuerpo, puede
preverse un protocolo similar para la identificación de fragmentos
de anticuerpos de alta afinidad, ligandos de proteína, moléculas
pequeñas o cualquier otra molécula con afinidad hacia otra. Por
tanto, la invención no se limita sólo a analizar la unión de
anticuerpos a antígenos.
Una realización de la invención proporciona un
método para analizar las propiedades cinéticas de anticuerpos para
permitir clasificar y la selección de anticuerpos con propiedades
cinéticas deseadas. La afinidad, tal como se describe en el
presente documento, refleja la relación entre la velocidad a la que
una molécula se une a otra molécula (constante de asociación,
K_{on}) y la velocidad a la que se produce la disociación del
complejo (constante de disociación, K_{off}). Cuando se combinan
un anticuerpo y una diana en condiciones adecuadas, el anticuerpo
se asociará con el antígeno diana. En algún punto la razón de la
cantidad de unión del anticuerpo y liberación de su diana alcanza
un equilibrio. Este equilibrio se denomina como la "constante de
afinidad" o simplemente "afinidad".
Cuando se comparan las reacciones de unión que
tienen concentraciones idénticas de anticuerpo y de molécula diana,
las reacciones que contienen anticuerpos de mayor afinidad tendrán
más anticuerpos unidos a la diana en equilibrio que las reacciones
que contienen anticuerpos de menor afinidad.
En los ensayos en los que se mide la unión de
una molécula a otra mediante la formación de complejos que generan
una señal, la cantidad de señal es proporcional a las
concentraciones de las moléculas así como a la afinidad de la
interacción. Para los fines de la presente descripción se emplean
ensayos para medir la formación de complejos entre anticuerpos y
sus dianas (en antígenos), en los que las señales que están
midiéndose en tales ensayos pueden ser proporcionales a las
concentraciones de anticuerpo o anticuerpos, la concentración del
antígeno diana y la afinidad de la interacción. Métodos de ensayo
adecuados para medir la formación de complejos
anticuerpo-diana incluyen ensayos de inmunoabsorción
ligados a enzimas (ELISA), ensayos de inmunoabsorción ligados a
fluorescencia (incluyendo sistemas Luminex, sistemas FMAT y FACS),
ensayo radioisotópico (RIA) así como otros que un experto en la
técnica puede seleccionar.
Otro aspecto de la presente invención incluye
métodos para clasificar cinéticamente anticuerpos mediante afinidad
basándose en la intensidad de la señal de un ensayo tal como un
ensayo enumerado anteriormente, cuando la diana o el antígeno se
proporcionan en concentraciones limitantes. Se combinan el
anticuerpo y el antígeno, se deja que la reacción de unión vaya
hasta el equilibrio, y tras conseguir el equilibrio, se realiza un
ensayo para determinar la cantidad de anticuerpo unido a la diana o
al antígeno. Según un aspecto de la presente invención, la cantidad
de anticuerpo unido detectada mediante el ensayo es directamente
proporcional a la afinidad del anticuerpo para la diana o el
antígeno. A concentraciones muy bajas de antígeno algunos
anticuerpos de baja afinidad no generarán una señal detectable
debido a una cantidad insuficiente de anticuerpo unido. A iguales
concentraciones muy bajas de antígeno, los anticuerpos de afinidad
moderada generarán señales débiles y los anticuerpos con alta
afinidad generarán señales fuertes.
Durante un ensayo habitual usando
concentraciones de moderada a alta de la diana, una colección de
anticuerpos diferentes que tienen afinidades diferentes para el
mismo antígeno diana puede generar señales de intensidad igual o
similar. Sin embargo, a medida que la cantidad de antígeno se
diluye, se vuelve posible distinguir las diferencias de afinidad
entre los anticuerpos. Usando concentraciones limitantes de antígeno
diana en el ensayo según las enseñanzas de la presente descripción,
es posible establecer una clasificación cinética de una colección
de anticuerpos frente al mismo antígeno diana.
En condiciones de cantidades limitantes de
antígeno, una colección de anticuerpos frente al mismo antígeno
dará un intervalo de señales desde altas hasta bajas o ninguna
señal, incluso aunque en el ensayo original usando niveles de altos
a moderados de antígeno, algunos de estos anticuerpos pueden haber
producido señales intensidad aparente similar. Así, pueden
clasificarse anticuerpos según la afinidad mediante la intensidad
de sus señales en un ensayo de antígeno limitante llevado a cabo
según las enseñanzas de la presente descripción.
Otro aspecto de la invención es un método de
determinación de anticuerpos con mayores afinidades que los
anticuerpos caracterizados y conocidos actualmente. Este método
implica usar los anticuerpos caracterizados como patrones
cinéticos. Entonces se mide una pluralidad de anticuerpos de prueba
frente a los anticuerpos de patrón cinético para determinar
aquellos anticuerpos que se unen a las preparaciones de antígeno más
diluidas que los anticuerpos de patrón. Después se mide una
pluralidad de anticuerpos de prueba frente al anticuerpo de patrón
cinético para determinar aquellos anticuerpos que tienen más
anticuerpo unido a una preparación diluida dada de antígeno. Esto
permite el descubrimiento rápido de anticuerpos que tienen una mayor
afinidad para el antígeno en comparación con los anticuerpos de
patrón cinético.
En una realización preferida se usa un ELISA en
un ensayo de antígeno limitante según la presente descripción.
Se ha determinado empíricamente que los
sobrenadantes de células B cultivadas secretan generalmente
anticuerpos en un intervalo de concentración de desde 20 ng/ml
hasta 800 ng/ml. Puesto que a menudo existe una cantidad limitada
de sobrenadante a partir de estos cultivos, los sobrenadantes de
cultivo de células B están normalmente diluidos 10 veces para la
mayor parte de los ensayos, dando una concentración de trabajo de
desde 2 ng/ml-80 ng/ml para su uso en ensayos de
determinación de la afinidad. En un aspecto de la invención, la
concentración apropiada del antígeno diana usado para recubrir
placas de ELISA se determinó usando una disolución de referencia a
partir de un anticuerpo monoclonal a una concentración de 100 ng/ml.
Este valor podía cambiar dependiendo del intervalo de concentración
de los anticuerpos de prueba y la afinidad del anticuerpo de
referencia, de modo que puede determinarse empíricamente la
concentración del antígeno diana requerida para dar la mitad de la
señal máxima en una medición basada en ELISA de la unión
anticuerpo/antígeno. Esta determinación se trata en más detalle a
continuación.
Se usó antígeno a una concentración de
recubrimiento óptimo determinada empíricamente en los ensayos de
medición de afinidad para distinguir los anticuerpos producidos
mediante diversos cultivos de células B que dieron un valor de
ELISA mayor que un anticuerpo monoclonal de referencia. Según los
métodos de la presente invención el único modo para obtener una
señal superior a la obtenida usando el anticuerpo de referencia es
si (1) el anticuerpo es de mayor afinidad que el anticuerpo de
referencia o (2) el anticuerpo tiene la misma afinidad pero está
presente en una mayor concentración que el anticuerpo monoclonal de
referencia. Tal como se describió previamente, los anticuerpos en
los sobrenadantes de cultivos de células B están normalmente a
concentraciones de entre 20-800 ng/ml y se diluyen
hasta una concentración de trabajo de entre 2 a 80 ng/ml. En una
realización, se usan anticuerpos de prueba a una concentración de
entre 2 a 80 ng/ml en ensayos que tienen una concentración de
anticuerpo de referencia de 100 ng/ml. La señal conseguida a partir
de los anticuerpos de prueba se compara con la del anticuerpo de
referencia a 100 ng/ml. Si se encuentra que los anticuerpos dentro
del grupo de prueba tienen una señal superior, entonces se supone
que el anticuerpo es de mayor afinidad que el anticuerpo de
referencia.
En otra realización, se clasificaron anticuerpos
generados a partir de hibridomas usando un ensayo de antígeno
cinético limitante en un protocolo basado en ELISA. Se confirmaron
las afinidades de unión para estos anticuerpos mediante
cuantificación y se clasificaron cinéticamente los anticuerpos
usando un sistema Biacore. Tal como se conoce, el sistema Biacore
da valores cinéticos formales para el coeficiente de unión entre
cada anticuerpo y el antígeno. Se determinó que la clasificación
cinética de anticuerpos usando el ensayo de antígeno limitante tal
como se enseña en la presente descripción estaba estrechamente
correlacionada con los valores cinéticos formales para estos
anticuerpos tal como se determinó mediante el método Biacore, tal
como se muestra en la tabla 5 (ejemplo 5).
Brevemente, la tecnología Biacore usa la
resonancia de plasmón superficial (SPR) para medir la separación
del anticuerpo a partir del antígeno a diversas concentraciones de
antígeno y a una concentración conocida de anticuerpo. Por ejemplo,
se cargan los chips con anticuerpo, se lavan y se expone el chip a
una disolución de antígeno para cargar los anticuerpos con
antígeno. Entonces se lava el chip continuamente con una disolución
sin antígeno. Se observa un aumento inicial en SPR a medida que se
forma el complejo de anticuerpo y antígeno, seguido por una
disminución a medida que se disocia el complejo
antígeno-anticuerpo. Esta disminución de señal es
directamente proporcional a la afinidad del anticuerpo. De manera
similar este método puede realizarse en el ensayo inverso con
concentraciones limitadas de anticuerpo que recubren el chip.
Usando la tecnología Luminex (MiraiBio, Inc.,
Alameda, CA) se someten a ensayo anticuerpos para determinar como
se unen a una pluralidad de perlas recubiertas de diferentes
antígenos. En este ensayo cada conjunto de perlas se recubre
preferiblemente con una concentración diferente de antígeno. Puesto
que el lector Luminex tiene la capacidad de multiplexar todos los
conjuntos de perlas, se combinan los conjuntos de perlas y se
determina la unión a anticuerpo para cada uno de los diferentes
conjuntos de perlas. Entonces puede seguirse el comportamiento de
los anticuerpos sobre las perlas recubiertas de manera diferencial.
Una vez normalizado para la concentración de anticuerpos, entonces
los anticuerpos que mantienen un alto grado de unión a medida que
se desplaza desde las concentraciones de antígeno no limitantes
hasta las concentraciones de antígeno limitadas se correlacionan
bien con la alta afinidad. De manera ventajosa pueden usarse estos
desplazamientos diferenciales para clasificar relativamente
afinidades de anticuerpos. Por ejemplo, las muestras con
desplazamientos más pequeños corresponden a anticuerpos de mayor
afinidad y los anticuerpos con desplazamientos más grandes
corresponden a anticuerpos de menor afinidad.
En otra realización de la invención, una serie
de concentraciones limitadas del anticuerpo que está sometiéndose a
prueba se compara con una disolución patrón de anticuerpo. Un método
de este tipo que usa concentraciones limitantes de anticuerpo
parecería que es una "inversa" del método que usa las
concentraciones de antígeno limitantes, pero proporciona un
mecanismo similar para examinar rápidamente un conjunto de
anticuerpos para determinar la afinidad relativa de cada anticuerpo
para el antígeno diana. También pueden usarse otras placas que
están, o pueden estar, químicamente modificadas para permitir el
recubrimiento pasivo o covalente. Un experto en la técnica
relevante puede idear modificaciones adicionales de los métodos
presentados en el presente documento para llevar a cabo un ensayo
usando dilución de anticuerpo limitante para examinar y clasificar
cinéticamente los anticuerpos de prueba.
Las realizaciones del método de ensayo de
antígeno limitante se practican usando un método mediante el cual
el antígeno se une o se fija a una superficie estacionaria antes de
las manipulaciones posteriores. La superficie es preferiblemente
parte de un recipiente en el que pueden producirse manipulaciones
posteriores; más preferiblemente, la superficie está en un matraz o
tubo de ensayo, incluso más preferiblemente la superficie está en el
pocillo de una placa de microtitulación tal como una placa de 96
pocillos, una placa de 384 pocillos o una placa de 864 pocillos.
Alternativamente, la superficie a la que se une el antígeno puede
ser parte de una superficie tal como un portaobjetos o perla, en
el/la que la superficie con antígeno unido puede manipularse en
etapas de unión a y detección de anticuerpos posteriores.
Preferiblemente, el procedimiento mediante el que se une o se fija
el antígeno a la superficie no interfiere con la capacidad de los
anticuerpos para reconocer y unirse a al antígeno diana.
En una realización, la superficie está
recubierta con estreptavidina y el antígeno está biotinilado. En una
realización particularmente preferida, la placa es una placa de
microtitulación, preferiblemente una placa de 96 pocillos, que
tiene estreptavidina que recubre al menos una superficie en cada
pocillo, y el antígeno está biotinilado. De la manera más
preferible, la placa es una placa de 96 pocillos Sigma SA y el
antígeno está biotinilado con biotina Pierce
EZ-link Sulpho-NHS
(Sigma-Aldrich Canada, Oakville Ontario, CANADÁ).
También pueden usarse métodos alternativos de biotinilación que
fijan la molécula de biotina a otros restos.
En el caso poco probable de que no pueda
biotinilizarse un antígeno, pueden sustituirse superficies
alternativas a las que el antígeno puede unirse. Por ejemplo, la
superficie Costar® Universal-BIND^{TM}, que se
está prevista para inmovilizar covalentemente biomoléculas mediante
un hidrógeno que puede extraerse usando luz UV dando como resultado
un enlace carbono-carbono. (Coming Life Sciences,
Coming, NY). Pueden usarse placas por ejemplo, placas de 96
pocillos Costar® Universal-BIND^{TM}. Un experto
en la técnica puede modificar las manipulaciones posteriores en el
caso de que el uso de superficies alternativas tales como Costar®
Universal-BIND^{TM} aumente el tiempo del ensayo
y/o requiera el uso de más antígeno.
En una realización de la presente invención, se
usa un diseño de ensayo de "tablero de ajedrez" para encontrar
la concentración óptima de antígeno unido. Se muestra un ejemplo a
continuación en la tabla 2. La siguiente descripción incluye una
descripción de las etapas para determinar la concentración óptima de
recubrimiento de antígeno biotinilado usando placas de 96 pocillos
recubiertas con estreptavidina. Esta descripción pretende
simplemente ilustrar un modo para poner en práctica diversos
aspectos de la presente invención. El alcance de la presente
invención no se limita a los métodos del ensayo descrito
anteriormente y a continuación, ya que un experto en la técnica
puede poner en práctica los métodos de la presente invención usando
una amplia variedad de materiales y manipulaciones. Métodos que
incluyen, pero no se limitan a; expresión de antígeno en células
(transitoria o estable), usando fagos que expresan diferentes
números de copia de antígeno por fago.
Se selecciona un antígeno que va a someterse a
prueba. Un antígeno de este tipo puede ser, por ejemplo, cualquier
antígeno que pueda proporcionar una diana terapéutica mediante
anticuerpos. Por ejemplo, marcadores tumorales, moléculas de
superficie celular, linfocinas, quimiocinas, proteínas asociadas a
patógeno e inmunomoduladores son ejemplos no limitantes de tales
antígenos.
Una disolución de antígeno a una concentración
inicial, de manera preferible de aproximadamente 1 ug/ml, se diluye
en una serie de diluciones escalonadas. Después se colocan las
muestras diluidas en superficies tales como en los pocillos de una
placa de microtitulación y también se distribuyen réplicas de cada
muestra en las superficies. Las disoluciones de antígeno pueden
contener agentes bloqueantes si se desea. En una realización
preferida, las diluciones en serie de antígeno se distribuyen a
través de las columnas de una placa de 96 pocillos. De manera
específica, se coloca una dilución de antígeno diferente en cada
columna, con réplicas de muestras en cada fila de la columna. En
una placa de 96 pocillos, las réplicas de cada dilución se colocan
en filas A-H bajo cada columna. Aunque las
diluciones de patrón varían de antígeno a antígeno, la serie de
dilución típica comienza en 1 ug/ml y se diluye en serie 1:2 hasta
una concentración final de aproximadamente 900 pg/ml.
En una realización, se diluye el antígeno
biotinilado desde una concentración de 1 \mug/ml hasta 900 pg/ml
de manera horizontal a través de una placa de 96 pocillos. Aunque un
tampón bloqueante preferido es una solución láctea salina tamponada
con fosfato (PBS), pueden sustituirse otros tampones tales como
albúmina sérica bovina (BSA) diluida en PBS. En otra realización,
se diluye antígeno biotinilado desde una concentración de 1 ug/ml
hasta 900 pg/ml en leche desnatada al 1%/1X PBS pH 7,4, y se pipetea
en los pocillos de las columnas 1 a 11 de un placa de
microtitulación Sigma SA (estreptavidina), colocando 8 réplicas de
cada dilución en las filas A-H de cada columna. La
columna 12 se deja en blanco, sirviendo como el control de "sólo
anticuerpo". El volumen final en cada pocillo es de 50 ul. El
antígeno se incuba en la superficie (por ejemplo, en los pocillos
de la placa) durante una cantidad de tiempo adecuada para que el
antígeno se fije a la superficie; el tiempo de incubación, la
temperatura y otras condiciones pueden determinarse a partir de las
instrucciones del fabricante y/o protocolos convencionales para la
superficie que esta usándose. Tras la incubación se elimina la
disolución de antígeno en exceso. Después, si se necesita, se
bloquean las placas con una disolución bloqueante adecuada que
contiene, por ejemplo, leche desnatada, leche en polvo, BSA,
gelatina, detergente u otros agentes bloqueantes adecuados, para
evitar la unión no específica durante las etapas posteriores.
Después se incuban las placas con antígeno
biotinilado durante una cantidad de tiempo adecuada para que el
antígeno se una o se fije a la superficie. Se incuba el antígeno
biotinilado en una placa Sigma SA a temperatura ambiente durante 30
minutos. Entonces se elimina de la placa la disolución de antígeno
biotinilado en exceso. En esta realización no es necesario bloquear
ya que las placas Sigma SA están bloqueadas previamente.
En otra realización que usa placas Costar®
Universal-BIND^{TM}, se adsorbe antígeno de manera
pasiva durante la noche a 4 grados C en 1X PBS pH 7,4, azida al
0,05%. Generalmente, si se usan placas Costar®
Universal-BIND^{TM}, la concentración inicial de
antígeno es una concentración algo mayor, preferiblemente de
2-4 ug/ml. A la mañana siguiente, se elimina la
disolución de antígeno en exceso de la placa o placas Costar®
Universal-BIND^{TM}, preferiblemente mediante
"eliminación rápida" ("flicking"), y cada placa se expone
a luz UV a 365 nm durante cuatro (4) minutos. Después se bloquea
cada placa con leche desnatada al 1%/1x PBS pH 7,4 a 100 ul de
disolución bloqueante por pocillo, durante 30 minutos.
Tras la incubación con antígeno y eliminación de
la disolución de antígeno en exceso, y bloqueo, si es necesario, se
lavan las placas cuatro veces (4X) con agua corriente. Las placas
pueden lavarse a mano o puede usarse una lavadora de microplacas u
otra herramienta de lavado adecuada.
Entonces se añade un anticuerpo de referencia
que reconoce y se une al antígeno. El anticuerpo de referencia es
preferiblemente un anticuerpo monoclonal, pero pueden ser
alternativamente anticuerpos policlonales, ligandos naturales o
receptores solubles, fragmentos de anticuerpo o moléculas
pequeñas.
Una disolución de anticuerpo de referencia,
también conocido como anticuerpo anti-antígeno, a
una concentración inicial, de manera preferible aproximadamente 1
ug/ml, se diluye en una serie de diluciones escalonadas. Las
muestras diluidas se colocan en superficies tales como en los
pocillos de una placa de microtitulación y también se distribuyen
réplicas de cada muestra en las superficies. Se distribuyen
diluciones en serie de anticuerpo de referencia a través de las
filas de una placa de 96 pocillos. Específicamente, cada dilución de
anticuerpo de referencia se coloca en una fila, colocando réplicas
de muestras en cada columna de la fila. En una placa de 96 pocillos
se coloca en cada fila una dilución diferente de anticuerpo de
referencia, colocando réplicas de cada dilución en cada columna a
través de cada fila comenzando en una concentración inicial de
aproximadamente 1 ug/ml de manera progresiva y se diluye 1:2 siete
veces para una serie de siete pocillos. Se usa como la serie de
dilución convencional una concentración final de aproximadamente 30
ng/ml. Las disoluciones de anticuerpo de referencia se incuban con
antígeno unido en condiciones adecuadas determinadas por los
materiales y reactivos que están usándose, de manera preferible
aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. Un experto en la
técnica puede determinar si sería adecuado para una realización
particular la incubación durante tiempos más largos o más cortos o
a temperaturas superiores o inferiores.
Si se desea, la placa puede envolverse de manera
ajustada y puede llevarse a cabo la incubación del anticuerpo de
referencia con antígeno unido con agitación para promover el
mezclado y la unión más eficaz. Pueden incubarse durante la noche
con agitación las placas que contienen anticuerpo de referencia y
antígeno unido, por ejemplo tal como se proporciona por un agitador
de microplacas Lab Line en el ajuste 3.
Las placas se lavan para eliminar anticuerpo de
referencia que no se ha unido, de manera preferible aproximadamente
cinco veces (5X) con agua. A continuación se añade un anticuerpo de
detección marcado que reconoce y se une al anticuerpo de referencia
y se incuba la disolución para permitir la unión del anticuerpo de
detección al anticuerpo de referencia. El anticuerpo de detección
puede ser policlonal o monoclonal. El anticuerpo de detección puede
estar marcado de cualquier manera que permita la detección de
anticuerpo unido al anticuerpo de referencia. El marcador puede ser
un marcador enzimático tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa del
rábano (HRP), o un marcador no enzimático tal como biotina o
digoxigenina, o puede ser un marcador radiactivo tal como ^{32}P,
^{3}H o ^{14}C, o puede ser cualquier otro marcador adecuado
para el ensayo basándose en reactivos, materiales y métodos de
detección disponibles.
Tras el marcado se añaden a cada pocillo de una
placa de microtitulación 50 ul de anticuerpo policlonal de cabra
anti-Fc de IgG humana conjugado con HRP (Pierce
Chemical Co, Rockford IL, número de catalogo 31416) a una
concentración de 0,5 ug/ml en leche desnatada al 1%, 1X PBS pH 7,4.
Después se incuba la placa durante 1 h a temperatura ambiente.
Se elimina la disolución en exceso que contiene
anticuerpo de detección y se lavan las placas con agua
repetidamente, preferiblemente al menos cinco veces con el fin de
eliminar todo el anticuerpo detección que no se ha unido.
La cantidad de anticuerpo de detección unido al
anticuerpo de referencia se determina usando el método apropiado
para medir y cuantificar la cantidad de marcador presente.
Dependiendo del marcador seleccionado, los métodos de medición
pueden incluir medir la actividad enzimática frente a sustrato
añadido, medir la unión a un componente de unión detectable (por
ejemplo para biotina), recuento de centelleo para medir la
radioactividad o cualquier otro método adecuado que va a
determinarse por un experto en la técnica relevante.
En la realización descrita anteriormente que usa
anticuerpo policlonal de cabra anti-Fc de IgG humana
conjugado con HRP como el anticuerpo de detección, se añaden a cada
pocillo 50 ul del sustrato de HRP cromogénico tetrametilbencidina
(TMB). Se incuba la disolución de sustrato durante aproximadamente
30 minutos a temperatura ambiente. Se finaliza la reacción de
HRP/TMB añadiendo 50 ul de ácido fosfórico 1 M a cada pocillo.
Después se cuantifica la cantidad de marcador
unido mediante el método apropiado, tal como medición
espectrofotométrica de la formación de productos de reacción o
complejos de unión, o el cálculo de la cantidad de marcador
radiactivo detectado. En las condiciones descritas aquí, la
cantidad de marcador medido en esta etapa es una medida de la
cantidad de anticuerpo de detección marcado unido al anticuerpo de
referencia.
En la realización descrita anteriormente que usa
anticuerpo policlonal de cabra anti-Fc de IgG humana
conjugado con HRP y sustrato TMB, se cuantifica la cantidad de
anticuerpo de detección unido al anticuerpo de referencia leyendo
la absorbancia (densidad óptica o "DO") a 450 nm de cada
pocillo de la placa.
Se selecciona una concentración conocida de
anticuerpo de referencia y se examinan los resultados de los
pocillos que tienen la concentración seleccionada de anticuerpo y
cantidades diferentes de antígeno. La concentración de antígeno que
produce la intensidad de señal deseada, o intensidad patrón, se
selecciona como la concentración óptima de antígeno para
experimentos posteriores. La señal patrón puede determinarse
empíricamente según las condiciones y materiales usados en una
realización particular, debido a que la señal patrón servirá como
punto de referencia para comparar las señales de otras reacciones.
Para un método de detección que produce un producto cromogénico,
una señal patrón deseable es una que cae dentro de la región más
dinámica del lector de ELISA u otro detector y puede ser una
densidad óptica (DO) de entre aproximadamente 0,4 y 1,6 unidades de
DO y para este sistema de manera preferible aproximadamente 1,0
unidades de DO, aunque es posible alcanzar señales que oscilan
desde 0,2 hasta más de 3,0 unidades de DO. Puede seleccionarse
cualquier valor de DO como la señal patrón, aunque un valor de DO
de aproximadamente 1,0 unidades de DO permite una medición precisa
de un intervalo de señales de prueba superiores o inferiores a 1,0
unidades de DO y además permite la comparación fácil con otras
señales de prueba y señales de referencia. La concentración de
antígeno identificada como la concentración que produce la señal
patrón se usará en experimentos posteriores para detectar y
clasificar cinéticamente los anticuerpos.
En una realización preferida que usa una placa
de 96 pocillos, se selecciona una concentración de anticuerpo de
referencia de 100 ng/ml. Es posible, dependiendo de la sensibilidad
y las concentraciones de anticuerpo empleadas en el sistema, usar
otras concentraciones de anticuerpo de referencia. Después se
examinan las señales de la reacción de anticuerpo de detección en
los pocillos en todas las columnas de la fila que contienen 100
ng/ml anticuerpo para encontrara la concentración de antígeno que
produce un valor de DO de aproximadamente 1,0. En la realización
preferida descrita anteriormente que usa anticuerpo policlonal de
cabra anti-Fc de IgG humana conjugado con HRP y
sustrato TMB, se examinan los pocillos en la fila que contiene 100
ng/ml de anticuerpo para determinar qué concentración de antígeno
produce una reacción que tiene un valor de DO de aproximadamente
1,0, cuando se mide la absorbancia a 450 nm. Entonces se usará esta
concentración de antígeno para los experimentos posteriores para
detectar y clasificar cinéticamente los anticuerpos. Un enfoque
similar para identificar las densidades óptimas de antígeno se usó
para el sistema basado en perlas Luminex.
La superficie o las superficies que se
usa(n) para llevar a cabo la detección de anticuerpos se
recubren con antígeno a la concentración óptima tal como se
determinó previamente. En una realización preferida, las superficies
son pocillos de una placa de 96 pocillos con estreptavidina tal
como una placa Sigma SA, y se añade a los pocillos antígeno
biotinilado a concentración óptima. En una realización más
preferida, se añaden 50 ul de antígeno en una disolución de leche
desnatada al 1%, 1X PBS pH 7,4, y se incuban las placas durante 30
minutos. En otra realización preferida se añade antígeno no
modificado a las placas Costar®
Universal-BIND^{TM} y se lleva a cabo la
incubación y la unión a antígeno mediada por UV según las
instrucciones del fabricante y/o los protocolos convencionales, tal
como se describió anteriormente.
Tras la incubación con disolución de antígeno
durante una cantidad de tiempo adecuada, se lavan las placas para
eliminar el antígeno que no se ha unido, preferiblemente al menos
cuatro veces (4x).
Los anticuerpos que van a detectarse y
clasificarse mediante el ensayo de antígeno limitante se denominan
anticuerpos de prueba. Pueden recuperarse anticuerpos de prueba a
partir de la disolución que rodea a las células que producen
anticuerpos. Preferiblemente, se recuperan anticuerpos de prueba de
los medios de cultivos de células B que producen anticuerpos,
sobrenadantes de hibridomas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
expresados a partir de cualquier tipo de célula, más
preferiblemente a partir del sobrenadante de cultivos de células B.
Las disoluciones que contienen anticuerpos de prueba, por ejemplo
los sobrenadantes de cultivos de células B, generalmente no
requieren tratamiento adicional; sin embargo, también serían
compatibles con los métodos descritos las etapas adicionales para
concentrar, aislar o purificar anticuerpos de prueba.
Cada disolución que contiene anticuerpos de
prueba se diluye para llevar la concentración dentro de un intervalo
deseable y se añaden muestras a una superficie que tiene antígeno
fijado. Normalmente, un intervalo de concentración deseable para
anticuerpos de prueba tiene una concentración máxima inferior a la
concentración de anticuerpo de referencia usada para seleccionar la
concentración óptima de antígeno tal como se describió
anteriormente. Un aspecto de la presente invención proporciona que
un anticuerpo de prueba producirá una señal superior a la del
anticuerpo de referencia para la misma concentración de antígeno si
el anticuerpo de prueba (a) tiene una mayor afinidad para el
antígeno o (b) tiene una afinidad similar pero está presente en
mayor concentración que el antígeno de referencia. Así, cuando se
usan los anticuerpos de prueba a concentraciones inferiores que la
concentración del anticuerpo de referencia usado para seleccionar la
concentración de antígeno usada en el ensayo de detección, sólo un
anticuerpo de prueba que tiene mayor afinidad para el antígeno
producirá una señal superior a la señal de anticuerpo de
referencia.
referencia.
En una realización en la que se usa una
concentración de anticuerpo de referencia de 100 ng/ml para
seleccionar la concentración óptima de antígeno (tal como se
describió anteriormente), los sobrenadantes de cultivos de células
B que tienen un intervalo de concentración de anticuerpo de prueba
determinado empíricamente de entre aproximadamente 20 ng/ml a 800
ng/ml se diluyen normalmente diez veces para producir una
concentración de anticuerpo de prueba de ensayo de trabajo de entre
aproximadamente 2 ng/ml a 80 ng/ml. Preferiblemente se someten a
prueba al menos dos muestras duplicadas de cada sobrenadante de
cultivo de células B diluido. Preferiblemente se añaden los
sobrenadantes de cultivos de células B diluidos a pocillos de una
placa de microtitulación, en la que los pocillos están recubiertos
con antígeno a una concentración óptima determinada previamente
usando antígeno y un anticuerpo de referencia.
Debe incluirse un control positivo como parte de
la detección, en la que el anticuerpo de referencia usado para
optimizar el ensayo determinando la concentración óptima de antígeno
se diluye y se hace reaccionar con el antígeno. El control positivo
proporciona un conjunto de mediciones útiles tanto como un control
interno como también para comparar con resultados de optimización
previos con el fin de confirmar, garantizar y demostrar que los
resultados de una detección de anticuerpos de prueba pueden
compararse con los resultados esperados del control positivo y
concuerdan con los resultados de optimización previos.
En una realización, cada sobrenadante del
cultivo de células B que va a someterse a prueba se diluye 1:10 en
leche desnatada al 1%/1X PBS pH 7,4/azida al 0,05%, y se añaden 50
ul a cada uno de dos pocillos recubiertos con antígeno de una placa
de 96 pocillos, de modo que están presentes en cada placa de 96
pocillos 48 muestras diferentes. Preferiblemente se añade un
control positivo que comprende una serie de dilución del anticuerpo
de referencia a los pocillos de aproximadamente la mitad de una
placa de 96 pocillos, para proporcionar la confirmación y para
demostrar que los resultados de la detección de anticuerpos de
prueba en sobrenadantes de cultivos de células B que van en
paralelo con el control positivo concuerdan internamente y también
concuerdan con los resultados de optimización previos.
Los anticuerpos de prueba se incuban con
antígeno en condiciones adecuadas. Los anticuerpos de referencia
usados como controles positivos se incuban en paralelo en las mismas
condiciones. En una realización preferida, las placas se envuelven
de manera ajustada, por ejemplo con envoltura de plástico o película
de parafina y se incuban con agitación durante 24 horas a
temperatura ambiente.
Las placas se lavan para eliminar los
anticuerpos de prueba que no se han unido, de manera preferible
aproximadamente cinco veces (5X) con agua. A continuación se añade
un anticuerpo de detección marcado que reconoce y se une al
anticuerpo de prueba, y se incuba la disolución para permitir la
unión del anticuerpo de detección al anticuerpo de prueba. También
se añade el anticuerpo de detección al control positivo para
confirmar la interacción entre el anticuerpo de referencia y el
anticuerpo de detección. El anticuerpo de detección puede ser
policlonal o monoclonal. El anticuerpo de detección puede estar
marcado de cualquier manera que permita la detección del anticuerpo
unido al anticuerpo de referencia. El marcador puede ser un marcador
enzimático tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano
(HRP), o un marcador no enzimático tal como biotina o digoxigenina,
o un marcador radiactivo tal como ^{32}P, ^{3}H o ^{14}C, o
fluorescencia, o puede ser cualquier otro marcador adecuado para el
ensayo basado en reactivos, materiales y métodos de detección
disponibles.
En una realización, que usa anticuerpos de
prueba humanos, se añaden 50 ul de anticuerpo policlonal de cabra
anti-Fc de IgG humana conjugado con HRP (Pierce
Chemical Co, Rockford IL, número de catalogo 31416) a una
concentración de 0,5 ug/ml en leche desnatada al 1%, 1X PBS pH 7,4 a
cada pocillo de placas de microtitulación que contienen anticuerpos
de prueba y anticuerpos de referencia (como control positivo).
Después se incuba la placa durante 1 h a temperatura ambiente.
Se elimina la disolución en exceso que contiene
anticuerpo de detección y se lavan las placas con agua
repetidamente, preferiblemente al menos cinco veces, con el fin de
eliminar todo el anticuerpo de detección que no se ha unido.
La cantidad de anticuerpo de detección unido a
anticuerpo de prueba (y unido al anticuerpo de referencia del
control) se determina usando el método apropiado para medir y
cuantificar la cantidad de marcador presente. Dependiendo del
marcador seleccionado, los métodos de medición pueden incluir medir
la actividad enzimática frente al sustrato añadido, medir la unión
a un componente de unión detectable (por ejemplo para biotina),
recuento de centelleo para medir la radioactividad o cualquier otro
método adecuado que va a determinarse por un experto en la técnica
relevante.
En el método descrito anteriormente que usa
anticuerpo policlonal de cabra anti-Fc de IgG humana
conjugado con HRP como el anticuerpo de detección, se añaden a cada
pocillo 50 ul del sustrato de HRP cromogénico tetrametilbencidina
(TMB). La disolución de anticuerpo-sustrato se
incuba durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente.
Se finaliza la reacción de HRP/TMB añadiendo 50 ul de ácido
fosfórico 1 M a cada pocillo.
Después se cuantifica la cantidad de marcador
unido mediante el método apropiado, tal como la medición
espectrofotométrica de la formación de productos de reacción o
complejos de unión o el cálculo de la cantidad de marcador
radiactivo detectado. Según un aspecto de la presente invención, la
cantidad de marcador proporciona una medida de la cantidad de
anticuerpo de detección marcado unido al anticuerpo de prueba (o, en
el control positivo, unido al anticuerpo de referencia). Según otro
aspecto de la presente invención, la cantidad de marcador
proporciona una medida de la cantidad de anticuerpo de prueba unido
al antígeno. Por tanto, la detección y la cuantificación de la
cantidad de marcador proporcionan un medio para medir la unión del
anticuerpo de prueba al antígeno de prueba. Comparando la señal
patrón con la señal que cuantifica la cantidad de anticuerpo de
prueba unido a antígeno, es posible identificar anticuerpos de
prueba con mayores afinidades buscando anticuerpos de prueba que
dan una señal superior a la de referencia.
En el método descrito anteriormente que usa
anticuerpo policlonal de cabra anti-Fc de IgG humana
conjugado con HRP y el sustrato TMB, la cantidad de anticuerpo de
detección unido a anticuerpo de prueba (y al anticuerpo de
referencia en el control positivo) se cuantifica leyendo la
absorbancia (densidad óptica, DO) a 450 nm de cada pocillo de cada
placa.
Se calcula el promedio de los resultados de cada
anticuerpo de prueba y se determina el intervalo patrón. En una
realización preferida en la que se someten a ensayo dos muestras de
cada anticuerpo de prueba usando un anticuerpo de detección marcado
con HRP, se calcula el promedio de los valores de DO a 450 nm y se
calcula la desviación estándar. Los valores de DO promedio de los
anticuerpos de prueba se comparan frente al valor de DO de la señal
patrón. También se calculan los valores de los ensayos con control
positivo y se examinan para determinar la fiabilidad del
ensayo.
Los anticuerpos de prueba se clasifican
cinéticamente considerando el valor de DO promedio y el intervalo
de DO entre las réplicas. El valor de DO promedio proporciona una
medida de la afinidad del anticuerpo de prueba para el antígeno, en
la que la afinidad se determina mediante comparación con la señal
patrón o el valor de DO del anticuerpo de referencia en el control
positivo. El intervalo proporciona una medida de la fiabilidad del
ensayo, en la que un intervalo estrecho indica que los valores de DO
son probablemente mediciones precisas de la cantidad de anticuerpo
de prueba unido al antígeno, y un intervalo amplio indica que los
valores de DO pueden no ser mediciones precisas de unión. Las
desviaciones estándar aceptables son normalmente DO de entre el
5-15% entre sí. A los anticuerpos de prueba que dan
los mayores valores de DO, en los que la desviación estándar del
valor promedio es baja, se les da la mayor clasificación
cinética.
En una realización, en la que la señal patrón es
de 1,0 unidades de DO, se considera que cualquier anticuerpo de
prueba tanto con una DO promedio de más de 1,0 unidades de DO como
una desviación estándar aceptablemente baja, tiene una mayor
afinidad para el antígeno que la afinidad del anticuerpo de
referencia.
En otra realización se usaron ensayos basados en
Luminex usando perlas recubiertas de antígeno de manera diferencial.
En este ensayo se clasificaron los anticuerpos basándose en cómo se
unen al antígeno a densidades de antígeno mayores y después a
menores.
Se biotiniló la hormona paratiroidea (PTH)
usando biotina Pierce EZ-Link
Sulpho-NHS según las indicaciones del fabricante
(Pierce EZ-link Sulpho-NHS Biotin,
(Pierce Chemical Co., Rockford, IL, número de catalogo 21217).
Cuando el antígeno no pudo biotinilarse, se sustituyeron por placas
Costar UV. El uso de las placas Costar UV aumentó el tiempo de
ensayo y generalmente requería el uso de más antígeno de manera
considerable.
Se llevó a cabo un ensayo diseñado en una
disposición de "tablero de ajedrez" tal como se describe a
continuación para determinar la concentración óptima de
recubrimiento del antígeno. Se realizó el ensayo usando placas de
96 pocillos recubiertas con estreptavidina (placas de
microtitulación Sigma SA, Sigma-Aldrich Chemicals,
St Louis MO, número de catalogo M5432) tal como sigue.
Se biotiniló el antígeno de la hormona
paratiroidea (PTH) usando biotina Pierce EZ-link
Sulpho-NHS ((PierceChemical Co, Rockford IL, número
de catalogo 21217) según las instrucciones del fabricante. El
antígeno biotinilado se diluyó en leche desnatada al 1%/1X PBS pH
7,4 en una serie de diluciones escalonadas desde una concentración
inicial de 500 ng/ml hasta una concentración final de 0,5 ng/ml. Se
distribuyó el antígeno biotinilado diluido de manera horizontal a
través de una placa de microtitulación Sigma SA de 96 pocillos
(Sigma Aldrich Chemicals, catalogo M-5432),
colocando 50 ul de cada dilución en los pocillos de cada una de las
columnas 1 a 11, con réplicas en cada pocillo de las filas
A-H bajo cada columna. No se añadió antígeno a la
columna 12. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30
minutos. No se realizó ninguna etapa de bloqueo porque las placas
Sigma SA están bloqueadas previamente.
Se lavó la placa cuatro veces con agua
corriente. Se lavaron las pacas a mano o usando una lavadora de
microplacas, cuando estaba disponible.
Se usó como anticuerpo de referencia un
anticuerpo anti-PTH con afinidad conocida. Se diluyó
en serie 1:2 el anticuerpo 15g2 anti-PTH en leche
desnatada al 1%/1X PBS pH 7,4/0,05% hasta una dilución inicial final
de 1 ug/ml, en 7 pocillos hasta una concentración final de 15 ng/ml
y se distribuyeron 50 ul de cada dilución en cada pocillo de la
fila A a la fila G, con réplicas en cada pocillo de las columnas
1-12. No se añadió anticuerpo a la fila H. Se
incubaron las placas que contenían el antígeno y el anticuerpo de
referencia a temperatura ambiente durante aproximadamente 24
horas.
Se envolvió la placa de manera ajustada
("hermética") con envoltura de plástico o película de parafina,
y se incubó durante la noche con agitación usando un agitador de
placas de titulación Lab Line en el ajuste 3.
Se lavaron las placas cinco veces (5X) con agua
para eliminar anticuerpo de referencia que no se había unido. Se
detecto el anticuerpo de referencia unido añadiendo cincuenta
microlitros (50 ul) de anticuerpo policlonal de cabra
anti-Fc de IgG humana conjugado con HRP (Pierce
Chemical Co, Rockford IL, número de catalogo 31416) 0,5 ug/ml en
leche desnatada al 1%/1X PBS pH 7,4 a cada pocillo e incubando la
placa durante 1 h a temperatura ambiente (Gt
anti-Human Fc HRP- Pierce número de catalogo -
31416).
La placa se lavó al menos cinco veces (5X) con
agua para eliminar el anticuerpo policlonal de cabra
anti-Fc de IgG humana conjugado con HRP no
unido.
Se añadieron cincuenta microlitros (50 ul) del
sustrato de HRP TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc,
Gaithersberg, MD) a cada pocillo y se incubó la placa durante media
hora a temperatura ambiente. Se finalizó la reacción de
HRP-TMB añadiendo 50 ul de ácido fosfórico 1 M a
cada pocillo. Se midió la densidad óptica (absorbancia) a 450 nm
para cada pocillo de la placa.
La tabla 2 muestra los resultados del ensayo de
referencia que usa PTH como el antígeno y anticuerpo 15g2
anti-PTH como el anticuerpo de referencia. Se
examinaron las mediciones de la DO de la fila de muestras
correspondientes a la concentración del anticuerpo de referencia de
100 ng/ml para encontrara la concentración de antígeno que da una
DO de aproximadamente 1,0. Se determinó que esta concentración es de
aproximadamente 15 ng/ml de PTH. Esta concentración de antígeno se
consideró la concentración óptima de antígeno y se usará para los
experimentos posteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubrieron placas de microtitulación SA con
antígeno PTH biotinilado a la concentración óptima de 15 ng/ml tal
como se determinó en el ejemplo 1. Se añadieron cincuenta
microlitros (50 ul) de antígeno biotinilado a una concentración de
15 ng/ml en leche desnatada al 1%/1X PBS pH 7,4 a cada pocillo, en
un patrón de dilución tal como se describió en el ejemplo 1. La
placa se incubó durante 30 minutos.
Se lavaron las placas cuatro veces (4X) con
agua, y se añadió un sobrenadante de cultivo de células B que
contenía anticuerpos de prueba diluidos 1:10 en leche desnatada al
1%/1X PBS pH 7,4/azida al 0,05% y 50 ul de cada muestra a cada uno
de dos pocillos. Se añadieron cuarenta y ocho (48) muestras
diferentes por placa de 96 pocillos. En una placa separada se
diluyó anticuerpo de referencia 15g2 anti-PTH a la
concentración usada para determinar la concentración óptima de
antígeno al menos en media placa. Esto proporcionó un control
positivo para garantizar que los resultados de los ensayos de
anticuerpos de prueba pueden compararse con los resultados de
optimización.
Las placas se envolvieron de manera ajustada con
envoltura de plástico o película de parafina y se incubaron con
agitación durante 24 horas a temperatura ambiente.
Al día siguiente, se lavaron todas las placas
cinco veces (5X) y se añadieron a cada pocillo 50 ul de anticuerpo
policlonal de cabra anti-Fc de IgG humana conjugado
con HRP a una concentración de 0,5 ug/ml en leche al 1%, 1X PBS pH
7,4. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura
ambiente.
Se lavaron las placas al menos cinco veces (5X
con agua corriente). Se añadieron cincuenta microlitros (50) ul de
sustrato de HPR TMB a cada pocillo, y se incubó la placa durante 30
minutos. Se finalizó la reacción de HRP-TMB
añadiendo 50 ul de ácido fosfórico 1 M a cada pocillo. Se midió la
densidad óptica (absorbancia) a 450 nm para cada pocillo de la
placa.
Se calculó el promedio de los valores de DO de
los anticuerpos de prueba y se calculó el intervalo. Los anticuerpos
con la mayor señal y desviación estándar aceptablemente baja se
seleccionaron como anticuerpos que tenían una mayor afinidad para
el antígeno que la que tenía el anticuerpo de referencia.
La tabla 3 muestra los resultados de un ensayo
de dilución de antígeno limitante usando PTH como ligando. Los
anticuerpos se clasifican según su afinidad relativa para diversos
antígenos de PTH y se identifican mediante su número de
pocillo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la concentración de recubrimiento
apropiada de IL-8 tal como se describió
anteriormente para determinar una concentración de
IL-8 que dio como resultado una DO de
aproximadamente 1. Después se incubó la concentración óptima con
una variedad de sobrenadantes de anticuerpo
anti-IL-8 derivados de animales
XenoMouse inmunizados con IL-8. La tabla 4 ilustra
resultados típicos y la clasificación de anticuerpos que se examinan
para determinar su afinidad para IL-8. Las columnas
"DO primaria" y "DO secundaria" se refieren a las DO
detectadas de la unión primaria y secundaria alcanzadas cuando se
usaron cantidades no limitadas de IL-8 en el ELISA
de unión. Los valores de DO notificados en la sección de antígeno
limitado se refieren a un promedio de dos ELISA de unión realizados
en antígeno limitado. Tal como se muestra mediante la tabla 4, los
tres anticuerpos superiores pueden conservar su unión a antígeno
incluso en las concentraciones limitadas. Otros anticuerpos que
también alcanzan DO altas en el ELISA de unión a antígeno no
limitado primaria y secundaria no pudieron alcanzar la misma señal
cuando las concentraciones de antígeno eran limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de aumentar el rendimiento eficaz del
procedimiento de clasificación de afinidad de anticuerpo se
marcaron diferentes concentraciones de un antígeno con diferentes
perlas coloreadas. En este ejemplo se usaron perlas del sistema
Luminex. Tal como se conoce, cada perla, cuando se activan, emiten
luz de una longitud de onda variante. Cuando se coloca en un lector
Luminex, puede determinarse fácilmente la identidad de cada
perla.
En este ejemplo, un color diferente de la perla
luminex con estreptavidina se unió a cada una de las cuatro
concentraciones de antígeno biotinilado (1 ug/ml, 100 ng/ml, 30
ng/ml y 10 ng/ml). Por tanto, se representó cada concentración del
antígeno mediante una perla de color diferente. Entonces se
mezclaron las cuatro concentraciones en una única disolución que
contenía las cuatro concentraciones unidas a color.
Después se diluyeron todas las muestras de
anticuerpos hasta la misma concentración (\sim500 ng/ml) usando
los resultados de la cuantificación Luminex o una cuantificación de
un punto mediante Luminex. Después se realizó una dilución en serie
(1:5) de todas las muestras de modo que se obtuvo un total de cuatro
puntos de dilución, mientras que se diluía preferiblemente
suficiente muestra para dos placas: una placa de cuantificación y la
placa de clasificación.
Con el fin de clasificar los anticuerpos se
cargaron en cada pocillo de la placa Luminex \sim2000 de cada
mezcla de muestras de antígeno en perlas luminex y después se
aspiró el pocillo. Entonces se cargaron en cada pocillo 50 ul de
cada muestra de anticuerpo (24 muestras en total) y se dejaron
durante la noche con agitación a 4ºC. Se lavaron las placas tres
veces (3X) con tampón de lavado. Entonces se realizó la detección
con un anticuerpo fluorescente antihumano
(hIgG-ficoeritrina (PE) (dilución 1:500)) que se
unía a 50 ul/pocillo, con agitación a temperatura ambiente durante
20 min. Después se lavaron las placas tres veces (3X) con tampón de
lavado. Se resuspendieron las placas en 80 ul de tampón bloqueante.
A continuación se cargaron las placas en el equipo Luminex.
Debido a que cada pocillo contenía cuatro
concentraciones diferentes del mismo antígeno, que podían
distinguirse basándose en el color, fue posible clasificar
rápidamente las afinidades de unión de los diferentes anticuerpos.
Por ejemplo, los anticuerpos que tenían afinidad de unión muy fuerte
para el antígeno se unían incluso a la dilución más débil del
anticuerpo. Esto pudo medirse analizando la cantidad de anticuerpo
fluorescente antihumano unido a la perla coloreada fijada a la
concentración más débil de antígeno. Alternativamente, los
anticuerpos que no se unieron fuertemente sólo pudieron detectarse
como la unión con las concentraciones de antígeno de 1 ug/ml y 100
ng/ml, pero no las concentraciones de 30 ng/ml o 10 ng/ml.
Se realizó el análisis de datos usando SoftMax
Pro para los datos de cuantificación. Se compararon la señal
Luminex de muestras sometidas a prueba a varias concentraciones.
Entonces se clasificaron las muestras de acuerdo con esto.
La siguiente técnica de clasificación cinética
se realizó mediante ELISA y se comparó con la cinética formal de
BiaCore. A continuación en la tabla 5 se encuentra una comparación
de un rendimiento de antígeno limitado típico comparado con las
mediciones absolutas de KD derivadas de Biacore. En breve, se
clasificaron 68 anticuerpos (unos con respecto a otros) usando el
antígeno limitado clasificado. De los 68 anticuerpos, se ampliaron
17 hasta cantidades suficientes para mediciones de afinidad formal
usando la tecnología BiaCore.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como puede observarse en general existe un
alto grado de correlación entre la alta clasificación de antígeno
limitado y la K_{D} formal. En el caso de los anticuerpos que no
se correlacionan bien, existen diversos motivos de por qué pueden
existir tales discrepancias. Por ejemplo, aunque el antígeno esté
recubierto en placas ELISA a baja densidad, no pueden descartarse
completamente los efectos de avidez. Además, es posible que cuando
se recubre el material de ensayo para la técnica de clasificación de
antígeno limitado, pueden enmascararse o alterarse ciertos
epítopos. En el análisis de Biacore, si el antígeno fluye sobre un
chip recubierto con anticuerpo, estos epítopos en el antígeno
pueden presentarse en una confirmación diferente y por tanto,
observarse a una concentración relativa diferente. Esto puede, a su
vez, dar como resultado una clasificación cinética diferente entre
los dos métodos.
También es posible que un anticuerpo con
afinidades derivadas de Biacore inferiores puede dar una
clasificación alta de antígeno limitado debido a que está presente
en la muestra de prueba una concentración de anticuerpo específico
para antígeno mucho mayor que la promedio. Esto puede, a su vez,
conducir a una puntuación de antígeno limitado artificialmente
alta.
De manera importante, el método de cinética de
antígeno limitado permitió una rápida determinación de afinidad
relativa e identificó a los anticuerpos con la mayor afinidad formal
de los anticuerpos sometidos a prueba en este panel. Además, ya que
el método de clasificación relativa cinética de antígeno limitado
puede extrapolarse fácilmente para someter a ensayo miles de
anticuerpos en fases tempranas de la generación de anticuerpos,
ofrece ventajas significativas sobre otras tecnologías que no
ofrecen ventajas similares de escala.
Claims (13)
1. Método de determinación de las afinidades de
unión relativas de anticuerpos para un antígeno, que comprende:
- proporcionar un anticuerpo de referencia que se une a un antígeno diana;
- determinar la concentración limitante del antígeno diana para el anticuerpo de referencia, en el que la concentración limitante maximiza el intervalo detectable de afinidades de anticuerpo dentro de un intervalo de concentración predeterminado para un conjunto de disoluciones de anticuerpo de prueba;
- proporcionar un conjunto de disoluciones de anticuerpo de prueba, en el que la concentración de anticuerpos en cada disolución de anticuerpo de prueba está dentro del intervalo de concentración predeterminado;
- incubar la concentración limitante de antígeno con cada disolución de anticuerpo de prueba en el conjunto de disoluciones de anticuerpo de prueba;
- medir el grado relativo con el que los anticuerpos en cada disolución de anticuerpo de prueba se unen a la concentración limitante de antígeno; y
- clasificar los anticuerpos en cada disolución de anticuerpo de prueba basándose en su afinidad de unión para dicha concentración limitada de antígeno con el fin de determinar la afinidad de unión relativa de cada anticuerpo de prueba para dicho antígeno.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
los anticuerpos de prueba se seleccionan del grupo que consiste en:
anticuerpos de mamíferos, de seres humanos, humanizados, de primates
no humanos, de ratón, de rata, de conejo, de cabra, de caballo, de
cobaya, de oveja, de vaca y quiméricos.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
los anticuerpos de prueba son anticuerpos recombinantes.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
los anticuerpos de prueba son fragmentos de anticuerpos.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
la medición del grado relativo comprende un ensayo seleccionado del
grupo que consiste en: un ensayo de inmunoabsorción ligado a
enzimas (ELISA), un ensayo de inmunoabsorción ligado a
fluorescencia, un ensayo radioisotópico (RIA) y un ensayo basado en
resonancia de plasmón superficial (SPR).
6. Método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de cada anticuerpo de prueba está entre 10 ng/ml y
100 ng/ml.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha concentración de cada anticuerpo de prueba está entre 10 ng/ml
y 50 ng/ml.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha concentración de cada anticuerpo de prueba está entre 10 ng/ml
y 25 ng/ml.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho conjunto de disoluciones de anticuerpo de prueba comprende un
conjunto de sobrenadantes que comprenden anticuerpos monoclonales
secretados a partir de un conjunto de hibridomas.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho conjunto de disoluciones de anticuerpo de prueba está entre
100 y 5000 disoluciones de anticuerpo.
11. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho conjunto de disoluciones de anticuerpo de prueba está entre
2500 y 5000 disoluciones de anticuerpo.
12. Método según la reivindicación 1, en el que
cada disolución de anticuerpo de prueba es una disolución de
anticuerpo policlonal.
13. Método según la reivindicación 1, en el que
cada disolución de anticuerpo de prueba es una disolución de
anticuerpo monoclonal.
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