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DE69228300T2 - Methoden und zusammensetzungen zur krebstherapie und zur vorhersagbarkeit der reaktionen auf diese behandlung - Google Patents

Methoden und zusammensetzungen zur krebstherapie und zur vorhersagbarkeit der reaktionen auf diese behandlung

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DE69228300T2
DE69228300T2 DE69228300T DE69228300T DE69228300T2 DE 69228300 T2 DE69228300 T2 DE 69228300T2 DE 69228300 T DE69228300 T DE 69228300T DE 69228300 T DE69228300 T DE 69228300T DE 69228300 T2 DE69228300 T2 DE 69228300T2
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DE
Germany
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cells
neu
cell
product
antibody
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Sarah Bacus
Michael Sela
Yosef Yarden
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Yeda Research and Development Co Ltd
Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Yeda Research and Development Co Ltd
Becton Dickinson and Co
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Description

    TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zum Auswählen von mutmaßlichen Antikrebsmitteln und zum Bestimmen der Wirksamkeit derartiger Agenzien, die geeignet bei der Behandlung eines Krebses sind, gekennzeichnet durch Expression eines Oberflächenonkogenprodukts. Diese Erfindung bezieht sich ferner allgemein auf Zusammensetzungen, die durch derartige Verfahren ausgewählt sind.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Transformation einer normalen Zelle in eine maligne Zelle führt charakteristischerweise unter anderen Dingen zu der unkontrollierten Proliferation der Nachkommenzellen, welche unreife, undifferenzierte Morphologie und Expression oder Überexpression von Onkogenen zeigen, die normalerweise nicht durch normale reife Zellen exprimiert werden.
  • Unter in Betracht ziehen dieser Transformation liefert das US Patent 4786590 ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von Tumorzellen in einem warmblütigen Wirtstier, wobei das Verfahren umfaßt: Kombinieren einer physiologischen Probe, die unter Verdacht steht, einen Zelloberflächenmembranrezeptor (CSMR) zu enthalten, mit einer Verbindung, die sich dazu eignet, an den CSMR zu binden, wobei der CSMR dadurch gekennzeichnet ist, daß (1) er in die Aktivierung von Zellen aus den ruhenden Phasen in den Zellteilungszyklus verwickelt ist, und (2) dazu fähig ist, spezifisch an eine Bindungsstelle eines transformierenden Retrovirus zu binden, und Bestimmen des Spiegels der Komplexbildung zwischen der Verbindung und dem CSMR im Vergleich zu einem vorher festgelegten Wert, was das Vorhandensein von Tumorzellen anzeigt.
  • Mittels weiterer Veranschaulichung beschreibt das US Patent 4968603 ein Verfahren zum Screenen von Patienten unter Bestimmen des Krankheitsstatus, wobei das Verfahren umfaßt: Messen des Spiegels der Amplifikation oder Expression des HER-2/neu Gens in einer Probe von einem Patienten, der an Brust- oder Eierstockadenokarzinom leidet, und Klassifizieren jener Patienten mit einem erhöhten Spiegel an Amplifikation oder Expression des HER-2/neu Gens relativ zu einem für normale Zellen charakteristischen Bezugsspiegel als wahrscheinlicher, an Krankheitsrückfall zu leiden oder eine verminderte Überlebenschance zu haben.
  • Es ist ein Ziel der Krebstherapie, selektiv das unkontrollierte Wachstum maligner Zellen zu töten oder zu inhibieren, während normale Zellen nicht nachteilig beeinträchtigt werden.
  • Traditionelle chemotherapeutische Mittel sind hoch cytotoxische Mittel, welche vorzugsweise größere Affinität in Bezug auf maligne Zellen als normale Zellen haben, oder zumindest vorzugsweise maligne Zellen basierend auf ihrer hohen Rate an metabolischer Aktivität beeinträchtigen. Wo ein Onkogenprodukt, das einzigartig gegenüber einer malignen Zelle ist, auf dessen Oberflächenmembran exprimiert oder überexprimiert wird, kann es dazu verwendet werden, auf derartige maligne Zellen zum Zwecke der Zerstörung unter Verwenden chemotherapeutischer Agenzien zu treffen, die dazu bestimmt sind, spezifisch mit dem Onkogenprodukt in Wechselwirkung zu treten. Extrem genaue Verfahren zum Zielen auf maligne Zellen für die Zerstörung sind mit der Ankunft von cytotoxischen Konjugaten verfügbar geworden, die aus einem starken Cytotoxin bestehen, das chemisch an ein Affinitätsmolekül wie beispielsweise einen monoklonalen Antikörper gebunden ist, eine Spezifität in Bezug auf ein einzigartiges durch eine maligne Zelle hergestelltes Protein haben, wie beispielsweise ein Zelloberflächenantigen. Unter Verwenden von Immuncytochemie- und Molekülanalysen ist es möglich, genau die Zusammensetzung und Struktur eines onkogenen Proteins zu identifizieren und einen monoklonalen Antikörper herzustellen, welcher die Kapazität hat, spezifisch das onkogene Protein zu binden, und somit die Genauigkeit zu erhöhen, das Cytotoxin an die beabsichtigte Zielzelle zu liefern.
  • Es ist vorgeschlagen worden, neben cytotoxischen Konjugaten monoklonale Antikörper zu verwenden, welche spezifisch an die Oberfläche einer Krebszelle binden. Anti- Tumorwirkungen von monoklonalen Antikörpern können durch die Effektorfunktion des Antikörpermoleküls durch natürliche immunologische Antwort an den Antigen- Antikörperkomplex erzielt werden. In dieser Hinsicht haben bestimmte monoklonale Antikörper gezeigt, daß sie zu einer Reduzierung der Tumorgröße führen. Unerwünschterweise jedoch haben andere monoklonale Antikörper, welche spezifisch an derartige Antigene auf der Oberfläche der malignen Zelle binden, keine Wirkung, oder schlimmer, beschleunigen tatsächlich das maligne Wachstum, obwohl derartige Antikörper spezifisch für den gleichen malignen Zelltyp und das gleiche Onkogenprodukt sind, wie die Antikörper, die Tumorgröße reduzieren. Im Hinblick auf die Nichtvorhersehbarkeit der Wirkung, wenn überhaupt, eines Antikörpers auf maligne Zellen ist es nicht möglich gewesen, vor dem Beginnen der Therapie zu bestimmen, ob ein oder mehrere ausgewählte Antikörper als Anti-Tumor-Agenzien reagieren oder eine genaue Prognose liefern würden. Vormals ist es nicht möglich gewesen zu bestimmen, welche Antikörperpräparationen einer Auswahl von monoklonalen Antikörpern (jeder davon ist fähig, spezifisch ein onkogenes Protein zu binden) Tumorantagonisten sind, und welche Tumoragonisten sind, die unerwünschterweise Vermehrung des malignen Wachstums beschleunigen können. Es würde wünschenswert sein, fähig zu sein, in einem in vitro Assay- Verfahren zu bestimmen, welche Antikörperpräparation (oder Kombination von Antikörpern) spezifische Affinität für ein Onkogenprodukt hat, und wieviel davon vorhergesagt würde, das Wachstum von malignen Zellen zu inhibieren und eine gute Prognose für den Patienten zu liefern. Es würde wünschenswert sein, ein in vitro Verfahren zum Prognostizieren der Wirksamkeit eines vorgeschlagenen therapeutischen Mittels (oder Kombination von Mitteln) und Dosierung davon zu liefern, wobei das Verfahren Zeit- und kostenwirksam wie auch minimal traumatisch gegenüber einem Krebspatienten ist, so daß das Verfahren praktisch bei der großen Viel zahl von Krebsfällen verwendet werden kann, die bei unterschiedlichen Patienten zu finden sind.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Wir haben festgestellt, daß bei Krebsen, die gekennzeichnet sind durch das Vorhandensein von malignen Zellen, welche ein oder mehrere membranassoziierte, rezeptorähnliche Onkogenproteine exprimieren oder überexprimieren, maligne Zellen induziert werden können, terminal zu differenzieren, indem eine wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein Affinitätsmolekül umfaßt, wie beispielsweise einen monoklonalen Antikörper, welcher spezifisch in Bezug auf ein Epitop auf der extrazellulären Domäne des Onkogenproteins ist, und/oder einen Liganden, welcher spezifisch in Bezug auf das Onkogenprotein ist. Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das maligne Wachstum eines, das gekennzeichnet ist durch die Expression oder Überexpression von mindestens dem HER-2/neu Onkogen. Von den Krebsen, welche charakteristisch HER-2/neu exprimieren oder überexprimieren, sind bestimmte Brust-, Magen-, Eierstock- und Speicheldrüsenkrebse.
  • Somit zieht ein Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen/Prognostizieren der Wirksamkeit eines therapeutischen Mittels bei der Behandlung eines Krebses nach sich, wobei maligne Zellen des Krebses ein Onkogenprodukt auf der extrazellulären Domäne der Zellen exprimieren oder überexprimieren, wobei das Verfahren die Stufe umfaßt: (a) Erhalten lebensfähiger maligner Zellen, welche mindestens ein Onkogenprodukt auf der extrazellulären Domäne der Zellen exprimieren oder überexprimieren und Teilen dieser in mindestens erste und zweite Teile: (b) Behandeln des ersten Teils, welcher lebensfähige maligne Zellen umfaßt, mit einer ausreichenden Menge einer Zusammensetzung, die mindestens eine Verbindung mit spezifischer Bindungsaffinität für das Onkogenprodukt hat, und in Berührung bringen des zweiten Teils mit einer Zusammensetzung, der es an der Verbindung oder Verbindungen mit spezifischer Bindungsaffinität für das Onkogenprodukt fehlt, und Inkubieren der ersten und zweiten Teile in einem physiologisch verträglichen Medium für eine Zeitmenge, die ausreichend ist, einen Prozentsatz der lebensfähigen malignen Zellen des ersten Teils zu induzieren, terminal zu differenzieren; und (c) Vergleichen des Prozentsatzes von Zellen in dem ersten Teil, welche morphologischen Beweis der Terminaldifferenzierung zeigen, mit dem Prozentsatz von Zellen in dem zweiten Teil, welche morphologischen Beweis von Terminaldifferenzierung zeigen, oder alternativ Vergleichen des Durchschnittswertes über den ersten Teil eines oder mehrerer Parameter, welche Terminaldifferenzierung zeigen, mit dem Durchschnittswert des (der) gleichen Parameter(s) über den zweiten Teil. Die lebensfähigen malignen Zellen können als eine Gewebebiopsie. Serumprobe oder andere Zelle erhalten werden, welche eine Probe von einem Patienten enthält, der an einem malignen Wachstum leidet. In welchem Fall ein therapeutisches Mittel, das auf den Patienten zurechtgeschnitten ist, ausgewählt werden kann. Alternativ können die malignen Zellen diejenigen einer etablierten transformierten Zelllinie sein, die von einem malignen Gewebe abstammt, wobei in diesem Fall das Verfahren der vorliegenden Erfindung als ein allgemeiner Screeningassay zum Auswählen von therapeutischen Antikrebsmitteln verwendet werden kann, die wirksam gegen derartiges bösartiges Wachstum sind.
  • In Übereinstimmung mit bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung kann die Induktion von Terminalzelldifferenzierung in malignen Zellen, die HER-2/neu exprimieren oder überexprimieren, durch einen erhöhten Prozentsatz von behandelten Zellen gezeigt werden, die einen reifen Phänotyp exprimieren. Beispielsweise kann im Fall von Brustkrebs die Induktion der Differenzierung in Übereinstimmung mit dem vorliegenden Verfahren durch das Vorhandensein von Milchkomponenten wie beispielsweise Casein und Lipidtröpfchen in den behandelten Zellen bestimmt werden. In Übereinstimmung mit anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung kann die Induktion der Terminaldifferenzierung in malignen Zellen, die HER2/neu exprimieren oder überexprimieren, durch einen erhöhten Prozentsatz an Zellen, die ICAM-1 (bezeichnet durch den Internationalen Workshop in Bezug auf menschliche Leukozytendifferenzierungsantigene wie CD54) und/oder E-Cadherin exprimieren (ein 80 kD Protein, beschrieben in Wheelock et al., J. Cell. Biochem., 34: 187-202 (1987), auch bekannt als "CAM 120/80") und/oder einen Anstieg am Gesamtkernbereich gezeigt werden.
  • Es ist festgestellt worden, daß eine Probe, die maligne Zellen umfaßt, welche HER- 2/neu exprimieren oder überexprimieren, wenn mit einem Affinitätsmolekül behandelt, welches spezifische Bindungsaffinität für die extrazelluläre Domäne des HER-2/neu Produkts hat, zu Terminalzelldifferenzierung führt, und daß diese Differenzierung korreliert ist mit der Translokation des HER-2/neu Produkts von der Oberflächenmembran einer malignen Zelle zu dem Zytoplasma oder perinuklearen Bereich der Zelle und mit einem vorübergehenden Anstieg in dem Über-Alles-HER-2/neu Gehalt der Zelle, wonach Translokation der Zellen aufhört, sich mit Geschwindigkeiten zu vermehren, die charakteristisch für maligne Zellen sind. Somit kann eine monoklonale Antikörperpräparation, die geeignet für die Behandlung eines malignen Wachstums ist, das gekennzeichnet ist durch HER-2/neu Expression (oder Überexpression), basierend auf ihrer Fähigkeit, in einem Verfahren der Erfindung in derartigen malignen Zellen Translokation des HER-2/neu Proteins oder die Expression anderer reifer Zellphänotypen, wie im nachfolgenden diskutiert, zu induzieren, gewählt werden.
  • Zusätzlich haben wir festgestellt, daß bei zumindest einigen Krebsen, die gekennzeichnet sind durch die Expression oder Überexpression eines membranassoziierten, rezeptorähnlichen Onkogenproteins, das in Berührung bringen derartiger maligner Zellen mit einem Liganden, der spezifisch für das membranassoziierte Protein ist, zu der Induktion der Terminalzelldifferenzierung und folglich dem Auftreten in derartigen Zellen vom reifen Phenotyp führt. Bei bevorzugten Aspekten der Erfindung exprimieren oder überexprimieren die malignen Zellen das HER-2/neu Produkt und Liganden, die spezifisch für das Produkt sind, sind beispielsweise Glykoprotein gp30 (Lupu et al., Science, 249: 1552-1555 (1990)) und neu Differenzierungsfaktor (oder "NDF", wie in Wen et al., Cell, 69: 559-72 (1992) beschrieben).
  • Somit zieht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung Verfahren zum Selektieren von therapeutischen Anti-Krebs-Mitteln und insbesondere monoklonalen Antikörpern und Liganden, und Prognostizieren ihrer in vivo Antwort auf Krebstherapie nach sich. Ein nachweisbarer Anstieg in Terminalzelldifferenzierung in malignen Zellen (beispielsweise aus einer gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelten Biopsie) stellt potentielle Wirksamkeit der Zusammensetzung bei Krebstherapie dar und liefert ein prognostisches Maß der potentiellen Wirksamkeit der Therapie in vivo.
  • Die folgenden Antikörper, welche (1) auch spezifisch in Bezug auf den extrazellulären Teil des menschlichen HER2/neu Produkts sind. (2) sich eignen zum Immunfällen eines einzelnen Proteins von 185 kD aus metabolisch markierten HER2 Zellen, (3) nicht mit menschlichem epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor ("EGFR) oder mit Ratten, p 18Sneu Protein reagieren und (4) signifikant das tumorartige Wachstum von HER2 Zellen in Mäusen inhibieren, sind beschrieben. Die Antikörper N12, N24 und N29 haben diese Eigenschaften und wurden in Bacus et al., Cancer Res., 52: 2580-89 (1992) beschrieben. N28, welches auch von Bacus et al. beschrieben ist, hat die entgegengesetzte Wirkung auf derartige Zellen. N24, N28, N29 und N12 wurden bei der Collection Nationale de Cultures de Microrganismes, Institute Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, Paris. Frankreich gemäß den Regeln 28 und 28a des Europäischen Patentübereinkommens mit den Hinterlegungsnummern I- 1260, I-1261, I-1262 und I-1263 am 19. August 1992 hinterlegt. Diese Antikörper, Fragmente oder chimären/humanisierten Versionen davon können allein (oder in Kombination miteinander) und/oder gebunden an Toxine verwendet werden, wodurch cytotoxische Konjugate gebildet werden, von denen beliebige oder alle als therapeutische Mittel verwendet werden können. Zusätzlich eignen sich diese Antikörper bei den zuvor beschriebenen prognostischen Verfahren.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 schildert das Binden der Anti-HER2/neu monoklonalen Antikörper an HER2 Zellen.
  • Fig. 2 veranschaulicht Immunfällung des HER2/neu Proteins durch verschiedene monoklonale Antikörper. Feld A veranschaulicht Immunfällung mit HER2 Zellen, die mit [³&sup5;S]Methionin markiert sind, und Feld B einen Kinase Assay.
  • Fig. 3 veranschaulicht die Wirkung verschiedener monoklonaler Antikörper in Bezug auf das Tumorwachstum in Mäusen ohne Thymusdrüsen. Feld A zeigt die Wirkungen von Antikörperbehandlung nach 21 Tagen nach Animpfung. Feld B veranschaulicht die Kinetiken von Tumorwachstum in mit Antikörper induzierten Mäusen ohne Thymusdrüse.
  • Fig. 4 veranschaulicht antikörperinduzierte Stimulierung der Tyrosinphosphorylierung des HER2/neu Produkts. Es sind die Autoradiogramme der SDS-Gel getrennten Proteine gezeigt, die in zwei unterschiedlichen Tyrosinphosphorylierungsassays erhalten sind. In Feld A wurden HER2 Zellen, die mit [³²P]Orthophosphat markiert waren, mit jedem Antikörper inkubiert und zwei aufeinanderfolgenden Immunfällungsstufen mit Anti- Phosphotyrosin und Anti-HER2/neu Antikörpern ausgesetzt. In Feld B wurden SKBR3 Zellen zuerst mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern inkubiert und anschließend zwei aufeinanderfolgenden Immunfällungsstufen ausgesetzt, gefolgt von Autophosphorylierung mit gamma [³²P]ATP und Mn²&supmin;.
  • Fig. 5 veranschaulicht die Wirkung verschiedener monoklonaler Antikörper auf die Turnoverrate des HER2/neu Proteins.
  • Fig. 6 veranschaulicht Verzögerung des Tumorwachstums durch Konjugate von Antikörpern N24 und N29 mit Ricin A.
  • Fig. 7 zeigt eine graphische Darstellung von AU-565 Zellzahlen pro Quadratzentimeter nach sechs Tagen Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Ligand gp30.
  • Fig. 8 zeigt eine graphische Darstellung des gesamten zellulären HER-2/neu Gehalts in AU-565 Zellen über eine Zeit, die quantitativ bestimmt wird durch immunhistochemische optische Dichte-Färbungsmittelanalyse. Offene Dreiecke zeigen eine Kontrollprobe, während offene Kreise eine sechs Tage lang mit 6 ng/ml gp30 behandelte Probe zeigen.
  • Fig. 9 zeigt die Wirkung des Liganden NDF über die Zeit auf AU-565 Zellen, gemessen mithilfe der Zellzahl und dem Kernbereich (A), und Casein, einem Lipidgehalt (B), und auf MDA-MB 453 Zellen, gemessen mithilfe der Zellzahl (C).
    • BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist festgestellt worden, daß bestimmte Affinitätsmoleküle, welche fähig sind, spezifisch an die extrazelluläre Domäne von rezeptorähnlichen Onkogenprodukten, insbesondere dem HER-2/neu Onkogenprodukt zu binden, die Fähigkeit haben, maligne Zellen zu induzieren, welche jenes Produkt exprimieren oder überexprimieren, wodurch terminal differenziert und unregulierte Vermehrung beendet wird. Das HER-2/neu Onkogen ist ein Mitglied der erbB-2 Onkogenfamilie. Das Verabreichen derartiger Affinitätsmoleküle an einen Patienten, der an einem malignen Wachstum leidet, gekennzeichnet durch Expression oder Überexpression eines derartigen Produktes, kann therapeutisch, allein oder in Verbindung mit anderen Therapien verwendet werden, wodurch Patienten behandelt werden, die an einer derartigen malignen Krankheit leiden. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wie sie in vitro Assayverfahren zum Selektieren oder Bestimmen der Wirksamkeit eines Affinitätsmoleküls betrifft, welches sich dazu eignet. Induktion von Terminaldifferenzierung in einer malignen Zelle von einem Patienten zu erzeugen, der an dem malignen Wachstum leidet, wird eine Zellprobe eines krebsartigen Gewebes mit derartigen malignen Zellen, welche ein Onkogenprodukt exprimieren oder überexprimieren, erhalten.
  • Vorzugsweise ist die Zellprobe eine Biopsie und ist geeigneterweise von der Größe, so daß sie in eine Vielzahl von Teilen zum Testen mit einem oder mehreren vermeintlichen Mitteln bei einer oder mehreren Konzentrationen geteilt werden kann. Während die Zellprobe bis zu mehrere Tage in einem geeigneten Aufrechterhaltungsmedium behalten werden kann, ist es bevorzugt, eine Zellprobe innerhalb von etwa 24 Stunden oder etwa weniger von dem Zeitpunkt an, wo sie zerschnitten wird, zu verwenden.
  • Die Zellprobe wird in einen ersten und zweiten Teil geteilt (jeder Teil kann dann weiter in eine geeignete Anzahl von repräsentativen Aliquoten geteilt werden), und die Teile werden in einzelne sterile Kulturkessel gesetzt (beispielsweise getrennte Vertiefungen einer Mikrotiterplatte). Die Anzahl von Aliquoten in einem Teil, der in einem Assay verwendet wird, wird bestimmt durch die Anzahl von Verbindungen und Konzentration davon, welche getestet werden. Auch für Gewebebiopsien wird es in Betracht gezogen, die Zellen zu zerhacken oder anders zu dispergieren, so daß sie kultiviert werden können, wodurch eine geeignete Anzahl von Kulturkesseln mit lebensfähigen malignen Zellen geliefert wird, die aus der Biopsie als primäre Kulturen gezüchtet wurden. Auf diese Weise kann die Anzahl von malignen Zellen, die für die Verwendung in einem Assayverfahren der Erfindung erhältlich sind, multipliziert werden. Es wird bevorzugt, mindestens ein Aliquot des biopsierten Gewebes (oder Zellen davon) als eine negative Kontrolle (oder zweiten Teil) zu haben, welcher nicht mit der vermeintlichen Antikrebsverbindung (en) in Kontakt gebracht wird, so daß der Prozentsatz an Zellen, welche Beweis der Terminalzelldifferenzierung in der Abwesenheit von vermeintlicher (vermeintlichen Verbindungen) zeigen, bestimmt werden kann.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann ein monoklonaler Antikörper oder Ligand (oder eine Kombination dieser Affinitätsmoleküle) zu der kultivierten Biopsie nach dem Säen hinzugefügt werden. Es ist bevorzugt, den Zellen zu erlauben, sich zu akklimatisieren, um Bedingungen für etwa einen Tag nach dem Säen zu kultivieren und dann das (die) vermeintliche(n) Mittel zu den entsprechenden Kulturen in Menge (n) hinzuzugeben, die ausreichend sind, eine vorher festgelegte Konzentration des Mittels zu ergeben. Alternativ kann eine Reihe von Röhren von Kulturmedien, von denen jede mit einer vorher festgelegten Menge eines oder mehrerer vermeintlicher Mittel ergänzt wird, dazu verwendet werden, die Zellen direkt in den Kulturkessel zu säen.
  • Die Aliquote werden dann für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreichend ist, Induktion von Terminalzelldifferenzierung in mindestens einem Teil der malignen Zellen zu induzieren. Allgemein zeigt ein statistisch bedeutsamer Prozentsatz an Zellen (im Vergleich zu einer negativen Kontrolle) Beweis von Terminalzelldifferenzierung innerhalb von etwa einem bis etwa sieben Tagen Inkubation in der Anwesenheit einer Verbindung, welche die Fähigkeit hat, Differenzierung zu induzieren. Herkömmliche Inkubationsbedingungen für menschliche oder andere Säugerzellen sind in der Technik gut bekannt. Geeignete Inkubationsbedingungen umfassen eine Inkubationstemperatur von etwa 20º-45ºC, bevorzugter etwa 37ºC, und eine angefeuchtete Atmosphäre von Luft, ergänzt mit etwa 5%-10% CO&sub2;. Wo die in den Assayverfahren der Erfindung verwendeten Inkubationszeiten etwa drei oder mehrere Tage übersteigen, kann es wünschenswert sein, verbrauchtes Kulturmedium in den entsprechenden Kesseln gegen frisches Kulturmedium, vorzugsweise ergänzt mit der gleichen Konzentration des vermeintlichen Mittels, auszutauschen.
  • Während es bevorzugt wird, die Auswahl von Affinitätsmolekülen für die Verwendung als Antikrebsmittel für individuelle Patienten zurechtzuschneiden, indem eine Zellprobe von einem derartigen Patienten in einem Assayverfahren der Erfindung verwendet wird, umfaßt die vorliegende Erfindung auch Screeningverfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit von Affinitätsmolekülen wie beispielsweise monoklonalen Antikörpern oder Liganden mit Spezifität für das HER-2/neu, wobei Zellen einer transformierten Zelllinie beispielsweise anstelle von biopsiertem Gewebe verwendet werden. Beispiele III und IV im nachfolgenden beschreiben die Induktion von Terminalzelldifferenzierung, die induziert wird durch Inkubieren von Zellen von gut bekannten, leicht erhältlichen transformierten Zelllinien mit monoklonalen Antikörperpräparationen, die spezifisch für einen Teil der extrazellulären Domäne des HER-2/neu Produkts sind.
  • Monoklonale Antikörper, welche spezifische Bindungsaffinität für bestimmte Regionen auf der extrazellularen Domäne des HER-2/neu Produkts haben, sind ein Typ von Affinitätsmolekülen, welche fähig sind, maligne Zellen unter Unterliegen von Terminalzelldifferenzierung zu induzieren, HER-2/neu zu exprimieren oder überzuexprimieren. Wichtigerweise ist es eine notwendige aber nicht ausreichende Bedingung, daß ein monoklonaler Antikörper spezifisch in Bezug auf ein Epitop auf der extrazellulären Domäne des HER-2/neu Produkts ist. In anderen Worten ausgedrückt, nicht alle monoklonalen Antikörper, welche fähig sind, spezifisch eine Region der extrazellulären Domäne von HER-2/neu zu binden, eignen sich zum Induzieren von Differenzierung. Einige monoklonale Antikörper, die diesem ersten Kriterium begegnen, haben keine Wirkung, oder schlimmer, können eine agonistische Wirkung auf die Vermehrung derartiger maligner Zellen haben, die HER-2/neu exprimieren, so daß ihre Verabreichung in vivo unerwünschterweise das Wachstum der krebsartigen Entartung fördern kann. Auch kann ein monoklonaler Antikörper, welcher fähig ist, Differenzierung zu induzieren, eine derartige Wirkung in einem Konzentrationsbereich haben, aber eine entgegengesetzte agonistische Wirkung bei einer unterschiedlichen (d. h. höheren oder niedrigeren) Konzentration haben. Somit liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen eines bevorzugten Bereichs von Dosierungen eines therapeutischen Mittels, das bei der Therapie zu verwenden ist.
  • Monoklonale Antikörper, die sich dazu eignen, mit dem HER-2/neu Produkt zu reagieren, sind in der Technik bekannt. Verfahren, um monoklonale Antikörper allgemein herzustellen, sind auch in der Technik gut bekannt. Siehe allgemein Harlow & Lane. Antibodies - A Laboratory Manual, Ch.s 5-6, Cold Spring Harbor (1988). Im Hinblick auf das Herstellen von monoklonalen Antikörpern, welche spezifisch für die extrazelluläre Domäne von HER-2/neu sind, wird, kurz gesagt, einem Tier, welches fähig ist, eine Immunantwort gegenüber dem Antigen zu produzieren (beispielsweise HER-2/neu Produkt) das Antigen in einer Weise injiziert, welches zu einer Immunantwort führt. Das Antigen kann HER-2/neu Produkt sein, welches aus malignen Zellen isoliert worden ist, welche das Protein erzeugen, oder das Antigen kann durch rekombinante Expression des HER-2/neu Gens (oder eines Teils davon, welcher mindestens einen Teil der extrazellulären Domäne kodiert), welches, wie im Stand der Technik bekannt ist, in eine geeignete Bakterien-, Hefe- oder Säugerwirtszelle für die Herstellung von rekombinantem HER-2/neu Produkt (oder Proteinfragment davon) transformiert oder transfektioniert worden ist, hergestellt werden. Monoklonale Antikörper können aus Mauslymphozyten hergestellt werden, indem einer Maus ein natürliches oder synthetisches Protein (oder Teil eines Proteins) oder Zellmembranen, die von ganzen Zellen abstammen, injiziert wird. Das immunisierte Tier entwickelt natürlicherweise eine Immunantwort gegenüber dem Antigen und erzeugt Milzzellen, welche Antikörper zu verschiedenen Epitopen des Antigens erzeugen, welche dann mit Myelomzellen unter Bilden von Hybridomen fusioniert werden. Klone mit der gewünschten Antikörperspezifität werden im Hinblick auf ihre Fähigkeit ausgewählt, (1) spezifisch an die extrazelluläre Domäne des HER-2/neu Produkts zu binden und (2) Terminalzelldifferenzierung in lebensfähigen malignen Zellen zu induzieren, welche HER- 2/neu exprimieren oder überexprimieren. Ausgewählte, Antikörper erzeugende Zelllinien werden mit Hilfe konventioneller Gewewbekulturtechniken erweitert, und monoklonale Antikörper können routinemäßig aus dem Kulturmedium gereinigt werden. Monoklonale Antikörper, welche das oben angeführte Kriterium (1) und (2) erfüllen, erscheinen fähig zu sein, die Wirkung eines Liganden für das HER-2/neu Produkt nachzuahmen. Chimäre oder humanisierte Formen dieser Antikörper sind für die in vivo Verwendung wünschenswert. Derartige Antikörper können in Übereinstimmung mit gut bekannten Verfahren hergestellt werden, von denen eines in dem U. S. Patent Nr. 4816397 beschrieben ist.
  • Es ist auch überraschenderweise festgestellt worden, daß Liganden für das HER-2/neu Produkt Affinitätsmoleküle sind, welche dazu fähig sind, maligne Zellen zu induzieren. HER-2/neu unter Erdulden von Terminalzelldifferenzierung zu exprimieren oder überzuexprimieren. Beispiele derartiger Liganden umfassen gp30 und NDF.
  • Nach Behandlung der Teile werden die Teile in Bezug auf Indizien von induzierter Terminaldifferenzierung analysiert. Phänotypischerweise wird induzierte Differenzierung durch Reifemarker, welche Inhibierung von Zellwachstum einschließen, geänderte cytoplasmatische Kern-Morphologie, erhöhte Expression von Zelladhäsionsmarkern (wie beispielsweise ICAM-1 und/oder E-Cadherin) und in malignen Brustzellen Vergrößerung der Kerngröße und Synthese von Milchkomponenten wie Casein und Lipiden bewiesen. Überraschenderweise ist festgestellt worden, daß begleitend mit einer oder mehreren dieser reifen phänotypischen Änderungen das HER-2/neu Protein von der Membran zu dem Cytoplasma und/oder Perinuclearregionen der Zelle transloziert (oder wandert), und daß diese Translokation zusätzlich mit einer vorübergehenden Zunahme an dem gesamten zellulären HER- 2/neu Gehalt verbunden ist. Translokation und eine vorübergehende Zunahme an dem gesamten zellulären HER-2/neu Gehalt dient als ein Indikator von Terminalzelldifferenzierung.
  • In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Reaktion auf Antikörper- oder Ligandentherapie in einem Patienten mit Brustkrebs oder Eierstockkrebs prognostiziert, indem eine biopsierte Probe von dem krebsförmigen Gewebe mit dem monoklonalen Antikörper oder Liganden, der für die Therapie für eine vorbestimmte Zeit ausgewählt ist, in Berührung gebracht wird, und indem durch immunhistochemische Färbetechniken Translokation des HER-2/neu Produkts von der Zellmembran zu dem Cytoplasma oder Perinuclearbereich der Krebszelle (oder eine vorübergehende Zunahme am Gesamt-HER- 2/neu Gehalt), eine Zunahme an Kernbereich und/oder eine Zunahme an ICAM-1 (und/oder E- Cadherin) Expression bestimmt wird. Gefärbte Proben können in Bezug auf Werte der optischen Dichte analysiert werden, welche den Mengen von gefärbten Zellbestandteilen entsprechen. Translokation kann bestimmt werden durch (1) eine Reduzierung von HER-2/neu in der Oberfläche, (2) eine Zunahme an HER-2/neu in dem Cytoplasma oder Perinuclearbereich, (3) eine vorübergehende Zunahme an dem Gesamt HER-2/neu Gehalt oder irgendeine Kombination aus (1), (2) und (3). Kernbereich und Expression von ICAM-1 oder E-Cadherin können mithilfe ähnlicher immunhistochemischer Techniken gemessen werden. Die malignen Zellen, die in Übereinstimmung mit einem Verfahren der Erfindung in Anwesenheit oder Abwesenheit eines vermeintlichen Antikrebsmittels behandelt sind, werden anschließend unter Bestimmen des Prozentsatzes an Zellen untersucht, die induziert worden sind, zu differenzieren.
  • Dieses kann bestimmt werden, indem der Prozentsatz von behandelten Zellen, welche HER-2/neu Produkt vorwiegend in dem Cytoplasma und/oder Perinuclearbereich enthalten, mit dem Prozentsatz an Zellen in einer negativen Kontrolle verglichen wird, die eine derartige Verteilung von HER-2/neu Produkt zeigt. Eine Verringerung von HER-2/neu Produkt in der Oberflächenmembran der behandelten Zellen allein oder in Kombination mit einer Zunahme in dem Cytoplasma oder Perinuclearbereich oder eine Zunahme an dem gesamten HER-2/neu Gehalt (im Vergleich zu unbehandelten Zellen) kann dazu verwendet werden, Induktion von Terminaldifferenzierung anzuzeigen.
  • Vorzugsweise kann die Durchschnittsmenge von membrangebundenen HER-2/neu pro Zelle in der Kontrollpopulation als ein Testwert beim Erhalten von Zellprozentsätzen verwendet werden. Der Durchschnitt wird aus einer statistisch signifikanten Anzahl von Zellen in der Kontrollgruppe berechnet werden. Dann wird die Menge von membrangebundenem HER-2/neu in einzelnen Kontrollgruppenzellen mit dem Durchschnitt verglichen, wobei bestimmt wird, welcher Prozentsatz der Population eine niedrigere Menge an membrangebundenem HER-2/neu hat, und welcher Prozentsatz eine höhere Menge hat. Zellen aus der behandelten Gruppe werden in ähnlicher Weise untersucht, wobei bestimmt wird, welcher Prozentsatz an Zellen weniger membrangebundenes HER-2/neu als der Kontrollgruppendurchschnitt beweist, und welcher Prozentsatz größeres membrangebundenes HER-2/neu als der Kontrollgruppendurchschnitt beweist. Letztendlich kann ein Vergleich gemacht werden zwischen den Prozentsätzen, die für die Kontrollgruppe erhalten worden sind, und den Prozentsätzen, die für die behandelte Gruppe erhalten worden sind. Eine statistisch signifikante Zunahme an dem Prozentsatz von Zellen in der behandelten Gruppe über den Prozentsatz von Zellen in der Kontrollgruppe, welche weniger membrangebundenes HER-2/neu als der Kontrollgruppendurchschnitt haben, zeigt Translokation von HER-2/neu. (Die gleiche Annäherung wird verfolgt durch Bestimmen von Änderungen in dem Kernbereich und der Zelladhäsionsmolekülexpression.)
  • Es kann auch die Menge von cytoplasmatischem HER-2/neu anstelle der Menge von membrangebundenem HER-2/neu untersucht werden, wobei Zellprozentsätze, wie zuvor beschrieben, erhalten werden. Eine statistisch signifikante Zunahme an dem Prozentsatz von Zellen in der behandelten Gruppe über den Prozentsatz von Zellen in der Kontrollgruppe, welche mehr cytoplasmatisches HER-2/neu als der Kontrollgruppendurchschnitt haben, zeigt Translokation von HER-2/neu.
  • Die Gesamtmenge von zellulärem HER-2/neu kann auch anstelle von membrangebundenem cytoplasmatischem HER-2/neu untersucht werden, wobei Zellprozentsätze, wie zuvor beschrieben, erhalten werden. Eine statistisch signifikante Zunahme an dem Prozentsatz von Zellen in der behandelten Gruppe über den Prozentsatz von Zellen in der Kontrollgruppe, welche mehr gesamtes zelluläres HER-2/neu als der Kontrollgruppendurchschnitt haben, zeigt Translokation von HER-2/neu.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann die Durchschnittsmenge von in einer Probe von behandelten Zellen gefundenem HER-2/neu (durch Untersuchung der optischen Dichtewerte nach Färben) mit der Durchschnittsmenge von in einer Probe von Kontrollzellen gefundenem HER-2/neu unter Bestimmen der Translokation verglichen werden. Die verglichene Menge kann nur diejenige sein, die membrangebunden ist, wobei in diesem Fall eine statistisch signifikante Verringerung an Färben in der behandelten Probe Translokation anzeigt. Alternativ kann die verglichene Menge nur cytoplasmatisch sein, oder kann der gesamte zelluläre Gehalt sein, wobei in diesen Fällen irgendeine statistisch signifikante Zunahme an Färben in der behandelten Probe Translokation anzeigt.
  • Die Lage und Verteilung einer zellulären Komponente, wie beispielsweise HER-2/neu Protein. Zelladhäsionsmolekül(e) oder Casein oder Lipidtropfen kann immunhistochemisch bestimmt werden. Die Zellen der biopsierten Probe können in einem Fixiermittel wie beispielsweise Paraformaldehyd fixiert werden, gefolgt von Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Aceton, Formalin oder Methanol, um die Zellen durchlässig für immunhistochemisches Färben zu machen. Verfahren der Fixierung sind in der Technik gut bekannt (siehe beispielsweise Bacus et al., Molec. Carcin., 3: 350-62 (1990).
  • Wo das Vorhandensein und die Verteilung von HER-2/neu und/oder Zelladhäsionsmolekül(en) zu bestimmen ist, können Zellen mit einem Antikörper gefärbt werden, welcher spezifisch für das HER-2/neu Produkt ist, und/oder Zelladhäsionsmolekül, das an einen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert ist, wie beispielsweise Fluorescein, Rhodamin und dergleichen. Wo zwei oder mehrere unterschiedliche Antikörper an Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert sind, ist es angemessen, jeden Antikörper an einen Fluoreszenzfarbstoff zu konjugieren, der bei unterscheidbaren Wellenlängen fluoresziert. Die Anordnung und Verteilung von HER-2/neu und/oder Zelladhäsionsmolekül(en) in den Zellen kann in konventioneller Weise mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden, und gewünschtenfalls mithilfe von konfokaler Mikroskopie bestätigt werden. Neben direktem Immunfluoreszenzfärben können indirekte Antikörperfärbeverfahren, welche das Vorhandensein von spezifischen Antigen-Antikörperkomplexen nachweisen, verwendet werden, beispielsweise können Peroxidase-anti-Peroxidase-Färbeverfahren oder alkalische-Phosphatase-Färben verwendet werden, um die Verteilung von HER-2/neu und/oder Zelladhäsionsmolekül(en)in derartigen fixierten Zellen zu bestimmen.
  • Reife Phänotyp-Expression kann auch verwendet werden, das Ausmaß von Terminalzelldifferenzierung in dem ersten Teil der Biopsie zu bestimmen. Beispielsweise können unreife menschliche Krebsbrustzellen und reife Zellen (beispielsweise maligne Zellen, welche induziert wurden, zu differenzieren) durch die Fähigkeit der reifen Zellen aber nicht der malignen Zellen unterschieden werden, menschliche Milchkomponenten einschließlich Casein und Lipide herzustellen. Der Prozentsatz an Zellen, welche dazu gebracht worden sind, in einem Verfahren der Erfindung zu differenzieren, kann durch das Vorhandensein derartiger Milchkomponenten bestimmt werden. Casein kann mithilfe von bekanntem immunhistochemischem Färben unter Verwenden von Anti-Casein-Antikörpern nachgewiesen werden. Das Vorhandensein von Lipiden kann durch Färben mit einer Farbstoffverbindung, die geeignet für derartigen Nachweis ist, beispielsweise Oil Red O., siehe beispielsweise Bacus et al., Molec. Carcin., 3: 350-62 (1990) nachgewiesen werden.
  • Nach dem Färben kann die Lage des HER-2/neu Proteins beispielsweise bestimmt und eine qualitative oder quantitative Analyse von der HER-2/neu Migration (d. h. Translokation) gemacht werden. Ein quantitativ bestimmtes Maß der Menge des Proteins pro Zelle kann genommen werden, indem die Mikroskopbilder von gefärbten Proben digitalisiert werden, und die Lichtintensitätswerte von Pixels des digitalisierten Bildes in optische Dichtewerte verwandelt werden, welche den Mengen von gefärbtem Protein entsprechen. Siehe beispielsweise Bacus et al., Applied Optics, 26, 3280-3293 (1987).
  • Insbesondere kann die mengenmäßige Bestimmung auf die folgende Weise durchgeführt werden. Eine Zellkulturprobe wird in Bezug auf das Onkogenprodukt gemäß einem Färbeverfahren, wie zuvor beschrieben, oder mit einem etwas anderen in der Technik bekannten Färbeverfahren gefärbt. Die Zellkulturprobe wird auch in Bezug auf DNA wie beispielsweise mithilfe der Feulgen-Technik gefärbt. Das DNA Färbemittel sollte auf der Basis der weggelassenen Wellenlänge unterscheidbar sein (d. h. von unterschiedlicher Farbe aus dem Färbemittel für das (die) Protein(e), um Differenzierung zwischen den Färbemitteln zu erlauben). Die Digitalisierung von unterschiedlichen filtrierten Bildern des einzelnen Probenbildes durch entsprechend unterschiedliche Filter, eines für jedes spezifische Färbemittel, ermöglicht einen optischen Dichtewert, der mit jedem Pixel jedes filtrierten Bildes in einem Computersystem verbunden ist, das programmiert ist, die Bilder zu verarbeiten. Die optische Dichte des (der) Proteinfärbemittelbildes(r) und die optische Dichte des DNA Färbemittelbildes werden durch den Computer summiert.
  • Das DNA Färbemittel wird auf eine andere Probe der gleichen Zellkultur aufgebracht, und ein Humanoperator identifiziert wechselwirkend einzelne Zellen zu dem Computer, welcher Summen von optischen Dichten für die einzelnen so identifizierten Zellen berechnet. Dieses zweite Bild liefert die Durchschnitts DNA pro Zelle. Die vorhergehende Summe der optischen Dichte aus dem ersten DNA Färbungsmittelbild, welches die gesamte DNA darstellt, die in jenem Bild gesehen wurde, wird durch die Durchschnitts DNA pro Zelle für die Kultur geteilt, dieses ergibt die Anzahl von Zellen in dem ersten Teil. Die Summe der optischen Dichte für das Protein wird dann durch diese Anzahl von Zellen geteilt, wobei der Durchschnittsproteingehalt pro Zelle erhalten wird. Ein Referenzkontrollteil einer Standardzelllinie, nicht notwendigerweise in irgendeiner Weise mit den Zellen aus der Probe verbunden, und in der der DNA Gehalt und Onkogenproteingehalt pro Zelle bekannt sind, können mit identischen Färbemitteln gefärbt werden und verwendet werden, die optische Dichte mit der Masse von gefärbtem Material zu kalibrieren. Ein umfassenderes Verständnis der mengenmäßigen Proteinbestimmung und der Kernbereichsmessung können aus dem U. S. Patent Nr. 4175860. U. S. Patent Nr. 4998284, U. S. Patent Nr. 5008185. U. S. Patent Nr. 5106283 und U. S. Patent Nr. 5028209 erhalten werden.
  • Die mengenmäßige Bestimmung von membrangebundenen HER-2/neu (und cytoplasmatischem HER-2/neu)und/oder Zelladhäsionsmolekül(en) kann vorzugsweise durchgeführt werden, indem für die optische Dichte-Summierung nur diejenigen Pixels in den digitalisierten Bildern gewählt werden, welche der Membran (oder dem Cytoplasma) oder entsprechenden Teilen davon entsprechen. Pixelselektion kann durch automatischen Computeralgorithmus oder durch Humanwechselwirkung durchgeführt werden.
  • Alternativ können membrangebundenes HER-2/neu und/oder Zelladhäsionsmolekül(e) mengenmäßig unter Verwenden der zuvor beschriebenen digitalisierten Bildanalyse in Verbindung mit Fixierungs- und Färbeverfahren bestimmt werden, welche die Membran nicht permeabel gegenüber den Elementen des Färbekomplexes machen, und somit exklusiv zum Färbern von membrangebundenem Produkt führen. Kurz gesagt, es werden beispielsweise Probenzellen 60 Minuten lang bei Raumtemperatur in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert. Der monoklonale Murin-Antikörper TA-1 (Applied Biotechnology, Cambridge, MA), welcher auf die äußere Membrandomäne von HER-2/neu gerichtet ist, wird typischerweise bei einer Konzentration von 2 ug/ml angewendet. Dieses Fixierungsverfahren macht die Zellen gegenüber dem TA-1 Antikörper nicht permeabel. Zweistufenantikörper und Färbemittel (beispielsweise Ziegen-anti-Maus-Antikörper konjugiert an einen Fluoreszenzfarbstoff) werden mit dem Ergebnis angewendet, daß nur membrangebundenes HER-2/neu gefärbt wird. Die Menge von membrangebundenem HER-2/neu pro Zelle, im Durchschnitt genommen über eine Probe von Zellen, wird, wie zuvor beschrieben, mithilfe von Bildanalyse und unter Verwenden eines Feulgenfärbemittels für DNA bestimmt.
  • Alternativ umfassen Indizien der Terminaldifferenzierung in Zellen, die Gegenstand des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind, morphologische Änderungen in Zellen, welche charakteristisch für einen reifen Zelltyp sind. In Fällen, wo die morphologische Änderung dramatisch ist, wie beispielsweise eine fundamentale qualitative Änderung in der Form oder Struktur einer Zelle (oder ihres Kerns), wie durch ein Mikroskop betrachtet, kann eine Bestimmung des Ausmaßes der Zelldifferenzierung gemacht werden, indem die Zellen unter einem Mikroskop untersucht und die Zahl der Zellen gezählt wird, welche qualitative morphologische Merkmale zeigen, die mit Terminalzelldifferenzierung verbunden sind. Maligne Zellen sind charakteristischerweise kompakt und sphärisch mit einem ähnlichen Kern, welcher dicht färbt, wohingegen terminal differenzierte Zellen charakteristischerweise flach gemacht sind, ein Cytoplasma haben, welches ein feines bortenartiges Aussehen und einen diffusen Kern zeigt. Der Prozentsatz an Zellen, welche die zuletzt genannten morphologischen Merkmale zeigen, kann verwendet werden, mengenmäßig das Ausmaß der Terminalzelldifferenzierung zu bestimmen, welche durch ein vermeintlich therapeutisches Mittel in einem gegebenen Anteil von Zellen induziert wird, und folglich eine Prognose zu erlauben, die sich auf die Wirkung des vermeintlichen therapeutischen Mittels bei dem malignen Wachstum, das versucht wird, zu behandeln, bezieht.
  • Darüber hinaus können quantitative morphologische Unterschiede wie beispielsweise die Änderung in dem Verhältnis des cytoplasmatischen Bereichs zu dem Kernbereich, welche mengenmäßig durch computergesteuerte Bildanalysetechniken, wie zuvorbeschrieben, bestimmt werden kann, verwendet werden, zwischen unreifen und reifen Zellen zu unterscheiden.
  • Zellvermehrung ist noch eine andere Maßnahme des Ausmaßes der Terminalzelldifferenzierung. Unreife Krebszellen werden sich unbegrenzt vermehren, wohingegen reife Zellen das nicht tun werden. Eine Stabilisierung und Reduzierung der Zellpopulation im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollzellen zeigt wesentliche Terminalzelldifferenzierung. Ein markierter Unterschied in Wachstumskurven zwischen behandelten und unbehandelten Teilen kann auch wesentliche Terminalzelldifferenzierung anzeigen. Statistische Verfahren zum Analysieren von Zellpopulationen sind in der Technik gut bekannt, und die zuvor genannten Beispiele sollten nicht als eine Beschränkung der Verfahren genommen werden, welche angewendet werden können. Aspekte der Terminalzelldifferenzierung innerhalb der Zellpopulation zu bestimmen.
  • Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, Sepharose, Triton, Sephadex und Bondapack sind registierte Handelsmarken.
    • BEISPIEL 1
  • Monoklonale Antikörper gegen das HER-2/neu Produkt wurden hergestellt, indem Balb/c Mäusen intraperitoneal 3mal (Zweiwochenintervalle) 3 bis 5 · 10&sup6; lebensfähige menschliche SKBR3 Brustkrebszellen in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung ("PBS") injiziert wurden. Milzzellen von Mäusen, welche eine starke Immunantwort entwickelten, wurden isoliert und mit NSO Myelomzellen fusioniert, wobei Polyethylenglykol verwendet wurde, und Hybridome wurden mit HAT (Hypoxathin/Aminopterin/Thymidin) Medium ausgewählt. Hybridome wurden im Hinblick auf spezifisches Binden an rekombinantes HER-2/neu Produkt gescreent, welches auf der Oberfläche von fixierten Chinesischen Hamstereierstockzellen (CHO) exprimiert war, welche mit einem entsprechenden Expressionsvektor transfektioniert worden waren. Monoklonale Antikörper, welche spezifisch HER-2/neu Produkte binden, wurden mit ¹²&sup5;I-markiertem Ziegen-anti-Maus F(ab')&sub2; Antikörper nachgewiesen. Die Antikörper, die spezifisch an an die transfektionierten CHO Zellen banden, wurden im Hinblick auf weitere Analyse selektiert, wobei entweder ein Immunfällungsassay mit [³&sup5;S]Methionin markierten Zellen ausgewählt wurde oder Immunfällung, gefolgt von Autophosphorylierung in der Anwesenheit von MnCl&sub2; und [³²P]ATP. Dieses Immunisierungsverfahren lockte spezifische Antikörper zu dem extrazellulären Teil des menschlichen HER-2/neu Antigens hervor. Vier der monoklonalen Antikörperpräparationen, bezeichnet als N12, N28, N24 und N29 wurden, wie zuvor beschrieben, hinterlegt. N10 wurde von Dr. Yosef Yarden des Weizmann Instituts. Rehovot, Israel hinterlegt. Monoklonale Antikörper N12, N24, N28 sind von der IgG&sub1; Unterklasse, und die N29 monoklonale Antikörperpräparation ist von der IgG&sub2; Unterklasse.
    • BEISPIEL II
  • N29 wurde aus Ascitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatfällung (40% Sättigung) gereinigt, gefolgt von Chromatographie auf einer Sepharose-Protein A Säule. Fraktionen, die den Antikörper enthielten, wurden durch Elution bei einem niedrigen pH (50 mM Zitronensäure bei pH 4,8) erhalten. Die Antikörperpräparation war homogen rein, bestimmt durch Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen. SDS-Polyacrylamid-Gel-getrennte schwere und leichte Ketten wurden auf Polyvinylidendifluoridmembranen übertragen und Edmanabbau ausgesetzt. Es wurden auf diese Weise Aminosäuresequenzen der Aminoenden sowohl der schweren wie auch der leichten Ketten (jeweils 20 Aminosäuren) folgendermaßen erhalten:
    • H. (schweren) Kette:
  • Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu
    • L. (leichten) Kette:
  • Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Val Asp Arg Ile Ser
  • Um die Antikörper N12, N24 und N29 zu charakterisieren wurden die folgenden Experimente durchgeführt.
  • HER2 Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen plattiert und auf Konfluenz untersucht. Konfluente Monoschichten der HER2 Zellen wurden eine Stunde lang bei 22ºC mit verschiedenen Konzentrationen von Antikörpern in PBS, welche 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthielten, inkubiert. Nach Waschen mit dem gleichen Puffer wurden die Zellen 90 Minuten lang mit I&sub1;&sub2;&sub5;-markiertem Ziegen-anti-Maus F(ab')&sub2; unter Bestimmen gebundener Antikörper inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen, mit 0,1 M NaOH löslich gemacht, und die Radioaktivität in einem Gammazähler bestimmt. Kontrollzellen wurden in der Abwesenheit des Murinantikörpers inkubiert, und ihr Hintergrundbinden wurde abgezogen.
  • Fig. 1 zeigt das Binden, ausgedrückt als % Sättigung, gegen Antikörperkonzentration der fünf Antikörper zu den HER2 Zellen: N10 ( ), N12 ( ), N24 (o), N28 ( ) und N29 ( ). Alle spezifisch gebunden an kultivierte Zellen, die HER2/neu mit unterschiedlichen scheinbaren Affinitäten exprimieren, N28 und N24 zeigten die höchste scheinbare Affinität, wohingegen N10 die niedrigste scheinbare Affinität zeigte.
  • HER2 Zellen wurden metabolisch mit [³&sup5;S]Methionin markiert, und die Zelllysate wurden getrennt einem Immunfällungsassay mit 10 ug jedes Antikörpers ausgesetzt. Als eine Kontrolle wurde ein irrelevanter Antikörper, Anti-Dinitrophenol (anti-DNP) verwendet. Proteine wurden auf einem SDS-7,5% Polyacrylamidgel getrennt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2A gezeigt.
  • Der Immunfällungsassay wurde, wie in Beispiel I beschrieben, durchgeführt, aber mit nicht markierten Zellen. Vor Elektrophorese wurden die Proteine aus dem Zelllysat durch Autophosphorylierung mit gamma[³²P]ATP und 10 mM MnCl&sub2; markiert. Autoradiogramme sind dargestellt: NI (kein Immunserum), Polycl (polyklonaler anti-HER2/neu Antikörper). Die Ergebnisse sind in Fig. 2B gezeigt.
  • Alle führten Immunfällung eines einzelnen Proteins von 185 kD aus metabolisch markierten HER2 Zellen durch, wie in Fig. 2A dargestellt. Dieses wurde auch in einem in vitro Kinaseassay reflektiert, der auf den Immunpräzipitaten durchgeführt wurde (Fig. 2B). Keine reagierte mit EGFR oder mit dem Ratten p185neu, Westernblotanalyse des HER-2/neu Proteins zeigte, daß nur N12 und N29 fähig waren, mit der denaturierten Form des Rezeptors zu reagieren (siehe Tabelle I). Für die Westernblotanalyse wurden HER2 Zelllysate durch SDS-PAGE getrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit den Antikörpern geblottet, gefolgt von Nachweisen unter Verwenden von an Ziegen-anti-Maus F(ab')&sub2; konjugierter Meerettichperoxidase.
  • Die Antikörper wurden auch im Hinblick auf ihre Fähigkeit untersucht, Tumorwachstum von Murinfibroblasten zu beeinflussen, die durch Überexpression von HER2/neu in Mäusen ohne Thymusdrüsen transformiert waren. HER2 Zellen (3 · 10&sup6;) wurden subkutan in CD1/nackte Mäuse injiziert. Die Antikörper oder eine Kontrolle (ein irrelevanter Antikörper gegenüber Dinitrophenol oder PBS) wurden intraperitoneal in Gruppen von 5 nackten Mäusen an den Tagen 3, 7 und 10 nach Tumoranimpfung injiziert. Tumorparameter wurden zweimal die Woche mit Tasterzirkeln gemessen, und das Tumorvolumen wurde gemäß der Formel berechnet: Tumorvolumen = Länge · Breite · Höhe. Um Volumenmessungen gültig zu machen, wurde die Korrelation zwischen dem Tumorvolumen und dem Tumorgewicht am Tag des Tiertötens bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 (Durchschnittstumorvolumen als Prozentsatz der Kontrolle, wobei "100" dem Kontrollwert gleicht: n = 5, gemessen 21 Tage nach Tumorimpfung) und in Fig. 3 dargestellt. TABELLE I
  • ND = nicht bestimmt
  • Fig. 3A beschreibt Tumorvolumen jeder Gruppe von Mäusen am Tage 21 nach Animpfung nach Behandlung. Das tumorartige Wachstum der HER2 Zellen wurde signifikant in nackten Mäusen inhibiert (P< 0,05, berechnet unter Verwenden des Anova und Duncanmehrfach- Vergleichstest), denen N29 und N21 injiziert war, im Vergleich zu Mäusen, die keinen Antikörper oder den Kontroll-anti-DNP Antikörper erhielten.
  • Fig. 3B beschreibt die Kinetiken des Tumorwachstums, ausgedrückt als Tumorvolumen, gegen die Zeit, bei Antikörperbehandlungsmäusen: Kontrolle ( ), N10 ( ), N12 ( ), N24 (o), N28 ( ), N29 ( ). Es kann gesehen werden, daß die inhibierende Wirkung der Antikörper 31 Tage nach Tumorinjektion bestand. Antikörper N10 und N24 zeigten weniger wirksame Inhibierung des Tumorwachstums. Im Unterschied dazu stimulierte monoklonaler Antikörper N28 übereinstimmend Tumorwachstum. Im wesentlichen identische Ergebnisse wurden in drei getrennten Experimenten erhalten.
  • Um die Möglichkeit zu testen, daß die in vivo gesehenen Wirkungen in vitro reflektiert werden, wurden Zellvermehrungsassay in Kultur und Zytotoxizitätsassay mit den Antikörpern auf der menschlichen SKBR3 Brustkarzinomzelllinie (aus der American Typ Culture Collection) durchgeführt.
  • Bei dem Zellvermehrungsassay wurden SKBR3 Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen (10³ Zellen/Vertiefung) plattiert und 48 Stunden lang in Medium inkubiert, das mit 10% fetalem Kalbsserum ergänzt war. Die Menge des Serums wurde dann auf 5% verringert, und die angegebenen Antikörper bei 10 ug/ml Konzentration hinzugegeben. Fünf Tage später wurde die Zahl von lebensfähigen Zellen bestimmt. Die Ergebnisse (in Prozentsatz) sind in Tabelle 1 dargestellt, wobei "100" der Menge der Zellvermehrung für Kontrollbehandlung entspricht.
  • Komplementabhängiger Cytotozitäts-("CDC") Assay von SKBR3 Tumorzellen wurde folgendermaßen durchgeführt: die SKBR3 Tumorzellen wurden 2 Stunden lang bei 37ºC in einem Volumen von 0,1 ml fetalem Kalbsserum mit 300 uCl Na[&sup5;²Cr]O&sub4; (New England Nuclear) inkubiert. Am Ende der Markierungsperiode wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen und 1,5 · 10&sup4; Zellen wurden in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen plattiert.
  • Es wurden verschiedene Konzentrationen der Antikörper hinzugefügt und 1 Stunde lang mit den Zellen inkubiert, gefolgt von der Zugabe von menschlichem oder Kaninchen- Komplement und weiteren 3 Stunden Inkubation. Angemessene Kontrollvertiefungen, welche die Zellen allein, Zellen ohne Antikörper oder kein Komplement enthielten, und Zellen, die in 10% SDS lysiert waren, wurden parallel eingerichtet. Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 1 dargestellt. Die Werte stellen [&sup5;¹Cr]O&sub4; Freigabe (bestimmt in einem Gammazähler) aus Zellen dar, die mit den angegebenen Antikörpern (50 ug/ml) behandelt sind, als Prozentsätze des gesamten zellulären Gehalts von [&sup5;¹Cr]. Die Mittel der Triplikatbestimmungen sind gegeben. Korrekturen wurden in Bezug auf spontane Freigabe in der Abwesenheit von Antikörper und Komplement durchgeführt.
  • Antikörper vermittelter zellabhängiger Zytotoxizitätsassay ("ADCC") wurde folgendermaßen durchgeführt: die SKBR3 Tumorzellen wurden mit Na[&sup5;¹Cr]O&sub4; wie zuvor beschrieben markiert. 5 · 10³ Zellen in 25 ul wurden 1 Stunde lang mit verschiedenen Konzentrationen der Antikörper inkubiert und anschließend 5 Stunden lang mit Effektorzellen, peripheralen menschlichen Blutlymphozyten (0,1 ml, Lymphozyten: Tumorzellen = 140 : 1) oder mit Maussplenozyten (120 : 1). [&sup5;¹Cr] Freigabe wurde, wie zuvor beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle 1 drücken die Prozentsätze der antikörper-vermittelten zellabhängigen Lyse von SKBR3 Zellen unter Verwenden von 50 ug/ml jedes Antikörpers in dem Assay aus.
  • Es wurden zwei unterschiedliche Assays verwendet, um die Kapazität der monoklonalen Antikörper zu testen. Tyrosinphosphorylierung des HER-2/neu-Proteins zu erhöhen: HER2 Zellen wurden metabolisch mit [³²P]Orthophosphat markiert, mit den Antikörpern inkubiert und zwei aufeinanderfolgenden Immunfällungsstufen mit Anti-Phosphotyrosin und Anti-HER- 2/neu Antikörpern ausgesetzt, wie von Yarden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3179-3183 (1989) beschrieben. Alternativ wurden SKBR3 Zellen zuerst mit den Antikörpern inkubiert und dann zwei aufeinanderfolgenden Immunfällungsstufen ausgesetzt, gefolgt von einem in vitro Phosphorylierungsassay in der Anwesenheit von gamma (³²P)ATP und MnCl&sub2;.
  • Die SKBR3 und HER2 Zellen wurden in einer Platte mit 24 Vertiefungen gezüchtet und 4 h in Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium (DMEM) ohne. Phosphat markiert, aber in der Anwesenheit von 1% dialysiertem fetalem Kalbsserum ("FCS") und [³²P]Orthophosphat (0,5 mCi/ml). Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und 15 Minuten lang bei 22ºC mit frischem Medium inkubiert, welches Antikörper bei einer Konzentration von 10 ug/ml enthielt. Nach dem Waschen wurden die Zellen in Solubilisierungspuffer (50 mM Hepes, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10% (Vol/Vol) Glycerol; 1% Triton X; 1 mM EDTA; 1 mM EGFR; 1,5 mM MgCl&sub2;; 2 mM PMSF: 1% Aprotinin, 1% Leupeptin (gerade vor Verwendung hinzugegeben)) lysiert, und das Tyrosin phosphorylierte HER2/neu Protein wurde mit einem agaroseimmobilisierten Antikörper zu Phosphotyrosin (Hung et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 4408-4412 (1987)) immungefällt. Die Immunkomplexe wurden mit Solubilisierungspuffer eluiert, welcher 50 mM p- Nitrophenylphosphat enthielt, und Immunfällung mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-HER- 2/neu Antikörper, der auf das Carboxyende des Proteins gerichtet war, ausgesetzt.
  • Gemäß dem ersten Assay wurden Monoschichten von HER2 Zellen mit [³²P]Orthophosphat markiert und dann 15 Minuten lang bei 22ºC mit 10 ug/ml jedes Antikörpers inkubiert. Tyrosinphosphorylierte Proteine wurden mit einem Anti-Phosphotyrosinantikörper immungefällt, gefolgt von spezifischer Elution und einer zweiten Immunfällungsstufe mit dem polyklonalen Kaninchen-anti-HER-2/neu Antikörper. Das Ausmaß der Induktion von Tyrosinphosphorylierung des HER-2/neu Proteins mittels der Antikörper wurde mittels Densitometrie von Autoradiogrammen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I und in Fig. 4A gezeigt.
  • In dem zweiten Assay wurden SKBR3 Zellen zuerst mit den Antikörpern inkubiert, in zwei aufeinanderfolgenden Stufen immungefällt, wie zuvor beschrieben, und mittels Autophosphorylierung mit gamma [³²P]ATP und Mn²&supmin; markiert. Die Autoradiogramme der SDS gelgetrennten Proteine sind in Fig. 4B gezeigt.
  • Ähnliche Ergebnisse wurden in beiden Analysen erhalten: N28 stimulierte signifikant Phosphorylierung des HER-2/Neu Produktes auf Tyrosinresten, wohingegen die anderem Antikörper niedrige oder keine Aktivität (N10) in lebenden Zellen zeigten.
  • Die Wechselwirkung von Rezeptortyrosinkinasen mit ihren entsprechenden Liganden wird üblicherweise an schnelle Endozytose gekoppelt. Es wurde das Potential der Antikörper zu dem menschlichem HER-2/neu Protein, wobei der Turnover des Rezeptors beschleunigt wurde, untersucht. Zu diesem Zweck wurden HER2 Zellen biosynthetisch mit radioaktivem Methionin markiert und anschließend über verschiedene Zeitperioden mit frischem Medium verfolgt, das unterschiedliche Antikörper enthielt. Am Ende der Verfolgungsperiode wurde das restliche markierte Protein immungefällt und mittels Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert.
  • SKBR3 oder HER2 Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen zu 80% Konfluenz gezüchtet und anschließend 16 Stunden bei 37ºC mit [³&sup5;S]Methionin (50 uCl/ml) markiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen mit frischem Medium in der Abwesenheit oder Anwesenheit der Antikörper (bei einer Konzentration von 10 ug/ml) verschiedene Zeitperioden inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen, und die Zelllysate wurden Immunfällung mit einem polyklonalen Kaninchenantikörper zu dem HER2/neu Protein ausgesetzt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als die Halbwertszeit des markierten Proteins (t1/2) sind in Tabelle I dargestellt.
  • Fig. 5 zeigt die Wirkung der Antikörper auf die Turnoverrate des HER-2/neu Produkts [ausgedrückt als HER2/neu Protein (% vom Anfang) gegen die Zeit]. HER2 Zellen wurden mit [³&sup5;S]Methionin in einer Platte mit 24 Vertiefungen markiert und anschließend über die angegebene Zeitdauer mit frischem Medium verfolgt, das die angegebenen Antikörper enthielt. Restliches ³&sup5;S-markiertes HER-2/neu Protein wurde Immunfällung mit dem polyklonalen Kaninchenantikörper ausgesetzt und auf einem SDS Gel getrennt. Quantitative Analyse des Rezeptorturnovers ist dargestellt, bestimmt durch Messen der Densitometrie des Autoradiogramms. Kontrollzellen ohne Antikörperbehandlung ( ), N10 antikörperbehandelte Zellen ( ), N12 ( ), N24 (o), N28 ( ) und N29 behandelte Zellen ( ). Wie in Fig. 5 dargestellt, beschleunigten alle die Antikörper in unterschiedlichen Ausmaßen die Turnoverrate des Rezeptors, wobei der Antikörper N29 der wirksamste war.
  • Konjugate von Ricin A und Antikörpern N24 und N29 wurden durch kovalentes Vernetzen mit dem bifunktionellen Reagenz SPDP (Succinimidyl-3-2-pyridyldithiopropionat) hergestellt. Ungebundenes Ricin wurde durch Gelfiltration auf Sephadex G100 getrennt. Die Konjugate wurden durch Passage auf Blue Sepharose CL-6B (Entfernung von unsubstituiertem Antikörper) gereinigt.
  • Die Konjugate wurden im Hinblick auf ihre Fähigkeit untersucht, Tumorwachstum, wie zuvor beschrieben, zu bewirken, zu diesem Zweck empfingen nackte weibliche CD1 Mäuse HER2 Tumorzellen (3,2 · 10&sup6;) subkutan injiziert. Elf Tage später wurde eine einzelne Injektion von Ricin A-Antikörperkonjugat intravenös injiziert. Ricin A-N24: 3,9 ug Ricin A gebunden an 65 ug Antikörper. Ricin A-N29: 4 ug Ricin A gebunden an 90 ug Antikörper. Die Tumorgröße wurde alle 3-4 Tage während 40 Tagen gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt, welche die Retardation von Tumorwachstum durch beide Konjugate Ricin A-N24 Antikörper und Ricin A-N29 Antikörper zeigt.
    • BEISPIEL III
  • Menschliche Brustkrebszelllinien, AU-565, MDA-MB 453 und MCF-7 sind in der Technik gut bekannt und breit verfügbar. Die AU-565 Zelllinie überexprimiert sowohl HER-2/neu wie EGFR, MDA-MB 453 Zellen überexprimieren HER-2/neu: MCF-7 Zellen überexprimieren nicht HER- 2/neu. In jedem Fall wurden kultivierte Zellen der entsprechenden Zelllinien trypsiniert, pelletisiert und in vier Kammerobjektträger (Nung, Naperville. ILL) bei 0,5 · 10&sup4; gesät. Die AU-565 Zellen wurden von Naval Biosciences Laboratory in Oakland, Californien erhalten. Kulturen der MCF-7 Zellen (ATCC Hinterlegungsnummer MCF-7 HTB 22) und MDA-MB 453 (ATCC Hinterlegungsnummer 453 HTB 131) wurden von der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland erhalten.
  • Die Zellen wurden in RPMI 1640, welches mit 20% fetalem Rinderserum, Penicillin (100 ug/ml) und Streptomycin (100 ug/ml) ergänzt war, in einem Befeuchtungsinkubator mit 8% CO&sub2; an Luft bei 37ºC kultiviert. Einen Tag nach Säen, als die Zellen annähernd 10%-20% konfluent waren, wurden die Zellkulturmediumzellen mit 10 ug/ml einer der folgenden monoklonalen Antikörperpräparationen mit Spezifität für die extrazelluläre Domäne des HER- 2/neu Proteins ergänzt: N12, N24, N28 und N29. Kontrolle IgG (ein irrelevanter IgG Antikörper). Auch PBS allein wurde zu bestimmten Kontrollkulturen als eine Kontrolle gegeben, in der IgG fehlte. Die Zellen wurden zusätzliche vier Tage kultiviert, und anschließend unter Bestimmen der Wirksamkeit der entsprechenden monoklonalen Antikörperpräparation im Hinblick auf Induzieren der malignen Brustzellen, Terminalzelldifferenzierung zu erdulden, untersucht. Differenzierung wurde durch den Prozentsatz an Zellen, die Lipid erzeugen, Zellzahlen, Kernbereich pro Zelle (um²) und die Translokation von HER-2/neu untersucht, wie durch den gesamten zellulären Gehalt des Proteins (wo 100% Expression der Menge HER-2/neu in kaum wachsenden unbehandelten Zellen entspricht) und Humanidentifizierung der Lage des Färbens bei konfokaler Mikroskopie bewiesen. Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse beziehen sich auf die AU-565 Zelllinie. TABELLE II
  • Die zuvor angegebenen Daten zeigen, daß monoklonale Antikörper N29, N24 und N12 die malignen Brustzellen induzierten, Differenzierung zu unterliegen und reife phänotypische Eigenschaften zu zeigen, wohingegen der N28 Antikörper, welcher auch spezifische Bindungsaffinität für einen Teil der extrazellulären Domäne des HER-2/neu Produkts hat, die Tumorartigkeit der behandelten AU-565 Zellen förderte. Konfokale Mikroskopbilder zeigten, daß die Behandlung von AU-565 Zellen mit N28 Antikörper nicht zu einer Translokation des HER-2/neu Proteins von der Membran führte, wohingegen Translokation von der Membran zu dem Cytoplasma und Perinuklearbereich der Zellen in AU- 565 Zellen gezeigt wurde, die mit den N29, N24 und N12 monoklonalen Antikörpern behandelt waren.
  • Ergebnisse für die MDA-MB 453 Zelllinie waren ähnlich zu Ergebnissen für die AU-565 Zelle. Die MCF-7 Zellen, welche kein HER-2/neu überexprimieren, waren größtenteils unbeeinflußt von den Antikörpern, mit der Ausnahme jedoch, daß monoklonaler Antikörper N29 den Prozentsatz an Zellen erhöhte, welche Lipidtropfchen zeigen.
  • Phänotypexpression als ein Marker der Terminalzelldifferenzierung wurde gemessen, indem die Produktion von Lipidtropfen und Casein, bei des sind Komponenten von menschlicher Milch, nachgewiesen wurde. Lipidtropfen wurden durch ein modifiziertes "Öl Rot O in Propylenglykol (Oil Red O in propylen glycol)" Verfahren nachgewiesen. D. C. Sheehan, Theory and Practice of Histotechnology, Seite 209. C. V. Mosby Company. St. Louis, (2. Auflage 1980). Für das Lipidfärbeverfahren wurde das Kulturmedium entfernt, die Zellen wurden mit 0,05 M phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,6 gespült und durch ein schnelles Eintauchen in -20ºC Methanol/Aceton fixiert. Nach Fixierungen wurden die Objektträger, auf denen die Zellen gezüchtet wurden, 2 Minuten lang bei Raumtemperatur in absolutes Propylenglykol in einer Öl Rot O (Oil Red O) Färbelösung gebracht. Die Objektträger wurden dann in 85% Isopropanol eingetaucht, mit entionisiertem Wasser gespült, in Mayer's Hematoxylin gegengefärbt, in gesättigtem Lithiumcarbonat blaugefärbt und mit Glycerolgallerte bedeckt.
  • Das Vorhandensein von Casein wurde durch histochemisches Färben mit einem monoklonalem Mausantikörper zu menschlichem &beta; oder &kappa; Casein nachgewiesen. Nach Entfernung des Mediums wurden die Zellobjektträger mit PBS gespült, und die Zellen wurden in Ethanol- Formol Lösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Nachdem das nichtspezifische Binden mit 20% Ziegenserum 20 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert war, wurden die Zellen mit dem Anti-Casein (&beta; und &kappa;) Antikörper (1 : 250 Verdünnung) bei Raumtemperatur 60 Minuten lang inkubiert. Die Objektträger wurden dann mit 0,5 M Tris gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (TBS) pH 7,6 gespült und dann mit biotinyliertem Ziegen- anti-Maus IgG (Jackson Labs, West Grove, PA) bei 1 : 200 Verdünnung 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden mit TBS gespült, und Streptomycin konjugierte alkalische Phosphatase (Jackson Labs) bei 1 : 200 Verdünnung wurde 30 Minuten lang auf die Zellen aufgebracht. Die Zellen wurden wiederum mit TBS gespült und 15 Minuten lang mit CAS Red (Cell Analysis Systems, Elmhurst, ILL) als das Chromogen inkubiert. Die Zellen wurden dann mit CAS DNA Färbemittel (Cell Analysis Systems) gegengefärbt.
  • Die Lokalisierung des HER-2/neu Produkts (d. h. Translokation von HER-2/neu) wurde unter Verwenden von konfokaler Mikroskopie nach Immunfluoreszenzfärben bestimmt. Für die Bestimmung der Translokation wurden die Zellen, nachdem die Kulturmedien entfernt und die Zellen mit PBS gespült waren, 10 Minuten lang mit 95% Ethanol permeabel gemacht. Im Anschluß an eine TBS Spülung wurden die Zellen in 10% neutral gepuffertem Formalin 30 Minuten lang post-fixiert. Nach einer entionisierten Wasserwaschung wurden die Zellen im Hinblick auf DNA mit einem Feulgenfärbemittel gefärbt, wonach sie gut mit TBS (pH 7,6) gespült wurden. Nach einer 20 Minuten Blockierung mit 20% normalem Ziegenserum wurde ein Teil der Zellen (der andere Teil diente als eine Schätzung des Durchschnitts DNA Gehalts der Zellen, im nachfolgenden beschrieben) mit einem polyklonalen Antikörper zu dem C Terminus des HER-2/neu Proteins (Onkogen Kit aus Zellanalysesystemen) 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann mit TBS gespült und mit einem ersten Verbindungsantikörper, Maus-anti-Kaninchen IgG, bei einer Proteinkonzentration von 10 mg/l (Jackson Laboratories) 30 Minuten lang inkubiert. Das Dichlortriazinylaminofluorescein [DTAF]-konjugierte Ziegen-anti-Maus IgG (Jackson Labs) wurde 30 Minuten lang bei einer Verdünnung von 1 : 100 angewendet. Die Zellen wurden dann mit TBS gespült und mit Gelvatol bedeckt. Die Lokalisierung wurde unter Verwenden eines Bio/Rad MCR-600 konfokalen Rastermikroskops bestimmt, das mit einem Fluoreszeinfilter versehen war. Konfokale optische Abschnitte wurden in 1 u Intervallen mit 10fachem Durchschnittnehmen pro Bild aufgezeichnet.
  • Ein CAS 200 Bildanalysator (Cell Analysis Systems), ein auf einem Mikroskop basierendes Zweifarbbildanalysesystem, wurde bei der mengenmäßigen Bestimmung des HER- 2/neu Proteins verwendet. Es wurden beide Festzustandsbildgebungskanäle des CAS 200 Bildanalysators verwendet. Digitalisierte Lichtintensitätswerte wurden in optische Dichte- Werte umgewandelt und zusammenaddiert, wobei das Ergebnis durch das Lambert-Beersche Absorptionsgesetz den Mengen gefärbter Zellbestandteile entsprach. Die beiden Bildgebungskanäle wurden spezifisch den beiden Komponenten der verwendeten Färbemittel angepaßt. Ein Kanal wurde für die mengenmäßige Bestimmung der gesamten DNA der Zellen in dem Bereich im Anschluß an Feulgenfärben mit einem DNA Färbekit verwendet, und der andere für die mengenmäßige Bestimmung des gesamten HER-2/neu Proteins der Zellen in dem Bereich im Anschluß an Immunfärben.
  • Eine separate Herstellung von Zellen aus der gleichen Kultur (der zweite Teil) wurde nur in Bezug auf DNA gefärbt. Ein Humanoperator identifizierte einzelne Zellen gegenüber dem Apparat, und es wurden die optischen Dichten der Pixels, die mit jeder Zelle verbunden waren, summiert. Aufsummierte optische Dichten für jede Zelle wie auch eine Zählung der Zahl der Zellen wurden hergestellt. Dieses lieferte die gesamte DNA Menge pro Zelle für die Kultur.
  • Weil die gesamte DNA Menge pro Zelle aus dieser zweiten Probe bekannt war, konnte der Durchschnitt von gesamtem HER-2/neu Protein pro Zelle aus den Daten der ersten Probe mit dem Computer berechnet werden, welche sowohl für DNA wie auch für HER-2/neu gefärbt worden waren. Spärlich wachsende AU-565 Zellen wurden zum Kalibrieren des HER-2/neu Proteingehalts verwendet. Das Färbeniveau in derartigen Zellen wurde als 100% definiert. Eine vollständige Beschreibung dieser mengenmäßigen Bestimmung ist in Bacus et al., Arch. Pathol. Lab. Med., 114: 164-169 (1990) verfügbar. Die Zellzahlen wurden durch Hämozytometerkammerzählen bestimmt, und die Lebensfähigkeit wurde durch Trypan Blau Farbstoffausschluß angezeigt.
  • Gemäß dem zuvor beschriebenen Behandlungs- und Analyseverfahren wurde festgestellt, daß der N29 Antikörper der beste Differenzierungsinducer ist. Vier Tage lang Behandlung von AU-565 Zellen mit 10 ug/ml N29 Anti körper verdoppelte den Anteil der Zellen mit flacher Morphologie und erhöhte den Kernbereich der Zellen im Durchschnitt auf 154 um² über den Kontrollzellkernbereich von 100 um². Der Anteil von morphologisch reifen AU-565 Zellen erhöhte sich von 10-20% in den unbehandelten Zellen auf mehr als 90% in den mit N29 Antikörper behandelten Zellen. Fraktion der mit N29 Antikörper behandelten 565 Zellen, welche Lipidtropfen enthielten, betrug 55% im Vergleich zu 12% in der nicht behandelten Kontrolle. Die Fraktion von N29-behandelten AU-565 Zellen, welche positiv im Hinblick auf das Vorhandensein von Casein nach vier Tagen färben, betrug mehr als 90% im Vergleich zu 20% für die unbehandelte Kontrolle. Die Population von N29 behandelten AU-565 Zellen betrug 4,8 · 10&sup4; unbehandelte Zellen.
  • Inkubation von AU-565 Zellen mit N29 Antikörper führte zu einer Verringerung an Membranfärben für HER-2/neu, welches von diffuser cytoplasmatischer Lokalisierung des Proteins begleitet war. Mengenmäßige Bestimmung des Färbens zeigte, daß die Wiederverteilung einen vorübergehenden Anstieg an gesamtem zellulären HER2/neu Gehalt einschloß, Konfokale Mikroskopbilder bestätigten die immunhistochemischen Färbeergebnisse.
  • Das Protein wanderte von der Membran und lokalisierte sich in dem Cytoplasma und insbesondere dem Perinucleus bei Behandlung mit N29 Antikörper.
  • Behandlung von MDA-MB 453 Zellen mit N29 Antikörper (Daten nicht dargestellt) lockte eine bemerkenswerte Wachstumsinhibierung von 60% hervor und eine Zunahme an Zellen, die positiv in Bezug auf Differenzierungsmarker sind: 90% der behandelten Zellen färbten positiv in Bezug auf Lipidtropfen, und 70% der behandelten Zellen färbten positiv in Bezug auf Casein. Behandlung von MCF-7 Zellen mit N29 Antikörper erhöhte die Fraktion, die Lipidtropfen und Casein enthielt, auf etwa 90% im Vergleich zu 2% in dem nicht behandelten Kontrollteil. N29 hatte nur eine geringe Wachstumsinhibierungswirkung auf MCF-7 Zellen.
    • BEISPIEL IV
  • Zellen der AU-565 Zelllinie wurden mit 1 ug/ml, 3 ug/ml und 10 ug/ml der N12, N24, N28 oder N29 Antikörper für eine Dauer von vier Tagen behandelt, wie in Beispiel III beschrieben. Ein nicht verwandtes IgG (10 ug/ml) wurde als eine Kontrolle verwendet. Färben in Bezug auf Lipidtropfen und HER-2/neu wie auch mengenmäßige Bestimmung des HER- 2/neu durch optische Dichte-Werte, Kernbereich (um' 2) und Bestimmung der Lokalisierung des Proteins wurden auch wie in Beispiel III durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt.
  • Wiederum zeigte der N29 Antikörper die beste Wirksamkeit beim Induzieren der Differenzierung. Die N29 Antikörperpräparation zeigte eine dosisabhängige, Differenzierung induzierende Wirkung bei so geringen Konzentrationen wie 1 ug/ml. Wiederum wurden spärlich wachsende AU-565 Zellen zum Kalibrieren des HER-2/neu Niveaus in den Zellen verwendet. Das Färbeniveau in diesen Zellen wurde als 100% definiert. TABELLE III
    • BEISPIEL V
  • Die menschliche Brustkrebszelllinie AU-565 wurde wie in Beispiel III oben kultiviert und mit dem breit verfügbaren TA-1 monoklonalen Antikörper inkubiert. Inkubation mit dem TA-1 monoklonalen Antikörper wurde 24 Stunden nach Zellanimpfung initiiert. 15%-20% der Zellen in den Kontrollkulturen zeigten einen reifen Phänotyp, gekennzeichnet durch große, bortenartige Kerne und ein verbreitetes Cytoplasma, welches ziemlich große Lipidtröpfchen enthielt. 2 tägige Inkubation von AU-565 Zellen mit 1 ug/ml TA-1 führte zu einem dreidimensionalen Muster von Zellwachstum mit einer erhöhten Fraktion von Zellen mit reifem Phänotyp. Am vierten Tag verringerte sich die Anzahl von Zellen in dem behandelten Teil um 60% relativ zu der Kontrolle, und die Fraktion von reifen Zellen erhöhte sich von dem Bereich von 15-20% auf den Bereich von 50%- 60%.
  • Immunhistochemisches Färben für Lipidtropfen und Kernbereich (u²) wurden wie in Beispiel III durchgeführt. Zellzahlen wurden mithilfe von Hämozytometerkammerzählen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt. TABELLE IV
    • BEISPIEL VI
  • Es ist gezeigt worden, daß ein 30 kD Faktor, gp30, ausgeschieden aus menschlichen MDA-MB-231 Brustkrebszellen, ein Ligand für das HER-2/neu Produkt, ein 185 kD Transmembranrezeptor (auch bekannt als p185HER-2/neu) ist, das durch das HER-2/neu Onkogen kodiert wird.
  • Kurz gesagt, gp30 kann aus den konditionierten Medien von MDA-MB-231 Zellen mittels Niedrigaffinitätschromatographie auf einer Heparin-Sepharose-Säule isoliert werden. Fraktionen, die aktives gp30 enthalten, können durch die Fähigkeit des gp30, EGFR auf den Zellmembranen von A431 Zellen oder MCF-7 Zellen zu binden, nachgewiesen werden. Fraktionen, die gp30 Aktivität enthalten, welche nach Heparin-Sepharose Chromatographie erhalten sind, können dann durch Phasenumkehrchromatographie auf einer Bondapak C3 Säule, die mit 0,05% Trifluoressigsäure äquilibriert ist, chromatographiert und mit einem Stufengradienten von Acetonitril eluiert werden und anschließend in einer zweiten Runde von Umkehrphasenchromatographie auf der Bondapak C&sub3; Säule (die mit 0,05% Trifluoressigsäure äquilibriert ist) erneut chromatographiert werden, wobei Elution mit einem engen Gradienten von Acetonitril durchgeführt wird.
  • Das in Beispiel VI verwendete gp30 wurde in PBS gelöst und filtriert. Die Proteinkonzentration der Ligandenlösung wurde nach der Filtrationsstufe bestätigt.
  • Maligne Brustzellen von jeder der drei Zelllinien AU-565, MDA-MB 453 und MCF-7 wurden, wie in Beispiel III beschrieben, gesät und kultiviert. Die Kulturmedien wurden mit 0,0, 0,3 oder 6,0 ng/ml gp30 anstelle der monoklonalen Antikörperpräparationen ergänzt. Die Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins von Lipidtropfen. Kernbereich (um²) und Zellzahl wurden alle wie in Beispiel III beschrieben durchgeführt.
  • Behandlung von AU-565 Zellen mit verschiedenen Dosierungen von gp30 inhibierten Zellwachstum in einer dosisabhängigen Weise in dem Nanogramm-Bereich. Viertägige Behandlung von AU-565 Zellen mit 6 ng/ml führte zu etwa 40% Wachstumsinhibierung. Viertägige Behandlung von MDA-MB 453 Zellen mit 6 ng/ml des Liganden gp30 führte zu 42% Wachstumsinhibierung im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle. Ähnliche Behandlung von MCF-7 Zellen führte zu keiner Inhibierung des Wachstums. Diese Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt. TABELLE V
  • Zur Behandlungszeit erhöhten etwa 7% AU-565 Zellen, 10% MDA-MB 453 Zellen und weniger als 1% MCF-7 Zellen vier Tage lang mit 6 ng/ml gp30 die Fraktion von Zellen mit Lipidtropfen auf 76%, wohingegen 15% der Kontrollzellen Lipidtropfen hatten. Im Hinblick auf MDA-MB 453 Zellen erhöhte viertägige Behandlung mit 6 ng/ml gp30 den Prozentsatz an Zellen, die Lipidtropfen zeigen, auf 84%, wohingegen 20% der Kontrollzellen Lipidtropfen zeigten. Ähnliche Behandlung von MCF-7 Zellen (welche kein HER-2/neu exprimieren) führte dazu, daß höchstens etwa 5% der Zellen Lipidtropfen zeigten, wohingegen weniger als 1% der Kontroll-MCF-7-Zellen (0,0 ng/ml gp30) Lipidtropfen zeigten.
  • AU-565-Zellen wurden auch mit gp30 bei geringeren Konzentrationen als 1 ng/ml behandelt. Überraschenderweise führte Behandlung dieser Zellen mit einer sehr geringen Dosis von gp30, weniger als 1 ng/ml, zur Stimulierung des Zellwachstums, wie in Fig. 7 gesehen werden kann. Diese Daten sind in Tabelle VI dargestellt. TABELLE VI
  • Zellen, die nicht mit gp30 behandelt waren, erzielten nach sechs Tagen eine Zelldicht von annähernd 8 · 10&sup4;/cm². Die Ergebnisse zeigen, daß eine maximale Wachstumsstimulierung bei einer Ligandenkonzentration von etwa 0,03 ng/ml für gp30 auftritt, wohingegen eine Zelldichte von etwa 1,93 · 10&sup5;/cm² erzielt wird. Somit scheinen sehr geringe Konzentrationen von gp30 malignes Zellwachstum in Zellen, welche HER-2/neu überexprimieren, zu agonisieren.
  • Im Hinblick auf das Induzieren von Zelldifferenzierung in malignen Zellen, welche HER-2/neu exprimieren oder überexprimieren, zeigten mehr als 90% der sechs Tage lang mit 6 ng/ml behandelten AU-565 Zellen reife Morphologie. Sechs Tage lang Behandlung von AU-565 Zellen mit 6 ng/ml gp30 erhöhte die Fraktion von Zellen mit identischen Behandlungsbedingungen, wobei der Prozentsatz an Zellen, die positiv in Bezug auf Casein färbten, sich auf 90% erhöhte (Kontrolle = 30%).
  • Unähnlich zu AU-565 zeigten mit 6 ng/ml gp30 behandelte MCF-7 Zellen (welche nicht HER-2/neu exprimieren) keine bemerkenswerten morphologischen Unterschiede im Vergleich zu unbehandelten Zellen.
  • Was die Induktion von Terminaldifferenzierung durch monoklonale Antikörper, die spezifisch für die extrazelluläre Domäne des HER-2/neu Proteins sind, anbelangt, führte Induktion von Terminaldifferenzierung durch gp30 zur Translokation des HER-2/neu Proteins von der Membran zu dem Cytoplasma und perinuklearen Bereich der Zelle.
  • Während vier Tagen in Kultur reagierte die Zelloberfläche von 80-90% der unbehandelten AU-565 Zellen mit dem Antikörper zu dem NER-2/neu Protein, wie durch Immunfärben gezeigt, beschrieben in den vorhergehenden Beispielen. Die verbleibenden Zellen, welche die Morphologie von reifen Zellen hatten, zeigten reduziertes Membranfärben und diffuses Cytoplasmafärben. Behandlung von AU-565 Zellen mit Konzentrationen von gp30. welche Wachstum inhibierten und Differenzierungsmarker induzierten (über 1 ng/ml) verursachten eine zeitabhängige Abnahme in Membranfärben und einen vorübergehenden Anstieg an dem gesamten zellulären HER-2/neu Färben und cytoplasmatischem Färben, wie in Fig. 8 gesehen werden kann. Das diffuse Immunfärben erhöhte sich zwei- bis dreifach während der anfänglichen zweitägigen Behandlung und verringerte sich in den folgenden zwei Tagen.
  • Jedoch änderte Behandlung von AU-565 Zellen mit 0,03-1 ng/ml gp30 nicht das Immunfärbemuster von HER-2/neu, welches hauptsächlich membranartig verblieb.
  • Das Immunfärben für HER-2/neu in MDA-MB 453 Zellen war weniger intensiv, jedoch waren das Muster und die Kinetiken des Färbens nach einer ähnlichen Behandlung ähnlich zu den bei AU-565 beobachteten.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß Behandlung von Brustkrebszellen mit gp30 in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration entweder Brustkrebszellwachstum inhibierte oder beschleunigte. Ligandenkonzentrationen, welche zur Zellwachstumsinhibierung führten, induzierten zelluläre Reaktionen, die zur Zelldifferenzierung und Erwerb des reifen Phänotyps führten, welches mit Translokation des HER-2/neu Proteins von der Membran zu dem perinuklearen Bereich verbunden war.
    • BEISPIEL VI
  • Zwei menschliche Brustkrebszelllinien, AU-565 und MCF-7, wurden mit den Chemikalien Mykophenolsäure (MPA), Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) oder Retinsäure (RA) behandelt, welche bekannt sind, Reifung bei niedrigen Konzentrationen in einer Vielzahl von menschlichen Zelltypen zu induzieren. Die Zellen wurden wie in Beispiel III kultiviert. Die Zellen wurden in vier Kammerobjektträger (Nunc) zu 0,5 · 10&sup4; oder 2 · 10&sup5; Zellen in 1 ml Medium pro Kammer oder in 100 mm Petrischalen zu 5 · 10&sup4; Zellen in 10 ml Medium geimpft.
  • PMA und RA wurden in Dimethylsulfoxid gelöst und bei -70ºC gelagert. MPA wurde in 150 mM NaHCO&sub3; gelöst. Behandlung mit MPA, PMA oder RA wurde 48 Stunden nach Zellanimpfung initiiert. Dünne Kulturen der zwei Zelllinien wurden vier Tage lang mit 9 uM MPA, 1,6 nM PMA oder 2,5 uM RA behandelt.
  • Es wurden drei Messungen der Zelldifferenzierung verwendet. Diese umfassen Zellzahl, Kernbereich (um²) und Prozentsatz von Zellen, die Lipidtropfen exprimieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII dargestellt. TABELLE VII
  • Zellvermehrung wurde bestimmt, indem Zellen in einer Hämozytometerkammer gemessen wurden. Die Zellzählung wurde vier Tage lang angezeigt.
  • Qualitatives morphologisches Aussehen charakterisierte auch Differenzierung. Die Analyse der Zellmorphologie in Kontrollkulturen zeigte an, daß 70-80% der unbehandelten, kaum wachsenden AU-565 Zellen die Morphologie von unreifen Zellen hatten, gekennzeichnet durch kompakte Kerne, die durch eine feine Schicht von Cytoplasma eingeschlossen waren. Weitere 10-20% zeigten eine Morphologie, die mit reifen Zellen verbunden war, mit großen und bortenartigen Kernen umgeben von einem ziemlich großen flachen Cytoplasma. Die Behandlung dieser Zelllinie mit MPA erhöhte die Fraktion von morphologischem Erscheinen.
  • Phänotypexpression als ein Marker von Terminalzelldifferenzierung wurde gemessen, indem die Produktion von Lipidtropfen und Casein nachgewiesen wurde, beide sind Komponenten der menschlichen Milch. Lipidtropfen wurden durch ein Öl Rot O in Propylenglykol (Oil Red O in propylene glycol) Modifizierungsverfahren, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, nachgewiesen.
  • Das Vorhandensein von Casein wurde durch histochemisches Färben mit einem menschlichen Antikörper zu Humancasein nachgewiesen.
  • Zur Behandlungszeit enthielten etwa 5% der Zellen in den dürftigen AU-565 Kulturen und weniger als 1% der Zellen in den MDF-7 Kulturen kleine Lipidtropfen. Behandlung von AU-565 Kulturen mit MPA oder PMA erhöhte die Fraktion von Zellen, die die Lipidtropfen enthielten, in einer zeitabhängigen Weise auf 60-70%. Behandlung mit RA erhöhte diese Fraktion auf mehr als 90%. Darüber hinaus wurden die Lipidtropfen in den behandelten Zellen sichtbar größer um mehr als das Fünffache als diejenigen, die in unbehandelten Zellen beobachtet wurden.
  • Unähnlich zu den AU-565 Zellen zeigten die mit MPA, PMA oder RA behandelten MCF-7 Kulturen nur einen geringen Anstieg in der Fraktion von Zellen, die die großen Lipidtropfen enthielten: bis zu etwa 5% der Zellen in mit MPA oder PMA behandelten Kulturen hatten wenig oder keinen Anstieg über Kontrollen in mit RA behandelten Kulturen.
  • Vier Tage, nachdem Behandlung der zwei Zelllinien begonnen war, enthielten die Kontrollkulturen weniger als 2% der Zellen, die positiv mit dem Anti-Casein-Antikörper reagierten. Behandlung von AU-565 Kulturen mit entweder MPA oder RA erhöhte dieses auf 70 bis 80% und Behandlung mit PMA auf etwa 90%. Behandlung der MCF-7 Kulturen mit MPA oder RA erhöhte auch den Prozentsatz an Zellen, die positiv in Bezug auf Casein färbten. PMA hatte selbst bei hohen Dosierungen wenig oder keine Wirkung auf die MCF-7 Zellfraktionen, die positiv in Bezug auf dieses Protein färbten.
  • Das HER-2/neu Protein wurde mithilfe spezifischer Antikörper, wie in Beispiel III beschrieben, nachgewiesen, und Translokation und mengenmäßige Bestimmung wurden, wie auch in Beispiel III beschrieben, durchgeführt.
  • Während vier Tagen in Kultur reagierte die Zelloberflächenmembran von 80-90% von unbehandelten AU-565 Zellen mit den zwei Antikörpern. Die verbleibenden Zellen, welche die Morphologie von reifen Zellen hatten, zeigten vermindertes Membranfärben aber erhöhtes diffuses zytoplasmatisches Färben. Behandlung von AU-565 Zellen mit MPA, PMA oder RA erzeugte eine zeitabhängige Verringerung in der Zelloberflächenmembrankonzentration von HER-2/neu und einen zwei- bis dreifachen Anstieg an cytoplasmatischer Konzentration des Proteins. Das Immunfärben in den unbehandelten MCF-7 Zellen betrug etwa ein Zehntel desjenigen in unbehandelten AU-565 Zellen. Jedoch waren das Muster und die Kinetiken des Immunfärbens nach Behandlung mit MPA oder RA ähnlich zu denjenigen, die für AU-565 Zellen beobachtet wurden. PMA, welches nicht Differenzierungsmarker in den MCF-7 Zellen induzierte, verursachte keine Änderung in dem Muster des Immunfärbens mit diesen Antikörpern.
    • BEISPIEL VII
  • Die biologischen Wirkungen von NDF, bestimmt auf AU-565 Zellen in einer ähnlichen Weise zu derjenigen, die zuvor in Beispiel VI für gp30 beschrieben war. Kurz gesagt. AU- 565 Zellen (0,4 · 10&sup4;) wurden in Kulturschalen in 1 ml Medium, welches mit 10% Serum ergänzt war, geimpft. Vierundzwanzig Stunden später wurde NDF bei den angegebenen Konzentrationen hinzugegeben, und die Zellen wurden nach vier zusätzlichen Tagen analysiert. Zellzahlen wurden bestimmt, und der Kernbereich wurde durch ein Bildgebungssystem nach DNA Färben mit Feulgen geschätzt. Die angegebenen Zahlen sind die berechneten Durchschnitte von zehn Mikroskopfeldern (40 · Verstärkung). Die Ergebnisse sind in Fig. 9A gezeigt.
  • AU-565 Zellen wurden, wie zuvor angegeben, behandelt und anschließend in Bezug auf Casein und Lipid, wie zuvor beschrieben, gefärbt. Die positiv in Bezug auf Lipide (geschlossene Kreise) und Casein (offene Kreise) gefärbten Durchschnittsfraktionen von Zellen wurden durch Zählen von gefärbten Zellen in zehn Mikroskopfeldern (40 · Verstärkung) bestimmt. Die Variation unter den Feldern überstieg nicht 15%. Die Ergebnisse sind in Fig. 9B dargestellt.
  • MDS-MB 453 (10&sup5;) Zellen wurden in Kulturschalen mit Mehrfachvertiefung geimpft, und nach 24 Stunden wurde ihr Medium durch serumfreies Medium ersetzt. Dieses wurde mit 5 ng/ml EGF (Quadrate) von 5 ng/ml NDF (Kreise) ergänzt. Kontrollkulturen (Dreiecke) erhielten keinen Wachstumsfaktor. Die Schalen wurden dann bei 37ºC inkubiert, und an den angegebenen Tagen wurden die Zellzahlen in Duplikatkulturen bestimmt. Die Durchschnitte und ihre Bereiche (vertikale Balken) sind in Fig. 9C dargestellt.
    • BEISPIEL VIII
  • Zusätzlich zu der Expression von HER-2/neu Protein in Krebszellen korreliert die Expression von ICAM-1 auch mit der induzierten Differenzierung bei Behandlung. Kurz gesagt. AU-565 Zellen wurden mit NDF, N29 oder N28 bei einer Konzentration von 10 ug/ml in einer Weise behandelt, die ähnlich zu derjenigen in Beispiel III beschriebenen ist. Ein monoklonaler Antikörper gegen ICAM-1 (Becton Dickinson Immunzytometrie Systeme. San Jose, CA) wurde auf behandelte Zellen aufgebracht. Expression von ICAM-1, HER-2/neu, Zellzahl, Prozent an Zellen gefärbt in Bezug auf Lipidtropfen und Kernbereich (um²) wurden mithilfe von in Beispiel III beschriebenen Verfahren bestimmt. Einheiten für ICAM-1 und HER-2/neu Expression sind willkürlich, wobei "1" den Wert der Expression in Kontrollzellen, wie mittels Bildzytometrie gemessen, darstellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII gezeigt. TABELLE VIII
  • Somit liefern die Verfahren der vorliegenden Erfindung ein mächtiges prognostisches Mittel zum Vorhersagen der Wirksamkeit einer Krebstherapie unter Verwenden von monoklonalen Antikörpern oder Liganden, welche Differenzierung von Krebszellen induzieren. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sorgen auch für das Screenen von vermeintlichen Antikrebsmitteln für die Bestimmung der Wirksamkeit des Mittels bei der Behandlung eines malignen Wachstums. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung identifizierte monoklonale Anti körper und Liganden induzieren die Expression des reifen Phänotyps und der Terminalzelldifferenzierung, wodurch das Wachstum einer bösartigen Entartung inhibiert wird. Zusätzlich sorgen die Verfahren der Erfindung für die Bestimmung von günstigen Dosierungen von und/oder verbesserten Kombinationen derartiger therapeutischer Mittel. Letztendlich werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung leicht durchgeführt und sind deshalb Zeit- und kostenwirksam wie auch minimal traumatisch gegenüber einem Krebspatienten.
  • Während die Erfindung mit etwas Spezifität beschrieben worden ist, können Modifikationen, die für die Fachleute offensichtlich sind, durchgeführt werden.

Claims (16)

1. Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit eines therapeutischen Mittels für die Behandlung eines Krebses in vitro, wobei maligne Zellen des Krebses ein Onkogenprodukt auf der extrazellulären Domäne der Zellen exprimieren oder überexprimieren, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt:
(a) Erhalten von lebensfähigen malignen Zellen, welche mindestens ein Onkogenprodukt auf der extrazellulären Domäne der Zellen exprimieren oder überexprimieren, und Teilen dieser in mindestens erste und zweite Teile;
(b) Behandeln des ersten Teils, welcher lebensfähige maligne Zellen umfaßt, mit einer ausreichenden Menge des Mittels, welches mindestens eine Verbindung mit spezifischer Bindungsaffinität in bezug auf das Onkogenprodukt umfaßt, und in Berührung bringen des zweiten Teils mit einer Zusammensetzung, der es an der Verbindung oder Verbindungen mit spezifischer Bindungsaffinität für das Onkogenprodukt fehlt;
(c) Inkubieren der ersten und zweiten Teile in einem physiologisch verträglichen Medium für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, einen Prozentsatz der lebensfähigen malignen Zellen des ersten Teils zu induzieren, terminal zu differenzieren; und
(d) Vergleichen des Prozentsatzes von Zellen in dem ersten Teil, welche Beweis der Terminaldifferenzierung zeigen, mit dem Prozentsatz an Zellen in dem zweiten Teil, welche morphologischen Beweis von Terminaldifferenzierung zeigen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die lebensfähigen malignen Zellen von einem Patienten erhalten werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zellen von einer Gewebebiopsie erhalten werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Onkogenprodukt HER-2/neu Protein ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Mittel mindestens einen monoklonalen Antikörper umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Mittel mindestens einen Liganden umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Beweis von Terminaldifferenzierung durch Translokation des Onkogenprodukts von der Oberfläche einer Zelle zu dem Cytoplasma der Zelle gemessen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Beweis von Terminaldifferenzierung durch Änderungen in der Expression eines oder mehrerer Zelladhäsionsmoleküle gemessen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei Translokation immunhistochemisch mit einem oder mehreren markierten Antikörpern für das Onkogenprodukt bestimmt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei morphologischer Beweis von Terminaldifferenzierung durch Änderungen im Kernbereich gemessen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Zelladhäsionsmolekül ICAM-1 ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Krebs Brustkrebs ist, und Terminaldifferenzierung durch Herstellung einer oder mehrerer Milchkomponenten gemessen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Milchkomponente Lipidtröpfchen ist.
14. Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit eines therapeutischen Mittels für Behandlung eines Krebses in vitro, wobei maligne Zellen des Krebses HER-2/neu Produkt auf der extrazellulären Domäne der Zellen exprimieren oder überexprimieren, wobei das Verfahren die Stufe umfaßt:
(a) Erhalten von lebensfähigen malignen Zellen, welche HER-2/neu Produkt in der extrazellulären Domäne der Zellen überexprimieren, aus einer Brust-, Magen-, Eierstock- oder Salivagewebebiopsie und Teilen dieser in mindestens erste und zweite Teile;
(b) Behandeln des ersten Teils, der lebensfähige maligne Zellen umfaßt, mit einer ausreichenden Menge des Mittels, welches mindestens eine Verbindung mit spezifischer Bindungsaffinität in Bezug auf HER-2/neu Produkt umfaßt, und in Berührung bringen des zweiten Teils mit einer Zusammensetzung, der es an der Verbindung oder Verbindungen mit spezifischer Bindungsaffinität für HER-2/neu Produkt mangelt;
(c) Inkubieren der ersten und zweiten Teile in einem physiologisch verträglichen Medium für eine Zeitmenge, die ausreichend ist, einen Prozentsatz der lebensfähigen malignen Zellen des ersten Teils zu induzieren, terminal zu differenzieren; und
(d) Vergleichen des Prozentsatzes von Zellen in dem ersten Teil, welche Translokation von HER-2/neu Produkt zeigen, mit dem Prozentsatz von Zellen in dem zweiten Teil, welche Translokation von HER-2/neu Produkt zeigen.
15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 14, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe von durch die Hybridome, die als I-1260, I-1261, I-1262 und I-1263 hinterlegt sind, hergestellten monoklonalen Antikörpern.
16. Verfahren nach Anspruch 1 oder 14, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gp30 und neu Differenzierungsfaktor.
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