DE69518406T2

DE69518406T2 - Monoklonale antikörper gegen den tie-rezeptor und deren verwendung

Info

Publication number: DE69518406T2
Application number: DE69518406T
Authority: DE
Inventors: Kari Alitalo; Paeivi Karnani; Marja-Terttu Matikainen
Original assignee: MATIKAINEN MARJA TERTTU
Current assignee: Licentia Oy
Priority date: 1994-03-29
Filing date: 1995-03-29
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2015-03-30
Also published as: EP0753015B1; CA2185043C; NO319586B1; MX9604391A; AU2139295A; ATE195533T1; US5955291A; JP3683270B2; WO1995026364A1; CA2185043A1; NZ283366A; JPH09511141A; DE69518406D1; DK0753015T3; NO964013L; AU697185B2; NO964013D0; EP0753015A1; ES2151595T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen spezifischen Antikörper, der mit Tie reagiert, einem Tyrosinkinase-Rezeptor, der in verschiedenen Endothelzellen und in bestimmten Tumorzellpopulationen gefunden wird. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung dieses Antikörpers und Verfahren für seine Verwendung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen gegen Tie gerichteten monoclonalen Antikörper als diagnostisches Mittel zum Nachweis bestimmter hämatopoetischer Zellen und hämatologischer und mit Angiogenese im Zusammenhang stehender Zustände, als Mittel zum Abbilden von Blutgefäßen und als Therapeutikum.
In westlichen Ländern kommen Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs sehr häufig vor und diese Krankheitsgruppen sind ökonomisch sehr wichtig, da davon betroffene Patienten typischerweise der Arbeit fernbleiben und über längere Zeiträume behandelt werden müssen. Sowohl bei der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen als auch der Krebs-Pathogenese spielen Blutgefäße eine wichtige Rolle. Eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von Gefäßkrankheiten spielen Endothelzellen, die die Innenwände von Blutgefäßen auskleiden. Traumata und Stoffwechselstörungen in Endothelzellen verursachen sogenannte Atherom-Plaques und ferner Arteriosklerose. Eine Gefäßneubildung, die durch die Tumorzellen über Wachstumsfaktorenstimulierende Endothelzellen induziert wird, stellt bei verschiedenen Carcinomen ein wichtiges Ereignis dar. Aus experimentellen Untersuchungen ist bekannt, daß zur Entwicklung und zum Wachstum von Krebszell-Kolonien eine Gefäßneubildung erforderlich ist, um den Transport von Nährstoffen und Sauerstoff in das wachsende Gewebe zu sichern.
Die zellulären Eigenschaften, die für die Entwicklung, Erhaltung und Regeneration differenzierter Zellen und Gewebe verantwortlich sind, werden zum großen Teil durch interzelluläre Signale reguliert, die über Wachstumsfaktoren und ähnliche Liganden und deren Rezeptoren vermittelt werden. Die Rezeptoren befinden sich auf der Oberfläche reagierender Zellen und binden sowohl Peptid- oder Polypeptid-Wachstumsfaktoren als auch andere Hormonähnliche Liganden. Infolge dieser Wechselwirkung erfolgen in den reagierenden Zellen schnelle biochemische Veränderungen, die sowohl zu einer schnellen als auch zu einer langfristigen Neuregulation der zellulären Genexpression führen. Mehrere Rezeptoren, die mit verschiedenen Zelloberflächen assoziiert sind, können spezifische Wachstumsfaktoren binden.
Die Tyrosin-Phosphorylierung ist einer der Schlüsselmechanismen der durch die Plasmamembran hindurch erfolgenden Signalübertragung. Mehrere derzeit bekannte Gene für Protein-Tyrosinkinasen codieren Transmembran- Rezeptoren für Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Hormone, wie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Insulin, den Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF-1), von Blutplättchen stammende Wachstumsfaktoren (PDGF-AA, AB und BB) und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs). Vgl. beispielsweise Heldin und Westermark, Cell Reg., 1 (1990), 555-556; Ullrich und Schlessinger, Cell, 61 (1990), 2243-354. Aufgrund der möglichen Beteiligung von Wachstumsfaktoren, wie FGFs, an mehreren wichtigen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie Angiogenese, Arteriosklerose und Entzündungskrankheiten, sind Wachstumsfaktor-Rezeptoren von Endothelzellen von besonderem Interesse (Folkman und Klagsbrun, Science, 235 (1987), 442-447). Auch die Rezeptoren mehrerer Wachstumsfaktoren des Blutbildungssystems sind Tyrosinkinasen. Dazu gehören der Rezeptor des koloniestimulierenden Faktors 1 (Sherr et al., Cell, 41 (1985), 665-676) und c-kit, der Rezeptor des Stammzellenfaktors (Huang et al., Cell, 63 (1990), 225-233).
Auf der Basis struktureller Ähnlichkeiten und Unterschiede können die Rezeptor-Tyrosinkinasen in evolutionäre Unterfamilien eingeteilt werden. Diese Proteine unterscheiden sich in ihrer Spezifität und Affinität (Ullrich und Schlessinger, vorstehend). Im allgemeinen handelt es sich bei Rezeptor- Tyrosinkinasen um Glycoproteine, bestehend aus einer extrazellulären Domäne, die den Wachstumsfaktor binden kann, einer Transmembran-Domäne, die normalerweise ein alpha-helikaler Teil des Proteins ist, einer Juxtamembran- Domäne, wo der Rezeptor beispielsweise mittels Proteinphosphorylierung reguliert werden kann, einer Tyrosinkinase-Domäne, die der enzymatische Rezeptor-Bestandteil ist, und einem Carboxy-terminalen Schwanz, der bei vielen Rezeptoren an der Erkennung und Bindung von deren spezifischen Substraten beteiligt ist.
In der Internationalen Patentveröffentlichung WO 93/14124 ist vor kurzem eine als Tie bezeichnete neuartige Endothelzell-Rezeptor-Tyrosinkinase beschrieben worden. Tie ist ein Akronym, das Tyrosinkinase enthaltende Immunglobulin- und EGF-artige Domänen bedeutet. Es ist anzunehmen, daß sich Tie zur Diagnose und Behandlung bestimmter Krankheiten eignet, an denen Endothelzellen und damit assoziierte Tie-Rezeptoren beteiligt sind, wie neoplastische Krankheiten, wozu Tumorangiogenese, Wundheilung, thromboembolische Krankheiten, Atherosklerose und Entzündungskrankheiten gehören.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jetzt monoclonale Antikörper hergestellt, die gegen den extrazellulären Teil der Endothelzell- Rezeptor-Tyrosinkinase Tie gerichtet sind. Diese monoclonalen Antikörper sind zum Nachweis von Tie in Zellkulturen mittels immunhistologischer Tests in vivo verwendet worden. Die Ergebnisse zeigen, daß Antikörper, die die extrazellulären Tie-Teile spezifisch erkennen, zur Kontrolle von hämatopoetischen Zellen und Endothelzellen in Gewebeproben und in einem Organismus und zur Diagnose verschiedener Typen krebsartiger Tumore verwendet werden können.
Fig. 1 stellt eine Analyse von MOLT-4- und HEL-Zellen bezüglich Tie mittels Immunfluoreszenz und Durchflußcytometrie dar.
Fig. 2 zeigt eine Immunperoxidase-Färbung von Tie in menschlichen Blutzellen.
Fig. 3 zeigt die biologische Verteilung des ¹²&sup5;I-markierten monoclonalen Antikörpers 3C4C7G6 in ausgewählten Zielgeweben in Mäusen, die eine 8 Tage alte Wunde aufweisen.
Fig. 4. Immunhistochemische Färbung von Tie in gesundem Gehirn, Glioblastoma multiforme und metastatischem Melanom. Maßstabsleiste: 0,05 mm.
Fig. 5. Immunhistochemische Färbungen eines Hämangioblastoms und eines Hämangiopericytoms mit Tie und vWF oder CD44 als Endothelzell-spezifische Marker. (40fache Vergrößerung).
Fig. 6. Verteilung des gegen Tie gerichteten Antikörpers 10F11 (% ID/g) in Hauptorganen nach 48 h, 72 h, 96 h und 120 h. (N = 3, 3, 3 bzw. 4).
Fig. 7. Verteilung des gegen Tie gerichteten Antikörpers 3c4 (% ID/g) in Hauptorganen nach 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h. (N = 3, 3, 7, 2 bzw. 2).
Fig. 8. Anreicherung von Radioaktivität nach 48 h, 96 h und 120 h mit dem Antikörper 10F11 und nach 6 h, 24 h, 48 h, 96 h und 120 h mit dem Antikörper 3c4.
Fig. 9. Standardkurve von vier verschiedenen Paaren von beschichtetem Antikörpermarkiertem Antikörper.
Fig. 10. Einzelkonzentrationen des Tie-Antigens (ug/l) in Serumproben von Patientinnen mit Brustkrebs (N = 2); Ovarialcarcinom (N = 5) und kleinzelligem Lungencarcinom (N = 6). Referenzproben (N = 20) stammen von Patienten ohne Carcinom.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung diagnostischer Verfahren zur Kontrolle von hämatopoetischen Zellen und Endothelzellen in Gewebeproben und in ganzen Organismen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von klinischen Nachweisverfahren, mit deren Hilfe sich der Zustand von Endothelzellen (Traumata, Wachstum, usw.) beschreiben läßt, und von Verfahren zum Nachweis von Endothelzellen und somit des Gefäßwachstums in einem Organismus. Die vorliegende Erfindung stellt einen Tie erkennenden Antikörper bereit, wobei dieser Antikörper gegen extrazelluläre Tie-Teile gerichtet ist.
Die Erfindung stellt insbesondere einen monoclonalen Antikörper bereit, der ein Epitop der extrazellulären Teile des Tie-Rezeptors spezifisch erkennt. Dieser monoclonale Antikörper wird als 3C4C7G6 bezeichnet. Die den monoclonalen Antikörper 3C4C7G6 produzierende Hybridom-Zellinie ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt (DSM- Hinterlegungsnummer ACC2159).
Der vorstehend erwähnte monoclonale Antikörper wird auch mit einem nachweisbaren Marker markiert bereitgestellt. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "nachweisbarer Marker" umfaßt beliebige dem Fachmann bekannte nachweisbare Marker. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der nachweisbare Marker jedoch aus der aus Radioisotopen, Fluorochromen, Farbstoffen, Enzymen und Biotin bestehenden Gruppe ausgewählt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind geeignete Radioisotope ¹²&sup5;I und ¹³¹I, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch den vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper bereit, der an ein abbildbares Mittel konjugiert ist. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "abbildbares Mittel" umfaßt Radioisotope, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Ein bevorzugtes Radioisotop ist 99m-Technetium.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung menschlicher Gewebe bereit, die eine Gefäßneubildung erfahren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Erhalt einer Probe eines Gewebes und/oder einer Körperflüssigkeit, von der vermutet wird, daß sie eine Gefäßneubildung erfährt, und
(b) Inkontaktbringen dieser Probe mit dem vorstehend erwähnten Tiespezifischen monoclonalen Antikörper unter Bedingungen, die zur Bildung eines Komplexes zwischen dem monoclonalen Antikörper und dem Antigen geeignet sind, und
(c) Nachweis des Vorliegens eines gebildeten Komplexes.
Ein Gewebe, das mit Hilfe dieses Verfahrens nachgewiesen werden kann, ist ein beliebiges gesundes Gewebe, präcanceröses Gewebe oder canceröses Gewebe eines festen Tumors mit Tie-enthaltenden Endothelzellen oder Leukämiezellen, die den Tie-Rezeptor exprimieren. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der monoclonale Antikörper mit einem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen nachweisbaren Marker markiert. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind zum Nachweis und zur Unterscheidung verschiedener Carcinom-Formen geeignet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Diagnose und Kontrolle von Erkrankungszuständen verschiedener Carcinome bereit, indem die Menge des Tie-Antigens bestimmt wird, das in menschlichem Serum zirkuliert, das von einem Patienten erhalten wurde, von dem man annimmt, daß er eine durch Endothelzell-Proliferation charakterisierte Krankheit aufweist.
Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper kann auch bei einem Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von Tie-Rezeptoren in einer Zellprobe verwendet werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Behandlung einer Zeliprobe mit dem erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper und Nachweis der Bindung des monoclonalen Antikörpers an Tie- Rezeptoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper zum Nachweis und zur Kontrolle bestimmter Typen von hämatopoetischen Zellen, insbesondere Zellen der B-Zell-Abstammungslinie, verwendet werden.
Die Behandlung eines Zellgemisches mit dem erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper kann in Lösung erfolgen, wie im Falle einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung, oder in festem Gewebe- Untersuchungsmaterial, wie Biopsiematerial, oder mit dem an einen festen Träger immobilisierten monoclonalen Antikörper, wie im Falle einer Säulen- Chromatographie oder einer direkten Immunadhäsion. Das Zellgemisch, das mit dem monoclonalen Antikörper behandelt werden soll, kann eine beliebige Lösung von Blutzellen oder Gewebezellen sein. Vorzugsweise stammt das Zellgemisch von gesunden Säugerzellen, Säuger-Knochenmark, zirkulierendem Blut oder tumor-verdächtigem Gewebe, bevorzugter von gesunden Zellen, Leukämiezellen und Zellen fester Tumore. Nach Behandlung des Zellgemisches mit dem monoclonalen Antikörper binden diejenigen Zellen mit Tie-Rezeptoren an den monoclonalen Antikörper, wobei ein Komplex zwischen Antikörper-Tie-Rezeptor gebildet wird. Das Vorliegen des Antikörper- Tie-Rezeptor-Komplexes und somit von Tie-Rezeptoren kann mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren nachgewiesen werden. Diese Verfahren umfassen ELISA-Verfahren, IRMA-Verfahren (ein Sandwich-Typ eines immunchemischen Tests), immunhistochemische Verfahren und RIA- Verfahren, wobei ein ¹²&sup5;I-Marker und Autoradiographie-Verfahren verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch den erfindungsgemäßen Antikörper zur Verwendung bei der Herstellung einer Zusammensetzung zum Abbilden des Vorliegens von Angiogenese bei Wundheilung, Entzündungen oder Tumoren bei Patienten bereit. Das Abbilden umfaßt die Verabreichung markierter Antikörper und den Nachweis mittels Abbilden an Stellen, an denen Endothelzellen an der Bildung neuer Gefäße beteiligt sind, oder den Nachweis von Leukämiezellen in Blut, Knochenmark oder Geweben.
Erfindungsgemäße humanisierte monoclonale Antikörper lassen sich bei der Behandlung neoplastischer Krankheiten, an denen Endothelzellen mit assoziierten Tie-Rezeptoren beteiligt sind, verwenden, indem Patienten, die von solchen Krankheiten betroffen sind, eine therapeutisch wirksame Menge eines anti-neoplastischen Therapeutikums verabreicht wird, das an einen solchen monoclonalen Antikörper konjugiert ist. Eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums ist eine beliebige Menge einer Verbindung, die eine Hemmung des Tumorwachstums, vorzugsweise das Absterben der neoplastischen Zellen und eine Verringerung der Gesamtzahl neoplastischer Zellen in einem Organismus bewirkt. Beispiele für solche Therapeutika sind Antikörper, die mit dem Radioisotop 90Y oder mit Toxin-Konjugaten, wie Ricin und verschiedenen mikrobiellen Toxinen, verknüpft sind.
Die Konjugation des Leukämie-Therapeutikums an den monoclonalen Antikörper kann unter Verwendung bekannter Verfahren, beispielsweise den von Press et al., J. Clin. Oncol., 7 (1989), 1027-1038, beschriebenen, erreicht werden. Vorzugsweise befindet sich die Konjugationsstelle auf dem monoclonalen Antikörper an einer anderen Position als die Bindungsstelle des monoclonalen Antikörpers für den Tie-Rezeptor. Vorzugsweise befindet sich die Konjugationsstelle auf dem Therapeutikum an einer funktionellen Gruppe, die sich von der der aktiven Stelle des Therapeutikums unterscheidet. Bevorzugter ist die Konjugationsstelle auch so gelegen, daß Konformationsänderungen des monoclonalen Antikörpers oder des Therapeutikums so gering wie möglich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Therapeutikums, das an ein Bindungsfragment des erfindungsgemäßen Antikörpers konjugiert ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung neoplastischer Krankheiten, wobei die Behandlung die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Therapeutikums umfaßt, das an das Bindungsfragment eines erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers konjugiert ist. Geeignete Bindungsfragmente sind solche Fragmente, die eine ausreichende Größe und Struktur beibehalten haben, die eine Bindung des Fragments an den Tie-Rezeptor erlauben. Solche Fragmente können mit Hilfe zahlreicher auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren hergestellt werden. Die hergestellten Bindungsfragmente können unter Verwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Bindungstests auf die Fähigkeit zur Bindung an den Tie- Rezeptor untersucht werden.
Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Antikörpers umfaßt die Verabreichung einer geeigneten Menge eines Arzneimittels, das den monoclonalen Antikörper als Wirkstoff enthält. Neben dem Wirkstoff kann das Arzneimittel auch geeignete Puffer, Verdünnungsmittel und Zusatzstoffe umfassen. Geeignete Puffer sind Tris-HCl-, Acetat-, Glycin- und Phosphat- Puffer, vorzugsweise Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5. Geeignete Verdünnungsmittel sind sterile wäßrige Lösungen, die mit NaCl, Lactose oder Mannit, vorzugsweise NaCl, auf einen isotonen Druck eingestellt sind. Geeignete Zusatzstoffe sind Albumin oder Helartin, um eine Adsorption an Oberflächen zu verhindern, Detergentien (z. B. Tween 20TM, Tween 80TM), Solubilisierungsmittel (z. B. Glycerin, Polyethylenglykol), Antioxidationsmittel (z. B. Ascorbinsäure, Natriumbisulfit) und Konservierungsstoffe (z. B. THIMERSOLTM, Benzylalkohol, Parabene).
Die Verabreichung kann mittels eines beliebigen herkömmlichen Mittels erfolgen, wozu die intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung gehören. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist die intravenöse Verabreichung. Die Verabreichung kann in einer Gabe oder in einer geeigneten Zahl von mehreren Gaben erfolgen.
Vorzugsweise liegt das pharmazeutische Präparat als Einheitsdosierungsform vor. In einer solchen Form wird das Präparat in Einheitsdosen aufgeteilt, die geeignete Mengen des Wirkstoffs enthalten, z. B. eine wirksame Menge, um den gewünschten Zweck zu erreichen.
Die tatsächlich eingesetzte Dosierung kann je nach den Erfordernissen des Patienten und der Schwere des zu behandelnden Zustands geändert werden. Die Bestimmung der richtigen Dosierung für einen bestimmten Fall gehört zum allgemeinen Fachwissen. Im allgemeinen wird eine Behandlung mit kleineren Dosierungen eingeleitet, die unter der optimalen Dosis der Verbindung liegen. Danach wird die Dosierung in kleinen Schritten solange erhöht, bis die optimale Wirkung unter den gegebenen Umständen erzielt ist, wobei die Verabreichung je nach Wunsch im wesentlichen kontinuierlich oder portionsweise während des Tages erfolgt. Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung werden entsprechend der Beurteilung des behandelnden Arztes bestimmt, der sowohl solche Faktoren, wie Alter, Zustand und Größe des Patienten als auch die Schwere der zu behandelnden Krankheit in Betracht zieht.
Ein typisches, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung empfohlenes Dosierungsschema liegt bei etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg Wirkstoff pro Tag.
Die Entwicklung und Verwendung von Maus-mAbs als Therapeutika leidet unter der Tatsache, daß sich die Halbwertszeit aufgrund der Herausbildung einer gegen Maus-Antikörper gerichteten Immunreaktion des Menschen (HAMA) verringert. Die Wirksamkeit der monoclonalen Maus-Antikörper in Patienten ist daher geringer (Übersichtsartikel von Adair et al., 1990). Bei Verwendung wiederholter Verabreichungen von Fremdproteinen treten auch nachteilige Nebenwirkungen auf. Viele dieser Probleme können unter Verwendung menschlicher monoclonaler Antikörper gelöst werden. Derzeit können diese Antikörper unter Verwendung molekularbiologischer Verfahren aus monoclonalen Maus-Antikörpern erzeugt werden, wobei der komplementaritätsbestimmende Bereich (CDR) von Maus-mAbs mit menschlichen mAbs verknüpft wird. Diese humanisierten Antikörper sind zur Verwendung bei der Immuntherapie beim Menschen geeignet. Auch Einzelketten-Antikörper (scFv) werden konstruiert. Bei der Konstruktion dieser scFv's werden Linkersequenzen unterschiedlicher Länge verwendet, wie von Whitlow et al., Protein Eng., 6 (8) (1993), 989-995 beschrieben, um die Bindung des Antikörpers an das Antigen zu optimieren.
Aus den vorangegangenen Erläuterungen wird deutlich, daß sich erfindungsgemäße Antikörper zur Diagnose und Bestimmung von Krankheitszuständen (z. B. verschiedener Carcinom-Typen), zum Nachweis und zur Kontrolle der Wundheilung, zur Behandlung verschiedener neoplastischer Krankheiten und zur Prophylaxe verwenden lassen. Der Fachmann kennt andere Verwendungen der gegenwärtig beanspruchten Erfindung.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung spezifischer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angegeben, ohne jedoch deren Schutzumfang zu beschränken. Dem Fachmann erschließen sich ohne weiteres andere Verwendungen und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

BEISPIEL 1

Erzeugung der extrazellulären Tie-Domäne in einem Baculovirus- Expressionssystem

Die cDNA-Sequenz des Tie-Proteins ist in Partanen, J., et al., Mol. Cell Biol., 12 (1992), 1698-1707, offenbart worden. Die cDNA-Sequenz, die die extrazelluläre Tie-Domäne (Aminosäuren 24-760), codiert, wurde unter Verwendung der PCR- Primer
5'-CGTAGATCTGGCGGTGGACCTGAC-3' und
5'-CGCCATGATCACTAGTGATGGTGATGGTGATGCTGCTGATCCAGGCCCTCTTCAGC-3'
mittels PCR amplifiziert und in die BamHI-Stelle des Vektors pVT-Bac (Tessier et al., Gene, 98 (1991), 177-183) cloniert. Am 3'-Ende der cDNA wurde eine Sequenz insertiert, die eine Spaltstelle von Faktor X (IEGR) codiert, der sechs aufeinanderfolgende Histidin-Reste folgten. Zur Expression der extrazellulären Tie-Domäne wurden dann Insektenzellen mit dem erhaltenen, als pVT-Tie bezeichnete Vektor transfiziert.
SF-9-Insektenzellen wurden mit dem Vektor pVT-Tie und DNA des Baculo- Gold-Baculovirus (Pharmingen Kat.-Nr. 21100D) cotransfiziert. Aus dem konditionierten Medium (TNMFH + 5% FCS) der transfizierten Zellen wurden virale Isolate mit Hilfe eines Plaque-Tests in Agarose aufgereinigt und in High- Five-Insektenzellen (Invitrogen) auf Expression des rekombinanten Proteins getestet. Eines der Isolate (BG-3-Virus) wurde zur Proteinproduktion im technischen Maßstab ausgewählt.
High-Five-Zellen wurden mit dem BG-3-Virus infiziert und das konditionierte Medium (EX-CELL 400, JRH Scientific) der infizierten Zellen wurde nach zwei Tagen gesammelt. Das rekombinante BG-3-Protein wurde mittels ConA-Affinitätschromatographie aus dem Medium aufgereinigt.

BEISPIEL 2

Erzeugung von gegen Tie gerichteten monoclonalen Antikörpern in Balb/C- Mäusen

Drei Monate alte weibliche Balb/c-Mäuse wurden mittels intraperitonealer Injektion von BG-3 (50 ug/Maus), das mit komplettem Freund-Adjuvans emulgiert worden war, immunisiert. In Abständen von drei bis vier Wochen wurden Auffrischungs-Injektionen von 50 ug verabreicht und nach einem weiteren Abstand von drei Wochen wurde eine letzte Auffrischungsdosis (20 ug BG-3 in PBS, intravenös verabreicht) verabreicht. Vier Tage nach der letzten Auffrischungsdosis wurden die Mäuse getötet und Maus-Milz-Lymphoidzellen wurden mit SP-2/0-Plasmacytom-Zellen in einem Verhältnis von 2 : 1 fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden auf Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (Nung) in Ex-Cell-320-Medium (Seralab), das fötales Kälberserum (FCS, 20%) enthielt und mit HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin, Gibco, 043-01060H, 50fach verdünnt) angereichert worden war, geerntet. Die Zellen wurden bei +37% in einer 5% CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre gezüchtet. Nach 10 Tagen wurde das mit HAT angereicherte Medium gegen mit HT angereichertes Zellkulturmedium (Gibco, 043-01065H, 50fach verdünnt) ausgewechselt. Das HT-Medium war mit HAT-Medium identisch, enthielt jedoch kein Aminopterin.
Zwei bis drei Wochen nach Fusion wurde die Produktion spezifischer Antikörper mit Hilfe des in Beispiel 5 beschriebenen Antigen-spezifischen immunfluorometrischen Tests (IFMA) getestet. Die Master-Clone wurden mittels Grenzverdünnung cloniert (Staszewski, 1984). Positive Clone wurden auf Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen (Nung) vermehrt, erneut cloniert und mittels des gleichen Tests erneut getestet. Positive Clone wurden mittels eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierverfahrens (FACS) getestet. Stabile Clone sezernierten zur IgG-Klasse gehörende Immunglobuline.
Es stellte sich heraus, daß ein als 3C4C7G6 bezeichneter Clon stabil einen monoclonalen Antikörper sezernierte, bei dem mittels IFMA bestimmt wurde, daß er zur Immunglobulinklasse IgG1 gehörte. Das Hybridom 3C4C7G6 wurde am 2. Dezember 1993 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Abteilung menschliche und tierische Zellkulturen und Viren, Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungs-Nr. ACC2159.
Mit Hilfe ähnlicher Verfahren wurden andere Clone erhalten, die Tiespezifische monoclonale Antikörper produzierten, die gegen das gleiche Epitop oder gegen andere Epitope gerichtet waren. Ein solcher Clon, 10F11G6, wurde zusammen mit dem vorstehend offenbarten Clon 3C4C7G6 für weitere Experimente ausgewählt.
Zur Produktion monoclonaler Antikörper als Aszitesflüssigkeit wurden Balb/c-Mäuse verwendet. Die Hybridome wurden den Mäusen nach einer Vorbehandlung der Tiere mit Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan, 98%, Aldrich-Chemie, D-7924 Steinheim, Kat.-Nr. T 2,280-2) intraperitoneal (i.p.) injiziert. Etwa zwei Wochen vor Injektion der Hybridomzellen wurden 0,5 ml Pristan injiziert (i.p.). Die Menge der injizierten Zellen betrug 7,5 bis 9 · 106 pro Maus. Die resultierende Aszitesflüssigkeit wurde 10-14 Tage nach Injektion der Hybridome gesammelt, wobei sie im Durchschnitt 0,3 mg/ml Antikörper enthielt, wie mittels des in Beispiel 6 beschriebenen Antigen-spezifischen IFMA-Tests bestimmt.

BEISPIEL 3

In-vitro-Produktion eines gegen Tie gerichteten monoclonalen Antikörpers in Hohlfaser-Bioreaktoren

Unter Verwendung des Tecnomouse-Systems (Gellex Inc.) wurden gegen Tie gerichtete monoclonale Antikörper in vitro produziert. Zuerst wurden Medien- Flaschen mit Deckeln und Filtern eine halbe Stunde bei 121ºC und einem Druck von 1,1 Bar autoklaviert. Danach wurden sie mit 1 l Dulbecco-MEM (Gibco, 042- 02501, mit 6,4 g/l Glucose, 2 mmol/l Glutamin, 066-1051H, 1 mmol/l Na-pyruvat, 066-1840E) gefüllt. Die Bioreaktor-Haltevorrichtung wurde steril in den Tecnomouse-Behälter überführt. Die Pumpe wurde eingeschaltet und die Rohrleitungen für das Medium wurden ebenso wie die leeren Abfall-Flaschen (die Ausflußrohrleitung) steril damit verbunden.
Das Einfüll- und Spülprogramm wurde nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, um das gesamte konservierende Material aus dem intrakapillaren Raum (IC) des Bioreaktors zu waschen. Das Programm wurde 4 Stunden bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 150 ml/h begonnen. Das Waschen wurde bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 50 ml/h 20 Stunden fortgesetzt, wobei gleichzeitig der extrakapillare Raum (EC) mit 5% FCS enthaltendem Dulbecco-MEM (DMFM) gewaschen wurde. Das Medium im EC- Raum wurde gegen frisches Medium steril ausgewechselt. Einen Tag später war der Bioreaktor fertig und konnte mit den Hybridomzellen beimpft werden.
Hybridomzellen wurden in Zellkulturflaschen in 10% FCS enthaltendem DMEM geerntet und 72 · 106 Zellen wurden gesammelt und in 5% FCS enthaltendes DMEM mit einem Volumen von 5 ml überimpft. Die Durchflußgeschwindigkeit des Mediums im intrakapillaren Raum betrug 100 ml/h. Zur Gewinnung monoclonaler Antikörper wurde das Kreislaufverfahren wie folgt verwendet: die Medium-Rohrleitung wurde mit der Medium-Flasche in Position "heraus" verbunden, wobei das Medium aus der Flasche entnommen und dem intrakapillaren Raum des Biorektors zugeführt wurde; die Ausflußrohrleitung wurde mit der Medium-Flasche in Position "hinein" verbunden, um das Medium in die Flasche zurückzubringen. Monoclonale Antikörper wurden dreimal pro Woche jeweils montags, mittwochs und freitags geerntet und jedes Mal wurde ein 10 ml-Volumen von frischem Medium, das 2,5% FCS in DMEM enthielt, ausgetauscht.
Die gegen BG-3 gerichtete Zellinie 3C4C7G6 produzierte im Zellkulturmedium Antikörper in einer mittleren Konzentration von 152 ug/ml. Nach Überimpfung der Zellen in den Bioreaktor im Tecnomouse-System (72 · 10&sup6; Zellen) wurden die produzierten Antikörper im Zeitraum von zwei bis drei Tagen geerntet. Die mittlere Produktion betrug 4,5 mg/Woche und die Gesamtproduktion über 2 Monate belief sich auf 37 mg.
Die entweder in Aszitesflüssigkeit oder im Tecnomouse-System produzierten Antikörper wurden mit Hilfe des AffigelTM-Protein A-MAPS II-Kits (BioRad) entsprechend den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Die Säule wurde für das Aufreinigungsverfahren mit Bindungspuffer (pH 9,0) äquilibriert. Die Antikörper wurden in Bindungspuffer der Protein-A-Matrix zugeführt und mit dem Bindungspuffer solange gewaschen, bis die Grundlinie erreicht wurde (mittels UV-Spektroskopie bei 280 nm nachgewiesen). Das spezifisch gebundene Material wurde mit einem Elutionspuffer mit einem pH-Wert von 3,0 vom Protein A eluiert und die Fraktionen wurden in Röhrchen gesammelt, die das Volumen von 1 mol/l Tris-HCl, pH-Wert 9,0 enthielten, das zur sofortigen Neutralisierung der Fraktion erforderlich war. Die Säule wurde mit Regenerierungspuffer regeneriert und bis zur nächsten Verwendung in einem 50 mmol/l Na-phosphat-Puffer, pH-Wert 7,5, aufbewahrt, der 0,05% NaN3 als Konservierungsmittel enthielt.

BEISPIEL 4

Produktion von gegen Tie gerichteten Antikörpern mittels Expression in Bakterien

Ein Bam HI-Fragment der Tie-cDNA (Nucleotide 520-1087) wurde in die Bam HI-Stelle des Vektors pGEXIT (Pharmacia) subcloniert, wobei ein offenes Leseraster erhalten wurde, das Glutathion-S-Transferase codierte, die mit einem die Aminosäuren 162-350 des Tie-Proteins codierenden Bereich (GST-Tie2) fusioniert war. Das Konstrukt wurde in den E. coli-Stamm DHSa transformiert und die Expression des Fusionsproteins wurde mittels IPTG induziert. Das erhaltene 40 kD-Fusionsprotein wurde in einem denaturierenden Agarose-Gel (FMC) aufgereinigt und für Immunisierungen verwendet.
Monoclonale Antikörper wurden produziert, wie vorstehend für das BG-3- Tie-Protein beschrieben. Nach zwei Subclonierungen wurden acht Clone erhalten, die Antikörper gegen das GST-Tie2-Protein sezernierten. Bei Western- Immunblot-Analysen reagierten diese mit Tie gleich stark. Unter Verwendung einer Protein A-Säule wurde Aszites von den gegen GST-Tie2 gerichteten Clonen aufgereinigt und zur Western-Blot-Analyse verwendet.

BEISPIEL 5

Markierung des Tie-Proteins mit Europium

Die in Beispiel 1 erzeugte extrazelluläre Tie-Domäne BG-3 wurde zur Verwendung in Tests markiert. Die Markierung wurde nach Mukkala et al., Anal. Biochem., 176 (2) (1989), 319-325, mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: Ein 125facher molarer Überschuß an Isothiocyanat-DTTA-Eu (N1-Chelat, Wallac, Finnland) wurde einer BG-3-Lösung (0,5 mg/ml in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 8,6) zugegeben und der pH-Wert wurde durch Zugabe eines zehntel Volumens von 0,5 mol/l Natriumcarbonat (Merck)-Puffer, pH-Wert 9,8, auf 9,8 eingestellt. Die Markierung wurde die Nacht über bei +4ºC durchgeführt. Ungebundener Marker wurde unter Verwendung von PD-10 (Pharmacia, Schweden) mit TSA-Puffer (50 mmol/l Tris-HCl, pH 7, 8, enthaltend 0,15 mol/l NaCl) als Elutionsmittel entfernt.
Nach Aufreinigung wurde dem markierten BG-3 Rinderserumalbumin (BSA) in einer Menge von 1mg/ml zugegeben und der Marker wurde bei +4ºC aufbewahrt.
Die Anzahl der pro BG-3-Molekül eingebauten Europium-Ionen betrug 2,9, wie mittels Bestimmung der Fluoreszenz im Verhältnis zu der bekannter EuCl&sub3;- Standards (Hemmilä et al., Anal. Biochem., 137 (1984), 335-343) ermittelt.

BEISPIEL 6

Immunfluorometrischer Screening-Test (IFMA)

Gegen den Tie-Rezeptor produzierte Antikörper wurden unter Verwendung eines immunfluorometrischen Tests vom Sandwich-Typ unter Verwendung von Mikrotiter-Streifenvertiefungen (Nung, Polysorb) durchmustert, die mit gegen Maus-IgG gerichtetem Kaninchen-Ig (Z 259, Dakopatts, Lovgren et al., Talanta, 31 (10B) (1984), 909-916) beschichtet waren. Die vorher beschichteten Vertiefungen wurden mittels einer Platewash-Vorrichtung 1296-024 (Wallac) einmal mit einer Waschlösung (DELFIA) gewaschen. Der DELFIA-Testpuffer wurde als Verdünnungspuffer sowohl für Zellkultur-Überstände als auch für das Serum von Mäusen, deren Milz entfernt worden war (bei Verdünnungen von 1 : 1000 bis 1 : 100 000) verwendet, das als Positivkontrolle in den Screening- Vortests eingesetzt wurde.
In den späteren Tests wurde gegen BG-3 gerichteter 3C4C7G6, der als Aszitesflüssigkeit produziert und mittels AffigelTM-Protein-A-MAPS aufgereinigt worden war, in einer Konzentration von 0,25 ng/ml bis 60 ng/ml in Testpuffer (100 ul, DELFIA) als Standard verwendet.
Eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur (oder in einer anderen Ausführungsform eine Inkubation die Nacht über bei +4ºC) wurde begonnen, indem 5 min auf einer Plateshake-Vorrichtung (1296-001, Wallac) geschüttelt und anschließend viermal mit der vorstehend beschriebenen Waschlösung gewaschen wurde.
Der in Beispiel 4 hergestellte, Eu-markierte BG-3 wurde in einer Konzentration von 10 ng/Vertiefung in 100 ul Testpuffer zugegeben. Nach 5 min auf einer Plateshake-Schüttelvorrichtung und einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Streifen, wie vorstehend beschrieben, gewaschen.
Pro Vertiefung wurden 200 ul Verstärkerlösung (DELFIA) zugegeben. Die Platten wurden 5 min auf einer Plateshake-Schüttelvorrichtung geschüttelt und die Fluoreszenzintensität wurde 10 min bis 15 min mittels einer ARCUS- 1230-Vorrichtung (Wallac) bestimmt (Lövgren et al., in: Alternative Immunoassays (Herausgeber Collins, W.P.), (1985), 203-216, John Wiley & Sons Ltd.).
Das DELFIA-System vom Sandwich-Typ ist sehr empfindlich, wobei die theoretische Empfindlichkeit für diesen gegen Tie gerichteten monoclonalen Antikörper unter 0,25 ng/ml liegt. Obwohl die Empfindlichkeit zur quantitativen Bestimmung von in Zellkultur-Überständen produzierten Mabs vorteilhaft war, ließ sich der Test auch zur quantitativen Bestimmung von in vitro erzeugten Mabs einsetzen. Der lineare Bereich reichte von 0,25 ng/ml bis 60 ng/ml (Fig. 2). Es stellte sich heraus, daß Schwankungen zwischen Tests sehr gering waren.

BEISPIEL 7

Radiomarkierter monoclonaler Antikörper zum Nachweis des Tie-Rezeptors in vivo

Der monoclonale Antikörper 3C4C7G6 wurde unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens (Greenwood et al., Biochem. J., 89 (1963), 114-123) mit ¹²&sup5;I markiert. Zur Markierung von 40 ug Antikörper wurden 1 mCi Na ¹²&sup5;I verwendet. Markierter Antikörper wurde mittels Elution von Sephadex-G25TM aufgereinigt, wobei eine Hauptfraktion von 1,8 ml erhalten wurde.
Mäusen, die das Lewis-Lungencarcinom aufwiesen, wurde ¹²&sup5;I-markierter Antikörper gegen BG-3 (3C4C7G6) in zwei verschiedenen Dosen von 1,2 ug und 2,4 ug i.v. verabreicht. Die biologische Verteilung des markierten Antikörpers in Mäusen wurde zu fünf verschiedenen Zeitpunkten bestimmt: 1) nach 6 h (N = 4), 2) nach 24 h (N = 7), 3) nach 47 h (N = 5), 4) nach 70 h (N = 3) und S) nach ' 117h(N = 2). Tabelle 1. Biologische Verteilung in Geweben zu den Zeitpunkten 1-5
Eierstöcke 8,445497 3,617958 2,622101 2,387713 0,662774 Die Ergebnisse zeigen, daß sich die gegen BG-3 gerichtete Aktivität im Blut, im Tumor und in den Blutgefäßen und in gewissen Mengen in Lungen und Eierstöcken konzentrierte. Zu den Zeitpunkten nach 48 h und 70 h war die Aktivität im Blut hoch: 9,3% ID/g und 7,9% ID/g (Prozentsatz der injizierten Dosis pro g Gewebe, berechnet für eine Maus von 20 g). Nach 24 h betrug die gegen BG-3 gerichtete Aktivität im Blut 11,3% und zum Zeitpunkt nach 6 h 36,2%.
¹²&sup5;I-markierter Antikörper gegen BG-3 (3C4C7G6) wurde auch Mäusen verabreicht, die eine 8 Tage alte Wunde im Haut-Epithelgewebe aufwiesen ("Wundheilungs-Mäuse"). Die Dosis des Wundheilungs-Mäusen verabreichten Antikörpers betrug 0,03 ug pro Tier. Die biologische Verteilung der Antikörper- Aktivität ist in Fig. 3 gezeigt. In dieser Figur stellt die Y-Achse den Prozentsatz der injizierten Dosis (% ID/g) dar und die X-Achse zeigt die verschiedenen Zeitpunkte der Injektion: 4 h (N = 2), 24 h (N = 6), 48 h (N = 6), 72 h (N = 4) und 120 h (N = 4). In Fig. 3 ist auch das Gleichgewicht gezeigt, das sich zwischen Zielgewebe und Plasma herausbildete.

BEISPIEL 8

99m-Tc-Markierung von gegen Tie gerichteten monoclonalen Antikörpern für Abbildungs-Untersuchungen

Der Antikörper wurde unter Verwendung des Verfahrens von Schwarz et al., J. Nucl. Med., 28 (1987), 721, und Mather et al., J. Nucl. Med., 31 (1990), 692- 697, mit 99 m-Technetium markiert. 2-Mercaptoethanol (ME) wurde zum Öffnen der Disulfid-Bindungen der schweren Kette im Scharnier-Bereich des Immunglobulins verwendet. Der Antikörper wurde auf etwa 10 mg/1 konzentriert und der Antikörper-Lösung wurde ME in ausreichender Menge zugegeben, wobei ein Molverhältnis von 1000 : 1 (0,47 ul ME/l mg Antikörper) erhalten wurde. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und der reduzierte Antikörper wurde mittels Gelfiltration auf einer 20 ml-Sephadex- G-50-Säule aufgereinigt und unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung als mobiler Phase eluiert. Nach Bestimmung der optischen Dichte bei 280 nm wurde die Antikörper-Fraktion vereinigt und bei - 20ºC in Form von 0,5 mg-Aliquots zur Markierung mit 99m-Tc aufbewahrt.
Nach Markierung mit 99m-Tc wurde das Antikörper-Aliquot aufgetaut und unter Verwendung eines Methylendiphosphonat (MDP)-Kits zum Abbilden von Knochen (Amerscan-Medronat II-Techentium-Knochenmittel, N. 165) mit 5 ml 0,9%iger steriler Kochsalzlösung nach den Anweisungen des Herstellers zubereitet. Dem Antikörper-Aliquot wurden 35 ul der MDP-Lösung, die 35 ug MDP und 2,4 ug SnF&sub2; enthielt, zugegeben und die Lösungen wurden gut gemischt. 99m-Tc-Pertechnetat wurde dem Gemisch zugegeben und es wurde vorsichtig geschüttelt. Die Reaktion wurde nach 10 min beendet. Die radiochemische Reinheit wurde mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie bestimmt.
Die Markierung des reduzierten Antikörpers ergab ein stabiles 99m-Tcmarkiertes Immunglobulin, da nur eine geringfügige unspezifische Bindung des Markers erfolgte. Die Markierungs-Wirksamkeit wurde mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt, wobei die Entwicklung in 0,9%-iger Kochsalzlösung erfolgte. Mindestens 85% der Immunreaktogenität blieben dabei erhalten. Die Stabilität in vivo wurde mittels eines Cystein- Behandlungstests in vitro analysiert.
Mit 99m-Tc markierte Antikörper gegen Tie können mit einer gewöhnlichen gamma-Kamera oder einem SPECT (Einzelphotonen-Emissions- Computertomographie)-Verfahren nachgewiesen werden, um die Durchflußgeschwindigkeit des Antikörpers im menschlichen Körper sichtbar zu machen.

BEISPIEL 9

Nachweis Tie-positiver Zellinien mittels FACS

Die in den Beispielen 2, 3 und 4 erzeugten, gegen Tie gerichteten Antikörper wurden zum Nachweis des Tie-Proteins in menschlichen Leukämie- Zellinien verwendet.
Die hämatopoetischen Zellinien HEL (menschliche Erythroleukämie) und MOLT-4 (T-Lymphoblastenleukämie) wurden von ATCC erhalten. Zur indirekten Immunfluoreszenz-Färbung von Tie unter Verwendung der erzeugten monoclonalen Antikörper und zur FACS-Analyse wurden HEL-Zellen (menschliche Erythroleukämie-Zellen) verwendet, die Erythroid- und Megakaryocyten-Marker coexprimieren. Die Zellen wurden ausgezählt, gewaschen und in Gegenwart mehrerer Verdünnungen (von 1 : 1 bis 1 : 200) der Antikörper inkubiert, gewaschen und danach in Gegenwart von FITCkonjugierten Antikörpern gegen Maus-Immunglobuline (sekundäre Antikörper) inkubiert. Die Analyse wurde mittels FACS IV durchgeführt. Als Negativkontrolle wurden die Zellen mit unspezifischen Maus- Immunglobulinen und anschließend mit den gleichen sekundären Antikörpern gefärbt. Als Negativ-Zellkontrolle verwendeten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die T-Leukämiezellinie MOLT-4, die keine Tie-mRNA exprimiert.
Die Ergebnisse zeigen, daß die gegen Tie gerichteten Antikörper durchschnittlich 85% der HEL-Zellen färben, während weniger als 1% der MOLT-Zellen positiv im Hinblick auf Tie gefärbt werden. Wenn Zellen beider Linien gemischt werden, unterscheiden die Antikörper positive HEL-Zellen von negativen MOLT-Zellen (Fig. 1). Auch bei Proben aus menschlichem Knochenmark wurden weniger als 1% der Zellen mit diesen Antikörpern positiv gefärbt.
Zellen aus den menschlichen Leukämiezellinien MOLT-4 (eine maligne T- Zellinie, die negativ für Tie-mRNA ist) und HEL (eine menschliche Erythroleukämie-Zellinie, die positiv für Tie-mRNA ist) wurden in einer Suspension in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 gemischt. Danach wurden die Zellen unter Verwendung der in Beispiel 2 erhaltenen, 1 : 10 verdünnten monoclonalen Antikörper gegen Tie und eines FITCkonjugierten, gegen Maus- IgG gerichteten Antikörpers als sekundärer Antikörper in Suspension gefärbt. Als Negativ-Kontrolle wurde der Antikörper gegen normales Maus-Serum ausgetauscht. Die Analyse erfolgte unter Verwendung von FACS IV. Die Ergebnisse zeigen zwei verschiedene Zellpopulationen, wobei eine Tie-positiv war und die andere Tie-negativ, wobei jede etwa 50% der gesamten analysierten Zellpopulation umfaßte (Fig. 1).
Einige der Tie-positiven Knochenmarkszellen erwiesen sich auch als positiv für den CD19-B-Zellmarker und waren allesamt negativ für CD38. Das zeigt, daß Tie in der B-Zell-Abstammungslinie exprimiert wird.

BEISPIEL 10

Analyse der monoclonalen Antikörper

Die Überstände der monoclonalen Zellkulturen wurden unter Verwendung einer FACS-Analyse auf ihre Fähigkeit zur Erkennung des Tie-Rezeptors auf Zelloberflächen getestet. Sowohl mit einem Tie-Expressionsvektor (Tie-cDNA voller Länge in pLTRpoly, Makela et al., 1991) transfizierte NIH3T3-Zellen und mit einem Kontrollvektor transfizierte NIH3T3-Zellen als auch HEL-Zellen (eine menschliche Erythroleukämie-Zellinie, die den endogenen Tie-Rezeptor exprimiert) und MOLT-4-Zellen (eine menschliche T-Zell-Leukämie-Zellinie, die Tie nicht exprimiert) wurden mit dem konditionierten Medium verschiedener Zellclone und anschließend mit FITC-markierten, gegen Maus gerichteten Kaninchen-Antikörpern (Dako) inkubiert. Die markierten Zellen wurden mittels einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortier-Vorrichtung (Beckton Dickinson) analysiert.
Auch mit den Clonen 1H3H7, 3C4C7 und SC12H9 wurde Aszites erzeugt. Der Clon 3C4D7 wurde weiter cloniert und ergab die Subclone 3C4C7G6, 3C4C7B11, 3C4C7E7 und 3C4C7F9, die einander ähnlich waren. Tabelle 2 Ergebnisse mit den gegen Tie gerichteten monoclonalen Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne gerichtet waren

BEISPIEL 11

Immunperoxidase-Färbung vom Tie in menschlichen Blutzellen

Zur Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen in das periphere Blut wurde einem Patienten Cyclophosphamid verabreicht und sieben Tage später wurden aus dem peripheren Blut "buffy-coat"-Zellen gesammelt. Rote Blutkörperchen aus der Zellsuspension wurden auf vorbereiteten Cytozentrifugen-Objektträgern hämolysiert. Diese wurden dann zur Immunfärbung unter Verwendung des aufgereinigten, gegen Tie gerichteten monoclonalen Antikörpers 3C4C7G6 und des Immunperoxidase-Verfahrens verwendet. Bei der Analyse von Knochenmarkszellen mittels Doppel- Immunfluoreszenzfärbung konnten Tie-positive Zellen (weniger als 1%) nicht eindeutig einer hämatopoetischen Zellabstammungslinie zugeordnet werden.
Auf einem Objektträger wurden unter 70 000 Zellen fünf positiv gefärbte Zellen identifiziert. Bei der Immunperoxidase-Färbung waren die Tie-positiven Zellen klein und rund, mit einem großen Kern und wenig Cytoplasma (Fig. 2). (Die dunkle Färbung einer positiven Zelle in der Figur ist auf die Peroxidase- Reaktion zurückzuführen, wodurch eine Tie-positive Zelle bestimmt wird). Die gegen Tie gerichteten monoclonalen Antikörper identifizieren somit spezifische hämatopoetische Zellen im Knochenmark und können zur Identifizierung definierter Untergruppen von hämatopoetischen Zellen verwendet werden.

BEISPIEL 12

Humanisierung des monoclonalen Antikörpers 3C4C7G6

3C4C7G6 kann unter Verwendung bereits bekannter Verfahren (Kolbinger et al., 1993; Kettleborough et al., 1991) humanisiert werden. Das Humanisierungs-Verfahren umfaßt den Einbau der komplementaritätsbestimmenden Bereiche (CDRs) der leichten (L) kappa-Kette der Maus und der schweren (H) Kette der Maus in menschliche variable (V) Bereiche und die Erzeugung von Punktmutationen in menschlichen Rahmenbereichen, um die ursprünglichen CDR-Konformationen aufrechtzuerhalten. Die umgebildeten VL- und VH-Ketten werden in geeigneten Expressionsvektoren mit DNAs verknüpft, die die konstanten Bereiche der menschlichen kappa-Kette bzw. gamma-1-Kette codieren.
Die Erzeugung von scFv wird erreicht, wie bereits von Whitlow et al., vorstehend (1993), beschrieben.
Die Affinitäten der humanisierten monoclonalen Antikörper und scFv's werden unter Verwendung der Verfahren getestet, die in der vorliegenden Anmeldung vorstehend beschrieben sind.

BEISPIEL 13

Konjugation eines Tie-spezifischen monoclonalen Antikörpers an ein Therapeutikum

Der monoclonale Antikörper 3C4C7G6 oder die in Beispiel 12 beschriebenen humanisierten Antikörper können an verschiedene Mittel zur diagnostischen Verwendung, wie in anderen Beispielen in der vorliegenden Erfindung beschrieben, oder zur therapeutischen Verwendung des erhaltenen Konjugats gekoppelt oder konjugiert werden.
Zur Verwendung bei der Therapie von Tumoren und verstreuter maligner Krankheiten, wie Leukämie, können die Antikörper mit Radioisotopen, wie ³²p, ¹³¹I, ¹²&sup5;I, &sup9;&sup0;Y, ¹&sup8;&sup8;Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi oder ¹&sup0;B, verknüpft werden (vgl. beispielsweise Scheinberg et al., Oncology, 1(1987), 31-37). Die Konjugation von Radioisotopen an den Antikörper wird mittels direkter Anlagerung der Isotope an die Antikörper mit Hilfe von im Stand der Technik beschriebenen Verfahren (vgl. beispielsweise Schwartz j., Nuclear Medicine, 28 (1987), 721) oder mit Hilfe von Chelat-Linkern, die das Radioisotop an den Antikörper binden, oder mittels eines zweiten Antikörpers gegen den spezifischen Antikörper erreicht. Verschiedene andere Mittel können an die Antikörper angelagert werden. Solche Mittel umfassen gegen Tumore gerichtete Arzneistoffe und Antibiotika, die aufgrund einer Wechselwirkung mit DNA über eine Einlagerung (z. B. Daunomycin, Adriamycin, Aclacinomycin) oder DNA-Spaltung (z. B. Esperamycin, Calicheamycin, Neocarzinostatin) toxisch sind, und andere toxische Cytostatika, wie cis-Platin, Vinblastin und Methotrexat (vgl. beispielsweise Greenfield et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 4 (1991), 107-119). Diese Mittel werden durch kovalente Anlagerung geeigneter Derivate der Mittel verknüpft.
Zur Verwendung bei therapeutischen Konjugaten der Antikörper sind auch viele Proteine und Glycoproteine verfügbar. Diese umfassen bakterielle Toxine, wie Diptherie-Toxin, Shigella-Toxin und Pseudomonas-Exotoxin, Pflanzen- Toxine, wie Ricin, Abrin, Modeccin, Viscumin, antivirales Kermesbeeren- Protein, Saporin, Momordin und Gelonin. Diese Proteine enthalten ein katalytisches Fragment und in einigen Fällen Fragmente oder Domänen, die Zelloberflächen-Strukturen erkennen oder die Translokation durch die Zellmembran hindurch erleichtern. Es werden entsprechend modifizierte Toxine verwendet, die eine verbesserte Spezifität gestatten, ohne daß die Stärke verlorengeht. Eine Konjugation von Toxinen an die Antikörper erfolgt mit Hilfe heterobifunktioneller Vernetzungsmittel, wie N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)-propionat (SPDP) oder 2-Iminothiolan.
Vor der therapeutischen Verwendung werden konjugierte Antikörper hinsichtlich ihrer toxischen Stärke, Zielspezifität, Stabilität in vitro und in vivo und anderer Eigenschaften getestet (vgl. beispielsweise Immunotoxins (Herausgeber Frankel), (1988), Kluwer Academic Publishers, Boston). Es ist erwünscht, daß die Toxizität des konjugierten Mittels und die Bindungsaffinität und Spezifität des Antikörpers durch das verwendete Kopplungsverfahren nur geringfügig beeinträchtigt wird. Die Konjugate werden deshalb auf Bindung an den Tie-Rezeptor getestet (vgl. Beispiel 10). Die in vitro-Toxizität gegen Zielzellen, wie die Leukämie-Zellinie Dami, wird getestet, indem der Einbau markierter Verbindungen in behandelte Zellkulturen gegenüber dem in mit einem Kontrollkonjugat behandelte Zellkulturen bestimmt wird, und direkter, indem Kulturen ermittelt werden, die in clonogenen und Zellwachstums- Rückextrapolations-Tests wachsen können. Die in vivo-Stabilität, Clearance und spezifische Toxizität werden bewertet, indem geeigneten tierischen Rezipienten, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen oder Affen, Konjugate verabreicht werden. Weitere solche Rezipienten sind gesunde Mäuse und in- vivo-Tumor-Modellsysteme und Leukämie-Xenograft-Modellsysteme, die menschliche neoplastische Zellen umfassen, die in Mausstämme mit einer Immunschwäche, wie die Nacktmaus oder die SCID-Maus, eingeführt wurden.

BEISPIEL 14

Herstellung eines den monoclonalen Antikörper 3C4C7G6 enthaltenden Arzneimittels

Erfindungsgemäße Arzneimittel umfassen eine wirksame Menge des Wirkstoffs, d. h. eines Tie-spezifischen monoclonalen Antikörpers, insbesondere des monoclonalen Antikörpers 3C4C7G6, entweder allein oder in Kombination mit einem geeigneten Puffer, Verdünnungsmittel und/oder Zusatzmittel. Solche Zusammensetzungen werden als sterile wäßrige Lösungen oder als lyophilisierte oder in anderer Weise getrocknete Formulierungen bereitgestellt. Typischerweise werden Antikörper in solchen Vehikeln in Konzentrationen von etwa 1 mg/ml bis 10 mg/ml formuliert.
Ein Beispiel für ein geeignetes Arzneimittel zur Injektion enthält den monoclonalen Antikörper 3C4C7G6 (lmg/ml) in einer gepufferten Lösung (pH 7,0 ±0,5) von Mononatriumdihydrogenphosphat (0,45 mg/ml) und Tween 80TM (0,2 mg/ml) in sterilem H&sub2;O. Erfindungsgemäße Arzneimittel werden in Dosen verabreicht, die vom Fachmann nach Untersuchung der Zielkrankheit, der Schwere der Symptome und der Merkmale des Patienten bestimmt werden. Beispielsweise können erfindungsgemäße Arzneimittel lokal angewendet werden, um einen maximalen Nutzen beim Stillstand des Tumorwachstums und der Gefäßneubildung oder bei der Wundheilung zu erzielen. Zur systemischen Verwendung sind jedoch unterschiedliche Dosen erforderlich, je nach den Merkmalen des Patienten, wie Gewicht, Alter, Fortschreiten der Krankheit, Stoffwechsel und anderen.
Aus der folgenden Beschreibung erschließen sich dem Fachmann weitere Ausführungsformen. Dementsprechend wird die vorliegende Erfindung nur durch die folgenden Patentansprüche beschränkt.

BEISPIEL 15

Immunhistochemische Färbung von Tie in gesundem Gehirn, Glioblastoma multiforme und metastatischem Melanom

Frische Proben von vorher unbehandelten cerebralen Gliomen und intrakranialen Meningiomen wurden während einer offenen Operation am Department of Neurosurgery, Helsinki University Central Hospital erhalten. Alle Tumorpatienten waren mit Corticosteroiden behandelt worden. Während einer Operation von hartnäckiger Epilepsie wurde eine Probe von nichtneoplastischem Kontroll-Hirngewebe erhalten. Mehrere der Tumorproben umfaßten benachbartes Hirngewebe. Alle Proben wurden nach chirurgischer Entfernung sobald wie möglich in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70ºC aufbewahrt. Die histopathologischen Diagnosen basierten sowohl auf Hämatoxylin/Eosin-gefärbten Kryostat-Schnitten als auch auf routinemäßig gefärbten Paraffin-Schnitten von benachbartem, Formaldehyd-fixiertem Tumor-Untersuchungsmaterial. Eine vollständige Auflistung der Proben ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3. Menschliche Gewebe-Proben
GBM = Glioblastoma multiforme
Sterilisierte Objektträger wurden in 2%-iges 3-Aminopropyltriethoxysilan (TESPA) in Aceton getaucht, um das Anhaften von Gewebe sicherzustellen. Auf den vorbehandelten Objektträgern wurden bei -20ºC 5 um-Kryostatschnitte geschnitten, in 4% Paraformaldhyd fixiert und bei -70ºC aufbewahrt.
Sowohl von den zur in situ-Hybridisierungsanalyse verwendeten Proben als auch von zwei weiteren malignen Gliom-Proben wurden 5 um- Kryostatschnitte auf TESPA-Objektträger geschnitten, wie vorstehend beschrieben. Die Schnitte wurden die Nacht über bei 37ºC im Vakuum getrocknet und unter Verwendung von monoclonalen Maus-Antikörpern gegen menschliches Tie (ein Gemisch monoclonaler Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne von Tie) und Kaninchen-Antikörpern (Dakopatts) gegen den menschlichen Von-Willebrand-Faktor (vWF) als endothelialen zellspezifischen Marker immunhistochemisch gefärbt.
Die Färbung wurde unter Verwendung des Vectastain-ABC-Elite- Biotin/Avidin-Systems für Maus-IgGs (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durchgeführt. Die endogene Peroxidase-Aktivität in den getrockneten, unfixierten Gewebeschnitten wurde mittels 30-minütiger Behandlung mit 0,5% H&sub2;O2 in Methanol blockiert. Nach Waschungen mit PBS wurden die Schnitte 20 min mit verdünntem Vectastain-Blockierungsserum inkubiert und dann mit einem unverdünnten gegen Tie gerichteten Antikörper (1 : 1) die Nacht über bei 4ºC oder mit einem Antikörper gegen den Von-Willebrand-Faktor (1 : 50) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Ein biotinylierter sekundärer Antikörper wurde während 45 min zugegeben und anschließend wurde das Vectastain-ABC- Reagenz während 30 min zugesetzt. Die Umsetzung wurde mit 0,2 mg/ml 3- Amino-9-ethylcarbazol (AEC), 0,03% H&sub2;O&sub2;, 14 mM Essigsäure und 33 mM Natriumacetat sichtbar gemacht. Als Kontrollen wurden normales Serum und ein Antigen-blockierter primärer Antikörper verwendet. Die Schnitte wurden in Hämatoxylin leicht gegengefärbt und in Aquamount eingebettet.
Blutgefäße in normalem Cortex-Gewebe erwiesen sich als negativ für das Tie-Protein (Fig. 4), während in der Glioblastom-Gefäßanordnung (B) und im Endothel des an GBM angrenzenden Gewebes (Nebenbild, B) eine starke Färbung beobachtet wurde. Das Tie-Protein wurde auch in Endothelzellen nachgewiesen, die sowohl Gefäße bei metastatischem Melanom auskleiden (C) als auch den Tumor begrenzen (Daten nicht gezeigt). Keine spezifische Färbung wurde beobachtet, wenn die Schnitte mit einem Antigen-blockierten Antikörper oder normalem Serum anstelle der gegen Tie gerichteten Antikörper inkubiert wurden. Zur weiteren Bestimmung des Ausmaßes und der Spezifität der Tie-Färbung wurden angrenzende Schnitte auf Faktor VIII gefärbt (D). Eine Zusammenfassung der bei der Tie-Färbung erhaltenen Ergebnisse ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4. Immunhistochemische Tie-Färbung
Die Ergebnisse untermauern die signifikante Rolle von Tie bei der Gefäß- Angiogenese, die das Fortschreiten eines Tumors begleitet.

BEISPIEL 16

Immunhistochemischer Nachweis des Tie-Proteins bei Hämangioblastomen und Hämangiopericytomen

In der vorliegenden Untersuchung haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Expression von endothelialen Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren in den beiden hochvaskulären CNS-Tumoren strittiger Herkunft, d. h. Kapillarhämangioblastomen und Hämangiopericytomen, analysiert.
Frische Proben von Hämangioblastomen und Hämangiopericytomen wurden während einer Operation am Department of Neurosurgery, Helsinki University Central Hospital erhalten (alle Tumorpatienten wurden mit Corticosteroiden behandelt). Die Proben wurden unmittelbar nach chirurgischer Entfernung schockgefroren und bei -70ºC aufbewahrt. Die histopathologischen Diagnosen basierten auf Hämatoxylin/Eosin-gefärbten Kryostat-Schnitten und auf routinemäßig gefärbten Paraffin-Schnitten von angrenzendem Formaldehyd-fixiertem Tumor-Untersuchungsmaterial.
Sterile Objektträger wurden mit 2% 3-Aminopropyltriethoxysilan (TESPA) in Aceton behandelt, um die Haftung des Gewebes sicherzustellen. Auf den Objektträgern wurden 5 mm-Kryostat-Schnitte geschnitten, in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert und bei -70ºC aufbewahrt.
Von den zur in situ-Hybridisierungs-Analyse verwendeten Proben wurden 5 mm-Kryostat-Schnitte auf TESPA-Objektträgern geschnitten, wie vorstehend beschrieben. Die Schnitte wurden die Nacht über bei 37ºC im Vakuum getrocknet und unter Verwendung monoclonaler Maus-Antikörper gegen menschliches Tie (monoclonale Antikörper gegen die extrazelluläre Tie- Domäne; eine freundliche Gabe von Dr. Juha Partanen) und von Kaninchen- Antikörpern (Dakopatts) gegen menschlichen Von-Willebrand-Faktor (vWF) und CD34 als endotheliale zellspezifische Marker (36) immunhistochemisch gefärbt.
Die Färbung wurde unter Verwendung des Vectastain-ABC-Elite- Biotin/Avidin-Systems für Maus-IgGs (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durchgeführt. Die endogene Peroxidase-Aktivität in den getrockneten, unfixierten Gewebeschnitten wurde mittels 30-minütiger Behandlung mit 0,5% H&sub2;O&sub2; in Methanol blockiert. Nach Waschungen mit PBS wurden die Schnitte 20 min mit verdünntem Vectastain-Blockierungsserum inkubiert und danach mit einem unverdünnten Antikörper gegen Tie (1 : 1) die Nacht über bei 4ºC oder einem Antikörper gegen CD34/Von-Willebrand-Faktor (1 : 50) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Ein biotinylierter sekundärer Antikörper wurde 45 min zugegeben und anschließend wurde Vectastain-ABC-Reagenz 30 min zugegeben. Die Umsetzung wurde mit 0,2 mg/ml 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC), 0,03% H&sub2;O&sub2;, 14 mM Essigsäure und 33 mM Natriumacetat sichtbar gemacht. Normales Serum und ein Antigen-blockierter primärer Antikörper wurden als Kontrollen verwendet. Schnitte wurden in Hämatoxylin leicht gegengefärbt und in Aquamount eingebettet.
Eine starke Expression des Tie-Proteins wurde in der Auskleidung der inneren Wand von Blutgefäßen bei beiden Hämangioblastomen (Fig. 4A, B) und in geringerem Maße bei Hämangiopericytomen (C-F) beobachtet. Die Mengen des Tie-Proteins unterschieden sich von Tumorgewebe zu Tumorgewebe erheblich und waren beispielsweise in einem locker texturierten Hämangiopericytom-Bereich (E, F) höher und in einer typischeren Tumorprobe geringer (C, D). Insgesamt war die Expression jedoch signifikant höher als die, die in normalem Cortex-Untersuchungsmaterial bereits analysiert worden war (23). Im Vergleich zur vWF-Immunfärbung (B, D, F) wurde Tie von Hämangiopericytom-Tumorzellen nicht exprimiert (C - F).
Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, daß Tie bei der Angiogenese in diesen beiden Gefäßtumoren eine Rolle spielen könnte.

BEISPIEL 17

Die in vivo-Aufnahme von gehen Tie gerichteten Antikörpern im Maus-Modell für Lewis-Lungencarcinom

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Aufnahme von radiomarkierten (¹²&sup5;I) MoAbs gegen Tie (10F11G6 und 3C4C7G6) in Hauptorgane der Maus und in Lungenmetastasen untersucht, um die Möglichkeit zu bestimmen, einen gegen Tie gerichteten MoAb zum Nachweis malignen Wachstums zu verwenden.
Die Radiomarkierung der Antikörper wurde wie folgt durchgeführt: 40 ug eines Antikörpers wurden unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens (Greenwood et al., vorstehend, 1963) mit 37 MBq Na-¹²&sup5;I markiert. Der markierte Antikörper wurde mit Sephadex-G25 aufgereinigt, was zu einer Hauptfraktion von 1,8 ml führte. Vor Untersuchungen zur biologischen Verteilung in vivo wurde die Affinität von drei radiomarkierten Antikörpern (3c4, 10F11, 7E8) in einem Zelltest verglichen (Lindmo, Nucl. Med., 21 (1984), 807-810). Alle Antikörper banden spezifisch an LE-GD-14-2-Zellen, bei denen es sich um transfizierte Maus-Endothelzellen handelt, die an ihrer äußeren Oberfläche den Tie-Rezeptor exprimieren, wobei die Bindung von 10F11 jedoch dreimal höher war als die der anderen (21 pMol/100 000 Zellen gegenüber 6-7 pMol/100 000 Zellen).
Bei Lungencarcinom-Experimenten verwendeten die Erfinder der vorliegenden Erfindung 6 bis 8 Wochen alte weibliche Mäuse (C57B1/6, Bomholtgaard, Dänemark), die Lewis-Lungencarcinom (LLC1/2)-Transplantate aufwiesen, die durch intramuskuläre Injektion von 1-10 M Zellen in 0,25 ml pro Tier in eine rechte Gliedmaße gezüchtet worden waren.
Einen Tag vor der Injektion radiomarkierter Antikörper wurde bei den Mäusen eine Schilddrüsen-Blockierung eingeleitet und während des Experiments mit einer KI-Lösung (400 mg/100 ml) ad libidum fortgesetzt.
Die biologische Verteilung von ¹²&sup5;I-markierten, gegen Tie gerichteten Antikörpern wurde 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h nach intravenöser Injektion von 30 ng Antikörper in 20 mM PBS untersucht. Bei dem Antikörper 10F11 sind 14 Tiere untersucht worden, die Lungenmetastasen von Lewis-Lungencarcinom aufwiesen: eines nach 24 h, drei nach 48 h, drei nach 72 h, drei nach 96 h und vier nach 7 Tagen (vgl. Fig. 6). Bei dem Antikörper 3c4 sind Lungenmetastasen nur bei drei Tieren vorhanden gewesen: nach 24 h, nach 48 h und nach 120 h (vgl. Fig. 7).
Nach 48 h zeigt 3c4 keine Bindung an Metastasen in der Lunge (Gewebe/Blut = 0,07), während nach 96 h jedoch beide Antikörper an Metastasen des Lewis-Lungencarcinom-Modells binden, wobei die Gewebe/Blut- Verhältnisse bei 3C4C7G6 und 10F11G6 2,4 bzw. 2,8 betragen.
Die Aufnahme der Antikörper 3c4 und 10F11 in Lungenmetastasen ist ähnlich, beide Antikörper binden in vivo an Metastasen, wobei 10F11 jedoch stärker an Serum bindet: nach 48 h 20% ID/g bei 10F11 gegenüber 10% ID/g bei 3c4.

BEISPIEL 18

Serumproben-Analyse mittels eines IRMA-Tests

Serumproben von Nicht-Carcinom-Patienten und Carcinom-Patienten wurden mit einem immunradiometrischen (IRMA) Test vom Sandwich-Typ (Miles L. et al., Nature, 219 (1968), 186-189) gescreent, wobei die zum Einfangen verwendeten, gegen Tie gerichteten Antikörper in Polystyrol-Röhrchen beschichtet wurden und die sekundären, gegen Tie gerichteten Antikörper unter Verwendung des vorstehend erwähnten Chloramin-T-Verfahrens mit ¹²&sup5;I-radiomarkiert wurden. Das rekombinante Tie-Protein wurde als Standard- Präparat zur Bestimmung der Antigen-Konzentration in den Serumproben verwendet. Die Konzentration der angewendeten großen Menge des Standardpräparats wurde unter Verwendung der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Zur Erstellung der Standardkurve wurde eine Antigen- Verdünnungsreihe verwendet, wobei die Konzentrationen des Tie-Antigens 0 ug/l, 18 ug/l, 36 ug/l, 72 ug/l, 144 ug/l, 720 ug/l und 3600 ug/l betrugen. Die Standardkurve von vier verschiedenen Paaren von beschichtetem Antikörpermarkiertem Antikörper ist in Fig. 9 gezeigt.
Mit Hilfe dieses Tests wurden sowohl Serumproben von Patienten mit Brustkrebs, Ovarialcarcinom und verschiedenen Lungenkrebs-Typen als auch Proben von Nicht-Krebs-Patienten gescreent. Die Patienten, bei denen in den Lungen neue Metastasen wuchsen, zeigten bei diesem Test erhöhte Werte. Patienten mit einer stabil verlaufenden Krankheit zeigen ähnliche Werte wie Nicht-Krebs-Patienten. Die nachgewiesenen Antigen-Konzentrationen im Serum von 20 Nicht-Krebs-Patienten und von drei Krebs-Patienten, die frische neue Metastasen aufwiesen, sind in Fig. 10 gezeigt. Von dem Patienten mit SCLC wurden jeweils im Abstand von ein bis zwei Monaten 6 Proben erhalten und von der Patientin mit Ovarialcarcinom und Becken-Metastasen 5 Proben. Von der Patientin mit Brustkrebs und neuen Lungenmetastasen wurden zwei Proben erhalten. Das in Fig. 10 verwendete Paar von beschichtetem Antikörpermarkiertem Antikörper umfaßte 3C4C7G6/10F11G6, wobei das Paar entsprechend der Standardkurve eine höhere Sensibilität aufwies (> 5 ug/l).

Claims

1. Monoclonaler Antikörper, der gegen die extrazellulären Teile einer Tie- Rezeptor-Tyrosinkinase gerichtet ist, wobei der Antikörper der monoclonale Antikörper anti-Tie-3C4C7G6 ist, der von der Hybridomzellinie, die unter der DSM-Hinterlegungsnummer ACC2159 hinterlegt ist, produziert wird.

2. Hybridomzellinie, die den monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 produziert, wobei die Hybridomzellinie unter der DSM-Hinterlegungsnummer ACC2159 hinterlegt ist.

3. Nachweisbar markierter Antikörper nach Anspruch 1.

4. Nachweisbar markierter Antikörper nach Anspruch 3, wobei die nachweisbare Markierung aus der Gruppe bestehend aus Radioisotopen, Fluorochromen, Farbstoffen, Enzymen und Biotin ausgewählt ist.

5. Humanisierter monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei eine komplementaritätsbestimmende Region der leichten und der schweren Kette des monoclonalen Maus-Antikörpers mit der variablen Region eines menschlichen Antikörpers fusioniert ist, und wobei die Konformation der komplementaritätsbestimmenden Region des Maus-Antikörpers erhalten ist.

6. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 5, der mit einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus cytotoxischen Agenzien, cytostatischen Arzneistoffen und Glycoproteinen konjugiert ist.

7. Verfahren zum Nachweis von Tie in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte:

(a) Inkubation einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Tie enthält, mit dem nachweisbar markierten Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von Tie gerichtet ist, nach Anspruch 3 oder 4;

(b) Waschen der Probe; und

(c) Nachweis des Vorhandenseins des nachweisbar markierten Antikörpers in der Probe.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Lösung, die Blutzellen oder Gewebezellen enthält, und einer festen Gewebeprobe.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Leukämiezellen und Knochenmarkszellen.

10. Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, die durch die Proliferation von Endothel-Zellen gekennzeichnet sind, umfassend die Schritte:

(a) Erhalten einer Gewebeprobe von einem Patienten, bei dem eine Krankheit vermutet wird, die durch die Proliferation von Endothel-Zellen gekennzeichnet ist;

(b) Inkubation dieser Gewebeprobe mit dem nachweisbar markierten Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von Tie gerichtet ist, nach Anspruch 3 oder 4;

(c) Waschen der Gewebeprobe; und

(d) Nachweis des Vorhandenseins des nachweisbar markierten anti-Tie- Antikörpers in der Gewebeprobe.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus neoplastischen Krankheiten wie Leukämie, Krankheiten, die Tumorangiogenese umfassen, Wundheilung, thromboembolische Krankheiten, Atherosklerose und entzündlichen Erkrankungen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus megakaryoblastischer Leukämie, Gliom, Meningeom, metastatischem Melanom, Hemangioblastom und Hemangiopericytom.

13. Verwendung des nachweisbar markierten Antikörpers, der gegen den extrazellulären Teil von Tie gerichtet ist, nach Anspruch 3 oder 4 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Abbildung von Gefäßneubildung in einem Organismus.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der markierte Antikörper mit 99m- Technetium markiert ist.

15. Verwendung nach Anspruch 13 und 14, wobei die Abbildung durch eine gamma-Kamera oder mit "Single Photon Emission Computerized Tomography" (SPECT) erfolgt.

16. Verfahren zur Diagnose und/oder Überwachung des Stadiums von Krebs, umfassend die Schritte:

(a) Erhalten einer Serumprobe von einem Patienten, bei dem eine Krankheit vermutet wird, die durch die Proliferation von Endothel-Zellen gekennzeichnet ist;

(b) Inkubation der Serumprobe mit dem nachweisbar markierten Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von Tie gerichtet ist, nach Anspruch 3 oder 4; und

(c) Nachweis des Vorhandenseins des nachweisbar markierten anti-Tie- Antikörpers in der Serumprobe.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das zu überwachende Stadium durch Metastasen gekennzeichnet ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Nachweisschritt über einen "Sandwich"-Test erfolgt.

19. Arzneimittel umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers, der gegen den extrazellulärenTeil von Tie gerichtet ist, nach Anspruch 1 oder von Derivaten davon in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Träger.

20. Arzneimittel nach Anspruch 19, wobei die wirksame Menge eines anti-Tie- Antikörpers in einem Bereich von etwa 1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml liegt.

21. Verwendung des Antikörpers, der gegen den extrazellulären Teil von Tie gerichtet ist, nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung der Symptome einer Krankheit, die durch das abnormale Wachstum von Endothel-Zellen gekennzeichnet ist.