DE102005009099A1

DE102005009099A1 - Proteinbindende Camptothecin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE102005009099A1
Application number: DE102005009099A
Authority: DE
Inventors: Felix Dr. Kratz; André Dr. Warnecke; Björn Schmid
Original assignee: KTB Tumorforschungs GmbH
Current assignee: KTB Tumorforschungs GmbH
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2006-08-31
Also published as: WO2006092230A3; WO2006092230A2

Abstract

Die Erfindung betrifft Camptothecin-Peptid-Derivate, die eine proteinbindende Gruppe enthalten und enzymatisch im Körper unter Freisetzung des Wirkstoffs oder eines niedermolekularen Wirkstoff-Derivates spaltbar sind.

Description

Die Erfindung betrifft Camptothecin-Peptid-Derivate, die eine proteinbindende Gruppe enthalten und unter Beteiligung der Cathepsine B und/oder D enzymatisch im Körper unter Freisetzung des Wirkstoffs oder eines niedermolekularen Wirkstoff-Derivates spaltbar sind.

Camptothecin (CPT) ist ein Alkaloid mit tumorhemmenden Eigenschaften (Wall M. E., et al. J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888–3890), dessen Derivate wie Topotecan oder Irinotecan zur Behandlung verschiedener Krebserkrankungen eingesetzt werden (Kollmannsberger C., et al. Oncology 1999, 56, 1–12, Rothenberg M. L. Oncologist 2001, 6, 66–80). Jedoch sind Therapien mit diesen Arzneistoffen von Nebenwirkungen begleitet. Um das Nebenwirkungsprofil und die Wirksamkeit von CPT bzw. CPT-Derivaten zu verbessern, wurden makromolekulare Transportformen von CPT durch Kopplung des Wirkstoffs an synthetische Polymere wie Poly(ethylenglykol) (Greenwald R. B., et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 551–562, Conover C. D., et al. Anti-Cancer Drug Design 1999, 14, 499–506), HPMA-Copolymere (Fraier D., et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 22, 505–514) oder HPMA-Copolymere in Verbindung mit Peptid-Spacern entwickelt (Caiolfa V. R., et al. J. Controlled Release 2000, 65, 105–119, Zamai M., et al. Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 29–40).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Prodrugs von CPT zu schaffen, die CPT oder CPT-Derivate im Tumor freisetzen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Camptothecin-Peptid-Derivate der allgemeinen Formel

worin R₁ = H oder OH, R₂ = H, NH₂, NO₂ oder N,N-Dimethylaminomethyl, R₃ = H oder Ethyl, R₄ = H, Alkyl oder Aryl, R₅ = H, Alkyl oder Aryl, von denen die beiden letztgenannten gegebenenfalls substituiert sein können, P₁-P₄ = L- oder D-Aminosäuren, X_aa eine löslichkeitsvermittelnde Aminosäure, n = 0 bis 3, m = 1 bis 3, k = 0 bis 5, p = 0 bis 6 bedeuten und PM eine proteinbindende Gruppe ist.

Eine integrierte hydrolytisch oder enzymatisch spaltbare Sollbruchstelle erlaubt hierbei eine kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs oder eines Aminoacyl-Wirkstoff-Derivates in vivo, sodass Camptothecin-Derivate der vorliegenden Erfindung Prodrugs darstellen.

Die erfindungsgemäßen CPT-Derivate sind aus einer antitumoral wirksamen Camptothecin-Komponente, einem Spacermolekül, einer Peptidkette und einem heterobifunktionellen Crosslinker aufgebaut. Im Folgenden wird dieser Aufbau näher erläutert:

Die antitumoral wirksame CPT-Komponente ist ein Wirkstoff der allgemeinen Formel

worin
R₁ = H, OH
R₂ = H, NH₂, NO₂ oder N,N-Dimethylaminomethyl
R₃ = H, Ethyl
bedeuten, welcher eine freie 20-Hydroxygruppe aufweist. Bevorzugte Wirkstoffe sind Camptothecin, Topotecan, 10-Hydroxycamptothecin, 9-Aminocamptothecin und 9-Nitrocamptothecin.

Das Spacermolekül ist eine Aminocarbonsäure der allgemeinen Formel

in der
R₄ = H, Alkyl oder Aryl, bevorzugt H
R₅ = H, Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls substituiert, bevorzugt H oder Methyl
n = 0 bis 3
bedeuten.

Besonders bevorzugte Spacer sind 4-Aminobutansäure, 5-Aminopentansäure, 3-Aminopropansäure sowie L- und D-Alanin.

Die Peptidkette setzt sich aus einer durch die Cathepsine B und/oder D spaltbaren Sequenz sowie einer N-terminalen löslichkeitsvermittelnden Komponente zusammen und hat die allgemeine Formel

in der
P₁-P₄ = L- oder D-Aminosäuren
X_aa = eine Aminosäure mit basischer Seitenkette
bedeuten.

Die Aminosäuren P₁ und P₃ sind bevorzugt ausgewählt unter den Aminosäuren Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin und/oder Phenylalanin. Die Aminosäuren P₂ und P₄ sind bevorzugt ausgewählt unter den Aminosäuren Leucin, Isoleucin, Norleucin und/oder Phenylalanin.

Die löslichkeitsvermittelnde Gruppe Xaa ist bevorzugt ausgewählt unter den Aminosäuren Arginin, Lysin und Histidin. Eine besonders bevorzugte Gruppe ist Arginin.

Der heterobifunktionelle Crosslinker ist eine Carbonsäure mit einer proteinbindenden Gruppe der allgemeinen Formel

in der
k = 0 bis 5
p = 0 bis 6
PM = proteinbindende Gruppe
bedeuten.

Die proteinbindende Gruppe (PM) ist bevorzugt ausgewählt unter einer 2-Dithiopyridylgruppe, einer Halogenacetamidgruppe, einer Halogenacetatgruppe, einer Disulfidgruppe, einer Acrylsäureestergruppe, einer Monoalkylmaleinsäureestergruppe, einer Monoalkylmaleaminsäureamidgruppe, einer N-Hydroxysuccinimidylestergruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Aziridingruppe oder einer Maleinimidgruppe. Eine besonders bevorzugte proteinbindende Gruppe ist die Maleinimidgruppe.

Wirkstoff und Spacermolekül sind durch eine Esterbindung zwischen der 20-Hydroxygruppe des Wirkstoffs und einer Carboxylgruppe des Spacermoleküls verbunden. Die Bindung zwischen Spacermolekül und der Crosslinker-Peptid-Einheit besteht aus einer Amidbindung zwischen der Aminogruppe des Spacermoleküls und der C-terminalen Carboxylgruppe der Crosslinker-Peptid-Einheit. Die Bindung zwischen Crosslinker und der Peptidkette besteht aus einer Amidbindung zwischen dem N-Terminus der Peptidkette und der Carboxylgruppe des Crosslinkers.

Eine wesentliche Eigenschaft der erfindungsgemäßen CPT-Derivate besteht darin, dass die Bindungen zwischen Wirkstoff und Spacermolekül sowie zwischen Spacermolekül und. dem Crosslinker hydrolytisch und/oder enzymatisch unter Beteiligung der Cathepsine B und/oder D spaltbar sind, wodurch eine kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs oder eines Aminoacyl-Wirkstoff-Derivates in Tumorgewebe ermöglicht wird. Die Cathepsine B und D werden in vielen humanen Tumoren überexprimiert, wodurch sie einen idealen Angriffspunkt für eine Targetorientierte, enzymatische Aktivierung von Prodrugs darstellen (Yan, S., et al. Biol. Chem. 1998, 2, 113–123, Leto, G., et al. Clin. Exp. Metastasis 2004, 91–106). Des Weiteren zeigen die erfindungsgemäßen CPT-Derivate eine rasche Spaltung in experimentellen Tumorhomogenaten (siehe Beispiel 5).

Die Herstellung der erfindungsgemäßen CPT-Derivate erfolgt bevorzugt durch Kondensation von Camptothecin-Derivaten der allgemeinen Formel

in der
R₁ = H oder OH
R₂ = H, NH₂, NO₂ oder N,N-Dimethylaminomethyl
R₃ = H oder Ethyl
bedeuten, mit Spacern der allgemeinen Formel

worin
R = eine dem Fachmann geläufige Schutzgruppe für Amine, bevorzugt Boc oder Fmoc
R₄ = H, Alkyl oder Aryl, bevorzugt H
R₅ = H, Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls substituiert, bevorzugt H oder Methyl
n = 0 bis 3
bedeuten.

Dabei werden als Reagenzien zur Aktivierung der Carboxylgruppe des Spacers vorzugsweise N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIPC), (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat (BOP), O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat (HATU) oder 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen wie z. B. Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) und/oder Scandium(III)trifluormethansulfonat eingesetzt. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in einem polar-aprotischen organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Dichlormethan, N,N-Dimethylformamid und Tetrahydrofuran. Die Umsetzungen werden zweckmäßig bei Temperaturen zwischen –10°C und Raumtemperatur durchgeführt, wobei die Reaktionszeit normalerweise zwischen 30 Minuten und 48 Stunden liegt. Die Aufarbeitung kann z. B. durch Umkristallisation aus Methanol oder Ethanol, oder durch Säulenchromatographie z. B. an Kieselgel erfolgen. Hierbei verwendete Laufmittel sind bevorzugt Chloroform-Methanol-Gemische, die gegebenenfalls Zusätze von Aminen oder Carbonsäuren enthalten können.

Anschließend wird die Schutzgruppe der Amino-Funktion entfernt. Diese Abspaltung kann z. B. durch Behandlung mit Trifluoressigsäure/Dichlormethan-Gemischen oder Piperidin erreicht werden. In einer für das Verfahren bevorzugten Ausführungsweise wird die Boc-geschütze Prodrugvorstufe 30 min mit Trifluoressigsäure/Dichlormethan 1:1 behandelt und das Produkt durch Fällung mit Diethylether isoliert.

Danach wird die erhaltene Prodrugvorstufe, der allgemeinen Formel

worin
R₁ = H oder OH
R₂ = H, NH₂, NO₂ oder N,N-Dimethylaminomethyl
R₃ = H oder Ethyl
R₄ = H, Alkyl oder Aryl, bevorzugt H
R₅ = H, Alkyl oder Aryl, gegebenenfalls substituiert, bevorzugt H, Methyl
n = 0 bis 3
bedeuten, durch Kondensation umgesetzt mit einer Crosslinker-Peptid-Einheit der allgemeinen Formel

worin
m = 1 bis 3
k = 0 bis 5
p = 0 bis 6
PM = proteinbindende Gruppe
bedeuten.

Dabei werden als Reagenzien zur Aktivierung der Carboxylgruppe der Crosslinker-Peptid-Einheit vorzugsweise O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat (HATU), (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat (BOP), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIPC), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen wie z. B. N-Ethyldiisopropylamin (DIEA), Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) eingesetzt. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in einem polaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in N,N-Dimethylformamid. Die Umsetzungen werden zweckmäßig bei Temperaturen zwischen –10°C und Raumtemperatur durchgeführt, wobei die Reaktionszeit normalerweise zwischen 30 Minuten und 48 Stunden liegt. Die Aufarbeitung erfolgt z. B. durch Säulenchromatographie bevorzugt an C₁₈-RP-Kieselgel. Bevorzugt verwendete Laufmittel sind hierbei Acetonitril-Wasser-Gemische, die gegebenenfalls Zusätze von Aminen oder Carbonsäuren, bevorzugt Trifluoressigsäure, enthalten können.

Nach einer bevorzugten Ausführungsweise wird Camptothecin zuerst mit Bocgeschützter 4-Aminobutansäure (Boc-GABA) und nachfolgender Abspaltung der Schutzgruppe zum Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)-Trifluoracetat umgesetzt, welches anschließend mit EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-OH (EMC = 6-Maleinimidocapronsäure) unter Benutzung von HATU als Kopplungsreagenz kondensiert wird (siehe Beispiel 1).

Durch die Verwendung löslichkeitsvermittelnder Arginingruppen lässt sich die Wasserlöslichkeit gegenüber CPT signifikant steigern. Solche Verbindungen weisen typischerweise eine gegenüber CPT um mehr als 400-fach gesteigerte Löslichkeit in isotonischer Kochsalzlösung auf (siehe Beispiel 2).

Die erfindungsgemäßen proteinbindenden Camptothecin-Derivate werden parenteral, bevorzugt intravenös appliziert. Dazu werden die erfindungsgemäßen CPT-Derivate als Lösungen, Feststoffe oder Lyophilisate, gegebenenfalls unter Verwendung üblicher Hilfsstoffe bereitgestellt. Solche Hilfsstoffe sind beispielsweise Polysorbate, Glucose, Lactose, Mannitol, Dextrane, Zitronensäure, Tromethamol, Triethanolamin, Aminoessigsäure und/oder synthetische Polymere. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen CPT-Derivate in einem isotonischen Puffer gelöst appliziert. Die Löslichkeit des CPT-Derivates kann gegebenenfalls durch pharmazeutische Lösungsmittel wie etwa 1,2-Propandiol, Ethanol, Isopropanol, Glycerol und/oder Poly(ethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 200 bis 600 g/mol, bevorzugt Poly(ethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 600 g/mol, und/oder Löslichkeitsvermittler wie z. B. Tween 80, Cremophor oder Polyvinylpyrrolidon verbessert werden.

Ein wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen CPT-Derivate liegt in einer raschen kovalenten Bindung an Serumproteine über die proteinbindende Gruppe, wodurch eine makromolekulare Transportform des Wirkstoffs generiert wird. Von Serumproteinen wie Transferrin, Albumin und LDL ist eine erhöhte Aufnahme in Tumorgewebe bekannt (Kratz F.; Beyer U. Drug Delivery 1998, 5, 281–299), sodass diese im Rahmen der Erfindung als endogene Träger für Zytostatika herangezogen werden können. Ein besonders bevorzugtes Serumprotein ist zirkulierendes Humanserumalbumin (HSA), das mit einer durchschnittlichen Konzentration von 30 bis 50 g/L die Hauptprotein-Komponente des menschlichen Blutes bildet (Peters T. Adv. Protein Chem. 1985, 37, 161–245) und eine freie Cysteingruppe (Cystein-34-Gruppe) an der Oberfläche des Proteins aufweist, welche zur Anbindung von thiolbindenden Gruppen wie Maleinimiden oder Disulfiden geeignet ist (WO 00/76551). Dass das erfindungsgemäße Maleinimid-funktionalisierte CPT-Derivate schnell und selektiv an HSA binden, zeigt Beispiel 3. Die Reaktion der neuen CPT-Derivate mit Serumproteinen kann auch extrakorporal durchgeführt werden, z. B. mit einer zur Infusion vorgesehenen Albumin-, Blut- oder Serummenge.

Gegenüber Camptothecin-Konjugaten mit synthetischen Polymeren als Trägersystemen besitzen die der Erfindung zugrunde liegenden CPT-Peptid-Derivate den Vorteil, chemisch eindeutig definiert zu sein.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung näher.

In der Zeichnung stellen dar:

1 ein Chromatogramm von humanem Blutplasma; bei λ = 370 nm ist lediglich eine geringfügige Absorption zu beobachten.

2 ein Chromatogramm von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT, das zuvor 30 min mit humanem Plasma inkubiert wurde (Detektion bei λ = 280 und 370 nm).

3 ein Chromatogramm des HSA-Konjugats von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT nach Spaltung durch Cathepsin B.

4 ein Chromatogramm des HSA-Konjugats von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT nach Spaltung in HT29-Kolorektaltumor-Homogenat bei pH 5,0.

5 ein Chromatogramm des HSA-Konjugats von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT nach Spaltung in HT29-Kolorektaltumor-Homogenat bei pH 7,4.

Beispiel 1 Herstellung von Camptothecin-20-O-(L-Alaninat)-Trifluoracetat
Zu einer Suspension von Boc-L-Alanin (489 mg, 2.58 mmol), Camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (330 mg, 2.58 mmol) sowie Scandium(III)trifluormethansulfonat (256 mg, 1.46 mmol) in 30 mL Dichlormethan wird unter Stickstoffatmosphäre bei –8°C N,N'-Diisopropylcarbodiimid (426 μL, 2.76 mmol) gegeben und 30 Minuten gerührt. Anschließend wird die Reaktionsmischung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, die Feststoffe abfiltriert und das Filtrat jeweils einmal mit 60 mL 0.1 N HCl, 0.1 M NaHCO₃ und destilliertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 30 minütige Behandlung mit 1 mL Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1) erhält man 292 mg Camptothecin-20-O-(L-alaninat)-Trifluoracetat als blassgelben Feststoff.
Beispiel 2 Herstellung von Camptothecin-20-O-(3-Aminopropanoat)-Trifluoracetat
Zu einer Lösung von Boc-3-Aminopropansäure (489 mg, 2.87 mmol) in 100 mL Dichlormethan werden bei 0°C Camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (210 mg, 1.72 mmol) sowie N,N'-Diisopropylcarbodiimid (420 μL, 2.87 mmol) unter Stickstoffatmosphäre gegeben und die entstandene Suspension sechzehn Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine klare Lösung entsteht. Anschließend wird zweimal mit 100 mL 0.1 N HCl gewaschen, die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 30 minütige Behandlung mit 1 mL Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1) erhält man 310 mg Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)-Trifluoracetat als blassgelben Feststoff.
Beispiel 3 Herstellung von Camptothecin-20-O-[(((((((6-maleinimidohexanoyl)arginyl)arginyl)alanyl)leucyl)alanyl)leucyl)-4-aminobutanoat] (abgekürzt EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT)
Zu einer Lösung von Boc-4-aminobutansäure (583 mg, 2.87 mmol) in 100 mL Dichlormethan werden bei 0°C Camptothecin (300 mg, 0.861 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (210 mg, 1.72 mmol) sowie N,N'-Diisopropylcarbodiimid (420 μL, 0.861 mmol) unter Stickstoffatmosphäre gegeben und die entstandene Suspension sechzehn Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei eine klare Lösung entsteht. Anschließend wird zweimal mit 100 mL 0.1 N HCl gewaschen, die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisation des Rückstands aus Methanol und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 30 minütige Behandlung mit 1 mL Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1) erhält man 310 mg Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)-Trifluoracetat als blassgelben Feststoff.
Anschließend wird zu einer Lösung von Camptothecin-20-O-(4-aminobutanoat)-Trifluoracetat (43 mg, 0.079 mmol), [((((6-(Maleinimidohexanoyl)arginyl)arginyl)alanyl)leucyl)alanyl]leucin-Trifluoracetat (100 mg, 0.087 mmol) und N-Ethyldiisopropylamin (54 μL, 0.316 mmol) in 1.5 mL N,N-Dimethylformamid, O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat (33 mg, 0.087 mmol) unter Stickstoffatmosphäre gegeben und 35 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag im Vakuum getrocknet. Die Reinigung des Rohprodukts erfolgt durch präparative C₁₈-RP-HPLC (Acetonitril/Wasser 40:60, 0.1% Trifluoressigsäure). Nach Lyophilisation erhält man 96 mg der Zielverbindung als leuchtend gelben Feststoff.
ESI-MS (4.0 kV, MeOH): m/z (%) 1307.6 ([M + H]⁺, 100), 1329.5 ([M + Na]⁺, 96) HPLC-Reinheit (λ = 370 nm, C₁₈-RP-Säule, Acetonitril/Wasser 40:60, 0.1% TFA): > 95%
Beispiel 4 Löslichkeit von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in isotonischer Kochsalzlösung.
Ergebnis:
Die erfindugsgemäßen CPT-Derivate zeigen somit gegenüber CPT eine um mehr als 400-fach gesteigerte Löslichkeit in isotonischer Kochsalzlösung.
Beispiel 5
Bindung von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT an HSA im Humanplasma
Humanplasma wurde durch Chromatographie an einer C₁₈-RP-HPLC-Säule (Symmetry^® 300-5 4.6 × 250 mm von Waters) durch Gradientenelution (Fluss: 1.2-1.8 mL/min; Eluent A: 30% 200 mM K₂HPO₄ pH 7, 70% Acetonitril; Eluent B: 72.5% 200 mM K₂HPO₄ pH 7, 28.5% Acetonitril; Gradient: 26 min Eluent B isokrat., 15 min 0–100% Eluent A linear) in seine Proteinbestandteile aufgetrennt und bei 254 nm detektiert (siehe 1).
Nun werden 1.56 mg EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in 200 μL Tris-Puffer (pH 7.4) bei Raumtemperatur gelöst (5 mM Lösung) und 10 μL dieser Lösung mit 490 μL Humanplasma 30 min lang bei 37°C inkubiert und die Probe anschließend auf die C₁₈-RP-HPLC-Säule aufgetragen (Methode s. oben). Bei Messung der Absorption bei 370 nm zeigt sich, dass der überwiegende Teil von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT an Albumin gebunden vorliegt (siehe 2).
Beispiel 6
Stabilität von HSA-Konjugaten von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT- in Humanplasma
Die Plasmastabilität der durch Inkubation von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT mit humanem Blutplasma generierten HSA-Konjugate wird mit der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Methode durch Messung der Abnahme der Peakflächen (λ = 370 nm) bestimmt:
Konjugat mit EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT: nach 48 h sind noch > 95% des HSA-Konjugats vorhanden.
Somit zeigt das Konjugat eine gute Stabilität in Humanplasma.
Beispiel 7
Enzymatische Spaltung von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT durch Cathepsin B
1.56 mg EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT werden in 200 μL Tris-Puffer pH 7.4 (für Cathepsin B) gelöst. 10 μL dieser Lösung werden über 30 Minuten mit 40 μL einer 20%igen HSA-Lösung bei 37°C inkubiert. Nachfolgend werden 10 μL Cathepsin-B-Lösung (71.7 μg/ml) zugegeben und jeweils mit Puffer auf ein Volumen von 500 μL verdünnt.
Die Bestimmung der Spaltprodukte erfolgt mit der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Methode (3).
Ergebnis:
Nach nur zweistündiger Spaltung mit Cathepsin B ist nach einer Retentionszeit von 13 Minuten ein niedermolekulares CPT-Derivat, sowie nach 5 Minuten CPT-GABA erkennbar.
Beispiel 8
Enzymatische Spaltung von EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT in HT29-Kolorektaltumor-Homogenat
1.56 mg EMC-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu-GABA-CPT werden in 200 μL Tris-Puffer pH 7.4 bzw. Natriumacetat-Puffer pH 5.0 gelöst. 10 μL dieser Lösung werden über 30 Minuten mit 40 μL einer 20%igen HSA-Lösung bei 37°C inkubiert. Nachfolgend werden 10 μL HT29-Kolorektaltumor-Homogenat zugegeben und mit Puffer auf ein Volumen von 500 μL verdünnt.
Herstellung des Tumor-Homogenats: Das Tumormaterial wird mittels eines Skalpells stark zerkleinert und 200 mg der Masse werden mit 800 μL Puffer (Tris-Puffer pH 7.4 bzw. Natriumacetat-Puffer pH 5.0) unter Zusatz von 3–4 Glasperlen im Schüttler homogenisiert. Anschließend wird bei 4°C zentrifugiert und der Überstand auf 200 μL aliquotiert.
Die Bestimmung der Spaltprodukte erfolgt mit der in Beispiel 3 beschriebenen HPLC-Methode (4 und 5).
Ergebnis:
Bei pH 5.0 ist nach 2 Stunden CPT-GABA erkennbar.
Bei pH 7.4 ist nach 2 Stunden ebenfalls CPT-GABA sowie nach 24 Stunden CPT als Spaltprodukt erkennbar.
Somit ist eine Aktivierung des erfindungsgemäßen CPT-Derivates im experimentellen Tumor-Homogenat in seine Wirkformen nachgewiesen.

Claims

Ein Camptothecin-Derivat der Formel I:
worin R₁ = H oder OH R₂ = H, NH₂, NO₂ oder N,N-Dimethylaminomethyl R₃ = H oder Ethyl R₄ = H, Alkyl oder Aryl R₅ = H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl P₁, P₃ = Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin und/oder Phenylalanin P₂, P₄ = Leucin, Isoleucin, Norleucin und/oder Phenylalanin X_aa = Aminosäure mit basischer Seitenkette n = 0 bis 3 m = 1 bis 3 k = 0 bis 5 p = 0 bis 6 PM eine proteinbindende Gruppe bedeutet.
Camptothecin-Derivat gemäß Anspruch 1, wobei PM eine Maleinimidgruppe, eine 2-Dithiopyridylgruppe, eine Halogenacetamidgruppe, eine Halogen acetatgruppe, eine Disulfidgruppe, eine Acrylsäureestergruppe, eine Monoalkylmaleinsäureestergruppe, eine Monoalkylmaleaminsäureamidgruppe, eine N-Hydroxysuccinimidylestergruppe, eine Isothiocyanatgruppe oder eine Aziridingruppe ist, die gegebenenfalls substituiert sein kann.
Camptothecin-Derivat nach Anspruch 2, wobei PM eine Maleinimidgruppe ist, die gegebenenfalls substituiert sein kann.
Camptothecin-Derivat nach Anspruch 1, worin R₁ = OH, R₂ = N,N-Dimethylaminomethyl und R₃ = H ist.
Camptothecin-Derivat nach Anspruch 3, worin R₁ = H, R₂ = H und R₃ = H ist.
Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R₄ = H, R₅ = H, Methyl, Hydroxymethyl, Phenylmethyl, 4-Hydroxyphenylmethyl, Imidazolylmethyl, Indolylmethyl, CH(CH₃)₂, CH₂CH(CH₃)₂, CH(CH₃)CH₂CH₃, CH(OH)CH₃, CH₂COOH, CH₂CH₂COOH, CH₂CONH₂, CH₂CH₂CONH₂, CH₂(CH₂)₃NH₂, CH₂CH₂SCH₃ oder CH₂(CH₂)₂NHC(NH)NH₂ ist.
Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin P₁ und P₃ gleich oder unterschiedlich sind und Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin oder Phenylalanin bedeuten.
Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin P₂ und P₄ gleich oder unterschiedlich sind und Leucin, Isoleucin, Norleucin oder Phenylalanin bedeuten.
Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin X_aa = Arginin, Lysin oder Histidin bedeuten.
Camptothecin-Derivat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin n = 0 bis 3, m = 1 bis 3, k = 0 bis 5 und p = 0 bis 6 ist.
Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin X_aa = Arginin und m = 2 bedeuten.
Camptothecin-Derivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin P₁, P₃ = Alanin und P₂, P₃ = Leucin bedeuten.
Verfahren zur Herstellung von Camptothecin-Derivaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Camptothecin-Derivat der allgemeinen Formel II
in der R₁ = H oder OH R₂ = H, NH₂, NO₂ oder N,N-Dimethylaminomethyl R₃ = H oder Ethyl bedeuten, wobei etwaige nukleophile Gruppen an R₁, R₂ und R₅ gegebenenfalls durch geeignete Schutzgruppen geschützt vorliegen, mit einem Spacer der allgemeinen Formel III
in der R = Boc-Schutzgruppe oder andere gängige Aminoschutzgruppe R₄ = H, Alkyl oder Aryl R₅ = H, Alkyl oder Aryl n = 0 bis 3 PM = eine proteinbindende Gruppe bedeuten, in Gegenwart von Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien und unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen umgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat oder 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid eingesetz werden.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Katalysatoren bzw. Hilfsbasen Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) und/oder Scandium(III)trifluormethansulfonat eingesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Camptothecin mit einer Boc-Aminocarbonsäure unter Einsatz von N,N'-Diisopropylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin umgesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Camptothecin mit Boc-4-Aminobutansäure unter Einsatz von N,N'-Diisopropylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin umgesetzt wird.
Verfahren zur Herstellung von Camptothecin-Derivaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Camptothecin-O-acyl-Derivat der allgemeinen Formel IV
in der R₁ = H oder OH R₂ = H, NH₂, NO₂ oder N,N-Dimethylaminomethyl R₃ = H oder Ethyl R₄ = H, Alkyl oder Aryl R₅ = H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl n = 0 bis 3 bedeuten, wobei etwaige nukleophile Gruppen an R₁, R₂ und R₅ gegebenenfalls durch geeignete Schutzgruppen geschützt vorliegen, mit einer Crosslinker-Peptid-Einheit der allgemeinen Formel V
in der P₁ und P₃ gleich oder unterschiedlich sind und Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Valin oder Phenylalanin bedeuten P₂ und P₄ gleich oder unterschiedlich sind und Leucin, Isoleucin, Norleucin oder Phenylalanin bedeuten X_aa = Arginin, Lysin oder Histidin m = 1 bis 3 k = 0 bis 5 p = 0 bis 6 PM eine proteinbindende Gruppe bedeutet, in Gegenwart von Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien und unter Zusatz gängiger Katalysatoren bzw. Hilfsbasen umgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbonsäure-Aktivierungsreagenzien N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, (Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium-Hexafluorophosphat, 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid oder O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Katalysatoren bzw. Hilfsbasen N-Ethyldiisopropylamin (DIEA), Trialkylamine, Pyridin, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) oder Hydroxybenzotriazol (HOBt) eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Carbonsäure-Aktivierungsreagenz O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat in Verbindung mit N-Ethyldiisopropylamin (DIEA) verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein Camptothecin-O-acyl-Trifluoracetat mit [((((6-(Maleinimidohexanoyl)arginyl)arginyl)alanyl)leucyl)alanyl]leucin-Trifluoracetat unter Einsatz von O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat in Verbindung mit N-Ethyldiisopropylamin (DIEA) umgesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass Camptothecin-O-4-aminobutanoat-Trifluoracetat mit [((((6-(Maleinimidohexanoyl)arginyl)arginyl)alanyl)leucyl)alanyl]leucin-Trifluoracetat unter Einsatz von O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat in Verbindung mit N-Ethyldiisopropylamin (DIEA) umgesetzt wird.
Arzneimittel enthaltend ein Camptothecin-Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfsstoffen und/oder pharmazeutischen Lösungsmitteln.
Verwendung eines Camptothecin-Derivates nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Behandlung von Krebskrankheiten.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krebskrankheiten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 in eine therapeutisch annehmbare Lösung überführt.