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KR20250164708A - 항 cd25 항체 및 항 cd25 항체-약물 콘주게이트 - Google Patents

항 cd25 항체 및 항 cd25 항체-약물 콘주게이트

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Publication number
KR20250164708A
KR20250164708A KR1020257030060A KR20257030060A KR20250164708A KR 20250164708 A KR20250164708 A KR 20250164708A KR 1020257030060 A KR1020257030060 A KR 1020257030060A KR 20257030060 A KR20257030060 A KR 20257030060A KR 20250164708 A KR20250164708 A KR 20250164708A
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KR
South Korea
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antibody
amino acid
seq
acid sequences
antigen
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020257030060A
Other languages
English (en)
Inventor
고타 사와노
유키코 도케
요시타카 이스미
료타 마츠모토
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Publication of KR20250164708A publication Critical patent/KR20250164708A/ko
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Abstract

CD25 에 대해 결합하는 내재화 활성을 갖는 항체, 그 항체를 포함하는 항종양 활성을 갖는 항체-약물 콘주게이트, 그 항체-약물 콘주게이트를 사용한 종양에 대한 치료 효과를 갖는 의약품, 및, 당해 항체, 항체-약물 콘주게이트 또는 의약품을 사용한 종양의 치료 방법 등의 제공을 과제로 한다. (1) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다, (2) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다는 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, CD25 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편을 제공한다. 이 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낼 수 있다.

Description

항 CD25 항체 및 항 CD25 항체-약물 콘주게이트
본 발명은, CD25 에 결합하는 작용을 갖는 항 CD25 항체, 그 항 CD25 항체의 제조 방법, 그리고 그 항체를 포함하는 항체-약물 콘주게이트, 그 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 항종양제 등에 관한 것이다.
제어성 T 세포 (Treg) 는 CD4 양성 T 세포의 서브세트의 하나로서 면역 응답의 억제나 자기 면역 관용을 확립 및 유지하는 역할을 갖는 세포 집단이다 (비특허문헌 1). 말초의 CD4 양성 T 세포의 10 ％ 남짓을 차지하고, 마스터 전사 인자로서 Forkhead box P3 (FoxP3) 이 동정되어 있다 (비특허문헌 2). FoxP3 의 미스 변이를 일으키고 있는 scurfy 마우스에서는 CD4 양성 세포의 과잉 증식이나 사이토카인의 상승이 확인되었다 (비특허문헌 3, 4). 또 인간에서는 FoxP3 의 유전자에 변이가 일어나면 Treg 의 기능 부전에 의해 IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked) 증후군이라고 불리는 자기 면역 이상증이 일어나는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 5). 이러한 점에서 면역 관용에 있어서 Treg 는 중요한 역할을 하고 있다.
암은 사망 요인의 상위를 차지하기도 하는 질환 (비특허문헌 6) 이며, 암세포의 이상 증식에 의한 정상 조직에 대한 상해에 의해 치사적인 질환이 된다. 암세포의 특징으로서, 무질서한 세포 증식성, 아포토시스에 대한 저항성, 타조직에 대한 유주성 (遊走性) 등 (비특허문헌 7) 을 들 수 있다. 또, 암세포의 특징으로서, 암세포에 대한 면역 응답의 기피도 들 수 있다.
암세포는 유전자 불안정성으로부터 드라이버 변이뿐만 아니라 패신저 변이를 포함하는 유전자 변이가 축적되어 있다. 이 유전자 변이로부터 전사, 번역된 이상 단백질은 네오안티젠으로서 제시된다. 이 네오안티젠은 자기 항원과는 상이하기 때문에, 통상적이라면 면역 세포에 정상적인 자기 세포는 아닌 것으로 인식되고, 배제된다 (비특허문헌 8).
그러나, 암 미소 환경하에서는 TGF-β 나 IL-10 과 같은 면역 억제성의 사이토카인, PD-1 이나 PD-L1 과 같은 면역 억제 분자의 고발현, 면역 억제 세포의 침윤을 비롯한 다양한 형태로 면역을 억제하는 환경이 구축되고, 면역 세포에 의한 암세포의 배제가 일어나기 어렵게 되어 있는 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 9). 최근에는, 면역 체크포인트 저해제로서 항 PD-1 항체 등이 임상 시험에서 유망한 결과를 나타내고, 멜라노마나 non-small cell lung cancer (NSCLC) 를 비롯한 다종의 진행암으로 승인되어 있다 (비특허문헌 10, 11). 단, 면역 체크포인트 저해제에 의해 효과를 나타내는 환자가 한정되어 있으며, 그 이유 중 하나로서 전술한 면역 억제 세포 (특히 Treg) 는 종양 면역을 억제하는 주요한 세포인 것으로 생각되고 있다. 종양 내에 Treg 가 존재함으로써 이펙터 T 세포 (Teff) 나 세포 상해성 T 세포 (CTL) 의 기능이 억제되고, 암세포를 이물질로서 배제할 수 없게 됨으로써 병상의 악화에 기여한다. 종양 내에서의 Treg 와 CTL 의 밸런스는 예후와의 상관도 보고되어 있다 (비특허문헌 12).
CD25 (별명 : IL-2 수용체 α 사슬, Tac 항원) 는 세포 외에 2 개의 Sushi 도메인을 갖는 I 형 막관통형 단백질 (비특허문헌 13, 14) 로, IL-2 수용체 α 사슬로서 알려져 있다. CD25 는, T 세포의 분화나 증식을 비롯하여 다양한 역할을 갖는 인자로서 알려져 있는 IL-2 와 결합했을 때에 IL-2 시그널을 세포 내에 전달하는 역할을 갖는다 (비특허문헌 15). CD25 는 활성화 T 세포나 B 세포와 같은 한정된 면역 세포에 저레벨로 발현되고 (비특허문헌 16, 17), Treg 에서는 고발현인 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 18). 또, Treg 의 면역 억제 활성은 CD25 발현의 강약과 상관하는 것이 나타나 있다 (비특허문헌 18). Treg 에 있어서의 CD25 의 역할로는 Treg 의 생존에 IL-2 시그널이 필수인 것 (비특허문헌 19), IL-2 와 결합하여 IL-2 를 소비함으로써 다른 면역 세포에 IL-2 와 결합할 기회를 감소시키는 것 등이 보고되어 있다 (비특허문헌 19). 또, CD25 는 비호지킨 림프종과 같은 혈액암 세포에서의 발현도 보고되어 있다 (비특허문헌 20).
지금까지 몇 가지 항 CD25 항체가 제조되어 있다. 그 중에는, CD25 의 IL-2 시그널을 유지한 채로 결합할 수 있는 항체와 IL-2 시그널을 저해하여 결합하는 항체의 2 종류가 존재하고 있다. 예를 들어, IL-2 시그널을 저해하는 항체로서, Anti-Tac (항인간 CD25 항체) 등이 있고, IL-2 시그널을 저해하지 않는 항체로서, 7G7B6 (항인간 CD25 항체) 등이 있다. Anti-Tac 는, IL-2 의존적인 T 세포 증식을 저해하지만, 7G7B6 은, 저해하지 않는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 21). 또, IL-2 시그널을 저해하는 항체인 바실릭시맙은, T 세포를 통한 면역 반응을 억제한다고 여겨지고, 장기 이식에 있어서의 거절 반응의 예방에 사용되고 있다. 따라서, IL-2 시그널을 저해하는 항 CD25 항체는 면역의 활성화를 억제한다. 한편으로 IL-2 시그널을 저해하지 않는 항 CD25 항체는, T 세포를 통한 면역 반응을 억제하지 않는 것으로 생각된다 (비특허문헌 22).
지금까지 항마우스 CD25 항체를 사용한 연구가 보고되어 있다. 최근에는, 이들 항체를 사용하여 마우스 종양 모델에 있어서의 치료 효과와 그 효과가 종양 내의 Treg 의 제거와 Teff 의 활성화에 기초하는 것인 것을 시사하는 결과가 보고되어 있다 (비특허문헌 22). 인간의 종양 내에 있어서는 Treg 중에서도 면역 억제 활성 작용이 강한 Treg 가 존재하는 것이 보고되어 있고 (비특허문헌 23), 이 세포 집단은 CD25 를 강하게 발현하기 때문에, 종양 내의 Treg 를 목표로 하는 데에 있어서 CD25 는 유망한 표적이다.
항체-약물 콘주게이트 (ADC) 는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 세포 상해 활성을 갖는 약물을 결합시킨 화합물이다 (비특허문헌 24). 이 특징으로부터 표적 항원을 발현하고 있지 않은 세포에 대한 영향을 억제하면서, 표적 항원을 발현하고 있는 세포를 사멸시키는 것을 기대할 수 있다. 지금까지 ADC 는 암 영역에서의 치료약으로서 개발이 진행되어 오고 있으며, 예를 들어 항 HER2 모노클로날 항체에 데룩스테칸을 결합시킨 엔허투 (상표) (트라스투주맙 데룩스테칸) 가 HER2 양성의 진행, 재발 유방암의 치료에 사용되고 있다.
항체를 사용하여 표적 항원을 발현하고 있는 세포를 특이적으로 배제하는 메커니즘으로서 항체 의존성 세포 상해 활성 (ADCC) 과 항체 의존성 세포 탐식 활성 (ADCP) 이 알려져 있다. 이 작용에 착목하여, ADCC 작용을 증강시킨 항체 기술이 개발되었다 (비특허문헌 25). 이 ADCC 작용을 증강시킨 항인간 CCR4 항체 포텔리지오 (상표) (모가물리주맙) 는 한정된 T 세포 림프종에서 효과가 확인되어 있다 (비특허문헌 26). 한편으로, ADCC 작용을 증강시킨 항체의 고형암으로의 전개는 효과에 찬부 양론이 있다 (비특허문헌 27). 고형암으로의 전개가 진행되지 않는 이유로서 ADCC 작용을 발휘하는 주된 면역 세포인 NK 세포의 존재의 적음이 생각되고 있다 (비특허문헌 28).
이러한 점에서 CD25 를 표적으로 한 Treg 의 제거를 목표로 한 암 치료약으로의 응용이 생각되어 왔다. 그러나, 지금까지 고형암에 있어서의 종양 내의 Treg 를 선택적으로 제거할 수 있었다는 보고는 없으며, CD25 를 표적으로 한 ADCC enhanced Ab 인 RG-6292 나 항 CD25 항체에 pyrrolobenzodiazepine (PBD) 을 결합시킨 ADC 인 ADCT-301 이 고형암에서 임상 시험을 현재 실시 중이다.
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본 발명의 과제는, CD25 에 결합하는 항체, 그 항체를 포함하는 항종양 활성을 갖는 항체-약물 콘주게이트, 그 항체-약물 콘주게이트를 사용한 종양에 대한 치료 효과를 갖는 의약품, 및, 당해 항체, 항체-약물 콘주게이트 또는 의약품을 사용한 종양의 치료 방법 등을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 과제를 달성하기 위해 예의 검토한 결과, 본 발명에서 개시되는 특정한 항체가 CD25 에 결합하고, 항체-약물 콘주게이트용의 항체로서 유용한 것을 알아내었다. 또한 본 발명에서 개시되는 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는 의약으로서 유용한 것을 알아내었다.
본원 발명은 이하의 발명을 포함한다.
[1] 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
(1) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(2) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
[2] CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는, [1] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[3] CD25 가, 인간 CD25, 게잡이원숭이 CD25, 또는 마우스 CD25 인, [1] 또는 [2] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[4] CD25 가, 인간 CD25 또는 게잡이원숭이 CD25 인, [3] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[4-2] CD25 가 인간 CD25 인, [3] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[5] CD25 가 마우스 CD25 인, [3] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[5-2] CD25 에 대한 결합에 대해, 이하의 (1) ∼ (6) :
(1) 서열 번호 26 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 27 의 20 ∼ 476 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(2) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(3) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(4) 서열 번호 30 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 31 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(5) 서열 번호 32 의 21 ∼ 239 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 33 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 및
(6) 서열 번호 54 의 21 ∼ 239 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 55 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체
으로 이루어지는 군에서 선택되는 항체 중 적어도 어느 1 개와 경합 저해 활성을 갖는, [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[5-3] CD25 에 대한 결합에 대해, 이하의 (1) ∼ (3) :
(1) 서열 번호 26 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 27 의 20 ∼ 476 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(2) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 및
(3) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체
으로 이루어지는 군에서 선택되는 항체 중 적어도 어느 1 개와 경합 저해 활성을 갖는, [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[5-4] CD25 에 대한 결합에 대해, 이하의 (1) 및 (2) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 및
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체
중 적어도 어느 1 개와 경합 저해 활성을 갖는, [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[6] 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
(2) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고,
이하의 (3) ∼ (4) :
(3) 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(4) 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는,
항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, [1] ∼ [5-4] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[7] 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(2) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
로 이루어지는 군에서 선택되는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는,
[1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[8] 인간화되어 있는, [1] ∼ [7] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[9] 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(3) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및
(4) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역, 그리고,
이하의 (5) ∼ (8) :
(5) 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(6) 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(7) (5) ∼ (6) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및
(8) (5) ∼ (6) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역
을 포함하는, [1] ∼ [8] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[10] 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
중 어느 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역
을 포함하는, [1] ∼ [9] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[11] 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
중 어느 것을 포함하는, [1] ∼ [10] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[12] 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는, [11] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[13] 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는, [11] 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[14] 항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는, [1] ∼ [13] 중 어느 하나에 기재된 항체의 항원 결합 단편.
[15] 항원 결합 단편이 scFv 인, [1] ∼ [13] 중 어느 하나에 기재된 항체의 항원 결합 단편.
[15-2] 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 인간화 항체.
[15-3] 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 인간화 항체.
[15-4] 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 인간화 항체.
[15-5] 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 인간화 항체.
[15-6] 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편으로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
상기 CD25 는, 인간 CD25, 게잡이원숭이 CD25, 또는 마우스 CD25 이고,
상기 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
(2) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고,
이하의 (3) ∼ (4) :
(3) 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(4) 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[15-7] 이하의 (a) ∼ (d) 중 어느 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편으로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
상기 CD25 는, 인간 CD25 또는 게잡이원숭이 CD25 이고,
상기 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(3) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및
(4) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역, 그리고,
이하의 (5) ∼ (8) :
(5) 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(6) 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(7) (5) ∼ (6) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및
(8) (5) ∼ (6) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역
을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[15-8] 이하의 (a) ∼ (d) 중 어느 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편으로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
상기 CD25 는, 인간 CD25 또는 게잡이원숭이 CD25 이고,
상기 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
중 어느 것을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[16] [1] ∼ [15-8] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
[17] 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(2) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [16] 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[18] 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [16] 또는 [17] 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[19] 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [16] 또는 [17] 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[20] [16] ∼ [19] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
[21] [20] 에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
[22] 숙주 세포가 진핵 세포인 [21] 에 기재된 숙주 세포.
[23] [21] 또는 [22] 에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 당해 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편의 제조 방법.
[24] 중사슬 또는 경사슬이, N-결합형 당사슬의 부가, O-결합형 당사슬의 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말단 글루타민 혹은 N 말단 글루탐산의 피로글루탐산화, 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 갖는, [1] ∼ [15-8] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[25] 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는, [24] 에 기재된 항체.
[26] 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는, [25] 에 기재된 항체.
[26-2] 항체의 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는 항체인, [15-2] ∼ [15-8] 중 어느 하나에 기재된 인간화 항체.
[26-3] 결실되어 있는 아미노산이 리신인, [26-2] 에 기재된 인간화 항체.
[27] 중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, [24] 에 기재된 항체.
[28] 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키는 당사슬 수식을 갖는, [1] ∼ [15-8] 및 [24] ∼ [27] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
[29] [1] ∼ [15-8] 및 [24] ∼ [28] 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편에 약물이 결합되어 있는 항체-약물 콘주게이트.
[30] 약물이, 세포 상해 활성을 갖는 물질, 세포 상해 활성 화합물, 항종양 활성을 갖는 물질, 화학 요법제, 분자 표적약, 면역 활성화제, 면역 억제제, 독소, 광 감수성 물질, 진단용 약제, 단백질, 펩티드, 아미노산, 핵산, 항원, 비타민, 호르몬, 혈액 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 자기 면역 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 항염증 물질, 항균 물질, 항진균 물질, 항기생충 물질, 항바이러스 물질, 및 항마취 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, [29] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[31] 약물이 세포 상해 활성 화합물인, [30] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[32] 세포 상해 활성 화합물이 다음 식 :
[화학식 1]
으로 나타내는 세포 상해 활성 화합물인 [31] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[32-2] 항체와 약물이, 다음 식 :
-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n1-C(=O)-L-GGFG-NH-X-C(=O)-
으로 나타내는 구조의 링커를 개재하여 결합되어 있는, [29] ∼ [32] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, n1 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고, L 은, -NH-(CH2-CH2-O)n2-CH2-CH2-, 또는 단결합을 나타내고, n2 는, 1 내지 6 의 정수를 나타내고, X 는, 탄소수 1 ∼ 20 개의 직사슬 또는 분기 사슬의 알킬렌기 (사슬 중의 1 또는 2 이상의 메틸렌기는 산소 원자 또는 황 원자로 치환되어도 된다.) 를 나타낸다. 그 알킬렌기는, 그 구조의 일부로서 탄소수 1 ∼ 6 의 고리형 포화 탄화수소기를 갖고 있어도 된다. 항체는, -(Succinimid-3-yl-N) 의 말단에 있어서 결합되어 있다. 약물은, 다른 일방의 말단의 카르보닐기에 결합되어 있다. 상기 식 중 GGFG 는, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신으로 이루어지는 펩티드 결합으로 연결되어 있는 아미노산 서열을 나타낸다.
-(Succinimid-3-yl-N)- 는 다음 식 :
[화학식 2]
으로 나타내는 구조이고, 이것의 3 위치에서 항체와 결합하고, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합되어 있다.)
[33] 항체와 약물이, 다음 식 (a) ∼ (f) :
(a) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(b) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(c) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
(d) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
(e) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 및
(f) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 구조의 링커를 개재하여 결합되어 있는, [29] ∼ [32-2] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, 항체는, -(Succinimid-3-yl-N) 의 말단에 있어서 결합되어 있다. 약물은, 다른 일방의 말단의 카르보닐기에 결합하고, 그것이 존재하는 경우에는 1 위치의 아미노기의 질소 원자를 결합 부위로 하여 결합되어 있다. 상기 식 중 GGFG 는, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신으로 이루어지는 펩티드 결합으로 연결되어 있는 아미노산 서열을 나타낸다.
-(Succinimid-3-yl-N)- 는 다음 식 :
[화학식 3]
으로 나타내는 구조이고, 이것의 3 위치에서 항체와 결합하고, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합되어 있다.)
[34] 링커가 이하의 (c), (d) 및 (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 식으로 나타내어지는 [29] ∼ [33] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
(c) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
(d) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
(e) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[35] 링커가 이하의 (c) 또는 (e) 의 식으로 나타내어지는 [29] ∼ [34] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
(c) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
(e) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[36] 이하의 식 :
[화학식 4]
으로 나타내는 구조를 갖는, [29] ∼ [35] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, AB 는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편을 나타낸다. n 은 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편과 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체 또는 그 항체의 1 항원 결합 단편당 평균 결합수를 나타낸다. 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편과 링커는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
[37] 이하의 식 :
[화학식 5]
으로 나타내는 구조를 갖는, [29] ∼ [35] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, AB 는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편을 나타낸다. n 은 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편과 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체 또는 그 항체의 1 항원 결합 단편당 평균 결합수를 나타낸다. 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편과 링커는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
[38] 항체가 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, [29] ∼ [37] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[39] 항체가, 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, [38] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[40] 항체가, 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, [38] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[41] 항체가 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 및 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, [29] ∼ [37] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[42] 항체가, 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, [41] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[43] 항체가, 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, [41] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[44] 중사슬 또는 경사슬이, N-결합형 당사슬의 부가, O-결합형 당사슬의 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말단 글루타민 혹은 N 말단 글루탐산의 피로글루탐산화 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 갖는, [29] ∼ [43] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[45] 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는, [44] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[46] 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는, [45] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[47] 중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, [44] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[48] 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키기 위한 당사슬 수식을 갖는, [29] ∼ [47] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[49] 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 1 ∼ 10 개의 범위인, [29] ∼ [48] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[50] 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 2 ∼ 8 개의 범위인, [49] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[51] 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 5 ∼ 8 개의 범위인, [50] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[52] 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 7 ∼ 8 개인, [51] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[52-2] 이하의 식 :
[화학식 6]
으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, AB 는, 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 인간화 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 상기 평균 결합수는 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
[52-3] 이하의 식 :
[화학식 7]
으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, AB 는, 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 인간화 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 상기 평균 결합수는 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
[52-4] 이하의 식 :
[화학식 8]
으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, AB 는, 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 인간화 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 상기 평균 결합수는 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
[52-5] 이하의 식 :
[화학식 9]
으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, AB 는, 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 인간화 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 상기 평균 결합수는 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
[52-6] 이하의 식 :
[화학식 10]
으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, AB 는, 서열 번호 18 의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 20 의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 상기 평균 결합수는 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
[52-7] 이하의 식 :
[화학식 11]
으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
(여기서, AB 는, 서열 번호 26 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 27 의 20 ∼ 476 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 상기 평균 결합수는 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
[52-8] 항체의 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는, [52-2] ∼ [52-7] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[52-9] 결실되어 있는 아미노산이 리신인, [52-8] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[53] [1] ∼ [15-8] 및 [24] ∼ [28] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, [29] ∼ [52-9] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
[54] 항종양약인 것을 특징으로 하는, [53] 에 기재된 의약 조성물.
[55] 대상에 있어서, 종양 세포가 CD25 를 발현하고 있거나, 혹은 종양 면역이 제어성 T 세포에 의해 억제되고 있는 것을 특징으로 하는, [54] 에 기재된 의약 조성물.
[56] 대상에 있어서, 종양 환경 중, 및/또는, 림프절 중에 제어성 T 세포가 존재하고 있는 것을 특징으로 하는, [55] 에 기재된 의약 조성물.
[57] 종양이, 혈액암, 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 뇌종양, 신경 교종, 안종양, 식도암, 위암, 대장암, 결장암, 간암, 췌장암, 신암, 신장암, 방광암, 부신 피질암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체암, 난소암, 흑색종 또는 육종인 것을 특징으로 하는, [53] ∼ [56] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[58] [1] ∼ [15-8] 및 [24] ∼ [28] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, [29] ∼ [52-9] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 어느 것을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
[59] 대상에 있어서, 종양 세포가 CD25 를 발현하고 있거나, 혹은 종양 면역이 제어성 T 세포에 의해 억제되고 있는 것을 특징으로 하는, [58] 에 기재된 치료 방법.
[60] 대상에 있어서, 종양 환경 중, 및/또는, 림프절 중에 제어성 T 세포가 존재하고 있는 것을 특징으로 하는, [58] 또는 [59] 에 기재된 치료 방법.
[61] 종양이, 혈액암, 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 뇌종양, 신경 교종, 안종양, 식도암, 위암, 대장암, 결장암, 간암, 췌장암, 신암, 신장암, 방광암, 부신 피질암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체암, 난소암, 흑색종 또는 육종인 것을 특징으로 하는, [58] ∼ [60] 중 어느 하나에 기재된 치료 방법.
[62] [1] ∼ [15-8] 및 [24] ∼ [28] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, [29] ∼ [52-9] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 적어도 1 개를 포함하는 의약 조성물 및 적어도 1 개의 항종양약을, 동시에, 따로 또는 연속하여 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
[63] [21] 또는 [22] 에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편을 채취하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편과 약물-링커 중간 화합물을 반응시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법.
[64] [29] ∼ [52-9] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘주게이트 및 면역 체크포인트 저해제가, 조합하여 투여되는, 의약 조성물.
[65] 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는, [64] 에 기재된 의약 조성물.
[66] 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제 중에 유효 성분으로서 함유되는, [64] 에 기재된 의약 조성물.
[67] 상기 면역 체크포인트 저해제가, 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 및 항 CTLA-4 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, [64] ∼ [66] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[68] 상기 면역 체크포인트 저해제가, 항 PD-1 항체인, [67] 에 기재된 의약 조성물.
[69] 상기 항 PD-1 항체가, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 신틸리맙, 스파르탈리주맙, 도스탈리맙, 세르플루리맙, 티슬레리주맙, 펜풀리맙, 토리팔리맙, zimberelimab, 캄렐리주맙, 레티판리맙, 세미플리맙, prolgolimab, geptanolimab, enlonstobart, QL-1604, pucotenlimab 및 finotonlimab 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것 이상인, [68] 에 기재된 의약 조성물.
[69-2] 상기 항 PD-1 항체가, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인, [68] 에 기재된 의약 조성물.
[70] 상기 면역 체크포인트 저해제가, 항 PD-L1 항체인, [67] 에 기재된 의약 조성물.
[71] 상기 항 PD-L1 항체가, 아테졸리주맙, 더발루맙, cosibelimab, adebrelimab, sugemalimab, 아벨루맙, socazolimab, KL-A167 및 envafolimab 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, [70] 에 기재된 의약 조성물.
[71-2] 상기 항 PD-L1 항체가, 아테졸리주맙, 더발루맙 및 아벨루맙으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, [70] 에 기재된 의약 조성물.
[72] 상기 면역 체크포인트 저해제가, 항 CTLA-4 항체인, [67] 에 기재된 의약 조성물.
[73] 상기 항 CTLA-4 항체가, 이필리무맙, botensilimab 및 트레멜리무맙으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, [72] 에 기재된 의약 조성물.
[73-2] 상기 항 CTLA-4 항체가, 이필리무맙인, [72] 에 기재된 의약 조성물.
[73-3] 암의 치료를 위한, [64] ∼ [73-2] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[73-4] 혈액암, 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 뇌종양, 신경 교종, 안종양, 식도암, 위암, 대장암, 결장암, 간암, 췌장암, 신암, 신장암, 방광암, 부신 피질암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체암, 난소암, 흑색종 및 육종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 치료를 위한, [64] ∼ [73-2] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[74] 면역 체크포인트 저해제에 대해 내성을 나타내는 암의 치료를 위한, [64] ∼ [73-2] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[75] 항체-약물 콘주게이트와, 면역 체크포인트 저해제가, 치료를 필요로 하는 개체에 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 질환의 치료 방법으로서, 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가 [29] ∼ [52-9], [67] ∼ [73-2] 중 어느 하나로 정의되어 있는 바와 같은, 치료 방법.
[76] 질환이, [73-3] ∼ [74] 중 어느 하나로 정의되어 있는, [75] 에 기재된 치료 방법.
[77] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, [75] 또는 [76] 에 기재된 치료 방법.
[78] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제에 유효 성분으로서 함유되는, [75] 또는 [76] 에 기재된 치료 방법.
[79] 질환의 치료를 위한, 면역 체크포인트 저해제와 조합한 사용을 위한, 항체-약물 콘주게이트로서, 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가 [29] ∼ [52-9], [67] ∼ [73-2] 중 어느 하나로 정의되어 있는 바와 같은, 항체-약물 콘주게이트.
[80] 질환이, [73-3] ∼ [74] 중 어느 하나로 정의되어 있는, [79] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[81] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, [79] 또는 [80] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[82] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제에 유효 성분으로서 함유되는, [79] 또는 [80] 에 기재된 항체-약물 콘주게이트.
[83] 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 면역 체크포인트 저해제와 조합한 항체-약물 콘주게이트의 사용으로서, 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가 [29] ∼ [52-9], [67] ∼ [73-2] 중 어느 하나로 정의되어 있는 바와 같은, 항체-약물 콘주게이트의 사용.
[84] 질환이, [73-3] ∼ [74] 중 어느 하나로 정의되어 있는, [83] 에 기재된 사용.
[85] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, [83] 또는 [84] 에 기재된 사용.
[86] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제에 유효 성분으로서 함유되는, [83] 또는 [84] 에 기재된 사용.
[87] 조합으로의 투여를 위한, 항체-약물 콘주게이트 및 면역 체크포인트 저해제를 함유하는 의약 제품으로서, 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가 [29] ∼ [52-9], [67] ∼ [73-2] 중 어느 하나로 정의되어 있는 바와 같은, 의약 제품.
[88] [73-3] ∼ [74] 중 어느 하나로 정의되어 있는 질환의 치료를 위한, [87] 에 기재된 의약 제품.
[89] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, [87] 또는 [88] 에 기재된 의약 제품.
[90] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제에 유효 성분으로서 함유되는, [87] 또는 [88] 에 기재된 의약 제품.
[91] 항체-약물 콘주게이트 및 면역 체크포인트 저해제를 함유하는 조합 의약으로서, 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가 [29] ∼ [52-9], [67] ∼ [73-2] 중 어느 하나로 정의되어 있는 바와 같은, 조합 의약.
[92] [73-3] ∼ [74] 중 어느 하나로 정의되어 있는 질환의 치료를 위한, [91] 에 기재된 조합 의약.
[93] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, [91] 또는 [92] 에 기재된 조합 의약.
[94] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제에 유효 성분으로서 함유되는, [91] 또는 [92] 에 기재된 조합 의약.
[95] 항체-약물 콘주게이트 및 면역 체크포인트 저해제를 함유하는 약학적 조합으로서, 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가 [29] ∼ [52-9], [67] ∼ [73-2] 중 어느 하나로 정의되어 있는 바와 같은, 약학적 조합.
[96] [73-3] ∼ [74] 중 어느 하나로 정의되어 있는 질환의 치료를 위한, [95] 에 기재된 약학적 조합.
[97] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, [95] 또는 [96] 에 기재된 약학적 조합.
[98] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제에 유효 성분으로서 함유되는, [95] 또는 [96] 에 기재된 약학적 조합.
[99] 질환의 치료를 위한, 면역 체크포인트 저해제와 조합한 항체-약물 콘주게이트의 사용으로서, 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가 [29] ∼ [52-9], [67] ∼ [73-2] 중 어느 하나로 정의되어 있는 바와 같은, 사용.
[100] 질환이, [73-3] ∼ [74] 중 어느 하나로 정의되어 있는, [99] 에 기재된 사용.
[101] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, [99] 또는 [100] 에 기재된 사용.
[102] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제에 유효 성분으로서 함유되는, [99] 또는 [100] 에 기재된 사용.
[103] 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제를 함유하는 의약으로서, 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 조합되어 투여되고, 상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가 [29] ∼ [52-9], [67] ∼ [73-2] 중 어느 하나로 정의되어 있는 바와 같은, 의약.
[104] [73-3] ∼ [74] 중 어느 하나로 정의되어 있는 질환의 치료를 위한, [103] 에 기재된 의약.
[105] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는, [103] 또는 [104] 에 기재된 의약.
[106] 상기 항체-약물 콘주게이트와, 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제에 유효 성분으로서 함유되는, [103] 또는 [104] 에 기재된 의약.
본 발명에 의해, CD25 에 결합하는 항체, 그 항체를 포함하는 항종양 활성을 갖는 항체-약물 콘주게이트, 그 항체-약물 콘주게이트를 사용한 종양에 대한 치료 효과를 갖는 의약품, 및, 당해 항체, 항체-약물 콘주게이트 또는 의약품을 사용한 종양의 치료 방법 등이 제공된다.
도 1 은, MAb1 의 인간, 게잡이원숭이, 마우스 CD25 발현 세포에 대한 결합 활성을 나타내는 도면이다.
도 2 는, IL-2 존재하에 있어서 MAb1, 래트 IgG2a 컨트롤 항체, IL-2 블로킹 항인간 CD25 항체인 바실릭시맙 또는 IL-2 논블로킹 항인간 CD25 항체인 7G7B6 에 의한 인간 pan T 세포의 증식의 변동을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 2 내지 24) 를 나타낸다.
도 3 은, IL-2 존재하에 있어서 MAb1, 래트 IgG2a 컨트롤 항체, 바실릭시맙 또는 7G7B6 에 의한 인간 PBMC 세포의 인산화 STAT5 의 변동을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 4 는, MAb1 또는 래트 IgG2a 컨트롤 항체의 내재화 활성을, 사포린을 결합시킨 항래트 IgG 시약 (Fab-ZAP) 을 사용하여 인간 pan T 세포의 생존율의 변동에 의해 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 5 는, CD25 항체인 M-A251 에 대한 MAb1, 인간 IgG1 컨트롤 항체, 또는 항인간 CD25 항체인 바실릭시맙의 경합성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 편차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 6 은, MAb2 의 인간, 게잡이원숭이, 마우스 CD25 발현 세포에 대한 결합 활성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 7 은, IL-2 존재하에 있어서 MAb2, 래트 IgG2a 컨트롤 항체, 또는 IL-2 블로킹 항마우스 CD25 항체인 PC61_hIgG1LALA (도면 중 PC61 로 표기) 에 의한 CTLL-2 세포의 인산화 STAT5 의 변동을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 8 은, MAb2, PC61 또는 래트 IgG2a 컨트롤 항체의 내재화 활성을, 사포린을 결합시킨 항래트 IgG 시약 (Fab-ZAP) 을 사용하여 마우스 pan T 세포의 생존율의 변동에 의해 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 9 는, cMAb1_hIgG1LALA 의 인간, 게잡이원숭이, 마우스 CD25 발현 세포에 대한 결합 활성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 10 은, PMA/PHA 존재하, cMAb1_hIgG1LALA, 인간 IgG1 컨트롤 항체 또는 바실릭시맙에 의한 인간 CD4 양성 T 세포의 증식의 변동을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 11 은, IL-2 존재하, cMAb1_hIgG1LALA, 인간 IgG1 컨트롤 항체, 바실릭시맙에 의한 인간 PBMC 의 인산화 STAT5 의 변동을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 12 는, cMAb1_hIgG1LALA-ADC 또는 인간 IgG1LALA-ADC 의, CD25 양성 인간 종양 세포주 Karpas-299 와 CD25 음성 인간 종양 세포주 Daudi 에 대한 in vitro 세포 증식 억제 활성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 편차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 13 은, cMAb1_hIgG1LALA-ADC 또는 인간 IgG1LALA-ADC 를 투여한 MDA-MB-231 세포 담암 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스의 종양 조직 중의, 인간 면역 세포당 Treg, CD8 양성 T 세포, GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 비율의 변동을 나타내는 도면이다 (n = 5).
도 14 는, cMAb2_hIgG1LALA 의 인간, 게잡이원숭이, 마우스 CD25 발현 세포에 대한 결합 활성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 15 는, cMAb2_hIgG1LALA, 인간 IgG1 또는 PC61_hIgG1LALA 의 CD25 양성 마우스 T 세포주 CTLL-2 에 대한 in vitro 세포 증식 억제 활성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 16 은, cMAb2_hIgG1LALA-ADC 또는 인간 IgG1LALA-ADC 의, CD25 양성 마우스 T 세포주 CTLL-2 에 대한 in vitro 세포 증식 억제 활성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 편차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 17 은, cMAb2_hIgG1-ADC 또는 인간 IgG1-ADC 를 투여한 CT26 세포 담암 마우스의 종양 체적의 변동을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 9) 를 나타낸다.
도 18 은, cMAb2_hIgG1-ADC 또는 인간 IgG1-ADC 를 투여한 CT26 세포 담암 마우스의 종양 내의, Treg, FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포, CD8 양성 T 세포 및 그랜자임 양성 CD8 양성 T 세포의 조직 중량당 세포수의 변동을 나타내는 도면이다. 도면 중의 점은 각 개체를 나타내고, 그들을 기초로 상자 수염도로서 나타낸 도면이다 (n = 10).
도 19 는, hMAb1A 및 hMAb1B 의 인간, 게잡이원숭이, 마우스 CD25 일과성 발현 세포에 대한 결합 활성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 편차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 20 은, IL-2 존재하, hMAb1A, hMAb1B, 인간 IgG1 컨트롤 항체 또는 바실릭시맙에 의한 인간 PBMC 의 증식의 변동을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 21 은, PMA/PHA 존재하, hMAb1A, hMAb1B, 인간 IgG1 컨트롤 항체, 바실릭시맙에 의한 인간 PBMC 의 인산화 STAT5 의 변동을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 22a 는, hMAb1A-ADC, hMAb1A 또는 인간 IgG1-ADC 의 CD25 양성 인간 종양 세포주 Karpas-299 와 CD25 음성 인간 종양 세포주 Daudi 에 대한 in vitro 세포 증식 억제 활성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 편차 (n = 3 혹은 6) 를 나타낸다.
도 22b 는, hMAb1B-ADC, hMAb1B 또는 인간 IgG1LALA-ADC 의 CD25 양성 인간 종양 세포주 EoL-1 과 CD25 음성 인간 종양 세포주 Daudi 에 대한 in vitro 세포 증식 억제 활성을 나타내는 도면이다. 도면 중의 에러바는 표준 편차 (n = 3) 를 나타낸다.
도 23 은, hMAb1A-ADC 또는 ABS 를 투여한 MDA-MB-231 세포 담암 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스의 종양 조직에 있어서의, Treg, FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포, CD8 양성 T 세포, GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 인간 CD45 양성 세포 중에서의 비율의 변동을 나타내는 도면이다 (n = 5).
도 24 는, hMAb1A-ADC, hMAb1B-ADC 또는 인간 IgG1LALA-ADC 를 투여한 MDA-MB-231 세포 담암 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스의 종양 조직에 있어서의, Treg, GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 인간 CD45 양성 세포 중에서의 비율의 변동을 나타내는 도면이다 (n = 4 혹은 5).
도 25 는, iTreg 를 표적 세포로 한 RG-6292 의 ADCC 활성을 나타내는 도면이다.
도 26 은, hMAb1A-ADC 와 RG-6292 의 iTreg 에 대한 살세포 활성을 iTreg 와 NK 세포의 비율을 변화시켜 비교를 나타내는 도면이다 (n = 3).
도 27 은, hMAb1A-ADC, ADCT-301 또는 ABS 를 투여한 MDA-MB-231 세포 담암 조혈 줄기세포 이식 NOG 마우스의 종양 조직에 있어서의, GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 종양 조직 1 mg 당 세포수의 변동을 나타내는 도면이다 (n = 5).
도 28 은, hMAb1A-L 경사슬 전체 길이 아미노산 서열 (시그널 서열 및 hMAb1A 경사슬의 아미노산 서열) (서열 번호 13) 을 나타낸다.
도 29 는, hMAb1A-H 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 (시그널 서열 및 hMAb1A 중사슬의 아미노산 서열) (서열 번호 15) 을 나타낸다.
도 30 은, hMAb1B-L 경사슬 전체 길이 아미노산 서열 (시그널 서열 및 hMAb1B 경사슬의 아미노산 서열) (서열 번호 14) 을 나타낸다.
도 31 은, hMAb1B-H 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 (시그널 서열 및 hMAb1B 중사슬의 아미노산 서열) (서열 번호 16) 을 나타낸다.
도 32 는, cMAb2_hIgG1-ADC 에 항 PD-1 항체 또는 래트 IgG2a 컨트롤 항체를 조합하여 투여한 담암 마우스의 종양 체적의 변동을 나타내는 도면이다. 인간 IgG1-ADC 에 항 PD-1 항체 또는 래트 IgG2a 컨트롤 항체를 조합하여 투여한 결과도 아울러 나타낸다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 3 내지 10) 를 나타낸다. CT26.WT 세포, EMT6 세포, MC38 세포, RENCA 세포, 또는 B16F10 세포를 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다.
도 33 은, cMAb2_hIgG1-ADC 에 항 PD-1 항체 또는 래트 IgG2a 컨트롤 항체를 조합하여 투여한 3LL 세포 담암 마우스의 종양 체적의 변동을 나타내는 도면이다. 인간 IgG1-ADC 에 항 PD-1 항체 또는 래트 IgG2a 컨트롤 항체를 조합하여 투여한 결과도 아울러 나타낸다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 8) 를 나타낸다.
도 34 는, cMAb2_hIgG1-ADC 에 항 CTLA-4 항체 또는 래트 IgG2b 컨트롤 항체를 조합하여 투여한 MC38 세포 담암 마우스의 종양 체적의 변동을 나타내는 도면이다. 인간 IgG1-ADC 에 항 CTLA-4 항체 또는 래트 IgG2b 컨트롤 항체를 조합하여 투여한 결과도 아울러 나타낸다. 도면 중의 에러바는 표준 오차 (n = 7 혹은 8) 를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태에 대해 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시형태는, 본 발명의 대표적인 실시형태의 일례를 나타낸 것이며, 이것에 의해 본 발명의 범위가 좁게 해석되는 것은 아니다.
본 명세서 중,「암」과「종양」은 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서 중,「유전자」라는 단어에는, DNA 뿐만 아니라 그 mRNA, cDNA 및 그 cRNA 도 포함된다.
본 명세서 중,「폴리뉴클레오티드」또는「뉴클레오티드」는, 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있으며, DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함된다. 본 명세서 중,「폴리뉴클레오티드」와「뉴클레오티드」는, 특별히 지정되지 않는 한, 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서 중,「폴리펩티드」와「단백질」은 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서 중,「세포」에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함한다.
본 명세서 중,「CD25」는, CD25 단백질과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 본 명세서 중, 인간 CD25 를「hCD25」로 기재하는 경우가 있다.
본 명세서 중,「세포 상해 활성」이란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 일으키는 것을 말하며, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 이량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능상의 손상을 일으키는 것을 말한다.
본 명세서 중,「세포 내에서 독성을 발휘한다」란, 어떠한 형태로, 세포 내에서 독성을 나타내는 것을 말하며, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 이량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하, 세포 증식 인자의 작용의 억제 등 모든 세포의 구조나 기능, 대사에 영향 을 초래하는 것을 말한다.
본 명세서 중,「항체」란, 어느 종에서 유래하는 항체여도 되지만, 바람직하게는 인간, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 낙타, 알파카 또는 라마 유래의 항체를 예시할 수 있다. 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지된 기술을 사용하여, 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 항체는, 인간 항체, 키메라화 항체 또는 인간화 항체이고, 바람직하게는 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체여도 되고, 모노클로날 항체여도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하고, 단특이성 항체여도 되고, 다특이성 항체 (이특이성 항체, 삼특이성 항체 등) 여도 된다.
본 명세서 중,「항체의 항원 결합 단편」이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편, 또는 항체의 항원 결합 부위 (경사슬 및 중사슬의 가변 영역, 또는 당해 가변 영역에 포함되는 CDR 등) 를 함유하는 융합 폴리펩티드를 의미한다. 항체의 항원 결합 단편은, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, VHH (variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody) 항체, diabody, 선상 항체, 및 scFv 를 다른 단백질의 기능성 도메인과 연결시킴으로써 항원에 대한 결합성이 부여된 융합 단백질 등을 포함한다. 항체의 항원 결합 단편에는, 그 단편을 포함하여 형성된 다특이성 항체도 포함된다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합 단편에 포함된다. 단, 항체의 항원 결합 단편은, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한, 이들 분자에 한정되지 않는다. 또, 이들 항원 결합 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개편된 항체 또는 그 항원 결합 부위를 코드하는 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
본 명세서 중,「에피토프」란, 특정한 항 CD25 항체가 결합하는 CD25 의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조를 의미한다. 상기의 CD25 의 부분 펩티드인 에피토프는 면역 어세이법 등 당업자에게는 잘 알려져 있는 방법에 의해 결정할 수 있다. 먼저, 항원의 다양한 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조에 있어서는, 공지된 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, CD25 의 C 말단 또는 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차적으로 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조한 후, 그들에 대한 항체의 반응성을 검토하여, 대략적인 인식 부위를 결정한 후에, 추가로 짧은 펩티드를 합성하여 그들 펩티드와의 반응성을 검토함으로써, 에피토프를 결정할 수 있다. 또, 복수의 세포 외 도메인으로 이루어지는 막 단백질에 결합하는 항체가, 복수의 도메인으로 이루어지는 입체 구조를 에피토프로 하고 있는 경우에는, 특정한 세포 외 도메인의 아미노산 서열을 개변하는 것에 의해, 입체 구조를 개변함으로써 어느 도메인과 결합할지를 결정할 수 있다. 특정한 항체가 결합하는 항원의 부분 입체 구조인 에피토프는, X 선 구조 해석 등에 의해 항체와 인접하는 항원의 아미노산 잔기를 특정하는 것에 의해서도 결정할 수 있다.
본 명세서 중,「동일한 에피토프에 결합한다」란, 공통의 에피토프에 결합하는 항체를 의미하고 있다. 제 1 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 제 2 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 혹은, 제 1 항체의 항원에 대한 결합에 제 2 항체가 경합하는 (즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 항원의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 본 명세서 중,「동일한 에피토프에 결합한다」란, 제 1 항체와 제 2 항체가, 당해 판정 방법 중 어느 일방 또는 양방에 의해, 공통의 에피토프에 결합한다고 판정된 경우를 말한다. 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합하고, 또한 제 1 항체가 항종양 활성이나 내재화 활성 등의 특수한 효과를 갖는 경우, 제 2 항체도 동일한 활성을 갖는 것을 기대할 수 있다.
본 명세서 중,「CDR」이란, 상보성 결정 영역 (CDR ; Complementarity Determining Region) 을 의미한다. 항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 개 지점의 CDR 이 있는 것이 알려져 있다. CDR 은, 초가변 영역 (hypervariable region) 이라고도 불리며, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있어, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이고, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조 상에 있어서, 각각 3 개 지점으로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 CDR 에 대해, 중사슬의 CDR 을 중사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측에서부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경사슬의 CDR 을 경사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측에서부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 위에서 서로 근접하고, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다. CDR 서열은, 당기술 분야에서 주지된 정의, 예를 들어, IMGT (Lefranc et al., 2003, Dev Comparat Immunol 27 : 55-77), Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) 및 Chothia (Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol 273 : 927-948) 등의 스킴에 따라 정의된다. 본 발명에 있어서, CDR 서열은 IMGT 의 정의에 의해 결정하였다.
본 명세서 중,「수개」란, 1 내지 10 개, 1 내지 9 개, 1 내지 8 개, 1 내지 7 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 또는 1 혹은 2 개를 의미한다.
본 명세서 중,「A ∼ B」는, A 및 B 를 포함하는 범위를 나타낸다. 「A 내지 B」도 마찬가지이다.
1. CD25
CD25 (별명 : IL-2 수용체 α 사슬, Tac 항원) 는 세포 외에 2 개의 Sushi 도메인을 갖는 I 형 막관통형 단백질 (비특허문헌 13, 14) 로, IL-2 수용체 α 사슬로서 알려져 있고, IL-2 와 결합했을 때에 IL-2 시그널을 세포 내에 전달하는 역할을 갖는다 (비특허문헌 15). CD25 는 활성화 T 세포나 B 세포와 같은 한정된 면역 세포에 저레벨로 발현되고 (비특허문헌 16, 17), Treg 에서는 고발현인 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 18). 또, Treg 의 면역 억제 활성은 CD25 발현의 강약과 상관하는 것이 나타나 있다 (비특허문헌 18). Treg 에 있어서의 CD25 의 역할로는 Treg 의 생존에 IL-2 시그널이 필수인 것 (비특허문헌 19), IL-2 와 결합하여 IL-2 를 소비함으로써 다른 면역 세포에 IL-2 와 결합할 기회를 감소시키는 것 등이 보고되어 있다 (비특허문헌 19). 또, CD25 는 비호지킨 림프종과 같은 혈액암 세포에서의 발현도 보고되어 있다 (비특허문헌 20).
본 발명에서 사용하는 CD25 단백질은, 인간, 비인간 포유 동물 (래트, 마우스, 원숭이 등) 의 CD25 발현 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 당해 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또, CD25 단백질을 in vitro 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, CD25 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시키는 것에 의해 CD25 를 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다. 또, 상기의 유전자 조작에 의한 CD25 발현 세포, 혹은 CD25 를 발현하고 있는 세포주를 CD25 단백질로서 사용하는 것도 가능하다. 또, CD25 의 cDNA 를 삽입한 발현 벡터를 직접 피면역 동물에게 투여하여 피면역 동물의 체내에서 CD25 를 발현시킬 수도 있다.
또, 상기 CD25 의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 당해 단백질과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 CD25 에 포함된다.
인간 CD25 단백질은, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
2. 항 CD25 항체
본 발명의 항 CD25 항체의 일례로서, IL-2 블로킹능을 갖지 않고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CD25 항체를 들 수 있다.
본 발명의 항 CD25 항체는, 어느 종에서 유래해도 되지만, 바람직하게는 인간, 원숭이, 래트, 마우스 또는 토끼를 예시할 수 있다. 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지된 기술을 사용하여, 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체여도 되고, 모노클로날 항체여도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다.
본 발명의 항 CD25 항체는 혈구 세포 및 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이며, 즉 혈구 세포 및 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 혈구 세포 및 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 및/또는 혈구 세포 및 종양 세포 내에 도입되어 내재화되는 특성 등을 구비하고 있다. 따라서, 본 발명의 항 CD25 항체와 약물을, 링커를 개재하여 결합시켜 항체-약물 콘주게이트로 할 수 있다.
항체의 혈구 세포 및 종양 세포에 대한 결합성은, 플로 사이토메트리를 사용하여 확인할 수 있다.
혈구 세포 및 종양 세포 내에 대한 항체의 내재화는, (1) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 도입된 항체를 형광 현미경으로 가시화하는 어세이 (Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761), (2) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 도입된 형광량을 측정하는 어세이 (Molecular Biology of the Cell Vol.15, 5268-5282, December 2004) 또는 (3) 치료 항체에 결합하는 이뮤노톡신을 사용하여, 세포 내에 도입되면 독소가 방출되어 세포 증식이 억제된다는 Mab-ZAP 어세이 (Bio Techniques 28 : 162-165, January 2000) 를 사용하여 확인할 수 있다. 이뮤노톡신으로는, 디프테리아 독소의 촉매 영역과 프로테인 G 의 리콤비넌트 복합 단백질도 사용 가능하다.
본 명세서에서 말하는,「IL-2 블로킹능을 갖지 않는다」및「IL-2 시그널을 저해하지 않는다」란, 항 CD25 항체 또는 그 항원 결합 단편의 존재하에서의 IL-2 시그널 전달이, 대조 항체의 존재하에서의 IL-2 시그널 전달과 비교하여 적어도 70 ％ 이상 유지되는 것을 의미한다.
IL-2 시그널 전달은, 예를 들어 IL-2 의존적인 T 세포의 증식 혹은 단백질 (예를 들어 STAT5) 의 인산화를 지표로 하여 평가할 수 있다. IL-2 와 항체의 존재하에서의 IL-2 의존적인 T 세포의 증식 혹은 단백질 인산화가, IL-2 존재하 또한 대조 항체 존재하에서의 세포 증식 혹은 단백질 인산화에 비해 적어도 70 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상인 경우, 항체가「IL-2 블로킹능을 갖지 않는다」및「IL-2 시그널을 저해하지 않는다」고 결정할 수 있다 (IL-2 논블로킹 항체). 당해 대조 항체에는, IL-2 블로킹능을 갖지 않는 것이 공지된 항체를 사용하면 되고, 본 실시예의 평가에서 사용한 항체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 래트 IgG2a 또는 인간 IgG1 이 사용될 수 있다. 또한, 측정계에 따라서는, IL-2 와 항체의 존재하에서의 IL-2 의존적인 T 세포의 증식 혹은 단백질 인산화가, IL-2 존재하 또한 대조 항체 존재하에서의 세포 증식 혹은 단백질 인산화에 비해 100 ％ 를 초과하는 경우도 있을 수 있는데, 이 경우에도 항체는 IL-2 논블로킹 항체로 결정해도 된다.
IL-2 시그널을 저해하는 항 CD25 항체는, IL-2 의존적인 T 세포 증식을 저해하거나 (비특허문헌 21), 혹은 T 세포를 통한 면역 반응을 억제하는 것이 지금까지 보고되어 있다 (비특허문헌 22).
IL-2 시그널을 저해하지 않는 항 CD25 항체가 높은 항종양 효과를 나타내는 마우스 종양 모델에 있어서, IL-2 시그널을 저해하는 항 CD25 항체에서는 항종양 효과가 거의 확인되지 않는다는 점 등에서, 항 CD25 항체에 의한 종양의 치료 효과는, 종양 내의 Treg 제거와 Teff 활성화의 쌍방에 기초하는 것이라는 보고가 있다 (비특허문헌 22). 그 때문에, IL-2 시그널을 저해하는 항 CD25 항체에서는, 종양 내 등에 있어서 IL-2 의존적인 Teff 의 증식을 저해해 버려, 충분한 치료 효과가 얻어지지 않는 것이 상정된다.
이 점에 있어서, IL-2 시그널을 저해하지 않는 항체인 본원 항체는, Teff 의 증식을 저해하지 않고 높은 항종양 활성을 발휘하는 것이 기대되며, 치료약으로서 우위성을 갖는 것으로 생각된다.
본 명세서에서 말하는,「인간 제어성 T 세포의 제거능을 나타낸다」란, 예를 들어, 무투여군, vehicle 투여군, 또는, 컨트롤 항체의 ADC 의 존재하에 비해, 본 발명에 관련된 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트된 항 CD25 항체 또는 그 항원 결합 단편의 존재하에서는, 인간 제어성 T 세포에 세포사를 유도하는 것 등에 의해, 종양 환경 중, 림프절 중, 및/또는, 혈액 중에 있어서의, 인간 CD45 세포당 인간 제어성 T 세포의 비율, 혹은 조직 중량당 인간 제어성 T 세포수를 감소시킬 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 말하는,「인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다」란, 예를 들어, 무투여군, vehicle 투여군, 또는, 컨트롤 항체의 ADC 의 존재하에 비해, 본 발명에 관련된 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트된 항 CD25 항체 또는 그 항원 결합 단편의 존재하에서는, 종양 환경 중, 림프절 중, 및/또는, 혈액 중에 있어서의, 인간 CD45 세포당 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 비율, 혹은 조직 중량당 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포수를 증가시킬 수 있는 것을 의미한다.
비교에 사용되는 당해 vehicle 이나 당해 컨트롤 항체의 ADC 에는, 예를 들어, 본 실시예의 평가에서 사용한 것을 사용할 수 있다.
본 명세서에서 말하는「CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성」이란, 예를 들어, CD25 발현 세포에, 1 차 항체로서 대조 항체 또는 피검 항체를, 2 차 항체로서 1 차 항체에 대한 결합성을 갖고 또한 세포 독성을 갖는 물질 (예를 들어 사포린 등) 이 결합된 항체를 접촉시켜, 세포 독성을 갖는 물질에 의해 유도되는 CD25 발현 세포의 세포사를 검출함으로써 평가할 수 있다. 즉, 1 차 항체로서 대조 항체를 접촉시킨 CD25 발현 세포에 있어서의 세포 생존율을 100 ％ 로 했을 때에, 1 차 항체로서 피검 항체를 접촉시킨 CD25 발현 세포에 있어서의 세포 생존율이 90 ％ 이하, 80 ％ 이하, 70 ％ 이하인 경우, 보다 바람직하게는 60 ％ 이하, 50 ％ 이하, 40 ％ 이하인 경우, 더욱 바람직하게는 30 ％ 이하, 20 ％ 이하, 10 ％ 혹은 그 이하인 경우에, 피검 항체가 CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다고 결정할 수 있다. 당해 대조 항체에는, CD25 에 대한 결합성을 갖지 않는 항체를 사용하면 되고, 본 실시예의 평가에서 사용한 항체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 래트 IgG2a 가 사용될 수 있다. 「내재화되는 활성」은,「내재화 활성」및「내재화 작용」과 호환적으로 사용된다.
항체-약물 콘주게이트는 세포 상해 효과를 발휘하는 화합물을 결합시키고 있으므로, 항체 자체가 항체 의존성 세포 상해 활성 효과, 항체 의존성 세포 탐식 활성 및 보체 의존성 세포 상해 활성을 갖는 것은 바람직하지만, 필수는 아니다. 세포 상해 활성 화합물의 세포 상해 활성을 혈구 세포 및 종양 세포에 있어서 특이적 및/또는 선택적으로 발휘시킬 목적에서는, 항체가 내재화되어 혈구 세포 내 및 종양 세포 내로 이행되는 성질이 있는 것이 중요하며 바람직하다.
항 CD25 항체는, 이 분야에서 통상적으로 실시되는 방법을 사용하여, 항원이 되는 폴리펩티드를 동물에게 면역시키고, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있지만, 바람직하게는, 입체 구조를 유지한 CD25 를 항원으로서 사용하는 것이 바람직하다.
항원의 유래는 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 항원을 동물에게 면역시킬 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 (異種) 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, 항원에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
이하, 구체적으로 CD25 에 대한 항체의 취득 방법을 설명한다.
(1) 항원의 조제
항원은 항원 단백질을 코드하는 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는, 항원 유전자를 발현 가능한 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현된 항원을 정제하면 된다. 상기의 유전자 조작에 의한 항원 발현 세포, 혹은 항원을 발현하고 있는 세포주를 동물에게 면역시키는 방법을 사용하는 것에 의해서도 항체를 취득할 수 있다.
또, 항원 단백질을 사용하지 않고, 항원 단백질의 cDNA 를 발현 벡터에 삽입하여 피면역 동물에게 투여하여, 피면역 동물의 체내에서 항원 단백질을 발현시키고, 항원 단백질에 대한 항체를 산생시키는 것에 의해서도 항체를 취득할 수 있다.
(2) 항 CD25 모노클로날 항체의 제조
본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 본원의 서열표로 나타낸 아미노산 서열로 특정되는 항체를 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편으로는, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) 이하 중 어느 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체).
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다)
(2) CD25 가 인간 CD25, 게잡이원숭이 CD25 또는 마우스 CD25 (바람직하게는 인간 CD25 또는 마우스 CD25 이고, 보다 바람직하게는 인간 CD25 이다) 인 상기 (1) 에 기재된 항체.
본 발명의 CD25 에 대한 항체의 취득 방법은, 항 CD25 항체를 취득할 수 있는 한에 있어서, 특별히 제한되지 않지만, 고차 구조를 유지한 CD25 를 항원으로서 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 바람직하게는 CD25 에 대한 결합에 대해, 이하의 (1) ∼ (6) :
(1) 서열 번호 26 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 27 의 20 ∼ 476 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(2) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(3) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(4) 서열 번호 30 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 31 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(5) 서열 번호 32 의 21 ∼ 239 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 33 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(6) 서열 번호 54 의 21 ∼ 239 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 55 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체
으로 이루어지는 군에서 선택되는 항체 중 적어도 어느 1 개와 경합 저해 활성을 갖는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편이고,
보다 바람직하게는, CD25 에 대한 결합에 대해, 이하의 (1) ∼ (3) :
(1) 서열 번호 26 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 27 의 20 ∼ 476 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(2) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(3) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체
으로 이루어지는 군에서 선택되는 항체 중 적어도 어느 1 개와 경합 저해 활성을 갖는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편이고,
보다 더욱 바람직하게는, CD25 에 대한 결합에 대해, 이하의 (1) 및 (2) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체
중 적어도 어느 1 개와 경합 저해 활성을 갖는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편이다.
본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 바람직하게는, 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
(2) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고,
이하의 (3) ∼ (4) :
(3) 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(4) 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체이다) 이고,
보다 바람직하게는, 이하의 (1) ∼ (2) :
(1) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(2) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
로 이루어지는 군에서 선택되는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 이고,
보다 더욱 바람직하게는, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 이다.
본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 바람직하게는, 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(3) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및
(4) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역, 그리고,
이하의 (5) ∼ (8) :
(5) 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(6) 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(7) (5) ∼ (6) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및
(8) (5) ∼ (6) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역
을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 이고,
보다 바람직하게는, (1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 또는 (2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 이다.
본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 바람직하게는, (1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 또는 (2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 이고,
보다 바람직하게는, 상기 중사슬 또는 상기 경사슬이 N-결합형 당사슬의 부가, O-결합형 당사슬의 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말단 글루타민 혹은 N 말단 글루탐산의 피로글루탐산화, 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 갖는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편이고 (바람직하게는 항체),
보다 더욱 바람직하게는, 상기 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 항체이고,
보다 더욱 바람직하게는, 2 개의 상기 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는 항체이고,
보다 더욱 바람직하게는, 상기 중사슬에 있어서 결실되어 있는 아미노산이 리신인 항체이다.
어느 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 으로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고, 또한,
상기 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 으로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고, 또한,
상기 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 으로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고, 또한,
상기 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 으로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고, 또한,
상기 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 으로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고, 또한,
상기 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고,
상기 항체는, 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하고, 또한,
상기 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는, 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고,
상기 항체는, 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하고, 또한,
2 개의 상기 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는, 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고,
상기 항체는, 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하고, 또한
2 개의 상기 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 리신이 결실되어 있는, 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고,
상기 항체는, 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하고, 또한,
상기 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는, 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고,
상기 항체는, 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하고, 또한,
2 개의 상기 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는, 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편은, 이하의 (a) ∼ (d) 중, 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체로서,
(a) CD25 에 특이적으로 결합한다.
(b) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
(c) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
(d) CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.
(상기 (a) ∼ (d) 중, 바람직하게는 (a), (b), (c) 또는 (d) 이고, 보다 바람직하게는 (a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (b) 및 (c), (b) 및 (d), 또는, (c) 및 (d) 이고, 보다 더욱 바람직하게는 (a), (b) 및 (c), (a), (b) 및 (d), (a), (c) 및 (d), 또는, (b), (c) 및 (d) 이고, 가장 바람직하게는 (a), (b), (c) 및 (d) 이다),
상기 CD25 는, 인간 CD25 이고,
상기 항체는, 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하고, 또한,
2 개의 상기 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 리신이 결실되어 있는, 항체이다.
본 발명에서 사용되는 항체-약물 콘주게이트는, 상기에 예시한 어느 실시형태의 항 CD25 항체 또는 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 당해 항 CD25 항체 등에, 세포 내에서 독성을 발휘하는 약물을 특정한 구조의 링커를 개재하여 결합시킨 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 종래의 항 CD25 항체 및 항 CD25 항체-약물 복합체보다 강한 Treg 제거능 및/또는 그랜자임 (GZMB) 양성 CD8 양성 T 세포 유도 활성을 나타낼 수 있다.
구체적인 모노클로날 항체 취득의 예로는, 이하를 들 수 있다.
(a) 항원으로서 사용하는 생체 고분자의 정제 ;
(b) Recombinant CD25 와 애주번트를 직접 피면역 동물 (예를 들어, 래트나 마우스) 에게 투여함으로써 면역 반응을 유기 (誘起) 시킨다. 이들 투여는 항체가를 올리기 위해 필요하면 1 회여도 되고 복수회여도 된다
(c) 면역 반응이 유기된 상기 서술한 동물로부터, 항체 산생 세포를 포함하는 조직 (예를 들어 림프절) 을 채취한다 ;
(d) 골수종 세포 (이하「미엘로마」라고 한다) (예를 들어, 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포) 의 조제 ;
(e) 항체 산생 세포와 미엘로마의 세포 융합 ;
(f) 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마군의 선별 ;
(g) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝) ;
(h) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육 ; 및/또는
(i) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성 (내재화 활성), 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정.
여기서 사용되는 항체가의 측정법으로는, 예를 들어, 플로 사이토메트리 또는 Cell-ELISA 법을 들 수 있지만 이들 방법에 제한되지 않는다.
이와 같이 하여 수립된 하이브리도마주의 예로는, 항 CD25 항체 산생 하이브리도마 MAb1, MAb2 를 들 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서는, 항 CD25 항체 산생 하이브리도마 MAb1 이 산생하는 항체를,「MAb1 항체」또는 간단히「MAb1」로 기재하고, 하이브리도마 MAb2 가 산생하는 항체를,「MAb2 항체」또는 간단히「MAb2」로 기재한다.
MAb1 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 18 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 MAb1 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 19 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. MAb1 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 1 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. MAb1 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 20 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 MAb1 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 21 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. MAb1 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 7 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. MAb1 항체의 서열을 표 1 에 나타낸다.
[표 1]
MAb2 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 22 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 MAb2 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 23 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. MAb2 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. MAb2 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 24 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 MAb2 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 25 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. MAb2 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. MAb2 항체의 서열을 표 2 에 나타낸다.
[표 2]
또한,「2. 항 CD25 항체의 제조」(a) 내지 (h) 의 공정을 재차 실시하여 별도로 독립적으로 모노클로날 항체를 취득한 경우나 다른 방법에 의해 별도로 모노클로날 항체를 취득한 경우에 있어서도, MAb1 항체 또는 MAb2 항체와 동등한 내재화 활성을 갖는 항체를 취득하는 것이 가능하다. 이와 같은 항체의 일례로서, MAb1 항체 또는 MAb2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다. 새롭게 제조된 모노클로날 항체가, MAb1 항체 또는 MAb2 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 모노클로날 항체가 MAb1 항체 또는 MAb2 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, MAb1 항체 또는 MAb2 항체의 CD25 에 대한 결합에 대해 그 모노클로날 항체가 경합하는 (즉, 그 모노클로날 항체가, MAb1 항체 또는 MAb2 항체와 CD25 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 모노클로날 항체가 항 CD25 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일한 것이 확인된 경우, 그 모노클로날 항체가 MAb1 항체 또는 MAb2 항체와 동등한 항원 결합능, 생물 활성 및/또는 내재화 활성을 갖고 있는 것이 강하게 기대된다.
(3) 그 밖의 항체
본 발명의 항체에는, 상기 CD25 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체 또는 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는, 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).
래트 항인간 CD25 항체 유래의 키메라 항체의 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CD25 항체 (예를 들어, MAb1 항체) 의 경사슬 가변 영역과 인간 유래의 정상 영역을 포함하는 경사슬, 및, 당해 래트 항인간 CD25 항체의 중사슬 가변 영역과 인간 유래의 정상 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
래트 항인간 CD25 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CD25 항체 (예를 들어, MAb1 항체) 의 경사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 중사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
래트 항인간 CD25 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CD25 항체 (예를 들어, MAb1 항체) 의 경사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 중사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb1 항체 유래의 키메라 항체로는, 예를 들어, 서열 번호 26 의 21 ∼ 126 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 서열 번호 27 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb1 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 26 의 21 ∼ 126 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 서열 번호 27 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb1 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 26 의 21 ∼ 126 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 서열 번호 27 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb1 항체 유래의 키메라 항체의 구체예로는, 서열 번호 26 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및, 서열 번호 27 의 20 ∼ 476 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 키메라 항인간 CD25 항체를 본 명세서 중,「cMAb1_hIgG1LALA 항체」또는「cMAb1_hIgG1LALA」라고 칭한다. cMAb1_hIgG1LALA 항체의 경사슬 아미노산 서열은 서열 번호 28 의 61 ∼ 696 번의 뉴클레오티드 서열로 코드되고, cMAb1_hIgG1LALA 항체의 중사슬 아미노산 서열은 서열 번호 29 의 58 ∼ 1428 번 뉴클레오티드 서열로 코드된다.
cMAb1_hIgG1LALA 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열은, MAb1 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열과 동일하고, 서열 번호 18 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. cMAb1_hIgG1LALA 항체의 경사슬은, 서열 번호 1 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖고, 각각, MAb1 의 경사슬의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 과 동일하다. cMAb1_hIgG1LALA 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산은, 서열 번호 19 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다.
cMAb1_hIgG1LALA 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, MAb1 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열과 동일하고, 서열 번호 20 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. cMAb1_hIgG1LALA 항체의 중사슬은, 서열 번호 7 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖고, 각각, MAb1 의 중사슬의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 과 동일하다. cMAb1_hIgG1LALA 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, 서열 번호 21 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. cMAb1_hIgG1LALA 항체의 서열을 표 3 에 나타낸다.
[표 3]
래트 항마우스 CD25 항체 유래의 키메라 항체의 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항마우스 CD25 항체 (예를 들어, MAb2 항체) 의 경사슬 가변 영역과 인간 유래의 정상 영역을 포함하는 경사슬, 및, 당해 래트 항마우스 CD25 항체의 중사슬 가변 영역과 인간 유래의 정상 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
래트 항마우스 CD25 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항마우스 CD25 항체 (예를 들어, MAb2 항체) 의 경사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 중사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
래트 항마우스 CD25 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항마우스 CD25 항체 (예를 들어, MAb2 항체) 의 경사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 중사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb2 항체 유래의 키메라 항체로는, 예를 들어, 서열 번호 30 의 21 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 서열 번호 31 의 20 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb2 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 30 의 21 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 서열 번호 31 의 20 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb2 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 30 의 21 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 서열 번호 31 의 20 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb2 항체 유래의 키메라 항체의 구체예로는, 서열 번호 30 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및, 서열 번호 31 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 키메라 항마우스 CD25 항체를 본 명세서 중,「cMAb2_hIgG1LALA 항체」,「cMAb2_hIgG1LALA」라고 칭한다. cMAb2_hIgG1LALA 항체의 경사슬 아미노산 서열은 서열 번호 34 의 61 ∼ 717 번의 뉴클레오티드 서열로 코드되고, cMAb2_hIgG1LALA 항체의 중사슬 아미노산 서열은 서열 번호 35 의 58 ∼ 1389 번 뉴클레오티드 서열로 코드된다.
MAb2 항체 유래의 키메라 항체의 다른 구체예로는, 서열 번호 32 의 21 ∼ 239 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및, 서열 번호 33 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 키메라 항마우스 CD25 항체를 본 명세서 중,「cMAb2_hIgG1 항체」,「cMAb2_hIgG1」이라고 칭한다. cMAb2_hIgG1 항체의 경사슬 아미노산 서열은 서열 번호 36 의 61 ∼ 717 번의 뉴클레오티드 서열로 코드되고, cMAb2_hIgG1 항체의 중사슬 아미노산 서열은 서열 번호 37 의 58 ∼ 1389 번의 뉴클레오티드 서열로 코드된다.
MAb2 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 54 의 21 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 서열 번호 55 의 20 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb2 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 54 의 21 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 서열 번호 55 의 20 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb2 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 54 의 21 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및, 서열 번호 55 의 20 ∼ 133 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 갖고 있어도 된다.
MAb2 항체 유래의 키메라 항체의 구체예로는, 서열 번호 54 의 21 ∼ 239 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및, 서열 번호 55 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 키메라 항마우스 CD25 항체를 본 명세서 중,「cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체」혹은「cMAb2_hIgG1LALA-PA」라고 칭한다. cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체의 경사슬 아미노산 서열은 서열 번호 56 의 61 ∼ 717 번의 뉴클레오티드 서열로 코드되고, cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체의 중사슬 아미노산 서열은 서열 번호 57 의 58 ∼ 1389 번 뉴클레오티드 서열로 코드된다.
cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열은, MAb2 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열과 동일하고, 서열 번호 22 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체의 경사슬은, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖고, 각각, MAb2 의 경사슬의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 과 동일하다. cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산은, 서열 번호 23 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다.
cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, MAb2 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열과 동일하고, 서열 번호 24 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체의 중사슬은, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖고, 각각, MAb2 의 중사슬의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 과 동일하다. cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, 서열 번호 25 에 나타내는 뉴클레오티드 서열로 코드된다. cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체의 서열을 표 4 에 나타낸다.
[표 4]
인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; Complementarity Determining Region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해, CDR 의 서열에 더하여 일부의 프레임워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제 공개 제90/07861호), 또한, 항원에 대한 결합능을 유지하면서, 일부의 CDR 의 아미노산 서열을 개변한 항체를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, MAb1 항체 유래의 인간화 항체란, MAb1 항체에 대해, 고유의 6 개의 CDR 서열을 전부 유지하고, 또한, 내재화 활성을 갖는 인간화 항체이면 되고, 특정한 인간화 항체에 한정되지 않는다. 당해 인간화 항체는, 내재화 활성을 갖는 한, 추가로 일부의 CDR 의 일부의 아미노산 서열이 개편되어 있어도 된다.
MAb1 항체의 인간화 항체의 실례로는, (1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번 또는 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열 (hMAb1A-L, hMAb1B-L), (2) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (3) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 그리고 (4) 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번 또는 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열 (hMAb1A-H, hMAb1B-H), (5) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (6) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬의 임의의 조합을 들 수 있다.
또, 본 명세서 중에 있어서의 아미노산의 치환으로는 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측사슬에 관련이 있는 아미노산 그룹 내에서 발생하는 치환이다. 바람직한 아미노산 그룹은, 이하와 같다 : 산성 그룹 = 아스파르트산, 글루탐산 ; 염기성 그룹 = 리신, 아르기닌, 히스티딘 ; 비극성 그룹 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 ; 및 비대전 극성 패밀리 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 다른 바람직한 아미노산 그룹은 다음과 같다 : 지방족 하이드록시 그룹 = 세린 및 트레오닌 ; 아미드 함유 그룹 = 아스파라긴 및 글루타민 ; 지방족 그룹 = 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신 ; 그리고 방향족 그룹 = 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 이러한 아미노산 치환은 원래의 아미노산 서열을 갖는 물질의 특성을 저하시키지 않는 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.
상기 경사슬 및 중사슬의 바람직한 조합의 항체로는, 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hMAb1A-L 경사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 경사슬 또는 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hMAb1B-L 경사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 경사슬, 및, 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hMAb1A-H 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 중사슬 또는 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hMAb1B-H 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
바람직한 예로는, 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
상기 경사슬 및 중사슬의 바람직한 조합의 항체의 다른 예로는, 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열 (본 명세서 중, hMAb1A-L 경사슬 전체 길이 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 또는 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열 (본 명세서 중, hMAb1B-L 경사슬 전체 길이 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열 (본 명세서 중, hMAb1A-H 중사슬 전체 길이 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 또는 서열 번호 16 에 나타내는 아미노산 서열 (본 명세서 중, hMAb1B-H 중사슬 전체 길이 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
바람직한 예로는, 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 에 나타내는 아미노산 서열의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다 (본 명세서 중,「hMAb1A 항체」또는「hMAb1B 항체」라고도 칭한다).
보다 바람직한 예로는, 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다. hMAb1A 항체 및 hMAb1B 항체의 서열을 표 5-1 내지 표 5-4 에 나타낸다.
[표 5-1]
[표 5-2]
[표 5-3]
[표 5-4]
상기의 중사슬 아미노산 서열 및 경사슬 아미노산 서열과 높은 서열 동일성을 나타내는 서열을 조합함으로써, 상기의 각 항체와 동등한 생물 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 이와 같은 서열 동일성은, 일반적으로는 80 ％ 이상의 서열 동일성이고, 바람직하게는 90 ％ 이상의 서열 동일성이고, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 서열 동일성이고, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성이다. 또, 중사슬 또는 경사슬의 아미노산 서열에 하나 내지 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 조합하는 것에 의해서도, 상기의 각 항체와 동등한 생물 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편은, 이하의 (a) 또는 (b) 의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함한다.
(a) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 그리고, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3.
(b) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 그리고, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편은, 이하의 (a) 또는 (b) 의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함한다.
(a) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역.
(b) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역.
본 발명의 다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편은, 이하의 (a) 또는 (b) 의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함한다.
(a) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열에 있어서의 각 CDR 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 CDR 을 포함하고, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열에 있어서의 각 CDR 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 CDR 을 포함하고, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역.
(b) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열에 있어서의 각 CDR 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 CDR 을 포함하고, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열에 있어서의 각 CDR 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 CDR 을 포함하고, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역.
본 발명의 다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편은, 이하의 (a) 또는 (b) 의 중사슬 및 경사슬을 포함한다.
(a) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬.
(b) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬.
본 발명의 다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편은, 이하의 (a) 또는 (b) 의 중사슬 및 경사슬을 포함한다.
(a) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열에 있어서의 각 CDR 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 CDR 을 포함하고, 각 CDR 서열 이외의 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열에 있어서의 각 CDR 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 CDR 을 포함하고, 각 CDR 서열 이외의 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬.
(b) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열에 있어서의 각 CDR 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 CDR 을 포함하고, 각 CDR 서열 이외의 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열에 있어서의 각 CDR 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 CDR 을 포함하고, 각 CDR 서열 이외의 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％, 86 ％, 87 ％, 88 ％, 89 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％ 또는 94 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％ 또는 98 ％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬.
2 종류의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은, 예를 들어, ClustalW version2 (Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ and Higgins DG (2007),「Clustal W and Clustal X version 2.0」, Bioinformatics. 23 (21) : 2947-2948) 의 디폴트 파라미터를 사용하여 서열을 정렬시킴으로써 결정할 수 있지만, 당업자에게 있어서 사용되는 것이면 이것에 한정되지 않는다.
여기서, 서열의「동일성」이란, 아미노산 서열인 경우이면, 비교해야 하는 2 개의 아미노산 서열의 잔기가 가능한 한 많이 일치하도록 양 아미노산 서열을 정렬시키고, 일치한 잔기수를, 전체 잔기수로 나눈 것을 백분율로 나타낸 것이다. 상기 정렬시에는, 필요에 따라, 비교하는 2 개의 서열의 일방 또는 쌍방에 적절히 갭을 삽입한다. 이와 같은 서열의 정렬화는, 예를 들어 BLAST, FASTA, CLUSTALW 등의 주지된 프로그램을 사용하여 실시할 수 있다. 갭이 삽입되는 경우, 상기 전체 잔기수는, 1 개의 갭을 1 개의 잔기로서 센 잔기수가 된다. 이와 같이 하여 센 전체 잔기수가, 비교하는 2 개의 서열 사이에서 상이한 경우에는, 동일성 (％) 은, 긴 쪽의 서열의 전체 잔기수로, 일치한 잔기수를 나누어 산출된다. 염기 서열의 동일성에 대해서도 마찬가지이다.
본 명세서에 있어서의 아미노산의 서열 동일성은 서열 해석 소프트웨어인 GENETYX-SV/RC (주식회사 제네틱스 제조) 를 사용하여 산출되는 것이고, 이 알고리즘은, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것이다.
또한, 서열 번호 13 에 나타내는 hMAb1A-L 경사슬 전체 길이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 21 ∼ 127 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 128 ∼ 233 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 38 에 나타내는 hMAb1A-L 경사슬 전체 길이 뉴클레오티드 서열 중, 1 ∼ 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 코드하고, 61 ∼ 381 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 가변 영역을 코드하고, 382 ∼ 699 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.
서열 번호 14 에 나타내는 hMAb1B-L 경사슬 전체 길이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 21 ∼ 127 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 128 ∼ 233 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 39 에 나타내는 hMAb1B-L 경사슬 전체 길이 뉴클레오티드 서열 중, 1 ∼ 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 코드하고, 61 ∼ 381 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 가변 영역을 코드하고, 382 ∼ 699 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.
서열 번호 15 에 나타내는 hMAb1A-H 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 146 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 147 ∼ 476 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 40 에 나타내는 hMAb1A-H 중사슬 전체 길이 뉴클레오티드 서열 중, 1 ∼ 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 코드하고, 58 ∼ 438 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 가변 영역을 코드하고, 439 ∼ 1428 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.
서열 번호 16 에 나타내는 hMAb1B-H 중사슬 전체 길이 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 146 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 147 ∼ 476 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 서열 번호 41 에 나타내는 hMAb1B-H 중사슬 전체 길이 뉴클레오티드 서열 중, 1 ∼ 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 코드하고, 58 ∼ 438 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 가변 영역을 코드하고, 439 ∼ 1428 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.
본 발명의 항체로는, 또한, CD25 에 결합하는, 인간 항체를 들 수 있다. 항 CD25 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 CD25 인간 항체는, 인간 항체의 중사슬과 경사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143, ; Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 ; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999. ; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 등을 참조.) 에 의해 취득할 수 있다.
이와 같은 인간 항체 산생 마우스는, 구체적으로는, 내재성 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 유전자 자리가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 개재하여 인간 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 유전자 자리가 도입된 유전자 재조합 동물로서, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제조 및 이들 동물끼리를 교배시킴으로써 만들어 낼 수 있다.
또, 유전자 재조합 기술에 의해, 그와 같은 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환시키고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 산생하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중으로부터 얻을 수도 있다.
여기서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미엘로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.
또, 인간 항체 라이브러리로부터 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p.427-431 등 참조.) 도 알려져 있다.
예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 본쇄 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116) 을 사용할 수 있다.
항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석하는 것에 의해, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
항원에 결합하는 scFv 의 DNA 서열이 밝혀지면, 당해 서열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (국제 공개 제92/01047호, 동 92/20791호, 동 93/06213호, 동 93/11236호, 동 93/19172호, 동 95/01438호, 동 95/15388호, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116).
새롭게 제조된 인간 항체가, 본 명세서에 기재된 래트 항 CD25 항체, 키메라 항 CD25 항체 또는 인간화 항인간 CD25 항체 (예를 들어, MAb1 항체, MAb2 항체, cMAb1_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체, cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체, hMAb1A 항체, hMAb1B 항체) 중 어느 1 개가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 인간 항체가 당해 래트 항 CD25 항체, 키메라 항 CD25 항체 또는 인간화 항인간 CD25 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 혹은, 본 명세서에 기재된 래트 항 CD25 항체, 키메라 항 CD25 항체 또는 인간화 항인간 CD25 항체 (예를 들어, MAb1 항체, MAb2 항체, cMAb1_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체, cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체, hMAb1A 항체, hMAb1B 항체) 의 CD25 에 대한 결합에 대해 그 인간 항체가 경합하는 (예를 들어, MAb1 항체, MAb2 항체, cMAb1_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체, cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체, hMAb1A 항체 또는 hMAb1B 항체와 CD25 에 대한 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 인간 항체가 본 명세서에 기재된 래트 항 CD25 항체, 키메라 항 CD25 항체 또는 인간화 항인간 CD25 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 당해 판정 방법 중 적어도 어느 일방의 방법에 의해「동일한 에피토프에 결합한다」고 판정된 경우, 새롭게 제조된 인간 항체가, 본 명세서에 기재된 래트 항 CD25 항체, 키메라 항 CD25 항체 또는 인간화 항인간 CD25 항체와「동일한 에피토프에 결합한다」고 할 수 있다. 에피토프가 동일한 것이 확인된 경우, 그 인간 항체가 래트 항 CD25 항체, 키메라 항 CD25 항체 또는 인간화 항인간 CD25 항체 (예를 들어, MAb1 항체, MAb2 항체, cMAb1_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1LALA 항체, cMAb2_hIgG1 항체, cMAb2_hIgG1LALA-PA 항체, hMAb1A 항체 또는 hMAb1B 항체) 와 동등한 생물 활성을 갖고 있는 것이 기대된다.
이상의 방법에 의해 얻어진 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체는, 공지된 방법 등에 의해 항원에 대한 결합성을 평가하고, 바람직한 항체를 선발할 수 있다.
본 발명의 항체에는 항체의 수식체도 포함된다. 당해 수식체란, 본 발명의 항체에 화학적 또는 생물학적인 수식이 실시되어 이루어지는 것을 의미한다. 화학적인 수식체에는, 아미노산 골격에 대한 화학 부분의 결합, N-결합형 또는 O-결합형 탄수화물 사슬의 화학 수식체 등이 포함된다. 생물학적인 수식체에는, 번역 후 수식 (예를 들어, N-결합형 또는 O-결합형 당사슬의 부가, N 말단 또는 C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, 또는 N 말단 글루타민 혹은 N 말단 글루탐산의 피로글루탐산화) 된 것, 원핵 생물 숙주 세포를 사용하여 발현시킴으로써 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된 것 등이 포함된다. 또, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 가능하게 하기 위해 표지된 것, 예를 들어, 효소 표지체, 형광 표지체, 어피니티 표지체도 이러한 수식물의 의미에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 항체의 수식물은, 항체의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
또, 본 발명의 항체에 결합되어 있는 당사슬 수식을 조절하는 것 (글리코실화, 탈푸코오스화 등) 에 의해, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항체의 당사슬 수식의 조절 기술로는, 국제 공개 제1999/54342호, 동 2000/61739호, 동 2002/31140호, 동 2013/120066호 등이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체에는 당해 당사슬 수식이 조절된 항체도 포함된다.
항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 서열을 코드하는 유전자, 및 경사슬 서열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환시킬 때에는, 중사슬 서열 유전자와 경사슬 서열 유전자는, 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 각각의 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다.
진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 특히 동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아세포 NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220), FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 들 수 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다.
이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 당해 배양에 있어서는 항체의 서열에 따라 수량이 상이한 경우가 있으며, 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 항체에는, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체도 포함된다.
또한, 포유류 배양 세포로 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되는 것이 알려져 있으며 (Journal of Chromatography A, 705 : 129-134 (1995)), 또, 동일하게 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실되고, 새롭게 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 : 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중사슬 서열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 및 이펙터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 상해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 관련된 항체에는, 당해 수식을 받은 항체 및 당해 항체의 항원 결합 단편도 포함되고, 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실된 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중사슬) 등도 포함된다. 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되고 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 결실체는 상기의 종류에 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중사슬은, 완전 길이 및 상기의 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 중 어느 1 종이어도 되고, 어느 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양비는 본 발명에 관련된 항체를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로는 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단의 1 개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.
본 발명의 항체의 아이소타입으로는, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 를 들 수 있다. 본 발명의 항체의 아이소타입으로서 IgG1 을 사용하는 경우에는, IgG1 항체는 변이를 갖고 있어도 되고, 정상 영역의 아미노산 잔기의 일부를 치환함으로써, 이펙터 기능을 조정하는 것이 가능하다 (WO 88/007089, WO 94/28027, WO 94/29351 참조). 이펙터 기능을 감약시킨 IgG1 의 변이체로는, IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A), IgG1 LALA-PA (IgG1-L234A, L235A, P329A) 등을 들 수 있다.
항체의 생물 활성으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원과 결합함으로써 그 항원을 발현하는 세포에 내재화되는 활성, 항원의 활성을 중화시키는 활성, 항원의 활성을 증강시키는 활성, 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 매개 식작용 (ADCP) 을 들 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체가 갖는 기능은, CD25 에 대한 결합 활성이고, 바람직하게는 IL-2 블로킹능을 갖지 않고, CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성이다. 또한, 본 발명의 항체는, 세포 내재화 활성에 더하여, ADCC 활성, CDC 활성 및/또는 ADCP 활성을 겸비하고 있어도 된다.
얻어진 항체는, 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.
이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.
어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (파마시아) 등을 들 수 있다.
또 항원을 고정화한 담체를 사용하여, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제하는 것도 가능하다.
3. 항 CD25 항체-약물 콘주게이트
(1) 약물
상기「2. 항 CD25 항체의 제조」에서 취득된 항 CD25 항체는 링커 구조를 개재하여 약물을 결합시킴으로써, 항 CD25 항체-약물 콘주게이트로 할 수 있다. 약물로는, 링커 구조에 결합할 수 있는 치환기 또는 부분 구조를 갖는 것이면 특별히 제한은 없다. 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는 결합하는 약물에 따라 여러 가지 용도에 사용할 수 있다. 그와 같은 약물의 예로는, 세포 상해 활성을 갖는 물질 (세포 상해 활성 화합물을 포함한다), 항종양 활성을 갖는 물질, 화학 요법제, 분자 표적약, 면역 활성화제, 면역 억제제, 독소, 광 감수성 물질, 진단용 약제, 단백질, 펩티드, 아미노산, 핵산, 항원, 비타민, 호르몬, 혈액 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 자기 면역 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 항염증 물질, 항균 물질, 항진균 물질, 항기생충 물질, 항바이러스 물질, 항마취 물질 등을 들 수 있다.
(1)-1 세포 상해 활성 화합물
본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트에 결합되는 화합물로서 세포 상해 활성 화합물을 사용하는 예에 대해 이하에 서술한다. 본 발명의 항 CD25 항체에, 세포 내에서 독성을 발휘하는 약물을 특정한 구조의 링커를 개재하여 결합시킨 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, CD25 를 발현하는 암세포를 직접 살상하는 효과를 나타낼 수 있다. 세포 상해 활성 화합물로는, 세포 상해 효과를 갖는 화합물로서, 링커 구조에 결합할 수 있는 치환기 또는 부분 구조를 갖는 것이면 특별히 제한은 없다. 세포 상해 활성 화합물의 세포 상해 효과는, 링커의 일부 또는 전부가 혈구 세포 내 및 종양 세포 내에서 절단되어 세포 상해 활성 화합물 (링커의 일부를 포함해도 된다) 이 유리됨으로써 발현된다. 링커가 약물과의 결합 부분에서 절단되면 세포 상해 활성 화합물이 본래의 구조로 유리되고, 그 본래의 세포 상해 효과가 발휘되기 때문에 바람직하다.
상기「2. 항 CD25 항체의 제조」에서 취득된 항 CD25 항체는 링커 구조를 개재하여 세포 상해 활성 화합물을 결합시킴으로써, 항 CD25 항체-약물 콘주게이트로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 세포 상해 활성 화합물의 하나의 예로서, 캠프토테신 유도체인 엑사테칸 ((1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디하이드로-9-하이드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온 ; 다음 식 : )
[화학식 12]
을 바람직하게 사용할 수 있다. 동 화합물은, 예를 들어, 미국 특허공개공보 US 2016/0297890호에 기재된 방법이나 그 밖의 공지된 방법으로 용이하게 취득할 수 있으며, 1 위치의 아미노기를 링커 구조에 대한 결합 부위로서 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 엑사테칸은 링커의 일부가 결합한 상태에서 세포 내에서 유리되는 경우도 있지만, 이와 같은 상태에서도 우수한 세포 상해 효과가 발휘되는 화합물이다.
엑사테칸은 캠프토테신 구조를 가지므로, 산성 수성 매체 중 (예를 들어 pH 3 정도) 에서는 락톤 고리가 형성된 구조 (폐환체) 에 평형이 치우치고, 한편, 염기성 수성 매체 중 (예를 들어 pH 10 정도) 에서는 락톤 고리가 개환된 구조 (개환체) 에 평형이 치우치는 것이 알려져 있다. 이와 같은 폐환 구조 및 개환 구조에 대응하는 엑사테칸 잔기를 도입한 약물 콘주게이트여도 동등한 세포 상해 효과가 기대되며, 어느 것도 본 발명의 범위에 포함되는 것은 말할 것도 없다.
다른 세포 상해 활성 화합물로서 예를 들어, 문헌 (Pharmacological Reviews, 68, p3-19, 2016) 에 기재된 항종양 화합물을 들 수 있으며, 그 일례로서, 독소루비신 (Doxorubicin), 칼리키아마이신 (Calicheamicine), 도라스타틴 (Dorastatin) 10, 모노메틸아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F (MMAF) 등의 아우리스타틴류 (Auristatins), DM1, DM4 등의 메이탄시노이드류 (Maytansinoids), 피롤로벤조디아제핀 (Pyrrolobenzodiazepine) 이량체인 SG2000 (SJG-136), 캠프토테신의 유도체인 SN-38, CC-1065 등의 듀오카르마이신류 (Duocarmycins), 아마니틴 (Amanitin), 다우노루비신, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 시클로시티딘, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메토트렉세이트, 백금계 항종양제 (시스플라틴 혹은 그 유도체), 택솔 혹은 그 유도체 등을 들 수 있다.
항체-약물 콘주게이트에 있어서, 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는, 그 유효성, 안전성에 영향을 미치는 중요 인자이다. 항체-약물 콘주게이트의 제조는, 약물의 결합수가 일정한 수가 되도록, 반응시키는 원료·시약의 사용량 등의 반응 조건을 규정하여 실시되지만, 저분자 화합물의 화학 반응과는 달리, 상이한 수의 약물이 결합한 혼합물로서 얻어지는 것이 통상적이다. 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는 평균값, 즉, 약물 평균 결합수로서 특정되고, 표기된다. 본 발명에서도 원칙적으로 언급이 없는 한, 즉, 상이한 약물 결합수를 갖는 항체-약물 콘주게이트 혼합물에 포함되는 특정한 약물 결합수를 갖는 항체-약물 콘주게이트를 나타내는 경우를 제외하고, 약물의 결합수는 평균값을 의미한다. 항체 분자에 대한 엑사테칸의 결합수는 컨트롤 가능하며, 1 항체당 약물 평균 결합수로서, 1 ∼ 10 개 정도의 엑사테칸을 결합시킬 수 있지만, 바람직하게는 2 ∼ 8 개, 3 ∼ 8 개, 4 ∼ 8 개, 5 ∼ 8 개, 6 ∼ 8 개, 7 ∼ 8 개이고, 보다 바람직하게는 5 ∼ 8 개이고, 더욱 바람직하게는 7 ∼ 8 개이고, 보다 더욱 바람직하게는 8 개이다. 또한, 당업자라면 본원의 실시예의 기재로부터 항체에 필요한 수의 약물을 결합시키는 반응을 설계할 수 있고, 엑사테칸의 결합수를 컨트롤한 항체-약물 콘주게이트를 취득할 수 있다.
(2) 링커 구조
본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트에 있어서 약물을 항 CD25 항체에 결합시키는 링커 구조에 대해 서술한다.
본원의 항체-약물 콘주게이트에 있어서, 항 CD25 항체와 약물을 결합시키는 링커 구조는, 항체-약물 콘주게이트로서 사용할 수 있는 한에 있어서 특별히 제한되지 않고, 사용 목적에 따라 적절히 선택하여 사용할 수도 있다. 링커 구조의 일례로는, 공지 문헌 (Pharmacol Rev 68 : 3-19, January 2016, Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0 등) 에 기재된 링커를 들 수 있고, 더욱 구체적인 예로는, VC (발린-시트룰린 : valine-citrulline), MC (말레인아미도카프로일 : maleimidocaproyl), SMCC (숙신이미딜 4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 : succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), SPP (N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜탄산 : N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)pentanoate, SS (디술파이드 : disulfide), SPDB (N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부티레이트 ; N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)butyrate, SS/히드라존, 히드라존, 카르보네이트를 들 수 있다.
다른 일례로는, 예를 들어, 미국 특허공개공보 US 2016/0297890호에 기재된 링커 구조 (일례로서, 단락 [0260] ∼ [0289] 에 기재된 것) 를 들 수 있고, 이하의 구조의 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한 이하에 나타내는 구조의 좌단이 항체와의 결합 부위이고, 우단이 약물과의 결합 부위이다. 또, 하기의 링커 구조 중의 GGFG 는, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신 (GGFG) 으로 이루어지는 펩티드 결합으로 연결되어 있는 아미노산 서열을 나타낸다.
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
보다 바람직하게는, 다음의 것을 들 수 있다.
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
보다 더욱 바람직하게는,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
를 들 수 있다.
항체는 -(Succinimid-3-yl-N) 의 말단, (예를 들어,『-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-』에 있어서는, (-CH2CH2CH2CH2CH2-) 가 결합하는 것과는 반대측의 말단 (좌말단)) 에서 결합하고, 세포 상해 활성 화합물은 -(Succinimid-3-yl-N) 과는 반대측의 말단 (상기 예에서는 우말단의, CH2-O-CH2-C(=O)- 의 카르보닐기에서 결합한다. 『-(Succinimid-3-yl-N)-』는, 다음 식 :
[화학식 13]
으로 나타내는 구조를 갖는다. 이 부분 구조에 있어서의 3 위치가 항 CD25 항체에 대한 결합 부위이다. 이 3 위치에서의 그 항체와의 결합은, 티오에테르를 형성하여 결합하는 것이 특징이다. 이 구조 부분의 1 위치의 질소 원자는, 이 구조가 포함되는 링커 내에 존재하는 메틸렌의 탄소 원자와 결합한다.
약물을 엑사테칸으로 하는 본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 있어서는, 하기의 구조의 약물-링커 구조를 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 (바람직하게는 항체) 에 결합시킨 것이 바람직하다. 이들 약물-링커 구조는, 1 항체 또는 그 항체의 1 항원 결합 단편당 평균 결합수로서, 1 내지 10 을 결합시키면 되는데, 바람직하게는 2 내지 8 이고, 보다 바람직하게는 5 내지 8 이고, 더욱 바람직하게는 7 내지 8 이고, 보다 더욱 바람직하게는 8 이다.
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
보다, 바람직하게는, 다음의 것이다.
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
보다 더욱 바람직하게는, 다음의 것을 들 수 있다.
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
또, -(NH-DX) 는 다음 식 :
[화학식 14]
으로 나타내는 구조이고, 엑사테칸의 1 위치의 아미노기의 수소 원자 1 개가 제거되어 생성되는 기를 나타낸다.
어느 실시형태에 있어서, 본원의 항체-약물 콘주게이트에 있어서의, 항 CD25 항체와 약물을 결합시키는 링커 구조는, 이하의 구조의 것이어도 된다.
-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n1-C(=O)-L-GGFG-NH-X-C(=O)-.
여기서, n1 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
L 은, -NH-(CH2-CH2-O)n2-CH2-CH2-, 또는 단결합을 나타내고,
n2 는, 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
X 는, 탄소수 1 ∼ 20 개 (바람직하게는 탄소수 1 ∼ 10 개) 의 직사슬 또는 분기 사슬의 알킬렌기 (사슬 중의 1 또는 2 이상의 메틸렌기는 산소 원자 또는 황 원자로 치환되어도 된다.) 를 나타낸다. 그 알킬렌기는, 그 구조의 일부로서 탄소수 1 ∼ 6 의 고리형 포화 탄화수소기 (예를 들어, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜타닐기, 시클로헥사닐기, 시스-1,3-시클로부틸렌기, 트랜스-1,3-시클로부틸렌기, 시스-1,2-시클로프로필렌기, 트랜스-1,2-시클로프로필렌기, 시스-1,4-시클로헥실렌기, 트랜스-1,4-시클로헥실렌기 등) 를 갖고 있어도 된다.
또한, 항체와의 결합 부위, 약물과의 결합 부위, GGFG,『-(Succinimid-3-yl-N)-』는, 상기와 같다.
어느 실시형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 항 CD25 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 1 항체 분자당 약물 링커의 평균 결합수는, 바람직하게는 1 내지 10 이고, 보다 바람직하게는 2 내지 8 이고, 보다 더욱 바람직하게는 5 내지 8 이고, 보다 더욱 바람직하게는 7 내지 8 이고, 보다 더욱 바람직하게는 7.5 내지 8 이고, 보다 더욱 바람직하게는 약 8 이다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 있어서 사용되는 항 CD25 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 1 항체 분자당 약물 또는 결합된 약물 링커의 수는, 바람직하게는 2 내지 8 의 범위 내의 정수이고, 보다 바람직하게는 2, 4, 6 또는 8 이고, 보다 더욱 바람직하게는 8 이다.
(3) 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법
본 발명의 항체-약물 콘주게이트에 사용할 수 있는 항체는, 상기「2. 항 CD25 항체의 제조」의 항 및 실시예에 기재된 내재화 활성을 갖는 항 CD25 항체 및 그 항체의 항원 결합 단편이면 특별히 제한이 없다.
다음으로, 본 발명의 항체-약물 콘주게이트의 대표적인 제조 방법에 대해 설명한다. 또한, 이하에 있어서, 화합물을 나타내기 위해, 각 반응식 중에 나타내는 화합물의 번호를 사용한다. 즉,『식 (1) 의 화합물』,『화합물 (1)』등이라고 칭한다. 또, 이 이외의 번호의 화합물에 대해서도 동일하게 기재한다.
(3)-1 제조 방법 1
하기 식 (1) 로 나타내는 항체-약물 콘주게이트 중, 티오에테르를 개재하여 항 CD25 항체와 링커 구조가 결합되어 있는 것은 항 CD25 항체를 환원하여 디술파이드 결합을 술프하이드릴기로 변환한 항체에 대해, 이미 알려진 방법에 의해 입수할 수 있는 화합물 (2) (예를 들어, US 2016/297890호 공개특허공보에 기재된 방법 (예를 들어 단락 [0336] ∼ [0374] 에 기재된 방법) 으로 입수 가능) 를 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어 하기의 방법에 의해 제조할 수 있다.
[식 중, AB 는, 술프하이드릴기를 갖는 항체를 나타낸다.]
여기서, L1 은,
-(Succinimid-3-yl-N)- 의 구조로 나타낸다.
L1' 는 다음 식으로 나타내는, 말레이미딜기를 나타낸다.
[화학식 15]
-L1-LX 는, 이하의 식으로 나타내는 어느 구조를 갖는다.
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
이들 중에서 보다 바람직하게는, 다음의 것이다.
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
또한, 바람직하게는, 다음의 것을 들 수 있다.
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
또, 상기의 반응식에 있어서 항체-약물 콘주게이트 (1) 에서는, 약물로부터 링커 말단까지의 구조 부분 1 개가 1 개의 항체에 대해 결합한 구조로서 기재되어 있지만, 이것은 설명을 위한 편의적인 기재로서, 실제로는 당해 구조 부분이 1 개의 항체 분자에 대해 복수개가 결합되어 있는 경우가 많다. 이 상황은 이하의 제조 방법의 설명에 있어서도 마찬가지이다.
즉, 이미 알려진 방법에 의해 입수할 수 있는 화합물 (2) (예를 들어, US 2016/297890호 공개특허공보에 기재된 방법 (예를 들어 단락 [0336] ∼ [0374] 에 기재된 방법) 으로 입수 가능) 와, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 반응시킴으로써, 항체-약물 콘주게이트 (1) 을 제조할 수 있다.
술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 는, 당업자에게 주지된 방법으로 얻을 수 있다 (Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, pp.56-136, pp.456-493, Academic Press (1996)). 예를 들어, Traut's 시약을 항체의 아미노기에 작용시키거나 ; N-숙신이미딜S-아세틸티오알카노에이트류를 항체의 아미노기에 작용시킨 후, 하이드록실아민을 작용시키거나 ; N-숙신이미딜3-(피리딜디티오)프로피오네이트를 작용시킨 후, 환원제를 작용시키거나 ; 디티오트레이톨, 2-메르캅토에탄올, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염 (TCEP) 등의 환원제를 항체에 작용시켜 항체 내 사슬 사이부의 디술파이드 결합을 환원하여 술프하이드릴기를 생성시키는 ; 등의 방법을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로는, 환원제로서 TCEP 를, 항체 내 사슬 사이부 디술파이드 1 개당에 대해 0.3 내지 3 몰 당량 사용하고, 킬레이트제를 포함하는 완충액 중에서, 항체와 반응시킴으로써, 항체 내 사슬 사이부 디술파이드가 부분적 혹은 완전히 환원된 항체를 얻을 수 있다. 킬레이트제로는, 예를 들어 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 이나 디에틸렌트리아민오아세트산 (DTPA) 등을 들 수 있다. 이들을 1 mM 내지 20 mM 의 농도로 사용하면 된다. 완충액으로는, 인산나트륨이나 붕산나트륨, 아세트산나트륨 용액 등을 사용할 수 있다. 구체적인 예에 있어서, 항체는 4 ℃ 내지 37 ℃ 에서 1 내지 4 시간 TCEP 와 반응시킴으로써 부분적 혹은 완전히 환원된 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 얻을 수 있다.
또한, 여기서 술프하이드릴기를 약물-링커 부분에 부가시키는 반응을 실시시킴으로써 티오에테르 결합에 의해 약물-링커 부분을 결합시킬 수 있다.
다음으로, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 1 개당, 2 내지 20 몰 당량의 화합물 (2) 를 사용하여, 항체 1 개당 2 개 내지 8 개의 약물이 결합한 항체-약물 콘주게이트 (1) 을 제조할 수 있다. 구체적으로는, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 포함하는 완충액에, 화합물 (2) 를 용해시킨 용액을 첨가하여 반응시키면 된다. 여기서, 완충액으로는, 아세트산나트륨 용액, 인산나트륨이나 붕산나트륨 등을 사용하면 된다. 반응시의 pH 는 5 내지 9 이고, 보다 바람직하게는 pH 7 부근에서 반응시키면 된다. 화합물 (2) 를 용해시키는 용매로는, 디메틸술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피리돈 (NMP) 등의 유기 용매를 사용할 수 있다. 화합물 (2) 를 용해시킨 유기 용매 용액을, 술프하이드릴기를 갖는 항체 (3a) 를 포함하는 완충액에 1 내지 20 ％v/v 를 첨가하여 반응시키면 된다. 반응 온도는, 0 내지 37 ℃, 보다 바람직하게는 10 내지 25 ℃ 이고, 반응 시간은, 0.5 내지 2 시간이다. 반응은, 미반응의 화합물 (2) 의 반응성을 티올 함유 시약에 의해 실활시킴으로써 종료할 수 있다. 티올 함유 시약은 예를 들어, 시스테인 또는 N-아세틸-L-시스테인 (NAC) 이다. 보다 구체적으로는, NAC 를, 사용한 화합물 (2) 에 대해, 1 내지 2 몰 당량 첨가하고, 실온에서 10 내지 30 분 인큐베이트함으로써 반응을 종료할 수 있다.
(4) 항체-약물 콘주게이트의 동정
제조한 항체-약물 콘주게이트 (1) 은, 이하의 공통 조작에 의해 농축, 버퍼 교환, 정제, 항체 농도 및 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정을 실시하고, 항체-약물 콘주게이트 (1) 의 동정을 실시할 수 있다.
(4)-1 공통 조작 A : 항체 혹은 항체-약물 콘주게이트 수용액의 농축
Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation) 의 용기 내에 항체 혹은 항체-약물 콘주게이트 용액을 넣고, 원심기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용한 원심 조작 (2000 G 내지 3800 G 로 5 내지 20 분간 원심) 으로, 항체 혹은 항체-약물 콘주게이트 용액을 농축시킨다.
(4)-2 공통 조작 B : 항체의 농도 측정
UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) 를 사용하여, 메이커 규정의 방법에 따라, 항체 농도의 측정을 실시한다. 그 때에, 항체마다 상이한 280 ㎚ 흡광 계수 (1.3 mLmg-1㎝-1 내지 1.8 mLmg-1㎝-1) 를 사용한다.
(4)-3 공통 조작 C : 항체의 버퍼 교환
Sephadex G-25 담체를 사용한 NAP-25 칼럼 (Cat.No.17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) 을, 메이커 규정의 방법에 따라, 염화나트륨 (50 mM) 및 EDTA (2 mM) 를 포함하는 인산 완충액 (50 mM, pH 6.0) (본 명세서에서 PBS6.0/EDTA 라고 칭한다.) 으로 평형화시킨다. 이 NAP-25 칼럼 1 개에 대해, 항체 수용액 2.5 mL 를 올린 후, PBS6.0/EDTA 3.5 mL 로 용출시킨 획분 (3.5 mL) 을 분취하였다. 이 획분을 공통 조작 A 에 의해 농축시키고, 공통 조작 B 를 사용하여 항체 농도의 측정을 실시한 후에, PBS6.0/EDTA 를 사용하여 20 mg/mL 로 항체 농도를 조정한다.
(4)-4 공통 조작 D : 항체-약물 콘주게이트의 정제
시판되는 Sorbitol (5 ％) 을 포함하는 아세트산 완충액 (10 mM, pH 5.5 ; 본 명세서에서 ABS 라고 칭한다.) 중 어느 완충액으로 NAP-25 칼럼을 평형화시켰다. 이 NAP-25 칼럼에, 항체-약물 콘주게이트 반응 수용액 (약 2.5 mL) 을 올리고, 메이커 규정의 양의 완충액으로 용출시킴으로써, 항체 획분을 분취한다. 이 분취 획분을 다시 NAP-25 칼럼에 올리고 완충액으로 용출시키는 겔 여과 정제 조작을 합계 2 내지 3 회 반복함으로써, 미결합의 약물 링커나 저분자 화합물 (트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염 (TCEP), N-아세틸-L-시스테인 (NAC), 디메틸술폭시드) 을 제거한 항체-약물 콘주게이트를 얻는다.
(4)-5 공통 조작 E : 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정
항체-약물 콘주게이트에 있어서의 결합 약물 농도는, 항체-약물 콘주게이트 수용액의 280 ㎚ 및 370 ㎚ 의 2 파장에 있어서의 UV 흡광도를 측정한 후에 하기의 계산을 실시함으로써, 산출할 수 있다.
어느 파장에 있어서의 전체 흡광도는 계 내에 존재하는 모든 흡수 화학종의 흡광도의 합과 동등한 [흡광도의 가성성 (加成性)] 으로부터, 항체와 약물의 콘주게이션 전후에 있어서, 항체 및 약물의 몰 흡광 계수에 변화가 없는 것으로 가정하면, 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 농도 및 약물 농도는, 하기의 관계식으로 나타낸다.
A280 = AD,280 + AA,280 = εD,280CD + εA,280CA 식 (1)
A370 = AD,370 + AA,370 = εD,370CD + εA,370CA 식 (2)
여기서, A280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체-약물 콘주게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, A370 은 370 ㎚ 에 있어서의 항체-약물 콘주게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, AA,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AA,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AD,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 콘주게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, AD,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 콘주게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, εA,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,280 은 280 ㎚ 에 있어서의 콘주게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,370 은 370 ㎚ 에 있어서의 콘주게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA 는 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 농도를 나타내고, CD 는 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 약물 농도를 나타낸다.
여기서, εA,280, εA,370, εD,280, εD,370 은, 사전에 준비한 값 (계산 추정값 혹은 화합물의 UV 측정으로부터 얻어진 실측값) 이 사용된다. 예를 들어, εA,280 은, 항체의 아미노산 서열로부터, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해 추정할 수 있다. εA,370 은, 통상적으로 제로이다. εD,280 및 εD,370 은, 사용하는 콘주게이트 전구체를 어느 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정함으로써, 람베르트·비어의 법칙 (흡광도 = 몰 농도 × 몰 흡광 계수 × 셀 광로 길이) 에 의해 얻을 수 있다. 항체-약물 콘주게이트 수용액의 A280 및 A370 을 측정하고, 이들 값을 식 (1) 및 (2) 에 대입하여 연립 방정식을 푸는 것에 의해, CA 및 CD 를 구할 수 있다. 또한 CD 를 CA 로 나눔으로써 1 항체당 약물 평균 결합수를 구할 수 있다.
(4)-6 공통 조작 F : 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수의 측정 (2)
항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수는, 전술한「(4)-5 공통 조작 E」에 더하여, 이하의 방법을 사용하는 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해서도 구할 수 있다. 이하에, 항체와 약물 링커가 디술파이드 결합되어 있는 경우의 HPLC 에 의한 약물 평균 결합수의 측정 방법을 기재한다. 당업자는, 이 방법을 참조하여, 항체와 약물 링커의 결합 양식에 의존하여 적절히 HPLC 에 의해 약물 평균 결합수를 측정할 수 있다.
F-1. HPLC 분석용 샘플의 조제 (항체-약물 콘주게이트의 환원)
항체-약물 콘주게이트 용액 (약 1 mg/mL, 60 μL) 을 디티오트레이톨 (DTT) 수용액 (100 mM, 15 μL) 과 혼합한다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이트함으로써, 항체-약물 콘주게이트의 경사슬 및 중사슬 사이의 디술파이드 결합을 절단한 샘플을, HPLC 분석에 사용한다.
F-2. HPLC 분석
HPLC 분석을, 하기의 측정 조건에서 실시한다.
HPLC 시스템 : Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 ㎚)
칼럼 : ACQUITY UPLC BEH Phenyl (2.1 × 50 ㎜, 1.7 ㎛, 130 Å ; Waters, P/N 186002884)
칼럼 온도 : 80 ℃
이동상 A : 0.10 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA), 15 ％ 2-프로판올을 포함하는 수용액
이동상 B : 0.075 ％ TFA, 15 ％ 2-프로판올을 포함하는 아세토니트릴 용액
그레이디언트 프로그램 : 14 ％-36 ％ (0 분-15 분), 36 ％-80 ％ (15 분-17 분), 80 ％-14 ％ (17 분-17.01 분), 14 ％ (17.01 분-25 분)
샘플 주입량 : 10 μL
F-3. 데이터 해석
F-3-1 약물이 결합되어 있지 않은 항체의 경사슬 (L0) 및 중사슬 (H0) 에 대해, 약물이 결합한 경사슬 (약물이 i 개 결합한 경사슬 : Li) 및 중사슬 (약물이 i 개 결합한 중사슬 : Hi) 은, 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 증가하고 유지 시간이 커지는 점에서, 예를 들어, L0, L1, H0, H1, H2, H3 의 순서대로 용출된다. L0 및 H0 과의 유지 시간 비교에 의해 검출 피크를 L0, L1, H0, H1, H2, H3 중 어느 것에 할당할 수 있다. 약물 결합수는, 당업자에 의해 정의될 수 있지만, 바람직하게는 L0, L1, H0, H1, H2, H3 이다.
F-3-2 약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, 약물 링커의 결합수에 따라, 경사슬, 중사슬 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 식에 따라 피크 면적값의 보정을 실시한다.
여기서, 각 항체에 있어서의 경사슬 및 중사슬의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해, 각 항체의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열로부터 추정되는 값을 사용할 수 있다. cMAb1_hIGg1LALA 의 경우, 그 아미노산 서열에 따라, 경사슬의 몰 흡광 계수로서 32742 를, 중사슬의 몰 흡광 계수로서 84458 을 추정값으로서 사용할 수 있다. 또, 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 각 약물 링커를 메르캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인으로 반응시키고, 말레이미드기를 숙신이미드티오에테르로 변환한 화합물의 실측의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 를 사용할 수 있다. 흡광도를 측정하는 파장은, 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있지만, 바람직하게는 항체의 피크가 측정될 수 있는 파장이고, 보다 바람직하게는 280 ㎚ 이다.
F-3-3 피크 면적 보정값 합계에 대한 각 사슬 피크 면적비 (％) 를 하기 식에 따라 계산한다.
F-3-4 항체-약물 콘주게이트에 있어서의 항체 1 분자당 약물 평균 결합수를, 하기 식에 따라 계산한다.
약물 평균 결합수 = (L0 피크 면적비 × 0 + L1 피크 면적비 × 1 + H0 피크 면적비 × 0 + H1 피크 면적비 × 1 + H2 피크 면적비 × 2 + H3 피크 면적비 × 3)/100 × 2
또한, 항체-약물 콘주게이트의 양을 확보하기 위해, 동일한 조건에서 제조하여 얻어진 약물 평균 결합수가 동일한 정도인 복수의 항체-약물 콘주게이트 (예를 들어 ± 1 정도) 를 혼합하여 새로운 로트로 할 수 있다. 그 경우, 약물 평균 결합수는 혼합 전의 약물 평균 결합수 사이에 들어간다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트의 하나의 구체예로는 다음 식 :
[화학식 16]
또는 다음 식 :
[화학식 17]
으로 나타내는 구조를 갖는 것을 들 수 있다.
여기서, AB 는 본 명세서에서 개시되는 항 CD25 항체를 나타내고, 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합 링커와 결합되어 있다. 여기서, n 은 이른바 DAR (Drug-to-Antibody Ratio) 와 동일한 의미이고, 1 항체당 약물 항체비를 나타낸다. 즉, 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수를 나타내지만, 이것은 평균값, 즉, 약물 평균 결합수로서 특정되고, 표기되는 수치이다. AB 는, 상기 항체의 항원 결합 단편이어도 되며, 그 경우, n 은, 그 항체의 항원 결합 단편과 결합되어 있는 약물-링커 구조의, 그 항체의 1 항원 결합 단편당 평균 결합수를 나타낸다. 본 발명의 [화학식 16] 및 [화학식 17] 로 나타내는 항체-약물 콘주게이트의 경우, 공통 조작 F 에 의한 측정으로, n 은, 2 내지 8 이면 되고, 바람직하게는 5 내지 8 이고, 더욱 바람직하게는 7 내지 8 이고, 보다 더욱 바람직하게는 8 이다.
본 발명의 항체 약물-콘주게이트의 일례로서, 상기 식 [화학식 16] 또는 [화학식 17] 에 나타내는 구조에 있어서, AB 로 나타내는 항체가, 이하의 (a) 내지 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 및 경사슬의 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는, 항체-약물 콘주게이트 또는 그 약학상 허용되는 염을 들 수 있다 :
(a) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
(b) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 또는
(c) 중사슬 또는 경사슬이 N-결합형 당사슬의 부가, O-결합형 당사슬의 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말단 글루타민이나 N 말단 글루탐산의 피로글루탐산화 등으로 대표되는 번역 후 수식, 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는, (a) 또는 (b) 에 기재된 항체.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트의 다른 예로서, 상기 식 [화학식 16] 또는 [화학식 17] 에 나타내는 구조에 있어서, AB 로 나타내는 항체가, 이하의 (a) 내지 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는, 항체-약물 콘주게이트 또는 그 약학상 허용되는 염을 들 수 있다 :
(a) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 ;
(b) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 ; 또는
(c) 중사슬 또는 경사슬이 N-결합형 당사슬의 부가, O-결합형 당사슬의 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말단 글루타민이나 N 말단 글루탐산의 피로글루탐산화 등으로 대표되는 번역 후 수식, 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는, (a) 또는 (b) 에 기재된 항체.
4. 의약
상기「2. 항 CD25 항체의 제조」의 항 및 실시예에 기재된 본 발명의 항 CD25 항체 및 당해 항체의 항원 결합 단편은, 세포 표면의 CD25 에 결합하고, 내재화 활성을 갖는 점에서, 단독으로 혹은 다른 약제와 조합하여, 의약으로서, 특히 암의 치료제로서 사용할 수 있다.
또, CD25 를 발현하고 있는 세포의 검출에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 항 CD25 항체 및 당해 항체의 항원 결합 단편은, 내재화 활성을 갖는 점에서, 항체-약물 콘주게이트에 사용하는 항체로서 제공할 수 있다.
상기「3. 항 CD25 항체-약물 콘주게이트」의 항 및 실시예에 기재된 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트 중에서 약물로서 세포 상해 활성을 갖는 약물이 사용되고 있는 것은, 내재화 활성을 갖는 항 CD25 항체 및/또는 당해 항체의 항원 결합 단편과 세포 상해 활성을 갖는 약물의 콘주게이트이고, Treg 및 CD25 를 발현하고 있는 암세포에 대해 세포 상해 활성을 나타내는 점에서, 의약으로서, 특히 암에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다. 당해 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, CD25 를 발현하는 암세포를 직접 살상하는 효과를 나타낼 수 있다. 게다가, 당해 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 종래의 항 CD25 항체 및 항 CD25 항체-약물 복합체보다 강한 Treg 제거능 및/또는 그랜자임 (GZMB) 양성 CD8 양성 T 세포 유도 활성을 나타낼 수 있다. 따라서, 당해 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, Treg 억제 효과에 의한 항종양 활성을 발휘하는 것을 기대할 수 있고, CD25 를 발현하는 암세포를 갖는 환자 및 종양 면역이 Treg 에 의해 억제되고 있는 암환자에게 투여함으로써, 우수한 항종양 효과 및 안전성을 달성하는 것을 기대할 수 있다.
본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 대기 중에 방치하거나, 또는 재결정이나 정제 조작을 하거나 함으로써, 수분을 흡수하거나, 혹은 흡착수가 부착되거나 하여, 수화물이 되는 경우가 있으며, 그와 같은 물을 포함하는 화합물 또는 약학상 허용될 수 있는 염도 각각 본 발명의 실시형태의 하나로서, 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트가, 아미노기 등의 염기성기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라 약학상 허용될 수 있는 산 부가염을 형성할 수 있다. 그와 같은 산 부가염으로는, 예를 들어 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염 등의 할로겐화수소산염 ; 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염 등의 저급 알칸술폰산염 ; 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염 등의 아릴술폰산염 ; 포름산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 또는 오르니틴산염, 글루탐산염, 아스파르트산염 등의 아미노산염 등을 들 수 있다.
본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트가, 카르복시기 등의 산성기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라 약학상 허용될 수 있는 염기 부가염을 형성할 수 있다. 그와 같은 염기 부가염으로는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 ; 암모늄염 등의 무기염 ; 디벤질아민염, 모르폴린염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 시클로헥실아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 디에탄올아민염, N-벤질-N-(2-페닐에톡시)아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염 등의 유기 아민염 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항체-약물 콘주게이트를 구성하는 원자의 1 이상이, 그 원자의 동위체로 치환된 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항 CD25 항체-약물 콘주게이트를 포함할 수 있다. 동위체에는 방사성 동위체 및 안정 동위체의 2 종류가 존재하며, 동위체의 예로는, 예를 들어, 수소의 동위체 (2H 및 3H), 탄소의 동위체 (11C, 13C 및 14C), 질소의 동위체 (13N 및 15N), 산소의 동위체 (15O, 17O 및 18O), 불소의 동위체 (18F) 등을 들 수 있다. 동위체로 표지된 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 조성물은, 예를 들어, 치료제, 예방제, 연구 시약, 어세이 시약, 진단제, 인비보 화상 진단제 등으로서 유용하다. 동위체로 표지된 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항체-약물 콘주게이트, 및, 동위체로 표지된 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항체-약물 콘주게이트의 임의의 비율의 혼합물도 전부 본 발명에 포함된다. 동위체로 표지된 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항체-약물 콘주게이트는, 당해 분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 후술하는 본 발명의 제조 방법에 있어서의 원료 대신에 동위체로 표지된 원료를 사용함으로써 제조할 수 있다.
in vitro 에서의 살세포 활성은 예를 들어, 세포의 증식 억제 활성으로 측정할 수 있다. 예를 들어, CD25 를 과잉 발현하고 있는 암세포주를 배양하고, 배양계에 여러 가지 농도로 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항 CD25 항체-약물 콘주게이트를 첨가하고, 포커스 활성, 콜로니 형성 및 스페로이드 증식에 대한 억제 활성을 측정할 수 있다. 여기서, 비호지킨 림프종 유래 암세포주 및 급성 골수성 백혈병 유래 암세포주를 사용함으로써, 비호지킨 림프종 및 급성 골수성 백혈병에 대한 세포 증식 억제 활성을 조사할 수 있다. 또한, 인간 정상 도너 및/또는 환자로부터 단리된 Treg 혹은 in vitro 에서 유도한 Treg (iTreg) 를 사용함으로써, Treg 에 대한 세포 증식 억제 활성을 조사할 수 있다.
in vivo 에서의 실험 동물을 사용한 암에 대한 치료 효과는, 예를 들어, 종양 세포주를 이식한 신제닉 마우스에 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항 CD25 항체-약물 콘주게이트를 투여하고, 암세포의 변화 (예를 들어, 종양 체적의 변화) 를 측정함으로써 평가할 수 있다. 또, 그 때에 종양 내의 면역 세포의 변동 (예를 들어, 면역 세포의 세포수의 변동) 도 측정할 수 있다. 또한, 종양 세포주를 이식한 인간 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기세포의 이입을 수반하는 NOG 마우스 (huNOG 마우스) 에 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항 CD25 항체-약물 콘주게이트를 투여하고, 종양 내의 면역 세포의 변동 (예를 들어, 면역 세포의 세포수의 변동) 도 측정할 수 있다. 이들에 의해, 암에 대한 치료 효과를 측정할 수 있다.
본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트가 적용되는 암의 종류로는, 치료 대상이 되는 암세포에 있어서 CD25 를 발현하고 있는 암 혹은 종양 면역이 Treg 에 의해 억제되고 있으면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 혈액암 (B 세포 림프종, T/NK 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병), 고형 종양 (유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 뇌종양, 신경 교종, 안종양, 식도암, 위암, 대장암, 결장암, 간암, 췌장암, 신암, 신장암, 방광암, 부신 피질암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체암, 난소암, 흑색종, 육종) 을 들 수 있다. 또한, 고빈도 마이크로새틀라이트 불안정성 (microsatellite instability-high : MSI-H), 미스매치 수복 기구 결손 (mismatch repair deficient : dMMR) 또는 높은 종양 유전자 변이량 (tumor mutation burden-high : TMB-H) 과 같은 바이오 마커를 갖는 것이 특정되는 암도 들 수 있다. 보다 바람직한 암의 예로는, 비소세포 폐암, 두경부암, 식도암, 위암, 흑색종을 들 수 있다.
본 발명의 항체, 당해 항체의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트 (본 단락에서는, 당해 항 CD25 항체-약물 콘주게이트의 링커가 절단되어 유리된 약물도 포함한다) 는, CD25 에 대한 결합 활성, IL-2 블로킹능, 이펙터 기능, 제어성 T 세포의 제거능, FoxP3 음성 CD4 양성 세포, CD8 양성 세포 및/또는 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진 능력, 결합 특이성, 항원 결합능, 내재화 활성, 항종양 활성, 용해성, 세포막 투과성, 혈중 농도, 대사 안정성, 조직 이행성, 바이오어베일러빌리티 (bioavailability), in vitro 활성, in vivo 활성, 약효 발현의 속도, 약효의 지속성, 물리적 안정성, 약물 상호 작용, 독성 등에 있어서, 하나 또는 복수의 관점에서 우수한 성질을 갖고, 의약으로서 유용하다. 본 단락에서 말하는「의약으로서 유용」이란, 반드시 상기의 여러 가지 능력·효과·작용·성질에 대해, 예를 들어,「있다」,「높다」,「크다」,「많다」,「양성」등에 의해 우수한 성질을 갖고, 의약으로서 유용한 경우뿐만 아니라, 상기의 능력·효과·작용·성질에 대해, 예를 들어,「없다」,「낮다」,「작다」,「적다」,「음성」등에 의해 우수한 성질을 갖고, 의약으로서 유용한 경우도 포함한다 (예를 들어, 독성이 낮다 등).
본 발명의 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 포유 동물에 대해 바람직하게 투여할 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트가 포함되는 의약 조성물에 있어서 사용되는 물질로는, 투여량이나 투여 농도에 따라, 이 분야에 있어서 통상적으로 사용되는 제제 첨가물 및 그 외에서 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 1 종 이상의 약학적으로 적합성의 성분을 포함하는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은, 대표적으로는, 1 종 이상의 약학적 캐리어 (예를 들어, 멸균한 액체 (예를 들어, 물 및 기름 (석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 기름 (예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등) 을 포함한다)) 를 포함한다. 물은, 상기 약학적 조성물이 정맥 내 투여되는 경우에 보다 대표적인 캐리어이다. 식염수 용액, 그리고 덱스트로오스 수용액 및 글리세롤 수용액 또한, 액체 캐리어로서, 특히, 주사용 용액을 위해 사용될 수 있다. 적절한 약학적 부형제는, 당해 분야에서 공지되어 있다. 상기 조성물은 또한, 원한다면, 미량의 습윤제 혹은 유화제, 또는 pH 완충화제를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 캐리어의 예는, E. W. Martin 에 의한「Remington's Pharmaceutical Sciences」에 기재된다. 그 처방은, 투여의 양태에 대응한다.
여러 가지 송달 시스템이 공지되어 있으며, 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법으로는, 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 및 피하의 경로를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 투여는, 예를 들어, 주입 또는 볼러스 주사에 의한 것일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항체-약물 콘주게이트의 투여는, 주입에 의한 것이다. 비경구적 투여는, 바람직한 투여 경로이다.
대표적 실시형태에 있어서, 상기 약학적 조성물은, 인간에 대한 정맥 내 투여에 적합한 약학적 조성물로서, 상습적 순서에 따라 처방된다. 대표적으로는, 정맥 내 투여를 위한 조성물은, 멸균의 등장성의 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 의약은 또한, 가용화제 및 주사 부위에서의 동통을 완화시키기 위한 국소 마취제 (예를 들어, 리그노카인) 를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은, (예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사쉐 등에 밀봉하여 시일된 용기 중의 건조 동결 건조 분말 또는 무수의 농축물로서, 별개로, 또는 단위 제형 중에서 함께 혼합하여 중 어느 것으로 공급된다. 상기 의약이 주입에 의해 투여될 예정인 경우, 그것은, 예를 들어, 멸균의 제약 그레이드의 물 또는 식염수를 포함하는 주입 보틀로 투약될 수 있다. 상기 의약이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은, 예를 들어, 상기 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록, 제공될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 본원의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 본원의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트만을 포함하는 의약 조성물이어도 되고, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항 CD25 항체-약물 콘주게이트, 및, 적어도 1 개의 이것 이외의 암 치료제를 포함하는 의약 조성물이어도 된다. 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 다른 암 치료제와 함께 투여할 수도 있으며, 이것에 의해 항암 효과를 증강시킬 수 있다. 이와 같은 목적에서 사용되는 다른 항암제는, 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 항체-약물 콘주게이트와 동시에, 따로, 혹은 연속하여 개체에 투여되어도 되고, 각각의 투여 간격을 바꾸어 투여해도 된다. 이와 같은 암 치료제로서, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴 등을 포함하는 백금 제제, 파클리탁셀, 도세탁셀 등을 포함하는 탁산계 화합물, 5-플루오로우라실, 젬시타빈 등의 대사 길항제, 타목시펜 등의 항에스트로겐, 레트로졸 등의 아로마타아제 저해제, 엔잘루타미드 등의 안드로겐 수용체 길항약, 이매티닙, 수니티닙, 렌바티닙 등을 포함하는 티로신 키나아제 저해제, 팔보시클립 등을 포함하는 CDK4/6 저해제, 올라파립 등을 포함하는 PARP 저해제, 피미테스핍 등을 포함하는 HSP90 저해제, 카보잔티닙 등을 포함하는 MEK 저해제, 다브라페닙 등을 포함하는 BRAF 저해제, 아다그라십 등을 포함하는 KRAS 저해제, 푸티바티닙 등을 포함하는 FGFR 저해제, IL-2, IFN-γ, G-CSF 등을 포함하는 사이토카인, 베바시주맙 등을 포함하는 혈관 신생 저해제, 트라스투주맙, 리툭시맙, 파니투무맙 등을 포함하는 종양 항원 혹은 마커 항원을 표적으로 한 모노클로날 항체, 트라스투주맙 데룩스테칸 등을 포함하는 항체-약물 콘주게이트, 이필리무맙, 렐라틀리맙 등을 포함하는 면역 체크포인트 저해제 등을 들 수 있지만, 항종양 활성을 갖는 약제이면 한정되는 것은 아니다.
이와 같은 의약 조성물은, 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 제제로서, 동결 건조 제제 혹은 액상 제제로서 제제화하면 된다. 동결 건조 제제로서 제제화할 때에는, 이 분야에 있어서 사용되는 적당한 제제 첨가물이 포함되는 제제여도 된다. 또 액제에 있어서도 동일하게 하여, 이 분야에 있어서 사용되는 각종 제제 첨가물을 포함하는 액상 제제로서 제제화할 수 있다.
의약 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 의해서도 변화하지만, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 항체-약물 콘주게이트의 항원에 대한 친화성, 즉, 항원에 대한 해리 정수 (Kd 값) 의 점에 있어서, 친화성이 높을수록 (Kd 값이 낮을수록), 소량의 투여량이어도 약효를 발휘시킬 수 있다. 따라서, 본원의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 항체-약물 콘주게이트의 투여량의 결정에 있어서는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 항체-약물 콘주게이트와 항원의 친화성의 상황에 기초하여 투여량을 설정할 수도 있다. 본 발명의 본원의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항체-약물 콘주게이트를 인간에 대해 투여할 때에는, 예를 들어, 약 0.001 ∼ 100 mg/㎏ 을 1 회 혹은 1 ∼ 180 일간에 1 회의 간격으로 복수회 투여하면 된다.
본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트와 함께 투여할 수 있는 다른 암 치료제로는, 바람직하게는 면역 체크포인트 저해제를 들 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는, 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트와, 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는 것이어도 되고, 항체-약물 콘주게이트와, 면역 체크포인트 저해제가, 단일의 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 투여되는 것을 특징으로 하는 것이어도 된다.
본 발명의 일 양태에서는, 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트와, 면역 체크포인트 저해제는, 각각 투여 경로가 상이해도 된다.
또, 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 항종양 면역을 활성화하는 작용에 의해 개선되는 질환의 치료용으로, 단일의 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 투여되는 것이어도 된다.
본 발명에 있어서,「면역 체크포인트 저해제」란, 면역 체크포인트 분자 혹은 그 리간드에 결합하여 면역 억제의 시그널 전달을 저해함으로써 T 세포의 활성화 억제 시그널을 해제하고, 종양 면역을 활성화하는 약제를 가리킨다.
면역 체크포인트 저해제는, 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체, 및 항 CTLA-4 항체 등으로서 임상에서의 유효성과 안전성이 확인되어 있는 것, 혹은, 이들과 동등한 작용 기전에 의해 임상 적용의 가능성을 갖는 것이면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체, 및 항 CTLA-4 항체를 들 수 있다. 이들은 단독으로 또는 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서,「항 PD-1 항체」란, PD-1 (Programmed cell death-1 ; CD279 ; PDCD1) 에 특이적으로 결합함으로써, PD-1 과, 그 결합 상대인, PD-L1 이나 PD-L2 의 상호 작용으로부터 발생하는 시그널 전달을 저감, 저해, 및/또는 간섭하는 작용을 갖는 항체를 가리킨다.
항 PD-1 항체로는, 임상에서의 유효성과 안전성이 확인되어 있으면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 니볼루맙 (Nivolumab) (국제 공개 제2006/121168호 등), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab) (국제 공개 제2008/156712호 등), 신틸리맙 (sintilimab), 스파르탈리주맙 (spartalizumab), 도스탈리맙 (Dostarlimab), 세르플루리맙 (Serplulimab), 티슬레리주맙 (Tislelizumab), 펜풀리맙 (Penpulimab), 토리팔리맙 (Toripalimab), zimberelimab, 캄렐리주맙 (Camrelizumab), 레티판리맙 (Retifanlimab), 세미플리맙 (cemiplimab), prolgolimab, geptanolimab, enlonstobart, QL-1604, pucotenlimab 및 finotonlimab 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 들 수 있다. 이들은 단독으로 또는 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또, 본 발명에 있어서 사용되는 항체-약물 콘주게이트와의 병용 효과를 전임상 연구에 있어서 확인할 목적에서, 시판되는 연구용 항 PD-1 항체 (예 : clone RMP1-14) 등을 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서,「항 PD-L1 항체」란, PD-L1 (Programmed cell death ligand 1 ; CD274 ; B7-H1) 에 특이적으로 결합함으로써, PD-L1 과, 그 결합 상대인, PD-1 이나 B7.1 (CD80) 의 상호 작용으로부터 발생하는 시그널 전달을 저감, 저해, 및/또는 간섭하는 작용을 갖는 항체를 가리킨다.
항 PD-L1 항체로는, 임상에서의 유효성과 안전성이 확인되어 있으면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 아테졸리주맙 (Atezolizumab) (국제 공개 제2010/077634호 등), 더발루맙 (Durvalumab) (국제 공개 제2011/066389호 등), cosibelimab, adebrelimab, sugemalimab, 아벨루맙 (Avelumab) (국제 공개 제2013/079174호 등), socazolimab, KL-A167 및 envafolimab 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 아테졸리주맙, 더발루맙 또는 아벨루맙을 들 수 있다. 이들은 단독으로 또는 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또, 본 발명에 있어서 사용되는 항체-약물 콘주게이트와의 병용 효과를 전임상 연구에 있어서 확인할 목적에서, 시판되는 연구용 항 PD-L1 항체 (예 : clone 10F.9G2) 등을 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서,「항 CTLA-4 항체」란, CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 ; CD152) 에 특이적으로 결합함으로써, CTLA-4 와, 그 결합 상대인, B7.1 (CD80) 이나 B7.2 (CD86) 의 상호 작용으로부터 발생하는 시그널 전달을 저감, 저해, 및/또는 간섭하는 작용을 갖는 항체를 나타낸다.
항 CTLA-4 항체로는, 임상에서의 유효성과 안전성이 확인되어 있으면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 이필리무맙 (Ipilimumab) (국제 공개 제2001/014424호 등), botensilimab 및 트레멜리무맙 (Tremelimumab) (국제 공개 제2000/037504호 등) 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 이필리무맙을 들 수 있다. 이들은 단독으로 또는 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또, 본 발명에 있어서 사용되는 항체-약물 콘주게이트와의 병용 효과를 전임상 연구에 있어서 확인할 목적에서, 시판되는 연구용 항 CTLA-4 항체 (예 : clone 9H10) 등을 사용할 수도 있다.
면역 체크포인트 저해제에는, 다중 특이적 분자가 포함된다. 다중 특이적 분자에는, IgG 형 다중 특이성 분자, 2 종류 이상의 가변 영역을 갖는 다중 특이성 분자, 예를 들어 탠덤 scFv, 1 본쇄 디아보디, 디아보디, 및 트리아보디와 같은 항체 단편, 공유 결합 또는 비공유 결합하여 연결되어 있는 항체 단편이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 다중 특이적 분자는 Fc 를 포함하고 있어도 된다.
다중 특이적 분자로서, 구체적으로는, 항 PD-1 항체 혹은 그 항원 결합 단편, 항 PD-L1 항체 혹은 그 항원 결합 단편, 항 PD-L2 항체 혹은 그 항원 결합 단편, 및, 항 CTLA-4 항체 혹은 그 항원 결합 단편으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 항체 혹은 그 항원 결합 단편을 포함하는 다중 특이성 항체 (다특이성 항체라고도 칭한다.), 보다 바람직하게는 항 PD-1 항체 혹은 그 항원 결합 단편 또는 항 CTLA4 항체 혹은 그 항원 결합 단편을 포함하는 이중 특이성 항체 (이특이성 항체라고도 칭한다.) 를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 이와 같은 다중 특이적 분자로는, 임상에서의 유효성과 안전성이 확인되어 있으면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 cadonilimab, ivonescimab 등을 들 수 있다.
본 발명은, 본원의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 본원의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트가 치료를 필요로 하는 개체에 투여되는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법을 포함한다. 본 발명은, 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한 본원의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 본원의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트를 포함한다. 본 발명은, 질환의 치료를 위한 의약을 제조하기 위한, 본원의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 본원의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트의 사용을 포함한다. 본 발명의 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편 혹은 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 다른 암 치료제와 함께 투여할 수도 있으며, 이것에 의해 항암 효과를 증강시킬 수 있다.
본 발명에 있어서,「면역 체크포인트 저해제에 대해 내성을 나타내는 암」이란, 면역 체크포인트 저해제에 내성을 나타내는 것이 확인된 암, 또는 면역 체크포인트 저해제에 내성을 나타내는 것을 합리적으로 인식 또는 예측할 수 있는 암을 나타낸다. 「면역 체크포인트 저해제에 대해 내성을 나타내는 암」은, 바람직하게는「기존의 면역 체크포인트 저해제에 대해 내성을 나타내는 암」이다. 본 발명에 있어서,「기존의 면역 체크포인트 저해제에 대해 내성을 나타내는 암」이란, 기존의 면역 체크포인트 저해제에 내성을 나타내는 것이 확인된 암, 또는 기존의 면역 체크포인트 저해제에 내성을 나타내는 것을 합리적으로 인식 또는 예측할 수 있는 암을 나타낸다.
본 발명에 있어서,「기존의 면역 체크포인트 저해제」란, 임상에 있어서 사용되고 있는 면역 체크포인트 저해제를 나타낸다.
본 발명에 있어서,「내성」이란, 항암제에 의한 치료에 대해 무응답인 성질을 나타내고,「난치성」,「무응답성」,「불응성」으로도 표현할 수 있고, 또, 무응답임으로써 종양의 증식을 방지할 수 없는 점에서,「불내성」으로도 표현할 수 있다. 또, 본 발명에서는,「내성」은, 항암제에 의한 치료를 실시한 후에, 환자의 암이 항암제에 의한 치료에 대해 저감수성인 경우, 암세포가 소실 혹은 축소되지 않는 경우, 완전 주효 (CR : Complete Response) 또는 부분 주효 (PR : Partial Response) 이 얻어지지 않는 경우, 및/또는 암이 조기에 진행되는 경우 (예를 들어, 난소암에 있어서 6 개월 이내 또는 미만) 를 포함한다.
본 발명의「내성」은,「기존의 면역 체크포인트 저해제에 의한 치료에 의해 획득된 내성」이어도 되고,「기존의 면역 체크포인트 저해제에 의한 치료에 의하지 않고 본래 구비된 내성」이어도 된다.
실시예
이하에 나타내는 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또, 이들은 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한,「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」(Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold SpringHarbor Laboratory Press 로부터 1989년 발간) 에 기재된 방법 및 그 밖의 당업자가 사용하는 실험서에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는, 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 실시하였다. 또, 본 명세서에 있어서, 특별히 기재가 없는 시약, 용매 및 출발 재료는, 시판되는 공급원으로부터 용이하게 입수 가능하다.
(실시예 1) 발현 벡터의 제조
1)-1 인간 CD25 발현 벡터
인간 CD25 발현 벡터 (이하,「pCMV3-hCD25」로 기재한다) 는, CD25/IL2R alpha cDNA ORF Clone, Human, untagged (Sino Biological 사) 를 사용하였다. 본 벡터에 클로닝된 인간 CD25 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 서열표의 서열 번호 42 에 나타내고, 인간 CD25 의 아미노산 서열을 서열표의 서열 번호 17 에 나타낸다.
1)-2 마우스 CD25 발현 벡터
마우스 CD25 발현 벡터 (이하,「pCMV3-mCD25」로 기재한다) 는, CD25/IL2R alpha cDNA ORF Clone, Mouse, untagged (Sino Biological 사) 를 사용하였다. 본 벡터에 클로닝된 마우스 CD25 유전자의 ORF 부분의 폴리뉴클레오티드 서열을 서열표의 서열 번호 43 에 나타내고, 마우스 CD25 의 아미노산 서열을 서열표의 서열 번호 44 에 나타낸다.
1)-3 게잡이원숭이 CD25 발현 벡터의 제조
게잡이원숭이 PBMC 로부터 조제한 mRNA 로부터 올리고 dT 프라이머를 사용하여 조제한 cDNA 를 주형에 프라이머 세트 :
프라이머 1F : 5'-ggtaccgccatggatccatacctgctcatgtggg-3' (서열 번호 45), 및
프라이머 1R : 5'-ctcgagctagattgttcttctattcttcctctg-3' (서열 번호 46)
를 사용하여 PCR 반응을 실시하고, 얻어진 PCR 산물을 Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (Thermo Fisher Scientific 사) 을 사용하여 pCR4 Blunt-TOPO 벡터에 삽입함으로써, 게잡이원숭이 CD25 cDNA 를 포함하는 클로닝 벡터를 제조하였다 (변이를 도입한 공정은 생략). 클로닝 벡터로부터 Kpn I 및 Xho I 로 게잡이원숭이 CD25 cDNA 를 잘라내고, 이것을 pCI 벡터의 Kpn I/Xho I 사이에 삽입함으로써, 게잡이원숭이 CD25 발현 벡터 (이하,「pCI-cCD25」로 기재한다) 를 제조하였다. 본 벡터에 클로닝된 게잡이원숭이 CD25 유전자의 ORF 부분의 폴리뉴클레오티드 서열을 서열표의 서열 번호 47 에 나타내고, 게잡이원숭이 CD25 의 아미노산 서열을 서열표의 서열 번호 48 에 나타낸다.
(실시예 2) 모노클로날 항체의 제조와 스크리닝
2)-1 면역
면역에는 WKY/Izm 래트의 암컷 (일본 SLC 사) 을 사용하였다. Recombinant Human IL-2 Receptor Subunit α/IL-2RA/CD25 (C-6His) (Novoprotein Scientific 사) 나 Recombinant Mouse IL-2R α/IL-2RA/CD25 (C-6His) (Novoprotein Scientific 사) 와 Freund's Complete Adjuvant (와코 순약 회사) 를 미근부에 투여한 래트의 림프절 및 비장을 채취하여 하이브리도마 제조에 사용하였다.
2)-2 하이브리도마의 제조
림프절 세포 또는 비장 세포와 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포 (ATCC : CRL-1581) 를 LF301-Cell Fusion Unit (BEX 사) 을 사용하여 전기 세포 융합하고, ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사) 에 희석시켜 배양하였다. 출현한 하이브리도마 콜로니를 회수함으로써 모노클론 하이브리드마를 제조하였다. 회수된 각 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 얻어진 하이브리도마 배양 상청, 혹은 하이브리도마 배양으로부터 정제한 항체를 사용하여 항 CD25 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝을 실시하였다.
2)-3 항체 스크리닝
2)-3-1 항원 결합성의 측정
2)-3-1-1 항원 유전자 발현 세포의 조제
10 ％ FBS 함유 Ham's F-12K (Kaighn's) 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 에서 계대 배양한 CHO-K1 세포를 10 ％ FBS 함유 Ham's F-12K (Kaighn's) 배지 중에서 4.5 × 105 cells/mL 가 되도록 조제하였다. 세포 현탁액 10 mL 에 대해, FuGene6 Transfection Reagent (Promega 사) 를 사용하여, pCMV3-hCD25, pCMV3-mCD25 또는 pCI-cCD25 를 각각 15 μg 도입하고, Collagen Type I-coated 96-웰 플레이트 (AGC TECHNO GLASS 사) 의 각 웰에 100 μL 씩 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 얻어진 도입 세포를 접착 상태인 채로, Cell-ELISA 에 사용하였다.
2)-3-1-2 Cell-ELISA
2)-3-1-1 에서 조제한 발현 벡터 도입 CHO-K1 세포의 상청을 제거 후, pCMV3-hCD25, pCMV3-mCD25 또는 pCI-cCD25 를 도입한 CHO-K1 세포의 각각에 대해, 하이브리도마 배양 상청 또는 정제 항체를 50 μL 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치 (靜置) 하였다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 세정 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 ECL anti-Rat IgG, HRP linked (GE Healthcare Bio-Sciences 사) 를 50 μL 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 세정한 후, TMB Microwell Peroxidase Substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories 사) 를 100 μL 첨가하였다. 실온 차광하에서 교반하면서 10 분간 발색 반응을 실시하고, STOP Solution (Kirkegaard & Perry Laboratories 사) 을 100 μL/well 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더 (SpectraMax : Molecular Devices 사) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다 (도면에 있어서, A450 은, 450 ㎚ 에서의 흡광도를 나타낸다.). 세포막 표면 상에 발현되는 CD25 에 특이적으로 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하기 위해, 첨가한 항체 농도 의존적으로 흡광도가 상승하는 배양 상청을 산생하는 하이브리도마를 항 CD25 항체 산생 양성으로서 선택하였다.
2)-3-2 항 CD25 항체의 정제
2)-3-1 에서 선택한 래트 항 CD25 항체 산생 하이브리도마 중에서, 인간 및 원숭이의 CD25 에 대한 결합성을 나타낸 클론, 및 마우스 CD25 에 대한 결합성을 나타낸 클론을 선발하고, 하이브리도마의 배양 상청으로부터 항체를 Spin column based Antibody Purification Kit (COSMOBIO 사) 를 사용하여 정제하였다. Monolithic silica-based Spin column 에 Binding Buffer 를 500 μL 첨가하고, 6000 rpm, 30 초, 4 ℃ 의 조건에서 원심기 MX-160 (TOMY 사) 을 사용하여 원심하여 플로 스루를 제거하였다. 하이브리도마 배양 상청을 500 μL 첨가하고, 6000 rpm, 30 초, 4 ℃ 의 조건에서 원심기 MX-160 (TOMY 사) 을 사용하여 원심하여 플로 스루를 제거하였다. PBS (와코 순약 회사) 를 500 μL 첨가하고, 6000 rpm, 30 초, 4 ℃ 의 조건에서 원심기 MX-160 (TOMY 사) 을 사용하여 원심하여 플로 스루를 제거하였다. 1.5 mL 마이크로 튜브에 Neutralization Buffer 를 20 μL 첨가하고, Spin column 을 세트하였다. Spin column 에 Elution Buffer 를 200 μL 첨가하고, 6000 rpm, 30 초, 4 ℃ 의 조건에서 원심기 MX-160 (TOMY 사) 을 사용하여 원심하여 정제 항체를 얻었다.
2)-3-3 항체 농도의 측정
2)-3-3-1 항체의 아이소타입 동정
2)-3-1 에서 선택한 래트 항 CD25 항체 산생 하이브리도마 중에서 인간 및 원숭이의 CD25 에 대한 결합성을 나타낸 클론, 및 마우스 CD25 에 대한 결합성을 나타낸 클론을 선발하고, 각 항체의 아이소타입을 동정하였다. 항체의 중사슬의 서브클래스, 경사슬의 타입은, Rat Ig Isotyping Ready-Set-Go (Thermo Fischer Scientific 사) 를 사용하여 동정하였다.
MaxiSorp flat-bottom 96 well plate (Thermo Fischer Scientific 사) 에 PBS 로 250 배 희석시킨 Capture Antibody 를 100 μL/well 씩 첨가하고, 4 ℃ 에서 3 일간 정치하여 고상화하였다. Wash Buffer (BD OptEIA Set A (BD Biosciences Pharmingen 사) 의 20 × Wash Buffer 를 MilliQ 로 20 배 희석) 로 2 회 세정 후, Blocking Buffer (0.1 ％ Tween-20 (BIO-RAD 사), 1 ％ BSA (와코 순약 공업사) 함유 PBS) 를 사용하여 블로킹하였다. Wash Buffer 로 2 회 세정 후, Assay Buffer (0.05 ％ Tween-20 (BIO-RAD 사), 0.5 ％ BSA (와코 순약 공업사) 함유 PBS) 를 50 μL/well 씩 첨가하였다. 또한, PBS 로 희석시킨 배양 상청을 50 μL/well 씩 첨가하고, 실온에서 2 시간 인큐베이션하였다. Wash Buffer 로 4 회 세정 후, Detection Antibody (Assay Buffer 로 500 배 희석) 하였다. Wash Buffer 로 4 회 세정 후, TMB Substrate Solution (BD OptEIA Set A (BD Biosciences Pharmingen 사) 의 Substrate ReagentA 및 B 를 등량 혼합) 을 100 μL/well 씩 첨가하고, 실온·차광하에서 교반하면서 10 분간 인큐베이션하였다. Stop Solution 을 100 μL/well (BD OptEIA Set A (BD Biosciences Pharmingen 사) 씩 첨가하고, 플레이트 리더 (Spectra Max, Molecular Device 사) 를 사용하여 450 ㎚ 와 570 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다.
2)-3-3-2 농도 측정
항체 농도는, Rat IgG ELISA Quantitaion Set (Bethyl Laboratories 사) 를 사용하여 측정하였다. 또한, 표준 물질은, 클론마다 2)-3-3-1 에서 결정한 아이소타입 정보에 기초하여 설정하고, Rat IgG1 Isotype Control (R&D Systems 사), Rat IgG2A Isotype Control (R&D Systems 사), 혹은 Rat IgG2B Isotype Control (R&D Systems 사) 을 사용하였다.
2)-3-4 인간 pan T 세포를 사용한 IL-2 의존적 세포 증식에 대한 영향
2)-3-4-1 인간 pan T 세포의 조제와 serum starvation
동결 인간 PBMC (Cellular Technology Limited 사) 를 C.T.L. Protocol 에 따라 융해시켰다. 그 후, Pan T Cell 아이솔레이션 키트 (Miltenyi BIOTEC 사) 를 사용하여, PBMC 로부터 pan T 세포를 분리하였다. 분리한 pan T 세포를 10 ％ FBS (Hyclone, 글로벌 라이프 사이언스 테크놀로지즈 재팬 주식회사), 1 ％ Penicillin-Streptomycin (Life Technologies 사) 첨가 RPMI (Life Technologies 사) 배지에서 5.0 × 105 cells/mL 가 되도록 현탁한 후, 이 세포 현탁액에 PHA (SIGMA-ALDRICH 사) 가 3 μg/mL 가 되도록 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 3 일간 배양하였다. 배양 후, 회수한 세포를 PBS 로 2 회 세정하고, 세포수를 카운트한 후, 1 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지에서 2.0 × 105 cells/mL 가 되도록 현탁하고, 배양 플라스크에 첨가하였다. 세포를 추가로 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 24 시간 배양함으로써 serum starvation 을 실시하였다.
2)-3-4-2 항체 용액의 조제와 첨가
항인간 CD25 항체인 바실릭시맙 (노바티스 파마사) 과 7G7B6 (Bio X Cell 사), 혹은 컨트롤 항체인 InVivoMab Rat IgG2a Isotype control (래트 IgG2a) (Bio X Cell 사) 은, ClonaCell-HY Cloning Medium E (Medium E) (STEM CELL 사) 로 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL 로 희석시켜 사용하였다.
96-well plate 의 각 웰에 각 농도의 바실릭시맙, 7G7B6, 컨트롤 항체, 혹은 하이브리도마 배양 상청을 5 μL 첨가하고, 그들 웰에 추가로 1 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지를 15 μL 첨가하였다.
2)-3-4-3 인간 Pan T 세포와 IL-2 용액의 첨가
Serum starvation 을 실시한 pan T 세포를 회수하고, 1.25 × 105 cells/mL 가 되도록 1 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지를 첨가하고, 현탁하였다. 2)-3-5-2 에서 용액을 첨가한 웰에, 40 μL/well 로 세포 현탁액을 첨가하였다. 또한, 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 15 분간 인큐베이션하였다.
리콤비넌트 인간 IL-2 (PeproTech 사) 는, 50 μL 의 0.1 M 아세트산으로 용해시킨 후, 0.45 mL 의 0.1 ％ BSA 함유 PBS 로 희석시킴으로써, 100 μg/mL 용액을 조제하였다. 또한, 1 ％ FBS/1 ％ Penicillin-Streptomycin 함유 RPMI 배지에서 3.75 ng/mL 가 되도록 희석시켰다. IL-2 첨가군의 웰에 40 μL/well 로 첨가하였다. 또, IL-2 비첨가군의 웰에는, 1 ％ FBS/1 ％ Penicillin-Streptomycin 함유 RPMI 배지를 40 μL/well 로 첨가하였다. 그 후, 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 48 시간 인큐베이션하였다.
2)-3-4-4 세포 증식의 측정
인큐베이션 후, 플레이트를 300 × g 로 5 분간 원심하고, 각 웰로부터 50 μL 의 상청을 제거하였다. 그들 웰에 CellTiter-Glo luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 키트인 Celltiter-Glo Reagent 를 50 μL 첨가하고, 2 분간 플레이트 셰이커로 교반하였다. 1 웰에 대해 50 μL 를 OptiPlate-96 (PerkinElmer 사) 에 옮겨 담고, 플레이트 리더 (Ensight : PerkinElmer 사) 로 발광 강도 (상대 발광량, RLU (Relative Light Unit)) 를 측정하여, 세포수의 지표로 하였다.
2)-3-5 인간 pan T 세포에 있어서의 IL-2 자극으로 증가하는 인산화 STAT5 (pSTAT5) 에 미치는 영향
2)-3-5-1 인간 pan T 세포의 조제와 serum starvation
동결 인간 PBMC 를 C.T.L. Protocol 에 따라 융해시켰다. 그 후, Pan T Cell 아이솔레이션 키트 (Miltenyi BIOTEC 사) 를 사용하여, PBMC 로부터 pan T 세포를 분리하였다. 분리한 pan T 세포를 10 ％ FBS (Hyclone, 글로벌 라이프 사이언스 테크놀로지즈 재팬 주식회사), 1 ％ Penicillin-Streptomycin (Life Technologies 사) 첨가 RPMI (Life Technologies 사) 배지에서 5.0 × 105 cells/mL 가 되도록 현탁한 후, 이 세포 현탁액에 PHA (SIGMA-ALDRICH 사) 가 3 μg/mL 가 되도록 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 3 일간 배양하였다. 배양 후, 회수한 세포를 PBS 로 2 회 세정하고, 세포수를 카운트한 후, 1 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지에서 2.0 × 105 cells/mL 가 되도록 현탁하고, 배양 플라스크에 첨가하였다. 세포를 추가로 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 24 시간 배양함으로써 serum starvation 을 실시하였다.
2)-3-5-2 항체 용액의 조제와 첨가
항인간 CD25 항체인 바실릭시맙 (노바티스 파마사) 과 7G7B6 (Bio X Cell 사), 혹은 컨트롤 항체인 InVivoMab Rat IgG2a Isotype control (래트 IgG2a) (Bio X Cell 사) 은, ClonaCell-HY Cloning Medium E (Medium E) (STEM CELL 사) 로 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL 로 희석시켜 사용하였다.
96-well plate 의 각 웰에 각 농도의 바실릭시맙, 7G7B6, 컨트롤 항체, 혹은 하이브리도마 배양 상청을 20 μL 첨가하였다.
2)-3-5-3 인간 pan T 세포와 IL-2 용액의 첨가
Serum starvation 을 실시한 pan T 세포를 회수하고, 1.25 × 105 cells/mL 가 되도록 1 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지를 첨가하고, 현탁하였다. 2)-3-5-2 에서 용액을 첨가한 웰에, 40 μL/well 로 세포 현탁액을 첨가하였다. 또한, 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 15 분간 인큐베이션하였다.
리콤비넌트 인간 IL-2 (PeproTech 사) 는, 50 μL 의 0.1 M 아세트산으로 용해시킨 후, 0.45 mL 의 0.1 ％ BSA 함유 PBS 로 희석시킴으로써, 100 μg/mL 용액을 조제하였다. 또한, 1 ％ FBS/1 ％ Penicillin-Streptomycin 함유 RPMI 배지에서 3.75 ng/mL 가 되도록 희석시키고, IL-2 첨가군의 웰에 40 μL/well 로 첨가하였다. 또, IL-2 비첨가군의 웰에는, 1 ％ FBS/1 ％ Penicillin-Streptomycin 함유 RPMI 배지를 40 μL/well 로 첨가하였다. 그 후, 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 15 분간 인큐베이션하였다.
2)-3-5-4 pSTAT5 측정
AlphaLISA SureFire Ultra phosho-STAT5 (Tyr694/699) kit (PerkinElmer 사) 에 부속된 5 × lysis buffer 를 H2O 로 1 × lysis buffer 로 조제하였다.
15 분간 인큐베이션 후의 플레이트를 300 × g 로 5 분간 원심하고, 각 웰의 상청을 흡인 제거한 후, 각 웰에 1 × lysis buffer 를 50 μL/well 로 첨가하였다. 플레이트를 10 분간 플레이트 셰이커로 교반하여, 세포 라이세이트를 조제하였다.
각 웰의 세포 라이세이트를 AlphaLISA 용 384-well SW plate (PerkinElmer 사) 에 5 μL/well 로 첨가하고, Acceptor Mix 를 2.5 μL/well 첨가한 후, 1 시간 플레이트 셰이커로 교반하였다. 차광하여 4 ℃, 하룻밤 인큐베이션한 후, Donor Mix 를 2.5 μL/well 첨가하고, 2 분간 셰이커로 교반한 후, 추가로 차광하여 2 시간 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트 리더 (Ensight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 Alpha 시그널을 측정하였다.
2)-3-6 인간 pan T 세포를 사용한 세포 내재화 활성의 측정 (Fab-ZAP 법)
2)-3-6-1 6-웰 플레이트 웰에 대한 항인간 CD3 항체와 항인간 CD28 항체의 고상화
6-웰 플레이트 (코닝사) 의 각 웰에 20 μg/mL 의 항인간 CD3 항체 (EXBIO Praha 사) 와 항인간 CD28 항체 (BECTON DICKINSON 사) 함유의 PBS 를 2 mL/well 로 첨가한 후, 플레이트를 플레이트 믹서로 혼합하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 상청을 제거하고, 웰을 PBS 로 1 회 세정하여 사용하였다.
2)-3-6-2 동결 인간 PBMC 로부터의 pan T 세포의 단리와 pan T 세포의 배양
동결 PBMC (Cellular Technology 사) 를 37 ℃ 워터 배스에서 융해시키고, 10 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin, Anti-Aggregate Wash (1/20 첨가) 함유의 RPMI (Life Technologies 사) 배지에 첨가한 후, 310 × g 로 10 분간 원심하였다. 상청을 제거한 후, 프레시 배지에서 재현탁하였다. 재현탁한 PBMC 로부터, Pan T Cell 아이솔레이션 키트 (Miltenyi BIOTEC 사) 를 사용하여, Pan T 세포를 단리하였다. 단리한 Pan T 세포를 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fisher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fisher Scientific 사) 배지에서 1.07 × 106 cells/mL 의 세포 현탁액을 조제하였다. 2)-3-5-1 에서 준비한 6-웰 플레이트에, 세포 현탁액을 4 mL/well 씩 파종하고, 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 4 일간 배양하였다. 또한, 배양 2 일째에, 1.5 ng/mL Recombinant Human IL-2 (PeproTech, Inc. 사), 10 ％ CTS Immune Cell SR 함유 IMDM 배지를 2 mL/well 로 첨가하였다.
2)-3-6-3 ZAP 어세이
Fab-ZAP rat (ADVANCED TARGETING SYSTEMS 사) 를 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지에서 희석시켜, 40 μg/mL, 8 μg/mL, 1.6 μg/mL, 0.32 μg/mL 의 Fab-ZAP rat 용액을 조제하였다. 또, 컨트롤 항체인 래트 IgG2a 및 래트 하이브리도마 배양 상청 혹은 정제 항체는, rat IgG 농도가 3000 ng/mL, 600 ng/mL, 120 ng/mL, 24 ng/mL 가 되도록 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지에서 희석시켰다. 웰 중의 Fab-ZAP rat 와 항 CD25 항체의 농도비가 2.67 : 1 의 농도비가 되도록, 각각의 용액을 96-well plate 에 첨가하고, Fab-ZAP 와 항 CD25 항체 비존재 (항체 농도가 0 ng/mL) 의 웰에는, 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지를 첨가하였다. 또, Fab-ZAP rat 비존재하에서의 결과를 얻기 위해, 래트 하이브리도마 배양 상청 혹은 정제 항체 용액만을 첨가한 96-well plate 도 준비하였다.
6-웰 플레이트에서 배양한 pan T 세포를 회수하고, 300 × g 로 10 분간 원심하였다. 상청을 제거한 후, 세포에 2.5 × 105 cells/mL 가 되도록 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지를 첨가하였다. 이들을 96-well plate 에 40 μL/well 로 첨가하였다. 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 3 일간 배양한 후, CellTiter-Glo luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 를 사용하여 세포수를 측정하였다. 항체 농도가 0 ng/mL 인 웰의 발광 강도를 100 ％ 로 하여, 각 웰의 발광 강도의 ％ 값을 계산하였다.
2)-3-7 항인간 CD25 항체와 M-A251 의 교차 경합 어세이
2)-3-7-1 인간 CD25 발현 CHO-1 세포의 조제
10 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin 함유 Ham's F-12K (Kaighn's) 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 에서 계대 배양한 CHO-K1 세포를 10 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin 함유 Ham's F-12K (Kaighn's) 배지 중에서 4.5 × 105 cells/mL 가 되도록 조제하였다. 세포 현탁액 10 mL 에 대해, FuGene6 Transfection Reagent (Promega 사) 를 사용하여, pCMV3-hCD25 를 15 μg 도입하고, Collagen Type I-coated 96-웰 플레이트 (AGC TECHNO GLASS 사) 의 각 웰에 100 μL 씩 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 내지 4 일간 배양하였다. 얻어진 도입 세포를 접착 상태인 채로, 어세이에 사용하였다.
2)-3-7-2 교차 경합 어세이
Biotin anti-human CD25 Antibody (clone ; M-A251, Biolegend 사) 0.5 mg/mL 를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 0.1 mg/mL 가 되도록 희석시켰다. 바실릭시맙 (노바티스 파마사), M-A251 (BD Biosciences 사), 취득 항체, 혹은 컨트롤 항체로서 사용한 IgG1, κ 인간 미엘로마 혈장 유래 (hIgG1, Merck KGaA 사) 를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1 μg/mL, 3 μg/mL, 10 μg/mL 가 되도록 희석시킨 후, Biotin 화 M-A251 항체 용액과 1 : 1 로 혼합하였다 (혼합 용액 1). 항체 비첨가군 (0 μg/mL) 용으로, 5 ％ FBS 함유 PBS 와 Biotin 화 M-A251 항체 용액을 1 : 1 로 혼합하였다 (혼합 용액 2). HRP Streptavidin (Biolegend 사) 0.5 mg/mL 를 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1000 배 희석시켰다. TMB Microwell Peroxidase Substrate (2-Component System) (Sera Care Life Sciences 사) 키트인 TMB Peroxidase Substrate 와 Peroxidase Substrate Solution B 를 1 : 1 로 혼합하여, 기질 용액으로 하였다. 96-well plate 의 웰로부터 배양 상청을 제거하고, 5 ％ FBS 함유 PBS 0.2 mL 로 1 회 세정하였다. 각 웰로부터 5 ％ FBS 함유 PBS 를 제거한 후, 혼합 용액 1 과 2 를 50 μL/well 로 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션하였다. 웰 내의 혼합 용액을 제거한 후, 각 웰을 0.2 mL 의 5 ％ FBS 함유 PBS 로 3 회 세정하였다. 각 웰로부터 5 ％ FBS 함유 PBS 를 제거한 후, 각 웰에 기질 용액을 0.1 mL/well 로 첨가하였다. 실온 차광하에서 교반하면서 5 분간 발색 반응을 실시하고, STOP Solution (Sera Care Life Sciences, Inc 사) 을 0.1 mL/well 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더 (SpectraMax : Molecular Devices 사) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다.
2)-3-8 항마우스 CD25 항체, PC61_hIgG1LALA, PC61G_hIgG1LALA 의 제조
항마우스 CD25 항체, PC61_hIgG1LALA, PC61G_hIgG1LALA 는, 문헌 (Huss et al., 2016. Immunology. 148 (3) : 276-286), 특허 (WO 2017/174331) 의 공지된 방법에 준하여 조제하였다.
2)-3-9 마우스 T 세포주 CTLL-2 세포에 있어서의 IL-2 자극으로 증가하는 인산화 STAT5 (pSTAT5) 에 미치는 영향
2)-3-9-1 CTLL-2 세포의 배양과 serum starvation
CD25 양성 마우스 종양 세포주 CTLL-2 를 1 mM Sodium Pyruvate (Thermo Fishcher Scientific 사), 1 × MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fishcher Scientific 사), 10 ％ T-STIM with ConA 함유 RPMI1640 (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 계대 배양하였다.
배양한 CTLL-2 세포를 회수하고, 300 × g 로 5 분간 원심한 후, RPMI1640 배지에서 2.0 × 106 cells/mL 가 되도록 현탁하였다. 세포 현탁액을 96-well plate 에 50 μL/well 로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 5 시간 배양하였다.
2)-3-9-2 항체 용액과 마우스 IL-2 용액의 조제와 첨가
정제 항체, IL-2 의 마우스 CD25 에 대한 결합을 저해하는 항마우스 CD25 항체인 PC61G_hIgGLALA 또는 컨트롤 항체인 래트 IgG2a 를, RPMI1640 배지에서 20 μg/mL 가 되도록 희석시켰다. 이들 항체 용액을 세포가 파종된 웰에 첨가한 후, 플레이트를 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 15 분간 인큐베이션하였다.
2)-3-9-3 pSTAT5 측정
2)-3-5-4 의 방법에 따라 실시하였다.
2)-3-10 마우스 pan T 세포를 사용한 세포 내재화 활성의 측정 (Fab-ZAP 법)
2)-3-10-1 웰에 대한 항마우스 CD3 항체와 항마우스 CD28 항체의 고상화
Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD3 Antibody (항마우스 CD3 항체 : Biolegend 사) 와 LEAF Purified anti-mouse CD28 Antibody (항마우스 CD28 항체 : Biolegend 사) 의 1 mg/mL 용액을 혼합하고, PBS 로 희석시켜 10 μg/mL 혼합 용액을 조제하였다. 이 혼합 용액을 6 웰 플레이트의 웰에 2 mL 첨가하고, 플레이트 믹서로 혼합한 후, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이션하였다. PBS 로 3 회 세정하여, 실험에 사용하였다.
2)-3-10-2 마우스 비장 세포로부터의 마우스 pan T 세포의 조제와 활성화
Balb/c 마우스로부터 조제한 비장 세포로부터 Pan T Cell Isolation Kit II, mouse (Miltenyi Biotec 사) 를 사용하여, 마우스 pan T 세포를 분리 회수하였다. 분리 회수한 마우스 pan T 세포에 0.5 ％ penicillin/streptomycin, 5 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 1 × MEM-NEAA, 10 ％ FBS 함유 RPMI 배지를 8 mL 첨가하여, 1.31 × 106 cells/mL 의 세포 현탁액을 조제하였다. 세포 현탁액에 2-mercaptoethanol 이 50 μM 과 마우스 IL-2 가 10 ng/mL 가 되도록 첨가한 후, 2)-3-10-1 에서 고상화한 6 웰 플레이트의 웰에 4 mL 파종하고, 37 ℃ 에서 3 일간 인큐베이션하였다.
2)-3-10-3 ZAP 어세이
Fab-ZAP rat (ADVANCED TARGETING SYSTEMS 사) 를 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지에서 희석시켜, 40 μg/mL, 8 μg/mL, 1.6 μg/mL, 0.32 μg/mL 의 Fab-ZAP rat 용액을 조제하였다. 또, 컨트롤 항체인 래트 IgG2a, Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD25 (PC61 항체) (BECTON DICKINSON 사) 및 래트 하이브리도마 배양 상청 혹은 정제 항체는, rat IgG 농도가 1500 ng/mL, 300 ng/mL, 60 ng/mL, 12 ng/mL 가 되도록 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지에서 희석시켰다. 웰 중의 Fab-ZAP rat 와 항 CD25 항체의 농도비가 0.53 : 1 의 농도비가 되도록, 각각의 용액을 96-well plate 에 첨가하고, Fab-ZAP rat 와 항 CD25 항체 비존재 (항체 농도가 0 ng/mL) 의 웰에는, 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지를 첨가하였다. 또, Fab-ZAP rat 비존재하에서의 결과를 얻기 위해, 래트 하이브리도마 배양 상청 혹은 정제 항체 용액만을 첨가한 96-well plate 도 준비하였다.
6-웰 플레이트에서 배양한 pan T 세포를 회수하고, 310 × g 로 10 분간 원심하였다. 상청을 제거한 후, 세포에, 2.5 × 105 cells/mL 가 되도록 1 ％ Penicillin-Streptomycin 첨가 RPMI 배지를 첨가하였다. 이들을 96-well plate 에 40 μL/well 로 첨가하였다. 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 3 일간 배양한 후, CellTiter-Glo luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 를 사용하여 세포수를 측정하였다. 항체 농도가 0 ng/mL 인 웰의 발광 강도를 100 ％ 로 하여, 각 웰의 발광 강도의 ％ 값을 계산하였다.
2)-2 에서 제조된 약 2000 클론에 대해 평가하고, 선발한 MAb1 과 MAb2 에 대해 추가적인 해석을 진행하였다.
(실시예 3) MAb1 의 성질
3)-1 항원 결합성
2)-3-1 의 방법에 따라 실시하였다. 또한, MAb1 은 정제 항체를 사용하여, 항체의 종농도가 0.02 μg/mL, 0.16 μg/mL, 1.25 μg/mL, 10 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 또, 항체 비첨가 웰 (0 μg/mL) 은 5 ％ FBS/PBS 를 첨가하였다. 그 결과, MAb1 은, pCMV3-hCD25, pCI-cCD25 를 도입한 CHO-K1 세포에 대해 항체 농도 의존적으로 결합하고, pCMV3-mCD25 를 도입한 CHO-K1 세포에는 결합하지 않았다 (도 1). 따라서, MAb1 은 인간 CD25 와 게잡이원숭이 CD25 에 대해 결합하는 것이 분명해졌다.
3)-2 IL-2 의존적인 인간 pan T 세포의 증식에 미치는 영향
2)-3-4 의 방법에 따라 실시하였다. 또한, MAb1 은 하이브리도마 배양 상청을 사용하여, 항체의 종농도가 11.1 μg/mL 가 되도록 첨가하였다 (n = 2). 그 결과, IL-2 와 컨트롤 항체인 래트 IgG2a (2.5 μg/mL) 를 첨가한 군의 T 세포수를 100 ％ 로 했을 때에, IL-2 와 IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙 (2.5 μg/mL) 을 첨가한 군의 T 세포수는 52 ％, IL-2 와 IL-2 논블로킹 항체인 7G7B6 (2.5 μg/mL) 을 첨가한 군의 T 세포수는 94 ％, IL-2 와 MAb1 을 첨가한 군의 T 세포수는 109 ％ 였다 (도 2). MAb1 첨가군의 IL-2 첨가로 증가한 T 세포수는, 컨트롤 항체인 래트 IgG2a 첨가군과 동일한 정도이고, IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙 첨가군의 IL-2 첨가로 증가한 T 세포수는 래트 IgG2a 첨가군과 비교하여 감소하고, IL-2 논블로킹 항체인 7G7B6 첨가군에서는 감소하지 않았던 점에서, MAb1 은 IL-2 의존적인 인간 T 세포의 증식 촉진에 영향을 주지 않는 IL-2 논블로킹 항체인 것이 분명해졌다.
3)-3 IL-2 자극으로 증가하는 인산화 STAT5 (pSTAT5) 에 대한 영향
3)-3-1 6-웰 플레이트 웰에 대한 항인간 CD3 항체의 고상화
6-웰 플레이트 (코닝사) 의 각 웰에 10 μg/mL 의 항인간 CD3 항체 (EXBIO Praha 사) 함유의 PBS 를 2 mL/well 로 첨가한 후, 플레이트를 플레이트 믹서로 혼합하고, 4 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 상청을 제거하고, 웰을 PBS 로 3 회 세정하여 사용하였다.
3)-3-2 인간 PBMC 의 조제와 serum starvation
동결 인간 PBMC 를 C.T.L. Protocol 에 따라 융해시켰다. 융해된 PBMC 를 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fisher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fisher Scientific 사) 배지에서 현탁하고, 3)-3-1 에서 준비한 6-웰 플레이트에 4 mL/well 씩 파종하였다. 플레이트는 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 5 일간 인큐베이션하였다.
3)-3-3 항체 용액의 조제와 첨가
MAb1 은 정제 항체를 사용하여, 항체의 종농도가 20 μg/mL 가 되도록 첨가하였다 (n = 3). 또, 컨트롤 항체로서 래트 IgG2a, IL-2 블로킹 항체로서 바실릭시맙, IL-2 논블로킹 항체로서 7G7B6 을 사용하고, 농도가 20 μg/mL 가 되도록 첨가하였다 (n = 3).
3)-3-4 인간 PBMC 와 IL-2 용액의 첨가
Serum starvation 을 실시한 PBMC 를 회수하고, 2 × 106 cells/mL 가 되도록 IMDM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 에서 조제하고, 7)-3-2 에서 항체 용액을 첨가한 플레이트에 50 μL/well 로 세포 현탁액을 첨가하였다. 또한, 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 15 분간 인큐베이션하였다.
리콤비넌트 인간 IL-2 (PeproTech 사) 는, 50 μL 의 0.1 M 아세트산으로 용해시킨 후, 0.45 mL 의 0.1 ％ BSA 함유 PBS 로 희석시킴으로써, 100 μg/mL 용액을 조제하였다. 추가로 IMDM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 에서 4 ng/mL 가 되도록 희석시키고, IL-2 첨가군의 웰에 25 μL/well 로 첨가하였다. 또, IL-2 비첨가군의 웰에는, IMDM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 를 25 μL/well 로 첨가하였다. 그 후, 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 15 분간 인큐베이션하였다.
3)-3-5 pSTAT5 측정
AlphaLISA SureFire Ultra phosho-STAT5 (Tyr694/699) kit (PerkinElmer 사) 에 부속된 5 × lysis buffer 를 H2O 로 1 × lysis buffer 로 조제하였다.
15 분간 인큐베이션 후의 플레이트를 377 g 로 5 분간 원심하고, 각 웰의 상청을 흡인 제거하였다.
각 웰에 1 × lysis buffer 를 50 μL/well 로 첨가하였다. 플레이트를 10 분간 플레이트 셰이커로 교반하여, 세포 라이세이트를 조제하였다. 각 웰의 세포 라이세이트를 AlphaLISA 용 384-well SW plate (PerkinElmer 사) 에 5 μL/well 로 첨가하고, Acceptor Mix 를 4 μL/well 첨가한 후, 2 분간 플레이트 셰이커로 교반하였다. 그 후, 차광하에서 1 시간 인큐베이션하였다.
Donor Mix 를 2.5 μL/well 첨가하고, 2 분간 플레이트 셰이커로 교반한 후, 추가로 차광하여 하룻밤 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트 리더 (Ensight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 Alpha 시그널을 측정하였다.
그 결과, IL-2 와 컨트롤 항체인 래트 IgG2a 를 첨가한 군의 pSTAT5 량을 100 ％ 로 했을 때에, IL-2 와 IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙을 첨가한 군에서는 1 ％, IL-2 와 IL-2 논블로킹 항체인 7G7B6 을 첨가한 군에서는 103 ％, IL-2 와 MAb1 을 첨가한 군에서는 108 ％ 였다 (도 3). IL-2 첨가로 증가한 pSTAT5 량은, 래트 IgG2a 첨가군과 비교하여, 바실릭시맙 첨가로 감소하고, 7G7B6 첨가로는 감소하지 않았던 점에서, MAb1 은 T 세포의 IL-2 시그널을 저해하지 않는 IL-2 논블로킹 항체인 것이 분명해졌다.
3)-4 인간 pan T 세포를 사용한 세포 내재화 활성의 측정 (Fab-ZAP 법)
2)-3-6 의 방법에 따라 실시하였다. 또한, MAb1 은 정제 항체를 사용하여, 각 웰에 농도가 1500 ng/mL, 300 ng/mL, 60 ng/mL, 12 ng/mL 가 되도록 첨가하였다. 각 농도에서의 대조 항체에서의 세포 생존율을 100 ％ 로 했을 때에 MAb1 의 세포 생존율은 각각 12 ng/mL 첨가군에서 58 ％, 60 ng/mL 첨가군에서 53 ％, 300 ng/mL 첨가군에서 44 ％, 1500 ng/mL 첨가군에서 47 ％ 였다 (n = 3) (도 4). Fab-ZAP 비첨가군에서는, 컨트롤 항체인 래트 IgG2a 혹은 MAb1 중 어느 농도 첨가군에서도 생존율의 변화는 확인되지 않았다. 따라서, MAb1 은, CD25 양성 세포에 내재화되는 항체인 것이 분명해졌다.
3)-5 항인간 CD25 항체와 M-A251 의 교차 경합 어세이
2)-3-7 의 방법에 따라 실시하였다. 그 결과, biotin 화 M-A251 의 인간 CD25 발현 CHO-1 세포에 대한 결합은, 인간 IgG1 첨가로는 억제되지 않고, M-A251 첨가로 억제된 점에서, 평가계의 타당성이 확인되었다 (도 5). 이 평가계에 있어서, biotin 화 M-A251 의 인간 CD25 발현 CHO-1 세포에 대한 결합은, MAb1 첨가로는 억제되지 않았다. 따라서, MAb1 과 M-A251 은 인간 CD25 의 상이한 부위에 결합하는 것이 분명해졌다 (도 5).
(실시예 4) MAb2 의 성질
4)-1 항원 결합성
2)-3-1 의 방법에 따라 실시하였다. 또한, MAb2 는 정제 항체를 사용하여, 항체의 종농도가 0.02 μg/mL, 0.16 μg/mL, 1.25 μg/mL, 10 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 또, 항체 비첨가 웰 (0 μg/mL) 에는, 항체 용액 대신에 5 ％ FBS 함유 PBS 를 첨가하였다. 그 결과, MAb2 는, pCMV3-mCD25 를 도입한 CHO-K1 세포에는 결합했지만, pCMV3-hCD25 또는 pCI-cCD25 를 도입한 CHO-K1 세포에는 결합하지 않았다 (도 6). 따라서, MAb2 는 마우스 CD25 에 대해 결합하는 것이 분명해졌다.
4)-2 마우스 CTLL-2 세포에 있어서의 IL-2 자극으로 증가하는 인산화 STAT5 (pSTAT5) 에 미치는 영향
2)-3-9 의 방법에 따라 실시하였다. IL-2 와 컨트롤 항체인 래트 IgG2a 를 첨가한 군에서의 pSTAT5 량을 100 ％ 로 했을 때에, IL-2 와 PC61_hIgG1LALA 를 첨가한 군에서는 48 ％, IL-2 와 MAb2 를 첨가한 군에서는 96.5 ％ 였다 (도 7). IL-2 첨가로 증가한 pSTAT5 량은, IL-2 블로킹 항체의 PC61_hIgG1LALA 첨가로 감소한 점에서, MAb2 는 IL-2 시그널을 블로킹하지 않는 항체인 것이 분명해졌다.
4)-3 내재화 활성 측정
2)-3-10 의 방법에 따라 실시하였다. 또한, MAb2 는 정제 항체를 사용하여, 각 웰에 농도가 7500 ng/mL, 1500 ng/mL, 300 ng/mL, 60 ng/mL 가 되도록 첨가하였다 (n = 3). 각 농도에서의 대조 항체에서의 세포 생존율을 100 ％ 로 했을 때에 MAb2, PC61 의 세포 생존율은 각각 60 ng/mL 첨가군에서 6 ％, 59 ％, 300 ng/mL 첨가군에서 4 ％, 39 ％, 1500 ng/mL 첨가군에서 4 ％, 31 ％, 7500 ng/mL 첨가군에서 5 ％, 29 ％ 였다 (도 8). Fab-ZAP 비첨가군에서는, 컨트롤 항체인 래트 IgG2a, PC61 혹은 MAb2 중 어느 농도 첨가군에서도 생존율의 변화는 확인되지 않았다. 따라서, MAb2 는 CD25 양성 세포에 내재화되는 항체인 것이 분명해졌다.
(실시예 5) MAb1, MAb2 의 아미노산 서열의 결정
5)-1 MAb1, MAb2 산생 하이브리도마로부터의 Total RNA 의 조제
MAb1, MAb2 의 가변 영역의 cDNA 를 증폭시키기 위해, MAb1, MAb2 산생 하이브리도마로부터, RNA 정제 키트 Direct-zol RNA Miniprep Kit (ZYMO RESEARCH) 를 사용하여 total RNA 를 조제하였다.
5)-2 5'-RACE PCR 에 의한 MAb1, MAb2 의 경사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
경사슬의 가변 영역의 cDNA 의 증폭은, 5)-1 에서 조제한 total RNA 의 약 1 μg 과 SMARTer RACE 5'/3' Kit (Thermo Scientific 사 제조) 를 사용하여 실시하였다. MAb1, MAb2 의 경사슬의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE 5'/3' Kit 에 부속), 및 공지된 래트 경사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭시킨 경사슬의 가변 영역의 cDNA 를 플라스미드에 클로닝하고, 다음으로 경사슬의 가변 영역의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
결정된 MAb1, MAb2 의 경사슬의 가변 영역의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 19, 23 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 18, 22 에 나타낸다.
5)-3 5'-RACE PCR 에 의한 MAb1, MAb2 의 중사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
중사슬의 가변 영역의 cDNA 의 증폭은, 5)-1 에서 조제한 total RNA 의 약 1 μg 과 SMARTer RACE 5'/3' Kit (Thermo Scientific 사 제조) 를 사용하여 실시하였다. MAb1, MAb2 의 중사슬의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE 5'/3' Kit 에 부속), 및 공지된 래트 중사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭시킨 중사슬의 가변 영역의 cDNA 를 플라스미드에 클로닝하고, 다음으로 중사슬의 가변 영역의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
결정된 MAb1, MAb2 의 중사슬의 가변 영역의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 21, 25 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 20, 24 에 나타낸다.
(실시예 6) 인간 IgG1LALA 키메라 MAb1 (cMAb1_hIgG1LALA), 인간 IgG1LALA 키메라 MAb2 (cMAb2_hIgG1LALA) 의 조제
6)-1 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화시켜 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 51 에 나타내는 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 를 사용하여 결합하여, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다.
pcDNA3.3/LK 로부터 네오마이신 발현 유닛을 제거함으로써 pCMA-LK 를 구축하였다.
6)-2 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1LALA 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화시켜 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 서열 번호 52 로 나타내는 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1LALA 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 를 사용하여 결합하여, pCMA-G1LALA 를 구축하였다.
6)-3 cMAb1_hIgG1LALA, cMAb2_hIgG1LALA 의 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 28 에 나타내는 cMAb1_hIgG1LALA 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 381 에 나타내는 DNA 단편, 서열 번호 34 에 나타내는 cMAb2_hIgG1LALA 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (Thermo Scientific 사 제조). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Thermo Scientific 사 제조) 를 사용하여, pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 cMAb1_hIgG1LALA, cMAb2_hIgG1LALA 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. cMAb1_hIgG1LALA 경사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 26, cMAb2_hIgG1LALA 경사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 30 에 나타낸다.
6)-4 cMAb1_hIgG1LALA, cMAb2_hIgG1LALA 의 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 29 에 나타내는 cMAb1_hIgG1LALA 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 438 에 나타내는 DNA 단편, 서열 번호 35 에 나타내는 cMAb2_hIgG1LALA 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 399 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (Thermo Scientific 사 제조). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Thermo Scientific 사 제조) 를 사용하여, pCMA-G1LALA 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 cMAb1_hIgG1LALA, cMAb2_hIgG1LALA 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. cMAb1_hIgG1LALA 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 27, cMAb2_hIgG1LALA 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 31 에 나타낸다.
6)-5 cMAb1_hIgG1LALA, cMAb2_hIgG1LALA 의 조제
6)-5-1 cMAb1_hIgG1LALA, cMAb2_hIgG1LALA 의 생산
FreeStyle 293F 세포 (Thermo Scientific 사 제조) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 1.2 × 109 개의 FreeStyle 293F 세포 (Thermo Scientific 사 제조) 를 3 L Fernbach Erle㎚eyer Flask (CORNING 사 제조) 에 파종하고, FreeStyle293 expression medium (Thermo Scientific 사 제조) 으로 희석시켜 2.0 × 106 세포/mL 로 조제하였다. 1.8 mg 의 Polyethyleneimine (Polyscience 사 제조) 을 Opti-Pro SFM 배지 (Thermo Scientific 사 제조) 20 mL 에 첨가하였다. 다음으로 0.24 mg 의 중사슬 발현 벡터와 0.36 mg 의 경사슬 발현 벡터를 20 mL 의 Opti-Pro SFM 배지 (Thermo Scientific 사 제조) 에 첨가하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액을 첨가하여 온화하게 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터에서 4 시간, 90 rpm 으로 진탕 배양 후에 600 mL 의 EX-CELL VPRO 배지 (SAFC Biosciences 사 제조), 18 mL 의 GlutaMAX I (GIBCO 사 제조), 및 30 mL 의 Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO 사 제조) 를 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터에서 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec 사 제조) 로 여과시켰다.
6)-5-2 cMAb1_hIgG1LALA 의 정제
6)-5-1 에서 얻어진 배양 상청으로부터 rProtein A 어피니티 크로마토그래피와 세라믹 하이드록시아파타이트의 2 단계 공정으로 항체를 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (Cytiva 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 항체를 용출시켰다. 항체가 포함되는 획분을 투석 (Thermo Scientific 사 제조, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로의 버퍼 치환을 실시하고, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석시킨 후에, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화한 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼 (일본 바이오래드사 제조, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사 제조, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius Stedim Biotech 사 제조) 로 여과시켜, 정제 샘플로 하였다.
6)-5-3 cMAb2_hIgG1LALA 의 정제
6)-5-1 에서 얻어진 배양 상청으로부터 rProtein A 어피니티 크로마토그래피로 항체를 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (Cytiva 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 항체를 용출시켰다. 용출된 획분을 투석 (Thermo Scientific 사 제조, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시하였다 (농도 미조정). 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius Stedim Biotech 사 제조) 로 여과시켜, 정제 샘플로 하였다.
(실시예 7) cMAb1_hIgG1LALA 의 성질
7)-1 항원 결합성의 측정
2)-3-1 의 방법에 따라 실시하였다. 또한, CHO-K1 세포에 첨가하는 cMAb1_hIgG1LALA 는 80-0.001 μg/mL 의 범위에서 첨가하였다. 또, 2 차 항체로서 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1000 배로 희석시킨 Peroxidase-AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories 사) 을 사용하였다. 또, 발색과 발색 정지를 위해서는 각각 TMB Microwell Peroxidase Substrate (2-Component System) (Sera Care Life Sciences 사) 와 TMB Stop Solution (Sera Care Life Sciences 사) 을 사용하였다. 그 결과, cMAb1_hIgG1LALA 는 pCMV3-hCD25, pCI-cCD25 를 도입한 CHO-K1 세포에 대해 항체 농도 의존적으로 결합하고, pCMV3-mCD25 를 도입한 CHO-K1 세포에는 결합하지 않았다 (도 9). 따라서, cMAb1_hIgG1LALA 는 인간 CD25 와 게잡이원숭이 CD25 에 대해 결합하는 것이 분명해졌다.
7)-2 인간 CD4 양성 T 세포를 사용한 IL-2 의존적 세포 증식에 대한 영향
7)-2-1 인간 CD4 양성 T 세포의 조제와 serum starvation
동결 인간 PBMC (Cellular Technology Limited 사) 를 C.T.L. Protocol 에 따라 융해시켰다. 그 후, CD4+ T Cell 아이솔레이션 키트, human (MILTENYI BIOTEC 사) 을 사용하여, PBMC 로부터 CD4 양성 T 세포를 분리하였다. 분리된 CD4 양성 T 세포를 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fisher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fisher Scientific 사) 배지에서 2 × 105 cells/mL 가 되도록 세포 현탁액을 조제하였다. 96-well plate (U-bottom) 에 세포 현탁액을 25 μL 파종하고, PHA (SIGMA-ALDRICH 사) 가 2 μg/mL 와 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (SIGMA-ALDRICH 사) 가 0.2 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 또한, 인간 IgG1, 바실릭시맙, cMAb1_hIgG1LALA 를 종농도 15 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 5 일간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 실온으로 되돌렸다. CellTiter-Glo luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 키트인 CellTiter-Glo Reagent 를 100 μL 첨가하고, 10 분간 플레이트 셰이커로 교반하였다. 100 μL/well 의 반응 용액을 96-well White Flat Bottom plate 에 옮겨 담고 플레이트 리더 (Ensight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 발광 강도 (상대 발광량, RLU (Relative Light Unit)) 를 측정하여, 세포수의 지표로 하였다. 그 결과, 인간 IgG1 첨가군의 세포수를 100 ％ 로 했을 때에, IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙 첨가군에서는 34 ％, cMAb1_hIgG1LALA 첨가군에서는 92 ％ 였다 (도 10). IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙 첨가군에서는 인간 IgG1 첨가군과 비교하여 T 세포수가 감소하고, cMAb1_hIgG1LALA 첨가군에서는 변화하지 않았다. 이상으로부터, cMAb1_hIgG1LALA 는 인간 CD4 양성 T 세포의 증식에 영향을 주지 않는 IL-2 논블로킹 항체인 것이 밝혀졌다.
7)-3 인간 PBMC 에 있어서의 IL-2 자극으로 증가하는 인산화 STAT5 (pSTAT5) 에 미치는 영향
7)-3-1 6-웰 플레이트 웰에 대한 항인간 CD3 항체의 고상화
6-웰 플레이트 (코닝사) 의 각 웰에 10 μg/mL 의 항인간 CD3 항체 (EXBIO Praha 사) 함유의 PBS 를 2 mL/well 로 첨가한 후, 플레이트를 플레이트 믹서로 혼합하고, 4 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 상청을 제거하고, 웰을 PBS 로 3 회 세정하여 사용하였다.
7)-3-2 인간 PBMC 의 조제와 serum starvation
동결 인간 PBMC 를 C.T.L. Protocol 에 따라 융해시켰다. 융해된 PBMC 를 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fisher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fisher Scientific 사) 배지에서 현탁하고, 7)-3-1 에서 준비한 6-웰 플레이트에 4 mL/well 씩 파종하였다. 플레이트는 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 3 일간 인큐베이션하였다.
7)-3-3 항체 용액의 조제와 첨가
컨트롤 항체인 인간 IgG1 과 항인간 CD25 항체인 바실릭시맙 (노바티스 파마사), 또는 cMAb1_hIgG1LALA 는 80 μg/mL 로 IMDM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 에서 희석시키고, V-bottom 96-well plate (Corning 사) 에 25 μL 첨가하였다. 항체를 첨가하지 않는 웰에 관해서는 IMDM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 를 25 μL 첨가하였다.
7)-3-4 인간 PBMC 와 IL-2 용액의 첨가
Serum starvation 을 실시한 PBMC 를 회수하고, 2 × 106 cells/mL 가 되도록 IMDM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 에서 조제하고, 7)-3-3 에서 항체 용액을 첨가한 플레이트에 50 μL/well 로 세포 현탁액을 첨가하였다. 또한, 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 15 분간 인큐베이션하였다.
리콤비넌트 인간 IL-2 (PeproTech 사) 는, 50 μL 의 0.1 M 아세트산으로 용해시킨 후, 0.45 mL 의 0.1 ％ BSA 함유 PBS 로 희석시킴으로써, 100 μg/mL 용액을 조제하였다. 추가로 IMDM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 에서 4 ng/mL 가 되도록 희석시키고, IL-2 첨가군의 웰에 25 μL/well 로 첨가하였다. 또, IL-2 비첨가군의 웰에는, IMDM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) 를 25 μL/well 로 첨가하였다. 그 후, 5 ％ CO2, 37 ℃ 의 조건하에서 15 분간 인큐베이션하였다.
7)-3-5 pSTAT5 측정
AlphaLISA SureFire Ultra phosho-STAT5 (Tyr694/699) kit (PerkinElmer 사) 에 부속된 5 × lysis buffer 를 H2O 로 1 × lysis buffer 로 조제하였다.
15 분간 인큐베이션 후의 플레이트를 340 × g 로 5 분간 원심하고, 각 웰의 상청을 흡인 제거한 후, PBS 를 첨가하여 동일하게 원심한 후에 상청을 흡인 제거하였다.
각 웰에 1 × lysis buffer 를 50 μL/well 로 첨가하였다. 플레이트를 10 분간 플레이트 셰이커로 교반하여, 세포 라이세이트를 조제하였다. 각 웰의 세포 라이세이트를 AlphaLISA 용 384-well SW plate (PerkinElmer 사) 에 8 μL/well 로 첨가하고, Acceptor Mix 를 4 μL/well 첨가한 후, 2 분간 플레이트 셰이커로 교반하였다. 그 후, 차광하에서 1 시간 인큐베이션하였다.
Donor Mix 를 4 μL/well 첨가하고, 2 분간 플레이트 셰이커로 교반한 후, 추가로 차광하여 하룻밤 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트 리더 (Ensight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 Alpha 시그널을 측정하였다. 그 결과, IL-2 와 컨트롤 항체인 인간 IgG1 의 첨가군에서의 pSTAT5 량을 100 ％ 로 했을 때에, IL-2 와 IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙의 첨가군에서는 1.2 ％, IL-2 와 cMAb1_hIgG1LALA 의 첨가군에서는 83.2 ％ 였다 (도 11). IL-2 첨가로 증가한 pSTAT5 량은, IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙의 첨가군에서 감소하고, cMAb1_hIgG1LALA 의 첨가에 의해 변동되지 않았다. 이 점에서, cMAb1_hIgG1LALA 는 IL-2 시그널을 블로킹하지 않는 항체인 것이 분명해졌다.
(실시예 8) cMAb1_hIgG1LALA-ADC, cMAb1_hIgG1LALA-ADC2, cMAb2_hIgG1LALA-ADC, cMAb2_hIgG1LALA-ADC2 의 조제
실시예 6 에서 조제된 cMAb1_hIgG1LALA 및 cMAb2_hIgG1LALA 를 사용하여, cMAb1_hIgG1LALA-ADC, cMAb1_hIgG1LALA-ADC2, cMAb2_hIgG1LALA-ADC, cMAb2_hIgG1LALA-ADC2 를, WO 2014/057687 등의 공지된 방법에 의해 조제하였다.
cMAb1_hIgG1LALA 항체는, 서열 번호 27 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 및 서열 번호 26 의 21 ∼ 126 번의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬을 포함한다. cMAb2_hIgG1LALA 항체는, 서열 번호 31 의 20 ∼ 133 번의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 및 서열 번호 30 의 21 ∼ 133 번의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬을 포함한다. cMAb1_hIgG1LALA 항체 및 cMAb2_hIgG1LALA 항체는, 각각 다음 식으로 나타내는 화합물과 링커에 의해 연결하였다.
[화학식 18]
그와 같은 cMAb1_hIgG1LALA-ADC, 및 cMAb2_hIgG1LALA-ADC 는, 이하의 식으로 나타내는 구조를 갖고 (n : 1 항체 분자당 콘주게이트된 약물 분자의 수는 4 ∼ 8 이며, 즉 1 항체당 콘주게이트된 약물 분자의 평균수 (n) : 대략 8), AB 는, cMAb1_hIgG1LALA 또는 cMAb2_hIgG1LALA 를 나타낸다.
[화학식 19]
cMAb1_hIgG1LALA-ADC2, 및 cMAb2_hIgG1LALA-ADC2 는, 이하의 식으로 나타내는 구조를 갖고 (n : 1 항체 분자당 콘주게이트된 약물 분자의 수는 4 ∼ 8 이며, 즉 1 항체당 콘주게이트된 약물 분자의 평균수 (n) : 대략 8), AB 는, cMAb1_hIgG1LALA 또는 cMAb2_hIgG1LALA 를 나타낸다.
[화학식 20]
대조 hIgG-ADC 는, 포유 동물 세포에 결합하지 않는 인간화 IgG1 아이소타입 대조 모노클로날 항체를 사용하여 cMAb1_hIgG1LALA-ADC, 및 cMAb2_hIgG1LALA-ADC 와 동일한 약물-링커로 구성되어 있다. 약물 링커는, WO 2015/115091 등의 공지된 방법으로 조제하였다.
8)-1 항체-약물 콘주게이트의 제조 cMAb1_hIgG1LALA-ADC
[화학식 21]
항체의 환원 : 실시예 6 에서 제조한 cMAb1_hIgG1LALA 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.60 mLmg-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 10.3 mg/mL 로 조제하였다. 본 용액 (4.0 mL) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.169 mL ; 항체 1 분자에 대해 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0600 mL) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬 사이부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드 (WO 2015/115091) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.282 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0282 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트「cMAb1_hIgG1LALA-ADC」를 함유하는 용액을 15.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 7642, εD,370 = 24111 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.36 mg/mL, 항체 수량 : 35.4 mg (86 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 5.1 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.7.
8)-2 항체-약물 콘주게이트의 제조 cMAb1_hIgG1LALA-ADC2
[화학식 22]
항체의 환원 : 실시예 6 에서 제조한 cMAb1_hIgG1LALA 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.60 mLmg-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 10.3 mg/mL 로 조제하였다. 본 용액 (4.0 mL) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.169 mL ; 항체 1 분자에 대해 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0600 mL) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬 사이부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드 (WO 2015/115091) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.282 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0282 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트「cMAb1_hIgG1LALA-ADC2」를 함유하는 용액을 15.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5440, εD,370 = 21240 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.74 mg/mL, 항체 수량 : 26.2 mg (63 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 6.2 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.9.
8)-3 항체-약물 콘주게이트의 제조 cMAb2_hIgG1LALA-ADC
[화학식 23]
항체의 환원 : 실시예 6 에서 제조한 cMAb2_hIgG1LALA 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.45 mLmg-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 10.1 mg/mL 로 조제하였다. 본 용액 (1.0 mL) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.0419 mL ; 항체 1 분자에 대해 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0150 mL) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬 사이부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.0698 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0070 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트「cMAb2_hIgG1LALA-ADC」를 함유하는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 7642, εD,370 = 24111 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.38 mg/mL, 항체 수량 : 8.30 mg (82 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 5.5 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.9.
8)-4 항체-약물 콘주게이트의 제조 cMAb2_hIgG1LALA-ADC2
[화학식 24]
항체의 환원 : 실시예 6 에서 제조한 cMAb2_hIgG1LALA 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.45 mLmg-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 10.1 mg/mL 로 조제하였다. 본 용액 (4.0 mL) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.168 mL ; 항체 1 분자에 대해 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.0600 mL) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬 사이부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.278 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0278 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트「cMAb2_hIgG1LALA-ADC2」를 함유하는 용액을 17.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 5440, εD,370 = 21240 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.06 mg/mL, 항체 수량 : 36.1 mg (90 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 6.0 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.9.
(실시예 9) cMAb1_hIgG1LALA-ADC 의 성질
9)-1 cMAb1_hIgG1LALA-ADC 를 사용한 세포 증식 억제 활성
9)-1-1 세포 배양
CD25 양성 인간 종양 세포주 Karpas-299 는, 2 mM glutamine (Life Technologies 사), 20 ％ FBS 함유 RPMI1640 (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 계대 배양하였다. 또, CD25 음성 인간 종양 세포주 Daudi 는, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 계대 배양하였다.
9)-1-2 세포 증식 억제 어세이
배양한 Karpas-299 는, 2 mM glutamine, 20 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 중에서 1 × 103 cells/50 μL/well 이 되도록 96 well clear U bottom microplate (Corning 사) 에 파종하였다. cMAb1_hIgG1LALA 를 0.015 μg/mL 내지 15 μg/mL, 컨트롤 hIgG1LALA-ADC, 및 cMAb1_hIgG1LALA-ADC 를 0.0015 μg/mL 내지 1.5 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 6 일간 배양하였다. 배양한 플레이트를 30 분간 실온에 정치하고, CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 의 Reagent 용액을 100 μL/well 첨가한 후, 실온·차광하에서 10 분간 플레이트 믹서 (타이텍사) 로 혼합하였다. 각 웰의 용액 100 μL 를 96 well white flat bottom microplate (Corning 사) 에 첨가하고, 플레이트 리더 (Ensight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 발광 강도 (상대 발광량, RLU (Relative Light Unit)) 를 측정하여, 세포수의 지표로 하였다.
또, CD25 발현 음성 인간 종양 세포주 DauDi 를 10 ％ FBS (GE Healthcare 사) 함유 RPMI1640 배지 (Thermo Fishcher Scientific 사) 를 사용하여 동일하게 세포 증식 억제 활성을 측정하였다. Daudi 에서는 1 × 104 cells/50 μL/well 이 되도록 파종하였다.
그 결과, cMAb1_hIgG1LALA-ADC 는 CD25 양성 인간 종양 세포주인 Karpas-299 의 경우에 있어서만, 인간 IgG1LALA-ADC 보다 낮은 농도로 세포 증식 억제 활성을 나타내었다 (도 12). 또, cMAb1_hIgG1LALA 의 첨가로는 세포 증식 억제 활성은 나타내지 않았다. 이상으로부터, cMAb1_hIgG1LALA-ADC 는 CD25 양성 세포의 증식 억제 활성을 갖는 것이 분명해졌다. cMAb1_hIgG1LALA-ADC2 에서도 동일한 작용을 나타내었다. 이들에 의한 CD25 양성 세포의 증식 억제는, cMAb1_hIgG1LALA-ADC 및 cMAb1_hIgG1LALA-ADC2 가 CD25 양성 세포에 내재화되어 세포사를 유도한 것에 의한 것으로 추찰할 수 있었다.
9)-2 cMAb1_hIgG1LALA-ADC 의 in vivo 면역 촉진 작용
9)-2-1 종양 조직의 채재 (採材) 와 세포 현탁액의 조제
10 ％ FBS 함유 Leibovitz's L-15 배지에서 계대 배양한 인간 유선암 유래 MDA-MB-231 세포 (American Type Culture Collection) 5 × 106 세포를 마트리겔에 현탁하고 암컷의 인간 CD34 세포 이입 면역 인간화 NOG 마우스 (huNOG 마우스) 의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 7 일 후에, 1 mg/㎏ 의 컨트롤 hIgG1LALA-ADC 또는 0.1 mg/㎏, 0.3 mg/㎏, 1 mg/㎏ 의 cMAb1_hIgG1LALA-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 5 마리). ADC 투여 28 일 후에 종양을 채재하였다. 채재한 종양괴를 gentleMACS (Miltenyi Biotec 사) 로 처리하고, 세포를 회수하였다. 세포를 PBS 로 세정하고, 재현탁한 후, 그 세포 현탁액을 플로 사이토메트리용 샘플로 하였다. 또한, 재현탁할 때의 PBS 량은, 종양 중량에 따라 다음의 양을 첨가하였다. 종양 중량 50 mg 까지는 0.6 mL, 종양 중량 50-100 mg 에서는 0.9 mL, 종양 중량 100-150 mg 에서는 1.2 mL, 150-200 mg 에서는 1.8 mL, 종양 중량 200-300 mg 에서는 2.4 mL 로 하였다.
9)-2-2 플로 사이토메트리 해석용 염색 용액의 조제
Zombie NIR dye 용액은, Zombie NIR Fixable Viability Kit (BioLegend 사) 에 첨부된 Zombie NIR dye 용액을 PBS 로 1000 배 희석시켜 조제하였다. Fc Block 용액은, Mouse BD Fc Block (BD Biosciences 사) 용액, Human BD Fc Block 용액과 0.5 ％ BSA 함유 autoMACS Rinsing Solution (Miltenyi Biotec 사) (이하,「MACS buffer」로 기재한다) 을 1 : 1 : 48 의 비율로 첨가 혼합하여 조제하였다. Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer 는, Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent (eBioscience 사) 인 Concentrate 3.5 mL 와 Diluent 10.5 mL 를 혼합하여 조제하였다. Perm wash buffer 는, Intracellular Staining Perm Wash Buffer (BioLegend 사) 를 H2O 로 10 배 희석시켜 조제하였다. 세포 표면 마커 항체 칵테일 용액은, 2 μL 의 FITC anti-human CD25 Antibody (BioLegend 사), 1 μL 의 APC anti-human CD8 Antibody (BioLegend 사), 3 μL 의 Brilliant Violet 421 anti-human CD4 Antibody (BioLegend 사), 2.5 μL 의 PE/Cyanine7 anti-human CD45RA Antibody (BioLegend 사), 2 μL 의 Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody, 2 μL 의 Brilliant Violet 605 anti-human CD45 Antibody (BD Biosciences 사) 와 Brilliant Violet 650 anti-human CD3 Antibody 를 첨가하고, MACS buffer 로 전체량을 50 μL 로 하여 사용하였다. 세포 내 마커 항체 칵테일 용액은, 3 μL 의 PE Mouse anti-Human FoxP3 (BD Biosciences 사), 3 μL 의 PerCP/Cyanine5.5 anti-human/mouse Granzyme B Recombinant Antibody (BioLegend 사), 1 μL 의 Mouse BD Fc Block (BD Biosciences 사) 과 1 μL 의 Human BD Fc Block 을 첨가하고, Perm wash buffer 로 전체량을 100 μL 로 하여 사용하였다.
9)-2-3 플로 사이토메트리 해석용 샘플의 항체 염색
9)-2-1 에서 조제한 플로 사이토메트리용 샘플 0.2 mL 에, Zombie NIR dye 희석 용액을 0.1 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. MACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 Fc Block 용액을 0.1 mL 첨가하고 4 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하였다. 세포에, 9)-2-2 에서 조제한 세포 표면 마커 항체 칵테일 용액을 0.1 mL 첨가하고 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. 다음으로, MACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 MACS buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 추가로 원심하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 추가로 2 회 실시하고, 세포를 세정하였다. Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션하였다. 세정한 세포에 세포 내 마커 항체 칵테일 용액을 0.2 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션한 후, Perm wash buffer 로 2 회 세정하고, 세포에 4 ％ 파라포름알데히드 용액을 첨가하고, 4 ℃ 에서 15 분간 인큐베이션하였다. 세포를 MACS buffer 로 2 회 세정한 후, 세포에 0.18 mL 의 MACS buffer 를 첨가하였다. 샘플을 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 플로 사이토메트리 해석을 실시하였다.
9)-2-4 플로 사이토메트리 해석
9)-2-3 에서 조제한 샘플을 플로 사이토미터 (BD LSR Fortessa X-20 셀 애널라이저 : BD Biosciences 사) 를 사용하여, Zombie NIR dye 음성 분획의 인간 CD45 양성 세포, 인간 FoxP3 양성 CD4 양성 CD3 양성 CD45 양성 세포 (인간 Treg 세포), 인간 CD8 양성 CD3 양성 CD45 양성 세포를 CD8 양성 T 세포 (인간 CD8 양성 T 세포), 인간 그랜자임 양성 CD8T 세포 (인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포) 의 세포수를 측정하였다. 그 후, 인간 Treg 세포, 인간 CD8 양성 T 세포, 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 각각의 세포수를 인간 CD45 양성 세포수로 나누어 인간 Treg 세포, 인간 CD8 양성 T 세포, 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 인간 CD45 세포당 세포수의 비율 (％ of hCD45) 을 산출하였다. 그 결과, 컨트롤 hIgG1LALA-ADC 투여군과 비교하여, cMAb1_hIgG1LALA-ADC 투여군에서는 투여량 의존적으로 인간 CD45 세포당 인간 Treg 세포수의 비율이 감소하고, 인간 CD8 양성 T 세포와 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포수의 비율의 증가가 관찰되었다 (도 13). 이들 결과로부터, cMAb1_hIgG1LALA-ADC 는, 인간 Treg 를 감소시킴으로써, 인간 CD8 양성 T 세포를 활성화하는 것이 분명해졌다. cMAb1_hIgG1LALA-ADC2 에서도 동일한 작용을 나타내었다.
(실시예 10) cMAb2_hIgG1LALA 의 성질
10)-1 항원 결합성의 측정
2)-3-1 의 방법에 따라 실시하였다. 또한, CHO-K1 세포에 첨가하는 cMAb2_hIgG1LALA 는 80-0.001 μg/mL 의 범위에서 첨가하였다. 또, 2 차 항체로서 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1000 배로 희석시킨 Peroxidase-AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories 사) 을 사용하였다. 또, 발색과 발색 정지를 위해서는 각각 TMB Microwell Peroxidase Substrate (2-Component System) (Sera Care Life Sciences 사) 와 TMB Stop Solution (Sera Care Life Sciences 사) 을 사용하였다. 그 결과, cMAb2_hIgG1LALA 는 pCMV3-mCD25 를 도입한 CHO-K1 세포에 대해 항체 농도 의존적으로 결합하고, pCMV3-hCD25, pCI-cCD25 를 도입한 CHO-K1 세포에는 결합하지 않았다 (도 14). 따라서, cMAb2_hIgG1LALA 는 마우스 CD25 에 대해 결합하는 것이 분명해졌다.
10)-2 마우스 CTLL-2 를 사용한 IL-2 의존적 세포 증식에 대한 영향
마우스 CTLL-2 세포의 배양에 관해서는 2)-3-9-1 에 따라 계대 배양한 세포를 사용하였다.
CD25 양성 마우스 종양 세포주 CTLL-2 를 1 mM Sodium Pyruvate (Thermo Fishcher Scientific 사), 1 × MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fishcher Scientific 사), 10 ％ T-STIM with ConA 함유 RPMI1640 (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지 중 5 × 102 cells/50 μL/well 이 되도록 96 well clear U bottom microplate (Corning 사) 에 파종하였다. 또한, cMAb2_hIgG1LALA, 컨트롤 hIgG1 및 PC61_hIgG1LALA 를 15 μg/mL 가 되도록 첨가하고 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 4 일간 배양하였다. 배양한 플레이트를 30 분간 실온에 정치하고, CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 의 Reagent 용액을 100 μL/well 첨가한 후, 실온·차광하에서 10 분간 플레이트 믹서 (타이텍사) 로 혼합하였다. 각 웰의 용액 100 μL 를 96 well white flat bottom microplate (Corning 사) 에 첨가하고, 플레이트 리더 (EnSight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 발광 강도 (상대 발광량, RLU (Relative Light Unit)) 를 측정하여, 세포수의 지표로 하였다. 그 결과, 컨트롤 항체인 인간 IgG1 첨가군의 세포수를 100 ％ 로 했을 때에, IL-2 블로킹 항체인 PC61_hIgG1LALA 의 첨가군의 세포수는 55 ％, cMAb2_hIgG1LALA 첨가군의 세포수는 104 ％ 였다 (도 15). 컨트롤 항체인 인간 IgG1 과 비교하여, IL-2 블로킹 항체인 PC61_hIgG1LALA 의 첨가군의 세포수는 감소되어 있었지만, cMAb2_hIgG1LALA 첨가군의 세포수는 변동되어 있지 않았던 점에서, cMAb2_hIgG1LALA 는 IL-2 의존적인 세포의 증식 촉진에 영향을 주지 않는 IL-2 논블로킹 항체인 것이 분명해졌다.
(실시예 11) cMAb2_hIgG1LALA-ADC 의 성질
11)-1 cMAb2_hIgG1LALA-ADC 를 사용한 세포 증식 억제 활성
11)-1-1 세포 배양
CD25 양성 마우스 종양 세포주 CTLL-2 를 1 mM Sodium Pyruvate (Thermo Fishcher Scientific 사), 1 × MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fishcher Scientific 사), 10 ％ T-STIM with ConA 함유 RPMI1640 (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 계대 배양하였다.
11)-1-2 세포 증식 억제 어세이
CD25 양성 마우스 T 세포주 CTLL-2 를 1 mM Sodium Pyruvate (Thermo Fishcher Scientific 사), 1 × MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fishcher Scientific 사), 10 ％ T-STIM with ConA 함유 RPMI1640 (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지 중 5 × 102 cells/50 μL/well 이 되도록 96 well clear U bottom microplate (Corning 사) 에 파종하였다. 또한, cMAb2_hIgG1LALA, 컨트롤 hIgG1LALA-ADC 및 cMAb2_hIgG1LALA-ADC 를 0.015 μg/mL 내지 15 μg/mL 가 되도록 첨가하고 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 4 일간 배양하였다. 배양한 플레이트를 30 분간 실온에 정치하고, CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 의 Reagent 용액을 100 μL/well 첨가한 후, 실온·차광하에서 10 분간 플레이트 믹서 (타이텍사) 로 혼합하였다. 각 웰의 용액 100 μL 를 96 well white flat bottom microplate (Corning 사) 에 첨가하고, 플레이트 리더 (EnSight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 발광 강도 (상대 발광량, RLU (Relative Light Unit)) 를 측정하여, 세포수의 지표로 하였다. 그 결과, 인간 IgG1LALA-ADC 및 cMAb2_hIgG1LALA 의 첨가로는 세포 증식 억제 활성은 나타내지 않았다. 한편으로, cMAb2_hIgG1LALA-ADC 는 이들 2 종류의 첨가군과 비교하여 세포 증식 억제 활성을 나타내었다 (도 16). 이 점에서 cMAb2_hIgG1LALA-ADC 는 마우스 CD25 발현 양성 세포에 대해 증식 억제 활성을 갖는 것이 밝혀졌다. cMAb2_hIgG1LALA-ADC2 에서도 동일한 작용을 나타내었다.
(실시예 12) cMAb2_hIgG1 의 조제
12)-1 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
6)-1 의 방법에 따라 실시하였다.
12)-2 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1' 의 구축
서열 번호 53 에 나타내는, 중사슬 시그널 서열 및 인간 중사슬 G1 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (유로핀 게노믹스사 제조). 이 DNA 단편을 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 절단 후, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해, 1.1 kb 의 DNA 단편을 잘라내고, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega 사 제조) 에 의해 정제하였다. pCMA-G1LALA 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화시켜 얻어지는 약 3.4 kb 의 프래그먼트와, 1.1 kb 의 DNA 단편을 Ligation High (토요보사 제조) 를 사용하여 결합하여, pCMA-G1' 를 구축하였다.
12)-3 cMAb2_hIgG1 의 발현 벡터의 구축
12)-3-1 cMAb2_hIgG1 의 경사슬 발현 벡터의 구축
cMAb2_hIgG1 의 경사슬 발현 벡터는, 6)-3 에서 구축하였다. cMAb2_hIgG1 의 경사슬 발현 벡터에 있어서의 항체 경사슬의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 36 에 나타낸다. 또, 아미노산 서열을 서열 번호 32 에 나타낸다.
12)-3-2 cMAb2_hIgG1 의 중사슬 발현 벡터의 구축
6)-4 에서 구축한 cMAb2_hIgG1-LALA 의 중사슬 발현 벡터를 주형으로 하고, 프라이머 2F (AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC : 서열 번호 49) 및 프라이머 2R (GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC : 서열 번호 50) 을 사용하여 가변 영역을 PCR 로 증폭시켰다. 그 후, In-Fusion HD PCR 클로닝 키트를 사용하여, pCMA-G1' 의 BlpI 부위에 삽입함으로써, cMAb2_hIgG1 의 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. cMAb2_hIgG1 의 중사슬 발현 벡터에 있어서의 항체 중사슬의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 37 에 나타낸다. 또, 아미노산 서열을 서열 번호 33 에 나타낸다.
12)-4 cMAb2_hIgG1 의 생산
FreeStyle 293F 세포 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 FreeStyle 293F 세포를 FreeStyle293 expression medium (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 으로 희석시켜 2.0 × 106 세포/mL 로 조정하고, 5 L Optimum Growth Flask (THOMSON 사 제조) 에 1.2 L 파종하였다. 3.6 mg 의 Polyethyleneimine (Polysciences 사 제조) 을 Opti-Pro SFM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 40 mL 에 첨가하였다. 다음으로 600 μg 의 중사슬 발현 벡터와 600 μg 의 경사슬 발현 벡터를 40 mL 의 Opti-Pro SFM 배지에 첨가하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액을 첨가하여 온화하게 교반하고, 추가로 5 분간 정치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터에서 4 시간, 105 rpm 으로 진탕 배양 후에 1.2 L 의 EX-CELL VPRO 배지 (SAFC Biosciences 사 제조), 및, 43.4 g/L 의 BD Recharge CD (BD Biosciences 사 제조) 를 60 mL 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터에서 6 일간, 105 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 원심 분리 후, 공경 0.2 ㎛ 의 필터 (PALL 사 제조) 로 여과시켰다.
12)-5 cMAb2_hIgG1 의 정제
12)-4 에서 얻어진 배양 상청으로부터 rProtein A 어피니티 크로마토그래피에 의한 1 단계 공정으로 항체를 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화하고, MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (Cytiva 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 항체를 용출시켰다. 항체가 포함되는 획분을 Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 를 사용하여, 투석에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로 버퍼 치환하였다. VIVASPIN 20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius Stedim Biotech 사 제조) 으로 항체를 농축시키고, IgG 농도를 약 2 mg/mL 로 조정하였다. 마지막으로 Minisart Plus (Sartorius Stedim Biotech 사 제조) 로 여과시켜, 정제 샘플로 하였다.
(실시예 13) cMAb2_hIgG1-ADC 의 조제
cMAb2_hIgG1-ADC 는 cMAb2_hIgG1 을 사용하여 실시예 8 에 따라 실시하였다.
13)-1 항체-약물 콘주게이트의 제조 cMAb2_hIgG1-ADC
[화학식 25]
항체의 환원 : 실시예 12 에서 제조한 cMAb2_hIgG1 을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.45 mLmg-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 10.8 mg/mL 로 조제하였다. 본 용액 (7.7 mL) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.344 mL ; 항체 1 분자에 대해 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.116 mL) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬 사이부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.573 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.0573 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트「cMAb2_hIgG1-ADC」를 함유하는 용액을 28.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 7642, εD,370 = 24111 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.82 mg/mL, 항체 수량 : 79.1 mg (95 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 5.9 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.8.
(실시예 14) cMAb2_hIgG1-ADC 의 항종양 활성과 종양 내 면역 세포의 변동
14)-1 CT26 모델에서의 항종양 활성 평가
10 ％ FBS 함유 RPMI1640 에서 계대 배양한 마우스 대장암 유래 CT26.WT 세포 (American Type Culture Collection) 2 × 105 세포를 암컷의 BALB/C 마우스의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 5 일 후에, 5 mg/㎏ 의 인간 IgG1-ADC 또는 5 mg/㎏ 의 cMAb2_hIgG1-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 9 마리). 이식 종양의 장경 및 단경을 주 2 내지 3 회, 전자 디지털 버니어 캘리퍼스 (주식회사 미츠토요 제조) 를 사용하여 측정하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.
종양 체적 (㎣) = 1/2 × 단경 (㎜) × 단경 (㎜) × 장경 (㎜)
그 결과, cMAb2_hIgG1-ADC 투여군에서는, 인간 IgG1-ADC 와 비교하여 종양 증식의 지연 및 퇴축이 확인되었다 (도 17). 이 점에서 cMAb2_hIgG1-ADC 는 항종양 활성을 갖는 것이 밝혀졌다.
14)-2 cMAb2_hIgG1-ADC 의 in vivo 면역 촉진 작용
14)-2-1 종양 조직의 채재와 세포 현탁액의 조제
10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 (Thermo Fishcher Scientific 사) 에서 계대 배양한 마우스 대장암 유래 CT26.WT 세포 (American Type Culture Collection) 2 × 105 세포를 암컷의 BALB/C 마우스의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 5 일 후에, 10 mg/㎏ 의 인간 IgG1-ADC 또는 10 mg/㎏ 의 cMAb2_hIgG1-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 20 마리). ADC 투여 후 7 일째와 14 일째에 10 마리씩 종양을 채재하였다. 채재한 종양괴를 gentleMACS (Miltenyi Biotec 사) 로 처리하고, 세포를 회수하였다. 세포를 PBS 로 세정하고, 재현탁한 후, 그 세포 현탁액을 플로 사이토메트리용 샘플로 하였다. 또한, 재현탁할 때의 PBS 량은, 종양 중량에 따라 다음의 양을 첨가하였다. 종양 중량 50 mg 까지는 0.8 mL, 종양 중량 50-100 mg 에서는 1.6 mL, 종양 중량 100-150 mg 에서는 2.0 mL, 150-200 mg 에서는 3.0 mL, 종양 중량 200-250 mg 에서는 4.0 mL 로 하였다.
14)-2-2 플로 사이토메트리 해석용 염색 용액의 조제
Zombie NIR dye 용액은, Zombie NIR Fixable Viability Kit (BioLegend 사) 에 첨부된 Zombie NIR dye 용액을 PBS 로 1000 배 희석시켜 조제하였다. Fc Block 용액은, Mouse BD Fc Block (BD Biosciences 사) 용액, MACS buffer 를 1 : 49 의 비율로 첨가 혼합하여 조제하였다. Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer 는, Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent (eBioscience 사) 인 Concentrate 2.5 mL 와 Diluent 7.5 mL 를 혼합하여 조제하였다. Perm wash buffer 는, Intracellular Staining Perm Wash Buffer (BioLegend 사) 를 H2O 로 10 배 희석시켜 조제하였다. 세포 표면 마커 항체 칵테일 용액은 2 μL 의 FITC anti-mouse CD25 Antibody (BioLegend 사), 2 μL 의 Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody (BioLegend 사), 2 μL 의 PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 Antibody (BD Biosciences 사), 3 μL 의 Brilliant Violet 650 anti-mouse CD3 Antibody (BioLegend 사), 2 μL 의 APC anti-mouse CD8 Antibody (BioLegend 사) 를 첨가하고, MACS buffer 로 전체량을 50 μL 로 하여 사용하였다. 세포 내 마커 항체 칵테일 용액은, 3 μL 의 PE Mouse anti-mouse FoxP3 (invitrogen 사), 3 μL 의 Brilliant Violet 421 anti-human Granzyme B Antibody (BD Biosciences 사) 와 1 μL 의 Mouse BD Fc Block (BD Biosciences 사) 을 첨가하고, Perm wash buffer 로 전체량을 100 μL 로 하여 사용하였다.
14)-2-3 플로 사이토메트리 해석용 샘플의 항체 염색
14)-2-1 에서 조제한 플로 사이토메트리용 샘플 0.2 mL 에, Zombie NIR dye 희석 용액을 0.1 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. MACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 Fc Block 용액을 0.05 mL 첨가하고 4 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하였다. 세포에, 14)-2-2 에서 조제한 세포 표면 마커 항체 칵테일 용액을 0.05 mL 첨가하고 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. 다음으로, MACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 MACS buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 추가로 원심하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 추가로 2 회 실시하고, 세포를 세정하였다. Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 정치 후, 원심하여 상청을 제거하고, Perm wash buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 원심하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 2 회 더 실시하고, 세포를 세정하였다. 세정한 세포에 세포 내 마커 항체 칵테일 용액을 0.2 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션 후, Perm wash buffer 로 2 회 세정하였다. 세포에 0.18 mL 의 MACS buffer 를 첨가하고, 플로 사이토메트리 해석을 실시하였다.
14)-2-4 플로 사이토메트리 해석
14)-2-3 에서 조제한 샘플을 플로 사이토미터 (BD LSR Fortessa X-20 셀 애널라이저 : BD Biosciences 사) 를 사용하여, 0.15 mL 의 샘플을 측정하였다. Zombie NIR dye 음성 분획의 마우스 CD45 양성 세포, 마우스 FoxP3 양성 CD4 양성 CD3 양성 CD45 양성 세포 (마우스 Treg 세포), 마우스 FoxP3 음성 CD4 양성 CD3 양성 CD45 양성 세포 (마우스 FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포), 마우스 CD8 양성 CD3 양성 CD45 양성 세포를 CD8 양성 T 세포 (마우스 CD8 양성 T 세포), 마우스 그랜자임 양성 CD8T 세포 (마우스 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포) 의 세포수를 측정하였다. 그 후, 마우스 Treg 세포, 마우스 CD8 양성 T 세포, 마우스 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 각각의 세포수를 이하의 식을 사용하여, 마우스 Treg 세포, 마우스 CD8 양성 T 세포, 마우스 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 종양 조직 1 mg 당 세포수를 산출하였다.
그 결과, 7 일째의 시점에 있어서 컨트롤 hIgG1-ADC 투여군과 비교하여, cMAb2_hIgG1-ADC 투여군에서는 종양 조직 1 mg 당 마우스 Treg 세포수의 양이 감소하고, 14 일째의 시점에 있어서 마우스 FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포, 마우스 CD8 양성 T 세포와 마우스 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 종양 조직 1 mg 당 증가가 관찰되었다 (도 18). 이들 결과로부터, cMAb2_hIgG1-ADC 는, 마우스 Treg 를 감소시킴으로써, 마우스 FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포와 마우스 CD8 양성 T 세포를 활성화하는 것이 분명해졌다.
(실시예 15) 인간화 항체의 제조
15)-1 MAb1 의 인간화 항체의 설계
15)-1-1 가변 영역의 분자 모델링
호몰로지 모델링으로서 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 을 이용하였다. 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 Discovery Studio (다쏘·시스템즈사 제조) 를 사용하여, 가변 영역에 대해 높은 서열 동일성을 갖는 Protein Data Bank (Nuc. Acids Res. 35, D301-D303 (2007)) 에 등록되어 있는 구조를 검색하였다. 히트한 중사슬, 경사슬 및 중사슬 경사슬 인터페이스 구조를 주형으로 하여, 삼차원 모델이 제조되었다.
15)-1-2 인간화 항체의 설계 방법
CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 인간화하였다. cMAb1 의 프레임워크 영역은, KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 에 있어서 기정되는 인간 kappa 사슬 서브그룹 3 및 4 의 컨센서스 서열과, 인간 gamma 사슬 서브그룹 3 의 컨센서스 서열에 높은 상동성을 갖는 점에서, 그들이 cMAb1 의 경사슬과 중사슬의 억셉터로서 각각 선택되었다. 억셉터 상에 이입해야 하는 도너 잔기는, Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준 등을 참고로, 삼차원 모델을 분석함으로써 선택되었다.
15)-1-3 MAb1 경사슬의 인간화
cMAb1 경사슬의 가변 영역을 기초로 인간화 항체 경사슬 hMAb1A 및 hMAb1B 의 가변 영역을 설계하였다.
설계된 가변 영역에, 인간의 κ 사슬 정상 영역을 접속시킨 인간화 항체 경사슬을 설계하고, 각각 hMAb1A-L, hMAb1B-L 로 명명하였다. hMAb1A-L, hMAb1B-L 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을 각각 서열 번호 13, 14 에 기재한다. 서열 번호 13, 14 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 각각 서열 번호 38, 39 에 기재한다.
15)-1-4 MAb1 중사슬의 인간화
cMAb1 중사슬의 가변 영역을 기초로 인간화 항체 중사슬 hMAb1A 및 hMAb1B 의 가변 영역을 설계하였다.
설계된 가변 영역에, 인간의 IgG1 의 gamma 사슬 정상 영역을 접속시킨 인간화 항체 중사슬을 설계하고, hMAb1A-H, hMAb1B-H 로 명명하였다. hMAb1A-H, hMAb1B-H 각각의 전체 길이 아미노산 서열을 각각 서열 번호 15, 16 에 기재한다. 서열 번호 15, 16 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 40, 41 에 기재한다.
15)-2 인간화 항체의 발현 벡터의 구축
15)-2-1 인간화 항체 hMAb1A 의 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 38 에 나타내는, 인간화 항체 hMAb1 의 경사슬 가변 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 399 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (Thermo Fisher Scientific 사 제조). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트를 사용하여, pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써, 인간화 항체 hMAb1 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 인간화 항체 hMAb1A 경사슬 발현 벡터에 있어서의 시그널 서열을 포함하는 인간화 항체 hMAb1A 항체 경사슬의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 38 에 나타낸다. 또, 아미노산 서열을 서열 번호 13 에 나타낸다.
15)-2-2 인간화 항체 hMAb1B 의 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 39 에 나타내는, 인간화 항체 hMAb1B 의 경사슬 가변 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 399 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (Thermo Fisher Scientific 사 제조). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트를 사용하여, pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써, 인간화 항체 hMAb1B 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 인간화 항체 hMAb1B 경사슬 발현 벡터에 있어서의 시그널 서열을 포함하는 인간화 항체 hMAb1B 항체 경사슬의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 39 에 나타낸다. 또, 아미노산 서열을 서열 번호 14 에 나타낸다.
15)-2-3 인간화 항체 hMAb1A 의 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 40 에 나타내는, 인간화 항체 hMAb1A 의 중사슬 가변 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 455 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (Thermo Fisher Scientific 사 제조). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트를 사용하여, 12)-2 에서 구축한 pCMA-G1' 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써, 인간화 항체 hMAb1A 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 인간화 항체 hMAb1A 중사슬 발현 벡터에 있어서의 시그널 서열을 포함하는 인간화 항체 hMAb1A 항체 중사슬의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 40 에 나타낸다. 또, 아미노산 서열을 서열 번호 15 에 나타낸다.
15)-2-4 인간화 항체 hMAb1B 의 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 41 에 나타내는, 인간화 항체 hMAb1B 의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 455 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (Thermo Fisher Scientific 사 제조). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트를 사용하여, 12)-2 에서 구축한 pCMA-G1' 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써, 인간화 항체 hMAb1B 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 인간화 항체 hMAb1B 중사슬 발현 벡터에 있어서의 시그널 서열을 포함하는 인간화 항체 hMAb1B 항체 중사슬의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 41 에 나타낸다. 또, 아미노산 서열을 서열 번호 16 에 나타낸다.
15)-3 인간화 항체 hMAb1 의 조제
15)-3-1 인간화 항체 hMAb1A 의 조제
FreeStyle 293F 세포 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 는, BCP 형 동물 세포 배양 장치 (주식회사 바이오트사 제조) 를 사용하여, 스피너 플라스크에서, 37 ℃, 8 ％ CO2 에서 계대, 배양하였다. 그 후의 배양은, 매뉴얼에 따라, WAVE BIOREACTOR (GE 헬스케어사 제조) 로 실시하였다. 대수 증식기의 FreeStyle 293F 세포를 FreeStyle293 expression medium (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 으로 희석시켜 2.0 ∼ 2.4 × 106 세포/mL 로 조정하고, 6 L 를 50 L 배양용 WAVE 백 (cytiva 사 제조) 에 이입하였다. 그 후, 6 L 의 FreeStyle293 expression medium 도 이입하고, 37 ℃, 8 ％ CO2 에서 흔들어 움직여 하룻밤 배양하였다. 37.5 mg 의 Polyethyleneimine (Polysciences 사 제조) 을 Opti-Pro SFM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 400 mL 에 첨가하였다. 다음으로 6.25 mg 의 인간화 항체 hMAb1 중사슬 발현 벡터, 및, 6.25 mg 의 인간화 항체 hMAb1 경사슬 발현 벡터를 400 mL 의 Opti-Pro SFM 배지에 첨가하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액을 첨가하여 온화하게 교반하고, 추가로 5 분간 정치한 후에 전체량을 FreeStyle 293F 세포를 배양하고 있는 50 L 배양용 WAVE 백에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 에서 흔들어 움직여 4 시간 배양 후에 10 L 의 1 ％ GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 를 포함하는 Balan CD HEK293 배지 (후지 필름 와코 순약) 및 2.5 L 의 1 ％ GlutaMAX 를 포함하는 Balan CD HEK293 Feed 배지 (후지 필름 와코 순약) 를 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 에서 흔들어 움직여 6 일간 배양하여 얻어진 배양 상청을 뎁스 필터 (공경 : 5 ㎛, GE 헬스케어사 제조) 를 통과시키고, 그 후, 캡슐 카트리지 필터 (공경 : 0.45 ㎛, 어드반텍 토요사 제조) 로 여과시켰다.
15)-3-2 인간화 항체 hMAb1B 의 조제
15)-3-1 에 기재한 방법에 의해, 1.25 mg 의 인간화 항체 hMAb1B 경사슬 발현 벡터, 및, 1.25 mg 의 인간화 항체 hMAb1B 중사슬 발현 벡터를 사용하여, FreeStyle 293F 세포 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 를 사용한 일과성 발현에 의해 조제하였다.
15)-4 인간화 항체 hMAb1A 및 hMAb1B 의 정제
15)-3-1 및 15)-3-2 에서 얻어진 배양 상청으로부터 rProtein A 어피니티 크로마토그래피와 세라믹 하이드록시아파타이트의 2 단계 공정으로 항체를 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 항체를 용출시켰다. 항체가 포함되는 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로의 버퍼 치환을 실시하고, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석시킨 후에, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화한 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼 (일본 바이오래드, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨/pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사) 으로 항체를 농축시키고, IgG 농도를 약 20 mg/mL 로 조정하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과시켜, 정제 샘플로 하였다.
(실시예 16) hMAb1 항체의 성질
16)-1 인간화 항체의 CD25 에 대한 결합능 평가
실시예 15 에서 제조한 인간화 항인간 CD25 항체 hMAb1A 및 hMAb1B 의 해리 정수 측정은, Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 을 사용하고, Human Antibody Capture Kit (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 를 사용하여 고정화한 Anti-Human IgG(Fc) antibody 에 항체를 리간드로서 포착 (캡처) 하고, 항원을 애널라이트로 하여 측정하는 캡처법으로 실시하였다. 러닝 버퍼로서 HBS-EP+ (GE Healthcare Bioscience 사 제조), 센서 칩으로서 CM5 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 를 사용하였다. 칩 상에 1 μg/mL 의 인간화 항체를 10 μL/분으로 60 초간 첨가한 후, 실시예 5 에서 사용한 항원의 희석 계열 용액 (hMAb1 에 대해 0.0625 ∼ 1 μg/mL) 을 유속 30 μL/분으로 120 초간 첨가하고, 계속해서 300 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서, 3M magnesium chloride (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 를 유속 20 μL/분으로 30 초간 첨가하였다. 데이터의 해석에는 1 : 1 결합 모델을 사용하여, 결합 속도 정수 ka, 해리 속도 정수 kd 및 해리 정수 (KD ; KD = kd/ka) 를 산출하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.
[표 6]
16)-2 종 교차성
2)-3-1 의 방법에 따라 실시하였다. 또한, 2 차 항체로서 5 ％ FBS 함유 PBS 로 1000 배로 희석시킨 Peroxidase-AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories 사) 을 사용하였다. 또, 발색과 발색 정지를 위해서는 각각 TMB Microwell Peroxidase Substrate (2-Component System) (Sera Care Life Sciences 사) 와 TMB Stop Solution (Sera Care Life Sciences 사) 을 사용하였다. 또, hMAb1A 및 hMAb1B 는 정제 항체를 사용하여, 항체의 종농도가 20 내지 0.001 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 또, 항체 비첨가 웰 (0 μg/mL) 은 항체 용액 대신에 5 ％ FBS 함유 PBS 를 첨가하였다. 결과를 도 19 에 나타낸다. hMAb1A 는 인간 CD25, 게잡이원숭이 CD25 에 결합하는 한편으로, 마우스 CD25 에는 결합하지 않는 것이 밝혀졌다. 또, hMAb1B 는 인간 CD25, 게잡이원숭이 CD25 에 결합하는 것이 밝혀졌다 (도 19).
16)-3 인간 CD4 양성 T 세포 혹은 인간 PBMC 를 사용한 IL-2 의존적 세포 증식에 대한 영향
hMAb1A 에 관해서는 7)-2 의 방법에 따라 실시하였다. 또한, CD4 양성 T 세포는 8 × 105 cells/mL 가 되도록 조제하였다. 또, 항체 농도는 100 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. hMAb1B 에 관해서는 정상인의 PBMC 를 사용하여 실시하였다. 정상인의 PBMC 는 Ficoll-Paque PLUS (cytiva 사) 를 사용하여 혈액으로부터 분리하였다. 분리한 PBMC 를 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fisher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fisher Scientific 사) 배지에서 2 × 105 cells/mL 가 되도록 세포 현탁액을 조제하였다. 96-well plate (U-bottom) 에 세포 현탁액을 25 μL 파종하고, PHA (SIGMA-ALDRICH 사) 가 2 μg/mL 와 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (SIGMAALDRICH 사) 가 0.2 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 또한, 인간 IgG1, 바실릭시맙, hMAb1B 를 종농도 20 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 5 일간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 실온으로 되돌렸다. CellTiter-Glo luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 키트인 CellTiter-Glo Reagent 를 100 μL 첨가하고, 10 분간 플레이트 셰이커로 교반하였다. 100 μL/well 의 반응 용액을 96-well White Flat Bottom plate 에 옮겨 담고 플레이트 리더 (Ensight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 발광 강도 (상대 발광량, RLU (Relative Light Unit)) 를 측정하여, 세포수의 지표로 하였다. 그 결과, 인간 IgG1 첨가군의 세포수를 100 ％ 로 했을 때에, IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙의 첨가군에서는 42 ％ 혹은 65 ％ 이고, hMAb1A 및 hMAb1B 첨가군에서는 각각 92 ％, 95 ％ 였다 (도 20). 인간 IgG1 첨가군과 비교하여, IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙 첨가군에서는 세포수가 감소하고, hMAb1A, hMAb1B 첨가군에서 세포수는 변동되지 않았던 점에서, hMAb1A 는 인간 CD4 양성 T 세포, hMAb1B 는 인간 PBMC 의 증식에 영향을 주지 않는 IL-2 논블로킹 항체인 것이 밝혀졌다.
16)-4 인간 PBMC 에 있어서의 IL-2 자극으로 증가하는 인산화 STAT5 (pSTAT5) 에 미치는 영향
7)-3 의 방법에 따라 실시하였다. 그 결과, IL-2 와 컨트롤 항체인 hIgG1 을 첨가한 군의 pSTAT 량을 100 ％ 로 했을 때에, IL-2 와 IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙을 첨가한 군에서는 0.01 ％, hMAb1 및 hMAb1B 를 첨가한 군에서는 각각 94 ％, 93 ％ 였다 (도 21). IL-2 첨가로 증가한 pSTAT5 량은, 컨트롤 항체인 hIgG1 의 첨가와 비교하여, hMAb1A 및 hMAb1B 의 첨가에 의해 변동되지 않고, IL-2 블로킹 항체인 바실릭시맙의 첨가로 감소한 점에서, hMAb1A 및 hMAb1B 는 IL-2 시그널을 블로킹하지 않는 항체인 것이 분명해졌다.
(실시예 17) hMAb1-ADC 의 조제
17)-1-1 hMAb1A-ADC 의 조제
hMAb1A-ADC 는 hMAb1A 를 사용하여, 실시예 8 에 따라 실시하였다.
[화학식 26]
항체의 환원 : 실시예 15 에서 제조한 hMAb1A 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.62 mLmg-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 10.0 mg/mL 로 조제하였다. 본 용액 (15.0 mL) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.617 mL ; 항체 1 분자에 대해 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.225 mL) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬 사이부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (1.03 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.103 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트「hMAb1A-ADC」를 함유하는 용액을 49.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 7642, εD,370 = 24111 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.62 mg/mL, 항체 수량 : 128 mg (85 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 4.7 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.9.
17)-1-2 hMAb1B-ADC 의 조제
hMAb1B-ADC 는 hMAb1B 를 사용하여, 실시예 8 에 따라 실시하였다.
[화학식 27]
항체의 환원 : 실시예 15 에서 제조한 hMAb1B 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.60 mLmg-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, PBS6.0/EDTA 로 10.0 mg/mL 로 조제하였다. 본 용액 (16.5 mL) 에 10 mM TCEP (도쿄 화성 공업 주식회사) 수용액 (0.676 mL ; 항체 1 분자에 대해 6.0 당량) 및 1 M 인산수소이칼륨 수용액 (Nacalai Tesque, Inc. ; 0.248 mL) 을 첨가하였다. 본 용액의 pH 가 7.0 ± 0.1 내인 것을 확인한 후에, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 항체 내 사슬 사이부의 디술파이드 결합을 환원하였다.
항체와 약물 링커의 콘주게이션 : 상기 용액을 15 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(4-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-4-옥소부틸)글리신아미드의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (1.13 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 15 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) 수용액 (0.113 mL ; 항체 1 분자에 대해 10 당량) 을 첨가하고, 추가로 실온에서 20 분간 교반하고, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 콘주게이트「hMAb1B-ADC」를 함유하는 용액을 59.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εD,280 = 7642, εD,370 = 24111 을 사용) 를 사용하여, 하기의 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 2.32 mg/mL, 항체 수량 : 138 mg (84 ％), 공통 조작 E 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 4.4 ; 공통 조작 F 로 측정된 항체 1 분자당 약물 평균 결합수 (n) : 7.7.
(실시예 18) hMAb1-ADC 의 성질
18)-1 hMAb1A-ADC 및 hMAb1B-ADC 를 사용한 세포 증식 억제 활성
18)-1-1 세포 배양
CD25 양성 인간 종양 세포주 Karpas-299 는, 2 mM glutamine (Life Technologies 사), 20 ％ FBS 함유 RPMI1640 (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 계대 배양하였다. CD25 양성 인간 종양 세포주 EoL-1 은, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 계대 배양하였다. 또, CD25 음성 인간 종양 세포주 Daudi 는, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 계대 배양하였다.
18)-1-2 세포 증식 억제 어세이
9)-1-2 에 따라 실시하였다. 단, 인큐베이션 기간은 6 일간 실시하였다. 또, EoL-1 에 관해서는 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 중에서 1 × 104 cells/50 μL/well 이 되도록 96 well clear U bottom microplate (Corning 사) 에 파종하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 6 일간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 실온으로 되돌렸다. CellTiter-Glo luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 키트인 CellTiter-Glo Reagent 를 100 μL 첨가하고, 10 분간 플레이트 셰이커로 교반하였다. 100 μL/well 의 반응 용액을 96-well White Flat Bottom plate 에 옮겨 담고 플레이트 리더 (Ensight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 발광 강도 (상대 발광량, RLU (Relative Light Unit)) 를 측정하여, 세포수의 지표로 하였다. 그 결과, CD25 양성 인간 종양 세포주인 Karpas-299 혹은 EoL-1 에 hMAb1A 혹은 hMAb1B 를 첨가해도 세포 증식 억제 활성은 나타내지 않았다. 한편으로, hMAb1A-ADC 혹은 hMAb1B-ADC 의 경우에 있어서는, 인간 IgG1-ADC 혹은 인간 IgG1LALA-ADC 보다 낮은 농도에서 세포 증식 억제 활성을 나타내었다 (도 22). 또, CD25 음성 인간 종양 세포주인 Daudi 에서는 hMAb1A-ADC 및 hMAb1B-ADC 는 세포 증식 억제 활성을 나타내지 않았다 (도 22). 이 점에서 hMAb1A-ADC 및 hMAb1B-ADC 는 CD25 발현 양성 세포에 대해 증식 억제 활성을 갖는 것이 밝혀졌다.
18)-2 hMAb1A-ADC 의 in vivo 면역 촉진 작용
18)-2-1 종양 조직의 채재와 세포 현탁액의 조제
10 ％ FBS 함유 Leibovitz's L-15 배지에서 계대 배양한 인간 유선암 유래 MDA-MB-231 세포 (American Type Culture Collection) 5 × 106 세포를 마트리겔에 현탁하고 암컷의 인간 CD34 세포 이입 면역 인간화 NOG 마우스 (huNOG 마우스) 의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 7 일 후에, Vehicle 로서 ABS, 또는 0.1 mg/㎏, 0.3 mg/㎏, 1 mg/㎏, 3 mg/㎏, 10 mg/㎏ 의 hMAb1A-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 5 마리). ADC 투여 23 일 후에 종양을 채재하였다. 채재한 종양괴를 gentleMACS (Miltenyi Biotec 사) 로 처리하고, 세포를 회수하였다. 세포를 PBS 로 세정하고, 재현탁한 후, 그 세포 현탁액을 플로 사이토메트리용 샘플로 하였다. 또한, 재현탁할 때의 PBS 량은, 종양 중량에 따라 다음의 양을 첨가하였다. 종양 중량 50 mg 까지는 0.2 mL, 종양 중량 50-80 mg 에서는 0.4 mL, 종양 중량 80-100 mg 에서는 0.8 mL, 100-120 mg 에서는 1.2 mL, 종양 중량 120-160 mg 에서는 1.5 mL, 160-200 mg 에서는 2.0 mL, 200-250 mg 에서는 2.5 mL 로 하였다.
18)-2-2 플로 사이토메트리 해석용 염색 용액의 조제
Zombie NIR dye 용액은, Zombie NIR Fixable Viability Kit (BioLegend 사) 에 첨부된 Zombie NIR dye 용액을 PBS 로 1000 배 희석시켜 조제하였다. Fc Block 용액은, Mouse BD Fc Block (BD Biosciences 사) 용액, Human BD Fc Block 용액과 MACS buffer 를 1 : 1 : 48 의 비율로 첨가 혼합하여 조제하였다. Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer 는, Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent (eBioscience 사) 인 Concentrate 와 Diluent 를 1 : 3 의 비율로 혼합하여 조제하였다. Perm wash buffer 는, Intracellular Staining Perm Wash Buffer (BioLegend 사) 를 H2O 로 10 배 희석시켜 조제하였다. 세포 표면 마커 항체 칵테일 용액은, 2 μL 의 FITC anti-human CD25 Antibody (BioLegend 사), 1 μL 의 APC anti-human CD8 Antibody (BioLegend 사), 3 μL 의 Brilliant Violet 421 anti-human CD4 Antibody (BioLegend 사), 2.5 μL 의 PE/Cyanine7 anti-human CD45RA Antibody (BioLegend 사), 2 μL 의 Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody (BioLegend 사), 2 μL 의 Brilliant Violet 605 anti-human CD45 Antibody (BioLegend 사) 와 2 μL 의 Brilliant Violet 650 anti-human CD3 Antibody (BioLegend 사) 를 첨가하고, MACS buffer 로 전체량을 50 μL 로 하여 사용하였다. 세포 내 마커 항체 칵테일 용액은, 3 μL 의 PE Mouse anti-Human FoxP3 (BD Biosciences 사), 3 μL 의 PerCP/Cyanine5.5 anti-human/mouse Granzyme B Recombinant Antibody (BioLegend 사), 1 μL 의 Mouse BD Fc Block (BD Biosciences 사) 과 1 μL 의 Human BD Fc Block 을 첨가하고, Perm wash buffer 로 전체량을 100 μL 로 하여 사용하였다.
18)-2-3 플로 사이토메트리 해석용 샘플의 항체 염색
18)-2-1 에서 조제한 플로 사이토메트리용 샘플 0.2 mL 를 원심하여 상청을 제거한 후에, Zombie NIR dye 희석 용액을 0.1 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. MACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 Fc Block 용액을 0.1 mL 첨가하고 4 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하였다. 세포에, 18)-2-2 에서 조제한 세포 표면 마커 항체 칵테일 용액을 0.1 mL 첨가하고 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. 다음으로, MACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 MACS buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 추가로 원심하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 추가로 2 회 실시하고, 세포를 세정하였다. Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 실온에서 1 시간 인큐베이션하였다. 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 Perm wash buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 추가로 원심하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 추가로 2 회 실시하고, 세포를 세정하였다. 세정한 세포에 세포 내 마커 항체 칵테일 용액을 0.2 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션한 후, Perm wash buffer 로 2 회 세정하고, 세포에 4 ％ 파라포름알데히드 용액을 첨가하고, 4 ℃ 에서 15 분간 인큐베이션하였다. 세포를 MACS buffer 로 2 회 세정한 후, 세포에 0.18 mL 의 MACS buffer 를 첨가하였다. 샘플을 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 플로 사이토메트리 해석을 실시하였다.
18)-2-4 플로 사이토메트리 해석
18)-2-3 에서 조제한 샘플을 플로 사이토미터 (BD LSR Fortessa X-20 셀 애널라이저 : BD Biosciences 사) 를 사용하여, Zombie NIR dye 음성 분획의 인간 CD45 양성 세포, 인간 FoxP3 양성 CD4 양성 CD3 양성 CD45 양성 세포 (인간 Treg 세포), 인간 FoxP3 음성 CD4 양성 CD3 양성 CD45 양성 세포 (인간 FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포), 인간 CD8 양성 CD3 양성 CD45 양성 세포 (인간 CD8 양성 T 세포), 인간 그랜자임 양성 CD8T 세포 (인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포) 의 세포수를 측정하였다. 그 후, 인간 Treg 세포, 인간 FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포, 인간 CD8 양성 T 세포, 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 각각의 세포수를 인간 CD45 양성 세포수로 나누어 인간 Treg 세포, 인간 FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포, 인간 CD8 양성 T 세포, 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 인간 CD45 세포당 세포수의 비율 (％ of hCD45) 을 산출하였다. 그 결과, Vehicle 군과 비교하여, hMAb1A-ADC 투여군에서는 투여량 의존적으로 인간 CD45 세포당 인간 Treg 세포수의 비율이 감소하고, 인간 FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포, 인간 CD8 양성 T 세포와 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포수의 비율의 증가가 관찰되었다 (도 23). 이들 결과로부터, hMAb1A-ADC 는, 인간 Treg 를 감소시킴으로써, 인간 FoxP3 음성 CD4 양성 T 세포나 인간 CD8 양성 T 세포를 활성화하는 것이 분명해졌다.
18)-3 hMAb1A-ADC 및 hMAb1B-ADC 의 in vivo 면역 촉진 작용
18)-3-1 종양 조직의 채재와 세포 현탁액의 조제
18)-2-1 에 따라 실시하였다. 단, 이식의 7 일 후에, 3 mg/㎏ 의 hMAb1A-ADC, hMAb1B-ADC 및 인간 IgG1LALA-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 4 혹은 5 마리). ADC 투여 후 21 일째에 채재를 실시하였다.
18)-3-2 플로 사이토메트리 해석용 염색 용액의 조제
18)-2-2 에 따라 실시하였다.
18)-3-3 플로 사이토메트리 해석용 샘플의 항체 염색
18)-2-3 에 따라 실시하였다.
18)-3-4 플로 사이토메트리 해석
18)-2-4 에 따라 실시하였다. 그 결과, 인간 IgG1LALA-ADC 군과 비교하여, hMAb1A-ADC 및 hMAb1B-ADC 투여군에서는 인간 CD45 세포당 인간 Treg 세포수의 비율이 감소하고, 인간 CD8 양성 T 세포와 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포수의 비율의 증가가 관찰되었다 (도 24). 이들 결과로부터, hMAb1A-ADC 및 hMAb1B-ADC 는, 인간 Treg 를 감소시킴으로써, 인간 CD8 양성 T 세포를 활성화하는 것이 분명해졌다.
(실시예 19) RG-6292 의 조제
특허 (WO 2019/175222) 의 방법에 준하여 조제하였다.
(실시예 20) RG-6292 와 hMAb1A-ADC 의 활성 비교
20)-1 ADCC 어세이
20)-1-1 iTreg 의 조제
iTreg 의 조제에는 말초혈 단핵구 (PBMC) 로서 동결 인간 PBMC (Cellular Technology 사) 를 해동시켜 사용하였다. PBMC 로부터 naive CD4 T 세포를 EasySep human naive CD4 T cell Isolation kit (STEMCELL 사) 를 사용하여 정제하였다. 얻어진 naive CD4 T 세포를 10 ％ FBS, 1 ％ Glutamax (Thermo Fishcher Scientific 사), 1 × Sodium pyruvate (Thermo Fishcher Scientific 사), 1 × MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fishcher Scientific 사), 25 mM HEPES (Thermo Fishcher Scientific 사), 30 ng/mL Recombinant Human IL-2 (Peprotech 사), 10 ng/mL Recombinant Human TGF-β, 50 μM 2-mercaptomethanol (Thermo Fishcher Scientific 사), 세포수와 동수의 Dynabeads Human T-Activator CD3/28 (Thermo Fishcher Scientific 사) 함유 X-VIVOTM 15 (Lonza 사) 배지에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 4 일간 배양하였다. 이 결과, 얻어진 세포를 iTreg 로서 사용하였다.
20)-1-2 NK 세포의 조제
정상인의 PBMC 는 Ficoll-Paque PLUS (cytiva 사) 를 사용하여 혈액으로부터 분리하였다. PBMC 로부터 NK 세포를 EasySepTM Human NK cell isolation Kit (STEMCELL 사) 를 사용하여 정제하였다. 얻어진 NK 세포는 4 ng/mL 리콤비넌트 인간 IL-2 (Peprotech 사) 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fishcher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다.
20)-1-3 ADCC 어세이
조제한 iTreg 에 PKH26 Red Fluorescent Cell linear Kits (SIGMA-ALDRICH 사) 에 포함되는 Diluent C 를 100 μL 첨가하였다. 또한, 4 μL PKH26 ethanolic dye solution 을 1 mL Diluent C 에 첨가하여 조제한 Dye Solution 을 100 μL 첨가하였다. 그 후, 실온에서 5 분간 인큐베이션하였다. 8 mL 의 10 ％ FBS 첨가 RPMI1640 배지 (Thermo Fishcher Scientific 사) 를 첨가하고, 20 ℃, 300 × g, 10 분간 원심하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 추가로 2 회 실시하고, 세포를 세정하였다. 그 후, 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fishcher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지에서 4 × 105 cells/mL 가 되도록 조제하였다. 이 세포 현탁액을 96 well clear U bottom microplate (Corning 사) 에 50 μL/well 첨가하였다. 동일하게 20)-1-2 에서 조제한 NK 세포를 2 × 106 cells/mL 가 되도록 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fishcher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지에서 조제하고, 50 μL/well 첨가하였다. 컨트롤 항체로서 hIgG1 (SIGMA-ALDRICH 사) 및 RG-6292 를 종농도 0.5, 5 μg/mL 가 되도록 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fishcher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지에서 희석시키고, 100 μL/well 첨가하였다. 그 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 4 시간 인큐베이션하였다.
20)-1-4 플로 사이토메트리 해석용 염색 용액의 조제
Zombie NIR dye 용액은, Zombie NIR Fixable Viability Kit (BioLegend 사) 에 첨부된 Zombie NIR dye 용액을 PBS 로 1000 배 희석시켜 조제하였다. Fc Block 용액은 Human BD Fc Block 용액과 2 mM EDTA (나칼라이 테스크사), 2 ％ FBS 함유 PBS (이하,「FACS Buffer」로 기재한다) 를 1 : 9 의 비율로 첨가 혼합하여 조제하였다.
세포 표면 마커 항체 칵테일 용액은 2.5 μL 의 AF700 anti-human CD3 Antibody (BioLegend 사), 2.5 μL 의 BV421 anti-human CD25 Antibody (BD Biosciences 사) 2.5 μL 의 APC anti-human OX40 Antibody (eBioscience 사) 를 첨가하고, FACS Buffer 로 전체량을 50 μL 로 하여 사용하였다.
20)-1-5 플로 사이토메트리 해석용 샘플의 항체 염색
20)-1-3 에서 인큐베이션한 플레이트를 4 ℃, 300 × g, 5 분간 원심하여 상청을 제거하였다. PBS 를 200 μL/well 첨가하고, 4 ℃, 300 × g, 5 분간 원심하여 상청을 제거하고 세포를 세정하였다. Zombie NIR dye 희석 용액을 0.1 mL 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이션하였다. FACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 4 ℃, 300 × g, 5 분간 원심하여 상청을 제거하였다. 그 후, FACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 4 ℃, 300 × g, 5 분간 원심하여 상청을 제거하는 작업을 2 회 실시하였다.
상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 Fc Block 용액을 0.05 mL 첨가하고 실온에서 10 분간 인큐베이션하였다. 또한, 20)-1-4 에서 조제한 세포 표면 마커 항체 칵테일 용액을 0.05 mL 첨가하고, 4 ℃, 차광하에서 1 시간 인큐베이션하였다. FACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 4 ℃, 300 × g, 5 분간 원심하여 상청을 제거하였다. 그 후, FACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 4 ℃, 300 × g, 5 분간 원심하여 상청을 제거하고 세포를 세정한 후에 FACS Buffer 를 0.2 mL 첨가하여 플로 사이토메트리 해석에 사용하였다.
20)-1-6 플로 사이토메트리 해석
20)-1-5 에서 조제한 샘플을 플로 사이토미터 (BD LSR Fortessa X-20 셀 애널라이저 : BD Biosciences 사) 를 사용하여, PKH26 양성 분획에서의 Zombie NIR dye 양성/음성 분획의 세포수를 각각 측정하였다. 거기에서, 이하의 식으로 사세포의 비율을 이하의 식을 사용하여 산출하였다.
사세포 (％) = (PKH26 양성 Zombie NIR dye 양성 분획의 세포수)/(PKH26 양성 분획의 세포수) × 100
그 결과, 제조한 RG-6292 는 iTreg 에 대해 ADCC 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다 (도 25).
20)-2 iTreg 를 사용한 in vitro 세포 증식 억제 평가
20)-2-1 iTreg 의 조제
20)-1-1 의 방법에 따라 실시하였다. 단, 배양은 3 일간으로 실시하였다.
20)-2-2 NK 세포의 조제
정상인의 PBMC 는 Ficoll-Paque PLUS (cytiva 사) 를 사용하여 혈액으로부터 분리하였다. PBMC 로부터 NK 세포를 EasySepTM Human NK cell isolation Kit (STEMCELL 사) 를 사용하여 정제하였다. 얻어진 NK 세포는 10 ％ CTS Immune Cell SR (Thermo Fishcher Scientific 사) 함유 IMDM (Thermo Fishcher Scientific 사) 배지 (이하, 10 ％ CTS + IMDM 배지라고 한다) 에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다.
20)-2-3 살세포 어세이
96 well clear U bottom microplate (Corning 사) 에 표적 세포인 iTreg 를 5 × 103 cells/25 μL/well 이 되도록 10 ％ CTS + IMDM 배지에서 조제하고 파종하였다. 계속해서, 이펙터 세포인 NK 세포를 25-1.25 × 103 cells/25 μL/well 의 범위에서 10 ％ CTS + IMDM 배지에서 조제하고 파종하였다. 항체 혹은 항체-약물 콘주게이트를 종농도 10-0.001 μg/mL 의 범위에서 50 μL/well 첨가하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 3 일간 배양하였다. 배양한 플레이트를 30 분간 실온에 정치하고, CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega 사) 의 Reagent 용액을 100 μL/well 첨가한 후, 실온·차광하에서 10 분간 플레이트 믹서 (타이텍사) 로 혼합하였다. 각 웰의 용액 100 μL 를 96 well white flat bottom microplate (Corning 사) 에 첨가하고, 플레이트 리더 (EnSight : PerkinElmer 사) 를 사용하여 발광 강도를 측정하였다.
세포 생존율로서 이하의 계산식을 사용하여 계산하였다.
세포 생존율 (RLU) = (iTreg 와 NK 세포를 공배양한 well 의 값) - (NK 세포만으로 배양한 well 의 값의 평균값)
그 결과, RG-6292 는 iTreg 에 대해 NK 세포의 양을 줄여 가면 증식 억제 작용을 확인할 수 없게 되는 반면, hMAb1A-ADC 는 NK 세포에 상관없이 iTreg 에 대해 증식 억제 작용을 나타내었다 (도 26). 종양 내에서는 말초혈보다 NK 세포/Treg 의 비가 작은 것이 보고되어 있다. 이 점에서 종양 내에 있어서도 hMAb1A-ADC 는 RG-6292 보다 Treg 의 제거능이 높은 것이 시사되었다.
(실시예 21) ADCT-301 의 조제
21)-1 Camidanlumab 의 조제
WO 2004/045512 에 기재된 방법에 준하여 조제하였다.
21)-2 ADCT-301 의 조제
WO 2014/057119 에 기재된 방법에 따라 합성하였다.
(실시예 22) ADCT-301 과 hMAb1A-ADC 의 활성 비교
22)-1 hMAb1A-ADC 와 ADCT-301 의 in vivo 면역 촉진 작용의 비교
22)-1-1 종양 조직의 채재와 세포 현탁액의 조제
10 ％ FBS 함유 Leibovitz's L-15 배지에서 계대 배양한 인간 유선암 유래 MDA-MB-231 세포 (American Type Culture Collection) 5 × 106 세포를 마트리겔에 현탁하고 암컷의 인간 CD34 세포 이입 면역 인간화 NOG 마우스 (huNOG 마우스) 의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 7 일 후에, 3 mg/㎏ 의 hMAb1A-ADC 또는 0.015 mg/㎏, 0.05 mg/㎏, 0.15 mg/㎏, 0.5 mg/㎏, 1.5 mg/㎏ 의 ADCT-301 을 정맥 내 투여하였다 (1 군 4 마리 또는 5 마리). ADC 투여 21 일 후 또는 23 일 후에 종양을 채재하였다. 채재한 종양괴를 gentleMACS (Miltenyi Biotec 사) 로 처리하고, 세포를 회수하였다. 세포를 PBS 로 세정하고, 재현탁한 후, 그 세포 현탁액을 플로 사이토메트리용 샘플로 하였다. 또한, 재현탁할 때의 PBS 량은, 종양 중량에 따라 다음의 양을 첨가하였다. 종양 중량 50 mg 까지는 0.3 mL, 종양 중량 50-80 mg 에서는 0.6 mL, 종양 중량 80-100 mg 에서는 0.9 mL, 100-120 mg 에서는 1.2 mL, 종양 중량 120-160 mg 에서는 1.5 mL, 종양 중량 160-200 mg 에서는 2.0 mL, 종양 중량 200-250 mg 에서는 2.5 mL 로 하였다.
22)-1-2 플로 사이토메트리 해석용 염색 용액의 조제
Zombie NIR dye 용액은, Zombie NIR Fixable Viability Kit (BioLegend 사) 에 첨부된 Zombie NIR dye 용액을 PBS 로 1000 배 희석시켜 조제하였다. Fc Block 용액은, Mouse BD Fc Block (BD Biosciences 사) 용액, Human BD Fc Block 용액과 MACS buffer 를 1 : 1 : 48 의 비율로 첨가 혼합하여 조제하였다. Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer 는, Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent (eBioscience 사) 인 Concentrate 3 mL 와 Diluent 9 mL 를 혼합하여 조제하였다. Perm wash buffer 는, Intracellular Staining Perm Wash Buffer (BioLegend 사) 를 H2O 로 10 배 희석시켜 조제하였다. 세포 표면 마커 항체 칵테일 용액은, 2 μL 의 FITC anti-human CD25 Antibody (BioLegend 사), 1 μL 의 APC anti-human CD8 Antibody (BioLegend 사), 3 μL 의 Brilliant Violet 421 anti-human CD4 Antibody (BioLegend 사), 2.5 μL 의 PE/Cyanine7 anti-human CD45RA Antibody (BioLegend 사), 2 μL 의 Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Antibody (BioLegend 사), 2 μL 의 Brilliant Violet 605 anti-human CD45 Antibody (BioLegend 사) 와 Brilliant Violet 650 anti-human CD3 Antibody 를 첨가하고, MACS buffer 로 전체량을 50 μL 로 하여 사용하였다. 세포 내 마커 항체 칵테일 용액은, 3 μL 의 PE Mouse anti-Human FoxP3 (BD Biosciences 사), 3 μL 의 PerCP/Cyanine5.5 anti-human/mouse Granzyme B Recombinant Antibody (BioLegend 사), 1 μL 의 Mouse BD Fc Block (BD Biosciences 사) 과 1 μL 의 Human BD Fc Block 을 첨가하고, Perm wash buffer 로 전체량을 100 μL 로 하여 사용하였다.
22)-1-3 플로 사이토메트리 해석용 샘플의 항체 염색
22)-1-1 에서 조제한 플로 사이토메트리용 샘플 0.2 mL 에, Zombie NIR dye 희석 용액을 0.1 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. MACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 Fc Block 용액을 0.1 mL 첨가하고 4 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하였다. 세포에, 22)-1-2 에서 조제한 세포 표면 마커 항체 칵테일 용액을 0.1 mL 첨가하고 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. 다음으로, MACS buffer 를 0.1 mL 첨가하고, 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 MACS buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 추가로 원심하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 추가로 2 회 실시하고, 세포를 세정하였다. Foxp3 Fixation/Permeabilization buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 실온에서 1 시간 인큐베이션하였다. 원심한 후, 상청을 흡인 제거하고 남은 세포에 Perm wash buffer 를 0.2 mL 첨가하고, 추가로 원심하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 추가로 2 회 실시하고, 세포를 세정하였다. 세정한 세포에 세포 내 마커 항체 칵테일 용액을 0.2 mL 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션한 후, Perm wash buffer 로 2 회 세정하고, 세포에 4 ％ 파라포름알데히드 용액을 첨가하고, 4 ℃ 에서 15 분간 인큐베이션하였다. 세포를 MACS buffer 로 2 회 세정 후, 세포에 0.18 mL 의 MACS buffer 를 첨가하였다. 샘플을 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 플로 사이토메트리 해석을 실시하였다.
22)-1-4 플로 사이토메트리 해석
22)-1-3 에서 조제한 샘플을 플로 사이토미터 (BD LSR Fortessa X-20 셀 애널라이저 : BD Biosciences 사) 를 사용하여, Zombie NIR dye 음성 분획의 인간 CD45 양성 세포, 인간 그랜자임 양성 CD8T 세포 (인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포) 의 세포수를 측정하였다. 그 후, 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 각각의 세포수를 이하의 식을 사용하여, 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포의 종양 조직 1 mg 당 세포수 (cells/mg) 를 산출하였다.
그 결과, ADCT-301 투여군과 비교하여, hMAb1A-ADC 투여군에서는 종양 조직 1 mg 당 인간 GZMB 양성 CD8 양성 T 세포수의 증가가 관찰되었다 (도 27). 이들 결과로부터, hMAb1A-ADC 는, ADCT-301 과 비교하여 인간 CD8 양성 T 세포를 활성화하는 것이 분명해졌다. 이 점에서 Treg 를 제거함으로써 CTL 을 활성화하는 것에 관하여 hMAb1A-ADC 는 ADCT-301 보다 우수한 것이 시사되었다.
(실시예 23) cMAb2_hIgG1-ADC 와 항 PD-1 항체의 병용 작용
23)-1 신제닉 모델에서의 항종양 활성 평가
마우스 대장암 유래 CT26.WT 세포 (American Type Culture Collection, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 에서 계대 배양) 2 × 105 세포를 암컷의 BALB/C 마우스의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 10 일 후에, 5 mg/㎏ 의 인간 IgG1-ADC 또는 cMAb2_hIgG1-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 8 마리 또는 10 마리). 이식의 6, 9, 11 일 후에, 5 mg/㎏ 의 래트 IgG2a 컨트롤 항체 (clone 2A3, Bio X Cell) 또는 항 PD-1 항체 (clone RMP1-14, Bio X Cell) 를 정맥 내 투여하였다.
마우스 유방암 유래 EMT6 세포 (American Type Culture Collection, 15 ％ FBS 함유 Waymouth's 에서 계대 배양) 3 × 105 세포를 암컷의 BALB/C 마우스의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 5 일 후에, 5 mg/㎏ 의 인간 IgG1-ADC 또는 cMAb2_hIgG1-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 8 마리). 이식의 6, 8, 11 일 후에, 5 mg/㎏ 의 래트 IgG2a 컨트롤 항체 또는 항 PD-1 항체를 정맥 내 투여하였다.
마우스 대장암 유래 MC38 세포 (Dr. S. A. Rosenberg, National Cancer Institute 로부터 분여, 10 ％ FBS 및 50 μM 2-Mercaptoethanol 함유 RPMI1640 에서 계대 배양) 2 × 105 세포를 암컷의 C57BL/6J 마우스의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 5 일 후에, 5 mg/㎏ 의 인간 IgG1-ADC 또는 cMAb2_hIgG1-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 6 마리). 이식의 6, 8, 11 일 후에, 5 mg/㎏ 의 래트 IgG2a 컨트롤 항체 또는 항 PD-1 항체를 정맥 내 투여하였다.
마우스 신암 유래 RENCA 세포 (American Type Culture Collection, 10 ％ FBS, MEM 용 비필수 아미노산 및 Sodium Pyruvate 함유 RPMI1640 에서 계대 배양) 3 × 105 세포를 수컷의 BALB/C 마우스의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 6 일 후에, 5 mg/㎏ 의 인간 IgG1-ADC 또는 cMAb2_hIgG1-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 3-7 마리). 이식의 7, 9, 12 일 후에, 5 mg/㎏ 의 래트 IgG2a 컨트롤 항체 또는 항 PD-1 항체를 정맥 내 투여하였다.
마우스 멜라노마 유래 B16F10 세포 (American Type Culture Collection, 10 ％ FBS 함유 Dulbecco's Modified Eagle Medium 에서 계대 배양) 3 × 105 세포를 암컷의 C57BL/6J 마우스의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 4 일 후에, 5 mg/㎏ 의 인간 IgG1-ADC 또는 cMAb2_hIgG1-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 4-8 마리). 이식의 5, 7, 10 일 후에, 5 mg/㎏ 의 래트 IgG2a 컨트롤 항체 또는 항 PD-1 항체를 정맥 내 투여하였다.
이식 종양의 장경 및 단경을 주 2 내지 3 회, 전자 디지털 버니어 캘리퍼스 (주식회사 미츠토요 제조) 를 사용하여 측정하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.
종양 체적 (㎣) = 1/2 × 단경 (㎜) × 단경 (㎜) × 장경 (㎜)
그 결과, CT26.WT 세포, MC38 세포, RENCA 세포나 B16F10 세포를 이식한 신제닉 모델에서는, cMAb2_hIgG1-ADC + 항 PD-1 항체 투여군 (병용군) 이, cMAb2_hIgG1-ADC + 래트 IgG2a 컨트롤 항체 투여군 (cMAb2_hIgG1-ADC 단제군) 이나 항 PD-1 항체 + 인간 IgG1-ADC 투여군 (항 PD-1 항체 단제군) 보다 강한 종양 증식의 지연 및 퇴축을 나타내었다 (도 32).
EMT-6 세포를 이식한 신제닉 마우스 모델에서의 병용군은, 항 PD-1 항체 단제군보다 강한 종양 증식의 지연 및 퇴축을 나타내었다 (도 32). 또, EMT-6 세포를 이식한 신제닉 마우스 모델에서의 병용군의 완전 주효율은 88 ％, cMAb2_hIgG1-ADC + 래트 IgG2a 컨트롤 항체 투여군의 완전 주효율은 63 ％ 로, cMAb2_hIgG1-ADC + 항 PD-1 항체 투여군 쪽이 높은 완전 주효율을 나타내었다. 이 점에서 cMAb2_hIgG1-ADC 는 항 PD-1 항체와 병용함으로써, 각 단제보다 강한 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
RENCA 세포 및 B16F10 세포를 각각 이식한, 어느 신제닉 마우스 모델에 있어서도, 항 PD-1 항체 단제군에서는 항종양 효과를 나타내지 않았던 반면, cMAb2_hIgG1-ADC + 항 PD-1 항체 투여군 (병용군) 에서는 항종양 효과를 나타내었다. 이 결과로부터, 본 발명의 항 CD25 항체-약물 콘주게이트는, 면역 체크포인트 저해제와 병용함으로써, 면역 체크포인트 저해제에 대해 내성을 나타내는 암에 대해서도 유효한 것이 시사되었다.
(실시예 24) 인간 IgG1LALA-PA 키메라 MAb2 (cMAb2_hIgG1LALA-PA) 의 조제
24)-1 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화시켜 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 51 에 나타내는 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 를 사용하여 결합하여, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다.
pcDNA3.3/LK 로부터 네오마이신 발현 유닛을 제거함으로써 pCMA-LK 를 구축하였다.
24)-2 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1LALA-PA 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화시켜 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 서열 번호 58 로 나타내는 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1LALA-PA 중사슬 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 XbaI 및 PmeI 로 소화시키고, Ligation High (토요보사 제조) 를 사용하여 결합하여, pCMA-G1LALA-PA 를 구축하였다.
24)-3 cMAb2_hIgG1LALA-PA 의 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 56 에 나타내는 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (Thermo Scientific 사 제조). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Thermo Scientific 사 제조) 를 사용하여, pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 cMAb2_hIgG1LALA 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 경사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 54 에 나타낸다.
24)-4 cMAb2_hIgG1LALA-PA 의 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 57 에 나타내는 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 416 에 나타내는 DNA 단편을 증폭 후, In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Thermo Scientific 사 제조) 를 사용하여, pCMA-G1LALA-PA 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 증폭시킨 DNA 단편을 삽입함으로써 cMAb2_hIgG1LALA-PA 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 55 에 나타낸다.
24)-5 cMAb2_hIgG1LALA-PA 의 조제
24)-5-1 cMAb2_hIgG1LALA-PA 의 생산
FreeStyle 293F 세포 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 FreeStyle 293F 세포를 FreeStyle293 expression medium (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 으로 희석시켜 2.0 × 106 세포/mL 로 조정하고, 5 L Optimum Growth Flask (THOMSON 사 제조) 에 1.2 L 파종하였다. 3.6 mg 의 Polyethyleneimine (Polysciences 사 제조) 을 Opti-Pro SFM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사 제조) 40 mL 에 첨가하였다. 다음으로 600 μg 의 중사슬 발현 벡터와 600 μg 의 경사슬 발현 벡터를 40 mL 의 Opti-Pro SFM 배지에 첨가하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액을 첨가하여 온화하게 교반하고, 추가로 5 분간 정치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터에서 4 시간, 105 rpm 으로 진탕 배양 후에 1.2 L 의 EX-CELL VPRO 배지 (SAFC Biosciences 사 제조), 및 43.4 g/L 의 BD Recharge CD (BD Biosciences 사 제조) 60 mL 를 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터에서 6 일간, 105 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 원심 분리 후, 공경 0.2 ㎛ 의 필터 (PALL 사 제조) 로 여과시켰다.
24)-5-2 cMAb2_hIgG1LALA-PA 의 정제
24)-5-1 에서 얻어진 배양 상청으로부터 rProtein A 어피니티 크로마토그래피로 항체를 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (Cytiva 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 항체를 용출시켰다. 용출된 획분을 투석 (Thermo Scientific 사 제조, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius Stedim Biotech 사 제조) 로 여과시켜, 정제 샘플로 하였다.
(실시예 25) 마우스 Lewis 폐암 3LL 세포 신제닉 모델에서의 cMAb2_hIgG1-ADC 와 항 PD-1 항체의 병용 작용
마우스 Lewis 폐암 유래 3LL 세포 (JCRB 세포 뱅크, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 에서 계대 배양) 3 × 105 세포를 암컷의 C57BL/6J 마우스의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 6 일 후에, 5 mg/㎏ 의 인간 IgG1-ADC 또는 cMAb2_hIgG1-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 8 마리). 이식의 7, 9, 12 일 후에, 5 mg/㎏ 의 래트 IgG2a 컨트롤 항체 (clone 2A3, Bio X Cell) 또는 항 PD-1 항체 (clone RMP1-14, Bio X Cell) 를 정맥 내 투여하였다.
이식 종양의 장경 및 단경을 주 2 내지 3 회, 전자 디지털 버니어 캘리퍼스 (주식회사 미츠토요 제조) 를 사용하여 측정하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.
종양 체적 (㎣) = 1/2 × 단경 (㎜) × 단경 (㎜) × 장경 (㎜)
그 결과, 3LL 세포를 이식한 신제닉 모델에서는, cMAb2_hIgG1-ADC + 항 PD-1 항체 투여군 (병용군) 이, cMAb2_hIgG1-ADC + 래트 IgG2a 컨트롤 항체 투여군 (cMAb2_hIgG1-ADC 단제군) 이나 항 PD-1 항체 + 인간 IgG1-ADC 투여군 (항 PD-1 항체 단제군) 보다 강한 종양 증식의 지연 및 퇴축을 나타내었다 (도 33).
(실시예 26) 마우스 대장암 MC38 세포 신제닉 모델에서의 cMAb2_hIgG1-ADC 와 항 CTLA-4 항체의 병용 작용
마우스 대장암 유래 MC38 세포 2 × 105 세포를 암컷의 C57BL/6J 마우스의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 기초로 군 분류를 하고, 이식의 5 일 후에, 3 mg/㎏ 의 인간 IgG1-ADC 또는 cMAb2_hIgG1-ADC 를 정맥 내 투여하였다 (1 군 7 혹은 8 마리). 이식의 6, 8, 11 일 후에, 5 mg/㎏ 의 래트 IgG2b 컨트롤 항체 (clone : LTF-2, Bio X Cell) 또는 항 CTLA-4 항체 (clone : 9D9, Bio X Cell) 를 정맥 내 투여하였다.
이식 종양의 장경 및 단경을 주 2 내지 3 회, 전자 디지털 버니어 캘리퍼스 (주식회사 미츠토요 제조) 를 사용하여 측정하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.
종양 체적 (㎣) = 1/2 × 단경 (㎜) × 단경 (㎜) × 장경 (㎜)
그 결과, cMAb2_hIgG1-ADC + 항 CTLA-4 항체 투여군 (병용군) 이, cMAb2_hIgG1-ADC + 래트 IgG2b 컨트롤 항체 투여군 (cMAb2_hIgG1-ADC 단제군) 이나 항 CTLA-4 항체 + 인간 IgG1-ADC 투여군 (항 CTLA-4 항체 단제군) 보다 강한 종양 증식의 지연을 나타내었다 (도 34).
산업상 이용가능성
본 발명에 의해, IL-2 블로킹능을 갖지 않고, 내재화 활성을 갖는 항 CD25 항체 및 그 항체를 포함하는 항체-약물 콘주게이트가 제공되었다. 그 항체-약물 콘주게이트는 암에 대한 치료약 등으로서 사용할 수 있다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 : MAb1 의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 2 : MAb1 의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 3 : MAb1 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 4 : MAb2 의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 5 : MAb2 의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 6 : MAb2 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 7 : MAb1 의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 8 : MAb1 의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 9 : MAb1 의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 10 : MAb2 의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 11 : MAb2 의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 12 : MAb2 의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 13 : hMAb1A-L 경사슬 전체 길이 아미노산 서열
서열 번호 14 : hMAb1B-L 경사슬 전체 길이 아미노산 서열
서열 번호 15 : hMAb1A-H 중사슬 전체 길이 아미노산 서열
서열 번호 16 : hMAb1B-H 중사슬 전체 길이 아미노산 서열
서열 번호 17 : 인간 CD25 의 아미노산 서열
서열 번호 18 : MAb1 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 19 : MAb1 경사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 20 : MAb1 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 21 : MAb1 중사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 22 : MAb2 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 23 : MAb2 경사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 24 : MAb2 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 25 : MAb2 중사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 26 : 시그널 서열 및 cMAb1_hIgG1LALA 의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 27 : 시그널 서열 및 cMAb1_hIgG1LALA 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 28 : 시그널 서열 및 cMAb1_hIgG1LALA 의 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 29 : 시그널 서열 및 cMAb1_hIgG1LALA 의 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 30 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA 의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 31 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 32 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1 의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 33 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 34 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA 의 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 35 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA 의 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 36 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1 의 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 37 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1 의 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 38 : 시그널 서열 및 hMAb1A 의 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 39 : 시그널 서열 및 hMAb1B 의 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 40 : 시그널 서열 및 hMAb1A 의 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 41 : 시그널 서열 및 hMAb1B 의 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 42 : 인간 CD25 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 43 : 마우스 CD25 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 44 : 마우스 CD25 의 아미노산 서열
서열 번호 45 : 프라이머 1F 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 46 : 프라이머 1R 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 47 : 게잡이원숭이 CD25 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 48 : 게잡이원숭이 CD25 의 아미노산 서열
서열 번호 49 : 프라이머 2F 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 50 : 프라이머 2R 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 51 : 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 52 : 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1LALA 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 53 : 중사슬 시그널 서열 및 인간 G1 사슬 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 54 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 55 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 56 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 경사슬의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 57 : 시그널 서열 및 cMAb2_hIgG1LALA-PA 중사슬의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 58 : 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1LALA-PA 중사슬 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열목록 전자파일 첨부

Claims (95)

  1. 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항 CD25 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
    (1) IL-2 블로킹능을 갖지 않는다.
    (2) 세포 상해 활성 화합물과 콘주게이트되어, 인간 제어성 T 세포의 제거능, 및/또는, 인간 그랜자임 양성 CD8 양성 세포의 증식 촉진능을 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    CD25 와 결합함으로써 CD25 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    CD25 가, 인간 CD25, 게잡이원숭이 CD25, 또는 마우스 CD25 인, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  4. 제 3 항에 있어서,
    CD25 가, 인간 CD25 또는 게잡이원숭이 CD25, 인, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  5. 제 3 항에 있어서,
    CD25 가 인간 CD25 인, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  6. 제 3 항에 있어서,
    CD25 가 마우스 CD25 인, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD25 에 대한 결합에 대해, 이하의 (1) ∼ (6) :
    (1) 서열 번호 26 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 27 의 20 ∼ 476 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
    (2) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
    (3) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
    (4) 서열 번호 30 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 31 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
    (5) 서열 번호 32 의 21 ∼ 239 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 33 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체,
    (6) 서열 번호 54 의 21 ∼ 239 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 55 의 20 ∼ 463 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체
    으로 이루어지는 군에서 선택되는 항체 중 적어도 어느 1 개와 경합 저해 활성을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (2) :
    (1) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
    (2) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고,
    이하의 (3) ∼ (4) :
    (3) 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (4) 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는,
    항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (2) :
    (1) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (2) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
    로 이루어지는 군에서 선택되는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 그리고, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는,
    항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화되어 있는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (4) :
    (1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (3) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및
    (4) (1) ∼ (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역, 그리고,
    이하의 (5) ∼ (8) :
    (5) 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (6) 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (7) (5) ∼ (6) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및
    (8) (5) ∼ (6) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역
    을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (2) :
    (1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
    중 어느 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역
    을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (2) :
    (1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
    중 어느 것을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  14. 제 13 항에 있어서,
    서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  15. 제 13 항에 있어서,
    서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 단편이 Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는, 항체의 항원 결합 단편.
  17. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 단편이 scFv 인, 항체의 항원 결합 단편.
  18. 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 인간화 항체.
  19. 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 인간화 항체.
  20. 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 인간화 항체.
  21. 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 인간화 항체.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  23. 제 22 항에 있어서,
    이하의 (1) ∼ (2) :
    (1) 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열 (KAS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (2) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열 (FVS) 로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
    서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  25. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
    서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  26. 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
  27. 제 26 항에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    숙주 세포가 진핵 세포인, 숙주 세포.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 당해 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중사슬 또는 경사슬이, N-결합형 당사슬의 부가, O-결합형 당사슬의 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말단 글루타민 혹은 N 말단 글루탐산의 피로글루탐산화, 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  31. 제 30 항에 있어서,
    중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는, 항체.
  32. 제 31 항에 있어서,
    2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는, 항체.
  33. 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는, 인간화 항체.
  34. 제 33 항에 있어서,
    결실되어 있는 아미노산이 리신인, 인간화 항체.
  35. 제 30 항에 있어서,
    중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, 항체.
  36. 제 1 항 내지 제 21 항 및 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키기 위한 당사슬 수식을 갖는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편.
  37. 제 1 항 내지 제 21 항 및 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편에 약물이 결합되어 있는 항체-약물 콘주게이트.
  38. 제 37 항에 있어서,
    약물이, 세포 상해 활성을 갖는 물질, 세포 상해 활성 화합물, 항종양 활성을 갖는 물질, 항종양 활성 화합물, 화학 요법제, 분자 표적약, 면역 활성화제, 면역 억제제, 독소, 광 감수성 물질, 진단용 약제, 단백질, 펩티드, 아미노산, 핵산, 항원, 비타민, 호르몬, 혈액 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 자기 면역 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 항염증 물질, 항균 물질, 항진균 물질, 항기생충 물질, 항바이러스 물질, 및 항마취 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 항체-약물 콘주게이트.
  39. 제 38 항에 있어서,
    약물이 세포 상해 활성 화합물인, 항체-약물 콘주게이트.
  40. 제 39 항에 있어서,
    세포 상해 활성 화합물이 다음 식 :

    으로 나타내는 세포 상해 활성 화합물인, 항체-약물 콘주게이트.
  41. 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체와 약물이, 다음 식 (a) ∼ (f) :
    (a) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
    (b) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
    (c) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
    (d) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
    (e) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 및
    (f) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 구조의 링커를 개재하여 결합되어 있는, 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, 항체는, -(Succinimid-3-yl-N) 의 말단에 있어서 결합되어 있다. 약물은, 다른 일방의 말단의 카르보닐기에 결합되어 있다. 상기 식 중 GGFG 는, 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신으로 이루어지는 펩티드 결합으로 연결되어 있는 아미노산 서열을 나타낸다.
    -(Succinimid-3-yl-N)- 는 다음 식 :

    으로 나타내는 구조이고, 이것의 3 위치에서 항체와 결합하고, 1 위치의 질소 원자 상에서 이것을 포함하는 링커 구조 내의 메틸렌기와 결합되어 있다.)
  42. 제 37 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    링커가 이하의 (c), (d) 및 (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 식으로 나타내어지는, 항체-약물 콘주게이트.
    (c) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
    (d) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
    (e) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
  43. 제 37 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    링커가 이하의 (c) 또는 (e) 의 식으로 나타내어지는, 항체-약물 콘주게이트.
    (c) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
    (e) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
  44. 제 37 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 식 :

    으로 나타내는 구조를 갖는, 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, AB 는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편을 나타낸다. n 은 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편과 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체 또는 그 항체의 1 항원 결합 단편당 평균 결합수를 나타낸다. 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편과 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
  45. 제 37 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 식 :

    으로 나타내는 구조를 갖는, 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, AB 는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편을 나타낸다. n 은 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편과 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체 또는 그 항체의 1 항원 결합 단편당 평균 결합수를 나타낸다. 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편과 링커는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
  46. 제 37 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 이하의 (1) ∼ (2) :
    (1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, 항체-약물 콘주게이트.
  47. 제 46 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, 항체-약물 콘주게이트.
  48. 제 46 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, 항체-약물 콘주게이트.
  49. 제 37 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 이하의 (1) ∼ (2) :
    (1) 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (2) 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 및 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, 항체-약물 콘주게이트.
  50. 제 49 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, 항체-약물 콘주게이트.
  51. 제 49 항에 있어서,
    항체가, 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편인, 항체-약물 콘주게이트.
  52. 제 37 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중사슬 또는 경사슬이, N-결합형 당사슬의 부가, O-결합형 당사슬의 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, N 말단 글루타민 혹은 N 말단 글루탐산의 피로글루탐산화 및 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 갖는, 항체-약물 콘주게이트.
  53. 제 52 항에 있어서,
    중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는, 항체-약물 콘주게이트.
  54. 제 53 항에 있어서,
    2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는, 항체-약물 콘주게이트.
  55. 제 52 항에 있어서,
    중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, 항체-약물 콘주게이트.
  56. 제 37 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키기 위한 당사슬 수식을 갖는, 항체-약물 콘주게이트.
  57. 제 37 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 1 ∼ 10 개의 범위인, 항체-약물 콘주게이트.
  58. 제 57 항에 있어서,
    약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 2 ∼ 8 개의 범위인, 항체-약물 콘주게이트.
  59. 제 58 항에 있어서,
    약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 5 ∼ 8 개의 범위인, 항체-약물 콘주게이트.
  60. 제 59 항에 있어서,
    약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수가 7 ∼ 8 개인, 항체-약물 콘주게이트.
  61. 이하의 식 :

    으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, AB 는, 서열 번호 13 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 인간화 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
  62. 이하의 식 :

    으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, AB 는, 서열 번호 13 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 15 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 인간화 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
  63. 이하의 식 :

    으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, AB 는, 서열 번호 14 의 21 ∼ 127 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 146 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 인간화 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
  64. 이하의 식 :

    으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, AB 는, 서열 번호 14 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 16 의 20 ∼ 476 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 인간화 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
  65. 이하의 식 :

    으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, AB 는, 서열 번호 18 의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 20 의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
  66. 이하의 식 :

    으로 나타내는 구조를 갖는 항체-약물 콘주게이트.
    (여기서, AB 는, 서열 번호 26 의 21 ∼ 232 번의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 27 의 20 ∼ 476 번의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체를 나타낸다. n 은 항체와 결합되어 있는 약물-링커 구조의 1 항체당 평균 결합수를 나타내고, 7 ∼ 8 의 범위를 나타낸다. 항체와 링커는 항체 유래의 술프하이드릴기를 개재하여 결합되어 있다.)
  67. 제 61 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는, 항체-약물 콘주게이트.
  68. 제 67 항에 있어서,
    결실되어 있는 아미노산이 리신인, 항체-약물 콘주게이트.
  69. 제 1 항 내지 제 21 항 및 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 제 37 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  70. 제 69 항에 있어서,
    항종양약인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  71. 제 70 항에 있어서,
    종양 세포가 CD25 를 발현하고 있거나, 혹은 종양 면역이 제어성 T 세포에 의해 억제되고 있는 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  72. 제 71 항에 있어서,
    종양 환경 중, 및/또는, 림프절 중에 제어성 T 세포가 존재하고 있는 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  73. 제 69 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이, 혈액암, 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 뇌종양, 신경 교종, 안종양, 식도암, 위암, 대장암, 결장암, 간암, 췌장암, 신암, 신장암, 방광암, 부신 피질암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체암, 난소암, 흑색종 또는 육종인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  74. 제 1 항 내지 제 21 항 및 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 제 37 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 어느 것을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
  75. 제 74 항에 있어서,
    종양 세포가 CD25 를 발현하고 있거나, 혹은 종양 면역이 제어성 T 세포에 의해 억제되고 있는 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
  76. 제 74 항 또한 제 75 항에 있어서,
    종양 환경 중, 및/또는, 림프절 중에 제어성 T 세포가 존재하고 있는 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
  77. 제 74 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이, 혈액암, 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 뇌종양, 신경 교종, 안종양, 식도암, 위암, 대장암, 결장암, 간암, 췌장암, 신암, 신장암, 방광암, 부신 피질암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체암, 난소암, 흑색종 또는 육종인 것을 특징으로 하는, 치료 방법.
  78. 제 1 항 내지 제 21 항 및 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편, 혹은, 제 37 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 적어도 1 개를 포함하는 의약 조성물 및 적어도 1 개의 항종양약을, 동시에, 따로 또는 연속하여 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
  79. 제 27 항 또는 제 28 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편을 채취하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 항체 또는 당해 항체의 항원 결합 단편과 약물-링커 중간 화합물을 반응시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법.
  80. 제 37 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘주게이트 및 면역 체크포인트 저해제가, 조합하여 투여되는, 의약 조성물.
  81. 제 80 항에 있어서,
    상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가, 각각 별이한 제제에 유효 성분으로서 함유되고, 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는, 의약 조성물.
  82. 제 80 항에 있어서,
    상기 항체-약물 콘주게이트 및 상기 면역 체크포인트 저해제가, 동일한 제제 중에 유효 성분으로서 함유되는, 의약 조성물.
  83. 제 80 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 저해제가, 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 및 항 CTLA-4 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 의약 조성물.
  84. 제 83 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 저해제가, 항 PD-1 항체인, 의약 조성물.
  85. 제 84 항에 있어서,
    상기 항 PD-1 항체가, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 신틸리맙, 스파르탈리주맙, 도스탈리맙, 세르플루리맙, 티슬레리주맙, 펜풀리맙, 토리팔리맙, zimberelimab, 캄렐리주맙, 레티판리맙, 세미플리맙, prolgolimab, geptanolimab, enlonstobart, QL-1604, pucotenlimab 및 finotonlimab 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 의약 조성물.
  86. 제 84 항에 있어서,
    상기 항 PD-1 항체가, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인, 의약 조성물.
  87. 제 83 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 저해제가, 항 PD-L1 항체인, 의약 조성물.
  88. 제 87 항에 있어서,
    상기 항 PD-L1 항체가, 아테졸리주맙, 더발루맙, cosibelimab, adebrelimab, sugemalimab, 아벨루맙, socazolimab, KL-A167 및 envafolimab 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 의약 조성물.
  89. 제 87 항에 있어서,
    상기 항 PD-L1 항체가, 아테졸리주맙, 더발루맙 및 아벨루맙으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 의약 조성물.
  90. 제 83 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 저해제가, 항 CTLA-4 항체인, 의약 조성물.
  91. 제 90 항에 있어서,
    상기 항 CTLA-4 항체가, 이필리무맙, botensilimab 및 트레멜리무맙으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 의약 조성물.
  92. 제 90 항에 있어서,
    상기 항 CTLA-4 항체가, 이필리무맙인, 의약 조성물.
  93. 제 80 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료를 위한, 의약 조성물.
  94. 제 80 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈액암, 유방암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 뇌종양, 신경 교종, 안종양, 식도암, 위암, 대장암, 결장암, 간암, 췌장암, 신암, 신장암, 방광암, 부신 피질암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체암, 난소암, 흑색종 및 육종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 치료를 위한, 의약 조성물.
  95. 제 80 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 체크포인트 저해제에 대해 내성을 나타내는 암의 치료를 위한, 의약 조성물.
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