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BR112019023832A2 - anticorpo, fragmento funcional do anticorpo, polinucleotídeo, vetor de expressão, células hospedeiras, métodos para produzir um anticorpo de interesse ou um fragmento funcional do anticorpo, para tratamento de um tumor e para produzir um conjugado anticorpo-fármaco, conjugado anticorpo-fármaco, e, composição farmacêutica - Google Patents

anticorpo, fragmento funcional do anticorpo, polinucleotídeo, vetor de expressão, células hospedeiras, métodos para produzir um anticorpo de interesse ou um fragmento funcional do anticorpo, para tratamento de um tumor e para produzir um conjugado anticorpo-fármaco, conjugado anticorpo-fármaco, e, composição farmacêutica Download PDF

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BR112019023832A2
BR112019023832A2 BR112019023832-8A BR112019023832A BR112019023832A2 BR 112019023832 A2 BR112019023832 A2 BR 112019023832A2 BR 112019023832 A BR112019023832 A BR 112019023832A BR 112019023832 A2 BR112019023832 A2 BR 112019023832A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
acid sequence
sequence shown
Prior art date
Application number
BR112019023832-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Atsuko Saito
Tsuyoshi Hirata
Kensuke Nakamura
Original Assignee
Daiichi Sankyo Company, Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=64273811&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BR112019023832(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Daiichi Sankyo Company, Limited filed Critical Daiichi Sankyo Company, Limited
Publication of BR112019023832A2 publication Critical patent/BR112019023832A2/pt

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
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Abstract

a presente invenção aborda o problema de prover: um anticorpo com uma atividade de internalização de ligação a cdh6; um conjugado anticorpo-fármaco consistindo no anticorpo mencionado acima e um fármaco com uma atividade antitumoral; um medicamento que usa o conjugado anticorpo-fármaco, o dito medicamento tendo um efeito terapêutico em tumores; um método para tratar tumores usando o anticorpo, o conjugado anticorpo-fármaco ou o medicamento; etc. são providos: um anticorpo anti-cdh6 com atividade de internalização; um conjugado anticorpo-fármaco consistindo no anticorpo mencionado acima e um fármaco com uma atividade antitumoral; e um medicamento e um método para tratar tumores usando o mesmo.

Description

1 / 164 ANTICORPO, FRAGMENTO FUNCIONAL DO ANTICORPO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULAS HOSPEDEIRAS, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ANTICORPO DE
INTERESSE OU UM FRAGMENTO FUNCIONAL DO ANTICORPO E PARA PRODUZIR UM CONJUGADO ANTICORPO-FÁRMACO, CONJUGADO ANTICORPO-FÁRMACO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USOS DE QUALQUER COMPONENTE SELECIONADO DO CONJUGADO ANTICORPO-FÁRMACO E DE UMA
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-CDH6 que se liga ao CDH6 e com um efeito de internalização, um método para a produção do anticorpo anti-CDH6, um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo o anticorpo, um agente antitumoral compreendendo o conjugado anticorpo-fármaco e similares. Fundamentos da Técnica
[002] As caderinas são glicoproteínas presentes na superfície das membranas celulares e funcionam como moléculas de adesão célula-célula através da ligação dependente de íons de cálcio dos seus domínios extracelulares N-terminais ou como moléculas de sinal responsáveis pela interação célula-célula. As caderinas clássicas estão na superfamília da caderina e são proteínas transmembranares de passagem única compostas por cinco domínios extracelulares (domínios CE), uma região transmembranar e um domínio intracelular. As caderinas clássicas são classificadas na família tipo I tipificada por E-caderina e N-caderina, e a família tipo II de acordo com as homologias de suas sequências de aminoácidos.
[003] A caderina-6 (CDH6) é uma proteína transmembranar de passagem única composta por 790 aminoácidos, classificada na família das caderinas do tipo II, e essa proteína tem domínios extracelulares N-terminais e intracelulares C-terminais. O gene CDH6 humano foi clonado pela primeira vez em 1995 (Literatura Não Patente 1), e sua sequência pode ser referida, por
2 / 164 exemplo, nos números de acesso NM_004932 e NP_004923 (NCBI).
[004] O CDH6 é especificamente expresso no cérebro ou nos rins no estágio de desenvolvimento e foi relatado que desempenha um papel importante na formação do circuito do sistema nervoso central (Literatura Não Patente 2 e 3) e no desenvolvimento de néfrons no rim (Literatura Não Patente 4 e 5). A expressão de CDH6 nos tecidos normais de humanos adultos está localizada nos túbulos dos rins, nas células epiteliais do duto biliar e similares.
[005] Enquanto isso, sabe-se que o CDH6 é especificamente superexpresso em locais de tumor em alguns tipos de câncer em adultos humanos. A correlação da expressão de CDH6 com mau prognóstico e sua aplicabilidade como marcador tumoral foi relatada em relação ao carcinoma de células renais humanas, particularmente o carcinoma de células renais claras (Literatura Não Patente 6 e 7). A alta expressão de CDH6 também foi relatada em relação ao câncer de ovário humano (Literatura Não Patente 8). Também foi relatado que o CDH6 está envolvido na transição epitelial- mesenquimal do câncer de tireoide humano (Literatura Não Patente 9). Além disso, foi relatado que o CDH6 também é expresso no câncer do duto biliar humano e no câncer de pulmão de células pequenas humanas (Literatura Não Patente 12 e 13).
[006] Os cânceres estão entre as principais causas de morte. Embora espere-se que o número de pacientes com câncer aumente com o envelhecimento da população, as necessidades de tratamento ainda não foram suficientemente satisfeitas. Os problemas dos quimioterápicos convencionais são os seguintes: devido à sua baixa seletividade, esses quimioterápicos são tóxicos não apenas para as células tumorais, mas também para as células normais e, portanto, apresentam reações adversas; e os quimioterápicos não podem ser administrados em quantidades suficientes e, portanto, não podem produzir seus efeitos suficientemente. Assim, nos últimos anos, foram
3 / 164 desenvolvidos fármacos moleculares alvo mais altamente seletivos ou fármacos de anticorpos, que têm como alvo moléculas que exibem mutações ou uma característica de alta expressão em células cancerígenas, ou moléculas específicas envolvidas na transformação maligna de células.
[007] Os anticorpos são altamente estáveis no sangue e se ligam especificamente aos seus antígenos alvo. Por esses motivos, espera-se uma redução na reação adversa, e um grande número de fármacos de anticorpo foi desenvolvido para moléculas altamente expressas na superfície das células cancerígenas. Uma das técnicas que dependem da capacidade de ligação específica ao antígeno dos anticorpos é usar um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). O ADC é um conjugado no qual um anticorpo que se liga a um antígeno expresso na superfície das células cancerígenas e pode internalizar o antígeno na célula através da ligação é conjugado a um fármaco com atividade citotóxica. O ADC pode dispensar o fármaco com eficiência às células cancerígenas e, dessa forma, espera-se que ele mate as células ao acumular o fármaco nas células cancerígenas (Literatura Não Patente 10 e Literatura de Patente 1 e 2). No que se refere ao ADC, por exemplo, o Adcetris(TM) (brentuximabe vedotina) compreendendo um anticorpo monoclonal anti-CD30 conjugado com monometil auristatina E foi aprovado como um fármaco terapêutico para o linfoma de Hodgkin e o linfoma anaplásico de grandes células. Além disso, Kadcyla(TM) (trastuzumabe emtansina) compreendendo um anticorpo monoclonal anti-HER2 conjugado com emtansina é usado no tratamento de câncer de mama progressivo ou recorrente positivo para HER2.
[008] As características de um antígeno alvo adequado para o ADC como um fármaco antitumoral são as seguintes: o antígeno é especificamente altamente expresso na superfície das células cancerígenas, mas tem baixa expressão ou não é expresso nas células normais; o antígeno pode ser internalizado nas células; o antígeno não é secretado da superfície celular; etc.
4 / 164 A capacidade de internalização do anticorpo depende das propriedades do antígeno alvo e do anticorpo. É difícil prever um local de ligação ao antígeno adequado para internalização a partir da estrutura molecular de um alvo ou prever um anticorpo com alta capacidade de internalização a partir da força de ligação, propriedades físicas e similares do anticorpo. Portanto, um desafio importante no desenvolvimento de ADC com alta eficácia é a obtenção de um anticorpo com alta capacidade de internalização contra o antígeno alvo (Literatura Não Patente 11).
[009] O ADC compreendendo DM4 conjugado a um anticorpo anti- CDH6 que se liga especificamente ao domínio EC 5 (EC5) de CDH6 é conhecido como ADC que alveja CDH6 (Literatura de Patente 3). Lista de Citação Literatura de Patente
[0010] Literatura de Patente 1: WO2014/057687
[0011] Literatura de Patente 2: US2016/0297890
[0012] Literatura de Patente 3: WO2016/024195 Literatura não Patente
[0013] Literatura não Patente 1: Shimoyama Y, et al., Cancer Research, 2206-2211, 55, May 15, 1995
[0014] Literatura não Patente 2: Inoue T, et al., Developmental Biology, 183-194, 1997
[0015] Literatura não Patente 3: Osterhout J A, et al., Neuron, 632- 639, 71, Aug 25, 2011
[0016] Literatura não Patente 4: Cho E A, et al., Development, 803- 812, 125, 1998
[0017] Literatura não Patente 5: Mah S P, et al., Developmental Biology, 38-53, 223, 2000
[0018] Literatura não Patente 6: Paul R, et al., Cancer Research, 2741-2748, July 1, 57, 1997
5 / 164
[0019] Literatura não Patente 7: Shimazui T, et al., Cancer, 963-968, 101(5), Sep.1, 2004
[0020] Literatura não Patente 8: Koebel M, et al., PLoS Medicine, 1749-1760, 5(12), e232, Dec.2008
[0021] Literatura não Patente 9: Gugnoni M, et al., Oncogene, 667- 677, 36, 2017
[0022] Literatura não Patente 10: Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016
[0023] Literatura não Patente 11: Peters C, et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015
[0024] Literatura não Patente 12: Goeppert B, et al., Epigenetics, 780- 790, 11(11), 2016
[0025] Literatura não Patente 13: Yokoi S, et al., American Journal of Pathology, 207-216, 161, 1, 2002 Sumário da Invenção Problema Técnico
[0026] É um objetivo da presente invenção fornecer um anticorpo que se liga especificamente a CDH6 e com alta atividade de internalização, um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo o anticorpo e com alta atividade antitumoral, um produto farmacêutico compreendendo o conjugado anticorpo-fármaco e com efeitos terapêuticos em um tumor, um método para o tratamento de um tumor usando o anticorpo, o conjugado anticorpo-fármaco ou o produto farmacêutico e similares. Solução para o Problema
[0027] Os presentes inventores conduziram estudos intensivos direcionados para alcançar o objeto descrito acima e verificaram que, surpreendentemente, um anticorpo que se liga especificamente ao domínio extracelular 3 (na presente descrição, também chamado de omo EC3) do CDH6 tem atividade de internalização extremamente alta contra células
6 / 164 expressando CDH6 e é útil como um anticorpo para ADC. Os inventores verificaram adicionalmente que um conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco compreendendo o anticorpo anti-CDH6 mencionado acima conjugado com um fármaco que exerce toxicidade em células através de um ligante com uma estrutura específica apresenta atividade antitumoral mais forte do que a dos conjugados CDH6-fármaco convencionais.
[0028] A presente invenção inclui os seguintes aspectos da invenção:
[1] um anticorpo que se liga especificamente à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4 e com capacidade de internalização que permite a captação celular, ou um fragmento funcional do anticorpo;
[2] o anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com [1], que tem atividade inibidora competitiva, para ligação à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, contra pelo menos qualquer anticorpo selecionado do grupo que consiste nos seguintes anticorpos (1) a (5): (1) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 53 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 56, (2) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69, (3) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, (4) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e uma
7 / 164 cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, e (5) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77;
[3] o anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com [1] ou [2], que compreende CDRL1, CDRL2 e CDRL3 em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (1) a (4): (1) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, (2) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 23, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 24, (3) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 33, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, e (4) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 44, e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (5) a (9): (5) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos
8 / 164 mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19, (6) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 27, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 29, (7) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 38, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 39, (8) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 47, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49, e (9) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19;
[4] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [3], que compreende CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (1) a (5): (1) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18, e
9 / 164
CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19, (2) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 23, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 24, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 27, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 29, (3) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 33, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 38, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 39, (4) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 44, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 47, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49, e (5) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13, e CDRL3 que consiste na
10 / 164 sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19;
[5] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [4], que é humanizado;
[6] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [5], que tem qualquer região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas seguintes regiões variáveis (1) a (4): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 67, (3) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (1) e (2), e (4) uma sequência de aminoácidos que compreende uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (1) a (3), e qualquer região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas seguintes regiões variáveis (5) a (9): (5) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 71, (6) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 75,
11 / 164 (7) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 79, (8) uma sequência de aminoácidos com uma homologia de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (5) a (7), e (9) uma sequência de aminoácidos que compreende uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (5) a (8);
[7] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [6], que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada em qualquer uma das seguintes combinações (1) a (4): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 71, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 75, (3) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 75, e (4) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ
12 / 164 ID NO: 79;
[8] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [7], que tem qualquer uma das seguintes combinações (1) a (4): (1) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69, (2) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, (3) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, e (4) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77;
[9] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com [8], que tem uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69;
[10] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com [8], que tem uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73;
[11] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com [8], que tem uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada
13 / 164 que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73;
[12] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com [8], que tem uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77;
[13] o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [12], em que o fragmento funcional é selecionado do grupo que consiste em Fab, F(ab’)2, Fab’ e Fv;
[14] um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [13];
[15] o polinucleotídeo de acordo com [14], que compreende polinucleotídeos em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (1) a (5): (1) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19, (2) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 23 e CDRL3 que consiste na
14 / 164 sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 24, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 27, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 29, (3) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 33 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 38 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 39, (4) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 44, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 47, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49, e (5) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência
15 / 164 de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19;
[16] o polinucleotídeo de acordo com [14] ou [15], que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69;
[17] o polinucleotídeo de acordo com [14] ou [15], que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73;
[18] o polinucleotídeo de acordo com [14] ou [15], que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73;
[19] o polinucleotídeo de acordo com [14] ou [15], que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77;
[20] um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer um de [14] a [19];
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[21] células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão de acordo com [20];
[22] as células hospedeiras de acordo com [21], em que as células hospedeiras são células eucarióticas;
[23] um método para produzir um anticorpo de interesse ou um fragmento funcional do anticorpo, que compreende a etapa de cultivar as células hospedeiras de acordo com [21] ou [22], e a etapa de coletar de um anticorpo de interesse ou um fragmento funcional do anticorpo da cultura obtida pela etapa mencionada acima;
[24] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [13], em que a cadeia pesada ou a cadeia leve passou por uma ou duas ou mais modificações selecionadas do grupo que consiste em glicosilação ligada a N, glicosilação ligada a O, processamento N-terminal, processamento C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, oxidação de metionina, adição de um resíduo de metionina ao terminal N, amidação de um resíduo de prolina, conversão de glutamina N- terminal ou ácido glutâmico N-terminal em ácido piroglutâmico, e uma deleção de um ou dois aminoácidos do terminal carboxila;
[25] o anticorpo de acordo com [24], em que um ou dois aminoácidos são deletados do terminal carboxila de uma cadeia pesada do mesmo;
[26] o anticorpo de acordo com [25], em que um aminoácido é deletado de cada um dos terminais carboxila de ambas as cadeias pesadas do mesmo;
[27] o anticorpo de acordo com qualquer um de [24] a [26], em que um resíduo de prolina no terminal carboxila de uma cadeia pesada do mesmo é adicionalmente amidado;
[28] o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [13] e [24] a [27], em que a modificação da
17 / 164 cadeia de açúcar é regulada para intensificar a atividade citotóxica celular dependente de anticorpo;
[29] um conjugado anticorpo-fármaco que compreende o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [13] e [24] a [28] conjugado a um fármaco;
[30] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [29], em que o fármaco é um composto antitumoral;
[31] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [30], em que o composto antitumoral é um composto antitumoral representado pela seguinte fórmula: [Fórmula 1]
[32] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [31], em que o anticorpo é conjugado com o fármaco através de um ligante com uma estrutura selecionada do grupo que consiste nas seguintes fórmulas (a) a (f): (a) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, (b) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, (c) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, (d) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, (e) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, e
18 / 164 (f) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-, em que o anticorpo é conectado ao terminal de -(Succinimid-3- il-N), o composto antitumoral é conectado ao grupo carbonila da fração - CH2CH2CH2-C(=O)- de (a), (b), (e) ou (f), da fração CH2-O-CH2-C(=O)- de (c) ou da fração CH2CH2-O-CH2-C(=O)- de (d) com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como uma posição de conexão, GGFG representa uma sequência de aminoácidos que consiste em glicina-glicina-fenilalanina- glicina ligada através de ligações peptídicas, e -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: [Fórmula 2] que é conectado ao anticorpo na posição 3 do mesmo e é conectado a um grupo metileno na estrutura ligante que contém essa estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1;
[33] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [32], em que o ligante é representado por qualquer fórmula selecionada do grupo que consiste nas seguintes fórmulas (c), (d) e (e): (c) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, (d) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, e (e) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-;
[34] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [33], em que o ligante é representado pela seguinte fórmula (c)
19 / 164 ou (e): (c) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, e (e) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-;
[35] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [34], que tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: [Fórmula 3] em que AB representa o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo, n representa o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante conjugada ao anticorpo por anticorpo, e o anticorpo é conectado ao ligante através de um grupo sulfidrila derivado do anticorpo;
[36] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [34], que tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula:
20 / 164 [Fórmula 4] em que AB representa o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo, n representa o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante conjugada ao anticorpo por anticorpo, e o anticorpo é conectado ao ligante através de um grupo sulfidrila derivado do anticorpo;
[37] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [36], em que o anticorpo é um anticorpo que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (1) a (4), ou um fragmento funcional do anticorpo: (1) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69, (2) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, (3) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, e (4) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na
21 / 164 sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77;
[38] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [37], em que o anticorpo é um anticorpo que compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69, ou um fragmento funcional do anticorpo;
[39] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [37], em que o anticorpo é um anticorpo que compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77, ou um fragmento funcional do anticorpo;
[40] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [39], em que a cadeia pesada ou a cadeia leve passou por uma ou duas ou mais modificações selecionadas do grupo que consiste em glicosilação ligada a N, glicosilação ligada a O, processamento N-terminal, processamento C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, oxidação de metionina, adição de um resíduo de metionina ao terminal N, amidação de um resíduo de prolina, conversão de glutamina N-terminal ou ácido glutâmico N-terminal em ácido piroglutâmico, e uma deleção de um ou dois aminoácidos do terminal carboxila;
[41] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [40], em que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está na faixa de 1 a 10;
[42] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [41], em que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está na faixa de 2 a 8;
[43] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [42], em
22 / 164 que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está na faixa de 5 a 8;
[44] o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [43], em que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está na faixa de 7 a 8;
[45] uma composição farmacêutica que compreende o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [29] a [44], um sal do mesmo ou um hidrato do conjugado ou sal;
[46] a composição farmacêutica de acordo com [45], que é um fármaco antitumoral;
[47] a composição farmacêutica de acordo com [46], em que o tumor é um tumor que expressa CDH6;
[48] a composição farmacêutica de acordo com [46] ou [47], em que o tumor é carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma de células renais papilares, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso do ovário, câncer de tiroide, câncer do duto biliar, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, glioblastoma, mesotelioma, câncer uterino, câncer de pâncreas, tumor de Wilms ou neuroblastoma;
[49] um método para tratar um tumor, que compreende administrar qualquer componente selecionado do conjugado anticorpo- fármaco como definido em qualquer um de [29] a [44], um sal do mesmo e um hidrato do conjugado ou sal a um indivíduo;
[50] o método de tratamento de acordo com [49], em que o tumor é um tumor que expressa CDH6;
[51] o método de tratamento de acordo com [49] ou [50], em que o tumor é carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma de células renais papilares, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso do ovário, câncer de tiroide, câncer do duto biliar, câncer de pulmão,
23 / 164 câncer de pulmão de células pequenas, glioblastoma, mesotelioma, câncer uterino, câncer de pâncreas, tumor de Wilms ou neuroblastoma;
[52] um método para tratar um tumor, que compreende administrar uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um componente selecionado do conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer um de [29] a [44], um sal do mesmo e um hidrato do conjugado ou sal, e pelo menos um fármaco antitumoral a um indivíduo, simultânea, separada ou continuamente;
[53] um método para produzir um conjugado anticorpo- fármaco, que compreende a etapa de reação do anticorpo ou do fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer um de [1] a [13] e [24] a [28], ou um anticorpo ou um fragmento funcional do anticorpo obtido pelo método de produção de acordo com [23] com um composto intermediário de fármaco- ligante; e
[54] um método para produzir um conjugado anticorpo- fármaco, que compreende a etapa de cultura das células hospedeiras de acordo com [21] ou [22], a etapa de coleta de um anticorpo de interesse ou um fragmento funcional do anticorpo da cultura obtido pela etapa mencionada acima, e a etapa de reação do anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo obtido pela etapa mencionada acima com um composto intermediário fármaco-ligante. Efeitos Vantajosos da Invenção
[0029] As características do anticorpo anti-CDH6 da presente invenção são reconhecer especificamente o domínio EC 3 (EC3) de CDH6 e ter alta atividade de internalização. Pode-se esperar que um conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco compreendendo o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção conjugado com um fármaco que exerce toxicidade em células por meio de um ligante com uma estrutura específica alcance um excelente efeito antitumoral e segurança por administração a pacientes com
24 / 164 células cancerígenas que expressam CDH6. Especificamente, o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção é útil como um agente antitumoral. Breve Descrição dos Desenhos
[0030] [Figura 1] A Figura 1 mostra os resultados da citometria de fluxo da análise da ligação de quatro anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato (clone nº rG019, rG055, rG056 e rG061) ou controle de IgG de rato para controlar células ou células 293T transfectadas com hCDH6. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
[0031] [Figura 2-1] A Figura 2-1 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato (rG019, rG055, rG056 e rG061) ou anticorpo de controle negativo IgG2b de rato contra células de controle ou células 293 transfectadas com hCDH6 de comprimento total. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
[0032] [Figura 2-2] A Figura 2-2 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato (rG019, rG055, rG056 e rG061) ou controle IgG de rato contra células de controle ou células 293 transfectadas com hCDH6 deletadas em EC1. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
[0033] [Figura 2-3] A Figura 2-3 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato (rG019, rG055, rG056 e rG061) ou controle IgG de rato contra células de controle ou células 293 transfectadas com hCDH6 deletadas em EC2. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
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[0034] [Figura 2-4] A Figura 2-4 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato (rG019, rG055, rG056 e rG061) ou controle IgG de rato contra células de controle ou células 293 transfectadas com hCDH6 deletadas em EC3. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
[0035] [Figura 2-5] A Figura 2-5 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato (rG019, rG055, rG056 e rG061) ou controle IgG de rato contra células de controle ou células 293 transfectadas com hCDH6 deletadas em EC4. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
[0036] [Figura 2-6] A Figura 2-6 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato (rG019, rG055, rG056 e rG061) ou controle IgG de rato contra células de controle ou células 293 transfectadas com hCDH6 deletadas em EC5. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
[0037] [Figura 3] A Figura 3 mostra os resultados da citometria de fluxo da avaliação da expressão de CDH6 na superfície da membrana celular de 4 tipos de linhagens de célula tumoral humana (linhagens celulares de tumor ovariano humano NIH:OVCAR-3, PA-1 e ES-2 e linhagem de célula tumoral humana de células renais humanas 786-O). A abcissa representa a intensidade da fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
[0038] [Figura 4] A Figura 4 mostra um gráfico no qual a atividade de internalização de 4 tipos de anticorpos anti-CDH6 de rato (rG019, rG055, rG056 e rG061) ou controle de IgG de rato foi avaliada em células NIH:OVCAR-3 e células 786-O usando reagente de IgG anti-rato Rat-ZAP
26 / 164 conjugado com uma toxina (saporina) que inibe a síntese proteica, ou fragmento IgG, Fc (gama) anti-rato de cabra específico não conjugado com a toxina como controle negativo. A ordenada do gráfico representa a atividade de ATP (RLU). Uma taxa de sobrevivência celular (%), calculada como uma taxa de sobrevivência relativa, quando o número de células vivas em um poço suplementado com o controle negativo em vez de Rat-ZAP foi definido como 100%, é mostrada abaixo de cada gráfico.
[0039] [Figura 5] A Figura 5 mostra a ligação do anticorpo anti- CDH6 quimérico humano chG019 ao CDH6 humano e CDH6 de macaco. A abcissa representa a concentração de anticorpos e a ordenada representa a quantidade de anticorpo ligado com base na intensidade de fluorescência média.
[0040] [Figura 6-1] As Figuras 6-1 e 6-2 mostram a atividade de ligação de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02) ou um anticorpo IgG1 humano de controle negativo contra CDH6 humano, CDH6 de macaco, CDH6 de camundongo e CDH6 de rato. A abcissa representa a concentração de anticorpos e a ordenada representa a quantidade do anticorpo ligado com base na intensidade de fluorescência média.
[0041] [Figura 6-2] As Figuras 6-1 e 6-2 mostram a atividade de ligação de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02) ou anticorpo IgG1 humano de controle negativo contra CDH6 humano, CDH6 de macaco, CDH6 de camundongo e CDH6 de rato. A abcissa representa a concentração de anticorpos e a ordenada representa a quantidade do anticorpo ligado com base na intensidade de fluorescência média.
[0042] [Figura 7-1] A Figura 7-1 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 ou anticorpo de controle negativo
27 / 164 hIgG1 contra células de controle ou células 293α transfectadas com hCDH6 de comprimento total. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado. A ordenada representa a contagem de células.
[0043] [Figura 7-2] A Figura 7-2 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 ou anticorpo de controle negativo hIgG1 contra células de controle ou células 293α transfectadas com hCDH6 deletadas em EC1. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado. A ordenada representa a contagem de células.
[0044] [Figura 7-3] A Figura 7-3 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 ou anticorpo de controle negativo hIgG1 contra células de controle ou células 293α transfectadas com hCDH6 deletadas em EC2. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado. A ordenada representa a contagem de células.
[0045] [Figura 7-4] A Figura 7-4 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 ou anticorpo de controle negativo hIgG1 contra células de controle ou células 293α transfectadas com hCDH6 deletadas em EC3. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado. A ordenada representa a contagem de células.
[0046] [Figura 7-5] A Figura 7-5 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 ou controle negativo hIgG1 contra células de controle ou células 293α transfectadas com hCDH6 deletadas em
28 / 164 EC4. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado. A ordenada representa a contagem de células.
[0047] [Figura 7-6] A Figura 7-6 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 ou controle negativo hIgG1 contra células de controle ou células 293α transfectadas com hCDH6 deletadas em EC5. A abcissa representa a intensidade da fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado. A ordenada representa a contagem de células.
[0048] [Figura 8] A Figura 8 mostra os resultados da citometria de fluxo do exame da expressão de CDH6 humano na linhagem celular de expressão estável 786-O/hCDH6 e sua linhagem celular parental 786-O. A abcissa representa a intensidade de fluorescência do Alexa Fluor 647, indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa uma contagem de células.
[0049] [Figura 9] A Figura 9 mostra o ensaio de competição de ligação de quatro anticorpos hG019 humanizados não marcados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 ou hIgG1 controle negativo usando (a) NOV0712 marcado ou (b) H01L02 marcado. A abcissa representa a concentração final do anticorpo não marcado adicionado e a ordenada representa a quantidade do anticorpo ligado com base na intensidade média da fluorescência.
[0050] [Figura 10-1] A Figura 10-1 mostra um gráfico no qual a atividade de internalização de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 e um anticorpo controle negativo foi avaliada em células NIH:OVCAR-3 usando reagente de IgG anti-humano Hum-ZAP conjugado com uma toxina (saporina) que inibe a síntese de proteínas, ou fragmento de IgG anti-humano de cabra F(ab’)2, fragmento específico Fc (gama) não conjugado com a toxina como controle negativo. A ordenada do gráfico representa a atividade de ATP
29 / 164 (RLU). Uma taxa de sobrevivência celular (%), calculada como uma taxa de sobrevivência relativa, quando o número de células vivas em um poço suplementado com o controle negativo em vez de Hum-ZAP foi definido como 100%, é mostrada abaixo de cada gráfico.
[0051] [Figura 10-2] A Figura 10-2 mostra um gráfico no qual a atividade de internalização de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 e um anticorpo controle negativo foi avaliada em células 786-O usando reagente de IgG anti-humano Hum-ZAP conjugado com uma toxina (saporina) que inibe a síntese de proteínas, ou fragmento de IgG anti-humano de cabra F(ab’)2, fragmento específico Fc (gama) não conjugado com a toxina como controle negativo. A ordenada do gráfico representa a atividade de ATP (RLU). Uma taxa de sobrevivência celular (%), calculada como uma taxa de sobrevivência relativa, quando o número de células vivas em um poço suplementado com o controle negativo em vez de Hum-ZAP foi definido como 100%, é mostrada abaixo de cada gráfico.
[0052] [Figura 10-3] A Figura 10-3 mostra um gráfico no qual a atividade de internalização de quatro anticorpos hG019 humanizados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo anti-CDH6 NOV0712 e um anticorpo controle negativo foi avaliada em células PA-1 usando reagente de IgG anti-humano Hum-ZAP conjugado com uma toxina (saporina) que inibe a síntese de proteínas, ou fragmento de IgG anti-humano de cabra F(ab’)2, fragmento específico Fc (gama) não conjugado com a toxina como controle negativo. A ordenada do gráfico representa a atividade de ATP (RLU). Uma taxa de sobrevivência celular (%), calculada como uma taxa de sobrevivência relativa, quando o número de células vivas em um poço suplementado com o controle negativo em vez de Hum-ZAP foi definido como 100%, é mostrada abaixo de cada gráfico.
[0053] [Figura 11] A Figura 11 mostra os resultados da avaliação da
30 / 164 atividade de inibição do crescimento celular in vitro de quatro conjugados de fármaco-hG019 humanizado (H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd e H04L02-DXd) ou NOV0712-DM4 contra células PA-1. A abcissa representa uma concentração de conjugado anticorpo-fármaco e a ordenada representa a taxa de sobrevivência celular (%).
[0054] [Figura 12] A Figura 12 mostra os efeitos antitumorais in vivo de quatro conjugados de fármaco-hG019 humanizado (H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd e H04L02-DXd) ou NOV0712-DM4. A avaliação foi realizada usando modelos animais nos quais a linhagem de célula tumoral de células renais humanas CDH6-positiva 786-O foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de erro padrão (SE).
[0055] [Figura 13] A Figura 13 mostra os efeitos antitumorais in vivo do conjugado de fármaco-hG019 humanizado H01L02-DXd ou NOV0712- DM4 ou NOV0712-DXd. A avaliação foi realizada usando modelos animais nos quais a linhagem de célula tumoral de ovário humano CDH6-positiva PA- 1 foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de SE.
[0056] [Figura 14] A Figura 14 mostra os efeitos antitumorais in vivo do conjugado de fármaco-hG019 humanizado H01L02-DXd ou NOV0712- DM4. A avaliação foi realizada usando modelos animais nos quais a linhagem de célula tumoral de ovário humano CDH6-positiva NIH:OVCAR-3 foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de SE.
[0057] [Figura 15] A Figura 15 mostra os efeitos antitumorais in vivo do conjugado de fármaco-hG019 humanizado H01L02-DXd ou NOV0712-
31 / 164 DM4. A avaliação foi realizada usando modelos animais nos quais a linhagem de célula tumoral de células renais humanas CDH6-positiva 786-O foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de SE.
[0058] [Figura 16] A Figura 16 mostra os efeitos antitumorais in vivo do conjugado de fármaco-hG019 humanizado H01L02-DXd ou NOV0712- DM4. A avaliação foi realizada usando modelos animais nos quais a linhagem de célula tumoral de ovário humano CDH6-negativa ES-2 foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de SE. Descrição das Modalidades
[0059] A seguir, as modalidades preferidas para a realização da presente invenção serão descritas com referência aos desenhos. Deve-se notar que as modalidades descritas abaixo meramente ilustram as modalidades representativas da presente invenção, e o escopo da presente invenção não deve ser estritamente interpretado devido a esses exemplos.
[0060] Na presente descrição, o termo “câncer” é usado para ter o mesmo significado que o termo “tumor”.
[0061] Na presente descrição, o termo “gene” é usado para incluir não apenas o DNA, mas também seu mRNA e cDNA, e cRNA dos mesmos.
[0062] Na presente descrição, o termo “polinucleotídeo” ou “nucleotídeo” é usado para ter o mesmo significado que o de um ácido nucleico e também inclui DNA, RNA, uma sonda, um oligonucleotídeo e um iniciador. Na presente descrição, os termos “polinucleotídeo” e “nucleotídeo” podem ser usados alternadamente entre si, a menos que especificado de outra forma.
[0063] Na presente descrição, os termos “polipeptídeo” e “proteína”
32 / 164 podem ser usados alternadamente entre si.
[0064] Na presente descrição, o termo “célula” inclui células em um animal individual e células cultivadas.
[0065] Na presente descrição, o termo “CDH6” pode ser usado para ter o mesmo significado que o da proteína CDH6. Na presente descrição, o CDH6 humano também é chamado de “hCDH6”.
[0066] Na presente descrição, o termo “atividade citotóxica” é usado para significar que uma mudança patológica é causada às células de qualquer maneira. O termo não significa apenas um trauma direto, mas também todos os tipos de danos estruturais ou funcionais causados às células, como clivagem de DNA, formação de um dímero básico, clivagem cromossômica, dano ao aparelho mitótico celular e redução nas atividades de vários tipos de enzimas.
[0067] Na presente descrição, a expressão “exercendo toxicidade nas células” é usada para significar que a toxicidade é apresentada nas células de qualquer maneira. O termo não significa apenas um trauma direto, mas também todos os tipos de influências estruturais, funcionais ou metabólicas causadas às células, como a clivagem do DNA, formação de um dímero básico, clivagem cromossômica, dano ao aparelho mitótico da célula, redução na atividades de vários tipos de enzimas e supressão dos efeitos dos fatores de crescimento celular.
[0068] Na presente descrição, o termo “fragmento funcional de um anticorpo”, também chamado de “fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo”, é usado para significar um fragmento parcial do anticorpo com atividade de ligação contra um antígeno e inclui Fab, F(ab’)2, scFv, um diacorpo, um anticorpo linear e um anticorpo multiespecífico formado a partir de fragmentos de anticorpo e similares. O Fab’, que é um fragmento monovalente de regiões variáveis de anticorpo obtido pelo tratamento de F(ab’)2 em condições redutoras, também é incluído no fragmento de ligação
33 / 164 ao antígeno de um anticorpo. No entanto, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo não está limitado a essas moléculas, desde que o fragmento de ligação ao antígeno tenha capacidade de ligação ao antígeno. Esses fragmentos de ligação ao antígeno incluem não apenas aqueles obtidos pelo tratamento de uma molécula de comprimento total de uma proteína de anticorpo com uma enzima apropriada, mas proteínas produzidas em células hospedeiras apropriadas usando um gene de anticorpo geneticamente engenheirado.
[0069] Na presente descrição, o termo “epítopo” é usado para significar o peptídeo parcial ou a estrutura tridimensional parcial da CDH6, à qual um anticorpo anti-CDH6 específico se liga. Esse epítopo, que é o peptídeo parcial descrito acima de CDH6, pode ser determinado por um método bem conhecido por um versado na técnica, como um imunoensaio. Primeiro, são produzidas várias estruturas parciais de um antígeno. No que se refere à produção de tais estruturas parciais, pode ser aplicada uma técnica conhecida de síntese de oligopeptídeos. Por exemplo, uma série de polipeptídeos, nos quais o CDH6 foi sucessivamente truncado a um comprimento apropriado a partir do terminal C ou do terminal N do mesmo, é produzida por uma técnica de recombinação genética bem conhecida por um versado na técnica. Depois disso, a reatividade de um anticorpo a esses polipeptídeos é estudada e os locais de reconhecimento são aproximadamente determinados. Depois disso, são sintetizados outros peptídeos mais curtos, e a reatividade dos mesmos a esses peptídeos pode então ser estudada, de modo a determinar um epítopo. Quando um anticorpo que se liga a uma proteína de membrana com uma pluralidade de domínios extracelulares é direcionado a uma estrutura tridimensional composta por uma pluralidade de domínios como um epítopo, o domínio ao qual o anticorpo se liga pode ser determinado modificando a sequência de aminoácidos de um domínio extracelular específico e, assim, modificando a estrutura tridimensional. O epítopo, que é
34 / 164 uma estrutura tridimensional parcial de um antígeno que se liga a um anticorpo específico, também pode ser determinado especificando os resíduos de aminoácidos de um antígeno adjacente ao anticorpo por análise estrutural de raios-X.
[0070] Na presente descrição, a frase “anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo” é usada para significar anticorpos que se ligam a um epítopo comum. Se um segundo anticorpo se liga a um peptídeo parcial ou a uma estrutura tridimensional parcial à qual um primeiro anticorpo se liga, pode ser determinado que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligam ao mesmo epítopo. Alternativamente, ao confirmar que um segundo anticorpo compete com um primeiro anticorpo pela ligação do primeiro anticorpo a um antígeno (isto é, um segundo anticorpo interfere na ligação de um primeiro anticorpo a um antígeno), pode-se determinar que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligam ao mesmo epítopo, mesmo que a sequência ou estrutura específica do epítopo não tenha sido determinada. Na presente descrição, a expressão “ligação ao mesmo epítopo” refere-se ao caso em que é determinado que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligam a um epítopo comum por qualquer um ou ambos os métodos de determinação. Quando um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo se ligam ao mesmo epítopo e, além disso, o primeiro anticorpo tem efeitos especiais, como atividade antitumoral ou atividade de internalização, pode-se esperar que o segundo anticorpo tenha a mesma atividade que a do primeiro anticorpo.
[0071] Na presente descrição, o termo “CDR” é usado para significar uma região determinante de complementaridade. Sabe-se que a cadeia pesada e a cadeia leve de uma molécula de anticorpo têm cada uma três CDRs. Essa CDR também é chamada de região hipervariável e está localizada nas regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo. Essas regiões têm uma estrutura primária particularmente altamente variável e são separadas em três locais na estrutura primária da cadeia polipeptídica em cada
35 / 164 uma das cadeia pesada e cadeia leve. Na presente descrição, com relação à CDR de um anticorpo, as CDRs de uma cadeia pesada são denominadas CDRH1, CDRH2 e CDRH3, respectivamente, do lado amino-terminal da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, enquanto as CDRs de uma cadeia leve são denominadas CDRL1, CDRL2 e CDRL3, respectivamente, do lado amino-terminal da sequência de aminoácidos da cadeia leve. Esses locais estão localizados próximos uns dos outros na estrutura tridimensional e determinam a especificidade do anticorpo para um antígeno ao qual o anticorpo se liga.
[0072] Na presente invenção, a expressão “hibridização sob condições rigorosas” é usada para significar que a hibridização é realizada na solução de hibridização comercialmente disponível no mercado ExpressHyb Hybridization Solution (fabricada pela Clontech Laboratories, Inc.) a 68°C, ou que a hibridização é realizada sob condições nas quais a hibridização é realizada usando um filtro imobilizado por DNA na presença de NaCl 0,7 a 1,0 M a 68°C, e o resultante é então lavado a 68°C com uma concentração de solução de SSC de 0,1 a 2 vezes (em que 1 vez a concentração de SSC consiste em 150 mM de NaCl e 15 mM de citrato de sódio) para identificação ou condições equivalentes.
[0073] Na presente descrição, o termo “um a vários” é usado para significar 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 ou 2.
1. CDH6
[0074] As caderinas são glicoproteínas presentes na superfície das membranas celulares e funcionam como moléculas de adesão célula-célula através da ligação dependente de íons de cálcio dos seus domínios extracelulares N-terminais ou como moléculas de sinalização responsáveis pela interação célula-célula. As caderinas clássicas estão na superfamília da caderina e são proteínas transmembranares de passagem única compostas por cinco domínios extracelulares (domínios CE), uma região transmembranar e
36 / 164 um domínio intracelular.
[0075] A CDH6 (caderina-6) é uma proteína transmembranar de passagem única composta por 790 aminoácidos, classificada na família das caderinas do tipo II, e essa proteína tem domínios extracelulares N-terminais e intracelulares C-terminais. O gene CDH6 humano foi clonado pela primeira vez em 1995 (Literatura Não Patente 1), e sua sequência pode ser referida, por exemplo, nos números de acesso NM_004932 e NP_004923 (NCBI).
[0076] A proteína CDH6 usada na presente invenção pode ser purificada diretamente das células que expressam CDH6 de um mamífero humano ou não humano (por exemplo, um rato, um camundongo ou um macaco) e pode então ser usada, ou uma fração da membrana celular das células mencionadas acima pode ser preparada e pode ser usada como a proteína CDH6. Alternativamente, a CDH6 também pode ser obtida sintetizando-a in vitro, ou permitindo que as células hospedeiras produzam CDH6 por manipulação genética. De acordo com essa manipulação genética, a proteína CDH6 pode ser obtida, especificamente, incorporando o cDNA do CDH6 em um vetor capaz de expressar o cDNA do CDH6 e, em seguida, sintetizando o CDH6 em uma solução contendo enzimas, substrato e materiais energéticos necessários para a transcrição e tradução, ou transformando as células hospedeiras de outros procariontes ou eucariontes, de modo a permitir que expressem CDH6. Além disso, as células que expressam CDH6 com base na manipulação genética descrita acima, ou uma linhagem celular que expressa CDH6, podem ser usadas para apresentar a proteína CDH6. Alternativamente, o vetor de expressão no qual o cDNA do CDH6 foi incorporado pode ser administrado diretamente a um animal a ser imunizado, e o CDH6 pode ser expresso no corpo do animal assim imunizado.
[0077] Além disso, uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição, deleção e/ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos descrita acima de CDH6, e
37 / 164 tem uma atividade biológica equivalente à da proteína CDH6, também está incluída no termo “CDH6”.
[0078] A proteína CDH6 humana tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1. A região extracelular da proteína CDH6 humana é composta pelo domínio extracelular 1 (na presente descrição, também chamado de EC1) com a sequência de aminoácidos nas posições 54 a 159 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, domínio extracelular 2 (na presente descrição, também chamado de EC2) com a sequência de aminoácidos nas posições 160 a 268 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, domínio extracelular 3 (na presente descrição, também chamado de EC3) com a sequência de aminoácidos nas posições 269 a 383 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, domínio extracelular 4 (na presente descrição, também chamado de EC4) com a sequência de aminoácidos nas posições 384 a 486 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, e domínio extracelular 5 (na presente descrição, também chamado de EC5) com a sequência de aminoácidos nas posições 487 a 608 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1. As sequências de aminoácidos de EC1 a EC5 são mostradas nas SEQ ID NOs: 2 a 6, respectivamente (Tabela 1).
2. Produção do anticorpo anti-CDH6
[0079] Um exemplo do anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode incluir um anticorpo anti-CDH6 que reconhece uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e tem atividade de internalização. Um exemplo do anticorpo anti- CDH6 da presente invenção pode incluir um anticorpo anti-CDH6 que reconhece especificamente uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e tem atividade de internalização. Um exemplo do anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode incluir um anticorpo anti-CDH6 que reconhece uma sequência de
38 / 164 aminoácidos que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e tem atividade de internalização. Um exemplo do anticorpo anti- CDH6 da presente invenção pode incluir um anticorpo anti-CDH6 que reconhece especificamente uma sequência de aminoácidos que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e tem atividade de internalização. A expressão “reconhece especificamente uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4” ou “reconhece especificamente um domínio EC3” como aplicado a um anticorpo é usado para significar que o anticorpo reconhece fortemente ou se liga fortemente ao domínio EC3 da CDH6 em comparação com os outros domínios extracelulares da CDH6.
[0080] O anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode ser derivado de qualquer espécie. Exemplos preferidos das espécies podem incluir humanos, macacos, ratos, camundongos e coelhos. Quando o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção é derivado de uma espécie diferente de humanos, é preferido quimerizar ou humanizar o anticorpo anti-CDH6 por uma técnica bem conhecida. O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou pode ser um anticorpo monoclonal, e um anticorpo monoclonal é preferido.
[0081] O anticorpo anti-CDH6 da presente invenção é um anticorpo que pode atingir células tumorais. Especificamente, o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção possui a propriedade de ser capaz de reconhecer células tumorais, a propriedade de ser capaz de se ligar a células tumorais e/ou a propriedade de ser internalizado em células tumorais por captação celular e similares. Por conseguinte, o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode ser conjugado com um composto com atividade antitumoral através de um ligante para preparar um conjugado anticorpo-fármaco.
[0082] A atividade de ligação de um anticorpo contra células tumorais pode ser confirmada por citometria de fluxo. A captação de um anticorpo nas
39 / 164 células tumorais pode ser confirmada por (1) um ensaio de visualização de um anticorpo captado celularmente sob um microscópio fluorescente usando um anticorpo secundário (marcado por fluorescência) que se liga ao anticorpo (Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761), (2) um ensaio de medição da quantidade de fluorescência captada celularmente usando um anticorpo secundário (marcado por fluorescência) que se liga ao anticorpo (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004) ou (3) um ensaio Mab-ZAP usando uma ligação de imunotoxina ao anticorpo, em que a toxina é liberada após a captação celular, de modo a suprimir o crescimento celular (Bio Techniques 28: 162-165, January 2000). Uma proteína conjugada recombinante de uma região catalítica da toxina da difteria e da proteína G pode ser usada como imunotoxina.
[0083] Na presente descrição, o termo “alta capacidade de internalização” é usado para significar que a taxa de sobrevivência (que é indicada por uma razão relativa à taxa de sobrevivência de células sem adição de anticorpos definida como 100%) das células que expressam CDH6 para as quais o anticorpo mencionado acima e um anticorpo IgG anti-rato marcado com saporina é preferivelmente de 70% ou menos e mais preferivelmente de 60% ou menos.
[0084] O conjugado anticorpo-fármaco antitumoral da presente invenção compreende um composto conjugado que exerce um efeito antitumoral. Portanto, é preferido, mas não essencial, que o próprio anticorpo tenha um efeito antitumoral. Com o objetivo de exercer especificamente e/ou seletivamente a citotoxicidade do composto antitumoral nas células tumorais, é importante e preferido que o anticorpo tenha a propriedade de ser internalizado e transferido para as células tumorais.
[0085] O anticorpo anti-CDH6 pode ser obtido imunizando um animal com um polipeptídeo que serve como antígeno por um método geralmente realizado nesse campo e, em seguida, coletando e purificando um
40 / 164 anticorpo produzido em um corpo vivo do mesmo. É preferido usar CDH6 retendo uma estrutura tridimensional como antígeno. Exemplos de tal método podem incluir um método de imunização de DNA.
[0086] A origem do antígeno não se limita a um humano e, portanto, um animal também pode ser imunizado com um antígeno derivado de um animal não humano, como um camundongo ou um rato. Nesse caso, um anticorpo aplicável à doença de um humano pode ser selecionado examinando a reatividade cruzada da ligação do anticorpo obtido ao antígeno heterólogo com o antígeno humano.
[0087] Além disso, células produtoras de anticorpos que produzem um anticorpo contra o antígeno podem ser fundidas com células de mieloma de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497; e Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365- 367, Plenum Press, N. Y. (1980)) para estabelecer hibridomas, de modo a obter um anticorpo monoclonal.
[0088] A seguir, o método para a obtenção de um anticorpo contra CDH6 será especificamente descrito. (1) Preparação do antígeno
[0089] O antígeno pode ser obtido permitindo que as células hospedeiras produzam um gene que codifica a proteína do antígeno de acordo com a manipulação genética. Especificamente, é produzido um vetor capaz de expressar o gene do antígeno, e o vetor é então introduzido nas células hospedeiras, de modo que o gene é expresso no mesmo e, posteriormente, o antígeno expresso pode ser purificado. O anticorpo também pode ser obtido por um método de imunização de um animal com as células que expressam antígenos com base na manipulação genética descrita acima, ou uma linhagem celular que expressa o antígeno.
[0090] Alternativamente, o anticorpo também pode ser obtido, sem o uso da proteína antigênica, incorporando cDNA da proteína antigênica em um
41 / 164 vetor de expressão, depois administrando o vetor de expressão a um animal a ser imunizado e expressando a proteína antigênica no corpo do animal assim imunizado, de modo que um anticorpo contra a proteína antigênica seja produzido no mesmo. (2) Produção de anticorpo monoclonal anti-CDH6
[0091] O anticorpo anti-CDH6 usado na presente invenção não é particularmente limitado. Por exemplo, um anticorpo especificado por uma sequência de aminoácidos mostrada na listagem de sequências do presente pedido pode ser usado adequadamente. O anticorpo anti-CDH6 usado na presente invenção é desejavelmente um anticorpo com as seguintes propriedades: (1) um anticorpo com as seguintes propriedades: (a) ligação específica a CDH6, e (b) ter a atividade de ser internalizado em células que expressam CDH6 por ligação a CDH6; (2) o anticorpo de acordo com (1) acima, em que o CDH6 é CDH6 humano; ou (3) o anticorpo de acordo com o (1) ou (2) acima, em que o anticorpo reconhece especificamente EC3 do CDH6 humano e tem atividade de internalização.
[0092] O método para obter o anticorpo contra CDH6 da presente invenção não é particularmente limitado desde que um anticorpo anti-CDH6 possa ser obtido. É preferido usar CDH6 mantendo sua conformação como um antígeno.
[0093] Um exemplo preferido do método para obter o anticorpo pode incluir um método de imunização de DNA. O método de imunização de DNA é uma abordagem que envolve a transfecção de um indivíduo animal (por exemplo, camundongo ou rato) com um plasmídeo de expressão de antígeno e, em seguida, a expressão do antígeno no indivíduo para induzir imunidade
42 / 164 contra o antígeno. A abordagem de transfecção inclui um método para injetar diretamente o plasmídeo no músculo, um método para injetar um reagente de transfecção, como um lipossoma ou polietilenimina na veia, uma abordagem usando um vetor viral, uma abordagem de injeção de partículas de ouro ligadas ao plasmídeo usando uma pistola de genes, um método hidrodinâmico de injeção rápida de uma solução plasmídica em grande quantidade na veia e similares. No que se refere ao método de transfecção de injeção do plasmídeo de expressão no músculo, uma técnica chamada eletroporação in vivo, que envolve a aplicação de eletroporação no local de injeção intramuscular do plasmídeo, é conhecida como uma abordagem para melhorar os níveis de expressão (Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep; 16 (9): 867-70 or Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13; 96 (8): 4262-7). Essa abordagem melhora ainda mais o nível de expressão, tratando o músculo com hialuronidase antes da injeção intramuscular do plasmídeo (McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther. 2001 Aug; 8 (16): 1264-70). Além disso, a produção de hibridoma pode ser realizada por um método conhecido e também pode ser realizada usando, por exemplo, um Sistema de Produção de Hibridoma Hybrimune (Cyto Pulse Sciences, Inc.).
[0094] Exemplos específicos de obtenção de um anticorpo monoclonal podem incluir os seguintes procedimentos: (a) a resposta imune pode ser induzida incorporando o cDNA de CDH6 em um vetor de expressão (por exemplo, pcDNA3.1; Thermo Fisher Scientific Inc.) e administrando diretamente o vetor a um animal (por exemplo, um rato ou um camundongo) a ser imunizado por um método como a eletroporação ou uma pistola de genes, de modo a expressar CDH6 no corpo do animal. A administração do vetor por eletroporação ou similar pode ser realizada uma ou mais vezes, preferivelmente uma pluralidade de vezes, se
43 / 164 necessário para intensificar a titulação de anticorpo; (b) coleta de tecido (por exemplo, um linfonodo) contendo células produtoras de anticorpos do animal mencionado acima no qual a resposta imune foi induzida; (c) preparação de células de mieloma (daqui em diante, chamadas de “mielomas”) (por exemplo, células SP2/0-ag14 de mieloma de camundongo); (d) fusão celular entre as células produtoras de anticorpos e os mielomas; (e) seleção de um grupo de hibridoma que produz um anticorpo de interesse; (f) divisão em clones de célula única (clonagem); (g) opcionalmente, a cultura de hibridomas para a produção em massa de anticorpos monoclonais ou a criação de animais nos quais os hibridomas são inoculados; e/ou (h) estudo da atividade fisiológica (atividade de internalização) e especificidade de ligação do anticorpo monoclonal assim produzido, ou exame das propriedades do anticorpo como reagente de marcação.
[0095] Exemplos do método para medir a titulação de anticorpo aqui usado podem incluir, mas não estão limitados a citometria de fluxo e ELISA celular.
[0096] Exemplos da cepa de hibridoma assim estabelecida podem incluir hibridomas produtores de anticorpos anti-CDH6 rG019, rG055, rG056 e rG061. Deve-se notar que, na presente descrição, um anticorpo produzido pelo hibridoma produtor de anticorpo anti-CDH6 rG019 é chamado de “anticorpo rG019” ou simplesmente “rG019”, um anticorpo produzido pelo hibridoma rG055 é chamado de “anticorpo rG055” ou simplesmente “rG055”, um anticorpo produzido pelo hibridoma rG056 é chamado de “anticorpo rG056” ou simplesmente “rG056” e um anticorpo produzido pelo hibridoma
44 / 164 rG061 é chamado de anticorpo “rG061” ou simplesmente “rG061”.
[0097] A região variável de cadeia leve do anticorpo rG019 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo rG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 11. A região variável de cadeia leve do anticorpo rG019 tem CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14. A região variável de cadeia pesada do anticorpo rG019 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo rG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 16. A região variável de cadeia pesada do anticorpo rG019 tem CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19. A sequência do anticorpo rG019 é mostrada na Tabela 1.
[0098] A região variável de cadeia leve do anticorpo rG055 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 20. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo rG055 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 21. A região variável de cadeia leve do anticorpo rG055 tem CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 23, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 24. A região variável de cadeia pesada do anticorpo rG055 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 25. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo rG055 é codificada pela
45 / 164 sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 26. A região variável de cadeia pesada do anticorpo rG055 tem CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 27, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 29. A sequência do anticorpo rG055 é mostrada na Tabela 1.
[0099] A região variável de cadeia leve do anticorpo rG056 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo rG056 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 31. A região variável de cadeia leve do anticorpo rG056 tem CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 33, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34. A região variável de cadeia pesada do anticorpo rG056 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 35. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo rG056 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 36. A região variável de cadeia pesada do anticorpo rG056 tem CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 38, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 39. A sequência do anticorpo rG056 é mostrada na Tabela 1.
[00100] A região variável de cadeia leve do anticorpo rG061 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 40. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo rG061 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 41. A região variável de cadeia leve do anticorpo rG061 tem CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, CDRL2 que
46 / 164 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 44. A região variável de cadeia pesada do anticorpo rG061 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 45. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo rG061 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 46. A região variável de cadeia pesada do anticorpo rG061 tem CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 47, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49. A sequência do anticorpo rG061 é mostrada na Tabela 1.
[00101] Além disso, no caso em que as etapas (a) a (h) em “2. Produção de anticorpo anti-CDH6” acima são realizadas novamente para obter independentemente um anticorpo monoclonal separadamente e também no caso em que um anticorpo monoclonal é obtido separadamente por outros métodos, um anticorpo com atividade de internalização equivalente à do anticorpo rG019, do anticorpo rG055, do anticorpo rG056 ou do anticorpo rG061 pode ser obtido. Um exemplo de tal anticorpo pode incluir um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo ao qual o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056 ou o anticorpo rG061 se ligam. Se um anticorpo monoclonal recém-preparado se liga a um peptídeo parcial ou a uma estrutura tridimensional parcial à qual o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056 ou o anticorpo rG061 se liga, pode ser determinado que o anticorpo monoclonal se liga ao mesmo epítopo ao qual o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056 ou o anticorpo rG061 se liga. Além disso, ao confirmar que o anticorpo monoclonal compete com o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056 ou o anticorpo rG061 na ligação do anticorpo ao CDH6 (ou seja, o anticorpo monoclonal interfere na ligação do anticorpo rG019, do anticorpo rG055, do anticorpo rG056 ou do
47 / 164 anticorpo rG061 ao CDH6), pode ser determinado que o anticorpo monoclonal se liga ao mesmo epítopo ao qual o anticorpo anti-CDH6 se liga, mesmo se a sequência ou estrutura específica do epítopo não tiver sido determinada. Quando se confirma que o anticorpo monoclonal se liga ao mesmo epítopo ao qual o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056 ou o anticorpo rG061 se liga, é fortemente esperado que o anticorpo monoclonal tenha capacidade de ligação ao antígeno, atividade biológica e/ou atividade de internalização equivalente à do anticorpo rG019, do anticorpo rG055, do anticorpo rG056 ou do anticorpo rG061. (3) Outros anticorpos
[00102] O anticorpo da presente invenção também inclui anticorpos geneticamente recombinantes que foram modificados artificialmente com a finalidade de reduzir a antigenicidade heterogenética para humanos, como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano, bem como o anticorpo monoclonal descrito acima contra CDH6. Esses anticorpos podem ser produzidos por métodos conhecidos.
[00103] Exemplo de anticorpo quimérico pode incluir anticorpos nos quais uma região variável e uma região constante são heterólogas entre si, como um anticorpo quimérico formado pela conjugação da região variável de um anticorpo derivado de camundongo ou rato a uma região constante derivada de humano (ver Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)).
[00104] Exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo anti- CDH6 humano de rato incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo a região variável da cadeia leve de cada anticorpo anti- CDH6 humano de rato descrito na presente descrição (por exemplo, o anticorpo rG019, o rG055 anticorpo, o anticorpo rG056 ou o anticorpo rG061) e uma região constante derivada de humano, e uma cadeia pesada compreendendo a região variável da cadeia pesada e uma região constante
48 / 164 derivada de humano.
[00105] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo anti-CDH6 humano de rato incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve com uma substituição de um a vários resíduos, 1 a 3 resíduos, 1 ou 2 resíduos, preferivelmente 1 resíduo, de aminoácidos na região variável da cadeia leve de cada anticorpo anti-CDH6 humano descrito na presente descrição (por exemplo, o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056 ou o anticorpo rG061) com outros resíduos de aminoácidos, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada com uma substituição de um a vários resíduos, 1 a 3 resíduos, 1 ou 2 resíduos, preferivelmente 1 resíduo, de aminoácidos na região variável da cadeia pesada da mesma por outros resíduos de aminoácidos. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada do homem.
[00106] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo anti-CDH6 humano de rato incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve com uma substituição de 1 ou 2 resíduos, preferivelmente 1 resíduo, de aminoácidos em qualquer 1 a 3 CDRs na região variável da cadeia leve de cada anticorpo anti- CDH6 humano descrito na presente descrição (por exemplo, o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056 ou o anticorpo rG061) com outros resíduos de aminoácidos, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada com uma substituição de 1 ou 2 resíduos, preferivelmente 1 resíduo, de aminoácidos em qualquer 1 a 3 CDRs na região variável da cadeia pesada da mesma por outros resíduos de aminoácidos. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada do homem.
[00107] Exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve que consiste na sequência
49 / 164 de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada do homem.
[00108] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve com uma substituição de um a vários resíduos, 1 a 3 resíduos, 1 ou 2 resíduos, preferivelmente 1 resíduo, de aminoácidos na região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10 com outros resíduos de aminoácidos, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada com uma substituição de um a vários resíduos, 1 a 3 resíduos, 1 ou 2 resíduos, preferivelmente 1 resíduo, de aminoácidos na região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15 com outros resíduos de aminoácidos. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada do homem.
[00109] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve com uma substituição de 1 ou 2 resíduos (preferivelmente 1 resíduo) de aminoácidos em 1 a 3 CDRs na região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10 com outros resíduos de aminoácidos, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada com uma substituição de 1 ou 2 resíduos (preferivelmente 1 resíduo) de aminoácidos em 1 a 3 CDRs na região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15 com outros resíduos de aminoácidos. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada do homem.
[00110] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do
50 / 164 anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 58. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada do homem. A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 58 é uma sequência com um resíduo de cisteína substituído com um resíduo de prolina em CDRH2 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15.
[00111] Exemplos específicos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de comprimento total de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 53, e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 56. Na presente descrição, esse anticorpo quimérico anti-CDH6 humano é chamado de “anticorpo quimérico G019”, “anticorpo chG019” ou “chG019”. A sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve do anticorpo chG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 54, e a sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada do anticorpo chG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 57.
[00112] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo chG019 é idêntica à sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rG019 e consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10. A cadeia leve do anticorpo chG019 tem CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, que são idênticas à cadeia leve CDRL1, CDRL2 e CDRL3,
51 / 164 respectivamente, de rG019. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo chG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 55.
[00113] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo chG019 consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 58. A cadeia peada do anticorpo chG019 tem CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:
19. A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 58 é uma sequência com um resíduo de cisteína substituído com um resíduo de prolina em CDRH2 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15. A CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60 é uma sequência com um resíduo de cisteína substituído com um resíduo de prolina na CDRH2 de rG019 mostrada na SEQ ID NO: 18. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo chG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 59.
[00114] A sequência do anticorpo chG019 é mostrada na Tabela 1.
[00115] Exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG055 de anticorpo anti-CDH6 humano de rato incluem um anticorpo quimérico que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 20, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 25. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada do homem.
[00116] Exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG056 de anticorpo anti-CDH6 humano de rato incluem um anticorpo quimérico que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região
52 / 164 variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 35. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada do homem.
[00117] Exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG061 de anticorpo anti-CDH6 humano de rato incluem um anticorpo quimérico que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 40, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 45. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada do homem.
[00118] Exemplos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo formado pela incorporação de apenas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) em um anticorpo derivado de humano (ver Nature (1986) 321, p. 522-525), um anticorpo formado pela incorporação dos resíduos de aminoácidos de algumas estruturas, bem como sequências de CDR, em um anticorpo humano de acordo com um método de enxerto de CDR (Publicação Internacional nº WO90/07861) e um anticorpo formado pela modificação das sequências de aminoácidos de algumas CDRs, mantendo a capacidade de ligação ao antígeno.
[00119] Na presente descrição, o anticorpo humanizado derivado do anticorpo rG019, do anticorpo rG055, do anticorpo rG056, do anticorpo rG061 ou do anticorpo chG019 não se limita a um anticorpo humanizado específico, desde que o anticorpo humanizado retenha todas as 6 sequências de CDR exclusivas do anticorpo rG019, do anticorpo rG055, do anticorpo rG056, do anticorpo rG061 ou do anticorpo chG019 e tenha atividade de internalização. As sequências de aminoácidos de algumas CDRs desse
53 / 164 anticorpo humanizado podem ser modificadas ainda mais, desde que ele tenha atividade de internalização.
[00120] Exemplos concretos do anticorpo humanizado do anticorpo chG019 podem incluir qualquer dada combinação de: uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na (1) sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 ou 67, (2) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 95% ou mais (preferivelmente uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência CDR) com a sequência de aminoácidos descrita acima (1), e (3) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos descrita acima (1); e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na (4) sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 71, 75 ou 79, (5) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 95% ou mais (preferivelmente uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência CDR) com a sequência de aminoácidos descrita acima (4), e (6) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos descrita acima (4).
[00121] Alternativamente, também pode ser usado um anticorpo com uma cadeia pesada ou cadeia leve humanizada e a outra cadeia derivada de um anticorpo de rato ou de um anticorpo quimérico. Exemplos de tal anticorpo podem incluir qualquer dada combinação de: uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em qualquer
54 / 164 sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na (1) sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 ou 67, (2) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 95% ou mais (preferivelmente uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência CDR) com a sequência de aminoácidos descrita acima (1), e (3) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos descrita acima (1); e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na (4) sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15, 25, 35, 45 ou 58, (5) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 95% ou mais (preferivelmente uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência CDR) com a sequência de aminoácidos descrita acima (4), e (6) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos descrita acima (4). Outros exemplos de tal anticorpo podem incluir qualquer dada combinação de: uma cadeia leve compreendendo uma região variável da cadeia leve consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na (1) sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10, 20, 30 ou 40, (2) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 95% ou mais (preferivelmente uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência CDR) com a sequência de aminoácidos descrita acima (1), e (3) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de
55 / 164 aminoácidos descrita acima (1); e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável da cadeia pesada consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na (4) sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 71, 75 ou 79, (5) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 95% ou mais (preferivelmente uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência CDR) com a sequência de aminoácidos descrita acima (4), e (6) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos descrita acima (4).
[00122] A substituição de aminoácidos na presente descrição é preferivelmente uma substituição conservativa de aminoácidos. A substituição conservativa de aminoácidos é uma substituição que ocorre dentro de um grupo de aminoácidos associado a certas cadeias laterais de aminoácidos. Grupos aminoácidos preferidos são os seguintes: grupo ácido = ácido aspártico e ácido glutâmico; grupo básico = lisina, arginina e histidina; grupo não polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano; e família polar não carregada = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina. Outros grupos de aminoácidos preferidos são os seguintes: grupo hidroxi alifático = serina e treonina; grupo contendo amida = asparagina e glutamina; grupo alifático = alanina, valina, leucina e isoleucina; e grupo aromático = fenilalanina, triptofano e tirosina. Essa substituição de aminoácidos é preferivelmente realizada sem prejudicar as propriedades de uma substância que tem a sequência de aminoácidos original.
[00123] Exemplos do anticorpo com uma combinação preferida das cadeias leves e cadeias pesadas descritas acima incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região
56 / 164 variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 63 (na presente descrição, também chamada de uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve hL02) ou uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 67 (na presente descrição, também chamada de uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve hL03), e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 71 (na presente descrição, também chamada de uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH01), uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 75 (na presente descrição, também chamada de uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH02) ou uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 79 (na presente descrição, também chamada de uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH04). Exemplos preferidos dos mesmos incluem: um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 63, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 71; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 63, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 75; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 63, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 79; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 67, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de
57 / 164 cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 71; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 67, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 75; e um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 67, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 79. Exemplos mais preferidos dos mesmos incluem: um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 63, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 71; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 63, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 75; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 63, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 79; e um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 67, e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 75.
[00124] Outros exemplos do anticorpo com uma combinação preferida das cadeias leves e cadeias pesadas descritas acima incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 61 (na presente descrição, também chamada de sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve
58 / 164 hL02) ou uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 65 (na presente descrição, também chamada de sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve hL03), e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 69 (na presente descrição, também chamada de sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada hH01), uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 73 (na presente descrição, também chamado de sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada hH02) ou uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 77 (na presente descrição, também chamada de sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada hH04). Exemplos preferidos dos mesmos incluem: um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 69; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 73; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de
59 / 164 aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 77; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 69; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 73; e um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 77. Exemplos mais preferidos dos mesmos incluem: um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 69 (na presente descrição, também chamado de “anticorpo H01L02” ou “H01L02”); um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve
60 / 164 mostrada na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 73 (na presente descrição, também chamado de “anticorpo H02L02” ou “H02L02”); e um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 77 (na presente descrição, também chamado de “anticorpo H04L02” ou “H04L02”); e um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 73 (na presente descrição, também chamado de “anticorpo H02L03” ou “H02L03”). As sequências do anticorpo H01L02, do anticorpo H02L02, do anticorpo H02L03 ou do anticorpo H04L02 são mostradas na Tabela 1.
[00125] Ao combinar sequências que mostram uma alta identidade com as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e sequências de aminoácidos da cadeia leve descritas acima, é possível selecionar um anticorpo com uma atividade biológica equivalente à de cada um dos anticorpos descritos acima. Essa identidade é uma identidade de geralmente 80% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, e ainda mais preferivelmente 99% ou mais. Além disso, também ao combinar sequências de aminoácidos de uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo uma substituição, deleção ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada
61 / 164 ou cadeia leve, é possível selecionar um anticorpo com uma atividade biológica equivalente à de cada um dos anticorpos descritos acima.
[00126] A identidade entre dois tipos de sequências de aminoácidos pode ser determinada alinhando as sequências usando os parâmetros padrão do Clustal W versão 2 (Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ and Higgins DG (2007),”Clustal W and Clustal X version 2.0”, Bioinformatics. 23 (21): 2947-2948).
[00127] Deve-se notar que na sequência de aminoácidos de comprimento total de cadeia leve hL02 mostrada na SEQ ID NO: 61, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 1 a 20 é a sequência de sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 21 a 128 é a região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 129 a 233 é a região constante. Na sequência de nucleotídeos de comprimento total de cadeia leve hL02 mostrada na SEQ ID NO: 62, a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 1 a 60 codifica a sequência de sinal, a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 61 a 384 codifica a região variável e a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 385 a 699 codifica a região constante.
[00128] Na sequência de aminoácidos de comprimento total de cadeia leve hL03 mostrada na SEQ ID NO: 65, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 1 a 20 é a sequência de sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 21 a 128 é a região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 129 a 233 é a região constante. Na sequência de nucleotídeos de comprimento total de cadeia leve hL03 mostrada na SEQ ID NO: 66, a sequência de nucleotídeos que consiste
62 / 164 nos nucleotídeos nas posições 1 a 60 codifica a sequência de sinal, a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 61 a 384 codifica a região variável e a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 385 a 699 codifica a região constante.
[00129] Na sequência de aminoácidos de comprimento total de cadeia pesada hH01 mostrada na SEQ ID NO: 69, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 1 a 19 é a sequência de sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 20 a 141 é a região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 142a 471 é a região constante. Na sequência de nucleotídeos de comprimento total de cadeia pesada hH01 mostrada na SEQ ID NO: 70, a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 1 a 57 codifica a sequência de sinal, a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 58 a 423 codifica a região variável e a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 424 a 1413 codifica a região constante.
[00130] Na sequência de aminoácidos de comprimento total de cadeia pesada hH02 mostrada na SEQ ID NO: 73, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 1 a 19 é a sequência de sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 20 a 141 é a região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 142a 471 é a região constante. Na sequência de nucleotídeos de comprimento total de cadeia pesada hH02 mostrada na SEQ ID NO: 74, a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 1 a 57 codifica a sequência de sinal, a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 58 a 423 codifica a região variável e a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 424 a 1413 codifica a região constante.
[00131] Na sequência de aminoácidos de comprimento total de cadeia
63 / 164 pesada hH04 mostrada na SEQ ID NO: 77, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 1 a 19 é a sequência de sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 20 a 141 é a região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 142a 471 é a região constante.
Na sequência de nucleotídeos de comprimento total de cadeia pesada hH04 mostrada na SEQ ID NO: 78, a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 1 a 57 codifica a sequência de sinal, a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 58 a 423 codifica a região variável e a sequência de nucleotídeos que consiste nos nucleotídeos nas posições 424 a 1413 codifica a região constante.
64 / 164
[Tabela 1-1] SEQ ID NO.
Sequência
Sequência de aminoácidos de CDH6 ORF humano
CDH6 EC1 humano
CDH6 EC2 humano CDH6 EC3 humano CDH6 EC4 humano
CDH6 EC5 humano
Sequência de aminoácidos de CDH6 ORF de camundongo
65 / 164
[Tabela 1-2]
Sequência de aminoácidos de CDH6 ORF de rato
Sequência de aminoácidos de CDH6 ORF de macaco cinomolgo sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve rG019 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve rG019
66 / 164
[Tabela 1-3] sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada rG019 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada rG019 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve rG055 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve rG055 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada rG055 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada rG055
67 / 164
[Tabela 1-4] sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve rG056 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve rG056 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada rG056 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada rG056 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve rG061 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve rG061
68 / 164
[Tabela 1-5] sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada rG061 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada rG061
Fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a sequência de sinalização da cadeia leve humana e a região constante da cadeiaκ humana
69 / 164
[Tabela 1-6] Fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a sequência de sinalização da cadeia pesada humana e a região constante de IgG1 humana
Fragmento de DNA que compreende a sequência de DNA que codifica a cadeia leve chG019 sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve chG019
70 / 164
[Tabela 1-7]
sequência de nucleotídeos de comprimento total da cadeia leve chG019 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve chG019 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve chG019 sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada chG019
71 / 164
[Tabela 1-8]
sequência de nucleotídeos de comprimento total da cadeia pesada chG019 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada chG019 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada chG019
72 / 164
[Tabela 1-9] sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve hL02 sequência de nucleotídeos de comprimento total da cadeia leve hL02 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve hL02 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve hL02 sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve hL03
73 / 164
[Tabela 1-10] sequência de nucleotídeos de comprimento total da cadeia leve hL03 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve hL03 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve hL03 sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada hH01
74 / 164
[Tabela 1-11] sequência de nucleotídeos de comprimento total da cadeia pesada hH01 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH01 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada hH01
75 / 164
[Tabela 1-12]
sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada hH02 sequência de nucleotídeos de comprimento total da cadeia pesada hH02 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH02
76 / 164
[Tabela 1-13]
sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada hH02 sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada hH04 sequência de nucleotídeos de comprimento total da cadeia pesada hH04
77 / 164
[Tabela 1-14] sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH04 sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada hH04 sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve NOV0712 sequência de nucleotídeos de comprimento total da cadeia leve NOV0712 sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada NOV0712
78 / 164 [Tabela 1-15] sequência de nucleotídeos de comprimento total da cadeia pesada NOV0712
[00132] Na presente descrição, as Tabelas 1-1 a 1-15 também são coletivamente chamadas de Tabela 1.
[00133] Outros exemplos do anticorpo da presente invenção podem incluir um anticorpo humano que se liga ao CDH6. O anticorpo humano anti- CDH6 significa um anticorpo humano com apenas a sequência gênica de um anticorpo derivado de cromossomos humanos. O anticorpo humano anti- CDH6 pode ser obtido por um método usando um camundongo produtor de anticorpo humano com um fragmento cromossômico humano compreendendo os genes da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo humano (ver Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727; etc.).
[00134] Esse camundongo produtor de anticorpo humano pode ser produzido especificamente usando um animal geneticamente modificado,
79 / 164 cujos loci genéticos da cadeia pesada e da cadeia leve da imunoglobulina endógena foram interrompidos e, em vez disso, os loci genéticos da cadeia pesada e da cadeia leve da imunoglobulina humana foram introduzidos usando um vetor de cromossomo artificial de levedura (YAC) ou similar, produzindo um animal knock-out e um animal transgênico a partir de um animal geneticamente modificado e depois reproduzindo esses animais um com o outro.
[00135] Caso contrário, o anticorpo humano anti-CDH6 também pode ser obtido através da transformação de células eucarióticas com cDNA que codifica cada uma das cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo humano, ou preferivelmente com um vetor compreendendo o cDNA, de acordo com técnicas de recombinação genética, e então cultivar as células transformadas produzindo um anticorpo monoclonal humano geneticamente modificado, para que o anticorpo possa ser obtido a partir do sobrenadante da cultura.
[00136] Nesse contexto, células eucarióticas e, preferivelmente, células de mamíferos como células CHO, linfócitos ou mielomas podem, por exemplo, ser usadas como hospedeiro.
[00137] Além disso, também é conhecido um método para obter um anticorpo humano derivado da exibição de fagos que foi selecionado a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos (ver Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427- 431; etc.).
[00138] Por exemplo, pode ser aplicado um método de exibição de fagos, que compreende permitir que as regiões variáveis de um anticorpo humano se expressem como um anticorpo de cadeia única (scFv) na superfície dos fagos e, em seguida, selecionar uma ligação de fago a um antígeno (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116).
80 / 164
[00139] Ao analisar o gene do fago que foi selecionado devido à sua capacidade de ligação ao antígeno, as sequências de DNA que codificam as regiões variáveis de um anticorpo humano que se liga ao antígeno podem ser determinadas.
[00140] Uma vez determinada a sequência de DNA da ligação do scFv ao antígeno, é produzido um vetor de expressão com a sequência mencionada acima e o vetor de expressão produzido é então introduzido em um hospedeiro apropriado e pode ser permitido expressá-lo, obtendo assim um anticorpo humano (Publicação Internacional nº WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, e WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).
[00141] Se um anticorpo humano recém-produzido se ligar a um peptídeo parcial ou a uma estrutura tridimensional parcial à qual se liga qualquer anticorpo anti-CDH6 humano de rato, anticorpo quimérico anti- CDH6 humano ou anticorpo humanizado anti-CDH6 humano descrito na presente descrição (por exemplo, o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056, o anticorpo rG061, o anticorpo chG019, o anticorpo H01L02, o anticorpo H02L02, o anticorpo H02L03 ou o anticorpo H04L02), pode ser determinado que o anticorpo humano se liga ao mesmo epítopo ao qual o anticorpo anti-CDH6 humano, o anticorpo quimérico anti-CDH6 humano ou o anticorpo humanizado anti-CDH6 humano se liga. Alternativamente, ao confirmar que o anticorpo humano compete com o anticorpo anti-CDH6 humano de rato, o anticorpo quimérico anti-CDH6 humano ou o anticorpo humanizado anti-CDH6 humano descrito na presente descrição (por exemplo, o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056, o anticorpo rG061, o anticorpo chG019, o anticorpo H01L02, o anticorpo H02L02, o anticorpo H02L03 ou o anticorpo H04L02) na ligação do anticorpo ao CDH6 (por exemplo, o anticorpo humano interfere na ligação
81 / 164 do anticorpo rG019, do anticorpo rG055, do anticorpo rG056, do anticorpo rG061, do anticorpo chG019, do anticorpo H01L02, do anticorpo H02L02, do anticorpo H02L03 ou do anticorpo H04L02 ao CDH6, preferivelmente EC3 de CDH6), pode ser determinado que o anticorpo humano se liga ao mesmo epítopo ao qual o anticorpo anti-CDH6 humano de rato, o anticorpo quimérico anti-CDH6 humano ou o anticorpo humanizado anti-CDH6 humano descrito na presente descrição se liga, mesmo se a sequência específica ou a estrutura do epítopo não for determinada. Na presente descrição, quando é determinado por pelo menos um desses métodos de determinação que o anticorpo humano “se liga ao mesmo epítopo”, conclui-se que o anticorpo humano recém-preparado “se liga ao mesmo epítopo” que o do anticorpo anti-CDH6 humano de rato, anticorpo quimérico anti-CDH6 humano ou anticorpo humanizado anti-CDH6 humano descrito na presente descrição. Quando se confirma que o anticorpo humano se liga ao mesmo epítopo, espera-se que o anticorpo humano tenha uma atividade biológica equivalente à do anticorpo anti-CDH6 humano de rato, ao anticorpo quimérico anti-CDH6 humano ou ao anticorpo humanizado anticorpo humano CDH6 (por exemplo, o anticorpo rG019, o anticorpo rG055, o anticorpo rG056, o anticorpo rG061, o anticorpo chG019, o anticorpo H01L02, o anticorpo H02L02, o anticorpo H02L03 ou o anticorpo H04L02).
[00142] Os anticorpos quiméricos, os anticorpos humanizados ou os anticorpos humanos obtidos pelos métodos descritos acima são avaliados quanto à sua atividade de ligação contra o antígeno de acordo com um método conhecido, etc., de modo que um anticorpo preferido possa ser selecionado.
[00143] Um exemplo de outro indicador para comparação das propriedades de anticorpos pode incluir a estabilidade de um anticorpo. Um calorímetro diferencial de varredura (DSC) é um aparelho capaz de medir rápida e exatamente um ponto médio da desnaturação térmica (Tm), servindo como um bom indicador para a estabilidade estrutural relativa de uma
82 / 164 proteína. Ao usar o DSC para medir valores de Tm e fazer uma comparação com os valores obtidos, as diferenças na estabilidade térmica podem ser comparadas. Sabe-se que a estabilidade de preservação de um anticorpo tem uma certa correlação com a estabilidade térmica do anticorpo (Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273), e assim, um anticorpo preferido pode ser selecionado usando a estabilidade térmica como um indicador. Outros exemplos do indicador para seleção de um anticorpo podem incluir alto rendimento em células hospedeiras adequadas e baixa aglutinação em uma solução aquosa. Por exemplo, uma vez que um anticorpo com o maior rendimento nem sempre apresenta a maior estabilidade térmica, é necessário selecionar um anticorpo mais adequado para administração a um ser humano, determinando-o de forma abrangente com base nos indicadores mencionados acima.
[00144] O anticorpo da presente invenção também inclui uma modificação de um anticorpo.
[00145] A modificação é usada para significar o anticorpo da presente invenção, que é quimicamente ou biologicamente modificado. Exemplos de tal modificação química incluem a ligação de uma fração química a um esqueleto de aminoácidos e a modificação química de uma cadeia de carboidratos ligada a N ou ligada a O. Exemplos dessa modificação biológica incluem anticorpos submetidos a uma modificação pós-tradução (por exemplo, glicosilação ligada a N ou O, processamento N-terminal ou C- terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, oxidação de metionina e conversão de glutamina N-terminal ou ácido glutâmico N- terminal em ácido piroglutâmico) e anticorpos ao terminal N ao qual é adicionado um resíduo de metionina como resultado de terem sido expressos usando células hospedeiras procariontes. Além disso, essa modificação também deve incluir anticorpos marcados para permitir a detecção ou isolamento do anticorpo da presente invenção ou de um antígeno, por
83 / 164 exemplo, um anticorpo marcado enzimaticamente, um anticorpo marcado com fluorescência e um anticorpo marcado com afinidade. Tal modificação do anticorpo da presente invenção é útil para a melhoria da estabilidade e retenção no sangue de um anticorpo; uma redução na antigenicidade; detecção ou isolamento de um anticorpo ou antígeno; etc.
[00146] Além disso, ao regular uma modificação da cadeia de açúcar (glicosilação, defucosilação, etc.) que se liga ao anticorpo da presente invenção, a atividade citotóxica celular dependente de anticorpo pode ser aumentada. Como técnicas de regulação da modificação da cadeia de açúcar de um anticorpo, são conhecidas as descritas nas Publicações Internacionais nº WO1999/54342, WO2000/61739 e WO2002/31140, etc., embora as técnicas não sejam limitadas a elas. O anticorpo da presente invenção também inclui anticorpos em relação aos quais a modificação da cadeia de açúcar mencionada acima foi regulada.
[00147] Uma vez que um gene de anticorpo é isolado, o gene pode ser introduzido em um hospedeiro apropriado para produzir um anticorpo, usando uma combinação apropriada de um hospedeiro e um vetor de expressão. Um exemplo específico do gene do anticorpo pode ser uma combinação de um gene que codifica a sequência da cadeia pesada do anticorpo descrito na presente descrição e um gene que codifica a sequência da cadeia leve do anticorpo aqui descrito. Após a transformação das células hospedeiras, esse gene de sequência da cadeia pesada e um gene da sequência da cadeia leve podem ser inseridos em um único vetor de expressão ou esses genes podem, em vez disso, ser inseridos em diferentes vetores de expressão.
[00148] Quando as células eucarióticas são usadas como hospedeiros, podem ser usadas células animais, células vegetais ou microrganismos eucarióticos. Em particular, exemplos de células animais podem incluir células de mamíferos, como células COS, que são células de macaco (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos de
84 / 164 camundongos NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), uma linhagem celular deficiente em di-hidrofolato redutase de células de ovário de hamster chinês (células CHO, ATCC CCL-61) (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p. 4126-4220), e células 293F FreeStyle (Invitrogen Corp.).
[00149] Quando células procarióticas são usadas como hospedeiros, Escherichia coli ou Bacillus subtilis podem ser usados, por exemplo.
[00150] Um gene de anticorpo de interesse é introduzido nessas células para transformação, e as células transformadas são então cultivadas in vitro para obter um anticorpo. Na cultura mencionada acima, há casos em que o rendimento é diferente dependendo da sequência do anticorpo e, portanto, é possível selecionar um anticorpo, que é facilmente produzido como medicamento, a partir de anticorpos com atividade de ligação equivalente, usando o rendimento como um indicador. Por conseguinte, o anticorpo da presente invenção também inclui um anticorpo obtido pelo método descrito acima para produzir um anticorpo, que compreende uma etapa de cultura das células hospedeiras transformadas e uma etapa de coleta de um anticorpo de interesse ou de um fragmento funcional do anticorpo da cultura obtida na etapa mencionada acima.
[00151] Sabe-se que o resíduo de lisina no terminal carboxila da cadeia pesada de um anticorpo produzido em células de mamíferos cultivadas é excluído (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), e também, sabe-se que os dois resíduos de aminoácidos no terminal carboxila da cadeia pesada, glicina e lisina, são excluídos e que o resíduo de prolina recém- posicionado no terminal carboxila é amidado (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). No entanto, essa deleção e modificação dessas sequências da cadeia pesada não influenciam a atividade de ligação ao antígeno e a função efetora (ativação do complemento, citotoxicidade celular dependente de anticorpo, etc.) de um anticorpo. Por conseguinte, o anticorpo de acordo com
85 / 164 a presente invenção também inclui um anticorpo que sofreu a modificação mencionada acima, e um fragmento funcional do anticorpo, e exemplos específicos de tal anticorpo incluem um mutante de deleção compreendendo uma deleção de 1 ou 2 aminoácidos no terminal carboxila da cadeia pesada e um mutante de deleção formado pela amidação do mutante de deleção mencionado acima (por exemplo, uma cadeia pesada na qual o resíduo de prolina no local do terminal carboxila é amidado). No entanto, os mutantes de deleção que envolvem uma deleção no terminal carboxila da cadeia pesada do anticorpo de acordo com a presente invenção não estão limitados aos mutantes de deleção descritos acima, desde que retenham a atividade de ligação ao antígeno e a função efetora. Duas cadeias pesadas que constituem o anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser qualquer tipo de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em um anticorpo completo e os mutantes de deleção descritos acima, ou podem ser uma combinação de dois tipos selecionados do grupo mencionado acima. A razão de mutantes de deleção individuais pode ser influenciada pelos tipos de células de mamífero cultivadas que produzem o anticorpo de acordo com a presente invenção e pelas condições de cultura. Exemplos do ingrediente principal do anticorpo de acordo com a presente invenção podem incluir anticorpos onde um resíduo de aminoácido é deletado em cada um dos terminais carboxila das duas cadeias pesadas.
[00152] Exemplos do isótipo do anticorpo da presente invenção podem incluir IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Entre outros, IgG1 e IgG4 são preferíveis.
[00153] Exemplos da atividade biológica de um anticorpo geralmente podem incluir a atividade de ligação ao antígeno, a atividade de internalização em células que expressam um antígeno pela ligação ao antígeno, a atividade de neutralização da atividade de um antígeno, a atividade de aumento da atividade de um antígeno, a atividade citotóxica celular dependente de
86 / 164 anticorpo (ADCC), atividade citotóxica dependente de complemento (CDC) e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP). A função do anticorpo de acordo com a presente invenção é a atividade de ligação contra CDH6 e é preferivelmente a atividade de internalização em células que expressam CDH6 por ligação a CDH6. Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ter atividade ADCC, atividade CDC e/ou atividade ADCP, bem como atividade de internalização celular.
[00154] O anticorpo obtido pode ser purificado para um estado homogêneo. Para a separação e purificação do anticorpo, podem ser usados métodos de separação e purificação usados para proteínas comuns. Por exemplo, cromatografia em coluna, filtração, ultrafiltração, relargagem, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida preparativa e focalização isoelétrica são adequadamente selecionados e combinados entre si, para que o anticorpo possa ser separado e purificado (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); e Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), embora exemplos dos métodos de separação e purificação não estejam limitados aos mesmos.
[00155] Exemplos da cromatografia podem incluir cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de fase reversa e cromatografia de absorção.
[00156] Essas técnicas cromatográficas podem ser realizadas usando cromatografia líquida como HPLC ou FPLC.
[00157] Exemplos da coluna usada na cromatografia de afinidade podem incluir uma coluna de proteína A e uma coluna de proteína G. Exemplos da coluna envolvendo o uso da proteína A podem incluir Hyper D, POROS e Sepharose F. F. (Pharmacia).
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[00158] Além disso, ao usar um carreador imobilizado por antígeno, o anticorpo pode ser purificado utilizando a atividade de ligação do anticorpo ao antígeno.
3. Conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 (1) Fármaco
[00159] O anticorpo anti-CDH6 obtido no item “2. Produção de anticorpo anti-CDH6” acima pode ser conjugado a um fármaco através de uma fração da estrutura ligante para preparar um conjugado fármaco- anticorpo anti-CDH6. O fármaco não é particularmente limitado desde que tenha um substituinte ou uma estrutura parcial que possa ser conectada a uma estrutura ligante. O conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 pode ser usado para vários fins, de acordo com o fármaco conjugado. Exemplos de tal fármaco podem incluir substâncias com atividade antitumoral, substâncias eficazes para doenças sanguíneas, substâncias eficazes para doenças autoimunes, substâncias anti-inflamatórias, substâncias antimicrobianas, substâncias antifúngicas, substâncias antiparasitárias, substâncias antivirais e substâncias antianestésicas. (1)-1 Composto antitumoral
[00160] Um exemplo usando um composto antitumoral como um composto a ser conjugado no conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente invenção será descrito abaixo. O composto antitumoral não é particularmente limitado desde que o composto tenha um efeito antitumoral e tenha um substituinte ou uma estrutura parcial que possa ser conectada a uma estrutura ligante. Após a clivagem de uma parte ou de todo o ligante nas células tumorais, a fração do composto antitumoral é liberada de modo que o composto antitumoral apresente um efeito antitumoral. À medida que o ligante é clivado na posição de conexão com o fármaco, o composto antitumoral é liberado em sua estrutura original para exercer seu efeito antitumoral original.
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[00161] O anticorpo anti-CDH6 obtido no item “2. Produção de anticorpo anti-CDH6” acima pode ser conjugado ao composto antitumoral através de uma fração da estrutura ligante para preparar um conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6.
[00162] Como um exemplo do composto antitumoral usado na presente invenção, o exatecan, um derivado de camptotecina ((1S,9S)-1-amino-9-etil- 5-fluoro-2,3-di-hidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H- benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona representada pela fórmula a seguir) pode preferivelmente ser usado. [Fórmula 5]
[00163] O composto pode ser facilmente obtido por, por exemplo, um método descrito na Publicação de Patente US nº US2016/0297890 ou outros métodos conhecidos, e o grupo amino na posição 1 pode ser preferivelmente usado como uma posição de conexão à estrutura de ligação. Além disso, o exatecan pode ser liberado nas células tumorais enquanto uma parte do ligante ainda está ligada ao mesmo. No entanto, o composto exerce um excelente efeito antitumoral, mesmo nesse estado.
[00164] Como o exatecan tem uma estrutura de camptotecina, sabe-se que o equilíbrio muda para uma estrutura com um anel de lactona formado (anel fechado) em meio aquoso ácido (por exemplo, da ordem do pH 3), enquanto o equilíbrio muda para uma estrutura com um anel de lactona aberto (anel aberto) em meio aquoso básico (por exemplo, da ordem do pH 10). Também se espera que um conjugado de fármaco no qual foram introduzidos resíduos de exatecan correspondentes a uma estrutura de anel fechado e uma estrutura de anel aberto tenham um efeito antitumoral equivalente, e não é
89 / 164 necessário dizer que qualquer um desses conjugados de fármaco está incluído no escopo da presente invenção.
[00165] Outros exemplos do composto antitumoral podem incluir compostos antitumorais descritos na literatura (Pharmacological Reviews, 68, p. 3-19, 2016). Exemplos específicos dos mesmos podem incluir doxorrubicina, caliqueamicina, dolastatina 10, auristatinas como monometil auristatina E (MMAE) e monometil auristatina F (MMAF), maitansinoides como DM1 e DM4, um dímero de pirrolbenzodiazepina SG2000 (SJG-136), um derivado de camptotecina SN-38, duocarmicinas como CC-1065, amanitina, daunorrubicina, mitomicina C, bleomicina, ciclocitidina, vincristina, vinblastina, metotrexato, agentes antitumorais à base de platina (cisplatina e derivados da mesma) e Taxol e derivados do mesmo.
[00166] No conjugado anticorpo-fármaco, o número de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo é um fator chave que influencia a eficácia e segurança do mesmo. A produção do conjugado anticorpo-fármaco é realizada especificando condições de reação, tais como as quantidades de materiais de partida e reagentes usados para a reação, de modo a atingir um número constante de moléculas de fármaco conjugadas. Ao contrário da reação química de um composto de baixo peso molecular, geralmente é obtida uma mistura contendo diferentes números de moléculas de fármaco conjugadas. O número de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo é definido e indicado como um valor médio, isto é, o número médio de moléculas de fármaco conjugadas. Salvo indicação em contrário, ou seja, exceto no caso de representar um conjugado anticorpo- fármaco com um número específico de moléculas de fármaco conjugadas que está incluído em uma mistura de anticorpo-fármaco com um número diferente de moléculas de fármaco conjugadas, o número de moléculas de fármaco conjugadas de acordo com para a presente invenção também significa um valor médio como regra. O número de moléculas de exatecan conjugadas a
90 / 164 uma molécula de anticorpo é controlável e, como um número médio de moléculas de fármaco conjugadas por anticorpo, aproximadamente 1 a 10 moléculas de exatecan podem ser conjugadas. O número de moléculas de exatecan é preferivelmente 2 a 8, 3 a 8, 4 a 8, 5 a 8, 6 a 8 ou 7 a 8, mais preferivelmente 5 a 8, ainda mais preferivelmente 7 a 8, ainda mais preferivelmente 8. Deve-se notar que um versado na técnica pode projetar uma reação para conjugar um número necessário de moléculas de fármaco a uma molécula de anticorpo com base na descrição dos Exemplos do presente pedido, e pode obter um conjugado anticorpo-fármaco com um número controlado de moléculas de exatecan conjugadas. (2) Estrutura ligante
[00167] A estrutura ligante que conjuga o fármaco com o anticorpo anti-CDH6 no conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente invenção será descrita.
[00168] No conjugado anticorpo-fármaco do presente pedido, a estrutura ligante que conjuga o anticorpo anti-CDH6 ao fármaco não é particularmente limitada desde que o conjugado anticorpo-fármaco resultante possa ser usado. A estrutura ligante pode ser adequadamente selecionada e usada de acordo com a finalidade de uso. Um exemplo da estrutura ligante pode incluir um ligante descrito na literatura conhecida (Pharmacol Rev 68: 3-19, January 2016, Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0, etc.). Exemplos específicos adicionais podem incluir VC (valina-citrulina), MC (maleimidocaproíla), SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato de succinimidila), SPP (4-(2-piridilditio)pentanoato de N- succinimidila), SS (dissulfeto), SPDB (4-(2-piridilditio)butirato de N- succinimidila), SS/hidrazona, hidrazona e carbonato.
[00169] Outro exemplo pode incluir uma estrutura ligante descrita na Publicação de Patente US nº US2016/0297890 (como um exemplo, as descritas nos parágrafos [0260] a [0289] da mesma). Qualquer estrutura
91 / 164 ligante dada abaixo pode preferivelmente ser usada. Deve-se notar que o terminal esquerdo da estrutura é uma posição de conexão com o anticorpo, e o terminal direito da mesma é uma posição de conexão com o fármaco. Além disso, a GGFG nas estruturas ligantes dadas abaixo representa uma sequência de aminoácidos que consiste em glicina-glicina-fenilalanina-glicina (GGFG) ligada através de ligações peptídicas. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-.
[00170] Mais preferidos são os seguintes: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[00171] Ainda mais preferidos são os seguintes: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, e
92 / 164 -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[00172] O anticorpo é conectado ao terminal de -(Succinimid-3-il-N) (por exemplo, um terminal oposto (terminal esquerdo) ao terminal ao qual - CH2CH2CH2CH2CH2- é conectado em “-(Succinimid-3-il-N)- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-”), e o composto antitumoral é conectado a um terminal (o grupo carbonila de CH2-O-CH2- C(=O)- no terminal direito no exemplo descrito acima) oposto ao terminal ao qual o anticorpo é conectado a -(Succinimid-3-il-N). “-(Succinimid-3-il-N)-” tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: [Fórmula 6]
[00173] A posição 3 dessa estrutura parcial é a posição de conexão com o anticorpo anti-CDH6. Essa conexão com o anticorpo na posição 3 é distinguida pela formação de uma ligação tioéter. O átomo de nitrogênio na posição 1 dessa fração da estrutura é conectado ao átomo de carbono do metileno que está presente no ligante, incluindo a estrutura.
[00174] No conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção com o exatecan como fármaco, é preferida uma fração da estrutura ligante do fármaco com qualquer estrutura dada abaixo para a conjugação com o anticorpo. Para essas frações da estrutura ligante-fármaco, o número médio conjugado por anticorpo pode ser de 1 a 10 e é preferivelmente de 2 a 8, mais preferivelmente de 5 a 8, ainda mais preferivelmente de 7 a 8 e ainda mais preferivelmente 8. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
93 / 164 -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX).
[00175] Mais preferidos são os seguintes: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00176] Ainda mais preferidos são os seguintes: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00177] -(NH-DX) tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: [Fórmula 7]
94 / 164 e representa um grupo que é derivado por remoção de um átomo de hidrogênio do grupo amino na posição 1 do exatecan. (3) Método para produzir o conjugado anticorpo-fármaco
[00178] O anticorpo que pode ser usado no conjugado anticorpo- fármaco da presente invenção não é particularmente limitado desde que seja um anticorpo anti-CDH6 com atividade de internalização ou um fragmento funcional do anticorpo, conforme descrito na seção acima “2. Produção de anticorpo anti-CDH6 “e os Exemplos.
[00179] A seguir, será descrito um método típico para a produção do conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção. Deve-se notar que, na descrição abaixo, o “nº do composto” mostrado em cada esquema de reação é usado para representar um composto. Especificamente, cada composto é chamado de “composto de fórmula (1)”, “composto (1)” ou similar. O mesmo vale para os outros nº dos compostos. (3)-1 Método de produção 1
[00180] O conjugado anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) dada abaixo, na qual o anticorpo anti-CDH6 é conectado à estrutura ligante via um tioéter pode ser produzido pela reação de um anticorpo com um grupo sulfidrila convertido a partir de uma ligação dissulfeto pela redução do anticorpo anti-CDH6, com o composto (2), o composto (2) podendo ser obtido por um método conhecido (por exemplo, obtido por um método descrito na literatura de publicação de patente US2016/297890 (por exemplo, um método descrito nos parágrafos [0336 ] a [0374])). Esse conjugado anticorpo-fármaco pode ser produzido pelo seguinte método, por exemplo. [Expressão 1] ( ) em que AB representa um anticorpo com um grupo sulfidrila,
95 / 164 em que L1 tem uma estrutura representada por -(Succinimid-3-il-N)-, e L1’ representa um grupo maleimidila representado pela seguinte fórmula. [Fórmula 8] -L1-LX tem uma estrutura representada por qualquer uma das seguintes fórmulas: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-.
[00181] Dentre eles, mais preferidos são os seguintes: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-
96 / 164 CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[00182] Mais preferidos são os seguintes: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, e -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[00183] No esquema de reação descrito acima, o conjugado anticorpo- fármaco (1) pode ser entendido como tendo uma estrutura na qual uma fração da estrutura do fármaco para o terminal ligante está ligada a um anticorpo. No entanto, essa descrição é dada por uma questão de conveniência e, na verdade, existem muitos casos em que uma pluralidade das frações de estrutura mencionadas acima é conectada a uma molécula de anticorpo. O mesmo vale para a explicação do método de produção descrito abaixo.
[00184] Especificamente, o conjugado anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido por reação do composto (2) obtenível por um método conhecido (por exemplo, obtenível por um método descrito na literatura de publicação de patente US2016/297890 (por exemplo, obtenível por um método descrito nos parágrafos [0336] a [0374])), com o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila.
[00185] O anticorpo (3a) com um grupo sulfidrila pode ser obtido por um método bem conhecido por um versado na técnica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Exemplos do método podem incluir, mas não se limitam a: Reagente de Traut reagindo com o grupo amino do anticorpo; S-acetiltioalcanoatos de N- succinimidila reagindo com o grupo amino do anticorpo seguido por reação com hidroxilamina; 3-(piridilditio)propionato de N-succinimidila reagindo com o anticorpo, seguido de reação com um agente redutor; o anticorpo reagindo com um agente redutor, como ditiotreitol, 2-mercaptoetanol ou cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para reduzir a ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo, de modo a formar um grupo sulfidrila.
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[00186] Especificamente, um anticorpo com ligações dissulfeto intercadeia parcial ou completamente reduzidas pode ser obtido usando 0,3 a 3 equivalentes molares de TCEP como agente redutor por ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo e reagindo o agente redutor com o anticorpo em uma solução tampão contendo um agente quelante. Exemplos do agente quelante podem incluir ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA). O agente quelante pode ser usado a uma concentração de 1 mM a 20 mM. Uma solução de fosfato de sódio, borato de sódio, acetato de sódio ou similar pode ser usada como solução tampão. Como um exemplo específico, o anticorpo (3a) com grupos sulfidrila parcial ou completamente reduzidos pode ser obtido por reação do anticorpo com TCEP a 4°C a 37°C por 1 a 4 horas.
[00187] Deve-se notar que, ao realizar uma reação de adição de um grupo sulfidrila a uma fração de ligante-fármaco, a fração de ligante-fármaco pode ser conjugada por uma ligação tioéter.
[00188] Então, usando 2 a 20 equivalentes molares do composto (2) por anticorpo (3a) com um grupo sulfidrila, pode ser produzido o conjugado anticorpo-fármaco (1) no qual 2 a 8 moléculas de fármaco são conjugadas por anticorpo. Especificamente, uma solução contendo o composto (2) dissolvido na mesma pode ser adicionada a uma solução tampão contendo o anticorpo (3a) com um grupo sulfidrila para a reação. Nesse contexto, uma solução de acetato de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio ou similar pode ser usada como solução tampão. O pH da reação é de 5 a 9 e, mais preferivelmente, a reação pode ser realizada próximo ao pH 7. Um solvente orgânico como dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA) ou N-metil-2-pirrolidona (NMP) pode ser usado como solvente para dissolver o composto (2). A reação pode ser realizada adicionando a solução contendo o composto (2) dissolvido no solvente orgânico a 1 a 20% v/v a uma solução tampão contendo o anticorpo (3a) com um grupo sulfidrila. A
98 / 164 temperatura da reação é de 0 a 37°C, mais preferivelmente de 10 a 25°C, e o tempo de reação é de 0,5 a 2 horas. A reação pode ser encerrada desativando a reatividade do composto não reagido (2) com um reagente contendo tiol. O reagente contendo tiol é, por exemplo, cisteína ou N-acetil-L-cisteína (NAC). Mais especificamente, a reação pode ser terminada adicionando 1 a 2 equivalentes molares de NAC ao composto (2) usado e incubando a mistura obtida à temperatura ambiente por 10 a 30 minutos. (4) Identificação do conjugado anticorpo-fármaco
[00189] O conjugado anticorpo-fármaco produzido (1) pode ser submetido a concentração, troca de tampão, purificação e medição da concentração de anticorpo e o número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo, de acordo com procedimentos comuns descritos abaixo, para identificar o conjugado anticorpo-fármaco (1). (4)-1 Procedimento comum A: Concentração de solução aquosa de anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco
[00190] A um recipiente Amicon Ultra (50.000 MWCO, Millipore Corporation), foi adicionada uma solução de um anticorpo ou de um conjugado anticorpo-fármaco, e a solução do anticorpo ou do conjugado anticorpo-fármaco foi concentrada por centrifugação (centrifugação de 2000 G a 3800 G por 5 a 20 minutos) usando uma centrífuga (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) (4)-2 Procedimento comum B: Medição da concentração de anticorpos
[00191] Usando um detector de UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), a medição da concentração de anticorpos foi realizada de acordo com o método definido pelo fabricante. A este respeito, foi usado o coeficiente de absorção de 280 nm diferindo entre os anticorpos (1,3 mLmg- 1 cm-1 a 1,8 mLmg-1cm-1). (4)-3 Procedimento comum C: Troca de tampão para anticorpo
[00192] Uma coluna NAP-25 (Cat. nº 17-0852-02, GE Healthcare
99 / 164 Japan Corporation) usando o carreador Sephadex G-25 foi equilibrada com um tampão fosfato (50 mM, pH 6,0) (chamado de PBS6,0/EDTA na presente descrição) contendo cloreto de sódio (50 mM) e EDTA (2 mM) de acordo com o método definido pelo fabricante. Uma solução aquosa do anticorpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL por coluna NAP-25 e, em seguida, uma fração (3,5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6,0/EDTA foi coletada. Essa fração foi concentrada pelo procedimento comum A. Após a medição da concentração do anticorpo usando o procedimento comum B, a concentração de anticorpos foi ajustada para 20 mg/mL usando PBS6,0/EDTA. (4)-4 Procedimento comum D: Purificação do conjugado anticorpo-fármaco
[00193] Uma coluna NAP-25 foi equilibrada com qualquer solução tampão disponível comercialmente, como um tampão acetato contendo sorbitol (5%) (10 mM, pH 5,5; chamado de ABS na presente descrição). Uma solução aquosa de reação do conjugado anticorpo-fármaco (aproximadamente 2,5 mL) foi aplicada à coluna NAP-25 e, posteriormente, a eluição foi realizada com a solução tampão em uma quantidade definida pelo fabricante, para coletar uma fração de anticorpo. Um processo de purificação por filtração em gel, no qual a fração coletada foi aplicada novamente na coluna NAP-25 e a eluição foi realizada com a solução tampão, foi repetido um total de 2 ou 3 vezes para obter o conjugado anticorpo-fármaco, excluindo ligante de fármaco não conjugado e compostos de baixo peso molecular (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), N-acetil-L-cisteína (NAC) e dimetilsulfóxido). (4)-5 Procedimento comum E: Medição da concentração de anticorpos no conjugado anticorpo-fármaco e número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo
[00194] A concentração de fármaco conjugado no conjugado anticorpo-fármaco pode ser calculada medindo a absorvância UV de uma solução aquosa do conjugado anticorpo-fármaco em dois comprimentos de
100 / 164 onda de 280 nm e 370 nm e, posteriormente, realizando o cálculo mostrado abaixo.
[00195] A absorvância total em qualquer comprimento de onda é igual à soma da absorvância de todas as espécies químicas que absorvem luz que estão presentes em um sistema [aditividade da absorvância]. Portanto, com base na hipótese de que os coeficientes de absorção molar do anticorpo e do fármaco não variam entre antes e após a conjugação entre o anticorpo e o fármaco, a concentração de anticorpos e a concentração de fármaco no conjugado anticorpo-fármaco são representadas pelas seguintes equações. A280 = AD,280 + AA,280 = εD,280CD + εA,280CA Equação (1) A370 = AD,370 + AA,370 = εD,370CD + εA,370CA Equação (2)
[00196] Nesse contexto, A280 representa a absorvância de uma solução aquosa do conjugado anticorpo-fármaco a 280 nm, A370 representa a absorvância de uma solução aquosa do conjugado anticorpo-fármaco a 370 nm, AA,280 representa a absorvância do anticorpo a 280 nm, AA,370 representa a absorvância do anticorpo a 370 nm, AD,280 representa a absorvância de um precursor de conjugado a 280 nm, AD,370 representa a absorvância de um precursor de conjugado a 370 nm, εA,280 representa o coeficiente de absorção molar do anticorpo a 280 nm, εA,370 representa o coeficiente de absorção molar do anticorpo a 370 nm, εD,280 representa o coeficiente de absorção molar de um precursor de conjugado a 280 nm, εD,370 representa o coeficiente de absorção molar de um precursor de conjugado a 370 nm, CA representa a concentração de anticorpo no conjugado anticorpo-fármaco, e CD representa a concentração de fármaco no conjugado anticorpo-fármaco.
[00197] Nesse contexto, em relação a εA,280, εA,370, εD,280, e εD,370, são usados valores preparados preliminarmente (valores estimados com base nos valores de cálculo ou medição obtidos por medição UV do composto). Por exemplo, εA,280 pode ser estimado a partir da sequência de aminoácidos do anticorpo por um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4,
101 / 164 2411-2423). εA,370 é geralmente zero. εD,280 e εD,370 podem ser obtidos de acordo com a lei de Lambert-Beer (absorvância = concentração molar × coeficiente de absorção molar × comprimento do trajeto celular) medindo a absorvância de uma solução na qual o precursor do conjugado usado é dissolvido a uma certa concentração molar. CA e CD podem ser determinados por medição de A280 e A370 de uma solução aquosa do conjugado anticorpo- fármaco e, em seguida, resolvendo as equações simultâneas (1) e (2) por substituição desses valores. Além disso, dividindo CD por CA, o número médio de moléculas de fármaco conjugadas por anticorpo pode ser determinado. (4)-6 Procedimento comum F: Medição do número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo no conjugado anticorpo- fármaco - (2)
[00198] O número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo no conjugado anticorpo-fármaco também pode ser determinado por análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) usando o método a seguir, além do “(4)-5 Procedimento comum E” mencionado acima. A seguir, será descrito o método para medir o número médio de moléculas de fármaco conjugadas por HPLC quando o anticorpo é conjugado ao ligante de fármaco por uma ligação dissulfeto. Um versado na técnica é capaz de medir adequadamente o número médio de moléculas de fármaco conjugadas por HPLC, dependendo da maneira de conexão entre o anticorpo e o ligante de fármaco, com referência a esse método. F-1. Preparação da amostra para análise por HPLC (Redução do conjugado anticorpo-fármaco)
[00199] Uma solução de conjugado anticorpo-fármaco (aproximadamente 1 mg/ mL, 60 µL) é misturada com uma solução aquosa de ditiotreitol (DTT) (100 mM, 15 µL). Ao incubar a mistura a 37°C por 30 minutos, a ligação dissulfeto entre a cadeia leve e a cadeia pesada do
102 / 164 conjugado anticorpo-fármaco é clivada. A amostra resultante é usada na análise por HPLC. F-2. Análise por HPLC
[00200] A análise por HPLC é realizada nas seguintes condições de medição. Sistema de HPLC: sistema de HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies, Inc.) Detector: Espectrômetro de absorção ultravioleta (comprimento de onda de medição: 280 nm Coluna: ACQUITY UPLC BEH Phenyl (2,1 × 50 mm, 1,7 µm, 130 angstroms; Waters Corp., P/N 186002884) Temperatura da coluna: 80°C Fase móvel A: Solução aquosa contendo 0,10% de ácido trifluoroacético (TFA) e 15% de 2-propanol Fase móvel B: Solução de acetonitrila contendo 0,075% de TFA e 15% de 2-propanol Programa de gradiente: 14%-36% (0 min-15 min), 36%-80% (15 min-17 min), 80%-14% (17 min-17,01 min.) e 14% (17,01 min-25 min) Injeção de amostra: 10 µL F-3. Análise de dados
[00201] F-3-1. Em comparação com as cadeias leves (L0) e pesadas (H0) de anticorpos não conjugados, uma cadeia leve ligada à(s) molécula(s) de fármaco (cadeia leve ligada à(s) molécula(s) de fármaco i: Li) e uma cadeia pesada ligada à(s) molécula(s) de fármaco (cadeia pesada ligada à(s) molécula(s) de fármaco i: Hi) apresentam maior hidrofobicidade em proporção ao número de moléculas de fármaco conjugadas e, portanto, têm um maior tempo de retenção. Portanto, essas cadeias são eluídas na ordem de, por exemplo, L0 e L1 ou H0, H1, H2 e H3. Os picos de detecção podem ser atribuídos a qualquer um dos L0, L1, H0, H1, H2 e H3 pela comparação dos
103 / 164 tempos de retenção com L0 e H0. O número de moléculas de fármaco conjugadas pode ser definido por um versado na técnica, mas é preferivelmente L0, L1, H0, H1, H2 e H3.
[00202] F-3-2. Uma vez que o ligante de fármaco tem absorção de UV, os valores da área de pico são corrigidos em resposta ao número de moléculas de ligante de fármaco conjugadas de acordo com a seguinte expressão usando os coeficientes de absorção molar da cadeia leve ou cadeia pesada e o ligante de fármaco. [Expressão 2] Valor corrigido da área de pico da cadeia leve ligada à(s) molécula(s) de fármaco i Área de pico Coeficiente de absorção molar da cadeia leve Coeficiente de absorção molar da cadeia leve + O número de moléculas de fármaco conjugadas (i) × Coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco [Expressão 3] Valor corrigido da área de pico da cadeia pesada ligada à(s) molécula(s) de fármaco i Área de pico Coeficiente de absorção molar da cadeia pesada Coeficiente de absorção molar da cadeia pesada + O número de moléculas de fármaco conjugadas (i) × Coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco
[00203] Nesse contexto, um valor estimado a partir da sequência de aminoácidos da cadeia leve ou cadeia pesada de cada anticorpo por um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) pode ser usado como coeficiente de absorção molar (280 nm) da cadeia leve ou cadeia pesada do anticorpo. No caso de H01L02, um coeficiente de absorção molar de 31710 e um coeficiente de absorção molar de 79990 foram usados como valores estimados para a cadeia leve e cadeia pesada, respectivamente, de acordo com a sequência de aminoácidos do anticorpo. O coeficiente de absorção molar realmente medido (280 nm) de um composto no qual o grupo maleimida foi convertido em tioéter de succinimida pela reação de cada ligante de fármaco com mercaptoetanol ou N-acetilcisteína foi usado como
104 / 164 coeficiente de absorção molar (280 nm) do ligante de fármaco. O comprimento de onda para medição da absorvância pode ser ajustado adequadamente por um versado na técnica, mas é preferivelmente um comprimento de onda no qual o pico do anticorpo pode ser medido e, mais preferivelmente, 280 nm.
[00204] F-3-3. A razão da área de pico (%) de cada cadeia é calculada para o total dos valores corrigidos das áreas de pico de acordo com a seguinte expressão. [Expressão 4] Razão da área de pico da cadeia leve ligada à(s) molécula(s) de fármaco i Razão da área de pico da cadeia pesada ligada à(s) molécula(s) de fármaco i ALi e AHi: Valores corrigidos das áreas de pico de Li e Hi, respectivamente
[00205] F-3-4. O número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo no conjugado anticorpo-fármaco é calculado de acordo com a seguinte expressão. Número médio de moléculas de fármaco conjugadas = (razão da área de pico L0 x 0 + razão da área de pico L1 x 1 + razão da área de pico H0 x 0 + razão da área de pico H1 x 1 + razão da área de pico H2 x 2 + razão da área de pico H3 x 3) / 100 x 2
[00206] Deve-se notar que, a fim de garantir a quantidade do conjugado anticorpo-fármaco, uma pluralidade de conjugados anticorpo- fármaco com quase o mesmo número médio de moléculas de fármaco conjugadas (por exemplo, da ordem de ±1), que foram produzidos em condições similares, pode ser misturada para preparar um novo lote. Nesse caso, o número médio de moléculas de fármaco do novo lote fica entre o número médio de moléculas de fármaco antes da mistura.
[00207] Um exemplo específico do conjugado anticorpo-fármaco da
105 / 164 presente invenção pode incluir um conjugado anticorpo-fármaco com uma estrutura representada pela seguinte fórmula: [Fórmula 9] ou a seguinte fórmula: [Fórmula 10]
[00208] Nesse contexto, AB representa o anticorpo anti-CDH6 descrito na presente descrição, e o anticorpo é conjugado ao ligante de fármaco por meio de um grupo sulfidrila resultante do anticorpo. Nesse contexto, n tem o mesmo significado que o da chamada DAR (razão de fármaco para anticorpo) e representa uma razão de fármaco para anticorpo por anticorpo. Especificamente, n representa o número de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo, que é um valor numérico definido e indicado como um valor médio, isto é, o número médio de moléculas de fármaco conjugadas. No caso do conjugado anticorpo-fármaco representado por [Fórmula 9] ou [Fórmula 10] da presente invenção, n pode ser de 2 a 8 e é
106 / 164 preferivelmente de 5 a 8, mais preferivelmente de 7 a 8 e ainda mais preferivelmente 8, em medição pelo procedimento comum F.
[00209] Um exemplo do conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção pode incluir um conjugado anticorpo-fármaco com uma estrutura representada pela fórmula [Fórmula 9] ou [Fórmula 10] descrita acima, em que o anticorpo representado por AB compreende qualquer anticorpo selecionado dentre o grupo que consiste nos seguintes anticorpos (a) a (g), ou um fragmento funcional do anticorpo, ou um sal farmacologicamente aceitável do conjugado anticorpo-fármaco: (a) um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 69; (b) um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 73; (c) um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 77; (d) um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de
107 / 164 aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 69; (e) um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 73; (f) um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 77; e (g) qualquer anticorpo selecionado do grupo que consiste nos anticorpos (a) a (f), em que a cadeia pesada ou a cadeia leve compreende uma ou duas ou mais modificações selecionadas do grupo que consiste em modificações pós-tradução tipificadas por glicosilação ligada a N, glicosilação ligada a O, processamento N-terminal, processamento C- terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, oxidação de metionina, adição de um resíduo de metionina ao terminal N, amidação de um resíduo de prolina e conversão de glutamina N-terminal ou ácido glutâmico N-terminal em ácido piroglutâmico e uma deleção de um ou dois aminoácidos no terminal carboxila.
4. Medicamento
[00210] Como o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção ou o fragmento funcional do anticorpo descrito na seção acima “2. Produção de
108 / 164 anticorpo anti-CDH6” e nos Exemplos se liga ao CDH6 na superfície das células tumorais e tem atividade de internalização, ele pode ser usado como um medicamento e, em particular, como um agente terapêutico para câncer, como tumor de células renais ou tumor de ovário, por exemplo, carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma de células renais papilares, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso ovariano, câncer de tireoide, câncer do ducto biliar, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas ou câncer de pulmão de células não pequenas), glioblastoma, mesotelioma, câncer uterino, câncer de pâncreas, tumor de Wilms ou neuroblastoma, isoladamente ou em combinação com um fármaco adicional.
[00211] Além disso, o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção ou o fragmento funcional do anticorpo pode ser usado na detecção de células que expressam CDH6.
[00212] Além disso, uma vez que o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção ou o fragmento funcional do anticorpo tem atividade de internalização, ele pode ser aplicado como o anticorpo em um conjugado anticorpo-fármaco.
[00213] Quando um fármaco com atividade antitumoral, como atividade citotóxica, é usado como fármaco, o conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente invenção descrito na seção acima “3. Conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6” e nos Exemplos é um conjugado do anticorpo anti-CDH6 e/ou do fragmento funcional do anticorpo com atividade de internalização e do fármaco com atividade antitumoral, como atividade citotóxica. Uma vez que esse conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 apresenta atividade antitumoral contra células cancerígenas que expressam CDH6, ele pode ser usado como medicamento e, em particular, como agente terapêutico e/ou agente profilático para câncer.
[00214] O conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente
109 / 164 invenção pode absorver a umidade ou ter água de adsorção, por exemplo, para se transformar em um hidrato quando deixado no ar ou submetido a procedimentos de recristalização ou purificação. Tal composto ou um sal farmacologicamente aceitável contendo água também está incluído na presente invenção.
[00215] Quando o conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente invenção tem um grupo básico tal como um grupo amino, pode formar um sal de adição de ácido farmacologicamente aceitável, se desejado. Exemplos desse sal de adição de ácido podem incluir: hidro-haletos, tais como fluoridrato, cloridrato, bromidrato e iodidrato; sais de ácidos inorgânicos, tais como nitrato, perclorato, sulfato e fosfato; alcanossulfonatos inferiores, tais como metanossulfonato, trifluorometanossulfonato e etanossulfonato; arilsulfonatos tais como benzenossulfonato e p- toluenossulfonato; sais de ácidos orgânicos como formiato, acetato, trifluoroacetato, malato, fumarato, succinato, citrato, tartarato, oxalato e maleato; e sais de aminoácidos, como sal de ornitina, glutamato e aspartato.
[00216] Quando o conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente invenção tem um grupo ácido tal como um grupo carbóxi, pode formar um sal de adição de base farmacologicamente aceitável, se desejado. Exemplos desse sal de adição de base podem incluir: sais de metais alcalinos, como um sal de sódio, um sal de potássio e sal de lítio; sais de metais alcalinoterrosos, como um sal de cálcio e um sal de magnésio; sais inorgânicos tais como um sal de amônio; e sais de amina orgânica, como um sal de dibenzilamina, um sal de morfolina, um sal de éster alquílico de fenilglicina, um sal de etilenodiamina, um sal de N-metilglucamina, um sal de dietilamina, um sal de trietilamina, um sal de ciclo-hexilamina, um sal de diciclo-hexilamina, um sal de N,N’-dibenziletilenodiamina, um sal de dietanolamina, um sal de N-benzil-N-(2-feniletoxi)amina, um sal de piperazina, sal de tetrametilamônio e um sal de
110 / 164 tris(hidroximetil)aminometano.
[00217] A presente invenção também pode incluir um conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 no qual um ou mais átomos que constituem o conjugado anticorpo-fármaco são substituídos por isótopos dos átomos. Existem dois tipos de isótopos: radioisótopos e isótopos estáveis. Exemplos do isótopo podem incluir isotipos de hidrogênio (2H e 3H), isótopos de carbono (11C, 13C e 14C), isótopos de nitrogênio (13N e 15N), isótopos de oxigênio (15O, 17O e 18O) e isótopos de flúor (18F). Uma composição compreendendo o conjugado anticorpo-fármaco marcado com esse isótopo é útil como, por exemplo, um agente terapêutico, um agente profilático, um reagente de pesquisa, um reagente de ensaio, um agente de diagnóstico e um agente de formação de imagem para diagnóstico in vivo. Cada conjugado anticorpo-fármaco marcado com um isótopo e misturas de conjugados anticorpo-fármaco marcados com um isótopo em qualquer razão dada estão incluídos na presente invenção. O conjugado anticorpo-fármaco marcado com um isótopo pode ser produzido, por exemplo, usando um material de partida marcado com um isótopo, em vez de um material de partida para o método de produção da presente invenção mencionado mais adiante, de acordo com um método conhecido na técnica.
[00218] A citotoxicidade in vitro pode ser medida com base na atividade de suprimir as respostas proliferativas das células, por exemplo. Por exemplo, é cultivada uma linhagem de células cancerígenas que superexpressam CDH6 e o conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 é adicionado em diferentes concentrações ao sistema de cultura. Posteriormente, sua atividade supressora contra a formação de foco, a formação de colônias e o crescimento de esferoides pode ser medida. Nesse contexto, por exemplo, usando uma linhagem de células cancerígenas derivada de tumor de células renais ou tumor de ovário, a atividade de inibição do crescimento celular contra tumor de células renais ou tumor de
111 / 164 ovário pode ser examinada.
[00219] Os efeitos terapêuticos in vivo no câncer em um animal experimental podem ser medidos, por exemplo, através da administração do conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 a um camundongo nu, no qual uma linhagem de células tumorais que expressam CDH6 altamente foi inoculada e da medição de uma mudança nas células cancerígenas. Nesse contexto, por exemplo, usando um modelo animal derivado de um camundongo imunodeficiente pela inoculação de células derivadas de carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma de células renais papilares, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso ovariano ou câncer de tireoide, podem ser medidos efeitos terapêuticos no carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma de células renais papilares, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso ovariano ou câncer de tireoide.
[00220] O tipo de câncer ao qual o conjugado fármaco-anticorpo anti- CDH6 da presente invenção é aplicado não é particularmente limitado desde que o câncer expresse CDH6 nas células cancerígenas a serem tratadas. Exemplos disso podem incluir carcinoma de células renais (por exemplo, carcinoma de células renais claras ou carcinoma de células renais papilares), câncer de ovário, adenocarcinoma seroso ovariano, câncer de tireoide, câncer de ducto biliar, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas ou câncer de pulmão de células não pequenas), glioblastoma, mesotelioma, câncer uterino, câncer de pâncreas, tumor de Wilms e neuroblastoma, embora o câncer não se limite aos mesmos desde que o câncer expresse CDH6. Exemplos mais preferidos de câncer podem incluir carcinoma de células renais (por exemplo, carcinoma de células renais claras e carcinoma de células renais papilares) e câncer de ovário.
[00221] O conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode preferivelmente ser administrado a um mamífero, e mais
112 / 164 preferivelmente a um humano.
[00222] Uma substância usada em uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode ser adequadamente selecionada a partir de aditivos farmacêuticos e outros geralmente usados nesse campo, em termos da dose aplicada ou da concentração aplicada, e depois usada.
[00223] O conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais componentes farmaceuticamente compatíveis. Por exemplo, a composição farmacêutica compreende tipicamente um ou mais carreadores farmacêuticos (por exemplo, líquidos esterilizados (por exemplo, água e óleo (incluindo óleo de petróleo e óleo de origem animal, origem vegetal ou origem sintética) (por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral e óleo de gergelim))). A água é um carreador mais típico quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Uma solução salina aquosa, uma solução aquosa de dextrose e uma solução aquosa de glicerol também podem ser usadas como um carreador líquido, em particular, para uma solução de injeção. Carreadores farmacêuticos adequados são conhecidos na técnica. Se desejado, a composição também pode compreender uma quantidade vestigial de um agente hidratante, um agente emulsificante ou um agente tamponante de pH. Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. A prescrição corresponde a um modo de administração.
[00224] São conhecidos vários sistemas de dispensação e podem ser usados para administrar o conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 da presente invenção. Exemplos da via de administração podem incluir, mas não estão limitados a vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea. A administração pode ser feita por injeção ou injeção de bolo,
113 / 164 por exemplo. De acordo com uma modalidade preferida específica, a administração do conjugado anticorpo-fármaco descrito acima é realizada por injeção. A administração parenteral é uma via de administração preferida.
[00225] De acordo com uma modalidade representativa, a composição farmacêutica é prescrita, como uma composição farmacêutica adequada para administração intravenosa a um humano, de acordo com procedimentos convencionais. A composição para administração intravenosa é tipicamente uma solução em uma solução tampão aquosa estéril e isotônica. Se necessário, o medicamento também pode conter um agente solubilizante e um anestésico local para aliviar a dor na área de injeção (por exemplo, lidocaína). Em geral, os ingredientes descritos acima são fornecidos, separadamente ou em conjunto em uma mistura na forma de dosagem unitária, como um pó liofilizado ou um concentrado anidro contido em um recipiente que é obtido vedando, por exemplo, uma ampola ou um sachê indicando a quantidade do agente ativo. Quando o medicamento deve ser administrado por injeção, ele pode ser administrado usando, por exemplo, um frasco de injeção contendo água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Quando o medicamento deve ser administrado por injeção, uma ampola de água ou solução salina estéril para injeção pode ser fornecida de modo que os ingredientes descritos acima sejam misturados um com o outro antes da administração.
[00226] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica compreendendo apenas o conjugado fármaco- anticorpo anti-CDH6 do presente pedido, ou pode ser uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 e pelo menos um outro agente terapêutico para câncer. O conjugado fármaco- anticorpo anti-CDH6 da presente invenção também pode ser administrado em conjunto com um agente terapêutico adicional para o câncer e, desse modo, pode intensificar um efeito anticâncer. O agente anticâncer adicional usado para esse fim pode ser administrado a um indivíduo, simultaneamente,
114 / 164 separadamente ou continuamente, junto com o conjugado anticorpo-fármaco. Caso contrário, o agente anticâncer adicional e o conjugado fármaco- anticorpo anti-CDH6 podem ser administrados ao indivíduo em intervalos de administração diferentes. Exemplos desse agente terapêutico para câncer podem incluir inibidores de tirosina quinase, incluindo imatinibe, sunitinibe e regorafenibe, inibidores de CDK4/6, incluindo palbociclibe, inibidores de HSP90 incluindo TAS-116, inibidores de MEK incluindo MEK162, e inibidores de ponto de verificação imune, incluindo nivolumabe, pembrolizumabe e ipilimumabe, embora o agente terapêutico para câncer não esteja limitado aos mesmos desde que o fármaco tenha atividade antitumoral.
[00227] Tal composição farmacêutica pode ser preparada como uma formulação com uma composição selecionada e uma pureza necessária na forma de uma formulação liofilizada ou uma formulação líquida. A composição farmacêutica preparada como uma formulação liofilizada pode ser uma formulação contendo um aditivo farmacêutico apropriado usado nesse campo. Da mesma forma, a formulação líquida pode ser preparada de modo que a formulação líquida contenha vários aditivos farmacêuticos usados nesse campo.
[00228] A composição e concentração da composição farmacêutica também variam dependendo do método de administração. No que se refere à afinidade do conjugado fármaco-anticorpo anti-CDH6 compreendido na composição farmacêutica da presente invenção para o antígeno, isto é, a constante de dissociação (valor Kd) do conjugado fármaco-anticorpo anti- CDH6 para o antígeno, conforme a afinidade aumenta (isto é, o valor de Kd é baixo), a composição farmacêutica pode exercer efeitos medicinais, mesmo se a dose aplicada for diminuída. Consequentemente, a dose aplicada do conjugado anticorpo-fármaco também pode ser determinada definindo a dose aplicada com base no estado da afinidade do conjugado anticorpo-fármaco para o antígeno. Quando o conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção
115 / 164 é administrado a um humano, ele pode ser administrado em uma dose de, por exemplo, aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg uma vez ou várias vezes em intervalos de 1 a 180 dias. Pode ser administrado preferivelmente na dose de 0,1 a 50 mg/kg e mais preferivelmente 1 a 50 mg/kg, 1 a 30 mg/kg, 1 a 20 mg/kg, 1 a 15 mg/kg, 2 a 50 mg/kg, 2 a 30 mg/kg, 2 a 20 mg/kg ou 2 a 15 mg/kg várias vezes em intervalos de 1 a 4 semanas, preferivelmente 2 a 3 semanas. Exemplos
[00229] Daqui em diante, a presente invenção será descrita especificamente nos seguintes exemplos. No entanto, esses exemplos não se destinam a limitar o escopo da presente invenção. Além disso, esses exemplos não devem ser interpretados de maneira limitada por qualquer meio. Deve-se notar que, nos exemplos a seguir, a menos que especificado de outra forma, operações individuais relacionadas à manipulação genética foram realizadas de acordo com o método descrito em “Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., publicado pela Cold Spring Harbor Laboratory Press em 1989) ou outros métodos descritos em manuais experimentais usados por versados na técnica ou, quando reagentes ou kits comercialmente disponíveis foram usados, os exemplos foram realizados de acordo com as instruções incluídas nos produtos comercialmente disponíveis. Na presente descrição, reagentes, solventes e materiais de partida estão prontamente disponíveis em fontes disponíveis comercialmente, a menos que especificado de outra forma. [Exemplo 1: Obtenção de anticorpo anti-CDH6 humano de rato com atividade de internalização] 1)-1 Construção de vetores de expressão de CDH6 de humanos, camundongos, ratos e macacos cinomolgos
[00230] Usando um vetor de expressão de cDNA que codifica a proteína CDH6 humana (NP_004923) (OriGene Technologies Inc.,
116 / 164 RC217889), o cDNA foi incorporado em um vetor para expressão em mamíferos de acordo com um método conhecido por um versado na técnica para produzir vetor de expressão de CDH6 humano pcDNA3.1-hCDH6. A sequência de aminoácidos do ORF (quadro de leitura aberto) da CDH6 humana é mostrada na SEQ ID NO: 1.
[00231] Usando um vetor de expressão de cDNA que codifica a proteína CDH6 de camundongo (NP_031692) (OriGene Technologies Inc., MC221619), o cDNA foi incorporado em um vetor para expressão em mamíferos de acordo com um método conhecido por um versado na técnica para produzir os vetores de expressão de CDH6 de camundongo pcDNA3.1- mCDH6 e p3xFLAG-CMV-9-mCDH6. A sequência de aminoácidos do ORF da CDH6 de camundongo é mostrada na SEQ ID NO: 7.
[00232] Usando cada fração de cDNA do vetor de expressão de cDNA que codifica a proteína CDH6 de rato (NP_037059) (OriGene Technologies Inc., RN211850), o cDNA foi incorporado em um vetor para expressão em mamíferos de acordo com um método conhecido por um versado na técnica para produzir os vetores de expressão de CDH6 de rato pcDNA3.1-rCDH6 e p3xFLAG-CMV-9-rCDH6. A sequência de aminoácidos do ORF da CDH6 de rato é mostrada na SEQ ID NO: 8.
[00233] O cDNA que codifica a proteína CDH6 de macaco cinomolgo foi clonado com cDNA sintetizado a partir do RNA total do rim do macaco cinomolgo como um modelo usando o iniciador 1 (5’- CACCATGAGAACTTACCGCTACTTCTTGCTGCTC-3’) (SEQ ID NO: 85) e o iniciador 2 (5’-TTAGGAGTCTTTGTCACTGTCCACTCCTCC-3’) (SEQ ID NO: 86). Foi confirmado que a sequência obtida correspondia à região extracelular do CDH6 do macaco cinomolgo (NCBI, XP_005556691.1). Também foi confirmado que a sequência correspondia à sequência completa do CDH6 do macaco cinomolgo (EHH54180.1) registrada no EMBL. O cDNA foi incorporado em um vetor para expressão
117 / 164 em mamíferos de acordo com um método conhecido por um versado na técnica para produzir o vetor de expressão de CDH6 de macaco cinomolgo pcDNA3.1-cynoCDH6. A sequência de aminoácidos do ORF da CDH6 de macaco cinomolgo é mostrada na SEQ ID NO: 9.
[00234] O kit EndoFree Plasmid Giga (Qiagen N.V.) foi usado para produção em massa do DNA plasmídico produzido. 1)-2 Imunização
[00235] Para imunização, foram usados ratos fêmeas WKY/Izm (Japan SLC, Inc.). Primeiro, os membros inferiores de cada rato foram pré-tratados com hialuronidase (Sigma-Aldrich Co. LLC) e, posteriormente, o vetor de expressão de CDH6 humano pcDNA3.1-hCDH6 produzido no Exemplo 1)-1 foi injetado intramuscularmente nos mesmos locais. Posteriormente, utilizando ECM830 (BTX), a eletroporação in vivo foi realizada nos mesmos locais, usando um eletrodo de duas agulhas. Aproximadamente uma vez a cada duas semanas, a mesma eletroporação in vivo foi repetida e, posteriormente, os linfonodos ou o baço foram coletados do rato e depois usados na produção de hibridomas. 1)-3 Produção de hibridomas
[00236] As células de linfonodos ou do baço foram fundidas com células SP2/0-ag14 de mieloma de camundongo (ATCC, nº CRL-1 581) de acordo com a fusão celular elétrica, usando uma unidade de fusão celular LF301 (BEX Co., Ltd.), e as células foram então suspensas e diluídas com meio de seleção ClonaCell-HY D (StemCell Technologies Inc.) e depois cultivadas sob condições de 37°C e 5% de CO2. Colônias individuais de hibridoma que apareceram no meio de cultura foram coletadas como hibridomas monoclonais, depois suspensas no meio de seleção ClonaCell-HY E (StemCell Technologies Inc.) e depois cultivadas em condições de 37°C e 5% de CO2. Após proliferação moderada de células, foram produzidos estoques congelados de células de hibridoma individuais, enquanto o
118 / 164 sobrenadante da cultura de hibridoma obtido foi usado para rastrear hibridomas produtores de anticorpos anti-CDH6 humano. 1)-4 Rastreio de hibridoma produtor de anticorpos de acordo com o método Cell-ELISA 1)-4-1 Preparação de células que expressam genes de antígeno para uso em Cell-ELISA
[00237] As células 293α (uma linhagem celular de expressão estável derivada das células HEK293 que expressam integrina αv e integrina β3) foram preparadas a 5 x 105 células/mL em meio DMEM suplementado com 10% de FBS. De acordo com os procedimentos de transdução para o uso de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.), o DNA de pcDNA3.1- hCDH6 ou pcDNA3.1-cynoCDH6 ou pcDNA3.1 como controle negativo foi introduzido nas células 293α, e as células foram dispensadas em uma quantidade de 100 µL/poço em uma placa de 96 poços (Corning Inc.). Depois disso, as células foram cultivadas em condições de 37°C e 5% de CO2 em meio DMEM suplementado com 10% de FBS por 24 a 27 horas. As células transfectadas obtidas foram usadas para Cell-ELISA em um estado adesivo. 1)-4-2 Cell-ELISA
[00238] O sobrenadante da cultura das células 293α transfectadas com o vetor de expressão preparado no Exemplo 1)-4-1 foi removido e o sobrenadante da cultura de cada hibridoma foi então adicionado às células 293α transfectadas com pcDNA3.1-hCDH6 ou pcDNA3.1-cynoCDH6 ou pcDNA3.1. As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células dos poços foram lavadas uma vez com PBS (+) suplementado com 5% de FBS e, em seguida, anticorpo anti-IgG-Peroxidase de rato produzido em coelho (Sigma-Aldrich Co. LLC) que foi diluído 500 vezes com PBS (+) suplementado com 5% de FBS foi adicionado aos poços. As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células nos poços foram lavadas três vezes com PBS (+) suplementado com 5% de FBS e, em seguida,
119 / 164 solução de coloração OPD (que foi preparada dissolvendo o dicloridrato de o- fenilenodiamina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e H2O2 em uma solução de OPD (citrato trissódico 0,05 M, hidrogenofosfato dissódico 0,1 M 12-água; pH 4,5), de modo que as substâncias se tornassem 0,4 mg/ml e 0,6% (v/v), respectivamente, foi adicionado em uma quantidade de 100 µL/poço aos poços. Uma reação de coloração foi realizada com agitação ocasional. Posteriormente, foi adicionado HCl 1 M à placa (100 µL/poço) para finalizar a reação de coloração, seguido pela medição da absorvância a 490 nm usando um leitor de placas (ENVISION: PerkinElmer, Inc.). Os hibridomas que produziram um sobrenadante da cultura apresentando maior absorvância nas células 293α transfectadas com o vetor de expressão pcDNA3.1-hCDH6 ou pcDNA3.1-cynoCDH6 do que nas células 293α transfectadas com o controle pcDNA3.1 foram selecionados como hibridomas que produzem anticorpos que se ligam a CDH6 humano e CDH6 de macaco cinomolgo. 1)-5 Triagem seletiva para ligação de anticorpos a CDH6 de macaco cinomolgo de acordo com citometria de fluxo 1)-5-1 Preparação de células que expressam genes de antígeno para uso em análise por citometria de fluxo
[00239] As células 293T foram semeadas em um balão de 225 cm2 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) a 5 × 104 células/cm2, e as células foram então cultivadas durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2 em meio DMEM suplementado com 10% de FBS. O pcDNA3.1-cynoCDH6 ou pcDNA3.1 como controle negativo foi introduzido nas células 293T usando Lipofectamine 2000, e as células foram adicionalmente cultivadas durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2. As células 293T transfectadas com cada vetor foram tratadas com TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Corp.) e as células foram lavadas com DMEM suplementado com 10% de FBS e depois suspensas em PBS suplementado com 5% de FBS. A suspensão celular obtida foi usada na análise por citometria de fluxo.
120 / 164 1)-5-2 Análise por citometria de fluxo
[00240] A especificidade de ligação ao CDH6 de macaco cinomolgo de um anticorpo produzido a partir de hibridomas produtores de anticorpo de ligação a CDH6 humano e CDH6 de macaco cinomolgo que foram selecionados por Cell-ELISA no Exemplo 1)-4 foi adicionalmente confirmada por citometria de fluxo. A suspensão das células 293T de expressão transitória preparadas no Exemplo 1)-5-1 foi centrifugada e o sobrenadante foi então removido. Depois disso, as células foram suspensas pela adição do sobrenadante da cultura de cada hibridoma. As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS e, posteriormente, as células foram suspensas pela adição de conjugado anti-IgG FITC de rato (Sigma-Aldrich Co. LLC) que foi diluído 500 vezes com PBS suplementado com 5% de FBS. As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS e, em seguida, ressuspensas em PBS suplementado com 5% de FBS e 2 µg/ml de 7- aminoactinomicina D (Molecular Probes, Inc.), seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Os dados foram analisados usando FlowJo (Tree Star, Inc.). Depois que as células mortas foram removidas da análise através do bloqueio de células positivas para 7- aminoactinomicina D, foi gerado um histograma da intensidade de fluorescência de FITC das células vivas. Os hibridomas que produzem anticorpos que se ligam especificamente ao CDH6 do macaco cinomolgo expressos na superfície da membrana celular foram selecionados com base nos resultados em que o histograma do anticorpo mudou para o lado de forte intensidade de fluorescência nas células 293T transfectadas com pcDNA3.1- cynoCDH6 em comparação com as células 293T transfectadas com o controle pcDNA3.1. 1)-6 Determinação do isotipo do anticorpo monoclonal de rato
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[00241] Os clones rG019, rG055, rG056 e rG061 sugeridos para se ligarem específica e fortemente a CDH6 humano e CDH6 de macaco foram selecionados dentre os hibridomas produtores de anticorpo anti-CDH6 de rato selecionados no Exemplo 1)-5, e o isotipo de cada anticorpo foi identificado. A subclasse da cadeia pesada e o tipo de cadeia leve do anticorpo foram determinados usando um KIT DE TESTE DE ISOTIPAGEM DE ANTICORPO MONOCLONAL DE RATO (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Como resultado, foi confirmado que todos esses 4 clones rG019, rG055, rG056 e rG061 tinham uma cadeia pesada da subclasse IgG2b e uma cadeia leve do tipo cadeia κ. 1)-7 Preparação de anticorpo anti-CDH6 humano de rato 1)-7-1 Produção de sobrenadante de cultura
[00242] Os anticorpos monoclonais anti-CDH6 humano de rato foram purificados a partir dos sobrenadantes da cultura de hibridoma. Primeiro, o volume de cada hibridoma produtor de anticorpo monoclonal anti-CDH6 de rato foi suficientemente aumentado com o Meio de Seleção ClonaCell-HY E (StemCell Technologies Inc.) e, posteriormente, o meio foi trocado com Hybridoma SFM (Thermo Fisher Scientific Corp.) ao qual foram adicionados 20% de FBS de IgG Ultra Baixa (Thermo Fisher Scientific Corp.). Depois disso, o hibridoma foi cultivado por 4 a 5 dias. O sobrenadante da cultura resultante foi colhido e a matéria insolúvel foi removida por passagem através de um filtro de 0,8 µm e através de um filtro de 0,2 µm. 1)-7-2 Purificação de anticorpo anti-CDH6 de rato
[00243] Um anticorpo (anticorpo anti-CDH6 de rato (rG019, rG055, rG056 ou rG061)) foi purificado a partir do sobrenadante da cultura de hibridomas preparado no Exemplo 1)-7-1 de acordo com a cromatografia de afinidade com Proteína G. O anticorpo foi adsorvido em uma coluna de Proteína G (GE Healthcare Biosciences Corp.), a coluna foi então lavada com PBS e o anticorpo foi então eluído com uma solução aquosa de glicina/HCl
122 / 164 0,1 M (pH 2,7). Tris-HCl 1 M (pH 9,0) foi adicionado ao eluato, de modo que o pH foi ajustado para pH 7,0 a 7,5. Posteriormente, usando o dispositivo de filtro centrífugo UF VIVASPIN20 (limite de peso molecular: UF30K, Sartorius Inc.), o tampão foi substituído por HBSor (histidina 25 mM/sorbitol a 5%, pH 6,0), enquanto o anticorpo estava concentrado, de modo que a concentração do anticorpo foi ajustada para 1 mg/mL. Finalmente, o anticorpo foi filtrado através de um filtro Minisart-Plus (Sartorius Inc.) para obter uma amostra purificada. [Exemplo 2: Avaliação in vitro do anticorpo anti-CDH6 de rato] 2)-1 Avaliação da capacidade de ligação do anticorpo anti-CDH6 de rato por citometria de fluxo
[00244] A atividade de ligação a CDH6 humano do anticorpo anti- CDH6 de rato produzido no Exemplo 1)-7 foi avaliada por citometria de fluxo. Usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.), o pcDNA3.1-hCDH6 produzido no Exemplo 1)-1 foi transitoriamente introduzido nas células 293T (ATCC). As células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2 e, em seguida, uma suspensão de células foi preparada. A suspensão das células 293T transfectadas foi centrifugada e o sobrenadante foi então removido. Posteriormente, as células foram suspensas pela adição de cada um dos 4 anticorpos monoclonais anti- CDH6 de rato (clone nº: rG019, rG055, rG056 e rG061), que foram preparados no Exemplo 1)-7 ou controle de IgG de rato (P&D Systems, Inc.) (concentração final: 10 ng/mL). As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS e depois suspensas pela adição de anticorpo anti-IgG (molécula inteira)-FITC de rato produzido em coelho (Sigma-Aldrich Co. LLC) que foi diluído 50 vezes com PBS suplementado com 5% de FBS. As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS, seguido pela
123 / 164 detecção usando um citômetro de fluxo (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Os dados foram analisados usando FlowJo (Tree Star, Inc.). Os resultados são mostrados na Figura 1. No histograma da Figura 1, a abcissa representa a intensidade de fluorescência de FITC, indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa uma contagem de células. O histograma sombreado mostra que foram usadas células 293T de controle negativo não transfectadas com hCDH6, e o histograma de linha sólida aberto mostra que foram usadas células 293T transfectadas com hCDH6. Como visto, a intensidade da fluorescência foi intensificada pela ligação do anticorpo ao hCDH6 na superfície celular. O controle de IgG de rato não se liga a nenhuma das células. Como resultado, foi confirmado que os 4 anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato produzidos se ligam a células 293T transfectadas com pcDNA3.1-hCDH6. 2)-2 Análise do local de ligação a CDH6 do anticorpo anti-CDH6 de rato por citometria de fluxo 2)-2-1 Construção do vetor de expressão para cada mutante de deleção de domínio de CDH6 humano
[00245] A região extracelular de comprimento total do CDH6 humano tem cinco domínios extracelulares, EC1 (SEQ ID NO: 2), EC2 (SEQ ID NO: 3), EC3 (SEQ ID NO: 4), EC4 (SEQ ID NO: 5), e EC5 (SEQ ID NO: 6). Um gene a ser expresso de modo que cada um dos cinco domínios EC possa ser excluído do CDH6 humano de comprimento total foi sintetizado por GeneArt e incorporado nos vetores p3xFLAG-CMV-9 para expressão em mamíferos (Sigma-Aldrich Co. LLC) de acordo com um método conhecido por um versado na técnica, a fim de produzir um vetor de expressão para cada mutante de deleção de domínio sem qualquer um de EC1 a EC5. 2)-2-2 Análise de epítopo do anticorpo anti-CDH6 de rato por citometria de fluxo usando mutante de deleção de domínio
[00246] Os epítopos aos quais os anticorpos anti-CDH6 humano de
124 / 164 rato se ligaram foram identificados por análise por citometria de fluxo usando uma linhagem de células 293α transfectada com cada vetor de deleção do domínio EC.
Usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.), cada vetor de expressão mutante de deleção de domínio produzido no Exemplo 2)-2-1, ou pcDNA3.1-hCDH6 para a expressão de CDH6 humano de comprimento total foi transitoriamente introduzido em uma linhagem de células 293α, que era uma linhagem celular derivada de células HEK293 por transfecção estável com vetores de expressão de integrina αv e integrina β3. As células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2 e, em seguida, uma suspensão de células foi preparada.
A suspensão das células 293α transfectadas foi centrifugada e um sobrenadante foi então removido.
Posteriormente, as células foram suspensas pela adição de cada um dos 4 anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato (clone nº: rG019, rG055, rG056 e rG061), que foram preparados no Exemplo 1)-7 ou controle de IgG de rato (P&D Systems, Inc.) (concentração final: 20 nM). As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora.
As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS e depois suspensas pela adição de anticorpo anti-IgG (molécula inteira)-FITC de rato produzido em coelho (Sigma-Aldrich Co.
LLC) que foi diluído 50 vezes com PBS suplementado com 5% de FBS.
As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora.
As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados usando FlowJo (Tree Star, Inc.). Os resultados são mostrados nas Figuras 2-1 a 2-6. Nos histogramas das Figuras 2-1 a 2-6, a abcissa representa a intensidade de fluorescência de FITC, indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa uma contagem de células.
O histograma sombreado mostra que foram usadas células 293α não transfectadas de controle negativo e o histograma de linha sólida aberto mostra que foram usadas células 293 que expressam hCDH6 de
125 / 164 comprimento total ou cada mutante de deleção de domínio EC. A intensidade da fluorescência é intensificada quando o anticorpo se liga ao hCDH6 de comprimento total ou a cada mutante de deleção do domínio EC na superfície das células. O controle de IgG de rato não se liga a nenhuma das células transfectadas. Os 4 anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato produzidos se ligam ao hCDH6 de comprimento total, ao mutante de deleção EC1, ao mutante de deleção EC2, ao mutante de deleção EC4 e ao mutante de deleção EC5, mas não se ligam ao mutante de deleção EC3. A partir desse resultado, foi demonstrado que os 4 anticorpos monoclonais anti-CDH6 de rato se ligam especificamente a hCDH6 com EC3 como epítopo. 2)-3 Atividade de internalização de anticorpo anti-CDH6 de rato 2)-3-1 Confirmação da expressão de CDH6 na linhagem de células tumorais humanas
[00247] A fim de selecionar uma linhagem de células tumorais humanas positivas para CDH6 para uso na avaliação dos anticorpos obtidos, as informações de expressão de CDH6 foram recuperadas de um banco de dados conhecido, e a expressão de CDH6 na superfície da membrana celular foi avaliada por citometria de fluxo. As linhagens de células tumorais de ovário humano NIH:OVCAR-3, PA-1 e ES-2 e a linhagem de células tumorais de células renais humanas 786-O (todas obtidas da ATCC) foram cultivadas em condições de 37°C e 5% de CO2 e, posteriormente, uma suspensão celular foi preparada. As células foram centrifugadas e o sobrenadante foi então removido. Posteriormente, as células foram suspensas pela adição de um anticorpo anti-CDH6 humano disponível no mercado (MABU2715, R&D Systems, Inc.) ou IgG1 de camundongo (BD Pharmingen) como controle negativo (concentração final: 50 µg/mL). As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS e então suspensas pela adição de Fragmento F(ab’)2 de imunoglobulinas anti-
126 / 164 camundongo de cabra conjugadas com FITC (Dako) que foi diluído 50 vezes com PBS suplementado com 5% de FBS. As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados usando FlowJo (Tree Star, Inc.). Os resultados são mostrados na Figura 3. No histograma da Figura 3, a abcissa representa a intensidade de fluorescência de FITC, indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células. O histograma sombreado mostra que o controle negativo mIgG1 foi usado na coloração, e o histograma de linha sólida aberto mostra que o anticorpo anti-CDH6 humano foi usado na coloração. Como visto, a intensidade da fluorescência foi intensificada pela ligação do anticorpo ao hCDH6 na superfície de células. O controle de mIgG1 não se liga a nenhuma das células. Como resultado, foi confirmado que as linhagens celulares NIH:OVCAR-3, PA-1 e 786-O expressam endogenamente CDH6 na superfície celular. Por outro lado, foi demonstrado que a linhagem celular ES- 2 não expressa CDH6. 2)-3-2 Avaliação da atividade de internalização de anticorpo anti-CDH6 de rato
[00248] A atividade de internalização dos anticorpos anti-CDH6 de rato foi avaliada usando um reagente anti-IgG de rato Rat-ZAP (Advanced Targeting Systems) conjugado com uma toxina (saporina) que inibe a síntese proteica. Especificamente, a linhagem de células tumorais de ovário humano positivas para CDH6 NIH:OVCAR-3 (ATCC) foi semeada a 4 x 103 células/poço em uma placa de 96 poços e depois cultivada durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2. A linhagem de células tumorais de células renais positivas para CDH6 humano 786-O (ATCC) foi semeada a 1 x 103 células/poço em uma placa de 96 poços e depois cultivada durante a noite. No dia seguinte, cada anticorpo anti-CDH6 de rato (concentração final: 1 nM) ou
127 / 164 anticorpo IgG2b de rato (R&D Systems, Inc.) como anticorpo de controle negativo foi adicionado à placa. Rat-ZAP (concentração final: 0,5 nM) ou anti-IgG de rato de cabra, específico de fragmento Fc (gama) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) não conjugado com a toxina (concentração final: 0,5 nM) como controle negativo foi adicionalmente adicionado à placa, e as células foram cultivadas sob condições de 37°C e 5% de CO2 por 3 dias. O número de células vivas foi medido pela quantificação da atividade ATP (RLU) usando um ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo(TM) (Promega Corp.). Nessa avaliação, o Rat- ZAP é absorvido pelas células de uma maneira dependente da atividade de internalização do anticorpo anti-CDH6 de rato, de modo que a saporina que inibe a síntese proteica é liberada nas células, de modo a suprimir o crescimento celular. Um efeito de inibição do crescimento celular causado pela adição do anticorpo anti-CDH6 foi indicado por uma taxa de sobrevivência relativa quando o número de células vivas em um poço suplementado com o controle negativo em vez de Rat-ZAP foi definido como 100%. A Figura 4 mostra um gráfico e uma tabela da taxa de sobrevivência celular. Como resultado, foi demonstrado que os anticorpos anti-CDH6 de rato se ligam a CDH6 e causam internalização. [Exemplo 3: Determinação da sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável do anticorpo anti-CDH6 de rato] 3)-1 Amplificação e sequenciamento da região variável da cadeia pesada rG019 e dos fragmentos de genes da região variável da cadeia leve 3)-1-1 Preparação do RNA total de G019
[00249] A fim de amplificar o cDNA que codifica cada região variável de rG019, o RNA total foi preparado a partir de G019 usando o reagente TRIzol (Ambion, Inc.). 3)-1-2 Amplificação do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rG019 por PCR 5’-RACE e determinação da sequência de nucleotídeos
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[00250] O cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada foi amplificado usando aproximadamente 1 µg do RNA total preparado no Exemplo 3)-1-1 e um Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.). Como iniciadores usados para amplificar o cDNA da região variável do gene da cadeia pesada rG019 de acordo com a PCR, foram usados UPM (Universal Primer A Mix: incluído no kit de amplificação de cDNA SMARTer RACE) e iniciadores projetados a partir das sequências das regiões constantes de cadeias pesadas de ratos conhecidas.
[00251] O cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada amplificado por PCR 5’-RACE foi clonado em um plasmídeo e, em seguida, a sequência de nucleotídeos do cDNA da região variável da cadeia pesada foi submetida a análise de sequência.
[00252] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rG019 é mostrada na SEQ ID NO: 16, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO:
15. 3)-1-3 Amplificação do cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de rG019 por PCR 5’-RACE e determinação da sequência de nucleotídeos
[00253] A amplificação e o sequenciamento foram realizadas pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 3)-1-2. No entanto, como iniciadores usados para amplificar o cDNA da região variável do gene da cadeia leve rG019 de acordo com a PCR, foram usados UPM (Universal Primer A Mix: incluído no kit de amplificação de cDNA SMARTer RACE) e iniciadores projetados a partir das sequências das regiões constantes de cadeias leves de ratos conhecidas.
[00254] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de rG019 é mostrada na SEQ ID NO: 11, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 10. 3)-2 Amplificação e sequenciamento da região variável da cadeia pesada de
129 / 164 rG055 e dos fragmentos de genes da região variável da cadeia leve
[00255] As sequências foram determinadas pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 3)-1.
[00256] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rG055 é mostrada na SEQ ID NO: 26, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO:
25. A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de rG055 é mostrada na SEQ ID NO: 21, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 20. 3)-3 Amplificação e sequenciamento da região variável da cadeia pesada de rG056 e dos fragmentos de genes da região variável da cadeia leve
[00257] As sequências foram determinadas pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 3)-1.
[00258] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rG056 é mostrada na SEQ ID NO: 36, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO:
35. A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de rG056 é mostrada na SEQ ID NO: 31, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 30. 3)-4 Amplificação e sequenciamento da região variável da cadeia pesada de rG061 e dos fragmentos de genes da região variável da cadeia leve
[00259] As sequências foram determinadas pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 3)-1.
[00260] A sequência de nucleotídeos determinada do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rG061 é mostrada na SEQ ID NO: 46, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO:
45. A sequência de nucleotídeos do cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de rG061 é mostrada na SEQ ID NO: 41, e a sequência de aminoácidos do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 40.
130 / 164 [Exemplo 4: Produção de anticorpo quimérico humano anti-CDH6 chG019] 4)-1 Construção do vetor de expressão quimérico humano do anticorpo anti- CDH6 chG019 4)-1-1 Construção do vetor de expressão de cadeia leve quimérica e humanizada pCMA-LK
[00261] Um fragmento de de aprox. 5,4 kb, que foi obtido pela digestão do plasmídeo pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.) com as enzimas de restrição XbaI e PmeI, foi ligado a um fragmento de DNA que compreende uma sequência de DNA (SEQ ID NO: 50) codificando uma sequência de sinalização da cadeia leve humana e uma região constante da cadeia κ humana, usando um kit de clonagem In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.), para produzir pcDNA3.3/LK.
[00262] Uma unidade de expressão de neomicina foi removida do pcDNA3.3/LK para construir o pCMA-LK. 4)-1-2 Construção do vetor de expressão de cadeia pesada do tipo IgG1 quimérico e humanizado pCMA-G1
[00263] Um fragmento de DNA, que foi obtido pela digestão de pCMA-LK com XbaI e PmeI para remover a sequência de DNA que codifica a sequência de sinalização da cadeia leve e a região constante da cadeia κ humana, foi ligado a um fragmento de DNA que compreende uma sequência de DNA (SEQ ID NO: 51) codificando uma sequência de sinalização da cadeia pesada humana e uma região constante da IgG1 humana, usando um kit de clonagem In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.), para construir pCMA-G1. 4)-1-3 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada chG019
[00264] Um fragmento de DNA das posições de nucleotídeos 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada chG019 mostrada na SEQ ID NO: 57 foi sintetizado (GENEART). Usando um kit de clonagem In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.), o fragmento de DNA sintetizado foi
131 / 164 inserido em um local de pCMA-G1 que foi clivado com a enzima de restrição BlpI, de modo a construir um vetor de expressão de cadeia pesada chG019. Deve notar-se que, para a cadeia pesada chG019, foi usada uma sequência CDR com cisteína substituída por prolina, a fim de evitar ligações dissulfeto imprevisíveis. 4)-1-4 Construção do vetor de expressão da cadeia leve chG019
[00265] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA (SEQ ID NO: 52) que codifica a cadeia leve chG019 foi sintetizado (GENEART). Usando um kit de clonagem In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.), o fragmento de DNA sintetizado foi ligado a um fragmento de DNA, que foi obtido por digestão de pCMA-LK com XbaI e PmeI para remover a sequência de DNA que codifica a sequência de sinalização da cadeia leve e a região constante da cadeia κ humana do mesmo, de modo a construir um vetor de expressão da cadeia leve chG019. 4)-2 Produção e purificação do anticorpo quimérico humano anti-CDH6 chG019 4)-2-1 Produção de chG019
[00266] De acordo com o manual, as células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) foram cultivadas e passadas. 1,2 × 109 células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) na fase de crescimento logarítmico foram semeadas em um frasco Fernbach Erlenmeyer de 3 L (Corning Inc.), depois diluídas com meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) a 2,0 × 106 células/mL. A 40 ml de meio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.), foram adicionados 0,24 mg do vetor de expressão da cadeia pesada, 0,36 mg do vetor de expressão da cadeia leve e 1,8 mg de polietilenoimina (Polyscience #24765), e a mistura obtida foi agitada suavemente. Após incubação por 5 minutos, a mistura foi adicionada às células FreeStyle 293F. As células foram cultivadas por agitação a 90 rpm em uma incubadora de CO2 a 8% a 37°C por 4 horas e, posteriormente, 600 mL de meio EX-CELL VPRO (SAFC
132 / 164 Biosciences Inc.), 18 mL de GlutaMAX I (GIBCO) e 30 mL de ultrafiltrato de levedura (GIBCO) foram adicionados à cultura. As células foram posteriormente cultivadas por agitação a 90 rpm em uma incubadora de CO2 a 8% a 37°C por 7 dias. O sobrenadante da cultura obtido foi filtrado através de um filtro de cápsula descartável (Advantec #CCS-045-E1H). 4)-2-2 Purificação de chG019
[00267] Um anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante da cultura obtido no Exemplo 4)-2-1 por um processo de uma etapa de acordo com a cromatografia de afinidade com rProteína A. O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna que foi recheada com MabSelectSuRe (GE Healthcare Biosciences Corp.) equilibrada com PBS e, posteriormente, a coluna foi lavada com PBS em uma quantidade de duas ou mais vezes o volume da coluna. Posteriormente, o anticorpo foi eluído com uma solução de cloridrato de arginina 2 M (pH 4,0), de modo que uma fração contendo um anticorpo foi coletada. A fração foi dialisada (Thermo Fisher Scientific Inc., cassete de diálise Slide-A-Lyzer), de modo que o tampão foi substituído por HBSor (histidina 25 mM/sorbitol a 5%, pH 6,0). Usando um dispositivo de filtro centrífugo UF VIVASPIN20 (limite de peso molecular: UF10K, Sartorius Inc.), o anticorpo foi concentrado, de modo que a concentração de IgG foi ajustada para 5 mg/ml ou mais. Finalmente, o anticorpo foi filtrado através de um filtro Minisart-Plus (Sartorius Inc.) para obter uma amostra purificada. 4)-3 Avaliação da atividade de ligação do anticorpo quimérico humano anti- CDH6 chG019
[00268] A atividade de ligação a CDH6 do anticorpo quimérico humano anti-CDH6 chG019 purificado em 4)-2 foi confirmada por citometria de fluxo. Usando Lipofectamine 2000, pcDNA3.1-hCDH6 ou pcDNA3.1- cynoCDH6 produzido no Exemplo 1)-1 ou pcDNA3.1 foi introduzido transitoriamente nas células 293α. As células foram cultivadas durante a noite
133 / 164 sob condições de 37°C e 5% de CO2 e, em seguida, uma suspensão de células foi preparada. chG019 foi adicionado à suspensão de cada uma dessas células. As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. Posteriormente, as células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS e então suspensas pela adição de anticorpo Fc anti-IgG humana de fragmento F(ab’)2 marcado com PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) que foi diluído 500 vezes com PBS suplementado com 5% de FBS. As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS e depois ressuspensas em PBS suplementado com 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados usando FlowJo (Tree Star, Inc.). Como mostrado na Figura 5, chG019 não se ligou às células 293α transfectadas com pcDNA3.1 como controle negativo, mas se ligou às células 293α transfectadas com pcDNA3.1-hCDH6 ou pcDNA3.1-cynoCDH6 de uma maneira dependente da concentração de anticorpo. Na Figura 5, a abcissa representa a concentração de anticorpos e a ordenada representa a quantidade de anticorpos ligados, com base na intensidade média da fluorescência. É evidente a partir desse resultado que chG019 se liga especificamente a CDH6 humano e CDH6 de macaco cinomolgo com atividade de ligação quase equivalente. [Exemplo 5: Produção de anticorpo anti-CDH6 humanizado] 5)-1 Projeto da forma humanizada de anticorpo anti-CDH6 5)-1-1 Modelagem molecular da região variável chG019
[00269] A modelagem molecular das regiões variáveis de chG019 explorou um método conhecido como modelagem de homologia (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). O programa de análise de estrutura tridimensional de proteínas disponível comercialmente BioLuminate (fabricado por Schrodinger, LLC) foi empregado usando, como modelo, uma estrutura (ID do PDB: 2I9L) registrado no Protein Data Bank (Nuc. Acid Res.
134 / 164 35, D301-D303 (2007)) com uma alta identidade de sequência para as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de chG019. 5)-1-2 Projeto da sequência de aminoácidos de hG019 humanizado
[00270] O chG019 foi humanizado por enxerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). As sequências de consenso do subgrupo 1 da cadeia gama humana e do subgrupo 1 da cadeia kapa são determinadas por KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) tinham alta identidade com as regiões estruturais de chG019 e, com base nisso, foram selecionadas como aceitadores para a cadeia pesada e a cadeia leve, respectivamente. Os resíduos de doadores a serem enxertados nos aceitadores foram selecionados analisando modelos tridimensionais com referência, por exemplo, aos critérios dados por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). 5)-2 Humanização da cadeia pesada chG019
[00271] Três cadeias pesadas assim projetadas foram nomeadas hH01, hH02 e hH04. A sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada hH01 é mostrada na SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69 é mostrada na SEQ ID NO: 70. A sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada hH02 é mostrada na SEQ ID NO: 73. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73 é mostrada na SEQ ID NO: 74. A sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada hH04 é mostrada na SEQ ID NO: 77. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77 é mostrada na SEQ ID NO: 78. 5)-3 Humanização da cadeia leve chG019
[00272] Duas cadeias leves assim projetadas foram nomeadas hL02 e hL03. A sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve hL02
135 / 164 é mostrada na SEQ ID NO: 61. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 é mostrada na SEQ ID NO: 62. A sequência de aminoácidos de comprimento total da cadeia leve hL03 é mostrada na SEQ ID NO: 65. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65 é mostrada na SEQ ID NO: 66. 5)-4 Projeto de hG019 humanizado por combinação de cadeia pesada e cadeia leve
[00273] Um anticorpo que consiste em hH01 e hL02 foi denominado “anticorpo H01L02” ou “H01L02”. Um anticorpo que consiste em hH02 e hL02 foi denominado “anticorpo H02L02” ou “H02L02”. Um anticorpo que consiste em hH02 e hL03 foi denominado “anticorpo H02L03” ou “H02L03”. Um anticorpo que consiste em hH04 e hL02 foi denominado “anticorpo H04L02” ou “H04L02”. 5)-5 Expressão de anticorpo anti-CDH6 humanizado 5)-5-1 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada de hG019 humanizado 5)-5-1-1 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada do tipo hG019- H01 humanizada
[00274] Um fragmento de DNA das posições nucleotídicas 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada do tipo hG019-H01 humanizada mostrada na SEQ ID NO: 70 foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão de cadeia pesada do tipo hG019-H01 humanizada foi construído pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 4)-1-3. 5)-5-1-2 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada do tipo hG019- H02 humanizada
[00275] Um fragmento de DNA das posições nucleotídicas 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada do tipo hG019-H02 humanizada mostrada na SEQ ID NO: 74 foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão de cadeia pesada do tipo hG019-H02 humanizada foi construído
136 / 164 pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 4)-1-3. 5)-5-1-3 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada do tipo hG019- H04 humanizada
[00276] Um fragmento de DNA das posições nucleotídicas 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada do tipo hG019-H04 humanizada mostrada na SEQ ID NO: 78 foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão de cadeia pesada do tipo hG019-H04 humanizada foi construído pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 4)-1-3. 5)-5-2 Construção do vetor de expressão da cadeia leve de hG019 humanizado 5)-5-2-1 Construção do vetor de expressão da cadeia leve do tipo hG019-L02 humanizada
[00277] Um fragmento de DNA que compreende uma sequência de DNA que codifica a região variável da cadeia leve do tipo hG019-L02 humanizada a partir das posições nucleotídicas 37 a 399 na sequência de nucleotídeos da cadeia leve do tipo hG019-L02 humanizada mostrada na SEQ ID NO: 62 foi sintetizado (GENEART). Usando um kit de clonagem In- Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.), o fragmento de DNA sintetizado foi inserido em um local de pCMA-LK que foi clivado com a enzima de restrição BsiWI, de modo a construir um vetor de expressão de cadeia leve do tipo hG019-L02 humanizada. 5)-5-2-2 Construção do vetor de expressão da cadeia leve do tipo hG019-L03 humanizada
[00278] Um fragmento de DNA que compreende uma sequência de DNA que codifica a região variável da cadeia leve do tipo hG019-L03 humanizada a partir das posições nucleotídicas 37 a 399 na sequência de nucleotídeos da cadeia leve do tipo hG019-L03 humanizada mostrada na SEQ ID NO: 66 foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão de cadeia leve do tipo hG019-L03 humanizada foi construído pelo mesmo método que o
137 / 164 aplicado no Exemplo 5)-5-2-1. 5)-5-3 Preparação de hG019 humanizado 5)-5-3-1 Produção de H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02
[00279] Os anticorpos foram produzidos pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 4)-2-1. H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02 foram produzidos pela combinação da cadeia pesada e da cadeia leve mostrada no Exemplo 5)-4. 5)-5-3-2 Purificação em duas etapas de H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02
[00280] O anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante da cultura obtido no Exemplo 5)-5-3-1 por um processo de duas etapas, ou seja, por cromatografia de afinidade com rProteína A e hidroxiapatita cerâmica. O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna que foi recheada com MabSelectSuRe (fabricada pela GE Healthcare Biosciences Corp.) equilibrada com PBS e, posteriormente, a coluna foi lavada com PBS em uma quantidade de duas ou mais vezes o volume da coluna. Subsequentemente, o anticorpo foi eluído usando uma solução de cloridrato de arginina 2 M (pH 4,0). Uma fração contendo o anticorpo foi dialisada (Thermo Fisher Scientific Inc., cassete de diálise Slide-A-Lyzer), de modo que o tampão fosse substituído por PBS. A solução de anticorpo foi diluída 5 vezes com um tampão de fosfato de sódio 5 mM/MES 50 mM/pH 7,0 e, em seguida, aplicada a uma coluna de hidroxiapatita cerâmica (Bio-Rad Laboratories, Inc., coluna de Hidroxiapatita Bio-Scale CHT Tipo 1) que foi equilibrada com um tampão de NaPi 5 mM/MES 50 mM/NaCl 30 mM/pH 7,0. A eluição foi realizada em um gradiente de concentração linear de cloreto de sódio, de modo que uma fração contendo um anticorpo foi coletada. Essa fração foi dialisada (Thermo Fisher Scientific Inc., cassete de diálise Slide-A-Lyzer), de modo que o tampão foi substituído por HBSor (histidina 25 mM/sorbitol a 5%, pH 6,0). O anticorpo foi concentrado com um dispositivo de filtro centrífugo UF VIVASPIN20 (limite de peso molecular: UF10K, Sartorius
138 / 164 Inc.), ajustando assim a concentração de IgG para 20 mg/ml. Finalmente, o anticorpo foi filtrado através de um filtro Minisart-Plus (Sartorius Inc.) para obter uma amostra purificada. [Exemplo de referência 1: Produção de anticorpo anti-CDH6 NOV0712]
[00281] O anticorpo anti-CDH6 NOV0712 usado nos Exemplos foi produzido com referência às sequências de aminoácidos de comprimento total de cadeia pesada e de comprimento total de cadeia leve (SEQ ID NO: 235 e SEQ ID NO: 234, respectivamente, na Publicação Internacional nº WO 2016/024195) do NOV0712 descrito na Publicação Internacional nº WO 2016/024195. Exemplo de referência 1)-1 Anticorpo anti-CDH6 NOV0712 Exemplo de referência 1)-1-1 Construção do vetor de expressão de cadeia pesada do anticorpo anti-CDH6 NOV0712
[00282] Um fragmento de DNA que codifica a região variável de cadeia pesada NOV0712 das posições de nucleotídeos 36 a 428 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada NOV0712 mostrada na SEQ ID NO: 84 foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão de cadeia pesada NOV0712 foi construído pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 4)-1-3. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada NOV0712 expressa pelo vetor de expressão da cadeia pesada NOV0712 é mostrada na SEQ ID NO: 83. Na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 83, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 1 a 19 é uma sequência de sinalização. Exemplo de referência 1)-1-2 Construção do vetor de expressão de cadeia leve do anticorpo anti-CDH6 NOV0712
[00283] Um fragmento de DNA que compreende uma sequência de DNA que codifica a região variável da cadeia leve NOV0712 a partir das posições nucleotídicas 37 a 405 na sequência de nucleotídeos da cadeia leve NOV0712 mostrada na SEQ ID NO: 82 foi sintetizado (GENEART). Um
139 / 164 vetor de expressão de cadeia leve NOV0712 foi construído pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 5)-5-2-1. A sequência de aminoácidos da cadeia leve NOV0712 expressa pelo vetor de expressão da cadeia leve NOV0712 é mostrada na SEQ ID NO: 81. Na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 81, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos nas posições 1 a 20 é uma sequência de sinalização. Exemplo de referência 1)-2 Preparação do anticorpo anti-CDH6 NOV0712 Exemplo de referência 1)-2-1 Produção do anticorpo anti-CDH6 NOV0712
[00284] NOV0712 foi produzido pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 4)-2-1. Exemplo de referência 1)-2-2 Purificação em uma etapa do anticorpo anti- CDH6 NOV0712
[00285] O anticorpo anti-CDH6 NOV0712 foi purificado a partir do sobrenadante da cultura obtido no Exemplo de Referência 1)-2-1 pelo mesmo método que o aplicado no Exemplo 4)-2-2 (concentração de anticorpo: 5 mg/l HBSor). [Exemplo 6: Avaliação in vitro de hG019 humanizado e NOV0712] 6)-1 Avaliação da atividade de ligação de hG019 humanizado 6)-1-1 Capacidade de ligação ao antígeno CDH6 humano de hG019 humanizado
[00286] A constante de dissociação entre o anticorpo e o antígeno (quimera humana recombinante CDH6 Fc His, R&D Systems, Inc.) foi medida usando o Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences Corp.), de acordo com um método de captura, que compreende capturar o antígeno como um ligante com o anticorpo anti-His imobilizado e depois medindo a constante de dissociação usando um anticorpo como analito. Aproximadamente 1000 RU do anticorpo anti-histidina (kit de captura His, GE Healthcare Biosciences Corp.) foram ligados covalentemente ao chip sensor CM5 (GE Healthcare Biosciences Corp.) pelo método de acoplamento de amina. O anticorpo
140 / 164 também foi imobilizado nas células de referência da mesma maneira que acima. HBS-P+ (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensoativo P20 a 0,05%) suplementado com CaCl2 1 mM foi usado como tampão de passagem. O antígeno foi adicionado ao chip imobilizado por anticorpo anti-histidina por 60 segundos e uma solução em série de diluição (0,391 a 100 nM) do anticorpo foi então adicionada a uma vazão de 30 µl/min por 300 segundos. Posteriormente, a fase de dissociação foi monitorada por 600 segundos. Como uma solução de regeneração, uma solução de glicina (pH 1,5) suplementada com MgCl2 5M foi adicionada duas vezes a uma vazão de 10 µl/min por 30 segundos. Um modelo de afinidade de estado estacionário no software de análise (software BIAevaluation, versão 4.1) foi usado na análise dos dados e a constante de dissociação (KD) foi calculada. Os resultados são mostrados na Tabela 2. [Tabela 2] Anticorpo KD(M) 1 H01L02 1,5E-09 2 H02L02 1,1E-09 3 H02L03 1,4E-09 4 H04L02 1,1E-09 6)-1-2 Atividade de ligação contra CDH6 humano, de macaco, camundongo ou rato
[00287] Usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.), pcDNA3.1-hCDH6, pcDNA3.1-cynoCDH6, p3xFLAG-CMV-9-mCDH6 ou p3xFLAG-CMV-9-rCDH6 produzido no Exemplo 1)-1 foi introduzido transitoriamente nas células 293α. As células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2 e, em seguida, uma suspensão de células foi preparada. As células 293α não transfectadas foram usadas como controle negativo. A suspensão das células 293α produzidas conforme descrito acima foi centrifugada e o sobrenadante foi então removido. Depois disso, as células foram suspensas pela adição de cada um dos 4 anticorpos hG019
141 / 164 humanizados (clone nº: H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), que foram preparados no Exemplo 5)-5-3, ou controle de IgG1 humana (Calbiochem). As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS e então suspensas pela adição de anti-IgG humana, F(ab’) de cabra PE Fc(gama) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) que foi diluído 500 vezes com PBS suplementado com 5% de FBS. As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados usando FlowJo (Tree Star, Inc.). Nas Figuras 6-1 e 6-2, a abcissa representa a concentração de anticorpos e a ordenada representa a quantidade de anticorpos ligados, com base na intensidade média da fluorescência. Como mostrado nas Figuras 6-1 e 6-2, o controle de IgG1 humana como controle negativo não se liga a nenhuma das células transfectadas com CDH6. Os 4 anticorpos hG019 humanizados (clone nº: H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02) se ligam a CDH6 humano e CDH6 de macaco cinomolgo, mas não se ligam a CDH6 de camundongo ou rato. Nenhum dos anticorpos se liga às células transfectadas com o vetor vazio pcDNA3.1 como controle negativo. Por outro lado, a Publicação Internacional nº WO 2016/024195 descreve que o anticorpo NOV0712 apresenta atividade de ligação contra todo o CDH6 humano, CDH6 de macaco cinomolgo, CDH6 de camundongo e CDH6 de rato. Como resultado, foi demonstrado que os 4 anticorpos hG019 humanizados obtidos na presente descrição são anticorpos anti-CDH6 que apresentam propriedades de ligação diferentes daquelas do anticorpo NOV0712. 6)-2 Análise de locais de ligação a CDH6 de hG019 humanizado e NOV0712 6)-2-1 Análise de epítopos usando mutante de deleção de domínio
[00288] Usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.),
142 / 164 cada vetor de expressão mutante de deleção de domínio produzido no Exemplo 2)-2-1, ou pcDNA3.1-hCDH6 para a expressão de CDH6 humano de comprimento total foi introduzido transitoriamente nas células.
As células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2 e, em seguida, uma suspensão de células foi preparada.
A suspensão das células 293α transfectadas foi centrifugada e o sobrenadante foi então removido.
Depois disso, as células foram suspensas pela adição de cada um dos 4 anticorpos hG019 humanizados (clone nº: H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), que foram preparados no Exemplo 5)-5-3, ou o anticorpo anti- CDH6 NOV0712, que foi preparado no Exemplo de Referência 1, ou IgG1 humana (Calbiochem) como controle negativo.
As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora.
As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS e então suspensas pela adição de F(ab’)2 de cabra anti-IgG humana de APC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) que foi diluído 500 vezes com PBS suplementado com 5% de FBS.
As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora.
As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados usando FlowJo (Tree Star, Inc.). Os resultados são mostrados nas Figuras 7-1 a 7-6. Nos histogramas das Figuras 7-1 a 7-6, a abcissa representa a intensidade de fluorescência de APC, indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa uma contagem de células.
O histograma sombreado mostra que foram usadas células 293α não transfectadas de controle negativo e o histograma de linha sólida aberto mostra que foram usadas células 293α que expressam hCDH6 de comprimento total ou cada mutante de deleção de domínio EC.
A intensidade da fluorescência é intensificada quando o anticorpo se liga ao hCDH6 de comprimento total ou a cada mutante de deleção do domínio EC na superfície celular.
O controle de IgG1 humana não se liga a nenhuma das células transfectadas.
Os 4
143 / 164 anticorpos hG019 humanizados (clone nº: H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02) se ligam ao hCDH6 de comprimento total, ao mutante de deleção EC1, ao mutante de deleção EC2, ao mutante de deleção EC4 e ao mutante de deleção EC5, mas não se ligam ao mutante de deleção EC3. Especificamente, foi demonstrado que os 4 anticorpos hG019 humanizados se ligam especificamente a hCDH6 com EC3 como epítopo. Por outro lado, o anticorpo anti-CDH6 NOV0712 se liga ao hCDH6 de comprimento total, ao mutante de deleção EC1, ao mutante de deleção EC2, ao mutante de deleção EC3 e ao mutante de deleção EC4, mas não se liga ao mutante de deleção EC5. Especificamente, foi demonstrado que o anticorpo anti-CDH6 NOV0712 se liga especificamente a hCDH6 com EC5 como epítopo. Isso é consistente com as informações do epítopo em NOV0712 descritas na Publicação Internacional nº WO 2016/024195. A partir desse resultado, foi demonstrado que os 4 anticorpos hG019 humanizados obtidos na presente descrição são anticorpos anti-CDH6 que apresentam propriedades diferentes daquelas do NOV0712. 6)-2-2 Ensaio de competição de ligação de anticorpos 6)-2-2-1 Produção de linhagem celular de expressão estável 786-O/hCDH6
[00289] A linhagem celular de expressão estável 786-O/hCDH6 foi produzida através da infecção de células 786-O (ATCC) com um retrovírus recombinante para expressão de CDH6 humano de comprimento total. Um vetor de retrovírus de expressão de CDH6 humano (pQCXIN-hCDH6) foi produzido usando um vetor de expressão de cDNA que codifica a proteína CDH6 humana (NP_004923) (OriGene Technologies Inc., RC217889) e incorpora o cDNA no vetor de retrovírus pQCXIN (Clontech Laboratories, Inc.) de acordo com um método conhecido por um versado na técnica. Usando FuGene HD (Promega Corp.), o pQCXIN-hCDH6 foi transitoriamente introduzido nas células de acondicionamento de retrovírus RetroPack PT67 (Clontech Laboratories, Inc.). Após 48 horas, um
144 / 164 sobrenadante da cultura contendo retrovírus recombinante foi recuperado e depois adicionado ao sistema de cultura de células 786-O, para que as células fossem infectadas. Três dias após a infecção, as células infectadas foram cultivadas em condições de 37°C e 5% de CO2 em um meio suplementado com G418 (Gibco) (concentração final: 50 mg/mL) e selecionadas com o fármaco, de modo a estabelecer a linhagem celular 786-O/hCDH6 que expressa estavelmente CDH6 humano. A alta expressão de CDH6 humano na linhagem de expressão estável foi confirmada por citometria de fluxo da mesma maneira que a aplicada no Exemplo 2)-3-1 (Figura 8). O anticorpo secundário anti-IgG1 de camundongo de cabra Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific Inc.) que foi diluído 500 vezes com PBS suplementado com 5% de FBS foi usado como um anticorpo para detecção. Os resultados são mostrados na Figura 8. No histograma da Figura 8, a abcissa representa a intensidade de fluorescência de Alexa Fluor 647, indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células. O histograma sombreado mostra que o controle negativo mIgG1 foi usado na coloração, e o histograma de linha sólida aberto mostra que o anticorpo anti-CDH6 humano foi usado na coloração. Como visto, a intensidade da fluorescência foi intensificada pela ligação do anticorpo ao hCDH6 na superfície celular. O controle de mIgG1 não se liga a nenhuma das células. Como resultado, foi demonstrado que a linhagem celular de expressão estável 786-O/hCDH6 expressa mais altamente CDH6 humano do que as células 786-O da linhagem parental. 6)-2-2-2 Ensaio de competição de ligação usando H01L02 marcado e NOV0712 marcado
[00290] O H01L02 marcado e o NOV0712 marcado foram produzidos usando um Kit de Marcação de Anticorpo Monoclonal Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific Inc.). A suspensão celular da linhagem celular de expressão estável 786-O/hCDH6 produzida em 6)-2-2-1 foi centrifugada e o
145 / 164 sobrenadante foi então removido.
Depois disso, as células foram suspensas pela adição de NOV0712 marcado ou H01L02 marcado (concentração final: 5 nM) e, além disso, a adição de cada um dos 4 anticorpos humanizados hG019 (clone nº: H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), que foram preparados no Exemplo 5)-5-3, ou o anticorpo anti-CDH6 NOV0712, que foi preparado no Exemplo de Referência 1, ou IgG1 humana (Calbiochem) como controle negativo (concentração final: como mostrada na abscissa da Figura 9). As células foram deixadas em repouso a 4°C durante 1 hora.
Posteriormente, as células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com 5% de FBS, seguido pela detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados usando FlowJo (Tree Star, Inc.). Os resultados são mostrados na Figura 9. A abcissa representa a concentração final do anticorpo não marcado adicionado e a ordenada representa a quantidade do anticorpo ligado com base na intensidade média da fluorescência.
Quando o NOV0712 não marcado é adicionado às células suplementadas com o NOV0712 marcado, a quantidade da ligação do anticorpo marcado é diminuída pela substituição pelo anticorpo não marcado de uma maneira dependente da concentração de adição, porque eles competem entre si pela ligação ao mesmo epítopo.
Por outro lado, mesmo que cada um dos 4 anticorpos hG019 humanizados ou IgG1 humana como controle negativo seja adicionado às células suplementadas com NOV0712 marcado, não há alteração na quantidade do anticorpo marcado ligado, indicando que esses anticorpos diferem no epítopo e, portanto, não competem entre si pela ligação.
De modo similar, quando cada um dos 4 anticorpos hG019 humanizados não marcados é adicionado às células suplementadas com H01L02 marcado, a quantidade da ligação do anticorpo marcado é diminuída pela substituição pelo anticorpo não marcado de uma maneira dependente da concentração de adição, porque eles competem entre si pela ligação ao mesmo epítopo.
Por outro lado, mesmo que NOV0712 ou IgG1
146 / 164 humana como controle negativo seja adicionado às células suplementadas com H01L02 marcado, não há alteração na quantidade do anticorpo marcado ligado, indicando que esses anticorpos diferem no epítopo e, portanto, não competem entre si pela ligação. 6)-3 Avaliação da atividade de internalização de hG019 humanizado e NOV0712
[00291] A atividade de internalização de hG019 humanizado e NOV0712 foi avaliada usando um reagente anti-IgG humana Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems) conjugado com uma toxina (saporina) que inibe a síntese proteica. Especificamente, a linhagem de células tumorais de ovário humano positivas para CDH6 NIH:OVCAR-3 (ATCC) foi semeada a 4 x 103 células/poço em uma placa de 96 poços e depois cultivada durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2. A linhagem de células tumorais de células renais positivas para CDH6 humano 786-O (ATCC) foi semeada a 1 x 103 células/poço em uma placa de 96 poços e depois cultivada durante a noite. A linhagem de células tumorais de ovário humano positivas para CDH6 PA-1 (ATCC) foi semeada a 1 x 103 células/poço em uma placa de 96 poços e depois cultivada durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2. No dia seguinte, cada anticorpo anti-CDH6 (concentração final: 1 nM) ou anticorpo IgG1 humano (Calbiochem) como anticorpo de controle negativo foi adicionado à placa. Hum-ZAP (concentração final: 0,5 nM) ou anti-IgG humana de cabra de fragmento F(ab’)2, específico de fragmento Fc (gama) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) não conjugado com a toxina (concentração final: 0,5 nM) como controle negativo foi adicionalmente adicionado à placa, e as células foram cultivadas sob condições de 37°C e 5% de CO2 por 3 dias. O número de células vivas foi medido pela quantificação da atividade ATP (RLU) usando ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo(TM). Nessa avaliação, o Hum-ZAP é absorvido pelas células de uma maneira dependente da atividade de internalização do anticorpo anti-
147 / 164
CDH6 humanizado, de modo que a saporina que inibe a síntese proteica é liberada nas células, de modo a suprimir o crescimento celular.
Um efeito de inibição do crescimento celular causado pela adição do anticorpo anti-CDH6 foi indicado por uma taxa de sobrevivência relativa quando o número de células vivas em um poço suplementado com o controle negativo em vez de Hum-ZAP foi definido como 100%. As Figuras 10-1 a 10-3 mostram um gráfico e uma tabela da taxa de sobrevivência celular.
Nesse experimento, considera-se que um anticorpo com forte atividade de internalização oferece uma baixa taxa de sobrevivência celular.
Como resultado, os 4 anticorpos hG019 humanizados têm uma taxa de internalização de aproximadamente 50 a 75% prevista a partir das taxas de sobrevivência celular para todas as três linhagens celulares.
Assim, os 4 anticorpos hG019 humanizados apresentam uma atividade de internalização muito alta e apresentam uma atividade de internalização muito maior que a do NOV0712. A partir do mecanismo dos efeitos medicinais do ADC, um anticorpo com maior atividade de internalização é considerado mais adequado como um anticorpo ADC. [Exemplo 7: Produção de conjugado fármaco-hG019 humanizado] 7)-1 Produção de conjugado anticorpo-fármaco H01L02-DXd Etapa 1: Conjugado anticorpo-fármaco (1)
148 / 164 [Fórmula 11] H01L02 工程11 Etapa
7.7
[00292] Redução do anticorpo: O H01L02 produzido no Exemplo 5 foi ajustado para 9,85 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando procedimentos comuns B (usando 1,53 mLmg-1cm-1 como coeficiente de absorção de 280 nm) e C descrito no método de produção 1. Para essa solução (5,7 mL), uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,231 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de 1 M de hidrogenofosfato de dipotássio (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0855 mL) foram adicionadas. Depois de confirmar que a solução tinha um pH dentro de 7,0 ± 0,1, a ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo foi reduzida por incubação da solução a 37°C por 2 horas.
[00293] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: A solução descrita acima foi incubada a 15°C por 10 minutos. Subsequentemente, uma solução 10 mM de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetoxi)metil]glicinamida em dimetilsulfóxido (0,386 mL; 10 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi
149 / 164 incubada a 15°C por 1 hora para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Subsequentemente, uma solução aquosa de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0347 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco.
[00294] Purificação: A solução descrita acima foi purificada pelo procedimento comum D descrito no método de produção 1 para obter 19 mL de uma solução contendo o conjugado anticorpo-fármaco do título “H01L02- ADC”.
[00295] Caracterização: Usando o procedimento comum E (usando εD,280 = 5440 e εD,370 = 21240) descrito no método de produção 1, os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00296] Concentração de anticorpo: 2,26 mg/mL, rendimento de anticorpo: 42,9 mg (76%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum E: 5,9, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum F: 7,7. 7)-2 Produção de conjugado anticorpo-fármaco H02L02-DXd Etapa 1: Conjugado anticorpo-fármaco (2) [Fórmula 12] H02L02 工程1 1 Etapa
7.6
150 / 164
[00297] Redução do anticorpo: O H02L02 produzido no Exemplo 5 foi ajustado para 9,95 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando procedimentos comuns B (usando 1,51 mLmg-1cm-1 como coeficiente de absorção de 280 nm) e C descrito no método de produção 1. Para essa solução (5,7 mL), uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,234 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de 1 M de hidrogenofosfato de dipotássio (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0855 mL) foram adicionadas. Depois de confirmar que a solução tinha um pH dentro de 7,0 ± 0,1, a ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo foi reduzida por incubação da solução a 37°C por 2 horas.
[00298] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: A solução descrita acima foi incubada a 15°C por 10 minutos. Subsequentemente, uma solução 10mM de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetoxi)metil]glicinamida em dimetilsulfóxido (0,389 mL; 10 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi incubada a 15°C por 1 hora para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Subsequentemente, uma solução aquosa de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0350 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco.
[00299] Purificação: A solução descrita acima foi purificada pelo procedimento comum D descrito no método de produção 1 para obter 19 mL de uma solução contendo o conjugado anticorpo-fármaco do título “H02L02- ADC”.
[00300] Caracterização: Usando o procedimento comum E (usando εD,280 = 5440 e εD,370 = 21240) descrito no método de produção 1, os seguintes
151 / 164 valores característicos foram obtidos.
[00301] Concentração de anticorpo: 2,61 mg/mL, rendimento de anticorpo: 49,6 mg (87%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum E: 5,9, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum F: 7,6. 7)-3 Produção de conjugado anticorpo-fármaco H02L03-DXd Etapa 1: Conjugado anticorpo-fármaco (3) [Fórmula 13]
O O O O H H N N N O N N N O O H H H
O O NH Me O
N F N
O Me
OH O O O O O
H H H02L03 N N N O
N N N O 工程11 Etapa O H
O H O H
NH Me O
N F N
O Me
OH O
7.6
[00302] Redução do anticorpo: O H02L03 produzido no Exemplo 5 foi ajustado para 9,86 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando procedimentos comuns B (usando 1,53 mLmg-1cm-1 como coeficiente de absorção de 280 nm) e C descrito no método de produção 1. Para essa solução (5,7 mL), uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,270 mL; 7,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de 1 M de hidrogenofosfato de dipotássio (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0855 mL) foram adicionadas. Depois de confirmar que a solução tinha um pH dentro de 7,0 ± 0,1, a ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo foi reduzida por incubação da solução a 37°C por 2 horas.
152 / 164
[00303] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: A solução descrita acima foi incubada a 15°C por 10 minutos. Subsequentemente, uma solução 10 mM de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetoxi)metil]glicinamida em dimetilsulfóxido (0,386 mL; 10 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi incubada a 15°C por 1 hora para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Subsequentemente, uma solução aquosa de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0347 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco.
[00304] Purificação: A solução descrita acima foi purificada pelo procedimento comum D descrito no método de produção 1 para obter 19 mL de uma solução contendo o conjugado anticorpo-fármaco do título “H01L02- ADC”.
[00305] Caracterização: Usando o procedimento comum E (usando εD,280 = 5440 e εD,370 = 21240) descrito no método de produção 1, os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00306] Concentração de anticorpo: 2,71 mg/mL, rendimento de anticorpo: 51,4 mg (91%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum E: 5,7, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum F: 7,6. 7)-4 Produção de conjugado anticorpo-fármaco H04L02-DXd Etapa 1: Conjugado anticorpo-fármaco (4) [Fórmula 14]
153 / 164 H04L02 工程1 1 Etapa
7.6
[00307] Redução do anticorpo: O H04L02 produzido no Exemplo 5 foi ajustado para 9,86 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando procedimentos comuns B (usando 1,53 mLmg-1cm-1 como coeficiente de absorção de 280 nm) e C descrito no método de produção 1. Para essa solução (5,7 mL), uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,232 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de 1 M de hidrogenofosfato de dipotássio (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0855 mL) foram adicionadas. Depois de confirmar que a solução tinha um pH dentro de 7,0 ± 0,1, a ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo foi reduzida por incubação da solução a 37°C por 2 horas.
[00308] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: A solução descrita acima foi incubada a 15°C por 10 minutos. Subsequentemente, uma solução 10 mM de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetoxi)metil]glicinamida em dimetilsulfóxido (0,386 mL; 10 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi incubada a 15°C por 1 hora para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo.
154 / 164 Subsequentemente, uma solução aquosa de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0347 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco.
[00309] Purificação: A solução descrita acima foi purificada pelo procedimento comum D descrito no método de produção 1 para obter 19 mL de uma solução contendo o conjugado anticorpo-fármaco do título “H04L02- ADC”.
[00310] Caracterização: Usando o procedimento comum E (usando εD,280 = 5440 e εD,370 = 21240) descrito no método de produção 1, os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00311] Concentração de anticorpo: 2,56 mg/mL, rendimento de anticorpo: 48,7 mg (87%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum E: 5,8, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum F: 7,6. [Exemplo de referência 2: Produção de conjugado fármaco-NOV0712] Exemplo de Referência 2)-1 Produção de conjugado anticorpo-fármaco NOV0712-DM4 Conjugado anticorpo-fármaco (5)
[00312] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: O NOV0712 produzido no Exemplo de Referência 1 foi ajustado para 9,7 mg/mL com HEPES8.1 20 mM (HEPES, Solução Tampão 1 M (20 mL) fabricada pela Life Technologies Corp. teve o pH ajustado para 8,1 com hidróxido de sódio 1 M e depois levado a 1 L com água destilada) usando procedimentos comuns B (usando 1,51 mLmg-1cm-1 como coeficiente de absorção a 280 nm) e C descritos no método de produção 1. A solução foi incubada a 20°C por 10 minutos. Subsequentemente, uma solução 10 mM de ácido 1-(2,5- dioxopirrolidin-1-iloxi)-1-oxo-4-(piridin-2-ildissulfanil)butano-2-sulfônico
155 / 164 descrita em WO2016/024195 em DMA (0,366 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo), uma solução 10 mM de N2-desacetil-desacetil-N2-(4- metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM4) em DMA (0,366 mL; 6,8 equivalentes por molécula de anticorpo) e 0,243 mL de DMA foram adicionados à mesma e a mistura obtida foi incubada a 20°C por 16 horas para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Subsequentemente, foi adicionada uma solução aquosa de ácido acético 1 M para ajustar o pH para 5,0, e a mistura obtida foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco.
[00313] Purificação: A solução descrita acima foi purificada pelo procedimento comum D descrito no método de produção 1 para obter 28 mL de uma solução contendo o conjugado anticorpo-fármaco do título “NOV0712-DM4”.
[00314] Caracterização: Usando o procedimento comum E (usando εA,280 = 200500, εA,252 = 76295, εD,280 = 43170, e εD,252 = 23224) descrito no método de produção 1, os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00315] Concentração de anticorpo: 2,58 mg/mL, rendimento de anticorpo: 72,2 mg (93%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum E: 3,0. Exemplo de Referência 2)-2 Produção de conjugado anticorpo-fármaco NOV0712-DXd Etapa 1: Conjugado anticorpo-fármaco (6)
156 / 164 [Fórmula 15] NOV0712 工程11 Etapa
7.8
[00316] Redução do anticorpo: O NOV0712 produzido no Exemplo de referência 1 foi ajustado para 9,26 mg/mL com PBS6.0/EDTA usando procedimentos comuns B (usando 1,5 mLmg-1cm-1 como coeficiente de absorção de 280 nm) e C descrito no método de produção 1. Para essa solução (6,6 mL), uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,254 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de 1 M de hidrogenofosfato de dipotássio (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0990 mL) foram adicionadas. Depois de confirmar que a solução tinha um pH dentro de 7,0 ± 0,1, a ligação dissulfeto intercadeia no anticorpo foi reduzida por incubação da solução a 37°C por 2 horas.
[00317] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: A solução descrita acima foi incubada a 15°C por 10 minutos. Subsequentemente, uma solução 10 mM de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetoxi)metil]glicinamida em dimetilsulfóxido (0,381 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi
157 / 164 incubada a 15°C por 1 hora para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Subsequentemente, uma solução aquosa de NAC 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0381 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada à mesma, e a mistura obtida foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco.
[00318] Purificação: A solução descrita acima foi purificada pelo procedimento comum D descrito no método de produção 1 para obter 23,5 mL de uma solução contendo o conjugado anticorpo-fármaco do título “NOV0712-ADC”.
[00319] Caracterização: Usando o procedimento comum E (usando εD,280 = 5440 e εD,370 = 21240) descrito no método de produção 1, os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00320] Concentração de anticorpo: 2,26 mg/mL, rendimento de anticorpo: 56,4 mg (92%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum E: 6,4, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum F: 7,8. [Exemplo de referência 3: Produção de H01L02-DM4] Exemplo de Referência 3)-1 Produção de conjugado anticorpo-fármaco H01L02-DM4 Conjugado anticorpo-fármaco (7)
[00321] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: O H01L02 produzido no Exemplo 5 foi ajustado para 9,8 mg/mL com HEPES8.1 20 mM (HEPES, Solução Tampão 1 M (20 mL) fabricada pela Life Technologies Corp. teve o pH ajustado para 8,1 com hidróxido de sódio 1 M e depois levado a 1 L com água destilada) usando procedimentos comuns B (usando 1,53 mLmg-1cm-1 como coeficiente de absorção a 280 nm) e C descritos no método de produção 1. A solução foi incubada a 20°C por 10 minutos. Subsequentemente, uma solução 10 mM de ácido 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-
158 / 164 iloxi)-1-oxo-4-(piridin-2-ildissulfanil)butano-2-sulfônico descrita em WO2016/024195 em DMA (0,062 mL; 11,5 equivalentes por molécula de anticorpo), e uma solução 10 mM de N2-desacetil-N2-(4-metil-4-mercapto-1- oxopentil)-maitansina (DM4) em DMA (0,082 mL; 15,1 equivalentes por molécula de anticorpo) foram adicionadas à mesma e a mistura obtida foi incubada a 20°C por 18 horas para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Subsequentemente, foi adicionada uma solução aquosa de ácido acético 1 M para ajustar o pH para 5,0, e a mistura obtida foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos para terminar a reação do ligante de fármaco.
[00322] Purificação: A solução descrita acima foi purificada pelo procedimento comum D descrito no método de produção 1 para obter 3,5 mL de uma solução contendo o conjugado anticorpo-fármaco do título “H01L02- DM4”.
[00323] Caracterização: Usando o procedimento comum E (usando εA,280 = 223400, εA,252 = 85646, εD,280 = 4317, e εD,252 = 23224) descrito no método de produção 1, os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00324] Concentração de anticorpo: 1,97 mg/mL, rendimento de anticorpo: 6,90 mg (88%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo procedimento comum E: 3,6. [Exemplo 8: Avaliação da atividade in vitro do conjugado anticorpo-fármaco] 8)-1 Avaliação da atividade de inibição do crescimento celular in vitro do conjugado anticorpo-fármaco contra linhagem de células tumorais humanas positivas para CDH6
[00325] A linhagem de células tumorais de ovário humano positiva para CDH6 PA-1 foi semeada sobre uma placa de 96 poços a 2 x 103 células/100 µL/poço em meio MEM suplementado com 10% de FBS, e as
159 / 164 células foram então cultivadas durante a noite sob condições de 37°C e 5% de CO2. No dia seguinte, cada um dos 4 conjugados fármaco-hG019 humanizado (nomes dos clones: H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd e H04L02- DXd) produzido no Exemplo 7 ou o conjugado fármaco-NOV0712 (NOV0712-DM4) produzido no Exemplo de Referência 2 foi adicionado às células de modo que as concentrações finais fossem de 0,0001 (nM) a 100 (nM). Após cultura durante 4 dias, o número de células vivas foi medido pela quantificação de ATP usando o Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo(TM) (Promega Corp.). A Figura 11 mostra a atividade de inibição do crescimento celular dependente da concentração quando cada conjugado anticorpo-fármaco foi adicionado às células. A partir desse resultado, foi demonstrado que os 4 conjugados fármaco-hG019 humanizado apresentam atividade de inibição de crescimento contra células tumorais a partir de uma concentração de adição mais baixa do que a do conjugado fármaco-NOV0712 e têm alta atividade antitumoral. [Exemplo 9: Efeito antitumoral in vivo do conjugado anticorpo-fármaco]
[00326] Os efeitos antitumorais dos conjugados anticorpo-fármaco foram avaliados usando modelos animais derivados de camundongos imunodeficientes pela inoculação de células da linhagem celular de tumor humano positivas para CDH6. Camundongos nus BALB/c com quatro a cinco semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu], Charles River Laboratories Japan Inc.) e camundongos SCID (CB17/Icr- Prkdc[scid]/CrlCrlj, Charles River Laboratories Japan Inc.) foram aclimatados por 3 dias ou mais sob condições de SPF antes do uso no experimento. Os camundongos foram alimentados com uma dieta sólida esterilizada (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) e receberam água da torneira esterilizada (que foi preparada adicionando uma solução de hipoclorito de sódio de 5 a 15 ppm à água da torneira). O diâmetro longo e o diâmetro curto do tumor inoculado foram medidos duas vezes por semana usando paquímetros digitais
160 / 164 eletrônicos (CD-15CX, Mitutoyo Corp.), e o volume do tumor foi então calculado de acordo com a seguinte expressão. Volume do tumor (mm3) = 1/2 × diâmetro longo (mm) × [diâmetro curto (mm)]2
[00327] Cada conjugado anticorpo-fármaco foi diluído com tampão ABS (tampão acetato 10 mM, sorbitol a 5%, pH 5,5) (Nacalai Tesque, Inc.), e a diluição foi administrada por via intravenosa na dose mostrada em cada exemplo à cauda de cada camundongo. O tampão ABS foi administrado da mesma maneira que acima a um grupo controle (grupo veículo). Foram usados seis camundongos por grupo no experimento. 9)-1 Efeito antitumoral - (1)
[00328] A linhagem de células tumorais 786-O (ATCC) de células renais humanas positivas para CDH6, cuja expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3-1, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.) e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 5 × 106 células na região do flanco direito de cada camundongo SCID macho (dia 0). No dia 18, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, cada um dos 4 conjugados anticorpo-fármaco (nomes dos clones: H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd e H04L02-DXd) produzidos no Exemplo 7 ou NOV0712-DM4 produzido no Exemplo de Referência 2 foram administrados por via intravenosa a uma dose de 3 mg/kg na cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 12. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de SE.
[00329] NOV0712-DM4 não apresentou efeito antitumoral significativo nesse modelo de tumor. Todos os 4 conjugados anticorpo- fármaco produzidos no Exemplo 7 diminuíram o volume do tumor após a administração, exerceram regressão significativa do tumor e sustentaram o efeito de regressão do tumor por 24 dias após a administração (Figura 12).
161 / 164 9)-2 Efeito antitumoral - (2)
[00330] A linhagem de células tumorais PA-1(ATCC) de ovário humanas positivas para CDH6, cuja expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3-1, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.) e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 8,5 × 106 células na região do flanco direito de cada camundongo nu fêmea (dia 0). No dia 11, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, o conjugado anticorpo-fármaco H01L02-DXd produzido no Exemplo 7, ou NOV0712-DM4 ou NOV0712-DXd produzido no Exemplo de Referência 2 foram administrados por via intravenosa a doses de 1 ou 3 mg/kg na cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 13. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de SE.
[00331] O NOV0712-DM4 não apresentou efeito antitumoral em nenhuma das doses de 1 e 3 mg/kg nesse modelo de tumor. Por outro lado, o H01L02-DXd diminuiu significativamente o volume do tumor após a administração nas doses de 1 e 3 mg/kg e exerceu um efeito de regressão do tumor (Figura 13). O anticorpo H01L02 obtido na presente descrição e o anticorpo NOV0712 foram conjugados com o mesmo fármaco DXd e os efeitos medicinais das amostras resultantes foram comparados. Como resultado, o H01L02-DXd exerceu um efeito antitumoral mais forte do que o do NOV0712-DXd nas doses de 1 e 3 mg/kg. Especificamente, foi demonstrado que o anticorpo H01L02 da presente invenção é um anticorpo superior para conjugados anticorpo-fármaco como agentes antitumorais ao anticorpo NOV0712 (Figura 13). 9)-3 Efeito antitumoral - (3)
[00332] A linhagem de células tumorais NIH:OVCAR-3 (ATCC) de ovário humanas positivas para CDH6, cuja expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3-1, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.) e a
162 / 164 suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 1 × 107 células na região do flanco direito de cada camundongo nu fêmea (dia 0). No dia 22, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, o conjugado anticorpo-fármaco H01L02-DXd produzido no Exemplo 7, ou NOV0712-DM4 produzido no Exemplo de Referência 2 foram administrados por via intravenosa a doses de 1 ou 3 mg/kg na cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 14. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de SE.
[00333] O NOV0712-DM4 não apresentou nenhum efeito antitumoral na dose de 1 mg/kg e apresentou um efeito antitumoral na dose de 3 mg/kg, embora o crescimento do tumor tenha sido observado duas semanas após a administração. Por outro lado, o H01L02-DXd suprimiu significativamente o aumento do volume do tumor após a administração nas doses de 1 e 3 mg/kg, e sustentou, particularmente, na dose de 3 mg/kg, o efeito de inibição do crescimento do tumor por um longo período de 31 dias após a administração (Figura 14).
[00334] O efeito de inibição do crescimento do tumor de NOV0712- DM4 produzido no Exemplo de Referência 2 ou H01L02-DM4 produzido no Exemplo de Referência 3 foi avaliado da mesma maneira que acima usando células PA-1. O H01L02-DM4 diminuiu ainda mais o volume do tumor que o NOV0712-DM4. Assim, o anticorpo H01L02 da presente invenção é superior como um anticorpo para conjugados anticorpo-fármaco atuando como agentes antitumorais em comparação com o anticorpo NOV0712. 9)-4 Efeito antitumoral - (4)
[00335] A linhagem de células tumorais 786-O (ATCC) de células renais humanas positivas para CDH6, cuja expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3-1, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.) e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 5 × 106
163 / 164 células na região do flanco direito de cada camundongo SCID macho (dia 0). No dia 20, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, o conjugado anticorpo-fármaco H01L02-DXd produzido no Exemplo 7, ou NOV0712-DM4 produzido no Exemplo de Referência 2 foram administrados por via intravenosa a doses de 1 ou 3 mg/kg na cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 15. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de SE.
[00336] O NOV0712-DM4 não apresentou efeito antitumoral significativo em nenhuma das doses de 1 e 3 mg/kg nesse modelo de tumor. Por outro lado, o H01L02-DXd diminuiu o volume do tumor após a administração nas doses de 1 e 3 mg/kg, e exerceu, particularmente, na dose de 3 mg/kg, regressão significativa do tumor, e sustentou o efeito de regressão do tumor por 20 dias após a administração (Figura 15). 9)-5 Efeito antitumoral - (5)
[00337] A linhagem de células tumorais ES-2 (ATCC) de ovário humanas negativas para CDH6, cuja ausência de expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3-1, foi suspensa em solução salina fisiológica, e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 1 × 106 células na região do flanco direito de cada camundongo nu fêmea (dia 0). No dia 7, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, o conjugado anticorpo-fármaco H01L02-DXd produzido no Exemplo 7, ou NOV0712-DM4 produzido no Exemplo de Referência 2 foram administrados por via intravenosa a doses de 1 ou 3 mg/kg na cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 16. A abcissa representa o número de dias e a ordenada representa o volume do tumor. O intervalo de erro representa um valor de SE.
[00338] Nesse modelo de tumor que não expressa CDH6, H01L02- DXd e NOV0712-DM4 não apresentaram efeito antitumoral em nenhuma das
164 / 164 doses. A partir desse resultado, o efeito antitumoral do conjugado anticorpo- fármaco no modelo de tumor positivo para CDH6 demonstrado nos Exemplos 9)-1, 9)-2, 9)-3, e 9)-4 é um efeito dependente da expressão de CDH6 nas células tumorais. Assim, o conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção é considerado como um fármaco antitumoral seletivo e seguro que apresenta especificamente um efeito antitumoral no tumor positivo para CDH6 sem causar citotoxicidade em tecidos normais negativos para CDH6 (Figura 16). Aplicabilidade industrial
[00339] A presente invenção fornece um anticorpo anti-CDH6 com atividade de internalização e um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo o anticorpo. O conjugado anticorpo-fármaco pode ser usado como um fármaco terapêutico para câncer e similares.

Claims (1)

1 / 18
REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4 e com capacidade de internalização que permite a captação celular, ou um fragmento funcional do anticorpo.
2. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem atividade inibidora competitiva, para ligação à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, contra pelo menos qualquer anticorpo selecionado do grupo que consiste nos seguintes anticorpos (1) a (5): (1) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 53 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 56, (2) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69, (3) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, (4) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, e (5) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a
2 / 18 471 na SEQ ID NO: 77.
3. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende CDRL1, CDRL2 e CDRL3 em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (1) a (4): (1) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, (2) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 23, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 24, (3) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 33, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, e (4) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 44, e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (5) a (9): (5) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19, (6) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 27, CDRH2 que consiste na sequência de
3 / 18 aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 29, (7) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 38, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 39, (8) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 47, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49, e (9) CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19.
4. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (1) a (5): (1) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19, (2) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22, CDRL2 que consiste na sequência de
4 / 18 aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 23, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 24, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 27, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 29, (3) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 33, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 38, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 39, (4) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 44, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 47, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49, e (5) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13, e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60, e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:
5 / 18
19.
5. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser humanizado.
6. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que tem qualquer região variável de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas seguintes regiões variáveis (1) a (4): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 67, (3) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (1) e (2), e (4) uma sequência de aminoácidos que compreende uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (1) a (3), e qualquer região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas seguintes regiões variáveis (5) a (9): (5) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 71, (6) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 75, (7) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 79, (8) uma sequência de aminoácidos com uma homologia de
6 / 18 sequência de pelo menos 95% ou mais com a sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (5) a (7), e (9) uma sequência de aminoácidos que compreende uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de uma região estrutural diferente de cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (5) a (8).
7. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada em qualquer uma das seguintes combinações (1) a (4): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 71, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 75, (3) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 67 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 75, e (4) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 79.
8. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que
7 / 18 tem qualquer uma das seguintes combinações (1) a (4): (1) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69, (2) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, (3) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, e (4) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77.
9. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69.
10. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73.
11. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73.
12. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo
8 / 18 com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77.
13. Fragmento funcional do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o fragmento funcional é selecionado do grupo que consiste em Fab, F(ab')2, Fab' e Fv.
14. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
15. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende polinucleotídeos em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (1) a (5): (1) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19, (2) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 23 e CDRL3 que consiste na
9 / 18 sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 24, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 27, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 29, (3) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 33 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 38 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 39, (4) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 44, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 47, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49, e (5) um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência
10 / 18 de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19.
16. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69.
17. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73.
18. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73.
19. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada
11 / 18 que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77.
20. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 19.
21. Células hospedeiras, caracterizadas pelo fato de serem transformadas com o vetor de expressão como definido na reivindicação 20.
22. Células hospedeiras de acordo com a reivindicação 21, caracterizadas pelo fato de que as células hospedeiras são células eucarióticas.
23. Método para produzir um anticorpo de interesse ou um fragmento funcional do anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar as células hospedeiras como definidas na reivindicação 21 ou 22, e a etapa de coletar de um anticorpo de interesse ou um fragmento funcional do anticorpo da cultura obtida pela etapa mencionada acima.
24. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada ou a cadeia leve passou por uma ou duas ou mais modificações selecionadas do grupo que consiste em glicosilação ligada a N, glicosilação ligada a O, processamento N-terminal, processamento C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, oxidação de metionina, adição de um resíduo de metionina ao terminal N, amidação de um resíduo de prolina, conversão de glutamina N-terminal ou ácido glutâmico N-terminal em ácido piroglutâmico, e uma deleção de um ou dois aminoácidos do terminal carboxila.
25. Anticorpo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que um ou dois aminoácidos são deletados do terminal carboxila de uma cadeia pesada do mesmo.
26. Anticorpo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que um aminoácido é deletado de cada um dos terminais
12 / 18 carboxila de ambas as cadeias pesadas do mesmo.
27. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que um resíduo de prolina no terminal carboxila de uma cadeia pesada do mesmo é adicionalmente amidado.
28. Anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou 24 a 27, caracterizado pelo fato de que a modificação da cadeia de açúcar é regulada para intensificar a atividade citotóxica celular dependente de anticorpo.
29. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou 24 a 28 conjugado a um fármaco.
30. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o fármaco é um composto antitumoral.
31. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o composto antitumoral é um composto antitumoral representado pela seguinte fórmula: [Fórmula 1]
32. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado com o fármaco através de um ligante com uma estrutura selecionada do grupo que consiste nas seguintes fórmulas (a) a (f): (a) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-
13 / 18 CH2CH2CH2-C(=O)-, (b) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, (c) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, (d) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, (e) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, e (f) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-, em que o anticorpo é conectado ao terminal de -(Succinimid-3- il-N), o composto antitumoral é conectado ao grupo carbonila da fração - CH2CH2CH2-C(=O)- de (a), (b), (e) ou (f), da fração CH2-O-CH2-C(=O)- de (c) ou da fração CH2CH2-O-CH2-C(=O)- de (d) com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como uma posição de conexão, GGFG representa uma sequência de aminoácidos que consiste em glicina-glicina-fenilalanina- glicina ligada através de ligações peptídicas, e -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: [Fórmula 2] que é conectado ao anticorpo na posição 3 do mesmo e é conectado a um grupo metileno na estrutura ligante que contém essa estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1.
33. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer
14 / 18 uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que o ligante é representado por qualquer fórmula selecionada do grupo que consiste nas seguintes fórmulas (c), (d) e (e): (c) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, (d) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, e (e) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
34. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, caracterizado pelo fato de que o ligante é representado pela seguinte fórmula (c) ou (e): (c) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, e (e) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
35. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 34, caracterizado pelo fato de que tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: [Fórmula 3] em que AB representa o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo, n representa o número médio de unidades da estrutura de
15 / 18 fármaco-ligante conjugada ao anticorpo por anticorpo, e o anticorpo é conectado ao ligante através de um grupo sulfidrila derivado do anticorpo.
36. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 34, caracterizado pelo fato de que tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: [Fórmula 4] em que AB representa o anticorpo ou o fragmento funcional do anticorpo, n representa o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante conjugada ao anticorpo por anticorpo, e o anticorpo é conectado ao ligante através de um grupo sulfidrila derivado do anticorpo.
37. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 36, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada em qualquer combinação selecionada do grupo que consiste nas seguintes combinações (1) a (4), ou um fragmento funcional do anticorpo: (1) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69, (2) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73,
16 / 18 (3) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 65 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 73, e (4) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77.
38. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo que compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 69, ou um fragmento funcional do anticorpo.
39. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo que compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 na SEQ ID NO: 61 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 na SEQ ID NO: 77, ou um fragmento funcional do anticorpo.
40. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 39, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada ou a cadeia leve passou por uma ou duas ou mais modificações selecionadas do grupo que consiste em glicosilação ligada a N, glicosilação ligada a O, processamento N-terminal, processamento C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, oxidação de metionina, adição de um resíduo de metionina ao terminal N, amidação de um resíduo de prolina, conversão de glutamina N-terminal ou ácido glutâmico N-terminal em ácido piroglutâmico, e uma deleção de um ou dois aminoácidos do terminal carboxila.
41. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer
17 / 18 uma das reivindicações 29 a 40, caracterizado pelo fato de que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está na faixa de 1 a 10.
42. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está na faixa de 2 a 8.
43. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está na faixa de 5 a 8.
44. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o número médio de unidades da estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está na faixa de 7 a 8.
45. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 44, um sal do mesmo ou um hidrato do conjugado ou sal.
46. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de ser um fármaco antitumoral.
47. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o tumor é um tumor que expressa CDH6.
48. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizada pelo fato de que o tumor é carcinoma de células renais, carcinoma renal de células claras, carcinoma de células renais papilares, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso do ovário, câncer de tiroide, câncer do duto biliar, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, glioblastoma, mesotelioma, câncer uterino, câncer de pâncreas,
18 / 18 tumor de Wilms ou neuroblastoma.
49. Uso de qualquer componente selecionado do conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 44, um sal do mesmo e um hidrato do conjugado ou sal, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar um tumor em um indivíduo.
50. Uso de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor que expressa CDH6.
51. Uso de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que o tumor é carcinoma de células renais, carcinoma renal de células claras, carcinoma de células renais papilares, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso do ovário, câncer de tiroide, câncer do duto biliar, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, glioblastoma, mesotelioma, câncer uterino, câncer de pâncreas, tumor de Wilms ou neuroblastoma.
52. Uso de uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um componente selecionado do conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 44, um sal do mesmo e um hidrato do conjugado ou sal, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar um tumor em um indivíduo, em que o medicamento é administrado simultânea, separada ou continuamente com pelo menos um fármaco antitumoral.
53. Método para produzir um conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de reação do anticorpo ou do fragmento funcional do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou 24 a 28, ou um anticorpo ou um fragmento funcional do anticorpo obtido pelo método de produção como definido na reivindicação 23 com um composto intermediário de fármaco-ligante.
Contagem de células Contagem de células Figura 1
Petição 870200000169, de 02/01/2020, pág. 190/216 Contagem de células Contagem de células 1/25
Contagem de células
Figura 2-1
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de comprimento total
Contagem de células Contagem de células Contagem de células Contagem de células
Contagem de células
Figura 2-2
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC1 deletado
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células Contagem de células Contagem de células
Figura 2-3
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC2 deletado
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células Contagem de células Contagem de células
Figura 2-4
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC3 deletado
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células Contagem de células Contagem de células
Figura 2-5
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC4 deletado
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células Contagem de células Contagem de células
Figura 2-6
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC5 deletado
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células
Figura 3
Petição 870200000169, de 02/01/2020, pág. 197/216 Contagem de células Contagem de células 8/25
Contagem de células Contagem de células
Figura 4
Atividade de ATP (RLU)
Controle negativo
IgG2b de rato
Nome do clone do anticorpo
Taxa de sobrevivência celular de NIH:OVCAR-3 usando Rat-ZAP (%)
IgG2b de rato Atividade de ATP (RLU)
Controle negativo
IgG2b de rato
Nome do clone do anticorpo Taxa de sobrevivência celular de 786-O usando Rat-ZAP (%) IgG2b de rato
Figura 5
Célula 293α transfectada
(Controle)
Anticorpo chG019
Figura 6-1
Controle
Anticorpo (nM)
Controle
Anticorpo (nM)
Controle
Anticorpo (nM)
Figura 6-2
Controle
Anticorpo (nM)
hIgG1 controle
Controle
Anticorpo (nM)
Figura 7-1
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de comprimento total
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células Contagem de células
Figura 7-2
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC1 deletado Contagem de células
Contagem de células
Contagem de células Contagem de células Contagem de células
Contagem de células
Figura 7-3
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC2 deletado Contagem de células
Contagem de células
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células
Contagem de células
Figura 7-4
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC3 deletado
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células
Contagem de células
Figura 7-5
Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC4 deletado Contagem de células
Contagem de células
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células
Contagem de células
Figura 7-6 Célula de controle ou célula transfectada com hCDH6 de EC5 deletado Contagem de células
Contagem de células
Contagem de células Contagem de células
Contagem de células
Contagem de células
Figura 8
Linhagem celular parental Linhagem celular de expressão estável Contagem de células Contagem de células
Figura 9
Ensaio de competição para ligação a célula pré-tratada com NOV0712 marcada com Alexa 488
Anticorpo não marcado (nM)
Ensaio de competição para ligação a célula pré-tratada com H01L02 marcada com Alexa 488
Anticorpo não marcado (nM)
Figura 10-1 Atividade de ATP (RLU)
Controle negativo
IgG1 humana
Nome do clone do anticorpo
Taxa de sobrevivência celular de NIH:OVCAR-3 usando Hum-ZAP (%)
IgG1 humana
Figura 10-2 Atividade de ATP (RLU)
Controle negativo
IgG1 humana
Nome do clone do anticorpo
Taxa de sobrevivência celular de 786-O usando Hum-ZAP
IgG1 humana
Figura 10-3
Atividade de ATP (RLU)
Controle negativo
IgG1 humana
Nome do clone do anticorpo
Taxa de sobrevivência celular de PA-1 usando Hum-ZAP (%)
IgG1 humana
Figura 11 Taxa de sobrevivência celular (%)
Conjugado anticorpo-fármaco (nM)
Figura 12
Tampão ABS Volume do tumor (mm³)
Número de dias após administração
Figura 13 Volume do tumor (mm³)
Tampão
Número de dias após administração
Figura 16 Volume do tumor (mm³)
Tampão ABS
Número de dias após administração
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