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TWI794230B - 抗ｃｄｈ６抗體及抗ｃｄｈ６抗體-藥物結合物、以及其製造方法 - Google Patents

抗ｃｄｈ６抗體及抗ｃｄｈ６抗體-藥物結合物、以及其製造方法 Download PDF

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TWI794230B
TWI794230B TW107116035A TW107116035A TWI794230B TW I794230 B TWI794230 B TW I794230B TW 107116035 A TW107116035 A TW 107116035A TW 107116035 A TW107116035 A TW 107116035A TW I794230 B TWI794230 B TW I794230B
Authority
TW
Taiwan
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antibody
amino acid
acid sequence
seq
sequence described
Prior art date
Application number
TW107116035A
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English (en)
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TW201900683A (zh
Inventor
齊藤敦子
平田剛之
中村健介
Original Assignee
日商第一三共股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=64273811&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI794230(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 日商第一三共股份有限公司 filed Critical 日商第一三共股份有限公司
Publication of TW201900683A publication Critical patent/TW201900683A/zh
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Abstract

本發明之課題係提供一種具有會與CDH6結合之內在化活性的抗體、該抗體與具有抗腫瘤活性的藥物之抗體-藥物結合物、使用了該抗體-藥物結合物的對腫瘤具有治療效果之醫藥品、及使用了該抗體、該抗體-藥物結合物或該醫藥品的腫瘤之治療方法。
依據本發明，而可提供具有內在化活性的抗CDH6抗體、該抗體與具有抗腫瘤活性的藥物之抗體-藥物結合物、使用此等的醫藥品及腫瘤之治療方法。

Description

抗CDH6抗體及抗CDH6抗體-藥物結合物、以及其製造方法
本發明係關於與CDH6結合，且具有內在化作用的抗CDH6抗體、該抗CDH6抗體之製造方法、以及包含該抗體的抗體-藥物結合物、包含該抗體-藥物結合物的抗腫瘤劑等。
黏附蛋白(cadherin)係存在於細胞膜表面的糖蛋白質，因鈣離子依賴性地N末端側之細胞外域彼此結合，而作為細胞間接著分子發揮作用，還作為擔任細胞間相互作用的信號分子發揮作用。黏附蛋白超家族(superfamily)之內，被分類為傳統黏附蛋白的分子群，係由5個細胞外域(extracellular domain、EC域)與1個跨膜域、及細胞內域所構成的1次跨膜蛋白質。傳統黏附蛋白係由胺基酸序列之相同性，分類為E-黏附蛋白、N-黏附蛋白所代表的第I型家族、及第II型家族。
黏附蛋白6(cadherin-6、CDH6)係被分類於第II型黏附蛋白家族，為由790個胺基酸所構成的1次跨膜蛋白質，於細胞外持有N末端側，於細胞內持有C末 端側。人類CDH6基因係於1995年首次被選殖(非專利文獻1)，可參考NM＿004932、NP＿004923(NCBI)等之登錄號。
CDH6係於發育期間於腦、腎臓中特異性地表現，已有報告於中樞神經系統的回路形成(非專利文獻2、非專利文獻3)、腎臓的腎元發育時(非專利文獻4、非專利文獻5)擔任重要任務。於成人之正常組織，CDH6之表現侷限於腎小管、膽管上皮細胞等。
另一方面，已知於成人的某些癌種，於腫瘤部位CDH6之表現會特異性地亢進，且在人類腎細胞癌，特別是腎臟透明細胞癌，已有報告CDH6表現及預後不良的相關、作為腫瘤標記的可利用性(非專利文獻6、非專利文獻7)。在人類卵巢癌亦已有報告CDH6的高表現(非專利文獻8)，亦有CDH6參與人類甲狀腺癌之上皮間質轉換及轉移的報告(非專利文獻9)。又，已有報告CDH6亦於人類膽管癌及人類小細胞肺癌中表現(非專利文獻12、13)。
癌症為死亡的主要原因，雖預計其罹患數會隨著人口高齡化而增加，但治療需求尚未充分被滿足。歷來之化學療法劑係因它們的選擇性低而有以下問題：因不僅對腫瘤細胞而且對正常細胞皆具有傷害性所致副作用、或無法投予充分的藥劑量而無法充分獲得藥劑的效果。因此，近年來，已進行開發選擇性更高的分子標的藥及抗體醫藥，其係以對癌細胞顯示特徵的變異及高表現的分子、參與細胞癌化的特定分子為標的。
抗體因血中安定性高，且會特異性地結合於標的抗原而可期待副作用的減輕，已經開發多種對於癌細胞表面上高表現的分子的抗體醫藥。就利用了抗體之抗原特異的結合能力的技術之一者而言，可列舉抗體-藥物結合物(Antibody-Drug Conjugate；ADC)。ADC係使具有細胞傷害活性的藥物結合於抗體者，而該抗體會與於癌細胞表面上表現的抗原結合且藉由該結合而可將抗原內化於細胞內，與結合者。ADC係藉由可有效率地將藥物送達至癌細胞，而可期待使藥物蓄積於癌細胞內，且使癌細胞死亡(非專利文獻10、專利文獻1及2)。作為ADC，例如，使單甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E)結合於抗CD30單株抗體的ADCetris(商標)(Brentuximab vedotin)已被認可作為何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及未分化大細胞淋巴瘤的治療藥。又，使美坦新(emtansine)結合於抗HER2單株抗體的Kadcyla(商標)(曲妥珠單抗-美坦新(trastuzumab emtansine))被用於HER2陽性的進行、再發乳癌的治療。
就適合作為抗腫瘤藥的ADC之標的抗原之特徵而言，可列舉於癌細胞表面特異性高表現且於正常細胞為低表現或未表現、可內化至細胞內、不會自細胞表面分泌抗原等。又，就適合ADC的抗體之重要特徵而言，除了會特異性地結合於成為標的之抗原以外，可列舉具有高內在化能力。抗體之內在化能力係取決於標的抗原與抗體兩者的性質，而要由標的之分子結構來推定適合內在化的抗原結合部位，或由抗體的結合強度、物 性等來輕易地推測內在化能力高的抗體係困難。因此，取得對標的抗原具有高內在化能力的抗體，係於開發有效性高的ADC上成為重要的課題(非專利文獻11)。
就將CDH6作為標的的ADC而言，已知有使DM4結合於會與CDH6之EC域5(EC5)特異性地結合之抗CDH6抗體的ADC(專利文獻3)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2014/057687
[專利文獻2]US2016/0297890
[專利文獻3]WO2016/024195
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Shimoyama Y,et al., Cancer Research, 2206-2211, 55, May 15, 1995
[非專利文獻2]Inoue T,et al., Developmental Biology, 183-194, 1997
[非專利文獻3]Osterhout J A,et al., Neuron, 632-639, 71, Aug 25, 2011
[非專利文獻4]Cho E A,et al., Development, 803-812, 125, 1998
[非專利文獻5]Mah S P,et al., Developmental Biology, 38-53, 223, 2000
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[非專利文獻7]Shimazui T,et al., Cancer, 963-968, 101(5), Sep.1, 2004
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[非專利文獻10]Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016
[非專利文獻11]Peters C,et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015
[非專利文獻12]Goeppert B,et al., Epigenetics, 780-790, 11(11), 2016
[非專利文獻13]Yokoi S, et al., American Journal of Pathology, 207-216, 161, 1, 2002
本發明之課題，係提供會對於CDH6特異性地結合的高內在化活性的抗體、含有該抗體且具有高抗腫瘤活性的抗體-藥物結合物、使用該抗體-藥物結合物的具有抗腫瘤的治療效果的醫藥品、及使用該抗體、抗體-藥物結合物或醫藥品的腫瘤之治療方法等。
本發明者等，為了達成上述課題而深入檢討的結果，驚訝地發現了：與CDH6之細胞外域3(本說明 書中，亦稱為EC3)特異性地結合的抗體，於表現CDH6的細胞具有極高的內在化活性，且有用於作為ADC抗體。再者，發現了：使在細胞內會發揮毒性的藥劑介隔特定結構的連接物而結合於該抗CDH6抗體的抗CDH6抗體-藥物結合物，會顯示較歷來之CDH6藥物複合體更強的抗腫瘤活性。
本案發明包含以下之發明；〔1〕一種抗體或該抗體之機能性片段，其與序列識別號4記載之胺基酸序列專一性結合，具有被併入細胞內的內在化能力；〔2〕如〔1〕記載之抗體或該抗體之機能性片段，其與序列識別號4記載之胺基酸序列的結合，具有與選自包含以下之(1)~(5)的群組之抗體中至少一者的競爭抑制活性：(1)具有由序列識別號53之第21~233號記載之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號56之第20~471號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體；(2)具有由序列識別號61之第21~233號記載之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體；(3)具有由序列識別號61之第21~233號記載之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體；(4)具有由序列識別號65之第21~233號記載之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471 號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體；及(5)具有由序列識別號61之第21~233號記載之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體；〔3〕如〔1〕或〔2〕中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含選自包含以下之(1)~(4)的群組之任一者記載之CDRL1、CDRL2及CDRL3、以及選自包含以下之(5)~(9)的群組之任一者記載之CDRH1、CDRH2及CDRH3：(1)由序列識別號12記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14記載之胺基酸序列所構成的CDRL3；(2)由序列識別號22記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號23記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號24記載之胺基酸序列所構成的CDRL3；(3)由序列識別號32記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號33記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號34記載之胺基酸序列所構成的CDRL3；及(4)由序列識別號42記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號43記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號44記載之胺基酸序列所構成的CDRL3，以及 (5)由序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號18記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；(6)由序列識別號27記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號28記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號29記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；(7)由序列識別號37記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號38記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號39記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；(8)由序列識別號47記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號48記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號49記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；及(9)由序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號60記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；〔4〕如〔1〕~〔3〕中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含選自包含以下之(1)~(5)的群組之CDRL1、CDRL2及CDRL3、以及CDRH1、CDRH2及CDRH3：(1)由序列識別號12記載之胺基酸序列所構成的 CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14記載之胺基酸序列所構成的CDRL3；及由序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號18記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；(2)由序列識別號22記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號23記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號24記載之胺基酸序列所構成的CDRL3；及由序列識別號27記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號28記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號29記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；(3)由序列識別號32記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號33記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號34記載之胺基酸序列所構成的CDRL3；及由序列識別號37記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號38記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號39記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；(4)由序列識別號42記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號43記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號44記載之胺基酸序列所構成的CDRL3；及由序列識別號47記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號48記載之胺基酸序列所構成的 CDRH2及由序列識別號49記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；及(5)由序列識別號12記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14記載之胺基酸序列所構成的CDRL3；及由序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號60記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；〔5〕如〔1〕~〔4〕中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其經人類化；〔6〕如〔1〕~〔5〕中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其具有選自包含以下之(1)~(4)的群組之至少一者記載之輕鏈可變區、以及選自包含以下之(5)~(9)的群組之至少一者記載之重鏈可變區：(1)由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區；(2)由序列識別號67記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區；(3)對於(1)~(2)之胺基酸序列各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(4)於(1)~(3)之胺基酸序列中各CDR序列以外之框架區的序列有1或數個胺基酸缺失、取代或添加的胺基酸序列；以及 (5)由序列識別號71記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；(6)由序列識別號75記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；(7)由序列識別號79記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；(8)對於(5)~(7)之胺基酸序列各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列；及(9)於(5)~(8)之胺基酸序列中各CDR序列以外之框架區的序列有1或數個胺基酸缺失、取代或添加的胺基酸序列；〔7〕如〔1〕~〔6〕中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其包含以下之(1)~(4)之任一者之輕鏈可變區及重鏈可變區：(1)由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號71記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；(2)由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號75記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；(3)由序列識別號67記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號75記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；或(4)由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕 鏈可變區及由序列識別號79記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；〔8〕如〔1〕~〔7〕中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其具有以下之(1)~(4)之任一者：(1)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；(2)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；(3)由序列識別號65之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；或(4)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；〔9〕如〔8〕記載之抗體或該抗體之機能性片段，其具有由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；〔10〕如〔8〕記載之抗體或該抗體之機能性片段，其具有由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；〔11〕如〔8〕記載之抗體或該抗體之機能性片段， 其具有由序列識別號65之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；〔12〕如〔8〕記載之抗體或該抗體之機能性片段，其具有由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；〔13〕如〔1〕~〔12〕中任一項記載之抗體之機能性片段，其中機能性片段選自包含Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv的群組；〔14〕一種多核苷酸，其係編碼如〔1〕~〔13〕中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段的多核苷酸；〔15〕如〔14〕記載之多核苷酸，其包含選自包含以下之(1)~(5)的群組之至少一者記載之多核苷酸：(1)編碼包含由序列識別號12記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編碼包含由序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號18記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸；(2)編碼包含由序列識別號22記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號23記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號24記載之胺基酸序列所 構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編碼包含由序列識別號27記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號28記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號29記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸；(3)編碼包含由序列識別號32記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號33記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號34記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編碼包含由序列識別號37記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號38記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號39記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸；(4)編碼包含由序列識別號42記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號43記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號44記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編碼包含由序列識別號47記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號48記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號49記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸；以及(5)編碼包含由序列識別號12記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編碼包含由 序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號60記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸；〔16〕如〔14〕或〔15〕記載之多核苷酸，其包含編碼由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈的多核苷酸及編碼由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的多核苷酸；〔17〕如〔14〕或〔15〕記載之多核苷酸，其包含編碼由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈的多核苷酸及編碼由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的多核苷酸；〔18〕如〔14〕或〔15〕記載之多核苷酸，其包含編碼由序列識別號65之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈的多核苷酸及編碼由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的多核苷酸；〔19〕如〔14〕或〔15〕記載之多核苷酸，其包含編碼由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈的多核苷酸及編碼由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的多核苷酸；〔20〕一種表現載體，其含有如〔14〕~〔19〕中任一項記載之多核苷酸；〔21〕一種宿主細胞，其係藉由如〔20〕記載之表現載體而被轉形；〔22〕如〔21〕記載之宿主細胞，其中宿主細胞為 真核細胞；〔23〕一種抗體或該抗體之機能性片段之製造方法，其特徵為包含培養如〔21〕或〔22〕記載之宿主細胞的步驟、及自於該步驟所獲得的培養物採取目的之抗體或該抗體之機能性片段的步驟；〔24〕如〔1〕~〔13〕中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其係重鏈或輕鏈受到選自包含以下的群組之1或2個以上之修飾：對N-鍵結的糖鏈加成、對O-鍵結的糖鏈加成、N末端的加工處理、C末端的加工處理、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化、於N末端的甲硫胺酸殘基的加成、脯胺酸殘基之醯胺化、N末端麩醯胺酸或N末端麩胺酸之焦麩胺酸化、及羧基末端中的1個或2個胺基酸缺失；〔25〕如〔24〕記載之抗體，其係於重鏈之羧基末端有1個或2個胺基酸缺失；〔26〕如〔25〕記載之抗體，其係於2條重鏈的雙方，於羧基末端有1個胺基酸缺失；〔27〕如〔24〕~〔26〕中任一項記載之抗體，其重鏈之羧基末端的脯胺酸殘基進一步被醯胺化；〔28〕如選自包含〔1〕~〔13〕及〔24〕~〔27〕所的群組之任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段，其為了使抗體依賴性細胞傷害活性增強，而糖鏈修飾被調節；〔29〕一種抗體-藥物結合物，其係藥物結合於如選自包含〔1〕~〔13〕及〔24〕~〔28〕的群組之任一項 記載之抗體或該抗體之機能性片段；〔30〕如〔29〕記載之抗體-藥物結合物，其中藥物為抗腫瘤性化合物；〔31〕如〔30〕記載之抗體-藥物結合物，其中抗腫瘤性化合物為下式所示的抗腫瘤性化合物：
Figure 107116035-A0202-12-0017-208
 〔32〕如〔29〕~〔31〕中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體及藥物為介隔選自包含下式(a)~(f)的群組之任一者的結構的連接物而結合：(a)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；(b)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；(c)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；(d)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；(e)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；及(f)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-，(其中，抗體係結合於-(琥珀醯亞胺-3-基-N)之末端；抗腫瘤性化合物係將1位之胺基之氮原子作為結合部位，而與(a)、(b)、(e)或(f)之-CH2CH2CH2-C(=O)-部分、(c)之CH2-O-CH2-C(=O)-部分或(d)之CH2CH2-O-CH2-C(=O)-部分的羰基結合；上述式中GGFG係表示以由甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸所構成之肽鍵而連結的胺基酸序列；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-係下式所示的結構：
Figure 107116035-A0202-12-0018-209
 在其之3位與抗體結合，且在1位之氮原子上與包含其之連接物結構內的亞甲基結合)；〔33〕如〔29〕~〔32〕中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中連接物係以選自包含以下之(c)、(d)及(e)的群組之任一者之式表示：(c)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；(d)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；(e)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；〔34〕如〔29〕~〔33〕中任一項記載之抗體-藥物 結合物，其中連接物係以以下之(c)或(e)之式表示：(c)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；(e)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；〔35〕如〔29〕~〔34〕中任一項記載之抗體-藥物結合物，其具有以下之式所表示的結構：
Figure 107116035-A0202-12-0019-210
 其中，AB表示抗體或該抗體之機能性片段；n表示與抗體結合的藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數；抗體與連接物係介隔源自抗體的硫氫基而結合；〔36〕如〔29〕~〔34〕中任一項記載之抗體-藥物結合物，其具有以下之式所表示的結構：
Figure 107116035-A0202-12-0020-211
 其中，AB表示抗體或該抗體之機能性片段；n表示與抗體結合的藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數；抗體與連接物係介隔源自抗體的硫氫基而結合；〔37〕如〔29〕~〔36〕中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體為包含選自包含以下之(1)~(4)的群組之至少一者記載之輕鏈及重鏈的抗體或該抗體之機能性片段：(1)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；(2)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；(3)由序列識別號65之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；或(4)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列 所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；〔38〕如〔37〕記載之抗體-藥物結合物，其中抗體為包含由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體或該抗體之機能性片段；〔39〕如〔37〕記載之抗體-藥物結合物，其中抗體為包含由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體或該抗體之機能性片段；〔40〕如〔29〕~〔39〕中任一項記載之抗體-藥物結合物，其係重鏈或輕鏈受到選自包含下列的群組之1或2以上之修飾：對N-鍵結的糖鏈加成、對O-鍵結的糖鏈加成、N末端的加工處理、C末端的加工處理、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化、於N末端的甲硫胺酸殘基的加成、脯胺酸殘基之醯胺化、N末端麩醯胺酸或N末端麩胺酸之焦麩胺酸化及羧基末端中的1個或2個胺基酸缺失；〔41〕如〔29〕~〔40〕中任一項記載之抗體-藥物結合物，其係經選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為1~10個之範圍；〔42〕如〔41〕記載之抗體-藥物結合物，其係經選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為2~8個之範圍；〔43〕如〔42〕記載之抗體-藥物結合物，其係經選 擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為5~8個之範圍；〔44〕如〔43〕記載之抗體-藥物結合物，其係經選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為7~8個；〔45〕一種醫藥組成物，其特徵為包含如〔29〕~〔44〕中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物；〔46〕如〔45〕記載之醫藥組成物，其為抗腫瘤藥；〔47〕如〔46〕記載之醫藥組成物，其中腫瘤為表現CDH6的腫瘤；〔48〕如〔46〕或〔47〕記載之醫藥組成物，其中腫瘤為腎細胞癌、腎臟透明細胞癌(clear cell carcinoma of kidney)、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌(ovarian serous adenocarcinoma)、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌、小細胞肺癌、神經膠母細胞瘤、間皮瘤(mesothelioma)、子宮癌、胰臓癌、威爾姆氏瘤(Wilms' tumor)或神經胚細胞瘤(neuroblastoma)；〔49〕一種腫瘤之治療方法，其特徵為對個體投予選自如〔29〕~〔44〕中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物之任一者；〔50〕如〔49〕記載之治療方法，其中腫瘤為表現CDH6的腫瘤；〔51〕如〔49〕或〔50〕記載之治療方法，其中腫瘤為腎細胞癌、腎臟透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵 巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌、小細胞肺癌、神經膠母細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰臓癌、威爾姆氏瘤或神經胚細胞瘤；〔52〕一種腫瘤之治療方法，其特徵為將包含選自如〔29〕~〔44〕中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物之至少一者的醫藥組成物及至少一種抗腫瘤藥，同時、分別或連續投予至個體；〔53〕一種抗體-藥物結合物之製造方法，其特徵為包含使如選自包含〔1〕~〔13〕及〔24〕~〔28〕的群組之任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段或是以如〔23〕記載之製造方法所獲得的抗體或該抗體之機能性片段、與藥物-連接物中間化合物進行反應的步驟；或〔54〕一種抗體-藥物結合物之製造方法，其特徵為包含培養如〔21〕或〔22〕記載之宿主細胞的步驟、自該步驟獲得的培養物採取目的之抗體或該抗體之機能性片段的步驟、及使該步驟所獲得的抗體或該抗體之機能性片段與藥物-連接物中間化合物進行反應的步驟。
本發明之抗CDH6抗體，係特徵為特異性辨識CDH6之EC域3(EC3)，且具有高內在化活性。使在細胞內會發揮毒性的藥劑介隔特定結構的連接物而結合於本發明之抗CDH6抗體的抗CDH6抗體-藥物結合物，係藉由對於具有會表現CDH6的癌細胞的患者進行投予，而可期待達成優異的抗腫瘤效果及安全性。即，本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物係有用於作為抗腫瘤 劑。
[圖1]圖1呈示調查大鼠抗CDH6單株抗體4種(株編號為rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照之對於對照細胞或hCDH6導入293T細胞的結合的流動式細胞測量術之結果。橫軸呈示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖2-1]圖2-1呈示調查大鼠抗CDH6單株抗體4種(rG019、rG055、rG056及rG061)或陰性對照抗體RatIgG2b之對於對照細胞或全長hCDH6導入293細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖2-2]圖2-2呈示大鼠抗CDH6單株抗體4種(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照之對於對照細胞或EC1缺失hCDH6導入293細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖2-3]圖2-3呈示大鼠抗CDH6單株抗體4種(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照之對於對照細胞或EC2缺失hCDH6導入293細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖2-4]圖2-4呈示大鼠抗CDH6單株抗體4種(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照之對於 對照細胞或EC3缺失hCDH6導入293細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖2-5]圖2-5呈示大鼠抗CDH6單株抗體4種(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照之對於對照細胞或EC4缺失hCDH6導入293細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖2-6]圖2-6呈示大鼠抗CDH6單株抗體4種(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照之對於對照細胞或EC5缺失hCDH6導入293細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖3]圖3呈示評價於4種類之人類腫瘤細胞株(人類卵巢腫瘤細胞株NIH：OVCAR-3，PA-1，ES-2及人類腎細胞腫瘤細胞株786-O)之細胞膜表面之CDH6的表現的流動式細胞測量術之結果。橫軸呈示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖4]圖4呈示4種類之大鼠抗CDH6抗體(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照之內在化活性，使用於使結合抑制蛋白質合成的毒素(皂草素(saporin))的抗大鼠IgG試藥Rat-ZAP或作為陰性對照之未結合毒素的山羊抗大鼠IgG，Fc(gamma)Fragment Specific，於NIH：OVCAR-3細胞及786-O細胞進行評價的圖。圖之縱軸呈示ATP活性(RLU)。於各圖表之下方，呈示細胞 生存率(%)，其係將添加陰性對照替代Rat-ZAP的孔之生存細胞數設為100%所算出相對生存率。
[圖5]圖5呈示人類嵌合抗CDH6抗體chG019之對人類CDH6及猴CDH6的結合。橫軸呈示抗體濃度，縱軸係將結合量以平均螢光強度(Mean Fluorescent Intensity)呈示。
[圖6-1]圖6-1及圖6-2呈示人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)或陰性對照抗體人類IgG1之對人類CDH6、猴CDH6、小鼠CDH6、大鼠CDH6的結合性。橫軸呈示抗體濃度，縱軸係將結合量以平均螢光強度(Mean Fluorescent Intensity)呈示。
[圖6-2]圖6-1及圖6-2呈示人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)或陰性對照抗體人類IgG1之對人類CDH6、猴CDH6、小鼠CDH6、大鼠CDH6的結合性。橫軸呈示抗體濃度，縱軸係將結合量以平均螢光強度(Mean Fluorescent Intensity)呈示。
[圖7-1]圖7-1呈示人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照抗體hIgG1之對於對照細胞或全長hCDH6導入293α細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的APC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖7-2]圖7-2呈示人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照抗體hIgG1之對於對照細胞或EC1缺失hCDH6導入293α細胞的結合性。橫軸呈示表現抗 體結合量的APC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖7-3]圖7-3呈示人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照抗體hIgG1之對於對照細胞或EC2缺失hCDH6導入293α細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的APC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖7-4]圖7-4呈示人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照抗體hIgG1之對於對照細胞或EC3缺失hCDH6導入293α細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的APC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖7-5]圖7-5呈示人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照之hIgG1之對於對照細胞或EC4缺失hCDH6導入293α細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的APC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖7-6]圖7-6呈示人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照之hIgG1之對於對照細胞或EC5缺失hCDH6導入293α細胞的結合性。橫軸呈示表現抗體結合量的APC之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖8]圖8呈示調查786-O/hCDH6安定表現細胞株及親細胞株786-O中的人類CDH6之表現的流動式細胞測量術之結果。橫軸呈示抗體結合量的Alexa Fluor 647之螢光強度，縱軸呈示細胞數。
[圖9]圖9呈示與使用(a)標識化NOV0712或(b)標識化H01L02、未標識化的人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照之hIgG1的結合競合試驗。橫軸呈示未標識化的抗體之添加時之終濃度，縱軸將結合量以平均螢光強度(Mean Fluorescent Intensity)表示。
[圖10-1]圖10-1呈示將人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712及陰性對照抗體之內在化活性，使用使抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)結合的抗人類IgG試藥Hum-ZAP或作為陰性對照之未結合毒素的F(ab’)2 Fragment Goat Anti-human IgG，Fc(gamma)Fragment Specific，於NIH：OVCAR-3細胞評價的圖表。圖表之縱軸呈示ATP活性(RLU)。各圖表之下方，呈示細胞生存率(%)，其係將添加陰性對照替代Hum-ZAP的孔之生存細胞數設為100%所算出的相對生存率。
[圖10-2]圖10-2呈示將人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712及陰性對照抗體之內在化活性，使用使抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)結合的抗人類IgG試藥Hum-ZAP或作為陰性對照之未結合毒素的F(ab’)2 Fragment Goat Anti-human IgG，Fc(gamma)Fragment Specific，於786-O細胞評價的圖。圖表之縱軸呈示ATP活性(RLU)。於各圖表之下方呈示細胞生存率(%)，其係將添加陰性對照替代Hum-ZAP的孔之生存細胞數設為 100%所算出的相對生存率。
[圖10-3]圖10-3呈示將人類化hG019抗體4種(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712及陰性對照抗體之內在化活性，使用使抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)結合的抗人類IgG試藥Hum-ZAP或作為陰性對照之未結合毒素的F(ab’)2 Fragment Goat Anti-human IgG，Fc(gamma)Fragment Specific，於PA-1細胞評價的圖表。圖表之縱軸表示ATP活性(RLU)。於各圖表之下方呈示生存率(%)，其係將添加陰性對照替代Hum-ZAP的孔之生存細胞數設為100%所算出的相對生存率。
[圖11]圖11呈示人類化hG019-藥物結合物4種(H01L02-DXd、H02L02-DXd、H02L03-DXd及H04L02-DXd)、或NOV0712-DM4之對PA-1細胞的活體外細胞增殖抑制活性評價。橫軸呈示抗體-藥物結合物之濃度，縱軸呈示細胞生存率(%)。
[圖12]圖12呈示人類化hG019-藥物結合物4種(H01L02-DXd、H02L02-DXd、H02L03-DXd及H04L02-DXd)、或NOV0712-DM4之活體內抗腫瘤效果。使用將CDH6陽性人類腎細胞腫瘤細胞株786-O移植於免疫不全小鼠的動物模型來評價。橫軸呈示日數，縱軸呈示腫瘤體積，誤差範圍表示標準誤差(SE)值。
[圖13]圖13呈示人類化hG019-藥物結合物H01L02-DXd或NOV0712-DM4或NOV0712-DXd之活體內抗腫瘤效果。使用將CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株 PA-1移植於免疫不全小鼠的動物模型來評價。橫軸呈示日數，縱軸呈示腫瘤體積，誤差範圍呈示SE值。
[圖14]圖14呈示人類化hG019-藥物結合物H01L02-DXd或NOV0712-DM4之活體內抗腫瘤效果。使用將CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株NIH：OVCAR-3移植於免疫不全小鼠的動物模型來評價。橫軸呈示日數，縱軸呈示腫瘤體積，誤差範圍呈示SE值。
[圖15]圖15呈示人類化hG019-藥物結合物H01L02-DXd或NOV0712-DM4之活體內抗腫瘤效果。使用將CDH6陽性人類腎細胞腫瘤細胞株786-O移植於免疫不全小鼠的動物模型來評價。橫軸呈示日數，縱軸呈示腫瘤體積，誤差範圍呈示SE值。
[圖16]圖16呈示人類化hG019-藥物結合物H01L02-DXd或NOV0712-DM4之活體內抗腫瘤效果。使用將CDH6陰性人類卵巢腫瘤細胞株ES-2移植於免疫不全小鼠的動物模型來評價。橫軸呈示日數，縱軸呈示腫瘤體積，誤差範圍呈示SE值。
[實施發明之形態]
以下，一邊參照圖式一邊說明用以實施本發明之較佳形態。又，以下說明的實施形態，係呈示本發明之代表性的實施形態之一例，並非藉由此等而狹隘解釋本發明之範圍。
於本說明書，「癌」與「腫瘤」係以相同意義使用。
於本說明書，所謂「基因」之用語不僅包含DNA，亦包含其mRNA、cDNA、及其cRNA。
於本說明書，「多核苷酸」或「核苷酸」係以與核酸相同的意義使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。於本說明書，「多核苷酸」與「核苷酸」只要未特別指定，可交換使用。
於本說明書，「多肽」與「蛋白質」可交換使用。
於本說明書，「細胞」亦包含動物個體內之細胞、培養細胞。
於本說明書，「CDH6」可以與CDH6蛋白質相同意義使用。於本說明書，亦有將人類CDH6記載為「hCDH6」的情形。
於本說明書，「細胞傷害活性」係指以某種形式帶來細胞病理的變化，不僅指直接的外傷，亦指DNA的切斷、或鹼基的二聚體形成、染色體之切斷、細胞分裂裝置之損傷、各種酵素活性的降低等引起之各種細胞之構造或機能上的損傷。
於本說明書，「在細胞內會發揮毒性」係指以某種形式於細胞內顯示毒性，不僅指直接的外傷，亦指DNA的切斷、或鹼基的二聚體形成、染色體之切斷、細胞分裂裝置之損傷、各種酵素活性的降低、細胞增殖因子之作用的抑制等對各種細胞之構造或機能、代謝帶來影響。
於本說明書，「抗體之機能性片段」亦稱為 「抗體之抗原結合片段」，意指具有與抗原的結合活性的抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、diabody、線狀抗體及抗體片段所形成的多特異性抗體等。又，將F(ab’)2於還原條件下處理的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之抗原結合片段。惟，只要具有與抗原的結合能力即可，並未限定於此等之分子。又，此等之抗原結合片段不僅包含將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理者，亦包含使用基因工程改變的抗體基因而於適當宿主細胞使產生的蛋白質。
於本說明書，「抗原決定位(epitope)」意指特定之抗CDH6抗體之結合的CDH6之部分肽或部分立體結構。前述之CDH6之部分肽的抗原決定位可藉由免疫試驗法等本技術領域中具通常知識者熟知的方法加以決定。首先，製作抗原之各式各樣部分結構。於部分結構之製作，可使用公知之寡核苷酸合成技術。例如，將自CDH6之C末端或N末端以適當長度依序縮短的一連串之多肽，使用本技術領域中具通常知識者周知之基因重組技術製作後，檢討對彼等肽的抗體之反應性，確定粗略辨識部位後，進一步藉由合成短肽而檢討與彼等肽之反應性，可決定抗原決定位。又，與包含複數之細胞外域的膜蛋白質結合的抗體為將包含複數域的立體結構作為抗原決定位的情形，藉由改變特定之細胞外域之胺基酸序列來改變立體結構，可決定與哪一域結合。為特定之抗體之結合的抗原之部分立體結構的抗原決定位，亦可藉由X射線結構解析將與抗體鄰接的抗原之胺基酸 殘基加以特定來決定。
於本說明書，「會結合於同一抗原決定位」係意指會與共通之抗原決定位結合的抗體。若第二抗體結合於第一抗體所結合的部分肽或部分立體結構，則可判定第一抗體與第二抗體係會結合於同一抗原決定位。或者，藉由確認第二抗體會對於第一抗體之對抗原的結合競合(即，第二抗體會妨礙第一抗體與抗原之結合)，而即使具體的抗原決定位之序列或結構並未決定，亦可判定第一抗體與第二抗體會結合於同一抗原決定位。於本說明書，「會結合於同一抗原決定位」係指第一抗體與第二抗體藉由該判定方法之任一者或兩者，而被判定為會與共通之抗原決定位結合的情形。第一抗體與第二抗體結合於同一抗原決定位，且第一抗體具有抗腫瘤活性或內在化活性等之特殊效果的情形，可期待第二抗體亦具有相同活性。
於本說明書，「CDR」係意指互補性決定區(CDR；Complementarity Determining Region)。已知於抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處的CDR。CDR亦稱為超可變區(hypervariable domain)，於抗體之重鏈及輕鏈的可變區內，係一次構造的變異性特別高的部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈的一次構造上，各自分離於3處。於本說明書，關於抗體之CDR，係將重鏈之CDR自重鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之CDR自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位係於立體構造上 相互接近，且決定對所結合之抗原的特異性。
於本說明書，「於嚴格條件下雜交」係指：於市售雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司)中，於68℃進行雜交；或使用固定了DNA的濾紙而於0.7~1.0M之NaCl存在下，於68℃進行了雜交之後，使用0.1~2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度SSC係包含150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)，於68℃進行洗淨，以藉此而可鑑定的條件或與其同等的條件的雜交。
於本說明書，「1~數個」意指1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個或1~2個。
1.CDH6
黏附蛋白係存在於細胞膜表面的糖蛋白質，因鈣離子依賴性地N末端側之細胞外域彼此結合，而作為細胞間接著分子發揮作用，還作為擔任細胞間相互作用的信號分子發揮作用。黏附蛋白超家族內，被分類為傳統黏附蛋白的分子群，係由細胞外5個之細胞外域(EC域)與1個之跨膜域、及細胞內域所構成的1次跨膜蛋白質。
CDH6(黏附蛋白-6(cadherin-6))被分類於第II型黏附蛋白家族，為由790個胺基酸所構成的1次跨膜蛋白質，於細胞外持有N末端側，於細胞內持有末端側。人類CDH6基因係於1995年初次被選殖出(非專利文獻1)，可利用NM_004932、NP_004923(NCBI)等之登 錄號而參照。
本發明所使用的CDH6蛋白質可由人類、非人類哺乳動物(大鼠、小鼠、猴等)之CDH6表現細胞直接純化使用，或者可調製該細胞之細胞膜劃分來使用，又，可藉由活體外合成CDH6、或者藉由基因操作使於宿主細胞產生而獲得。基因操作，具體而言，藉由將CDH6 cDNA組入可表現的載體後，於含有轉錄及轉譯所需要的酵素、基質及能量物質的溶液中加以合成，或者藉由使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形而使CDH6表現，可獲得該蛋白質。又，亦可將利用前述之基因操作的CDH6表現細胞、或者表現CDH6的細胞株作為CDH6蛋白質來使用。又，亦可將組入CDH6之cDNA的表現載體直接投予被免疫動物而於被免疫動物之體內使CDH6表現。
又，於上述CDH6之胺基酸序列，包含1或數個之胺基酸被取代、刪除及/或添加的胺基酸序列，具有與該蛋白質相同生物活性的蛋白質亦包含於CDH6。
人類CDH6蛋白質具有序列識別號1記載之胺基酸序列。人類CDH6蛋白質之細胞外區域係由具有序列識別號1記載之胺基酸序列之第54~159號之胺基酸序列的細胞外域1(於本說明書，亦稱為EC1)、具有序列識別號1記載之胺基酸序列之第160~268號之胺基酸序列的細胞外域2(於本說明書，亦稱為EC2)、具有於序列識別號1記載之胺基酸序列之第269~383號之胺基酸序列的細胞外域3(於本說明書，亦稱為EC3)、具有序列 識別號1記載之胺基酸序列之第384~486號之胺基酸序列的細胞外域4(於本說明書，亦稱為EC4)、及具有於序列識別號1記載之胺基酸序列之第487~608號之胺基酸序列的細胞外域5(於本說明書，亦稱為EC5)所構成。將EC1~EC5之胺基酸序列各自設為序列識別號2~6(表1)。
2.抗CDH6抗體之製造
作為本發明之抗CDH6抗體之一例，可列舉辨識包含序列識別號4所示的胺基酸序列的胺基酸序列，且具有內在化活性的抗CDH6抗體。作為本發明之抗CDH6抗體之一例，可列舉特異性辨識包含序列識別號4所示的胺基酸序列的胺基酸序列，且具有內在化活性的抗CDH6抗體。作為本發明之抗CDH6抗體之一例，可列舉辨識包含序列識別號4所示的胺基酸序列的胺基酸序列，且具有內在化活性的抗CDH6抗體。作為本發明之抗CDH6抗體之一例，可列舉特異性辨識包含序列識別號4所示的胺基酸序列的胺基酸序列，且具有內在化活性的抗CDH6抗體。抗體會「特異性辨識包含序列識別號4所示的胺基酸序列的胺基酸序列」或會「特異性辨識EC3域」係指，與CDH6之其他細胞外域比較，而抗體會強烈辨識或強烈結合CDH6之EC3域。
本發明之抗CDH6抗體係可源自任一物種，但較佳可例示人類、猴、大鼠、小鼠或兔。源自人類以外之物種的情形，使用周知之技術，而嵌合化或人類化 者較佳。本發明之抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體，但較佳為單株抗體。
本發明之抗CDH6抗體為可以腫瘤細胞為標的的抗體，即，具備可辨識腫瘤細胞的特性、可與腫瘤細胞結合的特性、及/或併入腫瘤細胞內而內在化的特性等，可將本發明之抗CDH6抗體與具有抗腫瘤活性的化合物，藉由連接物而結合而作成抗體-藥物結合物。
抗體之對腫瘤細胞的結合性，可使用流動式細胞測量術來確認。抗體向腫瘤細胞內的攝入可使用下列確認：(1)使用與治療抗體結合的二次抗體(螢光標識)，以螢光顯微鏡將攝入細胞內的抗體加以可視化的試驗(Cell Death and Differentiation，2008，15，751-761)、(2)使用與治療抗體結合的二次抗體(螢光標識)，測定攝入細胞內的螢光量的試驗(Molecular Biology of the Cell Vol.15,5268-5282,December 2004)或(3)使用與治療抗體結合的免疫毒素，一旦被攝入細胞內時毒素被釋放而細胞增殖被抑制的Mab-ZAP試驗(Bio Techniques 28：162-165,January 2000)來確認。就免疫毒素而言，亦可使用白喉毒素之觸媒區域與蛋白質G(Protein G)之重組複合蛋白質蛋白質。
於本說明書，所謂「高內在化能力」係意指將該抗體與皂草素標識抗大鼠IgG抗體投予的CDH6表現細胞之生存率(將抗體未添加時之細胞生存率設為100%的相對率表示者)較佳為70%以下，更佳為60%以下。
抗體-藥物結合物由於使發揮抗腫瘤效果的化合物結合，故抗體本身具有抗腫瘤效果雖較佳，但非必須。由使抗腫瘤性化合物之細胞毒性於腫瘤細胞特異性地及/或選擇性地發揮的目的來看，具有抗體內在化而於腫瘤細胞內移行的性質係重要且較佳的。
抗CDH6抗體可藉由使用此區域通常實施的方法，將成為抗原的多肽對動物免疫，採取、純化活體內產生的抗體而獲得，但較佳為使用保持立體結構的CDH6作為抗原使用者較佳。作為此種方法，可列舉DNA免疫法。
抗原之來源並未限於人類，亦可將源自小鼠、大鼠等之人類以外之動物的抗原對動物免疫。於此情形，藉由試驗與取得的異種抗原結合的抗體與人類抗原之交叉反應性，可選出可應用於人類疾病的抗體。
又，依據周知之方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，藉由使產生對抗抗原的抗體之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，亦可建立融合瘤，獲得單株抗體。
以下，具體地說明抗CDH6的抗體之取得方法。
(1)抗原之調製
抗原係可藉由基因操作編碼抗原蛋白質的基因而使於宿主細胞產生而獲得。具體而言，製作可表現抗原基因的載體，將其導入宿主細胞而使該基因表現，純化表現的抗原即可。藉由使用利用上述基因操作的抗原表現細胞、或表現抗原的細胞株對動物免疫的方法亦可取得抗體。
又，不使用抗原蛋白質，將抗原蛋白質之cDNA組入表現載體，投予至被免疫動物，使於被免疫動物之體內表現抗原蛋白質，藉由使產生對抗抗原蛋白質的抗體，亦可取得抗體。
(2)抗CDH6單株抗體之製造
本發明所使用的抗CDH6抗體並未特別限制，但可較佳使用例如，於本案序列表所示的胺基酸序列所特定的抗體。於本發明，就使用的抗CDH6抗體而言，期望具有以下特性。
(1)一種抗體，其特徵為具有以下特性：
(a)與CDH6特異性地結合
(b)藉由與CDH6結合而具有於CDH6表現細胞內在化的活性
(2)如上述(1)記載之抗體，其中CDH6為人類CDH6。
(3)如上述(1)或(2)記載之抗體，其中該抗體特異性辨識人類CDH6之EC3，且具有內在化活性
本發明之抗CDH6的抗體之取得方法只要可取得抗CDH6抗體，並未特別限制，較佳將保持高次結構的CDH6作為抗原使用。
作為較佳抗體之取得方法之一例，可列舉 DNA免疫法。DNA免疫法係指藉由將抗原表現質體基因導入至小鼠或大鼠等之動物個體，使抗原於個體內表現，而誘導對抗抗原的免疫的手法。基因導入之手法存有直接將質體肌肉內注射的方法、將脂質體或聚乙亞胺等之導入試藥作靜脈注射的方法、使用病毒載體的手法、將使質體附著的金粒子藉由基因槍射入的手法、急速地靜脈注射大量質體溶液的流體動力學法等。關於藉由表現質體之肌肉注射的基因導入法，作為使表現量提升的手法，已知將質體肌肉注射後，於相同部位施加電穿孔的活體內電穿孔的技術(Aihara H,Miyazaki J.Nat Biotechnol.1998 Sep；16(9)：867-70或Mir LM,Bureau MF,Gehl J,Rangara R,Rouy D,Caillaud JM,Delaere P,Branellec D,Schwartz B,Scherman D.Proc Natl Acad Sci USA.1999 Apr 13；96(8)：4262-7.)。本手法係於質體之肌肉注射前，藉由以玻尿酸酶(hyaluronidase)處理肌肉，進一步提升表現量(McMahon JM1,Signori E,Wells KE,Fazio VM,Wells DJ.Gene Ther.2001 Aug；8(16)：1264-70)。又，融合瘤之製作可藉由公知方法進行，例如，亦可使用Hybrimune Hybridoma Production System(Cyto Pulse Sciences公司)進行。
就具體的單株抗體取得例而言，可列舉以下。
(a)將CDH6之cDNA組入表現載體(例如，pcDNA3.1：Thermo Fisher Scientific)，藉由電穿孔、基因槍等之方法，將此載體直接投予被免疫動物(例如，大鼠或小鼠)，使於物體內表現CDH6，可誘發免疫反應。利用電穿孔等之載體投予若為提高抗體力價的必要，可作1次，亦可作複數次，較佳為複數次；(b)自誘發免疫反應的上述動物，採取含有抗體產生細胞的組織(例如淋巴節)；(c)骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)(例如，小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞)之調製；(d)抗體產生細胞與骨髓瘤之細胞融合；(e)產生為目的的抗體的融合瘤群的篩選；(f)對單一細胞株的分割(選殖)；(g)依情況，大量製造單株抗體用的融合瘤之培養、或移植融合瘤的動物之飼育；及/或(h)如此製造的單株抗體之生理活性(內在化活性)、及其結合特異性之檢討、或者作為標識試藥之特性檢定。
就此處使用的抗體力價之測定法而言，可列舉例如，流動式細胞測量術或Cell-ELISA法，但未限定於此等方法。
就如此建立的融合瘤株之例而言，可列舉抗CDH6抗體產生融合瘤rG019、rG055、rG056及rG061。又，於本說明書中，將抗CDH6抗體產生融合瘤rG019所產生的抗體記載為「rG019抗體」或簡單記載為「rG019」，將融合瘤rG055所產生的抗體記載「rG055抗體」或簡單記載為「rG055」，將融合瘤rG056所產生的抗體記載為「rG056抗體」或簡單記載為「rG056」，將融合瘤rG061所產生的抗體記載為「rG061抗體」或 簡單記載為「rG061」。
rG019抗體之輕鏈可變區係由序列識別號10所示的胺基酸序列所構成。該rG019抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列係由序列識別號11所示的核苷酸序列所編碼。rG019抗體之輕鏈可變區係具有由序列識別號12所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14所示的胺基酸序列所構成的CDRL3。rG019抗體之重鏈可變區係由序列識別號15所示的胺基酸序列所構成。該rG019抗體之重鏈可變區之胺基酸序列係由序列識別號16所示的核苷酸序列所編碼。rG019抗體之重鏈可變區具有由序列識別號17所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號18所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19所示的胺基酸序列所構成的CDRH3。將rG019抗體之序列示於表1。
rG055抗體之輕鏈可變區係由序列識別號20所示的胺基酸序列所構成。該rG055抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列係由序列識別號21所示的核苷酸序列所編碼。rG055抗體之輕鏈可變區具有由序列識別號22所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號23所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號24所示的胺基酸序列所構成的CDRL3。rG055抗體之重鏈可變區係由序列識別號25所示的胺基酸序列所構成。該rG055抗體之重鏈可變區之胺基酸序列係由序列識別號26所示的核苷酸序列所編碼。rG055抗體之重鏈可變區 具有由序列識別號27所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號28所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號29所示的胺基酸序列所構成的CDRH3。將rG055抗體之序列示於表1。
rG056抗體之輕鏈可變區係由序列識別號30所示的胺基酸序列所構成。該rG056抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列係序列識別號31所示的核苷酸序列所編碼。rG056抗體之輕鏈可變區具有由序列識別號32所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號33所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號34所示的胺基酸序列所構成的CDRL3。rG056抗體之重鏈可變區係由序列識別號35所示的胺基酸序列所構成。該rG056抗體之重鏈可變區之胺基酸序列係序列識別號36所示的核苷酸序列所編碼。rG056抗體之重鏈可變區具有由序列識別號37所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號38所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號39所示的胺基酸序列所構成的CDRH3。將rG056抗體之序列示於表1。
rG061抗體之輕鏈可變區係由序列識別號40所示的胺基酸序列所構成。該rG061抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列係序列識別號41所示的核苷酸序列所編碼。rG061抗體之輕鏈可變區具有由序列識別號42所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號43所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號44所示的胺基酸序列所構成的CDRL3。rG061抗體之重鏈可變 區係由序列識別號45所示的胺基酸序列所構成。該rG061抗體之重鏈可變區之胺基酸序列係序列識別號46所示的核苷酸序列編碼。rG061抗體之重鏈可變區具有由序列識別號47所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號48所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號49所示的胺基酸序列所構成的CDRH3。將rG061抗體之序列示於表1。
再者，再度實施「2.抗CDH6抗體之製造」(a)至(h)之步驟，而分別獨立取得單株抗體的情形、或藉由其他方法而另外取得單株抗體的情形，接可取得具有與rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體同等內在化活性的抗體。就此種抗體之一例，可列舉與rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體相同之抗原決定位結合的抗體。新製作的單株抗體若為與rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體之結合的部分肽或部分立體結構結合，可判定該單株抗體與rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體相同的抗原決定位結合。又，藉由確認對於rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體之對CDH6的結合，該單株抗體為競合(即，該單株抗體妨礙rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體與CDH6之結合)，即可未決定具體的抗原決定位之序列或結構，亦可判定該單株抗體結合於與抗CDH6抗體相同之抗原決定位。確認抗原決定位為相同的情形，強烈期待該單株抗體具有與rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體同等 之抗原結合能力、生物活性及/或內在化活性。
(3)其它抗體
本發明之抗體，除了上述抗CDH6的單株抗體之外，亦包含以使對人類的異種抗原性降低等為目的而人為地改變的基因重組型抗體，例如，嵌合(Chimeric)抗體、人類化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等之抗體可使用已知方法來製造。
就嵌合抗體而言，可列舉抗體之可變區與恆定區彼此為異種的抗體，例如，將源自小鼠或大鼠的抗體之可變區與源自人類的恆定區接合的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851-6855，(1984))。
就源自大鼠抗人類CDH6抗體之嵌合抗體之例而言，可列舉例如，由本說明書記載之大鼠抗人類CDH6抗體(例如，rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體)之包含各輕鏈可變區與源自人類之恆定區的輕鏈、及包含各重鏈可變區與源自人類之恆定區的重鏈所構成的抗體。
就源自大鼠抗人類CDH6抗體之嵌合抗體之另外例而言，可列舉例如，由包含將本說明書記載之大鼠抗人類CDH6抗體(例如，rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體)之各輕鏈可變區中之1~數殘基、1~3殘基、1~2殘基、較佳為1殘基之胺基酸取代為另外的胺基酸殘基的輕鏈可變區的輕鏈、及包含將各重鏈可變區中之1~數殘基、1~3殘基、1~2殘基、較 佳為1殘基之胺基酸取代為另外的胺基酸殘基的重鏈可變區的重鏈所構成的抗體，該抗體可具有任意之源自人類的恆定區。
就源自大鼠抗人類CDH6抗體之嵌合抗體之另外例而言，可列舉例如，由包含將本說明書記載之大鼠抗人類CDH6抗體(例如，rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體)之各輕鏈可變區中之任何1~3個之CDR中之1~2殘基、較佳為1殘基之胺基酸取代為另外的胺基酸殘基的輕鏈可變區的輕鏈、及包含將各重鏈可變區中任何1~3個之CDR中之1~2殘基、較佳為1殘基之胺基酸取代為另外的胺基酸殘基的重鏈可變區的重鏈所構成的抗體，該抗體可具有任意之源自人類的恆定區。
就源自rG019抗體之嵌合抗體而言，可列舉例如，由包含由序列識別號10所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈、及包含由序列識別號15所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈所構成的抗體，該抗體可具有任意之源自人類的恆定區。
就源自rG019抗體之嵌合抗體之另外例而言，可列舉例如，由包含由序列識別號10所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區中之1~數殘基、1~3殘基、1~2殘基、較佳為1殘基之胺基酸取代為另外的胺基酸殘基的輕鏈可變區的輕鏈、及包含由序列識別號15所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區中之1~數殘基、1~3殘基、1~2殘基、較佳為1殘基之胺基酸取代為另外 的胺基酸殘基的重鏈可變區的重鏈所構成的抗體，該抗體可具有任意之源自人類的恆定區。
就源自rG019抗體之嵌合抗體之另外例而言，可列舉例如，由包含由序列識別號10所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區中之任何1~3個CDR中之1或2殘基(較佳為1殘基)之胺基酸取代為另外的胺基酸殘基的輕鏈可變區的輕鏈、及包含由序列識別號15所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區中之任何1~3之CDR中之1或2殘基(較佳為1殘基)之胺基酸取代為另外的胺基酸殘基的重鏈可變區的重鏈所構成的抗體，該抗體可具有任意之源自人類的恆定區。
就源自rG019抗體之嵌合抗體之另外例而言，可列舉例如，由包含由序列識別號10所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈、及包含由序列識別號58所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈所構成的抗體，該抗體可具有任意之源自人類的恆定區。序列識別號58所示的胺基酸序列係將序列識別號15所示的胺基酸序列中之CDRH2中的半胱胺酸殘基取代為脯胺酸殘基的序列。
就源自rG019抗體之嵌合抗體之具體例而言，可列舉由包含由序列識別號53所示的輕鏈全長胺基酸序列所構成的輕鏈、及由序列識別號56所示的重鏈全長胺基酸序列所構成的重鏈所構成的嵌合抗體，於本說明書，將該嵌合抗人類CDH6抗體稱為「嵌合G019抗體」、「chG019抗體」或「chG019」。chG019抗體之 輕鏈全長胺基酸序列係由序列識別號54所示的核苷酸序列所編碼，chG019抗體之重鏈全長胺基酸序列係由序列識別號57所示的核苷酸序列所編碼。
chG019抗體之輕鏈可變區胺基酸序列係與rG019抗體之輕鏈可變區胺基酸序列相同，由序列識別號10所示的胺基酸序列所構成。chG019抗體之輕鏈具有由序列識別號12所示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13所示的胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14所示的胺基酸序列所構成的CDRL3，各自與rG019之輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3相同。chG019抗體之輕鏈可變區胺基酸係由序列識別號55所示的核苷酸序列所編碼。
chG019抗體之重鏈可變區胺基酸序列係由序列識別號58所示的胺基酸序列所構成。chG019抗體之重鏈具有由序列識別號17所示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號60所示的胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19所示的胺基酸序列所構成的CDRH3。序列識別號58所示的胺基酸序列係將序列識別號15所示的胺基酸序列中之CDRH2中的半胱胺酸殘基取代為脯胺酸殘基的序列。序列識別號60所示的胺基酸序列所構成的CDRH2係將序列識別號18所示的rG019 CDRH2中之半胱胺酸殘基取代為脯胺酸殘基的序列。chG019抗體之重鏈可變區胺基酸序列係由序列識別號59所示的核苷酸序列所編碼。
將chG019抗體之序列示於表1。
就源自大鼠抗人類CDH6抗體rG055抗體之嵌合抗體而言，可列舉例如，一種嵌合抗體，其由包含由序列識別號20所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈、及包含由序列識別號25所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈所構成，該抗體可具有任意之源自人類的恆定區。
就源自大鼠抗人類CDH6抗體rG056抗體之嵌合抗體而言，可列舉例如，一種嵌合抗體，其由包含由序列識別號30所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈、及包含由序列識別號35所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈所構成，該抗體可具有任意之源自人類的恆定區。
就源自大鼠抗人類CDH6抗體rG061抗體之嵌合抗體而言，可列舉例如，一種嵌合抗體，其由包含由序列識別號40所示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈、及包含由序列識別號45所示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈所構成，該抗體可具有任意之源自人類的恆定區。
就人類化抗體而言，可列舉僅將互補性決定區(CDR；Complementarity Determining Region)組入源自人類的抗體的抗體(參照Nature(1986)321，p.522-525)、藉由CDR移植法而除了CDR之序列外將一部分之框架區胺基酸殘基亦移植於人類抗體的抗體(國際公開第90/07861號)，又維持對抗原的結合能力的同時，改變一部分之CDR之胺基酸序列的抗體。
於本說明書，源自rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體或chG019抗體之人類化抗體，係指只要於rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體或chG019抗體之任一者，全部保持各別固有之6個CDR序列，且具有內在化活性的人類化抗體即可，並未限定於特定之人類化抗體。該人類化抗體只要具有內在化活性即可，亦可進一步改變一部分之CDR之一部分之胺基酸序列。
就chG019抗體之人類化抗體之實例而言，可列舉下列輕鏈以及重鏈之任意組合，其中該輕鏈為包含選自包含(1)序列識別號63或67記載之胺基酸序列、(2)相對於上述(1)之胺基酸序列具有至少95%以上之同一性的胺基酸序列(較佳為相對於各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列)、及(3)於上述(1)之胺基酸序列，有1或數個之胺基酸刪除、取代或添加的胺基酸序列的群組之至少一者記載之輕鏈可變區的輕鏈，以及該重鏈為包含選自包含(4)序列識別號71、75或79記載之胺基酸序列、(5)相對於上述(4)之胺基酸序列具有至少95%以上之同一性的胺基酸序列(較佳為相對於各CDR序列以外之框架區之序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列)、及(6)於上述(4)之胺基酸序列有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列的群組之至少一者記載之重鏈可變區的重鏈。
又，亦可使用將重鏈或輕鏈之一者人類化， 另一者為大鼠抗體或嵌合抗體之輕鏈或重鏈的抗體。就此種抗體之例而言，可列舉下列輕鏈以及重鏈之任意組合，其中該輕鏈為包含選自包含(1)序列識別號63或67記載之胺基酸序列、(2)相對於上述(1)之胺基酸序列具有至少95%以上之同一性的胺基酸序列(較佳為相對於各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列)、及(3)於上述(1)之胺基酸序列有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列的群組之至少一者記載之輕鏈可變區的輕鏈，以及該重鏈為包含選自包含(4)序列識別號15、25、35、45或58記載之胺基酸序列、(5)相對於上述(4)之胺基酸序列具有至少95%以上之同一性的胺基酸序列(較佳為相對於各CDR序列以外之框架區的序列至少具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列)、及(6)於上述(4)之胺基酸序列有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列的群組之至少一者記載之重鏈可變區的重鏈。就其他例而言，可列舉下列輕鏈以及重鏈之任意組合，其中該輕鏈為包含選自包含(1)序列識別號10、20、30或40記載之胺基酸序列、(2)相對於上述(1)之胺基酸序列具有至少95%以上之同一性的胺基酸序列(較佳為，相對於各CDR序列以外之框架區之序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列)、及(3)於上述(1)之胺基酸序列有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列的群組之至少一者記載之輕鏈可變區，以及該重鏈包含選自包含(4)序列識別號71、75或79記載之胺基酸序列、(5)相對於 上述(4)之胺基酸序列具有至少95%以上同一性的胺基酸序列(較佳為相對於各CDR序列以外之框架區之序列具有至少95%以上之序列同一性的胺基酸序列)、及(6)於上述(4)之胺基酸序列有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列的群組之至少一者記載之重鏈可變區的重鏈。
又，就本說明書中的胺基酸之取代而言，保存性胺基酸取代為較佳。保存性胺基酸取代係指與胺基酸側鏈有關連的胺基酸基團內產生的取代。較佳的胺基酸基團係如以下：酸性基團=天冬胺酸、麩胺酸；鹼性基團=離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性基團=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及非帶電極性家族=甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其他適合的胺基酸基團係如下：脂肪族羥基基團=絲胺酸及蘇胺酸；含醯胺基的基團=天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族基團=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；以及芳香族基團=苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。該胺基酸取代係較佳於不使具有原本胺基酸序列的物質的特性降低的範圍內進行。
就上述輕鏈及重鏈之較佳組合之抗體而言，可列舉由以下輕鏈及重鏈所構成的抗體：該輕鏈為具有序列識別號63所示的輕鏈可變區胺基酸序列(於本說明書，亦稱為hL02輕鏈可變區胺基酸序列)的輕鏈或具有序列識別號67所示的輕鏈可變區胺基酸序列(於本說明 書，亦稱為hL03輕鏈可變區胺基酸序列)的輕鏈；而該重鏈為具有序列識別號71所示的重鏈可變區胺基酸序列(於本說明書，亦稱為hH01重鏈可變區胺基酸序列)的重鏈、具有序列識別號75所示的重鏈可變區胺基酸序列(於本說明書，亦稱為hH02重鏈可變區胺基酸序列)的重鏈或具有序列識別號79所示的重鏈可變區胺基酸序列(於本說明書，亦稱為hH04重鏈可變區胺基酸序列)的重鏈。就較佳例而言，可列舉由具有序列識別號63所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號71所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗體；由具有序列識別號63所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號75所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗體；由具有序列識別號63所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號79所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗體；由具有序列識別號67所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號71所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗體；由具有序列識別號67所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號75所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗體；或，由具有序列識別號67所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號79所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗體。就更佳例而言，可列舉由具有序列識別號63所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號71所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗 體；由具有序列識別號63所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號75所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗體；由具有序列識別號63所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號79所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗體；或者，由具有序列識別號67所示的輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號75所示的重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所構成的抗體。
就上述輕鏈及重鏈之較佳組合之抗體之另外例而言，可列舉序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列(於本說明書，亦稱為hL02輕鏈全長胺基酸序列)之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈或序列識別號65所示的輕鏈全長胺基酸序列(於本說明書，亦稱為hL03輕鏈全長胺基酸序列)之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈、及序列識別號69所示的重鏈全長胺基酸序列(於本說明書，亦稱為hH01重鏈全長胺基酸序列)之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈、序列識別號73所示的重鏈全長胺基酸序列(於本說明書，亦稱為hH02重鏈全長胺基酸序列)之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈或序列識別號77所示的重鏈全長胺基酸序列(於本說明書，亦稱為hH04重鏈全長胺基酸序列)之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體。就較佳例而言，由序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺 基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號73所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成成的輕鏈及序列識別號77所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；序列識別號65所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號69所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；序列識別號65所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號73所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；或，序列識別號65所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號77所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體。就更佳例而言，可列舉序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號69所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體(於本說明書，亦稱為「H01L02抗體」或「H01L02」)；序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號73所示的重鏈 全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體(於本說明書，亦稱為「H02L02抗體」或「H02L02」)；序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號77所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體(於本說明書，亦稱為「H04L02抗體」或「H04L02」)；或，序列識別號65所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號73所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體(於本說明書，亦稱為「H02L03抗體」或「H02L03」)。將H01L02抗體、H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體之序列示於表1。
藉由組合顯示與上述之重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列高同一性的序列，而可選擇具有與上述之各抗體同等生物活性的抗體。此種同一性，一般而言為80%以上之同一性，較佳為90%以上之同一性，進一步較佳為95%以上之同一性，最佳為99%以上之同一性。又，藉由組合於重鏈或輕鏈之胺基酸序列有1至數個之胺基酸殘基被取代、刪除或添加的胺基酸序列，亦可選擇具有與上述之各抗體同等生物活性的抗體。
二種類之胺基酸序列間之同一性，可藉由使用ClustalW version2(Larkin MA,Blackshields G,Brown NP,Chenna R,McGettigan PA,McWilliam H,Valentin F,Wallace IM,Wilm A,Lopez R,Thompson JD,Gibson TJ and Higgins DG(2007),「Clustal W and Clustal X version 2.0」,Bioinformatics.23(21)：2947-2948)之系統內定參數(default parameter)而使序列整列來決定。
又，序列識別號61所示的hL02輕鏈全長胺基酸序列中，由第1~20號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列，由第21~128號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區，由第129~233號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區。序列識別號62所示的hL02輕鏈全長核苷酸序列中，由第1~60號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼訊息序列，由第61~384號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼可變區，由第385~699號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼恆定區。
序列識別號65所示的hL03輕鏈全長胺基酸序列中，由第1~20號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列，由第21~128號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區，由第129~233號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區。序列識別號66所示的hL03輕鏈全長核苷酸序列中，由第1~60號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼訊息序列，由第61~384號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼可變區，由第385~699號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼恆定區。
序列識別號69所示的hH01重鏈全長胺基酸序列中，由第1~19號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列，由第20~141號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區，由第142~471號之胺基酸殘基所 構成的胺基酸序列為恆定區。序列識別號70所示的hH01重鏈全長核苷酸序列中，由第1~57號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼訊息序列，由第58~423號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼可變區，由第424~1413號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼恆定區。
序列識別號73所示的hH02重鏈全長胺基酸序列中，由第1~19號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列，由第20~141號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區，由第142~471號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區。序列識別號74所示的hH02重鏈全長核苷酸序列中，由第1~57號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼訊息序列，由第58~423號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼可變區，由第424~1413號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼恆定區。
序列識別號77所示的hH04重鏈全長胺基酸序列中，由第1~19號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列，由第20~141號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區，由第142~471號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區。序列識別號78所示的hL04重鏈全長核苷酸序列，1~57號之核苷酸所構成的核苷酸序列為訊息序列，由第58~423號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼可變區，由第424~1413號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼恆定區。
Figure 107116035-A0202-12-0059-212
Figure 107116035-A0202-12-0060-213
Figure 107116035-A0202-12-0061-214
Figure 107116035-A0202-12-0062-215
Figure 107116035-A0202-12-0063-216
Figure 107116035-A0202-12-0064-217
Figure 107116035-A0202-12-0065-218
Figure 107116035-A0202-12-0066-219
Figure 107116035-A0202-12-0067-220
Figure 107116035-A0202-12-0068-221
Figure 107116035-A0202-12-0069-222
Figure 107116035-A0202-12-0070-223
Figure 107116035-A0202-12-0071-224
Figure 107116035-A0202-12-0072-225
Figure 107116035-A0202-12-0073-226
(於本說明書，有將表1-1~表1-15總稱為表1的情形)。
就本發明之抗體而言，可進一步列舉會與CDH6結合的人類抗體。抗CDH6人類抗體係意指僅具有源自人類染色體之抗體之基因序列的人類抗體。抗CDH6人類抗體，係可藉由使用了具有包含人類抗體之重鏈及輕鏈之基因的人類染色體片段的人類抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143,；Kuroiwa,Y.et.al.,Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.；Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等)而取得。
此種人類抗體產生小鼠，具體而言，作為將內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座破壞、取而代之以通過酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)載體等而導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座的重組動物，而可藉由基因剔除動物及基因轉殖動物之製作及使此等動物彼此交配來作出。
又，利用基因重組技術，藉由各自編碼此種人類抗體之重鏈及輕鏈的cDNA，較佳為藉由含該cDNA的載體，而將真核細胞轉形，培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，藉此亦可自培養上清液中獲得此抗體。
其中，作為宿主，例如可使用真核細胞，較佳為CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤等之哺乳動物細胞。
又，亦已知取得源自自人類抗體庫選出之噬菌體顯示的人類抗體的方法(參照Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D.et.al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)。
例如，可使用使人類抗體之可變區作為單鏈抗體(scFv)而於噬菌體表面表現，而選擇與抗原結合的噬菌體的噬菌體顯示法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。
解析以結合於抗原來進行了選擇的噬菌體之 基因，可藉此而決定編碼會結合於抗原之人類抗體之可變區的DNA序列。
若會結合於抗原的scFv之DNA序列變得清楚，則可藉由製作具有該序列的表現載體，並導入於適當宿主而使其表現，來取得人類抗體(國際公開第92/01047號、國際公開第92/20791號、國際公開第93/06213號、國際公開第93/11236號、國際公開第93/19172號、國際公開第95/01438號、國際公開第95/15388號、Annu.Rev.Immunol(1994)12，p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9)，p.1105-1116)。
新製作的人類抗體若會結合於本說明書記載之大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人類化抗人類CDH6抗體(例如，rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體、chG019抗體、H01L02抗體、H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體)之任一者會結合的部分肽或部分立體結構，則可判定該人類抗體會結合於與該大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人類化抗人類CDH6抗體相同的抗原決定位。或者，藉由確認相對於本說明書記載之大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人類化抗人類CDH6抗體(例如，rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體、chG019抗體、H01L02抗體、H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體)之對CDH6的結合而該人類抗體為競合(例如，妨礙該人類抗體rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體、chG019抗體、H01L02抗體、 H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體與CDH6的結合，較佳為妨礙與CDH6之EC3的結合)，即使未決定具體的抗原決定位之序列或結構，亦可判定該人類抗體會結合於與本說明書記載之大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人類化抗人類CDH6抗體相同之抗原決定位。於本說明書，藉由該判定方法之至少任一者之方法而被判定為「會結合於同一抗原決定位結合」的情形，可謂所新製作的人類抗體係與本說明書記載之大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人類化抗人類CDH6抗體「會結合於同一抗原決定位」。抗原決定位被確認為相同的情形，期待該人類抗體具有與大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人類化抗人類CDH6抗體(例如，rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體、chG019抗體、H01L02抗體、H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體)相同之生物活性。
藉由以上之方法所得到的嵌合抗體、人類化抗體、或人類抗體，可藉由公知之方法等來評價對抗原的結合性，並選出適合的抗體。
就比較抗體之性質之際的另一指標之一例而言，可列舉抗體之安定性。示差掃描熱析儀(DSC)係可快速又正確地測量成為蛋白質之相對的結構安定性的良好指標之熱變性中點(Tm)的裝置。使用DSC來測量Tm值並比較其值，可藉此而比較熱安定性之差異。抗體之保存安定性係已知呈現與抗體之熱安定性有某程度之相關 (Lori Burton,et.al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，而可以熱安定性為指標來選擇適合的抗體。就用以選擇抗體的其他指標而言，可列舉於適當宿主細胞中的產量高、及水溶液中之凝集性低。例如，並不一定是產量最高的抗體就會呈現最高的熱安定性，因此有必要基於以上所述指標而綜合性地判斷，而選出最適合對人類投予之抗體。
本發明之抗體亦包含抗體之修飾體。該修飾體係意指對本發明之抗體施予化學或生物學的修飾而成者。化學的修飾體中包含對胺基酸骨架的化學部分之鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈的化學修飾體等。生物學的修飾體中包含被轉譯後修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結的糖鏈加成、N末或C末端的加工處理、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化、或N末端麩醯胺酸或N末端麩胺酸之焦麩胺酸化)者，藉由使用原核生物宿主細胞來使其表現，而於N末端附加甲硫胺酸殘基者等。又，為了可進行本發明之抗體或抗原之檢測或單離而被標識者，例如，酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含於該修飾物之意義。此種本發明之抗體之修飾物係有用於抗體的安定性及血中滯留性之改善、抗原性之減輕、抗體或抗原之檢出或單離等。
又，藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾(糖苷化(glycosylation)、脫岩藻糖(fucose)化等)，可增強抗體依賴性細胞毒殺活性。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言，已知有國際公開第1999/54342號、國際公開 第2000/61739號、國際公開第2002/31140號等，但未限定於此等。本發明之抗體亦包含該糖鏈修飾被調節的抗體。
於一旦單離了抗體基因之後，導入適當宿主而製作抗體的情形，可使用適當的宿主與表現載體之組合。就抗體基因之具體例而言，可列舉將編碼本說明書記載的抗體之重鏈序列的基因、及編碼輕鏈序列的基因加以組合者。將宿主細胞轉形之際，重鏈序列基因與輕鏈序列基因可被插入相同表現載體，又亦可被插入各別表現載體。
使用真核細胞作為宿主的情形，可使用動物細胞、植物細胞、或真核微生物。尤其就動物細胞而言，可列舉哺乳類細胞，例如，為猴細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182，ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)、FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)。
使用原核細胞的情形，可列舉例如，大腸桿菌、枯草桿菌。
可藉由對此等之細胞藉由轉形來導入作為目的之抗體基因，並將經轉形的細胞於活體外培養，而獲得抗體。於該培養中，會有依抗體之序列而產量不同的情形，可自具有同等結合活性的抗體之中，以產量為指 標而選出容易作為醫藥生產者。因此，本發明之抗體中亦包含以下抗體，其藉由特徵為包含培養上述經轉形的宿主細胞的步驟、及自該步驟所獲得的培養物採收目的之抗體或該抗體的機能性片段的步驟之該抗體的製造方法而獲得。
又，已知哺乳類培養細胞所生產的抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又，已知相同重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2個胺基酸殘基缺失，且新位於羧基末端的脯胺酸殘基經醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。然而，此等重鏈序列之缺失及修飾對於抗體之抗原結合能力及效應子機能(補體之活性化或抗體依賴性細胞毒殺作用等)並無影響。所以，本發明之抗體中亦包含受該修飾的抗體及該抗體之機能性片段，亦包含於重鏈羧基末端有1或2個之胺基酸缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。惟，只要保有抗原結合能力及效應子機能，本發明之抗體之重鏈之羧基末端的缺失體並未限於上述種類。構成本發明之抗體的2股重鏈，可為選自包含完全長度及上述之缺失體之群組的重鏈之任一種，亦可為組合了任二種者。各缺失體之量比會受到產生本發明之抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件的影響，但就本發明之抗體之主成分而言，可列舉於2股重鏈之雙方，羧基末端之一個胺基酸殘基缺失的情形。
就本發明之抗體之同型而言，可列舉例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)等，但較佳為IgG1或IgG4。
就抗體之生物活性而言，一般可列舉抗原結合活性、藉由與抗原結合而內在化至表現該抗原的細胞的活性、中和抗原之活性的活性、增強抗原之活性的活性、抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性、補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性及抗體依賴性細胞媒介吞噬作用(ADCP)，但本發明之抗體所具有的機能係對CDH6的結合活性，較佳為藉由與CDH6結合而內在化至CDH6表現細胞的活性。再者，本發明之抗體除了細胞內在化活性之外，亦可兼具ADCC活性、CDC活性及/或ADCP活性。
所獲得的抗體可純化到均勻為止。抗體之分離、純化只要使用通常之蛋白質所使用的分離、純化方法即可。例如，只要適宜選擇管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳等加以組合，即可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但未限定於此等。
就層析而言，可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、膠體過濾層析、逆相層析、吸附層析等。
此等之層析可使用HPLC或FPLC等之液相層析來進行。
就用於親和性層析所使用的管柱而言，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。例如，就使用蛋白質A管柱的管柱而言，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia公司)等。
又亦可使用已將抗原固定化的載體(carrier)，利用對抗原之結合性而純化抗體。
3.抗CDH6抗體-藥物結合物 (1)藥物
以上述「2.抗CDH6抗體之製造」所取得的抗CDH6抗體，係可藉由介隔連接物結構部分使藥物結合，而作成抗CDH6抗體-藥物結合物。就藥物而言，只要具有可與連接物結構結合的取代基、部分結構即可，並未特別限制。抗CDH6抗體-藥物結合物可因應結合之藥物而使用於各式各樣的用途。就此種藥物之例而言，可列舉具有抗腫瘤活性的物質、具有對抗血液疾病的效果的物質、具有對抗自體免疫疾病的效果的物質、抗炎症物質、抗菌物質、抗真菌物質、抗寄生蟲物質、抗病毒物質、抗麻醉物質等。
(1)-1 抗腫瘤化合物
於以下陳述關於使用抗腫瘤性化合物來作為本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物所結合的化合物之例。就抗 腫瘤性化合物而言，只要為具有抗腫瘤效果的化合物，且具有可與連接物結構結合的取代基、部分結構者即可，並未特別限制。抗腫瘤性化合物係連接物之一部份或全部於腫瘤細胞內被切斷，抗腫瘤性化合物部分游離，而表現抗腫瘤效果。若連接物在與藥物結合部分被切斷，則抗腫瘤性化合物以原本的結構游離，會發揮其本來之抗腫瘤效果。
以上述「2.抗CDH6抗體之製造」所取得的抗CDH6抗體，係可藉由介隔連接物結構部分使抗腫瘤性化合物結合，而作成抗CDH6抗體-藥物結合物。
就本發明所使用的抗腫瘤性化合物之一例而言，較佳可使用為喜樹鹼(camptothecin)衍生物的依喜替康(exatecan)((1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 107116035-A0202-12-0082-31
并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮；下式：)
Figure 107116035-A0202-12-0082-227
此化合物可輕易地以例如美國專利公開公報US2016/0297890號記載之方法或其他周知方法取得，並可適當使用1位之胺基作為對連接物結構的結合部位。又，依喜替康亦有在連接物之一部份為結合的狀態下於腫瘤細胞內游離的情形，但其係即使於此種狀態下亦會發揮優異的抗腫瘤效果的化合物。
已知依喜替康因具有喜樹鹼結構，於酸性水性媒體中(例如，pH3左右)平衡偏向有內酯環形成的結構(閉環體)，另一方面，於鹼性水性媒體中(例如，pH10左右)平衡偏向內酯環為開環的結構(開環體)。即使為導入對應此種閉環結構及開環結構之依喜替康殘基的藥物結合物，亦被期待同等之抗腫瘤效果，當然，任一者之狀態亦被包含於本發明之範圍。
就其他之抗腫瘤性化合物而言，可列舉例如，文獻(Pharmacological Reviews,68,p3-19,2016)記載之抗腫瘤化合物，作為其一例，可列舉阿黴素(Doxorubicin)、卡奇黴素(Calicheamicine)、海兔毒素(Dorastatin)10、單甲基澳瑞他汀E(MMAE)、單甲基澳瑞他汀F(MMAF)等之澳瑞他汀類(Auristatins)、DM1、DM4等之美登素類(Maytansinoids)、吡咯开苯并吖庚三烯(Pyrrolobenzodiazepine)二聚體之SG2000(SJG-136)、為喜樹鹼之衍生物的SN-38、CC-1065等之倍癌黴素類(Duocarmycins)、鵝膏蕈鹼(Amanitin)、柔紅黴素(Daunorubicin)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、博來黴素(Bleomycin)、環胞苷(Cyclocytidine)、長春新鹼(Vincristine)、長春鹼(Vinblastine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、白金系抗腫瘤劑(順鉑(Cisplatin)或其衍生物)、塔克素(Taxol)或其衍生物等。
於抗體-藥物結合物中，對抗體1分子之藥物之結合數係影響其有效性、安全性的重要因子。抗體-藥物結合物之製造係以藥物之結合數成為一定數目的方 式，規定反應的原料‧試藥之使用量等之反應條件而實施，但與低分子化合物之化學反應不同，通常係作為結合了相異數目的藥物之混合物而獲得。對抗體1分子之藥物結合數係被特定、標記為平均值，即平均藥物結合數。本發明中原則上，除非另有指定，即，除了表示於具有相異藥物結合數的抗體-藥物結合物混合物中所含之具有特定藥物結合數的抗體-藥物結合物的情形，藥物之結合數係意指平均值。依喜替康對抗體分子之結合數係可控制，就每1抗體之藥物平均結合數而言，可使1至10個左右的依喜替康結合，但較佳為2~8個、3~8個、4~8個、5~8個、6~8個、7~8個，更佳為5~8個，進一步較佳為7~8個，又更佳為8個。又，若為本技術領域中具通常知識者，由本案實施例之記載，可設計使必要數目的藥物結合於抗體的反應，可取得控制依喜替康之結合數的抗體-藥物結合物。
(2)連接物結構
針對於本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物中使藥物與抗CDH6抗體結合的連接物結構進行說明。
於本案之抗體-藥物結合物中，結合抗CDH6抗體與藥物的連接物結構，只要可使用作為抗體-藥物結合物則未特別限制，亦可因應使用目的加以適當選擇。就連接物結構之一例而言，可列舉公知文獻(Pharmacol Rev 68：3-19,January 2016、Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0等)記載之連接物，進一步就具體例 而言，可列舉VC(纈胺酸-瓜胺酸：valine-citrulline)、MC(順丁烯二亞醯胺基己醯基：maleimidocaproyl)、SMCC(琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二亞醯胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯：succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)、SPP(N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸：N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)pentanoate、SS(二硫化物：disulfide)、SPDB(N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)butyrate、SS/腙、腙、碳酸酯。
就其他之一例而言，可列舉例如，美國專利公開公報US2016/0297890記載之連接物結構(作為一例，為段落[0260]~[0289]記載者)，可較佳使用以下之結構者。又以下所示的結構之左端係與抗體之結合部位，右端為與藥物之結合部位。又，下述之連接物結構中之GGFG係表示以由甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸(GGFG)所構成之肽鍵而連接的胺基酸序列。
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O -CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
更佳可列舉下列者：-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-進一步較佳可列舉：-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
抗體係於-(琥珀醯亞胺-3-基-N)之末端、(例如，於『-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-』，(-CH2CH2CH2CH2CH2-)所結合者為反對側之末端(左末端))進行結合，抗腫瘤性化合物係於與-(琥珀醯亞胺-3-基-N)反對側之末端(於上述例，以右末端之CH2-O-CH2-C(=O)-之羰基作結合。『-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-』係具有下式所表示的結構：
Figure 107116035-A0202-12-0087-228
此部分結構中的3位係對抗CDH6抗體的結合部位。在此3位之與該抗體的結合，係特徵為形成硫醚而結合。此結構部分之1位之氮原子，係與存在於包含此結構之連接物內的亞甲基之碳原子結合。
於將藥物作成依喜替康的本發明之抗體-藥物結合物，較佳為使下述之結構之藥物-連接物結構部分與抗體結合者。此等之藥物-連接物結構部分，係只要作為每1抗體之平均結合數而使1至10結合即可，但較佳為2至8，更佳為5至8，進一步較佳為7至8，更進一步較佳為8。
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
更佳為下列者。
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
又，更佳可列舉下列者。
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)。
又，-(NH-DX)係下式所表示的結構：
Figure 107116035-A0202-12-0088-229
表示去除依喜替康之1位之胺基的氫原子1個所生成的基。
(3)抗體-藥物結合物之製造方法
可使用於本發明之抗體一藥物結合物的抗體，只要為具有上述「2.抗CDH6抗體之製造」之項及實施例記載之內在化活性的抗CDH6抗體及該抗體之機能性片段，則未特別限制。
其次，針對本發明之抗體-藥物結合物之代表性的製造方法加以說明。又，於以下，為了呈示化合物，而使用各反應式中所示的化合物之編號。即，稱為『式(1)之化合物』、『化合物(1)』等。又，關於此以外之編號之化合物亦為同樣地記載。
(3)-1 製造方法1
下述式(1)所表示的抗體-藥物結合物中，介隔硫醚而抗CDH6抗體與連接物結構結合者係可藉由下列方法製造：對於將抗CDH6抗體還原而將雙硫鍵變換成硫氫基的抗體，使可藉由已知方法而獲得的化合物(2)(例如，能以US2016/297890號公開專利公報記載之方法(例如段落[0336]~[0374]記載之方法)獲得)進行反應。例如可藉由下述之方法製造。
Figure 107116035-A0202-12-0089-230
[式中，AB表示具有硫氫基的抗體。
其中，L1係以-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-之結構表示。
L1，係表示下式所表示的順丁烯二醯亞胺基]。
Figure 107116035-A0202-12-0090-236
-L1-LX具有以下之式所表示的任一結構。
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
此等中更佳為下列所示。
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
進一步，較佳可列舉下列者。
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
又，於上述之反應式中，抗體-藥物結合物(1)雖被記載為自藥物至連接物末端的結構部分1個對1個抗體而結合的結構，但此等係為了方便說明之記載，實際上，多為該結構部分為對1個之抗體分子而結合有複數個的情形。此狀況於以下之製造方法之說明中亦相同。
即，可藉由使具有硫氫基的抗體(3a)與可藉由已知之方法而獲得的化合物(2)(例如，能以US2016/297890號公開專利公報記載之方法(例如段落[0336]~[0374]記載之方法)獲得))進行反應，而製造抗體-藥物結合物(1)。
具有硫氫基的抗體(3a)係可以本技術領域中具通常知識者周知之方法來獲得(Hermanson,G.T,Bioconjugate Techniques,pp.56-136,pp.456-493,Academic Press(1996))。可列舉例如，使Traut’s試藥對 抗體之胺基進行作用；使N-琥珀醯亞胺基S-乙醯基硫烷酸酯類對抗體之胺基進行作用後，使經基胺進行作用；使N-琥珀醯亞胺基3-(吡啶基二硫基)丙酸酯進行作用後，使還原劑進行作用；使二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)等之還原劑對抗體進行作用而還原抗體內鏈間部之雙硫鍵，使硫氫基生成等之方法，但未被限定於此等。
具體而言，可將TCEP作為還原劑，而相對於抗體內鏈間部每一雙硫鍵使用0.3至3莫耳當量，於含螯合劑的緩衝液中，使與抗體進行反應，藉此而獲得抗體內鏈間部雙硫鍵部分或完全被還原的抗體。就螯合劑而言，可使用例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺5乙酸(DTPA)等。將此等以1mM至20mM之濃度來使用即可。就緩衝液而言，可使用磷酸鈉、硼酸鈉、乙酸鈉溶液等。於具體例中，可藉由使抗體於4℃至37℃與TCEP進行反應1至4小時，而獲得具有部分或完全被還原之硫氫基的抗體(3a)。
又，於此可藉由實施使硫氫基部分附加於藥物-連接物的反應，而藉由硫醚鍵使藥物-連接物部分結合。
其次，可對具有硫氫基的抗體(3a)每一個，使用2至20莫耳當量的化合物(2)，而製造對抗體每1個有2個至8個藥物結合的抗體-藥物結合物(1)。具體而言，只要對含有具硫氫基的抗體(3a)添加溶解了化合物(2)的溶液而使進行反應即可。此處，就緩衝液而言，只要 使用乙酸鈉溶液、磷酸鈉、硼酸鈉等即可。反應時之pH為5至9，更適合為只要於pH7附近使反應進行即可。就使化合物(2)溶解的溶媒而言，可使用二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡啶酮(NMP)等之有機溶媒。只要對含有具硫氫基的抗體(3a)的緩衝液添加已溶解化合物(2)的有機溶媒溶液1至20%v/v至而使反應進行即可。反應溫度為0至37℃，更適合為10至25℃，反應時間為0.5至2小時。反應係藉由使未反應之化合物(2)之反應性藉由含有硫醇的試藥失活，而可終止。含有硫醇的試藥係例如為半胱胺酸或N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)。更具體而言，相對於所使用的化合物(2)，而添加NAC 1至2莫耳當量，於室溫恆溫放置10至30分鐘，藉此而可終止反應。
(4)抗體-藥物結合物之鑑定
所製造的抗體-藥物結合物(1)係可藉由以下之共通操作進行濃縮、緩衝液交換、純化、抗體濃度及抗體每一分子之藥物平均結合數之測定，並進行抗體-藥物結合物(1)之鑑定。
(4)-1 共通操作A：抗體或抗體-藥物結合物水溶液之濃縮
將抗體或是抗體-藥物結合物溶液置入Amicon Ultra(50,000 MWCO，Millipore Corporation)之容器內，以使用了離心機(Allegra X-15R，Beckman Coulter,Inc.) 的離心操作(2000G至3800G，5至20分鐘離心)，而濃縮了抗體或是抗體-藥物結合物溶液。
(4)-2 共通操作B：抗體之濃度測定
使用UV測定器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific Inc.)，而按照製造商規定的方法，進行了抗體濃度之測定。於此時，對各抗體使用了相異的280nm吸光係數(1.3mLmg-1cm-1至1.8mLmg-1cm-1)。
(4)-3 共通操作C：抗體之緩衝液交換
使使用了Sephadex G-25擔體的NAP-25管柱(Cat.No.17-0852-02，GE Healthcare Japan Corporation)，按照製造商規定的方法，以含氯化鈉(50mM)及EDTA(2mM)的磷酸緩衝液(50mM，pH6.0)(於本說明書稱為PBS6.0/EDTA)平衡化。對於每一根此NAP-25管柱，放置抗體水溶液2.5mL後，分取了以PBS6.0/EDTA3.5mL所溶出的劃分(3.5mL)。將此劃分藉由共通操作A加以濃縮，使用共通操作B進行了抗體濃度之測定後，使用PBS6.0/EDTA調整抗體濃度成為20mg/mL。
(4)-4 共通操作D：抗體-藥物結合物之純化
以市售之含山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10mM，pH5.5；於本說明書稱為ABS)之任一緩衝液，使NAP-25管柱平衡化。於此NAP-25管柱，置入抗體-藥物結合物反應水溶液(約2.5mL)，以製造商規定量的緩衝液使溶 出，藉此而分取了抗體劃分。共計重複2至3次將此分取劃分再次置入NAP-25管柱並使緩衝液溶出的膠體過濾純化操作，藉此而獲得了除去未結合的藥物連接物、低分子化合物(參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)、二甲基亞碸)的抗體-藥物結合物。
(4)-5 共通操作E：抗體-藥物結合物中的抗體濃度及抗體每一分子之藥物平均結合數之測定
抗體-藥物結合物中的結合藥物濃度，係可藉由測定了抗體-藥物結合物水溶液之280nm及370nm的二波長中的UV吸光度後進行下述之計算而算出。
因某波長中的全吸光度會相等於系統內存在的全部吸收化學物種之吸光度之和[吸光度之加成性]，所以若假設於抗體與藥物之結合前後，於抗體及藥物之莫耳吸光係數無變化，則抗體-藥物結合物中的抗體濃度及藥物濃度係如下述之關係式所示。
A280=AD,280+AA,280=εD,280CD+εA,280CA 式(1)
A370=AD,370+AA,370=εD,370CD+εA,370CA 式(2)
其中，A280表示280nm中的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度，A370表示370nm中的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度，AA,280表示280nm中的抗體之吸光度，AA,370表示370nm中的抗體之吸光度，AD,280表示280nm中的結合物前驅物之吸光度，AD,370表示370nm中的結合物前驅物之吸光度，εA,280表示280nm中的抗體之莫耳吸光係數，εA,370表示370nm中的抗體之莫耳吸光係數，εD,280 表示280nm中的結合物前驅物之莫耳吸光係數，εD,370表示370nm中的結合物前驅物之莫耳吸光係數，CA表示抗體-藥物結合物中的抗體濃度，CD表示抗體-藥物結合物中的藥物濃度。
其中，εA,280、εA,370、εD,280、εD,370係使用事先準備的值(自計算推定值或化合物之UV測定所獲得的實測值)。例如，εA,280可自抗體之胺基酸序列，可藉由已知之計算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)來推定。εA,370係通常為零。εD,280及εD,370可藉由測定使使用的結合物前驅物溶解為某莫耳濃度的溶液之吸光度，而依照朗伯-比爾定律(Lambert-Beer law)(吸光度=莫耳濃度×莫耳吸光係數×室光徑長)來獲得。測定抗體-藥物結合物水溶液之A280及A370，將此等值帶入式(1)及(2)，解出連立方程式，可藉此而求得CA及CD。可藉由進一步將CD除CA而求得每1抗體之藥物平均結合數。
(4)-6 共通操作F：抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數之測定(2)
抗體-藥物結合物中抗體每一分子之藥物平均結合數係除了前述之「(4)-5共通操作E」之外，亦可藉由使用以下之方法的高速液體層析(HPLC)分析來求得。以下，記載抗體與藥物連接物為雙硫鍵的情形之利用HPLC的藥物平均結合數之測定方法。本技術領域中具通常知識者可參照此方法，而依抗體與藥物連接物之結合樣式，適當地利用HPLC來測定藥物平均結合數。
F-1.HPLC分析用樣品之調製(抗體-藥物結合物之還原)
將抗體-藥物結合物溶液(約1mg/mL、60μL)與二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100mM、15μL)混合。將藉由將混合物於37℃恆溫放置30分鐘而切斷了抗體-藥物結合物之輕鏈及重鏈間的雙硫鍵之樣品用於HPLC分析。
F-2.HPLC分析
以下述之測定條件進行HPLC分析。
HPLC系統：Agilent 1290 HPLC系統(Agilent Technologies)
檢測器：紫外吸光度計(測定波長：280nm)
管柱：ACQUITY UPLC BEH Phenyl(2.1×50mm、1.7μm、130Å；Waters、P/N 186002884)
管柱溫度：80℃
移動相A：含0.10%三氟乙酸(TFA)、15% 2-丙醇的水溶液
移動相B：含0.075%TFA、15% 2-丙醇的乙腈溶液
梯度程式：14%-36%(0分鐘-15分鐘)、36%-80%(15分鐘-17分鐘)、80%-14%(17分鐘-17.01分鐘)、14%(17.01分鐘-25分鐘)
樣品注入量：10μL
F-3.資料解析
F-3-1 相對於未結合藥物的抗體之輕鏈(L0)及重鏈(H0)，已結合藥物的輕鏈(有i個藥物結合的輕鏈：Li)及重鏈(有i個藥物結合的重鏈：Hi)，疏水性會與所結合的 藥物數成比例地增加而滯留時間變大，因此會以例如，L0、L1、H0、H1、H2、H3的順序溶出。可藉由L0及H0的滯留時間比較，而將檢出峰分配為L0、L1、H0、H1、H2、H3之其中之一。藥物結合數係可依本技術領域中具通常知識者而被定義，較佳為L0、L1、H0、H1、H2、H3。
F-3-2 因於藥物連接物有UV吸收，所以因應藥物連接物之結合數，使用輕鏈、重鏈及藥物連接物之莫耳吸光係數而按照下式進行波峰面積值之補正。
Figure 107116035-A0202-12-0098-232
其中，各抗體中的輕鏈及重鏈之莫耳吸光係數(280nm)係可藉由已知之計算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)，使用自各抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸序列所推定的值。於H01L02的情形，按照其胺基酸序列，而作為輕鏈之莫耳吸光係數，使用了31710作為推定值，作為重鏈之莫耳吸光係數，使用了79990作為推定值。又，藥物連接物之莫耳吸光係數(280nm)係使用了以巰基乙醇或N-乙醯基半胱胺酸使各藥物連接物進行反應，將順丁烯二醯亞胺基變換為琥珀醯亞胺硫醚的化合物之實測之莫耳吸光係數(280nm)。測定吸光度的波長係 可由本技術領域中具通常知識者適當設定，但較佳為可測定抗體之波峰的波長，更佳為280nm。
F-3-3 按照下式計算相對於波峰面積補正值合計的各鏈波峰面積比(%)。
Figure 107116035-A0202-12-0099-233
A Li 、A Hi ：Li、Hi各波峰面積補正值
F-3-4 依據下式計算抗體-藥物結合物中的抗體每一分子的藥物平均結合數。
藥物平均結合數=(L0波峰面積比x0+L1波峰面積比x1+H0波峰面積比x0+H1波峰面積比x1+H2波峰面積比x2+H3波峰面積比x3)/100x2
又，為了確保抗體-藥物結合物之量，而可將以相同條件製作而獲得的平均藥物數為相同程度之複數抗體-藥物結合物(例如約±1)混合來作成新的批次。該情形，平均藥物數會落在混合前之平均藥物數之間。
就本發明之抗體-藥物結合物之一個具體例而言，可列舉具有下式：
Figure 107116035-A0202-12-0100-234
或下式：
Figure 107116035-A0202-12-0100-235
所表示的結構者。
其中，AB表示於本說明書所揭示的抗CDH6抗體，介隔源自抗體的硫氫基而與結合連接物結合。其中，n與所謂的DAR(藥物對抗體的比率(Drug-to-Antibody Ratio))同意義，表示每1抗體之藥物抗體比。即，表示對抗體1分子之藥物結合數，但此係平均值，即，被特定為平均藥物結合數，而被標記的數值。本發明之[化9]及[化10]所表示的抗體-藥物結合物的情形，在藉由共通操作F的測定，n只要是2至8即 可，較佳為5至8，更佳為7至8，進一步較佳為8。
作為本發明之抗體藥物-結合物之一例，可列舉一種抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其包含於上述式[化9]或[化10]所示的結構，AB所表示的抗體為包含選自包含以下之(a)乃至(g)的群組之任一項記載之重鏈及輕鏈之抗體或其機能性片段：(a)由序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號69所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；(b)由序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號73所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；(c)由序列識別號61所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號77所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；(d)由序列識別號65所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號69所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；(e)由序列識別號65所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號73所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸 序列所構成的重鏈所構成的抗體；(f)由序列識別號65所示的輕鏈全長胺基酸序列之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及序列識別號77所示的重鏈全長胺基酸序列之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈所構成的抗體；或(g)選自包含(a)~(f)的群組之至少一者記載之抗體，其中重鏈或輕鏈包含選自包含以下的群組之1或2種以上之修飾：對N-鍵結的糖鏈加成、對O-鍵結的糖鏈加成、N末端的加工處理、C末端的加工處理、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化、於N末端的甲硫胺酸殘基的加成、脯胺酸殘基之醯胺化、N末麩醯胺酸或N末麩胺酸之焦麩胺酸化等所代表的轉譯後修飾、及羧基末端中的1個或2個胺基酸缺失。
4.醫藥
上述，「2.抗CDH6抗體之製造」之項目及實施例中所記載的本發明之抗CDH6抗體及該抗體之機能性片段，因與腫瘤細胞表面之CDH6結合，具有內在化活性，所以可單獨或與其他藥劑組合，而作為醫藥，作為腎細胞腫瘤及卵巢腫瘤等之癌症的治療劑，例如，腎細胞癌、腎臟透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌(例如，小細胞肺癌或非小細胞肺癌)、神經膠母細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰臓癌、威爾姆氏瘤或神經胚細胞瘤之治療劑來使用。
又，可用於表現CDH6的細胞之檢測。
再者，本發明之抗CDH6抗體及該抗體之機能性片段因具有內在化活性，而可提供作為用於抗體-藥物結合物的抗體。
在上述「3.抗CDH6抗體-藥物結合物」之項目及實施例中所記載之本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物中，被使用作為藥物而具有細胞傷害活性等之抗腫瘤活性的藥物者，係具有內在化活性的抗CDH6抗體及/或該抗體之機能性片段與具有細胞傷害活性等之抗腫瘤活性的藥物之結合物，由於對表現CDH6的癌細胞顯示抗腫瘤活性，而可作為醫藥，特別是作為抗癌症的治療劑及/或預防劑來使用。
本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物藉由放置於大氣中、或進行再結晶等之純化操作，而會吸收水分，或是吸附水使用附著等，而有成為水合物的情形，此種含水的化合物或藥理學上可容許的鹽亦包含於本發明。
本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物具有胺基等之鹼性基的情形，可依所需要而形成藥理學上可容許的酸加成鹽。就此種酸加成鹽而言，可列舉例如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽等之鹵化氫酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽等之低級烷烴磺酸鹽；苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽等之芳基磺酸鹽；甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等之有機酸鹽；或鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽 等之胺基酸鹽等。
本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物具有羧基等之酸性基的情形，可依所需要形成藥理學上可容許的鹽性加成鹽。就此種鹼性加成鹽而言，可列舉例如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等之鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等之鹼土類金屬鹽；銨鹽等之無機鹽；二苄基胺鹽、
Figure 107116035-A0202-12-0104-32
啉鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺(N-methylglucamine)鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、環己基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺鹽、哌
Figure 107116035-A0202-12-0104-33
鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽等之有機胺鹽等。
又，本發明中亦可包含構成抗體-藥物結合物的原子之1個以上已被該原子之同位素所取代的抗CDH6抗體-藥物結合物。同位素存有放射性同位素及安定同位素之2種類，就同位素之例而言，可列舉例如，氫的同位素(2H及3H)、碳的同位素(11C、13C及14C)、氮的同位素(13N及15N)、氧的同位素(15O、17O及18O)、氟的同位素(18F)等。包含已被同位素所標識的抗體-藥物結合物的組成物，係作為例如，治療劑、預防劑、研究試藥、試驗試藥、診斷劑、活體影像診斷劑等為有用的。已被同位素所標識的抗體-藥物結合物、及已被同位素所標識的抗體-藥物結合物之任意比例的混合物亦皆包含於本發明。已被同位素所標識的抗體-藥物結合物可藉由該區域公知之方法，例如，可經由使用已被同位素所標識的原料替代後述的本發明之製造方法中的原料 而製造。
活體外之殺細胞活性，例如，可藉由細胞之增殖抑制活性加以測定。例如，可培養過度表現CDH6的癌細胞株，於培養系以各種濃度添加抗CDH6抗體-藥物結合物，測定焦點活性、菌落形成及對球狀體(spheroid)增殖的抑制活性。其中，例如，藉由使用源自腎細胞腫瘤及卵巢腫瘤的癌細胞株等，而可調查對腎細胞腫瘤及卵巢腫瘤的細胞增殖抑制活性。
使用活體內之實驗動物的對癌症的治療效果係例如，可於移植高度表現CDH6的腫瘤細胞株的裸鼠投予抗CDH6抗體-藥物結合物，而測定癌細胞的變化。其中，例如，可藉由使用將源自腎細胞癌、腎臟透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌或甲狀腺癌的細胞移植至免疫不全小鼠的動物模型，測定對腎細胞癌、腎臟透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌或甲狀腺癌的治療效果。
就本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物適用的癌症之種類而言，只要是會於成為治療對象的癌細胞中表現CDH6的癌即可，並未特別限制，可列舉例如，腎細胞癌(例如，腎臟透明細胞癌或乳頭狀腎細胞癌)、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌(例如，小細胞肺癌或非小細胞肺癌)、神經膠母細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰臓癌、威爾姆氏瘤或神經胚細胞瘤，只要表現CDH6，並未限定於此等。就更佳的癌之例而言，可列舉腎細胞癌(例如，腎臟透明細胞癌、乳頭狀腎細胞 癌)或卵巢癌。
本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物係可適合對哺乳動物投予，但更佳為人類。
就含本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物的醫藥組成物中使用的物質而言，於投予量、投予濃度，可自此區域通常使用的製劑添加物佳以適當選擇而應用。
本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物可作為含有1種以上之藥學上適合性之成分的藥學的組成物而被投予。例如，上述藥學的組成物，代表性地，含有1種以上之藥學的載劑(例如，滅菌液體(例如，水及油(包含石油、動物、植物、或合成起源之油(例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)))。於上述藥學組成物被靜脈內投予的情形，水更為代表性的載劑。食鹽水溶液、以及右旋糖水溶液及甘油水溶液亦可作為液體載劑，尤其可用於注射用溶液。適當的藥學賦形劑可為該區域中公知。上述組成物，只要需要，亦可含有微量之濕潤劑或乳化劑、或pH緩衝化劑。適當藥學載劑之例記載於E.W.Martin之「Remington’s Pharmaceutical Sciences」。其處方係對應投予之態樣。
各種輸送系統為周知的，可用於投予本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物。就導入方法而言，可列舉皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、及皮下之路徑，但並未限定於此等。投予可為例如經由注入或團式注射(bolus injection)者。於特定之較佳實施形態中，上述抗體-藥物結合物之投予係經由注入。非經口的投予係較佳投予路 徑。
於代表性實施形態中，上述藥學組成物係作為適合對人類靜脈內投予的藥學組成物，而依據常用順序被調配。代表性地，靜脈內投予用之組成物係滅菌之等張性之水性緩衝液中的溶液。必要的情形，上述醫藥亦可含有助溶劑及用以緩和注射部位之疼痛的局部麻醉劑(例如，利卡多因(lignocaine))。一般而言，上述成分係以下列任一者供給，例如，有作為密封於顯示活性劑的量的安瓿或小袋(sachet)等而經封口的容器中之乾燥冷凍乾燥粉末或無水之濃縮物，各別、或於單位劑型中一起混合而供給的情形，此係例如，可以含有滅菌之製藥等級的水或食鹽水的注入瓶而投藥。上述醫藥係藉由注射而被投予的情形，注射用滅菌水或食鹽水之安瓿，例如，可為上述成分於投予前被混合的方式被提供。
本發明之醫藥組成物可為僅含有本案之抗CDH6抗體-藥物結合物的醫藥組成物，亦可為含有抗CDH6抗體-藥物結合物及至少一種其他之癌治療劑的醫藥組成物。本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物亦可與其他癌治療劑一起投予，據此可使抗癌效果增強。以如此目的所使用的其他抗癌劑，可與抗體-藥物結合物同時、各別、或連續投予至個體，亦可變換各自之投予間隔而投予。就此種癌治療劑而言，可列舉包含伊馬替尼(Imatinib)、舒尼替尼(Sunitinib)、癌瑞格(Regorafenib)等的酪胺酸激酶抑制劑；包含帕博西尼(Palbociclib)等的CDK4/6抑制劑；包含TAS-116等的HSP90抑制劑；包 含MEK162等的MEK抑制劑；包含尼泊單抗(Nibormab)、派姆單抗(Pembrolizumab)、易普利單抗(Ipilimumab)等的免疫檢查點抑制劑等，但只要具有抗腫瘤活性的藥劑即可，並未限定。
此種醫藥組成物，作為具有所選擇的組成及必要純度的製劑，只要製劑化為冷凍乾燥製劑或液狀製劑即可。製劑化為冷凍乾燥製劑之際，可為含有此區域所使用的適當製劑添加物的製劑。又於液劑亦同樣地可製劑化為含有此區域所使用的各種製劑添加物的液狀製劑。
醫藥組成物之組成及濃度也會依投予方法而變化，但本發明之醫藥組成物所含的抗CDH6抗體-藥物結合物，於抗體-藥物結合物之對抗原的親和性、即對抗原的解離常數(Kd值)之點，係親和性越高(Kd值低)，越能以即使為少量之投予量來發揮藥效。所以，於抗體-藥物結合物之投予量之決定時，亦可基於抗體-藥物結合物與抗原之親和性的狀況而設定投予量。將本發明之抗體-藥物結合物對人類投予之際，例如，只要將約0.001~100mg/kg以1次或是以於1~180日間1次之間隔來複數次投予即可。適合地，只要將0.1~50mg/kg，更適合地將1~50mg/kg、1~30mg/kg、1~20mg/kg、1~15mg/kg、2~50mg/kg、2~30mg/kg、2~20mg/kg或2~15mg/kg，以1~4週間1次，較佳為2~3週間1次的間隔來複數次投予即可。
[實施例]
藉由以下所示實施例而具體地說明本發明，但本發明並未限定於此等。又，此等於任何的意義皆非作限定解釋。又，於本說明書，關於基因操作的各操作，只要未特別明示，皆藉由「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold SpringHarbor Laboratory Press於1989年發刊)記載之方法及其他之本技術領域中具通常知識者使用的實驗書記載之方法來進行，或於使用市售之試藥、套組的情形，按照市售品之指示書來進行。又，於本說明書中，未特別記載之試藥、溶媒及起始材料係可自市售之供給源輕易地取得。
[實施例1：具有內在化活性的大鼠抗人類CDH6抗體之取得] 1)-1 人類、小鼠、大鼠及食蟹獼猴CDH6表現載體之構築
藉由使用編碼人類CDH6蛋白質(NP＿004923)的cDNA表現載體(OriGene公司、RC217889)，按照本技術領域中具通常知識者公知方法，組入哺乳動物表現用載體，製作了人類CDH6表現載體pcDNA3.1-hCDH6。將人類CDH6 ORF(Open Reading Frame)之胺基酸序列示於序列識別號1。
藉由使用編碼小鼠CDH6蛋白質(NP＿031692)的cDNA表現載體(OriGene公司、MC221619)，按照本技術領域中具通常知識者公知的方法，併入哺乳動物表現用載體，製作了小鼠CDH6表現載體pcDNA3.1-mCDH6、 及p3xFLAG-CMV-9-mCDH6。將小鼠CDH6 ORF之胺基酸序列示於序列識別號7。
藉由使用編碼大鼠CDH6蛋白質(NP＿037059)的cDNA表現載體(OriGene公司、RN211850)之各cDNA部分，按照本技術領域中具通常知識者公知方法，組入哺乳動物表現用載體，製作了大鼠CDH6表現載體pcDNA3.1-rCDH6、及p3xFLAG-CMV-9-rCDH6。將大鼠CDH6 ORF之胺基酸序列示於序列識別號8。
編碼食蟹獼猴CDH6蛋白質的cDNA，將由食蟹獼猴腎臓之總RNA合成的cDNA作為模板，使用引子1(5’-CACCATGAGAACTTACCGCTACTTCTTGCTGCTC-3’)(序列識別號85)及引子2(5’-TTAGGAGTCTTTGTCACTGTCCACTCCTCC-3’)(序列識別號86)，進行選殖。確認獲得的序列與食蟹獼猴CDH6(NCBI,XP_005556691.1)之細胞外區域一致。又，確認與EMBL所登錄的食蟹獼猴CDH6(EHH54180.1)全長序列一致。按照本技術領域中具通常知識者公知的方法，藉由組入哺乳動物表現用載體，製作了食蟹獼猴CDH6表現載體pcDNA3.1-cynoCD H6。將食蟹獼猴CDH6 ORF之胺基酸序列示於序列識別號9。
製作的質體DNA之大量調製係使用EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN)進行。
1)-2 免疫
於免疫使用WKY/Izm大鼠之雌鼠(日本SLC公司)。首先將大鼠兩足下腿部以透明質酸酶(hyaluronidase)(SIGMA-ALDRICH公司)作前處理後，於相同部位將實施例1)-1所製作的人類CDH6表現載體pcDNA3.1-hCDH6肌肉內注射。接著，使用ECM830(BTX公司)，使用2針電極，於相同部位實施活體內電穿孔。於隔約二週，重複一次相同之活體內電穿孔後，採取大鼠之淋巴節或脾臓而用於融合瘤製作。
1)-3 融合瘤製作
將淋巴節細胞或脾臓細胞及小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞(ATCC,No.CRL-1 581)，使用LF301 Cell Fusion Unit(BEX公司)，作電氣細胞融合後，懸浮於ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司)，稀釋，於37℃、5% CO2之條件下培養。出現的各融合瘤選植株，作為單選殖株被回收，懸浮於ClonaCell-HY Selection Medium E(StemCell Technologies公司)，於37℃、5% CO2之條件下培養。適度地增殖細胞後，製作各個融合瘤細胞的凍結基料(stock)的同時，將獲得的融合瘤培養上清液用於抗人類CDH6抗體產生融合瘤之篩選。
1)-4 利用Cell-ELISA法的抗體產生融合瘤之篩選
1)-4-1 Cell-ELISA用抗原基因表現細胞之調製
將293α細胞(源自表現整合素(integrin)αv及整合素β3的HEK293的安定表現細胞株)於含有10% FBS的 DMEM培養基中調製成5 x 105細胞/mL。按照使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scienftific公司)的轉染順序，對此293α細胞，導入pcDNA3.1-hCDH6或pcDNA3.1-cynoCDH6或作為陰性對照組之pcDNA3.1之DNA，各分注於100μL於96孔盤(Corning公司)後，於含有10% FBS的DMEM培養基中，於37℃、5% CO2之條件下培養24至27小時。將獲得的轉染細胞以接著狀態直接使用於Cell-ELISA。
1)-4-2 Cell-ELISA
去除實施例1)-4-1所調製的表現載體導入293α細胞之培養上清液後，各自對pcDNA3.1-hCDH6或pcDNA3.1-cynoCDH6或pcDNA3.1導入293α細胞添加融合瘤培養上清液，於4℃靜置1小時。孔中之細胞以含有5% FBS的PBS(+)清洗1次後，添加以含有5% FBS的PBS(+)稀釋500倍的Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA公司)，於4℃靜置1小時。孔中之細胞以含有5% FBS的PBS(+)清洗3次後，以100μL/孔添加OPD顯色液(於OPD溶解液(0.05M檸檬酸3鈉、0.1M磷酸氫2鈉‧12水pH4.5)中各自溶解o-伸苯基二胺二鹽酸鹽(和光純藥公司)、H2O2成為0.4mg/mL、0.6%(v/v)解)。一邊偶爾攪拌一邊進行顯色反應，將1M HCl以100μL/孔添加而使顯色反應停止後，以平盤讀數機(plate reader)(ENVISION：PerkinElmer公司)測定490nm之吸光度。與對照組之pcDNA3.1導入 293α細胞比較，於pcDNA3.1-hCDH6及pcDNA3.1-cynoCDH6表現載體導入293α細胞，選擇了產生顯示較高吸光度的培養上清液的融合瘤作為產生會結合於人類及食蟹獼猴CDH6之抗體的融合瘤。
1)-5 利用流動式細胞測量術篩選對食蟹獼猴CDH6選擇性結合的抗體 1)-5-1 流動式細胞測量術解析用抗原基因表現細胞之調製
以成為5×104細胞/cm2之方式，將293T細胞播種至225cm2燒瓶(Sumitomo Bakelite公司)，在含有10%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2的條件下培養一晚。於此293T細胞中，使用Lipofectamine 2000，導入pcDNA3.1-cynoCDH6或作為陰性對照之pcDNA3.1，於37℃、5%CO2之條件下，再培養一晚。以TrypLE Express(Thermo Fisher Scienftific公司)處理導入各載體的293T細胞，以含有10% FBS的DMEM清洗細胞後，懸浮於含有5%FBS的PBS。將獲得的細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。
1)-5-2 流動式細胞測量術解析
利用流動式細胞測量術法進一步確認於實施例1)-4之Cell-ELISA所選擇的與人類、及食蟹獼猴CDH6結合的抗體產生融合瘤所產生的抗體之對食蟹獼猴CDH6的結合特異性。將實施例1)-5-1所調製的暫時性表現293T 細胞之懸浮液離心，去除上清液後，對各自添加融合瘤培養上清液而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，添加以含有5%FBS的PBS稀釋500倍的Anti-Rat IgG FITC conjugate(SIGMA公司)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，再懸浮於含有2μg/mL 7-胺基放線菌素D(Molecular Probes公司)的5%FBS的PBS，以流式細胞儀(FC500：BeckmanCoulter公司)檢測。資料解析係以FlowJo(TreeStar公司)進行。以閘(gate)去除7-胺基放線菌素D陽性之死細胞後，作成活細胞之FITC螢光強度的直方圖。將產生相對於為對照的pcDNA3.1導入293T細胞之螢光強度直方圖，pcDNA3.1-cynoCDH6導入293T細胞之直方圖位移至強螢光強度側之抗體的融合瘤，選擇作為會特異性地結合於細胞膜表面上表現之食蟹獼猴CDH6的抗體產生融合瘤。
1)-6 大鼠單株抗體之同型之決定
自實施例1)-5所選擇的大鼠抗CDH6抗體產生融合瘤之中，選出被暗示會強烈地特異性地結合於人類以及猴CDH6的選殖株rG019、rG055、rG056、rG061，鑑定了各抗體之同型。抗體之重鏈之亞型、輕鏈之型式由RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT(DS PHARMA BIOMEDICAL公司)決定。其結果，確認rG019、rG055、rG056、rG061之4選植株或亞型為IgG2b，型式為κ鏈。
1)-7 大鼠抗CDH6抗體之調製 1)-7-1 培養上清液製作
大鼠抗人類CDH6單株抗體係自融合瘤培養上清液純化。首先，使大鼠抗CDH6單株抗體產生融合瘤以ClonaCell-HY Selection Medium E(StemCell Technologies公司)增殖至充分量後，培養基交換成已添加20%之Ultra Low IgG FBS(Thermo Fisher Scienftific公司)的Hybridoma SFM(Thermo Fisher Scienftific公司)，培養4-5日。回收本培養上清液，通過0.8μm之過濾器後，再通過0.2μm之過濾器而去除不溶物。
1)-7-2 大鼠抗CDH6抗體之純化
自實施例1)-7-1所製作的融合瘤之培養上清液，以Protein G親和性層析純化抗體(大鼠抗CDH6抗體(rG019、rG055、rG056、rG061))。使Protein G管柱(GE Healthcare Bioscience公司)吸附抗體，以PBS清洗管柱後，以0.1M甘胺酸/鹽酸水溶液(pH2.7)溶出。溶出液中添加1M Tris-HCl(pH9.0)，調整至pH7.0~7.5後，以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF30K、Sartorius公司)進行對HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH6.0)的緩衝液取代，同時進行抗體之濃縮，將抗體濃度調製成1mg/mL。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
[實施例2：大鼠抗CDH6抗體之活體外評價] 2)-1 利用流動式細胞測量術的大鼠抗CDH6抗體之結合能力評價
藉由流動式細胞測量術法評價實施例1)-7所製作的大鼠抗CDH6抗體之人類CDH6結合性。使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)將實施例1)-1所製作的pcDNA3.1-hCDH6暫時性導入293T細胞(ATCC)，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚後，調製細胞懸浮液。將基因導入的293T細胞懸浮液離心，去除上清液後，添加終濃度10ng/mL之實施例1)-7所調製的大鼠抗CDH6單株抗體4種(株編號為rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照(R & D Systems)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，添加以含有5%FBS的PBS稀釋50倍的Anti-Rat IgG(whole molecule)-FITC antibody produced in rabbit(SIGMA)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，以流式細胞儀(FC500：Beckman Coulter)進行檢測。資料解析以FlowJo(TreeStar)進行。將該結果示於圖1。於圖1之直方圖中，橫軸表示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸表示細胞數。陰影所示的直方圖表示使用未導入hCDH6的陰性對照293T細胞的情形，反白實線所示的直方圖顯示使用hCDH6導入293T細胞的情形。顯示藉由於細胞表面之hCDH6有抗體結合而螢光強度增強了。大鼠IgG對照並不會結合於任一細胞。此結果，確認了製作的大鼠抗CDH6單株 抗體4種會結合於pcDNA3.1-hCDH6導入293T細胞。
2)-2 利用流動式細胞測量術的大鼠抗CDH6抗體之CDH6結合部位之解析 2)-2-1 人類CDH6各域缺失體表現載體之構築
於人類CDH6之細胞外全長存有5個細胞外域，EC1(序列識別號2)、EC2(序列識別號3)、EC3(序列識別號4)、EC4(序列識別號5)、EC5(序列識別號6)。自人類CDH6全長，由GeneArt公司合成在每一處缺失表現5個EC域的基因，並按照本技術領域中具通常知識者公知的方法，組入哺乳動物表現用載體p3xFLAG-CMV-9載體(SIGMA-ALDRICH公司)，製作了分別缺失EC1至EC5的各域缺失表現載體。
2)-2-2 利用流動式細胞測量術之使用域缺失體的大鼠抗CDH6抗體之抗原決定位解析
利用使用導入各EC域缺失載體的293α細胞株的流動式細胞測量術解析，鑑定大鼠抗人類CDH6抗體之結合抗原決定位。對將整合素αv及整合素β3表現載體安定轉染至HEK293細胞內的細胞株293α細胞株，使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)暫時性導入實施例2)-2-1所作成的各域缺失體表現載體、及表現全長人類CDH6的pcDNA3.1-hCDH6，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚後，調製細胞懸浮液。將導入293α細胞懸浮液離心，去除上清液後，以終濃度20nM添加實 施例1)-7所調製的大鼠抗CDH6單株抗體4種(株編號為rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照(R & D Systems)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，添加以含有5%FBS的PBS稀釋50倍的Anti-Rat IgG(whole molecule)-FITC antibody produced in rabbit(SIGMA)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，以流式細胞儀(CantoII：BD Biosciences)進行檢測。資料解析以FlowJo(TreeStar)進行。將其結果示於圖2-1~圖2-6。於圖2-1~圖2-6之直方圖中，橫軸表示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸表示細胞數。陰影所示的直方圖表示使用未導入基因的陰性對照293α細胞的情形，反白實線所示的直方圖顯示使用全長hCDH6或各EC域缺失293細胞的情形。細胞表面之全長hCDH6或各EC域缺失體有抗體結合的情形，螢光強度會增強。大鼠IgG對照並不會結合於任一導入細胞。製作的大鼠抗CDH6單株抗體4種會結合於全長hCDH6、EC1缺失體、EC2缺失體、EC4缺失體、及EC5缺失體，但不會結合於EC3缺失體。由此結果顯示了，大鼠抗CDH6單株抗體4種會將hCDH6之EC3作為抗原決定位而特異性地結合之。
2)-3 大鼠抗CDH6抗體之內在化活性 2)-3-1 人類腫瘤細胞株中的CDH6之表現確認
為了選出用於取得抗體之評價的CDH6陽性人類腫瘤細胞株，自公知資料庫檢索CDH6表現資訊，利用流 動式細胞測量術法評價於細胞膜表面的CDH6之表現。將人類卵巢腫瘤細胞株NIH：OVCAR-3、PA-1、ES-2及人類腎細胞腫瘤細胞株786-O(全部獲自ATCC)於37℃、5% CO2之條件下培養後，調製細胞懸浮液。將細胞離心，去除上清液後，以終濃度50ug/mL添加市售抗人類CDH6抗體(MABU2715，R & D Systems)或作為陰性對照之小鼠IgG1(BD Pharmingen)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，添加以含有5%FBS的PBS稀釋50倍的F(ab’)2 Fragment of FITC-conjugated Goat Anti-mouse immunoglobulins(Dako)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，以流式細胞儀(CantoII：BD Biosciences)進行檢測。資料解析以FlowJo(TreeStar)進行。將其結果示於圖3。於圖3之直方圖，橫軸表示表現抗體結合量的FITC之螢光強度，縱軸表示細胞數。陰影所示的直方圖表示以陰性對照mIgG1染色的情形，反白實線所示的直方圖顯示以抗人類CDH6抗體染色的情形。顯示藉由於細胞表面之hCDH6有抗體結合而螢光強度會增強。mIgG1對照並不會結合於任一細胞。此結果顯了示NIH：OVCAR-3，PA-1及786-O細胞株係內在性地於細胞表面上表現CDH6。另一方面顯示了，ES-2細胞株完全不表現CDH6。
2)-3-2 大鼠抗CDH6抗體之內在化活性評價
大鼠抗CDH6抗體之內在化活性係使用結合抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)的抗大鼠IgG試藥 Rat-ZAP(ADVANCED TARGETING SYSTEMS)來評價。即，將人類CDH6陽性卵巢腫瘤細胞株NIH：OVCAR-3(ATCC)以4x103個細胞/孔接種於96孔盤，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。人類CDH6陽性腎細胞腫瘤細胞株786-O(ATCC)係以1x103個細胞/孔接種於96孔盤而培養一晚。次日，添加大鼠抗CDH6抗體(終濃度：1nM)或作為陰性對照抗體之大鼠IgG2b抗體(R & D Systems)。又添加Rat-ZAP(終濃度：0.5nM)或作為陰性對照之未結合毒素的Goat Anti-Rat IgG，Fc(gamma)Fragment Specific(JACKSON IMMUNORESEARCH)(終濃度：0.5nM)，於37℃、5%CO2條件下培養3日。生存細胞數係以利用CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega)的ATP活性(RLU)之定量來測定。於此評價，藉由依賴大鼠抗CDH6抗體之內在化活性而Rat-ZAP併入細胞內之抑制蛋白質合成的皂草素被釋放於細胞內，而抑制細胞增殖。利用抗CDH6抗體添加的細胞增殖抑制作用係以添加陰性對照替代Rat-ZAP的孔之生存細胞數設為100%時的相對生存率標記。圖4呈示圖表及細胞生存率之表。此結果顯示了，大鼠抗CDH6抗體結合於CDH6而引起內在化。
[實施例3：編碼大鼠抗CDH6抗體之可變區的Cdna之核苷酸定序] 3)-1 rG019重鏈可變區及輕鏈可變區之基因片段之增幅及序列決定
自3)-1-1 G019之總RNA的調製
為了增幅含rG019之可變區的cDNA，使用TRIzol Reagent(Ambion公司)自G019調製總RNA。
3)-1-2 利用5’-RACE PCR之含rG019的重鏈可變區的cDNA之增幅及核苷酸定序
含重鏈可變區的cDNA之增幅係使用實施例3)-1-1所調製的總RNA之約1μg與SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)來實施。就用於以PCR增幅rG019之重鏈基因之可變區的cDNA之引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)，及自公知之大鼠重鏈之恆定區的序列設計的引子。
將含以5’-RACE PCR增幅的重鏈之可變區的cDNA選殖於質體，其次實施重鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列的定序解析。
將編碼已被決定的rG019之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號16，將胺基酸序列示於序列識別號15。
3)-1-3 利用5’-RACE PCR的包含rG019之輕鏈可變區的cDNA之增幅及核苷酸定序
以與實施例3)-1-2同樣之方法實施。惟，作為用以PCR增幅rG019之輕鏈基因之可變區的cDNA的引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)、及自公知之大鼠輕鏈之 恆定區序列所設計的引子。
將編碼已被決定的rG019之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號11，將胺基酸序列示於序列識別號10。
3)-2 rG055重鏈可變區及輕鏈可變區之基因片段之增幅及序列決定
以與實施例3)-1同樣之方法來決定序列。
將編碼已被決定的rG055之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號26，將胺基酸序列示於序列識別號25。將編碼輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號21，將胺基酸序列示於序列識別號20。
3)-3 rG056重鏈可變區及輕鏈可變區之基因片段之增幅及序列決定
以與實施例3)-1同樣之方法來決定序列。
將編碼已被決定的rG056之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號36，將胺基酸序列示於序列識別號35。將編碼輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號31，將胺基酸序列示於序列識別號30。
3)-4 rG061重鏈可變區及輕鏈可變區之基因片段之增幅及序列決定
以與實施例3)-1同樣之方法來決定序列。
將編碼已被決定的rG061之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號46，將胺基酸序列示於序列識別號45。將編碼輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號41，將胺基酸序列示於序列識別號40。
[實施例4：人類嵌合化抗CDH6抗體chG019之製作] 4)-1 人類嵌合化抗CDH6抗體chG019之表現載體之構築 4)-1-1 嵌合及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK之構築
使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech公司)，將質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)以限制酶XbaI及PmeI消化所獲得的約5.4kb之片段、及含有編碼序列識別號50所示的人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA序列的DNA片段結合，而製作了pcDNA3.3/LK。
藉由自pcDNA3.3/LK去除新黴素(neomycin)表現單元而構築了pCMA-LK。
4)-1-2 嵌合及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1之構築
使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech公司)，將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA片段、及含有編碼序列 識別號51所表示的人類重鏈訊息序列及人類IgG1恆定區的DNA序列的DNA片段結合，而構築了pCMA-G1。
4)-1-3 chG019重鏈表現載體之構築
合成序列識別號57所示的chG019重鏈之核苷酸序列之核苷酸編號36至440所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由於pCMA-G1以限制酶BlpI切斷處插入合成的DNA片段，而構築了chG019重鏈表現載體。又，chG019重鏈為了防止未預期的雙硫鍵，而使用了將CDR中之半胱胺酸取代為脯胺酸的序列。
4)-1-4 chG019輕鏈表現載體之構築
合成含有序列識別號52所示的編碼ehG019輕鏈的DNA序列讀的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由結合合成的DNA片段與將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA片段，構築了chG019輕鏈表現載體。
4)-2 人類嵌合化抗CDH6抗體chG019之生產及純化 4)-2-1 chG019之生產
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係依據手冊，而實施繼代、培養。將對數增殖期之1.2×109個之FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING公司)，以FreeStyle293 expression medium(Invitrogen公司)稀釋而調製成2.0×106細胞/ml。於40ml之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中添加0.24mg之重鏈表現載體及0.36mg之輕鏈表現載體及1.8mg之聚伸乙亞胺(Polyscience # 24765)並緩緩攪拌，再放置5分鐘後，添加於FreeStyle 293F細胞。於37℃、8%CO2培養箱中以90rpm振盪培養4小時。之後添加600ml之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司)、18ml之GlutaMAX I(GIBCO公司)、及30ml之Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司)，於37℃、8%CO2培養箱中，以90rpm振盪培養7日而獲得的培養上清液，以Disposable Capsule Filter(Advantec # CCS-045-E1H)過濾。
4)-2-2 chG019之純化
將實施例4)-2-1所獲得的培養上清液以rProtein A親和性層析之1階段步驟加以純化。將培養上清液供應至經PBS平衡化的填充有MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱清洗。接著，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，收集包含抗體的劃分。將該劃分藉由透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行對HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH6.0)的緩衝液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分 級分子量UF10K，Sartorius公司)將抗體濃縮，將IgG濃度調製成5mg/ml以上。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
4)-3 人類嵌合化抗CDH6抗體chG019之結合性評價
將4)-2所純化的人類嵌合化抗CDH6抗體chG019之CDH6結合性藉由流動式細胞測量術法加以確認。使用Lipofectamine 2000，將實施例1)-1所製作的pcDNA3.1-hCDH6、或pcDNA3.1-cynoCDH6、或pcDNA3.1各自暫時性導入293α細胞，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚後，調製細胞懸浮液。於此等細胞懸浮液中添加chG019，於4℃靜置1小時後，以含有5%FBS的PBS清洗2次，添加以含有5%FBS的PBS稀釋500倍的PE標識F(ab’)2 Fragment抗人類IgG，Fcγ抗體(JACKSON IMMUNORESEARCH)並懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，再懸浮於含有5%FBS的PBS，以流式細胞儀(CantoII：BD Biosciences)進行檢測。資料解析以FlowJo(TreeStar)進行。如圖5所示，chG019未與為陰性對照的pcDNA3.1導入293α細胞結合，與pcDNA3.1-hCDH6及pcDNA3.1-cynoCDH6導入293α細胞為抗體濃度賴性結合。於圖5，橫軸表示抗體濃度，縱軸係將結合量以MeanFluorescent Intensity(平均螢光強度)表示。由此結果可知，chG019會對於人類及食蟹獼猴CDH6特異性地結合，結合活性幾乎相同。
[實施例5：人類化抗CDH6抗體之製作] 5)-1 抗CDH6抗體之人類化體設計 5)-1-1 chG019之可變區之分子模型
chG019之可變區之分子模型係利用為同源模型之公知方法(Methods in Enzymology，203，121-153，(1991))。將登錄於對於chG019之重鏈及輕鏈之可變區具有高序列同一性的Protein Data Bank(Nuc.Acid Res.35，D301-D303(2007))的結構(PDB ID：2I9L)作為模板，使用市售的蛋白質立體結構解析程式BioLuminate(Schrodinger公司製)來進行。
5)-1-2 對人類化hG019的胺基酸序列之設計
chG019係藉由CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))而人類化。於KABAT等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))中既定的人類之gamma鏈亞群1及kappa鏈亞群1之一致序列(consensus sequence)，因對chG019之框架區具有高同一性，而各自被選擇作為重鏈及輕鏈之接受體。應移入接受體上的供予體殘基藉由分析參考Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))所給予的基準等，分析三維結構模型而選擇。
5)-2 chG019重鏈之人類化
將設計的3種之重鏈命名為hH01、hH02及hH04。將hH01之重鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號69。將編碼序列識別號69之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號70。將hH02之重鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號73。將編碼序列識別號73之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號74。將hH04之重鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號77。將編碼序列識別號77之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號78。
5)-3 chG019輕鏈之人類化
將設計的2種之輕鏈命名為hL02及hL03。將hL02之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號61。將編碼序列識別號61之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號62。將hL03之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號65。將編碼序列識別號65之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號66。
5)-4 利用重鏈及輕鏈之組合之人類化hG019的設計
將由hH01及hL02所構成的抗體稱為「H01L02抗體」或「H01L02」。將由hH02及hL02所構成的抗體稱為「H02L02抗體」或「H02L02」。將由hH02及hL03所構成的抗體稱為「H02L03抗體」或「H02L03」。將由hH04及hL02所構成的抗體稱為「H04L02抗體」或「H04L02」。
5)-5 人類化抗CDH6抗體之表現 5)-5-1 人類化hG019之重鏈表現載體之構築 5)-5-1-1 人類化hG019-H01型重鏈表現載體之構築
合成序列識別號70所示的人類化hG019-H01型重鏈之核苷酸序列之核苷酸編號36至440所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例4)-1-3相同的方法，構築了人類化hG019-H01型重鏈表現載體。
5)-5-1-2 人類化hG019-H02型重鏈表現載體之構築
合成序列識別號74所示的人類化hG019-H02型重鏈之核苷酸序列之核苷酸編號36至440所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例4)-1-3相同之方法，構築了人類化hG019-H02型重鏈表現載體。
5)-5-1-3 人類化hG019-H04型重鏈表現載體之構築
合成序列識別號78所示的人類化hG019-H04型重鏈之核苷酸序列之核苷酸編號36至440所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例4)-1-3相同之方法，構築了人類化hG019-H04型重鏈表現載體。
5)-5-2 人類化hG019之輕鏈表現載體之構築 5)-5-2-1 人類化hG019-L02型輕鏈表現載體之構築
合成含有序列識別號62所示的人類化hG019-L02型輕鏈之核苷酸序列之核苷酸編號37至399所示的編碼人類化hG019-L02型輕鏈之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由插入將pCMA-LK於以限制酶 BsiWI切斷處所合成的DNA片段，構築了人類化hG019-L02型輕鏈表現載體。
5)-5-2-2 人類化hG019-L03型輕鏈表現載體之構築
合成含有序列識別號66所示的人類化hG019-L03型輕鏈之核苷酸序列之核苷酸編號37至399所示的編碼人類化hG019-L03型輕鏈之可變區的DNA序列的DNA片段(GENEART公司)。藉由以與實施例5)-5-2-1同樣之方法，構築了人類化hG019-L03型輕鏈表現載體。
5)-5-3 人類化hG019之調製 5)-5-3-1 H01L02、H02L02、H02L03、H04L02之生產
以與實施例4)-2-1同樣之方法加以生產。藉由實施例5)-4所示的重鏈及輕鏈之組合，生產了H01L02、H02L02、H02L03、H04L02。
5)-5-3-2 H01L02、H02L02、H02L03、H04L02之2步驟純化
將實施例5)-5-3-1所獲得的培養上清液，以rProtein A親和性層析陶瓷氫氧磷灰石(ceramic hydroxyapatite)之2階段步驟加以純化。將培養上清液供應至經PBS平衡化之有MabSelectSuRe填充的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量之2倍以上的PBS清洗管柱。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)將抗體溶出。包含抗體的劃分利用透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行對PBS的緩衝液取代，以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液稀釋 5倍後，施加於以5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化的陶瓷氫氧磷灰石(ceramic hydroxyapatite)管柱(日本Bio-Rad、Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column)。實施藉由氯化鈉之直線性濃度梯度溶出，收集包含抗體的劃分。該劃分利用透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行對HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH6.0)的緩衝液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF10K，Sartorius公司)將抗體濃縮，將IgG濃度調製為20mg/ml。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
[參考例1：抗CDH6抗體NOV0712之製作]
實施例所使用的抗CDH6抗體NOV0712係參照國際公開第2016/024195號記載之NOV0712之輕鏈全長、及重鏈全長之胺基酸序列(各自為國際公開第2016/024195之序列識別號235及序列識別號234)而製作。
參考例1)-1抗CDH6抗體NOV0712 參考例1)-1-1抗CDH6抗體NOV0712之重鏈表現載體之構築
合成含有序列識別號84所示的NOV0712之重鏈之核苷酸序列的核苷酸編號36至428所示的NOV0712之重鏈之可變區的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例4)-1-3同樣之方法，構築了NOV0712之重鏈表現載體。將藉由該NOV0712之重鏈表現載體表現的NOV0712 之重鏈之胺基酸序列示於序列識別號83。序列識別號83所示的胺基酸序列中，1~19號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列。
參考例1)-1-2抗CDH6抗體NOV0712之輕鏈表現載體之構築
合成含有序列識別號82所示的NOV0712之輕鏈之核苷酸序列的核苷酸編號37至405所示的編碼NOV0712之輕鏈之可變區的DNA序列(GENEART公司)。以與實施例5)-5-2-1同樣之方法，構築了NOV0712之輕鏈表現載體。將藉由該NOV0712之輕鏈表現載體所表現的NOV0712之輕鏈之胺基酸序列示於序列識別號81。序列識別號81所示的胺基酸序列中，1~20號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列。
參考例1)-2抗CDH6抗體NOV0712之調製 參考例1)-2-1抗CDH6抗體NOV0712之生產
以與實施例4)-2-1同樣之方法生產了NOV0712。參考例1)-2-2抗CDH6抗體NOV0712之1步驟純化自參考例1)-2-1所獲得的培養上清液，以與實施例4)-2-2同樣之方法，將抗CDH6抗體NOV0712純化(抗體濃度HBSor為5mg/l)。
[實施例6：人類化hG019及NOV0712之活體外評價] 6)-1 人類化hG019之結合性評價 6)-1-1 人類化hG019之人類CDH6抗原結合能
抗體與抗原(Recombinant Human CDH6 Fc His chimera，R & D Systems)之解離常數測定係使用Biacore T200(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE)，藉由對已固定化的抗His抗體以抗原作為配位體而捕捉(capture)，並將抗原作為分析物而進行測定之捕捉法進行。抗組胺酸抗體(His capture kit、GE HEALTHCARE BIOSCIENCE)係對Sensor chip CM5(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE)以胺偶合法使共價結合約1000RU。參考細胞亦同樣地固定化。使用添加1mM CaCl2的HBS-P+(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.05% Surfactant P20)作為電泳緩衝液(running buffer)。於已將抗組胺酸抗體固定化的晶片上，添加抗原60秒鐘之後，將抗體之稀釋系列溶液(0.391-100nM)以流速30μl/分鐘添加300秒鐘，接著，監測600秒鐘之解離相。作為再生溶液，將添加5M MgCl2的甘胺酸溶液pH1.5以流速10μl/分鐘添加30秒鐘，2次。資料之解析係使用分析軟體(BIAevaluation software，4.1版)之Steady State Affinity模型，算出解離常數(KD)。將結果示於表2。
Figure 107116035-A0305-02-0135-1
6)-1-2 對人類、猴、小鼠、大鼠CDH6的結合性
使用Lipofectamine 2000，將在實施例1)-1製作的pcDNA3.1-hCDH6、pcDNA3.1-cynoCDH6、p3xFLAG-CMV-9-mCDH6、p3xFLAG-CMV-9-rCDH6暫時性地導入293α細胞，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚後，調製細胞懸浮液。作為陰性對照，而使用未導入基因的293α細胞。將上述製作的293α細胞懸浮液離心，去除上清液後，添加實施例5)-5-3所調製的人類化hG019抗體4種(株編號為H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、或人類IgG1對照(Calbiochem)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，添加含有5%FBS的PBS稀釋500倍的anti-human Fcg PE goat F(ab’)(Jackson laboratory)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，以流式細胞儀(CantoII：BD Biosciences)進行了檢測。資料解析係以FlowJo(TreeStar)進行。於圖6-1及圖6-2中，橫軸表示抗體濃度，縱軸係將結合量以平均螢光強度(Mean Fluorescent Intensity)表示。如圖6-1及圖6-2所示，為陰性對照的人類IgG1對照對於任一者之CDH6基因導入細胞皆不會結合。人類化hG019抗體4種(株編號為H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)會結合於人類及食蟹獼猴CDH6，但並不會結合於小鼠及大鼠CDH6。任一抗體皆不會結合於為陰性對照的空載體pcDNA3.1導入細胞。另一方面，於國際公開第2016/024195號揭示NOV0712抗體係顯示對人類、食蟹獼猴、小鼠、及大鼠CDH6全部的結合活性。此結果顯示了，於本說明書取得的人類化hG019抗體4種為顯示與NOV0712抗體不同結合性質的抗CDH6抗體。
6)-2 人類化hG019及NOV0712之CDH6結合部位之解析 6)-2-1 使用域缺失體的抗原決定位解析
使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)，將在實施例2)-2-1作成的各域缺失體表現載體、及表現全長hCDH6的pcDNA3.1-hCDH6暫時性地導入，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚後，調製細胞懸浮液。將基因導入的293α細胞懸浮液離心，去除上清液後，添加在實施例5)-5-3調製的人類化hG019抗體4種(株編號為H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、或在參考例1調製的抗CDH6抗體NOV0712、或作為陰性對照之人類IgG1(Calbiochem)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，添加含有5%FBS的PBS稀釋500倍的APC-anti-human IgG goat F(ab’)2(Jackson laboratory)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，以流式細胞儀(CantoII：BD Biosciences)進行了檢測。資料解析係以FlowJo(TreeStar)進行。將該結果示於圖7-1~圖7-6。於圖7-1~圖7-6之直方圖中，橫軸表示表現抗體結合量的APC之螢光強度，縱軸表示細胞數。陰影所示的直方圖表示使用未導入基因的陰性對照293α細胞的情形，反白實線所示的直方圖顯示使用全長hCDH6或各EC域缺失 293α細胞的情形。於細胞表面之全長hCDH6或各EC域缺失體有抗體結合的情形，螢光強度會增強。人類IgG1對照未結合於任一者之導入細胞。人類化hG019抗體4種(株編號為H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)會結合於全長hCDH6、EC1缺失體、EC2缺失體、EC4缺失體、及EC5缺失體，但不會結合於EC3缺失體結合。即，顯示了人類化hG019抗體4種會將hCDH6之EC3作為抗原決定位而特異性地結合。另一方面，抗CDH6抗體NOV0712雖會結合於全長hCDH6、EC1缺失體、EC2缺失體、EC3缺失體、及EC4缺失體，但不會結合於EC5缺失體。即，顯示了抗CDH6抗體NOV0712抗體會將hCDH6之EC5作為抗原決定位而特異性地結合，與記載於國際公開第2016/024195號的NOV0712之抗原決定位資訊一致。由此結果顯示了，NOV0712與於本說明書取得的人類化hG019抗體4種為顯示不同性質的抗CDH6抗體。
6)-2-2 抗體之結合競合試驗 6)-2-2-1 786-O/hCDH6安定表現細胞株之製作
786-O/hCDH6安定表現細胞株係藉由使786-O細胞(ATCC)感染人類CDH6全長表現用重組反轉錄病毒而製作。人類CDH6表現反轉錄病毒載體(pQCXIN-hCDH6)係使用編碼人類CDH6蛋白質(NP_004923)的cDNA表現載體(OriGene公司RC217889)，按照本技術領域中具通常知識者公知的方法，藉由組入反轉錄病毒載體pQCXIN(CLONTECH)而製作。使用FuGene HD(Promega)，將pQCXIN-hCDH6暫時性導入反轉錄病毒包裝細胞RetroPack PT67(CLONTECH)，48小時後，回收含有重組反轉錄病毒的培養上清液，藉由添加至786-O細胞培養系，使相同細胞感染。自感染3日後，以終濃度50mg/mL添加G418(Gibco)的培養基，於37℃、5% CO2之條件下進行培養並進行感染細胞之藥劑選出，而建立安定表現人類CDH6的細胞株786-O/hCDH6。與實施例2)-3-1同樣地，以流動式細胞測量術確認安定表現株之人類CDH6的高表現(圖8)。檢測用抗體使用以含有5%FBS的PBS稀釋500倍的Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific)。將該結果示於圖8。於圖8之直方圖，橫軸表示抗體結合量的Alexa Fluor 647之螢光強度，縱軸表示細胞數。陰影所示的直方圖表示以陰性對照mIgG1染色的情形，反白實線所示的直方圖顯示以抗人類CDH6抗體染色的情形。顯示藉由於細胞表面之hCDH6有抗體結合而螢光強度會增強。mIgG1對照並不會結合於任一細胞結合。此結果顯示了，786-O/hCDH6安定表現細胞株與親株786-O細胞比較，而高度表現人類CDH6。
6)-2-2-2 使用標識化H01L02及標識化NOV0712的結合競合試驗
使用Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody Labeling Kit(Thermo Fisher)，製作了標識化H01L02及標識化NOV0712。將6)-2-2-1所製作的786-O/hCDH6安定表現細胞株之細胞懸浮液離心，去除上清液後，以終濃度5nM添加標識化NOV0712或標識化H01L02，進一步以圖9之橫軸所示的終濃度添加實施例5)-5-3調製的人類化hG019抗體4種(株編號為H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、或參考例1調製的抗CDH6抗體NOV0712、或為陰性對照之人類IgG1(Calbiochem)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS清洗2次後，以流式細胞儀(CantoII：BD Biosciences)進行檢測。資料解析以FlowJo(TreeStar)進行。將該結果示於圖9。橫軸表示未標識化的抗體之添加時之終濃度，縱軸將結合量以平均螢光強度(Mean Fluorescent Intensity)表示。將未標識化的NOV0712添加於標識化NOV0712的細胞的情形，因具有相同抗原決定位且結合為競合，置換為未標識化的抗體，標識化抗體之結合量為添加濃度依賴性地減少。另一方面，即使於添加標識化NOV0712的細胞添加人類化hG019抗體4種、或作為陰性對照之人類IgG1，因標識化抗體之結合量亦無變化，顯示此等之抗體係抗原決定位不同且結合並非競合。同樣地，於添加標識化H01L02的細胞添加未標識化的人類化hG019抗體4種的情形，因具有相同抗原決定位且結合為競合，取代未為標識化的抗體，標識化抗體之結合量為添加濃度依賴性地減少。另一方面，添加標識化H01L02的細胞中即使添加NOV0712、或作為陰性對照之人類IgG1，因標識化 抗體之結合量無變化，顯示此等之抗體係抗原決定位不同且結合未競合。
6)-3 人類化hG019及NOV0712之內在化活性評價
人類化hG019及NOV0712之內在化活性係使用使結合抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)的抗人類IgG試藥Hum-ZAP(ADVANCED TARGETING SYSTEMS)而評價。即，將人類CDH6陽性卵巢腫瘤細胞株NIH：OVCAR-3(ATCC)以4x103個細胞/孔，接種於96孔盤，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。人類CDH6陽性腎細胞腫瘤細胞株786-O(ATCC)係以1x103個細胞/孔接種於96孔盤而培養一晚。將人類CDH6陽性卵巢腫瘤細胞株PA-1(ATCC)以1x103個細胞/孔接種於96孔盤而於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。次日，添加抗CDH6抗體(終濃度：1nM)、或作為陰性對照抗體之人類IgG1抗體(Calbiochem)。又添加Hum-ZAP(終濃度：0.5nM)或作為陰性對照之未結合毒素的F(ab’)2 Fragment Goat Anti-human IgG，Fc(gamma)Fragment Specific(JACKSON IMMUNORESEARCH)(終濃度：0.5nM)，於37℃、5%CO2條件下培養3日。生存細胞數係以利用CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay的ATP活性(RLU)之定量加以測定。於此評價，取決於人類化抗CDH6抗體之內在化活性，藉由Hum-ZAP被攝入細胞內，且抑制蛋白質合成的皂草素於細胞內被釋放，細胞增殖被抑制。由於抗CDH6抗體添加的細胞 增殖抑制作用係以替代Hum-ZAP，而以將添加陰性對照的孔之生存細胞數設為100%的相對生存率表示。於圖10-1~圖10-3顯示圖表及細胞生存率之表。被認為於本實驗中，內在化活性強的抗體會顯示低的細胞生存率。此結果，人類化hG019抗體4種於3種之細胞株任一者中，由細胞生存率而予測的內在化率皆為約50~75%，顯示非常高的內在化活性，且與NOV0712比較，而顯示更高的內在活性。由ADC之藥效機制來看，具有高內在化活性的抗體被認為更適合作為ADC化抗體。
[實施例7：人類化hG019-藥物結合物之製作] 7)-1 抗體-藥物結合物之製作H01L02-DXd
步驟1：抗體-藥物結合物(1)
Figure 107116035-A0305-02-0142-2
抗體之還原：將實施例5所製作的H01L02，使用製造方法1所記載之共通操作B(作為280nm吸光係數，使用1.53mLmg-1cm-1)及C，以PBS6.0/EDTA調製成9.85mg/mL。於本溶液(5.7mL)中添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.231mL；對於抗體一分子為6.0當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0855mL)。確認本溶液的pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃恆溫放置2小時，將抗體內鏈間部之雙硫鍵還原。
抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液於15℃恆溫放置10分鐘。接著添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 107116035-A0202-12-0141-203
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之10mM二甲基亞碸溶液(0.386mL；相對於抗體一分子為10當量)，於15℃恆溫放置1小時，使藥物連接物結合於抗體。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0347mL；相對於抗體一分子為9當量)，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物的反應停止。
純化：將上述溶液，進行利用製造方法1記載的共通操作D的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物「H01L02-ADC」的溶液19mL。
特性評價：使用製造方法1記載的共通操作E(使用 εD,280=5440、εD,370=21240)，獲得下述之特性值。
抗體濃度：2.26mg/mL，抗體收穫量：42.9mg(76%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.9；以共通操作F測定的抗體每一分子之藥物藥物平均結合數(n)：7.7。
7)-2 抗體-藥物結合物之製作H02L02-DXd
步驟1：抗體-藥物結合物(2)
Figure 107116035-A0202-12-0142-33
抗體之還原：將實施例5所製作的H02L02，使用製造方法1所記載之共通操作B(作為280nm吸光係數，使用1.51mLmg-1cm-1)及C，以PBS6.0/EDTA調製成9.95mg/mL。於本溶液(5.7mL)中添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.234mL；對於抗體一分子為6.0當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0855mL)。確認本溶液的pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃恆溫放置2小時，將抗體內鏈間部之雙硫鍵還原。
抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液於15℃恆溫放置10分鐘。其次添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 107116035-A0202-12-0143-204
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之10mM二甲基亞碸溶液(0.389mL；相對於抗體一分子為10當量)，於15℃恆溫放置1小時，使藥物連接物結合於抗體。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0350mL；相對於抗體一分子為9當量)，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物的反應停止。
純化：將上述溶液，進行利用製造方法1記載的共通操作D的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物「H02L02-ADC」的溶液19mL。
特性評價：使用製造方法1記載的共通操作E(使用εD,280=5440、εD,370=21240)，獲得下述之特性值。
抗體濃度：2.61mg/mL，抗體收穫量：49.6mg(87%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.9；以共通操作F測定的抗體每一分子之藥物藥物平均結合數(n)：7.6。
7)-3 抗體-藥物結合物之製作H02L03-DXd
步驟1：抗體-藥物結合物(3)
Figure 107116035-A0202-12-0144-34
抗體之還原：將實施例5所製作的H02L03，使用製造方法1所記載之共通操作B(作為280nm吸光係數，使用1.53mLmg-1cm-1)及C，以PBS6.0/EDTA調製成9.86mg/mL。於本溶液(5.7mL)中添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.270mL；相對於抗體一分子為7.0當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0855mL)。確認本溶液的pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃恆溫放置2小時，將抗體內鏈間部之雙硫鍵還原。
抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液於15℃恆溫放置10分鐘。其次添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺 醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲
Figure 107116035-A0202-12-0145-205
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之10mM二甲基亞碸溶液(0.386mL；相對於抗體一分子為10當量)，於15℃恆溫放置1小時，使藥物連接物結合於抗體。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0347mL；相對於抗體一分子為9當量)，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物的反應停止。
純化：將上述溶液，進行利用製造方法1記載的共通操作D的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物「H01L02-ADC」的溶液19mL。
特性評價：使用製造方法1記載的共通操作E(使用εD,280=5440、εD,370=21240)，獲得下述之特性值。
抗體濃度：2.71mg/mL，抗體收穫量：51.4mg(91%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.7；以共通操作F測定的抗體每一分子之藥物藥物平均結合數(n)：7.6。
7)-4 抗體-藥物結合物之製作H04L02-DXd
步驟1：抗體-藥物結合物(4)
Figure 107116035-A0202-12-0146-35
抗體之還原：將實施例5製作的H04L02，使用製造方法1所記載之共通操作B(作為280nm吸光係數，使用1.53mLmg-1cm-1)及C，以PBS6.0/EDTA調製成9.86mg/mL。於本溶液(5.7mL)中添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.232mL；對於抗體一分子為6.0當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0855mL)。確認本溶液的pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃恆溫放置2小時，將抗體內鏈間部之雙硫鍵還原。
抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液於15℃恆溫放置10分鐘。其次添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并 [3’,4’：6,7]吲
Figure 107116035-A0202-12-0147-206
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之10mM二甲基亞碸溶液(0.386mL；相對於抗體一分子為10當量)，於15℃恆溫放置1小時，使藥物連接物結合於抗體。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0347mL；相對於抗體一分子為9當量)，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物的反應停止。
純化：將上述溶液，進行利用製造方法1記載的共通操作D的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物「H04L02-ADC」的溶液19mL。
特性評價：使用製造方法1記載的共通操作E(使用εD,280=5440、εD,370=21240)，獲得下述之特性值。
抗體濃度：2.56mg/mL，抗體收穫量：48.7mg(87%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.8；以共通操作F測定的抗體每一分子之藥物藥物平均結合數(n)：7.6。
[參考例2：NOV0712-藥物結合物之製作] 參考例2)-1抗體-藥物結合物之製作NOV0712-DM4 抗體-藥物結合物(5)
抗體與藥物連接物之結合：將參考例1所製作的NOV0712，使用製造方法1所記載之共通操作B(作為280nm吸光係數，使用1.51mLmg-1cm-1)及C，以1M氫氧化鈉將20mM HEPES8.1(LIFE TECHNOLOGIES公司製HEPES，1M Buffer Solution(20mL)作成pH8.1後，以蒸 餾水作成1L)調製成9.7mg/mL，於20℃恆溫放置10分鐘。其次添加WO2016/024195號公開專利公報記載之10mM 1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)-1-側氧基-4-(吡啶-2-基二氫硫基)丁烷-2-磺酸之DMA溶液(0.366mL；相對於抗體一分子為5.2當量)、10mM N2-脫乙醯基-脫乙醯基-N2-(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(maytansine)(DM4)之DMA溶液(0.366mL；相對於抗體一分子為6.8當量)、及0.243mL之DMA，於20℃恆溫放置16小時，使藥物連接物結合於抗體。其次，添加1M乙酸水溶液並作成pH5.0，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物的反應停止。
純化：將上述溶液，進行利用製造方法1記載的共通操作D的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物「NOV0712-DM4」的溶液28mL。
特性評價：使用製造方法1記載的共通操作E(使用εA,280=200500、εA,252=76295、εD,280=43170、及εD,252=23224)，獲得下述之特性值。
抗體濃度：2.58mg/mL，抗體收穫量：72.2mg(93%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.0。
參考例2)-2抗體-藥物結合物之製作NOV0712-DXd
步驟1：抗體-藥物結合物(6)
Figure 107116035-A0202-12-0149-36
抗體之還原：將參考例1所製作的NOV0712，使用製造方法1所記載之共通操作B(作為280nm吸光係數，使用1.51mLmg-1cm-1)及C，以PBS6.0/EDTA調製成9.26mg/mL。於本溶液(6.6mL)中添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.254mL；對於抗體一分子為6.0當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0990mL)。確認本溶液的pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃恆溫放置2小時，將抗體內鏈間部之雙硫鍵還原。
抗體與藥物連接物之結合：將上述溶液於15℃恆溫放置10分鐘。其次添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并 [3’,4’：6,7]吲
Figure 107116035-A0202-12-0150-207
并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之10mM二甲基亞碸溶液(0.381mL；相對於抗體一分子為9當量)，於15℃恆溫放置1小時，使藥物連接物結合於抗體。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0381mL；相對於抗體一分子為9當量)，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物的反應停止。
純化：將上述溶液，進行利用製造方法1記載的共通操作D的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物「NOV0712-ADC」的溶液23.5mL。
特性評價：使用製造方法1記載的共通操作E(使用εD,280=5440、εD,370=21240)，獲得下述之特性值。
抗體濃度：2.26mg/mL，抗體收穫量：56.4mg(92%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.4；以共通操作F測定的抗體每一分子之藥物藥物平均結合數(n)：7.8。
[參考例3：H01L02-DM4之製作] 參考例3)-1抗體-藥物結合物之製作H01L02-DM4
抗體-藥物結合物(7)
抗體與藥物連接物之結合：將實施例5所製作的H01L02，使用製造方法1所記載之共通操作B(作為280nm吸光係數，使用1.53mLmg-1cm-1)及C，以20mM HEPES8.1(LIFE TECHNOLOGIES公司製HEPES，1M Buffer Solution(20mL)以1M氫氧化鈉作成pH8.1後，以 蒸餾水作成1L)調製成9.8mg/mL，於20℃恆溫放置10分鐘。其次添加WO2016/024195號公開專利公報記載之10mM 1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)-1-側氧基-4-(吡啶-2-基二氫硫基)丁烷-2-磺酸之DMA溶液(0.062mL；相對於抗體一分子為11.5當量)、10mM N2-脫乙醯基-N2-(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)之DMA溶液(0.082mL；相對於抗體一分子為15.1當量)，於20℃恆溫放置18小時，使藥物連接物結合於抗體。其次，添加1M乙酸水溶液並作成pH5.0，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物的反應停止。
純化：將上述溶液，進行利用製造方法1記載的共通操作D的純化，獲得含有標題抗體-藥物結合物「H01L02-DM4」的溶液3.5mL。
特性評價：使用製造方法1記載的共通操作E(使用εA,280=223400、εA，252=85646、εD,280=4317、及εD，252=23224)，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.97mg/mL，抗體收穫量：6.90mg(88%)，以共通操作E測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.6。
[實施例8：抗體-藥物結合物之活體外活性評價] 8)-1 抗體-藥物結合物對CDH6陽性人類腫瘤細胞株之活體外細胞增殖抑制活性評價
將CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株PA-1於含有10% FBS的MEM培養基中成為2x103細胞/100μL/孔的方式 接種於96孔盤，於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。次日，使終濃度成為0.0001(nM)至100(nM)的方式添加實施例7所製作的人類化hG019-藥物結合物4種(株名為H01L02-DXd、H02L02-DXd、H02L03-DXd及H04L02-DXd)、或參考例2所製作的NOV0712-藥物結合物(NOV0712-DM4)。培養4日後，以藉由CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega)的ATP定量測定生存細胞數。圖11顯示各別添加抗體-藥物結合物時之濃度依賴性的細胞增殖抑制活性。此結果顯示，人類化hG019-藥物結合物4種與NOV0712-藥物結合物比較，自更低添加濃度顯示腫瘤細胞的增殖抑制活性，抗腫瘤活性高。
[實施例9：抗體-藥物結合物之活體內抗腫瘤效果]
抗體-藥物結合物之抗腫瘤效果係使用CDH6陽性人類腫瘤細胞株之細胞移植至免疫不全小鼠的動物模型來評價。實驗使用前，將4-5週齡之BALB/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu]、日本Charles River)及、SCID小鼠(CB17/Icr-Prkdc[scid]/CrlCrlj、日本Charles River)，於SPF條件化馴化3日以上。對小鼠投餌滅菌的固形飼料(FR-2，Funabashi Farms Co.,Ltd)，給予經滅菌的自來水(添加5-15ppm次氯酸鈉溶液而調製)。將移植的腫瘤之長徑及短徑以電子式數位測徑器(CD-15CX，Mitutoyo Corp.)，於1週測量2次，由以下所示的計算式，算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2
抗體-藥物結合物係全部以ABS緩衝液(10mM-Acetate Buffer，5%山梨糖醇，pH5.5)(NACALAI)稀釋，以各實施例所示的用量作尾靜脈內投予。又，同樣地投予ABS緩衝液作為對照組(媒劑組)。於實驗每1組使用6隻小鼠。
9)-1 抗腫瘤效果(1)
於實施例2)-3-1確認CDH6表現，且將CDH6陽性人類腎細胞腫瘤細胞株786-O(ATCC)懸浮於Matrigel(Corning公司)，將5×106個細胞皮下移植至雄SCID小鼠之右側腹部(第0日)，第18日進行隨機分組。於分組實施日，將實施例7所製作的抗體-藥物結合物4種(株名為H01L02-DXd、H02L02-DXd、H02L03-DXd及H04L02-DXd)、或參考例2所製作的NOV0712-DM4，以3mg/kg之用量作尾靜脈內投予。將結果示於圖12。橫軸表示日數，縱軸表示腫瘤體積，誤差範圍係表示SE值。
NOV0712-DM4於本腫瘤模型中並未顯示顯著的抗腫瘤效果。實施例7所作成的抗體-藥物結合物4種被認為任一者皆於投予後腫瘤體積減少，有顯著的腫瘤退縮，且投予後24日之間，腫瘤退縮效果持續(圖12)。
9)-2 抗腫瘤效果(2)
於實施例2)-3-1確認CDH6表現，且將CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株PA-1(ATCC)懸浮於 Matrigel(Corning公司)，將8.5×106個細胞皮下移植至雌裸鼠之右側腹部(第0日)，第11日實施隨機分組。於分組實施日，將實施例7所製作的抗體-藥物結合物H01L02-DXd或參考例2所製作的NOV0712-DM4或NOV0712-DXd以1及3mg/kg的用量作尾靜脈內投予。將結果示於圖13。橫軸表示日數，縱軸表示腫瘤體積，誤差範圍係表示SE值。
NOV0712-DM4係於本腫瘤模型中，1及3mg/kg任一者之用量皆未顯示抗腫瘤效果。另一方面，H01L02-DXd以1及3mg/kg任一者之用量皆投予後腫瘤體積顯著減少，發揮了使腫瘤縮退的效果(圖13)。又，比較了將相同藥物DXd結合(conjugate)於本說明書中取得的H01L02抗體或是NOV0712抗體與的檢體之藥效的結果，H01L02-DXd係1及3mg/kg任一者之用量都比NOV0712-DXd發揮強的抗腫瘤效果。即顯示了，相較於NOV0712抗體，就作為抗腫瘤劑之抗體-藥物結合物的抗體而言，本發明之H01L02抗體為更優異的抗體(圖13)。
9)-3 抗腫瘤效果(3)
以實施例2)-3-1確認CDH6表現且將CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株NIH：OVCAR-3(ATCC)懸浮於Matrigel(Corning公司)，將1×107個細胞皮下移植至雌裸鼠之右側腹部(第0日)，第22日實施隨機分組。於分組實施日，將實施例7所製作的抗體-藥物結合物H01L02-DXd或參考例2所製作的NOV0712-DM4，以1 及3mg/kg之用量作尾靜脈內投予。將結果示於圖14。橫軸表示日數，縱軸表示腫瘤體積，誤差範圍表示SE值。
NOV0712-DM4，係於1mg/kg完全不顯示抗腫瘤效果，而於3mg/kg雖顯示抗腫瘤效果，但被認為自投予2週後有腫瘤之再增殖。另一方面，H01L02-DXd係於1及3mg/kg任一者之用量，皆顯著地抑制投予後腫瘤體積之增加，特別是於3mg/kg，投予後歷經31日的長期間，腫瘤增殖抑制效果持續。(圖14)。
又，使用PA-1細胞，同樣地，評價以參考例2所製作的NOV0712-DM4或參考例3所作成的H01L02-DM4之腫瘤增殖抑制效果。H01L02-DM4，較NOV0712-DM4，腫瘤體積更為縮退，本發明之H01L02抗體，與NOV0712抗體相比，為作為抗腫瘤劑之抗體-藥物結合物的抗體更為優異的抗體。
9)-4 抗腫瘤效果(4)
於實施例2)-3-1確認CDH6表現，並將CDH6陽性人類腎細胞腫瘤細胞株786-O(ATCC)懸浮於Matrigel(Corning公司)，將5×106個細胞皮下移植至雄SCID小鼠之右側腹部(第0日)，第20日實施隨機分組。於分組實施日，將實施例7所製作的抗體-藥物結合物H01L02-DXd或參考例2所製作的NOV0712-DM4，以1及3mg/kg之用量作尾靜脈內投予。將結果示於圖15。橫軸表示日數，縱軸表示腫瘤體積，誤差範圍表示SE 值。
NOV0712-DM4於本腫瘤模型中，於1及3mg/kg任一者之用量皆未顯示顯著的抗腫瘤效果。另一方面，H01L02-DXd係於1及3mg/kg任一者之用量，投予後腫瘤體積皆減少，特別是於3mg/kg被認為有顯著的腫瘤的退縮，投予後20日之間，且腫瘤退縮效果維持續(圖15)。
9)-5 抗腫瘤效果(5)
於實施例2)-3-1確認未表現CDH6，將CDH6陰性人類卵巢腫瘤細胞株ES-2(ATCC)懸浮於生理食鹽水，將1×106個細胞皮下移植至雌裸鼠之右側腹部(第0日)，第7日實施隨機分組。於分組實施日，將實施例7所作成的抗體-藥物結合物H01L02-DXd或參考例2所製作的NOV0712-DM4，以1及3mg/kg之用量作尾靜脈內投予。將結果示於圖16。橫軸表示日數，縱軸表示腫瘤體積，誤差範圍表示SE值。
於不表現CDH6的本腫瘤模型中，H01L02-DXd及NOV0712-DM4係任一者之用量皆完全未顯示抗腫瘤效果。由此結果認為，於實施例9)-1、9)-2、9)-3、9)-4所示的CDH6陽性腫瘤模型之抗體-藥物結合物之抗腫瘤效果，係依賴於腫瘤細胞之CDH6表現而產生的效果，對CDH6陽性之腫瘤顯示特異性抗腫瘤效果，於CDH6陰性之正常組織不會造成細胞障礙之有選擇性且安全的抗腫瘤藥劑(圖16)。
[產業上之可利用性]
藉由本發明，可提供具有內在化活性的抗CDH6抗體及含該抗體的抗體-藥物結合物。該抗體-藥物結合物係可有用於作為對癌的治療藥等。
<110> 第一三共股份有限公司(DAIICHI SANKYO COMPANY,LIMITED)
<120> 抗CDH6抗體及抗CDH6抗體-藥物結合物、以及其製造方法
<130> FP1814
<140> TW 107116035
<141> 2018-05-11
<150> JP2017-096749
<151> 2017-05-15
<160> 86
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 790
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 107116035-A0305-02-0160-3
Figure 107116035-A0305-02-0161-4
Figure 107116035-A0202-12-0160-39
Figure 107116035-A0202-12-0161-40
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure 107116035-A0202-12-0161-41
Figure 107116035-A0202-12-0162-42
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Figure 107116035-A0202-12-0162-43
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Figure 107116035-A0202-12-0163-45
<210> 5
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Figure 107116035-A0202-12-0163-44
Figure 107116035-A0202-12-0164-46
<210> 6
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Figure 107116035-A0202-12-0164-47
<210> 7
<211> 790
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 7
Figure 107116035-A0202-12-0164-48
Figure 107116035-A0202-12-0165-49
Figure 107116035-A0202-12-0166-50
Figure 107116035-A0202-12-0167-51
Figure 107116035-A0202-12-0168-52
<210> 8
<211> 789
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 8
Figure 107116035-A0202-12-0168-53
Figure 107116035-A0202-12-0169-54
Figure 107116035-A0202-12-0170-55
Figure 107116035-A0202-12-0171-56
<210> 9
<211> 790
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 9
Figure 107116035-A0202-12-0172-57
Figure 107116035-A0202-12-0173-58
Figure 107116035-A0202-12-0174-59
Figure 107116035-A0202-12-0175-60
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 10
Figure 107116035-A0202-12-0175-61
<210> 11
<211> 324
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 11
Figure 107116035-A0202-12-0176-68
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 12
Figure 107116035-A0202-12-0176-67
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 13
Figure 107116035-A0202-12-0176-66
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 14
Figure 107116035-A0202-12-0176-63
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 15
Figure 107116035-A0202-12-0176-62
Figure 107116035-A0202-12-0177-69
<210> 16
<211> 366
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 16
Figure 107116035-A0202-12-0177-70
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 17
Figure 107116035-A0202-12-0178-72
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 18
Figure 107116035-A0202-12-0178-73
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 19
Figure 107116035-A0202-12-0178-74
<210> 20
<211> 109
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 20
Figure 107116035-A0202-12-0178-71
<210> 21
<211> 327
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 21
Figure 107116035-A0202-12-0179-75
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 22
Figure 107116035-A0202-12-0179-76
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 23
Figure 107116035-A0202-12-0179-77
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 24
Figure 107116035-A0202-12-0179-78
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 25
Figure 107116035-A0202-12-0180-80
<210> 26
<211> 363
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 26
Figure 107116035-A0202-12-0180-79
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 27
Figure 107116035-A0202-12-0181-81
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 28
Figure 107116035-A0202-12-0181-82
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 29
Figure 107116035-A0202-12-0181-83
<210> 30
<211> 109
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 30
Figure 107116035-A0202-12-0181-84
Figure 107116035-A0202-12-0182-89
<210> 31
<211> 327
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 31
Figure 107116035-A0202-12-0182-88
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 32
Figure 107116035-A0202-12-0182-87
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 33
Figure 107116035-A0202-12-0182-86
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 34
Figure 107116035-A0202-12-0182-85
<210> 35
<211> 121
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 35
Figure 107116035-A0202-12-0183-92
<210> 36
<211> 363
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 36
Figure 107116035-A0202-12-0183-91
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 37
Figure 107116035-A0202-12-0184-97
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 38
Figure 107116035-A0202-12-0184-96
<210> 39
<211> 13
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 39
Figure 107116035-A0202-12-0184-95
<210> 40
<211> 109
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 40
Figure 107116035-A0202-12-0184-93
Figure 107116035-A0202-12-0185-98
<210> 41
<211> 327
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 41
Figure 107116035-A0202-12-0185-99
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 42
Figure 107116035-A0202-12-0185-100
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 43
Figure 107116035-A0202-12-0185-101
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 44
Figure 107116035-A0202-12-0185-102
<210> 45
<211> 121
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 45
Figure 107116035-A0202-12-0186-104
<210> 46
<211> 363
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 46
Figure 107116035-A0202-12-0186-103
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 47
Figure 107116035-A0202-12-0187-105
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 48
Figure 107116035-A0202-12-0187-106
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 溝鼠
<400> 49
Figure 107116035-A0202-12-0187-107
<210> 50
<211> 449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼人類輕鏈訊息序列及kappa鏈恆定區的DNA序列之DNA
<400> 50
Figure 107116035-A0202-12-0187-108
Figure 107116035-A0202-12-0188-110
<210> 51
<211> 1132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含編碼人類重鏈訊息序列及IgG1恆定區的DNA序列之DNA
<400> 51
Figure 107116035-A0202-12-0188-111
<210> 52
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼chG019輕鏈之DNA序列的DNA
<400> 52
Figure 107116035-A0202-12-0189-112
<210> 53
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chG019輕鏈全長之胺基酸序列
<400> 53
Figure 107116035-A0202-12-0189-113
Figure 107116035-A0202-12-0190-114
<210> 54
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chG019輕鏈全長之核苷酸序列
<400> 54
Figure 107116035-A0202-12-0190-115
Figure 107116035-A0202-12-0191-118
<210> 55
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chG019輕鏈可變區之核苷酸序列
<400> 55
Figure 107116035-A0202-12-0191-117
<210> 56
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chG019重鏈全長之胺基酸序列
<400> 56
Figure 107116035-A0202-12-0191-116
Figure 107116035-A0202-12-0192-119
Figure 107116035-A0202-12-0193-120
<210> 57
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chG019重鏈全長之核苷酸序列
<400> 57
Figure 107116035-A0202-12-0193-121
Figure 107116035-A0202-12-0194-123
<210> 58
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chG019重鏈可變區之胺基酸序列
<400> 58
Figure 107116035-A0202-12-0194-122
Figure 107116035-A0202-12-0195-124
<210> 59
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> chG019重鏈可變區之核苷酸序列
<400> 59
Figure 107116035-A0202-12-0195-125
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> chG019 CDRH2之胺基酸序列
<400> 60
Figure 107116035-A0202-12-0196-126
<210> 61
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hL02輕鏈全長之胺基酸序列
<400> 61
Figure 107116035-A0202-12-0196-127
Figure 107116035-A0202-12-0197-128
<210> 62
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hL02輕鏈全長之核苷酸序列
<400> 62
Figure 107116035-A0202-12-0197-129
<210> 63
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hL02輕鏈可變區之胺基酸序列
<400> 63
Figure 107116035-A0202-12-0198-131
<210> 64
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hL02輕鏈可變區之核苷酸序列
<400> 64
Figure 107116035-A0202-12-0198-130
<210> 65
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hL03輕鏈全長之胺基酸序列
<400> 65
Figure 107116035-A0202-12-0199-132
Figure 107116035-A0202-12-0200-133
<210> 66
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hL03輕鏈全長之核苷酸序列
<400> 66
Figure 107116035-A0202-12-0200-134
<210> 67
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hL03輕鏈可變區之胺基酸序列
<400> 67
Figure 107116035-A0202-12-0200-135
Figure 107116035-A0202-12-0201-138
<210> 68
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hL03輕鏈可變區之核苷酸序列
<400> 68
Figure 107116035-A0202-12-0201-137
<210> 69
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hH01重鏈全長之胺基酸序列
<400> 69
Figure 107116035-A0202-12-0201-136
Figure 107116035-A0202-12-0202-139
Figure 107116035-A0202-12-0203-140
<210> 70
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hH01重鏈全長之核苷酸序列
<400> 70
Figure 107116035-A0202-12-0204-141
<210> 71
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hH01重鏈可變區之胺基酸序列
<400> 71
Figure 107116035-A0202-12-0205-142
<210> 72
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hH01重鏈可變區之核苷酸序列
<400> 72
Figure 107116035-A0202-12-0205-143
<210> 73
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hH02重鏈全長之胺基酸序列
<400> 73
Figure 107116035-A0202-12-0206-144
Figure 107116035-A0202-12-0207-145
Figure 107116035-A0202-12-0208-146
<210> 74
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hH02重鏈全長之核苷酸序列
<400> 74
Figure 107116035-A0202-12-0208-147
Figure 107116035-A0202-12-0209-149
<210> 75
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hH02重鏈可變區之胺基酸序列
<400> 75
Figure 107116035-A0202-12-0209-148
<210> 76
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hH02重鏈可變區之核苷酸序列
<400> 76
Figure 107116035-A0202-12-0210-150
<210> 77
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hH04重鏈全長之胺基酸序列
<400> 77
Figure 107116035-A0202-12-0210-151
Figure 107116035-A0202-12-0211-152
Figure 107116035-A0202-12-0212-153
<210> 78
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hH04重鏈全長之核苷酸序列
<400> 78
Figure 107116035-A0202-12-0212-154
Figure 107116035-A0202-12-0213-156
<210> 79
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hH04重鏈可變區之胺基酸序列
<400> 79
Figure 107116035-A0202-12-0213-155
Figure 107116035-A0202-12-0214-157
<210> 80
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hH04重鏈可變區之核苷酸序列
<400> 80
Figure 107116035-A0202-12-0214-158
<210> 81
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NOV0712輕鏈全長之胺基酸序列
<400> 81
Figure 107116035-A0202-12-0214-159
Figure 107116035-A0202-12-0215-160
<210> 82
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼序列識別號81之胺基酸序列的核苷酸序列
<400> 82
Figure 107116035-A0202-12-0216-162
<210> 83
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NOV0712重鏈全長之胺基酸序列
<400> 83
Figure 107116035-A0202-12-0216-161
Figure 107116035-A0202-12-0217-163
Figure 107116035-A0202-12-0218-164
<210> 84
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼序列識別號83之胺基酸序列之核苷酸序列
<400> 84
Figure 107116035-A0202-12-0218-165
Figure 107116035-A0202-12-0219-168
<210> 85
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 85
Figure 107116035-A0202-12-0219-167
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 86
Figure 107116035-A0202-12-0219-166

Claims (64)

  1. 一種抗體或該抗體之機能性片段，其與具有序列識別號4記載之胺基酸序列的CDH6之細胞外域3專一性結合，且具有被併入細胞內的內在化能力，該抗體或該抗體之機能性片段包含選自包含以下之(1)~(5)的群組之CDRL1、CDRL2及CDRL3、以及CDRH1、CDRH2及CDRH3：(1)由序列識別號12記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14記載之胺基酸序列所構成的CDRL3、及由序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號18記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；(2)由序列識別號22記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號23記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號24記載之胺基酸序列所構成的CDRL3、及由序列識別號27記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號28記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號29記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；(3)由序列識別號32記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號33記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號34記載之胺基酸序列所構成的CDRL3、及由序列識別號37記載之胺基酸序列所 構成的CDRH1、由序列識別號38記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號39記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；(4)由序列識別號42記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號43記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號44記載之胺基酸序列所構成的CDRL3、及由序列識別號47記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號48記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號49記載之胺基酸序列所構成的CDRH3；及(5)由序列識別號12記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14記載之胺基酸序列所構成的CDRL3、及由序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號60記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3。
  2. 如請求項1之抗體或該抗體之機能性片段，其對於序列識別號4記載之胺基酸序列的結合，具有與選自包含以下之(1)~(5)的群組之抗體中至少一者的競爭抑制活性：(1)具有由序列識別號53之第21~233號記載之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號56之第20~471號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體；(2)具有由序列識別號61之第21~233號記載之胺 基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體；(3)具有由序列識別號61之第21~233號記載之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體；(4)具有由序列識別號65之第21~233號記載之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體；及(5)具有由序列識別號61之第21~233號記載之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號記載之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體。
  3. 如請求項1或2之抗體或該抗體之機能性片段，其經人類化。
  4. 如請求項1或2之抗體或該抗體之機能性片段，其包含以下之(1)~(4)之任一者之輕鏈可變區及重鏈可變區：(1)由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號71記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；(2)由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號75記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；(3)由序列識別號67記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號75記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區；或 (4)由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號79記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
  5. 如請求項1或2之抗體或該抗體之機能性片段，其具有以下之(1)~(4)之任一者：(1)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；(2)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；(3)由序列識別號65之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；或(4)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈。
  6. 如請求項5之抗體或該抗體之機能性片段，其具有由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈。
  7. 如請求項5之抗體或該抗體之機能性片段，其具有由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈。
  8. 如請求項5之抗體或該抗體之機能性片段，其具有由序列識別號65之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈。
  9. 如請求項5之抗體或該抗體之機能性片段，其具有由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈。
  10. 如請求項1或2之抗體或該抗體之機能性片段，其中機能性片段選自包含Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv的群組。
  11. 一種多核苷酸，其係編碼如請求項1至10中任一項之抗體或該抗體之機能性片段的多核苷酸。
  12. 如請求項11之多核苷酸，其包含選自包含以下之(1)~(5)的群組之任一者記載之多核苷酸：(1)編碼包含由序列識別號12記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編碼包含由序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號18記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸；(2)編碼包含由序列識別號22記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號23記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號24記載之胺基酸 序列所構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編碼包含由序列識別號27記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號28記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號29記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸；(3)編碼包含由序列識別號32記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號33記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號34記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編碼包含由序列識別號37記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號38記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號39記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸；(4)編碼包含由序列識別號42記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號43記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號44記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編碼包含由序列識別號47記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號48記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號49記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸；以及(5)編碼包含由序列識別號12記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列所構成的CDRL2及由序列識別號14記載之胺基酸序列所構成的CDRL3的輕鏈可變區的多核苷酸；及編 碼包含由序列識別號17記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號60記載之胺基酸序列所構成的CDRH2及由序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH3的重鏈可變區的多核苷酸。
  13. 如請求項11或12之多核苷酸，其包含編碼由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈的多核苷酸及編碼由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的多核苷酸。
  14. 如請求項11或12之多核苷酸，其包含編碼由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈的多核苷酸及編碼由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的多核苷酸。
  15. 如請求項11或12之多核苷酸，其包含編碼由序列識別號65之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈的多核苷酸及編碼由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的多核苷酸。
  16. 如請求項11或12之多核苷酸，其包含編碼由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈的多核苷酸及編碼由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的多核苷酸。
  17. 一種表現載體，其含有如請求項11至16中任一項之多核苷酸。
  18. 一種宿主細胞，其係藉由如請求項17之表現載體而被轉形。
  19. 如請求項18之宿主細胞，其中宿主細胞為真核細胞。
  20. 一種抗體或該抗體之機能性片段之製造方法，其特徵為包含培養如請求項18或19之宿主細胞的步驟、及自於該步驟所獲得的培養物採取目的之抗體或該抗體之機能性片段的步驟。
  21. 如請求項1或2之抗體或該抗體之機能性片段，其係重鏈或輕鏈受到選自包含以下的群組之1或2個以上之修飾：對N-鍵結的糖鏈加成、對O-鍵結的糖鏈加成、N末端的加工處理、C末端的加工處理、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化、於N末端的甲硫胺酸殘基的加成、脯胺酸殘基之醯胺化、N末端麩醯胺酸或N末端麩胺酸之焦麩胺酸化、及羧基末端中的1個或2個胺基酸缺失。
  22. 如請求項21之抗體或該抗體之機能性片段，其係於重鏈之羧基末端有1個或2個胺基酸缺失。
  23. 如請求項22之抗體或該抗體之機能性片段，其係於2條重鏈的雙方，於羧基末端有1個胺基酸缺失。
  24. 如請求項22之抗體或該抗體之機能性片段，其係重鏈之羧基末端的脯胺酸殘基進一步被醯胺化。
  25. 如請求項1或2之抗體或該抗體之機能性片段，其係藉由調節糖鏈修飾而使抗體依賴性細胞傷害活性增強。
  26. 一種抗體-藥物結合物，其係藥物結合於如選自包含請求項1至10及請求項21至25的群組之任一項之抗體或該抗體之機能性片段。
  27. 如請求項26之抗體-藥物結合物，其中藥物為抗腫瘤 性化合物。
  28. 如請求項27之抗體-藥物結合物，其中抗腫瘤性化合物為下式所示的抗腫瘤性化合物：
    Figure 107116035-A0305-02-0230-5
  29. 如請求項26至28中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體及藥物係介隔選自包含下式(a)~(f)的群組之任一者的結構的連接物而結合：(a)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；(b)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；(c)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；(d)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；(e)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；及(f)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；(其中，抗體係結合於-(琥珀醯亞胺-3-基-N)之末 端；抗腫瘤性化合物係將1位之胺基之氮原子作為結合部位，而與(a)、(b)、(e)或(f)之-CH2CH2CH2-C(=O)-部分、(c)之CH2-O-CH2-C(=O)-部分或(d)之CH2CH2-O-CH2-C(=O)-部分的羰基結合；上述式中GGFG係表示以由甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸所構成之肽鍵而連結的胺基酸序列；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-為下式所示的結構：
    Figure 107116035-A0305-02-0231-6
     在其之3位與抗體結合，且在1位之氮原子上與包含其之連接物結構內的亞甲基結合)。
  30. 如請求項29之抗體-藥物結合物，其中連接物係以選自包含以下之(c)、(d)及(e)的群組之任一者之式表示：(c)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；(d)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；(e)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
  31. 如請求項29之抗體-藥物結合物，其中連接物係以以下之(c)或(e)之式表示：(c)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-； (e)-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
  32. 如請求項26至28中任一項之抗體-藥物結合物，其具有以下之式所表示的結構：
    Figure 107116035-A0305-02-0232-7
     其中，AB表示抗體或該抗體之機能性片段；n表示與抗體結合的藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數；抗體與連接物係介隔源自抗體的硫氫基而結合。
  33. 如請求項26至28中任一項之抗體-藥物結合物，其具有以下之式所表示的結構：
    Figure 107116035-A0305-02-0232-8
     其中，AB表示抗體或該抗體之機能性片段；n表示與抗體結合的藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數；抗體與連接物係介隔源自抗體的硫氫基而結合。
  34. 如請求項26至28中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體為包含選自包含以下之(1)~(4)的群組之任一者記載之輕鏈及重鏈的抗體或該抗體之機能性片段：(1)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；(2)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；(3)由序列識別號65之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號73之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈；或(4)由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈。
  35. 如請求項34之抗體-藥物結合物，其中抗體為包含由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號69之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體或該抗體之機能性片段。
  36. 如請求項34之抗體-藥物結合物，其中抗體為包含由序列識別號61之第21~233號之胺基酸序列所構成的輕鏈及由序列識別號77之第20~471號之胺基酸序列所構成的重鏈的抗體或該抗體之機能性片段。
  37. 如請求項26至28中任一項之抗體-藥物結合物，其係重鏈或輕鏈受到選自包含下列的群組之1或2以上 之修飾：對N-鍵結的糖鏈加成、對O-鍵結的糖鏈加成、N末端的加工處理、C末端的加工處理、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化、於N末端的甲硫胺酸殘基的加成、脯胺酸殘基之醯胺化、N末端麩醯胺酸或N末端麩胺酸之焦麩胺酸化及羧基末端中的1個或2個胺基酸缺失。
  38. 如請求項29之抗體-藥物結合物，其係經選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為1~10個之範圍。
  39. 如請求項38之抗體-藥物結合物，其係經選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為2~8個之範圍。
  40. 如請求項39之抗體-藥物結合物，其係經選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為5~8個之範圍。
  41. 如請求項40之抗體-藥物結合物，其係經選擇的1種之藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為7~8個。
  42. 一種醫藥組成物，其特徵為包含如請求項26至41中任一項之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。
  43. 如請求項42之醫藥組成物，其為抗腫瘤藥。
  44. 如請求項43之醫藥組成物，其中腫瘤為表現CDH6的腫瘤。
  45. 如請求項43或44之醫藥組成物，其中腫瘤為腎細胞癌、腎臟透明細胞癌(clear cell carcinoma of kidney)、 乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌(ovarian serous adenocarcinoma)、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌、小細胞肺癌、神經膠母細胞瘤、間皮瘤(mesothelioma)、子宮癌、胰臓癌、威爾姆氏瘤(Wilms' tumor)或神經胚細胞瘤(neuroblastoma)。
  46. 一種抗體-藥物結合物之製造方法，其特徵為包含使如選自包含請求項1至10及請求項21至25的群組之任一項之抗體或該抗體之機能性片段或是以如請求項20之製造方法所獲得的抗體或該抗體之機能性片段、與藥物-連接物中間化合物進行反應的步驟。
  47. 一種抗體-藥物結合物，其具有以下之式所表示的結構：
    Figure 107116035-A0305-02-0235-9
     其中，AB表示包含由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號71記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區之抗體；n表示與抗體結合的藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數，且該藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為1~10個之範圍。
  48. 如請求項47之抗體-藥物結合物，其藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為2~8個之範圍。
  49. 如請求項48之抗體-藥物結合物，其藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為5~8個之範圍。
  50. 如請求項49之抗體-藥物結合物，其藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為7~8個。
  51. 一種醫藥組成物，其特徵為包含如請求項47至50中任一項之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。
  52. 如請求項51之醫藥組成物，其為抗腫瘤藥。
  53. 一種抗體-藥物結合物，其具有以下之式所表示的結構：
    Figure 107116035-A0305-02-0236-11
     其中，AB表示包含由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號75記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區之抗體；n表示與抗體結合的藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數，且該藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為1~10個之範圍。
  54. 如請求項53之抗體-藥物結合物，其藥物-連接物結構 之每1抗體的平均結合數為2~8個之範圍。
  55. 如請求項54之抗體-藥物結合物，其藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為5~8個之範圍。
  56. 如請求項55之抗體-藥物結合物，其藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為7~8個。
  57. 一種醫藥組成物，其特徵為包含如請求項53至56中任一項之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。
  58. 如請求項57之醫藥組成物，其為抗腫瘤藥。
  59. 一種抗體-藥物結合物，其具有以下之式所表示的結構：
    Figure 107116035-A0305-02-0237-12
     其中，AB表示包含由序列識別號63記載之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區及由序列識別號79記載之胺基酸序列所構成的重鏈可變區之抗體；n表示與抗體結合的藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數，且該藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為1~10個之範圍。
  60. 如請求項59之抗體-藥物結合物，其藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為2~8個之範圍。
  61. 如請求項60之抗體-藥物結合物，其藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為5~8個之範圍。
  62. 如請求項61之抗體-藥物結合物，其藥物-連接物結構之每1抗體的平均結合數為7~8個。
  63. 一種醫藥組成物，其特徵為包含如請求項59至62中任一項之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。
  64. 如請求項63之醫藥組成物，其為抗腫瘤藥。
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