KR20020013515A - Ｌ-리보-ｌｎａ 유사체 - Google Patents

Abstract

LNA 뉴클레오사이드를 제공하기 위하여 2'-4'-브릿지가 뉴클레오사이드의 구조를 고정시킨 뉴클레오사이드 유사체를 L-리보-배위의 C-3' 및 C-4'에서 반전된 입체화학상을 갖도록 합성하였다. L-리보-LNA 뉴클레오사이드의 합성을 티민, 아데닌, 사이토신 및 우라실을 포함하는 뉴클레오염기에 적용시킬 수 있다. L-리보-LNA 배위를 갖는 록 핵산(LNAs)을 2'-O-4'-C-메틸렌-αL-리보푸라노실 뉴클레오타이드 및 그에 포함되는 L-리보-LNA 뉴클레오사이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드에서 사용되었다. 상보적인 핵산에 대한 높은 친화성에 의하여 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 상보적인 핵산의 표적 방법은 현저하게 증가한다.

Description

Ｌ-리보-ＬＮＡ 유사체{Ｌ-Ribo-ＬＮＡ analogues}

합성 올리고뉴클레오타이드는 분자 생물학 및 DNA-기초한 진단제 및 치료제와 같은 이종의 분야에서 널리 사용되는 화합물이다.

일반적 고려사항

상기 올리고뉴클레오타이드로 요약되는 넓은 범위의 다른 적용들에서의 유용하기 위해서는 많은 다른 필요성을 만족해야 한다. 치료제에서는, 예를 들면, 유용한 올리고뉴클레오타이드는 세포막을 통과할 수 있어야만 하고, 세포외 및 세포내의 뉴클레아제에 우수한 저항성을 가져야 하며, 바람직하게는 RNAseH와 같은 내생성 효소를 강화할 수 있는 능력을 가져야 한다. DNA-기초한 진단제 및 분자생물학에서는, 예를 들면, 폴리머라아제, 키나아제, 리가아제 및 포스파타아제와 같은 천연 핵산에 작용을 일으키는 넓은 범위의 여러 효소를 위한 유용한 기질로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드의 능력과 같은 다른 특성이 중요하다. 그러나, 모든 사용에 기초가 되는 올리고뉴클레오타이드의 기초적 특성은 와슨-크릭의 수소 결합(A-T 및 G-C) 또는 호그스틴(Hoogsteen)의 방법과 같은 다른 수소 결합의 구조를 사용하여 상보적인 싱글 스트랜드의 핵산에 특이적인 서열을 인식하거나 혼성화 하는 능력이다. 2개의 중요한 용어인 친화성(affinity) 및 특이성(specificity)은 주어진 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 특성을 특징지우는데 일반적으로 사용된다. 친화성은 상보적인 표적 서열에 상기 올리고뉴클레오타이드의 결합 강도의 크기이다(이중나선의 열안정성(thermostabiliy: Tm)으로 나타난다). 이중나선내의 각각의 뉴클레오염기 쌍은 열안정성을 증가시키고, 이와 같이 친화성은 증가하는 올리고뉴클레오타이드의 크기(뉴클레오염기의 수)와 함께 증가한다. 특이성은 올리고뉴클레오타이드가 완전히 상보적인 서열과 불일치하는 표적 서열사이를 구별할 수 있는 능력의 크기이다. 환언하면, 특이성은 표적내의 불일치하는 뉴클레오염기 쌍과 관련된 친화성의 상실의 크기이다.

일정한 올리고뉴클레오타이드 크기에서, 특이성은 올리고뉴클레오타이드와 그의 표적사이의 증가하는 불일치의 수와 함께 증가한다(즉, 불일치 퍼센트의 증가). 반대로 말하면, 일정한 불일치 수에서 올리고뉴클레오타이드의 크기가 증가하면, 특이성은 감소한다(즉, 불일치 퍼센트의 감소). 다른 방법으로 말하자면, 올리고뉴클레오타이드의 친화성의 증가는 특이성의 손실을 발생시키고, 반대의 경우도 마찬가지이다.

천연의 올리고뉴클레오타이드의 결점을 고려하여, DNA-기초한 치료제, 진단제 및 일반적인 분자생물학의 기술에 매우 바람직한 특이성 및 친화성을 증진시키기 위한 새로운 접근이 시도되고 있다.

구조적으로 제한된 뉴클레오타이드

올리고뉴클레오타이드는 표적 서열에 혼성화 할 때, 싱글 스트랜드 상태의 상대적으로 랜덤 코일 구조에서 이중나선(duplex) 상태의 정돈된 구조까지의 구조적 변이를 하는 것으로 알려져 있다.

이와 같이, 구조적 제한은 최근 비변형의 (2'-데옥시)올리고뉴클레오타이드와 비교하여 증가된 혼성화 성질을 나타내는 유사체의 조사에서 올리고뉴클레오타이드에 적용되었다. 예를 들면, 부가적 C-3', C-5'-에타노-브리지를 갖는 바이사이클로[3.3.0]뉴클레오사이드(M. Tarkoey, M. Bolli, B. Schweizer and C. Leumann,Helv. Chem. Acta, 1993,76, 481; Tarkoey, and C. Leumann,Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1993,32, 1432; M. Egli, P. Lubini, M. Dobler and C. Leumann,J. Am. Chem. Soc., 1993,115, 5855; M. Tarkoey, M. Bolli and C. Leumann,Helv. Chem. Acta, 1994,77, 716; M. Bolli and C. Leumann,Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1995,34, 694; M. Bolli, P. Lubini and C. Leumann,Helv. Chem. Acta, 1995,78, 2077; J. C. Litten, C. Epple and C. Leumann,Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995,5, 1231; J. C. Litten and C. Leumann,Helv. Chem. Acta, 1996,79, 1129; M. Bolli, J. C. Litten, R. Schueltz and C. Leumann,Chem. Biol., 1996,3, 197; M. Bolli, H. U. Trafelet and C. Leumann,Nucleic Acids Res.,1996,24, 4660), 부가적 C-1', C-6'- 또는 C-6', C-4'-메타노-브리지를 갖는 바이사이클로[3.1.0]뉴클레오사이드(K.-H. Altmann, R. Kesselring, E. Francotte and G. Rihs,Tetrahedron Lett., 1994,35, 2331; K.-H. Altmann, R. Imwinkelried, R. Kesselring and G. Rihs,Tetrahedron Lett., 1994,35, 7625; V. E. Marquez, M. A. Siddiqui, A. Ezzitouni, P. Russ, J. Wang, R. W. Wagner and M. D. Matteucci,J. Med. Chem, 1996,39, 3739; A. Ezzitouni and V. E. Marquez, J.Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 1073), 부가적 링은 뉴클레오사이드간의 결합의 일부가 천연의 포스포디에스테르 결합으로 치환된, 비변형의 뉴클레오사이드를 갖는 디머로서 합성된 부가적 C-2', C-3'-디옥살란 링을 포함하는 바이사이클로[3.3.0]- 및 [4.3.0]뉴클레오사이드(R. J. Jones, S. Swaminathan, J. F. Millagan, S. Wadwani, B. S. Froehler and M. Matteucci,J. Am. Chem. Soc., 1993,115, 9816; J. Wang and M. D. Matteucci,Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997,7, 229), 아마이드- 및 설폰아마이드-형태의 뉴클레오사이드간의 결합의 일부로서 C-2', C-3'-메타노 브리지를 갖는 바이사이클로[3.1.0]뉴클레오사이드를 포함하는 디머((C. G. Yannopoulus, W. Q. Zhou, P. Nower, D. Peoch, Y. S. Sanghvi and G. Just,Synlett, 1997, 378), 포름아세탈 뉴클레오사이드간의 결합을 통해 트라이머의 중간에 삽입된 바이사이클로[3.3.0]글루코스-유도된 뉴클레오사이드 유사체((C. G. Yannopoulus, W. Q. Zhou, P. Nower, D. Peoch, Y. S. Sanghvi and G. Just,Synlett, 1997, 378), 부가적 C-2', C-3'-연결된 6원 또는 5원환을 갖는 바이사이클로[4.3.0]- 및 [3.3.0]뉴클레오사이드((P. Nielsen, H. M. Pfundheller, J.Wengel,Chem. Commun.,1997, 826; P. Nielsen, H. M. Pfundheller, J. Wengel, XII International Roundtable: Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications; La Jolla, California, September 15-19, 1996; Poster PPI 43)가 합성되었고, 올리고뉴클레오타이드내로 삽입되었다. 불행하게도, 대부분의 경우에 상기 유사체 형태를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 비변형의 올리고뉴클레오타이드에 비해서 상보적인 핵산을 갖는 이중나선으로 안정하지 못하다. 이 경우, 이중나선 안정성의 적당한 개선이 관찰될 때, 이것은 오직 DNA 또는 RNA의 표적에 관련되거나, 또는 부분적이 아닌 완전히 변형된 올리고뉴클레오타이드에 관련되고, 그 역도 그러하다.

보고된 대부분의 유사체들의 평가는 G, A 및 C 뉴클레오염기를 갖는 유사체에 대한 데이타의 부족 및 특이성과 혼성화의 방법을 나타내는 데이타의 부족에 의해 더 복잡하게 된다. 다른 경우에서 완전히 변형된 올리고뉴클레오타이드의 합성은 널리 사용되는 표준 포스포라미디트(phosphoramidite) 화학과 양립할 수 없는 반면, 대부분의 경우에서 보고된 모노머 유사체의 합성은 매우 복잡하다.

최근에는 록 핵산(Locked Nucleic Acid: LNA)을 포함하는 올리고머가 보고되었다((Nielsen, P., Pfundheller, H. M., Olsen, C. E. and Wengel, J.,J. Chem. Soc., Perkin Trans.1,1997, 3423; Nielsen, P., Pfundheller, H. M., Wengel,J., Chem. Commun.,1997,9, 825; Christensen, N. K., Petersen, M., Nielsen, P., Jacobsen, J. P. and Wengel, J.,J. Am. Chem. Soc.,1998,120,5458; Koshkin, A. A. and Wengel, J.,J. Org. Chem.,1998,63, 2778; Obika, S.,Morio, K.-1., Hari, Y. and Imanishi, T.,Bioorg. Med. Chem. Lett.,1999, 515). 흥미롭게도, 2'-O,4'-C-메틸렌 브리지를 포함하는 LNA 모노머의 올리고뉴클레오타이드 서열내의 삽입은 변형된 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 능력의 예기치 못한 증가를 유발한다((Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Olsen, C. E. and Wengel,J., Chem. Commun.,1998, 455; Koshkin, A. K., Singh, S. K., Nielsen, P., Rajwanshi, V. K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C. E., and Wengel,J., Tetrahedron,1998, 54, 3607; Koshkin, A. A. Rajwanshi, V. K., and Wengel, J.,Tetrahedron Lett.,1998,39, 4381; Singh, Sanjay K. and Wengel,J., Chem. Commun.,1998, 1247; Kumar, R., Singh, S. K., Koshkin, A. A., Rajwanshi, V. K., Meldgaard, M., and Wengel,J., Bioorg. Med. Chem. Lett.,1998 , 8, 2219; Obika, S. et al.Tetrahedron Lett., 1997, 38, 8735; Obika, S. et al.Tetrahedron Lett.,1998, 39, 5401; Singh, S. K., Kumar, R., and Wengel, J.,J. Org. Chem.,1998,63,6078; Koshkin, A. A., Nielsen, P., Meldgaard, M., Rajwanski, V. K., Singh, S. K., and Wengel, J.,J. Am. Chem. Soc.,1998,120, 13252; Singh, S. K., Kumar, R., and wengel, J.,J. Org Chem.,1998,63, 10035). 이같은 LNA 모노머 및 상응하는 2'-티오-LNA 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 DNA 및 RNA와 함께, 변형된 올리고뉴클레오타이드인 바이 또는 트라이사이클릭 뉴클레오사이드에서 이미 관찰되지 않은 열 안정성(△Tm/변형 = +3~+11℃)을 갖는 이중나선을 형성하고, 개선된 선택성을 나타낸다.

일련의 논문에서, Seela 등은 하나 이상의 2'-데옥시-β-D-L-리보푸라노실 뉴클레오타이드 모노머를 포함하는 L-리보-DNA(도 1, 염기 = 아데닌-9-일, 사이토신-1-일, 구아닌-9-일 또는 티민-1-일)를 연구하였다((Rosemeyer, H.; Seela, F.Helv. Chem. Acta 1991,74,748; Rosemeyer, H.; Krecmerova, M.; Seela, F.Helv. Chem. Acta 1991,74, 2054; Seela, F.; Woerner, Rosemeyer, H.Helv. Chem. Acta 1994, 77, 883; Seela, F.; Heckel, M.; Rosemeyer, H.Helv. Chem. Acta 1996,79, 1451; Rosemeyer, H.; Seela, F. NucleosidesNucleotides,1995,14, 1041; Schoeppe, A.; Hinz, H.-J.; Rosemeyer, H.; Seela, F.Eur, J. Biochem.1996,239, 33). 상응하는 천연의 2'-데옥시-β-D-리보푸라노실 올리고뉴클레오타이드와 비교해서, L-리보-DNA는 일반적으로 거울상과 같은 2급 구조, 엔트로피적으로 바람직한 이중나선의 형태, 엑소뉴클레아제에 대해 증가된 안정성을 나타내고, 2'-데옥시-β-D-L-리보푸라노실 모노머의 적은 수를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 대해서는 상보적 DNA에 대한 감소된 열적 친화성을 나타낸다 (Rosemeyer, H.; Seela, F.Helv. Chem. Acta 1991,74, 748; Rosemeyer, H.; Krecmerova, M.; Seela, F.Helv. Chem. Acta 1991,74, 2054; Seela, F.; Woerner, Rosemeyer,H. Helv. Chem. Acta 1994,77, 883; Seela, F.; Heckel, M.; Rosemeyer,H. Helv. Chem. Acta 1996,79, 1451).

발명의 요약

상기한 것과 2'-O,4'-C-메틸렌 브리지된 LNA 모노머의 현저한 특성에 기초하여, LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 처음의 입체이성질체로서 하나 이상의 2'-O,4'-C-메틸렌-α-L-리보푸라노실 뉴클레오타이드 모노머(들)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하기로 하였다. α-L-리보-LNA 모노머성에 대한 컴퓨터 모델링결과 S-형 배위의 푸라노스 구조 나타낸다. 따라서, 본 발명의 목적은 2'-O,4'-C-메틸렌-α-L-리보푸라노실 뉴클레오타이드 모노머를 합성 및 이 모노머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 열적 안정성의 연구를 목표로 하였다. 그 결과 완전히 변형된 L-리보-LNA는 상보적인 핵산에 대한 고-친화성 표적화에 유용함을 나타내었다. C-3' 및 C-4'위치의 반전된(inverted) 입체화학을 고려할 때 놀라운 사실이 있었다.

따라서, 본 발명자들은 신규한 LNA 뉴클레오사이드 유사체(L-리보-LNAs) 및 L-리보-LNA 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공하였다. 상기 신규한 L-리보-LNA 뉴클레오사이드 유사체를 뉴클레오염기로서 티민을 사용하여 합성하였고, 올리고뉴클레오타이드내로의 삽입을 위한 뉴클레오사이드 유사체의 전체 조합을 제공하기 위한 다른 4개의 뉴클레오염기를 쉽게 합성할 수 있었다.

본 발명은 적어도 하나의 하기 일반식 I의 뉴클레오사이드의 유사체(이하, "L-리보-LNA"라 한다) 및 그의 염기 염 및 산 부가 염을 포함하는 올리고머에 관한 것이다:

상기 식에서, X는 -O-, -S-, -N(R^N*)-, -C(R⁶R^6*)-에서 선택되고;

B는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-4-알콕시, 임의로 치환된 C_1-4-알킬, 임의로 치환된 C_1-4-아실옥시, 뉴클레오염기, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되며;

P는 임의로 치환체 R⁵또는 동일하게 적용할 수 있는 치환체 R^5*를 포함하는 후행의 모노머에 대한 뉴클레오사이드간의 결합을 위한 라디칼 위치 또는 5'-말단 그룹을 나타내고;

P^*은 선행하는 모노머에 대한 뉴클레오사이드간의 결합 또는 3'-말단 그룹을 나타내며;

R^2*와 R^4*는 -C(R^aR^b)-, C(R^a)=C(R^a)-, -C(R^a)=N-, -O-, Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- 및 >C=Z로부터 선택되는 1∼4개의 그룹/원자로 구성된 바이라디칼을 나타내고(여기서, Z는 -O-, -S- 및 -N(R^a)-에서 선택되고, R^a와 R^b각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-12-알킬, 임의로 치환된 C_2-12-알케닐, 임의로 치환된 C_2-12-알키닐, 하이드록시, C_1-12-알콕시, C_2-12-알케닐옥시, 카복시, C_1-12-알콕시카보닐, C_1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디((C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, C_1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C_1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되며, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2개의 제미날(geminal) 치환체 R^a와 R^b는 함께 임의로 치환된 메틸렌 올레핀(=CH₂)을 나타낼 수 있다);

존재하는, 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶, 및 R^6*각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-12-알킬, 임의로 치환된 C_2-12-알케닐, 임의로 치환된 C_2-12-알키닐, 하이드록시, C_1-12-알콕시, C_2-12-알케닐옥시, 카복시, C_1-12-알콕시카보닐, C_1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디((C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, C_1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C_1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되며, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2개의 제미날 치환체는 함께 옥소, 티옥소, 이미노 또는 임의로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있거나 함께 -O-, -S- 및 -(NR^N)-로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자/그룹이 임의로 중간 및/또는 끝에 존재하는 1∼5개의 탄소원자 알킬렌 쇄로 구성된 스피로 바이라디칼을 형성할 수 있고(여기서, R^N은 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고 2개의 인접 (비-제미날) 치환체는 2중결합을 형성하는 부가적인 결합을 나타낼 수 있다); 존재하는 R^N*은 수소와 C_1-4-알킬에서 선택된다.

본 발명은 또한 하기 일반식 II의 뉴클레오사이드 유사체 (L-리보-LNA) 및 그의 염기 염 및 산 부가 염에 관한 것이다:

상기 식에서, 치환체 B는 뉴클레오염기, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되며;

X는 -O-, -S-, -N(R^N*)- 및 -C(R⁶R^6*)-에서 선택되고;

Q와 Q^*의 각각은 독립적으로 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, Prot-O-, Act-O-, 머캅토, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-알킬티오, 아미노, Prot-N(R^H)-, Act-N(R^H)-, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹, 리간드, 카복시, 설포노, 하이드록시메틸, Prot-O-CH₂-, Act-O-CH₂-, 아미노메틸, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂-, 카복시메틸, 설포노메틸(여기서, Prot는 각각 -OH, -SH 및 -NH(R^H)에 대한 보호 그룹이며, Act는 각각 -OH, -SH 및 -NH(R^H)에 대한 활성 그룹이고, R^H는 수소와 C_1-6-알킬로부터 선택됨)에서 선택되며;

R^2*와 R^4*는 함께 -O-, -(CR^*R^*)_r+s+1-, -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-, -O-(CR^*R^*)_r+s-O-, -S-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -S-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S-, 및 -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-로부터 선택되는 바이라디칼을 나타내고;

여기서, 각각의 R^*은 독립적으로 수소, 할로겐, 아지도, 시아노, 니트로, 하이드록시, 머캅토, 아미노, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로 부터 선택되고/거나 2개의 인접 (비-제미날) R^*은 함께 이중결합을 나타낼 수 있고, 각각의 r 및 s는 0∼3이고, 단 r+s의 합계는 1∼4이며;

존재하는 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶, 및 R^6*각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-12-알킬, 임의로 치환된 C_2-12-알케닐, 임의로 치환된 C_2-12-알키닐, 하이드록시, C_1-12-알콕시, C_2-12-알케닐옥시, 카복시, C_1-12-알콕시카보닐, C_1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디((C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, C_1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C_1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되며, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2개의 제미날 치환체는 함께 옥소, 티옥소, 이미노 또는 임의로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있거나 함께 -O-, -S- 및 -(NR^N)-로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자/그룹이 임의로 중간 및/또는 끝에 존재하는 1∼5개의 탄소원자 알킬렌 쇄로 구성된 스피로 바이라디칼을 형성할 수 있고(여기서, R^N은 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고, 2개의 인접 (비-제미날) 치환체는 2중결합을 형성하는 부가적인 결합을 나타낼 수 있음); 존재하지만 바이라디칼에는 포함되지 않는 R^N*은 수소와 C_1-4-알킬에서 선택되고;

단 올리고뉴클레오타이드 합성에서 지배적인 조건하에서 반응성인 어느 화학적 그룹(어느 뉴클레오염기를 포함)은 임의로 기능성 그룹으로 보호된다.

본 발명은 또한 올리고머의 제조를 위한 뉴클레오사이드 유사체 (L-리보-LNA)의 사용 및 진단제, 분자생물학 연구 및 치료를 위한 뉴클레오사이드 유사체 (L-리보-LNA)뿐만 아니라 올리고머의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 L-리보-배위의 바이사이클릭(bicyclic) 뉴클레오타이드 유사체의 분야 및 상보적인 싱글 스트랜드 및 더블 스트랜드의 핵산과 함께 뉴클레오염기 특이적 이중나선을 형성할 수 있는 합성 올리고뉴클레오타이드의 형성에 유용한 상기 뉴클레오타이드 유사체의 합성에 관한 것이다. 본 발명은 또한 진단제로서 사용할 수 있고, 올리고뉴클레오타이드내로 삽입될 수 있는 L-리보-배위의 바이사이클릭 뉴클레오타이드 유사체의 분야에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "L-리보-LNA"(L-리보-배위의 고정된 뉴클레오사이드 유사체(L-리보-configuratedLockedNucleosideAnalogue))는 본 발명의 올리고머내로 삽입되는 L-리보-구조의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 유사체(일반식 I) 또는 별개의 화학적 종류(일반식 II)를 언급한다. 용어 "모노머 L-리보-LNA"는후자의 경우를 언급한다.

올리고머와 뉴클레오사이드 유사체

상기와 같이 본 발명은 하나 이상의 L-리보-구조의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 신규한 올리고머(올리고뉴클레오타이드)에 관한 것이다. L-리보-구조의 바이사이클릭 뉴클레오사이드 유사체는 이하 "L-리보-LNA"라 칭한다.

올리고머(올리고뉴클레오타이드)내에 삽입된 각각의 가능한 L-리보-LNA는 일반식 I을 갖는다:

상기 식에서, X는 -O-(L-리보푸라노스 구조), -S-, -N(R^N*)-, -C(R⁶R^6*)-에서 선택되고. 여기서, R⁶, R^6*및 R^N*은 하기에 정의한 것과 같다. 이와 같이, 올리고머내로 삽입된 L-리보-LNA는 바이사이클릭 구조의 중요한 부분으로서 5원환을 포함한다.

가능한 5원환중에서, X가 -O-, -S- 및 -N(R^N*)-를 나타내는 것이 매우 흥미가 있고, X가 -O-인 것이 특히 흥미가 있다.

치환체 B는 올리고머가 DNA 또는 RNA와 혼성될 때, DNA 또는 RNA, 특히 DNA 또는 RNA의 뉴클레오염기와 작용(예, 수소결합 또는 공유 결합 또는 전자결합)할수 있는 그룹을 나타낼 수 있다. 또한, 치환체 B는 표지 또는 리포터로 작용하는 그룹을 나타낼 수 있거나 또는 치환체 B는 DNA 또는 RNA와 거의 작용하지 않거나, 작용하지 않게 기대되는 그룹(예, 수소)을 나타낼 수 있다. 이와 같이, 치환체 B는 바람직하게는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-4-알콕시, 임의로 치환된 C_1-4-알킬, 임의로 치환된 C_1-4-아실옥시, 뉴클레오염기, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "뉴클레오염기"는 비-천연 발생의 뉴클레오염기뿐만 아니라 천연 발생의 뉴클레오염기를 포괄한다. 이전에는 "비천연 발생"의 것으로 여겨져왔던 다양한 뉴클레오염기가 이후 천연계에서 계속적으로 발견되었다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 이와 같이, "뉴클레오염기"는 알려진 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클뿐만 아니라, 헤테로사이클 유사체 및 이것의 토토머도 포함된다. 뉴클레오염기의 구체적 예들로는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신, 우라실, 퓨린, 크산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N⁶-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N⁴,N⁴-에타노사이토신, N⁶,N⁶-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸사이토신, 5-(C³-C⁶)-알키닐사이토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소사이토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소사이토신, 이소구아닌, 이노신 및 Benner 등, 미국특허 제5,432,272호에 기술된 "비천연 발생"의 뉴클레오염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오염기"는 유사체 및 이것의 토토머뿐만 아니라 상기 예들의 전부를포함하게 의도된다. 특히 흥미로운 뉴클레오염기는 인간의 치료상 및 진단상의 적용에 관련된 천연 발생의 뉴클레오염기로서 간주되는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신 및 우라실이다.

본 명세서에서, 용어 "DNA 삽입제(intercalator)"는 DNA 또는 RNA 나선, 이중나선, 삼중나선내로 삽입될 수 있는 그룹을 의미한다. DNA 삽입제의 기능적 일부의 예는 아크리딘, 안트라센, 안트라퀴논과 같은 퀴논, 인돌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 디하이드로퀴논, 안트라사이클린, 테트라사이클린, 메틸렌 블루, 안트라사이클리논, 소랄렌(psoralen), 쿠마린, 에티디움-할라이드, 디네미신, 1,10-페난트롤린-구리와 같은 금속 복합체, 칼케아미신(calcheamicin)과 같은 트리스(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린)루테니움-코발트-엔디인, 포피린, 디스타마이신, 네트로프신, 바이올로겐, 다우노마이신이다. 특히 흥미로운 예로는 아크리딘, 안트라퀴논과 같은 퀴논, 메틸렌 블루, 소랄렌, 쿠마린 및 에티디움-할라이드이다.

본 명세서에서, 용어 "광화학적 활성 그룹"은 빛의 조사에 대해 화학적 반응을 할 수 있는 화합물을 포함한다. 이것의 기능성 그룹의 구체적 예로는 퀴논, 특히 6-메틸-1,4-나프토퀴논, 안트라퀴논, 나프토퀴논 및 1,4-디메틸-안트라퀴논, 디아지린, 방향족 아지드, 벤조페논, 소랄렌, 디아조 화합물 및 디아지리노 화합물이다.

본 명세서에서, "열화학적 활성 그룹"은 다른 그룹과 같이 열화학적으로 유도되는 공유결합을 형성할 수 있는 기능성 그룹으로 정의된다. 열화학적 활성 그룹의 기능적 일부의 구체적 예로는 카복실산, 활성화된 에스테르와 같은 카복실산 에스테르, 산 플루오라이드, 산 클로라이드, 산 브로마이드 및 산 요오디드와 같은 카복실산 할라이드, 카복실산 아지드, 카복실산 하이드라지드, 설폰산, 설폰산에스테르, 설폰산할라이드, 세미카바지드, 티오세미카바지드, 알데히드, 케톤, 1급 알콜, 2급 알콜, 3급 알콜, 페놀, 알킬 할라이드, 티올, 디설파이드, 1차 아민, 2급 아민, 3급 아민, 하이드라진, 에폭사이드, 말레이미드 및 붕산 유도체이다.

본 명세서에서, 용어 "킬레이팅 그룹"은 하나 이상의 결합 부위를 포함하고 빈번하게 다른 분자, 원자 또는 이온과 하나를 초과하는 결합 부위를 통해 동시에 결합하는 분자를 의미한다. 킬레이팅 그룹의 기능적 일부의 예는 이미노디아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 아미노포스폰산 등이다.

본 명세서에서, 용어 "리포터(reporter) 그룹"은 자체로 또는 검출물의 일부분으로써 검출할 수 있는 그룹을 의미한다. 리포터 그룹의 기능적 일부의 예는 바이오틴, 디곡시게닌, 형광 그룹(어떤 파장의 예를 들면 광 또는 X-ray와 같은 전기자기적 방사를 흡수할 수 있고, 계속해서 장 파장의 방사로서 흡수된 에너지를 다시 방출할 수 있는 그룹; 구체적 예는 단실(5-디메틸아미노)-1-나프탈렌설포닐), DOXYL(N-옥실-4,4-디메틸옥사졸리딘), ROXYL(N-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘), TEMPO(N-옥실-2,2,6,6,-테트라메틸피페리딘), 디니트로페닐, 아크리딘, 쿠마린, Cy3 및 Cy5(Biological Detection Systems사의 상표명), 에리트로신, 쿠마르산, 움벨리페론, 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 테트라메틸로다민, 록스(Rox), 7-니트로벤조-2-옥소-1-디아졸(NBD), 피렌, 플루오레세인, 유로피움, 루테니움, 사마리움및 다른 희귀 토금속, 방사성동위원소 표지, 화학형광 표지(화학반응동안에 빛의 방출을 통해서 감지될 수 있는 표지), 스핀 표지(유리 라디칼(예, 치환된 유기 니트록사이드) 또는 전자스핀공명 스펙트로스코피의 사용에 의해 감지할 수 있는 생물학적 분자에 결합된 상자성체 탐침(예, Cu²⁺, Mg²⁺)), 효소(예를 들면, 페록시데이즈, 알칼라인 포스파타아제, β-갈락토시데이즈 및 글루코스 옥시데이즈), 항원, 항체, 합텐(항체에 결합할 수 있지만, 그들에 의해 면역반응이 시작되지 않는 그룹, 예, 펩타이드와 스테로이드 호르몬), 세포막의 투과를 위한 운반 시스템, 예를 들면, 지방산 잔기, 스테로이드 구조(콜레스테릴), 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 특정 수용체를 위한 폴산 펩타이드, 엔도사이토스를 중재하는 그룹, 표피성장인자(EGF), 브래디키닌 및 혈소판 유도 성장인자(PDGF)이다. 특히 흥미로운 예는 바이오틴, 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 디니트로페닐, 디곡시게닌, 루테니움, 유로피움, Cy5 및 Cy3이다.

본 명세서에서, 용어 "리간드"는 결합하는 어떤 것을 의미한다. 상기 리간드는 예를 들면, 방향족 그룹(예, 벤젠, 피리딘, 나프탈렌, 안트라센 및 페난트렌), 헤테로방향족 그룹(예, 티오펜, 퓨란, 테르라하이드로퓨란, 피리딘, 디옥산 및 피리미딘), 카복실산, 카복실산 에스테르, 카복실산 할라이드, 카복실산 아지드, 카복실산 하이드라지드, 설폰산, 설폰산 에스테르, 설폰산 할라이드, 세미카바지드, 티오세미카바지드, 알데히드, 케톤, 1급 알콜, 2급 알콜, 3급 알콜, 페놀, 알킬 할라이드, 티올, 디설파이드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 하이드라진, 에폭사이드, 말레이미드, 임의로 하나 이상의 이종원소 예를 들면 산소 원소, 질소 원소 및/또는 황 원소로 삽입되거나 종료되고, 임의로 방향족 또는 모노/폴리비포화 탄화수소를 포함하는 C₁∼C₂₀알킬 그룹, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리옥시에틸렌, 폴리-β-알라닌과 같은 올리고/폴리아마이드, 폴리글리신, 폴리라이신, 펩타이드, 올리고/폴리사카라이드, 올리고/폴리포스페이드, 독소, 항생제, 세포 독 및 스테로이드와 같은 기능성 그룹 및 또한 "친화성 리간드"는 즉, 특정 단백질, 항체, 폴리- 및 올리고사카라이드 및 다른 생분자상의 위치에 대해 특이적 친화 부위를 갖는 기능성 그룹 또는 생분자를 포함할 수 있다.

DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드의 상기한 특정 예가 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분에 상응한다는 것은 당업자에게 분명하다. 더욱이 당업자에게 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드가 전형적으로 M-K-(여기서 M은 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분이고 K는 "활성/기능성" 부분이 5- 또는 6-원환에 결합되는 스페이서이다) 형태로 나타내어지는 것이 분명하다. 따라서, B가 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되는 경우, 그룹 B는 M-K-(여기서 M은 각각 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드의 "활성/기능성" 부분이고, K는 5-원환과 "활성/기능성" 부분사이에 1∼50 개의 원자, 바람직하게는 1∼30 개의 원자, 특히 1∼15 개의 원자를 포함하는 임의의 스페이서이다) 형태를 가짐을 이해하여야 한다.

본 명세서에서, 용어 "스페이서"는 위에서 정의된 바와 같은 유형의 두 개 이상의 다른 부위를 연결하는데 사용되는 열화학적 및 광화학적 비-활성 거리-유지 그룹을 의미한다. 스페이서는 그의 소수성, 친수성, 분자 유연성 및 길이를 포함한 다양한 특징에 기초하여 선택된다(예를 들어 Hermanson 등, "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, San Diego, California(1992), p.137-ff를 참조하라). 일반적으로, 스페이서의 길이는 약 400Å 또는 그 미만, 일부 적용에서 바람직하게는 100Å 미만이다. 따라서, 스페이서는 임의로 산소 원자, 질소 원자 및/또는 황 원자와 같은, 하나 이상의 헤테로원자가 임의로 중간 또는 끝에 존재하는 탄소 원자쇄를 포함한다. 따라서, 스페이서 K는 하나 이상의 아미드, 에스테르, 아미노, 에테르, 및/또는 티오에테르 기능기, 및 임의로 방향족 또는 일/다불포화 탄화수소, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리옥시에틸렌, 폴리-β-알라닌과 같은 올리고/폴리아미드, 폴리글리신, 폴리라이신, 및 일반적인 펩타이드, 올리고사카라이드, 올리고/폴리포스페이트를 포함할 수 있다. 더욱이 스페이서는 그의 결합된 단위로 구성될 수 있다. 스페이서의 길이는 5-원환과 관련하여 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분의 원하거나 필요한 위치 및 공간적 배향을 고려하여 변화될 수 있다. 특히 흥미로운 구체예에서, 스페이서는 화학적으로 절단될 수 있는 그룹을 포함한다. 그러한 화학적으로 절단가능한 그룹의 예는 환원적 조건하에서 절단가능한 디설파이드 그룹, 펩티다제로 절단가능한 펩타이드 단편 등을 포함한다.

본 발명의 하나의 일례에서, K는 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분이 5- 또는 6-원환에 직접 결합할 수 있도록 하는 단일 결합을 나타낸다.

바람직한 구체예에서, 화학식 Ⅰ 및 Ⅱ에서 치환체 B는 바람직하게는 뉴클레오염기, 특히 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신 및 우라실로부터 선택된다.

본 발명의 올리고머(화학식 Ⅰ)에서, P는 후행 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합을 위한 라디칼 위치, 또는 5'-말단 그룹을 나타낸다. 첫번째 가능성은 상기 L-리보-LNA가 5'-말단 "모노머"가 아닐 때 적용되는 반면, 두번째 가능성은 해당 L-리보-LNA가 5'-말단 "모노머"일 때 적용된다. 그러한 뉴클레오사이드간 결합 및 5'-말단 그룹은 치환체 R⁵(또한 동일하게 적용가능한: 치환체 R^5*)를 포함하여 그룹 P와 이중결합을 형성할 수 있음이 이해되어야 한다(이하 뉴클레오사이드간 결합 또는 5'-말단 그룹의 정의로부터도 분명하다)(5'-말단은 뉴클레오사이드에서 리보스 부위의 5' 탄소원자에 상응하는 위치를 가리킨다).

한편, P^*은 선행 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합 또는 3'-말단 그룹을 위한 라디칼 위치를 나타낸다. 유사하게, 첫번째 가능성은 상기 L-리보-LNA가 3'-말단 "모노머"가 아닐 때 적용되는 반면, 두번째 가능성은 해당 L-리보-LNA가 3'-말단 "모노머"일 때 적용된다(3'-말단은 뉴클레오사이드에서 리보스 부위의 3' 탄소원자에 상응하는 위치를 가리킨다).

본 명세서에서, 용어 "모노머"는 L-리보-LNAs뿐만 아니라, 천연 발생의 뉴클레오사이드, 비-천연 발생의 뉴클레오사이드, PNAs 및 LNAs 등에 관한 것이다. 따라서, 용어 "후행 모노머"는 5'-말단 방향에 있는 이웃 모노머에 관한 것이고, "선행 모노머"는 3'-말단 방향에 있는 이웃 모노머에 관한 것이다. L-리보-LNA 모노머의 위치로부터 알 수 있는, 그러한 후행 및 선행 모노머는 천연 발생의 뉴클레오사이드 또는 비-천연 발생의 뉴클레오사이드, 또는 심지어 추가의 L-리보-LNA 모노머일 수 있다.

결과적으로, 본 명세서에서(상기 정의로부터 유추될 수 있는 바와 같이), 용어 "올리고머"는 하나 이상의 L-리보-LNA(s)의 도입에 의해 변형된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.

본 발명의 중대한 부분은 5원환의 L-리보-구조가 R^2*및 R^4*가 함께 5원환상에 융합된 링을 형성하는 바이라디탈을 나타내는 단서와 결합한 것이다.

바이라디칼를 구성하는 그룹에서, Z는 -O-, -S- 및 -N(R^a)-에서 선택되고, R^a와 R^b각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-12-알킬, 임의로 치환된 C_2-12-알케닐, 임의로 치환된 C_2-12-알키닐, 하이드록시, C_1-12-알콕시, C_2-12-알케닐옥시, 카복시, C_1-12-알콕시카보닐, C_1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디((C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, C_1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C_1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되며(후자의 그룹은 치환체 B를 위해 정의된 스페이서를 포함할 수 있음), 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2개의 제미날 치환체 R^a와 R^b는 함께 임의로 치환된 메틸렌 올레핀(=CH₂, 아릴을 위한 임의의 치환체로서 정의된 치환체로 한번 또는 2번 임의로 치환됨)일 수 있다.

본 명세서에서, 즉, 본 발명의 명세서 및 청구의 범위에서, 바이라디칼의 배향은 좌측편이 가장 낮은 수의 치환체를 나타내고 우측편이 가장 높은 수의 치환체를 나타내게 한다. 이와 같이, R^2*및 R^4*가 함께 바이라디칼 "-O-CH₂-"를 나타내는 경우, 산소 원자는 R^2*를 나타내어, 산소 원자가 R^2*의 위치에 결합되고, 메틸렌 그룹은 R^4*를 나타내는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 올리고머에 혼입된 L-리보-LNA(s)에서 바이라디칼의 구조에 대한 수많은 흥미로운 가능성을 고려하여, 비-제미날 치환체의 쌍으로 구성되는 바이라디칼은 바람직하게는 -(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-Y-, -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y-, -Y-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r+s-, -Y-, -Y-Y-로부터 선택되고, 여기서 각각의 Y는 -O-, -S-, -Si(R^*)₂-, -N(R^*)-, >C=O, -C(=O)-N(R^*)-, 및 -N(R^*)-C(=O)-로부터 선택되며, 각각의 R^*는 독립적으로 수소, 할로겐, 아지도, 시아노, 니트로, 하이드록시, 머캅토, 아미노, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되고/거나, 두 개의 인접한(제미날이 아닌) R^*는 함께 이중 결합을 나타낼 수 있고; 각각의 r 및 s는 0-4이고 단 r+s의 합은 1-4이다. 특히 흥미로운 상황은 각각의 바이라디칼이 -Y-, (CR^*R^*)_r+s-, -(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-, 및 -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y-로부터 선택되고, 여기서 각각의 r 및 s는 0-3이며, 단 r+s의 합은 1-4인 것이다.

특히 흥미로운 올리고머는 올리고머내의 L-리보-LNA를 위한 하기의 기준이 적용된다: R^2*및 R^4*가 함께 -O-, -S-, -N(R^*)-, -(CR^*R^*)_r+s+1-, -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-, -O-(CR^*R^*)_r+s-O-, -S-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -S-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S-, 및 -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-로부터 선택된 바이라디칼을 나타내고; 여기서 각각의 r 및 s는 0-3이며, 단 r+s의합은 1-4이며, 여기서 R^*는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되고 모든 남은 치환체 R^*는 수소인 것이 더욱 바람직하다.

하나의 바람직한 변형예에서, 적어도 하나의 LNA의 바이라디칼에서 하나의 그룹 R^*은 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택된다(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다).

다른 바람직한 바람직한예에서, 적어도 하나의 LNA의 바이라디칼에서 하나의 그룹 R^*은 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되고 모든 남은 치환체 R^*는 수소이다.

존재하는 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶및 R^6*는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-12-알킬, 임의로 치환된 C_2-12-알케닐, 임의로 치환된 C_2-12-알키닐, 하이드록시, C_1-12-알콕시, C_2-12-알케닐옥시, 카복시, C_1-12-알콕시카보닐, C_1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴,헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디((C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, C_1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C_1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되며(여기서 후자 그룹은 치환체 B를 위해 정의된 스페이서를 포함할 수 있음), 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2개의 제미날 치환체는 함께 옥소, 티옥소, 이미노 또는 임의로 치환된 메틸렌 또는 함께 -O-. -S- 및 -(NR^N)-로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자/그룹이 임의로 중간 및/또는 끝에 존재하는 1∼5개의 탄소원자 알킬렌 쇄로 구성된 스피로 바이라디칼을 형성할 수 있고(여기서, R^N은 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고 2개의 인접 (비-제미날) 치환체는 2중결합으로 되는 부가적인 결합을 나타낼 수 있음); 존재하는, R^N*은 수소와 C_1-4-알킬에서 선택된다.

바람직하게는, L-리보-LNA(s)의 각각의 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶및 R^6*는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 하이드록시, C_1-6-알콕시, C_2-6-알케닐옥시, 카복시, C_1-6-알콕시카보닐, C_1-6-알킬카보닐, 포밀, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, 아지도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, 설파닐, C_1-6-알킬티오, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드 및 할로겐으로부터 선택되고, 두 개의 제미날 치환체는 함께 옥소를 나타내며, R^N*는, 바이라디칼에 존재하고 그에 관여하지 않을때, 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 변형예에서, X는 -O-, -S-, 및 -NR^N*-, 특히 -O-로부터 선택되고, 존재하는, L-리보-LNA(s)의 각각의 치환체 R^1*, R², R³, R^3*, R⁵, R^5*, R⁶및 R^6*는 수소를 나타낸다.

본 발명의 더욱 바람직한 변형예에서, X는 -O-이고, 치환체 R^1*, R², R³, R⁵및 R^5*는 수소를 나타내고, 올리고머내로 삽입된 L-리보-LNA의 R²및 R^4*는 함께 -O-, -(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-, 및 -(CH₂)_2-4-, 특히 -O-CH₂-, -S-CH₂-, 및 -NR^H-CH₂-로부터 선택된다. 일반적으로, 이제까지 얻어진 결과에 관하여, R^2*및 R^4*로 구성된 바이라디칼은 두 개의 탄소원자 브릿지를 형성하고, 즉, 바이라디칼은 퓨라노스 환(X=O)을 갖는 5원환을 형성하는 것이 바람직하다.

본 발명이 하나의 변형예에서, 바이라디칼은 -(CH₂)_2-4-이다.

상기 흥미로운 변형예에 대해, L-리보-LNA(s)는 하기 일반식 Ia를 갖는 것이 바람직하다:

또한 본 발명의 다른 흥미로운 부분은 B가 "β-배위"인 일반식 Ia의 변형체이다.

본 발명에 따른 올리고머는 일반적으로 상기 일반식 I(더욱 구체적으로는 일반식 Ia)의 1∼10000개의 L-리보-LNA(s) 및 천연 발생의 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체로부터 선택되는 0∼10000개의 뉴클레오사이드를 포함한다. 뉴클레오사이드의 수 및 L-리보-LNA(s)의 수의 합(n)은 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 적어도 5개, 특별히 적어도 7개이고, 예를 들어 2∼15000개의 범위, 3∼100개와 같이 바람직하게는 2∼100개의 범위, 3∼50개 또는 5∼50개 또는 7∼50개와 같이 특히 2∼50개의 범위가 바람직하다.

일부의 L-리보-LNA 변형된 올리고머는 DNA 및 RNA에 강하게(증가한 친화성을갖고) 혼성화 하는 것을 발견하였다. 전체의 L-리보-LNA 변형된 올리고머 및 L-리보-LNA 모노머와 다른 L-리보-배위의 뉴클레오사이드 유사체로 구성되는 올리고머들은 공통적인 혼성화 특성을 일으킨다고 현재 믿고 있다.

본 명세서에서, 용어 "뉴클레오사이드"는 헤테로사이클릭 염기의 글라이코사이드를 의미한다. 용어 "뉴클레오사이드"는 비-천연 발생의 뉴클레오사이드, 천연 발생의 뉴클레오사이드 및 기타 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 것으로서 넓은 의미로 사용된다.

뉴클레오사이드의 구체적인 예는 리보스 부위를 포함하는 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보스 부위를 포함하는 데옥시리보뉴클레오사이드이다. 그러한 뉴클레오사이드의 염기에 관하여, 이것은 모든 천연 발생의 염기, 예를 들어 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 및 우라실, 및 그의 모든 변형된 변이체 또는 모든 가능한 비천연적 염기일 수 있음을 이해하여야 한다.

상기 정의 및 알려진 뉴클레오사이드(천연 발생 및 비-천연 발생) 및 뉴클레오사이드 유사체(알려진 바이- 및 트리사이클릭 유사체 포함)를 고려할 때, 올리고머가 하나 이상의 L-리보-LNA(s)(치환체의 선택 및 바이라디칼의 선택에 관하여 동일하거나 상이할 수 있는) 및 하나 이상의 뉴클레오사이드 및/또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있음이 분명하다. 본 명세서에서 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드간 결합을 통해 결합된 뉴클레오사이드의 연속된 쇄를 의미한다: 그러나, 올리고머(올리고뉴클레오타이드)에 있는 하나 이상의 뉴클레오타이드 단위(모노머)의 뉴클레오염기는 상기 정의된 바와 같이 치환체 B에 관하여 변형될 수 있음을 이해하여야 한다.

상기 올리고머는 직쇄상, 분지상 또는 환상(cyclic)일 수 있다. 분지상 올리고머의 경우에, 분지점은 뉴클레오사이드내, 뉴클레오사이드간의 결합내 또는 관심있는 통합체내, L-리보-LNA내에 위치할 수 있다. 후자의 경우에 치환체 R²및 R^3*는 선행하는 모노머에 대한 뉴클레오사이드간의 결합을 나타내는 그룹 P^*를 나타낼 수 있고, 특히 R²는 더욱 P^*를 나타낸다.

상기 언급한 바와 같이, 올리고머의 L-리보-LNA(s)는 뉴클레오사이드간 결합을 통해 다른 모노머와 결합된다. 본 명세서에서, 용어 "뉴클레오사이드간 결합"은 -CH₂-, -O-, -S-, -NR^H-, >C=O, >C=NR^H, >C=S, -Si(R")₂-, -SO-, -S(O)₂-, -P(O)₂-, -PO(BH₃)-, -P(O,S)-, -P(S)₂-, -PO(R")-, -PO(OCH₃)-, 및 -PO(NHR^H)-(여기서 R^H는 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C_1-6-알킬 및 페닐로부터 선택된다)로부터 선택되는 2 내지 4 개, 바람직하게는 3 개의 그룹/원자로 구성된 결합을 의미한다. 그러한 뉴클레오사이드간 결합의 구체적인 예는 -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CO-CH₂-, -CH₂-CHOH-CH₂-, -O-CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-, -O-CH₂-CH=(후행 모노머에 대한 결합으로서 사용될때 R⁵포함), -CH₂-CH₂-O-, -NR^H-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-NR^H-, -CH₂-NR^H-CH₂-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -NR^H-CO-O-, -NR^H-CO-NR^H-, -NR^H-CS-NR^H-, -NR^H-C(=NR^H)-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-NR^H-, -O-CO-O-, -O-CO-CH₂-O-, -O-CH₂-CO-O-, -CH₂-CO-NR^H-, -O-CO-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-, -O-CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -CH=N-O-, -CH₂-NR^H-O-, -CH₂-O-N=(후행 모노머에 대한 결합으로서 사용될때 R⁵포함), -CH₂-O-NR^H-, -CO-NR^H-CH₂-, -CH₂-NR^H-O-, -CH₂-NR^H-CO-, -O-NR^H-CH₂-, -O-NR^H-, -O-CH₂-S, -S-CH₂-O-, -CH₂-CH₂-S-, -O-CH₂-CH₂-S-, -S-CH₂-CH=(후행 모노머에 대한 결합으로서 사용될때 R⁵포함), -S-CH₂-CH₂-, -S-CH₂-CH₂-O-, -S-CH₂-CH₂-S-, -CH₂-S-CH₂-, -CH₂-SO-CH₂-, -CH₂-SO₂-CH₂-, -O-SO-O-, -O-S(O)₂-O-, -O-S(O)₂-CH₂-, -O-S(O)₂-NR^H-, -NR^H-S(O)₂-CH₂-, -O-S(O)₂-CH₂-, -O-P(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -S-P(O)₂-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)₂-O-, -O-P(O)₂-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)₂-S-, -S-P(O)₂-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)₂-S-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(OCH₃)-O-, -O-PO(OCH₂CH₃)-O-, -O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-, -O-PO(BH₃)-O-, -O-PO(NHR^N)-O-, -O-P(O)₂-NR^H-, -NR^H-P(O)₂-O-, -O-P(O,NR^H)-O-, -CH₂-P(O)₂-O-, -O-P(O)₂-CH₂-, 및 -O-Si(R")₂-O-이며; 그중 -CH₂-CO-NR^H-, -CH₂-NR^H-O-, -S-CH₂-O-, -O-P(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -NR^H-P(O)₂-O-, -O-P(O,NR^H)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH₃)-O-, 및 -O-PO(NHR^N)-O-(여기서 R^H는 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C_1-6-알킬 및 페닐로부터 선택된다)가 특히 바람직하다. 추가의 구체적 예는 Mesmaeker 등,Current Opinion in Structural Biology1995,5, 343-355에 제공되어 있다. 뉴클레오사이드간 결합의 좌측편은 우측편이 선행 모노머의 5'-위치에 결합되는 반면, 치환체 P^*로서 5-원환에 결합된다.

또한 해당 L-리보-LNA가 5'-말단 모노머인 경우 그룹 P가 또한 5'-말단 그룹을 나타낼 수 있음이 상기로부터 분명하다. 그러한 5'-말단 그룹의 예는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬카보닐옥시, 임의로 치환된 아릴옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 및 -W-A'-이고, 여기서 W는 -O-, -S- 및 -N(R^H)-에서 선택되며, 여기서 R^H는 수소 및 C_1-6-알킬로부터 선택되고, A'는 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택된다(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다).

본 발명의 상세한 설명 및 청구범위에서, 용어 "모노포스페이트", "디포스페이트", 및 "트리포스페이트"는 각각 화학식의 그룹을 의미한다:

-O-P(O)₂-O^-, -O-P(O)₂-O-P(O)₂-O^-, 및 -O-P(O)₂-O-P(O)₂-O-P(O)₂-O^-

특히 흥미로운 구체예에서, 그룹 P는 모노포스페이트, 디포스페이드 및 트리포스페이트로부터 선택되는 5'-말단 그룹을 나타낸다. 특히 식 II의 트리포스페이트 변형체는 효소, 특히 핵산상의 활성인 것에 대한 기질로서 흥미롭다.

유사하게, 그룹 P^*는 해당 LNA가 3'-말단 모노머인 경우 3'-말단 그룹을 나타낼 수 있다. 그러한 3'-말단 그룹의 예는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬카보닐옥시, 임의로 치환된 아릴옥시, 및 -W-A'-이고, 여기서 W는 -O-, -S- 및 -N(R^H)-로부터 선택되며, 여기서 R^H는 수소 및 C_1-6-알킬로부터 선택되고, A'는 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택된다(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다).

본 발명의 바람직한 변형예에서, 올리고머는 하기 화학식 III을 갖는다:

G-[Nu-L]_n(o)-{[L-리보-LNA-L]_m(q)-[Nu-L]_n(q)}_q-G^*III

상기 식에서

q는 1∼50이고;

각각의 n(0)...n(q)는 독립적으로 0∼10000이며;

각각의 m(1)...m(q)는 독립적으로 1∼10000이고;

단 n(0)...n(q)와 m(1)...m(q)의 합은 2∼15000이며;

G는 5'-말단 그룹을 나타내고;

각각의 Nu는 독립적으로 천연 발생의 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오사이드를 나타내며;

각각의 L-리보-LNA는 독립적으로 뉴클레오사이드 유사체를 나타내고;

각각의 L은 독립적으로 Nu 및 L-리보-LNA로부터 선택되는 두 그룹간의 뉴클레오사이드간 결합을 나타내거나, L은 G^*와 함께 3'-말단 그룹을 나타내며;

각각의 L-리보-LNA-L은 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 화학식 Ⅰ의 뉴클레오사이드 유사체, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 일반식 Ia의 뉴클레오사이드 유사체를 나타낸다.

이 일례내서 및 일반적으로, 본 발명은 상이한 뉴클레오염기, 특히 티민, 사이토신 및 우라실로부터 선택되는 뉴클레오염기 및 아데닌과 구아닌으로부터 선택되는 뉴클레오염기를 갖는 L-리보-LNA를 포함할 흥미로운 가능성을 제공한다. 일례에서, 올리고머는 B(식 I 또는 Ia)가 아데닌 및 구아닌으로 구성된 그룹으로부터 선택된적어도 하나의 L-리보-LNA 및 B가 티민, 사이토신 및 우라실으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 L-리보-LNA를 포함할 수 있다.

상기에서 정의된 올리고머와 별도로, 본 발명은 또한 예를 들면, 핵산중합효소, 폴리뉴클레오타이드 키나아제, 말단전이효소를 위한 기질로써 올리고머의 제조 및 진단제(이하 참고)로 유용한 모노머 L-리보-LNA를 제공한다. 모노머 L-리보-LNAs는 올리고머내에의 구조로 정의된 L-리보-LNAs에 대한 전체적인 구조(특히 가능한 바이라디칼의 견지에서)와 상응한다. 그러나, 그룹 P 및 P^*의 견지에서, 하기에서 설명한 것과 같이, 모노머 L-리보-LNAs는 올리고머내의 구성과 약간 다르다. 또한 모노머 L-리보-LNAs는 특히 모노머 L-리보-LNAs가 화합 합성에 의해 올리고머내로 삽입될 때, 기능성 그룹, 보호 그룹을 포함한다.

본 발명은 또한 하기 일반식 II의 모노머 L-리보-LNA 뉴클레오사이드(L-리보-LNAs)에 관한 것이다:

상기 식에서, 치환체 B는 뉴클레오염기, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드에서 선택되며; X는 -O-, -S-, -N(R^N*)-, 및 -C(R⁶R^6*)-에서 선택되고, 특히 -O-, -S-, 및 -N(R^N*)-에서 선택되며;

Q와 Q^*의 각각은 독립적으로 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, Prot-O-, Act-O-, 머캅토, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-알킬티오, 아미노, Prot-N(R^H)-, Act-N(R^H)-, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시,임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹, 리간드, 카복시, 설포노, 하이드록시메틸, Prot-O-CH₂-, Act-O-CH₂-, 아미노메틸, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂-, 카복시메틸, 설포노메틸(여기서, Prot는 각각 -OH, -SH 및 -NH(R^H)에 대한 보호 그룹이며, Act는 각각 -OH, -SH 및 -NH(R^H)에 대한 활성 그룹이고, R^H는 수소와 C_1-6-알킬로부터 선택됨)에서 선택되며;

R^2*와 R^4*는 함께 -O-, -(CR^*R^*)_r+s+1-, -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-, -O-(CR^*R^*)_r+s-O-, -S-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -S-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S-, 및 -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-로부터 선택되는 바이라디칼을 나타내고; 여기서, 각각의 R^*은 올리고머를 위한 상기 정의와 같고, Q와 Q^*내에 포함되지 않는 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, 및 R^5*는 올리고머를 위한 상기 정의와 같다.

모노머 L-리보-LNA는 또한 그의 염기 염 및 산 부가 염을 포함한다.

또한 화학적 올리고뉴클레오타이드 합성에서 우월한 조건하에서 반응성인 모든 화학적 그룹(모든 뉴클레오염기 포함)은 임의의 공지의 보호된 기능성 그룹이라는 것은 이해되어야 한다. 이것은 모노머 L-리보-LNA의 뉴클레오염기뿐만 아니라 하이드록시, 아미노, 카복시, 설포노, 및 머캅토 그룹과 같은 그룹이 임의로 보호된 기능성 그룹인 것을 의미한다. 보호(및 비보호)는 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다(예, Greene, T.W. 및 Wuts, P.G.M., "Protective Groups in Organic Synthesis" 2판, John Wiley, N.Y.(1991), 및 M.J.Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, 1984).

하이드록시 보호 그룹의 예시적인 예는 임의로 치환된 트리틸, 예를 들어 4,4'디메톡시트리틸(DMT), 4-모노메톡시트리틸(MMT), 및 트리틸(Tr), 임의로 치환된 9-(9-페닐)크산테닐(픽실), 임의로 치환된 에톡시카보닐옥시, p-페닐아조페닐옥시카보닐옥시, 테트라하이드로피라닐(thp), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 메톡시테트라하이드로피라닐(mthp), 실릴옥시, 예를 들어 트리메틸실릴(TMS), 트리이소프로필실릴(TIPS), 3급-부틸디메틸실릴(TBDMS), 트리에틸실릴, 및 페닐디메틸실릴, 벤질옥시카보닐 또는 치환된 벤질옥시카보닐 에테르, 예를 들어 2-브로모 벤질옥시카보닐, t-부틸에테르, 알킬 에테르, 예를 들어 메틸 에테르, 아세탈(2개의 하이드록시 그룹을 포함), 아실옥시, 예를 들어 아세틸 또는 할로겐 치환된 아세틸, 예를 들어 클로로아세틸 또는 플루오로아세틸, 이소부티릴, 피발로일, 벤조일 및 치환된벤조일, 메톡시메틸(MOM), 벤질 에테르 또는 치환된 벤질 에테르, 예를 들어 2,6-디클로로벤질(2,6-Cl₂Bzl)이다. 다르게는, 하이드록시 그룹은 임의로 링커를 통해 고체 지지체에 부착되어 보호될 수있다.

아미노 보호 그룹의 예시적인 예는 Fmoc(플루오레닐메톡시카보닐), BOC(t-부틸옥시카보닐), 트리플루오로아세틸, 알릴옥시카보닐(alloc. AOC), 벤질옥시카보닐 (Z, cbz), 치환된 벤질옥시카보닐, 예를 들어 2-클로로 벤질옥시카보닐(2-CIZ), 모노메톡시트리틸(MMT), 디메톡시트리틸(DMT), 프탈로일, 및 9-(9-페닐)크산테닐(픽실)이다.

카복시 보호 그룹의 예시적인 예는 알릴 에스테르, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 2-시아노에틸에스테르, 트리메틸실릴에틸에스테르, 벤질 에스테르(Obzl), 2-아다만틸 에스테르(O-2-Ada), 사이클로헥실 에스테르(OcHex), 1,3-옥사졸린, 옥사졸러, 1,3-옥사졸리딘, 아미드 또는 히드라지드이다.

머캅토 보호 그룹의 예시적인 예는 트리틸(Tr), 아세트아미도메틸(acm), 트리메틸아세트아미도메틸(Tacm), 2,4,6-트레메톡시벤질(Tmob), t-부틸설페닐(StBu), 9-플루오로메틸(Fm), 3-니트로-2-피리딘설페닐(Npys), 및 4-메틸벤질(Meb)이다.

또한, 특히 모노머 L-리보-LNA를 본 발명에 따라 올리고머에 혼입시킬 때, 모노머 L-리보-LNA에 포함된 뉴클레오염기를 보호하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "보호된 뉴클레오염기"는 문제의 뉴클레오염기가 본 분야에 숙련된자에게 잘 알려진 그룹중에서 선택된 보호 그룹을 수반한다(참조,예를 들어 Protocols for Oligonucleotides and Analogs, vol 20, (Sudhir Agrawal, ed.), Humana Press, 1993, Totowa, NJ; S.L. Beaucage and R.P. lyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S.L. Beaucage and R.P. lyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223; and E. Uhlmann and A. Peyman, Chem. Rev., 90,543 참조). 예시적인 예는 벤조일, 이소부티릴, t-부틸, t-부틸옥시카보닐, 4-클로로-벤질옥시카보닐, 9-플루오레닐메틸, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐, 4-메톡시벤조일, 4-메톡시트리페닐메틸, 임의로 치환된 트리아졸로, p-톨루엔설포닐, 임의로 치환된 설포닐, 이소프로필, 임의로 치환된 아미딘, 임의로 치환된 트리틸, 페녹시아세틸, 임의로 치환된 아실, 픽실, 테트라하이드로피라닐, 임의로 치환된 실릴 에테르, 및 4-메톡시벤조일옥시카보닐이다. Chapter 1 in :"Protocols for oligonucleotides conjugates", Methods in Molecular Biology, vol 26, (Sudhir Agrawal, ed), Human Press, 1993, Totowa, NJ. and S.L. Beacucage and R. P. lyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223에는 추가의 적절한 예가 개시되어 있다.

바람직한 구체예에서, 모노머 L-리보-LNA중의 그룹 B는 바람직하게는 뉴클레오염기 및 보호된 뉴클레오염기로부터 선택된다.

본 발명에 따른 모노머 L-리보-LNA의 구체예에서, Q 및 Q^*, 바람직하게는, Q^*는 Act-O-, Act-S-, Act-N(R^H)-, Act-O-CH₂-, Act-S-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂-로부터 선택된 그룹을 나타내고, Q 및 Q^*중 다른 것, 바람직하게는 Q는 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, Prot-O-, 머캅토, Prot-S-, C_1-6-알킬티오, 아미노, Prot-N(R^H)-, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-5-알케닐, 임의로 치환된 C_2-5-알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-5-알키닐, 임의로 치환된 C_2-5-알키닐옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, DNA 삽입물(intercalator), 광학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹, 리간드, 카복시, 설포노, 하이드록시메틸, Prot-O-CH₂-, 아미노메틸, Prot-N(R^H)-CH₂-, 카복시메틸, 설포노메틸로 부터 선택된 그룹을 나타내며, R^H는 수소 및 C_1-6알킬로부터 선택된다.

상기한 경우에, 그룹 Prot는 -OH, -SH, 및 -NH(R^H)에 대한 보호 그룹을 각각 나타낸다. 이러한 보호 그룹은 안정하고 가역적인 보호 그룹에 대한 필요성을 고려하여 하이드록시 보호 그룹, 머캅토 보호 그룹, 및 아미노 보호 그룹에 대해 각각 상기된 것으로부터 선택된다. 그러나, -OH에 대한 보호 그룹은 임의로 치환된 트리틸, 예를 들어 디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸(MMT), 및 트리틸, 및 9-(9-페닐)크산테닐(픽실), 임의로 치환된 테트라하이드로피라닐(thp)로부터 선택되는 것(포스포로아미디트 올리고뉴클레오타이드 합성에 대한 추가의 적절한 하이드록시 보호 그룹은 Agrawal, ed. "protocols for Oligonucleotide Conjugates"; Methods in Molecular Biology, vol. 26, Humana Press, Totowa, NJ(1994) andProtocols for Oligonucleotides and Analogs, vol 20, (Sudhir Agrawal, ed), Humana Press. 1993, Totowa, NJ에 기술되어 있다) 또는 아세탈로서 보호되는 것; -SH에 대한 보호 그룹은 트리틸, 예를 들어 디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸(MMT), 및 트리틸(Tr), 및 9-(9-페닐)크산테닐(픽실), 임의로 치환된 테트라하이드로피라닐(thp)로부터 선택되는 것(포스포로아미디트 올리고뉴클레오타이드 합성에 대한 추가의 적절한 머캅토 보호 그룹은 또한 Agrawal(상기 참조)에 기술되어 있다); -NH(R^H)에 대한 보호 그룹은 트리틸, 예를 들어 디메톡시트리틸(DMT), 모노에톡시트리틸(MMT) 및 트리틸, 및 9-(9-페닐)크산테닐(픽실), 임의로 치환된 테트라하이드로피라닐(thp)로부터 선택되는 것(포스포로아미디트 올리고뉴클레오타이드 합성에 대한 추가의 적절한 아미노 보호 그룹은 Agrawal(상기 참조)에 의해 또한 기술되어 있다)이 바람직하다.

상기 구체예 및 본 명세서에서 정의된 모노머 L-리보-LNAs경우에서, Act는 각각 -OH, -SH, 및 -NH(R^H)에 대한 활성화 그룹을 나타낸다. 이러한 활성화 그룹은 예를 들어 임의로 치환된 O-포스포르아미디트, 임의로 치환된 O-포스포르트리에스테르, 임의로 치화된 O-포스포르디에스테르, 임의로 치환된 H-포스포네이트, 및 임의로 치환된 O-포스포네이트로부터 선택된다.

이와 관련하여, 용어 "포스포로아미디트"는 화학식 -P(OR^x)-N(R^y)_z(여기에서, R^x는 임의로 치환된 알킬 그룹, 예를 들어, 메틸, 2-시아노에틸, 또는 벤질을 나타내고, R^y의 각각은 임의로 치환된 알킬 그룹, 예를 들어 에틸, 이소프로필을 나타내거나 그룹 -N(R^y)₂은 모르폴리노 그룹 (-N(CH₂CH₂)₂O)을 형성한다)의 그룹을 의미한다. R^x는 바람직하게는 2-시아노에틸을 나타내고, 두 개의 R^y는 바람직하게는 동일하거나, 이소프로필을 나타낸다. 따라서, 특히 관련있는 포스포로아미디트는 N,N-디이소프로필-O-(2-시아노에틸)포스포로아미디트이다.

단일 모노머 L-리보-LNA 또는 수개의 모노머 L-리보-LNAs에 대해 본 명세서에서 사용된 보호 그룹은 이/이들 L-리보-LNA(들)가 본 발명에 따른 올리고머에 혼입될 때, 작용 그룹의 동시적인 탈보호 또는 순차적 탈보호를 수행하는 것이 가능하도록 선택될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 후자 상황은 DNA 삽입물 (intercalators), 광학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드(이들 그룹은 상기된 바와 같이 스페이서를 통해 부착될 수있다)와 같은 하나 또는 수개의 "활성/작용성" 그룹을 레지오선택적으로 도입할 가능성에 대해 개방되어 있다.

바람직한 구체예에서, Q는 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, Prot-O-, 머캅토, Prot-S-, C_1-6-알킬티오, 아미노, Prot-N(R^H)-, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, DNA 삽입물, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹, 리간드, 카복시, 설포노, 하이드록시메틸, Prot-O-CH₂-, 아미노메틸, Prot-N(R^H)-CH₂-, 카복시메틸, 설포노메틸(여기에서, Prot는 -OH, -SH, 및 -NH(R^H) 각각에 대한 보호 그룹이고, R^H는 수소 및 C_1-5알킬로부터 선택된다)로부터 선택되고, Q^*는 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, Act-O-, 머캅토, Act-S-, C_1-6-알킬티오, 아미노, Act-N(R^H)-, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐, 임의로 치환된 C_2-6알키닐옥시, DNA 삽입물, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹, 리간드, 카복시, 설포노(여기에서, Act는 -OH, -SH, 및 -NH(R^H) 각각에 대한 활성 그룹이고, R^H는 수소 및 C_1-6알킬로부터 선택된다)로부터 선택된다.

화학식(II)의 모노머 L-리보-LNAs는 올리고머에 혼입된 L-리보-LNA로서 다양한 입체이성체를 나타낸다. 따라서, 올리고머에 혼입된 L-리보-LNA에 대해 상기 기술된 입체이성체 변형체는 모노머 L-리보-LNAs의 경우에(그러나, 이때 P는 Q로치환되어야 한다는 것이 주목되어야 한다) 동등하게 적용될 수 있다고 믿어진다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 모노머 LNA는 화학식(IIa)를 갖는다.

상기 식에서, 치환체들은 상기와 같이 정의된다.

또한, 치환체의 정의, 바이라디칼, R' 등의 정의와 관련하여, 본 발명에 따른 올리고머에 대해 상기 정의된 바와 같은 바라마직한 구체예가 모노머 L-리보-LNAs의 경우에 또한 적용된다.

본 발명의 모노머 L-리보-LNA의 특히 흥미로운 구체예에서, B는 뉴클레오염기, 바람직하게는 티민, 시토신, 우라실, 아데닌 및 구아닌(특히 아데닌 및 구아닌)으로부터 선택된 뉴클레오염기를 나타내고, X는 -O-이며, R^2*및 R^4*는 함께 -(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- 및 -(CH₂)_0-1-N(R^N) -(CH₂)_1-3-, 특히 -O-CH₂-, -S-CH₂- 및 -R^N-CH₂-(여기에서, R^N은 수소 및 C_1-4알킬로부터 선택된다)로부터 선택된 바이라디칼을 나타내고, Q는 Prot-O-를 나타내며, Q^*는 Act-OH를 나타내며, R^1*, R², R^3*, R⁵및 R^5*는 각각 수소를 나타낸다. 본 구체예에서, R^N은 또한 DNA 삽입물, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 모노머 L-리보-LAN의 더욱 특별히 흥미로운 구체예에서, B는 뉴클레오염기, 바람직하게는 티민, 시토신, 우라실, 아데닌 및 구아닌(특히 아데닌 및 구아닌)으로부터 선택된 뉴클레오염기를 나타내고, X는 -O-이며, R^2*및 R^4*는 함께 -(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- 및 -(CH₂)_0-1-N(R^N) -(CH₂)_1-3-, 특히 -O-CH₂-, -S-CH₂- 및 -R^N-CH₂-(여기에서, R^N은 수소 및 C_1-4알킬로부터 선택된다)로부터 선택된 바이라디칼을 나타내고, Q는 하이드록시, 머캅토, C_1-6-알킬티오, 아미노, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6알콕시, 임의로 치환된 C_2-6알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-6알키닐옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 및 트리포스페이트로부터 선택되며, Q^*는 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, 머캅토, C_1-6알킬티오, 아미노, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 임의로 치환된 C_2-6알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐, 및 임의로 치환된 C_2-6알키닐옥시로부터 선택되고, R^3*는 수소, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-5알케닐, 및 임의로 치환된 C_2-6-알키닐으로부터 선택되고, R^1*, R², R⁵, 및 R^5*는 각각 수소를 나타낸다.또한, 여기에서, R^N은 또한 DNA 삽입물, 광화학적으로 활성인 그룹, 열화학적으로 활성인 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 한 면은 올리고머에 고체-상 및/또는 용액상 혼입을 위한 L-리보-LNA의 다양한 유도체를 제공하는 것이다. 예시적 예로서, 포스포르아미디트 접근, 포스포르트리에스터 접근, 및 H-포스포노에이트 접근을 각각 사용한 (1S,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(티민-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄, (1S,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(시토신-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄, (1S,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(우라실-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄, (1S,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(구아닌-1일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄, 및 (1S,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(아데닌-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄의 혼입을 위한 적절한 모노머는 각각 그들의 (1R,3R,4R,7R)-7-(2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시)-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(티민-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄, (1R,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(티민-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-7-O-(2-클로로페닐포스페이트) 및 (1R,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(티민-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-7-O-(H-포스페이트), 및 3-(시토신-1-일), 3-(우라실-1-일), 3-(아데닌-1-일) 및 3-(구아닌-1-일) 유사체이다. 또한, 모노머의 메틸렌옥시 바이라디칼이 메틸렌티오, 메틸렌아미노,또는 1,2-에틸렌 바이라디칼로 치환된 유사체는 또한 본 발명내의 특히 흥미로운 변이체(variants)를 구성한다고 기대된다. 메틸렌티오 및 메틸렌아미노 유사체는 메틸렌옥시 유사체로서 동등하게 적용될 수 있다고 믿어지고, 그러므로, (1S,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(티민-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄, (1S,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(시토신-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄, (1S,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(우라실-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄, (1S,3R,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(구아닌-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄, 및 (1S,3R ,4R,7R)-7-하이드록시-1-하이드록시메틸-3-(아데닌-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄의 혼입에 대해 상기 언급된 것과 상응하는 특별한 시약은 또한 본 발명내에서 특히 흥미로운 반응성 모노머로서 여겨져야 한다. 메틸렌아민 유사체 경우, 제 2 아민이 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 예를 들어 메틸 및 벤질, 임의로 치환된 C_1-6알킬카보닐, 예를 들어 트리플루오로아세틸, 임의로 치환된 아릴카보닐 및 임의로 치환된 헤테로아릴카보닐로부터 선택된 치환체를 수반할 수 있다는 것이 주목되어야 한다.

또한, 본 발명의 다른 흥미로운 일면은 B가 "β-배위"인 식 II 또는 IIa의 변형체이다.

모노머의 제조

바람직한 구체예에서, 2'-O,4-메틸렌 브릿지를 함유하는 α-L-리보-LNA는 하기 과정에 의해 합성되었다: 4-C-하이드록시메틸-α-D-크실로푸라노즈 1의 벤질화(T.F. Tam and B.Fraser-Ried, Can. J. Chem. , 1979, 57, 2818)하여 디-O-벤조일 유도체 2를 수득하고 순차적으로 80% 아세트산을 사용하여 아세토라이시스(acetolysis)한 후 아세틸화하여 1,2-디-O-아세틸화 푸라노즈로 전환시킨다. 변형된 보르부르겐(Vorbruggen) 방법(H. Vorbruggen, K. Krolligiewicz and B. Bennua, Chem, Ber., 1981, 114, 1234; H. Vorbruggen, and G. Hofle, Chem, Ber., 1981, 114, 1256)을 사용하여, 티민의 동소실릴화 및 트리메틸실릴 트리플레이트 매개 커플링에 의해 티민 β-배위 뉴클레오사이드 4를 수득하였다. 화합물 4를 소듐 메톡사이드로 처리하여 탈아실화시킴으로써 뉴클레오사이드 5를 수득하였다. 4,4'-디메톡시트리틸 보호가 이어지는 토실화는 5'-O-4,4'-디메톡시트리틸 보호된 뉴클레오사이드 유도체 7을 제공했다. 염기-유도된 환 폐쇄는 바이사이클릭 뉴클레오사이드 유도체 8을 제공했다. 탈벤질화하여 바이사이클릭 뉴클레오사이드 유사체 9를 수득하고, 이는 올리고뉴클레오타이드 합성용의 포스포르아미디트 유사체 10로 변형되었다. 본 예에서 사용된 커플링 방법은 본 분야에 숙련된자에 명백한 수개의 가능한 방법중 오직 하나이다.

치환 방법으로서, 도 3(실시에 12-14)에 나타낸 합성 서열을 사용할 수 있다. 따라서, 뉴클레오사이드 5를 트리메실화하여 뉴클레오사이드 11을 수득하고 이는 NaOH/EtOH/H₂O를 사용하여 폐환화시켰다. 사용되는 시험 조건하에서, 뉴클레오사이드 12를 제공하면서 동시에 잔존하는 메실옥시 그룹이 하이드록시 그룹으로 전환되었다. 실시예 14에서 설명된 표준 DMT-보호화에 α-L-리보-LNA 뉴클레오사이드 포스포르아미디트 유도체 10의 합성의 용이한 중간체인 뉴클레오사이드 8를 수득하였다(도 2).

기술된 예는 본 발명의 과정 및 실시예에 예시적인 것이다. 합성된 화합물의 구조는 1D NMR을 사용하여 입증되었다.

도식 1, 2 및 3에서 설명된 바와 같은 방법을 사용하여 티민외의 다른 피리미딘 염기의 α-L-리보-LNA 뉴클레오사이드 유도체, 예를 들면, 우라실, 사이토신, 5-치환된 우라실, 5-치환된 사이토신 및 그외의 치환된 피리미딘를 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법(Koshkin, A.A. singh, S.K., Nielsen, P., Rajwanshi, V.K.,Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C.E., Wengel, J. Tetragedron 1998, 54, 3607; Obika, S., Nanbu, D., Hari, Y., Andoh, J., Morio, K., Doi, T., Imanishi, T. Tetragedron Lelt, 1998, 39, 5401)에 의해 우라실 유도체를 상응하는 사이토신 유도체, 티민 유도체를 상응하는 5-메틸사이토신 유도체로 전환시킬 수 있다.

퓨린 α-L-리보-LNA 뉴클레오사이드 유도체를 합성하기 위한 다수의 적절한 합성법이 고안될 수 있다. 하기 언급되는 용어 " α-형"은 천연 RNA 뉴클레오사이드 모노머의 α-형을 의미하고, 하기 언급되는 용어 " β-형"은 천연 RNA 뉴클레오사이드 모노머의 β-형을 의미하고 , 용어 "β-퓨린 뉴클레오사이드" 또는 "β-피리미딘 뉴클레오사이드"는 뉴클레오염기가 천연 RNA 뉴크레오사이드 모노머중에 위치하는 것을 의미한다. 퓨린 α-L-리보-LNA 뉴클레오사이드 유도체의 가능한 합성방법의 예로서, 아라비노-배위 유사체(β-형의 푸라노즈 환에 위차하는 2'-OH 그룹)의 폐환화를 사용할 수 있다. 5'-산화, 알돌 응축 및 환원에 의해 이들 뉴클레오사이드를 상응하는 아라비노-배위 모 뉴클레오사이드로부터 제조할 수 있다.

상기 언급된 바와 같은 원하는 폐환화를 위하여 보호 그룹을 처리하고 5'-OH 그룹(푸라노즈 환의 β형에 위치)을 활성화시켜야 한다. 또한, 입체선택적으로 환원되는(예를 들면, NaBH₄사용) β-푸린 리보푸라노실 뉴클레오사이드의 4'-C-하이드록시메틸 유도체의 2'-OH 그룹(C3'에서 동시 반전되는 α형의 푸라노즈 환에 위치하는 2'-OH 및 3'-OH 그룹 및 β형의 푸라노즈 환(또는 α형의 푸라노즈 환)에 위치하는 3'-OH 그룹을 갖는)의 2'-산화에 의해 2'-탄소 원자에 반전된 배위를 갖는 원하는 뉴클레오사이드를 제공하여야 한다. 상기 언급된 바와 같은 원하는 폐환화를 위하여 보호 그룹을 처리하고 5'-OH 그룹(푸라노즈 환의 β형에 위치)을 활성화시켜야 한다. β-푸린 리보푸라노실 뉴클레오사이드의 4'-C-하이드록시메틸 유도체의 2'-탄소 원자(C3'에서 동시 반전되는 α형의 푸라노즈 환에 위치하는 2'-OH 및 3'-OH 그룹 및 β형의 푸라노즈 환(또는 α형의 푸라노즈 환)에 위치하는 3'-OH 그룹을 갖는)의 배위 반전을 위하여 다른 방법, 예를 들면, 미츠노부(Mitsunobu) 반응 또는 2'-O-활성화 유도체(예: 2'-O-메실, 2'-O-토실 또는 2'-O-트리플루오로메틴설포닐 유도체)를 O-뉴클레친화성, 예를 들면 아세테이즈, 벤조에이트, 알록사이드 등으로의 치환 반응을 사용할 수 있는 것으로 예상된다. 순차적으로 탈보호화하여 5'-하이드록시-4'-C-하이드록시메틸 유도체를 수득하고, 폐환화를 위한 활성(예: 모노- 또는 디메실화, 모노- 또는 디토실화 또는 모노- 또는 디트리플루오로메탄설폰화), 폐환화(필요한 경우, 2'-OH 그룹의 탈보호화후), 및 탈보호화하여 원하는 퓨린 α-L-리보 뉴클레오사이드를 제공하여야 한다. 퓨린 염기는 바람직하게는 표적 모노머중에서 보호화되어야 한고, 이는 원하는 합성 경로동안, 또는 최종 단계로서 트리메틸실릴화, 퓨린 염기의 유리 아미노 그룹의 보호화, 및 탈실릴화에 의해 수행될 수 있다. 공지된 보르부르겐 유형 방법에 따라 퓨라노즈 유도체 3(도 1)을 적절하게 보호된 아데닌 또는 구아닌 유도체와 커플링하여 출발 β-퓨린 뉴클레오사이드의 4'-C-하이드록시메틸 유도체를 제조할 수 있다(참조, 예: 뉴클레오사이드 4의 합성: 도 1)(Koshkin, A.A. Singh, S.K. Nielsen, P., Rajwanshi, V.K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C.E., Wengel, J. Tetrahedron 1998, 54, 3607).

상기 기재된 방법과 같은 공지된 방법에 따라 추가의 4'-C-하이드록시케리 그룹을 도입하여 상기 언급된 배위 반전을 β-푸린 리보푸라노실 뉴클레오사이드 (C3'에서 동시 반전되는 α형의 푸라노즈 환에 위치하는 2'-OH 및 3'-OH 그룹 및 β형의 푸라노즈 환(또는 α형의 푸라노즈 환)에 위치하는 3'-OH 그룹을 갖는)상에서 수행시킬 수 있을 것으로 예상된다. 또한 적절히 유도되고 보호된 피리미딘 뉴클레오사이드, 아라비노-배위 β-피리미딘 뉴클레오사이드, 또는 미리 폐환화된 α-L-리보-LNA 피리미딘 뉴클레오사이드상에서의 효소적 또는 화학적 트랜스글리코실화는 퓨린 α-L-리보-LNA 뉴클레오사이드 유도체의 합성 방법으로서 가능하다. 또는 푸라노즈 또는 헥사노즈로부터 출발하여 4-C-하이드록시메틸화, 2-탄소 원자에서의 배위 전환, 및 폐환화, 또는 이들중 하나 또는 두개의 방법(사용되는 출발물질에 따라 요구됨)을 수행할 수 있다. 필요한 보호 그룹 처리 및/또는 OH-그룹 활성화후, 순차적으로 폐환화전 또는 후로, 다른 염기(퓨린 또는 피리미딘-필요한 경우, 보호된 것)과 커플링하여 α-L-리보-LNA 피리미딘 및 퓨린 뉴클레오사이드 합성에 유용한 뉴클레오사이드 유도체를 제공할 수 있다.

바람직한 일례에서, 실시예 15, 16 및 17(도 4)에 기재된 방법을 사용하여 퓨린 α-L-리보-LNA 모노머, 예를 들면, 아데닌 또는 구아닌 유도체를 제조할 수 있다. 따라서, 당 3을 N-6-벤조일아데닌과 커플링하여 뉴클레오사이드 13을 수득하고, 이를 선택적으로 탈아세틸화하고 순차적으로 2'-O-트리플루오로메탄설포닐 유도체로 전환시켰다. 포타슘 아세테이트로 동시에 반응시켜 C2'에 반전을 갖는 2'-O-아세틸 유도체 14를 수득하였다. 탈아실화 종결 후 아데닌 부위를 재보호하고, 처음 두개의 하이드록시 그룹을 선택적으로 메실화하고 물:디옥산중에서 수산화나트륨으로 처리하여 α-L-리보-LNA 아데닌 뉴클레오사이드를 수득하였다. 뉴클레오사이드 15으 DMT-보호 후 탈벤질화하고 3'-O-포스포닐화하는 것은 포스포르아미디트 16을 수득하기 위한 하나의 가능한 방법이다(Koshkin, A.A. Singh, S.K. Nielsen, P., Rajwanshi, V.K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C.E., Wengel, J. Tetrahedron 1998, 54, 3607). 15의 탈벤질화후 처음 하이드록시 그룹의 선택적인 DMA-보호및 3'-O-포스피틸화는 포스포르아미디트 16을 수득하기 위한 또다른 방법이다.

α-L-리보-LNA 푸린 뉴클레오사이드의 합성을 위해 상기 기재된 모든 방법및 과정을 α-L-리보-LNA 피리미딘 뉴클레오사이드의 합성을 위한 치환 방법으로 사용하였다.

α-L-리보-LNA 피리미딘 및 푸린 뉴클레오사이드의 합성을 위해 사용되는 방법이 일반적으로 α-L-리보-LNA 뉴클레오사이드의 2'-아미도 및 2'-티오 유도체의 합성에 유용한 방법을 가져온다. 한 일례로서, β형의 푸라노즈 환에 위치하는 2'-아미도 또는 2'-티오 그룹을 적절하게 활성화된 5'-OH 그룹상에 어택트(attack)하여 폐환화함으로써 2'-아미도 또는 2'-티오 α-L-리보-LNA 피리미딘 또는 퓨린 뉴클레오사이드를 제공하여야 한다. 또한, β형의 푸라노즈 환에 위치하는 5'-아미도 또는 5'-티오 그룹을 적절하게 활성화된 5'-OH 그룹상에 어택트하여 폐환화함으로써 5'-아미도 또는 5'-티오 α-L-리보-LNA 피리미딘 또는 퓨린 뉴클레오사이드를 제공하여야 한다. 또다른 방법으로서, 아미노 또는 친핵성 물질(예: 각각 벤질아민 및 포타슘 티오아세테이드)를 사용하여 적절히 활성화되고, 보호된 배위 유도체, 예를 들면, 2'-O,5'-디메실, 2'-O,5'-디토실, 또는 2'-O,5'-디트리플루오로메탄설포닐 뉴클레오사이드를 폐환화하여 α-L-리보-LNA 뉴클레오사이드의 2'-아미도 및 2'-티오 유도체를 제공하여야 한다. 또한, β형의 푸라노즈 환에 위치하는 5'-OH 그룹을 α형의 푸라노즈 환에 위치하는 적절하게 활성화된 2'-OH 그룹상에 어택트하여 α-L-리보-LNA 피리미딘 또는 퓨린 뉴클레오사이드를 제공하여야 한다.

α-L-리보-LNA 피리미딘 뉴클레오사이드의 올리고머화에 사용된 방법을 α-L-리보-LNA 퓨린 뉴클레오사이드을 위한 방법으로 연속하여 사용할 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 올리고뉴클레오타이드 및 유사체의 합성을 위한 공지된 자동화된방법 또는 용액상 방법, 예를 들면, 포스포르트리에스테르 방법, H-포스포테이트 방법 또는 α-L-리보-LNA 피리미딘 뉴클레오사이드의 올리고머화에 사용되는 포스포르아미디트 방법의 변형법을 사용할 수 있다.

올리고머의 제조

본 발명의 직쇄-, 측쇄(M, Grotli and B. S. Sproat, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1995, 495; R.H.E. Hudson and M.J. Damha, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 2119: M. Von Bueren, G. V. Petersen, K. Rasmussen, G. Bradenburg, J. Wengel and F. Kirpekar, Tetrahedron, 1995, 51, 8491) 및 환형-(G. Prakash and E.T. Kool, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 3523) 올리고- 및 폴리뉴클레오타이드가 유기 화학 분야에 숙련된자에게 잘 알려진 핵산 화학의 중합화 기술을 사용하여 제조될 수있다. 포스포르아미디트 화학(S. L. Beaucage and R.P. lyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S.L. Beaucage and R.P. lyer, Tetraheron, 1992, 48, 2223)을 사용하였으나, H-포스페이트 화학, 포스포트리에스테르 화학 또는 효소 합성이 또한 사용될 수 있다. 포스포르아미디트 접근 경우 표준 연결 조건은 올리고뉴클레오타이드 합성동안 뉴클레오사이드 포스포르아미디트를 활성화하기 위한 교효율제로서 1H-테트라졸대신에 피리딘 하이드로클로라이드사용하여 약간 변형시키고, 연결시간은 10 내지 30분이었다.

원하는 서열의 합성후, 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단(고체 지지체로부터 절단하고, 실온에서 12시간동안 메탄올중에서 진한 암모니아를 사용하여 보호 그룹을 제거하며, 이어서 시판되는 일회성 카트리지(이는 탈트리틸화 포함)를 사용하여 역상 정제)하여 최종 올리고머 산물을 수득하였다. 다르게는, L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드 정제는 1회성 역상 HPLC를 사용하고/하거나, 에탄올 또는 부탄올로부터 침전시켜 수행될 수 있다. 캐필러리 겔 전기영동을 순도 및 합성된 올리고뉴클레오타이드 유사체의 조성을 입증하기 위하여 사용하였다. 그러나, 순도 및 조성은 역상 HPLC 및 MALDI-MS를 사용하여 입증할 수 있다.

일반적으로, 본 발명은 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 제조를 위한 본 명세서에 정의된 L-리보-LNA의 용도를 제공한다. L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 정상적인 뉴클레오타이드(즉, 천연적 뉴클레오사이드, 예를 들어 리보뉴클레오사이드 및/또는 데옥시뉴클레오사이드) 및 일반식 II로 정의된 것과 상이한 변형된 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다.

또한, 그에 고정화된 임의의 뉴클레오염기 보호되고 임의로 5'-OH 보호된 LNA를 갖는 고체 지지체 물질이 LNA 모노머가 3' 말단에 포함되어 있는 LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 합성을 물질로서 특히 흥미롭다. 이 경우에, 고체 지지체 물질은 바람직하게는 CPG, 예를 들어 쉽게(상업적으로) 이용될 수 있는 CPG 물질이고, 여기에, 3'-작용화되고, 임의의 뉴클레오염기 보호되며, 임의로 5'-OH 보호된 LNA가 이 특별한 물질에 대해 공급자가 언급한 조건을 사용하여 연결된다. 예를 들어 BioGenex Universial CPG 지지체(BioGenex, U.S.A)가 예를 들어 사용될 수 있다. 5'-OH 보호 그룹은 예를 들어 DMT 그룹일 수 있다. 3'-작용성 그룹은 문제의 CPG 물질에 적용될 수 있는 조건과 관련하여 선택되어야 한다.

적용

본 발명은 L-리보-LNA 유도체가 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드에 혼입됐을 때, 비변형된 올리고뉴클레오타이드에 비교해서 상보적인 DNA 및 RNA에 대해 이들 변형된 올리고뉴클레오타이드의 친화성을 감소시킨다는 놀라운 밝힘을 개시하고 있다. 그러나, 완전히 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드에 혼입되었을 때, 상보성 ssDNA 및 ssRNA 경우 혼성화 성질에서 극적인 증가가 관찰되었다. 기재된 특성외에도 L-리보-LNA-L-리보-LNAs의 특이 변이체-는 혼성화시 RNA 및 DNA 표적을 식별할 수 있는 능력을 갖는다. 따라서, 적용에 따라 완전히 변형된 L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드의 사용은 특이성을 손상시키지 않고(일정한 크기의 올리고뉴클레오타이드) 표준 올리고뉴클레오타이드의 친화성을 크게 증가시키거나 친화성을 손상시키지(올리고뉴클레오타이드의 크기에 있어서의 감소)않고, 특이성을 상당히 증가시키거나 특이적으로 RNA 표적에 혼성화하는 흥미를 자아내는 가능성을 제공한다.

또한 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 크게 증가된 혼성화 성질이외에 정상적 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드의 많은 유용한 물리화학적 성질을 나타낸다고 믿어진다. 전망은 우수한 용해도, 비변형된 올리고뉴클레오타이드를 닮은 염화 나트륨 및 테트라메틸암모늄 클로라이드와 같은 염에 대한 LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 반응, 다양한 폴리머라제용 프라이머로서 작용하는 LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 능력, 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용한 표적 증폭 반응에서 프라이머로서 작용하는 LNA 변형된 뉴클레오타이드의 능력, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제용 기질로서 작용하는 LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 능력,스트렙타비딘 코팅된 고체 표면상에 서열 특이적으로 PCR 앰플리콘을 포획하는 비오티닐화 LNA의 능력, 앰플리콘을 서열 특이적으로 포획하는 고정화된 LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 능력 및 매우 중요한 것으로 스트랜드 침입에 의해 서열 특이적으로 더블 스트랜드 DNA를 표적화하는 LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 능력을 포함한다. 그러므로, 본 분야에 숙련된자에게는 신규의 뉴클레오사이드 유사체가 치료, 진단 및 분자 생물학에서 올리고뉴클레오타이드 기초한 기술의 일반적인 성능을 개선시키는 매우 유용한 도구인 것이 명백하다.

본 발명의 목적은 올리고뉴클레오타이드 합성의 분야에 숙련된자에게 잘 알려진 과정 및 장치를 사용하여 올리고뉴클레오타이드에 혼입될 수 있는 본 발명에 따른 모노머 L-리보-LAN를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 비변형된 올리고뉴클레오타이드에 의해 형성된 상응하는 복합체보다 실질적으로 고친화성의 이중나선 또는 삼중나선을 형성하는 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 서열 특이적 방법으로 혼성화할 수 있는 완전히 또는 부분적으로 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 친화성을 손상시키지 않고 올리고뉴클레오타이드의 향상된 특이성을 얻기 위하여 완전히 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 L-리보-LNAs, 정상적인 뉴클레오사이드 및 다른 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 완전히 또는 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 "스트랜드 치환"에 의해 dsDNA 분자에서 표적 서열에 결합할 수 있는 높은 친화성을 갖는 완전히 변형된 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위하여 고친화성의 L-리보-LNAs를 이용하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 올리고뉴클레오타이드에 혼입될 때 상보적인 뉴클레오사이드에 대해 친화성에서 상이한 L-리보-LNAs의 상이한 부류를 제공하는 것이다. 이는 예를 들어 정상적인 뉴클레오염기 G, A, T, C 및 U를 예를 들어 변형된 수소 결합 가능성을 갖는 유도체로 치환하여 달성될 수 있다.

본 발명의 또다른 목적은 비변형된 카운터파트보다 뉴클레아제에 보다 내성인 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 혼성화시 DNA 및 RNA 표적을 식별할 수 있는 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. T_m측정 결과 놀랍게도 상보적인 RNA 올리고뉴클렐오타이드에 대한 α-L-리보-LNA의 T_m은 상보적인 DNA 대한 매 변형당 단지 2.7℃ 증가한 것과 비교하여 매 변형당 5.7℃이 증가되었음이 관찰되었다(실시에 11, 표 3 참조). 따라서, α-L-리보-LNA는 α-L-리보-LNA이 동일한 염기 서열을 갖는 DNA와는 혼성화되지 않고 주어진 RNA에만 특이적으로 혼성화될 수 있는 조건을 만들면서 DNA와 비교하여 RNA에 대한 친화성을 증가시킬 것이다. DNA 및 RNA 표적을 식별할 수 있는 능력은 하기 기재되는 다수의 상황에서 사용될 수 있다.

본 발명의 또다른 목적은 RNAseH를 강화시킬 수 있는 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 DNA 및 RNA 폴리머라제에 대한 기질로서 작용할 수 있는 L-리보-LNAs를 제공하여 유사체가 성장하는 핵산쇄에 혼입되거나 쇄 종결자로서 작용하게 한다.

본 발명의 추가의 목적은 치료제로서 작용할 수 있는 L-리보-LNA를 제공하는 것이다. 많은 예의 치료 뉴클레오사이드 유도체가 공지되어 있고, 본 명세서에 개시된 뉴클레오사이드 유사체의 유사한 유도체가 문헌(E. De Clercq, J. Med. Chem. 1995, 38, 2491: P. Herdewijn and E. De Clercq: Classical Antiviral Agents and Design of New Antiviral Agents and Design of New Antiviral Agents. In: A Textbook of Drug Design and Development; Eds. P. Krogsgaard-Larsen, T. Lijefors and U. Madsen; Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1996, p.425; I. K. Larsen: Anticanser Agents. In: A Textbook of Drug Design and Developments; Eds. P. Krogsgaard-Larsen, T. Lijefors and U. Madsen; Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1996, p. 460)으로부터 알려진 과정을 사용하여 합성될 수 있다.

더블-스트랜드 RNA는 항-바이러스 활성 및 종양 억제 활성을 갖는 것으로 나타났다(Sharp et al., Eur. J. Biochem. 1995, 230(1): 97-103, Lengyel-P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1993, 90(13):5893-5, and Laurent-Crawford et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1992, 8(2):285-90). 더블 스트랜드 LNA는 치료적으로 활성인 더블 스트랜드 RNA의 효과를 닮았고, 따라서 이러한 더블 스트랜드 LNA는 치료 약제로서 잠재성을 갖을 것 같다.

본 명세서에서 사용될 때, 용어 "천연 핵산"은 가장 넓은 의미에서 예를 들어 어떤 기원의 완전한 세포 또는 바이러스에 존재하는 핵산 또는 화학적 또는 물리적 수단에 의해 이러한 공급원으로부터 방출된 핵산 또는 증폭에 의해 이러한 1차 공급원으로부터 유래된 핵산과 같은 핵산을 의미한다. 천연 핵산은 싱글, 더블 또는 부분적으로 더블 스트랜드일 수 있고, 비교적 순수한 종 또는 상이한 핵산의 혼합물일 수 있다. 이는 또한 다른 핵산 및 다른 세포 성분을 포함하는 조 생물학적 샘플의 성분일 수 있다. 다른 한편, 용어 "합성 핵산"은 화학적 합성에 의해 제조된 핵산을 언급한다.

본 발명은 또한 핵산에 기초한 치료, 진단 및 분자 생물학에서 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다. L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 천연 또는 합성 핵산의 검출, 동정, 포획, 특성화, 정량화 및 단편화에서 사용될 수 있고, 생체내 및 시험관내 트랜스레이션(translation) 및 전사에서 블로킹제로서 사용될 수 있다. 많은 경우에, 다양한 분자를 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 것이 흥미롭다. 이러한 분자는 올리고뉴클레오타이드의 말단에 부착될 수있거나 하나이상의 내부 위치에 부착될 수 있다. 다르게는, 이들은 5' 또는 3' 말단에 부착된 스페이서를 통해 올리고뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 이러한 분자의 대표적인 그룹은 DNA 삽입물, 광화학적으로 활성인 그룹, 열화학적으로 활성인 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드이다.일반적으로, 비변형된 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드를 이들 분자로 표지화하는 모든 방법은 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 표지화하는데에 사용될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오타이드를 검출하는데에 사용되는 모든 방법은 일반적으로 상응하는 표지된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드에 적용된다.

따라서, L-리보-LAN 변형된 올리고뉴크레오타이드를 세포를 표지되지 않은 세포로부터 식별 또는 분리할 수 있는 세포 표지용으로 사용할 수 있다.

치료

용어 "스트랜드 치환"는 상기 표적 스트랜드로부터 다른 스트랜드를 치환하기 위하여 올리고뉴클레오타이드가 더블 스트랜드 DNA 또는 RNA에서 상보적인 표적 서열에 결합하는 과정에 관한 것이다.

본 발명의 한 면에서, "스트랜드 치환"를 수행할 수 있는 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드가 "항유전자" 접근에 기초한 신규의 약제학적 약제를 개발하는데에 이용된다. 삼중나선을 만들 수 있는 올리고뉴클레오타이드와 대조적으로, "스트랜드 치환" 올리고뉴클레오타이드는 dsDNA에서의 어느 서열이 생리학적 이온 강도 및 pH에서 표적화될 수 있게 한다.

"스트랜드 치환" 올리고뉴클레오타이드는 또한 RNA표적 서열이 분자내 수소 결합에 기인하여 접근할 수 없는 경우에 안티센스 접근에서 유리하게 사용될 수있다. 이러한 분자내 구조는 mRNA에서 일어날 수있고, 안티센스 접근에 의해 mRNA의 트랜스레이션을 "셧 다운(Shut down)" 시키려고 시도할 때 중대한 문제를 일으킬 수 있다.

예를 들어 tRNA, rRNA, snRNA 및 scRNA와 같은 세포 RNA의 다른 부류는 그들의 기능에 중요한 분자내 구조를 포함한다. 이들 부류의 고도로 구조화된 RNA는 단백질을 코딩하지 않고, (RNA/단백질 입자 형태로) mRNA 스플라이싱, 폴리아데닐화, 트랜스레이션, 편집, 유지 또는 염색체 말단 일체성의 유지와 같은 세포기능의 범위에 참가한다. 정상적 올리고뉴클레오타이드가 효율적으로 혼성화하는 것을 손상시키거나 방지하는 고도의 구조에 기인하여, 이들 부류의 RNA는 지금까지 안티센스 표적으로서 사용하는 것은 어려웠다. 그러나, 하기 기재되는 바와 같이 본 발명의 α-L-리보-LNA의 신규하고 놀라운 결과로 이들 RNAs를 α-L-리보-LNA로 표적화하는 것이 가능하다.

다수의 항생체가 박테리아의 리보좀과 상호작용하여 트랜스레이션 (translation)을 억제한다고 공지되어 있다. 일부의 항생제(예: 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 스펙티노마이신, 에데인, 하이그로마이신 및 네오마이신)은 박테리아의 16S rRNA중 특정 부위에 결합한다고 공지되어 있다(Moazed D and Noller HF,NATURE,1987, 327(6121), 389). 유사하게, 다른 항생제(예: 클로르암페니콜, 에리트로마이신, 카보마이신 및 베르나마이신 B)는 박테리아의 23S rRNA중 특정 부위와 상호작용을 한다(Moazed D and Noller HF,Biochimie,1987, 69(8), 879). 또한, 더욱 고등생물에서도 유사하게 설명될 수 있을 것이다(Spangler EA and Blackbun EH,J. Biol.Chem. 1985, 260(10), 6334).

또한, 리보좀 RNA에서 작용성의 접근가능한 위치에 표적되는 PNAs-PNAs(펩티드 핵산)는 다소 증가된 열안정성(Tm)으로 와슨-크릭 염기쌍 패션으로 DNA와 특이적으로 상호작용하는 분자-는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 트랜스레이션을 억제할 수 있다고 공지되어 있고(Good L and Nielsen PE,Proc Natl Acad Sci U.S.A., 1998, 95(5), 2073), 이것은 rRNA의 특정 위치에 결합하는 높은 친화성의 올리고뉴클레오타이드가 rRNA 결합 항생제의 작용을 모방할 수 있다는 것을 암시한다. LNA가 PNAs보다 더욱 높은 Tm으로 RNA에 결합하기 때문에, 특이적으로 박테리아성 rRNA에 결합하고 박테리아에서 트랜스레이션을 억제하는 LNAs를 제작할 있다. 본 발명의 연장으로서, 고등생물사이에서 rRNA 서열중의 작지만 현저한 차이를 사용하여 하나에서는 트랜스레이션을 억제할 수 있지만, 나머지 하나에서는 억제할 수 없는 LNA-올리고를 제작할 수 있을 것이다. 본 발명의 분명한 적용은 플라스모디움 spp.(Plasmodium spp.(말라리아 기생충), 스키스토소마 spp.(Schistosoma spp.(빌하르츠 주혈 흡충병(Bilgarzia) 유발), 다양한 필라리아(상피병 및 하천실명 유발), 구충(빈혈 유발), 다른 병원성 기생충에서 특이적으로 트랜스레이션을 특이적으로 억제하는 LNAs를 개발하는 것이다.

친화성이 높은 L-리보-LNA 모노머의 사용은 이러한 표적 RNA에 효과적으로 혼성화하기에 충분한 열안정성을 갖는 안티센스 탐침의 제작을 용이하게 하여야 한다. 그러므로, 바람직한 구체예에서, L-리보-LNA는 올리고뉴클레오타이드에 충분한 친화성을 부여하여 올리고뉴클레오타이드가 이들 RNA 부류에 혼성화할 수 있게 하여 RNA가 발견되는 입자의 질적 및/또는 양적 기능을 조절하는데에 사용된다.

안티센스 치료법에서 사용하고자 하는 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 고 친화성 및 RNAseH를 보강하는 능력의 이중 목적으로 제작된다. 이는예를 들어 비변형된 중앙 DNA 세그먼트에 인접하는 L-리보-LNA 단편을 가짐에 의해 달성될 수 있다. 또한, α-L-리보-LNA는 RNA를 더욱 선호하기 때문에, RNA 및 DNA 사이를 식별할 수 있는 α-L-리보-LNA의 특별한 능력을 다양한 일반 치료에서 안티센스로 적용할 수 있다. 관심의 대상이 되는 RNA에 특이적인 α-L-리보-LNA를 제작하여 표적 RNA와 유사한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 단편과의 비특정 결합을 피함으로써, DNA 구조를 변화시켜 해당 유전자에서 돌연변이를 유도시킬 수 있는 α-L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드의 염색체 DNA에 대한 안정적인 결합을 막을 수 있다. DNA 구조상의 변화 및 연관된 돌연변이가 원치않는 독성 부작용을 발생시킬 수 있다.

그러나 본 발명의 또다른 일면은 증가된 특이성을 갖는 리보자임(ribozyme)은 RNAse 촉매 활성과 상보적인 RNA 표적과 특이적으로 상호작용하는 능력을 조합시킨 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 및 그의 유사체이다. 이는 치료 분자로서 많은 관심의 대상이 되어왔고 α-L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드 관심의 대상이 되는 특성을 사용하여 특정 RNAs로 향하는 리보자임의 제작을 개선시킬 수 있다.

그러나, 본 발명의 또다른 일면은 활성 단백질의 통합된 필수 성분으로서 RNA를 포함하는 세포성 뉴클레오단백질, 이의 두가지 예인 리보좀 및 텔로머라아제와 특이적으로 상호작용하는 α-L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드이다. 텔로머라아제를 억제시키는 α-L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드 능력이 중요한 발명으로서 적용될 수 있다.

고등 진핵생물(인간 포함)의 염색체는 선형이다. 염색체의 말단의 1차구조(DNA 서열)가 밝혀졌고 모든 염색체 말단의 DNA 서열-특히 유기체에서-은 팽윤형태의 싱글-스트랜드 말단을 포함하는 단순 반복 유니트로 구성되어 있다고 판명되었다. 염색체 말단은 텔로머(telomere)로 명명된다. 인간에서 텔로머는 서열 5'-TTAGGG-3'(하나의 스트랜드의 서열, 중심체로부터 염색체 말단 방향으로)의 다중 반복된 긴 스트레치의 더블 스트랜드를 포함한다. 모든 DNA 폴리머라아제는 상보적인 DNA 스트랜드의 합성을 개시하기 위하여 주형 스트랜드 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머 둘 모두를 필요로하기 때문에, DNA 폴리머라아제는 단독으로 염색체의 가장 말단을 복제시킬 수 없다. 이로 인하여 염색체 복제시 염색체의 길이는 계속적으로 짧아지게 될 것이다. 정상 체세포에서 텔로머의 길이과 관련하여, 텔로머는 길이가 단지 5-15kb가 될 때까지 실제로 각 복제주기동안 점점 짧아지는 것처럼 보인다. 텔로머가 그 길이일 때, 세포는 정상적으로 분열은 멈추고 서서히 노화 단계에 접어든다. 단지 줄기세포(stem cell)는 예외적이다. 줄기 세포는 유기체가 살아있는동안 계속적으로 분열할 수 있는 분화된 세포이다. 흥미롭게도 줄기 세포의 텔로머는 계속적으로 길게(10-15kb) 유지된다. 이는 특정 효소, 텔로머라아제의 활성 때문이다. 텔로머라아제는 텔로머의 팽윤형의 싱글-스트랜드 말단을 특이적으로 신장시켜 텔로머가 안정적으로 길게 유지될 수 있게 하는 독특한 효소이다. 텔로머라아제는 리보뉴클레오단백질 효소, 즉 RNA를 포함하고 그의 효소 활성을 위해 RNA에 의존하는 단백질이다. 텔로머라아제의 구조는 다소 주형으로서 RNA를 사용하여 DNA를 합성할 수 있는 바이러스성 단백질 역전사 효소와 유사하다.

텔로머라아제의 효소적 능력은 텔로머를 신장시키기 위한 RNA 분자상에 유리텔로머 3' 말단의 정확한 위치화에 따라 달라진다. 텔로머의 가장 말단 또는 텔로머라아제의 RNA 성분과 특이적으로 상호작용할 수 있는 분자가 효소를 억제할 것이다. α-L-리보-LNA는 이 요건을 충족시키기 위해 제작될 수 있다. 그들 대부분이 용이하게 검출가능한 텔로머라아제 활성을 포함하는 암세포와는 상당히 대조적으로 줄기 세포를 제외한 정상의 체세포는 검출가능한 텔로머라아제 활성을 포함하지 않기 때문에 이는 예를 들면 암 치료법에서 관심의 대상이 될 것이다. 암세포는 불멸즉, 노화되지 않고 유기체가 죽을 때까지 계속적으로 증식하고 종양 덩어리를 형성한다. 현재까지의 모든 증거에 따르면 텔로머라아제의 활성이 암세포의 불멸화에 필수적이라고 제시되었다. 흥미롭게도, 암세포의 텔로머는 실질적으로 줄기세포의 텔로머보다 짧으며, 이는 암세포가 줄기세포보다 초기에 "텔로머 길이 막(telomere length barrier)"에 부딪쳤음을 암시하고 텔로머라아제 활성을 특이적으로 억제하는 약물이 항암제로서 유용하다는 것을 제시한다.

이와 관련하여, 인간 암세포의 텔로머라아제 활성을 억제시키기 위한 목적으로 α-L-리보-LNA의 특이한 특성을 사용하여 특정 부분의 텔로머라아제 RNA 성분으로 향하는 단쇄의 α-L-리보-LNA-올리고머를 제작하는 것이 중요한 문제가 될 것이다.

본 발명의 또다른 일면은 아프타머(aptamer)로서 L-리보-LNA-올리고뉴클레오타이드, 특히 α-L-리보-LNA-올리고뉴클레오타이드의 용도이다. 높은 친화성으로 주어진 표적, 예를 들면, 리간드 수용체에 특이적으로 결합하는 이 장래성이 있는 신규한 부류의 치료적 올리고뉴클레오타이드를 시험관내에서 선별한다. 결합 특성은 분자내 뉴클레오염기 쌍에 의해 3차 구조를 형성하는 올리고뉴클레오타이드의 능력에 반영된다. α-L-리보-LNA-올리고뉴클레오타이드를 포함하는 아프타머는 치료 목적을 위해 사용될 수 있는 유리한 특성을 나타낼 수 있다.

일부 경우에, 유전자의 발현을 하향-조절하는 것이 유리할 수 있고, 다른 경우에 그를 활성화하는 것이 유리할 수 있다. Mollegaard등(Mollegaard, N. E.; Buchardt, O.; Egholm; M.; Nielsen, P.E. proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994, 91, 3892)에 의해 나타난 바와 같이, "스트랜드 치환"할 수 있는 올리고머는 RNA 전사 활성화제로 작용할 수 있다. 본 발명의 한 면에서, "스트랜드 치환"할 수 있는 LNA는 치료적으로 관심 사항인 유전자를 활성화시키는데에 사용된다.

다수의 바이러스 감염 및 암의 화학요법에서, 다양한 형태의 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체가 효능이 있다고 입증되었다. L-리보-LNA 뉴클레오사이드는 잠재적으로 그러한 뉴클레오사이드 기초 약물로서 유용하다.

다수의 경우에서, 더블-스트랜드 RNA(DS-DNA)가 특이적인 약물학적 활성을 갖는다고 보고되었다. 전체적으로 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(들)을 포함하는 이중나선은 잠재적으로 그러한 더블-스트랜드 약물로서 유용하고 더블-스트랜드 α-L-리보-LNA 올리고뉴클레타이드가 생물학적으로 활성인 더블-스트랜드 RNA성 분자의 레파토리에 중요한 분자로서 첨가될 수 있다.

그러므로, 더블-스트랜드 LNA(DS-LNA)의 치료적 잠재능은 하기 설명되는 바와 같이, 암 또는 바이러스성 감염의 치료에 있다.

단독 또는 인터레론 감마와 함께 다양한 유형의 DS-RNAs가 몇몇 유형의 암세포의 성장을 억제한다고 보고되었다(Borecky et al.,Tex Rep Biol Med,1981, 41, 576: Sharp et al.,Eur J Biochem, 1995, 230(10), 97). DS-RNAs는 시험 동물의 배양액 및 종양에서 암세포의 성장을 억제한다. 적어도 두 개의 더블-스트랜드 RNA-활성화가능 효소, 더블-스트랜드 RNA-활성화가능 단백질 키나아제(PKR) 및 리보뉴클레아제 L이 DS-RNA의 종양-억제 활성에 포함되는 것처럼 보인다(Lengyel-P,Proc. Natl.Acad. Sci USA, 1993, 90(13), 5893). PKR은 DS-RAN에 의해 직접 활성화되지만, RNase L은 DS-RAN에 의해 활성화되지 않는 경우 잠복성인 (2'-5')올리고아데닐레이트 신타아제를 매개로 하여 DS-RNA에 의해 활성화된다. DS-RNA는 또한 자연살(NK) 세포 활성을 유도하고 이 활성에 의해 DS-RNA는 항-종양 활성을 초래한다.

천연의 DS-RNA는 전형적으로 바이러스 감염과 연관되지만, DS-RNA는 또한 항-바이러스성 활성을 갖는다고 입증되었다. DS-RNA는 인간 면역결핍 바이러스 HIV-1 및 HIV-2에 대하여 항바이러스성 활성이 입증되었다(Haines et al.,J Cell Biochem, 1991, 46(1), 9). 그러므로, AIDS 치료시 DS-RNA 및 DS-LNA는 치료 약물로서 잠재적인 캔디데이트이다.

그러나, DS-RNA는 실제로 그의 치료적 효능은 입증되어야 한다. 그러나, 포유류 세포는 다수의 DS-RNA 특이 뉴클레이즈를 포함하고 이들 활성 때문에 DS-RNA는 환자로부터 신속하게 제거된다. LNA는 RNA와 상당히 유사하고 RNA 대부분의 화학적 특성을 공유한다(Koshkin et al.,Tetrahedron, 1998, 54, 3607). LNA는 안정한 이중나선을 형성하고 RNA로부터 LNA로의 구조 변화는 미묘하다. 따라서, 적절한더블-스트랜드 LNAs는 특정 DS-RNAs의 작용을 모방할 수 있고 따라서 PKR 및/또는 (2'-5')올리고뉴클레오타이드 신타아제를 활성화시킬 수 있으며 LNA는 엑소뉴클레오성(exonucleolytic) 안정성을 나타내기 때문에(Singh et al.,Chem. Commun., 1998, 455) DS-LNA 분자는 DS-RNA와 관련하여 개선된 치료적 효능을 나타낼 수 있다.

본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 상기 정의된 바와 같은 약제학적으로 활성인 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적으로 활성인 L-리보-LNA 모노머를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

이러한 조성물은 경구, 비경구(정맥내, 복강내), 근육내, 직장, 비강내, 피부, 질, 구강, 눈 또는 폐 투여에 적합화된 형태, 바람직하게는 경구 투여에 적합화된 형태일 수 있고, 이러한 조성물은 예를 들어 일반적으로 "Remington's Pharmaceutical Science", 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 및 보다 최근의 간행물 및 in the monographs in "Drugs and the Pharmaceutical Sciences" series, Marcel Dekker 에 일반적으로 개시된 바와 같이 본 분야에 숙련된 자에게 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다.

진단

과잉의 가능한 돌연변이의 존재 경우 표적 핵산의 동시적인 분석을 위하여 상이한 올리고뉴클레오타이드의 패널을 이용하는 수개의 진단 및 분자 생물학 과정이 개발되어 왔다. 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드 패널은 표적 핵산중의 특별한 돌연변이의 존재가 그것이 혼성화 하는 고체 지지체상의 존재에 의해 밝혀질 수 있도록 고체 지지체상에 예정된 패턴으로 고정화되어 있다. 핵산의 분석에서 상이한 올리고뉴클레오타이드의 패널의 성공적인 사용에 대한 하나의 중요한 예비조건은 이들이 단일 적용된 혼성화 조건하에서 그들이 특별한 표적 서열에 모두 특이적이라는 것이다. 상보적인 표적 서열에 대해 표준 올리고뉴클레오타이드의 친화성 및 특이성이 그들의 서열 및 크기에 대해 심하게 의존하므로, 이 기준은 지금까지 만족시키는데에 어려웠다.

또한, 세포가 포함할 수 있는 다양한 유형의 RNA를 특징화하기 위하여 다수의 기술이 개발되었다. 특징화하는 공통된 접근 방식은 핵산 혼성화이고, 그러한 기술의 예는 하기와 같다: 동소혼성화, 도트 블랏 혼성화, 역도트 블랏 혼성화, 노던 혼성화, 및 역전사 중합효소 연쇄반응(rtPCR)이다. DNA 및 RNA 둘 모두를 포함하는 샘플상에서 이들 기술이 준비되었고, 분석에서 이러한 사실에 의해 DNA 및 RNA를 적절하게 식별할 수 있는 탐침이 존재하는 경우 용이하게 피할 수 있는 문제들이 빈번하게 발생한다. 이는 다양한 조직 표본상에서 수행된 동소혼성화에서 특히 문제시된다. RNA에 대하여 고도로 식별할 수 있는 혼성화 특성으로 샘플중 RNA와 특이적으로 혼성화할수 있도록 하여 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비관련된 DNAs와의 혼성화에 의해 발생하는오류의 가능성을 제거할 수 있도록 α-L-리보-LNA 올리고를 제작할 수 있다.

그러므로, 바람직한 구체예에서, L-리보-LNA는 탐침의 친화성 및/또는 특이성을 증가시키는 수단 및 상보적인 서열에 대해 상이한 올리고뉴크레오타이드의 친화성을 균일하게 하는 수단으로 사용된다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 이러한 친화성 모듈레이션은 예를 들면 올리고뉴클레오타이드중 선택된 뉴클레오사이드를 유사한 뉴클레오염기를 수반하는 L-리보-LNA로 치환하여 달성될 수 있다. 특히, 이는 α-L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드를 사용한다.

또다른 바람직한 구체예에서, L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 고도의 친화성 및 특이성이 천연 또는 합성 핵산의 서열 특이적 포획(capture) 및 정제에 이용된다. 한 면에서, 천연 또는 합성 뉴클레오타이드를 고체 표면상에 고정화된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드와 접촉시킨다. 이 경우에, 혼성화 및 포획이 동시에 일어난다. 포획된 핵산은 예를 들어 본 분야에서 잘 알려진 다양한 방법에 의해서 표면상에서 검출되고, 특성화되며, 정량화되거나 증폭될 수 있거나, 이는 고정화되고, 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 포획된 핵산을 탈혼성화 조건, 예를 들어 가열을 거치게하거나 저이온 강도의 완충액을 사용하여 특성화 또는 증폭화가 일어나기전에 표면으로부터 방출될 수 있다.

고체 지지체는 다양한 범위의 중합체 물질, 예를 들어 CPG(조절된 기공 유리), 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카바메이트 또는 폴리에틸렌으로부터 선택될 수 있고, 이는 다양한 형태, 예를 들어 튜브, 마이크로-역가 플레이트, 막대, 비드, 필터 등을 취할 수 있다. L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드의 고정화에 보통 이용되는 다양한 화학적 또는 광화학적 방법에 의해 또는 비-공유 결합 연결, 예를 들어 고정화된 스트렙타비딘에 비오티닐화 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 결합에 의해 5' 또는 3' 말단(또는 5' 또는3' 말단에 결합된 링커의 말단을 통해)을 통해 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 다른 고체 지지체상에 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 고정화시키기 위한 하나의 바람직한 방법은 (WO 96/31557)에 기술된 바와 같이 변형된 올리고뉴클레오타이드의 5'- 또는 3'-말단(임의로는 링커를 통해)에 공유결합된 광화학적으로 활성인 안트라퀴논을 사용하는 광화학적인 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 수반하는 표면을 제공한다.

또다른 면에서, L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 5'- 또는 3'-말단에 공유적으로 결합되는 리간드를 수반한다. 이 경우에, L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 용액중의 천연 또는 합성 핵산과 접촉시키고, 이후 형성된 혼성체를 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 수반하는 고체 지지체상에 포획시킨다.

또다른 면에서, "스트랜드 치환"를 수행할 수 있는 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 선행 변성없이 천연 및 합성 핵산을 포획하는데에 사용한다. 이러한 변형된 올리고뉴클레오타이드는 표적 서열이 안정한 분자내 구조의 빠른 형성에 기인하여 정상적 올리고뉴클레오타이드에 의해 접근하거나 불가능한 경우에 특히 유용하다. 이러한 구조를 포함하는 핵산의 예는 rRNA, tRNA, snRNA 및 scRNA이다.

또다른 바람직한 구체예에서, 고 특이성 목적으로 제작된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 핵산의 서열화에서 프라이머로서 및 PCR 반응과 같은 수개의 잘 알려진 증폭 반응에서 프라이머로서 사용된다. 본 명세서에 나타난 바와 같이, L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 제작은 이것이 지수 또는 선형 표적 증폭을 유지하는지를 결정한다. 증폭 반응의 생산물은 정상적인 DNA 프라이머로 생산된 증폭 산물의 분석에 적용될 수 있는 다양한 방법에 의해 분석될 수 있다. L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 선형 증폭을 유지하도록 제작된 특별한 경우에, 생성된 앰플리콘은 변성없이 상보적인 프라이머에 의해 표적화될 수 있는 싱글 스트랜드 말단을 수반한다. 이러한 말단은 예를 들어 고체 표면에 결합된 다른 상보적인 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드에 의해 앰플리콘을 포획하는데에 사용될 수 있다.

또다른 면에서, "스트랜드 치환"할 수 있는 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오 타이드는 선형 또는 지수 증폭 반응에서 프라이머로서 사용된다. 이러한 올리고머뉴클레오타이드의 사용은 증폭 반응의 후반 단계에서 앰플리콘 재혼성화와 효과적으로 경쟁하여 전체적인 앰플리콘 수율을 향상시킬 것으로 기대된다. Demers 등(Nucl. Acid Res. 1995, Vol 23, 3050-3055)은 PCR 반응의 전체적인 수율을 증가시키는 수단으로서 고-친화성, 비-연장성 올리고머의 사용을 개시하고 있다. 올리고머는 PCR 반응의 후반 단계에서 앰플리콘 재-혼성화를 방해하여 이들 효과를 유도해내는 것으로 믿어진다. 3' 말단에서 블로킹된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 동일한 잇점을 제공할 것으로 기대된다. 3' 말단의 블로킹은 예를 들어 3' 하이드록실 그룹을 수소 또는 포스페이트로 교환하는 것과 같은 수많은 방법으로 달성될 수 있다. 이러한 3' 블로킹된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 Yu등(Biotechniques, 1997, 23, 714-716)에 의해 기술된 것과 같은 유사한 방법으로 밀접히 관련된 핵산 서열을 선택적으로 증폭시키는데에 또한 사용될 수 있다.

최근에, 표적 증폭 반응에의해 생성된 앰플리콘의 예를 들어 실제-시간 검출에서 사용될 수 있는 신규의 탐침 부류가 발명되었다. 탐침의 이러한 부류의 하나는 "분자 비컨(Molecular Beacons)"이라고 명명되었다. 이들 탐침은 한말단에 플루오로포어를 포함하고 다른 말단에 퀀처 분자를 포함하는 부분적으로 반-상보성인 올리고뉴클레오타이드로서 합성된다. 용액에서 자유스러울 때, 탐침은 형광 신호를 소멸시키기에 플루우로포르에 충분히 가까이 퀀처를 위치시키는 헤어핀 구조(반-상보적인 영역에 의해 가이드됨)로 접힌다. 표적 핵산에 혼성화시, 헤어핀(hairpin)은 열려, 플루오로포어(fluorophor)와 퀀처를 분리하여 형광신호를 낸다.

또다른 부류의 탐침은 "태크만 탐침(Taqman probe)" 라고 명명된다. 이들 탐침은 또한 플루오로포어 및 퀀처 분자를 포함한다. 그러나, 분자 비컨과 대조적으로, 플루오로포어로부터 형광신호를 소멸시키는 퀀처능력은 탐침이 표적 서열에 혼성화한 후에도 유지된다. 대신에, 형광 시그날은 5' 에 위치한 프라이머로부터 태크만 탐침의 결합 부위로 합성을 개시하는 폴리머라제의 5' 엑소뉴클리아제 활성의 작용에 의해 탐침으로부터 퀀처 또는 플루오로포어를 물리적으로 분리시켜 혼성화한 후 발생된다.

표적 부위에 높은 친화성은 양 유형의 탐침에서 중요한 특징이고, 결과적으로, 이러한 탐침은 상당히 커진다(전형적으로 30 내지 40 머). 결과로서, 고품질의탐침의 생산에서 상당한 문제와 마주친다. 그러므로, 바람직한 구체예에서, LNA는 원하는 친화성을 유지하면서 크기를 감소시켜 태크만 탐침 및 분자 비컨의 생산과 추후 성능을 개선하는데에 사용된다.

또다른 면에서, L-리보-LNA는 새로운 친화성 쌍(완전히 또는 부분적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드)을 제작하는데에 사용된다. 친화성 상수는 넓은 범위에 걸쳐 쉽게 조정될 수 있고, 다수의 친화성 쌍이 제작되고, 합성될 수 있다. 친화성 쌍의 한 부분은 흥미로운 분자(예를 들어, 단백질, 앰플리콘, 효소, 폴리사카라이드, 항체, 햅텐, 펩타이드, PNA등)에 표준 방법에 의해 결합될 수 있고, 한편, 친화성 쌍의 다른 부분은 예를 들어 비드, 막, 마이크로-역가 플레이트, 막대, 튜브등과 같은 고체 지지체에 결합될 수 있다. 고체 지지체는 넓은 범위의 중합체 물질, 예를 들어 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌으로부터 선택될 수 있다. 친화성 쌍은 상기 언급된 표적 분자의 선택적 단리, 정제, 포획 및 다양성을 검출하는데에 사용될 수 있다.

또다른 상보적인 L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드(완전히 또는 부분적으로 변형됨)와의 상호작용에 의해 L-리보-LNA-표지된 분자를 포획하는 원리는 무한한 수의 신규의 친화성 쌍을 만드는데에 사용될 수 있다.

또다른 바람직한 구체예에서, L-리보-LNA 변형된 올리고사카라이드의 고치환성 및 특이성이 즉석 혼성화에서 유용한 탐침의 제조에서 이용된다. 예를 들어, L-리보-LNA는 원하는 친화성을 유지하면서, 이에 의해 탐침의 키네틱 및 샘플 표본을 침투하는 능력을 증가시키는 한편, 전통적인 DNA 탐침의 크기를 감소시키는데에 사용될 수 있다.

정제

본 발명의 또다른 일면은 RNA-특정 정제 방법에서 L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드, 특히 α-L-리보-LNA 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이다. 원핵생물, 진핵생물 또는 혼합된 생물학적 샘플로부터 핵산을 분리하기 위하여 통상적으로 사용되는 방법에서는 페놀 및 클로로포름과 같은 유기 용매가 사용된다. 핵산 분리는 전형적으로 프로테아제에 의해 수행되는 샘플의 효소 분해와 함께 시작되고 이것은 이온성 세제에 의해 세포 용균되며 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물에 의해 추출된다. 유기 및 수성상을 분리하고 수성상으로 분배된 핵산을 알콜을 사용하는 침전에 의해 회수한다. 그러나, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물은 인간 피부에 대하여 부식성이고 이것은 주의하여 취급되고 적절하게 폐기처분되어야 하는 위험한 폐기물로서 간주된다. 또한, 페놀/클로로포름을 사용하는 표준 추출법에 의해 RNA 및 DNA의 혼합물을 수득한다. 그러므로, RNA 및 DNA를 식별하는 α-L-리보-LNA의 능력을 사용하여 핵산 분리하여, 순수한 RNA의 샘플을 수득하는 것이 유리하다.

키트

본 발명은 또한 천연 또는 합성 핵산의 분리, 정제, 증폭, 검출, 동정, 정량화, 또는 포획하기 위한 키트를 제공하고, 여기에서, 키트는 반응 몸체 및 본 명세서에서 정의된 바와 같은 하나이상의 L-리보-LNA변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)를 포함한다. L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 상기 반응 몸체에 고정화된다.

본 발명은 또한 천연 또는 합성 핵산의 분리, 정제, 증폭, 검출, 동정, 정제, 또는 포획을 위한 키트를 제공하고, 여기에서, 키트는 반응 몸체 및 본 명세서에 정의된 하나이상의 L-리보-LNA를 포함한다. L-리보-LNA는 바람직하게는 상기 반응 몸체에 고정화된다(예를 들어, 상기 기술된 고정화 기술을 사용하여).

본 발명에 따른 키트 경우, 반응 몸체는 바람직하게는 보로실리케이트 유리, 소다-라임 유리, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌글리콜 테레프탈레이트, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐피롤리디논, 폴리메틸메타크릴레이트 및 폴리비닐클로라이드, 바람직하게는 폴리스티렌 및 폴리카보네이트로부터 선택된 고체 지지체 물질이다. 반응 몸체는 표본 튜브, 바이알, 슬라이드, 시트, 필름, 비드, 펠릿, 디스크, 플레이트, 링, 로드, 네트, 필터, 트레이, 마이크로역가 플레이트, 막대, 또는 다중-날(multi-bladed)의 막대의 형태일 수있다.

키트는 전형적으로 키트의 사용에 최적의 조건을 기술하는 지시 문구 시트가 수반된다.

실험

일반적

반응을 무수 용매를 사용할 때 질소 분위기하에서 수행하였다. 칼럼 크로마토그래피를 실리카 겔 60(0.040-0.063 mm)을 사용하여 유리 칼럼상에서 수행하였다. Na₂SO₄를 사용하여 유기상을 건조시킨후, 여과를 수행하였다. 60-80℃의 증류범위를 가진 석유 에테르를 사용하였다. 화학적 시프트 값 δ는 내부 참고로서 테트라메틸실란(¹H 및¹³C NMR) 및 85% H₃PO₄(³¹P NMR)에 대한 ppm 단위이다. 미세 분석을 The Microanalytical Laboratory, Department of Chemistry, University of Copenhagen에서 수행하였다.

하기 기술은 도 1-4 및 표 1-3을 수반한다.

L-리보-LNA 모노머의 제조

실시예 1

5-O-벤조일-4-C-벤조일옥시메틸-3-O-벤질-1,2-O-이소프로필리덴-α-D-글루코푸라노즈(2)

무수 피리딘(60cm³)중의 3-O-벤질-4-C-하이드록시메틸-1,2-이소프로필리덴-α-D-글루코푸라노즈(1)²⁶(25.0g, 0.096몰)의 교반된 얼음 냉각된 용액에 벤조일 클로라이드(4.1cm³, 0.035몰)를 첨가하였다. 실온에서 4시간동안 교반한후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, H₂O(50cm³)를 첨가하고, 혼합물을 디클로로메탄(100 cm³x3)으로 추출하였다. 유기상을 합하여 포화 탄산 수소 나트륨 수용액(30cm³x3) 및 염수(20cm³x3)로 세척하고, 건조시키며(Na₂SO₄), 감압하에서 증발 건조시켰다. 잔류물을 먼저 용리제로서 석유 에테르/디클로로메탄(1:1, v/v)를 사용하고, 이어서 디클로로메탄/메탄올(99:1, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 감압하에서 용매를 증발시킨후 황색 오일로서 푸라노즈 2(7.50 g, 90%)를 수득하였다.

실시예 2

5-O-벤조일-4-C-벤조일옥시메틸-3-O-벤질-1,2-디-O-아세틸-D-글루코푸라노즈(3)

80% 아세트산(60cm³)중의 푸라노즈 2(7.40g, 0.014 몰)의 용액을 90℃에서 9시간 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 증발 건조시키고, 잔류물을 톨루엔(10 cm³x3)과 함께 공증발시키고, 무수 피리딘(80cm³)중에서 용해시켰다. 무수 아세트산(5.5cm³)를 첨가하고, 용액을 실온에서 46시간동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 증발 건조시키고, 잔류물을 톨루엔(10cm³)과 함께 공증발시키며, 디클로로메탄(150 cm³)중에 용해시켰다. 용액을 포화 탄산 수소 나트륨 수용액(30 cm³) 및 염수(30cm³)으로 세척하고, 건조시키며(Na₂SO₄), 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 용리제로서 용리제로서 먼저 석유 에테르/디클로로메탄(1:1, v/v) 및 이어서 디클로로메탄/메탄올(99:1, v/v)사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 감압하에서 용매를 증발시킨후 맑은 오일로서 아노머 혼합물 3(α:β=3:1, 7.33g, 92%)을 수득하였다. 이 오일을 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.

실시예 3

1-(2-O-아세틸-5-O-벤조일-4-C-벤조일옥시메틸-3-O-벤질-β-D-크실로푸라노실)티민(4)

무수 아세토니트릴(80cm³)중의 아노머 혼합물 3(7.26g, 0.013몰) 및 티민(3.25g, 0.028몰)의 교반된 현탁액에 N,O-비스(트리메틸실릴) 아세트아미드(19.1cm³, 0.077 몰)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1시간동안 교반한후, 0℃로 냉각하였다. 트리메틸실릴 트리플레이트(4.1cm³, 0.023몰)를 10분동안 적가하고, 혼합물을 이어서 환류하에서 22시간동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨후, 포화 탄산 수소 나트륨 수용액(30cm³)을 첨가하고, 디클로로메탄(100cm³x3)을 사용하여 추출을 하였다. 유기상을 합하여, 포화 탄산 수소 나트륨(30cm³x3) 및 염수(50cm³x3)로 세척하고, 건조시키며(Na₂SO₄), 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 용리제로서 디클로로메탄/메탄올(0.5-2.0% 메탄올, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, 감압하에서 용매를 증발시킨후 백색 고체 물질로서 뉴클레오사이드 4(6.88g, 85%)를 수득하였다.

실시예 4

1-(3-O-벤질-4-C-하이드록시메틸-β-D-크실로푸라노실)티민(5)

메탄올(130cm³)중의 뉴클레오사이드 4(9.00g, 0.014몰)의 교반된 용액에 소듐 메톡사이드(3.87g, 0.0716몰)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반하고, 이어서 묽은 염산으로 중화시켰다. 혼합물을 감압하에서 증발 건조시키고, 톨루엔(15cm³x3)을 사용하여 공증발시켰다. 잔류물을 용리제로서 디클로로메탄/메탄올(4-15% 메탄올, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 감압하에서 용매를 증발시킨후 백색 고체 물질로서 뉴클레오사이드 트리올 5(4.82g, 89%)를 수득하였다.

실시예 5

1-(3-O-벤질-4-C-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-β-D-크실로푸라노실)티민(6)

무수 테트라하이드로푸란(400cm³)중의 뉴틀레오사이드 1-(3-O-벤질-4-C-하이드록시메틸-β-D-크실로푸라노실)티민(5)(5.38g, 14.2mmol)의 용액에 AgNO₃(2.66g, 15.7mmol) 이어서 무수 피리딘(5.7cm³) 및 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(5.30g, 15.6mmol)을 첨가하였다. 실온에서 18시간동안 질소하에 암실에서 혼합물을 교반하였다. 탄산수소나트륨 포화 수용액(10cm³)을 가하여 반응을 퀸칭시키고 생성된 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 혼합된 유기상을 감압하에 증발건조시키고 잔류물을 톨루엔으로 공-증발시키고 용리제로서 디클로로메탄/메탄올/피리딘(0.5% 메탄올; 0.5% 피리딘, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 감압하에서 용매의 증발시킨후 백색 기포로서 뉴클레오사이드 6(3.13g, 31%)을 수득하였다.

실시예 6

1-(3-O-벤질-4-C-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-2,5-디-O-(p-톨루엔설포닐)-β-D-크실로푸라노실)티민(7)

무수 피리딘(50cm³)중의 뉴틀레오사이드 6(2.79g, 3.9mmol)의 용액에 촉매량의 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘 및 p-톨루엔설포닐 클로라이드(6.50g, 34mmol)를 첨가하였다. 실온에서 24시간동안 질소하에 암실에서 혼합물을 교반하였다. 탄산수소나트륨 포화 수용액(100cm³)을 가하여 반응을 퀸칭시키고 생성된 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 혼합된 유기상을 탄산수소나트륨 포화 수용액(3x75cm³) 및 염화나트륨(2x75cm³)으로 세척하였다. 분리된 유기상을 건조(Na₂SO₄)시키고 감압하에 증발건조시켰다. 잔류물을 톨루엔으로 공-증발시키고 용리제로서 디클로로메탄/메탄올/피리딘(0.5% 메탄올; 0.5% 피리딘, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 용매를 증발시킨 후 황색 기포로서 뉴클레오사이드 7(2.40g, 62%)을 수득하였다.

실시예 7

(1R,3R,4S,7R)-7-벤질옥시-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(티민-1-일)-2,5-디옥사바이사이클로[2.2.1]헵탄(8)

에탄올 및 H₂O(1:1, v/v)의 혼합물중의 뉴틀레오사이드 7(3.87g, 3.92mmol)의 용액에 NaOH(2M, 8cm³)를 첨가하였다. 혼합물을 24시간동안 환류하에서 가열하고 냉각시킨 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 혼합된 유기상을 탄산수소나트륨 포화 수용액(2x75cm³)으로 세척하고 감압하에 증발건조시켰다. 잔류물을 용리제로서 디클로로메탄/메탄올/피리딘(0.5% 메탄올; 0.5% 피리딘, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 용매를 증발시킨 후 백색 기포로서 뉴클레오사이드 8(2.10g, 81%)을 수득하였다.

실시예 8

(1R,3R,4S,7R)-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-7-하이드록시-3-(티민-1-일)-2,5-디옥사바이사이클로[2.2.1]헵탄(9)

메탄올(30cm³)중의 뉴틀레오사이드 8(1.09g, 1.65mmol)의 용액에 암모늄 포름에이트(0.33g, 5.29mmol)를 첨가하였다. 메탄올(10cm³)중에 현탁된 촉매량의 Pd/c를 가하고 혼합물을 환류하에서 2시간동안 가열시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 감압하에서 증발건조시키고 잔류물을 용리제로서 디클로로메탄/메탄올/피리딘(2% 메탄올; 0.5% 피리딘, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 용매를 증발시킨 후 백색 고체 물질로서 뉴클레오사이드 9(0.76g, 80%)를 수득하였다.

실시예 9

(1R,3R,4S,7R)-7-(2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시)-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(티민-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄(10)

무수 디클로로메탄(4cm³)중의 뉴클레오사이드 9(420mg, 0.73mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민(0.4cm³) 및 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포르아미도클로라이디트(0.4cm³)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 18시간동안 질소하에 암실에서 교반하였다. 메탄올을 첨가하여 반응을 퀸칭시키고 혼합물을 에틸 아세테이트(10cm³)으로 희석시키고, 탄산수소나트륨 포화 수용액(3x10cm³) 및 염화나트륨(2x10cm³)으로 세척하고 감압하에 증발건조시켰다. 잔류물을 무수 아세토니트릴로 공증발시키고 용리제로서 페트롤륨 에테르/에틸 아세테이트/피리딘(30-40% 에틸 아세테이드; 0.2% 피리딘, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 오일을 수득하였다. 이 오일을 디클로로메탄(1cm³)중에 용해시키고 산물을 격렬하게 교반시키면서 -40℃에서 페트롤륨 에테르(20cm³)로부터 침전시켰다. 침전물을 여과하여 회수하고 무수 아세토니트릴로 공-증발시켜 백색 기포로서 뉴클레오사이드 10(117mg, 21%)을 수득하였다.

δ_P(CH₃CN) 149.9, 149.3

LNA 올리고뉴클레오타이드의 제조

실시예 10

비변형된 올리고뉴클레오타이드 및 포스포르아미디트 10로부터 유도된 L-리보-LNA를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 합성

L-리보-LNA 및 참조 올리고뉴클레오타이드를 Biosearch 8750 DNA 합성기상에서 제조하였다. 아미디트 10의 커플링을 "핸드 커플링(hand coupling)"(주사기의 아세토니트릴중에서 아미디트와 활성제를 예비혼합하고; 이어서 적용되는 연결 시간내내 매분마다 대략 2회 칼럼 반응기를 넘치게 함; CPG 고체 지지체)에 의해 수행하였다. 활성제로서 피리딘 하이드로클로라이드를 사용하여 L-리보-LNAs 합성을수행하였다(10-30분의 커플링 시간; 아미디트 10에 대한 단계적인 커플링 수득율은 99%). 비변형된 2'-데옥시뉴클레오사이드 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포르아미디트를 합성기의 RNA 프로그램에 따라 수행되는 즉시 이어지는 X 모노머 커플링외에는 합성기의 표준 DNA-프로그램을 사용하여 커플링시켰다. 서열의 완료후, 메탄올중의 진한 암모니아(32%(w/w), 실온, 12시간)를 사용하여 5'-O-DMT-ON 올리고를 탈보호화시키고 순차적으로 역상 정제(시판되는 일회용 카트리지(Cruachem); 이과정은 탈트리틸화를 포함한다)를 하여 최종 올리고머 산물을 수득하였다. 그러나, 비변형된 올리고뉴클레오타이드 및 오직 하나의 X 모노머를 포함하는 L-리보-LNA 경우, 5'-O-DMT 그룹이 서열 완결후 즉시 합성기에서 제거되었다. 이어서 메탄올중의 진한 암모니아(32% (w/w), 12 시간, 55℃) 처리 및 에탄올 침전은 산물 올리고머를 생성했다. 캐필러리 겔 전기영동을 합성된 L-리보-LNAs의 순도를 분석하기 위하여 사용하였다.

혼성화 데이타

실시예 11

모노머 X를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 열안정성

L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드의 열안정성을 열조절 Peltier 요소가 장치된 분광 광도계를 사용하여 스펙트로미트리(spectrophotometrically)하게 측정하였다. 1 ml의 혼성화 혼합물을 중간 염 완충액(10 mM Na₂HPO₄, pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) 및 동몰량의(1 μM 또는 1.5μM)의 상이한 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 그들의 상보적인 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 제조하였다. 비변형된 올리고뉴클레오타이드를 사용한 동일한 혼성화 혼합물을 참고로서 제조하였다. 온도를 10-90℃(1℃/분)로 선형으로 상승시키면서 260 nm에서의 흡광도를 기록하였다. 용융 온도(T_m값)가 용융 곡선의 1차 도함수의 최대치(+/- 1℃)로서 수득되었다. 표 1-3은 결과(L-리보-LNAs는 볼드체로 표시)를 요약한다. 도 2는 사용된 모노머 L-리보-LNA를 예시한다.

표 1로부터 올리고뉴클레오타이드 서열로 하나 이상의 연속된 α-L-리보-LNA 모노머 X의 혼입 (A) 및 (B)는 상보적인 RNA에 대한 α-L-리보-LNAs의 친화성을 현저하게 증가시키면서 DNA에 대한 α-L-리보-LNAs의 친화성은 변화시키지 않았다.

표 2는 RNA(rA₁₄), 단독으로 미스매치된(mismatch) RNA(5'-r(A₆CA₇)), 에난티오머 RNA(ent-rA₁₄) 및 단독으로 미스매치된 RNA(ent-5'-r(A₆CA₇))에 대한 결합 연구를 나타낸다.

표 3은 혼합-서열9-머 DNA, LNA 및 α-L-리보-LNA의 결합 연구를 나타난다.

대체 방법

실시예 12

1-(3-O-벤질-2,5-디-O-메탄설포닐-4-C-(메탄설포닐옥시메틸)-β-D-크실로푸라노실)티민(11)

무수 테트라하이드로퓨란(20cm³)중의 뉴클레오사이드 5(1100mg, 2.91mmol)의용액에 무수 피리딘(5cm³) 및 메탄설포닐클로라이드(1.2㎖, 15.5mmol)을 연속하여 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 18시간동안 질소하에 암실에서 교반하였다. 감압하에 증발건조시키고 에틸 아세테이트중에 용해시켰다. 유기상을 탄산수소나트륨 포화 수용액(3x10cm³)으로 세척하고 건조(Na₂SO₄)시켰다. 유기상을 감압하에 증발건조시켰다. 잔류물을 용리제로서 디클로로메탄/메탄올(2% 메탄올, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 뉴클레오사이드 11(908mg, 51%)을 수득하였다.

실시예 13

(1R,3R,4S,7R)-1-(하이드록시메틸)-7-벤질옥시-3-(티민-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄(12)

에탄올/물(10cm³, 1:1. v/v)중의 뉴클레오사이드 11(329mg, 0.54mmol)의 용액에 6M의 NaOH(수용액)(0.9㎖, 5.4mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 43시간동안 80℃에서 환류시키고 감압하에 증발건조시켰다. 잔류물을 용리제로서 디클로로메탄/메탄올(2.4% 메탄올, v/v)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 뉴클레오사이드 11(908mg, 51%)을 수득하였다.

실시예 14

뉴클레오사이드 12로부터 뉴클레오사이드 8의 합성

뉴클레오사이드 12의 1차 하이드록시 그룹의 표준 DMT-보호(예: 뉴클레오사이드 5의 1차 하이드록시 그룹의 표준 DMT-보호에 의한 뉴클레오사이드 5의 제조에서와 동일한 방법 사용)로 α-LNA-리보-LNA 뉴클레오사이드 포스포르아미디트 유도체 10의 합성에 사용될 수 있는 뉴클레오사이드 8을 수득하였다(참조 도2 및 관련 실시예).

실시예 15

9-(2-O-아세틸-5-O-벤조일-4-C-(벤조일옥시메틸)-3-O-벤조일-α-L-리보푸라노실)-6-N-벤조일아데닌(14)

당 3(2.05g)을 무수 아세토니트릴(30㎖)중에 용해시켰다. N-6-벤조일아데닌 (1.86g) 이어서 SnCl₄(1.3㎖)에 첨가하고 생성된 혼합물을 3.7시간동안 실온에서 교반하고 중성화될 때까지 NaHCO₃포화수용액을 가하였다. 셀라이트(Celite)를 통하여 여과시킨 후, 여액을 연속하여 NaHCO₃포화수용액(3x150㎖) 및 H₂O(2x150㎖)으로 세척하고, 건조(Na₂SO₄)시키고 증발건조시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(페트롤륨 에테트중 40-60% NaOAc)에 의해 정제하여 전체적으로 보호된 뉴클레오사이드 중간체(1.04g, 수득율 52%)를 수득하였다. 이 중간체(1.29g)를 메탄올(35㎖)중에 용해시키고 메탄올(35㎖))중의 NH₃포화 용액중에 첨가하였다. 2.3시간동안0℃에서 교반한 후, 혼합물을 감압하에서 증발건조시키고 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄중의 1% 메탄)에 의해 정제하여 무수 디클로로메탄(40㎖)중에 용해되는 중간체를 수득하였다. -50℃로 냉각시킨 후, 무수 피리딘(3㎖)을 트리플루오로메탄설폰산 무수물(0.65㎖)과 함께 첨가하였다. 50분동안 교반한 후, 추가의 트리플루오로메탄설폰산 무수물(0.65㎖)을 가하고 1시간동안 -10℃에서 교반을 계속하였다. 디클로로메탄(100㎖)를 첨가하고 NaHCO₃포화수용액(3x100㎖)을 사용하여 세척을 수행하였다. 분리된 유기상을 건조(Na₂SO₄)시키고 감압하에서 증발건조시켜 중간체를 수득하였다. 이 중간체를 톨루엔(20㎖) 및 KOAc(0.85g)중에 용해시키고 18-크라운-6(0.92g)을 첨가하고 생성된 혼합물을 7시간동안 80℃에서 교반하고 감압하에 증발건조시켜 잔류물을 수득하고 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄중의 0-1.5% 메탈올)에 의해 정제하여 뉴클레오사이드 14(3단계에 대하여 1.1g, 84%)를 수득하였다.

실시예 16

(1S,3R,4S,7R)-7-벤조일옥시-1-하이드록시메틸-3-(N-6-벤조일아데닌-9-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄(15)

뉴클레오사이드 14(3.05g)를 메탄올(200㎖)중에 NH₃포화 용액에 용해시키고 4일동안 실온에서 교반하고 33%의 NH₃수용액(60㎖)를 첨가하고 4시간동안 교반을계속하였다. 혼합물을 감암하에 증발건조시켜 중간체를 수득하고 이를 무수 피리딘(100㎖)에 용해시켰다. TMSCL(7.8㎖)을 첨가하고 실온에서 5시간동안 교반을 계속하였다. 0℃로 냉각시킨 후, 벤조일 클로라이드(2.4㎖)을 첨가하고 실온에서 16시간동안 교반을 계속하였다. H₂O(50㎖)를 첨가하고 5분 후 25% NH₃포화 수용액(25㎖)를 첨가하였다. 실온에서 20분동안 교반한 후, 혼합물을 감압하에 증발건조시키고 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄중 2-5% 메탄올)에 의해 정제하여 중간체(2단계를 통해 1.76g, 87%)를 수득하였다. 이 중간체(326mg)를 무수 피리딘(50㎖)에 용해시키고 교반하면서 0℃에서 메실 클로라이드(0.11㎖)를 첨가하였다. 2시간동안 교반한 후, H₂O(5㎖)를 첨가하고 감압하에 증발건조하여 혼합물의 부피를 대략 50%로 감소시켰다. 디클로로메탄(100㎖)를 가하고 HaHCO₃포화 수용액(3x20㎖)으로 세척을 수행하였다. 유기상을 건조(NaSO₄)시키고 감압하에 증발건조시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄중 2-4% 메탄올)에 의해 정제하여 중간체(284mg)를 수득하였다. 이 중간체(354mg)를 디옥산(15㎖), H₂O(15㎖) 및 2M NaOH(5.5㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 환류하에 72시간동안 교반한 후, 중성화될 때까지 디옥산중의 7%(w/w)의 HCl 용액을 가하였다. HaHCO₃포화 수용액(2x100㎖)으로 세척을 수행하고 유기상을 건조(NaSO₄)시키고 감압하에 증발건조시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄중 0-4% 메탄올)에 의해 정제하여 바이시클릭 뉴클레오사이드15(24mg)을 수득하였다.

실시예 17

(1S,3R,4S,7R)-7-(2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피녹시)-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(6-N-벤조일아데닌-9-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]옥탄(16)

뉴클레오사이드 15의 표준 DMT-보호화에 연속하여 탈벤질화 및 3'-O-포스피틸화하여 포스포르아미디트 16이 제공될 것으로 예상된다. 15로부터 16을 수득하는 또다른 가능한 방법은 15의 탈벤질화에 연속하여 1차 하이드록시 그룹의 선택적 DMT-보호화 및 최종적으로는 3'-O-포스피틸화이다. 실시예서 설명되는 반응은 표준 방법을 따른다(참조, 예: Koshkin, A.A.Singh, S.K.Nielsen, P., Rajwanshi, V.K., kumar,R.,Meldgaard, M.,Olsen, C.E.,Wengel,J.Tetrahedron 1998, 54,3607).

표 1:

^aX = 포스포로아미디트 10으로부터 유도된 모노머

Y = 2'-O,4'-C-메틸렌 브릿지를 포함하는 LNA 모노머, 비교 Singh et al(상기)

^b5'-dA₁₄와 복합화됨

^c5'-rA₁₄와 복합화됨

표 2:

^a상기의 표 1과 동일

^d온도 10-95℃ 범위에서 공동의(co-operative) 융점 Tm은 측정되지 않음.

표 3:

^*두개의 동일한 실험의 결과

Claims (63)

1. 적어도 하나의 하기 일반식 I의 뉴클레오사이드 유사체 및 그의 염기 염 및 산 부가 염을 포함하는 올리고머:

   상기 식에서, X는 -O-, -S-, -N(R^N*)-, -C(R⁶R^6*)-으로부터 선택되고;

   B는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-4-알콕시, 임의로 치환된 C_1-4-알킬, 임의로 치환된 C_1-4-아실옥시, 뉴클레오염기, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로부터 선택되며;

   P는 임의로 치환체 R⁵또는 동일하게 적용할 수 있는 치환체 R^5*를 포함하는 후행의 모노머에 대한 뉴클레오사이드간의 결합을 위한 라디칼 위치 또는 5'-말단 그룹을 나타내고;

   P^*은 선행하는 모노머에 대한 뉴클레오사이드간의 결합 또는 3'-말단 그룹을 나타내며;

   R^2*와 R^4*는 -C(R^aR^b)-, C(R^a)=C(R^a)-, -C(R^a)=N-, -O-, Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-,-N(R^a)- 및 >C=Z로부터 선택되는 1∼4개의 그룹/원자로 구성된 바이라디칼을 나타내고(여기서, Z는 -O-, -S- 및 -N(R^a)-으로부터 선택되고, R^a및 R^b각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-12-알킬, 임의로 치환된 C_2-12-알케닐, 임의로 치환된 C_2-12-알키닐, 하이드록시, C_1-12-알콕시, C_2-12-알케닐옥시, 카복시, C_1-12-알콕시카보닐, C_1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디((C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, C_1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C_1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로부터 선택되며, 여기서 아릴 및헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2개의 제미날(geminal) 치환체 R^a및 R^b는 함께 임의로 치환된 메틸렌 올레핀(=CH₂)을 나타낼 수 있다);

   존재하는, 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶, 및 R^6*각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-12-알킬, 임의로 치환된 C_2-12-알케닐, 임의로 치환된 C_2-12-알키닐,하이드록시, C_1-12-알콕시, C_2-12-알케닐옥시, 카복시, C_1-12-알콕시카보닐, C_1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디((C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, C_1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C_1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로부터 선택되며, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2개의 제미날 치환체는 함께 옥소, 티옥소, 이미노 또는 임의로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있거나 함께 -O-, -S- 및 -(NR^N)-로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자/그룹이 임의로 중간 및/또는 끝에 존재하는 1∼5개의 탄소원자 알킬렌 쇄로 구성된 스피로 바이라디칼을 형성할 수 있고(여기서, R^N은 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고 2개의 인접 (비-제미날) 치환체는 2중결합을 형성하는 부가적인 결합을 나타낼 수 있다); 존재하는 R^N*은 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택된다.
2. 제 1항에 있어서, 일반식 I의 1∼10000개의 L-리보-LNA 및 천연 발생의 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체로부터 선택되는 0∼10000개의 뉴클레오사이드를 포함하고, 단 뉴클레오사이드의 수 및 L-리보-LNA(s)의 수의 합은 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 예를 들어 2∼15000개의 범위인 올리고머.
3. 제 2항에 있어서, 적어도 하나의 L-리보-LNA는 치환체 B로서 뉴클레오염기를 포함하는 올리고머.
4. 제 2항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 7개, 바람직하게는 적어도 9개, 특히 적어도 11개, 특별히 적어도 13개의 후행의 L-리보-LNA 모노머를 포함하는 올리고머.
5. 제 2항에 있어서, 올리고머의 모든 뉴클레오사이드 모노머는 L-리보-LNA인 올리고머.
6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, L-리보-LNA(s)는 하기 일반식 Ia를 갖는 올리고머:

   상기 식에서, P, P^*, B, X, R^1*, R², R^2*, R^3*, R^4*, R⁵, 및 R^5*는 제 1항에서 정의된 바와 같다.
7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, X는 -C(R⁶R^6*)-, -O-, -S- 및 -N(R^N*)-, 바람직하게는 -O-, -S- 및 -N(R^N*)-, 특히 -O-로부터 선택되는 올리고머.
8. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, R^2*및 R^4*에 의해 구성되는 바이라디칼은 -(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-Y-, -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y-, -Y-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r+S-, -Y-, -Y-Y-로부터 선택되고, 여기서, 각각의 Y는 독립적으로 -O-, -S-, Si(R^*)₂-, -N(R^*)-, >C=O, -C(=O)-N(R^*)- 및 -N(R^a)-C(=O)-로부터 선택되며, 각각의 R^*은 독립적으로 수소, 할로겐, 아지도, 시아노, 니트로, 하이드록시, 머캅토, 아미노, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로부터 선택되고/선택되거나 2개의 인접 (비-제미날) R^*은 함께 이중결합을 나타낼 수 있고, 각각의 r 및 s는 0∼4이고 단 r+s의 합은 1∼4인 올리고머.
9. 제 8항에 있어서, 바이라디칼은 -Y-, -(CR^*R^*)_r+s-, -(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s- 및 -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y-(여기서, 각각의 r 및 s는 0∼3이고 단 r+s의 합은 1∼4임)로부터 선택되는 올리고머.
10. 제 9항에 있어서, 바이라디칼은 -O-, -S-, -N(R^*)-, -(CR^*R^*)_r+s+1-, -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-, -O-(CR^*R^*)_r+s-O-, -S-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -S-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S-, 및 -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-로부터 선택되고(여기서, 각각의 r 및 s는 0∼3이고 단 r+s의 합은 1∼4임), X는 -O-, -S- 및 -N(R^H)-(여기서, R^H는 수소 또는 C_1-4-알킬을 나타냄)로부터 선택되는 올리고머.
11. 제 10항에 있어서, X는 O이고, R²는 수소, 하이드록시 및 임의로 치환된 C_1-6-알콕시로부터 선택되며, R^1*, R^3*, R⁵, 및 R^5*는 수소를 나타내는 올리고머.
12. 제 11항에 있어서, 바이라디칼은 -O-, -(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- 및 -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-, 예를 들면, -O-CH₂-, -S-CH₂- 및 -N(R^N)-CH₂-로부터 선택되는 올리고머.
13. 제 11항 내지 제 12항중 어느 한 항에 있어서, B가 뉴클레오염기로부터 선택되는 올리고머.
14. 제 8항에 있어서, 바이라디칼이 -(CH₂)_2-4-인 올리고머.
15. 제 8항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 하나의 R^*은 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로부터 선택되고, 어느 남은 치환체 R^*은 수소인 올리고머.
16. 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 있어서, L-리보-LNA(s)의 어느 뉴클레오사이드간의 결합은 -CH₂-, -O-, -S-, -NR^H-, >C=O, >C=NR^H-, >C=S-, -Si(R")₂-, -SO-, -S(O)₂-, -P(O)₂-, -P(O,S)-, -P(S)₂-, -PO(R")-, -PO(OCH₃)-, 및 -PO(NHR^H)-(여기서, R^H는 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C_1-6-알킬 및 페닐로부터 선택됨)로부터 선택되는 2∼4개, 바람직하게는 3개의 그룹/원자로 구성된 결합으로부터 선택되는 올리고머.
17. 제 16항에 있어서, L-리보-LNA(s)의 어느 뉴클레오사이드간 결합은 -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CO-CH₂-, -CH₂-CHOH-CH₂-, -O-CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-, -O-CH₂-CH=, -CH₂-CH₂-O-, -NR^H-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-NR^H-, -CH₂-NR^H-CH₂-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -NR^H-CO-O-, -NR^H-CO-NR^H-, -NR^H-CS-NR^H-, -NR^H-C(=NR^H)-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-NR^H-, -O-CO-O-, -O-CO-CH₂-O-, -O-CH₂-CO-O-, -CH₂-CO-NR^H-, -O-CO-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-, -O-CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -CH=N-O-, -CH₂-NR^H-O-, -CH₂-O-N=, -CH₂-O-NR^H-, -CO-NR^H-CH₂-, -CH₂-NR^H-O-, -CH₂-NR^H-CO-, -O-NR^H-CH₂-, -O-NR^H-, -O-CH₂-S, -S-CH₂-O-, -CH₂-CH₂-S-, -O-CH₂-CH₂-S-, -S-CH₂-CH=, -S-CH₂-CH₂-, -S-CH₂-CH₂-O-, -S-CH₂-CH₂-S-, -CH₂-S-CH₂-, -CH₂-SO-CH₂-, -CH₂-SO₂-CH₂-, -O-SO-O-, -O-S(O)₂-O-, -O-S(O)₂-CH₂-, -O-S(O)₂-NR^H-, -NR^H-S(O)₂-CH₂-, -O-S(O)₂-CH₂-, -O-P(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -S-P(O)₂-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)₂-O-, -O-P(O)₂-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)₂-S-, -S-P(O)₂-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)₂-S-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(OCH₃)-O-, -O-PO(BH₃)-O-, -O-PO(NHR^N)-O-, -O-P(O)₂-NR^H-, -NR^H-P(O)₂-O-, -O-P(O,NR^H)-O-, 및 -O-Si(R")₂-O-로부터 선택되는 올리고머.
18. 제 1항 내지 제 17항중 어느 한 항에 있어서, 존재하는, L-리보-LNA(s)의 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶, 및 R^6*각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 하이드록시, C_1-6-알콕시, C_2-6-알케닐옥시, 카복시, C_1-6-알콕시카보닐, C_1-6-알킬카보닐, 포밀, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디((C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, 아지도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, 설파닐, C_1-6-알킬티오, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드 및 할로겐으로부터 선택되며, 2개의 제미날 치환체는 함께 옥소를 나타낼 수 있고, 존재하지만 바이라디칼에 포함되지 않는 R^N*은 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되는 올리고머.
19. 제 1항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, X는 -O-, -S- 및 -NR^N*-로부터 선택되고, 존재하는 L-리보-LNA(s)의 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶, 및 R^6*각각은 수소인 올리고머.
20. 제 1항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서, P는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬카보닐옥시, 임의로 치환된 아릴옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트 및 -W-A'-로부터 선택되는 5'-말단 그룹이고, 여기서 W는 -O-, -S- 및 -N(R^H)-로부터 선택되며, 여기서 R^H는 수소 및 C_1-6-알킬로부터 선택되고, A'는 DNA 삽입제, 광화학적활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되는 올리고머.
21. 제 1항 내지 제 20항중 어느 한 항에 있어서, P^*는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬카보닐옥시, 임의로 치환된 아릴옥시, 및 -W-A'-로부터 선택되는 3'-말단 그룹이고, 여기서 W는 -O-, -S- 및 -N(R^H)-로부터 선택되며, 여기서 R^H는 수소 및 C_1-6-알킬로부터 선택되고, A'는 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되는 올리고머.
22. 제 1항 내지 제 21항중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 III를 갖는 올리고머:

    G-[Nu-L]_n(o)-{[L-리보-LNA-L]_m(q)-[Nu-L]_n(q)}_q-G^*III

    상기 식에서,

    q는 1∼50이고;

    각각의 n(0)...n(q)는 독립적으로 0∼10000이며;

    각각의 m(1)...m(q)는 독립적으로 1∼10000이고;

    단 n(0)...n(q) 및 m(1)...m(q)의 합은 2∼15000이며;

    G는 5'-말단 그룹을 나타내고;

    각각의 Nu는 독립적으로 천연 발생의 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오사이드를 나타내며;

    각각의 L-리보-LNA는 독립적으로 뉴클레오사이드 유사체를 나타내고;

    각각의 L은 독립적으로 Nu 및 L-리보-LNA로부터 선택되는 두 그룹간의 뉴클레오사이드간 결합을 나타내거나, L은 G^*와 함께 3'-말단 그룹을 나타내며;

    각각의 L-리보-LNA-L은 독립적으로 일반식 Ⅰ의 뉴클레오사이드 유사체를 나타내는 올리고머.
23. 일반식 II의 뉴클레오사이드 유사체 (L-리보-LNA) 및 그의 염기 염 및 산 부가 염:

    상기 식에서, 치환체 B는 뉴클레오염기, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로부터 선택되며;

    X는 -O-, -S-, -N(R^N*)- 및 -C(R⁶R^6*)-로부터 선택되고;

    Q 및 Q^*의 각각은 독립적으로 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, Prot-O-, Act-O-, 머캅토, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-알킬티오, 아미노, Prot-N(R^H)-, Act-N(R^H)-, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹, 리간드, 카복시, 설포노, 하이드록시메틸, Prot-O-CH₂-, Act-O-CH₂-, 아미노메틸, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂-, 카복시메틸, 설포노메틸(여기서, Prot는 각각 -OH, -SH 및 -NH(R^H)에 대한 보호 그룹이며, Act는 각각 -OH, -SH 및 -NH(R^H)에 대한 활성 그룹이고, R^H는 수소 및 C_1-6-알킬로부터 선택됨)로부터 선택되며;

    R^2*및 R^4*는 함께 -O-, -(CR^*R^*)_r+s+1-, -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-, -O-(CR^*R^*)_r+s-O-, -S-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -S-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S-, 및 -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-로부터 선택되는 바이라디칼을 나타내고;

    여기서, 각각의 R^*은 독립적으로 수소, 할로겐, 아지도, 시아노, 니트로, 하이드록시, 머캅토, 아미노, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로 부터 선택되고/거나 2개의 인접 (비-제미날) R^*은 함께 이중결합을 나타낼 수 있고, 각각의 r 및 s는 0∼3이고, 단 r+s의 합계는 1∼4이며;

    존재하는 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶, 및 R^6*각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-12-알킬, 임의로 치환된 C_2-12-알케닐, 임의로 치환된 C_2-12-알키닐, 하이드록시, C_1-12-알콕시, C_2-12-알케닐옥시, 카복시, C_1-12-알콕시카보닐, C_1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디((C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, C_1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C_1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드로부터 선택되며, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2개의 제미날 치환체는 함께 옥소, 티옥소, 이미노 또는 임의로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있거나 함께 -O-, -S- 및 -(NR^N)-로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자/그룹이 임의로 중간 및/또는 끝에 존재하는 1∼5개의 탄소원자 알킬렌 쇄로 구성된 스피로 바이라디칼을 형성할 수 있고(여기서, R^N은 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고, 2개의 인접 (비-제미날) 치환체는 2중결합을 형성하는 부가적인 결합을 나타낼 수 있음); 존재하지만 바이라디칼에는 포함되지 않는 R^N*은 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고;

    단, 올리고뉴클레오타이드 합성에서 지배적인 조건하에서 반응성인 어느 화학적 그룹(어느 뉴클레오염기를 포함)은 임의로 기능성 그룹으로 보호된다.
24. 제 23항에 있어서, 그룹 B가 뉴클레오염기 및 기능성 그룹 보호된 뉴클레오염기로부터 선택되는 뉴클레오사이드 유사체.
25. 제 23항 내지 제 24항중 어느 한 항에 있어서, X는 -O-, -S-, 및 -N(R^N*)-로부터 선택되는 뉴클레오사이드 유사체.
26. 제 23항 내지 제 25항중 어느 한 항에 있어서, 존재하는, 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶, 및 R^6*각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 하이드록시, C_1-6-알콕시, C_2-6-알케닐옥시, 카복시, C_1-6-알콕시카보닐, C_1-6-알킬카보닐, 포밀, 아미노, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, 아지도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, 설파닐, C_1-6-알킬티오, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드 및 할로겐으로부터 선택되며, 2개의 제미날 치환체는 함께 옥소를 나타내고, 존재하지만 바이라디칼에 포함되지 않는 R^N*은 수소 및 C_1-4-알킬로부터 선택되고, 단 어느 수소, 아미노, 모노C_1-6-알킬)아미노, 설파닐 및 카복시는 임의로 보호되는 뉴클레오사이드 유사체.
27. 제 23항 내지 제 26항중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 치환체 R^1*, R², R^3*, R⁵, R^5*, R⁶, 및 R^6*각각은 수소를 나타내는 뉴클레오사이드 유사체.
28. 제 23항 내지 제 27항중 어느 한 항에 있어서, Q는 독립적으로 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, Prot-O-, 머캅토, Prot-S-, C_1-6-알킬티오, 아미노, Prot-N(R^H)-, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹, 리간드, 카복시, 설포노, 하이드록시메틸, Prot-O-CH₂-, 아미노메틸, Prot-N(R^H)-CH₂-, 카복시메틸, 설포노메틸(여기서, Prot는 각각 -OH, -SH 및 -NH(R^H)에 대한 보호 그룹이며, R^H는 수소 및 C_1-6-알킬로부터 선택됨)로부터 선택되고;

    Q^*는 독립적으로 수소, 아지도, 할로겐, 시아노, 니트로, 하이드록시, Act-O-, 머캅토, Act-S-, C_1-6-알킬티오, 아미노, Act-N(R^H)-, 모노- 또는 디(C_1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C_1-6-알콕시, 임의로 치환된 C_1-6-알킬, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐, 임의로 치환된 C_2-6-알케닐옥시, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐, 임의로 치환된 C_2-6-알키닐옥시, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅그룹, 리포터 그룹, 리간드, 카복시, 설포노(여기서, Act는 각각 -OH, -SH 및 -NH(R^H)에 대한 활성 그룹이며, R^H는 수소 및 C_1-6-알킬로부터 선택됨)로부터 선택되는 뉴클레오사이드 유사체.
29. 제 23항 내지 제 28항중 어느 한 항에 있어서, X는 O이고, R²는 수소, 하이드록시 및 임의로 치환된 C_1-6-알콕시로부터 선택되며, R^1*, R³, R⁵, 및 R^5*는 수소를 나타내는 뉴클레오사이드 유사체.
30. 제 23항 내지 제 29항중 어느 한 항에 있어서, 바이라디칼은 -O-, -(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- 및 -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-로부터 선택되는 뉴클레오사이드 유사체.
31. 제 30항에 있어서, 바이라디칼은 -O-CH₂-, -S-CH₂- 및 -N(R^N)-CH₂-로부터 선택되는 뉴클레오사이드 유사체.
32. 제 23항 내지 제 31항중 어느 한 항에 있어서, 바이라디칼은 -(CH₂)_2-4-, 바람직하게는 -(CH₂)₂-인 뉴클레오사이드 유사체.
33. 제 1항 내지 제 26항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머) 및 단백질, 앰플리콘, 효소, 폴리사카라이드, 항체, 합텐, 펩타이드 및 PNA로부터 선택되는 화합물의 컨쥬케이트.
34. 제 1항 내지 제 34항중 어느 한 항에 따른 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 제조를 위한 제 23항 내지 제 32항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA의 용도.
35. 제 33항에 있어서, L-리보-LNA의 삽입이 핵산 활성 효소에 대한 기질로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드의 능력을 조절하는 것인 용도.
36. L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 단백질, 앰플리콘, 효소, 폴리사카라이드, 항체, 합텐, 펩타이드 및 PNA로부터 선택되는 화합물의 컨쥬케이트의 제조를 위한 제 23항 내지 제 32항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA의 용도.
37. 핵산에 대해 활성인 효소에 대한 기질로서 제 23항 내지 제 32항중 어느 한항에서 정의된 L-리보-LNA의 용도.
38. 제 37항에 있어서, L-리보-LNA가 DNA 및 RNA 폴리머라아제에 대한 기질로서 사용되는 것인 용도.
39. 치료제로서의 제 23항 내지 제 32항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA의 용도.
40. 다른 서열의 LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드가 부착된 고체 표면의 제작에 있어서 제 23항 내지 제 32항중 어느 한 항에서 정의된 하나 이상의 L-리보-LNA의 용도.
41. 표적 핵산의 서열 특이적 절단에 있어서 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고머(리보자임)의 용도.
42. 예를 들면, 안티센스, 항원 또는 유전자 활성 치료제로서, 치료에 있어서 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
43. 제 42항에 있어서, LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드는 RNAseH를 강화하는것인 용도.
44. 예를 들면, 안티센스, 항원 또는 유전자 활성 치료제로서, 치료에 있어서 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 하나 초과의 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 복합체의 용도.
45. α-L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드를 tRNAs, rRNAs, snRANs 및 scRNAs로 구성된 그룹으로부터 선택되는 RNA와 특이적으로 상호작용시켜 트랜스레이션, RNA 스플라이싱, RNA 프로세싱, 및 다른 필수적인 세포성 과정으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 세포성 과정을 억제하는 치료에 있어서 제 6항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 α-L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
46. 예를 들면, 천연 또는 합성 핵산의 분리, 정제, 증폭, 검출, 동정, 정량 또는 포획을 위한 진단에 있어서 제 6항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
47. 예를 들면, 천연 또는 합성 핵산의 분리, 정제, 증폭, 검출, 동정, 정량 또는 포획을 위한 진단에 있어서 RNA 및 DNA를 식별하여 표적 RNA와 선택적으로 혼성화할 수 있는 제 6항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 α-L-리보-LNA 변형된올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
48. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 올리고뉴클레오타이드의 직접 또는 간접적 검출 또는 고체 지지체상에 올리고뉴클레오타이드의 고정화를 촉진하는 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 또는 리간드를 포함하는 것인 용도.
49. 제 48항에 있어서, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드는 화학적 절단 가능 그룹을 포함하는 스페이서(K)를 포함하는 용도.
50. 제 49항에 있어서, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이팅 그룹, 리포터 그룹 및 리간드는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드의 LNA(s)의 바이라디칼(즉, R^*로서)을 통해 결합되는 용도.
51. 제 50항에 있어서, RNA 또는 DNA와 같은 천연 발생 또는 합성 더블 스트랜드 또는 싱글 스트랜드 핵산의 포획 및 검출을 위한 용도.
52. 제 47항에 있어서, RNA 또는 DNA와 같은 천연 발생 더블 스트랜드 또는 싱글스트랜드 핵산의 정제를 위한 용도.
53. 분자 진단에 있어서 아프타머로서의 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
54. RNA 매개 촉매적 과정에서 아프타머로서의 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
55. 항생제, 약물, 아미노산, 펩타이드, 구조 단백질, 단백질 수용제, 단백질 효소, 사카라이드, 폴리사카라이드, 생물학적 코팩터, 핵산 또는 트리포스페이트의 특이적 결합에 있어서 아프타머로서의 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
56. 입체특이적 결합에 의한 라세미 혼합물로부터 에난티오머의 분리에 있어서 아프타머로서의 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
57. 세포를 표지하기 위한 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
58. 생체내 또는 시험관내의 tRNA, rRNA, snRNA 및 scRNA와 같은 비단백질 코딩 세포 RNA와 혼성화되는 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
59. 탐침으로부터의 형광 신호를 증가시켜 혼성상태의 올리고뉴클레오타이드를 비결합된 상태의 올리고뉴클레오타이드와 식별할 수 있도록 위치된 플루오로포어 및 퀀처를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 제작에 있어서 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)의 용도.
60. 반응체 및 제 1항 내지 제 22항중 어느 한 항에서 정의된 하나 이상의 L-리보-LNA 변형된 올리고뉴클레오타이드(올리고머)를 포함하는, 천연 또는 합성 핵산의 분리, 정제, 증폭, 검출, 동정, 정량 또는 포획을 위한 키트.
61. 반응체 및 제 23항 내지 제 32항중 어느 한 항에서 정의된 하나 이상의 L-리보-LNA(s)를 포함하는, 천연 또는 합성 핵산의 분리, 정제, 증폭, 검출, 동정, 정량 또는 포획을 위한 키트.
62. 제 60항 또는 제 61항에 있어서, L-리보-LNAs이 상기 반응체상에 고정화되는키트.
63. 진단 목적을 위한 제 23항 내지 제 32항중 어느 한 항에서 정의된 L-리보-LNA의 용도.