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KR20240070615A - 하나 이상의 비염기성 유닛을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

하나 이상의 비염기성 유닛을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드 Download PDF

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KR20240070615A
KR20240070615A KR1020247013540A KR20247013540A KR20240070615A KR 20240070615 A KR20240070615 A KR 20240070615A KR 1020247013540 A KR1020247013540 A KR 1020247013540A KR 20247013540 A KR20247013540 A KR 20247013540A KR 20240070615 A KR20240070615 A KR 20240070615A
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KR
South Korea
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gaa
ctc
ivs1
conjugate
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Pending
Application number
KR1020247013540A
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English (en)
Inventor
라이언 올리버
케빈 킴
메간 아헤른
Original Assignee
사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

올리고뉴클레오티드, 펩티드-올리고뉴클레오티드-접합체, 및 적어도 하나의 퓨린 및 피리미딘-무함유 비염기성 서브유닛을 갖는 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열이 본원에 제공된다. 또한, 근육 질환, 바이러스 감염, 또는 박테리아 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 및 펩티드-올리고뉴클레오티드-접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

하나 이상의 비염기성 유닛을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드
관련 출원
본 출원은 2022년 9월 20일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/408,277호 및 2021년 9월 30일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/261,860호의 이익을 주장하며, 이들의 전체 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
안티센스 기술은 대안적인 스플라이스 산물을 포함하는, 하나 이상의 특정 유전자 산물의 발현을 조절하기 위한 수단을 제공하며, 다수의 치료, 진단 및 연구 응용에서 독창적으로 유용하다. 안티센스 기술의 원리는, 표적 핵산에 혼성화되는 안티센스 화합물, 예를 들어 올리고뉴클레오티드가 다수의 안티센스 메커니즘 중 어느 하나를 통해 전사, 스플라이싱, 또는 번역과 같은 유전자 발현 활성을 조절한다는 것이다. 안티센스 화합물의 서열 특이성은, 질병에 관여하는 유전자의 발현을 선택적으로 조절하기 위한 표적 검증 및 유전자 기능화뿐만 아니라 치료제를 위한 도구로서 이들을 매력적으로 만든다.
글리코겐 축적 질환 II형(GSD-II)(폼페(Pompe)병, 글리코겐증 II, 산 말타아제 결핍증(AMD)으로도 알려짐)은 산 알파-글루코시다아제(GAA)라는 효소의 결핍에 의해 야기되는 유전성 상염색체 열성 리소좀 축적 장애이다. 신체 내에서 GAA의 역할은 글리코겐을 분해하는 것이다. GAA 활성 수준의 감소 또는 결핍은 심장, 골격근(호흡과 관련된 근육 포함), 간, 및 신경계를 포함하여, 영향을 받은 조직에서의 글리코겐의 축적을 초래한다. 이러한 글리코겐의 축적은 GSD-II를 가진 개체에서 진행성 근육 약화증 및 호흡 부전을 유발하는 것으로 여겨진다. GSD-II는 영아, 유아, 또는 성인에서 발생할 수 있으며, 해당 예후는 증상의 발병 시점 및 중증도에 따라 상이하다. 임상적으로, GSD-II는 중증(영아)부터 보다 경미한 후기 발병 성인 형태에 이르는 광범위하고 연속적인 중증도 스펙트럼으로 나타날 수 있다. 환자는 결국 호흡 부전으로 인해 사망한다. 질환의 중증도와 잔류 산 알파-글루코시다아제 활성 사이에는 명백한 상관 관계가 존재하며, 해당 활성은 질환의 후기 발병에서 정상치의 10 내지 20%이고 질환의 초기 발병 형태에서는 정상치의 2% 미만이다. GSD-II는 전 세계적으로 약 5,000 내지 10,000명에게 영향을 미치는 것으로 추정된다.
질환의 성인 발병 형태와 연관된 가장 흔한 돌연변이는 IVS1-13T>G이다. 성인 발병 GSD-II 환자의 2/3 이상에서 발견되는 이러한 돌연변이는 이형접합체 개체에게 선택적인 이점을 부여할 수 있거나 매우 오래된 돌연변이이다. 이러한 돌연변이를 갖는 성인 발병 GSD-II 개체의 광범위한 인종적 변이는 공통의 기원에 대해 논쟁의 대상이다.
GAA 유전자는 약 20 kb에 걸쳐 있는 20개의 엑손으로 이루어진다. 3.4 kb mRNA는 약 105 kD의 분자량을 갖는 단백질을 암호화한다. IVS1-13T>G 돌연변이는 개시 AUG 코돈을 함유하는 엑손 2(577개 염기)의 완전한 또는 부분적인 손실을 초래한다.
GSD-II에 대한 치료는 약물 치료 전략, 식이 조작, 및 골수 이식을 포함하나, 이에 대한 명백한 성공은 이루어지지 않았다. 최근 몇 년 동안, 효소 대체 요법(ERT)은 GSD-II 환자에게 새로운 가능성을 제시하였다. 예를 들어, 재조합 GAA 단백질 약물인 Myozyme®은 2006년 미국과 유럽 모두에서 GSD-II 질환을 가진 환자에게 사용하도록 승인을 받았다. Myozyme®은 리소좀으로의 전달을 위한 GAA 단백질의 표면 상의 만노오스-6-포스페이트(M6P)에 의존한다. 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration)은 또한 후기 발병형 폼페병 환자의 치료에 대해 넥스비아자임(Nexviazyme)®(아발글루코시다아제 알파-ngpt)을 승인하였다. 넥스비아자임은 M6P 수용체를 특이적으로 표적화하도록 설계된 효소 대체 요법(ERT)이다.
최근, RNA 하향 조절에 주로 사용되는 안티센스 기술은 스플라이싱 방법을 변경하도록 적용되었다. 많은 유전자의 일차 유전자 전사체(pre-mRNA)의 프로세싱은 인트론의 제거 및 공여자 스플라이스 부위가 수용자 스플라이스 부위에 연결되는 엑손의 정확한 스플라이싱을 포함한다. 스플라이싱은, 공여자 및 수용자 스플라이스 부위, 및 양성 엑손 스플라이스 인핸서(주로 엑손 내에 위치함)와 음성 스플라이스 모티프(스플라이스 사일렌서는 주로 인트론 내에 위치함)의 균형을 갖는 분지점(수용자 전-부위의 상류)의 조정된 인식을 포함하는 정밀한 방법이다.
비록 안티센스 기술 분야에서 상당한 진전이 있었지만, GSD-II의 개선된 치료를 위한, 안티센스 또는 항원 성능이 개선된 올리고뉴클레오티드 및 펩티드-올리고뉴클레오티드-접합체에 대한 필요성이 당업계에 남아 있다.
본 개시는, 글리코겐 축적 질환 II형(GSD-II)(폼페병, 글리코겐증 II, 산 말타아제 결핍증(AMD), 산 알파-글루코시다아제 결핍증, 및 리소좀 알파-글루코시다아제 결핍증으로도 알려짐) 치료로서 엑손 포함을 유도하기 위한, 안티센스 올리고머 및 관련 조성물, 그리고 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로, 엑손 2의 포함을 유도함으로써 GAA 유전자에 의해 암호화된 효소 활성 산 알파-글루코시다아제(GAA) 단백질의 수준을 회복시키는 것에 관한 것이다.
따라서, 안티센스 올리고머 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 본원에 제공되며, 여기에서 안티센스 올리고머는 18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 여기에서:
안티센스 올리고머의 각각의 서브유닛은 핵염기를 포함하거나 비염기성 서브유닛이고;
적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이고;
표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 80% 상보적이다.
안티센스 올리고머는 폼페병과 같은 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 다양한 질환을 치료하는 데 유용하다.
안티센스 올리고머는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머일 수 있다. 안티센스 올리고머는 세포 투과성 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 펩티드는 본원에 제공되거나 당업계에 공지된 펩티드 중 어느 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 표적 영역은 서열번호 2(GAA-IVS1(-189-167)) 및 서열번호 3(GAA-IVS1(-80-24))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-189-167), GAA-IVS1(-72,-48), GAA-IVS1(-71,-47), GAA-IVS1(-70,-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-65,-41), GAA-IVS1(-66,-42)로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-189-167)이다. 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-72,-48)이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-71,-47)이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-70,-46)이다. 일 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-69-45)이다. 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-65,-41)이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-66,-42)이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. X가 비염기성(B)인 경우, 핵염기 A, C, T, 또는 G 대신 수소가 존재한다.
일 구현예에서, B는 H이다.
추가의 일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
일 구현예에서, B는 H이다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고머의 핵염기는 모르폴리노 고리 구조에 연결되고, 여기에서 모르폴리노 고리 구조는 하나의 링 구조의 모르폴리노 질소를 인접한 고리 구조의 5' 고리 외 탄소에 결합시키는 인산-함유 서브유닛 간 결합에 의해 결합된다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고머의 핵염기는 펩티드 핵산(PNA)에 연결되고, 여기에서 인산염-당 폴리뉴클레오티드 백본은 핵염기가 연결되는 가요성 슈도-펩티드 중합체로 치환된다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고머의 핵염기 중 적어도 하나는 잠금 핵산(LNA)이고, 여기에서 잠금 핵산 구조는, 리보오스 모이어티가 2' 산소와 4' 탄소를 연결하는 여분의 가교를 갖는, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유사체이다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고머의 핵염기 중 적어도 하나는 가교 핵산(bridged nucleic acids, BNA)에 연결되고, 여기에서 당 형태는 푸라노오스 골격에 추가의 가교 구조를 도입함으로써 제한되거나 잠긴다. 일부 양태에서, 안티센스 올리고머의 핵염기 중 적어도 하나는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교 핵산(ENA)에 연결된다.
일부 양태에서, 변형된 안티센스 올리고머는 미잠금 핵산(UNA) 서브유닛을 함유할 수 있다. UNA 및 UNA 올리고머는 서브유닛의 C2'-C3' 결합이 절단된 RNA의 유사체이다.
일부 양태에서, 변형된 안티센스 올리고머는 비가교 산소 중 하나가 황으로 치환되는 하나 이상의 포스포로티오에이트(또는 S-올리고)를 함유한다. 일부 양태에서, 변형된 안티센스 올리고머는 리보오스의 2'-OH가 메틸, 메톡시에틸, 2-(N-메틸카르바모일)에틸, 또는 플루오로기로 각각 치환되는 하나 이상의 2' O-메틸, 2' O-MOE, MCE, 및 2'-F를 함유한다.
일부 양태에서, 변형된 안티센스 올리고머는, 시클로프로판 고리를 도입하여 골격의 형태적 유연성을 제한하고 골격 기하학적 구조의 비틀림각(γ)을 최적화함으로써 각각의 뉴클레오티드가 변형된 제한된 DNA 유사체 클래스인, 트리시클로-DNA(tc-DNA)이다.
일 양태에서, 안티센스 올리고머는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 여기에서:
변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 여기에서:
안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고머를 포함하고;
안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 서브유닛은 핵염기를 포함하거나 비염기 서브유닛이며, 여기에서 각각의 서브유닛은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단까지 순서대로 함께 취해져 표적화 서열을 형성하고;
적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이고;
표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 80% 상보적이다.
일 구현예에서, 본 개시는 화학식 I에 따른 안티센스 올리고머 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며:
식 중:
A'은 -N(H)CH2C(O)NH2, -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2, 및 로부터 선택되고, 식 중
R5는 -C(O)(O-알킬)x-OH이고, 식 중 x는 3-10이고, 각각의 알킬기는, 각각의 경우 독립적으로, C2-6-알킬이거나,
R5는 H, -C(O)C1-6-알킬, 트리틸, 모노메톡시트리틸, -(C1-6-알킬)-R6, -(C1-6-헤테로알킬)-R6, 아릴-R6, 헤테로아릴-R6, -C(O)O-(C1-6-알킬)-R6, -C(O)O-아릴-R6, -C(O)O-헤테로아릴-R6, 및 로부터 선택되고;
R6은 OH, SH, 및 NH2로부터 선택되거나, R6은 O, S, 또는 NH이고, 이들 각각은 고형 지지체에 공유 결합되고;
각각의 R1은 OH 및 -N(R3)(R4)로부터 독립적으로 선택되고, 식 중 R3 및 R4는, 각각의 경우 독립적으로, H 또는 -C1-6-알킬이고;
각각의 R2는, 각각의 경우 독립적으로, H(비염기성), 핵염기, 및 화학적 보호기로 관능화된 핵염기로부터 선택되되, 핵염기는, 각각의 경우 독립적으로, 피리딘, 피리미딘, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택되는 C3-6-헤테로시클릭 고리를 포함하고;
t는 8-40이고;
E'은 H, -C1-6-알킬, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸, 및 로부터 선택되고;
식 중
Q는 -C(O)(CH2)6C(O)- 또는 -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-이고;
R7은 -(CH2)2OC(O)N(R8)2이고, 식 중 R8은 -(CH2)6NHC(=NH)NH2이고;
L은 글리신, 프롤린, W, W-W, 또는 R9로부터 선택되되, L은 아미드 결합에 의해 J의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합되고;
W는 -C(O)-(CH2)m-NH-이고, 식 중 m은 2 내지 12이고;
R9는:
및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
p는 2, 3, 4, 또는 5이고;
R10은 결합, 글리신, 프롤린, W, 또는 W-W로부터 선택되고;
R11은 글리신, 프롤린, W, W-W, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R16은 결합, 글리신, 프롤린, W, 또는 W-W로부터 선택되되; R16은 아미드 결합에 의해 J의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합되고; J는 세포 투과성 펩티드이며;
G는 H, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되되, G는 J에 공유 결합된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머는 화학식 II에 따른 것이거나 이의 약학적으로 허용가능한 염이며:
식 중, 1에서 n 및 5'에서 3' 방향으로 각각의 Nu는 다음 중 하나에서의 핵염기에 상응하고:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. X가 비염기성(B)인 경우, 핵염기 A, C, T, 또는 G 대신 수소가 존재한다.
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고머는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 세포 투과성 펩티드를 포함하는 접합체이며, 여기에서:
변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 여기에서:
안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고머를 포함하고;
안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 투과성 펩티드에 공유 결합되고;
안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 서브유닛은 핵염기를 포함하거나 비염기 서브유닛이며, 여기에서 각각의 서브유닛은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단까지 순서대로 함께 취해져 표적화 서열을 형성하고;
적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이고;
표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 80% 상보적이다.
따라서, 화학식 I 또는 이의 염의 일 구현예에서, A'은
이거나, E'은 이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머는 화학식 IIIa에 따른 것이거나 이의 약학적으로 허용가능한 염이며:
식 중, 1에서 n 및 5'에서 3' 방향으로 각각의 Nu는 다음 중 하나에서의 핵염기에 상응하고:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. X가 비염기성(B)인 경우, 핵염기 A, C, T, 또는 G 대신 수소가 존재한다.
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
일 구현예에서, B는 H이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머는 화학식 (III)에 따른 것이거나 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며:
식 중, 1에서 n 및 5'에서 3' 방향으로 각각의 Nu는 다음 중 하나에서의 핵염기에 상응하고:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. X가 비염기성(B)인 경우, 핵염기 A, C, T, 또는 G 대신 수소가 존재한다.
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
일 구현예에서, B는 H이다.
안티센스 올리고머는 표적 영역에 대해 표적화 서열이 결합될 때 GAA mRNA의 엑손 2의 보유를 촉진할 수 있다. 안티센스 올리고머는 서열번호 1 내의 표적 영역에 완전히 상보적인 제2 안티센스 올리고뉴클레오티드와 비교하여 GAA 효소 활성의 효능을 보유한다. 또 다른 양태에서, 본원에 제공된 안티센스 올리고머 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
또한, 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에 제공된 안티센스 올리고머의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 안티센스 올리고머는 폼페병을 치료하는 데 사용될 수 있다.
도 1은 스크리닝 동안 다양한 PMO 화합물에 대해 발견된 GAA 효소 활성(효소 검정)을 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. Y-축은 미치료 대조군 대비 GAA 효소 활성의 배수 증가를 나타낸다. 개별 화합물을 10 mM로 투여하였다.
도 2a는 스크리닝 동안 다양한 PMO 화합물에 대해 발견된 GAA 효소 활성(효소 검정)을 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. Y-축은 미치료 대조군(UT) 대비 효소 활성(mmol/mg 시간) 및 GAA 효소 활성의 배수 증가를 나타낸다. 도 2b는 스크리닝 동안 다양한 PMO 화합물에 대해 발견된 GAA 효소 활성(효소 검정)을 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. Y-축은 미치료 대조군 대비 GAA 효소 활성의 배수 증가를 나타낸다. 개별 화합물을 20 mM로 투여하였다.
도 3은 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1의 -65 영역에서의 안티센스 마이크로워크 데이터를 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. 개별 화합물을 20 mM로 투여하였다.
도 4a는 스크리닝 동안 다양한 PPMO 화합물에 대해 발견된 GAA 효소 활성(효소 검정)을 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. X-축은 미치료 대조군 대비 GAA 효소 활성의 배수 증가를 나타낸다. 개별 화합물을 20 mM로 투여하였다.
도 4b는 스크리닝 동안 다양한 PPMO 화합물에 대해 발견된 GAA mRNA 전사체 수준(qPCR 검정)을 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. X-축은 비표적화 및 미치료 대조군 대비 GAA mRNA 내의 2개의 위치에서 측정했을 때의 GAA mRNA 전사체의 배수 증가를 나타낸다. 개별 화합물을 30 mM로 투여하였다.
도 5는 GAA 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1의 -169 영역에서의 안티센스 마이크로워크 데이터를 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. 개별 화합물을 10 mM로 투여하였다.
도 6은 PPMO #33, 34, 5, 및 7을 사용한 체질(gymnotic) 치료 후, 환자 섬유아세포에서의 GAA 효소 활성의 투여량 의존적 증가를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 7은 스크리닝 동안 PPMO 화합물에 대해 발견된 GAA mRNA 전사체 수준(qPCR 검정)을 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. Y-축은 비표적화 및 미치료 대조군 대비 GAA mRNA 전사체의 배수 증가를 나타낸다. 개별 화합물을 1, 2.5, 5, 10, 20, 및 30 mM로 투여하였다.
도 8은 선별된 PPMO #34, 5, 및 7을 사용한 체질 치료 후, 환자 iPSC 유래 근관에서의 엑손 1-2 접합부에 걸쳐 측정된 GAA 발현의 투여량 의존적 증가를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 9는 PPMO #5, 7 및 34를 사용한 치료 후, 환자 iPSC 유래 근관에서의 총 단백질에 대해 정규화된 GAA 단백질의 양의 증가를 도시하는 디지털 겔 이미지 및 그래프를 나타낸다.
도 10은 PPMO #12 및 15를 사용한 치료 후, 환자 iPSC 유래 근관에서의 총 단백질에 대해 정규화된 GAA 단백질의 양의 증가를 도시하는 디지털 겔 이미지 및 그래프를 나타낸다.
도 11은 PPMO #7, 5 및 12를 사용한 치료 후, 환자 iPSC 유래 근관에서의 GAA 효소 활성의 양의 증가를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 12는 선택된 PPMO 화합물의 응집 가능성을 도시하는 그래프를 나타낸다. 결과는 크기/강도 분포로서 도표화된다.
안티센스 올리고머 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 본원에 제공되며, 여기에서 안티센스 올리고머는 18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 여기에서 적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이다. 안티센스 올리고머는 폼페병을 포함하나 이에 한정되지 않는, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 다양한 질환을 치료하는 데 유용하다.
특정 구현예는, 세포에서 엑손-2 결실 GAA mRNA 대비 엑손 2 함유 GAA 코딩 mRNA의 수준을 향상시키는 방법에 관한 것으로서, 방법은 세포 중 엑손-2 결실 GAA mRNA 대비 엑손 2 함유 GAA mRNA의 수준이 향상되도록, 세포를 충분한 길이 및 상보성의 안티센스 올리고머와 접촉시켜 GAA 유전자 내의 영역에 특이적으로 혼성화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체의 세포이며, 방법은 안티센스 올리고머를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 세포 투과성 펩티드를 포함하는 안티센스 올리고머가 본원에 제공되며, 여기에서 안티센스 올리고머는 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 여기에서 적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이다.
폼페병을 치료하기 위한 방법 또한 본원에 제공된다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 주제를 실시하고 시험하는 데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법과 물질이 기술된다. 본 개시의 목적을 위해, 다음과 같은 용어들이 아래에 정의된다.
용어 "약"은 당업자에 의해 이해될 것이고, 사용되는 문맥에 따라 어느 정도 달라질 수 있다. 양, 시간적 지속 시간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 경우 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 특정 값으로부터 ±5%, ±1%, 및 ±0.1%를 포함하는, ±10%의 변화를 포함하는 것을 의미하는데, 이는 이러한 변화가 개시된 방법을 수행하는 데 적절하기 때문이다.
용어 "알킬"은 특정 구현예에서, 각각 1 내지 6개, 또는 1 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 포화, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 모이어티를 지칭한다. C1-6-알킬 모이어티의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 삼차-부틸, 네오펜틸, n-헥실 모이어티를 포함하나 이에 한정되지 않으며; C1-8-알킬 모이어티의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 삼차-부틸, 네오펜틸, n-헥실, 헵틸, 및 옥틸 모이어티를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
알킬 치환기 내의 탄소 원자의 개수는 접두어 "Cx-y"로 표시될 수 있으며, 여기에서, x는 치환기 내 탄소 원자의 최소 개수이고 y는 치환기 내의 탄소 원자의 최대 개수이다. 마찬가지로, Cx 사슬은 x개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 사슬을 의미한다.
용어 "헤테로알킬"은, 달리 언급되지 않는 한, 그 자체로서, 또는 다른 용어와 조합하여, 명시된 수의 탄소 원자 및 O, N, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 헤테로원자로 이루어진 안정적인 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 의미하며, 여기에서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 사차화될 수 있다. 헤테로원자(들)는, 헤테로알킬기의 나머지 부분과 헤테로알킬기가 부착되는 단편 사이를 포함하여, 헤테로알킬기의 임의의 위치에 배치될 수 있을 뿐만 아니라, 헤테로알킬기의 최원위 탄소 원자에 부착될 수 있다. 이의 예는 다음을 포함한다: -O-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-OH, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, 및 -CH2-CH2-S(=O)-CH3. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3, 또는 -CH2-CH2-S-S-CH3과 같이, 최대 2개의 헤테로원자는 연속적일 수 있다.
단독으로 또는 다른 용어와 조합하여 사용되는 용어 "아릴"은, 달리 언급되지 않는 한, 하나 이상의 고리(통상적으로 1개, 2개, 또는 3개의 고리)를 함유하는 탄소고리 방향족 시스템을 의미하며, 여기에서 이러한 고리는 바이페닐과 같은 펜던트 방식으로 함께 부착될 수 있거나, 나프탈렌과 같이 융합될 수 있다. 아릴기의 예는 페닐, 안트라실, 및 나프틸을 포함한다. 다양한 구현예에서, 아릴기의 예는 페닐(예를 들어, C6-아릴) 및 바이페닐(예를 들어, C12-아릴)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아릴기는 6 내지 16개의 탄소 원자를 갖는다. 일부 구현예에서, 아릴기는 6 내지 12개의 탄소 원자(예를 들어, C6-12-아릴)를 갖는다. 일부 구현예에서, 아릴기는 6개의 탄소 원자(예를 들어, C6-아릴)를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 방향족 특성을 갖는 헤테로고리를 지칭한다. 헤테로아릴 치환기는 탄소 원자의 수에 의해 정의될 수 있으며, 예를 들어, C1-9-헤테로아릴은 헤테로원자의 수를 포함하지 않으며 헤테로아릴기에 함유된 탄소 원자의 수를 나타낸다. 예를 들어, C1-9-헤테로아릴은 추가의 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함할 것이다. 다환 헤테로아릴은 부분적으로 포화된 하나 이상의 고리를 포함할 수 있다. 헤테로아릴의 비제한적인 예는, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐(예를 들어, 2- 및 4-피리미디닐 포함), 피리다지닐, 티에닐, 푸릴, 피롤릴(예를 들어, 2-피롤릴 포함), 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 피라졸릴(예를 들어, 3- 및 5-피라졸릴 포함), 이소티아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,3,4-트리아졸릴, 테트라졸릴, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 및 1,3,4-옥사디아졸릴을 포함한다.
다환 헤테로고리 및 헤테로아릴의 비제한적인 예는, 인돌릴(예를 들어, 3-, 4-, 5-, 6- 및 7-인돌릴 포함), 인돌리닐, 퀴놀릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 이소퀴놀릴(예를 들어, 1- 및 5-이소퀴놀릴 포함), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀릴, 신놀리닐, 퀴녹살리닐(예를 들어, 2- 및 5-퀴녹살리닐 포함), 퀴나졸리닐, 프탈라지닐, 1,8-나프티리디닐, 1,4-벤조디옥사닐, 쿠마린, 디하이드로쿠마린, 1,5-나프티리디닐, 벤조푸릴(예를 들어, 3-, 4-, 5-, 6- 및 7-벤조푸릴 포함), 2,3-디하이드로벤조푸릴, 1,2-벤즈이속사졸릴, 벤조티에닐(예를 들어, 3-, 4-, 5-, 6-, 및 7-벤조티에닐 포함), 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴(예를 들어, 2-벤조티아졸릴 및 5-벤조티아졸릴 포함), 퓨리닐, 벤즈이미다졸릴(예를 들어, 2-벤즈이미다졸릴 포함), 벤조트리아졸릴, 티옥산티닐, 카르바졸릴, 카르보리닐, 아크리디닐, 피롤리지디닐, 및 퀴놀리지디닐을 포함한다.
용어 "보호기" 또는 "화학적 보호기"는 화합물의 일부 또는 모든 반응성 모이어티를 차단하고, 해당 보호기가 제거될 때까지 이러한 모이어티가 화학 반응에 참여하는 것을 방지하는 화학적 모이어티, 예를 들어, T.W. Greene, P.G.M. Wuts의 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis, 제3판, John Wiley & Sons (1999)]에 열거되고 기술된 모이어티를 지칭한다. 상이한 보호기가 사용되는 경우, 각각의 (상이한) 보호기는 상이한 수단에 의해 제거될 수 있는 것이 유리할 수 있다. 완전히 이질적인 반응 조건 하에서 절단되는 보호기는 이러한 보호기의 차별적인 제거를 가능하게 한다. 예를 들어, 보호기는 산, 염기, 및 수소화분해에 의해 제거될 수 있다. 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 아세탈 및 삼차-부틸디메틸실릴과 같은 기는 산 불안정성이며, 수소화분해에 의해 제거 가능한 Cbz 기 및 염기 불안정성인 Fmoc 기로 보호된 아미노 기의 존재 하에 카르복시 및 하이드록시 반응성 모이어티를 보호하는 데 사용될 수 있다. 카르복실산 모이어티는 비제한적으로 메틸, 또는 에틸과 같은 염기 불안정성 기로 차단될 수 있으며, 하이드록시 반응성 모이어티는 삼차-부틸 카르바메이트와 같은 산 불안정성 기로 차단된 아민의 존재 하에 아세틸과 같은 염기 불안정성 기로 차단되거나 산 및 염기 안정성이지만 가수분해적으로 제거 가능한 카르바메이트로 차단될 수 있다.
카르복실산 및 하이드록실 반응성 모이어티는 또한 벤질기와 같은 가수분해적으로 제거 가능한 보호기로 차단될 수 있는 한편, 아민기는 Fmoc와 같은 염기 불안정성 기로 차단될 수 있다. 화학식 I 및 화학식 IV의 화합물의 합성에 특히 유용한 아민 보호기는 트리플루오로아세트아미드이다. 카르복실산 반응성 모이어티는 2,4-디메톡시벤질과 같은 산화적으로 제거 가능한 보호기로 차단될 수 있는 한편, 공존하는 아미노기는 불화물 불안정성 실릴 카르바메이트로 차단될 수 있다.
알릴 차단기는, 산-보호기 및 염기-보호기의 존재 하에서 유용하며, 이는 전자가 안정적이고 후속하여 금속 또는 pi-산 촉매에 의해 제거될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 알릴-차단된 카르복실산은 산 불안정성인 t-부틸 카르바메이트 또는 염기-불안정성 아세테이트 아민 보호기의 존재 하에 팔라듐(0)-촉매 반응으로 탈보호될 수 있다. 또 다른 형태의 보호기는 화합물 또는 중간체가 부착될 수 있는 수지이다. 잔기가 수지에 부착되는 한, 해당 작용기는 차단되고 반응할 수 없다. 일단 수지로부터 해제되면, 작용기는 반응할 수 있다.
용어 "핵염기", "염기 페어링 모이어티", "핵염기 페어링 모이어티", 또는 "염기"는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 및/또는 모르폴리노 서브유닛의 헤테로시클릭 고리 부분을 지칭한다. 핵염기는 자연 발생(예를 들어, 우라실, 티민, 아데닌, 시토신, 및 구아닌)일 수 있거나, 이들 자연 발생 핵염기의 변형체 또는 유사체일 수 있으며, 예를 들어, 핵염기의 하나 이상의 질소 원자는 각각의 경우에 독립적으로 탄소로 치환될 수 있다. 예시적인 유사체는 하이포크산틴(뉴클레어시드 이노신의 염기 성분); 2,6-디아미노퓨린; 5-메틸 시토신; C5-프로피닐-변형 피리미딘; 10-(9-(아미노에톡시)페녹사지닐)(G-클램프) 등을 포함한다.
염기 페어링 모이어티의 추가적인 예는, 아실 보호기에 의해 보호되는 각각의 아미노 기를 갖는 우라실, 티민, 아데닌, 시토신, 구아닌 및 하이포크산틴, 2-플루오로우라실, 2-플루오로시토신, 5-브로모라실, 5-요오드우라실, 2,6-디아미노퓨린, 아자시토신, 피리미딘 유사체(예컨대, 슈도이소시토신 및 슈도우라실) 및 다른 변형된 핵염기, 예컨대 8-치환된 퓨린, 크산틴, 또는 하이포크산틴(마지막 두 개는 천연 분해 산물임)을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 그 내용이 본원에 참조로서 통합되는, Chiu 및 Rana의 문헌[(2003) RNA 9:1034-1048], Limbach 등의 문헌[(1994) Nucleic Acids Res. 22:2183-2196] 및 Revankar 및 Rao의 문헌[Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313]에 개시된 변형된 핵염기 또한 고려된다.
염기 페어링 모이어티의 추가적인 예는 하나 이상의 벤젠 고리가 추가된 확장된-크기의 핵염기를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 핵 염기 교체는 다음의 문헌에 기술되어 있다: Glen Research 카탈로그 (www.glenresearch.com); Krueger AT 등의 문헌[ (2007) Acc. Chem. Res. 40:141-150; Kool ET의 문헌[(2002) Acc. Chem. Res. 35:936-943]; Benner SA 등의 문헌[ (2005) Nat. Rev. Genet. 6:553-543]; Romesberg FE 등의 문헌[ (2003) Curr. Opin. Chem. Biol. 7:723-733]; Hirao, I의 문헌[(2006) Curr. Opin. Chem. Biol. 10:622-627]; 이들의 내용은 참조로서 본원에 통합되고, 본원에 기술된 올리고머의 합성에 유용한 것으로 고려된다. 확장된 크기의 핵염기의 예가 아래에 제시된다:
용어 "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고머"는 복수의 연결된 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오시드와 뉴클레오티드 둘 모두의 조합을 포함하는 화합물을 지칭한다. 본원에 제공된 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안티센스 올리고머" 또는 "안티센스 화합물"은 상호교환적으로 사용되고, 서브유닛의 서열을 지칭하며, 각각은 리보오스 또는 다른 오탄당 또는 모르폴리노기로 이루어진 백본 서브유닛 상에서 운반되는 염기를 갖고, 여기에서 백본 기는 화합물 중 염기가 Watson-Crick 염기 페어링에 의해 핵산(일반적으로 RNA) 내의 표적 서열에 혼성화될 수 있게 하는 서브유닛간 결합에 의해 연결되어, 표적 서열 내에 핵산 올리고머 이종이중체를 형성한다. 올리고머는 표적 서열에 대해 정확한 서열 상보성 또는 거의 정확한 상보성을 가질 수 있다. 이러한 안티센스 올리고머는 표적 서열을 함유하는 mRNA의 번역을 차단하거나 억제하도록 설계되며, 이를 혼성화하는 서열로 "유도"되는 것으로 언급될 수 있다.
또한, 본원에서 "안티센스 올리고머" 또는 "안티센스 화합물"의 유형으로서 고려되는 것은 포스포로티오에이트-변형 올리고머, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 2'-플루오로-변형 올리고머, 2'-O,4'-C-에틸렌-가교 핵산(ENA), 트리시클로-DNA, 트리실로-DNA 포스포로티오에이트-변형 올리고머, 2'-O-[2-(N-메틸카르바모일)에틸] 변형 올리고머, 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형 올리고머, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 변형 올리고머, 및 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 조합뿐만 아니라, 당업계에 공지된 다른 안티센스 제제를 포함한다.
37℃ 초과, 45℃ 초과, 바람직하게는 적어도 50℃, 및 통상적으로 60℃ 내지 80℃ 이상의 Tm으로 안티센스 올리고머가 생리학적 조건 하에서 표적에 혼성화되는 경우, 해당 안티센스 올리고머는 표적 폴리뉴클레오티드에 "특이적으로 혼성화"되는 것이다. 올리고머의 "Tm"은 50%가 상보성 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 온도이다. Tm은, 예를 들어, Miyada 등의 문헌 [(1987) Methods Enzymol. 154:94-107]에 기술된 바와 같이, 생리식염수의 표준 조건 하에서 결정된다. 이러한 혼성화는 표적 서열에 대한 안티센스 올리고머의 "거의" 또는 "실질적인" 상보성뿐만 아니라 정확한 상보성으로 발생할 수 있다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 염기 페어링 규칙과 관련된 올리고뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드의 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 서열 "T-G-A (5'-3')"은 서열 "T-C-A (5'-3')"에 대해 상보적이다. 상보성은 핵산의 염기 중 단지 일부만이 염기 페어링 규칙에 따라 매칭되는 "부분적" 상보성일 수 있다. 또는, 핵산 간의 "완전한", "전체", 또는 "완벽한"(100%) 상보성이 존재할 수 있다. 핵산 가닥 간의 상보성은 핵산 가닥 간의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다. 완벽한 상보성이 종종 바람직하지만, 일부 구현예는 표적 RNA에 대해 하나 이상의, 그러나 바람직하게는 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 미스매치를 포함할 수 있다. 이러한 혼성화는 표적 서열에 대한 안티센스 올리고머의 "거의" 또는 "실질적인" 상보성뿐만 아니라 정확한 상보성으로 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 상보성으로 표적 서열에 혼성화될 수 있다. 올리고머 내의 임의의 위치에서의 변이가 포함된다. 특정 구현예에서, 올리고머의 종결부 근처의 서열 변이는 대체적으로 내부에서의 변이보다 바람직하며, 존재하는 경우, 이들은 일반적으로 5'-말단, 3'-말단, 또는 두 말단 모두의 약 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 뉴클레오티드 내에 있다.
용어 "TEG", "EG3", 또는 "트리에틸렌 글리콜 테일"은, 예를 들어, 이의 3' 말단 또는 5' 말단에서 올리고머에 접합된 트리에틸렌 글리콜 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "TEG"는 다음을 포함하되, 예를 들어, 화학식 I 또는 화학식 IV의 접합체의 A'는 해당 화학식을 갖는다:
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자연 발생 뉴클레오티드 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 및 우라실을 포함하며, 이들은 각각 기호 A, G, C, T, 및 U를 갖는다. 뉴클레오티드 염기는 또한 자연 발생 뉴클레오티드 염기의 유사체를 포함할 수 있다. 염기 페이링은 일반적으로 퓨린 A와 피리미딘 T 또는 U 사이, 및 퓨린 G와 피리미딘 C 사이에서 발생한다.
올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기(당업계에서 종종 단순히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형된 염기 또는 치환된 염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 핵산에서 가장 흔히 발견되는 하나 이상의 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기가 덜 흔한 염기 또는 비-천연 염기로 치환되는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵염기는 퓨린 염기의 N9 원자에서, 또는 피리미딘 염기의 N1 원자에서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 모르폴린 고리에 공유 결합된다.
퓨린 염기는 다음의 일반식에 의해 설명되는 바와 같이 이미다졸 링에 축합된 피리미딘 고리를 포함한다:
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아데닌과 구아닌은 핵산에서 가장 흔히 발견되는 2개의 퓨린 핵염기이다. 이들은 N6-메틸아데닌, N2-메틸구아닌, 하이포크산틴 및 7-메틸구아닌을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다른 자연 발생 퓨린으로 치환될 수 있다.
피리미딘 염기는 다음의 일반식으로 기술된 바와 같은 6-원 피리미딘 고리를 포함한다:
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시토신, 우라실 및 티민은 핵산에서 가장 흔히 발견되는 피리미딘 염기이다. 이들은 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 슈도우라실 및 4-티오우라실을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다른 자연 발생 피리미딘으로 치환될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드는 우라실 대신 티민 염기를 함유한다.
다른 변형 또는 치환된 염기는: 2,6-디아미노퓨린, 오르토산, 아그마티딘(agmatidine), 리시딘, 2-티오피리미딘(예를 들어, 2-티오우라실, 2-티오티민), G-클램프와 이의 유도체, 5-치환 피리미딘(예를 들어, 5-할로우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 5-아미노메틸우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-아미노메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 수퍼-T), 7-데아자구아니, 7-데아자아데닐, 7-아자-2,6-디아미노퓨린, 8-아자-7-데아자구아닌, 8-아자-7-데아자아데닌, 8-아자-7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 수퍼 G, 슈퍼 A, 및 N4-에틸시토신, 또는 이들의 유도체; N2-시클로펜틸구아닌 (cPent-G), N2-시클로펜틸-2-아미노퓨린 (cPent-AG), 및 N2-프로필-2-아미노퓨린 (Pr-AP), 슈도우라실, 또는 이들의 유도체; 및 2,6-디플루오로오톨루엔과 같은 등의 축퇴행성 또는 범용 염기, 또는 무염기성 부위와 같은 부재 염기(예를 들어, 1-데옥시리보오스, 1,2-디데옥시리보오스, l-데옥시-2-O-메틸리보오스; 또는 고리 산소가 질소로 치환된 피롤리돈 유도체(아자리보오스))를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 슈도우라실은 우라실의 자연 발생 이성질체 버전으로서, 우리딘(uridine)에서와 같이 정상적인 N-글리코시드가 아닌 C-글리코시드를 갖는다.
특정 변형 또는 치환된 핵염기는 본 개시의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6, 및 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 다양한 구현예에서, 핵염기는 핵산 이중체 안정성을 0.6-1.2℃만큼 증가시키는 것으로 나타난 5-메틸시토신 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형 또는 치환된 핵염기는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 정제를 용이하게 하는 데 유용하다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의(예를 들어, 3, 4, 5, 6개 이상의) 연속 구아닌 염기를 함유할 수 있다. 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드에서, 3개 이상의 연속 구아닌 염기의 스트링은 올리고뉴클레오티드의 응집을 초래하여 정제를 복잡하게 할 수 있다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드에서, 연속 구아닌 중 하나 이상은 하이포크산틴으로 치환될 수 있다. 3개 이상의 연속 구아닌 염기의 스트링 중 하나 이상의 구아닌에 대한 하이포크산틴의 치환은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 응집을 감소시켜 정제를 용이하게 할 수 있다.
용어 "비염기성 서브유닛"은 안티센스 올리고머 중 퓨린 및 피리미딘이 없는 서브유닛을 지칭한다. 일 구현예에서, "비염기성 서브유닛"은 수소이다. 본원에 통합된 비염기성 서브유닛은 안티센스 백본을 유지하지만 퓨린 또는 피리미딘 염기를 함유하지 않는다. 비염기성 서브유닛을 포함하는 안티센스 올리고머의 비제한적인 예가 아래에 도시되어 있다:
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본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 합성되며, 생물학적 기원의 안티센스 조성물을 포함하지 않는다. 본 개시의 분자는 또한 흡입, 분포, 또는 흡수, 또는 이들의 조합을 돕기 위해, 예를 들어 리포솜, 수용체-표적화 분자, 경구, 직장, 국소, 또는 다른 제형과 같은 다른 분자, 분자 구조, 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 캡슐화, 접합, 또는 달리 연관될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산 유사체"는 비-자연 발생 핵산 분자를 지칭한다. 핵산은 선형 구조로 함께 연결된 뉴클레오티드 서브유닛의 중합체이다. 각각의 뉴클레오티드는 오탄당(5-탄소 당)에 부착된 질소 함유 방향족 염기로 구성되며, 이는 결국 인산염기에 부착된다. 연속적인 인산염기는 포스포디에스테르 결합을 통해 함께 연결되어 중합체를 형성한다. 자연 발생 핵산의 2개의 일반적인 형태는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)이다. 해당 사슬의 일 말단은 당 모이어티의 5'-탄소 원자에 부착된 유리 인산염기를 운반하며, 해당 분자의 5' 말단으로 불린다. 다른 말단은 당 모이어티의 3'-탄소에서 유리 하이드록실(-OH)기를 가지며, 해당 분자의 3' 말단으로 불린다. 핵산 유사체는 하나 이상의 비-자연 발생 핵염기, 당, 및/또는 뉴클레오티드간 결합, 예를 들어 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 특정 구현예에서, "핵산 유사체"는 PMO이고, 특정 구현예에서, "핵산 유사체"는 양으로 하전된 양이온성 PMO이다.
"모르폴리노 올리고머" 또는 "PMO"는 일반적인 폴리뉴클레오티드에 수소 결합할 수 있는 염기를 지지하는 백본을 갖는 중합체 분자를 지칭하며, 여기에서 중합체는 오탄당 골격 모이어티가 결여되어 있고, 보다 구체적으로는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 전형적인 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 리보오스 백본이 결여되어 있지만, 이를 대신하여 고리 질소를 통한 커플링을 갖는 고리 질소를 함유한다. 예시적인 "모르폴리노" 올리고머는 포스포라미데이트 또는 포스포로디아미데이트 결합에 의해 함께 연결된 모르폴리노 서브유닛 구조를 포함하며, 이는 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접한 서브유닛의 5' 엑소시클릭 탄소에 결합시키며, 여기에서 각각의 서브유닛은 염기 특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오티드 중의 염기에 결합하는 데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기 페이링 모이어티를 포함한다. 모르폴리노 올리고머(안티센스 올리고머를 포함함)는, 예를 들어, 미국 특허 제5,034,506호; 제5,142,047호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,217,866호; 제5,506,337호; 제5,521,063호; 제5,698,685호; 제8,076,476호; 및 제8,299,206호; 그리고 PCT 공개 번호 WO 2009/064471에 기술되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.
바람직한 모르폴리노 올리고머는 본원에서 PMO로 지칭되는 포스포로디아미데이트-결합 모르폴리노 올리고머이다. 이러한 올리고머는 아래에 도시된 것과 같은 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성된다:
식 중, X는 NH2, NHR, 또는 NR2이고(여기에서 R은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸임), Y1은 O이고, Z는 O이고, Pi 및 Pj는 염기 특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오티드 중의 염기에 결합하는 데 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기 페어링 모이어티이다. 또한, 대안적인 포스포로디아미데이트 결합을 갖는 구조가 바람직하며, 여기에서 X는 메톡시 또는 에톡시와 같은 저급 알콕시이고, Y1은 NH 또는 NR이고(여기에서, R은 저급 알킬임), Z는 O이다.
대표적인 PMO는 서브유닛 간 결합이 결합(A1)인 PMO를 포함한다. 표 1을 참조한다.
"포스포라미데이트" 기는 3개의 부착된 산소 원자 및 1개의 부착된 질소 원자를 갖는 인을 포함하는 한편, "포스포로디아미데이트" 기는 2개의 부착된 산소 원자 및 2개의 부착된 질소 원자를 갖는 인을 포함한다. 대표적인 포스포로디아미데이트의 예는 다음과 같다:
각각의 Pi는, 독립적으로, H, 핵염기, 및 화학적 보호기로 관능화된 핵염기로부터 선택되며, 여기에서 핵염기는, 각각의 경우 독립적으로, 피리딘, 피리미딘, 트리아지난, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택되는 C3-6 헤테로시클릭 고리를 포함하고; n은 6 내지 38의 정수이다. PMO의 3' 종결부에서의 서브유닛의 고리 질소는 아세틸과 같은 캡핑기로 캡핑될 수 있거나, 유리 수소로 캡핑 해제될 수 있다.
본원에 기술된 올리고머의 하전되지 않거나 변형된 서브유닛간 결합에서, 하나의 질소는 항상 백본 사슬에 매달린다. 포스포로디아미데이트 결합에서, 제2 질소는 일반적으로 모르폴리노 고리 구조 중의 고리 질소이다.
PMO는 스플라이싱 또는 번역 기구 성분의 결합 또는 진행을 방지함으로써 유전자 발현을 억제하는, 수용성, 하전되지 않은, 또는 실질적으로 하전되지 않은 안티센스 분자이다. PMO는 또한 바이러스 복제를 억제하거나 차단하는 것으로 밝혀졌다(Stein, Skilling 등의 문헌(2001); McCaffrey, Meuse 등의 문헌(2003)). 이들은 효소 분해에 대해 내성이 높다(Hudziak, Barofsky 등의 문헌(1996)). PMO는 시험관 내 무세포 및 세포 배양 모델(Stein, Foster 등의 문헌(1997); Summerton 및 Weller의 문헌(1997)), 및 제브라피쉬, 개구리, 및 성게 배아 생체 내(Heasman, Kofron 등의 문헌(2000); Nasevicius 및 Ekker의 문헌(2000)) 뿐만 아니라, 성체 동물 모델, 예컨대 랫트, 마우스, 토끼, 개, 및 돼지(예를 들어, Arora 및 Iversen의 문헌(2000); Qin, Taylor 등의 문헌(2000); Iversen의 문헌(2001); Kipshidze, Keane 등의 문헌(2001); Devi의 문헌(2002); Devi, Oldenkamp 등의 문헌(2002); Kipshidze, Kim 등의 문헌(2002); Ricker, Mata 등의 문헌(2002) 참조)에서 높은 안티센스 특이성 및 효능을 입증하였다.
안티센스 PMO 올리고머는 다른 널리 사용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 비해, 세포 내로 흡수되고, 더 적은 비특이적 효과로 생체 내에서 보다 일관되게 효과적인 것으로 밝혀졌다(예를 들어, P. Iversen의 문헌["Phosphoramidite Morpholino Oligomers," in Antisense Drug Technology, S.T. Crooke, 편집, Marcel Dekker, Inc., New York, 2001] 참조). 아르기닌-풍부 펩티드에 대한 PMO의 접합은 이들의 세포 흡수를 증가시키는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는, 미국 특허 제7,468,418호 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "하전된", "하전되지 않은", "양이온성", 및 "음이온성"은 중성에 가까운 pH, 예를 들어, 약 pH 6 내지 8의 화학적 모이어티가 우세한 상태를 지칭한다. 예를 들어, 해당 용어는 생리학적 pH, 즉 7.4의 화학적 모이어티가 우세한 상태를 지칭할 수 있다.
"양이온성 PMO" 또는 "PMO+"는 이전에 기술된(예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는 PCT 공개 WO 2008/036127 참조) 임의의 수의 (1-피페라지노)포스피닐리덴옥시, (1-(4-(ω-구아니디노-알카노일))-피페라지노)포스피닐리덴옥시 결합(A2 및 A3; 표 1 참조)을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 지칭한다.
올리고뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 하전되지 않은 올리고뉴클레오티드 유사체)의 "백본"은 염기 페어링 모이어티를 지지하는 구조를 지칭하며; 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 모르폴리노 올리고머의 경우, "백본"은 서브유닛간 결합(예를 들어, 인 함유 결합)에 의해 연결된 모르폴리노 고리 구조를 포함한다. "실질적으로 하전되지 않은 백본"은 올리고뉴클레오티드 유사체의 백본을 지칭하며, 여기에서 서브유닛간 결합의 50% 미만은 중성 pH에 가깝게 하전된다. 예를 들어, 실질적으로 하전되지 않은 백본은, 중성 pH에 가깝게 하전된, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 심지어 0%의 서브유닛간 결합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 실질적으로 하전되지 않은 백본은, (생리학적 pH에서) 4개의 하전되지 않은 결합마다 (생리학적 pH에서) 최대 1개의 하전된 서브유닛간 결합을 포함하고, 8개마다 최대 1개, 또는 16개의 하전되지 않은 결합마다 최대 1개를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 핵산 유사체는 완전히 하전되지 않는다.
용어 "표적화 염기 서열" 또는 단순히 "표적화 서열"은 표적 서열, 예를 들어, 인간의 RNA 게놈 내의 표적 서열에 상보적인(또한, 실질적으로 상보적인) 핵산 유사체 내의 서열이다. 유사체 화합물의 전체 서열, 또는 이의 일 부분만이 표적 서열에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 20개의 염기를 갖는 유사체에서, 12-14개만이 표적화 서열일 수 있다. 일반적으로, 표적화 서열은 유사체 중의 인접한 염기로 형성되지만, 대안적으로, 예를 들어 유사체의 대향 단부로부터 함께 배치될 때, 표적 서열에 걸쳐 있는 서열을 구성하는 비연속적인 서열로 형성될 수 있다.
용어 "펩티드"는 복수의 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭한다. 본원에 제공된 펩티드는 세포성 투과 펩티드인 것으로 간주될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "세포 투과성 펩티드"(CPP) 또는 "담체 펩티드"는 세포에 의한 PMO의 흡수를 촉진할 수 있고, 이에 의해 PMO를 세포의 내부(세포질)에 전달할 수 있는 비교적 짧은 펩티드이다. CPP 또는 담체 펩티드는 일반적으로 약 12 내지 약 40개 아미노산 길이이다. 담체 펩티드의 길이는 특별히 제한되지 않으며 상이한 구현예에서 다양하다. 일부 구현예에서, 담체 펩티드는 4 내지 40개의 아미노산 서브유닛을 포함한다. 다른 구현예에서, 담체 펩티드는 6 내지 30개, 6 내지 20개, 8 내지 25개, 또는 10 내지 20개의 아미노산 서브유닛을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 CPP 구현예는 이하에서 추가로 설명되는 바와 같이 아르기닌-풍부 펩티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "펩티드-접합 포스포로디아미데이트-결합 모르폴리노 올리고머" 또는 "PPMO"는 펩티드, 예컨대 세포 투과성 펩티드(CPP) 또는 담체 펩티드에 공유 결합된 PMO를 지칭한다. 세포 투과성 펩티드는 세포에 의한 PMO의 흡수를 촉진함으로써, PMO를 세포의 내부(세포질)에 전달한다. 이의 아미노산 서열에 따라, CPP는 대체적으로 효과적일 수 있거나, 특정 유형 또는 특정 유형들의 세포에 대한 PMO 전달에 특이적 또는 선택적으로 효과적일 수 있다. PMO 및 CPP는 일반적으로 이들의 말단에서 연결되며, 예를 들어, CPP의 C-종결 말단은 PMO의 5' 말단에 연결될 수 있거나, PMO의 3' 말단은 CPP의 N-종결 말단에 연결될 수 있다. PPMO는 하전되지 않은 PMO, 하전된(예를 들어, 양이온성) PMO, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 접합체의 연결 모이어티는 PPMO를 방출하도록 절단될 수 있다.
담체 펩티드는 직접적으로 또는 선택적인 링커, 예를 들어, 하나 이상의 추가 자연 발생 아미노산, 예를 들어 시스테인(C), 글리신(G), 또는 프롤린(P), 또는 추가 아미노산 유사체, 예를 들어, 6-아미노헥산산(X), 베타-알라닌(B), 또는 XB를 통해 핵산 유사체에 연결될 수 있다. 당업계에 공지된 다른 연결 모이어티 또한 사용될 수 있다.
"아미노산 서브유닛"은 일반적으로 α-아미노산 잔기(-CO-CHR-NH-)이지만; R이 아미노산 측쇄인 β- 또는 다른 아미노산 잔기(예를 들어, -CO-CH2CHR-NH-)일 수도 있다.
용어 "자연 발생 아미노산"은 자연에서 발견되는 단백질에 존재하는 아미노산을 지칭하며; 이의 예는 알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글리신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 리신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V), 트립토판(W), 및 티로신(Y)을 포함한다. 용어 "비-천연 아미노산"은 자연에서 발견되는 단백질에 존재하지 않는 아미노산을 지칭하며; 이의 예는 베타-알라닌(β-Ala) 및 6-아미노헥사논산(Ahx)을 포함한다.
제제가 세포막을 가로지르는 수동적 확산 이외의 메커니즘에 의해 세포 내에 진입할 수 있는 경우, 해당 제제는 "포유류 세포에 의해 능동적으로 흡수된다". 제제는, 예를 들어, ATP-의존적 수송 메커니즘에 의해, 포유류 세포막을 가로지르는 제제의 수송을 지칭하는 "활성 수송"에 의해, 또는 수송 단백질에 대한 제제의 결합을 필요로 하는 수송 메커니즘에 의해 세포막을 가로지르는 안티센스 제제의 수송을 지칭하는 "촉진 수송"에 의해 수송될 수 있으며, 이는 이어서 막을 가로지르는 결합된 제제의 통과를 용이하게 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유효량"은 원하는 생물학적 결과를 달성하기에 충분한 물질의 임의의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 원하는 치료적 결과를 달성하기에 충분한 물질의 임의의 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대상체"는 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 염소, 양, 고양이, 개, 돼지, 소, 말, 원숭이, 비인간 영장류, 또는 인간을 포함할 수 있는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
개체(예를 들어, 포유류, 예컨대 인간) 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포의 자연 과정을 변경시키는 데 사용되는 임의의 유형의 개입이다. 치료는, 약학적 조성물의 투여를 포함하나 이에 한정되지는 않으며, 예방적으로 수행되거나 병리적 이벤트의 개시 또는 기병성 인자(etiologic agent)와의 접촉이 있은 후에 수행될 수 있다.
II. 펩티드-올리고뉴클레오티드
본원에 제공된 일부 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 올리고머가 제공되며, 여기에서:
변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 여기에서:
안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고머를 포함하고;
안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 서브유닛은 핵염기를 포함하거나 비염기 서브유닛이며, 여기에서 각각의 서브유닛은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단까지 순서대로 함께 취해져 표적화 서열을 형성하고;
적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이고;
표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 80% 상보적이다.
일 구현예에서, 비염기성 서브유닛은 표적화 서열의 내부에 있다.
일 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 20-40개 서브유닛 길이이다. 다른 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 19-29개 서브유닛 길이이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18-40, 19-30, 19-29, 20-40, 20-30, 20-25, 21-40, 21-30, 21-25, 22-40, 22-30, 22-25, 23-40, 23-30, 또는 23-25개 서브유닛 길이이다. 또 다른 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 서브유닛 길이이다.
일 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학식 I의 안티센스 올리고머 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이고:
식 중:
A'은 -N(H)CH2C(O)NH2, -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2, 및 로부터 선택되고, 식 중
R5는 -C(O)(O-알킬)x-OH이고, 식 중 x는 3-10이고, 각각의 알킬기는, 각각의 경우 독립적으로, C2-6-알킬이거나,
R5는 H, -C(O)C1-6-알킬, 트리틸, 모노메톡시트리틸, -(C1-6-알킬)-R6, -(C1-6-헤테로알킬)-R6, 아릴-R6, 헤테로아릴-R6, -C(O)O-(C1-6-알킬)-R6, -C(O)O-아릴-R6, -C(O)O-헤테로아릴-R6, 및 로부터 선택되고;
R6은 OH, SH, 및 NH2로부터 선택되거나, R6은 O, S, 또는 NH이고, 이들 각각은 고형 지지체에 공유 결합되고;
각각의 R1은 OH 및 -N(R3)(R4)로부터 독립적으로 선택되고, 식 중 R3 및 R4는, 각각의 경우 독립적으로, H 또는 -C1-6-알킬이고;
각각의 R2는, 각각의 경우 독립적으로, H(비염기성), 핵염기, 및 화학적 보호기로 관능화된 핵염기로부터 선택되되, 핵염기는, 각각의 경우 독립적으로, 피리딘, 피리미딘, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택되는 C3-6-헤테로시클릭 고리를 포함하고;
t는 8-40이고;
E'은 H, -C1-6-알킬, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸, 및 로부터 선택되고;
식 중
Q는 -C(O)(CH2)6C(O)- 또는 -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-이고;
R7은 -(CH2)2OC(O)N(R8)2이고, 식 중 R8은 -(CH2)6NHC(=NH)NH2이고;
L은 글리신, 프롤린, W, W-W, 또는 R9로부터 선택되되, L은 아미드 결합에 의해 J의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합되고;
W는 -C(O)-(CH2)m-NH-이고, 식 중 m은 2 내지 12이고;
R9는:
및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
p는 2, 3, 4, 또는 5이고;
R10은 결합, 글리신, 프롤린, W, 또는 W-W로부터 선택되고;
R11은 글리신, 프롤린, W, W-W, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R16은 결합, 글리신, 프롤린, W, 또는 W-W로부터 선택되되; R16은 아미드 결합에 의해 J의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합되고; J는 세포 투과성 펩티드이며;
G는 H, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되되, G는 J에 공유 결합된다.
일 양태에서, 안티센스 올리고머가 본원에 개시되며, 여기에서 안티센스 올리고머는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 세포 투과성 펩티드를 포함하는 접합체이되:
변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 여기에서
안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고머를 포함하고;
안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 투과성 펩티드에 공유 결합되고;
안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 서브유닛은 핵염기를 포함하거나 비염기 서브유닛이며, 여기에서 각각의 서브유닛은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단까지 순서대로 함께 취해져 표적화 서열을 형성하고;
적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이고;
표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 80% 상보적이다.
일 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 20-40개 서브유닛 길이이다. 다른 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 19-29개 서브유닛 길이이다.
일 구현예에서, 표적 영역은 서열번호 2(GAA-IVS1(-189-167)) 및 서열번호 3(GAA-IVS1(-80-24))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 표적 영역은 서열번호 2로서 제시된 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 표적 영역은 서열번호 3으로서 제시된 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-189-167), GAA-IVS1(-80-56), GAA-IVS1(-76-52), GAA-IVS1(-74-55), GAA-IVS1(-72-48), GAA-IVS1(-71-47), GAA-IVS1(-70-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-66-42), GAA-IVS1(-65-41), 및 GAA-IVS1(-49-24)로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-189-167)이다. 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-72,-48)이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-71,-47)이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-70,-46)이다. 일 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-69-45)이다. 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-65,-41)이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-66,-42)이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열 CCA GAA GGA AXX XCG AGA AAA GC(서열번호 4)를 포함하며, 여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다:
i) 서열번호: 5(CCA GAA GGA AGG BCG AGA AAA GC);
ii) 서열번호 6(CCA GAA GGA AGB GCG AGA AAA GC);
iii) 서열번호 7(CCA GAA GGA ABG GCG AGA AAA GC);
iv) 서열번호 8(CCA GAA GGA AGB BCG AGA AAA GC);
v) 서열번호 9(CCA GAA GGA ABB GCG AGA AAA GC); and
vi) 서열번호: 10(CCA GAA GGA ABG BCG AGA AAA GC).
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 5(CCA GAA GGA AGG BCG AGA AAA GC)를 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 6(CCA GAA GGA AGB GCG AGA AAA GC)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 7(CCA GAA GGA ABG GCG AGA AAA GC)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 8(CCA GAA GGA AGB BCG AGA AAA GC)을 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 9(CCA GAA GGA ABB GCG AGA AAA GC)를 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 10(CCA GAA GGA ABG BCG AGA AAA GC)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열 CCA GAA GGA AXX XCG AGA AAA GC(서열번호 4)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 5(CCA GAA GGA AGG BCG AGA AAA GC)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 6(CCA GAA GGA AGB GCG AGA AAA GC)으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 7(CCA GAA GGA ABG GCG AGA AAA GC)로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 8(CCA GAA GGA AGB BCG AGA AAA GC)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 9(CCA GAA GGA ABB GCG AGA AAA GC)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 10(CCA GAA GGA ABG BCG AGA AAA GC)으로 이루어진다.
일 구현예에서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-80-56), GAA-IVS1(-76-52), GAA-IVS1(-74-55), GAA-IVS1(-72-48), GAA-IVS1(-71-47), GAA-IVS1(-70-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-66-42), GAA-IVS1(-65-41), 및 GAA-IVS1(-49-24)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-72-48), GAA-IVS1(-71-47), GAA-IVS1(-70-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-66-42), 및 GAA-IVS1(-65-41)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며:
i) 서열번호: 11(CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG CTC T);
ii) 서열번호 12(ACT CAC XXX XCT CTC AAA GCA GCT C);
iii) 서열번호 13(CAC TCA CXX XXC TCT CAA AGC AGC T);
iv) 서열번호 14(GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG C);
v) 서열번호 15(GCG GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG C);
vi) 서열번호: 16(GGC GGC ACT CAC XXX XCT CTC AAA G);
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 서열번호: 17(GCA CTC ACB GGG CTC TCA AAG CAG C);
ii) 서열번호 18(GCA CTC ACG BGG CTC TCA AAG CAG C);
iii) 서열번호 19(GCA CTC ACG GBG CTC TCA AAG CAG C);
iv) 서열번호 20(GCA CTC ACG GGB CTC TCA AAG CAG C);
v) 서열번호 21(GCA CTC ACB BGG CTC TCA AAG CAG C);
vi) 서열번호: 22(GCA CTC ACG BBG CTC TCA AAG CAG C);
vii) 서열번호: 23(GCA CTC ACG GBB CTC TCA AAG CAG C); and
viii) 서열번호: 24(GGC GGC ACT CAC GBB GCT CTC AAA G).
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 11(CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG CTC T)을 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 12(ACT CAC XXX XCT CTC AAA GCA GCT C)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 13(CAC TCA CXX XXC TCT CAA AGC AGC T)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 14(GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG C)를 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 15(GCG GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG C)를 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 16(GGC GGC ACT CAC XXX XCT CTC AAA G)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 17(GCA CTC ACB GGG CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 18(GCA CTC ACG BGG CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 19(GCA CTC ACG GBG CTC TCA AAG CAG C)를 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 20(GCA CTC ACG GGB CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 21(GCA CTC ACB BGG CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 22(GCA CTC ACG BBG CTC TCA AAG CAG C)를 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 23(GCA CTC ACG GBB CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 24(GGC GGC ACT CAC GBB GCT CTC AAA G)를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 11(CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG CTC T)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 12(ACT CAC XXX XCT CTC AAA GCA GCT C)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 13(CAC TCA CXX XXC TCT CAA AGC AGC T)으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 14(GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 15(GCG GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG C)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 16(GGC GGC ACT CAC XXX XCT CTC AAA G)으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 17(GCA CTC ACB GGG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 18(GCA CTC ACG BGG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 19(GCA CTC ACG GBG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 20(GCA CTC ACG GGB CTC TCA AAG CAG C)으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 21(GCA CTC ACB BGG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 22(GCA CTC ACG BBG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 23(GCA CTC ACG GBB CTC TCA AAG CAG C)으로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 24(GGC GGC ACT CAC GBB GCT CTC AAA G)로 이루어진다.
일 구현예에서, 표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 상보적이다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 84%, 적어도 88%, 또는 적어도 92% 상보적이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 90% 상보적이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 95% 상보적이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 100% 상보적이다.
일 구현예에서, 각각의 비염기성 서브유닛은 표적화 서열의 5' 또는 3' 말단으로부터의 적어도 8개의 서브유닛이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 1 내지 5개의 비염기성 서브유닛을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1, 2, 3, 또는 4개의 비염기성 서브유닛을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 안티센스 올리고머는 화학식 IV를 갖는 안티센스-올리고머-접합체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이며:
식 중:
A'은 -N(H)CH2C(O)NH2, -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2, 및 로부터 선택되고, 식 중
R5는 -C(O)(O-알킬)x-OH이고, 식 중 x는 3-10이고, 각각의 알킬기는, 각각의 경우 독립적으로, C2-6-알킬이거나,
R5는 H, -C(O)C1-6-알킬, 트리틸, 모노메톡시트리틸, -(C1-6-알킬)-R6, -(C1-6-헤테로알킬)-R6, 아릴-R6, 헤테로아릴-R6, -C(O)O-(C1-6-알킬)-R6, -C(O)O-아릴-R6, -C(O)O-헤테로아릴-R6, 및 로부터 선택되고;
R6은 OH, SH, 및 NH2로부터 선택되거나, R6은 O, S, 또는 NH이고, 이들 각각은 고형 지지체에 공유 결합되고;
각각의 R1은 OH 및 -N(R3)(R4)로부터 독립적으로 선택되고, 식 중 R3 및 R4는, 각각의 경우 독립적으로, H 또는 -C1-6-알킬이고;
각각의 R2는, 각각의 경우 독립적으로, H(비염기성), 핵염기, 및 화학적 보호기로 관능화된 핵염기로부터 선택되되, 핵염기는, 각각의 경우 독립적으로, 피리딘, 피리미딘, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택되는 C3-6-헤테로시클릭 고리를 포함하고;
t는 8-40이고;
E'은 H, -C1-6-알킬, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸, 및 로부터 선택되고;
식 중
Q는 -C(O)(CH2)6C(O)- 또는 -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-이고;
R7은 -(CH2)2OC(O)N(R8)2이고, 식 중 R8은 -(CH2)6NHC(=NH)NH2이고;
L은 글리신, 프롤린, W, W-W, 또는 R9로부터 선택되되, L은 아미드 결합에 의해 J의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합되고;
W는 -C(O)-(CH2)m-NH-이고, 식 중 m은 2 내지 12이고;
R9는:
및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
p는 2, 3, 4, 또는 5이고;
R10은 결합, 글리신, 프롤린, W, 또는 W-W로부터 선택되고;
R11은 글리신, 프롤린, W, W-W, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R16은 결합, 글리신, 프롤린, W, 또는 W-W로부터 선택되되; R16은 아미드 결합에 의해 J의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합되고; J는 세포 투과성 펩티드이며;
G는 H, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되고, 여기에서 G는 J에 공유 결합되되;
단,
A'은 이고, E'은 이다.
일 구현예에서, E'은 H, -C1-6-알킬, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸, 및 로부터 선택된다.
일 구현예에서, A'은 -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2, , , 및 로부터 선택된다.
일 구현예에서. E'은 H, -C(O)CH3, 벤조일, 스레아로일, 트리틸, 4-메톡시트리틸, 및 로부터 선택된다.
일 구현예에서, A'은 -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2,, 및 로부터 선택되고;
E'은 이다.
일 구현예에서, A'은,
이고;
E'은 H, -C(O)CH3, 트리틸, 4-메톡시트리틸, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택된다.
일 구현예에서, 화학식 IV의 접합체는 다음으로부터 선택되는 접합체이며:
식 중 E'은 H, C1-6-알킬, -C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택된다.
일 구현예에서, 접합체는 화학식 (IVa)의 접합체이다. 일 구현예에서, 접합체는 화학식 (IVb)의 접합체이다.
일 구현예에서, 각각의 R1은 -N(CH3)2이다.
일 구현예에서, 각각의 핵염기는, 각각의 경우 독립적으로, 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸-시토신, 티민, 우라실, 및 하이포크산틴으로부터 선택된다. 일 구현예에서, L은 글리신이다. 일 구현예에서, L은 프롤린이다. 일 구현예에서, L은 -C(O)-(CH2)5-NH-이다. 일 구현예에서, L은 -C(O)-(CH2)2-NH-이다. 일 구현예에서, L은 -C(O)-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)5-NH-이다.
일 구현예에서, L은 이고, 식 중 R10은 결합이고, R11은 글리신 및 로부터 선택된다.
일 구현예에서, L은 이고, 식 중 R10은 결합이고; R11은 글리신 및 로부터 선택된다.
일 구현예에서, L은 이고, 식 중 R10은 결합이고; R11은 글리신 및 로부터 선택된다.
일 구현예에서, J는 rTAT, TAT, R9F2, R5F2R4, R4, R5, R6, R7, R8, R9, (RXR)4, (RXR)5, (RXRRBR)2, (RAR)4F2, (RGR)4F2로부터 선택된다.
일 구현예에서, G는 H, C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택된다. 일 구현예에서, G는 H 또는 -C(O)CH3이다. 일 구현예에서, G는 H이다. 일 구현예에서,
G는 -C(O)CH3이다.
일 구현예에서, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열이 제공되며, 여기에서 적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이다. 다른 구현예에서, 표적 영역은 서열번호 2(GAA-IVS1(-189-167)) 및 서열번호 3(GAA-IVS1(-80-24))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열을 포함하며:
i) 서열번호: 4(CCA GAA GGA AXX XCG AGA AAA GC);
ii) 서열번호 11(CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG CTC T);
iii) 서열번호 12(ACT CAC XXX XCT CTC AAA GCA GCT C);
iv) 서열번호 13(CAC TCA CXX XXC TCT CAA AGC AGC T);
v) 서열번호 14(GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG C);
vi) 서열번호: 15(GCG GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG C);
vii) 서열번호: 16(GGC GGC ACT CAC XXX XCT CTC AAA G);
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다.
일 구현예에서, B는 H이다.
추가의 구현예에서, 표적화 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다:
i) 서열번호: 5(CCA GAA GGA AGG BCG AGA AAA GC);
ii) 서열번호 6(CCA GAA GGA AGB GCG AGA AAA GC);
iii) 서열번호 7(CCA GAA GGA ABG GCG AGA AAA GC);
iv) 서열번호 8(CCA GAA GGA AGB BCG AGA AAA GC);
v) 서열번호 9(CCA GAA GGA ABB GCG AGA AAA GC);
vi) 서열번호 10(CCA GAA GGA ABG BCG AGA AAA GC);
vii) 서열번호 17(GCA CTC ACB GGG CTC TCA AAG CAG C);
viii) 서열번호 18(GCA CTC ACG BGG CTC TCA AAG CAG C);
ix) 서열번호 19(GCA CTC ACG GBG CTC TCA AAG CAG C);
x) 서열번호 20(GCA CTC ACG GGB CTC TCA AAG CAG C);
xi) 서열번호 21(GCA CTC ACB BGG CTC TCA AAG CAG C);
xii) 서열번호 22(GCA CTC ACG BBG CTC TCA AAG CAG C);
xiii) 서열번호 23(GCA CTC ACG GBB CTC TCA AAG CAG C); and
xiv) 서열번호 24(GGC GGC ACT CAC GBB GCT CTC AAA G).
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 접합체는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체이다.
일 구현예에서, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 접합체 또는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 질환은 폼페병이다. 일 구현예에서, 대상체는 인간이다. 추가의 구현예에서, 인간은 아동이다. 다른 구현예에서, 인간은 성인이다.
III. 올리고머 화학물질의 특징
또한, 안티센스 올리고머가 변형된 안티센스 올리고머인 안티센스 올리고머가 본원에 제공된다. 변형된 안티센스 올리고머의 예는, 비제한적으로, 모르폴리노 올리고머, 포스포로티오에이트 변형 올리고머, 2' O-메틸 변형 올리고머, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 포스포로티오에이트 올리고머, 2' O-MOE 변형 올리고머, 2'-플루오로-변형 올리고머, 2'-O,4'-C-에틸렌-가교 핵산(ENA), 트리시클로-DNA, 트리시클로-DNA 포스포로티오에이트 서브유닛, 2'-O-[2-(N-메틸카르바모일)에틸] 변형 올리고머, 및 전술한 것들의 임의의 조합을 포함한다. 포스포로티오에이트 및 2'-O-Me-변형 화학물질을 조합하여 2'O-Me-포스포로티오에이트 골격을 생성할 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO/2013/112053 및 WO/2009/008725를 참조하고, 이들은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고머의 핵염기는 모르폴리노 고리 구조에 연결되고, 여기서 모르폴리노 고리 구조는 하나의 링 구조의 모르폴리노 질소를 인접한 고리 구조의 5' 고리 외 탄소에 결합시키는 인산-함유 서브유닛 간 결합에 의해 결합된다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머의 핵염기는 펩티드 핵산(PNA)에 연결되고, 여기서 인산염-당 폴리뉴클레오티드 백본은 핵염기가 연결되는 가요성 슈도-펩티드 중합체로 치환된다. 일부 양태에서, 안티센스 올리고머의 핵염기 중 적어도 하나는 잠금 핵산(LNA)이고, 여기서 잠금 핵산 구조는, 리보오스 모이어티가 2' 산소와 4' 탄소를 연결하는 여분의 가교를 갖는, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유사체이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머의 핵염기 중 적어도 하나는 가교 핵산(bridged nucleic acids, BNA)에 연결되고, 여기서 당 형태는 푸라노오스 골격에 추가의 가교 구조를 도입함으로써 제한되거나 잠긴다. 일부 양태에서, 안티센스 올리고머의 핵염기 중 적어도 하나는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교 핵산(ENA)에 연결된다.
일부 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고머는 미잠금 핵산(UNA) 서브유닛을 함유할 수 있다. UNA 및 UNA 올리고머는 서브유닛의 C2'-C3' 결합이 절단된 RNA의 유사체이다.
일부 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고머는 비가교 산소 중 하나가 황으로 치환되는 하나 이상의 포스포로티오에이트(또는 S-올리고)를 함유한다. 일부 양태에서, 변형된 안티센스 올리고머는 리보오스의 2'-OH가 메틸, 메톡시 에틸, 2-(N-메틸카르바모일)에틸, 또는 플루오로기로 각각 치환되는 하나 이상의 2' O-메틸, 2' O-MOE, MCE, 및 2'-F를 함유한다.
일부 구현예에서, 변형된 안티센스 올리고머는, 시클로프로판 고리를 도입하여 골격의 형태적 유연성을 제한하고 골격 기하학적 구조의 비틀림각(g)을 최적화함으로써 각각의 뉴클레오티드가 변형된 제한된 DNA 유사체 클래스인, 트리시클로-DNA(tc-DNA)이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머의 핵염기 중 적어도 하나는 가교 핵산(bridged nucleic acids, BNA)에 연결되고, 여기서 당 형태는 푸라노오스 골격에 추가의 가교 구조를 도입함으로써 제한되거나 잠긴다. 일부 양태에서, 안티센스 올리고머의 핵염기 중 적어도 하나는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교 핵산(ENA)에 연결된다. 이러한 양태에서, BNA 또는 ENA에 연결된 각각의 핵염기는 5-메틸기를 포함한다. 본 개시의 올리고머 화학물질의 예시적인 구현예가 이하에서 추가로 기술된다.
1. 펩티드 핵산(PNA)
펩티드 핵산(PNA)은, 디옥시리보오스 골격과 구조적으로 동상체인 골격을 가진 DNA 유사체로서, 피리미딘 또는 퓨린 염기가 부착되는 N-(2-아미노에틸) 글리신 단위로 구성된다. 천연 피리미딘 및 퓨린 염기를 함유하는 PNA는 왓슨-크릭 염기-페어링 규칙을 따라 상보적 올리고머에 혼성화되며, 염기 쌍 인식의 관점에서 DNA를 모방한다. PNA의 골격은 인산디에스테르 결합보다는 펩티드 결합에 의해 형성되므로, 안티센스 응용분야에 매우 적합하다(아래 구조 참조). 골격이 하전되지 않으므로, PNA/DNA 또는 PNA/RNA 이중체는 정상보다 더 높은 열 안정성을 나타낸다. PNA는 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 인식되지 않는다. PNA의 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
천연 구조에 대한 라디칼의 구조 변화에도 불구하고, PNA는 나선 형태에서 DNA 또는 RNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있다. PNA의 특징은 상보적 DNA 또는 RNA에 대한 높은 결합 친화도, 단일 염기 미스매치에 의한 탈안정화 효과, 뉴클레아제 및 프로테아제에 대한 저항성, 염 농도와 무관하게 DNA 또는 RNA와의 혼성화, 및 호모퓨린(homopurine) DNA와의 삼중체 형성을 포함한다. PANAGENETM은 독점적인 Bts PNA 단량체(Bts; 벤조티아졸-2-설포닐기) 및 독점적인 올리고머화 공정을 개발하였다. Bts PNA 단량체를 사용하는 PNA 올리고머화는 탈보호화, 결합 및 캡핑의 반복적인 사이클로 구성된다. PNA는 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용해 합성하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,969,766호; 제7,211,668호; 제7,022,851호; 제7,125,994호; 제7,145,006호; 및 제7,179,896호를 참조한다. 또한, PNA의 제조에 대해서는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 참조한다. PNA 화합물에 대한 추가의 교시는 Nielsen 등의 문헌[Science, 254:1497-1500, 1991]에서 확인할 수 있다. 상기 문헌 각각은 그 전체가 참조로서 통합된다.
2. 잠금 핵산(LNA)
안티센스 올리고머는 "잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA)" 서브유닛을 함유할 수도 있다. "LNA"는 가교 핵산(BNA)이라 불리는 변형 클래스의 구성원이다. BNA는 C30-엔도 (northern) 당주름(sugar pucker)의 리보오스 고리의 형태를 잠그는 공유 연결을 특징으로 한다. LNA의 경우, 가교는 2'-O 위치와 4'-C 위치 사이의 메틸렌으로 구성된다. LNA는 골격 사전 구성과 염기 중첩을 향상시켜 혼성화와 열 안정성을 증가시킨다.
LNA의 구조는, 예를 들어, 다음 문헌에서 확인할 수 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다: Wengel 등의 문헌[Chemical Communications (1998) 455]; Koshkin 등의 문헌[Tetrahedron (1998) 54:3607]; Jesper Wengel의 문헌[Accounts of Chem. Research (1999) 32:301]; Obika 등의 문헌[Tetrahedron Letters (1997) 38:8735]; Obika 등의 문헌[Tetrahedron Letters (1998) 39:5401]; 및 Obika 등의 문헌[Bioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16:9230]. LNA의 비제한적인 예가 아래에 도시되어 있다.
본 개시의 안티센스 올리고머는 하나 이상의 LNA를 포함할 수 있으며; 일부 경우에, 안티센스 올리고머는 전체가 LNA로 구성될 수 있다. 개별 LNA 뉴클레오시드 서브유닛을 합성하고 이들을 올리고머로 혼입하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,572,582호; 제7,569,575호; 제7,084,125호; 제7,060,809호; 제7,053,207호; 제7,034,133호; 제6,794,499호; 및 제6,670,461호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 통합된다. 통상적인 서브유닛 간의 링커는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 모이어티를 포함하며; 대안적으로, 인을 함유하지 않는 링커가 사용될 수 있다. 추가의 구현예는, 각각의 LNA 서브유닛이 DNA 서브유닛에 의해 분리되는 안티센스 올리고머를 함유하는 LNA를 포함한다. 특정 안티센스 올리고머는 교번하는 LNA 및 DNA 서브유닛으로 구성되며, 여기서 서브유닛 간의 링커는 포스포로티오에이트이다.
3. 에틸렌-가교 핵산(ENA)
2'O,4'C-에틸렌-가교 핵산(ENA)은 BNA 클래스의 또 다른 구성원이다. 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
ENA 올리고머 및 이의 제조는 Obika 등의 문헌[Tetrahedron Lett (1997) 38 (50): 8735]에 기술되어 있으며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 본 개시의 안티센스 올리고머는 하나 이상의 ENA 서브유닛을 포함할 수 있다.
4. 비잠금 핵산 (UNA)
안티센스 올리고머는 "비잠금 핵산(unlocked nucleic acid, UNA)" 서브유닛을 함유할 수도 있다. UNA 및 UNA 올리고머는 서브유닛의 C2'-C3' 결합이 절단된 RNA의 유사체이다. LNA는 (DNA 및 RNA에 비해) 형태가 제한되는 반면, UNA는 매우 유연하다. UNA는 예를 들어 WO 2016/070166에 개시되어 있다. UNA의 비제한적인 예가 아래에 도시되어 있다.
통상적인 서브유닛 간의 링커는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 모이어티를 포함하며; 대안적으로, 인을 함유하지 않는 링커가 사용될 수 있다.
5. 포스포로티오에이트
"포스포로티오에이트"(또는 S-올리고)는 비가교 산소 중 하나가 황으로 치환된 정상 DNA의 변이체이다. 포스포로티오에이트의 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
뉴클레오티드 간 결합의 황화(sulfurization)는 5'에서 3' 방향으로 및 3'에서 5' 방향으로 DNA POL 1 엑소뉴클레아제, 뉴클레아제 S1 및 P1, RNase, 혈청 뉴클레아제 및 뱀 독 포스포디에스테라아제를 포함하는 엔도-및 엑소뉴클레아제의 작용을 감소시킨다. 포스포로티오에이트는 두 가지 주요 경로, 즉: 이황화탄소 중 황 원소 용액이 포스폰산수소에 미치는 작용에 의하거나, 테트라에틸티우람 디설파이드(TETD) 또는 3H-1, 2-벤조디티올-3-온 1, 1-디옥사이드(BDTD) 중 하나로 포스파이트 트리에스테르를 황화시키는 방법에 의해 만들어진다(예를 들어, Iyer 등의 문헌[J. Org. Chem. 55, 4693-4699, 1990]을 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다). 후자의 방법은, 대부분의 유기 용매에서 황 원소의 불용성 문제와 이황화탄소의 독성 문제를 회피한다. TETD 및 BDTD 방법은 또한 고순도의 포스포로티오에이트를 산출한다.
6. 트리시클로-DNA 및 트리시클로-포스포로티오에이트 서브유닛
트리시클로-DNA(tc-DNA)는, 시클로프로판 고리를 도입하여 골격의 입체적 유연성을 제한하고 골격 기하학적 구조의 비틀림각(γ)을 최적화함으로써 각각의 뉴클레오티드가 변형된 제한된 DNA 유사체 클래스이다. 동종염기성 아데닌과 티민을 함유하는 tc-DNA는 상보적 RNA와 함께 매우 안정적인 A-T 염기 쌍을 형성한다. 트리시클로-DNA 및 이의 합성은 국제 특허 출원 공개 제WO 2010/115993호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 본 개시의 안티센스 올리고머는 하나 이상의 트리시클로-DNA 서브유닛을 포함할 수 있으며; 일부 경우에, 안티센스 올리고머는 전체가 트리시클로-DNA 서브유닛으로 구성될 수 있다.
트리시클로-포스포로티오에이트 서브유닛은 포스포로티오에이트 서브유닛 간 결합을 갖는 트리시클로-DNA 서브유닛이다. 트리시클로-포스포로티오에이트 서브유닛 및 이의 합성은 국제 특허 출원 공개 제WO 2013/053928호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 본 개시의 안티센스 올리고머는 하나 이상의 트리시클로-DNA 서브유닛을 포함할 수 있으며; 일부 경우에, 안티센스 올리고머는 전체가 트리시클로-DNA 서브유닛으로 구성될 수 있다. 트리사이클-DNA/트리사이클-포스포로티오에이트 서브유닛의 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
7. 2' O-메틸, 2'-O-MOE, 및 2'-F 올리고머
"2'-O-Me 올리고머" 분자는 리보오스 분자의 2'-OH 잔기에서 메틸기를 갖는다. 2'-O-Me-RNA는 DNA와 동일한(또는 유사한) 거동을 보이지만 뉴클레아제 분해로부터 보호된다. 2'-O-Me-RNA는 추가적인 안정화를 위해 포스포로티오에이트 올리고머(PTO)와 조합될 수도 있다. 2'O-Me 올리고머(포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트)는 당업계의 일상적인 기술에 따라 합성될 수 있다(예를 들어, Yoo 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 32:2008-16, 2004]을 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다). 2'-O-Me 올리고머의 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
2'-O-메톡시에틸 올리고머(2'-O MOE)는 리보오스 분자의 2'-OH 잔기에서 메톡시에틸기를 가지고, 이에 대해서는 Martin 등의 문헌[Helv. Chim. Acta, 78, 486-504, 1995]에서 논의되며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 2'-O-MOE 서브유닛의 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
2'-플루오로 (2'-F) 올리고머는 2'-OH 대신에 2' 위치에서 플루오로 라디칼을 갖는다. 2'-F 올리고머의 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
2'-플루오로 올리고머는 WO 2004/043977에 추가로 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
2'-O-메틸, 2'-O-MOE, 및 2'-F 올리고머는 아래에 도시된 바와 같이 하나 이상의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수도 있다.
또한, 2'-O-메틸, 2'-O-MOE, 및 2'-F 올리고머는, 예를 들어, 아래에 예시된 2'-O-메틸 PS 올리고머인 드리사퍼센(drisapersen)에서와 같이, 올리고머 전체에 걸쳐 PS 서버유닛 간 결합을 포함할 수 있다.
대안적으로, 2'-O-메틸, 2'-O-MOE, 및/또는 2'-F 올리고머는 아래에 예시된 바와 같이, 올리고머의 단부에서 PS 결합을 포함할 수 있으며,
식 중:
R은 CH2CH2OCH3 (메톡시에틸 또는 MOE)이고;
X, Y, 및 Z는 지정된 5'-윙(wing), 중앙 갭 및 3'-윙 영역의 각각에 포함된 뉴클레오티드의 수를 각각 나타낸다.
본 개시의 안티센스 올리고머는 하나 이상의 2'-O-메틸, 2'-O-MOE, 및 2'-F 서브유닛을 포함할 수 있고, 본원에 기술된 임의의 서브유닛 간 결합을 이용할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시의 안티센스 올리고머는 그 전체가 2'-O-메틸, 2'-O-MOE, 또는 2'-F 서브유닛으로 구성될 수 있다. 본 개시의 안티센스 올리고머의 일 구현예는 그 전체가 2'-O-메틸 서브유닛으로 구성된다.
8. 2'-O-[2-(N-메틸카르바모일)에틸] 올리고머 (MCE)
MCE는 본 개시의 안티센스 올리고머에 유용한 2'-O 변형 리보뉴클레오시드의 다른 또 다른 예이다. 여기서, 2'-OH는 2-(N-메틸카르바모일)에틸 모이어티로 유도체화되어 뉴클레아제 저항성을 증가시킨다. MCE 올리고머의 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
MCE 및 이의 합성은 Yamada 등의 문헌[J. Org. Chem (2011) 76(9):3042-53]에 기술되어 있으며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 본 개시의 안티센스 올리고머는 하나 이상의 MCE 서브유닛을 포함할 수 있다.
9. 입체 특이적 올리고머
입체 특이적 올리고머는, 실질적으로 입체 순수형 올리고머가 생산되도록 각각의 인 함유 결합의 입체 화학물질이 합성 방법에 의해 고정된 것들이다. 입체 특이적 올리고머의 비제한적인 예가 아래에 예시되어 있다.
전술한 예에서, 올리고머의 각각의 인 성분은 동일한 입체 구성을 갖는다. 추가의 예는 본원에 기술된 올리고머를 포함한다. 예를 들어, LNA, ENA, 트리시클로-DNA, MCE, 2'-O-메틸, 2'-O-MOE, 2'-F, 및 모르폴리노 계의 올리고머는, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르, 포스포라미데이트, 포스포로디아미데이트, 또는 다른 인-함유 뉴클레오시드 간 결합과 같은 입체-특이적 인-함유 뉴클레오시드 간 결합을 이용해 제조될 수 있다. 입체 특이적 올리고머, 제조 방법, 키랄 조절식 합성, 키랄 설계, 및 이러한 올리고머의 생산에 사용하기 위한 키랄 보조제는 예를 들어, WO2017192664, WO2017192679, WO2017062862, WO2017015575, WO2017015555, WO2015107425, WO2015108048, WO2015108046, WO2015108047, WO2012039448, WO2010064146, WO2011034072, WO2014010250, WO2014012081, WO20130127858, 및 WO2011005761에 상세하게 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
입체 특이적 올리고머는 R P 또는 S P 구성에서 인을 함유하는 뉴클레오시드 간 결합을 가질 수 있다. 결합의 입체 구성이 조절되는 키랄 인을 함유하는 결합은 "입체 순수형(stereopure)"으로서 지칭되는 한편, 결합의 입체 구성이 조절되지 않는 키랄 인을 함유하는 결합은 "입체 랜덤형(stereorandom)"으로서 지칭된다. 소정의 구현예에서, 본 개시의 올리고머는, 생성된 올리고머가 미리 지정된 올리고머의 위치에서 입체 순수 서브유닛을 갖도록 복수의 입체 순수형 결합 및 입체 랜덤형 결합을 포함한다. 입체 순수형 서브유닛의 예시적인 위치는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/062862 A2의 도 7a 및 도 7b에 제공되어 있다. 일 구현예에서, 올리고머에서 키랄 인을 함유하는 모든 결합은 입체 랜덤형이다. 일 구현예에서, 올리고머에서 키랄 인을 함유하는 모든 결합은 입체 순수형이다.
n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 키랄 인-함유 결합 모두는 입체 랜덤형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 키랄 인-함유 결합 모두는 입체 순수형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 인-함유 결합 중 적어도 10%는 입체 순수형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 인-함유 결합 중 적어도 20%는 입체 순수형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 인-함유 결합 중 적어도 30%는 입체 순수형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 인-함유 결합 중 적어도 40%는 입체 순수형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 인-함유 결합 중 적어도 50%는 입체 순수형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 인-함유 결합 중 적어도 60%는 입체 순수형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 인-함유 결합 중 적어도 70%는 입체 순수형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 인-함유 결합 중 적어도 80%는 입체 순수형이다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머의 n개의 인-함유 결합 중 적어도 90%는 입체 순수형이다.
n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, S P 또는 R P)의 적어도 2개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, S P 또는 R P)의 적어도 3개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, S P 또는 R P)의 적어도 4개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, S P 또는 R P)의 적어도 5개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, S P 또는 R P)의 적어도 6개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 7개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 8개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 9개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 10개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 11개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 12개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 13개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 14개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 15개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 16개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 17개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 18개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 19개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, (즉, S P 또는 R P)의 적어도 20개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다.
n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향(즉, S P 또는 R P)의 적어도 2개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합 및 다른 입체 배향의 적어도 2개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유한다. 예를 들어, 올리고머는 S P 배향의 적어도 2개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합 및 R P 배향의 적어도 2개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 함유할 수 있다.
n개의 키랄 인-함유 결합을 갖는 올리고머의 구현예에서(여기서 n은 1 이상의 정수임), 올리고머는 동일한 입체 배향의 적어도 2개의 연속 입체 순수형 인-함유 결합을 교번하는 패턴으로 함유한다. 예를 들어, 올리고머는 2개 이상의 R P, 2개 이상의 S P, 및 2개 이상의 R P 등을 순서대로 함유할 수 있다.
10. 모르폴리노 올리고머
본 개시의 예시적인 구현예는 다음의 일반 구조를 갖고:
Summerton, J. 등의 문헌[Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7: 187-195 (1997)]의 도 2에 기술된 것과 같은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(phosphorodiamidate morpholino oligomers)에 관한 것이다. 본원에 기술된 것과 같은 모르폴리노는 전술한 일반 구조의 모든 입체이성질체 및 호변이성질체를 포함하도록 의도된다. 모르폴리노 올리고머의 합성, 구조 및 결합 특성은 미국 특허 제5,698,685호; 제5,217,866호; 제5,142,047호; 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,521,063호; 제5,506,337호; 제8,076,476호; 및 제8,299,206호에 상세히 설명되어 있으며, 이들 모두는 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 모르폴리노는 올리고머의 5' 단부 또는 3' 단부에서 "테일(tail)" 모이어티와 접합되어 올리고머의 안정성 및/또는 용해도를 증가시킨다. 예시적인 테일은 다음을 포함한다:
.
다양한 양태에서, 본 개시는 화학식 (IV)에 따른 안티센스 올리고머, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
일 구현예에서, 인간 산 알파 글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열이 제공되며, 여기에서 적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이다. 다른 구현예에서, 표적 영역은 서열번호 2(GAA-IVS1(-189-167)) 및 서열번호 3(GAA-IVS1(-80-24))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 표적 영역은 서열번호 2로서 제시된 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 표적 영역은 서열번호 3으로서 제시된 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-189-167), GAA-IVS1(-80-56), GAA-IVS1(-76-52), GAA-IVS1(-74-55), GAA-IVS1(-72-48), GAA-IVS1(-71-47), GAA-IVS1(-70-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-66-42), GAA-IVS1(-65-41), 및 GAA-IVS1(-49-24)로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-189-167)이다. 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-72,-48)이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-71,-47)이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-70,-46)이다. 일 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-69-45)이다. 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-65,-41)이다. 또 다른 구현예에서, 표적화 영역은 GAA-IVS1(-66,-42)이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열 CCA GAA GGA AXX XCG AGA AAA GC(서열번호 4)를 포함하며, 여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다:
i) 서열번호: 5(CCA GAA GGA AGG BCG AGA AAA GC);
ii) 서열번호 6(CCA GAA GGA AGB GCG AGA AAA GC);
iii) 서열번호 7(CCA GAA GGA ABG GCG AGA AAA GC);
iv) 서열번호 8(CCA GAA GGA AGB BCG AGA AAA GC);
v) 서열번호 9(CCA GAA GGA ABB GCG AGA AAA GC); and
vi) 서열번호 10(CCA GAA GGA ABG BCG AGA AAA GC).
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 5(CCA GAA GGA AGG BCG AGA AAA GC)를 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 6(CCA GAA GGA AGB GCG AGA AAA GC)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 7(CCA GAA GGA ABG GCG AGA AAA GC)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 8(CCA GAA GGA AGB BCG AGA AAA GC)을 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 9(CCA GAA GGA ABB GCG AGA AAA GC)를 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 10(CCA GAA GGA ABG BCG AGA AAA GC).
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열 CCA GAA GGA AXX XCG AGA AAA GC(서열번호 4)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 5(CCA GAA GGA AGG BCG AGA AAA GC)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 6(CCA GAA GGA AGB GCG AGA AAA GC)으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 7(CCA GAA GGA ABG GCG AGA AAA GC)로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 8(CCA GAA GGA AGB BCG AGA AAA GC)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 9(CCA GAA GGA ABB GCG AGA AAA GC)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 10(CCA GAA GGA ABG BCG AGA AAA GC)으로 이루어진다.
일 구현예에서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-80-56), GAA-IVS1(-76-52), GAA-IVS1(-74-55), GAA-IVS1(-72-48), GAA-IVS1(-71-47), GAA-IVS1(-70-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-66-42), GAA-IVS1(-65-41), 및 GAA-IVS1(-49-24)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-72-48), GAA-IVS1(-71-47), GAA-IVS1(-70-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-66-42), 및 GAA-IVS1(-65-41)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며:
i) 서열번호: 11(CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG CTC T);
ii) 서열번호 12(ACT CAC XXX XCT CTC AAA GCA GCT C);
iii) 서열번호 13(CAC TCA CXX XXC TCT CAA AGC AGC T);
iv) 서열번호 14(GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG C);
v) 서열번호 15(GCG GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG C);
vi) 서열번호: 16(GGC GGC ACT CAC XXX XCT CTC AAA G);
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 서열번호: 17(GCA CTC ACB GGG CTC TCA AAG CAG C);
ii) 서열번호 18(GCA CTC ACG BGG CTC TCA AAG CAG C);
iii) 서열번호 19(GCA CTC ACG GBG CTC TCA AAG CAG C);
iv) 서열번호 20(GCA CTC ACG GGB CTC TCA AAG CAG C);
v) 서열번호 21(GCA CTC ACB BGG CTC TCA AAG CAG C);
vi) 서열번호: 22(GCA CTC ACG BBG CTC TCA AAG CAG C);
vii) 서열번호: 23(GCA CTC ACG GBB CTC TCA AAG CAG C); and
viii) 서열번호: 24(GGC GGC ACT CAC GBB GCT CTC AAA G).
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 11(CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG CTC T)을 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 12(ACT CAC XXX XCT CTC AAA GCA GCT C)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 13(CAC TCA CXX XXC TCT CAA AGC AGC T)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 14(GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG C)를 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 15(GCG GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG C)를 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 16(GGC GGC ACT CAC XXX XCT CTC AAA G)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 17(GCA CTC ACB GGG CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 18(GCA CTC ACG BGG CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 19(GCA CTC ACG GBG CTC TCA AAG CAG C)를 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 20(GCA CTC ACG GGB CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 21(GCA CTC ACB BGG CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 22(GCA CTC ACG BBG CTC TCA AAG CAG C)를 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 23(GCA CTC ACG GBB CTC TCA AAG CAG C)을 포함한다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 24(GGC GGC ACT CAC GBB GCT CTC AAA G).
일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 11(CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG CTC T)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 12(ACT CAC XXX XCT CTC AAA GCA GCT C)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 13(CAC TCA CXX XXC TCT CAA AGC AGC T)으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 14(GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 15(GCG GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG C)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 16(GGC GGC ACT CAC XXX XCT CTC AAA G)으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 17(GCA CTC ACB GGG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 18(GCA CTC ACG BGG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 19(GCA CTC ACG GBG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 20(GCA CTC ACG GGB CTC TCA AAG CAG C)으로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 21(GCA CTC ACB BGG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 22(GCA CTC ACG BBG CTC TCA AAG CAG C)로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 23(GCA CTC ACG GBB CTC TCA AAG CAG C)으로 이루어진다. 다른 구현예에서, 표적화 서열은 서열번호 24(GGC GGC ACT CAC GBB GCT CTC AAA G)로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머는 화학식 II에 따른 것이거나 이의 약학적으로 허용가능한 염이며:
식 중, 1에서 n 및 5'에서 3' 방향으로 각각의 Nu는 다음 중 하나에서의 핵염기에 상응하고:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. X가 비염기성(B)인 경우, 핵염기 A, C, T, 또는 G 대신 수소가 존재한다.
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
일 구현예에서, B는 H이다.
일부 구현예에서, 화학식 (II)의 안티센스 올리고머는 유리 염기 형태이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 안티센스 올리고머는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 구현예에서, 화학식 (II)의 안티센스 올리고머는 이의 HCl(염산) 염이다. 특정 구현예에서, HCl 염은 1HCl, 2HCl, 3HCl, 4HCl, 5HCl, 또는 6HCl 염이다. 특정 구현예에서, HCl 염은 6HCl 염이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머는 화학식 IIIa에 따른 것이거나 이의 약학적으로 허용가능한 염이며:
식 중, 1에서 n 및 5'에서 3' 방향으로 각각의 Nu는 다음 중 하나에서의 핵염기에 상응하고:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. X가 비염기성(B)인 경우, 핵염기 A, C, T, 또는 G 대신 수소가 존재한다.
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
일 구현예에서, B는 H이다.
일부 구현예에서, 화학식 (IIIa)의 안티센스 올리고머는 유리 염기 형태이다. 일부 구현예에서, 화학식 (IIIa)의 안티센스 올리고머는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 구현예에서, 화학식 (IIIa)의 안티센스 올리고머는 이의 HCl(염산) 염이다. 특정 구현예에서, HCl 염은 5HCl 염이다. 특정 구현예에서, HCl 염은 6HCl 염이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머는 화학식 (III)에 따른 것이거나 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며:
식 중, 1에서 n 및 5'에서 3' 방향으로 각각의 Nu는 다음 중 하나에서의 핵염기에 상응하고:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. X가 비염기성(B)인 경우, 핵염기 A, C, T, 또는 G 대신 수소가 존재한다.
일 구현예에서, B는 H이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
일 구현예에서, B는 H이다.
일부 구현예에서, 화학식 (III)의 안티센스 올리고머는 유리 염기 형태이다. 일부 구현예에서, 화학식 (III)의 안티센스 올리고머는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 구현예에서, 화학식 (III)의 안티센스 올리고머는 이의 HCl(염산) 염이다. 특정 구현예에서, HCl 염은 5HCl 염이다. 특정 구현예에서, HCl 염은 6HCl 염이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머는 화학식 (V)에 따른 것이거나 이의 약학적으로 허용가능한 염이며:
식 중 1에서 n 및 5'에서 3' 방향으로 각각의 Nu는 다음 중 하나에서의 핵염기에 상응하고:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다. X가 비염기성(B)인 경우, 핵염기 A, C, T, 또는 G 대신 수소가 존재한다.
일 구현예에서, B는 H이다.
화학식 (V)의 일부 양태에서, X의 하나의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 각각 G이다. 특정 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고, 하나의 경우는 G이다. 화학식 (V)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 경우는 비염기성이고, X의 다른 2개의 경우는 G이다. 화학식 (V)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제3 경우는 G이다. 화학식 (V)의 특정 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제3 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제2 경우는 G이다.
화학식 (V)의 일부 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 G이다. 화학식 (V)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제2 경우는 비염기성이고 X의 제3 경우는 G이다. 화학식 (V)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제2 인스턴스는 G이다. 화학식 (V)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제1 경우는 G이다.
일 구현예에서, 표적화 서열은 다음의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다:
일 구현예에서, B는 H이다.
예를 들어, 화학식 (V)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머는 화학식 (Va)에 따르며:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다.
일 구현예에서, B는 H이다.
화학식 (Va)의 일부 양태에서, X의 하나의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 각각 G이다. 화학식 (Va)의 특정 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고, 하나의 경우는 G이다. 화학식 (Va)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 경우는 비염기성이고, X의 다른 2개의 경우는 G이다. 화학식 (Va)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제3 경우는 G이다. 화학식 (Va)의 특정 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제3 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제2 경우는 G이다.
화학식 (Va)의 일부 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 G이다. 화학식 (Va)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제2 경우는 비염기성이고 X의 제3 경우는 G이다. 화학식 (Va)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제2 인스턴스는 G이다. 화학식 (Va)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제1 경우는 G이다.
예를 들어, 화학식 (V)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머는 화학식 (Vb)에 따르며:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다.
일 구현예에서, B는 H이다.
화학식 (Vb)의 일부 양태에서, X의 하나의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 각각 G이다. 특정 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고, 하나의 경우는 G이다. 화학식 (Vb)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 경우는 비염기성이고, X의 다른 2개의 경우는 G이다. 화학식 (Vb)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제3 경우는 G이다. 화학식 (Vb)의 특정 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제3 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제2 경우는 G이다.
화학식 (Vb)의 일부 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 G이다. 화학식 (Vb)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제2 경우는 비염기성이고 X의 제3 경우는 G이다. 화학식 (Vb)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제2 인스턴스는 G이다. 화학식 (Vb)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제1 경우는 G이다.
예를 들어, 화학식 (V)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머는 화학식 (VII)에 따른다:
예를 들어, 화학식 (V)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머는 화학식 (VIII)에 따른다:
예를 들어, 화학식 (V)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머는 화학식 (Vc)에 따르며:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다.
일 구현예에서, B는 H이다.
화학식 (Vc)의 일부 양태에서, X의 하나의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 각각 G이다. 화학식 (Vc)의 특정 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고 하나의 경우는 G이다. 화학식 (Vc)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 경우는 비염기성이고, X의 다른 2개의 경우는 G이다. 화학식 (Vc)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제3 경우는 G이다. 화학식 (Vc)의 특정 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제3 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제2 경우는 G이다.
화학식 (Vc)의 일부 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 G이다. 화학식 (Vc)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제2 경우는 비염기성이고 X의 제3 경우는 G이다. 화학식 (Vc)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제2 인스턴스는 G이다. 화학식 (Vc)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제1 경우는 G이다.
예를 들어, 화학식 (V)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머는 화학식 (Vd)에 따르며:
여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이다.
일 구현예에서, B는 H이다.
화학식 (Vd)의 일부 양태에서, X의 하나의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 각각 G이다. 화학식 (Vd)의 특정 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고, 하나의 경우는 G이다. 화학식 (Vd)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 경우는 비염기성이고, X의 다른 2개의 경우는 G이다. 화학식 (Vd)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제3 경우는 G이다. 화학식 (Vd)의 특정 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제3 경우는 비염기성이고, X의 제1 및 제2 경우는 G이다.
화학식 (Vd)의 일부 양태에서, X의 2개의 경우는 비염기성이고 X의 다른 경우는 G이다. 화학식 (Vd)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제2 경우는 비염기성이고 X의 제3 경우는 G이다. 화학식 (Vd)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제1 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제2 인스턴스는 G이다. 화학식 (Vd)의 일부 양태에서, 5'에서 3' 방향으로 X의 제2 및 제3 경우는 비염기성이고 X의 제1 경우는 G이다.
IV. 표적 서열 및 표적 영역
안티센스 적용을 위한 일부 구현예에서, 올리고머는 핵산 표적 서열에 100% 상보적일 수 있거나(적어도 하나의 비염기성 서브유닛은 제외됨), 예를 들어, 올리고머와 핵산 표적 서열 사이에 형성된 이종이중체가 생체 내에서 발생할 수 있는 세포 뉴클레아제 및 다른 분해 모드의 작용을 견디기에 충분히 안정적인 한, 변이체를 수용하도록 불일치를 포함할 수 있다. 불일치가 존재하는 경우, 이는 중간에서보다 혼성 이중체의 말단 영역으로 갈수록 덜 불안정해진다. 허용되는 불일치의 수는, 이중체 안정성에 대해 공지된 원칙에 따라, 올리고머의 길이, 이중체의 G:C 염기쌍 백분율, 이중체 불일치(들)의 위치에 따른다. 이러한 안티센스 올리고머가 핵산 표적 서열에 반드시 100% 상보적일 필요는 없지만. 핵산 표적의 생물학적 활성, 예를 들어 암호화된 단백질(들)의 발현이 조절되도록, 표적 서열에 안정적이고 특이적으로 결합하는 것이 효과적이다.
올리고머와 표적 서열 사이에 형성된 이중체의 안정성은 결합 Tm 및 세포 효소 절단에 대한 이중체의 감수성의 함수이다. 상보성 서열 RNA에 대한 안티센스 화합물의 Tm은 Hames 등의 문헌[Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, pp.107-108]에 기술된 방법, 또는 Miyada CG. 및 Wallace RB의 문헌[(1987) Oligonucleotide hybridization techniques, Methods Enzymol. Vol. 154 pp. 94-107]에 기술된 방법과 같은 종래의 방법에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 안티센스 올리고머는 상보성 서열 RNA에 대해, 체온보다 높거나, 다른 구현예의 경우 50℃보다 높은 결합 Tm을 갖는다. 다른 구현예에서, Tm은 60-80℃ 또는 그 이상의 범위이다. 공지된 원리에 따르면, 올리고머 화합물의 Tm은 상보성 기반 RNA 혼성체에 비해, 이중체 중 C:G 쌍 염기의 비율, 및/또는 이종이중체의 길이(염기쌍 단위)를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 동시에, 세포 흡수를 최적화하기 위해, 올리고머의 크기를 제한하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 이유로, 20개 염기 이하의 길이에서 높은 Tm(50℃ 이상)을 나타내는 화합물은, 높은 Tm 값을 위해 20개 염기를 초과하는 염기를 필요로 하는 화합물보다 대체적으로 바람직하다. 일부 응용예에서, 예를 들어 20개 초과 염기의 더 긴 올리고머는 특정 이점을 가질 수 있다.
표적화 서열 염기는 정상 DNA 염기 또는 이의 유사체, 예를 들어, 표적 서열 RNA 염기에 대해 Watson-Crick 염기 페어링이 가능한 우라실 및 이노신일 수 있다.
안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단하거나 억제하거나 조절하도록 설계되거나, pre-mRNA 스플라이스 처리를 억제하거나 조절하도록 설계되거나, 표적화된 mRNA의 분해를 유도하도록 설계될 수 있으며, 이와 혼성화되는 표적 서열에 대해 "유도되거나", "표적화되는" 것으로 지칭될 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 사전 처리된 mRNA의 3' 또는 5' 스플라이스 부위, 분지점, 또는 스플라이싱의 조절에 관여하는 다른 서열을 포함하는 영역을 포함한다. 표적 서열은 엑손 내에 또는 인트론 내에 있거나 인트론/엑손 접합부에 걸쳐 있을 수 있다.
표적 RNA의 스플라이싱을 조절하가 위해 표적 RNA 서열에 대해 충분한 서열 상보성을 갖는 안티센스 올리고머는, 그렇지 않을 경우 스플라이싱을 조절하고/하거나 표적 RNA의 3차원 구조를 변경시킬 천연 단백질에 대한 결합 부위의 마스킹을 촉발하기에 충분한 서열을 갖는 안티센스 올리고머를 의미한다. 마찬가지로, 표적 RNA의 스플라이싱을 조절하가 위해 표적 RNA 서열에 대해 충분한 서열 상보성을 갖는 올리고머 시약은, 그렇지 않을 경우 스플라이싱을 조절하고/하거나 표적 RNA의 3차원 구조를 변경시킬 천연 단백질에 대한 결합 부위의 마스킹을 촉발하기에 충분한 서열을 갖는 올리고머 시약을 의미한다.
특정 구현예에서, 안티센스 올리고머는 인간 GAA pre-mRNA의 인트론 1에서의 서열에 대해 충분한 길이 및 상보성을 갖는다. 인간 GAA 유전자에 대한 인트론 1(서열번호 1) 서열은 아래 표 2에 제시되어 있다(서열번호 1의 3' 말단 근처의 강조된 T/G는 전술한 IVS1-13T>G 돌연변이이고; 해당 위치에서의 뉴클레오티드는 T 또는 G임).
특정 구현예에서, 표적 서열과 안티센스 표적화 서열 사이의 상보성의 정도는 안정적인 이중체를 형성하기에 충분하다. 표적 RNA 서열을 갖는, 안티센스 올리고머의 상보성 영역은, 비염기성 유닛을 제외하고, 8-11개 염기만큼 짧을 수 있지만, 12-15개 염기 이상, 예를 들어, 10-40개 염기, 12-30개 염기, 12-25개 염기, 15-25개 염기, 12-20개 염기, 또는 15-20개 염기(이들 범위 사이의 모든 정수를 포함함) 일 수 있다. 약 14-15개 염기의 안티센스 올리고머는 대체적으로 고유한 상보성 서열을 갖기에 충분히 길다. 특정 구현예에서, 본원에서 논의된 바와 같이, 필요한 결합 Tm을 달성하기 위해 최소 길이의 상보성 염기가 필요할 수 있다.
특정 구현예에서, 40개 염기만큼의 올리고머가 적합할 수 있으며, 여기에서 적어도 최소 염기 수, 예를 들어, 10-12개 염기는 표적 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, 세포 내 촉진 또는 활성 흡수는 약 30개 염기 미만의 올리고머 길이에서 최적화된다. 본원에 추가로 기술된 PMO 올리고머의 경우, 결합 안정성 및 흡수의 최적의 균형은 대체적으로 18-25개 염기 길이에서 발생한다. 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 염기로 이루어진 안티센스 올리고머(예를 들어, PMO, PMO-X, PNA, LNA, 2'-OMe)가 본 개시에 포함되며, 여기에서 적어도 약 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 연속 또는 비-인접 염기는 원하는 표적 서열에 상보적이다.
소정의 구현예에서, 안티센스 올리고머는 표적 서열에 100% 상보적일 수 있거나(적어도 하나의 비염기성 뉴클레오티드는 제외됨), 예를 들어, 올리고머와 표적 서열 사이에 형성된 이종이중체가 생체 내에서 발생할 수 있는 세포 뉴클레아제 및 다른 분해 모드의 작용을 견디기에 충분히 안정적인 한, 변이체를 수용하도록 불일치를 포함할 수 있다. 따라서, 특정 올리고머는, 올리고머(적어도 하나의 비염기성 뉴클레오티드는 제외됨)와 표적 서열 사이에, 실질적인 상보성, 즉 약 또는 적어도 약 70%의 서열 상보성, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상보성을 가질 수 있다. 뉴클레아제에 의한 절단에 덜 민감한 올리고머 백본이 본원에서 논의된다. 불일치가 존재하는 경우, 이는 일반적으로 중간에서보다 혼성 이중체의 말단 영역으로 갈수록 덜 불안정해진다. 허용되는 불일치의 수는, 이중체 안정성에 대해 공지된 원칙에 따라, 올리고머의 길이, 이중체의 G:C 염기쌍 백분율, 이중체 불일치(들)의 위치에 따른다. 이러한 안티센스 올리고머가 표적 서열에 반드시 100% 상보적일 필요는 없지만. 표적 pre-RNA의 스플라이싱이 조절되도록, 표적 서열에 안정적이고 특이적으로 결합하는 것이 효과적이다. 올리고머와 표적 서열 사이에 형성된 이중체의 안정성은 결합 Tm 및 세포 효소 절단에 대한 이중체의 감수성의 함수이다. 상보성 서열 RNA에 대한 올리고머의 Tm은 Hames 등의 문헌[Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, pp. 107-108]에 기술된 방법, 또는 Miyada C. G. 및 Wallace R. B.의 문헌[1987, Oligomer Hybridization Techniques, Methods Enzymol. Vol. 154 pp. 94-107]에 기술된 방법과 같은 종래의 방법에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고머는 상보성 서열 RNA에 비해, 체온보다 높은, 바람직하게는 약 45℃ 또는 50℃보다 높은 결합 Tm을 가질 수 있다. 60-80℃ 또는 그 이상의 범위 또한 Tm에 포함된다. 공지된 원리에 따르면, 올리고머의 Tm은 상보성 기반 RNA 혼성체에 비해, 이중체 중 C:G 쌍 염기의 비율, 및/또는 이종이중체의 길이(염기쌍 단위)를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 동시에, 세포 흡수를 최적화하기 위해, 올리고머의 크기를 제한하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 이유로, 25개 염기 이하의 길이에서 높은 Tm(45-50℃ 이상)을 나타내는 화합물은, 높은 Tm 값을 위해 25개 염기를 초과하는 염기를 필요로 하는 화합물보다 대체적으로 바람직하다.
특정 구현예에서, 안티센스 표적화 서열은 표 2에 열거된 표적 서열 중 하나 이상의 영역에 혼성화되도록 설계된다. 선택된 안티센스 표적화 서열은, 예를 들어, 약 12개 염기, 또는 그 이상, 예를 들어, 약 40개 염기로 보다 짧게 만들어질 수 있으며, 해당 서열이 표적 서열에 혼성화 시 스플라이스 조절에 영향을 미치기에 충분히 상보적이고, 선택적으로 45℃ 이상의 Tm을 갖는 이종이중체를 RNA와 함께 형성하는 한, 적은 수의 불일치를 포함할 수 있다.
V. 세포 투과성 펩티드(CPP)
예를 들어, 치환기 J의 범위 내에서 논의된 아르기닌-풍부 세포 투과성 펩티드(CPP)는 안티센스 올리고머의 세포 내 침투를 향상시키고 동물 모델의 다양한 근육 그룹에서 엑손 스키핑을 유발하는 데 효과적일 수 있다.
예시적인 아르기닌-풍부 펩티드는 아래의 표 3에 제시되어 있다.
또 다른 양태에서, 치환기 J의 범위 내의 예시적인 세포 투과성 펩티드가 표 4에 제공된다. 치환기 L에 대한 연결 지점은 표에 나타낸 바와 같다.
L = 화학식 (I)에 인용되고 본 명세서 전반에 걸쳐 기술된 바와 같음; β = 3-알라닌; α = 6-아미노헥사논산; tg = 미변형 아미노 말단, 또는 아세틸, 벤조일 또는 스테아로일기로 캡핑된 아미노 말단이고(즉, 아세틸 아미드, 벤조일 아미드 또는 스테아로일 아미드), Y는 NH-(CHR)-C(O)임 (여기에서, n은 2 내지 7이고, 각각의 R은 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 메틸임). 간략화를 위해, 모든 서열이 종결 td기로 표시되는 것은 아니지만; 각각의 전술한 서열은 미변형 아미노 종결부 또는 아세틸, 벤조일, 또는 스테아로일기로 캡핑된 아미노 종결부를 포함할 수 있음.
VI. 약학적 조성물
본 개시는 또한 개시된 안티센스 올리고머의 제형화 및 전달을 제공한다. 따라서, 본 개시의 일 양태는 본원에 개시된 바와 같은 안티센스 올리고머 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
안티센스 올리고머의 표적 핵산에 대한 효과적인 전달은 치료의 중요한 양태이다. 안티센스 올리고머 전달 경로는 경구 및 비경구 경로를 포함하는 다양한 전신 경로, 예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 및 근육내, 그리고 흡입, 경피, 및 국소 전달을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 적절한 경로는 치료 중인 대상체의 병태에 적절하게, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 피부의 바이러스 감염증의 치료에 있어서 안티센스 올리고머의 전달을 위한 적절한 경로는 국소 전달인 한편, 바이러스 호흡기 감염증의 치료에 있어서 안티센스 올리고머의 전달은 정맥내 또는 흡입에 의해 이루어질 수 있다. 안티센스 올리고머는 또한 바이러스 감염의 임의의 특정 부위에 직접 전달될 수 있다.
안티센스 올리고머는 생리학적으로 및/또는 약학적으로 허용가능한 임의의 편리한 비히클로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 당업자에 의해 사용되는 다양한 표준 약학적으로 허용가능한 담체 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 이의 예는 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 물(예를 들어, 주사용 멸균수), 수성 에탄올, 유화액, 예컨대 오일/물 유화액 또는 트리글리세리드 유화액, 정제, 및 캡슐을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 적절한 생리학적으로 허용가능한 담체의 선택은 선택된 투여 방식에 따라 달라질 것이다.
본 화합물(예를 들어, 안티센스 올리고머)은 대체적으로 유리 산 또는 유리 염기로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 화합물은 산 또는 염기 부가염의 형태로 사용될 수 있다. 유리 아미노 화합물의 산 부가염은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 유기산 및 무기산으로부터 형성될 수 있다. 적합한 유기산은, 말레산, 푸마르산, 벤조산, 아스코르브산, 숙신산, 메탄설폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 옥살산, 프로피온산, 타르타르산, 살리실산, 구연산, 글루콘산, 락트산, 만델산, 신남산, 아스파르트산, 스테아르산, 팔미트산, 글리콜산, 글루탐산, 및 벤젠설폰산을 포함한다. 적합한 무기산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 및 질산을 포함한다. 염기 부가염은 카르복실레이트 음이온으로 형성되는 염을 포함하며, 알칼리 및 알칼리 토금속(예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 바륨 및 칼슘)으로부터 선택된 것들과 같은 유기 및 무기 양이온뿐만 아니라 암모늄 이온 및 이의 치환된 유도체(예를 들어, 디벤질암모늄, 벤질암모늄, 2-하이드록시에틸암모늄 등)로 형성된 염을 포함한다. 따라서, 구조 (I)의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 임의의 그리고 모든 허용 가능한 염 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
추가적으로, 전구약물 또한 본 발명의 맥락 내에 포함된다. 전구약물은, 해당 전구약물이 환자에게 투여될 때 생체 내에서 구조 (I)의 화합물을 방출하는 임의의 공유 결합된 담체이다. 전구약물은 대체적으로 통상적인 조작에 의해 또는 생체 내에서 변형이 절단되어 모 화합물을 수득하는 방식으로 작용기를 변형시킴으로써 제조된다. 전구약물은, 예를 들어, 하이드록시, 아민, 또는 설프히드릴기가, 환자에게 투여될 때 절단되어, 하이드록시, 아민, 또는 설프히드릴기를 형성하는 임의의 기에 결합되는, 본 발명의 화합물을 포함한다. 따라서, 전구약물의 대표적인 예는 구조 (I)의 화합물의 알코올 및 아민 작용기의 아세테이트, 포름산염, 및 벤조에이트 유도체를 포함한다(그러나 이에 한정되지 않음). 또한, 카르복실산(-COOH)의 경우, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 등과 같은 에스테르가 사용될 수 있다.
VII, 제조 방법
염기성 질소 뉴클레오시드간 링커를 사용한 올리고머의 제조
모르폴리노 서브유닛, 변형된 서브유닛간 결합, 및 이를 포함하는 올리고머는, 예를 들어 그 전체 내용이 본원에 참조로서 통합되는 미국 특허 제5,185,444호, 및 제7,943,762호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 모르폴리노 서브유닛은 다음의 일반 반응식 1에 따라 제조될 수 있다.
반응식 1을 참조하면(B는 염기 페어링 모이어티를 나타내고 PG는 보호기를 나타냄), 모르폴리노 서브유닛은 도시된 바와 같이 상응하는 리보뉴클레오시드(1)로부터 제조될 수 있다. 모르폴리노 서브유닛(2)은 적절한 보호기 전구체, 예를 들어 트리틸 클로라이드와의 반응에 의해 선택적으로 보호될 수 있다. 아래에 보다 상세히 기술되는 것과 같이, 3' 보호기는 대체적으로 고상 올리고머를 합성하는 동안 제거된다. 염기 페어링 모이어티는 고상 올리고머 합성을 위해 적절히 보호될 수 있다. 적절한 보호기는 아데닌과 시토신에 대한 벤조일, 구아닌에 대한 페닐아세틸, 및 하이포크산틴(I)에 대한 피발로일옥시메틸을 포함한다. 피발로일옥시메틸기는 하이포크산틴 헤테로시클릭 염기의 N1 위치에 도입될 수 있다. 보호되지 않은 하이포크산틴 서브유닛이 사용될 수 있지만, 활성화 반응의 수율은 염기가 보호될 때 훨씬 우수하다. 다른 적절한 보호기는 미국 특허 제8,076,476호에 개시된 것들을 포함하고, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
3과 활성화된 인산 화합물 4를 반응시키면 원하는 결합 모이어티를 갖는 모르폴리노 서브유닛 5가 생성된다. 구조식 4의 화합물은 당업자에게 알려진 임의의 다양한 방법을 사용해 제조할 수 있다. 예를 들어, 이러한 화합물은 상응하는 아민과 인 옥시클로라이드의 반응에 의해 제조될 수 있다. 이와 관련하여, 아민 출발 물질은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 본 실시예 및 미국 특허 제7,943,762호에 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
구조식 5의 화합물을 서브유닛 간 결합을 포함하는 올리고머의 제조를 위한 고상 자동화 올리고머 합성에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 간단히 말해, 구조식 5의 화합물의 5' 단부를 변형시켜 고형 지지체(solid support)에 대한 링커를 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 화합물 5는 링커에 의해 고형 지지체에 연결될 수 있다. 일단 지지되면, 보호기(예를 들어, 트리틸)가 제거되고 유리 아민이 구조식 5의 제2 화합물의 활성화된 인 모이어티와 반응한다. 이러한 절차는 원하는 길이의 올리고가 수득될 때까지 반복된다. 종결 5' 말단의 보호기는 제거될 수 있거나, 5' 변형이 필요한 경우 남겨둘 수 있다.
변형된 모르폴리노 서브유닛 및 모르폴리노 올리고머의 제조는 본원의 실시예에서 보다 상세하게 기술된다. 임의의 수의 변형된 결합을 함유하는 모르폴리노 올리고머는 본원에 기술된 방법, 당업계에 공지된 방법 및/또는 본원에 참조로서 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이 제조된 모르폴리노 올리고머의 전반적인 변형이 실시예에 기술된다(예를 들어, PCT 공개 WO 2008/036127 참조).
본원에 기술된 바와 같은 추가의 연결 변형을 함유하는 PMO, PMO+, PPMO, 및 PMO-X의 합성은 당업계에 공지되고 계류 중인, 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는, 미국 특허 제8,299,206호 및 제8,076,476호, 그리고 PCT 공개 번호 WO 2009/064471, WO 2011/150408 및 WO 2012/150960에 기술된 방법을 사용하여 수행되었다.
3' 트리틸 변형을 갖는 PMO는, 중수소화 단계가 생략되는 것을 제외하고, 본질적으로 PCT 공개 번호 WO 2009/064471에 기술된 바와 같이 합성된다.
VIII. 치료 방법
치료 목적(예를 들어, GSD-II를 사용하는 대상체의 치료)을 위해 본 개시의 안티센스 올리고머를 사용하여 엑손 2 함유 GAA mRNA 및/또는 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 본원에 개시된 안티센스 올리고머 또는 이의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 질환은 폼페병이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머는 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA 내의 영역에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 길이 및 상보성의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기에서 해당 영역에 대한 안티센스 올리고머의 결합은 대상체의 세포 및/또는 조직에서 엑손 2 함유 GAA mRNA의 수준을 증가시킨다. 예시적인 안티센스 표적화 서열은 본원의 표 6A-6C에 제시되어 있다.
또한, 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA 내의 영역에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 길이 및 상보성의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 글리코겐 축적 질환 II형(GSD-II; 폼페병)의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 안티센스 올리고머가 본원에 포함되며, 여기에서 해당 영역에 대한 안티센스 올리고머의 결합은 엑손 2 함유 GAA mRNA의 수준을 증가시킨다.
GSD-II를 치료하는 방법 또는 GSD-II의 치료를 위한 의약의 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 화합물은:
18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하는, 안티센스 올리고머을 포함하며, 여기에서:
안티센스 올리고머의 각각의 서브유닛은 핵염기를 포함하거나 비염기성 서브유닛이고;
적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이고;
표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 80% 상보적이다. GSD-II를 치료하는 방법 또는 GSD-II의 치료를 위한 의약의 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 화합물은:
18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하는, 안티센스 올리고머을 포함하며, 여기에서:
안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고머를 포함하고;
안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 서브유닛은 핵염기를 포함하거나 비염기 서브유닛이며, 여기에서 각각의 서브유닛은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단까지 순서대로 함께 취해져 표적화 서열을 형성하고;
적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이고;
표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 80% 상보적이다.
GSD-II를 치료하는 방법 또는 GSD-II의 치료를 위한 의약의 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 화합물은:
18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파 글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하는, 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서,
안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고머를 포함하고;
안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 투과성 펩티드에 공유 결합되고;
안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 서브유닛은 핵염기를 포함하거나 비염기 서브유닛이며, 여기에서 각각의 서브유닛은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단까지 순서대로 함께 취해져 표적화 서열을 형성하고;
적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이고;
표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 80% 상보적이다.
전술한 바와 같이, "GSD-II"는 이의 영향을 받는 개체에서 종종 GAA 단백질의 과소발현을 특징으로 하는 인간 상염색체 열성 질환인, 글리코겐 축적 질환 II형(GSD-II 또는 폼페병)을 지칭한다. 여기에는 영아 GSD-II를 앓고 있는 대상체 및 해당 질환의 후기 발병 형태를 앓고 있는 대상체가 포함된다.
특정 구현예에서, 대상체는 심장, 골격근, 간, 및 신경계 조직을 포함하는 하나 이상의 조직에서 (예를 들어, 건강한 대상체에 비해 또는 더 이른 시점에 비해) GAA 단백질의 발현 및/또는 활성이 감소된다. 일부 구현예에서, 대상체는 심장, 골격근, 간, 및 신경계 조직을 포함하는 하나 이상의 조직에서 (예를 들어, 건강한 대상체에 비해 또는 더 이른 시점에 비해) 증가된 글리코겐 축적량을 갖는다. 특정 구현예에서, 대상체는, 가능하게는 기능적 GAA 단백질의 발현을 감소시키는 다른 돌연변이(들)와 조합될 수 있는, 적어도 하나의 IVS1-13T>G 돌연변이(c.336-13T>G로도 지칭됨)를 갖는다. GSD-II에 사용되는 분자 유전자 시험의 요약은 아래의 표 5에 제시되어 있다.
특정 구현예는 본원에 기술된 바와 같은, 세포, 조직 및/또는 대상체에서 엑손 2 함유 GAA mRNA 또는 단백질의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 경우, GAA mRNA 또는 단백질을 함유하는 엑손-2는 대조군, 예를 들어, 대조군 세포/대상체, 안티센스 올리고머가 없는 대조군 조성물, 치료 부재, 및/또는 이전 시점 대비, 약 또는 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%만큼 증가된다. 또한, 건강한 대조군의 수준 대비 GAA mRNA 또는 단백질을 함유하는 발현을 유지하는 방법이 포함된다.
일부 구현예는 본원에 기술된 바와 같은, 세포, 조직 및/또는 대상체에서 기능성/활성 GAA 단백질의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 소정의 경우, 기능성/활성 GAA 단백질의 수준은 대조군, 예를 들어, 대조군 세포/대상체, 안티센스 올리고머가 없는 대조군 조성물, 치료 부재, 및/또는 이전 시점 대비, 약 또는 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%만큼 증가된다. 또한, 건강한 대조군의 수준 대비 기능성/활성 GAA 단백질의 발현을 유지하는 방법이 포함된다.
특정 구현예는 본원에 기술된 바와 같은, 하나 이상의 세포, 조직, 및/또는 대상체에서 글리코겐의 축적을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 소정의 경우, 글리코겐 축적은 대조군, 예를 들어, 대조군 세포/대상체, 안티센스 올리고머가 없는 대조군 조성물, 치료 부재, 및/또는 이전 시점 대비, 약 또는 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%만큼 감소된다. 또한, 세포, 조직 및/또는 대상체에서 정상이거나 그렇지 않으면 건강한 글리코겐 수준(예를 들어, 무증상 수준 또는 GSD-II의 증상 감소와 연관된 수준)을 유지시키기 위한 방법이 포함된다.
또한, GSD-II의 하나 이상의 증상의 감소를 필요로 하는 대상체에서 이를 감소시키는 방법이 포함된다. 특정 예는, 영아 GSD-II의 증상, 예컨대 심장 비대증, 근긴장 저하증, 심근병증, 좌심실 유출 폐색증, 호흡 곤란증, 운동 지연/근육 약화, 및 섭식 장애/성장 장애를 포함한다. 추가의 예는, 후기 발병 GSD-II의 증상, 예컨대 근육 약화(예를 들어, 진행성 근육 약화를 포함하는 골격근 약화), 기침 장애, 재발성 흉부 감염, 근긴장 저하증, 운동 발달 지연, 삼키거나 씹는 데 있어서의 어려움, 및 폐활량 감소 또는 호흡 부전증을 포함한다.
본 개시의 안티센스 올리고머는 GSD-II를 (예방적으로 또는 치료적으로) 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 치료와 관련하여, 약물유전체학(즉, 개체의 유전자형과 외래 화합물 또는 약물에 대한 개체의 반응 사이의 관계에 대한 연구)이 고려될 수 있다. 치료제의 대사 차이로 인해 약리학적 활성 약물의 투여량과 혈중 농도 사이의 관계가 변경됨으로써 심각한 독성이나 치료 실패가 발생할 수 있다.
따라서, 의사 또는 임상의는 치료제의 투여 여부를 결정하고 치료제의 투여량 및/또는 치료 요법을 맞춤화하는 데 있어서 관련 약물유전체학 연구에서 얻은 지식을 적용하는 것을 고려할 수 있다.
안티센스 올리고머의 표적 핵산에 대한 효과적인 전달은 치료의 하나의 양태이다. 안티센스 올리고머 전달 경로는 경구 및 비경구 경로를 포함하는 다양한 전신 경로, 예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 및 근육내, 그리고 흡입, 경피, 및 국소 전달을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 적절한 경로는 치료 중인 대상체의 병태에 적절하게, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계, 및 뇌척수액은 RNA가 도입될 수 있는 일부 비제한적인 부위이다. 직접적인 CNS 전달이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 뇌실내 또는 경막내 투여가 투여 경로로서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 안티센스 올리고머(들)는 근육내 주사(IM)에 의해 대상체에게 투여된다; 즉 이들은 근육내 투여되거나 전달된다. 근육내 주사 부위의 비제한적인 예는 팔의 삼각근, 다리의 측두근, 및 엉덩이의 둔근, 및 둔부의 후둔근을 포함한다. 특정 구현예에서, PMO, PMO-X, 또는 PPMO는 IM으로 투여된다.
특정 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 중추신경계 조직에서의 글리코겐 축적이다. 이러한 예는 중추신경계 병리가 GSD-II에서 호흡 결핍에 기여하는 경우를 포함한다(예를 들어, DeRuisseau 등의 문헌[PNAS USA. 106:9419-24, 2009] 참조). 따라서, 본원에 기술된 안티센스 올리고머는, 예를 들어, 대상체가 CNS가 관여된 갖는 GSD-II를 갖는 경우, 임의의 당업계에서 인지된 방법에 의해 대상체의 신경계에 전달될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 안티센스 올리고머의 말초 혈액 주사는 확산 및/또는 활성 수단을 통해 전술한 시약을 말초 신경에 전달하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 안티센스 올리고머는 혈액-뇌-장벽(BBB)을 가로지르는 것을 촉진하여 중추신경계(CNS)의 신경 세포에 전술한 시약의 전달이 이루어지도록 변형될 수 있다. 안티센스 올리고머 기술 및 전달 전략의 최근의 특정 발전은 뉴런 장애에 대한 안티센스 올리고머 사용의 범위를 확장시켰다(예를 들어, Forte, A. 등의 문헌[2005. Curr. Drug Targets 6:21-29]; Jaeger, L. B., 및 W. A. Banks의 문헌[2005. Methods Mol. Med. 106:237-251]; Vinogradov, S. V. 등의 문헌[2004. Bioconjug. Chem. 5:50-60] 참조; 전술한 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 통합됨). 예를 들어, 본 개시의 안티센스 올리고머는 펩티드 핵산(PNA) 화합물로서 생성될 수 있다. PNA 시약은 각각 BBB를 가로지르는 것으로 식별되었다(Jaeger, L. B., 및 W. A. Banks의 문헌[2005. Methods Mol. Med. 106:237-251]). 예를 들어, 혈관활성제를 사용하는 대상체의 치료는 또한 BBB를 가로지르는 수송을 촉진하는 것으로 기술되었다(Id). BBB를 통해 능동적으로 수송되는 제제에 대한 본 개시의 안티센스 올리고머의 테더링 또한 전달 메커니즘으로서 사용될 수 있다. 요오드헥솔과 같은 조졍제와 함께(예를 들어, 개별적으로, 동시에, 동일한 제형으로) 안티센스제를 투여하면, 그 전체가 참조로서 통합된 PCT 공개 WO/2013/086207호에 기술된 바와 같이, BBB를 가로지르는 전달을 용이하게 할 수도 있다.
소정의 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머는 경피 방법에 의해 (예를 들어, 안티센스 올리고머를 유화액에 혼입함으로써(여기에서, 해당 안티센스 올리고머는 선택적으로 리포솜에 패키징됨)) 전달될 수 있다. 이러한 경피 및 유화액/리포좀 매개 전달 방법은, 당업계에서, 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로서 통합되는, 미국 특허 제6,965,025호에 안티센스 올리고머의 전달로서 기술되어 있다.
본원에 기술된 안티센스 올리고머는 또한 이식 가능한 장치를 통해 전달될 수 있다. 이러한 장치의 설계는, 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로서 통합되는 미국 특허 제6,969,400호에 기술된, 합성 이식물 설계로서 업계에서 인정받는 프로세스이다.
안티센스 올리고머는 당업계에서 인정된 기술(예를 들어, 형질감염, 전기천공, 융합, 리포좀, 콜로이드성 중합체 입자, 및 바이러스 및 비-바이러스 벡터뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 수단)을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 선택된 전달 방법은 적어도 올리고머 화학, 치료될 세포 및 세포의 위치에 따라 달라지게 되며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 국소화는 리포좀을 유도하기 위해 표면 상에 특이적 마커를 갖는 리포좀, 표적 세포를 함유하는 조직 내로의 직접 주사, 특이적 수용체 매개 흡수 등에 의해 이루어질 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 안티센스 올리고머는, 예를 들어, 리포좀 매개 흡수, 엑소좀 매개 흡수, 지질 접합체, 폴리리신 매개 흡수, 나노입자 매개 흡수, 및 수용체-매개 세포내분비, 그리고 추가적인 비-세포내분비성 전달 모드, 예컨대 미세주입, 투과화(예를 들어, 스트렙토리신-O 투과화, 음이온성 펩티드 투과화), 전기천공, 및 당업계에 공지된 다양한 비침습적 비-세포내분비성 전달 방법(Dokka 및 Rojanasakul의 문헌[Advanced Drug Delivery Reviews 44, 35-49]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로서 통합됨)을 포함하는 방법을 사용하여 전달될 수 있다.
안티센스 올리고머는 생리학적으로 및/또는 약학적으로 허용가능한 임의의 편리한 비히클 또는 담체로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 당업자에 의해 사용되는 다양한 표준 약학적으로 허용가능한 담체 중 어느 하나를 포함할 수도 있다. 이의 예는 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 물, 수성 에탄올, 유화액, 예컨대 오일/물 유화액 또는 트리글리세리드 유화액, 정제, 및 캡슐을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 적절한 생리학적으로 허용가능한 담체의 선택은 선택된 투여 방식에 따라 달라질 것이다. "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 투여에 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가 활성 화합물에 부적합한 경우를 제외하고는, 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 조성물 중 혼입될 수 있다.
본 개시의 화합물(예를 들어, 안티센스 올리고머)은 일반적으로 유리산 또는 유리염기로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 화합물은 산 또는 염기 부가염의 형태로 사용될 수 있다. 본 개시의 유리 아미노 화합물의 산 부가염은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 유기산 및 무기산으로부터 형성될 수 있다. 적합한 유기산은, 말레산, 푸마르산, 벤조산, 아스코르브산, 숙신산, 메탄설폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 옥살산, 프로피온산, 타르타르산, 살리실산, 구연산, 글루콘산, 락트산, 만델산, 신남산, 아스파르트산, 스테아르산, 팔미트산, 글리콜산, 글루탐산, 및 벤젠설폰산을 포함한다.
적합한 무기산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 및 질산을 포함한다. 염기 부가염은 카르복실레이트 음이온으로 형성되는 염을 포함하며, 알칼리 및 알칼리 토금속(예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 바륨 및 칼슘)으로부터 선택된 것들과 같은 유기 및 무기 양이온뿐만 아니라 암모늄 이온 및 이의 치환된 유도체(예를 들어, 디벤질암모늄, 벤질암모늄, 2-하이드록시에틸암모늄 등)로 형성된 염을 포함한다. 따라서, 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 임의의 그리고 모든 허용 가능한 염 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
추가적으로, 전구약물 또한 본 개시의 맥락 내에 포함된다. 전구약물은, 해당 전구약물이 환자에게 투여될 때 생체 내에서 화합물을 방출하는 임의의 공유 결합된 담체이다. 전구약물은 대체적으로 통상적인 조작에 의해 또는 생체 내에서 변형이 절단되어 모 화합물을 수득하는 방식으로 작용기를 변형시킴으로써 제조된다. 전구약물은, 예를 들어, 하이드록시, 아민, 또는 설프히드릴기가, 환자에게 투여될 때 절단되어, 하이드록시, 아민, 또는 설프히드릴기를 형성하는 임의의 기에 결합되는, 본 개시의 화합물을 포함한다. 따라서, 전구약물의 대표적인 본 개시의 안티센스 올리고머의 알코올 및 아민 작용기의 아세테이트, 포름산염, 및 벤조에이트 유도체를 포함한다(그러나 이에 한정되지 않음). 또한, 카르복실산(-COOH)의 경우, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 등과 같은 에스테르가 사용될 수 있다.
일부 경우, 안티센스 올리고머의 세포 내로의 흡수를 용이하게 하기 위해 리포좀이 사용될 수 있다(예를 들어, Williams, S.A.의 문헌[Leukemia 10(12):1980-1989, 1996]; Lappalainen 등의 문헌[Antiviral Res. 23:119, 1994]; Uhlmann 등의 문헌[antisense oligomers: a new therapeutic principle, Chemical Reviews, Volume 90, No. 4, 25 pages 544-584, 1990]; Gregoriadis, G.의 문헌[Chapter 14, Liposomes, Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341, Academic Press, 1979] 참조). 또한, 예를 들어 WO 93/01286에 기술된 바와 같이, 안티센스 올리고머 투여를 위한 비히클로서 하이드로겔이 사용될 수 있다. 대안적으로, 올리고머는 미소구체 또는 미세입자로 투여될 수 있다. (예를 들어, Wu, G.Y. 및 Wu, C.H.의 문헌[J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 30 1987] 참조). 대안적으로, 미국 특허 제6,245,747호에 기술된 바와 같이, 안티센스 올리고머와 복합체를 이룬 가스 충진 미세 기포의 사용은 표적 조직으로의 전달을 향상시킬 수 있다. 서방형 조성물 또한 사용될 수 있다. 이들은 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 형상화된 용품의 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고머는 적절한 약학적 담체 중, 리소좀 축적 장애의 증상을 나타내는 포유류 대상체, 예를 들어 인간 또는 가축에게 투여된다. 방법의 일 양태에서, 대상체는 인간 대상체, 예를 들어 GSD-II(폼페병)를 앓고 있는 것으로 진단된 환자이다. 바람직한 일 구현예에서, 안티센스 올리고머는 약학적으로 허용가능한 담체 중에 함유되고, 경구 전달된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 안티센스 올리고머는 약학적으로 허용가능한 담체 중에 함유되고, 정맥내(i.v.) 전달된다.
일 구현예에서, 안티센스 화합물은 적어도 200-400 nM의 안티센스 올리고머의 피크 혈액 농도를 생성하는 데 효과적인 양 및 방식으로 투여된다. 일반적으로, 안티센스 올리고머의 1회 이상의 투여량이 대체적으로 약 1 내지 2주의 기간 동안 일정한 간격으로 투여된다. 경구 투여에 대한 바람직한 투여량은 70 kg 당 약 1-1000 mg의 안티센스 올리고머이다. 일부 경우, 1000 mg 올리고머/환자 초과의 투여량이 필요할 수 있다. i.v. 투여의 경우, 바람직한 투여량은 70 kg 당 약 0.5 mg 내지 1000 mg 올리고머이다. 안티센스 올리고머는 단기간 동안 일정한 간격으로, 예를 들어, 2주 이하 동안 매일 투여될 수 있다. 그러나, 일부 경우, 올리고머는 더 긴 기간에 걸쳐 간헐적으로 투여된다. 투여는 항생제 또는 다른 치료적 치료제의 투여 이후 또는 이와 동시에 이루어질 수 있다. 치료 요법은 면역검정, 다른 생화학적 시험, 및 치료 중인 대상체의 생리학적 검사의 결과에 기초하여, 표시된 바와 같이 조정될 수 있다(투여량, 빈도, 경로 등).
특정 구현예에서, 방법은 시험관 내 방법이다. 다른 특정 구현예에서, 방법은 생체 내 방법이다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 비인간 영장류 세포이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 인간 세포이다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 자연 발생 세포이다. 다른 특정 구현예에서, 숙주 세포는 조작된 세포이다.
특정 구현예에서, 안티센스 올리고머는 적절한 약학적 담체 중, 포유류 대상체, 예를 들어 인간 또는 실험실 동물 또는 가축에게 투여된다.
특정 구현예에서, 안티센스 올리고머는 추가 제제와 함께, 포유류 대상체, 예를 들어 인간 또는 실험실 동물 또는 가축에게 투여된다. 안티센스 올리고머 및 추가 제제는 동일하거나 상이한 투여 경로 및/또는 부위를 통해 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 소정의 구현예에서, 안티센스 올리고머 및 추가 제제는 공동 제형화되고 함께 투여될 수 있다. 소정의 구현예에서, 안티센스 올리고머 및 추가 제제는 키트에 함께 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체 중 함유된 안티센스 올리고머는 경구 전달된다.
일 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체 중 함유된 안티센스 올리고머는 정맥내(i.v.) 전달된다.
추가적인 투여 경로, 예를 들어 피하, 복강내, 및 폐 또한 본 개시에서 고려된다.
방법의 또 다른 적용에서, 대상체는 가축 동물, 예를 들어 돼지, 소 또는 염소 등이며, 치료는 예방적 또는 치료적이다. 또한, 가축에게 식품 물질을 공급하는 방법에서, 식품 물질을 전술한 바와 같은 안티센스 올리고머 조성물의 유효량으로 보충시키는 개선안이 고려된다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고머는 적어도 200 nM의 안티센스 올리고머의 피크 혈액 농도를 생성하는 데 효과적인 양 및 방식으로 투여된다. 일 구현예에서, 안티센스 올리고머는 적어도 200 nM의 안티센스 올리고머의 피크 혈장 농도를 생성하는 데 효과적인 양 및 방식으로 투여된다. 일 구현예에서, 안티센스 올리고머는 적어도 200 nM의 안티센스 올리고머의 피크 혈청 농도를 생성하는 데 효과적인 양 및 방식으로 투여된다.
일 구현예에서, 안티센스 올리고머는 적어도 400 nM의 안티센스 올리고머의 피크 혈액 농도를 생성하는 데 효과적인 양 및 방식으로 투여된다. 일 구현예에서, 안티센스 올리고머는 적어도 400 nM의 안티센스 올리고머의 피크 혈장 농도를 생성하는 데 효과적인 양 및 방식으로 투여된다. 일 구현예에서, 안티센스 올리고머는 적어도 400 nM의 안티센스 올리고머의 피크 혈청 농도를 생성하는 데 효과적인 양 및 방식으로 투여된다.
일반적으로, 안티센스 올리고머의 1회 이상의 투여량이 대체적으로 약 1 내지 2주의 기간 동안 일정한 간격으로 투여된다. 경구 투여에 대한 바람직한 투여량은 체중 kg 당 약 0.01-15 mg의 안티센스 올리고머이다. 일부 경우, kg 당 15 mg 초과의 안티센스 올리고머의 투여량이 필요할 수 있다. i.v. 투여의 경우, 바람직한 투여량은 체중 kg 당 약 0.005 mg 내지 15 mg 안티센스 올리고머이다. 안티센스 올리고머는 단기간 동안 일정한 간격으로, 예를 들어, 2주 이하 동안 매일 투여될 수 있다. 그러나, 일부 경우, 안티센스 올리고머는 더 긴 기간에 걸쳐 간헐적으로 투여된다. 투여는 항생제 또는 다른 치료적 치료제의 투여 이후 또는 이와 함께 이루어질 수 있다. 치료 요법은 면역검정, 다른 생화학적 시험, 및 치료 중인 대상체의 생리학적 검사의 결과에 기초하여, 표시된 바와 같이 조정될 수 있다(투여량, 빈도, 경로 등).
안티센스 올리고머를 사용하는 효과적인 생체 내 치료 요법은 투여 지속 기간, 투여량, 빈도 및 경로뿐만 아니라 치료 중인 대상체의 병태(즉, 예방적 투여 대 국소 또는 전신 감염에 대한 투여)에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 이러한 생체 내 요법은 최적의 치료 결과를 달성하기 위해, 종종 치료 중인 시험에 의한 모니터링, 및 이에 상응하는 투여량 또는 치료 요법의 조정을 필요로 할 것이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머는 포유류 세포에 의해 능동적으로 흡수된다. 추가의 구현예에서, 안티센스 올리고머는 이러한 흡수를 용이하게 하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 수송 모이어티(예를 들어, 수송 펩티드)에 접합될 수 있다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 마치 구체적으로 그리고 개별적으로 표시되어 참조에 의해 통합된 것처럼 동일한 수준으로 참조로서 본원에 통합된다.
실시예
본 실시예는, 예시의 목적을 위해 그리고 본 개시의 특정 구현예를 설명하기 위해 아래에 제시된다. 그러나, 본 청구범위의 범주는 어떤 방식으로도 본원에 제시된 실시예에 의해 제한되지 않는다. 개시된 구현예에 대한 다양한 변경 및 변형이 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시의 화학적 구조, 치환기, 유도체, 제형 또는 방법과 관련된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 이러한 변경 및 변형은, 본 개시의 사상 및 첨부된 청구범위의 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원의 반응식 중 구조 내의 변수의 정의는 본원에 제시된 화학식 내의 상응하는 위치의 정의에 상응한다.
실시예 1 - 안티센스 표적화 서열의 설계
안티센스 올리고머 표적화 서열은 인간 GAA 유전자에서의 IVS1-13T>G 돌연변이와 관련된 치료적 스플라이스-스위칭 응용을 위해 설계되었다. 여기에서, 스플라이스-스위칭 올리고머는 인트론 및 엑손 스플라이스 사일렌서 요소(각각 ISS 및 ESS 요소)를 억제하며, 이에 의해 성숙한 GAA mRNA에서의 엑손 2 보유를 촉진할 것으로 예상된다. 정상 또는 거의 정상인 GAA 발현의 복원은 이에 이어서 기능적 효소가 합성될 수 있게 함으로써, GSD-II 환자에게 임상적 이점을 제공할 것이다.
표 6A-6C에 제시된 바와 같은 표적화 서열을 포함하는 예시적인 올리고머를 PPMO(아르기닌-풍부 CPP와 같은, CPP에 접합된 올리고머)로서 제조하였다. 후술하는 바와 같이, 이들 안티센스 올리고머를 아래의 실시예 2에 또한 기술된 바와 같은 체질 흡수 프로토콜을 사용하여 GSD-II 환자 유래 섬유아세포 및 환자 iPSC 유래 근관 내로 도입하였다.
실시예 2 - 물질 및 방법
GSD-II 세포. GSD-II(Coriell 세포주 GM00443 및 GM11661)를 가진 개체로부터의 환자 유래 섬유아세포를 10%-15% FBS가 포함된 Eagle의 DMEM 중에서 표준 프로토콜에 따라 배양하였다. 세포는 실험 전에 적어도 2번 계대배양되었으며, 형질감염 시 약 80% 융합되었다. GM00443 및 GM11661 환자 유래 섬유아세포를 iPSC 계통으로 재프로그래밍하고, 후속하여 근육아세포로 분화시키고, 증식시키고, 보관하였다. 환자 iPSC 유래 근육아세포를 근육아세포 증식 배지에서 배양하고 사용 전에 2회 계대배양하였다. 근육아세포를 치료 전 2일 동안 근관으로 분화시켰다.
GM00443 섬유아세포는 30세 남성으로부터 유래한다. 성인 형태; 30대에 발병; GAA에 대한 mRNA의 정상 크기 및 양, 항체에 의해 검출된 GAA 단백질, 그러나 정상 산-알파-1,4 글루코시다아제 활성의 9 내지 26%에 불과함; CCR에서의 3회 계대배양; 공여자 대상체는 GAA 유전자의 인트론 1의 수용자 부위의 위치 -13에서 T>G 전환을 운반하는 하나의 대립유전자를 갖는 이형접합성이며, 이는 대안적으로 제1 코딩 엑손의 결실을 갖는 스플라이싱된 전사체를 생성함[엑손 2 (IVS1-13T>G)].
GM11661 섬유아세포는 38세 남성으로부터 유래한다. 간 기능 검사 이상; 신체 활동 중 가끔씩 다리에 쥐가 남(charley-horse); 아침 두통; 기름진 음식에 대한 내성; 복부 낭종; 결핍된 섬유아세포 및 WBC 산-알파-1,4 글루코시다아제 활성; 공여자 대상체는 화합물 이형접합체임: 대립유전자 1은 GAA 유전자의 인트론 1의 수용자 부위의 위치 -13에서 T>G 전환을 가짐(IVS1-13T>G); 생성된 대안적으로 스플라이싱된 전사체는 개시 코돈을 함유하는 엑손 2의 프레임 내 결실을 가짐; 대립유전자 2는 엑손 18의 프레임 내 결실을 운반함.
치료 프로토콜. 환자 유래 섬유아세포를 사용 전에 2회 계대배양하였다. 다양한 농도의 PPMO를 함유하는 배지를 변화시킴으로써 세포를 약 80% 컨플루언시로 치료하였다. 환자 iPSC-유래 근육아세포를 사용 전에 적어도 2회 계대배양/증식시켰다. 근육아세포를 1일 동안 배양하고, 다양한 농도의 PPMO를 함유하는 분화 배지를 사용하여 처리하기 전에 2일 동안 근관으로 분화시켰다.
GAA qPCR. 정량적 PCR 실험의 경우, 기준 유전자에 더하여 엑손 1-2 및 엑손 3-4 접합부에서 GAA mRNA를 동시에 증폭시키는 멀티플렉스 TaqMan qPCR 검정을 사용하였다. 치료된 환자 iPSC 유래 근관으로부터의 100-500 ng의 총 RNA를 SuperScript VILO cDNA 합성 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 역전사하였다. Quantstuio 7 Pro thermocycler(Thermo Fisher)를 사용하는 TaqMan Multiplex Master Mix(Thermo Fisher)를 사용하여 증폭하기 전에 cDNA를 3-10배 희석하였다. 각각의 qPCR 반응은 GAA 엑손 1-2 접합부를 검출하기 위한 FAM 프로브, GAA 엑손 3-4 접합부를 검출하기 위한 VIC 프로브, 및 기준 유전자를 검출하기 위한 JUN 프로브를 함유하였다. 멀티플렉스에서의 각각의 검정 및 프로브 세트에 대한 상대적 표준 곡선을 생성하고, 이를 사용하여 기준 유전자에 대해 정규화된 치료된 샘플에서의 각각의 종의 출발량을 계산하였다.
GAA 효소 검정 및 단백질 단순 Wes. 환자 유래 섬유아세포를 약 80% 컨플루언시로 배양한 다음, 체질 흡수를 통해 PPMO 화합물로 치료하였다. 치료는 6일 동안 계속되었으며, 해당 시점에서 Abcam GAA Activity Assay Kit(ab252887)를 사용하여 GAA 활성을 측정하였다.
ProteinSimple® Jes TM 시스템을 사용하여 GAA 단백질에 대한 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다. 재조합 항-GAA 항체(EPR4716(2))(Abcam ab137068) 및 ProteinSimple® 항-토끼 검출 모듈(DM-001) 및 12-230 kDa 분리 모듈(SM-W004)을 사용하여 GAA를 검출하였다. ProteinSimple® Protein normalization Kit(AM-PN01)를 사용하여 GAA 단백질 농도를 총 단백질에 대해 정규화하였다.
실시예 3 - 안티센스 PPMO의 제조 (R 1 은 -N(CH 3 ) 2 임)
안티센스 PPMO는 인간 GAA pre-mRNA(예를 들어, 인간 GAA pre-mRNA의 인트론 1)를 표적화하도록 설계되었고, 본원에 기술된 바와 같이 합성되었으며, GSD-II 환자 유래 섬유아세포 및 GSD-II 환자 iPSC 유래 근관의 치료에 사용되었다.
실시예 4 - GSD-II 환자 유래 섬유아세포에서의 GAA 활성 및 단백질
전술한 안티센스 PPMO를 체질 흡수로 GM00443 또는 GM11661 섬유아세포 및 환자 후 iPSC 유래 근관에 전달하였다. 37℃에서 5% CO2로 4 내지 6일 동안 인큐베이션하고, 세포를 용해시키고, 전술한 바와 같이 면역분석에 의해 용해물 중 GAA 활성 또는 GAA 단백질 발현을 측정하였다. 대체적으로, 본 개시의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 치료된 세포에서의 GAA 효소의 단백질 발현은 미치료 세포에서의 GAA 발현 수준보다 높았다. 이러한 결과는 본 개시의 올리고뉴클레오티드가 후기 발병 폼페병 환자의 세포에서의 GAA 효소의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 변이체 올리고뉴클레오티드의 표적화 서열은 인간 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적이며, 여기에서 표적 영역은 퓨린 및 피리미딘이 없는 비염기성 서브유닛을 포함한다. 놀랍게도, 이들 비염기성 서브유닛의 사용은 부모 서열의 효능을 유지하면서 저수율 올리고뉴클레오티드의 합성을 촉진시켰다.
실시예 5 - 활성화된 모르폴리노 비염기성 서브유닛의 소규모 합성
일반 제조: 화합물 1(1.10당량)을 디클로로메탄(7.00 mL/g) 중에 현탁시켰다. 이 현탁액에 테트라메틸구아니딘(0.50 당량) 및 디이소프로필에틸아민(1.80 당량)을 첨가하고, 혼합물을 30℃로 가온시키고 60분 동안 유지시켜 물질을 용해시킨 후 실온으로 냉각시켰다. 별도로, 트리틸 클로라이드(1.00당량)을 디클로로메탄(2.42 mL/g) 중에 용해시키고, 이 용액을, 온도를 30℃ 미만으로 유지시키며 제1 용액에 서서히 첨가하였다. 반응 완료 시(1-2시간), 반응 혼합물을 구연산염 완충액(pH 4) 및 물로 세척하였다. 유기상을 분리하고 화합물 2 함량에 대해 분석하였다(수율: 93%).
화합물 2(1.00 당량)의 용액에 2,6-루티딘(1.15 당량) 및 N-메틸이미다졸(0.38 당량)을 첨가하고, 용액을 대기 증류로 6.00 mL/g의 부피로 농축시켰다. 디클로로메탄(5.00 mL/g)을 용액에 첨가하고, 대기 증류로 동일한 부피로 다시 농축시켰다. 이러한 프로세스를, Karl-Fischer 적정으로 수분 함량을 검출할 수 없을 때까지 반복하고, 용액을 0-5℃로 냉각시켰다. 디메틸아미노포스포릴 디클로라이드(1.05 당량)를 옅은 스트림으로 첨가하고, 반응 혼합물을 실온으로 밤새 가온시켰다.
반응 완료를 확인한 후, 혼합물을 분자체 컬럼으로 통과시키고, 생성된 용액을 헵탄 중 에틸 아세테이트의 단계적 구배를 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물 함유 분획을 풀링하고, 해당 풀을 증발 건조시켜 최종 생성물 고형분을 생성하였다(수율: 최종 단계에 대해 73%, 2-단계 프로세스에 대해 68%).
활성화된 모르폴리노 서브유닛은 수성 HPLC 이동상에서 불안정하기 때문에, 1-(4-니트로페닐)피페라진(NPP)을 이용한 퀀치 유도체화를 사용하여, 서브유닛을 HPLC 분석을 위한 안정적인 디아미드화 유도체로 전환시켰다. 　NPP는 391 nm에서 강력하게 흡수되므로, 안정성을 제공하는 것 외에도, 이는 391 nm에서의 분석을 사용하여 올리고머의 성장 사슬과 반응할 가능성이 있는 불순물을 관찰하는 데 사용될 수 있다.
분석을 위한 생성물은 NPP-유도 활성화된 모르폴리노 비염기성 서브유닛이기 때문에, 해당 물질의 표준을 합성하고 HPLC, 질량 분광계 및 NMR로 특성화하였다. 　 이는 질량 분광계 및 NMR로 확인된 구조를 갖는 합성된 표준의 HPLC 크로마토그램과 비교하여 활성화된 서브유닛을 식별할 수 있게 한다. 　 HPLC 분석에서의 생성물 피크는 2개의 부분 입체이성질체의 부분 분리로 인해 약간 분할된다.
실시예 6 - GSD-II 환자 유래 섬유아세포에서의 GAA 활성
섬유아세포 배양물. 인간 섬유아세포 세포주를 5% CO2의 37℃ 인큐베이터에서 15% 소태아 혈청(FBS) 및 2 mM의 L-글루타민을 함유하는 변형된 이글(Eagle) 배지(MEM, Thermo Fisher) 중에 유지하였다. 여기에서 사용되는 섬유아세포 세포주는 Coriell Institute로부터 입수하였으며, 이는 다음의 세포주를 포함한다: GM08402(건강한 대조군), GM08400(건강한 대조군), GM00443(폼페병 후기 발병), GM11661(폼페병 후기 발병), GM20089(폼페병 영아 발병), 및 GM20123(건강한 폼페병 담체). 치료 1일 전, 세포를 24-웰 세포 배양 플레이트에 30,000 세포/웰로 도말하고 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 PBS 중에서 세척하고, 배지가 보충된 PPMO의 치료제를 웰에 첨가하였다. 세포를 치료제와 함께 인큐베이션하고 배지를 6일 동안 변화시키지 않았다. GAA 활성 검정 용해의 경우, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 얼음-냉각 GAA Activity Assay Buffer(Abcam) 중에 용해시켰다. 도 6은 선택된 PPMO 화합물을 사용한 체질 치료 후 환자 섬유아세포에서의 GAA 발현의 투여량 의존적 증가를 나타내다.
실시예 7 - GSD-II 환자 유래 근관에서의 GAA 활성 및 단백질
환자 iPSC 유래 근관. 환자 섬유아세포를 무-피더(feeder) 및 무-풋프린트(footprint) 방법을 사용하여 iPSC로 재프로그래밍하였다. 마커 Oct3/4, NANOG, TRA-1-60을 사용하는 면역염색으로 전분화능(Pluripotency)을 검증하였다. iPSC는 정상 핵형 및 알칼리 인산분해효소 활성을 유지하였다. iPSC 세포주를 근육아세포로 분화시키고, 동결시키고, 재생시켰다. 근육아세포 마커 Desmin 및 MyoD의 면역형광법 및 qPCR로 측정했을 때의 키 마커의 발현으로 근원성 계통을 확인하였다. 근육아세포의 종결부 분화를 배양 3-6일에 걸쳐 수행하고, 면역형광법으로 측정된 근원성 마커 MHC 및 MyoG의 발현으로 이를 확인하였다.
섬유아세포의 iPSC 내로의 비-통합적 재프로그래밍. 섬유아세포는 DMEM 10% FCS에서 유지되었다. 밤새 인큐베이션한 후, 배양 배지를 신선한 것으로 교체하고, 세포를 FuGENE6 형질감염 시약(Promega)을 사용하여, Epi5 TM iPSC Reprogramming Kit(Themofisher)로부터의 2 μg의 에피솜 플라스미드로 형질감염시켰다. 다음 날, 배양 배지를 mTeSR-플러스 배지(StemCell Technologies)로 교체하였다. 재프로그래밍 프로세스 동안, 형질감염된 세포를 mTeSR plus 중에서 배양하고, 배지를 형질감염 후 최대 2주까지 격일로 교체하였다. 피펫 팁을 사용하여, Geltrex 매트릭스로 덮인 새로운 배양 접시 상에 콜로니를 옮겼다. 해당 절차 1시간 전, 10 μM Y-27632를 배양 배지에 첨가하였다. iPSC는 Alonso-Barroso 등의 문헌[Stem Cell Res. 23, 173-177; 2017]에 기술된 바와 같이 mTeSR 플러스 배지에서 추가로 전파되고 유지되었다.
SKM 분화. 근원성 전구세포를 이전에 기술된 프로토콜에 따라 hiPSC로부터 분화시켰다(Chal, J 등의 문헌[ Al. Nat. Biotech. 2015, 33, 962-969]). 요약하면, 다단계 소분자 분화 프로토콜을 통해 근원성 전구세포를 생성하였다. 근원성 전구세포를 증식시키고, 계대배양하고, 60 μg/mL 콜라겐 I 코팅된 6-웰 플레이트에서 동결 보존하였다. 근육아세포 분화를 위해, 동결된 근원성 전구세포를 근육아세포 증식 배지(iXCells, Cat. # MD-0102A)에서 해동시켰다. 성장 배지를 8일 동안 2일마다 새롭게하고, 이에 이에서 동결 보존하였다. 근관 분화를 위해, 근육아세포를 회수하고 32,000/cm2의 밀도로 시딩하고, 근육아세포 증식 배지를 사용하여 배양하여 100% 컨플루언시를 달성하였다. 골격근 세포 분화를 위해, 융합성 근육아세포 배양물을 근육아세포 분화 배지(iXCells, Cat.# MD-0102B)로 스위칭시키고, 배지를 2일마다 교체하였다. 근육아세포 분화 배지 중 72시간 후, 세장형 근관이 명백해졌다.
PPMO는 LOPD 환자 iPSC 유래 근관에서 GAA 발현을 증가시킴. 환자 iPSC 유래 근육아세포를 96-웰 또는 24-웰 콜라겐 코팅된 플레이트(Corning)에 시딩하고 iPSC 유래 근육아세포 증식 배지(iXCells Biotechnologies)에서 48시간 동안 증식시켰다. 배지를 근관 분화 배지(iXCells Biotechnologies)로 변경하고, 48시간 동안 분화를 지속시켰다. 그런 다음, 배지를 표시된 농도의 PPMO를 함유하는 신선한 분화 배지로 변경하였다. 제조사 프로토콜에 따라, Quick -RNA 96 Kit(Zymo)를 사용하여 72시간의 체질 치료 후 세포 배양물로부터 RNA를 추출하였다. 제조사 프로토콜에 따라, 100-300 ng의 RNA를 superscript VILO 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 역전사하였다. FAM 채널 상에서의 엑손 1-2 유전자좌에서의 GAA 발현(Hs.PT.58.24962380, Integrated DNA Technologies, 900 nM 프라이머, 250 nM 프로브), VIC 채널 상에서의 엑손 3-4 유전자좌에서의 GAA(Hs01089834_m1, Thermo Fisher, 1.8 μM 프라이머, 500 nM 프로브), 및 JUN 채널 상에서의 HPRT(Hs99999909_m1_qsy, Thermo Fisher, 900 nM 프라이머, 250 nM 프로브)를 측정하는 멀티플렉스 qPCR 검정이 Quantstudio 7 Pro PCR 열순환기(Thermo Fisher) 상에서 Multiplex Master Mix(Thermo Fisher)로 사용되었다. qPCR 사이클링 조건은 95℃에서 20초 동안의 초기 변성 단계, 이에 이어서 3초 동안의 95℃의 40회 사이클, 1.92℃/초 램핑 속도의 20초 동안의 58℃로 구성되었다. 도 7 및 도 8은 선별된 PPMO를 사용한 체질 치료 후, 환자 iPSC 유래 근관에서의 GAA 발현의 투여량 의존적 증가를 나타낸다.
PPMO는 LOPD 환자 iPSC 유래 근관에서 GAA 단백질을 증가시킴. 환자 iPSC 유래 근육아세포를 24-웰 콜라겐 코팅된 플레이트(Corning)에 시딩하고 iPSC 유래 근육아세포 증식 배지(iXCells Biotechnologies)에서 24시간 동안 증식시켰다. 배지를 근관 분화 배지(iXCells Biotechnologies)로 변경하고, 24시간 동안 분화를 지속시켰다. 그런 다음, 배지를 표시된 농도의 PPMO를 함유하는 신선한 분화 배지로 변경하였다. 96시간의 체질 치료 후 RIPA 용해 완충액(Thermo Fisher)을 사용하여 세포 용해물을 제조하였다. Pierce BCA Assay Kit(Thermo Fisher)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 자동화된 모세관 웨스턴 블롯 시스템인 JESS 시스템(Proteinsimple)용 샘플 제조 키트(Proteinsimple)를 사용하여 세포 용해물을 제조하였다. 프로토콜 지침에 따라, 세포 용해물을 0.1X 샘플 완충액(Proteinsimple)을 사용하여 동일한 단백질 농도로 희석시키고, 5X 형광 마스터 혼합물(Proteinsimple)과 혼합하였다. 프로토콜 지침에 따라 샘플을 95℃에서 변성시켰다. 무-우유 항체 희석제; 단백질 정규화 기질; 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)-접합 이차 항체; 화학발광 기질; 및 분석 플레이트의 표시된 웰 내에 분배된 세척 완충액으로 희석된 1:400 희석 항-GAA 일차 항체(Abcam ab137068)를 사용하여 JESS를 수행하였다. 비오티닐화된 래더 마커와 함께 JESS 플레이트 상의 표시된 위치에 샘플을 3회 로딩하고, 분석 플레이트를 JESS 장치에 넣었다. 단백질 정규화 키트 및 Compass Software(Proteinsimple)에 대한 분석을 사용하여, 모세관 웰에 포함된 총 단백질의 피크 면적에 대해 단백질의 신호 강도(피크 면적)을 정규화하였다. Compass Software(ProteinSimple)를 사용하여 GAA 단백질 밴드의 정량적 분석을 수행하였다. 도 9 및 도 10은 선택된 PPMO 화합물을 사용한 치료 후 환자 iPSC 유래 근관에서의 GAA 단백질의 증가를 나타낸다.
PPMO는 LOPD 환자 iPSC 유래 근관에서 GAA 단백질을 증가시킴. 환자 iPSC-유래 근육아세포를 24-웰 콜라겐-코팅 플레이트(Thermo Fisher)에 80,000 세포/웰로 Expansion Media(EM, iXCells Biotechnologies)에 도말하였다. EM에서 48시간 성장시킨 후, 세포를 PBS 중에서 세척하고 배지를 Differentiation Media(DM, iXCells Biotechnologies)로 변경하였다. 세포를 DM 중에서 48시간 동안 인큐베이션한 다음, PPMO-보충 DM으로 치료하고, 배지 변경 없이 4일 동안 인큐베이션하였다. GAA 활성 검정 용해물을 위해, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 얼음-냉각 GAA Activity Assay Buffer(Abcam) 중에 용해시켰다. 도 11은 선택된 PPMO 화합물을 사용한 치료 후 환자 iPSC 유래 근관에서의 GAA 효소 활성의 투여량 의존적 증가를 나타낸다.
실시예 8 - 비염기성 치환은 PPMO 응집을 감소시킴
제조사의 표준 프로토콜을 사용하여, Zetasizer Nano(Malvern)를 사용하는 동적 광 산란으로 PBS(Gibco) 중의 일정한 농도 용액 중 PPMO 샘플의 응집을 측정하였다. 도 12는 비염기성 치환이 PPMO 응집을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 유리 PPMO의 비율은 동적 광 산란(DLS)으로 측정 시 비염기성 치환과 함께 증가한다.
요약하면, 본원에 제공된 PPMO 화합물은 LOPD 환자 유래 근관에서 GAA 스플라이싱을 일관되게 보정하고 GAA 단백질 및 효소 활성 수준을 증가시켰다. 인간 IVS1-GAA의 표적 결합은 LOPD의 마우스 모델에서 확인되었다. 놀랍게도, 비염기성 서브유닛의 치환은 부모 서열만큼 활성인 GAA 효소를 복원하는 데 있어서 거의 효과적이다(예를 들어, PPMO 7 대 PPMO 33). 흥미롭게도, DLS 데이터는 비염기성 서브유닛의 포함에 의한 이들 서열에서의 응집 또는 이차 구조 형성의 일부 변경을 나타낸다.

Claims (55)

  1. 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 세포 투과성 펩티드를 포함하는 접합체로서:
    상기 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18-40개 서브유닛 길이이고, 인간 산 알파-글루코시다아제(GAA) 유전자의 pre-mRNA의 인트론 1(서열번호 1) 내의 표적 영역에 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 여기에서
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고머를 포함하고;
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상기 세포 투과성 펩티드에 공유 결합되고;
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 서브유닛은 핵염기를 포함하거나 비염기 서브유닛이며, 여기에서 상기 각각의 서브유닛은 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단까지 순서대로 함께 취해져 표적화 서열을 형성하고;
    상기 적어도 하나의 서브유닛은 비염기성 서브유닛이고;
    상기 표적화 서열은, 상기 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 상기 표적 영역에 대해 적어도 80% 상보적인, 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 표적 영역은 서열번호 2(GAA-IVS1(-189-167)) 및 서열번호 3(GAA-IVS1(-80-24))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 표적 영역은 서열번호 2로서 제시되는 서열을 포함하는, 접합체.
  4. 제2항에 있어서, 표적 영역은 서열번호 3으로서 제시되는 서열을 포함하는, 접합체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-189-167), GAA-IVS1(-80-56), GAA-IVS1(-76-52), GAA-IVS1(-74-55), GAA-IVS1(-72-48), GAA-IVS1(-71-47), GAA-IVS1(-70-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-66-42), GAA-IVS1(-65-41), 및 GAA-IVS1(-49-24)로부터 선택되는, 접합체.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-189-167)인, 접합체.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서, 표적화 서열은 서열 CCA GAA GGA AXX XCG AGA AAA GC(서열번호 4)를 포함하고, 여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이며, 여기에서 적어도 하나의 X는 B인, 접합체.
  8. 제1항 또는 제7항에 있어서, 표적화 서열은:
    i) 서열번호: 5(CCA GAA GGA AGG BCG AGA AAA GC);
    ii) 서열번호 6(CCA GAA GGA AGB GCG AGA AAA GC);
    iii) 서열번호 7(CCA GAA GGA ABG GCG AGA AAA GC);
    iv) 서열번호 8(CCA GAA GGA AGB BCG AGA AAA GC);
    v) 서열번호 9(CCA GAA GGA ABB GCG AGA AAA GC); and
    vi) 서열번호 10(CCA GAA GGA ABG BCG AGA AAA GC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 접합체.
  9. (내용 없음)
  10. 제1항 또는 제5항에 있어서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-80-56), GAA-IVS1(-76-52), GAA-IVS1(-74-55), GAA-IVS1(-72-48), GAA-IVS1(-71-47), GAA-IVS1(-70-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-66-42), GAA-IVS1(-65-41), 및 GAA-IVS1(-49-24)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  11. 제1항 또는 제10항에 있어서, 표적 영역은 GAA-IVS1(-72-48), GAA-IVS1(-71-47), GAA-IVS1(-70-46), GAA-IVS1(-69-45), GAA-IVS1(-66-42), 및 GAA-IVS1(-65-41)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  12. 제1항 또는 제11항에 있어서, 표적화 서열은:
    i) 서열번호: 11(CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG CTC T);
    ii) 서열번호 12(ACT CAC XXX XCT CTC AAA GCA GCT C);
    iii) 서열번호 13(CAC TCA CXX XXC TCT CAA AGC AGC T);
    iv) 서열번호 14(GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG C);
    v) 서열번호 15(GCG GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG C);
    vi) 서열번호: 16(GGC GGC ACT CAC XXX XCT CTC AAA G)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고;
    여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B인, 접합체.
  13. 제1항 또는 제12항에 있어서, 표적화 서열은:
    i) 서열번호: 17(GCA CTC ACB GGG CTC TCA AAG CAG C);
    ii) 서열번호 18(GCA CTC ACG BGG CTC TCA AAG CAG C);
    iii) 서열번호 19(GCA CTC ACG GBG CTC TCA AAG CAG C);
    iv) 서열번호 20(GCA CTC ACG GGB CTC TCA AAG CAG C);
    v) 서열번호 21(GCA CTC ACB BGG CTC TCA AAG CAG C);
    vi) 서열번호: 22(GCA CTC ACG BBG CTC TCA AAG CAG C);
    vii) 서열번호: 23(GCA CTC ACG GBB CTC TCA AAG CAG C); and
    viii) 서열번호: 24(GGC GGC ACT CAC GBB GCT CTC AAA G)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 84%, 적어도 88%, 또는 적어도 92% 상보적인, 접합체.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 90% 상보적인, 접합체.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 적어도 95% 상보적인, 접합체.
  17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열은, 비염기성 서브유닛 또는 서브유닛들을 제외하고, 표적 영역에 대해 100% 상보적인, 접합체.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 비염기성 서브유닛은 표적화 서열의 5' 또는 3' 말단으로부터의 적어도 8개의 서브유닛인, 접합체.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1 내지 5개의 비염기성 서브유닛을 포함하는, 접합체.
  20. 제1항 내지 제4항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1, 2, 3, 또는 4개의 비염기성 서브유닛을 포함하는, 접합체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체는 화학식 IV의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이며:

    식 중:
    A'은 -N(H)CH2C(O)NH2, -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2, , 및 로부터 선택되고, 식 중
    R5는 -C(O)(O-알킬)x-OH이고, 식 중 x는 3-10이고, 각각의 알킬기는, 각각의 경우 독립적으로, C2-6-알킬이거나,
    R5는 H, -C(O)C1-6-알킬, 트리틸, 모노메톡시트리틸, -(C1-6-알킬)-R6, -(C1-6-헤테로알킬)-R6, 아릴-R6, 헤테로아릴-R6, -C(O)O-(C1-6-알킬)-R6, -C(O)O-아릴-R6, -C(O)O-헤테로아릴-R6, 및 로부터 선택되고;
    R6은 OH, SH, 및 NH2로부터 선택되거나, R6은 O, S, 또는 NH이고, 이들 각각은 고형 지지체에 공유 결합되고;
    각각의 R1은 OH 및 -N(R3)(R4)로부터 독립적으로 선택되고, 식 중 R3 및 R4는, 각각의 경우 독립적으로, H 또는 -C1-6-알킬이고;
    각각의 R2는, 각각의 경우 독립적으로, H(비염기성), 핵염기, 및 화학적 보호기로 관능화된 핵염기로부터 선택되되, 핵염기는, 각각의 경우 독립적으로, 피리딘, 피리미딘, 퓨린, 및 데아자-퓨린으로부터 선택되는 C3-6-헤테로시클릭 고리를 포함하고;
    t는 8-40이고;
    E'은 H, -C1-6-알킬, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸, 및 로부터 선택되고;
    식 중
    Q는 -C(O)(CH2)6C(O)- 또는 -C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-이고;
    R7은 -(CH2)2OC(O)N(R8)2이고, 식 중 R8은 -(CH2)6NHC(=NH)NH2이고;
    L은 글리신, 프롤린, W, W-W, 또는 R9로부터 선택되되, L은 아미드 결합에 의해 J의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합되고;
    W는 -C(O)-(CH2)m-NH-이고, 식 중 m은 2 내지 12이고;
    R9는:
    , , 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
    p는 2, 3, 4, 또는 5이고;
    R10은 결합, 글리신, 프롤린, W, 또는 W-W로부터 선택되고;
    R11은 글리신, 프롤린, W, W-W, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R16은 결합, 글리신, 프롤린, W, 또는 W-W로부터 선택되되; R16은 아미드 결합에 의해 J의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합되고; J는 세포 투과성 펩티드이며;
    G는 H, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되고, 여기에서, G는 J에 공유 결합되되;
    단,
    A'은 이고, E'은 인, 접합체.
  22. 제21항에 있어서, E'은 H, -C1-6-알킬, -C(O)C1-6-알킬, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 트리메톡시트리틸, 및 로부터 선택되는, 접합체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, A'은 -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2, , , 및 로부터 선택되는, 접합체.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, E'은 H, -C(O)CH3, 벤조일, 스테아로일, 트리틸, 4-메톡시트리틸, 및 로부터 선택되는, 접합체.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, A'은 -N(C1-6-알킬)CH2C(O)NH2, , 및 로부터 선택되고;
    E'은 인, 접합체.
  26. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, A'은
    이고,
    E'은 H, -C(O)CH3, 트리틸, 4-메톡시트리틸, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되는, 접합체.
  27. 제21항에 있어서, 화학식 IV의 펩티드-올리고뉴클레오티드 접합체는:

    로부터 선택되는 펩티드-올리고뉴클레오티드 접합체이되,
    식 중 E'은 H, C1-6-알킬, -C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되는, 접합체.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체는 화학식 (IVa)의 접합체인, 접합체.
  29. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체는 화학식 (IVb)의 접합체인, 접합체.
  30. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1은 -N(CH3)2인, 접합체.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 핵염기는, 각각의 경우 독립적으로, 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸-시토신, 티민, 우라실, 및 하이포크산틴으로부터 선택되는, 접합체.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열은 다음의 서열:
    i) 서열번호: 4(CCA GAA GGA AXX XCG AGA AAA GC);
    ii) 서열번호 11(CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG CTC T);
    iii) 서열번호 12(ACT CAC XXX XCT CTC AAA GCA GCT C);
    iv) 서열번호 13(CAC TCA CXX XXC TCT CAA AGC AGC T);
    v) 서열번호 14(GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG CAG C);
    vi) 서열번호: 15(GCG GCA CTC ACX XXX CTC TCA AAG C);
    vii) 서열번호: 16(GGC GGC ACT CAC XXX XCT CTC AAA G)을 포함하되;
    여기에서 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B인, 접합체.
  33. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열은:
    i) 서열번호: 5 (CCA GAA GGA AGG BCG AGA AAA GC );
    ii) 서열번호 6(CCA GAA GGA AGB GCG AGA AAA GC);
    iii) 서열번호 7(CCA GAA GGA ABG GCG AGA AAA GC);
    iv) 서열번호 8(CCA GAA GGA AGB BCG AGA AAA GC);
    v) 서열번호 9(CCA GAA GGA ABB GCG AGA AAA GC);
    vi) 서열번호 10(CCA GAA GGA ABG BCG AGA AAA GC);
    vii) 서열번호 17(GCA CTC ACB GGG CTC TCA AAG CAG C);
    viii) 서열번호 18(GCA CTC ACG BGG CTC TCA AAG CAG C);
    ix) 서열번호 19(GCA CTC ACG GBG CTC TCA AAG CAG C);
    x) 서열번호 20(GCA CTC ACG GGB CTC TCA AAG CAG C);
    xi) 서열번호 21(GCA CTC ACB BGG CTC TCA AAG CAG C);
    xii) 서열번호 22(GCA CTC ACG BBG CTC TCA AAG CAG C);
    xiii) 서열번호 23(GCA CTC ACG GBB CTC TCA AAG CAG C); and
    xiv) 서열번호 24(GGC GGC ACT CAC GBB GCT CTC AAA G)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 접합체.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, L은 글리신인, 접합체.
  35. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, L은 프롤린인, 접합체.
  36. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, L은 -C(O)-(CH2)5-NH-인, 접합체.
  37. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, L은 -C(O)-(CH2)2-NH-인, 접합체.
  38. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, L은 -C(O)-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)5-NH-인, 접합체.
  39. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, L은 이고; R10은 결합이고; R11은 글리신 및 로부터 선택되는, 접합체.
  40. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, L은 이고; R10은 결합이고; R11은 글리신 및 로부터 선택되는, 접합체.
  41. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, L은 이고; R10은 결합이고; R11은 글리신 및 로부터 선택되는, 접합체.
  42. 제21항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, J는 rTAT, TAT, R9F2, R5F2R4, R4, R5, R6, R7, R8, R9, (RXR)4, (RXR)5, (RXRRBR)2, (RAR)4F2, (RGR)4F2로부터 선택되는, 접합체.
  43. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, G는 H, C(O)CH3, 벤조일, 및 스테아로일로부터 선택되는, 접합체.
  44. 제21항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, G는 H 또는 -C(O)CH3인, 접합체.
  45. 제21항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, G는 H인, 접합체.
  46. 제21항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, G는 -C(O)CH3인, 접합체.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  48. 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 접합체, 또는 제47항의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 질환은 폼페병인, 방법.
  50. 제48항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 인간은 아동인, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 인간은 성인인, 방법.
  53. 안티센스 올리고머 화합물로서:

    및

    로부터 선택되고,
    식 중 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B인, 안티센스 올리고머 화합물.
  54. 제53항에 있어서, 안티센스 올리고머 화합물은 하기 식과 같고:
    ,
    식 중 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B인, 안티센스 올리고머 화합물.
  55. 제53항에 있어서, 안티센스 올리고머 화합물은 하기 식과 같고:
    ,
    식 중 각각의 X는 독립적으로 구아닌(G)으로부터 선택되거나, 비염기성(B)이고, 여기에서 적어도 하나의 X는 B이고;
    일 구현예에서, B는 H인, 안티센스 올리고머 화합물.
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