JP2023538630A - Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置するためのａ１ｃｆ阻害剤の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＨＢＶ感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の処置に使用するためのＡ１ＣＦ阻害剤に関する。本発明は、特に、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡなどのｃｃｃＤＮＡを不安定化するためのＡ１ＣＦ阻害剤の使用に関する。本発明はまた、Ａ１ＣＦに対して相補的であり、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡのレベルを低下させることができる核酸分子に関する。本発明はまた、ＨＢＶ感染症の処置における医薬組成物、及びその使用も含む。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の処置に使用するためのＡ１ＣＦ阻害剤に関する。本発明は、特に、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡなどのｃｃｃＤＮＡを不安定化するためのＡ１ＣＦ阻害剤の使用に関する。本発明はまた、Ａ１ＣＦに対して相補的であり、Ａ１ＣＦの発現を減少させることができる、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドなどの核酸分子に関する。本発明はまた、ＨＢＶ感染症の処置における医薬組成物、及びその使用も含む。

背景
Ｂ型肝炎は、逆転写を介して複製する小型肝臓指向性ウイルスであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に起因する感染性疾患である。慢性ＨＢＶ感染症は、肝硬変及び肝細胞癌腫のような重篤な肝疾患に対する重要な因子である。慢性ＨＢＶ感染症に対する現在の処置は、多機能逆転写酵素であるウイルスポリメラーゼを標的とする、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テノホビル・ジソプロキシル、及びテノホビル・アラフェナミドなどのペグ化１型インターフェロン又はヌクレオシ（チ）ド類似体の投与に基づいている。処置の成功は、通常、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の消失として測定される。しかしながら、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡは感染後も体内に残存するため、完全なＨＢｓＡｇクリアランスが達成されることは稀である。ＨＢＶの持続は、核内で安定に維持されているＨＢＶゲノムのエピソーム型によって媒介される。このエピソーム型は「共有結合閉環状（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡ」（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる。ｃｃｃＤＮＡは、ウイルス複製中間体であるプレゲノム（ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）を含む、全てのＨＢＶ転写物の鋳型として役立つ。ｃｃｃＤＮＡのいくつかのコピーの存在は、末期のＨＢＶ感染症を再開するのに充分であろう。ＨＢＶに対する現在の処置はｃｃｃＤＮＡを標的としない。しかしながら、慢性ＨＢＶ感染症の治癒には、ｃｃｃＤＮＡの排除が必要であろう（Ｎａｓｓａｌ，Ｇｕｔ．２０１５ Ｄｅｃ；６４（１２）：１９７２－８４．ｄｏｉ：１０．１１３６／ｇｕｔｊｎｌ－２０１５－３０９８０９による概説）。

Ａ１ＣＦ（ＡＰＯＢＥＣ１相補因子（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ））は、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡの停止のために、Ｇｌｎに対するＣＡＡコドンからＵＡＡコドンへの転写後編集を担うアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素複合体の成分である。アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡへの終止コドンの導入は、消化管における脂質代謝を変化させる。編集酵素複合体は、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ－１（アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素１）及びＡ１ＣＦ遺伝子によってコードされる相補因子で構成される最小コアを含む。Ａ１ＣＦタンパク質は、３つの同一でないＲＮＡ認識モチーフを有し、ＲＮＡ結合タンパク質のｈｎＲＮＰ Ｒファミリーに属する。これはアポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡに結合し、おそらく触媒サブユニットＡＰＯＢＥＣ１をｍＲＮＡにドッキングして、その標的シトシンを脱アミノ化することを可能にする役割を果たす（Ｃｈｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２００３ Ａｕｇ １；２２（１５）：３９７１－８２）。

アポリポプロテインＢ ｍＲＮＡ編集酵素複合体に関する多くの報告は、ＡＰＯＢＥＣ１相補因子ではなく、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１に焦点を当てている。ＡＰＯＢＥＣ１はアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡを編集するだけでなく、ＨＢＶを含むウイルスゲノムも編集することが示されている。

ＨＢＶ複製のマウスモデルでは、Ｒｅｎａｒｄらは、マウスＡＰＯＢＥＣ１がインビボでＨＢＶを編集することを示した（Ｒｅｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｊｕｌ １６；４００（３）：３２３－３４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１０．０５．０２９）。対照的に、ラットＡＰＯＢＥＣ１はＨＢＶ ＤＮＡ産生を阻害しなかった（Ｒｏｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００５ Ａｕｇ；４２（２）：３０１－９）。

Ｇｏｎｚａｌｅｚらは、ヒトＡＰＯＢＥＣ１がＨＢＶ ＤＮＡを編集することを示した。ＨＢＶ及びヒトＡＰＯＢＥＣ１を同時トランスフェクトした細胞では、ＨＢＶゲノムにいくつかのＧからＡへの超変異が同定された。さらに、ヒトＡＰＯＢＥＣ１の存在は、ＨＢＶ ＤＮＡの複製に影響を与えた。具体的には、ＡＰＯＢＥＣ１の発現が増加すると、ＨＢＶ ＤＮＡ量が減少することが示された（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００９ Ｏｃｔ ２１；６：９６．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４２－４６９０－６－９６）。

我々の知る限りでは、Ａ１ＣＦは、ｃｃｃＤＮＡの安定性及び維持に関してｃｃｃＤＮＡ依存性因子として同定されたことはなく、Ａ１ＣＦを阻害する分子がＨＢＶ感染症の処置のためのｃｃｃＤＮＡ不安定化剤として示唆されたこともない。

さらに、我々の知る限りでは、Ａ１ＣＦ発現の調節に潜在的に関連するオリゴヌクレオチドの唯一の開示は、国際公開第２０１６／１４２９４８号に示唆されている。しかしながら、国際公開第２０１６／１４２９４８号は、選択的スプライスバリアントを作製するための、Ａ１ＣＦを含む列挙された多数の標的のスプライシングの変更に関する。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、スプライシング因子結合部位をコードするデコイオリゴヌクレオチドであり、したがって標的自体には結合しない。国際公開第２０１６／１４２９４８号はまた、癌、炎症、免疫学的障害、神経変性、アルツハイマー病、パーキンソン病、ウイルス感染症（ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＢＶ）を含む処置のリストに言及している。しかしながら、Ａ１ＣＦを標的とするオリゴヌクレオチドの具体的な例もＨＢＶにおけるそれらの使用もない。

本発明の目的
本発明は、Ａ１ＣＦの阻害とＨＢＶ感染細胞中のｃｃｃＤＮＡの量の減少との間に関連があり、これがＨＢＶ感染個体の処置に関連することを示す。本発明の目的は、ＨＢＶ感染細胞中のｃｃｃＤＮＡの量を減少させるＡ１ＣＦ阻害剤を同定することである。このようなＡ１ＣＦ阻害剤はＨＢＶ感染症の処置に用いることができる。

本発明は、インビトロ及びインビボでＡ１ＣＦの発現を阻害することができる、新規の核酸分子を更に同定する。

本発明は、Ａ１ＣＦの発現を調節し、Ａ１ＣＦの機能に関連する疾患を処置又は予防することができる核酸を標的とするオリゴヌクレオチドに関する。

したがって、第１の態様では、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の処置及び／又は予防用のＡ１ＣＦ阻害剤を提供する。特に、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ及び／又はＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の量を減少させることができる Ａ１ＣＦ阻害剤が有用である。そのような阻害剤は、有利には、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡを減少させることができる、１２～６０ヌクレオチド長の核酸分子である。

さらなる態様では、本発明は、哺乳動物Ａ１ＣＦ、例えば、ヒトＡ１ＣＦ、マウスＡ１ＣＦ又はカニクイザルＡ１ＣＦに対して少なくとも９０％相補的な、例えば、完全に相補的な、少なくとも１０ヌクレオチド、特に１６～２０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む１２～６０ヌクレオチド、例えば１２～３０ヌクレオチドの核酸分子に関する。そのような核酸分子は、Ａ１ＣＦを発現する細胞におけるＡ１ＣＦの発現を阻害することができる。Ａ１ＣＦの阻害は、細胞中に存在するｃｃｃＤＮＡの量の減少を可能にする。核酸分子は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子又はｓｈＲＮＡ核酸分子（特に化学的に生成されたｓｈＲＮＡ分子）から選択することができる。

本発明のさらなる態様は、Ａ１ＣＦの発現及び／又は活性を阻害する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡに関する。特に、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡを減少させる１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシド及び１つ又は複数のホスホロチオエート結合を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド又は修飾ｓｉＲＮＡが有利である。

さらなる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡなどの本発明のＡ１ＣＦ阻害剤と、薬学的に許容され得る添加物とを含む医薬組成物を提供する。

更なる態様では、本発明は、本発明のＡ１ＣＦ阻害剤、例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は組成物を有効量で細胞に投与することによって、Ａ１ＣＦを発現している標的細胞におけるＡ１ＣＦ発現のインビボ又はインビトロ調節を提供する。いくつかの実施形態では、Ａ１ＣＦ発現は、標的細胞において、一切無処理又は対照で処理されたレベルと比較して少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％減少する。いくつかの実施形態では、標的細胞はＨＢＶに感染し、ＨＢＶ感染細胞のｃｃｃＤＮＡは、ＨＢＶ感染標的細胞において、一切無処理又は対照で処理されたレベルと比較して少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％減少する。いくつかの実施形態では、標的細胞はＨＢＶに感染し、ＨＢＶ感染細胞のｐｇＲＮＡは、ＨＢＶ感染標的細胞において、一切無処理又は対照で処理されたレベルと比較して少なくとも５０％、又は少なくとも６０％減少する。

更なる態様では、本発明は、Ａ１ＣＦのインビボ活性に関連する疾患、障害、又は機能障害を処置又は予防するための方法であって、該疾患、障害、又は機能障害に罹患する又は罹り易い対象に、治療的又は予防的に有効量の、本発明のＡ１ＣＦ阻害剤、例えば本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを投与することを含む、方法を提供する。

本発明の更なる態様は、本発明の核酸分子のコンジュゲート及び本発明の分子を含む医薬組成物である。特に、ＧａｌＮＡｃクラスターのように、肝臓を標的とするコンジュゲートである。

図１Ａ－Ｌ：例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートを図示する。オリゴヌクレオチドは「オリゴヌクレオチド」という用語によって表され、アシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分は三価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である。図１Ａ－Ｄの化合物は、ジリジンブランチャー（ｂｒａｎｃｈｅｒ）分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図１Ａ（図１Ａ－１及び図１Ａ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図１Ｂ（図１Ｂ－１及び図１Ｂ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはリンカーなしでアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に直接結合している。図１Ｃ（図１Ｃ－１及び図１Ｃ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）及び図１Ｄ（図１Ｄ－１及び図１Ｄ－２は、同じ化合物の２つの異なるジアステレオ異性体を示す）の化合物では、オリゴヌクレオチドはＣ６リンカーを介してアシアロ糖タンパク質受容体標的化コンジュゲート部分に結合している。図１Ｅ－Ｋの化合物は、種々の長さ及び構造の市販のトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）ブランチャー分子及びスペーサー、並びに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。図１Ｌの化合物は、合成の一部として依然として固体支持体上にある間にオリゴヌクレオチドに添加された単量体ＧａｌＮＡｃホスホラミダイトから構成され、Ｘ＝Ｓ又はＯであり、独立してＹ＝Ｓ又はＯであり、ｎ＝１～３である（国際公開第２０１７／１７８６５６号参照）。図１Ｂと図１Ｄは、本明細書ではＧａｌＮＡｃ２又はＧＮ２とも呼ばれ、それぞれ、Ｃ６リンカーを有さないものと、有するものである。 図１Ａ－Ｌ：例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートを図示する。 図１Ａ－Ｌ：例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートを図示する。 図１Ａ－Ｌ：例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートを図示する。 図１Ａ－Ｌ：例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートを図示する。 図１Ａ－Ｌ：例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートを図示する。 図１Ａ－Ｌ：例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートを図示する。 図１Ａ－Ｌ：例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲートを図示する。

図１Ａ－Ｄのそれぞれに示される２つの異なるジアステレオ異性体は、コンジュゲート反応の結果である。したがって、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートのプールは、２つの異なるジアステレオ異性体のうちの１つのみを含有することができ、又は特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートのプールは、２つの異なるジアステレオ異性体の混合物を含有することができる。

定義
ＨＢＶ感染症
用語「Ｂ型肝炎ウイルス感染症」又は「ＨＢＶ感染症」とは、当該技術分野では一般的に知られており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ、かつ肝臓に影響を及ぼす感染性疾患を指す。ＨＢＶ感染症は急性感染症又は慢性感染症であり得る。慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：ＣＨＢ）感染症は、世界中で２億４８００万人に影響する世界的な疾病負荷である。年間およそ６８６，０００人の死亡は、ＨＢＶ関連末期肝疾患及び肝細胞癌腫（ＨＣＣ）に起因する（ＧＢＤ ２０１３；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０１５ Ｏｃｔ １７；３８６（１０００３）：１５４６－５５）。ＷＨＯは、更なる介入がなければ、ＣＨＢ感染者の数は今後４０～５０年間にわたり現在の高い水準を維持し、累積２０００万人が２０１５～２０３０年の間に死亡すると予測した（ＷＨＯ、２０１６年）。ＣＨＢ感染症は特異な臨床症状を呈する同種疾患ではない。感染した個体は、生涯でＣＨＢ関連肝疾患のいくつかの段階を経て進行している。これらの病期もまた標準治療（ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ｃａｒｅ：ＳＯＣ）による処置の基礎となる。現在のガイドラインでは、血清ＡＬＴレベル、ＨＢＶ ＤＮＡレベル、及び肝疾患の重症度の３つの基準に基づいて、ＣＨＢに感染した特定の個人のみを処置することを推奨している（ＥＡＳＬ、２０１７年）。この推奨は、ＳＯＣ、すなわちヌクレオシ（チ）ド類似体（ＮＡ）及びペグ化インターフェロン－α（ＰＥＧ－ＩＦＮ）が治癒的ではなく、かつ長期間投与しなければならず、それによって安全性リスクが増加するという事実による。ＮＡはＨＢＶ ＤＮＡ複製を効果的に抑制する。しかしながら、他のウイルスマーカには非常に限られた影響しか及ぼさない／一切影響を及ぼさない。ＨＢＶ感染症の２つの特徴である、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）は、ＨＢＶ治癒を目的とする新薬の主な標的である。ＣＨＢ患者の血漿中において、ＨＢｓＡｇサブウイルス（中空）粒子は、ＨＢＶビリオンを数で１０３～１０５倍上回る（Ｇａｎｅｍ＆Ｐｒｉｎｃｅ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００４ Ｍａｒ １１；３５０（１１）：１１１８－２９）。その過剰は、急性ＨＢＶ感染症の消散後に観察された血清学的マーカーである中和抗ＨＢｓ抗体を発現できない個体を含む、該疾患の免疫病理発生に寄与すると考えられている。

いくつかの実施形態では、「ＨＢＶ感染症」という用語は、「慢性ＨＢＶ感染症」を指す。

さらに、この用語は、任意のＨＢＶ遺伝子型による感染症を包含する。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ａに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｅに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｆに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｇに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｈに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｉに感染している。

いくつかの実施形態では、処置される患者は、ＨＢＶ遺伝子型Ｊに感染している。

ｃｃｃＤＮＡ（共有結合的に閉じた環状ＤＮＡ）
ｃｃｃＤＮＡは感染した肝細胞の核に存在するＨＢＶのウイルス遺伝的鋳型であり、増殖性感染に必要な全てのＨＢＶ ＲＮＡ転写物を生じ、慢性ＨＢＶ感染症の自然経過中のウイルス持続に関与する（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ＆Ｚｏｕｌｉｍ，Ａｎｔｉｖｉｒ Ｔｈｅｒ．２０１０；１５ Ｓｕｐｐｌ ３：３－１４．ｄｏｉ：１０．３８５１／ＩＭＰ１６１９）。ｃｃｃＤＮＡはウイルスのリザーバとして作用し、処置中止後のウイルスリバウンド源であって、長期の、時として、生涯の処置を必要とする。ＰＥＧ－ＩＦＮは、その種々の副作用に起因して、ＣＨＢの小サブセットにしか投与できない。

したがって、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの分解又は除去により定義される完全治癒をＣＨＢ患者の大部分にもたらすことができる新規の治療法が、強く必要とされている。

化合物
本明細書では、用語「化合物」とは、Ａ１ＣＦの発現又は活性を阻害することができる任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、本発明に係るＲＮＡｉ分子若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子、又はそのような核酸分子を含む任意のコンジュゲートである。例えば、本明細書において、化合物は、Ａ１ＣＦを標的とする核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡであり得る。

オリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも称され得る。

明細書及び特許請求の範囲に記載されているオリゴヌクレオチドは、概して、７０ヌクレオチド長未満の治療用オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、若しくはそれを含み得、又は例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー若しくはリボザイムなどの他の核酸分子であり得る。治療的オリゴヌクレオチド分子は、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって、研究室内で作製される。しかしながら、ｓｈＲＮＡは、多くの場合、レンチウイルスベクタを用いて細胞に送達され、次いで転写されて一本鎖ＲＮＡを生成し、これにより、ＲＮＡ干渉機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を含む）と相互作用することができるステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造を形成するであろう。本発明の一実施形態では、ｓｈＲＮＡは、化学的に生成されたｓｈＲＮＡ分子である（プラスミド又はウイルスからの細胞ベースの発現に依存しない）。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列又は順序、若しくはその修飾が言及される。概して、本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは標的細胞への侵入時にベクタから転写されるｓｈＲＮＡである。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～７０ヌクレオチド長、例えば１２～６０、例えば１３～５０、例えば１４～４０、例えば１５～３０、例えば１６～２５、例えば１６～２２、例えば１６～２０連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、１２～２５ヌクレオチドの長さを有し得る。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、１５～２２ヌクレオチドの長さを有し得る。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２４以下のヌクレオチド、例えば２２、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６、又は１７ヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、核酸分子が１２～２５ヌクレオチドを含むと記される場合、１２ヌクレオチド及び２５ヌクレオチドの両方が含まれる。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（複数可）は、哺乳動物における標的核酸の発現の調節用である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸分子は、典型的には、標的核酸（複数可）の発現を阻害するためのものである。

本発明の一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ剤、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択される。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈと相互作用する高親和性修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非ヌクレオシド部分（コンジュゲート部分）に結合され得る。

オリゴヌクレオチドのライブラリは、バリアントオリゴヌクレオチドのコレクションとして理解されるべきである。オリゴヌクレオチドのライブラリの目的は様々であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのライブラリは、オリゴヌクレオチドのライブラリ内で最も強力な配列を同定する目的で、１つ又は複数の哺乳動物Ａ１ＣＦ標的核酸を標的とする重複する核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから構成される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのライブラリは、親又は先祖オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド設計バリアント（子核酸分子）のライブラリであって、オリゴヌクレオチド設計バリアントは、親核酸分子のコア核酸塩基配列を保持する。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で用いられる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、自己内又は自己間の相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長にわたって５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができるものと理解される。

有利には、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を低下させるためＲＮＡヌクレオシドを含まない。

有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ又は複数の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。さらに、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることは有利である。

ＲＮＡｉ分子
本明細書では、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」という用語は、ＲＮＡヌクレオシドを含有し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を媒介する短い二本鎖オリゴヌクレオチドを指し、触媒的ＲＩＳＣ成分のアルゴナウトと相互作用する。ＲＮＡｉ分子は、細胞、例えば哺乳動物対象などの対象内の細胞における標的核酸の発現を調節、例えば阻害する。ＲＮＡｉ分子には、一本鎖ＲＮＡｉ分子（Ｌｉｍａ ａｔ ａｌ ２０１２ Ｃｅｌｌ １５０：８８３）及び二本鎖ｓｉＲＮＡ、並びに短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤である。

ｓｉＲＮＡ
「低分子干渉リボ核酸」又は「ｓｉＲＮＡ」という用語は、低分子干渉リボ核酸ＲＮＡｉ分子を指す。それは、二本鎖ＲＮＡ分子の一種であり、当該技術分野においては、短鎖干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られている。ｓｉＲＮＡは典型的には、（パッセンジャー鎖とも呼ばれる）センス鎖、及び（ガイド鎖とも呼ばれる）アンチセンス鎖を含み、各鎖は１７～３０ヌクレオチド長、典型的には１９～２５ヌクレオシド長であり、アンチセンス鎖は、標的核酸（好適には成熟ｍＲＮＡ配列）に対して相補的、例えば少なくとも９５％相補的であり、例えば完全に相補的であり、センス鎖はアンチセンス鎖に相補的であるために、センス鎖とアンチセンス鎖はデュプレックス又はデュプレックス領域を形成する。ｓｉＲＮＡ鎖は、平滑末端二重鎖を形成し得るか、又は有利には、センス鎖及びアンチセンス鎖３’末端は、例えば、１、２、又は３ヌクレオシドの３’オーバーハングを形成することがあり、これは、インビボでＲＩＳＣ基質を形成するＤｉｃｅｒによって生成される生成物に類似する。Ｄｉｃｅｒ基質の有効な拡張形態は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３４９，８０９号及び米国特許第８，５１３，２０７号に記載されている。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２ｎｔ ３’オーバーハングを有する。したがって、二重鎖領域は、例えば１７～２５ヌクレオチド長、例えば２１～２３ヌクレオチド長であり得る。

一旦細胞内に入ると、アンチセンス鎖は、標的核酸の標的分解又は標的阻害を媒介するＲＩＳＣ複合体に組み込まれる。ｓｉＲＮＡは、典型的には、ＲＮＡヌクレオシドに加えて修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子はまた、修飾ヌクレオチド間結合及び２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’－４’二環式リボース修飾ヌクレオシド（ＬＮＡ及びｃＥＴ又は２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡのような２’置換修飾を含む）を用いて化学的に修飾されてもよい。特に、２’フルオロ、２’－Ｏ－メチル、又は２’－Ｏ－メトキシエチルをｓｉＲＮＡに組み込むことができる。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡセンス（パッセンジャー）鎖のヌクレオチドの全ては、ＬＮＡなどの２’糖修飾ヌクレオシドで修飾され得る（例えば、国際公開第２００４／０８３４３０号、同第２００７／０８５４８５号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖は不連続であり得る（例えば、国際公開第２００７／１０７１６２号を参照されたい）。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のシード領域で生じる熱不安定化ヌクレオチドの取込みは、ｓｉＲＮＡのオフターゲット活性の減少に有用であることが報告されている（例えば、国際公開第２０１８／０９８３２８号を参照されたい）。好適には、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に５’リン酸基又は５’リン酸模倣物を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端は、ＲＮＡヌクレオシドである。

一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートのヌクレオシド間結合を更に含む。ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｉｅ）若しくはメチルホスホネートのヌクレオシド間結合は一方若しくは両方の鎖の３’末端にあり得る（例えば、アンチセンス鎖又はセンス鎖）か、又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホネートのヌクレオシド間結合は一方若しくは両方の鎖の５’末端にあり得る（例えば、アンチセンス鎖又はセンス鎖）か、又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホネートのヌクレオシド間結合は一方又は両方の鎖の５’末端及び３’末端の両方にあり得る（例えば、アンチセンス鎖又はセンス鎖）。いくつかの実施形態では、残りのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、１つ又は複数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ｓｉＲＮＡ分子において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合はＲＩＣＳにおけるヌクレアーゼ切断を減少し得るため、したがって、アンチセンス鎖における全てのヌクレオシド間結合が修飾されはしないことが有利である。

ｓｉＲＮＡ分子は、リガンドを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。

生物学的分布については、ｓｉＲＮＡを標的リガンドにコンジュゲートされ得るか、及び／又は脂質ナノ粒子に製剤化され得る。

本発明の他の態様は、治療的使用に適したｓｉＲＮＡ分子といったこれらのｄｓＲＮＡを含む医薬組成物と、例えば本明細書に開示されている種々の疾患症状の処置のために、本発明のｓｉＲＮＡといったｄｓＲＮＡ分子を投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法と、に関する。

ｓｈＲＮＡ
「短ヘアピンＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」という用語は、一般に４０個～７０個の間のヌクレオチド長、例えば４５個～６５個の間のヌクレオチド長、例えば５０～６０ヌクレオチド長であり、ステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造を形成する分子を指し、これは、特徴的な２塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短干渉ＲＮＡにｄｓＲＮＡをプロセシングすると考えられるＤｉｃｅｒとして既知のエンドヌクレアーゼと相互作用し、次いでＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する。ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合及び２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’－４’二環式リボース修飾ヌクレオシド（ＬＮＡ及びｃＥＴ又は２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡのような２’置換修飾を含む）を用いて化学的に修飾されてもよい。

いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子は、１つ又は複数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ＲＮＡｉ分子において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ＲＩＣＳにおけるヌクレアーゼ切断を減少し得るため、したがってｓｈＲＮＡ分子のステムループにおける全てのヌクレオシド間結合が修飾されはしないことが有利である。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ｓｈＲＮＡ分子のステムループの３’及び／又は５’末端、特に標的核酸に対して相補的ではない分子の部分に配置されることが有利であり得る。標的核酸に対して相補的なｓｈＲＮＡ分子の領域は、しかしながら、Ｄｉｃｅｒによる切断後に３’末端及び／又は５’末端になると予測される部分における最初の２～３個のヌクレオシド間結合でもまた修飾され得る。

連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に対して相補的な核酸分子の領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に用いられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡ分子のガイド鎖に含まれる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に対して１００％相補的であるｓｈＲＮＡ分子の一部である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域のような連続ヌクレオチド配列を含み、任意に、更なるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基（例えば、標的化のためのコンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に対して相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、連続ヌクレオチド配列を構成である。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に対して１００％相補的である。

ヌクレオチド及びヌクレオシド
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ又は複数のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、互換的に「単位」又は「モノマー」と呼ぶことができる。

修飾ヌクレオシド
本明細書で用いられる「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ又は複数の修飾の導入によって、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、修飾ヌクレオシドの１つ又は複数は修飾糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、「ヌクレオシド類似体」又は修飾「ユニット」又は修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。

修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１又は複数のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合又は１又は複数のホスホロジチオエートのヌクレオシド間結合のような、１又は複数の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。

本発明のオリゴヌクレオチドでは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を用いることが有利である。

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造の容易さに起因して、特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てが、ホスホロチオアートである。

いくつかの有利な実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、又はオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。

ＥＰ ２ ７４２ １３５に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外の）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これはＥＰ ２ ７４２ １３５によれば、例えば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。

核酸塩基
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語はまた、天然に存在する核酸塩基とは異なっていてもよいが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能する修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しないバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。

いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｄ）に変えることにより修飾される。

核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵにより示されてもよく、各文字は、任意に等価機能の改変された核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。

修飾オリゴヌクレオチド
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ若しくは複数の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。

相補性
「相補性」又は「相補的」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。

用語「％相補的」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に対して相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５’－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。

同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

ハイブリダイゼーション
本明細書で用いられる「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔ_ｍ）によって説明されることが多い。生理学的条件では、Ｔ_ｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ及びＬａｃｒｏｉｘ（２００３年）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」第１３巻、第５１５～５３７頁）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋ_ｄ）によって反応の解離定数（Ｋ_ｄ）に関連付けられ、式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発反応であり、自発反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定し得る。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５ に記載の最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いて、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６ ａｎｄ ＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載される適切に得られる熱力学的パラメータを使用し、数値的に推定し得る。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて、－１０ｋｃａｌ未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０から－６０ｋｃａｌ、例えば－１２から－４０、例えば－１５から－３０ｋｃａｌ、又は－１６から－２７ｋｃａｌ、例えば－１８から－２５ｋｃａｌの範囲内の推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。

標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物Ａ１ＣＦをコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、Ａ１ＣＦ標的核酸と称することができる。

適切には、標的核酸は、Ａ１ＣＦタンパク質、特に、本明細書で配列番号１、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１として提供されるｐｒｅ－ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ配列をコードするヒトＡ１ＣＦ遺伝子などの哺乳動物Ａ１ＣＦをコードする。

本発明の治療用オリゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物Ａ１ＣＦのエクソン領域（特に、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡであるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドでもある）を標的とすることができるか、又は例えば、Ａ１ＣＦプレｍＲＮＡ（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の任意のイントロン領域を標的とすることができる。ヒトＡ１ＣＦ遺伝子は１０個の転写物をコードし、そのうちの８個はタンパク質コードであり、したがって潜在的な核酸標的である。

表１は、配列番号１、すなわちヒトＡ１ＣＦプレｍＲＮＡ配列の予測エクソン及びイントロン領域を列挙する。

適切には、標的核酸は、ヒト、カニクイザル及びマウスＡ１ＣＦ（表２）のゲノム配列並びにヒト、サル及びマウスＡ１ＣＦのプレｍＲＮＡ配列並びにヒトＡ１ＣＦの成熟ｍＲＮＡ（表３）の概要を提供するヒトＡ１ＣＦ（例えば表２及び表３を参照）などのＡ１ＣＦタンパク質、特に哺乳動物Ａ１ＣＦをコードする。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１、２、３、４、６、７、８、１０、及び１１、又はその天然に存在するバリアント（例えば、哺乳動物Ａ１ＣＦをコードする配列）からなる群から選択される。

本発明の核酸分子を研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。

インビボ又はインビトロ用途に関して、本発明の治療用核酸分子は、典型的には、Ａ１ＣＦ標的核酸を発現する細胞内で、Ａ１ＣＦ標的核酸の発現を阻害することが可能である。いくつかの実施形態では、上記細胞は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含む。本発明の核酸分子の核酸塩基の連続配列は、典型的には、核酸分子の長さにわたって測定して、任意に１つ又は２つのミスマッチを除いて、また任意にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチドを除いて、Ａ１ＣＦ標的核酸の保存された領域に対して相補的である。標的核酸は、哺乳動物Ａ１ＣＦタンパク質、例えばヒトＡ１ＣＦ、例えば配列番号１として開示されるものなどのヒトＡ１ＣＦプレｍＲＮＡ配列、配列番号２として開示されるものなどのサルＡ１ＣＦプレｍＲＮＡ配列、又は配列番号３として開示されるものなどのマウスＡ１ＣＦプレｍＲＮＡ配列をコードするプレｍＲＮＡ、又は配列番号４、６、７、８、１０、若しくは１１として開示されるヒト成熟ｍＲＮＡなどの成熟Ａ１ＣＦｍＲＮＡなどのメッセンジャーＲＮＡである。配列番号１～１３はＤＮＡ配列である。標的ＲＮＡ配列は、チミジン塩基（Ｔ）の代わりに、ウラシル（Ｕ）塩基を有することが理解されよう。

例示的な標的核酸に関する更なる情報は、表２及び３に提供される。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号２である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号３である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号４である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号５である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号６である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号７である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号８である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号９である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１０である。

いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１１である。

標的配列
本明細書で使用される用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチド又は核酸分子に対して相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に対して相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明の核酸分子の相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかの核酸分子により標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。

いくつかの実施形態では、標的配列は、ヒトＡ１ＣＦ ｍＲＮＡエクソン、例えばｅ１、ｅ２、ｅ３、ｅ４、ｅ５、ｅ６、ｅ７、ｅ８、ｅ９、ｅ１０、ｅ１１、ｅ１２、１３、ｅ１４、及びｅ１５からなる群から選択されるＡ１ＣＦヒトｍＲＮＡエクソンからなる群から選択される配列である（例えば上記の表１参照）。

したがって、本発明は、ｅ１～ｅ１５（表１参照）からなる群から選択される配列番号１のエクソン領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な連続配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。

いくつかの実施形態では、標的配列は、ヒトＡ１ＣＦ ｍＲＮＡイントロン、例えば、ｉ１、ｉ２、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ９、ｉ１０、ｉ１１、ｉ１２、ｉ１３、及びｉ１４からなる群から選択されるＡ１ＣＦヒトｍＲＮＡイントロンからなる群から選択される配列である（例えば上記の表１参照）。

したがって、本発明は、ｉ１～ｉ１４（表１参照）からなる群から選択される配列番号１のイントロン領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な連続配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。

いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１２、１３、１４及び１５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書で言及される連続ヌクレオチド配列は、配列番号１２、１３、１４及び１５からなる群から選択される標的配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９５％相補的である。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１２、１３、１４及び１５からなる群から選択される標的配列に対して完全に相補的である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸上の領域、例えば本明細書に記載される標的配列に対して相補的又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。

治療用オリゴヌクレオチドが相補的であるか又はハイブリダイズする標的核酸配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの一続きの連続する核酸塩基を含む。連続ヌクレオチド配列は、１２個～７０個の間のヌクレオチド、例えば１２～５０、例えば１３～３０、例えば１４～２５、例えば１５～２０、例えば１６～１８連続ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、表４又は５に示される領域を標的とする。

いくつかの実施形態において、標的配列は、上記の表４に示されるような標的領域１Ａ～２００１Ａからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、標的配列は、上記の表５に示されるような標的領域１Ｃ～１７８Ｃからなる群から選択される。

標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。本発明の治療的使用のためには、標的細胞がＨＢＶに感染している場合が有利である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、若しくはウッドチャック細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞（例えば、カニクイザル細胞）若しくはヒト細胞である。

好ましい実施形態では、標的細胞は、Ａ１ＣＦプレｍＲＮＡ又はＡ１ＣＦ成熟ｍＲＮＡなどのＡ１ＣＦ ｍＲＮＡを発現する。Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。

更に、標的細胞は肝細胞であってもよい。一実施形態では、標的細胞は、ＨＢＶに感染した初代ヒト肝細胞であり、ＨＢＶ感染個体に由来するか、又はヒト化肝臓を有するＨＢＶに感染したマウス（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ、ＰＸＢマウス）に由来するかのいずれかである。

本発明によれば、標的細胞は、ＨＢＶに感染していてもよい。更に、標的細胞は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含み得る。したがって、標的細胞は、Ａ１ＣＦプレｍＲＮＡ又はＡ１ＣＦ成熟ｍＲＮＡなどのＡ１ＣＦ ｍＲＮＡ及びＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含むことが好ましい。一実施形態では、標的細胞はヒト細胞である。一実施形態では、ヒト細胞は肝細胞である。

天然に存在するバリアント
用語「天然に存在するバリアント」とは、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＡ１ＣＦ遺伝子又は転写産物のバリアント、及び対立遺伝子バリアントを指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在するバリアントを標的とし得る。

いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、哺乳動物Ａ１ＣＦ標的核酸、例えば配列番号１及び／又は配列番号２に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、配列番号１のヒトＡ１ＣＦ標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントは、既知の多型である。

発現の阻害
本明細書で使用される「発現の阻害」という用語は、標的細胞においてＡ１ＣＦ（ＡＰＯＢＥＣ１相補因子）の量又は活性を阻害するＡ１ＣＦ阻害剤の能力の全体的な用語として理解されるべきである。発現又は活性の阻害は、Ａ１ＣＦプレｍＲＮＡ若しくはＡ１ＣＦ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、又は細胞中のＡ１ＣＦタンパク質若しくは活性のレベルを測定することによって決定され得る。発現の阻害は、インビトロ又はインビボで決定され得る。阻害は、対照を参照することによって決定される。対照は、生理食塩水組成物で処理された個々の細胞又は標的細胞であることが一般に理解される。

「阻害」又は「阻害する」という用語は、Ａ１ＣＦの発現又は活性を下方調節する、減少させる、抑制する、減らす、低下させる、低減させるとも呼ばれ得る。

Ａ１ＣＦの発現の阻害は、例えばプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの分解によって、例えばＲＮＡ干渉経路を介して機能するギャップマー又は核酸分子、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを動員するＲＮａｓｅ Ｈを使用して起こり得る。あるいは、本発明の阻害剤は、Ａ１ＣＦポリペプチドに結合し、Ａ１ＣＦの活性を阻害するか、又は他の分子へのその結合を妨げ得る。

いくつかの実施形態では、Ａ１ＣＦ標的核酸の発現又はＡ１ＣＦタンパク質の活性の阻害は、標的細胞中のＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの量の減少をもたらす。好ましくは、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの量は、対照と比較して低減する。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの量の減少は、対照と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％である。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ感染細胞中のｃｃｃＤＮＡの量は、対照と比較した場合、少なくとも５０％、例えば６０％、例えば７０％減少する。

いくつかの実施形態では、Ａ１ＣＦ標的核酸の発現又はＡ１ＣＦタンパク質の活性の阻害は、標的細胞中のＨＢＶ ｐｇＲＮＡの量の低減をもたらす。好ましくは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡの量は、対照と比較して低減する。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡの量の低減は、対照と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％である。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ感染細胞中のｐｇＲＮＡの量は、対照と比較した場合、少なくとも５０％、例えば６０％減少する。

糖修飾
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ又は複数のヌクレオシドを含み得る。

リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドは、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。

このような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、又は典型的にはリボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素との間にビラジカル架橋を有する二環式環、又は典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドが含まれる。

糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、又は５’位で導入され得る。

高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、これは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔ^ｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２^ｏＣの範囲内、より好ましくは＋１．５～＋１０^ｏＣの範囲内、最も好ましくは＋３～＋８^ｏＣの範囲内の融解温度の上昇をもたらす。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野において知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環上の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。

実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、高められた結合親和性及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドにもたらすことができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＲＮＡヌクレオシド及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。

本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。

ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’糖修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。

非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６、国際公開第００／６６６０４、国際公開第９８／０３９３５２、国際公開第２００４／０４６１６０、国際公開第００／０４７５９９、国際公開第２００７／１３４１８１、国際公開第２０１０／０７７５７８、国際公開第２０１０／０３６６９８、国際公開第２００７／０９００７１、国際公開第２００９／００６４７８、国際公開第２０１１／１５６２０２、国際公開第２００８／１５４４０１、国際公開第２００９／０６７６４７、国際公開第２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、Ｍｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、及びＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７に開示されている。

本発明のＬＮＡヌクレオシドの特定の例がスキーム１に示されている（Ｂは上記定義されたとおりである）。

特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。

ＲＮａｓｅ Ｈの活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定での使用について、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ（登録商標）（大腸菌で発現したＨｉｓタグと融合した組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１）から入手できる。

ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーオリゴヌクレオチド又はギャップマー設計とも称され得る。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介した標的核酸の阻害に用いられる。ギャップマー型オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの別個の構造領域、５’－フランク、ギャップ及び３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’→３’方向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）が隣接する。領域Ｆ及びＦ’の１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる（すなわち、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、例えばＬＮＡ及び２’－ＭＯＥから独立して選択される、高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。

ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’及び３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ、５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、即ち５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。

領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含み得る。

ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２から３２ヌクレオシド、例えば１３から２４、例えば１４から２２ヌクレオシド、例えば１５から２０、例えば１６から１８ヌクレオシドであり得る。

例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ_１－８－Ｇ_５－１８－Ｆ’_１－８、例えば
Ｆ_１－８－Ｇ_７－１８－Ｆ’_２－８
ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなるか又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が独立して１～８個のヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、そのうち１～４個が２’糖修飾され、Ｆ及びＦ’領域の５’及び３’末端を規定し、ＧがＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる６個～１８個の間のヌクレオシドの領域である。いくつかの実施形態では、Ｇ領域はＤＮＡヌクレオシドからなる。

いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続する配列からなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から選択されてもよい。

幾つかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、ＬＮＡと２’置換糖修飾ヌクレオチドの両方を含む（混合ウィング設計）。いくつかの実施形態では、２’置換糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位からなる群から独立して選択されてもよい。

幾つかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドが、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ又はＦ’、若しくはＦ及びＦ’は、任意に、ＤＮＡヌクレオシドを含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の全修飾ヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ又はＦ’、若しくはＦ及びＦ’は、任意に、ＤＮＡヌクレオシドを含んでいてもよい。このような実施形態では、フランキング領域Ｆ又はＦ’、若しくはＦ及びＦ’の両方が少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方に、ＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。β－Ｄ－オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方に、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、若しくはそれからなるギャップマーである。

いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１－５－［領域Ｇ］_６－１８－［ＬＮＡ］_１－５であり、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義で定義したとおりである。

ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］_１－８－［領域Ｇ］_５－１６－［ＭＯＥ］_１－８、例えば［ＭＯＥ］_２－７－［領域Ｇ］_６－１４－［ＭＯＥ］_２－７、例えば［ＭＯＥ］_３－６－［領域Ｇ］_８－１２－［ＭＯＥ］_３－６、例えば［ＭＯＥ］_５－［領域Ｇ］_１０－［ＭＯＥ］ _５ のものであり、領域Ｇはギャップマーの定義に規定したとおりである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。

オリゴヌクレオチド内の領域Ｄ’又はＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’、並びにさらに５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか、又はそれからなり得る。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に対して完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤ’’と称され得る。

領域Ｄ’又はＤ’’の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分又は別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連結に用いられる場合、コンジュゲート部分を有する連続ヌクレオチド配列は、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、若しくは合成又は製造を容易にするために使用されてもよい。

領域Ｄ’及びＤ’’は、それぞれ、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に結合して、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’又はＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’又はＤ’’は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

領域Ｄ’又はＤ’’は、独立して、１、２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、標的核酸に対して相補的であっても、相補的でなくてもよい。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの糖修飾ヌクレオチドではなく、若しくはこれらの塩基修飾バージョンでもない。Ｄ’又はＤ’’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は国際公開第ＷＯ２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。

一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。

幾つかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特に、Ｆ_１－８－Ｇ_５－１８－Ｆ’_２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特に、Ｄ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１８－Ｆ’_２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特に、Ｆ_１－８－Ｇ_５－１８－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特に、Ｄ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１８－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３

いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

コンジュゲート
本明細書で用いられる「コンジュゲート」という用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域Ｄ’又はＤ’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。

オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成は、ＭａｎｏｈａｒａｎによるＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｄ．，Ｃｈ．１６，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２００１ ａｎｄ Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１２，１０３の包括的レビューに報告されており、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物（例えば、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質（例えば抗体）、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）又はそれらの組合せからなる群から選択される。

例示的なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができるものである。特に、三価Ｎ－アセチルガラクトサミンのコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲへの結合に適しており、例えば、国際公開第２０１４／０７６１９６号、国際公開第２０１４／２０７２３２号、及び国際公開第２０１４／１７９６２０号（参照することによって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そのようなコンジュゲートは、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取り込みを増強するのに役立つ。

リンカー
結合又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基又はセグメントを目的の別の化学基又はセグメントに連結する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。

本発明の幾つかの実施形態では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意に、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を含み得る。

領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、又はそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化又は還元条件、若しくは薬剤などの化学条件、並びに哺乳動物の細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも２つの連続したホスホジエステル結合、例えば、少なくとも３つ又は４つ又は５つの連続したホスホジエステル結合を含む、１個～５個の間のヌクレオシド、例えば、１、２、３、４又は５個のヌクレオシド、より好ましくは２個～４個の間のヌクレオシド、最も好ましくは２又は３個の結合したヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドは、ＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、ＷＯ２０１４／０７６１９５（参照により本明細書に組み込まれる）においてより詳細に記載されている。

領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造又はオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－Ｃ又はＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）はＣ６アミノアルキル基である。

処置
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の処置、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。予防とは、ＨＢＶ感染症が慢性ＨＢＶ感染症に転化するのを防ぐこと、又は慢性ＨＢＶ感染症による肝硬変及び肝細胞癌腫などの重篤な肝疾患を予防することと理解することができる。

患者
本発明の目的について、「対象」（又は「患者」）は、脊椎動物であり得る。本発明に関連して、用語「対象」は、ヒト及び他の動物、特に哺乳動物と、他の生物との両方を含む。したがって、本明細書に提供される手段及び方法は、ヒト治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。好ましくは、対象は、哺乳動物である。より好ましくは、対象は、ヒトである。

本明細書の他の箇所に記載されるように、処置される患者は、慢性ＨＢＶ感染症などのＨＢＶ感染症に罹患している可能性がある。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ感染症に罹患している患者は、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）に罹患している可能性がある。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ感染症に罹患している患者は、肝細胞癌腫に罹患していない。

発明の詳細な説明
感染肝細胞におけるＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡは持続的な慢性感染症及び再活性化に関与し、全てのウイルスサブゲノム転写物及びプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の鋳型であって、新たに合成されたウイルス子孫と細胞内ヌクレオカプシド再循環を介したｃｃｃＤＮＡプール補充との両方を確実にする。本発明の文脈において、Ａ１ＣＦがｃｃｃＤＮＡ安定性と関連することが初めて示された。この知識により、ＨＢＶ感染対象におけるｃｃｃＤＮＡを不安定化する機会が生まれ、慢性感染ＨＢＶ患者の完全治癒の機会が開ける。

本発明の一態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の処置及び／又は予防用のＡ１ＣＦ阻害剤である。

Ａ１ＣＦ阻害剤は、例えばＡ１ＣＦタンパク質に特異的に結合する小分子であることができ、該阻害剤は、ｃｃｃＤＮＡへのＡ１ＣＦタンパク質の結合を防止又は減少させる。

本発明の実施形態は、ＨＢＶ感染細胞などの感染細胞中のｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡの量を減少させることができる、Ａ１ＣＦ阻害剤である。

更なる実施形態では、Ａ１ＣＦ阻害剤は、ＨＢＶ感染個体においてインビボでＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇを減少させることができる。

ＨＢＶの処置における使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤
理論に拘束されるものではないが、Ａ１ＣＦは、ｃｃｃＤＮＡへの直接的又は間接的な結合を介して、細胞核におけるｃｃｃＤＮＡの安定化に関与し、Ａ１ＣＦとｃｃｃＤＮＡとの結合／会合を妨げることによって、ｃｃｃＤＮＡは不安定化され、分解しやすくなると考えられる。したがって、本発明の一実施形態は、Ａ１ＣＦタンパク質と相互作用し、ｃｃｃＤＮＡへのその結合／会合を防止又は減少させるＡ１ＣＦ阻害剤である。

本発明のいくつかの実施形態では、阻害剤は、抗体、抗体フラグメント又は小分子化合物である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、Ａ１ＣＦタンパク質、例えば配列番号１、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によってコードされるＡ１ＣＦタンパク質に特異的に結合する、抗体、抗体断片又は小分子であり得る。

本発明の核酸分子
治療用核酸分子は、Ａ１ＣＦ転写物を標的とし、ＲＮＡ干渉経路又はＲＮａｓｅ Ｈ切断のいずれかを介してその分解を促進することができるので、潜在的に優れたＡ１ＣＦ阻害剤である。あるいは、アプタマーのようなオリゴヌクレオチドもまた、Ａ１ＣＦタンパク質相互作用の阻害剤として作用し得る。

本発明の一態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の処置及び／又は予防用のＡ１ＣＦ標的化核酸分子である。このような核酸分子は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択され得る。

本発明のセクションは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の処置及び／又は予防に好適な新規の核酸分子を解説する。

本発明の核酸分子は、インビトロ及びインビボでＡ１ＣＦのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を阻害することができる。阻害は、Ａ１ＣＦをコードする標的核酸にオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって達成される。標的核酸は、哺乳動物Ａ１ＣＦ配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１の配列などのヒトＡ１ＣＦプレ－ｍＲＮＡ配列、又は配列番号４～１１から選択されるヒト成熟Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号２の配列などのカニクイザルＡ１ＣＦ配列であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、標的の発現を阻害又は下方調節することにより、それを調節することができる。好ましくは、このような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％の発現の阻害、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、２５ｎＭの核酸分子をＰＸＢ－ＰＨＨ細胞にトランスフェクトすることによって、インビトロで少なくとも５０％又は６０％、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡの発現レベルを阻害することができ、この標的減少の範囲は、ｃｃｃＤＮＡ減少との良好な相関を有する核酸分子を選択する点で有利である。適切には、実施例は、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡ阻害を測定するために使用され得るアッセイを提供する（例えば、実施例１及び「材料及び方法」セクション）。Ａ１ＣＦ阻害は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップマー領域などのオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、Ａ１ＣＦ発現の所望の阻害を示すのに尚充分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又は、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数、例えばオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。

本発明の一態様は、１２～６０ヌクレオチド長の核酸分子であって、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば少なくとも１２～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、哺乳動物Ａ１ＣＦ標的核酸、特にヒトＡ１ＣＦ核酸に対して少なくとも９５％相補的、例えば完全に相補的である、オリゴヌクレオチドに関する。これらの核酸分子はＡ１ＣＦのｍＲＡ及び／又はタンパク質の発現を阻害することができる。

本発明の一態様は、哺乳動物Ａ１ＣＦ標的配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、少なくとも１２ヌクレオチド、例えば１２～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１２～３０ヌクレオチド長の核酸分子に関する。

本発明のさらなる態様は、配列番号１の標的配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な、１４～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む本発明による核酸分子に関する。

いくつかの実施形態では、核酸分子は、１２～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは、標的核酸又は標的配列の領域と、少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である。

オリゴヌクレオチド、若しくはその連続ヌクレオチド配列が、標的配列の領域に対して完全に相補性（１００％相補性）である、又は、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に、１つ又は２つのミスマッチを含み得る場合、有利である。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１及び／又は配列番号４、５、６、７、８、９、１０及び／又は１１の標的配列の領域に対して１００％相補的である。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１及び／又は２の標的核酸に対して少なくとも９０％又は９５％相補性、例えば完全に（又は１００％）相補的である。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号２及び／又は配列番号４、５、６、７、８、９ １０及び／又は１１の標的核酸に対して少なくとも９０％又は９５％相補性、例えば完全に（又は１００％）相補的である。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１、及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号３の標的核酸に対して少なくとも９０％又は９５％相補性、例えば完全に（又は１００％）相補的である。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子の連続配列は、表４に示す標的領域１Ａ～２００１Ａからなる群から選択される配列番号１の領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子の連続配列は、表５に示す標的領域１Ｃ～１７８Ｃからなる群から選択される配列番号１の領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、１２～６０ヌクレオチド長、例えば１３～５０、例えば１４～３５、例えば１５～３０、例えば１６～２２連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。好ましい実施形態では、核酸分子は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。

いくつかの実施形態では、標的核酸に対して相補的である核酸分子の連続ヌクレオチド配列は、１２～３０、例えば１３～２５、例えば１５～２３、例えば１６～２２連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、標的配列に対して相補的であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの連続ヌクレオチド配列は、１８～２８、例えば１９～２６、例えば２０～２４、例えば２１～２３連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、標的核酸に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、１２～２２、例えば１４～２０、例えば１６～２０、例えば１５～１８、例えば１６～１８、例えば１６、１７、１８、１９又は２０の連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、表６に列挙された配列からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなる（材料及び方法セクション）。

連続オリゴヌクレオチド配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸に対する結合親和性を増大させるために修飾され得ることが理解される。

修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と称される。

本発明の核酸分子は、修飾ヌクレオシド及びＲＮＡヌクレオシド（特に、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ分子）又はＤＮＡヌクレオシド（特に、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いて設計することができる。

有利な実施形態では、核酸分子又は連続ヌクレオチド配列は、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含み、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＤＮＡヌクレオシド、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ヌクレオシド、２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシド及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシド（複数可）の１つ又は複数がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。

有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の最も３’側のヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシドである。

更なる実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。好適なヌクレオシド間修飾は、「修飾ヌクレオシド間結合」の「定義」セクションに記載されている。

有利には、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートなどの少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル・ヌクレオシド間結合である。

オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端における少なくとも２～３個のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である場合、有利である。

一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、連続ヌクレオチド配列内の少なくとも７５％、例えば全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であれば有利である。いくつかの実施形態では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続配列中の全ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

本発明の有利な実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ、例えばＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することができる。有利な構造設計は、例えば、「ギャップマー」、「ＬＮＡギャップマー」、及び「ＭＯＥギャップマー」の「定義」セクションに記載されているギャップマー設計である。本発明では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＦ－Ｇ－Ｆ’設計のギャップマーである場合が有利である。

全ての場合において、Ｆ－Ｇ－Ｆ’設計は、「オリゴヌクレオチド中の領域Ｄ’又はＤ’’」の「定義」セクションに記載されるように、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を更に含み得る。

本発明のさらなる態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどの核酸分子を、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合することができるコンジュゲート部分、例えば二価又は三価のＧａｌＮＡｃクラスターに共有結合することによって、肝臓に直接標的化することができる。

コンジュゲート
ＨＢＶ感染症は主に肝臓の肝細胞に影響を及ぼすので、Ａ１ＣＦ阻害剤をコンジュゲート部分に結合させ、未結合阻害剤と比較して阻害剤の肝臓への送達を増加させることが、有利である。一実施形態では、肝臓標的化部分は、コレステロール若しくは他の脂質を含む部分、又はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができるコンジュゲート部分から選択される。

いくつかの実施形態では、本発明は、コンジュゲート部分に共有結合した本発明の核酸分子を含む、コンジュゲートを提供する。

アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）コンジュゲート部分は、ガラクトースと同等以上の親和性でアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧＲ標的化部分）に結合することができる、１つ以上の炭水化物部分を含む。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性が研究されており（例えば、Ｊｏｂｓｔ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｋ．ＪＢ．Ｃ．１９９６，２７１，６６８６を参照）、又は当技術分野で典型的な方法を用いて容易に決定される。

一実施形態では、コンジュゲート部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群より選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。

ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分を生成するために、ＡＳＰＧＲ標的化部分（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ）をコンジュゲート足場に付着させることができる。一般に、ＡＳＰＧＲ標的化部分は、足場の同じ末端にあり得る。一実施形態では、コンジュゲート部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合され得るブランチャー分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を結合するスペーサーに結合された、２～４個の末端ＧａｌＮＡｃ部分からなる。

更なる実施形態では、コンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して、一価、二価、三価、又は四価である。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。

ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分としては、例えば、国際公開第２０１４／１７９６２０号及び同第２０１６／０５５６０１号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９０８０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているもの、並びに、Ｔｙｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３などのＧａｌＮＡｃ部分が結合した小さなペプチド；肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合するグリコトリペプチド、例えば、Ｄｕｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０００，３１３，２９７；リシン系ガラクトースクラスター（例えば、Ｌ３Ｇ４；Ｂｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９９，２１４）；及びコラン系ガラクトースクラスター（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体に対する炭水化物認識モチーフ）を挙げることができる。

ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分、特に三価ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分は、当該技術分野で公知の方法を用いてオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端に結合することができる。一実施形態では、ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合する。

一実施形態では、コンジュゲート部分は、図１に示すような三価のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図１Ａ－１若しくは図１Ａ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図１Ｂ－１若しくは図１Ｂ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図１Ｃ－１若しくは図１Ｃ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。一実施形態では、コンジュゲート部分は、図１Ｄ－１若しくは図１Ｄ－２の三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又はその両方の混合物である。

製造方法
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８７年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１５４巻第２８７～３１３頁を参照のこと）。さらなる実施形態において、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲーティング部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。

薬学的な塩
本発明による化合物は、その薬学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持する従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。

さらなる態様では、本発明は、核酸分子の薬学的に許容され得る塩又はそのコンジュゲート、例えば薬学的に許容され得るナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。

医薬組成物
さらなる態様では、本発明は、本発明の化合物のいずれか、特に前述の核酸分子及び／又は核酸分子コンジュゲート又はその塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５０～３００μＭの溶液の濃度で薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される。

本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単な総説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体及びアジュバントの適切で好ましいさらなる例を提供している（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子若しくは核酸分子コンジュゲート、又はその薬学的に許容され得る塩は、粉末、例えば凍結乾燥粉末などの固体形態である。

本発明の化合物、核酸分子若しくは核酸分子コンジュゲートは、医薬組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容され得る活性又は不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の調製のための組成物及び方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含む多くの基準に依存する。

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、又は滅菌フィルタにかけられてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、又は凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９又は６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤又は薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子又は核酸分子コンジュゲートはプロドラッグである。特に核酸分子コンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分は核酸分子から切断される。

投与
本発明の化合物、核酸分子又は核酸分子コンジュゲート又は医薬組成物は、局所的に、又は経腸的に、又は非経口的に（例えば、静脈内、皮下、又は筋肉内）投与され得る。

好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射若しくは注入を含む非経口経路によって投与される。一実施形態では、活性核酸分子又は核酸分子コンジュゲートは静脈内投与される。別の実施形態では、活性核酸分子又は核酸分子コンジュゲートは皮下投与される。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子、核酸分子コンジュゲート又は医薬組成物は、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、又は月に１回であり得る。

本発明はまた、医薬の製造のために記載された本発明の核酸分子又は核酸分子コンジュゲートの使用も提供し、該医薬は皮下投与のための剤形である。

併用療法
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子、核酸分子コンジュゲート又は医薬組成物などの本発明の阻害剤は、別の治療剤との併用処置で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害の標準ケアであり得る。

例として、本発明の核酸分子又は核酸分子コンジュゲートは、アンチセンス（他のＬＮＡオリゴマーを含む）、ｓｉＲＮＡ（ＡＲＣ５２０など）、アプタマー、モルホリノ、又は任意の他の抗ウイルス、ヌクレオチド配列依存性作用様式のいずれかを介して作用する、オリゴヌクレオチド系抗ウイルス剤、例えば配列特異的オリゴヌクレオチド系抗ウイルス剤などの他の活性剤と組み合わせて使用することができる。

さらなる例として、本発明の核酸分子又は核酸分子コンジュゲートは、インターフェロン（例えば、ペグ化インターフェロンα）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ＧＳ－９６２０）、又は治療ワクチンなどの免疫刺激抗ウイルス化合物といった他の活性物質と組み合わせて使用することができる。

さらなる例として、本発明の核酸分子又は核酸分子コンジュゲート剤は、抗ウイルス活性を有する他の活性物質、例えば小分子と組み合わせて使用することができる。これらの他の活性物質は、例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド阻害剤（例えば、エンテカビル又はテノホビル・ジソプロキシルフマル酸塩）、封入阻害剤、侵入阻害剤（例えば、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ）であり得る。

特定の実施形態では、追加の治療剤は、ＨＢＶ薬、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）薬、化学療法薬、抗生物質、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗真菌薬、抗寄生虫薬、制吐薬、下痢止め薬、又は免疫抑制薬であり得る。

特に、関連する実施形態では、追加のＨＢＶ剤は、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン；ＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害薬；第２のアンチセンスオリゴマー；ＨＢＶ治療ワクチン；ＨＢＶ予防ワクチン；ラミブジン（３ＴＣ）；エンテカビル（ＥＴＶ）；フマル酸テノホビル・ジソプロキシル（ＴＤＦ）；テルビブジン（ＬｄＴ）；アデホビル；又はＨＢＶ抗体療法（単クローン性又は多クローン性）であり得る。

他の特定の関連する実施形態では、更なるＨＣＶ剤は、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈａｃｏｎ）－１（ペグ化及び非ペグ化）；リバビリン；ペガシス；ＨＣＶ ＲＮＡ複製阻害剤（例えば、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ社製ＶＰ５０４０６シリーズ）；ＨＣＶアンチセンス剤；ＨＣＶ治療ワクチン；ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤；ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤；又はＨＣＶモノクローナル抗体療法若しくはＨＣＶポリクローナル抗体療法であり得る。

用途
本発明の核酸分子は、例えば、診断、治療及び予防のための研究試薬として利用し得る。

研究では、そのような核酸分子を使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）及び実験動物におけるＡ１ＣＦタンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進し得る。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、又はタンパク質を生成する遺伝子若しくはｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することによって達成される。

本発明の核酸分子を研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。

本発明はまた、Ａ１ＣＦを発現している標的細胞においてＡ１ＣＦ発現を調節するためのインビボ又はインビトロの方法であって、有効量の本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物を該細胞に投与することを含む、方法も、包含する。

いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物又はインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、肝臓中に存在する。標的細胞は肝細胞であってもよい。

本発明の一態様は、医薬として使用するための本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物又は医薬組成物に関する。

本発明の一態様では、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物又は医薬組成物などのＡ１ＣＦ阻害剤は、ＨＢＶ感染細胞中のｃｃｃＤＮＡレベルを減少させ、それによりＨＢＶ感染症を阻害することができる。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、感染細胞中における以下のパラメータ（ｉ）ｃｃｃＤＮＡの減少、及び／又は（ｉｉ）ｐｇＲＮＡの減少、及び／又は（ｉｉｉ）ＨＢＶ ＤＮＡの減少、及び／又は（ｉｖ）ＨＢＶウイルス抗原の減少のうちの１つ以上に影響を及ぼすことができる。

例えば、ＨＢＶ感染症を阻害する核酸分子は、（ｉ）感染細胞中のｃｃｃＤＮＡレベルを、対照と比較して、少なくとも４０％、例えば５０％、６０％又は７０％減少、又は（ｉｉ）ｐｇＲＮＡレベルを、少なくとも４０％、対照と比較して、例えば５０％、６０％又は７０％減少させることができる。対照は、未処理の細胞若しくは動物、又は適切な対照で処理された細胞若しくは動物であり得る。

ＨＢＶ感染症の阻害は、ＨＢＶに感染した初代ヒト肝細胞を用いてインビトロで、又はヒト化肝細胞ＰＸＢマウスモデル（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏから入手可能、また、Ｋａｋｕｎｉら（２０１４年）「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．」第１５巻、第５８～７４も参照されたい）を用いてインビボで測定することができる。ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの分泌阻害は、製造業者の指示に従って、例えばＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定することができる。細胞内ｃｃｃＤＮＡ又はＨＢＶ ｍＲＮＡ及びｐｇＲＮＡの減少は、例えば、材料及び方法セクションに記載されるように、ｑＰＣＲによって測定することができる。試験化合物がＨＢＶ感染を阻害するかどうかを評価するための更なる方法は、例えば国際公開第２０１５／１７３２０８号に記載されているとおりｑＰＣＲにより、又はノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、又は免疫蛍光を用いて、ＨＢＶ ＤＮＡの分泌を測定することである。

Ａ１ＣＦレベルの減少により、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物又は医薬組成物は、ＨＢＶ感染症の発症を阻害するために、又はその処置において使用することができる。特に、ｃｃｃＤＮＡの不安定化及び減少により、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物又は医薬組成物は、ＨＢｓＡｇの分泌のみを減少させる化合物と比較して、慢性ＨＢＶ感染症の発症をより効率的に阻害又は処置する。

したがって、本発明の一態様は、ＨＢＶ感染個体におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを減少させるための本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物などのＡ１ＣＦ阻害剤の使用に関する。

本発明の更なる態様は、慢性ＨＢＶ感染症の発症を阻害又は処置するための本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物などのＡ１ＣＦ阻害剤の使用に関する。

本発明の更なる態様は、ＨＢＶ感染者の感染性を低下させるための、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物などのＡ１ＣＦ阻害剤の使用に関する。本発明の特定の態様では、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物などのＡ１ＣＦ阻害剤は、慢性ＨＢＶ感染症の発症を阻害する。

本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物などのＡ１ＣＦ阻害剤（又は本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、若しくは医薬組成物を予防的に受容するもの）で処置される対象は、好ましくはヒトであり、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性及び／又はＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者であり、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性及びＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者である。

したがって、本発明は、有効量の、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物などのＡ１ＣＦ阻害剤を投与することを含む、ＨＢＶ感染症を処置する方法に関する。本発明は更に、慢性ＨＢＶ感染症に起因する肝硬変及び肝細胞癌腫を予防する方法に関する。一実施形態では、本発明のＡ１ＣＦ阻害剤は、肝細胞癌腫の処置を意図するものではなく、その予防のみを意図する。

本発明はまた、医薬、特にＨＢＶ感染症若しくは慢性ＨＢＶ感染症の処置、又はＨＢＶ感染者の感染性の減少に使用する医薬の製造のための、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物などのＡ１ＣＦ阻害剤の使用を提供する。好ましい実施形態では、医薬は、皮下投与のための剤形で製造される。

本発明はまた、医薬を製造するための本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の使用を提供し、該薬物は静脈内投与のための剤形である。

本発明の核酸分子、コンジュゲート又は医薬組成物などのＡ１ＣＦ阻害剤は、併用療法で使用され得る。例えば、本発明の核酸分子、コンジュゲート、又は医薬組成物は、ＨＢＶの処置及び／又は予防のために、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビルなどの他の抗ＨＢＶ剤、又はＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害剤、ＨＢｓＡｇ分泌阻害剤、ＨＢＶカプシド阻害剤、アンチセンスオリゴマー（例えば、国際公開第２０１２／１４５６９７号、同第２０１４／１７９６２９号、及び同第２０１７／２１６３９０号に記載）、ｓｉＲＮＡ（例えば、国際公開第２００５／０１４８０６号、同第２０１２／０２４１７０号、同第２０１２／２０５５３６２号、同第２０１３／００３５２０号、同第２０１３／１５９１０９号、同第２０１７／０２７３５０号、及び同第２０１７／０１５１７５号に記載）、ＨＢＶ治療ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ＨＢＶ抗体療法（単クローン性又は多クローン性）、又はＴＬＲ２、３、７、８、若しくは９アゴニストなどの他の抗ＨＢＶ剤と組み合わせてもよい。

本発明の実施形態
本発明の以下の実施形態は、本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わせて使用することができる。上記の、特に「発明の概要」、「定義」及び「発明の詳細な説明」の項で提供される定義及び説明は、以下に準用される。

１． Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の処置及び／又は予防用のＡ１ＣＦ阻害剤。

２． Ａ１ＣＦ阻害剤が有効量で投与される、実施形態１に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

３． ＨＢＶ感染症が慢性感染症である、実施形態１又は２に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

４． 感染細胞中のｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡの量を減少させることができる、実施形態１～３に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

５． Ａ１ＣＦタンパク質のｃｃｃＤＮＡへの会合を防止又は減少させる、実施形態１～４のいずれか一つに記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

６． Ａ１ＣＦタンパク質に特異的に結合する小分子であり、ｃｃｃＤＮＡへのＡ１ＣＦタンパク質の会合を防止又は低減する、実施形態５に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

７． Ａ１ＣＦタンパク質が配列番号４、５、６、７、８、９、１０又は１１によってコードされる、実施形態６に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

８． 哺乳動物のＡ１ＣＦ標的核酸に対して少なくとも９０％相補的な少なくとも１２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる１２～６０ヌクレオチド長の核酸分子である、実施形態１～７のいずれか一つに記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

９． 哺乳動物のＡ１ＣＦ標的核酸のレベルを減少させることができる、実施形態８に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１０． 哺乳動物のＡ１ＣＦ標的核酸がＲＮＡである、実施形態８又は９に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１１． ＲＮＡがプレｍＲＮＡである、実施形態１０に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１２． 核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡからなる群より選択される、実施形態８～１１のいずれか一つに記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１３． 核酸分子が一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は二本鎖ｓｉＲＮＡである、実施形態１２に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１４． 哺乳動物Ａ１ＣＦ標的核酸が、配列番号１、４、５、６、７、８、９、１０及び１１からなる群から選択される、実施形態８から１３のいずれか一つに記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１５． 核酸分子の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２の標的核酸に対して少なくとも９８％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態８～１３のいずれか一つに記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１６． 核酸分子の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２及び配列番号３の標的核酸に対して少なくとも９８％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態８～１３のいずれか一つに記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１７． ＨＢＶ感染細胞中のｃｃｃＤＮＡの量が、対照と比較した場合、少なくとも５０％、例えば６０％減少する、実施形態１～１６のいずれか一つに記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１８． ＨＢＶ感染細胞中のｐｇＲＮＡの量が、対照と比較した場合、少なくとも５０％、例えば６０％減少する、実施形態１～１６のいずれか一つに記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

１９． 哺乳動物のＡ１ＣＦ標的核酸の量が、対照と比較した場合、少なくとも５０％、例えば６０％減少する、実施形態８～１８のいずれか一つに記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。

２０． １２～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる１２～６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物Ａ１ＣＦ標的核酸に対して少なくとも９０％相補的、例えば９５％、例えば９８％の完全な相補的である、核酸分子。

２１． 核酸分子が化学的に作製される、実施形態２０に記載の核酸分子。

２２． 哺乳動物Ａ１ＣＦ標的核酸が配列番号１、４、５、６、７、８、９、１０及び１１からなる群より選択される、実施形態２０又は２１に記載の核酸分子。

２３． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２の標的核酸に対して少なくとも９８％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態２０又は２１に記載の核酸分子。

２４． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２及び配列番号３の標的核酸に対して完全に相補的である、実施形態２０又は２１に記載の核酸分子。

２５． １２～３０ヌクレオチド長である、実施形態２０～２３のいずれか一つに記載の核酸分子。

２６． 核酸分子が二本鎖ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子である、実施形態２０～２５のいずれか一つに記載の核酸分子。

２７． 核酸分子が一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態２０～２５のいずれか一つに記載の核酸分子。

２８． 連続ヌクレオチド配列が、表４又は表５から選択される標的核酸配列に対して完全に相補的である、実施形態２０～２７のいずれか一つの核酸分子。

２９． －１５ ｋｃａｌ未満のΔＧ°で配列番号１及び配列番号２の標的核酸にハイブリダイズすることができる、実施形態２０～２８のいずれか一つに記載の核酸分子。

３０． 連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１４連続ヌクレオチド、特に１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる、実施形態２０～２９のいずれか一つに記載の核酸分子。

３１． 連続ヌクレオチド配列が、１４～２２個のヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる、実施形態２０～２９のいずれか一つに記載の核酸分子。

３２． 連続ヌクレオチド配列が、１６～２０個のヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる、実施形態３１に記載の核酸分子。

３３． １４～２５ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる、実施形態２０～３２のいずれか一つに記載の核酸分子。

３４． １６～２２ヌクレオチド長の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド鎖を含むか、又はそれらからなる、実施形態３３に記載の核酸分子。

３５． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号１２、１３、１４、及び１５からなる群から選択される標的配列に対して完全に相補的である、実施形態２０～３４のいずれか一つの核酸分子。

３６． 連続ヌクレオチド配列が、それが相補的である哺乳動物のＡ１ＣＦ標的核酸と比較して０～３個のミスマッチを有する、実施形態２０～３５のいずれか一つの核酸分子。

３７． 連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物のＡ１ＣＦ標的核酸と比較して１つのミスマッチを有する、実施形態３６に記載の核酸分子。

３８． 連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物のＡ１ＣＦ標的核酸と比較して２つのミスマッチを有する、実施形態３６に記載の核酸分子。

３９． 連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物のＡ１ＣＦ標的核酸に対して完全に相補的である、実施形態３６に記載の核酸分子。

４０． １つ又は複数の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態２０～３９のいずれか一つに記載の核酸分子。

４１． １つ又は複数の修飾ヌクレオシドが高親和性修飾ヌクレオシドである、実施形態４０に記載の核酸分子。

４２． １つ又は複数の修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態４０又は４１に記載の核酸分子。

４３． １つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシド及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態４２に記載の核酸分子。

４４． １つ又は複数の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、実施形態４０～４３のいずれか一つに記載の核酸分子。

４５． 修飾ＬＮＡヌクレオシドが、オキシＬＮＡ、アミノＬＮＡ、チオＬＮＡ、ｃＥＴ及びＥＮＡからなる群から選択される、実施形態４４に記載の核酸分子。

４６． 修飾ＬＮＡヌクレオシドが、それに続く２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ_２－を有するオキシＬＮＡである、実施形態４４又は４５に記載の核酸分子。

４７． オキシＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシＬＮＡである、実施形態４６に記載の核酸分子。

４８． 修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－を有するｃＥＴである、実施形態４４又は４５に記載の核酸分子。

４９． ｃＥＴが（Ｓ）ｃＥＴ、すなわち６’（Ｓ）メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡである、実施形態４８に記載の核酸分子。

５０． ＬＮＡがＥＮＡであり、それに続く２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－を有する、実施形態４４又は４５に記載の核酸分子。

５１． 少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、実施形態２０～５０のいずれか一つの核酸分子。

５２． 上記少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態５１に記載の核酸分子。

５３． ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態２０～５２のいずれか一つに記載の核酸分子。

５４． アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列が、ギャップマーである、実施形態５３に記載の核酸分子。

５５． アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなるか、又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が独立して１～４個の２’糖修飾ヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、ＧがＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる６個～１８個の間のヌクレオシドの領域である、実施形態５４に記載の核酸分子。

５６． １～４個の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＤＮＡヌクレオシド、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ヌクレオシド、２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシド及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態５５に記載の核酸分子。

５７． 領域Ｆ及びＦ’における１～４個の２’糖修飾ヌクレオシドの１つ又は複数がＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５５又は５６に記載の核酸分子。

５８． 領域Ｆ及びＦ’における２’糖修飾ヌクレオシドの全てがＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５７に記載の核酸分子。

５９． ＬＮＡヌクレオシドが、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、α－Ｌ－オキシ－ＬＮＡ、β－Ｄ－アミノ－ＬＮＡ、α－Ｌ－アミノ－ＬＮＡ、β－Ｄ－チオ－ＬＮＡ、α－Ｌ－チオ－ＬＮＡ、（Ｓ）ｃＥＴ、（Ｒ）ｃＥＴ β－Ｄ－ＥＮＡ及びα－Ｌ－ＥＮＡから選択される、実施形態５６～５８のいずれか一つに記載の核酸分子。

６０． 領域Ｆ及びＦ’が同一のＬＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５６～５９のいずれか一つに記載の核酸分子。

６１． 領域Ｆ及びＦ’における全ての２’糖修飾ヌクレオシドがオキシ－ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５６～６０のいずれか一つに記載の核酸分子。

６２． 領域ＧにおけるヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドである、実施形態５５～６１のいずれか一つに記載の核酸分子。

６３． 領域Ｇが、少なくとも７５％のＤＮＡヌクレオシドからなる、実施形態６２に記載の核酸分子。

６４． 領域Ｇにおける全てのヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドである、実施形態６３に記載の核酸分子。

６５． 実施形態２０～６４のいずれか一項に記載の核酸分子と、核酸分子に共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート化合物。

６６． 核酸分子が二本鎖ｓｉＲＮＡであり、コンジュゲート部分がｓｉＲＮＡのセンス鎖に共有結合している、実施形態６５に記載のコンジュゲート化合物。

６７． コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質、又はそれらの組合せから選択される、実施形態６５又は６６に記載のコンジュゲート化合物。

６８． コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる、実施形態６５～６７のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物。

６９． コンジュゲート部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクサミンからなる群から選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む、実施形態６８に記載のコンジュゲート化合物。

７０． アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分が、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、実施形態６９に記載のコンジュゲート化合物。

７１． コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して、一価、二価、三価、又は四価である、実施形態６９又は７０コンジュゲート化合物。

７２． コンジュゲート部分が、２～４つの末端ＧａｌＮＡｃ部分と、アンチセンス化合物にコンジュゲートされ得るブランチャー分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を結合するスペーサーと、からなる、実施形態７１に記載のコンジュゲート化合物。

７３． スペーサーが、ＰＥＧスペーサーである、実施形態７２に記載のコンジュゲート化合物。

７４． コンジュゲート部分が、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば三価のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分である、実施形態６８～７３のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物。

７５． コンジュゲート部分が、図１の三価ＧａｌＮＡｃ部分のうち１つから選択される、実施形態６８～７４のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物。

７６． コンジュゲート部分が、図１Ｂ－１若しくは図１Ｂ－２の三価ＧａｌＮＡｃ部分、又はその両方の混合物である、実施形態７５に記載のコンジュゲート化合物。

７７． コンジュゲート部分が、図１Ｄ－１若しくは図１Ｄ－２の三価ＧａｌＮＡｃ部分、又はその両方の混合物である、実施形態７５に記載のコンジュゲート化合物。

７８． 核酸分子とコンジュゲート部分との間に配置されたリンカーを含む、実施形態６５～７７のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物。

７９． リンカーが生理学的に不安定なリンカーである、実施形態７８に記載のコンジュゲート化合物。

８０． 生理学的に不安定なリンカーが、ヌクレアーゼ感受性リンカーである、実施形態７９に記載のコンジュゲート化合物。

８１． 生理学的に不安定なリンカーが、２～５個の連続ホスホジエステル結合からなる、実施形態７９又は８０のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物。

８２． 非コンジュゲート核酸と比較して、肝臓対腎臓の間の改善した細胞分布、又は該コンジュゲート化合物の該肝臓への改善した細胞取込みを示す、実施形態６５～８１のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物。

８３． 実施形態２０～６４のいずれか一つに記載の核酸分子、実施形態６５～８２のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物又はその許容され得る塩、並びに薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物。

８４． Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症を予防、改善、及び／又は阻害する化合物を同定するための方法であって、
ａ． 試験化合物を
ｉ． Ａ１ＣＦポリペプチド；又は
ｉｉ． Ａ１ＣＦを発現する細胞と接触させることと、
ｂ． 上記試験化合物の存在下又は非存在下において、Ａ１ＣＦの発現及び／又は活性を測定することと、
ｃ． Ａ１ＣＦの発現及び／又は活性を減少させ、ｃｃｃＤＮＡを減少させる化合物を同定することと
を含む、方法。

８５． Ａ１ＣＦを発現している標的細胞におけるＡ１ＣＦ発現を調節するためのインビボ又はインビトロ方法であって、実施形態２０～６４のいずれか一つに記載の核酸分子、実施形態６５～８２のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物、又は実施形態８３に記載の医薬組成物を有効量で上記細胞に投与することを含む、方法。

８６． Ａ１ＣＦ発現が、標的細胞において、一切無処理又は対照で処理されたレベルと比較して少なくとも５０％、又は少なくとも６０％減少する、実施形態８５に記載の方法。

８７． 標的細胞がＨＢＶに感染し、ＨＢＶ感染細胞のｃｃｃＤＮＡが、ＨＢＶ感染標的細胞において、一切無処理又は対照で処理されたレベルと比較して少なくとも５０％、又は少なくとも６０％減少する、実施形態８５に記載の方法。

８８． ＨＢＶ感染症などの疾患を処置又は予防するための方法であって、治療有効量又は予防有効量の、実施形態２０～６４のいずれか一つに記載の核酸分子、実施形態６５～８２のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物、又は実施形態８３に記載の医薬組成物を、疾患に罹患しているか又は疾患に罹患しやすい対象に投与することを含む、方法。

８９． 対象におけるＨＢＶ感染症などの疾患を処置又は予防するための医薬として使用するための、実施形態２０～６４のいずれか一項に記載の核酸分子、又は実施形態６５～８２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物、又は実施形態８３に記載の医薬組成物。

９０． 対象におけるＨＢＶ感染症などの疾患を処置又は予防するための医薬を調製するための実施形態２０～６４のいずれか一つに記載の核酸分子又は実施形態６５～８２のいずれか一つに記載のコンジュゲート化合物の使用。

９１． 対象が哺乳動物である、実施形態８８～９０のいずれか一つの方法、核酸分子、コンジュゲート化合物又は使用。

９２． 哺乳動物がヒトである、実施形態９１に記載の方法、核酸分子、コンジュゲート化合物又は使用。

これより、本発明を、限定的な特徴を有しない以下の実施例によって説明する。

材料及び方法
ｓｉＲＮＡ配列及び化合物

ｓｉＲＮＡのプール（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＵ－０１３５７６－０２－０００５，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）は、上記の表に列挙された配列を標的とする４つの個々のｓｉＲＮＡ分子を含む。

オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野で一般に知られている。以下は、適用できるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、支持体、及び濃度に関してわずかに異なる方法によって、生成されている場合がある。

オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ ４８のホスホロアミダイトアプローチを１μｍｏｌスケールで用いて、ウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の最後に、水性アンモニアを６０℃で５～１６時間使用してオリゴヌクレオチドを固相支持体から切断する。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）又は固相抽出によって精製し、ＵＰＬＣによって特徴付け、分子量をさらにＥＳＩ－ＭＳによって確認する。

オリゴヌクレオチドの伸長：
β－シアノエチル－ホスホロアミダイトのカップリング（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、又はＬＮＡ－Ｔ）は、アセトニトリル中の０．１Ｍの５’－Ｏ－ＤＭＴ保護アミダイト及びアセトニトリル（０．２５Ｍ）中のＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）の溶液を活性剤として用いて行われる。最終サイクルでは、所望の修飾を有するホスホロアミダイト、例えばコンジュゲート基を結合するためのＣ６リンカー、又はそのようなコンジュゲート基を使用できる。ホスホルチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１Ｍ）を用いることにより行われる。ホスホジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍヨウ素を用いて導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に通常使用される試薬である。

固相合成後のコンジュゲートでは、固相合成の最後のサイクルで市販のＣ６アミノリンカーホルフォラミダイトを使用でき、脱保護及び固相支持体からの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが単離される。コンジュゲートは、標準的な合成方法を使用した官能基の活性化によって導入される。

ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）Ｃ１８ １０μｍ １５０×１０ｍｍカラムでの分取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８及びアセトニトリルを５ｍＬ／分の流速で緩衝液として使用する。収集された画分を凍結乾燥して、精製された化合物を典型的には白色固体として得る。

略語：
ＤＣＩ：４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィ

Ｔ_ｍアッセイ：
オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）二重鎖を、５００ｍｌのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈し、５００ｍｌの２倍Ｔ_ｍ緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＮａ－リン酸、ｐＨ７．０）と混合する。この溶液を９５℃で３分間加熱し、次いで、室温で３０分間アニールする。二重鎖の融解温度（Ｔ_ｍ）は、ＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ペルチェ温度プログラマーＰＴＰ６を備えたＬａｍｂｄａ ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で測定する。温度を２０℃から９５℃に上昇させ、次いで２５℃に低下させ、２６０ｎｍで吸収を記録する。一次導関数と、融解及びアニーリングの両方の極大値とを使用して、二重鎖Ｔ_ｍを評価する。

クローン増殖培地（ｄＨＣＧＭ）．ｄＨＣＧＭは、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ｍＭヘペス、４４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１５μｇ／ｍＬ Ｌ－プロリン、０．２５μｇ／ｍＬインスリン、５０ｎＭデキサメタゾン、５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．１ｍＭ Ａｓｃ－２Ｐ、２％ＤＭＳＯ、及び１０％ＦＢＳ（石田ら、２０１５年）を含有するＤＭＥＭ培地である。細胞を、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下において３７℃のインキュベーターで培養した。培養培地を、播種後２４時間、採取まで２日毎に交換した。

ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞
新鮮な初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ，Ｈｉｇａｓｈｉ－Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ Ｃｉｔｙ，Ｊａｐａｎ（ＰＸＢ－細胞はＩｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ ２０１５ Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１８５（５）：１２７５－８５にも記載されている）によって９６ウェルプレート形式で７０，０００細胞／ウェルで提供した。

到着したら、ＰＨＨ培地中の４％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ中でＰＨＨ細胞をＨＢＶと共に１６時間インキュベートすることによって、ＨｅｐＧ２ ２．２．１５由来ＨＢＶ（バッチＺ１２）を使用してＰＨＨに２ＧＥのＭＯＩを感染させた。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１００８２）、２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５１４０－１４８）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５６３０－０８０）、４４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３（Ｗａｋｏ、カタログ番号１９５－１４５１５）、１５μｇ／ｍｌ Ｌ－プロリン（ＭＰ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号０２１９４７２８２５）、０．２５μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ １８８２）、５０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ８８９３）、５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ９６４４）及び０．１ｍＭのＬ－アスコルビン酸２－リン酸（Ｗａｋｏ、カタログ番号０１３－１２０６１）を補充したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２１８８５）からなる新鮮ＰＨＨ培地中、５％ ＣＯ_２で加湿雰囲気を培養した。細胞を、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下において３７℃のインキュベーターで培養した。培養培地を、播種後２４時間、採取まで週に３回交換した。

ｓｉＲＮＡトランスフェクション
感染の４日後、細胞を３連でＡ１ＣＦ ｓｉＲＮＡプール（表６を参照）でトランスフェクトした。薬物なし対照（ＮＤＣ）、陰性対照ｓｉＲＮＡ及びＨＢｘ ｓｉＲＮＡを対照として含めた（表７を参照）。

ウェル毎に、１８．２μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉａ）及び０．６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＮｏ．１３７７８）を含む２μｌの陰性対照ｓｉＲＮＡ（ストック濃度１μＭ）、Ａ１ＣＦ ｓｉＲＮＡプール（ストック濃度１μＭ）、ＨＢｘ対照ｓｉＲＮＡ（ストック濃度０．１２μＭ）又はＨ_２Ｏ（ＮＤＣ）のいずれかでトランスフェクション混合物を調製した。トランスフェクション混合物を混合し、トランスフェクションの５分前に室温でインキュベートした。トランスフェクションの前に、培地をＰＨＨ細胞から除去し、Ｐ／Ｓを含まないＨｅｐａＲＧ補充物（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、＃ＡＤＤ７１１Ｃ）を補充した１００μｌ／ウェルのＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ、番号３２５５１）と交換した。２０μｌのトランスフェクション混合物を各ウェルに添加して、陰性対照ｓｉＲＮＡ若しくはＡ１ＣＦ ｓｉＲＮＡプールについては１６ｎＭ、又はＨＢｘ対照ｓｉＲＮＡについては１．９２ｎＭの最終濃度を得て、プレートを穏やかに揺動させた後、インキュベーターに入れた。培地を６時間後にＰＨＨ培地と交換した。ｓｉＲＮＡ処理を上記のように感染後６日目に繰り返した。感染後８日目に上清を回収し、－２０^ｏＣで保存した。所望であれば、上清からＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを決定することができる。

ＨＢＶ抗原発現の測定 ＨＢＶ抗原の発現及び分泌は、必要に応じて、収集した上清中で測定することができる。ＨＢＶ増殖パラメータであるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルは、製造業者のプロトコルに従って、ＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、ＣＬ０３１０－２号、ＣＬ０３１２－２号）を用いて測定される。簡単に述べると、２５μＬ／ウェルの上清をそれぞれの抗体被覆マイクロタイタプレートに移し、２５μＬの酵素コンジュゲート試薬を加える。プレートを振盪機上で室温にて６０分間インキュベートした後、自動洗浄機を用いて洗浄緩衝液によりウェルを５回洗浄する。２５μＬの基質Ａ及びＢを各ウェルに加えた。プレートを振盪機上で室温にて１０分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）発光リーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光を測定する。

細胞生存率測定
細胞生存率は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製ＣＣＫ８、＃９６９９２）によって上清を含まない細胞で測定した。測定のために、ＣＣＫ８試薬を通常の培養培地で１：１０に希釈し、１００μｌ／ウェルを細胞に添加した。インキュベーター内で１時間インキュベートした後、８０μｌの上清を透明な平底９６ウェルプレートに移し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。吸光度値をＮＤＣに対して正規化し、これを１００％に設定して相対細胞生存率を計算した。

ウイルスパラメータの減少が細胞死の原因ではないことを確認するために細胞生存率測定値が使用され、値が１００％に近いほど毒性が低い。

ｃｃｃＤＮＡ及びＨＢＶ ＤＮＡ定量化のためのｑＲＴ－ＰＣＲ
細胞生存率決定後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ（商標）キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＡＭ１７２９）からの５０μｌ／ウェルの溶解溶液で溶解し、－８０ ^ｏＣで保存した。

ｃｃｃＤＮＡ ｑＰＣＲ分析の前に、細胞溶解物の画分をＴ５酵素（１５Ｕ／４μＬ細胞溶解物；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｍ０３６３Ｌ）で消化した。消化を３７^ｏＣで３０分間行った。

各反応に関するｃｃｃＤＮＡの定量のために、２μｌのＴ５消化細胞溶解物、０．５μｌの２０×ｃｃｃＤＮＡ＿ＤＡＮＤＲＩ Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブ（以下の表に列挙されるＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カスタム＃ＡＩ１ＲＷ７Ｎ、ＦＡＭ色素）、５μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４４４４５５７）及び２．５μｌのＤＥＰＣ処理水を用いた。技術的な三連を各サンプルに関して実行した。

細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ及び正常化対照、ヒトヘモグロビンベータ（ＨＢＢ）の定量化のために、各反応について、２μｌの未消化細胞溶解物、０．５μｌの２０×ＨＢＶ Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｐａ０３４５３４０６＿ｓ１、ＦＡＭ色素）、０．５μｌの２０×ＨＢＢ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プライマー／プローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｈｓ００７５８８８９＿ｓ１、ＶＩＣ色素）、５μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４４４４５５７）及び２μｌのＤＥＰＣ処理水を使用した。技術的な三連を各サンプルに関して実行した。

ｑＲＴ－ＰＣＲを、急速加熱ブロック（９５℃で２０秒間、次いで９５℃で１秒間及び６０℃で２０秒間を４０サイクル）の標準設定を用いてＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｋ１２ Ｆｌｅｘで実行した。

各試料についての９つ全ての生物学的及び技術的反復実験の中央値Ｃｔに対して０．９を超える差を有する値を除外することによって、データセットから外れ値を除去した。ｃｃｃＤＮＡ及び総ＨＢＶ ＤＮＡの倍数変化を、２^{－ｄｄＣＴ}法を介してＣｔ値から決定し、ハウスキーピング遺伝子としてのＨＢＢに対して正規化した。発現レベルを平均薬物なし対照試料の％として示す（すなわち、値が低いほど阻害／減少は大きくなる）。

Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡ発現を測定するためのリアルタイムＰＣＲ
Ａ１ＣＦ ＲＮＡレベル及び正常化対照の定量のために、ＧＵＳ Ｂ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＮＡ－ｔｏ－Ｃｔ（商標）１－Ｓｔｅｐキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃４３９２６５６）を使用した。各反応について、２μｌの未消化細胞溶解物、０．５μｌの２０×Ａ１ＣＦ Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｈｓ００２０５８４０＿ｍ１、ＦＡＭ染料）、０．５μｌの２０×ＧＵＳ Ｂ Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｈｓ００９３９６２７＿ｍ１、ＶＩＣ染料）、５μｌの２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ－ＰＣＲ Ｍｉｘ、０．２５μｌの４０×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ及び１．７５μｌのＤＥＰＣ処理水を使用した。技術的三連実験を各試料について行い、存在するＤＮＡによる潜在的増幅を評価するために、マイナスＲＴ対照を含めた。

ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｋ１２ Ｆｌｅｘで、４８Ｃで１５分間、９５°Ｃで１０分間、次いで、９５°Ｃで１５秒間及び６０°Ｃで６０秒間を４０サイクル実行した。

参照遺伝子ＧＵＳ Ｂ及び非トランスフェクト細胞に対して正規化された比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を使用して、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡ発現レベルを分析した。ＧＵＳ Ｂ ＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡの定量に使用したプライマーを表８に列挙する。発現レベルを平均薬物なし対照試料の％として示す（すなわち、値が低いほど阻害／減少は大きくなる）。

実施例１：ｓｉＲＮＡ処置から生じるＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞におけるＡ１ＣＦ ｍＲＮＡ、ＨＢＶ細胞内ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡの減少の測定
以下の実験では、ＨＢＶパラメータ、ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡに対するＡ１ＣＦノックダウンの効果を試験した。

ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞を、材料及び方法のセクション「ｓｉＲＮＡトランスフェクション」に記載されているように、ＤｈａｒｍａｃｏｎからのｓｉＲＮＡのプール（ＬＵ－０１３５７６－０２－０００５、表６参照）で処理した。

４日間の処理の後、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ及び細胞内ＨＢＶ ＤＮＡを、材料及び方法のセクション「Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡ発現を測定するためのリアルタイムＰＣＲ」、「ｃｃｃＤＮＡ及びＨＢＶ ＤＮＡ定量化のためのｑＲＴ－ＰＣＲ」に記載されるようにｑＰＣＲによって測定した。結果を、平均薬物なし対照試料の％として表９に示す（すなわち、値が低いほど、阻害／減少は大きくなる）。

このことから、Ａ１ＣＦ ｓｉＲＮＡプールは、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ並びにＨＢＶ ＤＮＡを非常に効率的に減少させることができることが分かる。陽性対照は、予想通り細胞内ＨＢＶ ＤＮＡを減少させたが、ｃｃｃＤＮＡに影響を及ぼさなかった。

Claims (32)

1. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の処置に使用するためのＡ１ＣＦ（ＡＰＯＢＥＣ１相補因子）阻害剤。
2. 前記ＨＢＶ感染症が慢性感染症である、請求項１に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。
3. ＨＢＶ感染細胞中のｃｃｃＤＮＡ（共有結合閉環状ＤＮＡ）の量を減少させることができる、請求項１又は２に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。
4. 前記阻害剤が、哺乳動物Ａ１ＣＦ標的配列、特にヒトＡ１ＣＦ標的配列に対して少なくとも９５％相補的、例えば完全に相補的である、少なくとも１２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む１２～６０ヌクレオチド長の核酸分子であり、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡを発現する細胞において、前記Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡの発現を減少させることができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。
5. 前記阻害剤が、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。
6. 前記哺乳動物Ａ１ＣＦ標的配列が、配列番号１、４、５、６、７、８、９、１０及び１１からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。
7. 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２の標的配列に対して少なくとも９８％相補的、例えば完全に相補的である、請求項４～６のいずれか一項に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。
8. 前記ＨＢＶ感染細胞中の前記ｃｃｃＤＮＡの量が、少なくとも６０％減少する、請求項３～７のいずれか一項に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。
9. 前記Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡが、少なくとも６０％減少する、請求項４～７のいずれか一項に記載の使用のためのＡ１ＣＦ阻害剤。
10. 哺乳動物のＡ１ＣＦ標的配列、特にヒトＡ１ＣＦ標的配列に対して９０％相補的、例えば完全に相補的である、少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む１２～３０ヌクレオチド長の核酸分子であって、Ａ１ＣＦ ｍＲＮＡの発現を阻害することができる、核酸分子。
11. 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１、４、５、６、７、８、９、１０及び１１からなる群より選択される配列に対して完全に相補的である、請求項１０に記載の核酸分子。
12. 前記核酸分子が、１２～２５ヌクレオチド長、例えば１６～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、請求項１０又は１１に記載の核酸分子。
13. 前記核酸分子が、二本鎖ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
14. 前記核酸分子が、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
15. 前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる、請求項１４に記載の核酸分子。
16. 前記核酸分子が、１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
17. 前記１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アルコキシ－ＲＮＡヌクレオシド、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡヌクレオシド、２’－アミノ－ＤＮＡヌクレオシド、２’－フルオロ－ＤＮＡヌクレオシド、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ヌクレオシド、２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシド及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、請求項１６に記載の核酸分子。
18. 前記１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、請求項１６又は１７に記載の核酸分子。
19. 前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１０～１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
20. 前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の全てが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１９に記載の核酸分子。
21. 前記核酸分子又はその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が、独立して、１～４個の２’糖修飾ヌクレオシドを含み、Ｇが、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる６個～１８個の間のヌクレオシドの領域、例えば６個～１８個の間のＤＮＡヌクレオシドを含む領域である、請求項１０～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
22. 請求項１０～２１のいずれか一項に記載の核酸分子と、前記核酸分子に共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート化合物。
23. 前記コンジュゲート部分が、三価ＧａｌＮＡｃ部分などのＧａｌＮＡｃ部分、例えば図１の三価ＧａｌＮＡｃ部分の１つ若しくは複数から選択されるＧａｌＮＡｃ部分であるか、又はそれを含む、請求項２２に記載のコンジュゲート化合物。
24. 前記コンジュゲート化合物が、少なくとも２つの連続するホスホジエステル結合を含む２～５個の連結されたヌクレオシドからなる生理学的に不安定なリンカーを含み、前記生理学的に不安定なリンカーが、前記核酸分子の５’又は３’末端に共有結合している、請求項２２又は２３に記載のコンジュゲート化合物。
25. 請求項１０～２１のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項２２～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物の薬学的に許容され得る塩。
26. 請求項１０～２１のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物、又は請求項２５に記載の薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る添加物とを含む、医薬組成物。
27. Ａ１ＣＦを発現している標的細胞におけるＡ１ＣＦ発現を阻害するためのインビボ又はインビトロ方法であって、請求項１０～２１のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物、請求項２５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項２６に記載の医薬組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
28. 疾患を処置するための方法であって、治療有効量又は予防有効量の、請求項１０～２１のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物、請求項２５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項２６に記載の医薬組成物を、疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、方法。
29. 前記疾患がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症である、請求項２８に記載の方法。
30. 薬に使用するための、請求項１０～２１のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物、請求項２５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項２６に記載の医薬組成物。
31. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症の処置に使用するための、請求項１０～２１のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物、請求項２５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項２６に記載の医薬組成物。
32. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、例えば慢性ＨＢＶ感染症の処置のための医薬の調製のための、請求項１０～２１のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物、請求項２５に記載の薬学的に許容され得る塩、又は請求項２６に記載の医薬組成物の使用。
    

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