JP7601957B2

JP7601957B2 - 皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンおよびその使用

Info

Publication number: JP7601957B2
Application number: JP2023108556A
Authority: JP
Inventors: 懐慶孫; 寧王; 涵劉; 運林裴; 川霞江; 朝万郭; 艶峰 ▲じょう▼; 湲肖
Original assignee: 広東丸美生物技術股▲フン▼有限公司
Priority date: 2023-02-14
Filing date: 2023-06-30
Publication date: 2024-12-17
Anticipated expiration: 2043-06-30
Also published as: JP2024115499A; CN116003577A; CN116003577B

Description

本発明は、スキンケアの技術分野に関し、具体的に、皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンおよびその使用に関する。

皮膚細胞内外の環境が変化すると、皮膚の防衛および修復機構が変化に適応できず、皮膚の損傷、および損傷の累積による老化状態を引き起こしている。検討によれば、ラジカルは、人体の老化を引き起こす重要な要素の１つであることが示されている。人体内に、様々なラジカル、たとえばスーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルラジカル、ＤＰＰＨラジカルなどが存在し、ラジカルは、細胞および組織の分解、代謝機能の低下を招来する恐れがある。正常な代謝以外、人体内のラジカルの濃度は、日照り、汚染、運動程度、精神状態などの要素にも影響されている。そのため、耐酸化成分を含有するスキンケア製品を用いて、多すぎるラジカルを除去し、体の退化を遅延し、皮膚の老化を抑制することができる。

シゾフィランは、スエヒロタケからの天然由来のβ－Ｄ－グルカンであり、（１－３）－結合のβ－Ｄ－ピラン型グルコース残基の主鎖および（１－６）－結合のピラン型グルコース残基の側鎖からなり、耐酸化および耐放射の能力を持っている。シゾフィランは、細胞酸化酵素系の抑制や、酸化した遷移金属イオンの錯化誘導により、ラジカルの生成を抑制することができ、ラジカルの除去、遺伝子発現の調節、およびタンパク質の合成などの手段で耐放射の作用を果たし、放射により損傷された細胞のアポトーシス時間を延長し、脂質の過酸化を抑制することができる。

コラーゲンは、生体高分子であり、動物の結合組織における主成分であり、哺乳動物の体内の含有量が最も多く、分布が最も広い機能性タンパク質でもあり、タンパク質の総量の２５～３０％を占めている。コラーゲンは、良好な生体適合性、生体分解性および生体活性を有するため、食品、医薬、組織工学（Ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）などの分野において広く適用されている。コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン分子、ＩＩＩ型コラーゲン分子、ＩＶ型コラーゲン分子、ＸＩ型コラーゲン分子などを含み、皮膚に保湿し、潤い、細胞の増殖を促進し、細胞のバリアを補強させる作用を有している。

ＣＮ１１３０５７９３２Ａは、皮膚のしわを改善するコラーゲンスキンケア製品が開示されている。この皮膚のしわを改善するコラーゲンスキンケア製品は、重量部で、活性植物５～１５部、グリセリン１０～１５部、ブチレングリコール１～２部、活性添加物７～１３部、コラーゲン５～１０部および脱イオン水３０～４０部を原料として含み、粉砕、混合、発泡撹拌、二次混合、殺菌を経由し、コラーゲンの添加、最終混合により調製された。該発明は、調製時にスキンケア製品生産設備を採用することで、生産が改善され、収集に便利であり、最終に得られたスキンケア製品がコラーゲン活性、およびコラーゲンの生産を促進する活性を有し、加齢に伴って皮膚が老化してしわが現れてきたという問題を効果的に改善することができる。

ＣＮ１０２６７０４７７Ａは、治療効果が良く、副作用がない、皮膚の欠陥を改善するコラーゲンスキンケア製品が開示されている。該スキンケア製品は、重量部で、１０～３０部の海藻（植物コラーゲン高含有）、１０～３０部のはちみつ、１～５部のビタミンＥを含む。

従って、耐酸化、抗老化、修復および保湿活性などの多重効果を備えるスキンケア製品
組成物を探索し、複数の角度から皮膚の損傷に対する修復を補強することについては、非常に有意義なものになっている。

従来技術の不足に対して、本発明は、組換えコラーゲンおよびその使用を提供し、特に皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンおよびその使用を提供することを目的とする。

その目的を達成するために、本発明は、以下の技術案をを採用する。

第１態様として、本発明は、皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンであって、前記皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示される配列を含む皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンを提供する。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列は、以下の通りである。

ＧＧＧＣＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＧＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＣＣＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＧＴＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＣＴＴＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＧＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＡＴＧＣＣＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＧＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＴＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＡ

本発明では、創造的に新規な組換えコラーゲン配列が発見される。前記皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示される配列を含み、ＳＥＱＩＤＮＯ：１でコードされたアミノ酸配列は、Ｉ型コラーゲン９５０～１０７５位アミノ酸、ＩＩＩ型コラーゲン５９４～７２９位および１１９３～１１９９位アミノ酸を含む。前記組換えコラーゲンは、保湿、皮膚のコラーゲンの補給、細胞増殖の促進、耐酸化、抗老化などの効果を有するとともに、良好な組織適合性、皮膚透過性および安全性を有する。

第２態様として、本発明は、
第１態様に記載の皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンと、シゾフィランとを含む鎮静・修復効果を有する組成物を提供する。

本発明に係る鎮静・修復効果を有する組成物は、第１態様に記載の皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンと、シゾフィランとを含み、２種の成分を組み合わせて使用し、相俟って、保湿、耐酸化、細胞増殖の促進、さらに皮膚損傷の修復の向上などの点で相乗効果を有する。

好ましくは、前記鎮静・修復効果を有する組成物は、質量部で、
０．０１～０．５部の皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンおよび０．１～５部のシゾフィランを含む。

前記皮膚鎮静・修復の組換えコラーゲンの質量部は、０．０１部、０．１部、０．２部、０．３部、０．４部または０．５部などを選択することができる。

前記シゾフィランの質量部は、０．１部、１部、２部、３部、４部または５部などを選択することができる。

上記の各数値範囲内の具体的な点値はすべて選択可能であり、ここで説明を省略する。

本発明に係る鎮静・修復効果を有する組成物は、質量部で、０．０１～０．５部の皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンおよび０．１～５部のシゾフィランを含む場合、両者を組み合わせて使用することで、皮膚損傷に対する修復効果がさらに優れる。

好ましくは、前記鎮静・修復効果を有する組成物は、保湿剤をさらに含む。

好ましくは、前記保湿剤は、グリセリン、１，３－ブタンジオール、ヒアルロン酸ナトリウム、アセチルヒアルロン酸ナトリウム、加水分解ヒアルロン酸ナトリウムまたはセラミド３のいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む。前記少なくとも２種の組合せは、グリセリンと１，３－ブタンジオールの組合せ、１，３－ブタンジオールとヒアルロン酸ナトリウムの組合せまたはヒアルロン酸ナトリウムとアセチルヒアルロン酸ナトリウムの組合せなどを含み、他の任意の組合せ形態は、いずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。

好ましくは、前記保湿剤は、グリセリンである。

本発明に係る保湿剤がグリセリンを特定選択する場合、前記皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンとシゾフィランとの組合せは、さらに、グリセリンと組み合わせて使用することができ、保湿の点でより強い相乗効果を発揮する。

好ましくは、前記鎮静・修復効果を有する組成物は、質量部で、
０．０１～０．５部の第１態様に記載の皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲン、０．１～５部のシゾフィランおよび５～５０部のグリセリンを含む。

前記皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンの質量部は、０．０１部、０．１部、０．２部、０．３部、０．４部または０．５部などを選択することができる。

前記グリセリンの質量部は、５部、１０部、１５部、２０部、２５部、３０部、３５部、４０部、４５部または５０部などを選択することができる。

好ましくは、前記シゾフィランの調製方法は、
葛根を含有する培地で、スエヒロタケを発酵培養させ、発酵培養液に対してＳｅｖａｇ法でタンパク質を除去した後、エタノール溶液を添加して発酵培養液における多糖を沈殿させ、前記シゾフィランを調製したことを含む。

本発明に係るシゾフィランは、葛根を含有する培地でスエヒロタケを発酵させることにより調製されたものである。調製されたシゾフィランは、耐酸化、細胞修復、保湿及び免疫調節などの点で効果がより顕著である。そのため、培地に葛根を添加して調製されたシゾフィランは、前記鎮静・修復効果を有する組成物の調製に用いられる場合、前記組成物の耐酸化、修復および保湿作用をさらに補強させる。

第３態様として、本発明は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記鎮静・修復効果を有する被覆体は、
マイクロカプセル材と、前記マイクロカプセル材の内部に被覆された第２態様に記載の鎮静・修復効果を有する組成物と、を含む。

本発明に係る前記鎮静・修復効果を有する被覆体は、第２態様に記載の鎮静・修復効果を有する組成物の外部にマイクロカプセル材を被覆したものである。被覆の後、前記鎮静・修復作用を有する組成物は、浸透作用がより強く、皮膚組織に用いられる場合、発揮された保湿、耐酸化、鎮静・修復などの作用もさらに補強する。

好ましくは、前記マイクロカプセル材の調製原料は、ポリグリセリル非イオン界面活性剤を含む。

好ましくは、前記ポリグリセリル非イオン界面活性剤は、ポリグリセリン－１０ジイソステアリン酸エステル、ポリグリセリン－１０ラウリン酸エステルまたはポリグリセリン－１０オレイン酸エステルのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む。前記少なくとも２種の組合せは、ポリグリセリン－１０ジイソステアリン酸エステルとポリグリセリン－１０ラウリン酸エステルとの組合せ、ポリグリセリン－１０ラウリン酸エステルまたはポリグリセリン－１０オレイン酸エステルの組合せまたはポリグリセリン－１０ジイソステアリン酸エステルとポリグリセリン－１０オレイン酸エステルとの組合せなどを含み、他の任意の組合せ形態は、いずれも選択可能であり、ここで説明を省略する。

第４態様として、本発明は、第３態様に記載の鎮静・修復効果を有する被覆体の調製方法を提供する。前記調製方法は、
ポリグリセリル非イオン界面活性剤と、第２態様に記載の鎮静・修復効果を有する組成物を混合するステップ（１）と、
ステップ（１）で調製された混合物に対して被覆支援処理を行い、前記鎮静・修復効果を有する被覆体を調製し、前記被覆支援処理は高電圧パルス電界支援処理および／または超音波支援処理を含むステップ（２）と、を含む。

本発明に係る鎮静・修復効果を有する被覆体の調製方法は、有効成分とマイクロカプセル材を混合するだけで、被覆支援処理の作用下で前記被覆体を調製できる。本方法は、調製プロセスがシンプルであり、産業的拡大を容易にする。

好ましくは、ステップ（２）における被覆支援処理は、高電圧パルス電界支援処理である。

好ましくは、前記高電圧パルス電界支援処理は、電界強度が０．５～２ｋＶ／ｃｍであり、パルス処理数が１０～６０個であり、材料の導電率が２０００～６０００μＳ／ｃｍである。

前記０．５～２ｋＶ／ｃｍのうちの具体的な数値は、０．５ｋＶ／ｃｍ、０．７ｋＶ／ｃｍ、０．９ｋＶ／ｃｍ、１．１ｋＶ／ｃｍ、１．３ｋＶ／ｃｍ、１．５ｋＶ／ｃｍ、１．７ｋＶ／ｃｍ、１．９ｋＶ／ｃｍまたは２ｋＶ／ｃｍなどを選択することができる。

前記１０～６０個のうちの具体的な数値は、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個または６０個などを選択することができる。

前記２０００～６０００μＳ／ｃｍのうちの具体的な数値は、２０００μＳ／ｃｍ、３０００μＳ／ｃｍ、４０００μＳ／ｃｍ、５０００μＳ／ｃｍまたは６０００μＳ／ｃｍなどを選択することができる。

第５態様として、本発明は、第１態様に記載の組換えコラーゲン、第２態様に記載の鎮静・修復効果を有する組成物または第３態様に記載の鎮静・修復効果を有する被覆体のスキンケア製品の調製における使用を提供する。

従来技術に対して、本発明は、以下の有益な効果を有する。

１、本発明では、前記皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示される配列を含み、ＳＥＱＩＤＮＯ：１でコードされたアミノ酸配列は、Ｉ型コラーゲン９５０～１０７５位アミノ酸、ＩＩＩ型コラーゲン５９４～７２９位および１１９３～１１９９位アミノ酸を含む。前記組換えコラーゲンは、保湿、皮膚のコラーゲンの補給、細胞増殖の促進、耐酸化、抗老化などの効果を有するとともに、良好な組織適合性、皮膚透過性および安全性を有する。

２、本発明に係る鎮静・修復効果を有する組成物は、第１態様に記載の皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンとシゾフィランとを含み、２種の成分を組み合わせて使用し、相俟って、保湿、耐酸化、細胞増殖の促進、さらに皮膚損傷に対する修復などの点で相乗作用を有する。

３、本発明に係る前記鎮静・修復効果を有する被覆体は、第２態様に記載の鎮静・修復効果を有する組成物の外部にマイクロカプセル材を被覆したものである。被覆の後、前記鎮静・修復作用を有する組成物は、浸透作用がより強く、皮膚組織に用いられる場合、発揮された保湿、耐酸化、鎮静・修復などの作用もさらに補強する。

４、本発明に係る鎮静・修復効果を有する被覆体の調製方法は、有効成分とマイクロカプセル材を混合するだけで、被覆支援処理の作用下で前記被覆体を調製できる。本方法は、調製プロセスがシンプルであり、産業的拡大を容易にする。

以下、具体的な実施形態によって、さらに本発明の技術案を説明する。当業者であれば、かかる実施例が本発明を理解するためのものに過ぎず、本発明を具体に制限するものと見なすべきではないということを理解すべきである。

本発明では、実施過程、条件、試薬、試験方法などは、以下の意図的に言及されるもの以外、すべてこの分野の普遍的知識、および公知常識であり、特に限定されたものがない。各々の実施例における具体的な条件を明記していない試験方法については、通常は、慣用条件またはメーカーから推薦された条件に応じたものである。

特に断らない限り、本明細書に用いられるすべての専門用語および科学用語は、いずれも本発明が属する分野の当業者にとって通常理解している意味と同じ意味を有する。しかし、矛盾があれば、定義を含む本発明に準じする。

下記試験におけるｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターは、ＭＡＣＫＬＩＮから購入されている。スエヒロタケは、広東省微生物研究所から購入されたスエヒロタケＧＩＭ５．４３菌株である。ＢＬ２１（ＤＥ３）化学的コンピテント細胞は、ＭＥＲＣＫから購入された、型番ＣＭＣ００１４－４Ｘ４０ＵＬのものである。

［調製例１］
本調製例は、皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲン凍結乾燥粉末を提供する。前記皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲン凍結乾燥粉末の調製方法は、以下のステップを含む。

（１）組換えプラスミドの構築：上述したＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列に応じて、発現担体の大腸菌宿主に適用するｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターを選択し、シークエンシング会社に送って合成して、組換えコラーゲン発現ベクターｐＥＴ－２８ａ－１を調製した。

（２）組換え発酵菌株の構築：ｐＥＴ－２８ａ－１発現ベクターを、化学変換法により大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））コンピテント細胞に形質転換した。アガロースゲル電気泳動により、形質転換後の平板コロニーの陽性クローン単体を選別し、選別された陽性クローン単体を２ｍＬのＬＢ培地に転移接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。培養後の菌液を、体積分率５０％のグリセリンで１倍希釈し、凍結保存チューブに分注し、－８０℃の条件下で凍結保存し、組換えコラーゲン発酵菌株を調製した。

（３）組換え発酵菌株の発酵培養：１０μＬのＬＢ組換えコラーゲン発酵菌液を固体ＬＢプレートに塗布し、３７℃のインキュベーターで１２ｈ培養した後、モノクローンを選別して、５０ｍＬの５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有量を含有するＬＢ液体培地に接種し、シェーカーに置き、３７℃、２００ｒｐｍで１４ｈ培養した。そして、１：１００の割合で２００ｍＬの５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有量を含有するＬＢ液体培地に接種し、３７℃で、菌液ＯＤ＝０．６までに培養した後、ＩＰＴＧを添加し、最終濃度が１ｍＭになって、継続して４ｈ培養した。その後、４℃、４０００ｒｐｍで、１５ｍｉｎ遠心して菌体を収集した。

（４）組換えコラーゲンの精製：菌体を超音波粉砕した後、遠心し、沈殿をＴｒｉｔｏｎＸ－１００洗浄液で洗浄し、再度遠心して上澄みを除去し、沈殿に６Ｍの塩酸グアニジンを添加し、ｐＨを８に調節し、沈澱を十分に溶解させた後、溶解液にニッケルアフィニティークロマトグラフィー樹脂を通じさせ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭの濃度勾配のイミダゾール溶液を使用して順次に溶出した。溶出液をタンパク質濃縮カラムで濃縮した後、濃縮液を収集して１晩透析した（透析袋、ＲＣ膜、１４ＫＤ、扁平幅４４ｍｍ（生工Ｆ６００１１２））。その後、ＢＣＡキットでタンパク質の濃度を検出し、５ｍｇのタンパク質当たりに体積濃度５％のマンニトール水溶液を０．５ｍＬ添加する割合でマンニトール水溶液と均一に混合した。その後、凍結乾燥機を用いて
－４０℃で１０ｍｉｎ予め凍結し、最後に－３５℃で凍結乾燥して、組換えコラーゲン凍結乾燥粉末を調製した。

［調製例２］
本調製例は、シゾフィランを提供する。前記シゾフィランの調製方法は、以下の通りである。

（１）スエヒロタケ発酵生成物の調製：スエヒロタケを、５％の細菌接種量で発酵培地に接種し、２８℃、１６０ｒｐｍの条件下で発酵した。１２０ｈ発酵した後、発酵生成物を遠心処理し、菌体および葛根粉末を除去して発酵生成物を得た。発酵培地の成分は、０．６％の葛根粉末、０．３％の酵母エキス、０．０５％の硫酸マグネシウム、０．１％のリン酸二水素カリウム、３％のグルコースおよび残量の水である。

（２）シゾフィランの調製：発酵生成物に同体積の蒸留水を添加して希釈した。希釈した後、体積分率０．５％の活性炭を添加し、８０℃の水バス処理で４０ｍｉｎ脱色させ、遠心し、濾液を４００メッシュ篩にかけて活性炭を除去し、澄み透明の発酵液を得た。発酵液は、Ｓｅｖａｇ法により、タンパク質を５回溶出した。その後、３倍体積の９５％エタノールで発酵液における多糖を沈殿させた。洗浄した後、蒸留水を添加して再溶解し、流水および蒸留水中に２４ｈ透析した。透析液を濃縮させ、凍結乾燥し、前記シゾフィランを調製した。

［調製例３］
本調製例は、シゾフィランを提供する。前記シゾフィランの調製方法は、発酵培地には葛根粉末が含まれない点だけで調製例２と異なり、他の操作はいずれも調製例２と同様である。

［実施例１］
本実施例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、以下の通りである。

（１）１部のポリグリセリン－１０ジイソステアリン酸エステル、０．５部のポリグリセリン－１０ラウリン酸エステル、０．２部の調製例１で調製された組換えコラーゲン、０．３部の調製例２で調製されたシゾフィランおよび１５部のグリセリンを混合し、１００部になるまで水を添加した。

（２）混合溶液に対して高電圧パルス電界支援処理を行った。パラメータとしては、電界強度が０．５ｋＶ／ｃｍであり、パルス処理数が１０個であり、材料の導電率が２０００μＳ／ｃｍである。処理の後、前記鎮静・修復効果を有する被覆体を得た。

［実施例２］
本実施例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、以下の通りである。

（１）１部のポリグリセリン－１０ジイソステアリン酸エステル、０．５部のポリグリセリン－１０ラウリン酸エステル、０．０１部の調製例１で調製された組換えコラーゲン、５部の調製例２で調製されたシゾフィランおよび５０部のグリセリンを混合し、１００部になるまで水を添加した。

（２）混合溶液に対して高電圧パルス電界支援処理を行った。パラメータとしては、電界強度が０．５ｋＶ／ｃｍであり、パルス処理数が２０個であり、材料の導電率が６００
０μＳ／ｃｍである。処理の後、前記鎮静・修復効果を有する被覆体を得た。

［実施例３］
本実施例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、以下の通りである。

（１）１部のポリグリセリン－１０ジイソステアリン酸エステル、０．５部のポリグリセリン－１０ラウリン酸エステル、０．５部の調製例１で調製された組換えコラーゲン、０．１部の調製例２で調製されたシゾフィランおよび５部のグリセリンを混合し、１００部になるまで水を添加した。

（２）混合溶液に対して高電圧パルス電界支援処理を行った。パラメータとしては、電界強度が２ｋＶ／ｃｍであり、パルス処理数が６０個であり、材料の導電率が２０００μＳ／ｃｍであり、処理の後、前記鎮静・修復効果を有する被覆体を得た。

［実施例４］
本実施例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、調製原料にはグリセリンが含まれず、グリセリンの質量部を割合で組換えコラーゲンおよびシゾフィランに割り当てる点だけで実施例１と異なり、他の操作はいずれも実施例１と同様である。

［実施例５］
本実施例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、調製例２で調製されたシゾフィランを調製例３で調製されたシゾフィランに置き換える点だけで実施例１と異なり、他の操作はいずれも実施例１と同様である。

［実施例６］
本実施例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、０．２部の調製例１で調製された組換えコラーゲンおよび０．３部の調製例２で調製されたシゾフィランを、０．５部の組換えコラーゲンとシゾフィランとの混合物（混合物における組換えコラーゲンとシゾフィランの割合が０．０１：５．１である）に置き換える点だけで実施例１と異なり、他の操作はいずれも実施例１と同様である。

［実施例７］
本実施例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、０．２部の調製例１で調製された組換えコラーゲンおよび０．３部の調製例２で調製されたシゾフィランを、０．５部の組換えコラーゲンとシゾフィランとの混合物（混合物における組換えコラーゲンとシゾフィランの割合が０．６：０．０５である）に置き換える点だけで実施例１と異なり、他の操作はいずれも実施例１と同様である。

［比較例１］
本比較例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、調製原料には組換えコラーゲンが含まれず、組換えコラーゲンの質量部をシゾフィランに割り当てる点だけで実施例１と異なり、他の操作はいずれも実施例１と同様である。

［比較例２］
本比較例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、調製原料にはシゾフィランが含まれず、シゾフィランの質量部を組換えコラーゲンに割り当てる点だけで実施例１と異なり、他の操作はいずれも実施例１と同様である。

［比較例３］
本比較例は、鎮静・修復効果を有する被覆体を提供する。前記被覆体の調製方法は、調製原料には、シゾフィランおよび組換えコラーゲンが含まれず、シゾフィランおよび組換えコラーゲンの質量部をグリセリンに割り当てる点だけで実施例１と異なり、他の操作はいずれも実施例１と同様である。

［試験例１］
本試験例は、各々の実施例または比較例の鎮静・修復効果を有する被覆体の耐酸化作用について評価した。具体的な評価方法は、以下の通りである。

ＤＰＰＨの消去効率を用いて実施例および比較例の耐酸化性能について評価した。具体的な評価方法は、以下の通りである。０．５ｇの被覆体をそれぞれ４ｍＬのＤＰＰＨ（１００μＭ、９９ｗｔ％のエタノール中で）溶液に浸漬し（対照群としてＤＰＰＨだけ含有する溶液を用い）、暗所で６０ｍｉｎインキュベートした。そして、紫外－可視分光光度計で混合溶液の５１７ｎｍにおける吸光度値を測定した。ＤＰＰＨ消去率＝（対照群の吸光度－試験群の吸光度）／対照群の吸光度×１００％という式で算出し、その結果を表１に示す。

表１のデータから分かるように、比較例１および比較例２は、実施例１に比較すると、調製原料にはそれぞれ組換えコラーゲンおよびシゾフィランの１種を欠いて、そのＤＰＰＨ消去率が実施例１よりも低いことから、シゾフィランおよび組換えコラーゲンの２種の成分が相俟って、ＤＰＰＨを消去する点で、予想外の相乗効果を有することが判明した。実施例５は、実施例１に比較すると、発酵培地には葛根粉末が含まれ、そのＤＰＰＨの消去率が実施例１よりも低いことから、葛根粉末の添加によりシゾフィランの生成物の耐酸化性能を補強させることが判明した。実施例６および実施例７は、実施例１に比較すると、組換えコラーゲンとシゾフィランの質量部の割合が（０．０１～０．５）：（０．１～５）の範囲ではなく、そのＤＰＰＨ消去率が実施例１よりも低いことから、組換えコラー
ゲンとシゾフィランの質量部の割合が（０．０１～０．５）：（０．１～５）の範囲である場合、この２種の成分を組み合わせて使用し、耐酸化性能がより強くなることが判明した。

［試験例２］
本試験例は、各々の実施例または比較例の鎮静・修復効果を有する被覆体の保湿作用について評価した。具体的な評価方法は、以下の通りである。

皮膚が健康な１８～４０歳のボランティアを１００人選択し、男女比が半分づつであり、ランダムに１０群に分けており、実施例および比較例に係る鎮静・修復効果を有する被覆体を用いた。ボランティアがアームを洗浄した後、２ｍｇ／ｃｍの使用量でアームの内側における直径２ｃｍの試験領域に均一に塗布し、１日当たり１回、３０日間連続して使用した。皮膚試験装置（ＭＣ７５０、ドイツＣＫ）によってボランティアの使用前および使用後の皮膚含水量を測定した。

使用前、および３０日間連続して使用した後、それぞれ各被験者の皮膚含水量を測定し、データ当たり３回測定し、各群の平均値を算出し、皮膚含水量の変化率＝（３０日間使用後の皮膚含水量－使用前の皮膚含水量）／使用前の皮膚含水量×１００％という式に従って皮膚含水量の変化率を算出し、測定結果を表２に示す。

表２のデータから分かるように、比較例１および比較例２は、実施例１に比較すると、調製原料にはそれぞれ組換えコラーゲンおよびシゾフィランの一種を欠いて、その皮膚含水量の変化率が実施例１よりも低いことから、シゾフィランおよび組換えコラーゲンの２種の成分が相俟って、前記被覆体の保湿作用が補強可能となることが判明した。実施例４および比較例３は、実施例１に比較すると、前記鎮静・修復効果を有する被覆体の調製原料にはそれぞれグリセリンまたは組換えコラーゲンおよびシゾフィランの組合せを欠いて、その皮膚含水量の変化率がいずれも実施例１よりも低いことから、グリセリン、組換え
コラーゲンおよびシゾフィランの三つものを組み合わせて使用し、相俟って、皮膚保湿作用を向上させる点で予想外の相乗効果を有することが判明した。

［試験例３］
本試験例は、調製例１の組換えコラーゲン、各々の実施例または比較例の鎮静・修復効果を有する被覆体の細胞増殖効果について評価した。具体的な評価方法は、以下の通りである。

成長状態が良好なＨａＣａＴ細胞（ヒト不死化角化細胞）を取り、９６ウェルプレートに播いて１７ｈ培養した後、無血清基本培地へ交換し、７ｈ培養した後、旧い培地を捨てて、１％の組換えコラーゲン水溶液、または各実施例または比較例で調製された被覆体溶液（被覆体の培地における濃度が２μｇ／ｍＬである）を含有する培地に添加した。ブランクは、培地には被覆体を含まない以外、試験群と一致した。４８ｈ培養した後、ＣＣＫ８法により、細胞生存率を検出し（６３０ｎｍを基準波長として、波長４５０ｎｍで吸光度値を測定し）、データ当たり３回測定し、各群の平均値を算出した。相対細胞増殖率＝（試験群の吸光度－ブランクの吸光度）／ブランクの吸光度×１００％という式に従って相対細胞増殖率を算出した。

表３のデータから分かるように、調製例１の組換えコラーゲンは、優れた細胞増殖促進効果を有する。また、比較例１および比較例２は、実施例１に比較すると、調製原料にはそれぞれ組換えコラーゲンおよびシゾフィランの１種を欠いて、その相対細胞増殖率が実施例１よりも低いことから、シゾフィランおよび組換えコラーゲンの２種の成分が相俟って、細胞増殖の促進の点で予想外の相乗効果を有することが判明した。実施例５は、実施例１に比較すると、発酵培地には葛根粉末が含まれ、その相対細胞増殖率が実施例１よりも低いので、葛根粉末の添加により、シゾフィランの細胞増殖の促進能力を補強させることが判明した。

［試験例４］
本試験例は、各実施例または比較例の鎮静・修復効果を有する被覆体の皮膚鎮静・修復について評価した。具体的な評価方法は、以下の通りである。

（１）モルモットを６６匹取り、雌雄が半分づつであった。試験の１ｄ前に右後足の毛を剃り落とし、脱毛面積が約２ｃｍ^２であった。モルモットをランダムに１１群に分け、各群に６匹のモルモットを含み、それぞれ実施例１～７群、比較例１～３群およびブランクと表記した。

（２）１日当たり１回で、実施例１～７群、比較例１～３群およびブランクのモルモットに対して、２ｄ連続して、脱毛箇所にそれぞれ実施例または比較例で調製された被覆体溶液を０．０５ｇ塗布し、ブランクに対して、等量の脱イオン水を塗布した。

（３）試験の３日目、生理食塩水で、それぞれ、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）および０．１％（ｗ／ｖ）のリン酸ヒスタミン溶液を調製した。粗いサンドペーパーで、モルモットの右後足の裏の脱毛箇所を擦傷し、擦傷面積が約１ｃｍ^２であった。さらに、対応する被覆体溶液を局部に１回塗布し、塗布量が０．０５ｇであった。ブランクに対して、等量の脱イオン水を塗布し、１０ｍｉｎ後に、擦傷箇所に０．０１％（ｗ／ｖ）のリン酸ヒスタミン溶液を０．０５ｍＬ滴下した。モルモットが３ｍｉｎ以内に振り返って右後足を舐めるか否かを観察した。現れなかった場合、継続して擦傷箇所に０．０２％（ｗ／ｖ）のリン酸ヒスタミン溶液を０．０５ｍＬ滴下し、モルモットが３ｍｉｎ以内に振り返って右後足を舐めるか否かを観察した。このように、モルモットが３ｍｉｎ以内に右後足を舐めったまで、３ｍｉｎおきに上記勾配に応じて濃度を増加し、毎回リン酸ヒスタミン溶液を０．０５ｍＬ滴下した。この際に滴下したリン酸ヒスタミンの累計総量を痒み閾値（μｇ）とし、同一群におけるモルモットの痒み閾値の平均値および痒み閾値の差異率を算出し、痒み閾値の差異率＝（試験群の痒み閾値－ブランクの痒み閾値）／ブランクの痒み閾値×１００％、その結果を表４に示す。

表４のデータから分かるように、痒み閾値が高いほど、対応の皮膚バリア作用、即ち、被覆体溶液の鎮静・修復能力が強くなった。実施例４および比較例３は、実施例１に比較すると、前記鎮静・修復効果を有する被覆体の調製原料には、それぞれグリセリンまたは組換えコラーゲンおよびシゾフィランの組合せを欠いて、その痒み閾値の差異率がいずれも実施例１よりも低いことから、グリセリン、組換えコラーゲンおよびシゾフィランの三つものが組み合わせて使用されて、相俟って、皮膚の鎮静・修復の点で予想外の相乗効果を有することが判明した。比較例１および比較例２は、実施例１に比較すると、調製原料には、それぞれ組換えコラーゲンおよびシゾフィランの１種を欠いて、その痒み閾値の差異率がいずれも実施例１よりも低いことから、シゾフィランおよび組換えコラーゲンの２種の成分が相俟って、前記被覆体のかゆみ止め・修復作用を向上させることができることが判明した。実施例５は、実施例１に比較すると、発酵培地には葛根粉末が含まれ、その痒み閾値の差異率が実施例１よりも低いことから、葛根粉末の添加によりシゾフィランの生成物の耐酸化性能を向上させて、皮膚のバリア作用を向上させることができることが判明した。実施例６および実施例７は、実施例１に比較すると、組換えコラーゲンとシゾフィランの質量部の割合が（０．０１～０．５）：（０．１～５）の範囲ではなく、その痒み閾値の差異率が実施例１よりも低いことから、組換えコラーゲンとシゾフィランの質量部の割合が（０．０１～０．５）：（０．１～５）の範囲である場合、２種の成分を組み合わせて使用し、皮膚の鎮静・修復機能がより強くなることが判明した。

［試験例５］
実施例で調製された鎮静・修復効果を有する被覆体について安全性評価を行った。具体的な評価方法は以下の通りである。《化粧品安全技術規範２０１５版》における第７章の人体安全性検出方法中の人体皮膚パッチテスト方法に従って試験を行った。（１）１８～６０歳の試験要求に満たす女性のボランティアを選択したが、排除標準は、（ａ）最近１週間に抗ヒスタミン薬を使用したか、または最近１ヶ月以内に免疫抑制剤を使用したもの、（ｂ）最近２ヶ月以内にテスト部位にいずれの抗炎症薬を使用したもの、（ｃ）炎症性皮膚病を罹患した被験者は臨床上で治癒されていないもの、（ｄ）インスリン依存型糖尿
病患者、（ｅ）治療されている喘息または他の慢性呼吸器疾患患者、（ｆ）最近６ヶ月以内に抗癌化学療法を受けたもの、（ｇ）免疫不全または自己免疫疾患患者、（ｈ）哺乳期または妊娠期の女性、（ｉ）両側の乳房を切除した、及び両側の腋下リンパ節を切除したもの、（ｎ）皮膚の被験部位における瘢痕、色素、萎縮、紅斑または他の瑕疵により試験結果に影響されたと判定したもの、（ｏ）ほかの臨床試験研究に参与したもの、（ｐ）体質が極めて敏感なもの、（ｑ）非ボランティアまたは試験要求に従って所定の内容を完成できないものである。（２）各実施例あたり１群に対応し、群ごとにボランティアが１０人いて、面積が５０ｍｍ^２超えず、深さが約１ｍｍの合格パッチテスト装置を選用し、各実施例で調製された被覆体溶液をパッチテスト装置のセルに投入し、使用量が約０．０２５ｇである。ブランクとして対照ウェルには何も入れない。テストサンプルを添加したパッチテスト装置用の低感作性テープを被験者の背中または前腕側に付け、手のひらで軽く押圧して皮膚に均一に付けさせて、２４ｈ維持した。（３）テストサンプルパッチテスト装置を除去した後の３０ｍｉｎ（圧痕がなくなった後）、２４ｈおよび４８ｈで、表５に示す標準に基づいて皮膚の反応を観察した。表５に示す標準に応じて評価を行った。

結果から分かるように、本発明で調製された製品は、安全で、刺激がなく、より高い使用価値を有した。

本発明は上記実施例によって本発明の調製プロセスを説明したが、本発明は上記実施例に限られるものではない、即ち、本発明は上記実施例によって実施しなければならないものではないと出願人は声明する。当業者にとって、本発明に対する如何なる改良、本発明の製品の各原料への等価置換及び補助成分の追加、具体的な実施形態の選択等はいずれも本発明の保護範囲及び開示範囲に入ることが明瞭である。

以上、本発明の好適な実施形態を詳しく説明したが、本発明は、上記実施形態における具体的なディテールに限定されない。本発明の技術的構想範囲内で、本発明の技術案に対して複数種の簡単な変形を行うことができ、これらの簡単な変形は、いずれも本発明の保
護範囲に属するものである。

なお、上記の具体的な実施形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾しない場合、任意の適切な形態で組み合わせることができる。不必要な繰り返しを回避するために、本発明では、別途に各種の可能な組合せ形態について説明しない。

Claims

皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンと、シゾフィランと、を含み、
前記皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１で示される配列である、
ことを特徴とする鎮静・修復効果を有する組成物。
前記鎮静・修復効果を有する組成物は、質量部で
０．０１～０．５部の皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲンと、０．１～５部のシゾフィランと、を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の鎮静・修復効果を有する組成物。
前記鎮静・修復効果を有する組成物は、さらに保湿剤を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の鎮静・修復効果を有する組成物。
前記保湿剤は、グリセリン、１，３－ブタンジオール、ヒアルロン酸ナトリウム、アセチルヒアルロン酸ナトリウム、加水分解ヒアルロン酸ナトリウムまたはセラミド３のいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、
ことを特徴とする請求項３に記載の鎮静・修復効果を有する組成物。
前記保湿剤は、グリセリンである、
ことを特徴とする請求項４に記載の鎮静・修復効果を有する組成物。
前記鎮静・修復効果を有する組成物は、質量部で、
０．０１～０．５部の皮膚の鎮静・修復用の組換えコラーゲン、０．１～５部のシゾフィラン、および５～５０部のグリセリンを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の鎮静・修復効果を有する組成物。
前記シゾフィランの調製方法は、
葛根を含有する培地でスエヒロタケを発酵培養させ、発酵培養液に対してＳｅｖａｇ法でタンパク質を除去した後、エタノール溶液を添加して発酵培養液における多糖を沈殿させ、遠心して前記シゾフィランを調製したことを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の鎮静・修復効果を有する組成物。
マイクロカプセル材と、前記マイクロカプセル材の内部に被覆された請求項１～７のいずれか一項に記載の鎮静・修復効果を有する組成物と、を含む、
ことを特徴とする鎮静・修復効果を有する被覆体。
前記マイクロカプセル材の調製原料は、ポリグリセリル非イオン界面活性剤を含む、
ことを特徴とする請求項８に記載の鎮静・修復効果を有する被覆体。
前記ポリグリセリル非イオン界面活性剤は、ポリグリセリン－１０ジイソステアリン酸エステル、ポリグリセリン－１０ラウリン酸エステルまたはポリグリセリン－１０オレイン酸エステルのいずれか１種または少なくとも２種の組合せを含む、
ことを特徴とする請求項９に記載の鎮静・修復効果を有する被覆体。
ポリグリセリル非イオン界面活性剤と、請求項１～７のいずれか一項に記載の鎮静・修復効果を有する組成物を混合するステップ（１）と、
ステップ（１）で調製された混合物に対して被覆支援処理を行い、前記鎮静・修復効果を有する被覆体を調製し、前記被覆支援処理は、高電圧パルス電界支援処理および／または超音波支援処理を含む、ステップ（２）と、を含む、
ことを特徴とする請求項８に記載の鎮静・修復効果を有する被覆体の調製方法。
ステップ（２）に記載の被覆支援処理は、高電圧パルス電界支援処理である、
ことを特徴とする請求項１１に記載の鎮静・修復効果を有する被覆体の調製方法。
前記高電圧パルス電界支援処理は、電界強度が０．５～２ｋＶ／ｃｍであり、パルス処理数が１０～６０個であり、材料の導電率が２０００～６０００μＳ／ｃｍである、
ことを特徴とする請求項１１に記載の鎮静・修復効果を有する被覆体の調製方法。
請求項１に記載の鎮静・修復効果を有する組成物の、スキンケア製品の調製における使用。
請求項８に記載の鎮静・修復効果を有する被覆体の、スキンケア製品の調製における使用。