CN103102407A

CN103102407A - 基因重组人胶原蛋白

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Publication number: CN103102407A
Application number: CN2013100332996A
Authority: CN
Inventors: 梁亮
Original assignee: XI'AN ELAGEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Chuangjian Medical Technology Co ltd
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: CN103102407B

Abstract

一种由真核菌生产的人源化基因重组人胶原蛋白，全长474个氨基酸，由两段完全相同的人Ⅲ型胶原片段串联而成，C端连接6个组氨酸残基作为特异性亲和纯化标记。基因重组人胶原蛋白性能优于动物胶原蛋白、原核工程菌重组胶原；带有特异性亲和纯化标记，易于得到高纯度产品。

Description

基因重组人胶原蛋白

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组胶原蛋白及其生产方法。

背景技术

胶原蛋白是一种生物高分子物质，是维持肌肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要物质。主要存在于人和动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织中重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原蛋白对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增加循环，达到滋润皮肤延缓老化，美容，消皱，养发的目的。

生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱或酶来处理动物组织（猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮/鳞等），从中提取胶原蛋白。这些方法虽然成本低廉、回收率较高，但是制取的胶原蛋白均为分子量很小且长度不等的混合胶原蛋白肽段，俗称明胶，很难起到保湿、滋养的效果；提取工艺简单粗放，产物纯度不佳，常有异味；动物来源，无法摆脱生物安全隐患，极大的限制了传统胶原在化妆品、食品、药品等各类产品中的广泛应用；加工提取时产生巨量废水严重伤害环境；技术门椹低，原料来源不易控制，造成皮鞋奶、毒胶囊横行，食品、药品安全隐患严重。

为了解释传统动物胶原的一系列问题，许多学者开始着手应用生物技术来生产重组胶原，因微生物培养的种种便利，利用重组微生物生产胶原逐渐成为主流。产业化生产的，如范代娣应用大肠杆菌高密度发酵培养生产的重组类人胶原蛋白，并已成功应用到化妆品领域。但是细菌表达体系具有内毒素、热原等生物安全问题，使得产品的生产、检测成本高企，并存在隐患；表达的蛋白以包涵体形式存在细菌细胞内，产物纯化困难、回收率受限制；另外原核表达系统比较低级，不能完成表达产物的翻译后加工修饰，使产物不具有生物活性。

因此，越来越多的学者开始利用真核微生物生产重组胶原：张凤龙等利用毕赤酵母合成几乎完全人源性的重组胶原，应用于化妆品。但其纯化方法仅采用了超滤、凝胶过滤、离子交换等传统非特异性的大分子分离技术，纯度不够高，杂蛋白和部分降解蛋白无法彻度去除，满足不了微创美容、整形美容对纯度的更高要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有重组胶原及其制备技术的不足，提供一种真核工程菌生产的完全人源化的重组胶原，其性能远优于动物胶原蛋白、原核微生物重组胶原；同时带有特异性亲和纯化标记，易于得到高纯度产品。

基因重组人胶原蛋白全长474个氨基酸，由两段完全相同的人Ⅲ型胶原片段串联而成，C末端连接6个组氨酸残基，其序列（SEQ ID NO.1）如下：

AGNTGAPGSP　GVSGPKGDAG　QPGEKGSPGA　QGPPGAPGPL　GIAGITGARG　50 LAGPPGMPGP　RGSPGPQGVK　GESGKPGANG LSGERGPPGP　QGLPGLAGTA　100 GEPGRDGNPG　SDGLPGRDGS　PGGKGDRGEN　GSPGAPGAPG　HPGPPGPVGP　150 AGKSGDRGES　GPAGPAGAPG　PAGSRGAPGP QGPRGDKGET　GERGAAGIKG　200 HRGFPGNPGA　PGSPGPAGQQ　GAIGSPGPAE FTAGNTGAPG　SPGVSGPKGD　250 AGQPGEKGSP　GAQGPPGAPG　PLGIAGITGA RGLAGPPGMP　GPRGSPGPQG 300

VKGESGKPGA　NGLSGERGPP　GPQGLPGLAG　TAGEPGRDGN　PGSDGLPGRD　350 GSPGGKGDRG　ENGSPGAPGA　PGHPGPPGPV　GPAGKSGDRG　ESGPAGPAGA　400 PGPAGSRGAP　GPQGPRGDKG　ETGERGAAGI　KGHRGFPGNP　GAPGSPGPAG 　450 QQGAIGSPGP　ADHHHHHHTG　LARF 　　 474

蛋白为单链结构，其中1～229和233～461为相同的Ⅲ型胶原肽段，两段人Ⅲ型胶原蛋白片段之间有EFT连接，233～461的人Ⅲ型胶蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF进行修饰，其中463～468为亲和纯化标记6His。

生产上述蛋白的基因重组工程菌及蛋白制备方法由下述步骤组成：

（一）、重组表达载体的构建

从人新鲜胎盘中提取总RNA，反转录为cDNA，根据GenBankⅢ型人胶原蛋白COL3A1基因序列，设计PCR扩增引物F（SEQ ID NO.2）、R（SEQ ID NO.3）：

F: GAATCTGTGAATCATGCCCTAC

R: GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT

以cDNA为模版PCR扩增COL3A1基因，产物长度为3295bp。回收特异性产物连接于pGM-T载体，得到质粒pGM-T- COL3A1；

依照《分子克隆实验指南》中多重PCR的方法，以pGM-T- COL3A1质粒为模板，使用引物F1、F2、R进行多重PCR扩增，得到产物为722bp的产物COL3，引物为：

（SEQ ID NO.4）F1:AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG

（SEQ ID NO.5）F2:TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT

（SEQ ID NO.6）R: TTGAATTCTGCAGGTCCTGG

将产物COL3和载体pPIC9K分别做EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为pPIC9K-COL3；

以质粒pPIC9K-COL3为模板，设计引物，再次扩增COL3，同时添加6His标记。引物为：

（SEQ ID NO.7）F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC

（SEQ ID NO.8）R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG

将二次扩增产物COL3-6His和质粒pPIC9K-COL3分别进行EcoRⅠ、AgeⅠ双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为pPIC9K-COL3-COL3-6His。目标蛋白的基因序列如下：

1 GCGGGTAACA CTGGTGCTCC TGGCAGCCCT GGAGTGTCTG GACCAAAAGG

51 TGATGCTGGC CAACCAGGAG AGAAGGGATC GCCTGGTGCC CAGGGCCCAC

101 CAGGAGCTCC AGGCCCACTT GGGATTGCTG GGATCACTGG AGCACGGGGT

151 CTTGCAGGAC CACCAGGCAT GCCAGGTCCT AGGGGAAGCC CTGGCCCTCA

201 GGGTGTCAAG GGTGAAAGTG GGAAACCAGG AGCTAACGGT CTCAGTGGAG

251 AACGTGGTCC CCCTGGACCC CAGGGTCTTC CTGGTCTGGC TGGTACAGCT

301 GGTGAACCTG GAAGAGATGG AAACCCTGGA TCAGATGGTC TTCCAGGCCG

351 AGATGGATCT CCTGGTGGCA AGGGTGATCG TGGTGAAAAT GGCTCTCCTG

401 GTGCCCCTGG CGCTCCTGGT CATCCAGGCC CACCTGGTCC TGTCGGTCCA

451 GCTGGAAAGA GTGGTGACAG AGGAGAAAGT GGCCCTGCTG GCCCTGCTGG

501 TGCTCCCGGT CCTGCTGGTT CCCGAGGTGC TCCTGGTCCT CAAGGCCCAC

551 GTGGTGACAA AGGTGAAACA GGTGAACGTG GAGCTGCTGG CATCAAAGGA

601 CATCGAGGAT TCCCTGGTAA TCCAGGTGCC CCAGGTTCTC CAGGCCCTGC

651 TGGTCAGCAG GGTGCAATCG GCAGTCCAGG ACCTGCAGAA TTCACTGCGG

701 GTAACACTGG TGCTCCTGGC AGCCCTGGAG TGTCTGGACC AAAAGGTGAT

751 GCTGGCCAAC CAGGAGAGAA GGGATCGCCT GGTGCCCAGG GCCCACCAGG

801 AGCTCCAGGC CCACTTGGGA TTGCTGGGAT CACTGGAGCA CGGGGTCTTG

851 CAGGACCACC AGGCATGCCA GGTCCTAGGG GAAGCCCTGG CCCTCAGGGT

901 GTCAAGGGTG AAAGTGGGAA ACCAGGAGCT AACGGTCTCA GTGGAGAACG

951 TGGTCCCCCT GGACCCCAGG GTCTTCCTGG TCTGGCTGGT ACAGCTGGTG

1001　AACCTGGAAG AGATGGAAAC CCTGGATCAG ATGGTCTTCC AGGCCGAGAT

1051 　GGATCTCCTG GTGGCAAGGG TGATCGTGGT GAAAATGGCT CTCCTGGTGC

1101 　CCCTGGCGCT CCTGGTCATC CAGGCCCACC TGGTCCTGTC GGTCCAGCTG

1151 　GAAAGAGTGG TGACAGAGGA GAAAGTGGCC CTGCTGGCCC TGCTGGTGCT

1201 　CCCGGTCCTG CTGGTTCCCG AGGTGCTCCT GGTCCTCAAG GCCCACGTGG

1251 　TGACAAAGGT GAAACAGGTG AACGTGGAGC TGCTGGCATC AAAGGACATC

1301 　GAGGATTCCC TGGTAATCCA GGTGCCCCAG GTTCTCCAGG CCCTGCTGGT

1351 　CAGCAGGGTG CAATCGGCAG TCCAGGACCT GCAGATCACC ACCACCACCA

1401 　CCACACCGGT　CTTGCTAGAT　TC　　　　　　　　　　　（SEQ ID NO.9）。

（二）基因重组工程菌毕赤酵母的构建

将制备得到的pPIC9K-COL3-COL3-6His用限制性内切酶SalⅠ线性化，并制备毕赤酵母SMD1168（Invitrogen）感受态细胞，电击转化pPIC9K-COL3-COL3-6His质粒。以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，得到毕赤酵母基因工程菌（已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO. 7189，保藏日期：2013年1月21日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：巴斯德比赤酵母 Pichia pastoris）。

（三）制备基因重组人胶原蛋白

用BMGY培养基于30℃ 250rpm培养毕赤酵母基因工程菌16~18小时，OD₆₀₀=2～6；室温下1500g～3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD₆₀₀=1.0左右，将所得的菌液置于500mL的三角瓶中，用双层纱布封口，于30℃ 250rpm继续生长；每24小时向培养基中添加甲醇至终浓度为1%开始诱导培养，直到100小时以上。发酵培养结束后，离心收集上清，在非变性条件下用Ni-NTA His Bands树脂（Merck）吸附重组胶原，漂洗流出杂质，最后再洗脱重组胶原，收集洗脱液。洗脱液经超滤系统（PALL）脱盐、浓缩。浓缩液经冷冻干燥制得基因重组人胶原蛋白。

作为化妆品的功能性原料，基因重组人胶原蛋白在化妆品中的使用方法说明如下：

称取基因重组人胶原蛋白冻干粉，按1mg：1mL比例加入5%甘露醇，充分溶解后，过滤除菌，无菌条件下每1mL分装灌入3mL无菌西林瓶中，半盖无菌胶塞，真空冷冻干燥后，轧铝盖，制成基因重组人胶原蛋白导入冻干粉。另配制0.05%透明质酸溶液，过滤除菌，无菌条件下灌装入3mL无菌西林瓶中，盖无菌胶塞，轧铝盖，制成冻干粉溶剂。美容院使用时，用一次性无菌注射器抽出全部溶剂，注入冻干粉瓶中，摇匀使充分溶解，然后再抽出溶液配合导入仪器使用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1. 相比较传统胶原，完全人源化的基因重组人胶原蛋白避免了动物胶原带来的免疫排斥反应，杜绝了生物安全隐患，工艺过程对环境友好；

2. 相比较现有来自原核工程菌的胶原，基因重组人胶原蛋白无内毒素隐患；

3. 相比较现有来自真核工程菌的胶原，基因重组人胶原蛋白携带特异性亲和纯化标记，纯化步骤简单，产物纯度很高，满足微创、整形美容产品使用。

附图说明

图1为载体pPIC9K-COL3-COL3-6His构建技术路线图。

图2为重组毕赤酵母表达基因重组人胶原蛋白的电泳图。

具体实施方式

实施例1

基因重组人胶原蛋白全长474个氨基酸，由两段完全相同的人Ⅲ型胶原片段串联而成，末端连接6个组氨酸残基，其序列（SEQ ID NO.1）如下：

制备方法如下：

1. 重组表达载体的构建

1.1. RNA提取（参照TaKaRa公司RNAiso Plus试剂说明书）

(1) 称取经超低温冻结的人新鲜胎盘组织约50mg，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；

(2) 向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状；

(3) 将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟；

(4) 12,000g 4℃离心5分钟；

(5) 吸取上清液，移入新的离心管中；

(6) 加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，剧烈振荡15秒。待溶液充分乳化后，再室温静置5分钟；

(7) 12,000g 4℃离心15分钟。吸取上清液转移至另一新的离心管中；

(8) 加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟；

(9) 12,000g 4℃离心10分钟；

(10) 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇lml，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇；

(11) 室温干燥沉淀2～5分钟，加入适量的RNase-free水溶解沉淀,完全溶解后于-80℃保存。

1.2. 反转录（参照TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit说明书）

(1) 在Microtube管中配制下列混合液：

试剂使用量

dNTP Mixture（10 mM each） 1μL

Random 6 mers（20 μM） 1μL

Template RNA 5μL

RNase Free dH2O 补足到10μL

(2) 在PCR仪上进行变性、退火反应：65℃ 5min，冰上冷却；

(3) 离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部；

(4) 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：

试剂使用量

上述变性、退火后反应液 10μL

5×PrimeScript Buffer 4μL

RNase Inhibitor（40 U/μL） 0.5μL

PrimeScript RTase 0.5 μL

RNase Free dH2O 5 μL

(5) 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：30℃ 10min、42℃ 30min、70℃ 10min，冰上冷却。

1.3. 扩增COL3A1基因（参照TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit说明书）

根据GenBankⅢ型人胶原蛋白COL3A1基因序列，设计PCR扩增引物F、R：

F: GAATCTGTGA ATCATGCCCT AC （SEQ ID NO.2）

R: GAAGTCATAA TCTCATCGGT GTT （SEQ ID NO.3）

按下列组成配制PCR反应液：

试剂使用量

10×PCR Buffer Ⅱ 5μL

dNTP Mixture（10 mM each） 2μL

引物F 0.5μL

引物R 0.5μL

TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μL） 0.5 μL

上述的反转录反应液 ≤5 μL

RNase Free dH2O 补足到50 μL

反应条件分别为：95℃ 5min——（94℃ 30S——60℃ 30S——72℃ 2.5min）30cycles——72℃ 10min——4℃ 10min。

1.4. 制备pGMT-COL3A1质粒

利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TaKaRa公司Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit），按产品说明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶上回收3295bp的特异性条带COL3A1。按天根生化pGM-T克隆试剂盒说明书，连接COL3A1于pGM-T载体上，转化感受态E.coli DH 5α，涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆接种于10mL LB培养基中，37℃振荡过夜培养。得到质粒pGM-T-COL3A1。

1.5. 双酶切COL3

(1) 依照《分子克隆实验指南》中多重PCR的方法，以pGM-T-COL3A1质粒为模板，使用引物F1、F2、R进行多重PCR扩增，得到产物为722bp的产物COL3，引物为：

（SEQ ID NO.4）F1:AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG

（SEQ ID NO.5）F2:TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT

（SEQ ID NO.6）R: TTGAATTCTGCAGGTCCTGG

反应体系为：

试剂使用量

10×Reaction Buffer 5μL

dNTP Mixture (10 mM each) 2.0μL

pGM-T-COL3A1 5μL

Primer F1/F2 (20μM) 各0.5μL

Primer R (20μM) 1μL

Taq 酶 0.5μL

ddH₂O 补足50μL

反应条件为：

95℃ 5 min——（94℃ 30 S——60℃ 30 S——72℃ 40S）30 cycles－—72℃ 10 min

(2) 利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TaKaRa公司Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit），按产品说明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶上回收722bp的特异性条带COL3；

(3) 回收后的COL3按如下体系37℃水浴消化1.5～2.0h进行双酶切：

试剂使用量

10×buffer 20μL

COL3(150ng/μL) 40μL

EcoRⅠ 5μL

XhoⅠ 5μL

ddH₂O 补足200μL

终止反应前先取出5μL 以0.7%琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全；

(4) 利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TaKaRa公司Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit），按产品说明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶上回收酶切条带，-20℃保存待用。

1.6. 构建pPIC9K-COL3质粒

(1) 取冷冻的DH5α 感受态细胞一管，放于冰上解冻，立即加入质粒pPIC9K（≦50ng），手指轻弹使其混合，在冰中放置30 分钟；

(2) 42℃水浴热激恰好90 秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1–2 分钟；

(3) 加入800μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃温育50分钟；

(4) 吸取100-200μL菌液，涂于含有卡那霉素（50μg/mL）的固体LB平板上；

(5) 37℃培养箱，倒置培养12－18小时；

(6) 挑选单菌落接种于含有卡那霉素（50μg/mL）的液体LB培养基中，37℃，150rpm摇床培养过夜，之后利用质粒提取试剂盒操作说明，进行pPIC9K的质粒大量提取；

(7) 按以下体系大量双酶切pPIC9K：

试剂使用量

10×buffer 20μL

pPIC9K (200ng/μL) 35μL

XhoⅠ 5μL

EcoRⅠ 5μL

ddH₂O 补足200μL

(8) 按胶回收试剂盒（TaKaRa公司Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit），产品说明书，回收酶切条带；

(9) 按如下体系混合，将双酶切的COL3和pPIC9K在16℃下连接2小时：

试剂使用量

COL3(100 ng/μL) 11μL

pPIC9K (200ng/μL) 5μL

buffer 2μL

T4 DNA连接酶 2μL

(10) 连接产物按上述步骤(1)～(6)制备大量pPIC9K-COL3质粒，-20℃保存待用。

1.7. 制备COL3-6His

(1) 以质粒pPIC9K-COL3为模板，设计引物，再次扩增COL3，同时添加6His标记。引物为：

F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC（SEQ ID NO.7）

R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG（SEQ ID NO.8）

反应体系为：

试剂使用量

10×Reaction Buffer 5μL

dNTP Mixture (10 mM each) 1.0μL

pPIC9K-COL3 1μL

Primer F (20μM) 1μL

Primer R (20μM) 1μL

Taq酶 1μL

ddH₂O 补足50μL

反应条件为：

94℃ 5 min——（94℃ 30 S——55℃ 30 S——72℃ 1min）30 cycles——72℃ 10 min

(2) 利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TaKaRa公司Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit），按产品说明书，从琼脂糖凝胶上回收特异性条带COL3-6His。

1.8. 制备pPIC9K-COL3-COL3-6His质粒

(1) 将COL3-6His和质粒pPIC9K-COL3分别按以下体系用 EcoRI 和AgeI大量双酶切：

试剂使用量

10×buffer 20μL

COL3-6His 或pPIC9K-COL3 (200ng/μL) 35μL

AgeI 5μL

EcoRⅠ 5μL

ddH₂O 补足200μL

回收目的片段，按如下体系连接成为pPIC9K-COL3-COL3-6His质粒：

试剂使用量

pPICK9-COL3 0.5μL

COL3-6His 5μL

Buffer 1μL

T4连接酶 0.5μL

ddH₂O 补足10μL

(2) 按1.6中(1)～(6)的步骤大量制备pPIC9K-COL3-COL3-6His质粒，-20℃保存待用。

2. 重组毕赤酵母工程菌的构建

2.1. pPIC9K-COL3-COL3-6His质粒的线性化

取限制性内切酶SalⅠ10μL，pPIC9K-COL3-COL3-6His质粒20μg左右，加入100μL buffer H，加水补足到1000μL后混匀，37℃水浴消化5h，终止反应前先取出5μL反应液，以0.7%琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全，酶切完全后，用质粒提取试剂盒对线性化质粒进行质粒提取。

2.2. 毕赤酵母（SMD1168）感受态细胞的制备

（1）挑取酵母单菌落，接种至含有5mL YPD培养基试管中，30℃、250rpm 培养过夜；

（2）取50μL 的培养物接种至含有50mL 新鲜培养基的300mL 三角瓶中，28~30℃、250rpm培养过夜，至OD₆₀₀ 值达到1.1-1.3；

（3）将培养物于4℃，1500g离心5min，用50mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

（4）按步骤（3）离心，用25mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

（5）按步骤（3）离心，用20mL的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

（6）按步骤（3）离心，用0.3mL 的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为0.5mL；

（7）每80μL分装一份，-70℃保存。

2.3. 毕赤酵母的电转化

（1）用无水乙醇冲洗电转化杯三遍，于灭过菌的超净台中晾干残余乙醇；

（2）将电转化杯转至冰中预冷10 分钟；

（3）将5~20μg 的线性化pPIC9K-COL3-COL3-6His质粒溶解在5~10μL灭菌双蒸水中，与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中；

（4）电击，电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击时间为4~10mSec；

（5）电击完毕后，加入1mL 冰预冷的1mol/L 的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL 离心管中；

（6）将菌体悬液涂布于MD 平板上，每100μL~200μL涂布一块平板。

2.4. 多拷贝插入重组子的筛选

（1）在生长有转化子的MD平板表面加入2mL灭菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器在His+转化子表面轻轻涂刮，并转移到50mL 离心管中；

（2）加入20mL 灭菌双蒸水稀释，混匀后测定其OD600 值（1 OD600=5×10⁷cells/mL）；

（3）取10⁵ 个细胞涂布于含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，倒置，30℃培养72~96h；

（4）在无菌96孔板中每孔加入200μL YPD液体培养基；

（5）用无菌牙签往步骤（4）分别接入在含有0.5mg/mL G418 的YPD平板上获得的转化子，混匀，于30℃培养48h；

（6）48h后，取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第一块96 孔板所得的培养物，于30℃培养24h；

（7）24h后，再取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第二块96孔板所得的培养物，于30℃培养24h；

（8）24h后，分别从第三块96 孔板中取出1μL 分别点在含有1.0mg/mL 和4.0mg/mL G418的YPD平板上，于30℃继续培养96h-120h。酵母SMD1168转化子若能在含越高浓度G418的培养基上生长，说明该转化子含有越多拷贝的目的基因，即有多个pPIC9K-COL3-COL3-6His片断转化进了酵母SMD1168并同源重组插入了酵母的染色体上。

3. 制备基因重组人胶原蛋白

(1) 用BMGY培养基于30℃/250rpm培养毕赤酵母基因工程菌16~18小时，OD₆₀₀=2～6；

(2) 室温下1500g～3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD₆₀₀=1.0左右，将所得菌液置于500mL的三角瓶中，用双层纱布封口，于30℃ 250rpm继续生长；

(3) 每24小时向培养基中添加甲醇至终浓度为1%开始诱导培养，直到100小时以上；

(4) 发酵培养结束后，4℃下3000g离心20min，收集上清；

(5) 上清中加入5～7倍体积的纯水，再经超滤浓缩至初始体积的20%；

(6) 取1mL浓缩液中加入100μL 1×Ni-NTA 结合缓冲液，4℃充分混合；

(7) 加入20μL 50% Ni –NTA His·Bind 树脂悬液4℃轻柔混匀,结合30分钟；

(8) 15,000g离心10s沉淀树脂，弃上清；

(9) 用100μL 1×Ni-NTA 漂洗缓冲液漂洗树脂，15,000g 离心10秒,小心吸去上清。再重复1次；

(10) 用 20μL 1×Ni-NTA 洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，15,000 g 离心10秒,小心将上清转移至干净小管中。再重复3 次。取少量上清进行SDS-PAGE分析检测；

(11) 收集上清，加入5倍体积的纯水，再经超滤浓缩至初始体积的10～20%；

(12) 取10ml浓缩液倒入50ml小烧杯中，放入-20℃冰箱冷冻过夜，然后转入冷冻干燥机中-45℃，开启真空泵，维持48小时；

(13) 冻干结束后，小心打开放气阀，直至内外气压平衡。取出烧杯，得到白色粉末状基因重组人胶原蛋白。

实施例2

现给出基因重组人胶原蛋白用于外用美容护肤产品的实施例：

按以下质量配比，用水溶解各原料，并充分搅拌均匀即成一款无色无味透明的保湿护肤精华液：

基因重组人胶原蛋白 1％

透明质酸钠 0.1％

β-葡聚糖 1％

霍霍巴酯 0.5％

丝氨酸 0.1％

山梨醇 5％

甜菜碱 5％

乳酸钠 3％

使用方法：早晚洁面后，直接涂抹于面部，轻轻拍打至完全吸收。

实施例3：

基因重组人胶原蛋白 0.01％

透明质酸钠 0.01％

β-葡聚糖 0.01％

霍霍巴酯 0.01％

丝氨酸 0.01％

山梨醇 1％

甜菜碱 1％

乳酸钠 0.1％

实施例4

现给出基因重组人胶原蛋白在高档微创美容化妆品中的应用实施例：

(1) 精确称取基因重组人胶原蛋白冻干粉10.0mg，溶于5%甘露醇溶液，充分溶解后定容至10.0mL；

(2) 用0.22μm微乳滤膜过滤除菌；

(3) 无菌条件下每1.0mL分装灌入3mL无菌西林瓶中，半盖无菌胶塞，真空冷冻干燥后，轧铝盖，制成基因重组人胶原蛋白导入冻干粉；

(4) 另配制0.05%透明质酸钠溶液，按照(2)的方法过滤除菌；

(5) 无菌条件下灌装入3mL无菌西林瓶中，每瓶3.0mL，加盖无菌胶塞，轧铝盖，制成冻干粉溶剂；

(6) 使用时，用一次性无菌注射器抽出全部溶剂，注入冻干粉瓶中，摇匀使充分溶解，然后再抽出溶液配合导入仪器使用。

实施例5

现给出基因重组人胶原蛋白作为化妆品原料进行的急性经口毒性试验实施例：

实验动物：20只健康小鼠，8～12周龄，雌雄各半，体重25～30克；

饲养条件：全价营养颗粒饲料喂食，分笼饲养，室温23±3℃，相对湿度40~70%，每天光照12小时，自由饮用水和采食。试验前动物需在实验环境中适应3天；

剂量：预试时，未发现样品5000mg/kg体重剂量有明显毒性反应和死亡，故正式实验采用一次最大限度试验，剂量设为5000mg/kg体重；

配制：准确称取样品3.0克，溶解于纯水中，定容至30mL，配制成10%浓度，作为试验用液。

试验步骤

染毒方式：按0.2mL/10g体重的量在24小时内分三次经口灌胃给予试验溶液，灌胃前12小时，自由饮水，灌胃后禁食3～4小时，然后可正常饮食；

观察期限及指标：观察14天，每天记录动物中毒症状及死亡情况，观察期内存活动物每周称重，观察期结束后存活动物称重，处死后尸检，计算LD₅₀。

测试结果：灌胃后，所有受试动物在观察期内未见明显中毒症状及死亡。故小鼠经口毒性LD₅₀>5000mg/kg体重。

受试物对小鼠经口毒性试验结果

剂量（mg/kg）	实验动物数（只）	死亡动物数（只）	死亡率
				5000	20	0	0.0

结论：根据《化妆品卫生规范》（2007年版）的急性经口毒性评价规定，基因重组人胶原蛋白样品属实际无毒级。

实施例6

现给出基因重组人胶原蛋白作为化妆品原料进行的急性经皮毒性试验实施例：

实验动物：10只健康大鼠，8～12周龄，雌雄各半，体重200～250克；

剂量：预试时，未发现样品2500mg/kg体重剂量有明显毒性反应和死亡，故正式实验采用一次最大限度试验，剂量设为2500mg/kg体重；

配制：按每只动物体重称量受试样品，加几滴纯水调成糊状。

试验步骤

染毒方式：试验前24小时，将动物背部去毛，面积约为40cm²，将受试样品均匀涂抹于去毛区，用纱布及油纸覆盖，再用医用胶布固定。染毒24小时后，去除，并用温水清洗皮肤上的残留样品；

测试结果：所有受试动物在观察期内未见明显中毒症状及死亡。故大鼠经皮毒性LD₅₀>2500mg/kg体重。

受试物对大鼠经口皮毒性试验结果

剂量（mg/kg）	实验动物数（只）	死亡动物数（只）	死亡率
				2500	10	0	0.0

结论：根据《化妆品卫生规范》（2007年版）的急性经皮毒性评价规定，基因重组人胶原蛋白样品属实际无毒级。

SEQUENCE LISTING

<110> 西安益力欣生物科技有限公司

<120> 基因重组人胶原蛋白

<130> ELG33H6

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> SIMILAR

<222> (1)..(229)

<223> 人Ⅲ型胶原蛋白片段

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(474)

<223> 基因重组人胶原蛋白完整序列

<220>

<221> SIMILAR

<222> (233)..(461)

<223> 人Ⅲ型胶原蛋白片段

<220>

<221> DOMAIN

<222> (462)..(474)

<223> C末端的修饰片段

<220>

<221> DOMAIN

<222> (463)..(468)

<223> 6His片段

<400> 1

Ala Gly Asn Thr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro Lys

1 5 　　10 　15

Gly Asp Ala Gly Gln Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly

　　20 　　　25 　　　30

Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile Thr Gly Ala

　35 　　　40 　　　45

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Met Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro

　50 　　　55 　　　60

Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala Asn Gly

65 　　　70 　　　75 　　　80

Leu Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu

　　　85 　　　90 　　　95

Ala Gly Thr Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp

　　100 　　　105 　　　110

Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly

　　　115 　　　120 　　　125

Glu Asn Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro

　130 　　　135 　　　140

Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser

145 　　　150 　　　155 　　　160

Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly

　　　165 　　　170 　　　175

Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu

　　180 　　　185 　　　　190

Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro

　　195 　　200 　　　205

Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly

　210 　　　215 　　　220

Ser Pro Gly Pro Ala Glu Phe Thr Ala Gly Asn Thr Gly Ala Pro Gly

225 　　　230 　　　235 　　　240

Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Gln Pro Gly Glu

　　　245 　　　250 　　　255

Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu

　　260 　　　265 　　　270

Gly Ile Ala Gly Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly

　275 　　280 　　　285

Met Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu

　290 　　　295 　　300

Ser Gly Lys Pro Gly Ala Asn Gly Leu Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro

305 　　　310 　　　315 　　　320

Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly Glu Pro Gly

　　　325 　　　330 　　　335

Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Ser

　　340 　　　345 　　　350

Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn Gly Ser Pro Gly Ala Pro

　355 　　　360 　　　365

Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly

　370 　　　375 　　　380

Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala

385 　　　390 　　　395 　　　400

Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg

　　　405 　　　410 　　　415

Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys Gly

　　420 　　　425 　　　430

His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro

　435 　　　440 　　　445

Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly Ser Pro Gly Pro Ala Asp His His

　450 　　　455 　　460

His His His His Thr Gly Leu Ala Arg Phe

465 　　470

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gaatctgtga atcatgccct ac 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gaagtcataa tctcatcggt gtt 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

aggctgaagc tgcgggtaac actg 24

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

tctctcgaga aaagagaggc tgaagct 27

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ttgaattctg caggtcctgg 20

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccgaattca ctgcgggtaa cactggtgc 29

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaaaccggtg tggtggtggt ggtggtgatc tgcaggtcct ggactg 46

<210> 9

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1422)

<223> 基因重组人胶原蛋白基因序列

<400> 9

gcg ggt aac act ggt gct cct ggc agc cct gga gtg tct gga cca aaa 48

Ala Gly Asn Thr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro Lys

1 　　　5 　　　10 　　 15

ggt gat gct ggc caa cca gga gag aag gga tcg cct ggt gcc cag ggc 96

Gly Asp Ala Gly Gln Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly

　　 20 　　　25 　　　30

cca cca gga gct cca ggc cca ctt ggg att gct ggg atc act gga gca 144

Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile Thr Gly Ala

　 35 　　　40 　　45

cgg ggt ctt gca gga cca cca ggc atg cca ggt cct agg gga agc cct 192

Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Met Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro

　50 　　　55 　　　60

ggc cct cag ggt gtc aag ggt gaa agt ggg aaa cca gga gct aac ggt 240

Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala Asn Gly

65 　　　70 　　　75 　　　80

ctc agt gga gaa cgt ggt ccc cct gga ccc cag ggt ctt cct ggt ctg 288

Leu Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu

　　　85 　　　 90 　　　95

gct ggt aca gct ggt gaa cct gga aga gat gga aac cct gga tca gat 336

Ala Gly Thr Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp

　　100 　　　105 　　　110

ggt ctt cca ggc cga gat gga tct cct ggt ggc aag ggt gat cgt ggt 384

Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly

　　115 　　　120 　　125

gaa aat ggc tct cct ggt gcc cct ggc gct cct ggt cat cca ggc cca 432

Glu Asn Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro

　130 　　　135 　　　140

cct ggt cct gtc ggt cca gct gga aag agt ggt gac aga gga gaa agt 480

Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser

145 　　150 　　　155 　　　160

ggc cct gct ggc cct gct ggt gct ccc ggt cct gct ggt tcc cga ggt 528

Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly

　　　165 　　170 　　　175

gct cct ggt cct caa ggc cca cgt ggt gac aaa ggt gaa aca ggt gaa 576

Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu

　　180 　　　185 　　　190

cgt gga gct gct ggc atc aaa gga cat cga gga ttc cct ggt aat cca 624

Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro

　195 　　200 　　　205

ggt gcc cca ggt tct cca ggc cct gct ggt cag cag ggt gca atc ggc 672

Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly

　210 　　215 　　　220

agt cca gga cct gca gaa ttc act gcg ggt aac act ggt gct cct ggc 720

Ser Pro Gly Pro Ala Glu Phe Thr Ala Gly Asn Thr Gly Ala Pro Gly

225 　　230 　　　235 　　240

agc cct gga gtg tct gga cca aaa ggt gat gct ggc caa cca gga gag 768

Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Gln Pro Gly Glu

　　245 　　　250 　　255

aag gga tcg cct ggt gcc cag ggc cca cca gga gct cca ggc cca ctt 816

Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu

　　260 　　265 　　　270

ggg att gct ggg atc act gga gca cgg ggt ctt gca gga cca cca ggc 864

Gly Ile Ala Gly Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly

　275 　　280 　　　285

atg cca ggt cct agg gga agc cct ggc cct cag ggt gtc aag ggt gaa 912

Met Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu

　290 　　295 　　　300

agt ggg aaa cca gga gct aac ggt ctc agt gga gaa cgt ggt ccc cct 960

Ser Gly Lys Pro Gly Ala Asn Gly Leu Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro

305 　　　310 　　　315 　　　320

gga ccc cag ggt ctt cct ggt ctg gct ggt aca gct ggt gaa cct gga 1008

Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly Glu Pro Gly

　　　325 　　　330 　　　335

aga gat gga aac cct gga tca gat ggt ctt cca ggc cga gat gga tct 1056

Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Ser

　　340 　　　345 　　　350

cct ggt ggc aag ggt gat cgt ggt gaa aat ggc tct cct ggt gcc cct 1104

Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn Gly Ser Pro Gly Ala Pro

　　355 　　　360 　　　365

ggc gct cct ggt cat cca ggc cca cct ggt cct gtc ggt cca gct gga 1152

Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly

　370 　　375 　　　380

aag agt ggt gac aga gga gaa agt ggc cct gct ggc cct gct ggt gct 1200

Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala

385 　　　390 　　　395 　　　400

ccc ggt cct gct ggt tcc cga ggt gct cct ggt cct caa ggc cca cgt 1248

Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg

　　　405 　　　410 　　　415

ggt gac aaa ggt gaa aca ggt gaa cgt gga gct gct ggc atc aaa gga 1296

Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys Gly

　　420 　　　425 　　　430

cat cga gga ttc cct ggt aat cca ggt gcc cca ggt tct cca ggc cct 1344

His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro

　　435 　　　440 　　　 445

gct ggt cag cag ggt gca atc ggc agt cca gga cct gca gat cac cac 1392

Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly Ser Pro Gly Pro Ala Asp His His

　450 　　　455 　　460

cac cac cac cac acc ggt ctt gct aga ttc 1422

His His His His Thr Gly Leu Ala Arg Phe

465 　　470

Claims

1.一种人源化基因重组胶原蛋白，其特征是序列如下：蛋白全长474个氨基酸，其中1～229和233～461为相同的人Ⅲ型胶蛋白原片段，两段人Ⅲ型胶原蛋白片段之间有EFT连接，233～461的人Ⅲ型胶蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF进行修饰；其氨基酸序列如下：（SEQ ID NO.1）

VKGESGKPGA　NGLSGERGPP　GPQGLPGLAG　TAGEPGRDGN　PGSDGLPGRD　350 GSPGGKGDRG　ENGSPGAPGA　PGHPGPPGPV　GPAGKSGDRG　ESGPAGPAGA　400 PGPAGSRGAP　GPQGPRGDKG　ETGERGAAGI　KGHRGFPGNP　GAPGSPGPAG 　450 QQGAIGSPGP　ADHHHHHHTG　LARF　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 474。

2.一种生产权利要求1所述蛋白的工程菌，其特征在于该工程菌由下述步骤获得：

（1）克隆人Ⅲ型胶蛋白基因

从人新鲜胎盘中提取总RNA，反转录为cDNA，根据GenBankⅢ型人胶原蛋白COL3A1基因序列，设计基因PCR扩增引物F、R：

（SEQ ID NO.2）F: GAATCTGTGAATCATGCCCTAC

（SEQ ID NO.3）R: GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT

以cDNA为模版扩增得到基因片段，产物长度为3295bp；

（2）构建质粒pPIC9K-COL3-COL3-6His

利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶上回收特异性条带COL3A1；依照pGM-T克隆试剂盒说明书，将COL3A1连接于pGM-T载体上，得到质粒pGM-T-COL3A1；以pGM-T-COL3A1质粒为模板，以F1、F2、R为引物进行多重PCR扩增，得到产物COL3长度为722bp，引物为：

（SEQ ID NO.4）F1:AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG

（SEQ ID NO.5）F2:TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT

（SEQ ID NO.6）R: TTGAATTCTGCAGGTCCTGG

将产物COL3和质粒pPIC9K分别做EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为质粒pPIC9K-COL3；

以质粒pPIC9K-COL3为模板，再次扩增COL3得到COL3-6His，引物为：

F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC （SEQ ID NO.7）

R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG（SEQ ID NO.8）

将二次扩增产物COL3-6His和质粒pPIC9K-COL3分别进行EcoRI、AgeI双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为质粒pPIC9K-COL3-COL3-6His；

（3）基因重组构建表达人Ⅲ型胶蛋白的毕赤酵母基因工程菌

将制备得到的质粒pPIC9K-COL3-COL3-6His用限制性内切酶SalⅠ线性化，并制备毕赤酵母SMD1168（Invitrogen）感受态细胞，电击转化pPIC9K-COL3-COL3-6His质粒，以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，得到毕赤酵母基因工程菌。

3.制备权利要求1所述蛋白的方法，其特征在于用BMGY培养基于30℃ 250rpm培养权利要求2所述的毕赤酵母基因工程菌16~18小时，至OD₆₀₀=2～6；室温下1500g～3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD₆₀₀=1.0左右，将所得的菌液置于三角瓶中，用双层纱布封口，于30℃ 250rpm继续生长；每24小时向培养基中添加甲醇至终浓度为1%开始诱导培养，直到100小时以上；发酵培养结束后，离心收集上清，在非变性条件下用Ni-NTA His Bands树脂（Merck）吸附重组胶原，漂洗流出杂质，最后再洗脱重组胶原，收集洗脱液；洗脱液经超滤系统（PALL）脱盐、浓缩，浓缩液经冷冻干燥制得基因重组人胶原蛋白。

4.一种编码权利要求1所述蛋白的基因序列，其特征在于序列如下：（SEQ ID NO.9）

1 GCGGGTAACA CTGGTGCTCC TGGCAGCCCT GGAGTGTCTG GACCAAAAGG

51 TGATGCTGGC CAACCAGGAG AGAAGGGATC GCCTGGTGCC CAGGGCCCAC

101 CAGGAGCTCC AGGCCCACTT GGGATTGCTG GGATCACTGG AGCACGGGGT

151 CTTGCAGGAC CACCAGGCAT GCCAGGTCCT AGGGGAAGCC CTGGCCCTCA

201 GGGTGTCAAG GGTGAAAGTG GGAAACCAGG AGCTAACGGT CTCAGTGGAG

251 AACGTGGTCC CCCTGGACCC CAGGGTCTTC CTGGTCTGGC TGGTACAGCT

301 GGTGAACCTG GAAGAGATGG AAACCCTGGA TCAGATGGTC TTCCAGGCCG

351 AGATGGATCT CCTGGTGGCA AGGGTGATCG TGGTGAAAAT GGCTCTCCTG

401 GTGCCCCTGG CGCTCCTGGT CATCCAGGCC CACCTGGTCC TGTCGGTCCA

451 GCTGGAAAGA GTGGTGACAG AGGAGAAAGT GGCCCTGCTG GCCCTGCTGG

501 TGCTCCCGGT CCTGCTGGTT CCCGAGGTGC TCCTGGTCCT CAAGGCCCAC

551 GTGGTGACAA AGGTGAAACA GGTGAACGTG GAGCTGCTGG CATCAAAGGA

601 CATCGAGGAT TCCCTGGTAA TCCAGGTGCC CCAGGTTCTC CAGGCCCTGC

651 TGGTCAGCAG GGTGCAATCG GCAGTCCAGG ACCTGCAGAA TTCACTGCGG

701 GTAACACTGG TGCTCCTGGC AGCCCTGGAG TGTCTGGACC AAAAGGTGAT

751 GCTGGCCAAC CAGGAGAGAA GGGATCGCCT GGTGCCCAGG GCCCACCAGG

801 AGCTCCAGGC CCACTTGGGA TTGCTGGGAT CACTGGAGCA CGGGGTCTTG

851 CAGGACCACC AGGCATGCCA GGTCCTAGGG GAAGCCCTGG CCCTCAGGGT

901 GTCAAGGGTG AAAGTGGGAA ACCAGGAGCT AACGGTCTCA GTGGAGAACG

951 TGGTCCCCCT GGACCCCAGG GTCTTCCTGG TCTGGCTGGT ACAGCTGGTG

1001 AACCTGGAAG AGATGGAAAC CCTGGATCAG ATGGTCTTCC AGGCCGAGAT

1051 GGATCTCCTG GTGGCAAGGG TGATCGTGGT GAAAATGGCT CTCCTGGTGC

1101 CCCTGGCGCT CCTGGTCATC CAGGCCCACC TGGTCCTGTC GGTCCAGCTG

1151 GAAAGAGTGG TGACAGAGGA GAAAGTGGCC CTGCTGGCCC TGCTGGTGCT

1201 CCCGGTCCTG CTGGTTCCCG AGGTGCTCCT GGTCCTCAAG GCCCACGTGG

1251 TGACAAAGGT GAAACAGGTG AACGTGGAGC TGCTGGCATC AAAGGACATC

1301 GAGGATTCCC TGGTAATCCA GGTGCCCCAG GTTCTCCAGG CCCTGCTGGT

1351 CAGCAGGGTG CAATCGGCAG TCCAGGACCT GCAGATCACC ACCACCACCA

1401 CCACACCGGT CTTGCTAGAT TC。

5.一种用于使用基因重组工程菌生产重组人源胶原蛋白时的重组胶原蛋白纯化方法，其特征在于在进行基因重组工程菌构建过程中，在进行重组人源胶原蛋白氨基酸序列设计时，使用附带有蛋白质修饰功能的核苷酸引物，对人源胶原蛋白氨基酸序列采用附加DHHHHHHTGLARF的方式进行修饰，并在从工程菌发酵液中提取重组人源胶原蛋白时通过Ni –NTA His·Bind 树脂吸附的方式纯化。

6.一种用于权利要求5所述的，附带有蛋白质修饰功能的核苷酸引物，其特征在于根据人源胶原蛋白氨基酸序列设计核苷酸引物时，在C端增加设计6个用于表达组氨酸的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述用于在C端增加6个用于表达组氨酸的核苷酸序列是GTGGTGGTGGTGGTGGTG。

8.权利要求6所述的附带有蛋白质修饰功能的核苷酸引物，其特征在于其核苷酸序列为

F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC

R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG 。

9.权利要求1所述的基因重组人胶原蛋白在制备化妆品中的用途。

10.一种用于美容的外用护肤产品，其特征在于所制备的产品以水为溶剂，由以下质量配比的原料组成：

基因重组人胶原蛋白 0.01～1％

透明质酸钠 0.01～0.1％

β-葡聚糖 0.01～1％

霍霍巴酯 0.01～0.5％

丝氨酸 0.01～1％

山梨醇 1～5％

甜菜碱 1～5％

乳酸钠 0.1～3％。

11.一种用于美容的导入性产品，其特征在于分别由冻干粉和溶剂组成，冻干粉由以下质量配比的无菌原料配制而成，并冷冻干燥：

基因重组人胶原蛋白 0.1％

甘露醇 5％；

溶剂由0.05％无菌透明质酸钠溶液组成。