CN114681386A - 一种动物来源外泌体组合物及其在制备皮肤抗衰老和抗过敏制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物医药技术领域，具体公开了一种动物来源外泌体组合物及其在制备皮肤抗衰老和抗过敏制剂中的应用。所述动物来源外泌体组合物包括外泌体60‑80份，小球藻生长因子35‑55份，人表皮生长因子2.5‑3.5份，烟酰胺25‑45份，卵磷脂2‑6份，亚油酸2‑5份。所述动物来源外泌体组合物能够提高成纤维细胞的增殖活性，提高程度保持在132%以上。本申请所述的动物来源外泌体组合物用于抗皱的护肤品和药品中，能够有效地减少皮肤皱纹的数量。

Description

一种动物来源外泌体组合物及其在制备皮肤抗衰老和抗过敏 制剂中的应用

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，更具体地涉及一种动物来源外泌体组合物及其在制备皮肤抗衰老和抗过敏制剂中的应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多功能的自我更新细胞，在再生医学中具有巨大的应用潜力，这些间充质干细胞可以用于再生研究的临床试验，其可以来源于骨髓、肝脏、脾脏、肺肾、胃肠、骨骼肌、脂肪、韧带、胎盘、脐带、脐血、牙髓和皮肤等组织中。

外泌体是间充质干细胞分泌的一种微小囊泡，直径在40-100nm。外泌体含有蛋白质、mRNAs、miRNAs和DNA。外泌体与干细胞相比，外泌体更稳定、安全，保存更方便。外泌体已被证明与干细胞本身具有相似的生物活性，这些来源于MSCs的外泌体已成为无细胞治疗的新灯塔，具有较低的免疫排斥风险，未来的应用前景也更加广阔。

皮肤抗衰老医学美容就是未来应用中的一类，也是一项长期而艰巨的课题。人类对年轻健康外貌的追求不断地加深，对于抗衰老产品的需求只增不减。因此，研究有效的抗衰老技术和抗衰老产品，具有重要意义和广阔的市场前景。

发明内容

为了促进皮肤的代谢能力，减少皱纹的数量，本申请提供了一种动物来源外泌体组合物及其在制备皮肤抗衰老和抗过敏制剂中的应用。

第一方面，本申请提供了一种动物来源外泌体组合物，按重量份数计，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体60-80份，小球藻生长因子35-55份，人表皮生长因子2.5-3.5份，烟酰胺25-45份，卵磷脂2-6份，亚油酸2-5份。

在本申请中，所述动物来源外泌体组合物主要由外泌体、小球藻生长因子、人表皮生长因子和烟酰胺构成，通过这四种物质的相互协同，可以提高人体中成纤维细胞的增殖活性，进而促进皮肤的更新，提高代谢能力，减少皱纹的数量；此外，所述动物来源外泌体组合物具有一定的免疫调节性能，提高抗过敏能力。

外泌体是间充质干细胞分泌的一种纳米级小囊泡，通过培养间充质干细胞可以获得外泌体。

间充质干细胞的来源较为广泛，例如骨髓、肝脏、脾脏、肺肾、胃肠、骨骼肌、脂肪、韧带、胎盘、脐带、脐血、牙髓和皮肤等组织中。在本申请中，以动物的脐带作为实验对象，所述外泌体取自胎生动物的脐带中，胎生动物选自羊、牛和猪等。经过本申请中实验的验证，外泌体取自羊的脐带时，与小球藻生长因子、人表皮生长因子和烟酰胺配合后，成纤维细胞的增殖活性最高，能够提高178％。外泌体取自猪和牛的脐带时，与小球藻生长因子、人表皮生长因子和烟酰胺配合后亦可提高成纤维细胞的增殖活性。当外泌体取自猪的脐带时，成纤维细胞的增殖活性提高158％。当外泌体取自牛的脐带时，成纤维细胞的增殖活性提高144％。

其中，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：

S1，利用胎生动物的脐带进行间充质干细胞的培养、纯化及传代；

S2，取P3代间充质干细胞制备外泌体；

S3，外泌体的分离、过滤和保存。

小球藻是世界上生长最快的植物之一，快速生长的秘密是因为小球藻内含有特有的小球藻生长因子。

本申请所述小球藻生长因子的制备方法，包括以下步骤：

S1，温浴：将原料为小球藻粉或小球藻泥放入40-50℃的水中浸泡，浸泡时间为12-15小时，使小球藻细胞壁扩张和软化；

S2，破壁：在温浴后的小球藻浆中加入果胶酶，将温度控制在40±3℃，使小球藻细胞壁发生水解反应，获得破壁的小球藻泥，其中原料与果胶酶的重量比为1：(1-3)；

S3，酶解：再向步骤S2中加入核酸酶和蛋白酶，温度控制在45℃-55℃，使破壁的小球藻泥水解为小球藻生长因子的混合物，其中原料(原料为小球藻泥或小球藻粉)、核酸酶和蛋白酶的重量比为1：(0.5-0.8)：(0.5-0.8)；

S4，分离：用离心设备将小球藻生长因子的混合物离心分离，得到小球藻生长因子的液体。

利用上述方法制备的小球藻生长因子，活性成分的含量较高，重金属含量较低，且制备方法简单，成本较低，适用于批量化的制备。

人表皮生长因子(Human Epidermal Growth Factor，简称为hEGF)是由53个氨基酸组成的小分子多肽，分子量约为6000道尔顿，对酸、碱、热等理化因素均较稳定。人表皮生长因子与外泌体、小球藻生长因子和烟酰胺能够促进成纤维细胞的增殖活性，增加成纤维细胞的数量，从而减少皱纹的数量，达到坑衰老和抗过敏的目的。

当动物来源外泌体组合物中缺少人表皮生长因子与外泌体、小球藻生长因子、和烟酰胺中的任一一种组分时，成纤维细胞的增殖活性略有提高。当外泌体组合物中缺少外泌体时，成纤维细胞的增殖活性提高仅为2％；当外泌体组合物中缺少小球藻生长因子时，成纤维细胞的增殖活性提高仅为5％；当外泌体组合物中缺少人表皮生长因子时，成纤维细胞的增殖活性提高仅为1％；当外泌体组合物中缺少烟酰胺时，成纤维细胞的增殖活性提高仅为8％。因此，将上述缺少任一一种组分的动物来源外泌体组合物制备成护肤品时，不能有效地减少皱纹的数量。

在本申请中，动物来源外泌体组合物中外泌体、小球藻生长因子、人表皮生长因子和烟酰胺按照(60-80份)/(35-55份)/(2.5-3.5份)/(25-45份)进行配合时，能更好的提高成纤维细胞的增殖活性，使成纤维细胞的增殖活性提高132％以上。

当动物来源外泌体组合物中更换其他组分时，比如，将小球藻生长因子替换为胶原蛋白；将人表皮生长因子替换为胶原蛋白；将烟酰胺替换为胶原蛋白；将人表皮生长因子替换为乙酰基六肽，同样也可以提高成纤维细胞的增殖活性，提高程度仅在4％-21％。

优选地，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体70-80份，小球藻生长因子35-45份，人表皮生长因子3-3.5份，烟酰胺35-45份，卵磷脂2-6份，亚油酸2-5份。

在一个具体的实施方案中，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体75份，小球藻生长因子40份，人表皮生长因子3.2份，烟酰胺40份，卵磷脂4份，亚油酸3份。该动物来源外泌体组合物能够使成纤维细胞的增殖活性提高178％以上。

优选地，所述动物来源外泌体组合物还包括吐温80 2-5份。

在本申请，动物来源外泌体组合物中还添加了吐温80，吐温80对细胞具有较好的渗透能力。在吐温80的作用下，能够将外泌体、小球藻生长因子、人表皮生长因子和烟酰胺中的有效成分透过皮肤表面输送到皮肤内部，提高成纤维细胞的增殖活性，从而达到抗衰老的作用。

第二方面，本申请提供了一种动物来源外泌体组合物在制备皮肤抗衰老中的制剂中的应用，所述制剂为护肤品或药品。

第三方面，本申请提供了一种动物来源外泌体组合物在制备抗过敏制剂中的应用，所述制剂为护肤品或药品。

在本申请中，通过外泌体、小球藻生长因子、人表皮生长因子、烟酰胺、卵磷脂和亚油酸按照相应的比例制备成动物来源外泌体组合物。动物来源外泌体组合物能够提高人体细胞增殖活性，具有免疫调节和抗衰老的作用。所以，可以将动物来源外泌体组合物用于抗过敏和皮肤抗衰老的护肤品或药品等产品的制备中。优选地，所述护肤品可以为精华液、乳液、面膜或面霜，方便日常使用。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请中，外泌体、小球藻生长因子、人表皮生长因子和烟酰胺四种组分能够相互协同，相互增效，可以提高成纤维细胞的增殖活性，使皮肤更新和代谢能力得以提高，减少皮肤皱纹的数量，还能提高抗过敏的能力；

2、本申请中所述动物来源外泌体组合物包括外泌体75份，小球藻生长因子40份，人表皮生长因子3.2份，烟酰胺40份；所述动物来源外泌体组合物使成纤维细胞的增殖活性提高178％以上；

3、本申请所述动物来源外泌体组合物可用于抗过敏和皮肤抗衰老的护肤品或药品，能够有效地减少皮肤皱纹的数量，起到抗衰老的作用。

具体实施方式

以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。

1、外泌体的制备

包括以下步骤：

选择新生羊的脐带，利用含1％双抗的PBS洗涤，去除残血，并剔除脐动静脉，将新生羊脐带剪成0.8-1.0cm的脐带组织段；将脐带组织段贴壁接种在培养皿中，在培养皿中加入4mL培养基，培养基为含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F12培养基，于37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下进行培养，每3-4d换液1次。在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。待细胞增殖融合至90％时，用胰蛋白酶消化传代培养。

取培养P3代脐带干细胞于10cm培养皿中，待细胞增殖融合至90％时，按照1:4进行传代；P4细胞融合至对数生长期时，弃培养基，PBS漂洗两次，加入无FBS的DMEM/F12培养基6mL/皿，24h后收取培养基于离新管中，进行外泌体的分离：①预冷低温离心机，超速离心机至4℃；②300g，4℃离心10min，除细胞碎片；③将离心后上清液移植超速离心管中，用PBS补齐；④29500g，4℃离心20min，进一步去除细胞及碎片；⑤0.22μm滤器过滤离心后留上清液，去除大于200nm的粒子；⑥过滤后上清液于另一超速离心管中，120000g，4℃离心90min；⑦弃上清，无菌滤纸吸净管壁液体，管底即为外泌体，加入相应液体，-80保存待用。

2、小球藻生长因子的制备

S1，温浴：将20mg的小球藻泥放入45℃的水中浸泡，浸泡时间为15小时，使小球藻的细胞壁充分扩张和软化，获得小球藻浆；

S2，破壁：向小球藻浆中加入40mg的果胶酶(小球藻泥与果胶酶的重量比为1:2)，将温度控制在40±3℃，使小球藻细胞壁发生水解反应，获得破壁的小球藻泥；

S3，酶解：再向步骤S2中加入10mg的核酸酶和10mg的蛋白酶(小球藻泥、核酸酶和蛋白酶的重量比为1:0.5:0.5)，将温度升温至50℃，使破壁的小球藻泥水解为小球藻生长因子的混合物；

S4，分离：用离心设备将小球藻生长因子的混合物离心分离，得到小球藻生长因子。

实施例

实施例1

将通过上述制备方法获得的外泌体70mg，小球藻生长因子45mg以及人表皮生长因子3mg，烟酰胺35mg，卵磷脂4mg和亚油酸3mg进行混合制备得到动物来源外泌体组合物。

实施例2-9与实施例1的区别如表2所示。

表2实施例2-9与实施例1的区别(单位：mg)

类别	外泌体	小球藻生长因子	人表皮生长因子	烟酰胺
					实施例1	70	45	3	35
实施例2	60	45	3	35
					实施例3	80	45	3	35
实施例4	70	35	3	35
					实施例5	70	55	3	35
实施例6	70	45	2.5	35
					实施例7	70	45	3.5	35
实施例8	70	45	3	25
					实施例9	70	45	3	45

实施例10

实施例10与实施例1不同之处在于，实施例10中所述外泌体源自猪的脐带。

实施例11

实施例11与实施例1不同之处在于，实施例11中所述外泌体源自牛的脐带。

实施例12

实施例12与实施例1不同之处在于，实施例12中所述动物来源外泌体组合物还包括3mg的吐温80。

实施例13与实施例1不同之处在于，实施例13中所述动物来源外泌体组合物还包括6mg的吐温80。

对比例

对比例1-12与实施例1的区别如表2所示。

表2对比例1-12与实施例1的区别(单位：mg)

类别	外泌体	小球藻生长因子	人表皮生长因子	烟酰胺
					对比例1	55	45	3	35
对比例2	85	45	3	35
					对比例3	70	30	3	35
对比例4	70	60	3	35
					对比例5	70	45	2	35
对比例6	70	45	4	35
					对比例7	70	45	3	20
对比例8	70	45	3	50
					对比例9	0	45	3	35
对比例10	70	0	3	35
					对比例11	70	45	0	35
对比例12	70	45	3	0

对比例13

对比例13与实施例1的区别在于，对比例13中将小球藻生长因子替换为胶原蛋白。

对比例14

对比例14与实施例1的区别在于，对比例14中将人表皮生长因子替换为胶原蛋白。

对比例15

对比例15与实施例1的区别在于，对比例15中将烟酰胺替换为胶原蛋白。

对比例16

对比例16与实施例1的区别在于，对比例16中将人表皮生长因子替换为乙酰基六肽。

性能检测试验

一、细胞的增殖活性测定

1、培养

利用购自武汉普诺赛生命科技有限公司的人真皮成纤维细胞进行增殖活性测定。首先将人真皮成纤维细胞按照要求进行初步培养；然后取生长状态良好的对数生长期人真皮成纤维细胞，调整细胞浓度至110⁵个/mL，混匀后接种于96孔板中加入含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养基。待人真皮成纤维细胞完全贴壁后，分别加入实施例1-13和对比例1-16制备的动物来源外泌体组合物，加入后的动物来源外泌体组合物的终浓度为5μg/mL，对人真皮成纤维细胞进行培养，记为29组实验组并进行编号。设置对照组(培养基中不加入外泌体组合物)。

2、检测

将上述所述的29组实验组和对照组培养24h后，每孔加入20μL浓度为8mg/mL的MTT溶液，继续培养5h后，去除上清液，加入120μL的二甲基亚砜，利用酶标仪检测其在490nm处的吸光度(OD值)，通过OD值按照如下公式计算实验组细胞增殖活性，空白对照组增殖活性计为100％：实验组增殖活性＝实验组OD值/空白对照组OD值100％。

具体检测结果如表3所示。

表3人真皮成纤维细胞增殖活性的检测结果(％)

结合实施例1-13和对比例1-16并结合表3可以看出，本申请实施例1-13和对比例1-16制备的动物来源外泌体组合物均能够提高人真皮成纤维细胞的增殖活性。但是，实施例1-13中人真皮成纤维细胞的增殖活性提高为132％以上。而对比例1-16中人真皮成纤维细胞的增殖活性提高为1％-82％，不能够有效地减少皮肤皱纹的数量。

结合实施例1-3和对比例1-2并结合表3可以看出，当小球藻生长因子、人表皮生长因子和烟酰胺一定时，随着外泌体的增加，成纤维细胞的增殖活性先增高后下降。当外泌体的含量在60-80份时，成纤维细胞的增殖活性可以提高154％以上。

结合实施例1、4、5和对比例3-4并结合表3可以看出，当外泌体、人表皮生长因子和烟酰胺一定时，随着小球藻生长因子的增加，成纤维细胞的增殖活性先增高后下降。当外泌体的含量在35-55份时，成纤维细胞的增殖活性可以提高160％以上。

结合实施例1-13和对比例9-12并结合表3可以看出，所述动物来源外泌体组合物通过外泌体、小球藻生长因子、人表皮生长因子和烟酰胺相互配合，成纤维细胞的增殖活性可以提高132％以上。当对比例9-12中缺少任一组分时，成纤维细胞的增殖活性提高为1％-8％。

二、外泌体组合物的应用

1、外泌体组合物在制备皮肤抗衰老中的制剂中的应用

根据细胞增殖活性的测定结果，将实施例1和对比例1制备成面膜。众所周知，随着年龄的不断增加，细胞的活性或新陈代谢能力逐渐降低，30岁是一个明显的界限，大多数人30岁后皮肤皱纹逐渐的增多。因此，本申请选择年龄在30-40岁的女性志愿者20名，40-50岁的女性志愿者20名，50-60岁的女性志愿者20名，将志愿者随机分为两组，每组内各年龄段的志愿者各10名，一组敷上由实施例1制备成面膜，另一组敷上由对比例1制备成面膜。一种所述面膜包括由实施例1制备的动物来源外泌体组合物60mg，另一种所述面膜包括由对比例1制备的动物来源外泌体组合物60mg。两种面膜其余组分均相同，包括肉豆蔻酸异丙酯50mg、五元胜肽32mg、羧乙基纤维素纳35mg、乙二胺四乙酸二钠50mg、十二甲基环六硅氧烷50mg、蛋黄卵磷脂45mg、鲸蜡硬脂醇40mg、大豆异黄酮20mg、甘硼酸二钾50mg、抗菌剂6mg、乳化剂6mg、活性剂5mg。

利用皮肤镜对每位志愿者皮肤的皱纹进行打分，包括使用前、使用后1d、5d、10d、20d和30d，满分为10分(皱纹越少，分值越高)。具体打分表如表4所示。

表4皱纹打分表

从表4可以看出，由本申请实施例1制备的面膜对30-60岁的年龄段的人具有较好的抗皱效果。在20d后均保持在及格水平以上。由实施例1制备的面膜不能起到有效地抗皱能力。

2、外泌体组合物在制备皮肤抗过敏制剂中的应用

选取6-8周雌雄各半的小鼠，将小鼠随机分为四组，每组10只，第一组为对照组，未做处理。第二组为诱导对照组，利用1％二硝基氯苯进行诱导，然后采用1％的邻二甲苯加强诱导，重复诱导使其致敏。

第三组为实施例1治疗组，采用第二组的方式将小鼠致敏，然后利用实施例1所述的动物来源外泌体组合物制备成护肤品，将护肤品涂抹于致敏处，每日三次；所述护肤品包括实施例1制备的动物来源外泌体组合物10mg，2mg的甘油硬酯酸脂、2mg的鲸蜡醇硬脂醇、4mg的尿素、2mg的甘油、3mg的异丙酯、0.5mg的卡波姆、1mg的黄原胶、去离子水8mg。

第四组为对比例1治疗组，采用第二组的方式将小鼠致敏，然后利用对比例1所述的动物来源外泌体组合物制备成护肤品，将护肤品涂抹于致敏处，每日三次；所述护肤品包括对比例1制备的动物来源外泌体组合物10mg，2mg的甘油硬酯酸脂、2mg的鲸蜡醇硬脂醇、4mg的尿素、2mg的甘油、3mg的异丙酯、0.5mg的卡波姆、1mg的黄原胶、去离子水8mg。

对上述四组小鼠分别进行血清总IGE水平测试，具体检测结果如表5所示。

表5血清总IGE水平检测结果

组别	血清总IGE(ng/mL)
		第一组	38.23±21.34
第二组	243.43±44.62
		第三组	85.38±18.35
第四组	189.81±20.57

从表5可以看出，第三组(实施例1治疗组)中的血清总IGE更加接近第一组(对照组)的血清总IGE，说明由实施例1制备的护肤品具有较好的抗过敏性能。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种动物来源外泌体组合物，其特征在于，按重量份数计，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体60-80份，小球藻生长因子35-55份，人表皮生长因子2.5-3.5份，烟酰胺25-45份，卵磷脂2-6份，亚油酸2-5份。

2.根据权利要求1所述的动物来源外泌体组合物，其特征在于，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体70-80份，小球藻生长因子35-45份，人表皮生长因子3-3.5份，烟酰胺35-45份，卵磷脂2-6份，亚油酸2-5份。

3.根据权利要求1所述的动物来源外泌体组合物，其特征在于，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体70份，小球藻生长因子45份，人表皮生长因子3份，烟酰胺35份，卵磷脂4份，亚油酸3份。

4.根据权利要求1-3任一项所述的动物来源外泌体组合物，其特征在于，所述动物来源外泌体组合物还包括吐温80 2-5份。

5.根据权利要求1-3任一项所述的动物来源外泌体组合物，其特征在于，所述动物来源外泌体源自胎生动物的脐带。

6.根据权利要求5所述的动物来源外泌体组合物，其特征在于，所述胎生动物为羊。

7.一种动物来源外泌体组合物在制备皮肤抗衰老中制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的动物来源外泌体组合物在制备皮肤抗衰老中制剂中的应用，其特征在于，所述制剂为护肤品或药品。

9.一种动物来源外泌体组合物在制备抗过敏制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的动物来源外泌体组合物在制备抗过敏制剂中的应用，其特征在于，所述制剂为护肤品或药品。