CN111420023B - 含i型胶原和透明质酸的复合物及制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有I型胶原和透明质酸的复合物，其特征在于，该复合物包括I型胶原、透明质酸和平衡物质；其中，平衡物质包括NaH₂PO₄‑Na₂HPO₄体系、Tris‑HCl体系、Tris‑马来酸体系或HEPES体系，以及包括NaCl和/或KCl；该复合物的pH为6‑8，NaCl和/或KCl的浓度为0.2‑0.9重量％。本发明还提供了所述复合物的制备方法。本发明的复合物在生理pH值范围内，I型胶原和透明质酸能在较广范围的比例互溶，且体系稳定，长时间也不会出现沉淀或变性；而且该复合物的渗透压和张力均适于生理体系。本发明提供的复合物能够有效促进表皮细胞分泌胶原纤维、抑制炎症，有效地促进皮肤组织修复。本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物的制备方法简单，成本低廉，易于大规模生产。

Description

含I型胶原和透明质酸的复合物及制备和用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种含I型胶原和透明质酸的复合物及该复合物的制备方法，以及该复合物在制备皮肤损伤修复的药物中的用途，或者所述复合物用于修复皮肤损伤的化妆品。

背景技术

皮肤损伤是由体内、外多因素引发的皮肤组织结构和功能的缺损和丢失。皮肤损伤可分为轻微损伤和较重的损伤。通常情况下，轻微损伤可以自行愈合，但较重的损伤依靠自行愈合难以取得良好效果。

细胞的代谢平衡是皮肤组织重塑与修复的基础，外源性添加活性单体可以改善受损皮肤组织的微环境，促进皮肤组织新陈代谢所需营养素的合成代谢，对加速皮肤再生与修复进程至关重要。

胶原蛋白和透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是皮肤组织中最重要的细胞分泌基质成分。天然皮肤组织中胶原蛋白形成纤维网络，透明质酸镶嵌整合为组织结构并赋予生理功能，协同发挥生物学作用，促进细胞迁移、分化和增殖代谢活性。胶原蛋白与透明质酸等细胞外重要基质成份经过理化特性优化和重组，非常适合皮肤局部愈合所需微环境下的皮肤修复与再生。

HA在体内是以其酸的形式存在，而现有提取方法由于工艺上的限制通常以其盐的形式获得；胶原与盐形式的HA二者带相反电荷，在液体状态下极易形成聚合物而产生沉淀，因此，这大大限制了胶原蛋白-HA仿生复合修复材料的研究与应用。为了扩展胶原蛋白-HA仿生复合修复材料的用途，现有的专利文献报道的方法包括设计将二者隔离使用(201310099817.4)；也有通过物理或化学方法将二者相溶混合，如通过电化学处理去除HA中的钠盐(200910041033.X)，但工艺比较复杂；疏基化HA改性，与胶原自交联形成水凝胶三维支架(201711462799.6)，改性后将影响胶原的功能活性的发挥。

此外，胶原的等电点为pH7.4左右，当溶液接近中性时胶原不稳定，容易析出。然而，中性环境是细胞中代谢最适的pH。

发明内容

针对现有技术中存在的主要问题，本发明提供一种I型胶原和透明质酸相溶并保持它们活性的复合物，该复合物制备简单，成本低，体系稳定。

因此，一方面，本发明提供了一种含有I型胶原和透明质酸的复合物，其特征在于，该复合物包括I型胶原、透明质酸和平衡物质；其中，所述平衡物质包括NaH₂PO₄-Na₂HPO₄体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系或HEPES体系，以及包括NaCl和/或KCl；该复合物的pH为6-8。

另一方面，本发明提供了所述复合物在制备皮肤损伤修复的药物中的用途；或者所述复合物用于修复皮肤损伤的化妆品。

另一方面，本发明提供了一种制备含有I型胶原和透明质酸的复合物的方法，其中，该方法包括以下步骤：

a.配制平衡物质：向水中加入NaH₂PO₄-Na₂HPO₄体系的物质、Tris-HCl体系的物质、Tris-马来酸体系的物质或或HEPES体系的物质，以及NaCl和/或KCl；

b.向所述平衡液中加入I型胶原和透明质酸，获得含有I型胶原和透明质酸的复合物，该复合物的pH为6-8。

本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物，在生理pH值范围内，I型胶原和透明质酸能够以任意比例互溶，而且体系稳定，长时间放置也不会出现沉淀；而且在优选的方式中，该复合物的渗透压和张力均适于生理体系。

本发明提供的含有I型胶原蛋白和HA的复合物能够有效促进表皮细胞分泌胶原纤维及基质、抑制炎症过敏、抗衰老的活性成分，调控细胞代谢活性，能够有效地促进皮肤组织修复及恢复血液循环。

本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物的制备方法非常简单，成本低廉，易于大规模生产。

附图说明

图1：实施例1制备的I型胶原及Sigma公司提供的I型胶原的SDS-PAGE电泳图谱；

图2：实施例1制备的Ⅰ型胶原的特征性吸收峰；

图3A：对比例1制备的混合液的特征性吸收峰；图3B：实施例2制备的凝胶液的特征性吸收峰；

图4A：对比例2制备的混合液的特征性吸收峰；图4B：实施例3制备的凝胶液的特征性吸收峰；

图5A：对比例3制备的混合液的特征性吸收峰；图5B：实施例4制备的凝胶液的特征性吸收峰；

图6A为对照组、添加CI和HA组、添加CI，HA和SAC组的Col1-α1的mRNA表达的图；图6B为对照组、添加CI和HA组、添加CI，HA和SAC组的Col17-α1的mRNA表达的图；图6C为对照组、添加CI和HA组、添加CI，HA和SAC组的iNOS的mRNA表达的图；图6D为对照组、添加CI和HA组、添加CI，HA和SAC组的LIF的mRNA表达图；6E为对照组、添加CI和HA组、添加CI，HA和SAC组的MMP-1的mRNA表达的图；

图7A为激光治疗痤疮后涂敷类人胶原蛋白修复敷料治疗前脸部状况；图7B为涂敷类人胶原蛋白修复敷料2.5天时脸部状况；图7C为涂敷本发明凝胶液0.5天时脸部状况；图7D为涂敷本发明凝胶液1.5天时脸部状况；图7E为涂敷本发明凝胶液2.5天时脸部状况；

图8A为使用本发明凝胶液之前痤疮状况；图8B为使用本发明凝胶液2.5天时痤疮状况；

图9A为使用本发明凝胶液前疤痕的状况；图9B为在使用本发明凝胶液2周时疤痕的状况。

具体实施方式

本发明提供了一种含有I型胶原和透明质酸的复合物，其特征在于，该复合物包括I型胶原、透明质酸和平衡物质；其中，所述平衡物质包括NaH₂PO₄-Na₂HPO₄体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系或HEPES体系，以及包括NaCl和/或KCl；该复合物的pH为6-8。

为了获得等渗，优选地，NaCl和/或KCl的浓度为0.2-0.9重量％。

在本发明提供的复合物中，I型胶原和透明质酸能够在较广范围的比例互溶，因此，它们的重量比例没有特别的限制。

为了更加接近软骨组织中I型胶原和透明质酸的组成，优选地，I型胶原和透明质酸的重量比为1-20：10-1；更优选为1-5：5-1。

I型胶原和透明质酸的浓度没有特别限制，但为了有效补充I型胶原和透明质酸，优选地，I型胶原的浓度为0.5-8mg/ml，优选为1-5mg/ml；透明质酸的浓度为0.1-8mg/ml，更优选为0.5-5mg/ml。

为了提供更接近生理体系的复合物，在本发明的一个优选实施方式中，所述平衡物质包括NaH₂PO₄-Na₂HPO₄体系和NaCl；其中，在所述复合物中，NaH₂PO₄的浓度为0.04-0.7重量％、Na₂HPO₄的浓度为0.1-0.9重量％、NaCl的浓度为0.3-0.8重量％；优选地，NaH₂PO₄的浓度为0.08-0.64重量％、NaH₂PO₄的浓度为0.2-0.8重量％、NaCl的浓度为0.4-0.5重量％。

为了进一步提高本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物的稳定性，其中，所述平衡物质还含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80中的一种或几种。

在一种优选的实施方式中，所述平衡物质含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80；优选地，所述葡萄糖的浓度为0.1-10重量％，优选为1-5重量％；所述1,3丙二醇的浓度为0.5-3重量％，优选为0.5-2重量％；所述吐温80的浓度为0.1-1重量％，优选为0.1-0.5重量％。

发明人发现，在本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物，平衡物质不仅能够提供生理环境下的pH值，具有增溶与助溶作用，有助于使I型胶原与HA以任意比例互溶；同时能有效维持液体等张及渗透压，非常适于生理体系的直接应用。

为了进一步提高皮肤的修复效果，本申请发明人对大量的中药成分进行了研究，并意外发现丹参提取物加入到上述的含有I型胶原和透明质酸的复合物，能够在保护、改善软骨细胞生长微环境的同时，具有刺激细胞生理代谢分泌活动，调控信号通路活性促进表皮细胞再生，抑制活化损伤炎症基因和引起的细胞凋亡关键因子iNOS表达、抑制参与介导炎症响应和刺激急性炎症蛋白合成的细胞介素LIF基因表达等多重调节作用，从而能在进一步提高修复效果的同时有效改善炎症与过敏反应。

因此，本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物还含有丹参提取物。

为了进一步提高修复效果，所述丹参提取物中活性成分的含量为50-99重量％，优选为60-90重量％。

为了进一步提高修复效果，所述活性成分的浓度为3-200μg/ml，优选为7-100μg/ml，更优选为10-50μg/ml。

为了进一步保持丹参有效成分的活性以及使药物进行缓释，所述丹参提取物以微囊的形式存在于所述复合物中。微囊可以用现有技术制备，优选地，以壳聚糖、明胶、海藻酸盐及甲基纤维素等水溶性材料为囊材进行包裹制备微囊，其中囊心为丹参提取物。微囊可以克服丹参水溶性有效成份容易吸潮活性下降的问题，并起到缓释作用。

优选地，所述丹参提取物为水溶性提取物。

优选地，所述复合物还含有凝胶基质辅料；优选地，所述凝胶基质辅料的浓度为0.1-3重量％。所述凝胶基质包括但不限于纤维素衍生物、卡波姆、海藻酸盐、西黄蓍胶和明胶中的一种或几种。

本发明提供的复合物可以用于在制备皮肤损伤修复的药物中的用途；或者所述复合物用于修复皮肤损伤的化妆品。

所述皮肤损伤包括：各种外界因素导致的创伤：例如，烧伤、烫伤、冻伤、晒伤、割伤等导致的皮肤损伤；压疮，例如，褥疮，防护用品压力性损伤；疤痕；皮肤过敏，例如，季节性的皮肤过敏；红肿；痤疮；潮红；激光治疗手术后的红肿与炎症。

本发明还提供一种用于修复损伤皮肤的药物复合物，该药物复合物包括本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物。所述药物复合物根据实际情况需要还可以包括其它成分，例如抗生素。所述药物复合物还可以包括药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体可以为，例如填充剂、芳香剂、调味剂、着色剂、润湿剂、赋形剂、表面活性剂。

本发明提供的药物复合物可根据本领域已知的方法制备，制成适于人或动物使用的任何剂型。

本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物在所述药物复合物中的含量通常为0.1-95重量％，或可根据不同的应用由本领域技术人员进行相应调整。

本发明提供的药物复合物中，所述药物复合物可以为凝胶剂，贴敷料(例如，用无纺布、敷垫作为承托)等。

本发明还提供所述的药物复合物可以作为注射剂，或作为组织工程植入材料使用。本发明还提供一种用于修复损伤皮肤的化妆品，所述化妆品可以为洗面奶，面霜，乳液，面膜(可以为含有无纺布或棉纤维面膜，或者为不含无纺布的面膜)，或贴敷料等。

本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物在所述化妆品中的含量通常为0.1-95重量％，或可根据不同的应用由本领域技术人员进行相应调整。

本发明还提供一种制备含有I型胶原和透明质酸的复合物的方法，其中，该方法包括以下步骤：

a.配制平衡物质：向水中加入NaH₂PO₄-Na₂HPO₄体系的物质、Tris-HCl体系的物质、Tris-马来酸体系的物质或或HEPES体系的物质，以及NaCl和/或KCl；

b.向所述平衡液中加入I型胶原和透明质酸，获得含有I型胶原和透明质酸的复合物，该复合物的pH为6-8；

在一种优选的实施方式中，NaCl和/或KCl的浓度为0.2-0.9重量％。

在一种优选的实施方式中，制备的含有I型胶原和透明质酸的复合物中I型胶原和透明质酸的重量比没有特别限制，优选为1-10：10-1；更优选为1-5：5-1。

在一种优选的实施方式中，在制备的含有I型胶原和透明质酸的复合物中，I型胶原的浓度为0.5-8mg/ml，优选为1-5mg/ml；透明质酸的浓度为0.1-8mg/ml，优选为0.5-5mg/ml。

在本发明的一个优选实施方式中，所述平衡物质包括NaH₂PO4-Na₂HPO₄体系和NaCl；并且在制备的含有I型胶原和透明质酸的复合物中，NaH₂PO₄的浓度为0.04-0.7重量％、Na₂HPO₄的浓度为0.1-0.9重量％、NaCl的浓度为0.3-0.8重量％；优选地，NaH₂PO₄的浓度为0.08-0.5重量％、NaH₂PO₄的浓度为0.3-0.8重量％、NaCl的浓度为0.4-0.5重量％。

在本发明的一个优选实施方式中，所述平衡物质还含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80中的一种或几种。

在一种优选的实施方式中，在制备的含有I型胶原和透明质酸的复合物中，所述平衡物质含有葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80；优选地，所述葡萄糖的浓度为0.1-10重量％，优选为1-5重量％；所述1,3丙二醇的浓度为0.5-3mg/ml，优选为0.5-2mg/ml；所述吐温80的浓度为0.1-1mg/ml，优选为0.1-0.5mg/ml。

在一种优选的实施方式中，本发明的制备含有I型胶原和透明质酸的复合物的方法还包括向步骤b中获得含有I型胶原和透明质酸的复合物中加入包裹丹参提取物的微囊。

所述微囊可以采用本领域已知的技术制备，优选地，采用喷雾干燥法包裹制备微囊；优选采用壳聚糖为囊材。

I型胶原和透明质酸都可以商购获得。

实施例

实施例1：胶原蛋白的制备及物理化学性能检测

前处理：牛筋腱切碎，清洗，生理盐水洗涤后包封，经Co⁶⁰消毒。余下步骤在无菌条件下进行。

制备高纯度的Ⅰ型胶原溶液：牛筋腱碎中加入0.5M醋酸适量，并加入胃蛋白酶(20g牛筋腱加入1克胃蛋白酶)，于6℃酶解24-48小时，15mmol/LEDTA终止酶解。离心收取上清液为I型胶原溶液，此过程在4℃进行。

纯化：按体积1:1加入胶原溶液及10％NaCl盐析，静置过夜。离心获取沉淀，用0.5M醋酸溶解，去离子水中透析至pH 5，得到高纯度的I型胶原溶液(≧10mg/ml)。

标准对照产品：SigmaI型胶原产品C9301，称取0.6mg，加入0.5M乙酸120μL缓慢震荡使其溶解，配置成5mg/ml溶液。取10μL加入平衡液中备用。

I型胶原蛋白质量检测(参照中国医药行业标准YY0954-2015附录B杂蛋白检测方法)：采用Tris-甘氨酸不连续分离系统，配制6％分离胶、5％浓缩胶。取浓度为10mg/ml的I型胶原溶液及Sigma标准对照液，各10μl，加入90μL双蒸水稀释后，按比例加入2xLoadingbuffer混匀，沸水浴10min；12000xg，5min离心取上清液15μL进行SDS-PAGE电泳。条件：60V，20min；120V，1h 25min(仪器型号：Bio-Rad，PowerPac Universal)，用考马斯亮蓝R-250染色液对凝胶进行染色，扫描凝胶成像(Umax,PowerLook,2100XL-USB)，得到高纯度特征性I型胶原条带。图1中左一道为分子量标准物，左二道为上述制备的I型胶原；右一道为sigma的I型胶原。

取2μL样品，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)扫描，波长200nm-800nm，胶原特征峰217、230nm读数分别为1.592和1.397(图2)，符合Ⅰ型胶原蛋白特征要求。

采用实施例1制备的I型胶原和进行后续实验。

实施例2：本申请复合的制备(pH 6)

a.配制平衡物质(90ml)：在去离子水中加入NaH₂PO₄ 0.643g，Na₂HPO₄ 0.189g；NaCl 0.47g，葡萄糖0.1g，1,3丙二醇0.5ml，吐温80 0.1ml。

b.量取10mg/ml I型胶原液10ml。

c.HA 800mg溶于a配制的平衡物质40ml中，HA浓度20mg/ml。

d.混合步骤a、b、c，获得含有Ⅰ型胶原和HA的复合物100ml，该复合物的pH 6，NaH₂PO₄的浓度约为0.643重量％，Na₂HPO₄的浓度约为0.189重量％，NaCl的浓度约为0.47重量％，葡萄糖的浓度约为0.1重量％，1,3丙二醇的浓度为0.5ml/ml，吐温80的浓度为0.1ml/ml，Ⅰ型胶原的浓度为1mg/ml，HA的浓度为8mg/ml。

实施例3：本申请复合物的制备(pH 7)

a.配制平衡(70ml)物质：在去离子水中加入NaH₂PO₄ 0.322g，Na₂HPO₄ 0.566g，NaCl 0.45g，葡萄糖2g，1,3丙二醇1.5ml，吐温80 0.5ml。

b.量取10mg/ml的Ⅰ型胶原液30ml。

c.HA 200mg溶于a配制的平衡物质20ml中，HA浓度10mg/ml。

d.混合步骤a、b、c，获得获得含有Ⅰ型胶原和透明质酸的复合物100ml，该复合物的pH为7，NaH₂PO₄的浓度约为0.322重量％；Na₂HPO₄的浓度约为0.566重量％，NaCl的浓度约为0.44重量％，葡萄糖的浓度约为5重量％，1,3丙二醇的浓度为1.5ml/ml，吐温80的浓度为0.5ml/ml，透明质酸的浓度为2mg/ml，Ⅰ型胶原的浓度为3mg/ml。

实施例4：本申请复合物的制备(pH8)

a.配制平衡物质(20ml)：在去离子水中加入NaH₂PO₄的浓度为0.04g；Na₂HPO₄0.897g；NaCl 0.42g，葡萄糖4g，1,3丙二醇3ml，吐温80 0.98ml。

b.量取10mg/ml的Ⅰ型胶原液80ml。

c.HA 50mg溶于a配制的平衡物质5ml中，HA浓度10mg/ml。

d.混合步骤a、b、c，获得含有Ⅰ型胶原和透明质酸的复合物100ml，该复合物的pH为8，NaH₂PO₄的浓度约为0.04重量％；Na₂HPO₄的浓度约为0.897重量％；NaCl的浓度约为0.42重量％，葡萄糖的浓度约为4重量％，1,3丙二醇的浓度为3ml/ml，吐温80的浓度为0.98ml/ml，透明质酸的浓度为0.5mg/ml，Ⅰ型胶原的浓度为8mg/ml。

对比例1：制备低浓度的胶原和HA的混合液

用实施例1方法制备Ⅰ型胶原溶液，浓度为2mg/ml。

用PBS配制HA溶液，浓度为16mg/ml，pH 6。

以1:1混合步骤a与b配制的溶液，即按照混合后终浓度透明质酸为8

mg/ml，Ⅰ型胶原的浓度为1mg/ml添加，获得含有Ⅰ型胶原和透明质酸的混合液(有沉淀生成)，该混合液的pH为6。

对比例2：制备中等浓度的胶原和HA的混合液

用实施例1方法制备高浓度I型胶原溶液，浓度为6mg/ml。

用PBS配制HA溶液，浓度为4mg/ml。

以1:1混合步骤a与b配制的溶液，即按照混合后透明质酸的终浓度为2mg/ml，I型胶原的浓度为3mg/ml添加，获得含有I型胶原和透明质酸的混合液(有沉淀生成)，该混合液的pH为7。

对比例3：制备高浓度的胶原和HA的混合液(pH 8)

用实施例1方法制备高浓度I型胶原溶液，浓度为16mg/ml。

用PBS配制HA溶液，浓度为1mg/ml。

以1:1混合步骤a与b配制的溶液，即按照混合后终浓度透明质酸为0.5mg/ml，Ⅰ型胶原的浓度为8mg/ml添加，获得含有Ⅰ型胶原和透明质酸的混合液(有沉淀生成)，该混合液的pH为8。

物理性能测试1：检测I型胶原与HA稳定相容性(pH 6)

实施例2配制的复合物及对比例1配制的低浓度混合液，分别于4℃，12000xg，10min离心，吸取上清液备用。分别各取2μl样品检测，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)波长200nm-800nm连续扫描，并对Ⅰ型胶原特征峰230nm进行读数，发现混合液上清液中特征峰，230nm基本消失；而本发明复合凝胶液离心前后特征峰无显著变化(图3)。

羟脯氨酸法测定胶原浓度(参照中国医药行业标准YY0954-2015附录A胶原蛋白检测方法)：按照南京建成羟脯胺酸检测试剂盒(A030-2-1)说明书操作。吸取a处理的两种样品的离心上清液0.25ml，加入试剂盒中的水解液0.5ml混匀，沸水浴水解20min；调节pH至65，按操作步骤离心后取上清液，于波长550nm下检测吸光度，并于标准品进行比较，计算出I型胶原蛋白含量(表1)。

葡萄糖醛酸法测定透明质酸钠含量(参照中国医药行业标准YY0308-2004附录A方法)：吸取a处理的两种样品的离心上清液、葡萄糖醛酸标准液各200μl置冰水浴中，缓慢加入预冷的0.025M四硼酸钠硫酸1ml摇匀，沸水浴中煮沸20min后取出冷却至室温，加入预冷的0.1％咔唑乙醇溶液40μl，充分摇匀后置于室温2h。用分光光度计测定550nm处各标准管与样品管的吸光度。利用标准曲线计算出样品管中葡萄糖醛酸含量，并根据公式换算样品中透明质酸钠质量浓度(表1)。

通过胶原及HA的浓度测定，结果显示混合液组离心后与离心前比较，HA与胶原浓度均有显著下降；而是海水里2配制的复合物离心前后HA与胶原浓度均无显著性差异，表明本发明平衡物质有良好的稳定性及促进相溶的作用。

表1 pH 6低浓度Ⅰ型胶原与HA稳定相容性实验蛋白检测分析

注：**有显著性差异

物理性能测试2：检测I型胶原与HA稳定相容性(pH 7)

实施例3配制的复合物及对比例2配制的中浓度混合液，分别于4℃，12000xg，10min离心，吸取上清液备用。分别各取2μl样品检测，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)波长200nm-800nm连续扫描，，并对Ⅰ型胶原特征峰230nm进行读数，发现混合液上清液中特征峰230nm基本消失；而本发明复合物离心前后特征峰无显著变化(图4)。

余下步骤与性能测试1中b-d相同，结果表明本发明平衡物质(pH 7)有良好的稳定性及促进相溶的作用(表2)。

表2 pH 7中等浓度Ⅰ型胶原与HA稳定相容性实验蛋白检测分析

注：**有显著性差异

物理性能测试3：检测I型胶原与HA稳定相容性(pH 8)

实施例4配制的复合物及对比例3配制的高浓度混合液，分别于4℃，12000xg，10min离心，吸取上清液备用。分别各取2μl样品检测，使用超微量核酸蛋白检测仪(Nanodrop 2000)波长200nm-800nm连续扫描，，并对Ⅰ型胶原特征峰230nm进行读数，发现混合液上清液中特征峰230nm基本消失；而本发明复合物离心前后特征峰无显著变化(图5)。

余下步骤与性能测试1中b-d相同，结果表明本发明平衡物质(pH 8)有良好的稳定性及促进相溶的作用(表3)。

表3 pH 8高浓度Ⅰ型胶原与HA稳定相容性实验蛋白检测分析

注：**有显著性差异

物理性能测试4：I型胶原与HA复合物存放稳定性检测

性能测试2中制备的I型胶原与HA复合物(pH 7)存放12周后，同样用羟脯氨酸法测定胶原的浓度、葡萄糖醛酸法测定透明质酸钠含量，结果显示放置12周后I型胶原与HA的含量与pH均无变化，表明本发明平衡物质具有良好的稳定性。

表4 pH 7I型胶原与HA凝胶液存12周放稳定性实验

性能测试5：本发明复合物对表皮细胞表型的影响

I型胶原包被培养板：将实施例3制备的I型胶原复合物(pH 7)加入24孔培养板中，每孔0.3ml，于37℃培养箱中干燥2天成膜。临用前添加DMEM-F12培养基1ml平衡备用。

表皮细胞(人角质形成细胞，Hacat细胞株)表型调控实验：

实验组分为：不加药的对照组、I型胶原(CI)+HA处理组，和I型胶原(CI)+HA+丹参提取物(丹参活性成分(Salvia active components,SAC))处理组，共三组。Hacat细胞接种于24孔板中，其中，I型胶原(CI)+HA处理组，和I型胶原(CI)+HA+SAC处理组的细胞接种于上述I型胶原包被的24孔板中；细胞接种密度每孔为3万，加入含有10％血清和1％双抗的MEM培养基，丹参提取物用PBS溶解，按照丹酚酸B有效浓度优选为20μg/ml的量添加；三种样品于37℃，5％CO₂条件下培养24小时。

荧光定量qPCR检测，分析测试5种基因分别为Col1-α1、Col17-α1、iNOS、LIF与MMP-1：同时以GAPDH检测作为内参基因进行表达量差异分析(图6)。结果显示：①促进细胞增殖分化的正向表型基因Col1-α1的表达：与对照组相比，I型胶原(CI)+HA组和I型胶原(CI)+HA+SAC组的Col1-α1的表达均有显著上调，差异有显著性；其中I型胶原(CI)+HA+SAC组显示最佳效果(图6A)。②介导角质形成细胞与基底膜的粘附，并作为细胞内、外联系的桥梁、缓解皮肤老化的基因Col17的表达：与对照组相比，I型胶原(CI)+HA组和I型胶原(CI)+HA+SAC组的Col17的表达均有显著上调，差异极显著；其中I型胶原(CI)+HA+SAC组显示最佳效果(图6B)。③活化损伤炎症基因和引起的细胞凋亡关键因子iNOS的表达：在加入生长调控因素后随着代谢活性的增加而呈现显著下调趋势，与对照组相比，I型胶原(CI)+HA组和I型胶原(CI)+HA+SAC组的iNOS的表达均有显著上调，差异极显著；其中I型胶原(CI)+HA+SAC组显示最佳效果(图6C)；④参与介导炎症响应和刺激急性炎症蛋白合成的细胞介素LIF基因表达，在加入生长调控因素后随着代谢活性的增加而呈现显著下调趋势，与对照组相比，I型胶原(CI)+HA组和I型胶原(CI)+HA+SAC组的iNOS的表达均有显著上调，差异极显著；其中I型胶原(CI)+HA+SAC组显示最佳效果(图6D)。⑤参与细胞表面受体的剪切，释放凋亡配体以及使趋化因子/细胞介素失活，使细胞产生破坏的MMP-1的表达：与对照组相比，I型胶原(CI)+HA组和I型胶原(CI)+HA+SAC组的MMP-1均有统计学显著下调，其中I型胶原(CI)+HA+SAC组的MMP-1的表达接近消失，显示最佳效果。上述结果表明本发明提供的复合物具有改善人角质形成细胞生长微环境，保护细胞代谢平衡等多重调节作用(图6E)。

以下实验将检测本发明提供的含有I型胶原和透明质酸的复合物在改善红肿，痤疮，疤痕等方面的效果

以下实验采用的凝胶通过以下方法制备：将99重量％的实施例3获得的凝胶与1重量％的羟甲基丙基纤维素混合均匀。

性能测试6：

入选对象情况(1名自愿者)：痤疮在采用激光治疗术后当天，脸部出现红肿、炎症及过敏症状的患者。

实验过程：在采用激光治疗痤疮的当天晚上，用常规办法流水清洁脸部皮肤，擦干。挤出适量“类人胶原蛋白修复敷料”(西安巨子生物基因技术股份有限公司)，均匀涂抹患处皮肤，早晚各一次，使用2.5天，患者感觉去红、消炎效果不明显，参见图7A和7B。图7A涂敷“类人胶原蛋白修复敷料”前脸部状况；图7B为涂敷“类人胶原蛋白修复敷料”2.5天时脸部状况；

然后，该患者涂敷本发明的凝胶液，方法同使用“类人胶原蛋白修复敷料”相同。图7C为使用本发明凝胶液0.5天时脸部状况，图7D为使用本发明凝胶液1.5天时脸部状况；图7D为使用本发明凝胶液2.5天时脸部状况。结果表明：本发明的凝胶液能显著消除激光手术后的红肿、炎症。

性能测试7：

入选对象情况(10名自愿者)：青春期痤疮，脸部出现粉刺、丘疹、脓疱及红肿等症状。

使用方法：采用常规办法流水清洁脸部皮肤，擦干。用本发明凝胶液均匀涂抹患处皮肤，早晚各一次。所有自愿者在使用1天后，痤疮明显减轻。在使用2.5天后，效果非常显著。图8A为其中一位患者在使用本发明凝胶液之前痤疮状况；图8B为使用本发明凝胶液2.5天时痤疮状况。

性能测试8：

入选观察对象情况(1名)：手部激光去痣，术后形成增生性疤痕4月。

使用方法：清洁液洗手，擦干。用本发明凝胶液均匀涂抹患处皮肤，每天1次。图9A为使用本发明凝胶液前疤痕的状况；图9B为在使用本发明凝胶液2周时疤痕的状况。结果表明：本发明凝胶液能显著减小疤痕，原本凸起的肉芽组织变为扁平，显著减轻色素沉着。

性能测试9：

入选观察对象情况(20名自愿者)：长时间佩戴口罩、护目镜等防护用品，脸部出现压力性损伤，或有红肿、丘疹或痕痒等过敏表现。

使用方法：临睡前用常规办法流水清洁脸部皮肤，擦干。用本发明凝胶液均匀涂抹患处皮肤。第二天早上，所有自愿者的红肿、丘疹或痕痒症状明显消失。

Claims (9)

1.一种含有I型胶原和透明质酸的复合物，其特征在于，该复合物由I型胶原、透明质酸和平衡物质组成；其中，所述平衡物质由以下物质组成：1. NaH₂PO4-Na₂HPO₄体系、Tris-HCl体系、Tris-马来酸体系或HEPES体系；2. 葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80；3. NaCl和/或KCl；该复合物的pH为6-8，其中，所述葡萄糖的浓度为0.1-10重量%，所述1,3丙二醇的浓度为0.5-3重量%，所述吐温80 的浓度为0.1-1 重量%；NaCl和/或KCl的浓度为0.2- 0.9重量%；

其中，所述I型胶原按照以下方法制备：牛筋腱碎中加入0 .5M醋酸，并加入胃蛋白酶酶解24-48小时，此过程在4℃下进行；离心收取上清胶原液，按体积1:1加入胶原溶液及10％NaCl盐析，静置过夜；离心获取沉淀，用0 .5M醋酸溶解，去离子水中透析至pH 5。

2.根据权利要求1所述的复合物，其中，I型胶原和透明质酸的重量比为1-20：10-1。

3.根据权利要求1所述的复合物，其中，I型胶原的浓度为0.5-8 mg/ml，透明质酸的浓度为0.1-8 mg/ml。

4.根据权利要求1所述的复合物，其中，I型胶原的浓度为1-5 mg/ml，透明质酸的浓度为0.5-5 mg/ml。

5.根据权利要求1所述的复合物，其中，所述平衡物质由以下物质组成：NaH₂PO₄-Na₂HPO₄体系，葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80，和NaCl；其中，在所述复合物中，NaH₂PO₄ 的浓度为0.04-0.7重量%、Na₂HPO₄的浓度为0.1- 0.9重量%；所述葡萄糖的浓度为1-5重量%，所述1,3丙二醇的浓度为0.5-2重量%，所述吐温80 的浓度为0.1-0.5重量%；NaCl的浓度为0.3- 0.8重量%。

6.根据权利要求5所述的复合物，其中，NaH₂PO₄的浓度为0.08 - 0.64重量%、NaH₂PO₄的浓度为0.2- 0.8重量%、NaCl的浓度为0.4-0.5重量%。

7.权利要求1-6中任意一项所述的复合物在制备皮肤损伤修复的药物中的用途；或者所述复合物在制备用于修复皮肤损伤的化妆品中的用途。

8.权利要求7所述的用途，其中，所述皮肤损伤包括创伤、皮肤过敏、红肿、痤疮、潮红及疤痕修复。

9.一种制备权利要求1所述的含有I型胶原和透明质酸的复合物的方法，其中，该方法包括以下步骤：

a. 配制平衡物质：向水中加入NaH₂PO₄-Na₂HPO₄体系的物质、Tris-HCl体系的物质、Tris-马来酸体系的物质或HEPES体系的物质；2. 葡萄糖、1,3丙二醇和吐温80；3. NaCl和/或KCl；所述葡萄糖的浓度为0.1-10重量%，所述1,3丙二醇的浓度为0.5-3重量%，所述吐温80 的浓度为0.1-1重量%；

b．向所述平衡液中加入I型胶原和透明质酸，获得含有I型胶原和透明质酸的复合物，该复合物的pH为6-8，NaCl和/或KCl的浓度为0.2- 0.9重量%。