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CN116194078A - 水凝胶形式的包含橙来源的细胞外囊泡的药物组合物 - Google Patents

水凝胶形式的包含橙来源的细胞外囊泡的药物组合物 Download PDF

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CN116194078A
CN116194078A CN202180062349.6A CN202180062349A CN116194078A CN 116194078 A CN116194078 A CN 116194078A CN 202180062349 A CN202180062349 A CN 202180062349A CN 116194078 A CN116194078 A CN 116194078A
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evs
orange
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derived
hydrogel
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乔瓦尼·卡穆西
基亚拉·加伊
玛格丽塔·阿尔巴·卡洛塔·普马托
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Original Assignee
Eten Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及用于组织修复和/或再生治疗方法的水凝胶形式的药物组合物，其包含直径为10至500nm并显示促血管生成活性的橙来源的细胞外囊泡(EVs)。在本发明的药物组合物中，橙来源的EVs分散在水凝胶基质中并可从所述基质中释放。本发明还涉及制备所述药物组合物的方法。

Description

水凝胶形式的包含橙来源的细胞外囊泡的药物组合物
技术领域
本发明涉及水凝胶形式的包含橙来源的细胞外囊泡(EVs)的药物组合物及其在再生治疗中的用途。
背景技术
细胞外囊泡(EVs)是由各种活细胞释放的小颗粒混合群体。细胞外囊泡(EVs)包括通过质膜出芽释放的微囊泡和来自核内体区室的外泌体。细胞外囊泡被称为“颗粒”、“微粒”、“纳米囊泡”、“微囊泡”和“外泌体”(
Figure BDA0004119513270000011
M等人,Biological properties ofextracellular vesicles and their physiological functions.J ExtracellVesicles.2015年5月14日；4:27066doi:10.3402/jev.v4.27066；/>
Figure BDA0004119513270000012
J等人,Minimalexperimental requirements for definition of extracellular vesicles and theirfunctions:a position statement from the International Society forExtracellular Vesicles.J Extracell Vesicles.2014年12月22日；3:26913.doi:10.3402/jev.v3.26913.；Harrison P等人,Extracellular Vesicles in Health andDisease.CRC Press,1-5页,2014)。
EVs由包含细胞质蛋白、表面受体、脂质相互作用蛋白、DNA和RNA分子的磷脂双层形成。要传输的物质是复杂的，并根据细胞的来源而变化。EVs可以将其要传输的物质转移到受体细胞，通过这种方式，它们介导激活信号级联的细胞间通讯，和细胞反应。
几乎从所有哺乳动物细胞类型和体液中，以及从包括细菌和植物在内的低等生物中，都分离出了细胞外囊泡。近年来，许多治疗方法聚焦在细胞外囊泡的使用上，包括皮肤再生应用。
CN 2016/10983610A公开了在喷雾瓶中使用来源于间充质干细胞的细胞外囊泡与细胞因子组合用于治疗表皮损伤。
CN109865033A公开了包含间充质干细胞外泌体和软膏组合物的外用软膏用于修复糖尿病足伤口的用途。
最近的发现表明，可食用植物来源的EVs对皮肤也表现出有益的治疗效果。
WO2017/052267公开了局部施用的可食用天然植物来源的EVs在皱纹形成、保湿、增白、上皮细胞增殖和胶原沉积方面促进皮肤改善的用途。
WO 2019/027387 A2公开了小麦、大蒜和生姜来源的细胞外囊泡用于促进伤口闭合的用途，因为它们可以诱导角质细胞的迁移。
PCT/EP2020/056632公开了植物来源的EVs，包括橙来源的EVs，以及它们用于治疗溃疡、皮炎、角膜损伤、眼部疾病、粘膜损伤和感染性损伤的治疗用途。
在目前可用于伤口和损伤的治疗中，最常见的药物之一是以水凝胶为代表的。水凝胶最初开发于20世纪50年代，包含多种水合聚合物敷料，可调节伤口表面的液体交换。它们被用作皮肤伤口和损伤的治疗，因为它们调节伤口床中的液体水平并维持潮湿的环境，有利于组织修复。尽管有上述特性，水凝胶作为治疗剂效果不佳，因为它们不能直接促进愈合过程，如细胞增殖、细胞迁移或血管生成(Tavakoli S,Klar AS.Advanced Hydrogels asWound Dressings.Biomolecules.2020；10(8):E1169.2020年8月11日出版.doi:10.3390/biom10081169.Broussard KC,Powers JG.Wound dressings:selecting the mostappropriate type.Am J Clin Dermatol.2013；14(6):449-459.doi:10.1007/s40257-013-0046-4)。
为了克服现有技术的限制和缺点，本发明提供了如所附独立权利要求中定义的水凝胶形式的药物组合物，其包含橙来源的细胞外囊泡(EVs)，以及制备所述药物组合物的方法。从属权利要求确定了要求保护的组合物和方法的进一步有利特征。所附权利要求的主题构成了本说明书的组成部分。
发明内容
本发明人已经发现来源于橙植物或橙果实的细胞外囊泡促进皮肤闭合的有益过程，特别是血管生成。此外，本发明人进行的实验研究已经令人惊讶地揭示，与单独的EVs或水凝胶相比，与水凝胶组合的橙来源的EVs在加速以局部缺血或血管生成受损为特征的皮肤损伤的再生方面显著更有效。
据本发明人所知，现有技术没有公开源自橙植物或橙果实的细胞外囊泡具有促血管生成作用，也没有公开这些EVs与水凝胶的复合物在以局部缺血或血管生成受损为特征的伤口和皮肤损伤上局部施用时的治疗作用。
因此，本发明的一个方面是一种水凝胶形式的药物组合物，其包含：
(i)橙来源的细胞外囊泡(EVs)；
(ii)聚合物胶凝剂；
(iii)占组合物总重量至少10重量％的水；和
(iv)任选地，药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂，
其中所述橙来源的细胞外囊泡(EVs)被脂双层膜包围，并且其特征在于，通过基于光散射的纳米粒子追踪分析(NTA)测量，它们具有10至500nm的直径，并且它们显示促血管生成活性，
其中所述聚合物胶凝剂和水形成水凝胶基质，所述橙来源的EVs分散在其中，所述EVs可从所述水凝胶基质中释放，
用于组织修复和/或再生治疗方法。
如本文所用，术语“橙来源的细胞外囊泡”是指源自意指柳橙(Citrus sinensis)果实的橙果实的纳米颗粒，以及源自一种或多种橙物种(species Citrus sinensis)的植物的细胞的纳米颗粒。应当理解，术语“橙”包括本领域已知的任何橙品种。这类品种的非限制性例子是瓦伦西亚橙(Valencia)、脐橙、红橙、血橙、塔罗科橙(Tarocco)、甜橙、摩洛橙(Moro)、桑吉内洛橙(Sanguinello)和纽霍尔橙(Newhall)。
橙来源的EVs由磷脂双层分隔或包裹，并携带来自其来源细胞的脂质、蛋白质、核酸和其他分子。通常，细胞外囊泡的直径在10-1000nm的范围内。
本发明利用直径在10至500nm范围内，优选在20至400nm范围内，甚至更优选在25至350nm范围内的橙来源的细胞外囊泡(EVs)。
本领域技术人员很清楚可用于确定EV直径的标准方法。
在这些方法中，纳米粒子追踪分析(NTA)，基于布朗运动的分析，通常用于可视化和测量悬浮液中10-1000nm范围内的纳米粒子。这种方法允许用动态光散射(DLS)表征溶液中的细胞外泡囊。通过直接观察扩散来单独但同时分析每个囊泡。该分析允许确定颗粒浓度和尺寸分布。该尺寸与布朗运动相关，允许检测颗粒的平移扩散直径，即所谓的流体动力学直径。粒子运动的速率与液体的粘度、温度和粒子的尺寸有关，并且不受粒子密度或折射率的影响。粒子的运动速率与通过斯托克斯-爱因斯坦方程计算的球体等效流体动力学半径有关。事实上，悬浮液中粒子或分子的布朗运动导致激光以不同的强度散射。对这些强度波动的分析产生了布朗运动的速度，并因此使用斯托克斯-爱因斯坦关系得出了颗粒尺寸。
如本领域众所周知的，透射电子显微镜(TEM)也被认为是表征EVs形态的标准工具。TEM是一种高分辨率的显微镜方法，可以直接可视化和表征EVs。作为最常用的能够可视化EVs的技术之一，TEM允许研究EV的结构、形态、膜完整性和尺寸。
在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物中橙来源的EVs的量在组合物的总体积的1010至1012EVs/ml的范围内，更优选橙来源的EVs的量为1011EVs/ml。
在本发明的另一个优选实施方案中，药物组合物中橙来源的EVs蛋白的量在组合物总体积的5μg至500μg/ml的范围内，更优选在组合物总体积的40μg至60μg/ml范围内。
在本发明的一个实施方案中，EVs群体的蛋白质含量在1至103ng/109EVs的范围内。
在另一个实施方案中，EVs的RNA含量在10至60ng/1010EVs的范围内。
术语“蛋白质含量”和“RNA含量”包括用于本发明的EVs的内部和膜含量两者。
用于本发明的EVs中的脂质的例子包括但不限于24-亚丙基胆固醇、β谷甾醇、菜油甾醇、二棕榈酸甘油酯、二十烷醇和/或缩水甘油硬脂酸酯。
本发明的范围包括含有单一种类橙类的果实和/或植物来源的EVs的药物组合物，以及含有多个橙类的果实和/或植物来源的EVs的药物组合物。
本发明中使用的EVs的特征在于它们显示促血管生成活性。
在本说明书中，表述“促血管生成作用”旨在促进内皮细胞迁移、增殖或内皮细胞的血管形成，并增加体外或体内促血管生成介质的释放。血管生成是一种基本的生物学过程，其损伤涉及多种损伤的发病机理，所述损伤包括缺血性溃疡，如压迫性溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病性溃疡、缺血性溃疡、渗出性溃疡、代谢障碍性溃疡、创伤性溃疡和粘膜损伤如糖尿病性损伤。此外，血管生成对于向细胞提供营养和允许组织再生是必不可少的。血管生成加速不同损伤的再生，包括烧伤、瘘管、牛皮癣、角化病、角膜炎、裂纹、创伤性溃疡、粘膜损伤(例如由于假体引起的创伤性损伤、口腔、褥疮、生殖器粘膜损伤)、皮炎(包括痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、特应性皮炎、接触性皮炎、出汗性湿疹、神经性皮炎、疱疹样皮炎)、由旨在治疗癌前损伤(例如光化性角化病)的促凋亡药物诱导的细胞损伤。因此，用于本发明的橙来源的EVs在治疗上述疾病中特别有效。
优选地，根据本发明的橙来源的EVs是从橙汁或橙植物细胞的培养基中纯化的。橙植物细胞可以来自叶、果肉、嫩枝或芽。
合适的纯化技术包括但不限于超速离心和切向流过滤。选择用于纯化橙来源的EVs的最合适方法属于本领域普通技术人员的知识和技能范围。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物中橙来源的EVs是新鲜制备的。在另一个实施方案中，在与水凝胶组合之前，将药物组合物中橙来源的EVs储存在4℃、-20℃或-80℃下。在另一个实施方案中，橙来源的EVs在与水凝胶混合前被冻干。
根据本发明，药物组合物是水凝胶的形式。水凝胶是通过一种或多种聚合物胶凝剂单体的简单反应产生的水溶胀和交联的聚合物网络。通常，水凝胶基质由水和一种类型的聚合物或由不同聚合物的组合物组成。
根据本发明的药物组合物中水的量为组合物总重量的至少10重量％。
适用于本发明药物组合物的聚合物胶凝剂的示例性非限制性实例包括但不限于纤维素和基于纤维素的聚合物，例如羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、纤维素胶、胶原蛋白、水解胶原蛋白、壳聚糖、明胶、透明质酸(HA)、甘油、聚乙二醇(PEG)、多硫酸化糖胺聚糖(PSGAG)、甘油、丙二醇和藻酸钙。
在本发明的范围内，水凝胶由水和单一聚合物或不同聚合物的组合组成。应当理解，聚合物分子可以以其天然形式或经过化学改性使用。这些组分可以单独使用或组合使用。
水凝胶的优点是可以以几种不同的物理状态获得，包括例如薄片、无定形凝胶(干的或预混合的)和浸渍纱布。它们的高含水量吸引了一些生物医学应用，因为它模拟了软组织中高度水合的生理细胞外基质环境。事实上，水凝胶对治疗干燥伤口特别有效，因为它们具有再水合和维持潮湿环境的能力。此外，这些系统保持伤口闭合，通过自溶促进坏死组织的清除，并促进伤口清创。它们对伤口也有冷却作用，可以减轻感知到的疼痛。
在根据本发明的药物组合物中，橙来源的EVs分散并包封在水凝胶基质中，并以受控方式从所述基质中释放到损伤组织中，即逐渐地并在延长的时间内释放。
此外，EVs制剂的水凝胶包封允许稳定这些囊泡并保护它们免于降解，从而增强囊泡的治疗效果。此外，根据常规方法，本发明的药物组合物可以含有合适的赋形剂、防腐剂、溶剂或稀释剂。
示例性的赋形剂包括但不限于泛醇、二醇(包括丙二醇、聚乙二醇)、树胶(包括瓜尔胶)、糖(包括乳糖、葡萄糖、蔗糖)、山梨醇、甘露醇、木糖醇、硼酸和硼酸盐(包括四硼酸钠)、甘油(glycerol)、甘油(glycerin)、尿囊素、鱼精蛋白、山梨醇卡波姆或卡波姆钠、三乙醇胺、脲(包括咪唑烷基脲)、藻酸盐、EDTA、苯甲酸钠、磷酸钙和硅酸钙、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、硬脂酸镁、吐温、脂肪酸、脂肪酸醇、脂肪酸酯、植物提取物(包括芦荟叶汁)。
示例性防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯(包括对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、甲醛供体(包括DMDM乙内酰脲、咪唑烷基脲和戊二醛)、苯酚衍生物，苯甲酸，苯甲醇。合适的溶剂或稀释剂包括但不限于纯净水、乙醇和苯甲醇。
本发明的药物组合物还可以包括表面活性剂、湿润剂、抗氧化剂、粘度稳定剂、螯合剂、缓冲剂、低级醇、芳香剂、pH调节剂等。这些分子可以以其天然形式或经过化学改性的形式使用。这些组分可以单独使用或组合使用。
根据本发明，药物组合物可进一步包含一种或多种选自抗生素、抗细菌剂和抗真菌剂的抗微生物剂，以提高药物组合物促进损伤闭合的功效。合适的抗生素、抗真菌剂和抗细菌剂包括但不限于离子化银(Ag+)(包括氧化银、硝酸银、硫酸银、银盐、银沸石、磺胺嘧啶银(SSD)和银纳米颗粒(AgNPs))、聚维酮碘、卡地姆碘、氯己定葡萄糖酸盐、喹诺酮和氟喹诺酮(包括环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星)、青霉素(包括阿莫西林、双氯西林)、头孢菌素(包括头孢氨苄)、林可酰胺(包括克林霉素)、四环素(包括多西环素)、EDTA、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、链霉素、克林霉素和呋喃西林以及庆大霉素。这些分子可以以其天然形式或经过化学改性的形式使用。这些组分可以单独使用或组合使用。
为了提高促进伤口闭合的功效，本发明的药物组合物可以另外包含抗炎剂。合适的抗炎剂包括但不限于类固醇类抗炎剂(例如可的松、氢化可的松和泼尼松)以及非类固醇类抗炎剂(包括布洛芬、萘普生、双氯芬酸、水杨酸、吲哚美辛)。这些组分可以单独使用或组合使用。
此外，药物组合物可以含有生长因子和促再生剂，以提高其治疗效果。合适的生长因子和促再生剂包括但不限于表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。
优选地，根据本发明的药物组合物具有3.5至7.0，更优选4.0至5.0的酸性pH，以便降低伤口的pH，防止碱中毒，防止感染，并促进伤口闭合。
根据靶位点，本发明的药物组合物可以多种方式施用。对于皮肤和外粘膜修复，药物组合物可以局部地或通过局部注射施用。对于局部施用，药物组合物可以配制成凝胶、软膏、乳膏或油膏。优选地，药物组合物具有柔软的粘性质地，以改善对伤口的粘附而不渗漏。
为了促进EV-水凝胶的递送和控制EV随时间的释放，药物组合物可以与医疗装置如贴剂、手术线、纱布结合。
施用剂量和EVs释放的速率和持续时间根据各种因素来确定，例如待治疗的病况、患者的特征和损伤的大小，并且可以由本领域普通技术人员通过使用他/她的普通知识来确定。
优选地，橙来源的EVs从水凝胶基质中的释放进行至少一天(24小时)，例如至少两天(48小时)、至少三天(72小时)、至少四天、至少五天、至少六天、至少七天或至少八天。
当药物组合物被局部施用时，它应该优选被分布以完全覆盖伤口表面，并且任选地，它应该被辅助敷料覆盖以保持伤口清洁。
药物组合物可以包装成单个单位剂量，或多个单个单位剂量，优选包装在塑料管或铝管中。这种管可以提供有小喷口，该喷口允许凝胶分布到伤口床中。该药物组合物旨在增强细胞和/或组织修复。
如将在以下实施例中详细说明的，本发明的药物组合物结合了橙来源的促血管生成EVs和水凝胶的治疗效果，令人惊讶地实现了对受损组织的改善的协同再生效果。此外，本发明的药物组合物保证了EVs的稳定和储存，以及EVs向损伤部位的局部有效和时间控制的释放。
这些特征使得本发明的药物组合物特别适用于损伤组织(如皮肤和粘膜)中多种损伤的治疗性处理，特别是溃疡、皮炎、角膜损伤、眼部疾病、粘膜损伤和感染性损伤。本发明提供了组合在水凝胶中的橙来源的EVs作为治疗主题处理的适用性，其促进了对受损组织的再生作用和细胞修复，特别是当受损组织显示受损的血管生成或血管生成促进加速了受损组织中的再生时。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物用于皮肤、粘膜或软组织损伤的闭合的再生治疗方法中，例如用于皮肤伤口的闭合。
其中受损组织显示血管生成受损的疾病和病况包括但不限于缺血性溃疡(例如压迫性溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病性溃疡、缺血性溃疡、渗出性溃疡、代谢障碍性溃疡、创伤性溃疡)和粘膜损伤(例如糖尿病性损伤)。
其中促进受损组织中的血管生成加速组织再生的疾病和病况包括但不限于烧伤、瘘管、牛皮癣、角化病、角膜炎、裂纹、创伤性溃疡、粘膜损伤(例如由于假体等引起的创伤性损伤、口腔、褥疮、生殖器粘膜损伤)、皮炎(包括痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、特应性皮炎、接触性皮炎、出汗性湿疹、神经性皮炎、疱疹样皮炎)、由旨在治疗癌前损伤(例如光化性角化病)的促凋亡药物诱导的细胞损伤。
如上定义的药物组合物的制备方法也在本发明的范围内。根据本发明，该方法包括以下步骤：
(i)将聚合物胶凝剂溶解在预定量的水中以形成水凝胶基质，其中预定量的水占药物组合物总重量的至少10重量％；
(ii)向步骤(i)中获得的水凝胶基质中添加如上定义的橙来源的细胞外囊泡(EVs)；和
(iii)将所述橙来源的EVs与水凝胶基质混合，从而获得水凝胶形式的药物组合物，其中EVs分散在水凝胶基质中。
用于根据本发明的方法的合适的聚合物胶凝剂如上文有关药物组合物所描述。
优选地，聚合物胶凝剂溶解在预定量的水中，其浓度基于水的总体积在1至100mg/ml的范围内，更优选地，基于水的总体积在2至50mg/ml的范围内。
根据本发明的方法，步骤(ii)中橙来源的EVs与水凝胶基质的混合可通过涡旋进行，优选至少30秒的时间。
本发明的方法可以进一步包括步骤(iv)，在混合后，将含有分散在水凝胶基质中的橙来源的EVs的组合物在37℃下保持5-10分钟。
在本发明方法的一个实施方案中，在步骤(i)中，将聚合物胶凝剂在37℃的水中机械搅拌至少30分钟，以获得所述聚合物胶凝剂的完全溶解。
在另一个实施方案中，水凝胶和橙来源的EVs在混合前保持在37℃至少10分钟。
在又一个实施方案中，在步骤(iii)的混合之后，将获得的组合物在37℃保持至少10分钟。
附图说明
下面的实验部分纯粹是为了说明而提供的，并不旨在限制所附权利要求中定义的本发明的范围。在下面的实验部分中，参考了附图，其中：
图1显示了实验实施例1中橙来源的EVs的表征。(A)NanoSight分析和透射电子显微镜照片的代表性图像(原始放大倍数为60,000倍，比例尺为500nm(B)和150,000倍，比例尺为200nm(E))，显示了橙来源的EVs的直径尺寸。柱状图显示了(C)EVs的平均蛋白质含量，表示为109EVs中蛋白质的纳克(ng)，和(D)RNA含量，表示为1010EVs中RNA的纳克(ng)，这是在多个橙来源的EVs的制备物上测量的。
图2显示了在实验实施例2中从不同水凝胶中释放橙来源的EVs。EVs从水凝胶(羧甲基纤维素和胶原蛋白)中的释放以随时间释放的EVs数量(A代表羧甲基纤维素，C代表胶原蛋白)和蛋白质量(B代表羧甲基纤维素，D代表胶原蛋白)来评估。为了进行该实验，将包含水凝胶和不同剂量的EVs(108、109和1010EVs)的水凝胶或药物组合物保持在与生理盐水溶液直接接触的24孔板中。在时间0(0)和30分钟(30分钟)、1小时(1h)、3小时(3h)、6小时(6h)、24小时(24h)、48小时(48h)、72小时(72h)时，分析生理盐水溶液中EVs的存在。分别使用NanoSight仪器和BCA试剂盒，在每个时间点对生理盐水溶液中的EVs和蛋白质进行定量。水凝胶释放的EVs量以EV/ml的数值表示，而释放的蛋白质量以μg/ml表示。对每个数据集进行N＝3次实验。
图3显示了实验实施例3中药物组合物的橙来源的EVs在靶细胞中的掺入。用荧光标记的EVs(荧光染料PKH26)和水凝胶(羧甲基纤维素、胶原蛋白、乙基纤维素、壳聚糖、明胶、PEG)的混合物处理HMEC靶细胞。在不同时间点(6小时(6h)、24小时(24h)、48小时(48h)、72小时(72h))用Citofluorimetry测定靶细胞对EVs的摄取。EVs的摄取显示为与单独的靶细胞相比的信号强度的百分比(阴性对照，CTR-)。对每个数据集进行N＝3次实验。CTR-：未刺激的内皮细胞。108、109或1010EV：yu或不与水凝胶一起使用的橙来源的EVs的剂量。通过比较单独EVs或与水凝胶组合的EVs的囊泡摄取来计算统计显著性。p：***<0.005；****<0.001。
图4显示了在实验实施例4中本发明的药物组合物在体外促进内皮细胞上血管生成的能力。通过用单独的橙来源的EVs或单独的水凝胶或EVs和水凝胶的组合刺激内皮细胞24、48和72小时来进行管形成测定。直方图显示了如上所述进行刺激时在基质凝胶上形成的管结构的总长度(平均±SEM)。对每个数据集进行N＝3次实验。CTR-：未刺激的内皮细胞。CTR+：补充胎牛血清和生长因子的培养基。EV：109橙来源的EVs。H1：单独的羧甲基纤维素水凝胶。H1+EV：含109橙来源的EV的羧甲基纤维素水凝胶。H2：单独胶原蛋白水凝胶。H2+EV：含109橙来源的EV的胶原蛋白水凝胶。将每种情况与所有其他情况进行比较，计算统计显著性。p：****<0.0001vs.CTR-；#<0.0001vs.H1；<0.0001vs.H2；α<0.05vs EV。
图5显示了在实验实施例4中本发明的药物组合物在体外促进内皮细胞迁移的能力。划痕试验通过用单独的橙来源的EVs或单独的水凝胶或EVs和水凝胶的组合刺激内皮细胞24、48和72小时来进行。直方图显示了如上所述进行刺激后伤口闭合的百分比(平均值±SEM)。对每个数据集进行N＝3次实验。CTR-：未刺激的内皮细胞。CTR+：补充胎牛血清和生长因子的培养基。EV：109橙来源的EVs。H1：单独的羧甲基纤维素水凝胶。H1+EV：含109橙来源的EV的羧甲基纤维素水凝胶。H2：单独胶原蛋白水凝胶。H2+EV：含109橙来源的EV的胶原蛋白水凝胶。将每种情况与所有其他情况进行比较，计算统计显著性。p：****<0.0001vs.CTR-；**<0.01vs.CTR-；*<0.05vs.CTR-；#<0.0001vs.H1；§<0.0001vs.H2；α<0.05vs EV。
图6显示了在实验实施例4中本发明的药物组合物在体外促进成纤维细胞迁移的能力。划痕试验通过用单独的橙来源的EVs或单独的水凝胶或EVs和水凝胶的组合刺激成纤维细胞24、48和72小时来进行。直方图显示了如上所述进行刺激后伤口闭合的百分比(平均值±SEM)。对每个数据集进行N＝4次实验。CTR-：未受刺激的成纤维细胞。CTR+：补充有10％胎牛血清的培养基。EV：109橙来源的EVs。H1：单独的羧甲基纤维素水凝胶。H1+EV：含109橙来源的EV的羧甲基纤维素水凝胶。H2：单独胶原蛋白水凝胶。H2+EV：含109橙来源的EV的胶原蛋白水凝胶。将每种情况与所有其他情况进行比较，计算统计显著性。p：****<0.0001vs.CTR-；***<0.001vs.CTR-；#<0.0001vs.H1；§<0.0001vs.H2；α<0.05vs EV。
图7显示了在实验实施例4中不同类型的水凝胶在体外对内皮细胞和成纤维细胞没有毒性。用羧甲基纤维素水凝胶(H1)或胶原蛋白水凝胶(H2)刺激内皮细胞和成纤维细胞，通过BrdU增殖试验评估与阴性对照相比增殖速率的降低来测量毒性。该图显示了成纤维细胞(左上)和内皮细胞(右上)的增殖百分比(平均±SEM)。对每个数据集进行N＝3次实验。CTR-：未刺激的细胞。CTR+：添加10％胎牛血清的培养基用于成纤维细胞，或添加胎牛血清和生长因子(Endogro)的培养基用于内皮细胞。H1：单独的羧甲基纤维素水凝胶。H2：单独胶原蛋白水凝胶。将每种情况与CTR-进行比较，计算统计显著性。p：****<0.0001；**<0.01。
此外，图7显示了在实验实施例4中体外促进内皮细胞增殖的能力。用单独的橙来源的EVs或单独的水凝胶，或EVs和水凝胶的组合物刺激内皮细胞24、48和72小时。该图下部的图显示了如上所述进行24小时刺激后内皮细胞增殖的百分比(平均值±SEM)。对每个数据集进行N＝3次实验。CTR-：未刺激的细胞。CTR+：添加10％胎牛血清的培养基用于成纤维细胞，或添加胎牛血清和生长因子(Endogro)的培养基用于内皮细胞。EV：109橙来源的EVs。H1：单独的羧甲基纤维素水凝胶。H1+EV：含109橙来源的EV的羧甲基纤维素水凝胶。H2：单独胶原蛋白水凝胶。H2+EV：含109橙来源的EV的胶原蛋白水凝胶。将每种情况与所有其他情况进行比较，计算统计显著性。p：***<0.001vs.CTR-；#<0.05vs.H1；§<0.001vs.H2；α<0.05vsEV。
图8显示在实验实施例5中，本发明的药物组合物在体内溃疡模型中加速组织再生。在小鼠中诱导溃疡并用羧甲基纤维素(H1)、含109EVs的羧甲基纤维素(H1+EV)、壳聚糖(H2)、含109EVs的壳聚糖(H2+EV)处理。作为对照，使用未处理的溃疡(CTR-)。将伤口面积，即处理6天后测得的仍开放的伤口面积，表示为与时间0时的原始伤口面积相比的百分比。图的下方显示了处理伤口的代表性图像。每个数据集使用N＝5只动物。CTR-：未处理的伤口。通过比较不同处理与未处理组的效果来计算统计显著性(CTR-)：p：*<0.05；****<0.001。通过比较每种水凝胶与相同水凝胶和EVs(H1对H1+EV，或H2对H2+EV)的效果来计算统计显著性：p：$<0.05。
图9显示了在实验实施例5中，本发明的药物组合物在糖尿病体内溃疡模型中加速组织再生。在小鼠中诱导溃疡，并用羧甲基纤维素(水凝胶)、羧甲基纤维素和109EVs(水凝胶+EV)处理。作为对照，使用未处理的溃疡(CTR-)。(A)伤口面积，即在处理3、6、10和14天后测量的伤口仍开放的面积，以与时间0时的原始伤口面积相比的百分比报告。每个数据集使用N＝5只动物。CTR-：未处理的伤口。比较不同处理的效果，计算统计学显著性：p：*<0.05；**<0.01；***<0.005；****<0.001。(B、C、D)为处理14天后伤口组织的组织学分析结果。苏木精和曙红染色用于测量(B)伤口宽度，作为伤口大小(μm)，(C)上皮再形成的百分比，作为伤口中新形成的上皮与原始伤口大小相比的百分比，(D)伤口的上皮厚度(μm)。将使用水凝胶和EVs的组合的处理与使用单独的水凝胶(水凝胶)的处理以及未处理的伤口(CTR-)进行比较。每个数据集使用N＝5只动物。CTR-：未处理的伤口。比较不同处理的效果，计算统计学显著性：p：***<0.005；****<0.001。
具体实施方式
材料和方法
细胞外囊泡分离
从橙汁中分离出胞外囊泡。压榨橙植物的果实，然后使用递减的孔隙等级依次过滤果汁以除去纤维。然后用差速超速离心或切向流过滤将EVs纯化。对于差速超速离心，将汁液在1,500g下离心30分钟以除去碎片和其他污染物。然后，通过在4℃首先以10,000g超速离心，然后以100,000g超速离心1小时来纯化EVs(Beckman Coulter Optima L-90K，Fullerton，CA，美国)。最终的沉淀用加入1％ DMSO的磷酸盐缓冲生理盐水重悬，并用0.22微米过滤器过滤以灭菌。
细胞外泡囊在-80℃下长期使用或储存。对于切向流过滤，首先通过用Supracap50(Pall)深度过滤片盘过滤以排除纤维和碎片使汁液变得澄清。然后，使用切向流过滤盒TFF Omega(Pall Cadence)通过浓缩和渗滤来纯化过滤的汁液。最后，来自切向流过滤的滞留物通过用0.2nm过滤器过滤进行灭菌。
纳米粒子追踪分析(NTA)
使用纳米粒子追踪分析(NTA)来定义直径和轮廓的EV尺寸，使用配备有405nm激光器和NTA 3.1分析软件的NanoSight LM10系统(NanoSight Ltd.，Amesbury，英国)。样品中存在的EVs在激光器光源下的布朗运动由照相机记录，并由NTA通过斯托克斯-爱因斯坦方程转换成尺寸和浓度参数。照相机水平对于所有的采集都在16，并且对于每个样本，记录了五个30秒持续时间的视频。简而言之，将纯化的EVs以1∶2000稀释在1ml无囊泡的生理盐水溶液中(Fresenius Kabi，Runcorn，英国)。优化NTA采集后设置，并在所有样本中保持恒定，然后分析每个视频以测量EV均值、模式和浓度。
透射电子显微镜(TEM)
通过将EVs加载到200目镍聚醋酸甲基乙烯脂碳涂覆网格(Electron MicroscopyScience,Hatfield,PA)上20分钟来进行EVs的透射电子显微镜检查。然后用含有2.5％戊二醛和2％蔗糖的溶液固定EVs，在蒸馏水中反复洗涤后，用NanoVan(Nanoprobes，Yaphank，nk，美国)对样品进行负染色，并用Jeol JEM1010电子显微镜检查。
蛋白质提取和定量
通过补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,美国)混合物的RIPA缓冲液(150nM NaCl，20nM Tris-HCl，0.1％十二烷基硫酸钠，1％脱氧胆酸钠，1％ Triton X-100，pH 7.8)从EVs中提取蛋白质。按照制造商的方案，通过BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，美国)对蛋白质含量进行定量。简而言之，将10μl样品分配到96孔板的孔中，使用用牛血清白蛋白(BSA)建立的线性标准曲线测定总蛋白浓度。
RNA提取和定量
根据制造商的方案，使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从EVs和细胞中分离总RNA。使用分光光度计(mySPEC,VWR,Radnor,PA,美国)对样品的RNA浓度进行定量。
水凝胶制备
通过将水凝胶重悬在水或生理盐水溶液中来生产水凝胶。使用的水凝胶包括羧甲基纤维素、胶原蛋白、乙基纤维素、壳聚糖、明胶和PEG(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri，美国)。充分混合后，通过用0.22μm过滤器过滤将水凝胶灭菌并备用。为了将水凝胶与橙来源的EVs结合，将水凝胶与不同剂量的EVs(108、109、1010EVs)混合。
细胞培养
人微血管内皮细胞(HMEC)通过用猿猴病毒40永生化原代人真皮微血管内皮细胞的获得。在补充有bullet kit(EBM，Lonza，Basel，瑞士)和1ml Mycozap CL(Lonza)的内皮基础培养基中培养HMEC。正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)是原代成人成纤维细胞(Lonza)。NHDF在补充有bullet kit和1ml Mycozap PR(Lonza)的FGM-2生长培养基(Lonza)中培养。
细胞外囊泡摄取
为了评估橙来源的EVs对细胞的摄取，在37℃下用PKH-26染料(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri，美国)标记EVs 30分钟，并使用10mL聚碳酸酯管(SW 90Ti转子，Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机)在4℃下通过100,000g超速离心洗涤2小时。对于摄取实验，将25,000个HMEC细胞/孔铺在24孔板中，并用含有生理盐水溶液(CTR-)、水凝胶或水凝胶和EVs的组合物的具有0.4μm孔的小室培养。在每个时间点(6、24、48和72小时)后，移除小室，充分洗涤细胞，用胰蛋白酶分离细胞，并使用带有CytExpert软件(Beckman Coulter Optima L-90K，Fullerton，CA，美国)的CytoFLEX流式细胞仪通过FACS测量它们的荧光。
体外成管试验
在24孔板中，在生长因子减少的Matrigel(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ，美国)上研究试管或毛细血管样结构的体外形成。将HMEC(25,000个细胞/孔)接种到单独的DMEM(未处理的对照)或EndoGRO MV-VEGF培养基(阳性对照)中的基质凝胶包被的孔上，或者接种到在DMEM中单独的水凝胶或含有EVs的水凝胶(剂量109EVs)存在下的孔上。每个条件重复三次。孵育24小时后，记录每个孔的五个随机场相位衬度图像(放大倍数为×10)。使用ImageJ软件测量管状结构网络的总长度。结果表示为每种条件下总长度的平均值。用在24、48和72小时收集的条件培养基重复该试验。
体外划痕试验分析
将内皮细胞(HMEC)和成纤维细胞(NHDF)以～50×103细胞/孔的密度接种在24孔板的适当培养基中。当细胞达到完全聚合时，用无菌尖端产生划痕以模拟伤口。在刺激(t＝0)之前，使用Leica照相机(Leica,Wetzlar,德国)获得孔的显微照片。然后用单独的DMEM(阴性对照)，或Endogro(Lonza)用于HMEC或DMEM，用10％ FBS用于NHDF作为阳性对照，或用含有EVs的DMEM(剂量109EVs)或在单独的水凝胶或含有EVs的水凝胶(剂量109EVs)存在下的DMEM刺激细胞。使用Leica相机拍摄照片，对“伤口闭合”现象进行24小时监控。通过ImageJ软件(Bethesda，MD，美国)测量伤口面积来分析图像。结果表示为伤口闭合的百分比，将t0时的伤口面积视为100％，并计算24小时时细胞占据的相应面积。用在24、48和72小时收集的条件培养基重复该试验。
体外增殖试验
将内皮细胞(HMEC)和成纤维细胞(NHDF)以2000细胞/孔的密度接种在96孔板中，并使其粘附。用DMEM替换培养基，放置过夜。然后，在单独的水凝胶或含有EVs的水凝胶(剂量为109EVs)存在下，用单独的DMEM(阴性对照)，或用于HMEC或Endogro(Lonza)用于HMEC或DMEM，用10％ FBS用于NHDF作为阳性对照，或在单独的水凝胶或含有EVs的水凝胶(剂量109EVs)存在下的DMEM刺激细胞72小时。每个条件重复进行四次。然后向每个孔中加入10μlBrdU标记溶液(BrdU比色分析，Roche)，并将平板孵育过夜。在培养24小时后分析刺激的效果。根据制造商的说明进行含量测定的开展。通过ELISA读板仪在370nm处测量吸光度。计算每种条件下的平均吸光度。吸光度直接地与增殖率成正比。将所有平均吸光度归一化为用作标准样品的未处理对照(CTR-)的平均值。结果显示了与等于1的阴性对照相比的相对增殖率。
体内实验
将9周龄的正常雄性(BALB)或患糖尿病的NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl(NGS)雄性小鼠麻醉，并通过电剃去除背部皮肤毛发。通过腹膜内注射链脲佐菌素(40mg/kg)4天诱发NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl(NGS)小鼠患糖尿病，并且在患有约20天糖尿病后治疗动物，测量为血糖水平>200。使用一次性活组织检查打孔器(PMD Medical)在中线的每一侧制造四个6毫米直径的全层皮肤伤口。每只动物的每个伤口都接受了不同的处理。受伤的那一天算作第0天。通过伤口测量在不同时间(第0、3、6天正常小鼠；对于糖尿病小鼠为0、3、6、10和14)监测动物。每次，伤口都接受新的治疗敷用。在最后一个时间点，处死小鼠，收集背部皮肤伤口进行组织学分析。使用苏木精和曙红染色进行组织学分析，并使用Imagej软件测量伤口宽度、作为伤口中新形成的上皮的百分比的上皮再形成的百分比、伤口的上皮厚度。
统计分析
使用软件Graph Pad 8(演示版)进行数据分析。结果以平均±标准误差(SEM)表示。单向方差分析(ANOVA)用于证实组间的统计差异，而Student’s t检验用于两个样本之间的比较。我们使用p<0.05作为最低显著性水平。
结果/实施例
实施例1
发明人在他们的实验中使用了橙来源的EVs。通过差速超速离心或切向流过滤分离EVs。用这两种方法得到的表征结果是相同的。通过Nanosight分析，橙来源的EVs显示直径尺寸在25-400nm范围内，平均直径尺寸约为200nm(图1A)。通过透射电子显微镜(TEM)分析展示，橙来源的EVs显示出由电子致密膜界定的圆形形态(图1B和1E)。TEM分析证实EVs的平均直径约为200nm。
为了检测橙来源的EVs的含量，测量了EVs的蛋白质和RNA含量。蛋白质浓度显示在图1C中，并显示了109个EVs的异质蛋白质含量均值为600ng蛋白质。RNA浓度如图1D所示，并显示了1010个EVs的可变RNA含量均值为22ng RNA。
进一步的分析表明橙来源的EVs含有囊泡特征性的蛋白质，如HSP70、HSP80、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PD)和果糖-二磷酸醛缩酶6(FBA6)；以及植物蛋白，如Patellin-3-like和网格蛋白重链。
此外，橙来源的EVs的脂质含量揭示了大量的脂质，包括24-亚丙基胆固醇、β谷甾醇、缩水甘油硬脂酸酯、二棕榈酸甘油酯、菜油甾醇、二十醇、二十烷、十六烷、十六醇、十八烷、十八醇、十四烷、十四烯、瓦伦烯(Valencene)和硬脂酸酯。
实施例2
本发明人进行了实验，以评估水凝胶以受控的方式保存和释放橙来源的EVs。为此，在增加的时间测量药物组合物周围微环境中释放的EVs和EV蛋白的量(图2)。简而言之，将本发明的药物组合物与生理盐水溶液接触，并在增加的时间点测量生理盐水溶液中EVs的释放。该分析清楚地表明，由羧甲基纤维素或胶原蛋白组成的水凝胶允许在30分钟后就能释放出颗粒形式的EVs(图2A、C)。此外，蛋白质的定量证实了30分钟后EVs已经从水凝胶中释放出来(图2B、D)。EVs的释放在30分钟后就可以检测到，随着时间的推移从24小时到48小时增加，在72小时后仍然存在。其他水凝胶(乙基纤维素、壳聚糖、明胶、PEG)也获得了类似的数据。综上所述，这些结果表明，所有水凝胶都能够保存橙来源的EVs，并在与细胞或皮肤表面接触时，允许其在增加的时间受控释放，在处理30分钟后开始，至少长达3天。
实施例3
为了发挥其生物学作用，橙来源的EVs必须通过水凝胶释放并进入靶细胞。为了评估掺入药物组合物中的EVs的功能，进行了实验来分析这些囊泡在不同时间点(6、24、48和72小时)进入(摄取)靶细胞的能力(图3)。对于这种类型的实验，药物组合物中包括渐增剂量的用荧光染料标记的橙来源的EVs(108EVs、109EVs、1010EVs)。
将组合物与靶细胞接触，通过细胞荧光分析来定量靶细胞(内皮细胞)中的EVs摄取。通过将本发明的药物组合物与单独的EVs(不含水凝胶)和单独的靶细胞(阴性对照，CTR-)进行比较来评估摄取速率。图3所示的结果表明，包含在药物组合物中的EVs和单独的EVs都进入了靶细胞。有趣的是，在处理6小时和24小时后，与水凝胶中包含的EVs相比，单独EVs的摄取显著更高。然而，随着时间的增加，即在48和72小时，趋势发生逆转，EVs与水凝胶的组合允许靶细胞中显著更高的摄取。这种效应随着时间的推移而增强，在72小时时达到最大峰值。综上所述，这些数据表明，与单独的EVs相比，水凝胶可以保护EVs免于降解，并且在24小时后允许这些囊泡更有效和更持久的释放以及允许它们被靶细胞摄取。用不同的水凝胶(羧甲基纤维素、胶原蛋白、乙基纤维素、壳聚糖、明胶、PEG)获得了类似的数据。
实施例4
为了研究本发明药物组合物的治疗潜力，进行了体外功能试验。具体而言，体外测试了包含橙来源的EVs和水凝胶的药物组合物促进内皮细胞血管生成和迁移以及成纤维细胞迁移的能力。
含有水凝胶和橙来源的EVs的药物组合物用于体外刺激细胞24、48和72小时。这里显示的结果是使用两种水凝胶(羧甲基纤维素水凝胶(H1)和胶原蛋白水凝胶(H2))获得的。用其他类型的水凝胶，包括明胶、壳聚糖、PEG和乙基纤维素获得了类似的结果。
EVs的促血管生成能力通过管形成试验来测试，将内皮细胞接种在基质胶(图4)上，该基质胶具有包含水凝胶和橙来源的EVs或单独的水凝胶或单独的EVs的药物组合物，并孵育24、48和72小时。内皮细胞用单独的橙来源的EVs(EV)、单独的水凝胶(H1、H2)、或用包含水凝胶和橙来源的EVs的药物组合物(H1+EV、H2+EV)刺激。在EVs释放24、48或72小时后，对所有条件进行测试。与未处理的对照(CTR-)相比，单独使用EVs(EV)时，以及与单独使用水凝胶(H1和H2)相比，使用包含水凝胶和EVs的组合物(H1+EV、H2+EV)时，观察到总管长度显著增加。此外，与单独的EVs(EV)和单独的水凝胶(H1、H2)相比，包含水凝胶和EVs(H1+EV、H2+EV)的组合物显示出在促进血管生成方面显著更有效。在每个时间点(24、48和72小时)观察到这种结果。这表明包含橙来源的EVs和水凝胶的组合物在促进内皮细胞上的血管生成方面具有协同效应，并且这种药物组合物在处理一天(24小时)后已经明显比单独的水凝胶或单独的橙来源的EVs更有效。所述效果在至少3天的处理中保持不变。
本发明的药物组合物对内皮细胞和成纤维细胞迁移的作用通过在单层细胞上进行划痕并在24小时后测量细胞的迁移来评估。用含有水凝胶和橙来源的EVs的药物组合物来体外刺激细胞24、48和72小时。
所示结果是使用两种水凝胶(即羧甲基纤维素水凝胶(H1)和胶原蛋白水凝胶(H2))获得的。用其他类型的水凝胶，包括明胶、壳聚糖、PEG和乙基纤维素获得了类似的结果。
本发明人观察到，与单独的EVs(EV)和单独的水凝胶(H1和H2)相比，使用橙来源的EVs和水凝的组合胶(H1+EV和H2+EV)，内皮细胞(图5)和成纤维细胞(图6)的迁移率显著更高，单独的EVs也能有效地促进细胞迁移，但程度在统计学上显著更低，而单独的水凝胶(H1和H2)无效，与未处理的对照相当。在EVs释放24、48或72小时后，在两种细胞上测试所有条件。实验证明，橙来源的EVs和水凝胶不仅在新血管的形成中具有协同效应，而且在促进内皮细胞的迁移中也具有协同效应，并且在处理一天(24小时)后，这种药物组合物明显比单独的水凝胶或单独的橙来源的EVs更有效。所述效果在至少3天的处理中保持不变(图5)。事实上，内皮细胞的迁移有助于新血管的形成(血管生成)，该数据支持本发明药物组合物的促血管生成活性。
在成纤维细胞上获得了类似的结果(图6)，表明包含橙来源的EVs和水凝胶的药物组合物也通过促进损伤中存在的其它细胞类型而发挥了治疗效果。事实上，成纤维细胞参与再生过程，对它们的迁移的促进有助于加速伤口闭合。本发明的药物组合物可作用于损伤部位的多个细胞的事实支持了其对加速组织再生和伤口闭合的有益效果。
此外，不同类型的水凝胶对内皮细胞和成纤维细胞的无毒性通过增殖试验进行体外评估(图7)。本发明人观察到羧甲基纤维素水凝胶(H1)或胶原蛋白水凝胶(H2)不影响也不降低成纤维细胞(图7，右上图)和内皮细胞(图7，左上图)的增殖速率。用不同类型的水凝胶，包括明胶、壳聚糖、乙基纤维素和PEG，也获得了类似的结果。化合物的毒性通过细胞增殖的减少来揭示。用H1或H2刺激的成纤维细胞和内皮细胞的增殖百分比与基础条件(未刺激的对照，CTR-)相当。这些数据表明，水凝胶是无毒的，可以与橙来源的EVs结合用于治疗目的。
此外，本发明人观察到，与单独的橙来源的EVs(EV)或单独的水凝胶(H1和H2)相比，从水凝胶释放的橙来源的EVs(H1+EV和H2+EV)显著增加了内皮细胞的增殖(图7，下图)。在本发明的组合物中，与未处理的对照(CTR-)相比，橙来源的EVs和水凝胶在促进内皮细胞增殖方面具有协同效应，并且所述组合物明显比单独的水凝胶或单独的橙来源的EVs更有效。所示结果是通过使用两种水凝胶(羧甲基纤维素水凝胶(H1)和胶原蛋白水凝胶(H2))获得的。其他类型的水凝胶，包括明胶、壳聚糖和乙基纤维素，也获得了类似的结果。
实施例4中说明的所有实验证实了EVs可以逐渐从水凝胶中释放，并在每个时间点(24、48和72小时)保持其生物效应。本发明的药物组合物在几个小时(6小时)的处理后已经改善了水凝胶和EV的生物活性。所述效果在至少3天的处理中保持不变。事实上，含有橙来源的EVs和水凝胶的药物组合物在处理几个小时后就已经有效，并保持效力几天，并保证EVs逐渐分布到受体细胞。
实验实施例4中显示的所有结果表明，包含橙来源的EVs和水凝胶的药物组合物的治疗活性主要由其促血管生成活性介导。事实上，EVs和水凝胶的组合物促进内皮细胞的增殖和迁移，并诱导新血管的更高形成。此外，EVs和水凝胶的组合物也作用于参与损伤再生并存在于损伤中的其他细胞类型，例如成纤维细胞。通过促进成纤维细胞的迁移，EVs和水凝胶的组合物允许成纤维细胞迁移到损伤部位并沉积胶原蛋白，有助于促进伤口闭合。
实施例5
为了评估药物组合物的治疗效果，将不同的水凝胶与橙来源的EVs组合，并在体内溃疡模型上测试其活性(图8)。在小鼠模型中诱导溃疡，并用羧甲基纤维素(H1)、羧甲基纤维素和EVs(H1+EV)、壳聚糖(H2)、壳聚糖和EVs(H2+EV)处理。3天后更换药物，处理6天后评估疗效。以伤口面积与处理前0时间的初始伤口面积相比的百分比来衡量效果。数据清楚地表明，与未处理的伤口(CTR-)(图8)相比，单独的两种水凝胶(羧甲基纤维素和壳聚糖)都能够轻微地减少伤口面积。重要的是，每种水凝胶与橙来源的EV的组合显著增加了它们的治疗效果(H1+EV对H1，以及H2+EV对H2)。结果证实了包含水凝胶和橙来源的EVs的药物组合物的治疗功效。更具体地说，该实验证明了水凝胶与EVs的组合在加速伤口闭合方面比单独使用水凝胶更有效。为此，本发明的药物组合物尤其可用于治疗其中血管生成有利于并加速闭合过程的几种损伤，例如烧伤、瘘管、牛皮癣、角化病、角膜炎、裂纹、创伤性溃疡、粘膜损伤(例如由于假体等引起的创伤性损伤、口腔、褥疮、生殖器粘膜损伤)、皮炎(包括痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、特应性皮炎、接触性皮炎、出汗性湿疹、神经性皮炎、疱疹样皮炎)、由旨在治疗癌前损伤(例如光化性角化病)的促细胞凋亡药物诱导的细胞损伤。
为了进一步分析本发明药物组合物的治疗活性，在糖尿病性溃疡的体内小鼠模型上评估了所述组合物的再生效果(图9)。事实上，糖尿病溃疡比正常溃疡更难闭合，因为糖尿病损害了组织再生能力。伤口面积表示为伤口面积相对于处理前0时间的原始面积的百分比(图9A)。伤口在糖尿病小鼠上进行，并且每三天更换一次药物。在时间0和3、6、10和14天后进行伤口面积测量。该分析清楚地表明，在每个时间点，与未处理的伤口(CTR-)和单独的水凝胶(水凝胶)相比，本发明的药物组合物的处理在加速伤口闭合方面是最有效的(图9A)。
此外，使用水凝胶和EVs的组合的处理是唯一能够在处理3天后诱导伤口面积显著减少的处理(图9A)。组织的组织学分析证实，与单独的水凝胶和未处理的伤口(CTR-)相比，本发明的组合物具有更高的治疗效果(图9B、C、D)。用苏木精和曙红染色的组织切片用于测量伤口宽度(图9B)、上皮再形成的百分比(图9C)和上皮厚度(图9D)。
与仅用水凝胶处理或未处理的对照相比，用水凝胶和EVs的组合处理的伤口宽度显著减小(图9B)。
上皮再形成百分比的分析表明，与单独使用水凝胶处理或未处理的对照相比，使用水凝胶和EVs的组合的处理在伤口中诱导了显著更高的新上皮细胞形成(图9C)。新的上皮细胞对伤口的闭合至关重要。
最后，与单独用水凝胶处理或未处理的对照相比，用水凝胶和EVs组合处理的组织切片呈现出较高的上皮厚度(图9D)，表明再生更有效，并允许恢复通常较高上皮厚度。
总之，所有数据证实，与单独用水凝胶处理相比，在处理3天后，本发明的药物组合物在加速糖尿病性溃疡的伤口闭合方面具有更高的治疗效果。这表明这种药物组合物特别适用于治疗天然血管生成过程受损或损害的多种损伤，如糖尿病足溃疡、糖尿病粘膜溃疡、代谢障碍性溃疡，或存在缺血性损伤，包括缺血性溃疡，如压迫性溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡、缺血性溃疡、渗出性溃疡、创伤性溃疡和其他粘膜损伤。

Claims (15)

1.一种水凝胶形式的药物组合物，包含：
(i)橙来源的细胞外囊泡(EVs)；
(ii)聚合物胶凝剂；
(iii)占组合物总重量至少10重量％的水；和
(iv)任选地，药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂，
其中所述橙来源的细胞外囊泡(EVs)被脂双层膜包围，并且其特征在于，通过基于光散射的纳米粒子追踪分析(NTA)测量，它们具有10至500nm的直径，并且它们显示促血管生成活性，
其中所述聚合物胶凝剂和水形成水凝胶基质，橙来源的EVs分散在其中，所述橙来源的EVs可从所述水凝胶基质中释放，
用于组织修复和/或再生治疗方法。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述橙来源的EVs源自一种或多种橙物种植物和/或所述一种或多种橙物种植物的一种或多种果实。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述橙来源的EVs的量基于所述组合物的总体积在1010至1012EVs/ml的范围内。
4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述橙来源的EVs蛋白质的量基于所述组合物的总体积在5μg至500μg/ml的范围内。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述橙来源的EVs的蛋白质含量在1至1×103ng/109EVs的范围内。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述橙来源的EVs的RNA含量在10至60ng/1010EVs的范围内。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，其中所述聚合物胶凝剂选自由以下组成的组：纤维素和基于纤维素的聚合物，包括羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、纤维素胶、胶原蛋白、水解胶原蛋白、壳聚糖、明胶、透明质酸(HA)、甘油、聚乙二醇(PEG)、多硫酸化糖胺聚糖(PSGAG)、甘油、丙二醇、海藻酸钙及其任意组合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其进一步包含治疗剂，所述治疗剂选自由抗生素、抗细菌剂、抗真菌剂、抗炎剂、生长因子、促再生剂及其任意组合组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其具有在3.5至7.0之间的pH。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其用于组织损伤闭合的再生治疗方法中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其用于疾病或病况的治疗性处理，所述疾病或病况选自由以下组成的组：缺血性溃疡，例如压迫性溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病性溃疡、缺血性溃疡、渗出性溃疡、代谢障碍性溃疡、创伤性溃疡，粘膜损伤如糖尿病损伤、烧伤、瘘管、牛皮癣、角化病、角膜炎、裂纹、创伤性溃疡，包括由假体引起的创伤性损伤和口腔、褥疮、生殖器粘膜损伤的粘膜损伤，包括痤疮、湿疹、脂溢性皮炎、特应性皮炎、接触性皮炎、出汗性湿疹、神经性皮炎、疱疹样皮炎的皮炎，以及由旨在治疗包括光化性角化病在内的癌前损伤的促凋亡药物诱导的细胞损伤。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其适于局部施用或适于通过注射施用。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述治疗包括在至少1天的时间内从所述水凝胶基质中释放橙来源的EVs。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述橙来源的EVs从所述水凝胶基质中的释放是在至少7天的时期内进行的。
15.一种制备根据权利要求1至12中任一项所述的药物组合物的方法，包括以下步骤：
(i)将聚合物胶凝剂溶解在预定量的水中以获得水凝胶基质，其中所述预定量的水占所述药物组合物总重量的至少10重量％；
(ii)向步骤(i)中获得的水凝胶基质中添加如权利要求1、2、3、4、5或6中任一项所定义的橙来源的细胞外囊泡(EVs)；和
(iii)将所述橙来源的EVs与水凝胶基质混合，从而获得水凝胶形式的药物组合物，其中所述EVs分散在所述水凝胶基质中。
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