CN116003577A

CN116003577A - 一种用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白及其应用

Info

Publication number: CN116003577A
Application number: CN202310123476.3A
Authority: CN
Inventors: 孙怀庆; 郭朝万; 刘涵; 王宁; 聂艳峰; 肖湲
Original assignee: Guangdong Marubi Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Marubi Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2023-02-14
Filing date: 2023-02-14
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2043-02-14
Also published as: JP7601957B2; CN116003577B; JP2024115499A

Abstract

本发明提供一种用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白及其应用，编码所述用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的序列。SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列包括I型胶原蛋白950‑1075位氨基酸，III型胶原蛋白594‑729位和1193‑1199位氨基酸。所述重组胶原蛋白具有保湿、补充皮肤胶原、促进细胞增殖、抗氧化、抗衰老等功效，并且具有良好的组织相容性、皮肤透过性和安全性。

Description

一种用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白及其应用

技术领域

本发明属于皮肤护理技术领域，具体涉及一种用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白及其应用。

背景技术

当皮肤细胞内外环境发生变化，皮肤防卫和修复机制无法适应变化会造成皮肤的损伤和损伤逐渐积累后的衰老状态。研究表明，自由基是导致人体衰老的重要因素之一。人体内存在各种自由基，如超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基等，自由基会造成细胞和组织分解，代谢功能受损。除正常代谢外，人体内自由基的浓度还会受到阳光辐射、污染、运动程度、精神状态等因素的影响。因此使用含有抗氧化成分的护肤产品可以消除过多的自由基，延缓身体退化、抑制肌肤衰老。

裂褶菌多糖是一种产自裂褶菌的天然来源的β-D-葡聚糖，由(1-3)-连接的β-D-吡喃型葡萄糖残基主链和(1-6)-连接的吡喃型葡萄糖残基的侧链组成，具有抗氧化和抗辐射的能力。裂褶菌多糖可通过抑制细胞氧化酶系、络合诱导氧化的过渡金属离子来抑制自由基的产生；可通过清除自由基，调节基因表达及蛋白合成等途径来发挥抗辐射作用，延长辐射损伤细胞的凋亡时间，抑制脂质过氧化。

胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25-30％。胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。胶原蛋白包括Ⅰ型胶原分子、III型胶原分子、IV型胶原分子、Ⅺ型胶原分子等，胶原蛋白具有保湿、润泽皮肤，促进细胞增殖和增强细胞屏障的作用。

CN113057932A公开了一种改善皮肤皱纹的胶原蛋白护肤品，该改善皮肤皱纹的胶原蛋白护肤品包括如下重量份原料：活性植物5-15份、甘油10-15份、丁二醇1-2份、活性添加物7-13份、胶原蛋白5-10份以及去离子水30-40份，通过粉碎、混合、发泡搅拌、二次混合、灭菌、加入胶原蛋白、终混制备得到，该发明在制备时采用了一种护肤品生产设备使生产得到改善，收集方便，最终得到的护肤品具有胶原蛋白活性与促进胶原蛋白生产活性，可有效改善随着年龄增加皮肤衰老出现皱纹的问题。

CN102670477A公开一种治疗效果好，无副作用的改善皮肤缺陷的胶原蛋白护肤品。该护肤品以重量份数计为：海藻(富含植物胶原蛋白)10-30份、蜂蜜10-30份、维生素E1-5份。

因此，探索具备抗氧化、抗衰老、修复及保湿活性等多重功效的护肤品组合物，从多个角度强化皮肤损伤修复是非常有意义的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组胶原蛋白及其应用，尤其提供一种用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白，编码所述用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的序列。

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为：

GGGCCTCAAGGTATTGCTGGACAGCGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGTCAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTCCTGGCCCCTCTGGTGAACCTGGCAAACAAGGTCCCTCTGGAGCAAGTGGTGAACGTGGTCCCCCTGGTCCCATGGGCCCCCCTGGATTGGCTGGACCCCCTGGTGAATCTGGACGTGAGGGGGCTCCTGGTGCCGAAGGTTCCCCTGGACGAGACGGTTCTCCTGGCGCCAAGGGTGACCGTGGTGAGACCGGCCCCGCTGGACCCCCTGGTGCTCCTGGTGCTCCTGGTGCCCCTGGCCCCGTTGGCCCTGCTGGCAAGAGTGGTGATCGTGGTGAGACTGGTCCTGCTGGTCCCGCCGGAGAACGAGGTGGCCCTGGAGGACCTGGCCCTCAGGGTCCTCCTGGAAAGAATGGTGAAACTGGACCTCAGGGACCCCCAGGGCCTACTGGGCCTGGTGGTGACAAAGGAGACACAGGACCCCCTGGTCCACAAGGATTACAAGGCTTGCCTGGTACAGGTGGTCCTCCAGGAGAAAATGGAAAACCTGGGGAACCAGGTCCAAAGGGTGATGCCGGTGCACCTGGAGCTCCAGGAGGCAAGGGTGATGCTGGTGCCCCTGGTGAACGTGGACCTCCTGGATTGGCAGGGGCCCCAGGACTTAGAGGTGGAGCTGGTCCCCCTGGTCCCGAAGGAGGAAAGGGTGCTGCTGGTCCTCCTGGGCCACCTGGTGCTGCTGGTACTCCTGGTCTGCAAGGAATGCCTGGACCTGGTCCTTGCTGTGGTGGTTAA

本发明创造性地发现了一种新的重组胶原蛋白序列，编码所述用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的序列，SEQ IDNO:1编码的氨基酸序列包括I型胶原蛋白950-1075位氨基酸，III型胶原蛋白594-729位和1193-1199位氨基酸。所述重组胶原蛋白具有保湿、补充皮肤胶原、促进细胞增殖、抗氧化、抗衰老等功效，并且具有良好的组织相容性、皮肤透过性和安全性。

第二方面，本发明提供一种具有舒缓修复功效的组合物，所述具有舒缓修复功效的组合物包括：

如第一方面所述的用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白和裂褶菌多糖。

本发明所涉及的具有舒缓修复功效的组合物包括如第一方面所述的用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白和裂褶菌多糖，两种成分搭配使用，相辅相成，在保湿、抗氧化，促进细胞增殖，进而提高皮肤损伤修复等方面具有协同增效的作用。

优选地，所述具有舒缓修复功效的组合物以质量份数计包括：

0.01-0.5份用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白和0.1-5份裂褶菌多糖。

所述皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白的质量份数可以选择0.01份、0.1份、0.2份、0.3份、0.4份或0.5份等；

所述裂褶菌多糖的质量份数可以选择0.1份、1份、2份、3份、4份或5份等；

上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

本发明所涉及的具有舒缓修复功效的组合物以质量份数计包括0.01-0.5份用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白和0.1-5份裂褶菌多糖时，二者组合应用，皮肤损伤修复效果更优。

优选地，所述具有舒缓修复功效的组合物还包括保湿剂。

优选地，所述保湿剂包括甘油、1,3-丁二醇、透明质酸钠、乙酰化透明质酸钠、水解透明质酸钠或神经酰胺3中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合包括甘油和1,3-丁二醇的组合、1,3-丁二醇和透明质酸钠的组合或透明质酸钠和乙酰化透明质酸钠的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述保湿剂为甘油。

本发明所涉及的保湿剂特定选择甘油时，所述用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的组合还可以与甘油搭配使用，在保湿方面发挥更强的协同增效作用。

0.01-0.5份如第一方面所述的用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白、0.1-5份裂褶菌多糖和5-50份甘油；

所述甘油的质量份数可以选择5份、10份、15份、20份、25份、30份、35份、40份、45份或50份等；

优选地，所述裂褶菌多糖的制备方法包括：

裂褶菌在含葛根的培养基中发酵培养，发酵培养液使用Sevag法去除蛋白后，添加乙醇溶液沉淀发酵培养液中的多糖，制得所述裂褶菌多糖。

本发明所涉及的裂褶菌多糖是由裂褶菌在含葛根的培养基中发酵制得，制得的裂褶菌多糖在抗氧化，细胞修复，保湿和免疫调节等方面的效果更加显著。因此，培养基中添加葛根制得的裂褶菌多糖用于制备所述具有舒缓修复功效的组合物时，所述组合物的抗氧化、修复和保湿作用进一步增强。

第三方面，本发明提供一种具有舒缓修复功效的包裹体，所述具有舒缓修复功效的包裹体包括：

微囊包裹材料和包裹于所述微囊包裹材料内部的如第二方面所述的具有舒缓修复功效的组合物。

本发明提供的所述具有舒缓修复功效的包裹体是在如第二方面所述的具有舒缓修复功效的组合物的外部包裹微囊包裹材料，包裹后，所述具有舒缓修复作用的组合物渗透作用更强，在用于皮肤组织时，其发挥的保湿、抗氧化、舒缓修复等作用也进一步增强。

优选地，所述微囊包裹材料的制备原料包括聚甘油基非离子表面活性剂；

优选地，所述聚甘油基非离子表面活性剂包括聚甘油-10二异硬脂酸酯、聚甘油-10月桂酸酯或聚甘油-10油酸酯中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合包括聚甘油-10二异硬脂酸酯和聚甘油-10月桂酸酯的组合和聚甘油-10月桂酸酯或聚甘油-10油酸酯的组合或聚甘油-10二异硬脂酸酯和聚甘油-10油酸酯的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

第四方面，本发明提供如第三方面所述的具有舒缓修复功效的包裹体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)混合聚甘油基非离子表面活性剂和如第二方面所述的具有舒缓修复功效的组合物；

(2)对步骤(1)制得的混合物进行包裹辅助处理，制得所述具有舒缓修复功效的包裹体；所述包裹辅助处理包括高压脉冲电场辅助处理和/或超声波辅助处理。

本发明所述的具有舒缓修复功效的包裹体的制备方法仅需将有效成分与微囊包裹材料混合，在包裹辅助处理的作用下，即可制得所述包裹体，本方法制备工艺简单，易于工业放大。

优选地，步骤(2)所述包裹辅助处理为高压脉冲电场辅助处理。

优选地，所述高压脉冲电场辅助处理的场强为0.5-2kV/cm，脉冲处理个数为10-60个，物料电导率为2000-6000μS/cm。

所述0.5-2kV/cm中的具体数值可以选择0.5kV/cm、0.7kV/cm、0.9kV/cm、1.1kV/cm、1.3kV/cm、1.5kV/cm、1.7kV/cm、1.9kV/cm或2kV/cm等；

所述10-60个中的具体数值可以选择10个、20个、30个、40个、50个m或60个等；

所述2000-6000μS/cm中的具体数值可以选择2000μS/cm、3000μS/cm、4000μS/cm、5000μS/cm或6000μS/cm等；

第五方面，本发明提供如第一方面所述的重组胶原蛋白、如第二方面所述具有舒缓修复功效的组合物或如第三方面所述的具有舒缓修复功效的包裹体在制备皮肤护理产品中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1、本发明中编码所述用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白的核苷酸序列包括如SEQID NO:1所示的序列，SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列包括I型胶原蛋白950-1075位氨基酸，III型胶原蛋白594-729位和1193-1199位氨基酸。所述重组胶原蛋白具有保湿、补充皮肤胶原、促进细胞增殖、抗氧化、抗衰老等方面的功效，并且具有良好的组织相容性、皮肤透过性和安全性。

2、本发明所涉及的具有舒缓修复功效的组合物包括如第一方面所述的用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白和裂褶菌多糖，两种成分搭配使用，相辅相成，在保湿、抗氧化，促进细胞增殖，进而提高皮肤损伤修复等方面具有协同增效的作用。

3、本发明提供的所述具有舒缓修复功效的包裹体是在如第二方面所述的具有舒缓修复功效的组合物的外部包裹微囊包裹材料，包裹后，所述具有舒缓修复作用的组合物渗透作用更强，在用于皮肤组织时，其发挥的保湿、抗氧化、舒缓修复等作用也进一步增强。

4、本发明所述的具有舒缓修复功效的包裹体的制备方法仅需将有效成分与微囊包裹材料混合，在包裹辅助处理的作用下，即可制得所述包裹体，本方法制备工艺简单，易于工业放大。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。

下述实验中的pET-28a(+)载体购自麦克林；裂褶菌为购自广东省微生物研究所的裂褶菌GIM 5.43菌株；BL21(DE3)化学感受态细胞为购自默克货号为CMC0014-4X40UL的商品。

制备例1

本制备例提供一种用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白冻干粉，所述用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白冻干粉的制备方法包括如下步骤：

(1)重组质粒构建：按照前述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，选择表达载体大肠杆菌宿主适用的pET-28a(+)载体，送至测序公司进行合成，制得重组胶原蛋白表达载体pET-28a-1。

(2)重组发酵菌株构建：将pET-28a-1表达载体使用化学转化法转至大肠杆菌(BL21(DE3))感受态细胞中，利用琼脂糖凝胶电泳筛选转化后平板菌落中的阳性克隆子，将筛选出的阳性克隆子转接至2mL LB培养基，37℃，200rpm培养12h，培养后的菌液使用体积分数为50％的甘油稀释1倍，分装到冻存管中，冻存在-80℃条件下，制得重组胶原蛋白发酵菌株。

(3)重组发酵菌株发酵培养：将10μL LB重组胶原蛋白发酵菌液涂布于固体LB平板，37℃培养箱培养12h后，挑选单克隆，接种于50mL含50μg/mL卡那霉素含量的LB液体培养基中，置于摇床中37℃200rpm培养14h，然后以1:100的比例接种200mL含50μg/mL卡那霉素含量的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD＝0.6后加入IPTG，使终浓度达到1mM，继续培养4h，随后4℃，4000rpm，离心15min收集菌体。

(4)重组胶原蛋白纯化：将菌体超声破碎后离心，沉淀使用TritonX-100洗涤液洗涤，再次离心去除上清，沉淀加入6M盐酸胍，并调节pH到8，充分溶解沉淀后将溶解液过镍亲和层析树脂，使用20mM、50mM、100mM、200mM、500mM浓度梯度咪唑溶液依次洗脱，洗脱液使用蛋白浓缩柱浓缩后，收集浓缩液透析过夜(透析袋，RC膜，14KD，扁平宽度44mm(生工F600112))，随后使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，并按每5mg蛋白加入体积浓度5％的甘露醇水溶液0.5mL的比例与甘露醇水溶液混匀，随后使用冻干机在-40℃预冻10min，最后-35℃冻干，得到重组胶原蛋白冻干粉。

制备例2

本制备例提供一种裂褶菌多糖，所述裂褶菌多糖的制备方法如下：

(1)制备裂褶菌发酵产物：将裂褶菌按照5％的接菌量接种至发酵培养基中，28℃，160rpm条件下进行发酵。发酵120h后，将发酵产物进行离心处理，除去菌体及葛根粉末，得到发酵产物。发酵培养基成分为：0.6％葛根粉末、0.3％酵母浸膏、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾、3％葡萄糖以及余量的水。

(2)制备裂褶菌多糖：向发酵产物中添加等体积蒸馏水稀释，稀释后加入体积分数为0.5％的活性炭，于80℃水浴处理40min脱色，离心，滤液过400目筛网除去活性炭，得到清晰透明的发酵液，发酵液使用Sevag法洗脱蛋白5次，随后使用3倍体积95％乙醇沉淀发酵液中的多糖，洗涤后加入蒸馏水复溶，并在流水和蒸馏水中透析24h，透析液浓缩，冷冻干燥，制得所述裂褶菌多糖。

制备例3

本制备例提供一种裂褶菌多糖，所述裂褶菌多糖的制备方法与制备例2的区别仅在于，发酵培养基中不含葛根粉末，其余操作均与制备例2相同。

实施例1

本实施例提供一种具有舒缓修复功效的包裹体，所述包裹体的制备方法如下所述：

(1)混合1份聚甘油-10二异硬脂酸酯、0.5份聚甘油-10月桂酸酯、0.2份制备例1制得重组胶原蛋白、0.3份制备例2制得裂褶菌多糖和15份甘油，加水补齐100份。

(2)将混合溶液进行高压脉冲电场辅助处理，参数选择：场强0.5kV/cm、脉冲处理个数为10个、物料电导率为2000μS/cm，处理后得到所述具有舒缓修复功效的包裹体。

实施例2

(1)混合1份聚甘油-10二异硬脂酸酯、0.5份聚甘油-10月桂酸酯、0.01份制备例1制得重组胶原蛋白、5份制备例2制得裂褶菌多糖和50份甘油，加水补齐100份。

(2)将混合溶液进行高压脉冲电场辅助处理，参数选择：场强0.5kV/cm、脉冲处理个数为20个、物料电导率为6000μS/cm，处理后得到所述具有舒缓修复功效的包裹体。

实施例3

(1)混合1份聚甘油-10二异硬脂酸酯、0.5份聚甘油-10月桂酸酯、0.5份制备例1制得重组胶原蛋白、0.1份制备例2制得裂褶菌多糖和5份甘油，加水补齐100份。

(2)将混合溶液进行高压脉冲电场辅助处理，参数选择：场强2kV/cm、脉冲处理个数为60个、物料电导率为2000μS/cm，处理后得到所述具有舒缓修复功效的包裹体。

实施例4

本实施例提供一种具有舒缓修复功效的包裹体，所述包裹体的制备方法与实施例1的区别仅在于制备原料中不含甘油，并将甘油的质量份数按比例分配至重组胶原蛋白和裂褶菌多糖，其余操作均与实施例1相同。

实施例5

本实施例提供一种具有舒缓修复功效的包裹体，所述包裹体的制备方法与实施例1的区别仅在于将制备例2制得的裂褶菌多糖替换为制备例3制得的裂褶菌多糖，其余操作均与实施例1相同。

实施例6

本实施例提供一种具有舒缓修复功效的包裹体，所述包裹体的制备方法与实施例1的区别仅在于将0.2份制备例1制得重组胶原蛋白和0.3份制备例2制得的裂褶菌多糖替换为0.5份重组胶原蛋白和裂褶菌多糖混合物(混合物中重组胶原蛋白与裂褶菌多糖的比例为0.01:5.1)，其余操作均与实施例1相同。

实施例7

本实施例提供一种具有舒缓修复功效的包裹体，所述包裹体的制备方法与实施例1的区别仅在于将0.2份制备例1制得重组胶原蛋白和0.3份制备例2制得的裂褶菌多糖替换为0.5份重组胶原蛋白和裂褶菌多糖混合物(混合物中重组胶原蛋白与裂褶菌多糖的比例为0.6:0.05)，其余操作均与实施例1相同。

对比例1

本对比例提供一种具有舒缓修复功效的包裹体，所述包裹体的制备方法与实施例1的区别仅在于制备原料中不含重组胶原蛋白，并将重组胶原蛋白的质量份数分配至裂褶菌多糖，其余操作均与实施例1相同。

对比例2

本对比例提供一种具有舒缓修复功效的包裹体，所述包裹体的制备方法与实施例1的区别仅在于制备原料中不含裂褶菌多糖，并将裂褶菌多糖的质量份数分配至重组胶原蛋白，其余操作均与实施例1相同，

对比例3

本对比例提供一种具有舒缓修复功效的包裹体，所述包裹体的制备方法与实施例1的区别仅在于制备原料中不含裂褶菌多糖和重组胶原蛋白，并将裂褶菌多糖和重组胶原蛋白的质量份数分配至甘油，其余操作均与实施例1相同。

测试例1

本测试例对各实施例或对比例的具有舒缓修复功效的包裹体的抗氧化作用进行评价，具体评价方式如下：

使用DPPH的清除效率来评估实施例和对比例的抗氧化性能。具体评价方法包括：0.5g包裹体分别浸入4mL DPPH(100μM，在99wt％乙醇中)溶液中(使用仅含DPPH的溶液作为对照组)，并在暗处孵育60min。然后使用紫外-可见分光光度计测量混合溶液在517nm处的吸光度值。使用以下等式计算：DPPH清除率＝(对照组吸光度-实验组吸光度)/对照组吸光度×100％，结果如表1所示。

表1

组别	DPPH清除率(％)
		实施例1	67.3
实施例2	62.4
		实施例3	66.5
实施例4	67.9
		实施例5	42.7
实施例6	33.9
		实施例7	51.0
对比例1	29.1
		对比例2	18.2
对比例3	3.9

由表1数据可知，对比例1和对比例2与实施例1相比，制备原料分别缺少重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的一种，其DPPH清除率较实施例1低，表明裂褶菌多糖和重组胶原蛋白两种成分相辅相成，在清除DPPH方面具有意想不到的协同增效作用；实施例5与实施例1相比，发酵培养基含有葛根粉末，其DPPH清除率较实施例1低，表明葛根粉末的加入增强裂褶菌多糖的产物的抗氧化性能；实施例6与实施例7较实施例1相比，重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的质量份数比不在(0.01-0.5):(0.1-5)的范围内，其DPPH清除率较实施例1低，表明重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的质量份数比例在(0.01-0.5):(0.1-5)的范围时，两种成分搭配应用，抗氧化性能更强。

测试例2

本测试例对各实施例或对比例的具有舒缓修复功效的包裹体的保湿作用进行评价，具体评价方式如下：

选取100名皮肤健康的18-40岁的志愿者，男女比例各占一半，随机分成10组，使用实施例和对比例提供的具有舒缓修复功效的包裹体。志愿者清洁手臂后，按2mg/cm的用量均匀涂抹于手臂内侧直径为2cm的测试区域内，每天使用一次，连续使用30天，通过皮肤测试仪(MC750，德国CK)测定志愿者使用前和使用后皮肤含水量；

在使用前以及连续使用30天后分别测试各位受试者的皮肤含水量，每个数据测试三次，计算每组平均值，按照如下公式计算皮肤含水量变化率：

皮肤含水量变化率＝(使用30天后皮肤含水量-使用前皮肤含水量)/使用前皮肤含水量×100％；测试结果如表2所示：

表2

由表2数据可知，对比例1和对比例2较实施例1相比，制备原料分别缺少重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的一种，其皮肤含水量变化率较实施例1低，表明裂褶菌多糖和重组胶原蛋白两种成分相辅相成，能够增强所述包裹体的保湿作用；实施例4和对比例3较实施例1相比，所述具有舒缓修复功效的包裹体的制备原料中分别缺少甘油或重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的组合，其皮肤含水量变化率均较实施例1低，表明甘油、重组胶原蛋白和裂褶菌多糖三者联合应用，相辅相成，在提高皮肤保湿作用方面具有意想不到的协同增效作用。

测试例3

本测试例对制备例1的重组胶原蛋白、各实施例或对比例的具有舒缓修复功效的包裹体的细胞增殖效果进行评价，具体评价方式如下：

取生长状态良好的HaCaT细胞(人永生化角质细胞)铺96孔板培养17h后，更换无血清的基础培养基培养7h后，弃去旧培养基，加入含有1％重组胶原蛋白水溶液或含有各实施例或对比例制得的包裹体溶液(包裹体在培养基中的浓度为2μg/mL)的培养基，空白组的培养基中不含包裹体，其余与实验组一致。培养48h后用CCK8法检测细胞活力(以630nm为参比波长，于波长450nm处测定吸光度值)，每个数据测试三次，计算每组平均值，按照如下公式计算相对细胞增殖率：相对细胞增殖率＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/空白组吸光度×100％。

表3

组别	相对细胞增殖率(％)
		实施例1	41.9
实施例2	38.1
		实施例3	36.7
实施例4	42.2
		实施例5	18.3
实施例6	26.1
		实施例7	25.4
对比例1	13.1
		对比例2	9.2
对比例3	1.6
		制备例1	29.8

由表3数据可知，制备例1的重组胶原蛋白具有优异的促进细胞增殖效果。此外，对比例1和对比例2与实施例1相比，制备原料分别缺少重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的一种，其相对细胞增殖率较实施例1低，表明裂褶菌多糖和重组胶原蛋白两种成分相辅相成，在促进细胞增殖方面具有意想不到的协同增效作用；实施例5与实施例1相比，发酵培养基含有葛根粉末，其相对细胞增殖率较实施例1低，表明葛根粉末的加入增强裂褶菌多糖的促进细胞增殖的能力。

测试例4

本测试例对各实施例或对比例的具有舒缓修复功效的包裹体的皮肤舒缓修复进行评价，具体评价方式如下：

(1)取66只豚鼠，雌雄各半，在实验1d前剔除右后足上的毛，去毛面积约为2cm²，将豚鼠随机分为11组，每组含有6只豚鼠，分别记录为实施例1-7组、对比例1-3组和空白组。

(2)实施例1-7组、对比例1-3组和空白组的豚鼠连续2d在去毛处分别涂抹实施例或对比例制备的包裹体溶液0.05g，空白组涂抹等量去离子水，每天1次。

(3)实验第3天，用生理盐水分别配置0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)和0.1％(w/v)的磷酸组胺溶液。用粗砂纸将豚鼠右后足背去毛处擦伤，擦伤面积约为1cm²，局部再涂抹相应的包裹体溶液1次，涂抹量为0.05g，空白组涂抹等量去离子水，10min后，在擦伤处滴加0.01％(w/v)的磷酸组胺溶液0.05mL，观察豚鼠否在3min内回头舔舐右后足，如未出现，在擦伤处继续滴加0.02％(w/v)的磷酸组胺溶液0.05mL，观察豚鼠否在3min内回头舔舐右后足。以此类推，每隔3min按上述梯度增加浓度，每次滴加磷酸组胺溶液0.05mL，直至豚鼠在3min内舔舐右后足。以此时所滴加的磷酸组胺的累计总量为致痒阈(μg)，计算同一组别豚鼠致痒阈的平均值和致痒阈差异率，致痒阈差异率＝(实验组致痒阈-空白组致痒阈)/空白组致痒阈×100％，结果如表4所示。

表4

由表4数据可知，致痒阈越高，对应的皮肤屏障作用越强，即包裹体溶液的舒缓修复功能越强；实施例4和对比例3较实施例1相比，所述具有舒缓修复功效的包裹体的制备原料中分别缺少甘油或重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的组合，其致痒阈差异率均较实施例1低，表明甘油、重组胶原蛋白和裂褶菌多糖三者联合应用，相辅相成，在舒缓修复皮肤方面具有意想不到的协同增效作用。对比例1和对比例2与实施例1相比，制备原料分别缺少重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的一种，其致痒阈差异率均较实施例1低，表明裂褶菌多糖和重组胶原蛋白两种成分相辅相成，能够提高所述包裹体的止痒修复作用；实施例5与实施例1相比，发酵培养基含有葛根粉末，其致痒阈差异率较实施例1低，表明葛根粉末的加入增强裂褶菌多糖的产物的抗氧化性能，进而能够提高皮肤的屏障作用；实施例6与实施例7较实施例1相比，重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的质量份数比例不在(0.01-0.5):(0.1-5)的范围内，其致痒阈差异率较实施例1低，表明重组胶原蛋白和裂褶菌多糖的质量份数比例在(0.01-0.5):(0.1-5)的范围时，两种成分搭配应用，皮肤舒缓修复功能更强。

测试例5

对实施例制得的具有舒缓修复功效的包裹体进行安全性评价。具体评价方法为：按照《化妆品安全技术规范2015版》中，第七章人体安全性检验方法中的人体皮肤斑贴试验方法进行试验。(1)选择18-60岁复合实验要求的女性志愿者，排除标准：(a)近一周使用抗组胺药或近一个月内使用免疫抑制剂者；(b)近两个月内受试部位应用任何抗炎药物者；(c)受试者患有炎症性皮肤病临床未愈者；(d)胰岛素依赖性糖尿病患者；(e)正在接受治疗的哮喘或其他慢性呼吸系统疾病患者；(f)在近6个月内接受抗癌化疗者；(g)免疫缺陷或自身免疫性疾病患者；(h)哺乳期或妊娠妇女；(i)双侧乳房切除及双侧腋下淋巴结切除者；(n)在皮肤待试部位由于瘢痕、色素、萎缩、鲜红斑痣或其他瑕疵而影响试验结果的判定者；(o)参加其他的临床试验研究者；(p)体质高度敏感者；(q)非志愿参加者或不能按试验要求完成规定内容者。(2)每个实施例对应一组，每组10名志愿者；选用面积不超过50mm²、深度约1mm的合格斑试器材。将各实施例制得的包裹体溶液放入斑试器小室内，用量约为0.025g。对照孔不置任何物质为空白对照。将加有受试物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的背部或前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。(3)分别于去除受试物斑试器后30min(待压痕消失后)、24h和48h按表5标准观察皮肤反应。并根据表5的标准进行评估。

表5

结果显示，本发明制得的产品，安全无刺激，具有更高的使用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的制备工艺，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白，其特征在于，编码所述用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的序列。

2.一种具有舒缓修复功效的组合物，其特征在于，所述具有舒缓修复功效的组合物包括：

如权利要求1所述的用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白和裂褶菌多糖。

3.如权利要求2所述的具有舒缓修复功效的组合物，其特征在于，所述具有舒缓修复功效的组合物以质量份数计包括：

4.如权利要求2或3所述的具有舒缓修复功效的组合物，其特征在于，所述具有舒缓修复功效的组合物还包括保湿剂；

优选地，所述保湿剂包括甘油、1,3-丁二醇、透明质酸钠、乙酰化透明质酸钠、水解透明质酸钠或神经酰胺3中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述保湿剂为甘油；

0.01-0.5份如权利要求1所述的用于皮肤舒缓修复的重组胶原蛋白、0.1-5份裂褶菌多糖和5-50份甘油；

优选地，所述裂褶菌多糖的制备方法包括：

裂褶菌在含葛根的培养基中发酵培养，发酵培养液使用Sevag法去除蛋白后，添加乙醇溶液沉淀发酵培养液中的多糖，离心制得所述裂褶菌多糖。

5.一种具有舒缓修复功效的包裹体，其特征在于，所述具有舒缓修复功效的包裹体包括：

微囊包裹材料和包裹于所述微囊包裹材料内部的如权利要求2-4中任一项所述的具有舒缓修复功效的组合物。

6.如权利要求5所述的具有舒缓修复功效的包裹体，其特征在于，所述微囊包裹材料的制备原料包括聚甘油基非离子表面活性剂；

优选地，所述聚甘油基非离子表面活性剂包括聚甘油-10二异硬脂酸酯、聚甘油-10月桂酸酯或聚甘油-10油酸酯中的任意一种或至少两种的组合。

7.如权利要求5或6所述的具有舒缓修复功效的包裹体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)混合聚甘油基非离子表面活性剂和如权利要求2-4中任一项所述的具有舒缓修复功效的组合物；

8.如权利要求7所述的具有舒缓修复功效的包裹体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述包裹辅助处理为高压脉冲电场辅助处理。

9.如权利要求7或8所述的具有舒缓修复功效的包裹体的制备方法，其特征在于，所述高压脉冲电场辅助处理的场强为0.5-2kV/cm，脉冲处理个数为10-60个，物料电导率为2000-6000μS/cm。

10.如权利要求1所述的重组胶原蛋白、如权利要求2-4中任一项所述具有舒缓修复功效的组合物或如权利要求5或6所述的具有舒缓修复功效的包裹体在制备皮肤护理产品中的应用。