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CN111363029A - 重组人源ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法 - Google Patents

重组人源ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法 Download PDF

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CN111363029A
CN111363029A CN201811590564.XA CN201811590564A CN111363029A CN 111363029 A CN111363029 A CN 111363029A CN 201811590564 A CN201811590564 A CN 201811590564A CN 111363029 A CN111363029 A CN 111363029A
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pro
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collagen
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

本发明公开了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法。所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白含有498个氨基酸,理论分子量约54.5kd,构建的重组人源Ⅲ型胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白。本发明的重组人源胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性,其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100%相同,应用于人体当中不会造成免疫排斥,可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。

Description

重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,涉及一种重组人源III型胶原蛋白、表达重组人源III型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法。
背景技术
胶原(Collagen)是脊椎动物体内最重要的结构蛋白,约占蛋白总量的25~30%。作为细胞外基质中含量最丰富的蛋白,胶原是结缔组织和几乎所有薄壁器官间隙组织中最主要的结构蛋白,起着稳定组织和器官并维持其结构完整的作用。由于天然胶原蛋白不易溶于水,且使用的通常为牛或猪来源的胶原,分子量大小不等,性质非常复杂,难于进行进一步的加工,存在动物病毒隐患,限制了其作为生物材料在医疗器械等领域的应用。因此,研究通过基因构建技术,利用生物反应器表达重组胶原蛋白来解决这些问题,且已经取得良好进展。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种外源蛋白表达系统,既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点,还具有原核生物表达系统不具有的对外源蛋白的修饰如糖基化、蛋白磷酸化等特点。在过去的20年中已有200多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达,其中许多产品已被广泛应用于临床的诊断治疗和科研工作中。在毕赤酵母表达系统中外源基因不是存在于自主复制的表达载体中,而是和表达载体一起通过同源重组整合在酵母染色体上,随染色体一起复制和遗传,不会发生外源基因的丢失现象;毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性,可实现细胞高密度培养,利于大规模工业化生产;毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白,发酵产物的累积不会对其产生毒副作用,并且毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少,便于纯化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亲水性优异的重组人源III型胶原蛋白,以及分泌表达该蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法,能高效、安全地进行重组人源III型胶原蛋白的胞外分泌表达。
实现本发明目的的技术方案如下:
本发明的重组人源III型胶原蛋白,氨基酸序列如SEQ No.2所示。
本发明的重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa,核苷酸序列如SEQ No.3所示。
本发明构建的重组人源III型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的核苷酸序列如SEQNo.4所示,通过将重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。
本发明构建的分泌表达重组人源III型胶原蛋白的菌株为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris JY0301,保藏编号为CGMCC No.16462,该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0301通过将Sac I酶切得到的线性化重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。
本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因III型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列,将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中,转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌,经过初步发酵及纯化步骤,得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本发明的重组人源III型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性,其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100%相同,应用于人体当中不会造成免疫排斥,在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为人Ⅲ型α链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
图2为重组人源Ⅲ型胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
图3为重组人源Ⅲ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的构建示意图。
图4为重组人源Ⅲ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的Sac I酶切琼脂糖凝胶电泳图。
图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。
图6为阳性克隆菌株的凝胶电泳图。
图7为阳性克隆菌株的PCR凝胶电泳图。
图8为#3,#4,#5,#10阳性克隆菌株培养48和72小时的样品的蛋白表达分析图。
图9为#10阳性克隆菌株的蛋白表达的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
1.蛋白序列选择
对人Ⅲ型α链胶原蛋白的氨基酸序列(SEQ No.1)进行疏水性分析,评价结果如图1所示。疏水性评价分值越低其亲水性越好。选择评分低的氨基酸片段,将这些片段整合成新的蛋白,即本发明的重组人源Ⅲ型胶原蛋白(SEQ No.2)。对重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸进行疏水性分析,结果如图2所示,该蛋白中所有氨基酸疏水性评价均低于零,表明该蛋白的亲水性很好。
2.质粒构建及线性化
将重组人源Ⅲ型胶原蛋白翻译成碱基序列(SEQ No.3),采用基于PAS(PCR-basedAccurate Synthesis)的方法合成基因Ⅲα498aa,双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和NotI之间,图3为重组人源Ⅲ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的构建示意图。将获得的重组质粒ppic9K-Ⅲα498aa转入TOP10克隆菌株,挑取阳性克隆子测序,测序结果拼接如SEQ No.4所示。SEQ No.4的100-105碱基处及1603-1610碱基处为酶切位点。
提取质粒20μg,使用Sac I酶切线性化,冻干浓缩待用。37℃消化3h。取5μl,进行1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果如图4所示。其中M为DNA标准品,从下到上1000,2000,3000,4000,5000,6000,8000,10000bp;1为Sac I酶切;2为回收目的片段。
表1酶切线性化体系配制表
Figure BDA0001920144100000031
3.电转毕赤酵母细胞GS115
冰浴电转杯,将10μL线性化质粒加入到装有80μL毕赤酵母感受态细胞的1.5mL EP管内,混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中,然后把电转杯冰浴5min。电击条件为:电压1.5kV;电容25μF;电阻200Ω,电击时间为4~10msec。电击完成后,将650μL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里,用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中,30℃静置培养2h。低速离心收集菌体,全部涂布于MD平板上,30℃恒温培养3~4d。图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。
4.PCR鉴定阳性克隆菌株
待平板长出菌落,用接种环挑取平板上生长的单菌,将它接入到装有500μL YPD液体培养基离心管,30℃,180r/min过夜培养。挑选10株克隆,分别提取基因组DNA,如图6所示。M为DNA标准品,从下到上1000,2000,3000,4000,5000,6000,8000,10000bp;1-10:各克隆菌株提取的基因组。使用载体上引物PCR鉴定,结果如图7所示,其中,M:DNA标准品,从下到上100,200,500,750,1000,2000bp;1-10:各克隆菌株的PCR扩增片段。
5.小试表达鉴定
诱导表达:取鉴定的阳性菌株(3#,4#,5#,10#)50μl接入装有10ml BMGY的锥形瓶中,30℃,220r/min过夜培养,摇至OD600=2~6(对数生长,大约16~18h);室温离心5000r/min离心5min,收集细胞,去除上清,用10ml BMMY重悬细胞,进行诱导表达;每24h从培养基中取样1ml,并加甲醇至终浓度0.5%继续诱导;以下各时间点0,24,48,72,96h样品10000r/min离心2min收集上清液,置于-20℃待检测。
三氯乙酸沉淀法浓缩表达产物:
(1)在离心管中加入500μl培养液上清和1/9体积的100%的TCA,振荡混合,4℃沉淀过夜;
(2)12000r/min离心10min,沉淀为粘稠带黄褐色胶状物,弃上清,收集沉淀,另将EP管倒置于吸水纸上,37℃烘箱静置10~20min,使管壁无明显液体残留;
(3)加入200μl冷丙酮,振荡混匀,样品在室温下静置10min,洗去管壁和管底残留的TCA;
(4)12000r/min离心10min,弃上清,重复步骤(2)和(3),重复2~3次;
(5)加入上样缓冲液30μl,37℃孵育1h,溶解沉淀;如果沉淀不溶解,可用100μl枪头吹打至沉淀溶解。
6.鉴定分析
Western Blotting检测:
(1)取样品上样10μl;
(2)上样完毕后,聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶,再将电压升至200V直到电泳结束;
(3)电泳结束后,取下凝胶进行转膜,恒压100V转膜,约为1.5h,恒流250mA;
(4)电转结束后,取下膜后先用PBST洗涤4次,每次5min;
(5)将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h;
(6)用封闭液稀释一抗(Rabbit anti-His),膜在一抗稀释液(稀释比例1:1000)中4℃过夜;
(7)次日将膜取出后用PBST洗膜4次,每次5min;
(8)用含5%牛奶的封闭液稀释二抗(羊抗兔),膜在二抗稀释液(稀释比例1:5000)中37℃反应1h;
(9)反应完毕后,把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次,每次5min;
(10)ECL显影,曝光。
将选择的3#,4#,5#,10#株阳性克隆的48和72小时的样品,进行Western Blot初步检测。检测结果如图8所示,其中M:蛋白标准品;1:GS115菌株培养72小时上清样品;2:3#阳性菌株培养48小时上清样品;3:3#阳性菌株培养72小时上清样品;4:4#阳性菌株培养48小时上清样品;5:4#阳性菌株培养72小时上清样品;6:5#阳性菌株培养48小时上清样品;7:5#阳性菌株培养72小时上清样品;8:10#阳性菌株培养48小时上清样品;9:10#阳性菌株培养72小时上清样品。
表达分析:
SDS-PAGE电泳检测:选取10#阳性菌进行表达情况分析结果如图9所示。其中,M:蛋白标准品;1:GS115菌株培养72小时上清;2:10#阳性菌株培养0小时上清;3:10#阳性菌株培养24小时上清;4:10#阳性菌株培养48小时上清;5:10#阳性菌株培养72小时上清;6:10#阳性菌株培养96小时上清。10#阳性菌株命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0301,该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101),保藏编号为CGMCC No.16462。
本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因Ⅲ型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列,将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中,转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌,经过初步发酵及纯化步骤,得到高纯度的重组类人胶原蛋白。实验证明该法生产的重组类人胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性,由于其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100%相同,所以应用于人体当中不会造成免疫排斥,可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。本发明采用的是分泌型表达载体,成功实现了重组类人胶原蛋白的分泌型表达,表达产物分泌在上清液中,方便纯化,具有其他重组类人胶原蛋白生产所不具备的优势,便于规模化生产操作。由于载体电转入毕赤酵母之后,基因整合在毕赤酵母基因组上,所以重组菌的稳定性好,经过多次传代基因不容易发生流失并能保持高效表达的性状,能够很好的实现稳定生产,毕赤酵母生产方法为好氧发酵,菌体密度高,表达量还有很大的提升空间。
序列表
<110> 江苏江山聚源生物技术有限公司
<120> 重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1466
<212> PRT
<213> 人属(Homo sapiens)
<400> 1
Met Met Ser Phe Val Gln Lys Gly Ser Trp Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
His Pro Thr Ile Ile Leu Ala Gln Gln Glu Ala Val Glu Gly Gly Cys
20 25 30
Ser His Leu Gly Gln Ser Tyr Ala Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu
35 40 45
Pro Cys Gln Ile Cys Val Cys Asp Ser Gly Ser Val Leu Cys Asp Asp
50 55 60
Ile Ile Cys Asp Asp Gln Glu Leu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Ile Pro
65 70 75 80
Phe Gly Glu Cys Cys Ala Val Cys Pro Gln Pro Pro Thr Ala Pro Thr
85 90 95
Arg Pro Pro Asn Gly Gln Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly
100 105 110
Pro Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asn Gly Asp Pro Gly Ile Pro Gly Gln
115 120 125
Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Glu Ser Cys
130 135 140
Pro Thr Gly Pro Gln Asn Tyr Ser Pro Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp Val
145 150 155 160
Lys Ser Gly Val Ala Val Gly Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Gly Pro Ala
165 170 175
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Ser Gly His Pro Gly
180 185 190
Ser Pro Gly Ser Pro Gly Tyr Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Gln
195 200 205
Ala Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ile Gly Pro Ser
210 215 220
Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly
225 230 235 240
Glu Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ile Lys Gly Pro Ala Gly Ile
245 250 255
Pro Gly Phe Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Asp Gly Arg Asn
260 265 270
Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Pro Gly Leu Lys Gly Glu Asn Gly
275 280 285
Leu Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Ala
290 295 300
Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Arg
305 310 315 320
Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly
325 330 335
Pro Pro Gly Thr Ala Gly Phe Pro Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Glu
340 345 350
Val Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Ser Asn Gly Ala Pro Gly Gln Arg
355 360 365
Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly His Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly
370 375 380
Pro Pro Gly Ile Asn Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Glu Met Gly Pro
385 390 395 400
Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro Gly Leu Met Gly Ala Arg Gly Pro Pro
405 410 415
Gly Pro Ala Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly
420 425 430
Glu Pro Gly Lys Asn Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Glu
435 440 445
Arg Gly Glu Ala Gly Ile Pro Gly Val Pro Gly Ala Lys Gly Glu Asp
450 455 460
Gly Lys Asp Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly
465 470 475 480
Ala Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro
500 505 510
Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly
515 520 525
Val Pro Gly Gly Pro Gly Met Arg Gly Met Pro Gly Ser Pro Gly Gly
530 535 540
Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Ser
545 550 555 560
Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly
565 570 575
Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Asn Asp Gly Ala Pro Gly Lys
580 585 590
Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro
595 600 605
Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly
610 615 620
Pro Gly Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu
625 630 635 640
Gln Gly Leu Pro Gly Thr Gly Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro
645 650 655
Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly
660 665 670
Gly Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Leu
675 680 685
Ala Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu
690 695 700
Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly
705 710 715 720
Thr Pro Gly Leu Gln Arg Met Pro Gly Glu Arg Gly Gly Leu Gly Ser
725 730 735
Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly Ala Asp
740 745 750
Gly Val Pro Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly
755 760 765
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Pro Gly Asp Lys Gly Glu Gly Gly Ala
770 775 780
Pro Gly Leu Pro Gly Ile Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg
785 790 795 800
Gly Glu Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly
805 810 815
Gln Asn Gly Glu Pro Gly Gly Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu
820 825 830
Lys Gly Glu Gly Gly Pro Pro Gly Val Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ser
835 840 845
Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Arg Gly
850 855 860
Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Leu
865 870 875 880
Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser
885 890 895
Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Asn Thr Gly
900 905 910
Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Gln
915 920 925
Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro
930 935 940
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly
945 950 955 960
Pro Pro Gly Met Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Val
965 970 975
Lys Gly Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala Asn Gly Leu Ser Gly Glu Arg
980 985 990
Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly
995 1000 1005
Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu Pro Gly Arg
1010 1015 1020
Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn Gly Ser Pro
1025 1030 1035 1040
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly
1045 1050 1055
Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro
1060 1065 1070
Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln
1075 1080 1085
Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly
1090 1095 1100
Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser
1105 1110 1115 1120
Pro Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly Ser Pro Gly Pro Ala
1125 1130 1135
Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly
1140 1145 1150
Thr Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn
1155 1160 1165
Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro
1170 1175 1180
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Val
1185 1190 1195 1200
Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly Gly Glu Lys Ala Gly Gly Phe
1205 1210 1215
Ala Pro Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp
1220 1225 1230
Glu Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu
1235 1240 1245
Ile Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg Asp
1250 1255 1260
Leu Lys Phe Cys His Pro Glu Leu Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Val Asp
1265 1270 1275 1280
Pro Asn Gln Gly Cys Lys Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met
1285 1290 1295
Glu Thr Gly Glu Thr Cys Ile Ser Ala Asn Pro Leu Asn Val Pro Arg
1300 1305 1310
Lys His Trp Trp Thr Asp Ser Ser Ala Glu Lys Lys His Val Trp Phe
1315 1320 1325
Gly Glu Ser Met Asp Gly Gly Phe Gln Phe Ser Tyr Gly Asn Pro Glu
1330 1335 1340
Leu Pro Glu Asp Val Leu Asp Val His Leu Ala Phe Leu Arg Leu Leu
1345 1350 1355 1360
Ser Ser Arg Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile
1365 1370 1375
Ala Tyr Met Asp Gln Ala Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu
1380 1385 1390
Met Gly Ser Asn Glu Gly Glu Phe Lys Ala Glu Gly Asn Ser Lys Phe
1395 1400 1405
Thr Tyr Thr Val Leu Glu Asp Gly Cys Thr Lys His Thr Gly Glu Trp
1410 1415 1420
Ser Lys Thr Val Phe Glu Tyr Arg Thr Arg Lys Ala Val Arg Leu Pro
1425 1430 1435 1440
Ile Val Asp Ile Ala Pro Tyr Asp Ile Gly Gly Pro Asp Gln Glu Phe
1445 1450 1455
Gly Val Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu
1460 1465
<210> 2
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Gln Pro Gly
1 5 10 15
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Lys Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Ser
20 25 30
Pro Gly Ser Asn Gly Ala Pro Gly Gln Arg Gly Glu Pro Gly Pro Gln
35 40 45
Gly His Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ile Asn Gly
50 55 60
Ser Pro Gly Gly Lys Gly Glu Met Gly Ala Ala Gly Glu Arg Gly Ala
65 70 75 80
Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys
85 90 95
Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Met
115 120 125
Arg Gly Met Pro Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro
130 135 140
Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly
145 150 155 160
Pro Ser Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly Pro Lys Gly Asn Asp Gly Ala
165 170 175
Pro Gly Lys Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln
180 185 190
Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly
195 200 205
Pro Thr Gly Pro Gly Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Pro
210 215 220
Gln Gly Thr Gly Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro Gly Glu Pro
225 230 235 240
Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Gly Lys Gly Asp Ala Gly
245 250 255
Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Gly Lys Gly Ala
260 265 270
Ala Gly Pro Pro Gly Leu Gln Arg Met Pro Gly Glu Arg Gly Gly Leu
275 280 285
Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly
290 295 300
Ala Asp Gly Val Pro Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro
305 310 315 320
Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Pro Gly Asp Lys Gly Glu Gly
325 330 335
Gly Ala Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly
340 345 350
Leu Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly Glu
355 360 365
Asn Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro
370 375 380
Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly
385 390 395 400
Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp
405 410 415
Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys Gly His Arg
420 425 430
Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly
435 440 445
Gln Gln Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Thr Ser Gly His Pro Gly Pro
450 455 460
Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu
465 470 475 480
Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
485 490 495
Ala Pro
<210> 3
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgctagag gtaacgatgg tgcaagaggt tctgatggtc aaccaggtcc acctggtcct 60
ccaggtgcta aaggtgaagt tggtccagct ggttctcctg gatctaatgg tgctccagga 120
caaagaggtg aacctggtcc acaaggtcat gctggtgctc aaggtccacc aggaccacca 180
ggcattaacg gttctccagg tggaaagggt gaaatgggtg ctgctggtga aagaggtgca 240
ccaggtttta gaggtcctgc tggtccaaat ggtattccag gtgaaaaagg tccagccggt 300
gaacgtggtg ctcctggtcc agcaggtcca agaggtgctg caggcgaacc aggtagagat 360
ggtgtaccag gtggtccagg tatgagaggt atgccaggat ctccaggcgg tcctggttca 420
gatggtaaac ccggacctcc aggatcacaa ggtgaatcag gtagacccgg tcctcctgga 480
ccttctggtc ctagaggaca acctggacct aagggaaatg atggtgcccc aggtaagaat 540
ggtgagcgtg gtggtcccgg cggtccaggt cctcaaggac ctcctggaaa aaatggtgaa 600
actggacctc aaggccctcc aggtcctacc ggtccaggtg gtgataaggg tgatactggc 660
ccaccaggac ctcaaggtac aggtggtcca ccaggtgaaa atggtaaacc aggtgaacca 720
ggtcctaagg gtgatgccgg cgctcctggt ggcaaaggtg acgctggcgc tccaggcgag 780
agaggacctc caggtcctga aggtggtaaa ggtgctgccg gtcctccagg attgcaaaga 840
atgccaggtg agagaggtgg tttgggttca ccaggtccaa aaggcgacaa aggtgaaccc 900
ggcggacccg gtgctgatgg tgttcctggt aaagatggac caagaggtcc aactggacca 960
attggcccac ctggtccagc cggacaacca ggtgacaaag gcgaaggtgg tgctcccggt 1020
gagcctggaa gagatggtaa tccaggatct gatggtttgc caggtcgtga tggttcccct 1080
ggcggaaaag gtgatagagg cgaaaatgga tccccaggcg caccaggcgc tcccggacat 1140
cccggaccac caggtccagt aggtcctgca ggtaaatctg gtgatagggg agaatctggt 1200
cctgccggta gtagaggtgc ccctggtcct cagggtccac gtggtgacaa aggtgagaca 1260
ggtgaaagag gcgctgctgg tattaagggt catagaggtt ttccaggtaa cccaggtgca 1320
cccggaagtc caggaccagc cggtcaacag ggccctcctg gtaaggacgg tacttctggt 1380
catcctggtc ctattggccc tccaggacca aggggtaata gaggtgaaag gggttctgaa 1440
ggttccccag gtcatccagg tcagcccggt ccaccaggac ctccaggtgc tcca 1494
<210> 4
<211> 1610
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaaataacg ggttattgtt tataaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa 60
ggggtatctc tcgagaaaag agaggctgaa gcttacgtag aattcggtgc tagaggtaac 120
gatggtgcaa gaggttctga tggtcaacca ggtccacctg gtcctccagg tgctaaaggt 180
gaagttggtc cagctggttc tcctggatct aatggtgctc caggacaaag aggtgaacct 240
ggtccacaag gtcatgctgg tgctcaaggt ccaccaggac caccaggcat taacggttct 300
ccaggtggaa agggtgaaat gggtgctgct ggtgaaagag gtgcaccagg ttttagaggt 360
cctgctggtc caaatggtat tccaggtgaa aaaggtccag ccggtgaacg tggtgctcct 420
ggtccagcag gtccaagagg tgctgcaggc gaaccaggta gagatggtgt accaggtggt 480
ccaggtatga gaggtatgcc aggatctcca ggcggtcctg gttcagatgg taaacccgga 540
cctccaggat cacaaggtga atcaggtaga cccggtcctc ctggaccttc tggtcctaga 600
ggacaacctg gacctaaggg aaatgatggt gccccaggta agaatggtga gcgtggtggt 660
cccggcggtc caggtcctca aggacctcct ggaaaaaatg gtgaaactgg acctcaaggc 720
cctccaggtc ctaccggtcc aggtggtgat aagggtgata ctggcccacc aggacctcaa 780
ggtacaggtg gtccaccagg tgaaaatggt aaaccaggtg aaccaggtcc taagggtgat 840
gccggcgctc ctggtggcaa aggtgacgct ggcgctccag gcgagagagg acctccaggt 900
cctgaaggtg gtaaaggtgc tgccggtcct ccaggattgc aaagaatgcc aggtgagaga 960
ggtggtttgg gttcaccagg tccaaaaggc gacaaaggtg aacccggcgg acccggtgct 1020
gatggtgttc ctggtaaaga tggaccaaga ggtccaactg gaccaattgg cccacctggt 1080
ccagccggac aaccaggtga caaaggcgaa ggtggtgctc ccggtgagcc tggaagagat 1140
ggtaatccag gatctgatgg tttgccaggt cgtgatggtt cccctggcgg aaaaggtgat 1200
agaggcgaaa atggatcccc aggcgcacca ggcgctcccg gacatcccgg accaccaggt 1260
ccagtaggtc ctgcaggtaa atctggtgat aggggagaat ctggtcctgc cggtagtaga 1320
ggtgcccctg gtcctcaggg tccacgtggt gacaaaggtg agacaggtga aagaggcgct 1380
gctggtatta agggtcatag aggttttcca ggtaacccag gtgcacccgg aagtccagga 1440
ccagccggtc aacagggccc tcctggtaag gacggtactt ctggtcatcc tggtcctatt 1500
ggccctccag gaccaagggg taatagaggt gaaaggggtt ctgaaggttc cccaggtcat 1560
ccaggtcagc ccggtccacc aggacctcca ggtgctccat aagcggccgc 1610

Claims (5)

1.重组人源III型胶原蛋白,氨基酸序列如SEQ No.2所示。
2.重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa,核苷酸序列如SEQ No.3所示。
3.重组人源III型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa,核苷酸序列如SEQ No.4所示。
4.根据权利要求3所述的重组人源III型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的构建方法,其特征在于,通过将重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。
5.重组人源III型胶原蛋白表达菌株,为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0301,保藏编号为CGMCC No.16462。
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