CN117757797B - 一种编码人III型胶原蛋白α链的核酸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种编码人III型胶原蛋白α链的核酸及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的核酸，此核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5任一项所示。此核酸进行了密码子和mRNA二级结构优化，经优化后的核酸更稳定且更有利于在人体内高效表达，因此，可以获得更高表达水平的胶原蛋白，从而获得更好的抗衰效果，在制备抗皮肤衰老、修复妊娠纹、注射填充美容和治疗因III型胶原蛋白缺失引起的疾病等的产品(产品形式包括包括但不限于注射液、冻干粉、可溶性微针贴片和通过无针注射器注射的注射液，产品使用方式包括但不限于皮内注射、微针贴片贴敷和使用无针注射器进行皮内注射)中极具应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种编码人III型胶原蛋白α链的核酸及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，是在哺乳动物中含量最多、分布最广的功能性蛋白，主要由成纤维细胞合成和分泌，在皮肤中构成了一张细密的弹力网。成年人皮肤中的胶原蛋白主要以I型胶原蛋白(约85％)与III型胶原蛋白(约15％)为主，其中，I型胶原主要增强皮肤的柔韧度让皮肤紧致，III型胶原让皮肤细嫩。婴儿皮肤中III型胶原占比最多，成年后皮肤几乎无法合成III型。人体胶原蛋白含量在10岁左右达到顶峰(约90％)，25岁后下降到60％，之后逐年递减。真皮层胶原蛋白含量的减少是皮肤老化和黑色素出现的根源。胶原蛋白流失导致皮肤皱纹、干燥粗糙、松弛、暗沉等衰老表现。
向真皮层内补充胶原蛋白是改善皮肤皱纹等衰老现象的有效方法，皮内注射的方式是最直接有效的胶原蛋白补充方式。目前，胶原蛋白主要有三种来源，分别为动物来源(从牛、猪等动物的组织中提取)、胎盘来源(从人胎盘中提取)以及体外表达来源(大肠杆菌等原核细胞及酵母等真核细胞内合成并纯化)。其中，动物来源的胶原蛋白有病毒和抗原性，容易导致免疫排斥反应，因此，使用时容易引起过敏反应，使用前需要做试敏，试敏一至两次阴性的使用者也仍有再过敏的可能；并且，动物来源的胶原蛋白普遍存在提取方法复杂且污染严重，原材料获取困难且难以长时间储存，制造成本高且难以大规模量产的缺陷；另外，动物来源的胶原蛋白属于异源蛋白，降解较快，疗效维持时间短，一般在数月内降解。胎盘来源的胶原蛋白原料来源少且提取工艺复杂，存在成本高且产量低的缺陷。体外表达的重组人胶原蛋白难以完成复杂的翻译后修饰及糖基化过程，很难形成正确的胶原蛋白纤维结构，而只有具有纤维结构的胶原蛋白才能具有良好的支撑皮肤结构，维持皮肤弹性等功能，因此，体外表达的重组人胶原蛋白改善皮肤衰老的效果较差；并且，由于人胶原蛋白在现有原核或真核表达系统中的表达量不高，因此，重组人胶原蛋白也存在产量低，成本高，价格昂贵的缺陷。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的核酸，所述核酸为：
(a)包含SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的核酸；
(b)以(a)作为模板转录而来的核酸；
(c)在(a)或(b)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且保留其源自序列的生物学功能的由(a)衍生的核酸；
(d)与(a)、(b)或(c)部分或全部互补的核酸。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸为：
(a)由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列组成的核酸；
(b)以(a)作为模板转录而来的核酸；
(c)在(a)或(b)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，与(a)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，并且，保留其源自序列的生物学功能的由(a)衍生的核酸；
(d)与(a)、(b)或(c)部分或全部互补的核酸。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸是指由多个核苷酸聚合成的生物大分子化合物。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸包括DNA分子、RNA分子、PNA分子或LNA分子中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸以单链或双链形式存在。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸为线性或环状。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸为编码链或非编码链。
在本发明的一种实施方式中，所述(b)为以(a)的一条链作为模板转录而来的编码链；所述(b)中，以(a)作为模板转录而来的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ IDNO.14所示。
在本发明的一种实施方式中，所述互补为完全互补或部分互补。
在本发明的一种实施方式中，所述人III型胶原蛋白α链(Homo sapiens collagentype III alpha 1chain，COL3A1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸中的碱基为修饰碱基或非修饰碱基。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述核酸。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒携带的核酸连接有自复制元件、翻译调控元件、核酶或用于环化的互补序列中的至少一种；所述自复制元件包括来源于病毒的自复制组件；所述翻译调控元件包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、转座子、5’UTR、3’UTR、多腺苷酸序列(PAS，Polyadenylation[poly(A)]signals)或标记基因中的至少一种；所述核酶包括I型内含子核酶或II型内含子核酶中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于病毒的自复制组件包括病毒中与RNA复制作用相关的非结构蛋白的基因序列、非结构蛋白基因的突变序列、病毒的部分结构蛋白的基因序列、病毒结构蛋白基因的突变序列或病毒结构蛋白基因的删减序列中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于病毒的自复制组件取自黄病毒、甲病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。
在本发明的一种实施方式中，所述黄病毒包括乙型脑炎病毒、登革热病毒森林脑炎病毒或昆津病毒中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述乙型脑炎病毒包括乙型脑炎病毒SA-14株、乙型脑炎病毒SA-14-14-2疫苗株(Japanese Encephalitis Virus，JEV)或乙型脑炎病毒SA-14-5-3株中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于病毒的自复制组件为来源于乙型脑炎病毒的NS1～NS5基因、结构蛋白基因C的删减序列和结构蛋白基因E的删减序列。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于病毒的自复制组件为乙型脑炎病毒SA-14-14-2疫苗株的NS1～NS5基因、结构蛋白基因C的删减序列和结构蛋白基因E的删减序列。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子包括T7启动子、SP6启动子或亚基因组启动子(subgenomic promoter)中的至少一种；所述聚腺苷酸化信号包括A120或A30N(1-10)A70中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸的上游依次连接有T7启动子和5’UTR，下游依次连接有3’UTR和聚腺苷酸化信号；
或者，所述核酸的上游依次连接有T7启动子、5’UTR和亚基因组启动子(subgenomic promoter)，下游依次连接有来源于病毒的自复制组件和3’UTR；
或者，所述核酸的上游连接有T7启动子、Group I Intron序列、靶点序列、用于环化的互补序列1和IRES序列，下游连接有用于环化的互补序列2。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体包括病毒载体或非病毒载体中的至少一种；所述病毒载体包括黄病毒载体、逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体、杂合病毒载体、杆状病毒载体、单纯疱疹病毒载体或慢病毒载体中的至少一种；所述非病毒载体包括质粒载体。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体包括PGEM-3zf质粒、PUC19质粒或PUC57质粒中的至少一种
本发明还提供了一种mRNA，所述mRNA携带上述核酸。
在本发明的一种实施方式中，所述mRNA包括非复制线性mRNA、自复制线性mRNA或环状mRNA中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，当mRNA为非复制线性mRNA或自复制线性mRNA时，所述mRNA由上述重组质粒转录而得；
当mRNA为环状mRNA时，所述mRNA由上述重组质粒转录后环化而得。
在本发明的一种实施方式中，当mRNA为非复制线性mRNA时，所述核酸的上游依次连接有T7启动子和5’UTR，下游依次连接有3’UTR和聚腺苷酸化信号；
当mRNA为自复制线性mRNA时，所述核酸的上游依次连接有T7启动子、5’UTR和亚基因组启动子(subgenomic promoter)，下游依次连接有来源于病毒的自复制组件和3’UTR；
当mRNA为环状mRNA时，所述核酸的上游连接有IRES序列。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于病毒的自复制组件包括病毒中与RNA复制作用相关的非结构蛋白的基因序列、非结构蛋白基因的突变序列、病毒的部分结构蛋白的基因序列、病毒结构蛋白基因的突变序列或病毒结构蛋白基因的删减序列中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于病毒的自复制组件取自黄病毒、甲病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。
在本发明的一种实施方式中，所述黄病毒包括乙型脑炎病毒、登革热病毒森林脑炎病毒或昆津病毒中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述乙型脑炎病毒包括乙型脑炎病毒SA-14株、乙型脑炎病毒SA-14-14-2疫苗株(Japanese Encephalitis Virus，JEV)、乙型脑炎病毒SA-14株或乙型脑炎病毒SA-14-5-3株中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于病毒的自复制组件为来源于乙型脑炎病毒的NS1～NS5基因、结构蛋白基因C的删减序列和结构蛋白基因E的删减序列。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于病毒的自复制组件为乙型脑炎病毒SA-14-14-2疫苗株的NS1～NS5基因、结构蛋白基因C的删减序列和结构蛋白基因E的删减序列。
在本发明的一种实施方式中，所述非复制线性mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述自复制线性mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述环状mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明还提供了一种宿主细胞或细胞外泌体，所述宿主细胞或细胞外泌体的基因组整合有上述基因；或者，所述宿主细胞或细胞外泌体携带上述重组质粒；或者，所述宿主细胞或细胞外泌体携带上述mRNA。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞包括真核细胞和/或原核细胞。
本发明还提供了一种病毒样颗粒(VLP)，所述病毒样颗粒的基因组整合有上述基因；或者，所述病毒样颗粒携带上述重组质粒；或者，所述病毒样颗粒携带上述mRNA。
在本发明的一种实施方式中，所述病毒样颗粒来自于慢病毒、乙脑病毒、乙肝病毒、HPV病毒、狂犬病毒、逆转录病毒、登革热病毒或昆津病毒。
本发明还提供了上述基因或上述重组质粒或上述mRNA或上述宿主细胞或细胞外泌体或上述病毒样颗粒在制备用于抗皮肤衰老、修复妊娠纹、注射填充美容或治疗因III型胶原蛋白缺失引起的疾病的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述因III型胶原蛋白缺失引起的疾病包括特发性皮炎或Ehlers-Danlos综合征中的至少一种。
本发明还提供了一种用于抗皮肤衰老、修复妊娠纹、注射填充美容或治疗因III型胶原蛋白缺失引起的疾病的产品，所述产品的成分包含上述基因或上述mRNA中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述产品的成分包含有机相和水相；所述水相的成分包含上述mRNA；所述有机相的成分包含脂类。
在本发明的一种实施方式中，所述有机相的成分还包含单宁酸；所述水相的成分还包含ATP。
在本发明的一种实施方式中，所述有机相中，脂类和单宁酸的摩尔比为80～95：0～15。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述mRNA的浓度为0.1～5mg/mL，ATP的浓度为0～20mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述脂类包含C14-PEG2000、胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、阳离子脂类DLinDMA或阳离子脂质MC3中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述产品的为皮内注射用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5任一项所示。此核酸序列进行了密码子及mRNA二级结构优化，经优化后的核酸序列更稳定并且更有利于在人体内高效表达，因此，此核酸序列可以获得更高表达水平的胶原蛋白，从而获得更好的抗衰效果，在制备抗皮肤衰老、修复妊娠纹、注射填充美容和治疗因III型胶原蛋白缺失引起的疾病等的产品(产品形式包括包括但不限于注射液、冻干粉、可溶性微针贴片和通过无针注射器注射的注射液，产品使用方式包括但不限于皮内注射、微针贴片贴敷和使用无针注射器进行皮内注射)中极具应用前景。
进一步地，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3任一项所示。此核酸序列在此在人体内高效表达的效果更佳。
2、本发明提供了一种mRNA，所述mRNA由携带编码人III型胶原蛋白α链的核酸的重组质粒转录或转录后环化而得；所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5任一项所示。向真皮层内注射此mRNA，并通过物理方式(包括但不限于局部加热、超声、电穿孔等)、化学方式(包裹于脂质纳米颗粒内)或生物方式(装载于细胞、外泌体或病毒样颗粒内)将mRNA递送到真皮细胞内，可以在真皮细胞(主要是成纤维细胞)内生产III型胶原蛋白。成纤维细胞是人皮肤内生产胶原蛋白的主要细胞，是胶原蛋白的天然工厂，具备胶原蛋白分子翻译后修饰和糖基化相关的一系列酶。在成纤维细胞内翻译表达的人胶原蛋白分子能够经历和天然胶原蛋白一样的翻译后修饰(脯氨酸羟基化等)、加工、糖基化等过程，产生纤维状结构，从而更好地发挥胶原蛋白的功能。这是体外合成的胶原蛋白无法比拟的。此mRNA作为人III型胶原蛋白mRNA皮内注射产品解决了目前市场上胶原蛋白产品存在的问题，完全具备天然胶原蛋白的功能，能够更好地补充胶原蛋白，对抗皱纹、暗沉、松弛等皮肤衰老问题。同时，胶原蛋白mRNA的表达量及表达时长对于维持抗衰老效果非常重要。此mRNA携带的编码人III型胶原蛋白α链的核酸进行了密码子及mRNA二级结构优化，经优化后的核酸序列更有利于在人体内高效表达，因此可以获得更高表达水平的胶原蛋白，从而获得更好的抗衰效果。
进一步地，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3任一项所示。此核酸序列在此在人体内高效表达的效果更佳。
附图说明
图1：重组质粒LY-01的质粒图谱。
图2：自复制线性mRNA的结构示意图。
图3：重组质粒LY-02的质粒图谱。
图4：非复制线性mRNA和自复制线性化mRNA的电泳结果。图4中，泳道M为RNAladder，泳道1为COL3A1 mRNA，泳道2为COL3A1 mRNA replicon。
图5：环状mRNA的结构示意图。
图6：非复制线性mRNA和自复制线性化mRNA在细胞中的表达(Western blot)。图6中，泳道A为非复制线性mRNA(SEQ ID NO.6)，泳道B为非复制线性mRNA(SEQ ID NO.8)，泳道C为自复制线性化mRNA(SEQ ID NO.10)。
图7：非复制线性mRNA和自复制线性化mRNA在细胞中的表达(免疫荧光)。图7中，A为非复制线性mRNA(SEQ ID NO.6)，B非复制线性mRNA(SEQ ID NO.8)，C为自复制线性mRNA(SEQ ID NO.10)。
图8：不同组光老化裸鼠皮肤皱纹的变化情况。图8中，A为注射生理盐水的小鼠，B为注射100μg实施例5中非复制线性mRNA(SEQ ID NO.8)的小鼠，C为注射30μg实施例5中非复制线性mRNA-LNP(SEQ ID NO.8)的小鼠，D为注射30μg实施例3中自复制线性mRNA(SEQ IDNO.10)的小鼠，E为注射10μg实施例4中自复制mRNA-LNP(SEQ ID NO.10)的小鼠。
图9：不同组光老化裸鼠皮肤弹力的变化情况。图9中，mRNA为未非复制线性mRNA(SEQ ID NO.8)，replicon为自复制线性mRNA(SEQ ID NO.10)。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。下述实施例中涉及的293T细胞购自上海细胞中心，阳离子脂类DLinDMA二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇、C14-PEG2000购自赛诺邦格，单宁酸购自sigma，大肠杆菌DH5a购自全式金，LB培养基和LB-Kan平板为配制而得(LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，用NaOH调节pH到7.4；LB-Kan平板的配方为：在LB培养基中加入琼脂15g/L，高压灭菌后，待培养基冷却到50℃，加入卡那霉素50μg/mL)，BspQI限制性内切酶购自NEB，T7 RNA聚合酶购自NEB，DNase酶I购自NEB，PGEM-3zf质粒购自维真生物，NEB高产mRNA合成试剂盒、NEB Monach mRNA纯化柱及RNase R购自NEB，DMEM高糖培养基购自Lonza，双抗、胎牛血清、Opti-MEM培养基购自Invitrogen，HumanCollagenIIIa抗体及二抗购自Abcam，微流控混合器购自Precision Nanosystem、型号为Ignite+TM；下述实施例中涉及的序列由上海生工生物公司合成。
实施例1：一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(SEQ ID NO.1为编码人III型胶原蛋白α链的原始DNA分子的基础上，经密码子优化以及二级结构优化而得)。
实施例2：一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子，所述RNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
实施例3：一种编码人III型胶原蛋白α链的自复制线性化mRNA
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的自复制线性化mRNA，所述自复制线性化mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
所述自复制线性化mRNA的制备过程如下：
合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码人III型胶原蛋白α链的基因，得到基因片段；PCR扩增该基因片段，并通过扩增引物在其上游加入EcoRI酶切位点(GAATTC)，在其下游加入NotI酶切位点(CCCGGG)和保护碱基(TCC)，得到COL3A1基因片段；
根据黄病毒家族中乙型脑炎病毒(JEVVA14-14-2疫苗株)的基因组，设计并合成乙型脑炎病毒SA-14-14-2疫苗株的NS1～NS5基因、结构蛋白基因C的删减序列和结构蛋白基因E的删减序列组成的自复制mRNA元件(此自复制mRNA元件包含用于编码乙脑病毒自复制组件的基因，但缺乏编码用于制造具有传染性的乙脑病毒颗粒的结构蛋白的基因)，并在此自复制mRNA元件中插入T7启动子、5’UTR、subgenomic promoter、3’UTR、卡那霉素抗性基因以及复制启始点Ori，得到含有自复制mRNA元件的质粒；将含有自复制mRNA元件的质粒用EcoRI和NotI双酶切后切胶回收(酶切体系：自复制mRNA元件lμg、EcoRI 1μL、NotI lμL、10×Buffer 2μL，ddH20将体系补足20μL，酶切条件：37℃水浴2h)，得到回收片段；
将回收片段和COL3A1基因片段混合，通过无缝克隆的方式将COL3A1片段连接到回收片段中(无缝克隆体系：回收片段217ng、COL3A1基因片段258ng、2×HieffEnzymePremix l0μL，ddH20将体系补足20μL，无缝克隆条件：50℃反应20mins)，得到连接产物；将连接产物和大肠杆菌DH5a的感受态细胞按照体积比1：10(连接产物:大肠杆菌DH5a的感受态细胞＝1：10)混合后，先冰浴30min，然后42℃热击90s，再冰浴3min，最后加入预热至37℃的1mL LB培养基中，于37℃、100rpm培养1h，得到转化子；将转化子涂布于LB-Kan平板(含50μg/mL Kan的LB平板)，37℃培养16h，得到菌液；对菌液进行PCR扩增后(PCR扩增过程为：以菌液为模板，扩增目的条带，扩增反应循环条件为：94℃5min-(94℃1min，56℃30s，72℃3min)×30个循环-72℃10min-4℃)，电泳观察PCR扩增产物(电泳条件：1％(w/v，g/100mL)琼脂糖凝胶；120V，上样量：5μLPCR扩增产物；预期结果：COLA1基因片段约4400bp)；提取PCR验证结果符合预期的质粒送测序公司测序；提取测序验证完全正确的质粒，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的重组质粒LY-01(质粒图谱见图1)；
将重组质粒LY-01用BspQI限制性内切酶酶切(酶切体系：重组质粒LY-01 l0μg、BspQI 1μL、10×NEBuffer 3.15μL，ddH20将体系补足20μL，酶切条件：50℃水浴1h)，得到酶切混合物；向酶切混合物中加入占酶切混合物总体积1/10的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇后，先-20℃沉淀30分钟，然后12000rpm离心30分钟，再弃上清，最后用10μL无核酶水溶解沉淀，得到线性化的重组质粒LY-01；以线性化的重组质粒LY-01作为模板，先使用T7 RNA聚合酶对模板DNA进行体外共转录加帽反应(Co-Transcriptional Capping，反应体系：10×Reaction Buffer 2μL、NTP每种10mM、Cap Analog 8mM，线性化的重组质粒LY-01 1μg、T7RNA Enzyme Mix 100U，ddH20将体系补足20μL，反应过程：37℃反应2小时)，在体外转录合成mRNA的同时将7-甲基化鸟酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，Cap GAU)加至转录的mRNA的5’端，再使用DNase酶I对模板DNA进行降解(降解过程为：在体外共转录加帽反应后所得体系中加入1μL DNaseI(2mM)并补ddH20至总体积为30μL，37℃反应15分钟，得到反应产物；在反应产物中补ddH20至总体积300μL并加入7.5M氯化锂混匀，得到混合体系；将混合体系先于-80℃静置60分钟，14000g、4℃离心20分钟，弃上清，然后用70％(v/v)酒精清洗沉淀，14000g、4℃离心5分钟，弃上清，风干5分钟，再溶解在40μL ddH20内，得到转录所得mRNA产物；用分光光度计定量转录所得mRNA产物；取400ng转录所得mRNA产物和2×Loading buffer混合，先80℃孵育2分钟，再置于冰盒中孵育2分钟，上样，1×TAE缓冲液电泳，电泳条件：1％(w/v，g/100mL)琼脂糖凝胶；120V电泳30mins)，得到核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示的自复制线性化mRNA(自复制线性mRNA的结构见图2，电泳结果见图4)，将其命名为COL3A1 mRNA replicon。
实施例4：一种用于抗皮肤衰老的自复制mRNA-LNP
本实施例提供了一种用于抗皮肤衰老的自复制mRNA-LNP，所述自复制mRNA-LNP由实施例3的自复制线性化mRNA、脂类、单宁酸以及ATP组成；所述脂类由C14-PEG2000、胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以及阳离子脂类DLinDMA组成。
所述自复制mRNA-LNP的制备过程如下：
将自复制线性化mRNA和ATP溶解至柠檬酸纳缓冲液(pH 3.0，浓度10mM)中，使得柠檬酸纳缓冲液中，自复制线性化mRNA的浓度为0.26mg/mL，ATP的浓度为2mg/mL，得到混合液A；将脂类和单宁酸溶解至无水乙醇中，使得无水乙醇中，C14-PEG2000、胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、阳离子脂类DLinDMA以及单宁酸的摩尔比为2：40：9：44：5，得到混合液B；将混合液A和混合液B按照体积比3：1加入过微流控混合器将混合液A和混合液B混合，从而引起脂类的沉淀及在电荷作用下将mRNA和ATP包裹进入LNP内，得到自复制mRNA-LNP。
实施例5：一种编码人III型胶原蛋白α链的非复制线性mRNA
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的非复制线性mRNA，所述非复制线性mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
所述非复制线性化mRNA的制备过程如下：
合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码人III型胶原蛋白α链的基因，得到基因片段；PCR扩增该基因片段，并通过扩增引物在其上游加入BamHII酶切位点(GGATCC)和保护碱基(CG)，在其下游加入SmaI酶切位点(CCCGGG)和保护碱基(TCC)，得到COL3A1基因片段；
以PGEM-3zf质粒为基础，在PGEM-3zf质粒T7启动子的下游引入5’UTR序列(含BamHI酶切位点，SEQ ID NO.15)，在PGEM-3zf质粒的多克隆位点中引入3’UTR序列(含SmaI酶切位点，SEQ ID NO.16)、polyA序列以及BspQI酶切位点(polyA+BspQI，SEQ ID NO.17)，得到改造质粒；
将COL3A1基因片段和改造质粒经BamHII和SmaI双酶切后连接，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的重组质粒LY-02(质粒图谱见图3)；将重组质粒LY-02用BspQI限制性内切酶酶切(酶切体系：重组质粒LY-01 l0μg、BspQI 1μL、10×NEBuffer 3.15μL，ddH20将体系补足20μL，酶切条件：50℃水浴1h)，得到酶切混合物；向酶切混合物中加入占酶切混合物总体积1/10的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇后，先-20℃沉淀30分钟，然后12000rpm离心30分钟，再弃上清，最后用10μL无核酶水溶解沉淀，得到线性化的重组质粒LY-02；以线性化的重组质粒LY-02作为模板，先使用T7 RNA聚合酶对模板DNA进行体外共转录加帽反应(Co-Transcriptional Capping，反应体系：10×Reaction Buffer 2μL、NTP每种10mM、CapAnalog 8mM，线性化的重组质粒LY-02 1μg、T7 RNA Enzyme Mix 100U，ddH20将体系补足20μL，反应过程：37℃反应2小时)，在体外转录合成mRNA的同时将7-甲基化鸟酸帽结构(7-methylguanylate cap structure，Cap GAU)加至转录的mRNA的5’端，再使用DNase酶I对模板DNA进行降解(降解过程为：在体外共转录加帽反应后所得体系中加入1μL DNaseI(2mM)并补ddH20至总体积为30μL，37℃反应15分钟，得到反应产物；在反应产物中补ddH20至总体积300μL并加入7.5M氯化锂混匀，得到混合体系；将混合体系先于-80℃静置60分钟，14000g、4℃离心20分钟，弃上清，然后用70％(v/v)酒精清洗沉淀，14000g、4℃离心5分钟，弃上清，风干5分钟，再溶解在40μL ddH20内，得到转录所得mRNA产物；用分光光度计定量转录所得mRNA产物；取400ng转录所得mRNA产物和2×Loading buffer混合，先80℃孵育2分钟，再置于冰盒中孵育2分钟，上样，1×TAE缓冲液电泳，电泳条件：1％(w/v，g/100mL)琼脂糖凝胶；120V电泳30mins)，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的非复制线性化mRNA(电泳结果见图4)，将其命名为COL3A1 mRNA。
实施例6：一种用于抗皮肤衰老的非复制mRNA-LNP
本实施例提供了一种用于抗皮肤衰老的非复制mRNA-LNP，所述非复制mRNA-LNP为在实施例4的基础上，将实施例3的自复制线性化mRNA替换为实施例5的非复制线性化mRNA。
实施例7：一种编码人III型胶原蛋白α链的环状mRNA
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的环状mRNA，所述环状mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
所述环状mRNA的制备过程如下：
合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码人III型胶原蛋白α链的基因，并在其上游连接T7启动子、Group I Intron序列、靶点序列、用于环化的互补序列1和IRES序列，下游连接有用于环化的互补序列2，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的得到体外转录模板；
使用NEB高产mRNA合成试剂盒对体外转录模板进行IVT反应；IVT反应生成的产物用NEB Monach mRNA纯化柱进行纯化后，用RNase R进行消化处理，将线性mRNA降解掉，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的环状mRNA(环状mRNA的结构见图5)，将其命名为Circ-COL3A1 mRNA。
实施例8：一种用于抗皮肤衰老的环状mRNA-LNP
本实施例提供了一种用于抗皮肤衰老的环状mRNA-LNP，所述环状mRNA-LNP为在实施例4的基础上，将实施例3的自复制线性化mRNA替换为实施例7的环状mRNA。
实施例9：一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(SEQ ID NO.1为编码人III型胶原蛋白α链的原始DNA分子的基础上，经密码子优化以及二级结构优化而得)。
实施例10：一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子，所述RNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
实施例11：一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(SEQ ID NO.1为编码人III型胶原蛋白α链的原始DNA分子的基础上，经密码子优化以及二级结构优化而得)。
实施例12：一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子，所述RNA分子为实施例11的DNA分子转录而得的编码链。
实施例13：一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示(SEQ ID NO.1为编码人III型胶原蛋白α链的原始DNA分子的基础上，经密码子优化以及二级结构优化而得)。
实施例14：一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子，所述RNA分子为实施例13的DNA分子转录而得的编码链。
对比例1：一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子
本对比例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(SEQ ID NO.6为未经改造的野生型的编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子)。
对比例2：一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子
本实施例提供了一种编码人III型胶原蛋白α链的RNA分子，所述RNA分子为对比例1的DNA分子转录而得的编码链。
对比例3：一种用于抗皮肤衰老的自复制线性化mRNA
本对比例提供了一种用于抗皮肤衰老的自复制线性化mRNA，所述自复制线性化mRNA为在实施例3的基础上，将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子替换为对比例4的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的编码人III型胶原蛋白α链的DNA分子，将其命名为wild type COL3A1 mRNA。
实验例1：DNA分子序列参数的比较
本实验例提供了DNA分子序列参数的比较实验，具体实验过程如下：
比较SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.6的序列参数，比较结果见表1。由表1可知，经优化后的序列，最小自由能(MFE)和CAI值都较野生型序列有提高，其中SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3的最小自由能MFE值最低，CAI值最高，所以选择这两个序列进行进一步的实验验证。
经RNA二级结构分析，SEQ ID NO.2的二级结构中含有的假节最少，连续互补碱基数不超过15个，前5个核苷酸没有互补，且hairpin的长度未超过33，所以推测SEQ ID NO.2的蛋白表达效果最佳，这一推测也得到了实验证实。
表1 SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.6序列参数的比较
实验例2：线性化mRNA在细胞中的表达
本实验例提供了线性化mRNA在细胞中的表达实验，具体实验过程如下：
实验一：Western blot检测
细胞培养及铺板：将复苏好的293T细胞以4*10^6个的接种量接种在含有5mL培养基的培养瓶中(培养基为DMEM高糖培养基+5％的双抗+10％胎牛血清)，于37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养至细胞融合度达到80％后，用胰酶消化细胞消化并计数，得到实验用293T细胞；将实验用293T细胞以每孔2*10^5个的接种量接种至每孔添加有0.5mL培养基的24孔板中，于37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养24h。
脂质体mRNA转染293T细胞：吸弃24孔板中的培养基，用PBS缓冲液清洗；将0.75μLlipofectamin MessengerMAx转染试剂与25μL Opti-MEM培养基混合并静置10分钟后，与用25μL Opti-MEM培养基稀释的0.5μg mRNA(mRNA分别为实施例3的COL3A1 mRNA replicon、实施例5的COL3A1 mRNA、对比例6的wild type COL3A1 mRNA)，混合后静置5分钟，得到混合物；将混合物添加至清洗好的24孔板中，于37℃、5％(v/v)CO2培养箱继续培养24h。
蛋白样品的处理：293T细胞中加入50μL细胞裂解液及1％(w/v，g/100mL)的苯甲基磺酰氟，冰上放置5分钟，离心机14000g离心5分钟，将上清转移至新的离心管，-80℃保存备用。
电泳：使用预制梯度胶，蛋白上样量20μL，电泳条件：150V，40min。
电转：使用PVDF膜，在90V电压下转膜1小时。
封闭：使用1×PBST缓冲液配制5％(w/v，g/100mL)脱脂奶粉作为封闭液，4℃封闭16h。
一抗孵育：使用1×PBST缓冲液将Human CollagenIIIa抗体稀释500倍，室温(25℃)下孵育2小时；孵育结束后，用1×PBST缓冲液洗膜4次，每次5分钟。
二抗孵育：使用1×PBST缓冲液将二抗稀释2000倍，室温(25℃)下孵育1小时；孵育结束后，用1×PBST缓冲液洗膜4次，每次5分钟。
成像：ECL成像液A液：B液＝1：1(体积比)，在成像系统中进行显影，显影结果见图6。
由图6可知，在转染mRNA剂量相同且电泳上样量相同的前提下，经序列优化后的mRNA表达量明显高于未优化序列，自复制mRNA表达量明显优于非复制mRNA。
实验二：免疫荧光检测
细胞培养及铺板：将复苏好的293T细胞以4*10^6的接种量接种在含有5mL培养基的培养瓶中(培养基为DMEM高糖培养基+5％的双抗+10％胎牛血清)，于37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养至细胞融合度达到80％后，用胰酶消化细胞消化并计数，得到实验用293T细胞；将实验用293T细胞用培养基稀释至浓度为5*10^6/mL，得到细胞悬液；在6孔板中预先铺入盖玻片，取100μL细胞悬液接种至盖玻片上，于37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养培养2小时后，每孔补加1mL培养基。于37℃、5％(v/v)CO2培养箱继续培养16小时。
脂质体mRNA转染293T细胞：吸弃6孔板中的培养基，用PBS缓冲液清洗；将3.75μLlipofectamin MessengerMAx转染试剂与125μL Opti-MEM培养基混合并静置10分钟后，与用25μL Opti-MEM培养基稀释的2.5μg mRNA(mRNA分别为实施例3的COL3A1 mRNAreplicon、实施例5的COL3A1 mRNA、对比例6的wild type COL3A1 mRNA)，混合后静置5分钟，得到混合物；将混合物添加至清洗好的6孔板中，于37℃、5％(v/v)CO2培养箱继续培养24h。
样品的处理：在长满293T细胞的盖玻片取出，PBS缓冲液清洗2次后，浸泡于PBS缓冲液中；
固定：使用2％(w/v，g/100mL)多聚甲醛固定液固定细胞。
透过处理：使用0.5％(w/v，g/100mL)TritonX-100对细胞进行透过处理。
封闭：使用1XPBS配制5％BSA作为封闭液,4℃封闭过夜。
一抗孵育：使用1×PBST缓冲液将Human CollagenIIIa抗体稀释100倍，室温(25℃)下孵育2小时；孵育结束后，用1×PBST缓冲液洗膜4次，每次5分钟。
二抗孵育：使用1×PBST缓冲液将二抗稀释500倍，室温(25℃)下孵育1小时；孵育结束后，用1×PBST缓冲液洗膜4次，每次5分钟。
成像：倒置荧光显微镜观察细胞，拍照，结果见图片7。
由图7可知，在转染mRNA剂量相同的前提下，经序列优化后的mRNA表达量明显高于未优化序列，自复制mRNA表达量明显优于非复制mRNA。
实验例2：线性化mRNA的抗衰性能验证
本实验例提供了线性化mRNA的抗衰性能验证实验，具体实验过程如下：
实验一：褶皱指标
10～12周龄雌性裸鼠用紫外线(UVB，波长311nm紫外灯)照射背部皮肤(灯管置于背部上方约30cm处)，每隔一天照射一次，连续照射8周。照射剂量：前2周，1MED(60mJ·cm-2)，第3周剂量升高到2MED(120mJ·cm-2)，第4周3MED(180mJ·cm-2)，第5～8周4MED(240mJ·cm-2)。经紫外照射的裸鼠随机分为5组，每组6只，另外加一组未照射裸鼠作为对照组(sham)。5组紫外照射光老化裸鼠分别注射100μL生理盐水、100μg实施例5的COL3A1mRNA、30μg实施例6的非复制mRNA-LNP、30μg实施例3的COL3A1 mRNA replicon、10μg实施例4的自复制mRNA-LNP。使用32G BD注射器进行注射，将样品稀释至200μL，注射裸鼠后背部正中区，6个点位，每个点位注射30μL。注射前及注射后7天和28天分别拍照，拍照结果见图8。
由图8可知，注射生理盐水的对照组小鼠在注射前和注射后皱纹无明显变化，而注射mRNA的各组小鼠皱纹都有不同程度的减轻，而且效果持续直至28天。肉眼观察10μg实施例4的自复制mRNA-LNP组皮肤皱纹减轻最明显，其次是30μg实施例6的非复制mRNA-LNP组，再次是30μg实施例3的COL3A1 mRNA replicon组，100μg实施例5的COL3A1 mRNA组效果略差。
实验二：弹力指标
取实验一的注射药物后28天的裸鼠，吸入异氟烷麻醉后，使用Cutometer MPA580(Courage&Khazaka Electronics，Cologne，德国)检测皮肤弹性，使用2mm孔径探头测量，使用模式1在注射部位附近测量3次，分析R2参数(值越接近100％，皮肤弹力越好)，测量结果见图9。
由图9可知，未照射紫外线的裸鼠为sham组，其皮肤弹力值设为100％，其他组裸鼠是经紫外线照射后的光老化裸鼠。皮肤弹力值和sham组相比得到一个百分比值。注射生理盐水的对照组小鼠皮肤弹力值最低，说明生理盐水对改善光老化裸鼠的皮肤弹力无明显作用。而注射mRNA的各组小鼠皮肤弹力值明显高于生理盐水组。10μg实施例4的自复制mRNA-LNP组皮肤皮肤弹力最好，其次是30μg实施例6的非复制mRNA-LNP，再次是30μg实施例3的COL3A1 mRNA replicon组，100μg实施例5的COL3A1 mRNA虽效果略差，但和生理盐水组相比也有非常明显的改善。各组之间进行配对t检验结果如下表。各组p值均小于0.01，差别有显著意义。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种编码人III型胶原蛋白α链的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求1所述的核酸。
3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带的核酸连接有自复制元件、翻译调控元件、核酶或用于环化的互补序列中的至少一种；所述自复制元件包括来源于病毒的自复制组件；所述翻译调控元件包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、转座子、5’UTR、3’UTR、多腺苷酸序列或标记基因中的至少一种；所述核酶包括I型内含子核酶或II型内含子核酶中的至少一种。
4.一种mRNA，其特征在于，所述mRNA携带权利要求1所述的核酸。
5.如权利要求4所述的mRNA，其特征在于，所述mRNA包括非复制线性mRNA、自复制线性mRNA或环状mRNA中的至少一种；
当mRNA为非复制线性mRNA或自复制线性mRNA时，所述mRNA由权利要求2或3所述的重组质粒转录而得；
当mRNA为环状mRNA时，所述mRNA由权利要求2或3所述的重组质粒转录后环化而得。
6.一种宿主细胞或细胞外泌体，其特征在于，所述宿主细胞的基因组整合有权利要求1所述的核酸；或者，所述宿主细胞或细胞外泌体携带权利要求2或3所述的重组质粒；或者，所述宿主细胞或细胞外泌体携带权利要求4或5所述的mRNA。
7.一种病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒的基因组整合有权利要求1所述的核酸；或者，所述病毒样颗粒携带权利要求2或3所述的重组质粒；或者，所述病毒样颗粒携带权利要求4或5所述的mRNA。
8.权利要求1所述的核酸或权利要求2或3所述的重组质粒或权利要求4或5所述的mRNA或权利要求6所述的宿主细胞或细胞外泌体或权利要求7所述的病毒样颗粒在制备用于抗皮肤衰老、修复妊娠纹、注射填充美容或治疗因III型胶原蛋白缺失引起的疾病的药品中的应用。
9.一种用于抗皮肤衰老、修复妊娠纹、注射填充美容或治疗因III型胶原蛋白缺失引起的疾病的药品，其特征在于，所述药品的成分包含权利要求1所述的核酸或权利要求4或5所述的mRNA中的至少一种。
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