JP7532360B2

JP7532360B2 - ウィルソン病を処置するための組成物および方法

Info

Publication number: JP7532360B2
Application number: JP2021526562A
Authority: JP
Inventors: カルティクラマモールティ，; ステファニータグリアテラ，; アンタネンハウス，; アンドリューヤング，; ズー－インチェン，; チージャン，; ステファニーマーティン，; デイビッドオーバーコフラー，; ビクトリアウォン，; ジャンミンリー，
Original assignee: エンコーデッドセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2024-08-13
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: US20210369870A1; EP4257155A3; EP3880809A1; EP3880809A4; JP2022507534A; CA3118936A1; TW202039854A; EP4257155A2; WO2020102723A1; CN113302290A

Description

相互参照
本出願は、２０１８年１１月１６日出願の米国仮特許出願第６２／７６８，７４４号の利益を主張し、該出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

開示の背景
ウィルソン病は、銅の代謝の常染色体劣性遺伝性障害である。ウィルソン病は銅輸送ＡＴＰアーゼ２（ＡＴＰアーゼ銅輸送ベータとも称される）またはＡＴＰ７Ｂ遺伝子の変異によって惹起される。ＡＴＰ７Ｂは主として肝細胞で発現し、銅の膜貫通輸送において機能している。ＡＴＰ７Ｂ欠損は肝細胞による胆汁への銅の排泄の低下を引き起こし、肝臓、脳、およびその他の組織を含む種々の組織における銅の蓄積をもたらす。ウィルソン病の現行の治療法は、銅のレベルを低減させることを目的とする非治癒的なキレート化のアプローチを含んでいる。根底にある代謝欠陥を逆転させることができる遺伝子治療等の治療戦略は、極めて有利であろう。しかし、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子はほぼ４．４ｋＢと、多くの遺伝子治療ベクターのパッケージサイズの限界に近く、完全長の遺伝子を用いる遺伝子治療のアプローチを困難なものにしている。完全長遺伝子の発現を治療レベルで提供することができるウィルソン病のための遺伝子治療のアプローチに対するニーズがある。

開示の概要
一態様では、本出願は（ｉ）配列番号３もしくは４に対して少なくとも８０％の配列同一性、または（ｉｉ）配列番号５もしくは６に対して少なくとも９２％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、そのような核酸分子は配列番号３もしくは４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、配列番号３もしくは４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または配列番号３～６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。例示的な実施形態では、そのような核酸分子は配列番号３～６のいずれか１つを有するヌクレオチド配列を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、そのような調節エレメントは、配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。

別の態様では、本出願は、（ｉ）配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードし、肝臓におけるウイルスベクターからの発現のために最適化されているヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、肝臓における発現のためにコドン最適化されている。ある特定の実施形態では、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＡＡＶベクターからの発現のために最適化されている。ある特定の実施形態では、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有している。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。他の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。他の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号２を有するＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、肝臓における配列番号１を含む核酸分子からのＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも３倍大きな肝臓における核酸分子からの機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルをもたらす。他の実施形態では、肝臓における核酸分子からの機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルは、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも５倍または７倍大きい。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、プロモーター配列を含む調節エレメントを含む。ある特定の実施形態では、プロモーター配列は、哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも１０倍または少なくとも５０倍大きな発現を生じる。ある特定の実施形態では、調節エレメントはエンハンサー配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは１５０未満のｂｐ、１２０未満のｂｐ、または１０５未満のｂｐを有する。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。

別の態様では、本出願は本明細書で提供される核酸分子のいずれかを含む発現ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。

別の態様では、本出願は本明細書で提供される核酸分子のいずれかまたは発現ベクターのいずれかを含むウイルス粒子を提供する。ある特定の実施形態では、ウイルス粒子はＡＡＶのカプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。

別の態様では、本出願は本明細書で提供される核酸分子のいずれかまたは発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。

別の態様では、本出願は本明細書に記載される核酸分子のいずれか、発現ベクターのいずれか、またはウイルス粒子のいずれか、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、対象における機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を増加させるための方法であって、本出願は本明細書に記載される核酸分子のいずれか、発現ベクターのいずれか、ウイルス粒子のいずれか、または医薬組成物のいずれかを前記対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本出願はＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載される核酸分子のいずれか、発現ベクターのいずれか、ウイルス粒子のいずれか、または医薬組成物のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本出願はウィルソン病を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載される核酸分子のいずれか、発現ベクターのいずれか、ウイルス粒子のいずれか、または医薬組成物のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本出願は対象における機能的ＡＴＰ７Ｂの発現を増加させる際における使用のための、本明細書に記載される核酸分子のいずれか、発現ベクターのいずれか、ウイルス粒子のいずれか、または医薬組成物のいずれかを提供する。

別の態様では、本出願はＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害を処置する際における使用のための、本明細書に記載される核酸分子のいずれか、発現ベクターのいずれか、ウイルス粒子のいずれか、または医薬組成物のいずれかを提供する。

別の態様では、本出願はウィルソン病を処置する際における使用のための、本明細書に記載される核酸分子のいずれか、発現ベクターのいずれか、ウイルス粒子のいずれか、または医薬組成物のいずれかを提供する。

別の態様では、本出願は本明細書で提供されるウイルス粒子を産生するプロセスであって、（ｉ）本明細書で提供される宿主細胞を培養培地中で培養すること、および（ｉｉ）細胞培養上清または宿主細胞からウイルス粒子を回収することを含む、プロセスを提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は（ａ）ＡＡＶｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子、ならびに／または（ｂ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸分子をさらに含む。

別の態様では、本出願はウイルス粒子の産生のための、本明細書に記載される核酸分子のいずれかまたは発現ベクターのいずれかの使用を提供する。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号６６～６８のいずれか１つを有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは配列番号６７を含む。

ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子もしくは第ＸＩＩ因子のうちいずれか１つ、またはそれらのバリアントもしくは機能的断片をコードする。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は第ＶＩＩＩ因子またはそのバリアントもしくは機能的断片をコードする。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子はＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントもしくは機能的断片をコードする。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は肝臓における発現のためにコドン最適化されているバリアントヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子はＡＡＶベクターからの発現のために最適化されているバリアントヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアントヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するバリアントヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は、配列番号３～１８のいずれか１つを含む。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は、配列番号５を含む。

ある特定の実施形態では、調節エレメントはプロモーター配列である。ある特定の実施形態では、核酸分子はエンハンサー配列をさらに含む。

ある特定の実施形態では、調節エレメントは１５０未満のｂｐを有する。ある特定の実施形態では、調節エレメントは１２０未満のｂｐを有する。ある特定の実施形態では、調節エレメントは１０５未満のｂｐを有する。

ある特定の実施形態では、調節エレメントは哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも１０倍大きな発現を生じる。ある特定の実施形態では、調節エレメントは哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも５０倍大きな発現を生じる。

ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子はＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は配列番号２を有するＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

ある特定の実施形態では、肝臓におけるバリアントヌクレオチド配列からの機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルは、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも５倍大きい。ある特定の実施形態では、肝臓におけるバリアントヌクレオチド配列からの機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルは、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも７倍大きい。

ある特定の実施形態では、核酸分子はウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列である。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲのＡＡＶ配列はＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９配列である。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載される核酸分子のいずれかを含む発現ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載される核酸分子または発現ベクターのいずれかを含むウイルス粒子を提供する。ある特定の実施形態では、ウイルス粒子はＡＡＶのカプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ウイルス粒子はＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９のカプシドタンパク質を含む。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載される核酸分子のいずれかを含む宿主細胞を提供する。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、発現ベクター、またはウイルス粒子、ならびに１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、本出願は対象における機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を増加させるための方法であって、（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本出願はＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害を処置するための方法であって、（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む治療有効量の核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本出願はウィルソン病を処置するための方法であって、（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む治療有効量の核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本出願は対象における機能的ＡＴＰ７Ｂの発現を増加させる際における使用のための、（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を提供する。

別の態様では、本出願はＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害の処置を増大させる（increasing treating）際における使用のための、（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を提供する。

別の態様では、本出願はウィルソン病を処置する際における使用のための、（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を提供する。

別の態様では、本出願はウイルス粒子を産生するプロセスであって、（ｉ）（ａ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｂ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養培地中で培養すること、ならびに（ｉｉ）細胞培養上清または宿主細胞からウイルス粒子を回収することを含む、プロセスを提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は（ａ）ＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子、および／または（ｂ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸分子を、さらに含む。

別の態様では、本出願はウイルス粒子の産生のための、（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子または発現ベクターの使用を提供する。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号２４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号２４を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号５を有する配列を含む。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号６７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号６７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号６７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、配列番号６７を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号５を有する配列を含む。

ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。ある特定の実施形態では、バリアントヌクレオチド配列は、配列番号２を有するＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

ある特定の実施形態では、核酸分子はウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列である。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列はＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９の配列である。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。ある特定の実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子または発現ベクターを含むウイルス粒子を提供する。ある特定の実施形態では、ウイルス粒子はＡＡＶのカプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

別の態様では、本出願は（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子、発現ベクター、またはウイルス粒子、ならびに１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、本出願は対象における機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を増加させるための方法であって、（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本出願はＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害を処置するための方法であって、（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む治療有効量の核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本出願はウィルソン病を処置するための方法であって、（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む治療有効量の核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本出願は対象における機能的ＡＴＰ７Ｂの発現を増加させる際における使用のための、（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を提供する。

別の態様では、本出願はＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害の処置を増大させる際における使用のための、（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を提供する。

別の態様では、本出願はウィルソン病を処置する際における使用のための、（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子、発現ベクター、ウイルス粒子、または医薬組成物を提供する。

別の態様では、本出願はウイルス粒子を産生するプロセスであって、（ｉ）（ａ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｂ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子または発現ベクターを含む宿主細胞を培養培地中で培養すること、ならびに（ｉｉ）細胞培養上清または宿主細胞からウイルス粒子を回収することを含む、プロセスを提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は（ａ）ＡＡＶｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子、ならびに／または（ｂ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸分子をさらに含む。

別の態様では、本出願はウイルス粒子の産生のための、（ｉ）配列番号２４または配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む核酸分子または発現ベクターの使用を提供する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
（ｉ）配列番号３もしくは４に対して少なくとも８０％の配列同一性、または（ｉｉ）配列番号５もしくは６に対して少なくとも９２％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする、核酸分子。
（項目２）
配列番号３または４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
配列番号３または４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目４）
配列番号３～６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目５）
配列番号３～６のいずれか１つを有するヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目６）
ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする、項目１に記載の核酸分子。
（項目７）
配列番号２を有するＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする、項目１に記載の核酸分子。
（項目８）
肝臓における前記核酸分子からの前記機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルが、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも３倍大きい、項目１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目９）
肝臓における前記核酸分子からの前記機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルが、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも５倍大きい、項目８に記載の核酸分子。
（項目１０）
肝臓における前記核酸分子からの前記機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルが、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも７倍大きい、項目９に記載の核酸分子。
（項目１１）
調節エレメントをさらに含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１２）
前記調節エレメントが、配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１１に記載の核酸分子。
（項目１３）
前記調節エレメントが、配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１２に記載の核酸分子。
（項目１４）
前記調節エレメントが、配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１３に記載の核酸分子。
（項目１５）
前記調節エレメントが、配列番号１９～４３のいずれか１つを有する配列を含む、項目１４に記載の核酸分子。
（項目１６）
前記調節エレメントがプロモーター配列を含む、項目１１から１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１７）
前記プロモーター配列が、哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも１０倍大きな発現を生じる、項目１６に記載の核酸分子。
（項目１８）
前記プロモーター配列が、哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも５０倍大きな発現を生じる、項目１６に記載の核酸分子。
（項目１９）
前記調節エレメントがエンハンサー配列をさらに含む、項目１１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目２０）
前記調節エレメントが１５０未満のｂｐを有する、項目１１から１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目２１）
前記調節エレメントが１２０未満のｂｐを有する、項目１１から１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目２２）
前記調節エレメントが１０５未満のｂｐを有する、項目１１から１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目２３）
ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含む、項目１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目２４）
前記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列である、項目２３に記載の核酸分子。
（項目２５）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、項目２４に記載の核酸分子。
（項目２６）
項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目２７）
ウイルスベクターである、項目２６に記載の発現ベクター。
（項目２８）
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、項目２７に記載の発現ベクター。
（項目２９）
項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子または項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクターを含むウイルス粒子。
（項目３０）
ＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、項目２９に記載のウイルス粒子。
（項目３１）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、項目３０に記載のウイルス粒子。
（項目３２）
項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子または項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目３３）
項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子、項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクター、または項目２９から３１のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目３４）
対象における機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を増加させるための方法であって、項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子、項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目２９から３１のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目３３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３５）
ＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害を処置するための方法であって、治療有効量の項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子、項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目２９から３１のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目３３に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目３６）
ウィルソン病を処置するための方法であって、治療有効量の項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子、項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目２９から３１のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目３３に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目３７）
対象における機能的ＡＴＰ７Ｂの発現を増加させる際における使用のための、項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子、項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目２９から３１のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目３３に記載の医薬組成物。
（項目３８）
ＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害の処置を増大させる際における使用のための、項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子、項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目２９から３１のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目３３に記載の医薬組成物。
（項目３９）
ウィルソン病を処置する際における使用のための、項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子、項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目２９から３１のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目３３に記載の医薬組成物。
（項目４０）
項目２９から３１のいずれかに記載のウイルス粒子を産生するプロセスであって、（ｉ）項目３２に記載の宿主細胞を培養培地中で培養すること、および（ｉｉ）細胞培養上清または前記宿主細胞から前記ウイルス粒子を回収することを含む、プロセス。
（項目４１）
前記宿主細胞が、（ａ）ＡＡＶｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子ならびに／または（ｂ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸分子をさらに含む、項目４０に記載のプロセス。
（項目４２）
ウイルス粒子の産生のための、項目１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子または項目２６から２８のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
（項目４３）
（ｉ）配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および
（ｉｉ）機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードし、肝臓におけるウイルスベクターからの発現のために最適化されているバリアントヌクレオチド配列
を含む核酸分子。
（項目４４）
前記調節エレメントが、配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、項目４３に記載の核酸分子。
（項目４５）
前記調節エレメントが、配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目４４に記載の核酸分子。
（項目４６）
前記調節エレメントが、配列番号１９～４３のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目４５に記載の核酸分子。
（項目４７）
前記調節エレメントが、配列番号１９～４３のいずれか１つを有する配列を含む、項目４６に記載の核酸分子。
（項目４８）
前記バリアントヌクレオチド配列が、肝臓における発現のためにコドン最適化されている、項目４３から４７のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目４９）
前記バリアントヌクレオチド配列が、ＡＡＶベクターからの発現のために最適化されている、項目４３から４８のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目５０）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、項目４３から４９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目５１）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、項目５０に記載の核酸分子。
（項目５２）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目５１に記載の核酸分子。
（項目５３）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、項目５２に記載の核酸分子。
（項目５４）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号３～１８のいずれか１つを含む、項目５３に記載の核酸分子。
（項目５５）
前記調節エレメントがプロモーター配列である、項目４３から５４のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目５６）
エンハンサー配列をさらに含む、項目４３から５５のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目５７）
前記調節エレメントが１５０未満のｂｐを有する、項目４３から５６のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目５８）
前記調節エレメントが１２０未満のｂｐを有する、項目４３から５６のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目５９）
前記調節エレメントが１０５未満のｂｐを有する、項目４３から５６のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目６０）
前記調節エレメントが、哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも１０倍大きな発現を生じる、項目４３から５９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目６１）
前記調節エレメントが、哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも５０倍大きな発現を生じる、項目４３から６０のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目６２）
ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする、項目４３から６１のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目６３）
配列番号２を有するＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする、項目４３から６１のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目６４）
肝臓における前記バリアントヌクレオチド配列からの前記機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルが、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも５倍大きい、項目４３から６３のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目６５）
肝臓における前記バリアントヌクレオチド配列からの前記機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルが、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも７倍大きい、項目４３から６３のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目６６）
ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含む、項目４３から６５のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目６７）
前記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列である、項目６６に記載の核酸分子。
（項目６８）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、項目６７に記載の核酸分子。
（項目６９）
項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目７０）
ウイルスベクターである、項目６９に記載の発現ベクター。
（項目７１）
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、項目７０に記載の発現ベクター。
（項目７２）
項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子または項目６９から７１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含むウイルス粒子。
（項目７３）
ＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、項目７２に記載のウイルス粒子。
（項目７４）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、項目７３に記載のウイルス粒子。
（項目７５）
項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子または項目６９から７１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目７６）
項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子、項目６９から７１のいずれか一項に記載の発現ベクター、または項目７２から７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目７７）
対象における機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を増加させるための方法であって、項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子、項目６８から７０のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目７２から７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目７６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目７８）
ＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害を処置するための方法であって、治療有効量の項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子、項目６９から７１のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目７２から７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目７６に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目７９）
ウィルソン病を処置するための方法であって、治療有効量の項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子、項目６９から７１のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目７２から７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目７６に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目８０）
対象における機能的ＡＴＰ７Ｂの発現を増加させる際における使用のための、項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子、項目６９から７１のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目７２から７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目７６に記載の医薬組成物。
（項目８１）
ＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害を処置する際における使用のための、項目４１から６８のいずれか一項に記載の核酸分子、項目６９から７１のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目７２から７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目７６に記載の医薬組成物。
（項目８２）
ウィルソン病を処置する際における使用のための、項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子、項目６９から７１のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目７２から７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目７６に記載の医薬組成物。
（項目８３）
項目７２から７４のいずれか一項に記載のウイルス粒子を産生するプロセスであって、（ｉ）項目７５に記載の宿主細胞を培養培地中で培養すること、および（ｉｉ）細胞培養上清または前記宿主細胞から前記ウイルス粒子を回収することを含む、プロセス。
（項目８４）
前記宿主細胞が、（ａ）ＡＡＶｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子、ならびに／または（ｂ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸分子をさらに含む、項目８３に記載のプロセス。
（項目８５）
ウイルス粒子の産生のための、項目４３から６８のいずれか一項に記載の核酸分子または項目６９から７１のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
（項目８６）
（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および
（ｉｉ）前記調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列
を含む核酸分子。
（項目８７）
前記調節エレメントが、配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、項目８６に記載の核酸分子。
（項目８８）
前記調節エレメントが、配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目８７に記載の核酸分子。
（項目８９）
前記調節エレメントが、配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目８８に記載の核酸分子。
（項目９０）
前記調節エレメントが、配列番号６６～６８のいずれか１つを有する配列を含む、項目８９に記載の核酸分子。
（項目９１）
前記調節エレメントが配列番号６７を含む、項目９０に記載の核酸分子。
（項目９２）
前記治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、もしくは第ＸＩＩ因子、またはそれらのバリアントもしくは機能的断片のうちいずれか１つをコードする、項目８６～９１のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目９３）
前記治療用導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子またはそのバリアントもしくは機能的断片をコードする、項目９２に記載の核酸分子。
（項目９４）
前記治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントもしくは機能的断片をコードする、項目９０に記載の核酸分子。
（項目９５）
前記治療用導入遺伝子が、肝臓における発現のためにコドン最適化されているバリアントヌクレオチド配列を含む、項目８６から９４のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目９６）
前記治療用導入遺伝子が、ＡＡＶベクターからの発現のために最適化されているバリアントヌクレオチド配列を含む、項目８６から９５のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目９７）
前記治療用導入遺伝子が、配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアントヌクレオチド配列を含む、項目８６から９６のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目９８）
前記治療用導入遺伝子配列が、配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するバリアントヌクレオチド配列を含む、項目９７に記載の核酸分子。
（項目９９）
前記治療用導入遺伝子配列が、配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントヌクレオチド配列を含む、項目９８に記載の核酸分子。
（項目１００）
前記治療用導入遺伝子配列が、配列番号３～１８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントヌクレオチド配列を含む、項目９９に記載の核酸分子。
（項目１０１）
前記治療用導入遺伝子配列が、配列番号３～１８のいずれか１つを含む、項目１００に記載の核酸分子。
（項目１０２）
前記治療用導入遺伝子配列が配列番号５を含む、項目１０１に記載の核酸分子。
（項目１０３）
前記調節エレメントがプロモーター配列である、項目８６から１０２のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１０４）
エンハンサー配列をさらに含む、項目８６から１０３のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１０５）
前記調節エレメントが１５０未満のｂｐを有する、項目８６から１０４のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１０６）
前記調節エレメントが１２０未満のｂｐを有する、項目８６から１０４のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１０７）
前記調節エレメントが１０５未満のｂｐを有する、項目８６から１０４のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１０８）
前記調節エレメントが、哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも１０倍大きな発現を生じる、項目８６から１０７のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１０９）
前記調節エレメントが、哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも５０倍大きな発現を生じる、項目８６から１０８のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１１０）
前記治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする、項目８６から１０９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１１１）
前記治療用導入遺伝子が、配列番号２を有するＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする、項目８６から１０９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１１２）
肝臓における前記治療用導入遺伝子配列からの機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルが、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも５倍大きい、項目８６から１１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１１３）
肝臓における前記治療用導入遺伝子配列からの前記機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルが、配列番号１を含む核酸分子からの肝臓におけるＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現のレベルと比較して少なくとも７倍大きい、項目１１２に記載の核酸分子。
（項目１１４）
ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含む、項目８６から１１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１１５）
前記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列である、項目１１４に記載の核酸分子。
（項目１１６）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、項目１１５に記載の核酸分子。
（項目１１７）
項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目１１８）
ウイルスベクターである、項目１１７に記載の発現ベクター。
（項目１１９）
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、項目１１８に記載の発現ベクター。
（項目１２０）
項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子または項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクターを含むウイルス粒子。
（項目１２１）
ＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、項目１２０に記載のウイルス粒子。
（項目１２２）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、項目１２１に記載のウイルス粒子。
（項目１２３）
項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子または項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１２４）
項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクター、または項目１２０から１２２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目１２５）
対象における機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を増加させるための方法であって、項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１２０から１２２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１２４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目１２６）
ＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害を処置するための方法であって、治療有効量の項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１２０から１２２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１２４に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目１２７）
ウィルソン病を処置するための方法であって、治療有効量の項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１２０から１２２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１２４に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目１２８）
対象における機能的ＡＴＰ７Ｂの発現を増加させる際における使用のための、項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１２０から１２２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１２４に記載の医薬組成物。
（項目１２９）
ＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害の処置を増大させる際における使用のための、項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１２０から１２２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１２４に記載の医薬組成物。
（項目１３０）
ウィルソン病を処置する際における使用のための、項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１２０から１２２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１２４に記載の医薬組成物。
（項目１３１）
項目１２０から１２２のいずれか一項に記載のウイルス粒子を産生するプロセスであって、（ｉ）項目１２３に記載の宿主細胞を培養培地中で培養すること、および（ｉｉ）細胞培養上清または前記宿主細胞から前記ウイルス粒子を回収することを含む、プロセス。
（項目１３２）
前記宿主細胞が、（ａ）ＡＡＶｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子、ならびに／または（ｂ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸分子をさらに含む、項目１３１に記載のプロセス。
（項目１３３）
ウイルス粒子の産生のための、項目８６から１１６のいずれか一項に記載の核酸分子または項目１１７から１１９のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
（項目１３４）
（ｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および
（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列
を含む核酸分子。
（項目１３５）
前記調節エレメントが、配列番号２４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１３４に記載の核酸分子。
（項目１３６）
前記調節エレメントが、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１３５に記載の核酸分子。
（項目１３７）
前記調節エレメントが、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１３６に記載の核酸分子。
（項目１３８）
前記調節エレメントが、配列番号２４を有する配列を含む、項目１３７に記載の核酸分子。
（項目１３９）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１３４から１３８のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１４０）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１３９に記載の核酸分子。
（項目１４１）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１４０に記載の核酸分子。
（項目１４２）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号５を有する配列を含む、項目１４１に記載の核酸分子。
（項目１４３）
（ｉ）配列番号６７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメント、および
（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするバリアントヌクレオチド配列
を含む核酸分子。
（項目１４４）
前記調節エレメントが、配列番号６７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１４３に記載の核酸分子。
（項目１４５）
前記調節エレメントが、配列番号６７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１４４に記載の核酸分子。
（項目１４６）
前記調節エレメントが、配列番号６７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１４５に記載の核酸分子。
（項目１４７）
前記調節エレメントが、配列番号６７を有する配列を含む、項目１４６に記載の核酸分子。
（項目１４８）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１４３から１４７のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１４９）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１４８に記載の核酸分子。
（項目１５０）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１４９に記載の核酸分子。
（項目１５１）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号５を有する配列を含む、項目１５０に記載の核酸分子。
（項目１５２）
前記バリアントヌクレオチド配列が、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする、項目１３４から１５１のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１５３）
前記バリアントヌクレオチド配列が、配列番号２を有するＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする、項目１３４から１５２のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１５４）
ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含む、項目１３４から１５３のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１５５）
前記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列である、項目１５４に記載の核酸分子。
（項目１５６）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、項目１５５に記載の核酸分子。
（項目１５７）
項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目１５８）
ウイルスベクターである、項目１５７に記載の発現ベクター。
（項目１５９）
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、項目１５８に記載の発現ベクター。
（項目１６０）
項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子または項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクターを含むウイルス粒子。
（項目１６１）
ＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、項目１６０に記載のウイルス粒子。
（項目１６２）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である、項目１６１に記載のウイルス粒子。
（項目１６３）
項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子または項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１６４）
項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクター、または項目１６０から１６２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目１６５）
対象における機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を増加させるための方法であって、項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１６０から１６２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１６４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目１６６）
ＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害を処置するための方法であって、治療有効量の項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１６０から１６２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１６４に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目１６７）
ウィルソン病を処置するための方法であって、治療有効量の項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１６０から１６２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１６４に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目１６８）
対象における機能的ＡＴＰ７Ｂの発現を増加させる際における使用のための、項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１６０から１６２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１６４に記載の医薬組成物。
（項目１６９）
ＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害の処置を増大させる際における使用のための、項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１６０から１６２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１６４に記載の医薬組成物。
（項目１７０）
ウィルソン病を処置する際における使用のための、項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクター、項目１６０から１６２のいずれか一項に記載のウイルス粒子、または項目１６４に記載の医薬組成物。
（項目１７１）
項目１６０から１６２のいずれか一項に記載のウイルス粒子を産生するプロセスであって、（ｉ）項目１６３に記載の宿主細胞を培養培地中で培養すること、および（ｉｉ）細胞培養上清または前記宿主細胞から前記ウイルス粒子を回収することを含む、プロセス。
（項目１７２）
前記宿主細胞が、（ａ）ＡＡＶｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子ならびに／または（ｂ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸分子をさらに含む、項目１７１に記載のプロセス。
（項目１７３）
ウイルス粒子の産生のための、項目１３４から１５６のいずれか一項に記載の核酸分子または項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。

参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み込まれるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。不一致の場合には、定義を含めて本明細書が優先する。

本発明の新規の特徴は、特に添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が活用されている例示的な実施形態について記載している以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。

図１は、ＨＥＫ２９３細胞における、野生型ＡＴＰ７Ｂ（配列番号１）の発現レベルの、２つのコドン最適化バリアント（バリアント２（配列番号４）およびバリアント３（配列番号５））と比較した場合の比較を示す。

図２は、マウス肝臓における、野生型ＡＴＰ７Ｂ（配列番号１）の発現レベルの、２つのコドン最適化バリアント（バリアント２（配列番号４）およびバリアント３（配列番号５））と比較した場合の比較を示す。

図３Ａは、異なる調節エレメント（例えば、配列番号１９および配列番号２０）を含むプラスミドの標準化ルシフェラーゼ値を示し、調節エレメントが有したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼの発現に対する効果を実証している。例えば、配列番号２１（最小ＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）プロモーターと組み合わされた配列番号１９を含む）は、ｍｉｎＣＭＶプロモーター単独によって駆動された発現の約１．４倍大きく、かつＳＣＰプロモーターによって駆動された発現の約６０倍大きいレベルでルシフェラーゼの発現を駆動した。

図３Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ＳＣＰ、ｍｉｎＣＭＶ、およびＣＡＧと比較した、各調節エレメント（例えば、配列番号２１および配列番号２２）のサイズ標準化活性（標準化ルシフェラーゼ活性を塩基対での調節エレメントの長さで割ることにより計算される）を示す。配列番号２２（ｍｉｎＣＭＶプロモーターと連結した配列番号２０を含む）は、ｍｉｎＣＭＶプロモーター単独の約３．５倍大きく、かつＳＣＰプロモーターの約１４０倍大きいレベルでのサイズ標準化活性を生じた。

図３Ｃは、陰性対照および陽性対照（配列番号２２）と比較した、調節エレメント配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９の標準化ルシフェラーゼ発現を示す。調節エレメントの全ては、配列番号２２によって駆動された発現のレベルに匹敵する高レベルの標準化ルシフェラーゼ発現を生じた。

図３Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、陰性対照、陽性対照（配列番号２２）、ＣＭＶ＋ＣＭＶｅ、およびＣＭＶ単独と比較した、調節エレメント配列番号３４、配列番号３６、配列番号３２、または配列番号３３の標準化ルシフェラーゼ発現を示す。各調節エレメントは、ＣＭＶ単独およびＣＭＶ＋ＣＭＶｅより高いルシフェラーゼ発現を駆動した。

図３Ｅは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、陰性対照と比較した、調節エレメント配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３の標準化ルシフェラーゼ発現を示す。試験された各調節エレメントは、陰性対照より高いルシフェラーゼ発現を駆動した。

図４は、１Ｅ１０（または１０^１０）の、マウスあたりゲノムコピー数（ｇｃ／マウス）、１Ｅ１１（または１０^１１）ｇｃ／マウス、または１Ｅ１２（または１０^１２）ｇｃ／マウスの用量で、配列番号２３の配列を有する調節エレメントを含む発現カセットで処置されたマウスにおけるＡＴＰ７Ｂの相対的発現（Ｌｏｇ２）を示す。データは、配列番号２３を含む発現カセットの用量とｉｎｖｉｖｏでのＡＴＰ７Ｂの発現との間の正相関を示した。

図５は、配列番号２６、２７、２３、２５、２２、３３、または２４の配列を有する調節エレメントを含む発現カセットで処置され、かつ５Ｅ１１（または５×１０^１１）ｇｃ／マウスの用量で投与されたマウスにおけるＥＧＦＰの相対的発現（Ｌｏｇ１０）を示す。データは、それらの調節エレメントが、ｉｎｖｉｖｏでのマウスの肝臓において、ＲＮＡ転写物により測定された場合、ＥＧＦＰ発現のレベルの上昇を生じたことを示している。

図６は、配列番号２６、２７、２３、２５、２２、３３、または２４の配列を有する調節エレメントを含む発現カセットで処置され、かつ５Ｅ１１（または５×１０^１１）ｇｃ／マウスの用量で投与されたマウスにおける、ＧＦＰを発現する肝細胞のパーセンテージを示す。データは、試験された調節エレメントの多くが、マウスにおいて高いパーセンテージの肝細胞で発現し、配列番号２４が、８０％より多くの肝細胞において発現した。

図７は、ＡＡＶＩＴＲ－ＬおよびＩＴＲ－Ｒ、ならびに大きい導入遺伝子、例えば、ＡＴＰ７Ｂのコドン最適化バリアントに作動可能に連結した、本開示の１つまたは複数の比較的短いヒト由来調節エレメント（例えば、配列番号２３～４３）を含む、本開示の例示的な発現カセット、ベクター、またはプラスミドを示す。そのようなｒＡＡＶベクターは、遺伝子治療処置に使用することができる。

図８は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置されたマウスの肝臓における相対的ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、いくつかのプロモーターエレメントの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を、ラベルされた濃度で含有した。

図９Ａおよび９Ｂは、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、雄（パネルＡ）および雌（パネルＢ）の野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスの肝臓における相対的タンパク質発現を示すウェスタンブロット分析である。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図１０Ａおよび１０Ｂは、雄（パネルＡ）および雌（パネルＢ）マウスにおける、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスの肝臓における相対的タンパク質発現を示すＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図１１は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける、二倍体ゲノムあたりのベクターコピー数を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図１２は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。統計検定を、ＡＴＰ７ＢＫＯ＋ＰＢＳ群とＡＴＰ７ＢＫＯ＋ウイルス群との間で実施した（^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊＊＊＝ｐ＜１Ｅ－５）。

図１３は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。統計検定を、ＡＴＰ７ＢＫＯ＋ＰＢＳ群とＡＴＰ７ＢＫＯ＋ウイルス群との間で実施した（^＊＊＝ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。

図１４Ａ～１４Ｃは、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける肝臓傷害および代謝機能の血清化学分析を示す一連のグラフである。（Ａ）ＡＬＰ、ＡＬＴ、およびＡＳＴ；（Ｂ）ＡＬＢ／Ｇｌｏｂ、アルブミン、抱合型ビリルビン、および総ビリルビン；ならびに（Ｃ）コレステロールおよびグルコース。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。図１４Ａ～１４Ｃは、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける肝臓傷害および代謝機能の血清化学分析を示す一連のグラフである。（Ａ）ＡＬＰ、ＡＬＴ、およびＡＳＴ；（Ｂ）ＡＬＢ／Ｇｌｏｂ、アルブミン、抱合型ビリルビン、および総ビリルビン；ならびに（Ｃ）コレステロールおよびグルコース。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図１５は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるＴＩＭＰ１タンパク質レベルを示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図１６は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照での処置から２１週間後の、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける尿銅濃度を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図１７は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける最終血清銅レベルを示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図１８は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける脳銅レベル（乾燥重量）を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図１９は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける肝臓ローダミン染色を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図２０Ａ～２０Ｃは、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける、炎症、線維症、および大細胞変化のスコアを示す一連のグラフである。（Ａ）：炎症スコア；（Ｂ）：線維症スコア、および（Ｃ）：大細胞変化スコア。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。図２０Ａ～２０Ｃは、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける、炎症、線維症、および大細胞変化のスコアを示す一連のグラフである。（Ａ）：炎症スコア；（Ｂ）：線維症スコア、および（Ｃ）：大細胞変化スコア。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。図２０Ａ～２０Ｃは、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける、炎症、線維症、および大細胞変化のスコアを示す一連のグラフである。（Ａ）：炎症スコア；（Ｂ）：線維症スコア、および（Ｃ）：大細胞変化スコア。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図２１Ａおよび２１Ｂは、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける免疫細胞浸潤を示す。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。白色矢印は、ＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける免疫細胞浸潤を示す。黒色矢印は、ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯマウスの肝臓組織における線維症の結果としてのコラーゲン線維を示す。

図２２は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるアルファ－ＳＭＡ染色を示す。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。白色矢印は、ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおいて観察された肝星細胞の活性化を示す。

図２３Ａ（雄）および図２３Ｂ（雌）は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける遺伝子の示差的な遺伝子発現を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図２４は、異なる濃度のＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照で処置されたマウスにおけるＡＴＰ７Ｂ発現レベルを示すグラフである。ＡＡＶ５およびＡＡＶ８ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図２５は、異なる濃度のＡＡＶ５もしくはＡＡＶ８ウイルス、またはＰＢＳ対照で処置された野生型マウスにおける二倍体ゲノムあたりのベクターコピー数を示すグラフである。ＡＡＶ５およびＡＡＶ８ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図２６は、異なる濃度のＡＡＶ５もしくはＡＡＶ８ウイルス、またはＰＢＳ対照で処置された野生型マウスにおけるＡＴＰ７Ｂタンパク質濃度を示すグラフである。ＡＡＶ５およびＡＡＶ８ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図２７は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるセルロプラスミン活性を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図２８は、ＡＡＶ５ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるセルロプラスミン活性を示すグラフである。ＡＡＶ５ウイルスは、ラベルされているように、配列番号６７または配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図２９は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３０は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性を示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３１は、ＡＡＶ５ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性を示すグラフである。ＡＡＶ５ウイルスは、ラベルされているように、配列番号６７または配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３２は、ＡＡＶ５ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性を示すグラフである。ＡＡＶ５ウイルスは、ラベルされているように、配列番号６７または配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３３は、異なる濃度のＡＡＶ５ウイルス、またはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性を示すグラフである。ＡＡＶ５ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３４は、異なる濃度のＡＡＶ５ウイルス、またはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性を示すグラフである。ＡＡＶ５ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３５は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるＴＩＭＰ１タンパク質レベルを示すグラフである。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３６は、ＡＡＶ８ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける尿銅レベルを示すグラフである。尿試料を、ウイルスが注射されてから３週間後に採取した。ＡＡＶ８ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３７は、ＡＡＶ５ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける尿銅レベルを示すグラフである。尿試料を、ウイルスが注射されてから１６週間後に採取した。ＡＡＶ５ウイルスは、ラベルされているように、配列番号６７または配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３８は、異なる濃度のＡＡＶ５ウイルス、またはＰＢＳ対照で処置された、ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける尿銅レベルを示すグラフである。尿試料を、ウイルスが注射されてから４週間後に採取した。ＡＡＶ５ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図３９は、異なる濃度のＡＡＶ５ウイルス、またはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける用量依存性ＡＴＰ７Ｂ発現を示すグラフである。ＲＮＡを、ウイルスが注射されてから８週間後に測定した。ＡＡＶ５ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図４０は、ＡＡＶ５ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるＡＴＰ７Ｂタンパク質濃度を示すグラフである。ＡＡＶ５ウイルスは、ラベルされているように、配列番号６７または配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図４１は、異なる濃度のＡＡＶ５ウイルス、またはＰＢＳ対照で処置された、野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおけるＡＴＰ７Ｂタンパク質濃度を示すグラフである。タンパク質を、ウイルスが注射されてから４週間後または８週間後に測定した。ＡＡＶ５ウイルスは、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

図４２Ａおよび４２Ｂは、ＡＡＶ５ウイルスまたはＰＢＳ対照で処置された、雌（パネルＡ）および雄（パネルＢ）の野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウスの肝臓における相対的タンパク質発現を示すウェスタンブロット分析である。ＡＡＶ５ウイルスは、ラベルされているように、配列番号６７または配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有した。

開示の詳細な説明
ＡＴＰ７Ｂバリアントヌクレオチド配列、そのような配列を含むベクター、ならびに種々の疾患および障害、特にウィルソン病の処置におけるそれらの使用が本明細書で提供される。

定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も同様に含むことを意図する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」またはそれらの異形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の様式で包括的であることを意図する。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、「含む」は「実質的に～からなる」または「～からなる」で置き換えることができる。

用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用し得る。用語は、他が要求される場合を除いて、全ての血清型、サブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方をカバーする。略称「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。用語「ＡＡＶ」は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、およびそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶならびにヒツジＡＡＶを含む。種々の血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびにネイティブの末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列は、当該分野で公知である。かかる配列は、文献中またはＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースにおいて見出すことができる。「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（即ち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つの、一般には２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド封入されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（即ち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳動物細胞中に送達される導入遺伝子）を含む場合、これは、典型的には、「ｒＡＡＶウイルス粒子」または単に「ｒＡＡＶ粒子」と呼ばれる。

用語「約」または「およそ」は、その値が測定または決定される方法、即ち、測定システムの制限に一部依存する、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味する。例えば、「約」は、当該分野の実務に従って、１標準偏差以内または１よりも大きい標準偏差以内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大で２０％、最大で１５％、最大で１０％、最大で５％または最大で１％）の範囲を意味し得る。

用語「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする」、「分析する」およびそれらの文法的等価物は、任意の形態の測定を指すために本明細書で相互交換可能に使用し得、エレメントが存在するかしないかを決定すること（例えば、検出）を含む。これらの用語は、定量的決定および／または定性的決定の両方を含み得る。評価は、相対的または絶対的であり得る。

用語「発現」は、核酸配列もしくはポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと引き続いて翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

「発現カセット」は、発現のためのコーディング配列（例えば遺伝子）に作動可能に連結した１つまたは複数の調節エレメントを含む核酸分子を指す。

用語「有効量」または「治療有効量」は、以下に定義される疾患処置が含まれるがこれに限定されない意図した適用に影響を与えるのに十分な、本明細書に記載される組成物の量を指す。治療有効量は、当業者によって容易に決定することができる、意図した処置適用（細胞内またはｉｎｖｉｖｏ）、または処置されている対象および疾患状態、例えば、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などに依存して変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答を誘導する用量にも当てはまる。具体的な用量は、選択された特定の組成物、従うべき投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織、およびそれを運搬する物理的送達系に依存して変動する。

ヌクレオチドまたはペプチドの配列の「断片」は、「完全長」の配列と考えられるもの未満である配列を指すことを意味している。

ＤＮＡまたはタンパク質の配列の「機能的断片」は、完全長もしくは参照のＤＮＡまたはタンパク質の配列より短いが、完全長もしくは参照のＤＮＡまたはタンパク質の配列の生物活性と実質的に類似した少なくとも１つの生物活性（機能的または構造的のいずれか）を保持している配列の生物学的に活性な断片を指す。

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」は相互交換可能に用いられ、その中に外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「トランスフォーマント」および「形質転換された細胞」を含み、これらは初代形質転換細胞および継代数に関わらずこれから誘導された子孫を含む。子孫は核酸含量において親細胞と完全に同一でなくてよいが、変異を含んでよい。元の形質転換された細胞においてスクリーニングされまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異子孫は、本明細書に含まれる。

用語「ｉｎｖｉｔｒｏ」は、対象の身体の外側で起こる事象を指す。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイは、対象の外側で実行される任意のアッセイを包含する。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイは、生きた細胞または死んだ細胞が使用される、細胞に基づくアッセイを包含する。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイは、インタクトな細胞が使用されない無細胞アッセイもまた包含する。

用語「ｉｎｖｉｖｏ」は、対象の身体において起こる事象を指す。

「単離された」核酸は、その天然の環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞の中に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体の外に、天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在し、またはコーディング配列のみを含む。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」、「作動可能な連結」、「作用的に連結した」またはそれらの文法的等価物は、遺伝エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並置であって、それらのエレメントが、予測された様式でそれらを作動させる関係にある並置を指す。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る調節エレメントは、その調節エレメントがコード配列の転写を開始することを助ける場合、コード領域に作用的に連結されている。この機能的関係が維持される限り、調節エレメントとコード領域との間に介在する残基が存在してもよい。

「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性の、医薬製剤または組成物中の活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤を含むが、これらに限定されない。

用語「医薬製剤」または「医薬組成物」は、その中に含まれる活性成分の生物活性が効果的であることを許容する形態であって、その製剤が投与される対象に対して許容できないほど毒性の追加の成分を含まない調製物を指す。

一般に、相互交換可能に使用し得る「配列同一性」または「配列相同性」は、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチド毎またはアミノ酸毎の正確な対応を指す。２つまたはそれより多い配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、「パーセント相同性」とも呼ばれるその「パーセント同一性」を決定することによって比較することができる。参照配列（例えば核酸またはアミノ酸の配列）に対するパーセント同一性は、参照配列の長さによって除算し１００を乗算した、２つの最適にアラインされた配列間の正確なマッチの数として計算することができる。配列同一性のマッチの数を決定する場合に、保存的置換はマッチとして考慮しない。第１の配列（Ａ）の長さが第２の配列（Ｂ）の長さと等しくない場合、Ａ：Ｂ配列のパーセント同一性はＢ：Ａ配列のパーセント同一性とは異なることが認識される。例えばパーセント同一性を評価する目的のための配列アラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えばワールドワイドウェブｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能なＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅアライナーを参照）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えばワールドワイドウェブｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えばワールドワイドウェブｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／で入手可能なＥＭＢＯＳＳＷａｔｅｒアライナーを参照）、およびＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａアラインメントプログラム（例えばワールドワイドウェブｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／ｏｍｅｇａ／およびF. Sievers et al., Mol Sys Biol. 7: 539 (2011)を参照）を含むがこれらに限定されない任意の好適なアラインメントアルゴリズムまたはプログラムによって実施することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアラインメント法に基づき、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）；ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７（１９９３）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）で議論されるとおりである。

用語「対象」および「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。本明細書に記載される方法は、ヒト治療、獣医学適用、および／または疾患もしくは状態の動物モデルにおける前臨床研究において有用であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」、「治療」などは、疾患もしくは障害の進行を軽減、遅延もしくは遅くすること、疾患もしくは障害の影響もしくは症状を低減すること、疾患もしくは障害の開始を予防すること、疾患もしくは障害の再発を予防すること、疾患もしくは障害の開始を阻止し改善すること、疾患、障害、もしくは病態に関して有益なまたは所望の結果、例えば治療上の有益性および／または予防上の有益性を得ることを含むがこれらに限定されない所望の薬学的および／または生理学的な効果を得ることを指す。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる処置を包含し、（ａ）疾患に罹患しやすい、または疾患に罹患する危険があるが罹患したとはまだ診断されていない対象において疾患が生じることを防止すること、（ｂ）疾患を阻止すること、即ちその進行を阻むこと、および（ｃ）疾患を緩和すること、即ち疾患の退行を惹起することを含む。治療利益には、処置されている根底にある障害の根絶または軽快が含まれる。また、治療利益は、対象が根底にある障害になおも苦しんでいる場合があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるような、根底にある障害に関連する生理学的症状の１つまたは複数の根絶または軽快で達成される。一部の場合には、予防利益のために、組成物が、特定の疾患を発達させるリスクがある対象、または疾患の生理学的症状の１つもしくは複数を報告する対象に、この疾患の診断がなされていない場合であっても、投与され得る。本開示の方法は、任意の哺乳動物で使用し得る。一部の場合には、処置は、症状の減少または休止を生じ得る。予防効果には、疾患もしくは状態の出現を遅延もしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の開始を遅延もしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を遅くする、停止させる、もしくは逆転させること、またはそれらの任意の組合せが含まれる。

ヌクレオチド配列の「バリアント」は、最も一般的な野生型ＤＮＡ配列（例えばそのＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって参照されるｃＤＮＡまたは配列）または特定された参照配列と比較して遺伝的改変または変異を有する配列を指す。

「ベクター」は、本明細書で使用される場合、それが連結された別の核酸分子の、その核酸分子が複製されまたは発現されることができる細胞への送達を媒介するために用いることができる核酸分子を指す。この用語は自己複製型核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが作動可能に連結した核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターは本明細書で「発現ベクター」と称する。その他のベクターの例には、プラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。

他に示さない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者にとってそれらが有するのと同じ意味を有し、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡテクノロジーの従来技術を使用する。

ＡＴＰ７Ｂバリアント
銅輸送ＡＴＰアーゼ２またはＡＴＰアーゼ銅輸送ベータ（ＡＴＰ７Ｂ）は、銅を細胞外に搬出することによって機能するＰ型カチオン輸送ＡＴＰアーゼである。ＡＴＰ７Ｂは、胆汁への排泄と機能的セルロプラスミンの合成のためのアポセルロプラスミンへの組み込みの両方のための分泌経路への、細胞内シャペロンタンパク質からの銅の輸送に関与している。ＡＴＰ７Ｂに媒介される銅の輸送には、その細胞質Ｎ末端ドメインを介する銅と、ヌクレオチド結合ドメインを介するＡＴＰとの結合が関与している。次いでＡＴＰが加水分解され、ＡＴＰ７ＢはＰドメインに位置する残基Ｄ１０２７で一時的にリン酸化される。引き続く脱リン酸化によって、膜を通して銅を輸送するために必要なエネルギーが放出される。ヒト酵素をコードする遺伝子は染色体１３に位置している（染色体位置１３ｑｌ４．３、遺伝子名ＡＴＰ７Ｂ）。選択的スプライシングによって産生される５つのアイソフォームがＡＴＰ７Ｂについて記載されている。アイソフォーム１（１４６５アミノ酸長さ）が最長のアイソフォームであり、本明細書でカノニカルまたは野生型配列と称する（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００００４４．２、配列番号１は野生型ヌクレオチド配列であり、配列番号２は本明細書において使用する野生型アミノ酸配列である）。さらなる４つのアイソフォームは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１００５９１８．１、ＮＰ＿００１２３０１１１．１、ＮＰ＿００１３１７５０７．１、ＮＰ＿００１３１７５０８．１である。

ＡＴＰ７Ｂは銅転位のための細胞膜を通る経路を形成する８個の膜貫通ドメインを有している。ＡＴＰ７ＢにはＰ型ＡＴＰアーゼタンパク質ファミリーに特徴的ないくつかの保存されたモチーフが存在する。これらのモチーフはＡＴＰ触媒に必要であり、ＡＴＰ結合部位を含むヌクレオチド結合ドメイン（Ｎ－ドメイン）、保存されたアスパラギン酸残基を含むリン酸化ドメイン（Ｐ－ドメイン）、およびホスファターゼドメインを含むアクチュエータードメイン（Ａ－ドメイン）を含む。高度に保存されたシグネチャー残基、即ちＮ－ドメインにおけるＳＥＨＰＬ、Ｐ－ドメインにおけるＤＫＴＧ、およびＡ－ドメインにおけるＴＧＥがこれらのモチーフの中に存在する。タンパク質はまた、膜を通る銅転位に必要な膜内ＣＰＣモチーフを含む。ＡＴＰ７Ｂはまた、それぞれがほぼ７０個のアミノ酸および高度に保存された金属結合モチーフＧＭｘＣｘｘＣ（ここでｘは任意のアミノ酸である）を含む６個の金属結合ドメイン（ＭＢＤ）（金属結合部位（ＭＢＳ）または重金属関連（ＨＭＡ）部位とも呼ばれる）を有する大きなＮ末端を有する。これらのＭＢＤは、ＭＢＤ１個あたりＣｕ（Ｉ）１原子の化学量論でＣｕ（Ｉ）に結合する。ＡＴＰ７Ｂのこれらのアミノ末端ＭＢＤは、銅転位、キュプロエンザイムへの銅の組み込み、ＡＴＰアーゼの活性、局在化および輸送、ならびにタンパク質－タンパク質の相互作用を含むその機能のいくつかの態様と関連している。ＭＤＢ部位はアミノ末端から開始して、ドメインＭＢＤ１（野生型配列におけるアミノ酸５９～１２５）、ＭＢＤ２（アミノ酸１４４～２１０）、ＭＢＤ３（２５８～３２７）、ＭＢＤ４（３６０～４２６）、ＭＢＤ５（４８９～５５５）、およびＭＢＤ６（５６５～６３１）として同定される。

一態様では、本出願は、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質またはＡＴＰ７Ｂタンパク質の機能的断片をコードするバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列を提供する。ＡＴＰ７Ｂタンパク質またはその断片が機能的であるか否かを判定するために任意の好適な方法が使用できる。ある特定の実施形態では、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質またはその機能的断片は、野生型タンパク質の１つまたは複数の活性、例えば触媒活性および／または銅輸送活性をｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏアッセイで呈することができるものである。ある特定の実施形態では、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質またはその機能的断片は、野生型ＡＴＰ７Ｂと比較して少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の活性を有する。ＡＴＰ７Ｂ活性を測定するためのｉｎｖｉｔｒｏアッセイの１つの例には、その中で内因性銅輸送ＡＴＰアーゼＣＣＣ２が欠失し、そのため分泌コンパートメントへの銅の輸送が妨害され、銅依存性フェロキシダーゼＦｅｔ３が不活性になっている酵母の株が含まれる。そのような株における機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質または機能的断片の発現により、Ｆｅｔ３活性が回復する。R. Tsivkovskii et al., J. Biol. Chem 77(2): 976-983 (2002)、J.R. Forbes et al., Am J Hum Genet. 63: 1663-1674 (1998)、G. Hsi et al., Hum Mutat 29: 491-501 (2008)、およびL.M. Luoma et al., Hum Mutat 31: 569-577 (2010)を参照されたい。ＡＴＰ７Ｂ活性を測定するための別の例示的なｉｎｖｉｔｒｏアッセイには、Ｓｆ９細胞におけるバキュロウイルス発現システムを用いてＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントを発現させ、次いで触媒活性およびベシクルへの銅（^６４Ｃｕ）の輸送を測定することが含まれる。例えばR. Tsivkovskii et al., J. Biol. Chem 77(2): 976-983 (2002)およびD. Huster et al., Gastroenterology 142(4): 947-956 (2012)を参照されたい。例示的な実施形態では、機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質またはその機能的断片は、ｉｎｖｉｖｏアッセイ（例えば以下に記載するウィルソン病のマウスモデル）において野生型タンパク質を置換することができるものである。バリアントＡＴＰ７Ｂが機能的であるか否かを判定するために、例えば非セルロプラスミン結合型銅（ＮＣＣまたは「遊離銅」または銅インデックス）、血清トランスアミナーゼレベル（ＡＬＴ）、血清銅レベル、２４時間尿銅、肝臓の銅レベルの測定、ならびに食事の銅耐性、肝臓の炎症、胆管の増殖、および肝線維症等の種々の因子の臨床評価を含む種々のエンドポイントを用いることができる。ＡＴＰ７Ｂバリアントが機能的であるか否かを評価するための例示的なｉｎｖｉｖｏアッセイには、例えばＡＴＰ７Ｂ遺伝子に大きな欠失を有するＬｏｎｇＥｖａｎｓＣｉｎｎａｍｏｎラット（K. Terada et al. Pediatr Int. 41(4):414-8(1999)）、ＡＴＰ７Ｂコーディング配列に点変異を有するＪａｃｋｓｏｎの毒性ミルクマウス（E.A. Roberts et al. Mol Genet Metab. 93(l):54-65 (2008)）、およびＡＴＰ７Ｂマウス（D. Huster D et al. Am J Pathol. 168(2):423-34 (2006)）を含むウィルソン病のための種々の動物モデルが含まれる。マウスにおけるＡＴＰ７Ｂ活性を分析するためには標準的な方法が使用できる。例えば、（ｉ）血清トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルは、Ｈｉｔａｃｈｉ７４７ＣｌｉｎｉｃａｌＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いるＤＧＫＣ法（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって決定され得、（ｉｉ）血清セルロプラスミン活性はSchosinsky et al., Clinical Chemistry 20(12): 1556-1563 (1974)によって記載されたように基質としてｏ－ジアニシジン二塩酸塩（dihydrochloridc）（４，４’－ジアミノ－３，３’－ジメトキシ－ビフェニル）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳａｎＬｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ）を用いて分光光度計によって５４０ｎｍの吸光度を測定することによって決定され得、（ｉｉｉ）尿の銅含量は原子吸光分光法（ＳＩＭＡＡ６０００、Ｐｅｒｋｉｎ－ＥｌｍｅｒＧｍｂＨ、Ｂｏｄｅｎｓｅｅｗｅｒｋ）によって決定され得る。犠牲死の後、組織学的判定、ならびに銅の含量、炎症、胆管の増殖、および線維化の分析のために、肝臓を切除することができる。（ｉ）肝臓の銅含量は、原子吸光分光法（ＳＩＭＡＡ６０００、Ｐｅｒｋｉｎ－ＥｉｍｅｒＧｍｂＨ、Ｂｏｄｅｎｓｅｅｗｅｒｋ）によって、およびＴｉｍｍの硫化物銀染色（G. Danscher and J. Zimmer, Histochemistry 55(1): 27-40 (1978)）によって、乾燥肝組織で決定することができ、（ｉｉ）肝臓の構造はヘマトキシリン（hematozylin）およびエオシンで染色した切片で評価することができ、（ｉｉｉ）抗マウスＣＤ４５抗体（例えばＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＵＳＡ；カタログ番号１０３１０２）を用いる免疫組織化学を用いて肝臓における炎症性浸潤を検出することができ、（ｉｖ）抗マウスＰａｎＣｋ抗体（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１８－０１３２、クローンＡＥ１／ＡＥ３）を用いる免疫組織化学を用いて胆管細胞を検出することができ、（ｖ）コラーゲンを検出するためのＳｉｒｉｕｓＲｅｄ染色を用いて線維化を判定することができる。例えばＷＯ２０１６／０９７２１８、ＷＯ２０１７／１０３６２４、およびＷＯ２０１８／１２６１１６を参照されたい。一般に、ウィルソン病のＡＴＰ７Ｂノックアウトマウスモデルには肝疾患に繋がる肝臓における重篤な銅の蓄積が関与し、血清銅レベルが上昇し、最終的に尿銅レベルがヘテロ接合マウスで観察されるレベルより高くに増加する。これらのｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイにおけるＡＴＰ７Ｂバリアントの効果を野生型ＡＴＰ７Ｂ対照と比較して、所望の効果およびそれによる機能活性を探索することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、発現を増加させるためにコドン最適化されている。例示的な実施形態では、そのようなバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、特定の細胞または組織型、例えば肝臓または肝臓細胞における発現を増加させるためにコドン最適化されている。ある特定の実施形態では、コドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、コドン最適化されていないヌクレオチド配列からの同じ機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現と比較して少なくとも約２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれより多く、機能的ＡＴＰ７Ｂ配列の発現を増加させる。一実施形態では、コドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、コドン最適化されていないヌクレオチド配列（例えば配列番号１）からの完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現と比較して少なくとも約２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれより多く、完全長のＡＴＰ７Ｂ配列（例えば配列番号２）の発現を増加させる。例示的な実施形態では、コドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、肝臓または肝臓細胞における機能的ＡＴＰ７Ｂ配列の発現を増加させる。コドン最適化されている配列とコドン最適化されていない配列の発現レベルを比較する場合には、比較は標準的条件、例えば同じまたは類似の発現ベクター、細胞型、培養条件等を用いて行うべきである。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列（例えば配列番号１）に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、または７０％未満の配列同一性を有する配列を含み、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列（例えば配列番号１）に対して８０％未満の配列同一性を有する配列を含み、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して１００％同一のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列（例えば配列番号１）に対して約６０～７０％、６０～７５％、６０～８０％、６０～８５％、６０～９０％、６０～９５％、６５～７０％、６５～７５％、６５～８０％、６５～８５％、６５～９０％、６５～９５％、７０～７５％、７０～８０％、７０～８５％、７０～９０％、７０～９５％、７５～８０％、７５～８５％、７５～９０％、７５～９５％の配列同一性を有する配列を含み、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列（例えば配列番号１）に対して７０～８０％の配列同一性を有する配列を含み、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して１００％同一のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型配列（例えば配列番号１）の同じ位置に存在するコドンと比較して改変された、少なくとも３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５９、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、もしくは１４５０、または約３５０～１２００、３５０～１１００、３５０～９００、３５０～７５０、４５０～１２００、４５０～１１００、４５０～９００、４５０～７５０、７５０～１１００、７５０～１２００、７５０～９００、９００～１２００、もしくは９００～１１００個のコドンを有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型配列（例えば配列番号１）の同じ位置に存在するコドンと比較して改変された、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または約２０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、２０～６０％、２０～５０％、２０～４０％、３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６０％、３０～５０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６０％、４０～５０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６０％、６０～９０％、６０～８０％、もしくは６０～７９％のコドンを有する。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型配列（例えば配列番号１）の同じ位置に存在するコドンと比較して改変された約５００～１１００個のコドンを有する配列を含み、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して１００％同一のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型配列（例えば配列番号１）の同じ位置に存在するコドンと比較して改変された約４０～７０％のコドンを有する配列を含み、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して１００％同一のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

ＡＴＰ７Ｂ配列は、当技術分野で公知の任意の方法を用いてコドン最適化することができる。例えば、コドン最適化されているＡＴＰ７Ｂ配列は、オンラインで利用可能な方法（例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）を参照）、ワールドワイドウェブｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍで利用可能なコドン最適化ツール、またはワールドワイドウェブｃｓ．ｕｂｃ．ｃａ）で利用可能なＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚｅｒソフトウェアを用いて、公開された方法（例えばSM Richardson et al., Genome Research 16:550-556 (2006)、A. Villalobos et al., BMC Bioinformatics 7:285 (2006)、W. Gao et al., Biotechnology Progress 20:443-448 (2004)、S. Jayaraj et al., Nucleic Acids Research 33:3011-3016 (2005)、G. Wu et al., Protein Expr Purif. 47:441-445 (2006)、M. Bode et al., Nucleic Acids Research. 37:W214-221 (2009)、D. Raab et al., Systems and Synthetic Biology 4:215-225 (2010)、P. Gaspar et al., Bioinformatics 28:2683-2684 (2012)、E. Angov et al., PloS One 3:e2189 (2008)、A. Fuglsang, Protein Expr Purif. 31:247-249 (2003)、W. Qian et al., PLoS Genetics. 8:e1002603 (2012)、GW Hatfield and DA Roth, Biotechnology Annual Review 13:27-42 (2007)、VP Mauro and SA Chappell, Trends Mol. Med. 20(11): 604-613 (2014)、ＷＯ２０１５／－１２９２４、ＵＳ２０１４／００３２１８６、およびＵＳ２００６／０１３６１８４を参照）を用いて、またはコドン最適化サービスを提供する会社（例えばワールドワイドウェブａｔｕｍ．ｂｉｏのＡＴＵＭ、またはワールドワイドウェブｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍのＧｅｎＳｃｒｉｐｔを参照）を用いて、産生することができる。ある特定の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂをコードする核酸配列の一部がコドン最適化されている。例示的な実施形態では、ＡＴＰ７Ｂをコードする全体の配列がコドン最適化されている。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片またはドメインをコードするように短縮されている。そのような短縮されたＡＴＰ７Ｂバリアントヌクレオチド配列は、約５ｋｂ未満のパッキング容量を有する遺伝子治療ベクターを構築するために有用であり、それにより完全長のＡＴＰ７Ｂ遺伝子はベクターのパッキング容量に近くなるか、それを超える。例えば、ＡＡＶベクターは約４．７ｋｂのパッキング容量を有し、完全長のＡＴＰ７Ｂ遺伝子は約４．４ｋｂであるので、ＡＡＶベクターのパッキング容量に近い。ある特定の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂバリアントヌクレオチド配列は、少なくとも１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、もしくは２０００ｂｐ、または約１００～２０００ｂｐ、１００～１５００ｂｐ、１００～１０００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～２０００ｂｐ、２００～１５００ｂｐ、２００～１００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、７５０～２０００ｂｐ、７５０～１５００ｂｐ、７５０～１０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、もしくは１２００～１５００ｂｐだけ短縮されている。ある特定の実施形態では、そのようなバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、Ｎ末端で、Ｃ末端で、Ｎ末端もしくはＣ末端を包含しないＡＴＰ７Ｂタンパク質の内部の位置で、またはＮ末端およびＣ末端において部分的に短縮された機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。例示的な実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、Ｎ末端で短縮された機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列はコドン最適化されかつ短縮されており、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の機能的断片をコードする。一実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は少なくとも１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、もしくは２０００ｂｐ、または約１００～２０００ｂｐ、１００～１５００ｂｐ、１００～１０００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～２０００ｂｐ、２００～１５００ｂｐ、２００～１０００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、７５０～２０００ｂｐ、７５０～１５００ｂｐ、７５０～１０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、もしくは１２００～１５００ｂｐだけ短縮されており、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードし、そのようなバリアント配列は、機能的ＡＴＰ７Ｂ断片の発現を、コドン最適化されていないヌクレオチド配列（例えば配列番号１の断片）からの等価のＡＴＰ７Ｂタンパク質断片の発現と比較して少なくとも約２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれより多く増加させるように、コドン最適化されている。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、Ｎ末端において１～１０００ｂｐだけ短縮されており、機能的ＡＴＰ７Ｂ断片をコードし、肝臓または肝臓細胞における発現を、コドン最適化されていない等価のＡＴＰ７Ｂ断片の発現と比較して少なくとも５倍増加させるようにコドン最適化されている。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、配列番号１～１８のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。例示的な実施形態では、そのようなバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は機能的ＡＴＰ７Ｂタンパク質またはその断片をコードする。例示的な実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は天然に存在しない配列である。

一実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、配列番号３に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。例示的な実施形態では、そのような配列はコドン最適化されており、完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質（例えば配列番号２を有する）をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化配列は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を、コドン最適化されていないヌクレオチド配列（例えば配列番号１）からの等価のＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれより多く増加させる。別の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする配列番号３の短縮を含む。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号３は約１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、もしくは２０００ｂｐ、または約１００～２０００ｂｐ、１００～１５００ｂｐ、１００～１０００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～２０００ｂｐ、２００～１５００ｂｐ、２００～１００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、７５０～２０００ｂｐ、７５０～１５００ｂｐ、７５０～１０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、もしくは１２００～１５００ｂｐだけ短縮され得、得られる短縮された配列はＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。一実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列はＮ末端において１～１０００ｂｐだけ短縮された配列番号３を含み、機能的ＡＴＰ７Ｂ断片をコードし、肝臓または肝臓細胞における発現をコドン最適化されていない等価のＡＴＰ７Ｂ断片の発現と比較して少なくとも５倍増加させるようにコドン最適化されている。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、配列番号３を含む。

一実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、配列番号４に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。例示的な実施形態では、そのような配列はコドン最適化されており、完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質（例えば配列番号２を有する）をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化配列は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を、コドン最適化されていないヌクレオチド配列（例えば配列番号１）からの等価のＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれより多く増加させる。別の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする配列番号４の短縮を含む。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号４は約１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、もしくは２０００ｂｐ、または約１００～２０００ｂｐ、１００～１５００ｂｐ、１００～１０００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～２０００ｂｐ、２００～１５００ｂｐ、２００～１００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、７５０～２０００ｂｐ、７５０～１５００ｂｐ、７５０～１０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、もしくは１２００～１５００ｂｐだけ短縮され得、得られる短縮された配列はＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。一実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列はＮ末端において１～１０００ｂｐだけ短縮された配列番号４を含み、機能的ＡＴＰ７Ｂ断片をコードし、肝臓または肝臓細胞における発現をコドン最適化されていない等価のＡＴＰ７Ｂ断片の発現と比較して少なくとも５倍増加させるようにコドン最適化されている。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、配列番号４を含む。

一実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、配列番号５に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。例示的な実施形態では、そのような配列はコドン最適化されており、完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質（例えば配列番号２を有する）をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化配列は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を、コドン最適化されていないヌクレオチド配列（例えば配列番号１）からの等価のＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれより多く増加させる。別の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする配列番号５の短縮を含む。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号５は約１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、もしくは２０００ｂｐ、または約１００～２０００ｂｐ、１００～１５００ｂｐ、１００～１０００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～２０００ｂｐ、２００～１５００ｂｐ、２００～１００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、７５０～２０００ｂｐ、７５０～１５００ｂｐ、７５０～１０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、もしくは１２００～１５００ｂｐだけ短縮され得、得られる短縮された配列はＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。一実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列はＮ末端において１～１０００ｂｐだけ短縮された配列番号５を含み、機能的ＡＴＰ７Ｂ断片をコードし、肝臓または肝臓細胞における発現をコドン最適化されていない等価のＡＴＰ７Ｂ断片の発現と比較して少なくとも５倍増加させるようにコドン最適化されている。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、配列番号５を含む。

一実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、配列番号６に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。例示的な実施形態では、そのような配列はコドン最適化されており、完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質（例えば配列番号２を有する）をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化配列は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現を、コドン最適化されていないヌクレオチド配列（例えば配列番号１）からの等価のＡＴＰ７Ｂタンパク質の発現と比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれより多く増加させる。別の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする配列番号６の短縮を含む。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号３は約１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、もしくは２０００ｂｐ、または約１００～２０００ｂｐ、１００～１５００ｂｐ、１００～１０００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～２０００ｂｐ、２００～１５００ｂｐ、２００～１００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、７５０～２０００ｂｐ、７５０～１５００ｂｐ、７５０～１０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、もしくは１２００～１５００ｂｐだけ短縮され得、得られる短縮された配列はＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。一実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列はＮ末端において１～１０００ｂｐだけ短縮された配列番号６を含み、機能的ＡＴＰ７Ｂ断片をコードし、肝臓または肝臓細胞における発現をコドン最適化されていない等価のＡＴＰ７Ｂ断片の発現と比較して少なくとも５倍増加させるようにコドン最適化されている。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、配列番号６を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される調節エレメントに関連して用いられ得るバリアントＡＴＰ７Ｂ配列はＷＯ２０１７／１０３６２４に開示されたコドン最適化されているＡＴＰ７Ｂ配列を含む。そのような実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、配列番号７に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。例示的な実施形態では、そのような配列はコドン最適化されており、完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。別の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする配列番号７の短縮を含む。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号７は約１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、もしくは２０００ｂｐ、または約１００～２０００ｂｐ、１００～１５００ｂｐ、１００～１０００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～２０００ｂｐ、２００～１５００ｂｐ、２００～１００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、７５０～２０００ｂｐ、７５０～１５００ｂｐ、７５０～１０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、もしくは１２００～１５００ｂｐだけ短縮され得、得られる短縮された配列はＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。一実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列はＮ末端において１～１０００ｂｐだけ短縮された配列番号７を含み、機能的ＡＴＰ７Ｂ断片をコードする。例示的な実施形態では、本明細書で開示される調節配列に関連して用いることができるコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は配列番号７を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される調節エレメントに関連して用いられ得るバリアントＡＴＰ７Ｂ配列はＷＯ２０１８／１２６１１６に開示されたコドン最適化されているＡＴＰ７Ｂ配列を含む。そのような実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、配列番号８に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。例示的な実施形態では、そのような配列はコドン最適化されており、完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。別の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする配列番号８の短縮を含む。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号８は約１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、もしくは２０００ｂｐ、または約１００～２０００ｂｐ、１００～１５００ｂｐ、１００～１０００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～２０００ｂｐ、２００～１５００ｂｐ、２００～１００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、７５０～２０００ｂｐ、７５０～１５００ｂｐ、７５０～１０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、もしくは１２００～１５００ｂｐだけ短縮され得、得られる短縮された配列はＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。一実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列はＮ末端において１～１０００ｂｐだけ短縮された配列番号８を含み、機能的ＡＴＰ７Ｂ断片をコードする。ＷＯ２０１８／１２６１１６に記載された例示的なコドン最適化され短縮されたバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、最初の２つの金属結合ドメインを除去するように短縮されたコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列（配列番号９）、最初の４つの金属結合ドメインを除去するように短縮されたコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列（配列番号１０）、最初の５つの金属結合ドメインを除去するように短縮されたコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列（配列番号１１）、第１の金属結合ドメインを除去するように短縮されたコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列（配列番号１２）、第２の金属結合ドメインを除去するように短縮されたコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列（配列番号１３）、および第３の金属結合ドメインを除去するように短縮されたコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列（配列番号１４）を含む。例示的な実施形態では、本明細書で開示される調節配列に関連して用いることができるコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は配列番号８を含む。例示的な実施形態では、本明細書で開示される調節配列に関連して用いることができるコドン最適化され短縮されたバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は配列番号９～１４のいずれか１つを含む。

他の実施形態では、本明細書で開示される調節配列に関連して用いることができるコドン最適化され短縮されたバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、最初の３つの金属結合ドメイン（ＷＯ２０１８／１２６１１６を参照）または金属結合ドメイン１～４および６（例えばCarter et al., Biochem J. 380: 805-813 (2004)、Gourdon et al., Biol. Chem. 393(4): 205-216 (2012)、Lutsenko et al., Physiological Reviews 87(3): 1011-1046 (2013)、およびＵＳ２０１５／００４５２８４を参照）を除去するように短縮されたＡＴＰ７Ｂ配列を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される調節配列に関連して用いられ得るバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、ＷＯ２０１６／０９７２１８またはＷＯ２０１６／０９７２１９に開示されたコドン最適化ＡＴＰ７Ｂ配列を含む。そのような実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、配列番号１５に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。例示的な実施形態では、そのような配列はコドン最適化されており、完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。別の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする配列番号１５の短縮を含む。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号１５は約１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、もしくは２０００ｂｐ、または約１００～２０００ｂｐ、１００～１５００ｂｐ、１００～１０００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～２０００ｂｐ、２００～１５００ｂｐ、２００～１００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、５００～２０００ｂｐ、５００～１５００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、７５０～２０００ｂｐ、７５０～１５００ｂｐ、７５０～１０００ｂｐ、１０００～１５００ｂｐ、もしくは１２００～１５００ｂｐだけ短縮され得、得られる短縮された配列はＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。一実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列はＮ末端において１～１０００ｂｐだけ短縮された配列番号１５を含み、機能的ＡＴＰ７Ｂ断片をコードする。ＷＯ２０１６／０９７２１９に記載された例示的なコドン最適化され短縮されたバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、金属結合部位または重金属関連（ＨＭＡ）ドメインの１つまたは複数が除去された、コドン最適化され短縮されたバリアントを含む（例えば、ＨＭＡ１は野生型ＡＴＰ７Ｂ配列のアミノ酸５９～１２５を含み、ＨＭＡ２は野生型ＡＴＰ７Ｂ配列のアミノ酸１４４～２１０を含み、ＨＭＡ３は野生型ＡＴＰ７Ｂ配列のアミノ酸２５８～３２７を含み、ＨＭＡ４は野生型ＡＴＰ７Ｂ配列のアミノ酸３６０～４２６を含み、ＨＭＡ５は野生型ＡＴＰ７Ｂ配列のアミノ酸４８９～５５５を含み、ＨＭＡ６は野生型ＡＴＰ７Ｂ配列のアミノ酸５６５～６３１を含む）。例示的な実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は最初の４つの金属結合ドメインが除去されたタンパク質をコードするように短縮されている。例示的な実施形態では、本明細書で開示される調節配列に関連して用いることができるコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は配列番号１５を含む。例示的な実施形態では、本明細書で開示される調節配列に関連して用いることができるコドン最適化され短縮されたバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は配列番号１７を含む。別の実施形態では、本明細書で開示される調節配列に関連して用いることができるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、配列番号１６または１８を含む短縮されコドン最適化されていない配列である。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸分子は、改変された塩基を何ら含まない。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸分子はＤＮＡ分子である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸分子は、改変された塩基を何ら含まないＤＮＡ分子である。

核酸構築物
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ構築物は、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列に加えて１つまたは複数の調節エレメントを含む核酸構築物の一部である。例示的な実施形態では、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ構築物は、細胞においてバリアントＡＴＰ７Ｂ配列の発現を駆動することが可能なようにＡＴＰ７Ｂ構築物の上流に置かれたプロモーターを含む核酸構築物の一部である。

一実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、（２）本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列のいずれか１つ、例えば（ｉ）配列番号１～１８（以下の表１に示す）のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号１～１８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）その機能的断片もしくはバリアントを含むバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した、（１）（ｉ）配列番号２３～４３、４８～５５、もしくは６６～７０（下の表２および表３に示す）のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号２３～４３、４８～５５、もしくは６６～７０のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を有するプロモーターを含む。

一実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列のいずれか１つ、例えば配列番号１～１８（下の表１に示す）のいずれか１つを含むバリアントＡＴＰ７Ｂ配列またはその機能的断片に作動可能に連結した配列番号２３～４３、４８～５５、もしくは６６～７０（下の表２および表３に示す）のいずれか１つを有するプロモーターを含む。別の実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列のいずれか１つ、例えば配列番号１～１８（下の表１に示す）のいずれか１つを含むバリアントＡＴＰ７Ｂ配列またはその機能的断片に作動可能に連結した配列番号１９～４３または６６～６８（下の表２に示す）のいずれか１つのうち２つもしくはそれより多い（例えば２つもしくはそれより多い、３つもしくはそれより多い、４つもしくはそれより多い、５つもしくはそれより多い、または２つ、３つ、４つ、もしくは５つの）組合せを有する調節エレメントを含む。

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列のいずれか１つ、例えば配列番号１～１８（下の表１に示す）のいずれか１つを含むバリアントＡＴＰ７Ｂ配列またはその機能的断片に作動可能に連結した配列番号２３～４３もしくは６６～６８（下の表２に示す）のいずれか１つを有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、プロモーター配列は、哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターからの同じバリアントＡＴＰ７Ｂ配列の発現のレベルと比較して少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、もしくは７５倍、または少なくとも２０～９０倍、２０～８０倍、２０～７０倍、２０～６０倍、３０～９０倍、３０～８０倍、３０～７０倍、３０～６０倍、４０～９０倍、４０～８０倍、４０～７０倍、４０～６０倍、５０～９０倍、５０～８０倍、５０～７０倍、５０～６０倍、６０～９０倍、６０～８０倍、６０～７０倍、７０～９０倍、７０～８０倍、８０～９０倍大きなバリアントＡＴＰ７Ｂ配列の発現を生じる。ある特定の実施形態では、プロモーター配列は、高いパーセンテージの肝細胞、例えばバリアントＡＴＰ７Ｂ構築物を発現する核酸構築物を含む少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくはそれより多く、または少なくとも２０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、８０～１００％、８０～９５％、８０～９０％、９０～１００％、もしくは９０～９５％の肝細胞におけるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列の発現を駆動する。

一実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、（ｉ）配列番号３～６のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号３～６のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した配列番号２３～４３、４８～５５、もしくは６６～７０のいずれか１つを有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

一実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号３～６のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号３～６のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した配列番号２２を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

一実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号３～６のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号３～６のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した配列番号３３を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

一実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号３～６のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号３～６のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した配列番号２４を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号４、（ｉｉ）配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した配列番号３３を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した配列番号３３を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（２）（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した、（１）（ｉ）配列番号２４、（ｉｉ）配列番号２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号４、（ｉｉ）配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した配列番号２４を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した配列番号２４を有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号１～１８のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号１～１８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列（２）に作動可能に連結した、（ｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むプロモーター（１）を含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号４、（ｉｉ）配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列（２）に作動可能に連結した、（ｉ）配列番号６６、（ｉｉ）配列番号６６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むプロモーター（１）を含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列（２）に作動可能に連結した、（ｉ）配列番号６６、（ｉｉ）配列番号６６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むプロモーター（１）を含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号４、（ｉｉ）配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列（２）に作動可能に連結した、（ｉ）配列番号６７、（ｉｉ）配列番号６７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むプロモーター（１）を含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列（２）に作動可能に連結した、（ｉ）配列番号６７、（ｉｉ）配列番号６７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むプロモーター（１）を含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号４、（ｉｉ）配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列（２）に作動可能に連結した、（ｉ）配列番号６８、（ｉｉ）配列番号６８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むプロモーター（１）を含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

例示的な実施形態では、本開示の核酸構築物は、（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列（２）に作動可能に連結した、（ｉ）配列番号６８、（ｉｉ）配列番号６８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むプロモーター（１）を含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

一実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、（ｉ）配列番号３～６のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号３～６のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むコドン最適化されているバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、改変されたサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ－Ｓ１）プロモーター、肝特異的トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、改変されたトランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター、アルファ１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、ヒトアルブミン（ｈｕｍＡｌｂ）プロモーター、肝特異的プロモーター（ＬＳＰ）、およびＢ型肝炎コアプロモーター（例えばＷＯ２０１８／１２６１１６、Miyatake et al., J. Virol. 71: 5124-32 (1997)、およびSandig et al., Gene Ther. 3: 1002-9 (1996)を参照）からなる群から選択されるプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

一実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、（ｉ）配列番号７～１８のいずれか１つ、（ｉｉ）配列番号７～１８のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列、または（ｉｉｉ）上記のいずれかの機能的断片を含むバリアントＡＴＰ７Ｂ配列に作動可能に連結した、配列番号２１～４３または６６～６８のいずれか１つを有するプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、そのようなバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、野生型ＡＴＰ７Ｂタンパク質配列（例えば配列番号２）に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するタンパク質をコードするコドン最適化配列である。ある特定の実施形態では、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、（ｉ）配列番号７、８、もしくは１５のいずれか１つ、または（ｉｉ）配列番号７、８、もしくは１５のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含んでよく、そのようなコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂ配列は、例えば配列番号２を有する完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の機能的断片をコードするように短縮されたコドン最適化バリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列を含む。例示的なコドン最適化され短縮されたＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号９～１４または１７のいずれか１つ、または（ｉｉ）配列番号９～１４または１７のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含んでよく、そのようなコドン最適化され短縮されたバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、ＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の機能的断片をコードするように短縮されたバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列を含む。例示的な短縮されたＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１６もしくは１８のいずれか１つ、または（ｉｉ）配列番号１６もしくは１８のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含んでよく、そのような短縮されたバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列はＡＴＰ７Ｂの機能的断片をコードする。

別の態様では、本出願は、配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む調節エレメントを含む核酸構築物を提供する。ある特定の実施形態では、そのような調節エレメントは、配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２５ｂｐ、１２０ｂｐ、１１９ｂｐ、１１８ｂｐ、１１７ｂｐ、１１６ｂｐ、１１５ｂｐ、１１４ｂｐ、１１３ｂｐ、１１２ｂｐ、１１１ｂｐ、１１０ｂｐ、１０５ｂｐ、１００ｂｐ、９９ｂｐ、９８ｂｐ、９７ｂｐ、９６ｂｐ、９５ｂｐ、９４ｂｐ、９３ｂｐ、９２ｂｐ、９１ｂｐ、９０ｂｐ、８５ｂｐ、８０ｂｐ、または７５ｂｐ未満のｂｐを有する。ある特定の実施形態では、調節エレメントは、約７５～１５０ｂｐ、７５～１４０ｂｐ、７５～１３０ｂｐ、７５～１２０ｂｐ、７５～１１０ｂｐ、７５～１００ｂｐ、７５～９０ｂｐ、８０～１５０ｂｐ、８０～１４０ｂｐ、８０～１３０ｂｐ、８０～１２０ｂｐ、８０～１１０ｂｐ、８０～１００ｂｐ、８０～９０ｂｐ、８５～１５０ｂｐ、８５～１４０ｂｐ、８５～１３０ｂｐ、８５～１２０ｂｐ、８５～１１０ｂｐ、８５～１００ｂｐ、８５～９０ｂｐ、９０～１５０ｂｐ、９０～１４０ｂｐ、９０～１３０ｂｐ、９０～１２０ｂｐ、９０～１１０ｂｐ、９０～１００ｂｐ、９５～１５０ｂｐ、９５～１４０ｂｐ、９５～１３０ｂｐ、９５～１２０ｂｐ、９５～１１０ｂｐ、９５～１００ｂｐ、１００～１５０ｂｐ、１００～１４０ｂｐ、１００～１３０ｂｐ、１００～１２０ｂｐ、または１００～１１０ｂｐを有する。ある特定の実施形態では、そのような調節エレメントは、哺乳動物細胞中で、例えばＣＭＶ、ｍＴＴＲ、またはアルファ１アンチトリプシンプロモーター等の対照プロモーターからの同じ導入遺伝子配列の発現のレベルと比較して少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、もしくは７５倍、または少なくとも２０～９０倍、２０～８０倍、２０～７０倍、２０～６０倍、３０～９０倍、３０～８０倍、３０～７０倍、３０～６０倍、４０～９０倍、４０～８０倍、４０～７０倍、４０～６０倍、５０～９０倍、５０～８０倍、５０～７０倍、５０～６０倍、６０～９０倍、６０～８０倍、６０～７０倍、７０～９０倍、７０～８０倍、８０～９０倍大きな導入遺伝子の発現を生じる。ある特定の実施形態では、そのような調節エレメントは、高いパーセンテージの肝細胞、例えば導入遺伝子配列を発現する核酸構築物を含む少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくはそれより多く、または少なくとも２０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、６０～９０％、６０～８０％、６０～７０％、７０～９０％、７０～８０％、８０～１００％、８０～９５％、８０～９０％、９０～１００％、もしくは９０～９５％の肝細胞における導入遺伝子配列の発現を駆動する。ある特定の実施形態では、そのような調節エレメントは、例えばＡＴＰアーゼ銅輸送アルファ（ＡＴＰ７Ａ）、ＡＴＰアーゼ銅輸送ベータ（ＡＴＰ７Ｂ）、ＡＴＰアーゼリン脂質輸送８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ４）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ１１）、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、コンタクチン随伴タンパク質様２（ＣＮＴＮＡＰ２）、亜鉛フィンガーＥ－ボックス結合ホメオボックス２（ＺＥＢ２）、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、もしくは第ＸＩＩ因子、またはそれらのバリアントもしくは機能的断片等の治療用導入遺伝子に作動可能に連結している。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子またはそのバリアントもしくは機能的断片をコードする。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントもしくは機能的断片をコードする。ある特定の実施形態では、治療用導入遺伝子は、例えば肝臓等の特定の細胞または組織型における発現のためにコドン最適化されている。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される核酸構築物は、プロモーターに加えて、例えば転写の開始または終止に関連する配列、エンハンサー配列、および効率的なＲＮＡプロセシングシグナル等の、別の調節エレメントを含む。例示的な調節エレメントには、例えば、イントロン、エンハンサー、ＵＴＲ、安定性エレメント、ＷＰＲＥ配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、翻訳後応答エレメントもしくはポリアデニル化（ポリＡ）配列、またはそれらの組合せが含まれる。調節エレメントは、遺伝子発現の転写段階、転写後段階または翻訳段階において遺伝子発現をモジュレートするように機能し得る。ＲＮＡレベルにおいて、調節は、翻訳（例えば、翻訳のためにｍＲＮＡを安定化する安定性エレメント）、ＲＮＡ切断、ＲＮＡスプライシングおよび／または転写終結のレベルにおいて生じ得る。種々の実施形態では、調節エレメントは、コード領域に、目的の細胞型における遺伝子発現選択性を増加させる、ＲＮＡ転写物が産生される速度を増加させる、産生されたＲＮＡの安定性を増加させる、および／またはＲＮＡ転写物からのタンパク質合成の速度を増加させる転写因子を動員し得る。

一実施形態では、本明細書に記載される核酸構築物は、エンハンサー配列をさらに含む。例示的なエンハンサー配列には、例えばＥｎ３４エンハンサー（ヒトアポリポタンパク質肝変制御領域からの３４ｂｐコアエンハンサー）、ＥｎＴＴＲエンハンサー（トランスサイレチンからの１００ｂｐエンハンサー配列）、α１－ミクログロブリン／ビクニン前駆体エンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー（α１－ミクログロブリン／ビクニン前駆体からの１００ｂｐの遠位エンハンサーの４２ｂｐへの短縮バージョン）、またはＡｐｏＥエンハンサーが含まれる。例えばＷＯ２０１８／１２６１１６およびWu et al., Mol Therapy 16(2): 280-289 (2008)を参照されたい。別の実施形態では、好適なエンハンサー配列は、配列番号１９または配列番号２０を含むイントロン性配列である。ある特定の実施形態では、エンハンサー配列は、本明細書に記載される核酸構築物において導入遺伝子およびプロモーターの上流、またはプロモーターと導入遺伝子との間に位置する。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される核酸構築物は、ポリＡ配列をさらに含む。適切なポリＡ配列には、例えば、約７５ｂｐ長である人工ポリＡ（ＰＡ７５）（例えば、ＷＯ２０１８／１２６１１６を参照のこと）、ウシ成長ホルモンポリＡ、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、ウサギベータグロビンポリＡ、ＨＳＶチミジンキナーゼポリＡ、プロタミン遺伝子ポリＡ、アデノウイルス５ＥＩｂポリＡ、成長ホルモンポリＡまたはＰＢＧＤポリＡが含まれる。ある特定の実施形態では、ポリＡ配列は、本明細書に記載される核酸構築物において導入遺伝子の下流に位置する。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子に従う使用に適した調節エレメントは、５００ｂｐ、４５０ｂｐ、４００ｂｐ、３５０ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２２５ｂｐ、２００ｂｐ、１７５ｂｐ、１５０ｂｐ、１４５ｂｐ、１４０ｂｐ、１３５ｂｐ、１３０ｂｐ、１２５ｂｐ、１２０ｂｐ、１１５ｂｐ、１１０ｂｐ、１０５ｂｐ、１００ｂｐ、９５ｂｐ、９０ｂｐ、８５ｂｐ、８０ｂｐ、もしくは７５ｂｐ未満のｂｐ、または約８０～３００ｂｐ、８０～２７５ｂｐ、８０～２５０ｂｐ、８０～２００ｂｐ、８０～１５０ｂｐ、８０～１２５ｂｐ、８０～１２０ｂｐ、８０～１１５ｂｐ、８０～１１０ｂｐ、８０～１０５ｂｐ、８０～１００ｂｐ、８５～３００ｂｐ、８５～２７５ｂｐ、８５～２５０ｂｐ、８５～２００ｂｐ、８５～１５０ｂｐ、８５～１２５ｂｐ、８５～１２０ｂｐ、８５～１１５ｂｐ、８５～１１０ｂｐ、８５～１０５ｂｐ、８５～１００ｂｐ、９０～３００ｂｐ、９０～２７５ｂｐ、９０～２５０ｂｐ、９０～２００ｂｐ、９０～１５０ｂｐ、９０～１２５ｂｐ、９０～１２０ｂｐ、９０～１１５ｂｐ、９０～１１０ｂｐ、９０～１０５ｂｐ、９０～１００ｂｐ、９５～３００ｂｐ、９５～２７５ｂｐ、９５～２５０ｂｐ、９５～２００ｂｐ、９５～１５０ｂｐ、９５～１２５ｂｐ、９５～１２０ｂｐ、９５～１１５ｂｐ、９５～１１０ｂｐ、９５～１０５ｂｐ、９５～１００ｂｐ、１００～３００ｂｐ、１００～２７５ｂｐ、１００～２５０ｂｐ、１００～２００ｂｐ、１００～１５０ｂｐ、１００～１２５ｂｐ、１００～１２０ｂｐ、１００～１１５ｂｐ、１００～１１０ｂｐ、もしくは１００～１０５ｂｐを含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載される核酸分子に従う使用に適した調節エレメントは、約１００～１２０ｂｐ、約１１７ｂｐ、または約１００ｂｐを含む。

ある特定の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂ核酸配列および調節エレメントを含む本明細書に記載される核酸構築物はＡＡＶベクターでのパッケージングに適しており、例えば約４．７Ｋｂ未満からなる。ある特定の実施形態では、ＡＴＰ７Ｂ核酸配列および調節エレメントを含む本明細書に記載される核酸構築物は、約４，４５０～４，５５０ｂｐ、４，４５０～４，５４０ｂｐ、４，４５０～４，５３０ｂｐ、４，４５０～４，５２０ｂｐ、４，４５０～４，５１０ｂｐ、４，４５０～４，５００ｂｐ、４，４６０～４，５５０ｂｐ、４，４６０～４，５４０ｂｐ、４，４６０～４，５３０ｂｐ、４，４６０～４，５２０ｂｐ、４，４６０～４，５１０ｂｐ、４，４６０～４，５００ｂｐ、４，４７０～４，５５０ｂｐ、４，４７０～４，５４０ｂｐ、４，４７０～４，５３０ｂｐ、４，４７０～４，５２０ｂｐ、４，４７０～４，５１０ｂｐ、４，４７０～４，５００ｂｐ、４，４８０～４，５５０ｂｐ、４，４８０～４，５４０ｂｐ、４，４８０～４，５３０ｂｐ、４，４８０～４，５２０ｂｐ、４，４８０～４，５１０ｂｐ、４，４８０～４，５００ｂｐ、４，４９０～４，５５０ｂｐ、４，４９０～４，５４０ｂｐ、４，４９０～４，５３０ｂｐ、４，４９０～４，５２０ｂｐ、４，４９０～４，５１０ｂｐ、もしくは４，４９０～４，５００ｂｐからなり、または約４，４９８ｂｐもしくは約４，５１５ｂｐからなる。例示的な実施形態では、そのような核酸構築物は、完全長のＡＴＰ７Ｂタンパク質、例えば配列番号２を有するＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする。

発現ベクター
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されたバリアントＡＴＰ７Ｂヌクレオチド配列または発現構築物は、発現ベクターに組み込まれ得る。

発現ベクターは、トランスフェクションまたは形質導入を介して標的細胞に核酸分子を送達するために使用し得る。ベクターは、組み込みまたは非組み込みベクターであり得、これは、宿主細胞のゲノム中に発現カセットまたは導入遺伝子を組み込むベクターの能力を指す。発現ベクターの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：（ａ）非ウイルスベクター、例えば、直鎖状オリゴヌクレオチドおよび環状プラスミドを含む核酸ベクター；人工染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）および細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ）；エピソームベクター；トランスポゾン（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ）；ならびに（ｂ）ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター。

発現ベクターは、直鎖状オリゴヌクレオチドまたは環状プラスミドであり得、物理的方法および化学的方法を含む種々のトランスフェクション法を介して、細胞に送達し得る。物理的方法は、一般に、遺伝子材料の細胞内送達を促進するにあたって、細胞膜障壁に対抗するために物理的力を使用する送達の方法を指す。物理的方法の例には、針の使用、弾道ＤＮＡ（ｂａｌｌｉｓｔｉｃＤＮＡ）、電気穿孔、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、フォトポレーション（ｐｈｏｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マグネトフェクションおよびハイドロポレーション（ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。化学的方法は、一般に、化学的担体が核酸分子を細胞に送達する方法を指し、これには、無機粒子、脂質に基づくベクター、ポリマーに基づくベクターおよびペプチドに基づくベクターが含まれ得る。

一部の実施形態では、発現ベクターは、無機粒子を使用して標的に投与される。無機粒子は、細網内皮系から回避するように、または捕捉された分子を分解から保護するために様々なサイズ、形状、および／または多孔度について操作されているナノ粒子などのナノ粒子を指し得る。無機ナノ粒子は、金属（例えば、鉄、金、および銀）、無機塩、またはセラミックス（例えば、カルシウム、マグネシウム、またはケイ素のリン酸塩または炭酸塩）から調製することができる。これらのナノ粒子の表面は、ＤＮＡ結合または標的化遺伝子送達を促進するためにコーティングすることができる。磁性ナノ粒子（例えば、超磁性酸化鉄）、フラーレン（例えば、可溶性炭素分子）、炭素ナノチューブ（例えば、円柱状フラーレン）、量子ドット、および超分子系もまた使用され得る。

一部の実施形態では、発現ベクターは、カチオン性脂質（例えば、カチオン性リポソーム）を使用して、標的細胞に投与される。種々の型の脂質が、遺伝子送達、例えば、脂質ナノエマルジョン（例えば、これは、乳化剤によって安定化した別の不混和性液体中の１つの不混和性液体の分散物である）または固体脂質ナノ粒子などについて調査されている。

一部の実施形態では、発現ベクターは、ペプチドに基づく送達ビヒクルを使用して、標的細胞に投与される。ペプチドに基づく送達ビヒクルは、送達される遺伝子材料を保護する、特異的細胞受容体を標的化する、エンドソーム膜を破壊する、および遺伝子材料を核中に送達するという利点を有し得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、ポリマーに基づく送達ビヒクルを使用して、標的細胞に投与される。ポリマーに基づく送達ビヒクルは、天然のタンパク質、ペプチドおよび／もしくは多糖または合成ポリマーを含み得る。一実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。ＰＥＩは、アニオン性細胞表面残基に結合しエンドサイトーシスを介して細胞中に持ち込まれる正に荷電した粒子へと、ＤＮＡを凝縮させ得る。他の実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）、ポリ（ＤＬ－乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ－ラクチド－コ－グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、デンドリマー、キトサン、デキストランの合成アミノ誘導体、および／またはカチオン性アクリルポリマーを含み得る。ある特定の実施形態では、ポリマーに基づく送達ビヒクルは、ポリマー、例えば、ＰＥＧおよびＰＬＬなどの混合物を含み得る。

ある特定の実施形態では、発現ベクターは、遺伝子治療に適切なウイルスベクターであり得る。ウイルス遺伝子治療ベクターまたは遺伝子送達ベクターの好ましい特徴には、再現性よく安定に繁殖および高い力価まで精製される能力；標的化された送達を媒介する能力（例えば、他の場所での広いベクター散在なしに目的の組織または臓器に導入遺伝子を特異的に送達する能力）；ならびに有害な副作用を誘導することなしに遺伝子送達および導入遺伝子発現を媒介する能力が含まれ得る。

いくつかの型のウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルスと呼ばれる非病原性パルボウイルスが、ウイルス感染経路を利用し、但し複製および毒性をもたらし得るウイルス遺伝子の引き続く発現を回避することによって、遺伝子治療を目的として操作により作製されている。かかるウイルスベクターは、ウイルスゲノムからコード領域の全てまたは一部を欠失させるが、機能、例えば、ウイルスカプシド中へのベクターゲノムのパッケージングまたは宿主クロマチン中へのベクター核酸（例えば、ＤＮＡ）の組み込みのために必要であり得るインタクトな配列（例えば、末端反復配列）を残すことによって得ることができる。

種々の実施形態では、適切なウイルスベクターには、レトロウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型ウイルス）、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス即ちＡＡＶ）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血症肉腫ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、レンチウイルスおよびスプーマウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルスおよび肝炎ウイルスが含まれる。ウイルスベクターは、宿主ゲノム中に組み込まれるそれらの能力に従って、２つの群－組み込みおよび非組み込みに分類され得る。オンコレトロウイルス（ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）およびレンチウイルスは、宿主細胞クロマチン中に組み込まれ得るが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスは、細胞核中で染色体外エピソームとして優勢に存続する。

ある特定の実施形態では、適切なウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスを指す。レトロウイルスの例には、オンコレトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、およびレンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）が含まれる。レトロウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡであり、シスまたはトランスで提供され得る種々の遺伝子を含む。例えば、レトロウイルスゲノムは、遺伝子発現、逆転写および宿主染色体中への組み込みのためのエレメントと共に、シス作用性配列、例えば、２つの長い末端反復（ＬＴＲ）を含み得る。他の成分には、新たに形成されたビリオン中への特異的ＲＮＡパッケージングのためのパッケージングシグナル（プサイ即ちψ）、および逆転写の間のプラス鎖ＤＮＡ合成の開始の部位であるポリプリントラクト（ＰＰＴ）が含まれる。さらに、レトロウイルスゲノムは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含み得る。ｇａｇ遺伝子は、構造タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ｓｓＲＮＡに付随しウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を実行する酵素をコードし、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープをコードする。一般に、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにトランスで提供される。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。少なくとも５つの血清群または血清型のレンチウイルスが認識されている。異なる血清型のウイルスは、ある特定の細胞型および／または宿主に示差的に感染し得る。レンチウイルスには、例えば、霊長類レトロウイルスおよび非霊長類レトロウイルスが含まれる。霊長類レトロウイルスには、ＨＩＶおよびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。非霊長類レトロウイルスには、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびビスナウイルスが含まれる。レンチウイルスまたはレンチベクターは、静止状態の細胞を形質導入することが可能であり得る。オンコレトロウイルスベクターと同様、レンチベクターの設計は、シス作用性配列およびトランス作用性配列の分離に基づき得る。

ある特定の実施形態では、本出願は、最適化された治療的レトロウイルスベクターによる送達のために設計された発現ベクターを提供する。レトロウイルスベクターは、左（５’）ＬＴＲ；ウイルスのパッケージングおよび／または核インポートを補助する配列；プロモーター；必要に応じて１つまたは複数のさらなる調節エレメント（例えば、エンハンサーまたはポリＡ配列など）；必要に応じてレンチウイルス逆応答エレメント（ＲＲＥ）；バリアントＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子；必要に応じてインスレーター；ならびに右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含むレンチウイルスであり得る。

例示的な実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する小さい複製欠損非エンベロープ型動物ウイルスである。ＡＡＶは、ヒト疾患を引き起こさないことが公知であり、軽度の免疫応答を誘導する。ＡＡＶベクターはまた、宿主細胞ゲノム中に組み込まれることなしに、分裂細胞および静止状態の細胞の両方に感染できる。

ＡＡＶゲノムは、約４．７ｋｂ長の直鎖状一本鎖ＤＮＡからなる。ゲノムは、約１４５ｂｐ長の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。ＩＴＲは、パリンドローム配列を含む５’末端におけるヌクレオチド配列（５’ＩＴＲ）および３’末端に位置するヌクレオチド配列（３’ＩＴＲ）からなる。これらのＩＴＲは、相補的塩基対合によって、第２鎖合成のためのＤＮＡ複製の開始の間にプライマーとして機能するＴ字型ヘアピン構造を形成するように折り畳まれることによって、シスで機能する。２つのオープンリーディングフレームは、ビリオンの複製およびパッケージングに関与するｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする。例示的な実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子もｃａｐ遺伝子も含まない。かかる遺伝子は、以下にさらに記載されるように、ビリオンを産生するためにトランスで提供され得る。

ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、スタッファー核酸を含み得る。一部の実施形態では、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質またはカナマイシンもしくはアンピシリンなどの抗生物質耐性遺伝子をコードし得る。ある特定の実施形態では、スタッファー核酸は、ＩＴＲ配列の外側に配置してよい（例えば、５’ＩＴＲ配列と３’ＩＴＲ配列との間に位置するバリアントＡＴＰＢ導入遺伝子配列および調節配列と比較して）。

ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２およびＡＡＶ１３を含む種々の血清型のＡＡＶが存在する。これらの血清型は、それらのトロピズム、またはそれらが感染する細胞の型が異なる。ＡＡＶは、複数の血清型由来のゲノムおよびカプシドを含み得る（例えば、シュードタイプ）。例えば、ＡＡＶは、血清型５または血清型８由来のカプシド中にパッケージングされた血清型２のゲノム（例えば、ＩＴＲ）を含み得る。シュードタイプは、形質導入効率を改善し得るだけでなく、トロピズムを変更させ得る。

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶウイルス粒子もしくはビリオンが、バリアントＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子を細胞、細胞型、または組織に送達するために使用され得、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏ、またはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで行われ得る。例示的な実施形態では、そのようなＡＡＶベクターは、複製欠損性である。一部の実施形態では、ＡＡＶウイルスは、それが、ヘルパー因子の存在下でのみ、複製し、ビリオンを産生することができるように操作または遺伝子改変される。

例示的な実施形態では、本出願は、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターを提供する。ＡＡＶは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－ＤＪ、またはキメラ、ハイブリッドもしくはバリアントＡＡＶであり得る。ＡＡＶはまた、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のために設計された発現ベクターは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のためにデザインされた発現ベクターは、５’ＩＴＲ、プロモーター、ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶによる送達のためにデザインされた発現ベクターは、５’ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む。例示的な実施形態では、ＡＡＶによる送達のためにデザインされた発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号２１～５５のいずれか１つまたはそのバリアントもしくは機能的断片を含むプロモーター、配列番号１～１８のいずれか１つまたはそのバリアントもしくは機能的断片を含むＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。一実施形態では、ＡＡＶによる送達のためにデザインされた発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号２１～５５のいずれか１つまたはそのバリアントもしくは機能的断片を含むプロモーター、配列番号３～６のいずれか１つまたはそのバリアントもしくは機能的断片を含むＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ＡＡＶによる送達のためにデザインされた発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号１５～１７のいずれか１つまたはそのバリアントもしくは機能的断片を含むプロモーター、配列番号４または５のいずれか１つを含むＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ＡＡＶによる送達のためにデザインされた発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号２１～４７のいずれか１つまたはそのバリアントもしくは機能的断片を含むプロモーター、配列番号７～１８のいずれか１つを含むＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ＡＡＶによる送達のためにデザインされた発現ベクターは、５’ＩＴＲ、配列番号２３～４３のいずれか１つまたはそのバリアントもしくは機能的断片を含むプロモーター、配列番号７、８、または１５のいずれか１つを含むＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子、および３’ＩＴＲを含む。

宿主細胞
別の態様では、本発明は、本発明のバリアントＡＴＰ７Ｂ配列を含む核酸分子または発現ベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり得る。例示的な実施形態では、宿主細胞は、目的のウイルスによる感染に対して感受性であり、ｉｎｖｉｔｒｏでの培養に適した任意の細胞系を指す。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、ｅｘｖｉｖｏ遺伝子治療を目的として使用し得る。かかる実施形態では、細胞に、本発明のバリアントＡＴＰ７Ｂ配列を含む核酸分子または発現ベクターをトランスフェクトし、患者または対象中に引き続いて移植する。移植された細胞は、自家、同種または異種の起源を有し得る。臨床使用のために、細胞単離は、一般に、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）条件下で実施される。移植前に、細胞の品質、および微生物もしくは他の夾雑物の非存在が、典型的にはチェックされ、放射線および／または免疫抑制処理などによる肝臓プレコンディショニングが実施され得る。さらに、宿主細胞は、細胞の増殖および／または分化を刺激するために、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの成長（増殖）因子と一緒に移植され得る。

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、肝臓へのｅｘｖｉｖｏ遺伝子治療に使用し得る。好ましくは、この細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞であり、これらには、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、類人猿；チンパンジー；サルおよびオランウータン、イヌおよびネコを含む飼い慣らされた動物、ならびに家畜、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギ、またはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターが含まれるがこれらに限定されない他の哺乳動物種などが含まれるがこれらに限定されない。当業者は、移植される患者または対象に従って、より適切な細胞を選択する。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、自己再生特性および多能性特性を有する細胞、例えば、幹細胞または人工多能性幹細胞であり得る。幹細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞または筋細胞の少なくとも１つへと分化することが可能であり、任意の型の組織から単離され得る。一般に、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯または末梢血から単離される。それを得るための方法は、当業者に周知である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知）は、成体細胞から直接生成され得る多能性幹細胞の型である。Ｙａｍａｎａｋａらは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ遺伝子をマウスおよびヒトの線維芽細胞中に移入し、細胞にそれらの遺伝子を発現させることによって、ｉＰＳ細胞を誘導した（ＷＯ２００７／０６９６６６）。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、引き続いて、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの代わりにＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を使用してヒトｉＰＳ細胞を産生した（ＷＯ２００８／１１８８２０）。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、肝細胞であり得る。細胞単離およびその後のヒトまたはマウスレシピエントへの移植を含む肝細胞移植手順は、例えば、Filippi and Dhawan, Ann NY Acad Sci. 2014, 1315 50-55；Yoshida et al., Gastroenterology 1996, 111: 1654-1660；Irani et al. Molecular Therapy 2001, 3:3, 302-309；およびVogel et al. J Inherit Metab Dis 2014, 37:165-176に記載されている。ウイルスベクターの肝細胞へのｅｘｖｉｖｏ形質導入のための方法は、例えば、Merle et al., Scandinavian Journal of Gastroenterology 2006, 41:8, 974-982に記載されている。

例示的な実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、パッケージング細胞である。この細胞は、接着細胞または浮遊細胞であり得る。パッケージング細胞、およびヘルパーベクターまたはウイルスまたはＤＮＡ構築物（複数可）は、ウイルスベクターの完全な複製およびパッケージングに必要とされる全ての欠けた機能をトランスで一緒に提供する。

好ましくは、このパッケージング細胞は、真核生物細胞、例えば、サル、ヒト、イヌおよびげっ歯類の細胞を含む哺乳動物細胞である。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ０１／３８３６２）、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣＣＣＬ－１７１）、ＷＩ－３８（ＡＴＣＣＣＣＬ－７５）、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ－１５７３）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２）および胎仔アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣＣＬ－１６０）である。非ヒト霊長類細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ８１）、ＣＯＳ－１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ－１６５０）またはＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ－１６５１）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ－３４）である。げっ歯類細胞の例は、ハムスター細胞、例えば、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞またはＣＨＯ細胞である。

哺乳動物供給源の代替として、本発明における使用のための細胞系は、トリ供給源、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはキジに由来し得る。トリ細胞系の例には、トリ胚性幹細胞（ＷＯ０１／８５９３８およびＷＯ０３／０７６６０１）、不死化アヒル網膜細胞（ＷＯ２００５／０４２７２８）、およびニワトリ細胞（ＷＯ２００６／１０８８４６）またはアヒル細胞、例えば、ＥＢ６６細胞系（ＷＯ２００８／１２９０５８およびＷＯ２００８／１４２１２４）を含むトリ胚性幹細胞由来細胞が含まれる。

別の実施形態では、この宿主細胞は、昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ－１７１１）、Ｓｆ２１細胞（ＩＰＬＢ－Ｓｆ２１）、ＭＧ１細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－ＭＧ１）またはＨｉｇｈＦｉｖｅ（商標）細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）である。

ある特定の実施形態では、（例えば、バリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含む）本発明の組換えＡＡＶベクター／ゲノムを有する核酸構築物（例えば、プラスミド）を含む本明細書で提供される宿主細胞は、１つまたは複数の追加の核酸構築物、例えば、（ｉ）ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするがＩＴＲ配列を有しない核酸構築物（例えば、ＡＡＶヘルパープラスミド）、ならびに／または（ｉｉ）ＡＡＶ複製に必要なアデノウイルス機能を提供する核酸構築物（例えば、プラスミド）をさらに含み得る。例示的な実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、以下を含む：ｉ）本発明のバリアントＡＴＰ７Ｂ配列を含む核酸構築物または発現ベクター（すなわち、組換えＡＡＶゲノム）；ｉｉ）ＩＴＲ配列を有しない、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする核酸構築物；ならびにｉｉｉ）（下記でさらに記載されているような）アデノウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物。

ある特定の実施形態では、ｒｅｐ、ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子は、単一のプラスミド上で組み合わせることができる（Blouin V et al. J Gene Med. 2004; 6(suppl): S223-S228；Grimm D. et al. Hum. Gene Ther. 2003; 7: 839-850）。したがって、別の例示的な実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、以下を含む：ｉ）本発明のバリアントＡＴＰ７Ｂ配列を含む核酸分子または発現ベクター（すなわち、組換えＡＡＶゲノム）；ならびにｉｉ）ＩＴＲ配列を有しない、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードし、アデノウイルスヘルパー遺伝子をさらに含む、プラスミド。

別の実施形態では、本明細書で提供される宿主細胞は、以下を含む：ａ）本発明のバリアントＡＴＰ７Ｂ配列を含む核酸構築物または発現ベクター（すなわち、組換えＡＡＶゲノム）；ｂ）ＩＴＲ配列を有しない、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド；ならびにｃ）アデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡＲＮＡを含むプラスミド；ここで、共トランスフェクションは、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ－１５７３）のような、アデノウイルスＥ１遺伝子を構成的に発現し、トランス補完する（transcomplement）細胞、好ましくは、哺乳動物細胞において実施される。

ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターの大規模産生に適切な宿主細胞は、組換えバキュロウイルスの組合せが感染し得る昆虫細胞である（Ｕｒａｂｅｅｔａｌ．Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００２；１３：１９３５－１９４３）。例えば、ＳＦ９細胞を、パッケージングされるＡＡＶｒｅｐ、ＡＡＶｃａｐおよびＡＡＶベクターをそれぞれが発現する３つのバキュロウイルスベクターで共感染させ得る。これらの組換えバキュロウイルスベクターは、ウイルスの複製および／またはパッケージングに必要とされるウイルスヘルパー遺伝子機能を提供する。

本発明に従う遺伝子治療のためのビリオンの構築および産生のためのさらなるガイダンスは、ＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｓｅｒｉｅｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３７．ＭｅｒｔｅｎａｎｄＡｌ－Ｒｕｂｅａｉ（Ｅｄｓ．）；２０１１ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．Ｍ．Ｇｉａｃｃａ．２０１０Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；ＨｅｉｌｂｒｏｎｎＲ．ａｎｄＷｅｇｅｒＳ．ＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ：ＣｕｒｒｅｎｔＳｔａｔｕｓｏｆＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ：ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１９７；Ｍ．Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｋｏｒｔｉｎｇ（Ｅｄ．）．２０１０Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；ｐｐ．１４３－１７０；Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｒ．Ｏ．ＳｎｙｄｅｒａｎｄＰ．Ｍｏｕｌｌｌｉｅｒ（Ｅｄｓ）．２０１１ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；ＢｕｎｎｉｎｇＨ．ｅｔａｌ．Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．２００８；１０：７１７－７３３；およびＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍ．ＣｈｉｌｌｏｎａｎｄＡ．Ｂｏｓｃｈ（Ｅｄｓ．）；Ｔｈｉｒｄ．Ｅｄｉｔｉｏｎ．２０１４ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）において見出され得る。

ビリオンおよびビリオンを産生する方法
ある特定の実施形態では、本出願は、本発明のバリアントＡＴＰ７Ｂ配列を含むウイルスベクターを含むウイルス粒子を提供する。用語「ウイルス粒子」および「ビリオン」は、本明細書で相互交換可能に使用され、カプシド内、場合によっては、例えば、レトロウイルスについては、カプシドを取り囲む脂質エンベロープ内にパッケージングされたウイルスゲノム（例えば、ウイルス発現ベクター）を含む感染性の、典型的には複製欠損性のウイルス粒子に関する。「カプシド」は、ウイルスゲノムが中にパッケージングされる構造を指す。カプシドは、タンパク質でできた数個のオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相互作用によって形成された正二十面体カプシドを有する。一実施形態では、本明細書で提供されるビリオンは、本明細書に記載されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列を含むＡＡＶベクターをタンパク質シェル中にパッケージングすることによって得られた、組換えＡＡＶビリオン即ちｒＡＡＶビリオンである。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される組換えＡＡＶビリオンは、同じ特定の血清型のＡＡＶに対応する天然のＣａｐタンパク質によって形成されるウイルス粒子中に、特定のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムをカプシド封入することによって調製され得る。他の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶウイルス粒子は、異なる血清型由来のタンパク質中にパッケージングされた所与のＡＡＶ血清型のＩＴＲ（複数可）を含むウイルスベクターを含む。例えば、ＢｕｎｎｉｎｇＨｅｔａｌ．ＪＧｅｎｅＭｅｄ２００８；１０：７１７－７３３を参照のこと。例えば、所与のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲを有するウイルスベクターは、以下へとパッケージングされ得る：ａ）同じもしくは異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質から構成されるウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ５のカプシドタンパク質；ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ８のカプシドタンパク質；など）；ｂ）異なるＡＡＶ血清型もしくは変異体由来のカプシドタンパク質の混合物から構成されるモザイクウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ５のカプシドタンパク質と共にＡＡＶ２のＩＴＲ）；ｃ）異なるＡＡＶ血清型もしくはバリアント間でのドメイン交換によって短縮されたカプシドタンパク質から構成されるキメラウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ３ドメインを有するＡＡＶ５のカプシドタンパク質と共にＡＡＶ２のＩＴＲ）；またはｄ）標的細胞特異的受容体とのストリンジェントな相互作用を可能にする選択的結合ドメインを呈するように操作された標的化されたウイルス粒子（例えば、ペプチドリガンドの挿入によって遺伝的に短縮されたＡＡＶ２のカプシドタンパク質と共にＡＡＶ４のＩＴＲ；またはカプシド表面へのペプチドリガンドのカップリングによって非遺伝的に改変されたＡＡＶ２のカプシドタンパク質）。

当業者は、本明細書で提供されるＡＡＶビリオンが、任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含み得ることを認識しているであろう。一実施形態では、ウイルス粒子は、肝臓細胞への送達により適している、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択されるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を含む（Nathwani et al. Blood 2007; 109: 1414-1421；Kitajima et al. Atherosclerosis 2006; 186:65-73）。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、核酸構築物の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列がＡＡＶ２血清型であり、かつカプシドタンパク質がＡＡＶ８血清型である、本発明の核酸構築物を含む。

トランスフェクション、安定な細胞系産生、ならびにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７１（１１）：８７８０－８７８９）およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む多数の方法が、ｒＡＡＶビリオンの産生のために当該分野で公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養は、全て以下を必要とする；１）例えば、ヒト由来細胞系、例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９もしくは２９３細胞、または昆虫由来細胞系、例えば、バキュロウイルス産生系の場合にはＳＦ－９を含む、適切な宿主細胞；２）野生型もしくは変異体アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される、適切なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子および遺伝子産物；４）ＡＡＶＩＴＲ配列が隣接する導入遺伝子（例えば、本明細書に記載されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列）；ならびに５）ｒＡＡＶ産生を支持するための適切な培地および培地成分。

種々の実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞は、以下の３つの成分を含む：（１）ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、（２）ヘルパー機能を提供する遺伝子、ならびに（３）導入遺伝子（例えば、プロモーターの制御下でかつＩＴＲが隣接する本明細書に開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列）。ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶｃａｐ遺伝子、およびヘルパー機能を提供する遺伝子は、これらの遺伝子をベクター、例えば、プラスミドなどの中に組み入れ、このベクターを宿主細胞中に導入することによって、細胞中に導入され得る。ｒｅｐ、ｃａｐおよびヘルパー機能遺伝子は、同じプラスミドまたは異なるプラスミド中に組み入れ得る。好ましい実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミド中に組み入れ、ヘルパー機能を提供する遺伝子は、別のプラスミド中に組み入れる。ビリオン産生のための宿主細胞の創製のための種々のプラスミド（例えば、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能、または導入遺伝子を含む）は、当該分野で周知の任意の適切な方法を使用することによって、細胞中に導入され得る。トランスフェクション法の例には、リン酸カルシウムによる共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム媒介性融合、リポフェクション、レトロウイルス感染および遺伝子銃トランスフェクションが含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能ならびに導入遺伝子（例えば、プロモーターの制御下でかつＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列）を提供するプラスミドは、細胞中に同時に導入され得る。別の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにヘルパー機能を提供するプラスミドは、導入遺伝子を含むプラスミドの導入の前または後に、細胞中に導入され得る。例示的な実施形態では、細胞に、以下の３つのプラスミドを同時にトランスフェクトする（例えば、三重トランスフェクション法）：（１）導入遺伝子（例えば、プロモーターの制御下でかつＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列）を含むプラスミド、（２）ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびに（３）ヘルパー機能を提供する遺伝子を含むプラスミド。例示的な宿主細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞であり得る。

他の実施形態では、（１）ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、（２）ヘルパー機能を提供する遺伝子、ならびに（３）導入遺伝子、のうち１つまたは複数は、エピソームとして、および／またはパッケージング細胞のゲノム中に組み込まれて、パッケージング細胞によって保有され得る。一実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにヘルパー機能が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であり得、宿主細胞に、導入遺伝子（例えば、プロモーターの制御下でかつＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列）を含むプラスミドを一過的にトランスフェクトする。別の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であり、宿主細胞に、導入遺伝子（例えば、プロモーターの制御下でかつＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列）を含むプラスミドおよびヘルパー機能を含むプラスミドを一過的にトランスフェクトする。別の実施形態では、宿主細胞は、ヘルパー機能が宿主細胞中で安定に維持されるパッケージング細胞であり得、宿主細胞に、導入遺伝子（例えば、プロモーターの制御下でかつＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列）を含むプラスミドならびにｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むプラスミドを一過的にトランスフェクトする。別の実施形態では、宿主細胞は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ヘルパー機能ならびに導入遺伝子配列（例えば、プロモーターの制御下でかつＩＴＲが隣接する本明細書で開示されるバリアントＡＴＰ７Ｂ配列）で安定にトランスフェクトした産生細胞系であり得る。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞に由来し得る。

別の実施形態では、産生細胞系は、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質を提供するバキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞系（典型的にはＳｆ９細胞）である。この系は、アデノウイルスヘルパー遺伝子を必要としない（ＡｙｕｓｏＥ，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１０，１０：４２３－４３６）。

用語「ｃａｐタンパク質」は、本明細書で使用される場合、ネイティブＡＡＶＣａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｃａｐタンパク質の機能的活性の例には、カプシドの形成を誘導する能力、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進する能力、カプシド中へのＡＡＶＤＮＡのパッケージング（即ち、カプシド封入）を促進する能力、細胞受容体に結合する能力、および宿主細胞中へのビリオンの進入を促進する能力が含まれる。原則として、任意のＣａｐタンパク質が、本発明の文脈において使用し得る。

ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶウイルスの宿主トロピズム、細胞、組織または臓器特異性、受容体の使用法、感染効率および免疫原性に対して影響を有することが報告されている。従って、ｒＡＡＶにおける使用のためのＡＡＶｃａｐは、例えば、対象の種（例えば、ヒトまたは非ヒト）、対象の免疫学的状態、長期もしくは短期処置への対象の適性、または特定の治療的適用（例えば、特定の疾患もしくは障害の処置、または特定の細胞、組織もしくは臓器への送達）を考慮して選択され得る。ある特定の実施形態では、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群のＡＡＶに由来する。例示的な実施形態では、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ８に由来する。

一部の実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶＣａｐは、上述のＡＡＶｃａｐまたはそのコード核酸のうち１つの変異誘発（即ち、挿入、欠失または置換による）によって生成され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶｃａｐは、上述のＡＡＶｃａｐのうち１つまたは複数に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％のまたはそれより高い類似性がある。

一部の実施形態では、ＡＡＶｃａｐは、上述のＡＡＶｃａｐのうち２個、３個、４個またはそれよりも多くに由来するドメインを含むキメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶｃａｐは、２個もしくは３個の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶに由来するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３モノマーのモザイクである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、上述のｃａｐのうち１つよりも多くを含む。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンにおける使用のためのＡＡＶｃａｐは、異種配列または他の改変を含むように操作される。例えば、選択的標的化または免疫回避を付与するペプチドまたはタンパク質配列が、ｃａｐタンパク質中に操作により導入され得る。あるいは、またはさらに、ｃａｐは、ｒＡＡＶの表面がポリエチレングリコール化（即ち、ペグ化）されるように化学的に改変され得、これにより、免疫回避を促進し得る。ｃａｐタンパク質はまた、（例えば、その天然の受容体結合を除去するために、または免疫原性エピトープをマスクするために）変異誘発され得る。

用語「ｒｅｐタンパク質」は、本明細書で使用される場合、ネイティブＡＡＶｒｅｐタンパク質（例えば、ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｒｅｐタンパク質の機能的活性の例には、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニック形成を介してＤＮＡの複製を促進すること、ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性を含む、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性が含まれる。さらなる機能には、ＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーション、および宿主染色体中へのＡＡＶＤＮＡの部位特異的組み込みが含まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０由来；より好ましくは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型由来であり得る。

一部の実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶｒｅｐタンパク質は、上述のＡＡＶｒｅｐまたはそのコード核酸のうち１つの変異誘発（即ち、挿入、欠失または置換による）によって生成され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶｒｅｐは、上述のＡＡＶｒｅｐのうち１つまたは複数と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％のまたはそれより高い類似性がある。

表現「ヘルパー機能」または「ヘルパー遺伝子」は、本明細書で使用される場合、複製のためにＡＡＶが依存するウイルスタンパク質を指す。ヘルパー機能には、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリに関与するタンパク質が含まれるがこれらに限定されない、ＡＡＶ複製に必要とされるタンパク質が含まれる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、公知のヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスのいずれかに由来し得る。ヘルパー機能には、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬＢ、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼが含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、複製のためにＡＡＶが依存するタンパク質は、アデノウイルスに由来する。

一部の実施形態では、本発明の方法における使用のための、複製のためにＡＡＶが依存するウイルスタンパク質は、上述のウイルスタンパク質またはそのコード核酸のうち１つの変異誘発（即ち、挿入、欠失または置換による）によって生成され得る。一部の実施形態では、ウイルスタンパク質は、上述のウイルスタンパク質のうち１つまたは複数に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％のまたはそれより高い類似性がある。

複製のためにＡＡＶが依存するｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質およびウイルスタンパク質の機能をアッセイするための方法は、当該分野で周知である。

目的の導入遺伝子（例えば、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列）を発現させるための宿主細胞を、ＡＡＶビリオンのアセンブリに適切な条件下で成長させることができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶビリオンのアセンブリおよび培地中へのビリオンの放出を促進するために、適切な期間にわたって成長させる。一般に、細胞を、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間または最大で約１０日間にわたって成長させることができる。約１０日後（または使用する培養条件および特定の宿主細胞に依存して、より早く）、産生のレベルは、一般に、有意に減少する。一般に、培養の時間は、ウイルス産生の観点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合、ウイルス産生は、一般に、本明細書に記載されるように、適切な宿主細胞においてヘルパーウイルス機能を供給すると開始する。一般に、細胞は、ヘルパーウイルス感染の（またはウイルス産生が開始した）約４８～約１００時間後、好ましくは約４８～約９６時間後、好ましくは約７２～約９６時間後、好ましくは約６８～約７２時間後に回収される。

ｒＡＡＶ産生培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適切な種々の条件（広い温度範囲にわたって、様々な期間にわたって、など）下で成長させることができる。ｒＡＡＶ産生培養物には、適切な接着依存性容器（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｖｅｓｓｅｌ）、例えば、ローラーボトル、ホローファイバーフィルター、マイクロキャリア、および充填床または流動床バイオリアクターなどにおいて培養することができる接着依存性培養物が含まれる。ｒＡＡＶベクター産生培養物には、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、および使い捨てシステム、例えば、Ｗａｖｅバッグシステムを含む種々の方法で培養することができる、浮遊に適応させ浮遊に適応されたた宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ、２９３およびＳＦ－９細胞もまた含まれ得る。

当該分野で公知の適切な培地が、ｒＡＡＶビリオンの産生のために使用し得る。これらの培地には、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、ＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨにが生産する培地が含まれるがこれらに限定されず、これらの各々は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養培地には、０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルの血清または血清由来組換えタンパク質が補充され得る。あるいは、ｒＡＡＶベクターは、動物由来産物を含まない培地とも呼ばれ得る、無血清条件で産生され得る。

ＡＡＶビリオン産生を可能にするために宿主細胞を培養した後、得られたビリオンを、回収および精製することができる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶビリオンは、（１）宿主細胞の溶解によって産生培養物の宿主細胞から、および／または（２）トランスフェクション後一定期間の後、好ましくは７２時間後のこれらの細胞の培養培地から、得ることができる。ｒＡＡＶビリオンは、産生培養物由来の使用済みの培地から回収され得るが、ただし、細胞は、インタクトな細胞から培地中へのｒＡＡＶビリオンの放出を引き起こす条件下で培養される（例えば、米国特許第６，５６６，１１８号を参照のこと）。細胞を溶解させる適切な方法もまた、当該分野で公知であり、これには、例えば、複数回の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流体化、ならびに化学物質、例えば、界面活性剤および／またはプロテアーゼによる処理が含まれる。

回収後、ｒＡＡＶビリオンを、精製することができる。用語「精製した」は、本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶビリオンが天然に存在する場所またはそれらが当初そこから調製された場所にこれもまた存在し得る他の成分の少なくとも一部を欠くｒＡＡＶビリオンの調製物を含む。従って、例えば、精製したｒＡＡＶビリオンは、供給源混合物、例えば、培養溶解物または産生培養物上清からそれを富化するための単離技術を使用して調製され得る。富化は、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合で、または感染力によるなどの種々の方法で測定し得、あるいは供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉性の物質、例えば、ヘルパーウイルス、培地成分などを含む産生培養夾雑物もしくは工程内夾雑物を含む夾雑物に関連して測定し得る。

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物は、宿主細胞デブリを除去するために清澄化され得る。一部の実施形態では、産生培養回収物は、種々の標準的な技術、例えば、遠心分離、または０．２μｍもしくはそれよりも大きいポアサイズのフィルター（例えば、酢酸セルロースフィルターまたは一連のデプスフィルター）を介した濾過を使用して、清澄化され得る。

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物は、産生培養物中に存在する任意の高分子量ＤＮＡを消化するために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）でさらに処理される。一部の実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）消化は、標準的な条件、例えば、３０分間～数時間の期間にわたって周囲～３７℃の範囲の温度で１～２．５単位／ｍｌの最終濃度のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）の下で実施される。

ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを、以下の精製ステップの１つまたは複数を使用して単離または精製することができる：平衡遠心分離；フロースルーアニオン交換濾過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するための接線流濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活性化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノ濾過；およびアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉。これらのステップは、単独で、種々の組合せで、または異なる順序で使用し得る。ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法は、例えば、Ｘｉａｏｅｔａｌ．，（１９９８）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ７２：２２２４－２２３２；米国特許第６，９８９，２６４号および同第８，１３７，９４８号；ならびにＷＯ２０１０／１４８１４３において見出される。

ある特定の実施形態では、精製したＡＡＶビリオンは、ＰＢＳに対して透析し、濾過し、－８０℃で貯蔵することができる。ウイルスゲノムの力価は、検量線として線状化プラスミドＤＮＡを使用する定量的ＰＣＲによって決定することができる（例えば、ＬｏｃｋＭ，ｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１０；２１：１２７３－１２８５を参照のこと）。

医薬組成物
ある特定の実施形態では、本出願は、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。他の実施形態では、本出願は、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列を含むビリオンおよび薬学的に許容される担体を提供する。例示的な実施形態では、かかる組成物は、遺伝子治療適用に適切である。医薬組成物は、好ましくは、製造および貯蔵の条件下で、無菌かつ安定である。無菌の溶液は、例えば、無菌の濾過メンブレンを介した濾過によって達成され得る。

医薬組成物中の許容される担体および賦形剤は、好ましくは、使用される投与量および濃度においてレシピエントにとって非毒性である。許容される担体および賦形剤には、バッファ、例えば、ホスフェート、シトレート、ＨＥＰＥＳおよびＴＡＥ、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン、防腐剤、例えば、塩化ヘキサメトニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）、レゾルシノールおよび塩化ベンザルコニウム、タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストランおよび免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、ヒスチジンおよびリシン、ならびに炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースおよびソルビトールが含まれ得る。本開示の医薬組成物は、注射可能な製剤の形態で非経口投与され得る。注射のための医薬組成物は、無菌の溶液または任意の薬学的に許容される液体をビヒクルとして使用して製剤化され得る。薬学的に許容されるビヒクルには、無菌の水および生理的食塩水が含まれるがこれらに限定されない。

本開示の医薬組成物は、マイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセル、およびポリメチルメタクリレートマイクロカプセル中で調製され得る。本開示の医薬組成物は、他の薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル中でも調製され得る。遺伝子治療のための医薬組成物は、許容される希釈剤中にあってよく、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含んでよい。

本明細書で提供される医薬組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、または腹腔内投与のために製剤化され得る。医薬組成物はまた、経鼻、スプレー、経口、エアロゾル、直腸もしくは膣投与のために製剤化され得、またはそれを介して投与され得る。一実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、間質経路により、すなわち、組織の間隙への、またはその間隙の中への注射により、投与される。組織標的は、例えば肝臓組織に特異的であり得、またはそれは、いくつかの組織、例えば、筋肉および肝臓組織の組合せであり得る。例示的な組織標的には、肝臓、骨格筋、心筋、脂肪沈着物、腎臓、肺、血管内皮、上皮、および／または造血細胞が挙げられ得る。好ましい実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、肝臓内注射、すなわち、肝臓組織の間質腔の中への注射により投与される。これらの方法の１つまたは複数が、本開示の医薬組成物を投与するために使用され得る。

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、「有効量」または「治療有効量」を含む。本明細書で使用される場合、そのような量は、所望の治療結果、例えば、ＡＴＰ７Ｂ発現のレベルを増加させること、ならびに／または銅転位活性が上昇し、それにしたがって、胆汁中の銅を増加させ、血清、肝臓、脳、および尿中の銅を低減することを達成するのに必要な投薬量および期間における有効な量を指す。

本開示の医薬組成物の投与量は、投与の経路、処置される疾患、および対象の肉体的特徴（例えば、年齢、体重、全体的健康）を含む因子に依存する。投与量は、最適な治療応答を提供するために調整され得る。典型的には、投与量は、顕著な毒性を誘導することなしに、疾患を有効に処置する量であり得る。一実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、５×１０^１１～１×１０^１４ｇｃ／ｋｇ（患者体重の１キログラムあたりのゲノムコピー数（ｇｃ／ｋｇ））の範囲内の量または用量で、ＡＴＰ７Ｂ欠損症（例えば、ウィルソン病が挙げられる）の処置のために患者に投与することができる。より特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０^１１ｇｃ／ｋｇ～約３×１０^１３ｇｃ／ｋｇもしくは約１×１０^１２～約１×１０^１４ｇｃ／ｋｇもしくは約１×１０^１２～約１×１０^１３ｇｃ／ｋｇの範囲内に含まれる量、または約５×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、１．５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、２．０×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、２．５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、３×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、３．５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、４×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、４．５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、５．５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、６×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、６．５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、７×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、７．５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、８×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、８．５×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、９×１０^１２ｇｃ／ｋｇもしくは９．５×１０^１２ｇｃ／ｋｇの量で投与される。ｇｃ／ｋｇは、例えば、ｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定することができる（例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋｅｔａｌ，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒＭｅｔｈｏｄｓ．２０１４Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５を参照のこと）。別の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、１×１０^９～１×１０^１１ｉｕ／ｋｇ（ベクターの感染単位（ｉｕ）／対象または患者の体重（ｋｇ））の範囲内の量または用量で、ＡＴＰ７Ｂ欠損（例えば、ウィルソン病を含む）の処置のために、患者に投与され得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、必要に応じて単位用量で形成され得る。かかる単一の投与単位は、約１×１０^９ｇｃ～約１×１０^１５ｇｃを含み得る。

本開示の医薬組成物は、それを必要とする対象に、例えば、１または複数回（例えば、１～１０回またはそれよりも多く）、毎日、毎週、毎月、年に２回、毎年、または医学的に必要な場合、投与され得る。例示的な実施形態では、単回投与で十分である。一実施形態では、医薬組成物は、ヒト対象における使用に適しており、静脈内に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射によって末梢静脈を介して送達される。他の実施形態では、医薬組成物は、約１０分間（±５分間）にわたる、約２０分間（±５分間）にわたる、約３０分間（±５分間）にわたる、約６０分間（±５分間）にわたるまたは約９０分間（±１０分間）にわたる注入によって、末梢静脈を介して送達される。

別の態様では、本出願は、１つまたは複数のコンテナ中に本明細書に記載される核酸分子、ベクター、宿主細胞、ビリオンまたは医薬組成物を含むキットをさらに提供する。キットは、キット内に含まれる核酸分子、ベクター、宿主細胞またはビリオンを患者に投与する方法を記載する指示または包装材料を含み得る。キットのコンテナは、任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属などのもの、および任意の適切なサイズ、形状または構成のものであり得る。ある特定の実施形態では、キットは、適切な液体または溶液形態で核酸分子、ベクター、宿主細胞、ビリオンまたは医薬組成物を含む１つまたは複数のアンプルまたはシリンジを含み得る。

処置の方法
別の態様では、本出願は、本明細書に記載されているようなバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含む核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物、またはビリオンを投与することにより、細胞、組織、もしくは対象においてＡＴＰ７Ｂ発現を増加させ、対象においてＡＴＰ７Ｂ発現の減少もしくはＡＴＰ７Ｂ機能の欠損に関連する疾患もしくは障害を処置する、またはウィルソン病を処置する方法を提供する。目的の細胞、組織、または対象において、バリアントＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子のｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏ、またはｅｘｖｉｖｏ発現を与えまたは誘導するために、目的の細胞にバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を送達するのに任意の公知の技術を使用することができる。

一実施形態では、本出願は、本明細書に記載されているようなバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含む核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物、またはビリオンを使用して、細胞、組織、または対象においてＡＴＰ７Ｂ発現のレベルを増加させるための方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞、組織、または対象におけるＡＴＰ７Ｂ発現のレベルは、バリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含む核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物、またはビリオンの投与前の細胞、組織、または対象におけるＡＴＰ７Ｂの発現のレベルと比較して、少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、もしくは５０倍、または少なくとも約２％、５％、１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、もしくは２００％、増加する。対象由来の細胞、組織、または試料におけるＡＴＰ７Ｂ発現のレベルを決定するために様々な方法が使用され得、その方法には、例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、処置されるべき細胞、組織、または対象は、結果としてＡＴＰ７Ｂの発現のレベルが減少し、および／または機能的ＡＴＰ７Ｂの発現のレベルが減少する、内因性ゲノムＡＴＰ７Ｂにおける突然変異を含む。ある特定の実施形態では、細胞、組織、または対象は、ＡＴＰ７Ｂについてハプロ不全である。例示的な実施形態では、本出願は、対象においてＡＴＰ７Ｂ発現を増加させるための方法であって、プロモーターに作動可能に連結した本明細書に記載されているようなバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含むＡＡＶビリオンを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の実施形態では、本出願は、対象において、ＡＴＰ７Ｂ発現の減少、ＡＴＰ７Ｂ機能の欠損に関連する疾患もしくは障害、またはＡＴＰ７Ｂ発現および／もしくは活性の上方制御が治療利益を生じ得る任意の他の障害を処置するための方法であって、本明細書に記載されているようなバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含む核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物、またはビリオンを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。ＡＴＰ７Ｂ発現および／または機能の増加が有益であり得る障害の例には、例えば、ＡＴＰ７Ｂ依存性リソソームエキソサイトーシスの減少およびリソソームにおける銅の蓄積に関連する障害、例えば、胆汁うっ滞性（choleostatic）障害、アルツハイマー病、および／またはがんが挙げられる（例えば、Polishchuck et al., Dev Cell. 29(6), 686-700 (2014)；Gupta and Lutsenko, Future Med. Chem. 1:1125-1142 (2009)参照）。ある特定の実施形態では、対象は、結果としてＡＴＰ７Ｂの発現のレベルが減少し、および／または機能的ＡＴＰ７Ｂの発現のレベルが減少する、内因性ゲノムＡＴＰ７Ｂにおける突然変異を含む。ある特定の実施形態では、対象はＡＴＰ７Ｂについてハプロ不全である。ある特定の実施形態では、対象は、疾患を引き起こすＡＴＰＢバリアントタンパク質を有する。例示的な実施形態では、本出願は、対象において、ＡＴＰ７Ｂ発現の減少、ＡＴＰ７Ｂ機能の欠損に関連する疾患もしくは障害、またはＡＴＰ７Ｂ発現および／もしくは活性の上方制御が治療利益を生じ得る任意の他の障害を処置するための方法であって、プロモーターに作動可能に連結した本明細書に記載されているようなバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含むＡＡＶビリオンを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の実施形態では、本出願は、ウィルソン病を処置するための方法であって、本明細書に記載されているようなバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含む核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物、またはビリオンを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。ウィルソン病は、銅が、肝臓においてセルロプラスミンに取り込まれることができず、肝臓から胆汁へ排泄され得ない、銅代謝の常染色体性劣性遺伝障害である。銅は、肝臓に蓄積し、その後、脳および腎臓に蓄積する。その疾患は、神経学的症状発現および肝硬変の徴候により特徴付けられる。ウィルソン病は、主に、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼをコードするＡＴＰ７Ｂ遺伝子における突然変異によって引き起こされる、代謝の遺伝性エラーである。ＡＴＰ７Ｂは、胆汁への排泄と、機能的セルロプラスミンの合成のためのアポ型セルロプラスミンへの取り込みの両方のために、銅を細胞内シャペロンタンパク質から分泌経路へ輸送することを担う。ウィルソン病の発症は、冒された組織における銅の蓄積による（例えば、EASL Clinical Practice Guidelines: Wilson's disease, EASL Journal of Hepatology, 2012, 56(671-85)およびWD, Online Mendelian Inheritance in Man catalog accession number OMIN 277900；ワールドワイドウェブ上でomim.org/entry/277900において入手可能；参照）。ウィルソン病を有する一部または全部の患者に存在する、ｈＡＴＰ７Ｂ遺伝子における様々な突然変異および／または生じるタンパク質は公知である。ウィルソン病に寄与する既知の突然変異の完全なリストは、ワールドワイドウェブ上でｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３５６７０において見出すことができる。

ウィルソン病の臨床上の顕著な特徴は、カイザーフライシャー輪であり、それは、神経学的症状を有する患者の９５％、および神経学的症状をもたない患者の半分をやや超える割合に存在する。神経学的徴候は多様であり、最も多いのは、振戦、運動失調、およびジストニアである。ウィルソン病を有する患者において、何らかの型の肝臓疾患に遭遇し得る。臨床的に明らかな肝臓疾患は、神経学的症状発現に１０年間も先行し得、神経学的症状を有するほとんどの患者は、診察時に、ある程度の肝臓疾患を有する。肝臓疾患の主症状は、非常に多様であり得、生化学的異常のみを有する無症候性から、全てのその合併症を有する明白な肝硬変まで様々であり得る。ウィルソン病はまた、急性肝不全として現れる場合があり、時々、クームス陰性溶血性貧血および急性腎不全を伴う場合もある。例えば、EASL Clinical Practice Guidelines: Wilson's disease, EASL Journal of Hepatology, 2012, 56(671-85)参照。

様々な実施形態では、任意の重症度のウィルソン病を有する対象が、本明細書で提供される方法に従って処置され得る。ある特定の実施形態では、ウィルソン病を有する対象は、以下の特性の１つまたは複数を有し得る：血清ビリルビンレベルの上昇（例えば、約１００μｍｏｌ／Ｌより高い）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの上昇（例えば、約１００Ｕ／Ｌより高い）、国際標準化比（ＩＮＲ）レベルの上昇（例えば、約１．３より高い）、白血球（ＷＢＣ）数の上昇（例えば、約６．８×１０^９／Ｌより高い）、および／またはアルブミンレベルの減少（例えば、約４４ｇ／Ｌ未満）。ウィルソン病を有する患者を同定するために使用することができる他の適切な検査には、例えば、非セルロプラスミン結合型銅（ＮＣＣ；「遊離銅」または銅インデックスとも呼ばれる）、２４時間尿銅、肝銅、および遺伝的突然変異検査が挙げられる（例えば、銅レベルの測定のための例示的な方法について、McMillin et al, Am J Clin Pathol. 2009; 131(2): 160-165 (2009)参照）。

様々な実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列の投与を含む、本明細書で提供される方法は、ホロセルロプラスミン（holoceruplasmin）合成、セルロプラスミンオキシダーゼ活性、および／もしくは胆汁における銅排泄を増加させおよび／もしくは回復すること（それにしたがって、血清、肝臓、脳、および尿中の銅蓄積を低減すること）を含む、ウィルソン病の１つもしくは複数の症状の重症度を軽減し、寛解させ、もしくは低減し得、ならびに／または腹痛、疲労、黄疸、不随意運動の頻度、筋硬直、言語障害、嚥下障害、もしくは身体的協調障害の重症度を軽減し、寛解させ、もしくは低減し得る。ある特定の実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列の投与を含む本明細書で提供される方法は、結果として、以下の結果の１つまたは複数を生じ得る：２５％またはそれより多い血清銅レベルの低減、２４時間あたり３～８μｍｏｌまたはそれ未満の尿中銅排泄、血清非セルロプラスミン結合型銅（ＮＣＣ）の正常化（＜１５０μｇ／Ｌ）、血清アミノトランスフェラーゼの正常化（肝臓生化学、ＡＬＴ／ＡＳＴ）、尿中Ｃｕの正常化（正常の＜４０μｇ／２４時間（０．６μｍｏｌ／２４時間）上限）、血清セルロプラスミンの正常化（＞２００ｍｇ／Ｌ）、臨床全般印象（Clinician Global Impression）（ＣＧＩ）尺度の向上。様々な実施形態では、結果の評価は、非セルロプラスミン結合型銅、２４時間尿銅、もしくは肝銅レベルを測定することにより、および／または食事性銅許容度の臨床評価により、評価され得る。ある特定の実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ配列の投与を含む本明細書で提供される方法は、結果として、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、またはそれより多い、血清銅レベルの低減を生じ得る。

例示的な実施形態では、本出願は、ウィルソン病を処置するための方法であって、プロモーターに作動可能に連結した本明細書に記載されているようなバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含むＡＡＶビリオンを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

ある特定の実施形態では、バリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含む核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物、またはビリオンを投与することを含む、本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の追加の治療剤の投与をさらに含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、Ｄ－ペニシラミンおよびトリエンチンなどのキレート剤での処置、ならびに／またはジメルカプトコハク酸ナトリウム、ジメルカプトコハク酸、亜鉛、およびテトラチオモリブデートなどの他の作用物質での処置を含み得る。他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ダイエット中で銅が低い対象を処置することを含み得る。様々な実施形態では、追加の治療剤は、本明細書に記載されたバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸と同時にまたは逐次的に投与され得る。例えば、追加の治療剤は、本明細書に記載されているようなバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含む核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物、またはビリオンの投与の前、後、および／または前と後に投与され得る。他の実施形態では、追加の治療剤は、本明細書に記載されているようなバリアントＡＴＰ７Ｂ核酸配列を含む核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物、またはビリオンと同時に投与され得る。

様々な実施形態では、本明細書に記載された方法に従って処置することができる対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ロバ、ウマ、イヌ、ネコ、ラマ、サル（例えば、アカゲザルまたはカニクイザルなどのマカク）、またはヒトである。例示的な実施形態では、対象はヒトである。

配列

これらの実施例は、例証のためのみ提供され、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するためではない。

（実施例１）
ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＰ７Ｂコドン最適化バリアントの発現
ＨＥＫ２９３細胞を、標準方法により培養し、６ウェルプレートのウェルにつき３ｕｇのプラスミドをトランスフェクト（ＰＥＩ）した。トランスフェクションから７２時間後、細胞を採取し、カラム上でのＤＮアーゼ処理を含めて、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造会社のプロトコールに従って、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ＯｌｉｇｏＤＴプライマーを使用して、逆転写した（６５℃ ５分間、５５℃ １０分間、８５℃ １０分間）。ＡＴＰ７Ｂのコドン最適化バリアントに特異的なプライマーを、信頼性を試験するために標準曲線により試験し、ｃＤＮＡを、以下の条件：（９８℃ ２分間、４０×［９８℃ １０秒間、５８℃ ３０秒間、９２℃ １５秒間］）下でのｑＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）に使用した。

ＷＴＡＴＰ７Ｂ（配列番号１）、ＡＴＰ７ＢバリアントＮｏ．２（配列番号４）、およびＡＴＰ７ＢバリアントＮｏ．３（配列番号５）に対するプライマーは、ほぼ１００％の同等の増幅効率を示した（データ未呈示）。ＡＴＰ７Ｂ発現を、ＧＡＰＤＨに対して標準化し、デルタ－デルタＣｔ法を使用して、ベースラインに対する変化倍率として表した。

結果は図１に示されている。ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＰ７Ｂバリアント２（配列番号４）の発現のレベルは、野生型ＡＴＰ７Ｂ（配列番号１）の発現のレベルの約２．５倍大きく、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）の発現のレベルは、野生型ＡＴＰ７Ｂ（配列番号１）の発現のレベルの約５．５倍大きかった。

（実施例２）
マウス肝臓におけるＡＴＰ７Ｂコドン最適化バリアントの発現
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（条件あたりｎ＝１０マウス）に、尾静脈を介して、配列番号２４を有するプロモーターの制御下の野生型ＡＴＰ７Ｂ（配列番号１）またはコドン最適化ＡＴＰ７Ｂバリアント２もしくは３（それぞれ、配列番号４および５）を含有するＡＡＶ８ベクター（１Ｅ１２ｇｃ／マウス）を注射した。ウイルス送達から２週間後、肝臓を回収した。左肝葉をＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＭ７０２０Ｍ）中に一晩保存し、ＲＴ－ｑＰＣＲによるヒトＡＴＰ７ＢＲＮＡ分析のためにＲＮＡｌａｔｅｒ除去後、－８０℃に移した。

表５および図２に示されているように、マウス肝臓におけるＡＴＰ７Ｂバリアント２（配列番号４）の発現のレベルは、野生型ＡＴＰ７Ｂ（配列番号１）の発現のレベルの約５倍大きく、マウス肝臓におけるＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）の発現のレベルは、野生型ＡＴＰ７Ｂ（配列番号１）の発現のレベルの約７．８倍大きかった。

（実施例３）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における短いプロモーターからの高発現
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、いくつかの異なる調節エレメント、すなわち、プロモーター制御なし、ＳＣＰ、ＣＭＶ、配列番号２１（ｍｉｎＣＭＶに作動可能に連結した配列番号１９）、配列番号２２（ｍｉｎＣＭＶに作動可能に連結した配列番号２０）、およびＣＡＧのうちの１つの制御下でのルシフェラーゼ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。各構築物からの標準化ルシフェラーゼ値は図３Ａに示されている。各構築物からのサイズ標準化活性値は図３Ｂに示されている。本明細書で使用される調節エレメントおよびプロモーターの配列は、上記の表２および表３に提供されている。ｍｉｎＣＭＶプロモーターに連結した調節エレメント配列番号１９、およびｍｉｎＣＭＶプロモーターに連結した調節エレメント配列番号２０は、ｍｉｎＣＭＶ単独およびＳＣＰ単独より高いレベルのルシフェラーゼ発現を駆動した。ｍｉｎＣＭＶプロモーターに連結した場合の配列番号１９および配列番号２０のどちらも、調節エレメント（すなわち、配列番号１９または２０）を含まない、対照、ＳＣＰ、またはｍｉｎＣＭＶプロモーターと比較して、ＨＥＫ２９３Ｔ腎臓細胞においてルシフェラーゼの高い発現を駆動した。

類似した標準化ルシフェラーゼ発現実験を、図３Ｃ、図３Ｄ、および図３Ｅに示されているように、追加の対照および制御配列を用いて行った。ホタル発現もまた、試験された全ての試料における類似したトランスフェクション効率を保証するためにアッセイした。図３Ｃにおいて、調節エレメント配列番号２２、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９の標準化ルシフェラーゼ発現を、２つの陰性対照（すなわち、いかなる発現も駆動しないことが知られた配列）と比較した。試験された調節エレメントのそれぞれは、陰性対照と比較して、ルシフェラーゼ発現の高いレベル、例えば、少なくとも１０倍、５０倍、もしくは１００倍、またはそれより大きい倍数のレベルを生じた。

図３Ｄにおいて、調節エレメント配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３２、または配列番号３３を含むプラスミドからの標準化ルシフェラーゼ発現を、陰性対照、およびルシフェラーゼに作動可能に連結した、ＣＭＶｅに連結したＣＭＶまたはＣＭＶのいずれかを含む類似したプラスミドと比較した。試験された各調節エレメント（すなわち、配列番号２２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３２、および配列番号３３）は、陰性対照、ＣＭＶ単独、およびＣＭＶ＋ＣＭＶｅより高いルシフェラーゼ発現を生じた。試験された比較的短い調節エレメントは、ルシフェラーゼに連結したＣＭＶプロモーターまたはＣＭＶ＋ＣＭＶｅを含むプラスミドと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または５０倍より大きい標準化ルシフェラーゼ発現を示した。

図３Ｅにおいて、ルシフェラーゼに作動可能に連結した調節エレメント配列番号２８、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、または配列番号４３を含むプラスミドからの標準化ルシフェラーゼ発現を、陰性対照（すなわち、発現活性を有しないことが公知の配列）と比較した。各調節エレメント（すなわち、配列番号２８、２９、および４０～４３）は、陰性対照より高いルシフェラーゼ発現を駆動し、一方、配列番号４１は、陰性対照より１０^２倍より大きい標準化ルシフェラーゼ発現、または少なくとも１００倍大きいルシフェラーゼ発現を駆動した。

（実施例４）
短いプロモーターからの肝臓における野生型ＡＴＰ７Ｂ発現
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、配列番号２３の制御下の野生型ＡＴＰ７Ｂを含有するＡＡＶ８ベクターを静脈内に注射した。ウイルス送達から２週間後、肝臓を回収した。肝臓パンチを破壊し、１０ｕｌ／ｍＬベータ－メルカプトエタノールを追加したＲＬＴの６００ｕｌ中にホモジナイズし、カラム上でのＤＮアーゼ処理を含めて、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造会社のプロトコールに従って、ＲＮＡを抽出した。各試料について、ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ＯｌｉｇｏＤＴプライマーを使用して、逆転写した（６５℃ ５分間、５５℃ １０分間、８５℃ １０分間）。ヒトＡＴＰ７Ｂに対するプライマー（５’－ＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＴ－３’（配列番号６４）；５’－ＧＧＣＣＴＧＡＡＣＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡ－３’（配列番号６５）），およびＧＡＰＤＨに対するプライマー（５’ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ－３’（配列番号４４）；５’－ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ－３’（配列番号４５））を、信頼性を保証するために標準曲線で検証し、以下の増幅条件：（９８℃ ２分間、４０×［９８℃ １０秒間、６７℃ ３０秒間、９２℃ １５秒間］）下でのｑＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）に使用した。ＡＴＰ７Ｂ発現を、ＧＡＰＤＨに対して標準化し、デルタ－デルタＣｔ法を使用して、ベースラインに対する変化倍率として表した。図４および表６に示されているように、配列番号２３は、３つの異なる用量において、肝臓でＡＴＰ７Ｂの発現を駆動し、最高のウイルス用量が最高のＡＴＰ７Ｂ発現を生じるという、用量応答を示した。

実施例４は、ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子に作動可能に連結した、本明細書に開示された１つまたは複数の調節エレメントを含む発現カセットが、それを必要とする動物、哺乳動物、またはヒト対象において、ＡＴＰ７Ｂ欠損に関連する障害または状態、例えば、ウィルソン病を処置するために使用し得ることを例証している。さらに、そのような発現カセットは、ｒＡＡｖ８を使用して、例えば、静脈内注射または注入により、ｉｎｖｉｖｏで全身性に送達することができる。

（実施例５）
肝臓における高ＥＧＦＰ転写
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、様々な調節エレメント：配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、および３３の制御下のＥＧＦＰを含有するＡＡＶ８ベクターを静脈内に注射した。各ＡＡＶ８ベクターを、５×１０^１１ｇｃ／マウスの用量で投与した。ウイルス送達から２週間後、肝臓を回収した。肝臓パンチを破壊し、１０ｕｌ／ｍＬベータ－メルカプトエタノールを追加したＲＬＴの６００ｕｌ中にホモジナイズし、カラム上でのＤＮアーゼ処理を含めて、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造会社のプロトコールに従って、ＲＮＡを抽出した。各試料について、ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ＯｌｉｇｏＤＴプライマーを使用して、逆転写した（６５℃ ５分間、５５℃ １０分間、８５℃ １０分間）。ＥＧＦＰに対するプライマー（５’－ＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧ－３’（配列番号４６）；５’－ＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣ－３’（配列番号４７））およびＧＡＰＤＨに対するプライマー（配列番号４４および配列番号４５）を、以下の増幅条件：（９８℃ ２分間、４０×［９８℃ １０秒間、６５℃ ３０秒間、９２℃ １５秒間］）下でのｑＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）に使用した。ＥＧＦＰ発現を、ＧＡＰＤＨに対して標準化し、デルタ－デルタＣｔ法を使用して、ベースラインに対する変化倍率として表した（図５）。図５に示されているように、試験された調節エレメントのそれぞれは、肝臓において、ＲＮＡ転写物により測定された場合、ＥＧＦＰ発現を増加させた。さらに、配列番号２２、配列番号３３、および配列番号２４は、ＥＧＦＰの同等のレベルを生じた。

実施例５は、本開示の比較的短い調節エレメントが、ＲＮＡ転写物により測定された場合、肝臓において導入遺伝子発現の高いレベルを生じ得ることを例証している。

（実施例６）
高いパーセンテージの肝細胞がＥＧＦＰを発現する
野生型（Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ）マウスに、候補調節エレメントの制御下の、ＫＡＳＨ核テザリングドメインと融合したＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ－ＫＡＳＨ）を含有するＡＡＶ８（５×１０^１１ｇｃ／マウス）またはＰＢＳ対照を静脈内（尾静脈）に注射した。注射から４週間後、動物を屠殺し、４ｍｍの肝臓パンチを、肝臓右側葉から採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ中に保存した。

肝臓パンチ（Ｎ＝５、動物あたり１個）を、溶解緩衝液中でダウンス（dounce）して、核を遊離させた。粗核調製物を、遠心分離により得、核完全性を確認するためにＤＡＰＩで染色した。核を、フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩフローサイトメーター）によりＧＦＰ発現について分析し、ゲーティングストラテジーを確定するためにＰＢＳ注射された対照を使用した。試料ごとに、１０，０００個の事象を記録し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＧＦＰ＋核およびＧＦＰ－核が決定され、対照試料の＜９９．５％がＧＦＰ陽性とみなされた。データは、ＧＦＰ＋として検出された、総ＤＡＰＩ＋事象に占めるパーセンテージとして表されている（図６）。図６に示されているように、試験された調節エレメントの多くが、マウスにおいて、高パーセンテージの肝細胞で発現し、配列番号２４は、８０％より多くの肝細胞において発現した。

（実施例７）
マウスモデルにおけるウィルソン病の処置
本明細書に記載された核酸構築物を使用する、ウィルソン病および／またはその症状の処置は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の欠損を生じる、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子における３００ｂｐ欠失を有するＬｏｎｇＥｖａｎｓＣｉｎｎａｍｏｎラット（K. Terada et al. Pediatr Int. 41(4):414-8(1999)）；ＡＴＰ７Ｂコード化タンパク質の第２の推定膜貫通ドメインに対応するＡＴＰ７Ｂコード配列におけるＧｌｙ７１２Ａｓｐミスセンス変異を有し、結果として機能障害性ＡＴＰ７Ｂタンパク質を生じる、Ｊａｃｋｓｏｎの毒性ミルクマウス（ｔｘ^ｊ）（E.A. Roberts et al. Mol Genet Metab. 93(l):54-65 (2008)）；ＡＴＰ７Ｂエクソン２の一部分の逆の転写フレームで配向したネオマイシンカセットでの置換を操作することによってマウスＡＴＰ７ＢｍＲＮＡにおいて早期終止コドンを導入することにより作製された、ＡＴＰ７Ｂノックアウトマウス（ＡＴＰ７ＢＫＯ、ＡＴＰ７Ｂ^－／－またはＷＤマウス）（Buikova O.I. et al. Human Molecular Genetics 8(9): 1665-1671 (1999)）；およびＡＴＰ７Ｂマウス（D. Huster D et al. Am J Pathol. 168(2):423-34 (2006)）系統などの様々なマウス系統において試験することができる。ＡＴＰ７Ｂノックアウトマウスは、肝臓におけるＡＴＰ７Ｂ発現を示さず、尿中の高いＣｕ排泄、血清中の低いホロセルロプラスミンレベル、高いトランスアミナーゼレベル、肝臓における高いＣｕ濃度、および病的な肝臓組織像を示す。これらのマウスは、神経学的疾患を除く、ヒトウィルソン病の典型的な生化学的特性を示す（Lutsenko S. Biochemical Society Transactions 36(Pt 6): 1233-1238 (2008)）。

ＡＡＶ遺伝子治療およびそのような遺伝子治療を使用する処置を含む、本明細書に記載されたＡＴＰ７Ｂバリアント組成物を試験するために、上記のマウス系統のそれぞれのウィルソン病モデルマウスおよび対照マウス（例えば、野生型ＡＴＰ７Ｂ遺伝子を有するマウス）に、対照（例えば、ＰＢＳ、空ＡＡＶ、またはｅＧＦＰもしくは別のレポーター遺伝子のいずれかを発現するＡＡＶ）、またはバリアントＡＴＰ７Ｂ配列（例えば、上記の表１に記載されたバリアントＡＴＰ７Ｂ配列のいずれか１つ）を含む発現カセットを注射する（例えば、静脈内注射により投与する）。いくつかのＡＡＶは、上記の表２に記載された１つまたは複数の調節エレメント配列をさらに含み得る。

ＡＡＶ注射後、以下の測定値のうちの１つまたは複数を、経時的に定期的にモニターする：血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、および血清総ビリルビンレベル、血清Ｃｕレベル、血清セルロプラスミン活性、ならびに／または尿Ｃｕレベル。

血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、および／またはビリルビンレベルは、例えば、血液試料を採取し、ＡｎｔｅｃｈＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、またはＨｉｔａｃｈｉ７４７ＣｌｉｎｉｃａｌＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用するＤＧＫＣ方法（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により分析することによって、決定され得る。血清セルロプラスミン活性は、例えば、Ｓｃｈｏｓｉｎｓｋｙ（Clinical Chemistry 1974; 20(12): 1556-1563）により記載されているように、基質としてｏ－ジアニシジンジヒドロクロリド（４，４’－ジアミノ－３，３’－ジメトキシ－ビフェニル）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳａｎＬｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ）を用いて、分光光度計において５４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定され得る。血清および尿中の銅含有量は、例えば、原子吸光分析（ＳＩＭＡＡ６０００、Ｐｅｒｋｉｎ－ＥｌｍｅｒＧｍｂＨ、Ｂｏｄｅｎｓｅｅｗｅｒｋ製）により、誘導結合プラズマ質量分析により、またはＥｘｏｖａ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、ＵＫ）により、決定され得る。加えて、血液試料は、セルロプラスミンの銅結合型と非銅結合型の両方のレベルについて、ウェスタンブロットにより評価され得る。

加えて、マウスのＡＡＶでの処置後、ＡＴＰ７ＢＡＡＶでの処置が結果として、ＡＴＰ７Ｂ発現の増加を生じ得ることを示すために、ＡＴＰ７Ｂの発現レベルが、様々なＰＣＲおよび／またはシーケンシング方法を使用して、経時的にモニターされ得る。ノーザンブロット分析およびインサイチューハイブリダイゼーションもまた、ＡＴＰ７Ｂ発現をｉｎｖｉｖｏで分析するために使用することができる。ＡＴＰ７ＢｍＲＮＡ発現の増加がＡＴＰ７Ｂタンパク質の増加と相関することを示すために、ＡＴＰ７Ｂタンパク質のレベルもまた、処置後、モニターされ得る。ＡＴＰ７Ｂタンパク質は、様々な方法を使用してアッセイすることができ、その方法には、ウェスタンブロット分析、免疫組織化学法、免疫蛍光組織化学法、および／またはＥＬＩＳＡアッセイが挙げられるが、それらに限定されない。

動物は、ベクター投与後６～７ヶ月目に屠殺され、肝臓が、組織学的分析のために切除され得る。肝臓の銅含有量は、乾燥した肝臓組織において、例えば、原子吸光分析（ＳＩＭＡＡ６０００、Ｐｅｒｋｉｎ－ＥｌｍｅｒＧｍｂＨ、Ｂｏｄｅｎｓｅｅｗｅｒｋ製）により、およびＴｉｍｍの硫化銀染色（Danscher G. and Zimmer J. Histochemistry 1978; 55(1): 27-40）により、決定され得る。肝臓構造は、例えば、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された切片において、評価され得る。抗マウスＣＤ４５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＵＳＡ；カタログ番号１０３１０２）での免疫組織化学法は、肝臓において炎症性浸潤を検出するために実施され得る。加えて、抗マウスＰａｎＣｋ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１８－０１３２、クローンＡＥ１／ＡＥ３）での免疫組織化学法もまた、胆管細胞を検出するために実施され得る。肝線維症は、コラーゲン決定のための方法としての通常のシリウスレッド染色を使用して決定され得る。

発現カセットを含むＡＡＶの異なる用量もまた、各遺伝子治療処置の安全性および有効性プロファイルを決定するためにマウスへ投与され得る。これらの前臨床研究はまた、ウィルソン病を処置するために使用するための遺伝子治療の最適な用量についての情報を提供し得る。

（実施例８）
ＡＡＶ８により送達されるＡＴＰ７Ｂの肝臓発現
ＡＴＰ７Ｂヌルマウスを、マウスＡＴＰ７Ｂのコード領域のエクソン２へ停止コドンを挿入することにより作製した（ＡＴＰ７ＢＫＯ）。ＡＡＶ８ウイルスを、三重トランスフェクションを使用する接着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより、産生し、ＡＡＶ５カプシドタンパク質でシュードタイプ化させた。組換えベクターを、超遠心およびカラムクロマトグラフィーにより精製し、その後、バイアル化の前に滅菌濾過した。Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（およそ８週齢）に、様々な調節エレメント（配列番号２４、６６、６７、６８、６９、および７０）の制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウスまたは２×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でＡＡＶ８を、尾静脈を介して静脈内に注射した。ウイルス送達から４週間後、肝臓を回収した。４ミリメートルの肝臓パンチを、肝臓右側葉から採取し、ＲＮＡ試料をこれらの試料から採取した。ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子発現のレベルを確立するためにＲＮＡ試料を使用して、ＱＰＣＲ分析を実施した。簡単に述べれば、ＲＮｅａｓｙキットを使用して、肝臓試料からＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶファーストストランド合成システム（ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍ）を使用して、入力ＲＮＡ試料からｃＤＮＡを生成した。ＱＰＣＲ反応を、ＫＡＰＡＳＹＢＲＦａｓｔｑＰＣＲマスターミックスを使用して、製造会社のプロトコールに従って、設定し、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６システムにおいて実施した。発現レベルを、内部対照としてＧＡＰＤＨを使用して、標準化した。注射されたウイルスの濃度について標準化した場合、配列番号２４および配列番号６７候補を有するプロモーター候補が、全ての試験された候補の中で最も高いレベルのＡＴＰ７Ｂ発現を示すことが観察された（図８）。ＰＢＳ処理された動物由来の肝臓試料を使用して、ｈＡＴＰ７ＢＲＮＡの検出可能なレベルは、観察されなかった。

ＡＴＰ７Ｂタンパク質発現をまた、ウェスタンブロット分析により測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。ウイルス送達から５ヶ月後、肝臓を回収した。４ミリメートルの肝臓パンチを、肝臓右側葉から採取し、液体窒素中に凍結させた。肝臓パンチ（動物あたり１個）を、溶解緩衝液中に浸して、タンパク質を遊離させ、可溶化した。可溶化液を遠心分離して、透明にした後、ウェスタンブロッティング分析を実行してＡＴＰ７Ｂ発現を測定した。全タンパク質のおよそ１５マイクログラムを、ウェスタンブロッティングのためにゲルに添加し、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の検出のためにＡｂｃａｍ組換え抗ＡＴＰ７Ｂ抗体（ＥＰＲ６７９３、カタログ番号ａｂ１３１２０８）を使用した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ雄と雌の両方においてロバストかつ持続的なＡＴＰ７Ｂ発現をもたらした（図９）。カスパーゼ３タンパク質存在量にも切断にも明らかな差は観察されなかった。各レーンは、ラベルされた群における個々の動物由来の試料を表した。

ＡＴＰ７Ｂタンパク質発現をまた、ＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ分析により測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。ウイルス送達から５ヶ月後、肝臓を回収した。４ミリメートルの肝臓パンチを、肝臓右側葉から採取し、液体窒素中に凍結させた。肝臓パンチ（動物あたり１個）を、溶解緩衝液中に浸して、タンパク質を遊離させ、可溶化した。可溶化液を遠心分離して、透明にした後、ＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ分析を実行してＡＴＰ７Ｂ発現を測定した。研究試料を、抗ＡＴＰ７ＢｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）コーティング化ＭＳＤプレート上に標準曲線と並べてプレーティングし、サンドイッチＥＬＩＳＡ形式で二次抗ＡＴＰ７ＢｐＡｂ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、検出した。その後、ＳＵＬＦＯＴＡＧレポーター抗体（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）をプレートに加えた。１×読み取り緩衝液を加えた時点に、読み出しが起こり、プレートをＭＳＤ機械上で読み取った。ＡＴＰ７Ｂの試料濃度は、標準曲線に対して電気化学発光シグナルを逆算することにより得られた。ウイルス処置は、雄と雌の両方のＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおいてロバストかつ持続的なＡＴＰ７Ｂ発現をもたらした（図１０Ａおよび１０Ｂ）。

最後に、ｉｎｖｉｖｏ肝臓ベクターコピー数を測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。ウイルス送達から５ヶ月後、肝臓を回収し、上記のように、肝臓パンチを採取し、処理して、ゲノムＤＮＡ調製物を作製した。ウイルスＤＮＡ含有量を、生じたゲノムＤＮＡ調製物において定量化した。マウス肝臓ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ血液＆組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した。ＤＮＡ量を、ＵＶ分光光度計を使用して決定し、標準化した。２０ｎｇの肝臓ＤＮＡを、ｄｄＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘｆｏｒＰｒｏｂｅｓ（ｎｏｄＵＴＰ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）ならびにＡＴＰ７Ｂコドン最適化配列の領域に対して方向づけられたＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブと共に２０μｌ反応物に加えた。液滴を発生させ、鋳型を自動液滴発生装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびサーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して増幅した。ＰＣＲ後、試料を、ＱＸ２０００液滴リーダーに添加し、それにより読み取って、肝臓におけるベクターコピー数を決定した。マウスゲノムＴｆｒｃ（Ｔｆｒｃ）配列（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、ゲノムＤＮＡ含有量を標準化するための内部対照としての役割を果たし、同じ反応において増幅された。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ雄と雌の両方の動物の肝臓においてロバストかつ持続的なウイルス含有量をもたらした（図１１）。ＴａｑＭａｎ（商標）コピー数参照アッセイ、マウス、Ｔｆｒｃ；カタログ番号：４４５８３６７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、コピー数分析に使用した。

（実施例９）
ＡＴＰ７Ｂのウイルス投与がＡＴＰ７ＢＫＯ動物において肝毒性を減らす
ＡＴＰ７Ｂ動物における肝損傷を評価するために、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性を測定した。ＡＬＴ活性は、一般に使用される、肝臓傷害についての血清バイオマーカーであり、ＡＬＴ活性の増加が進行中の肝損傷を示唆する。ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。血清試料を、ウイルス注射後３週間ごとに、注射後の最初の３ヶ月間、採取した。最終血清試料もまた、剖検手順中に採取した。ＡＬＴ測定を、血清試料に関して実行した。ＡＬＴ活性を、製造会社のマニュアルに従って臨床アナライザーを使用して、測定した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物においてＡＬＴの誘導を有意に減らし、ＡＴＰ７ＢＫＯモデルにおける肝臓傷害の正常化を示唆した（図１２）。

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は、別の一般に使用される、動物における肝臓傷害についての血清バイオマーカーであり、ＡＳＴ活性の増加が進行中の肝損傷を示唆する。ＡＴＰ７Ｂ動物において肝損傷を評価するためにＡＳＴ活性を測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。血清試料を、ウイルス注射後３週間ごとに、注射後の最初の３ヶ月間、採取した。最終血清試料もまた、剖検手順中に採取した。ＡＳＴ測定を、血清試料に関して実行した。ＡＬＴ活性を、製造会社のマニュアルに従って臨床アナライザーを使用して、測定した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物においてＡＳＴの誘導を有意に減らし、ＡＴＰ７ＢＫＯモデルにおける肝臓傷害の正常化を示唆した（図１３）。

野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウス肝臓をまた、炎症、線維症、および大細胞変化について評価した。マウスを、上記のように、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有するＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照で処置した。最終血清試料を、ウイルス注射から５ヶ月後、採取した。最終血清試料を、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルブミン、ビリルビン、コレステロール、およびグルコースのレベル測定を含む、肝臓傷害および代謝機能を測定するための包括的血清化学パネル分析に供した。血清化学パネル分析を、製造会社のマニュアルに従って臨床アナライザーを使用して実施した。広範囲の生化学的変化が、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物において観察された。ＡＴＰ７Ｂバリアント３を含有するＡＡＶ８での処置は、これらの変化をＷＴレベルへ戻して、完全に正常化した（図１４）。

ＴＩＭＰ１タンパク質存在量についてのＥＬＩＳＡ分析もまた、最終血清試料にマウスＴＩＭＰ１ＥＬＩＳＡキット（ＳｉｇｍａＲＡＢ０４６８－１ＫＴ）を使用して、製造会社の使用説明書に基づき、実施した。ＴＩＭＰ１は、肝臓線維症についての血清に基づいたバイオマーカーである。血清ＴＩＭＰ１の有意な増加が、ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物において観察され、進行中の肝臓線維症と一致した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物において血清ＴＩＭＰ１レベルをＷＴレベルへ戻して、完全に正常化した（図１５）。

（実施例１０）
ＡＴＰ７Ｂのウイルス投与が、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物における銅濃度の増加を減らす
ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。尿試料を、ウイルス注射から２１週間後、採取した。銅濃度を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＳｃｉｅｘＥｌａｎ６０００ＩＣＰ質量分析計を用いて、製造会社のマニュアルに従い、誘導結合型プラズマ質量分析により測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯ動物由来の尿銅濃度は、ＷＴ動物と比較して、有意に増加した。しかしながら、ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯマウスで観察された尿中銅濃度の増加を実質的に減らした（図１６）。

銅濃度をまた、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有するＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を注射されたＡＴＰ７ＢＫＯマウスの最終血清および脳試料において測定した。最終の血清および脳試料を、ウイルス注射から５ヶ月後、採取し、銅測定を実施した。ＡＴＰ７ＢＫＯ動物は、血清と脳の両方において銅レベルの増加を示した。しかしながら、ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物で観察された銅含有量の増加を正常化した（図１７および１８）。

ＷＴおよびＡＴＢ７ＢＫＯマウスにおいて銅沈着レベルを評価するために、肝臓組織をまた、ローダニン（rhodanine）色素で染色した。ローダニンは、組織切片におけるタンパク質性銅沈着に対する強い親和性を有するキレート試薬であり、ウィルソン病患者試料において銅沈着を検出するために一般に使用される。ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける肝臓組織を、ウイルス注射から５ヶ月後、組織像分析のために処理した。組織を回収し、２４時間、ホルマリン固定し、その後、パラフィン包埋し、５ｕｍ厚さ切片に切断した。パラフィン切片を脱パラフィンし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）、ローダニン、および抗アルファＳＭＡで染色した。日常的な組織診断を、J.A. Keirnan, Histological and Histochemical Methods 5th Edition、Ｈ＆Ｅ１４９～５０ページ、ＰＳＲ１９０～１ページ、およびローダニン３３１ページにおける手順に従って実施した。免疫組織化学法について、脱パラフィン後、組織を、ｐＨ６クエン酸緩衝液中、９５℃で熱賦活し、その後、抗アルファＳＭＡ（ａｂｃａｍａｂ５６９４）で染色し、それを抗ウサギ－ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＡ１６１１０）、続いて、ＡｋｏｙａＴＳＡ－Ｆｉｔｃを使用して検出した。組織を、ＡｋｏｙａＰｏｌａｒｉｓにおいて２０×倍率で画像化した。ＤＡＰＩ染色は、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒにおける核セグメンテーションおよび計数を可能にし、アルファＳＭＡ染色のエリアを定量化し、核計数に対して標準化した。ローダニン染色は、ＷＴ動物由来の肝臓組織と比較して、ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物由来の肝臓組織が、銅沈着の有意な増加を示し、銅蓄積が、ウィルソン病肝臓の主な特徴であるという事実と一致した。しかしながら、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有するＡＡＶ８ウイルスでの処置は、ＡＴＰ７ｂＫＯマウスの肝臓における銅沈着を減らした（図１９）。

野生型およびＡＴＰ７ＢＫＯマウス肝臓をまた、炎症、線維症、および大細胞変化について評価した。マウスを、上記のように、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有するＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照で処置した。ＷＴおよびＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおける肝臓組織を、ウイルス注射から５ヶ月後、組織像分析のために処理した。独立した病理学者による盲検病理評価により、ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物における肝臓炎症の増加、線維症の増加、および大細胞変化が浮き彫りにされた。ウイルス処置は、これらの変化をＷＴレベルへ戻して、完全に正常化した。肝臓炎症のスコアリングは、０から４までの昇順スケール：０（存在なし）、１（軽度）、２（中程度）、３（顕著）、および４（重度）を使用する、この研究（Brunt, Hepatology 31(1): 241-246 (2000)）に基づいたスコアリングシステムに従っている。肝臓線維症のスコアリングは、０から４までの昇順スケールを使用する、この研究（T. Gilat et al., Hepatology 38(2): 436-442 (2003)）に基づいたスコアリングシステムに従っている。大細胞変化のスコアリングは、０から４までの昇順スケールを使用する、この研究（B. Thoolen et al., Toxicologic Pathology 38(7): 5S-81S (2010)）に基づいたスコアリングシステムに従っている。図における各ドットは、個々の動物についてのスコアリングを表す（図２０）。

（実施例１１）
ＡＴＰ７Ｂのウイルス投与はＡＴＰ７ＢＫＯ動物における肝臓傷害を減らす
ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。注射から５ヶ月後、上記のように、肝臓組織を組織像分析のために処理した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物における免疫細胞浸潤の誘導を有意に減らした（図２１Ａ）。

肝臓組織をまた、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）で、ＰＳＲ染色キット（Ａｂｃａｍａｂ１５０６８１）に記載された標準染色手順を使用して、染色した。ＰＳＲ染色は、ＷＴ動物由来の肝臓組織と比較して、ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物由来の肝臓組織が線維症（黒色矢印）の有意な増加を示すことを示した。しかしながら、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有するＡＡＶ８ウイルスでのウイルス処置が、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物における免疫細胞浸潤の誘導を正常化した（図２１Ｂ）。

肝臓組織をさらに、アルファ－ＳＭＡ染色分析に供した。アルファ－ＳＭＡは、活性化肝星細胞についてのマーカーであり、陽性シグナルは、進行中の肝臓傷害／線維性応答を示唆する。肝星細胞の顕著な活性化が、ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物において観察され（白色矢印により示されている）、進行中の肝臓線維症および免疫浸潤と一致した。配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有するＡＡＶ８ウイルスでのウイルス処置は、これらの変化をＷＴレベルへ戻して完全に正常化した（図２２）。

（実施例１２）
ＡＴＰ７ＢＫＯ動物におけるトランスクリプトーム分析
ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。ＲＮＡ試料を肝臓試料から採取し、全トランスクリプトーム分析を実施した。ポリアデニル化ＲＮＡシーケンシングライブラリを、ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑｓｔｒａｎｄｅｄｍＲＮＡ試料調製キットを使用して、製造会社のマニュアルに従って作製し、ＮｅｘｔＳｅｑ５００システム上でシーケンシングした。各試料について約２千万個のリードが生成された。リードマッピング、トランスクリプトームアセンブリ、および遺伝子発現分析を、Ｈｉｓａｔ２、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ、およびＤＥｓｅｑ２を用いて、それらのそれぞれのマニュアルに従って実施した。ＷＴ動物とＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物を比較して、複数の生物学的経路において有意な変化が同定された。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物における自然免疫経路および肝臓代謝経路のトランスクリプトームレベル変化をＷＴレベルへ戻して有意に正常化した。

主成分分析（Principle component analysis）（ＰＣＡ）もまた、トランスクリプトームデータセットに関して実施した。ＰＣＡ分析は、高次元のデータセットの類似度および分散を説明するために使用され、ＲＮＡシーケンシング試料の類似度を定義するための、すなわち、サブグループまたは異常値を同定するための、一般に使用される方法である。ＰＣＡ分析を、ＤＥＳｅｑ２ｐａｃｋａｇｅｉｎＲを使用して、ユーザーマニュアルに従って実施した。ＷＴ動物と比較して、ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物についてのトランスクリプトームシグネチャにおいて大きな変化が同定された。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物におけるトランスクリプトームシグネチャをＷＴレベルへ戻して正常化した。

ＲＮＡ試料を、トランスクリプトーム分析において発現差異を示す重要な遺伝子を確証するためにＱＰＣＲ分析にさらに供した。例には、Ｃｏｌ１Ａ１、Ｃｏｌ３Ａ１、Ｃｏｌ４Ａ１、Ｃｏｌ１６Ａ１が挙げられ、それらの全ては、コラーゲン合成および肝臓線維症について重要なコンポーネントをコードする遺伝子である。ＭＭＰ２は、細胞外マトリックスリモデリングにとって重要なメタロプロテイナーゼであり、肝臓線維症における線維形成促進性機能を有する。ＩＬ６は、炎症を制御するサイトカインであり、ＨＭＧＣＲは、肝臓におけるコレステロール生合成に関与する重要な酵素である。ＱＰＣＲ確証とトランスクリプトームプロファイリングデータの間で高い一貫性が観察され、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物は、肝臓線維症に関与するコラーゲン遺伝子および炎症促進性遺伝子の顕著な誘導、ならびにＨＭＧＣＲなどの代謝遺伝子の低下を示した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物における遺伝子発現プロファイルをＷＴレベルへ戻して正常化した（図２３）。

（実施例１３）
ＡＡＶ５およびＡＡＶ８マウスにおけるＡＴＰ７Ｂの肝臓発現
Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（およそ８週齢）に、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、１×１０^１１ｇｃ／マウス、５×１０^１１ｇｃ／マウス、または２．５×１０^１２ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８またはＡＡＶ５を、尾静脈を介して静脈内に注射した。ウイルス送達から４週間後、肝臓を回収した。４ミリメートルの肝臓パンチを、肝臓右側葉から採取し、ＲＮＡ試料をこれらの試料から採取した。ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子発現のレベルを確立するためにＲＮＡ試料を使用して、ＱＰＣＲ分析を実施した。簡単に述べれば、ＲＮｅａｓｙキットを使用して、肝臓試料からＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶファーストストランド合成システムを使用して、入力ＲＮＡ試料からｃＤＮＡを生成した。ＱＰＣＲ反応を、ＫＡＰＡＳＹＢＲＦａｓｔｑＰＣＲマスターミックスを使用して、マニュアルに従って、設定し、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６システムにおいて実施した。発現レベルを、内部対照としてＧＡＰＤＨを使用して標準化した。本発明者らは、ＡＡＶ８ウイルス投与が、最高レベルのＡＴＰ７Ｂ発現をもたらし、一方、ＡＡＶ５ウイルス投与もまた、ＡＴＰ７Ｂ発現の増加を示すことを観察した（図２４）。ＰＢＳで処置された動物由来の肝臓試料を使用して、検出可能なレベルのｈＡＴＰ７ＢＲＮＡは観察されなかった。ＡＴＰ７Ｂ構築物およびＧＡＰＤＨについてのこの研究に使用されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、上記の表７に列挙されている。

１×１０^１１ｇｃ／マウス、５×１０^１１ｇｃ／マウス、または２．５×１０^１２ｇｃ／マウスの濃度での、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント＃３（配列番号５）を含有するＡＡＶ８またはＡＡＶ５ウイルスを注射されたマウスにおいて、ｉｎｖｉｖｏ肝臓ベクターコピー数を測定した。ウイルス送達から４週間後、肝臓を回収し、上記のように処理して、ゲノムＤＮＡ調製物を作製した。生じたゲノムＤＮＡ調製物においてウイルスＤＮＡ含有量を定量化した。マウス肝臓ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ血液＆組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＤＮＡ量を、ＵＶ分光光度計を使用して、決定し、標準化した。２０ｎｇの肝臓ＤＮＡを、ｄｄＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘｆｏｒＰｒｏｂｅｓ（ｎｏｄＵＴＰ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）ならびにＡＴＰ７Ｂコドン最適化配列の領域に対して方向づけられたＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブと共に２０μｌ反応物に加えた。液滴を発生させ、鋳型を自動液滴発生装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）およびサーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して増幅した。ＰＣＲ後、試料を、ＱＸ２０００液滴リーダーに添加し、それにより読み取って、肝臓におけるベクターコピー数を決定した。マウスゲノムＴｆｒｃ（Ｔｆｒｃ）配列（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、ゲノムＤＮＡ含有量を標準化するための内部対照としての役割を果たし、同じ反応において増幅された。ウイルス処置は、ＷＴ動物の肝臓においてロバストかつ持続的なウイルス含有量をもたらした（図２５）。ＴａｑＭａｎ（商標）コピー数参照アッセイ、マウス、Ｔｆｒｃ；カタログ番号：４４５８３６７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、コピー数分析に使用した。

ＡＴＰ７Ｂタンパク質発現もまた、上記のようにＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ分析により測定した。Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（およそ８週齢）に、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有するＡＡＶ８もしくはＡＡＶ５、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して、異なる濃度で静脈内に注射した。ウイルス送達から４週間後、肝臓を処理し、ＡＴＰ７Ｂ発現を測定するために、ＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ分析を実行した。ウイルス処置は、ＷＴ動物において、用量依存性ＡＴＰ７Ｂ発現をもたらした（図２６）。

（実施例１４）
ＡＴＰ７ＫＯ動物におけるセルロプラスミン活性
セルロプラスミン活性は、肝臓ＡＴＰ７Ｂ活性についてのバイオマーカーであり、肝臓における正常な銅輸送／代謝に大きく依存する。ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、５×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。血清試料を、ウイルス注射後３週間ごとに採取した。セルロプラスミン活性を、セルロプラスミン比色活性キット（ＡｒｂｏｒａｓｓａｙｓＫ０３５－Ｈ１）を使用して、製造会社のマニュアルに従って測定した。ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物は、ＷＴ動物と比較して有意により低いセルロプラスミン活性を示した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物におけるセルロプラスミン活性欠損を正常化し、ＡＴＰ７ＢＫＯモデルにおける銅代謝の正常化を示した（図２７）。

配列番号２４、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３を含有するＡＡＶ５（５×１０^１２ｇｃ／マウス）またはＰＢＳ対照を静脈内（尾静脈）に注射された週齢４～６週間ＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおいて、セルロプラスミン活性を同様に測定した。血清試料を、ウイルス注射後３週間ごとに採取し、セルロプラスミン活性を上記のように測定した。ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物は、ＷＴ動物と比較して有意により低いセルロプラスミン活性を示し、一方、ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物におけるセルロプラスミン活性欠損を正常化した。これは、ＡＡＶ５ウイルスを投与されたＡＴＰ７ＢＫＯマウスについての銅代謝の正常化を確認した（図２８）。

（実施例１５）
ＡＴＰ７Ｂのウイルス投与はＡＴＰ７ＢＫＯ動物における肝毒性を減らす
配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３を含有するＡＡＶ８（５×１０^１１ｇｃ／マウス）またはＰＢＳ対照を静脈内（尾静脈）に注射された週齢４～６週間ＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおいて、ＡＬＴおよびＡＳＴ活性を測定した。血清試料を、ウイルス注射後３週間ごとに、注射後の最初の３ヶ月間、採取した。最終血清試料もまた、剖検手順中に採取した。ＡＬＴおよびＡＳＴ測定を、上記で論じられているように血清試料に関して実行した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物においてＡＬＴおよびＡＳＴの誘導を有意に減らし、ＡＴＰ７ＢＫＯモデルにおける肝臓傷害の正常化を示唆した（図２９および３０）。

配列番号２４、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３を含有するＡＡＶ５（５×１０^１２ｇｃ／マウス）またはＰＢＳ対照を静脈内（尾静脈）に注射された週齢４～６週間ＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおいて、ＡＬＴおよびＡＳＴ活性を同様に測定した。血清試料を、ウイルス注射後３週間ごとに、注射後の最初の３ヶ月間、採取した。最終血清試料もまた、剖検手順中に採取した。ＡＬＴおよびＡＳＴ測定を、上記で論じられているように血清試料に関して実行した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物においてＡＬＴおよびＡＳＴの誘導を有意に減らし、ＡＴＰ７ＢＫＯモデルにおける肝臓傷害の正常化を示唆した（図３１および３２）。

次に、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３を含有するＡＡＶ５（２×１０^１２ｇｃ／マウスまたは５×１０^１２ｇｃ／マウス）またはＰＢＳ対照を静脈内（尾静脈）に注射された４～６週齢ＡＴＰ７ＢＫＯマウスにおいて、ＡＬＴおよびＡＳＴ活性を測定した。血清試料を、ウイルス注射後３～４週間ごとに採取した。ＡＬＴおよびＡＳＴ測定を、上記で論じられているように血清試料に関して実行した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物においてＡＬＴおよびＡＳＴの誘導を有意に減らし、ＡＴＰ７ＢＫＯモデルにおける肝臓傷害の正常化をさらに確認した（図３３および３４）。

ＴＩＭＰ１タンパク質存在量についてのＥＬＩＳＡ分析もまた、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３を含有するＡＡＶ８（５×１０^１１ｇｃ／マウス）またはＰＢＳ対照を静脈内（尾静脈）に注射されたＡＴＰ７ＢＫＯマウス由来の血清試料に実施した。マウスＴＩＭＰ１ＥＬＩＳＡキット（ＳｉｇｍａＲＡＢ０４６８－１ＫＴ）を、製造会社のマニュアルに従って使用した。ＴＩＭＰ１は、肝臓線維症についての血清に基づいたバイオマーカーである。血清ＴＩＭＰ１の有意な増加が、ＰＢＳで処置されたＡＴＰ７ＢＫＯ動物において観察され、進行中の肝臓線維症と一致した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物において血清ＴＩＭＰ１レベルをＷＴレベルへ戻して、完全に正常化した（図３５）。

（実施例１６）
ＡＴＰ７Ｂのウイルス投与はＡＴＰ７ＢＫＯ動物における銅濃度の増加を減らす
ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、５×１０^１１ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ８、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。尿試料を、ウイルス注射から３週間後、採取した。銅濃度を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＳｃｉｅｘＥｌａｎ６０００ＩＣＰ質量分析計を用いて、製造会社のマニュアルに従って、誘導結合型プラズマ質量分析により測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯ動物由来の尿銅濃度は、ＷＴ動物と比較して、有意に増加した。しかしながら、ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯマウスで観察された尿中銅濃度の増加を実質的に減らした（図３６）。

尿銅濃度をまた、ＡＡＶ５ウイルスを注射されたマウスにおいて測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、５×１０^１２ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ５、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。尿試料を、注射から１６週間後、採取した。銅濃度を、上記のように測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯ動物由来の尿銅濃度は、ＷＴ動物と比較して、有意に増加し、ウイルス処置は、尿中銅濃度を有意に正常化した（図３７）。

その後、ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ週齢４～６週間）に、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、２×１０^１２ｇｃ／マウスまたは５×１０^１２ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ５、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。尿試料を、注射から４週間後、採取した。銅濃度を、上記のように測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯ動物由来の尿銅濃度は、ＷＴ動物と比較して、有意に増加し、ウイルス処置は、尿中銅濃度を有意に正常化した（図３８）。

（実施例１７）
ＡＡＶ５マウスにおけるＡＴＰ７Ｂの肝臓発現
ＡＴＰ７Ｂノックアウト（ＫＯ）マウス（およそ週齢４～６週間）に、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有するＡＡＶ５（２×１０^１２ｇｃ／マウスまたは５×１０^１２ｇｃ／マウス）、またはＰＢＳ対照を、静脈内（尾静脈）に注射した。ウイルス送達から８週間後、肝臓を処理し、ＲＮＡｌａｔｅｒ試薬中に保存した。保存された肝臓試料からＲＮＡ試料を精製し、ＡＴＰ７Ｂバリアント３についての転写物存在量を、上記のようにＱＰＣＲにより定量化した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物において用量依存性ＡＴＰ７Ｂ発現をもたらした（図３９）。

ＡＴＰ７Ｂタンパク質発現を、上記のようにＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ分析により測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、５×１０^１２ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ５、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。ウイルス送達から５ヶ月後、肝臓を上記のように処理し、ＡＴＰ７Ｂ発現を測定するためにＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ分析を実行した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物においてロバストかつ持続的なＡＴＰ７Ｂ発現をもたらした（図４０）。

ＡＴＰ７Ｂタンパク質発現もまた、５×１０^１２ｇｃ／マウスまたは２×１０^１２ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ５を投与されたマウスにおいて、ＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ分析により測定した。ＡＴＰ７Ｂノックアウト（ＫＯ）マウス（およそ４～６週齢）に、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有するＡＡＶ５、またはＰＢＳ対照を、静脈内（尾静脈）に注射した。ウイルス送達から４週間または８週間後、肝臓を上記のように処理し、ＡＴＰ７Ｂ発現を測定するために、前に記載されているようにＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ分析を実行した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ動物において用量依存性ＡＴＰ７Ｂ発現をもたらした（図４１）。

ＡＴＰ７Ｂタンパク質発現をまた、ウェスタンブロット分析により測定した。ＡＴＰ７ＢＫＯマウス（およそ４～６週齢）に、配列番号２４、配列番号６７を有するプロモーターの制御下のＡＴＰ７Ｂバリアント３（配列番号５）を含有する、５×１０^１２ｇｃ／マウスの濃度でのＡＡＶ５、またはＰＢＳ対照を、尾静脈を介して静脈内に注射した。ウイルス送達から５ヶ月後、肝臓を回収した。４ミリメートルの肝臓パンチを、肝臓右側葉から採取し、液体窒素中に凍結させた。肝臓パンチ（動物あたり１個）を、溶解緩衝液中に浸して、タンパク質を遊離させ、可溶化した。可溶化液を遠心分離して、透明にした後、ＡＴＰ７Ｂ発現を測定するためにウェスタンブロッティング分析を実行した。全タンパク質のおよそ１５ｕｇを、ウェスタンブロッティングのためにゲルに添加し、ＡＴＰ７Ｂタンパク質の検出のためにＡｂｃａｍ組換え抗ＡＴＰ７Ｂ抗体（ＥＰＲ６７９３、カタログ番号ａｂ１３１２０８）を使用した。ウイルス処置は、ＡＴＰ７ＢＫＯ雄と雌の両方においてロバストかつ持続的なＡＴＰ７Ｂ発現をもたらした（図４２）。

本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、かつ記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者に明らかであろう。多数のバリエーション、変化、および置換が今、本発明から逸脱することなく、当業者の頭に浮かぶであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明を実践するのに用いられ得ることは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法と構造およびそれらの等価物がそれらにより包含されることが意図される。

Claims

配列番号６６～６８のいずれか１つに対して少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するプロモーター配列を含む調節エレメント、および
前記調節エレメントに作動可能に連結した治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列
を含む核酸分子。
前記治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、もしくは第ＸＩＩ因子、またはそれらのバリアントもしくは機能的断片のうちいずれか１つをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
前記治療用導入遺伝子が、肝臓における発現のためにコドン最適化されているバリアントヌクレオチド配列を含む、および／または
前記治療用導入遺伝子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからの発現のために最適化されているバリアントヌクレオチド配列を含む、請求項１または請求項２に記載の核酸分子。
前記調節エレメントがプロモーター配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
前記調節エレメントが１５０未満のｂｐ、１２０未満のｂｐまたは１０５未満のｂｐの長さである、請求項４に記載の核酸分子。
エンハンサー配列をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
前記調節エレメントが、哺乳動物細胞中でＣＭＶプロモーターと比較して少なくとも１０倍または少なくとも５０倍大きな発現を生じる、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
前記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列である、請求項８に記載の核酸分子。
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列がＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を含む、請求項９に記載の核酸分子。
請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
ウイルスベクターである、請求項１１に記載の発現ベクター。
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターを含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１１から１３のいずれか一項に記載の発現ベクターを含むウイルス粒子。
前記ウイルス粒子がＡＡＶのカプシドタンパク質を含む、請求項１４に記載のウイルス粒子。
前記ＡＡＶがＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を含む、請求項１５に記載のウイルス粒子。
請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１１から１３のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の発現ベクター、または請求項１４から１６のいずれか一項に記載のウイルス粒子、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
請求項１４から１６のいずれか一項に記載のウイルス粒子を産生するプロセスであって、
（ｉ）請求項１７に記載の宿主細胞を培養培地中で培養すること、および
（ｉｉ）細胞培養上清または前記宿主細胞から前記ウイルス粒子を回収すること
を含む、プロセス。
前記宿主細胞が、（ａ）ＡＡＶｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子をコードする核酸分子、ならびに／または（ｂ）ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸分子をさらに含む、請求項１９に記載のプロセス。
ウイルス粒子の産生のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１１から１３のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。