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CN113302290A - 治疗威尔逊氏病的组合物和方法 - Google Patents

治疗威尔逊氏病的组合物和方法 Download PDF

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CN113302290A
CN113302290A CN201980089235.3A CN201980089235A CN113302290A CN 113302290 A CN113302290 A CN 113302290A CN 201980089235 A CN201980089235 A CN 201980089235A CN 113302290 A CN113302290 A CN 113302290A
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atp7b
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斯蒂芬妮·塔利亚泰拉
安妮·坦侬豪斯
安德鲁·杨
陈思颖
张弛
斯蒂芬妮·马丁
大卫·奥伯科夫勒
维多利亚·黄
李建民
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Coding Therapy Co
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Abstract

本文提供了包含变体铜转运ATP酶2(ATP7B)核酸序列的核酸分子和载体。已经将这样的序列优化以在哺乳动物细胞、肝细胞中表达和/或从腺伴随病毒载体(AAV)表达，包括截短的和/或密码子优化的变体。还提供了包含这样的ATP7B变体核酸序列的病毒载体，及其用于治疗与ATP7B缺乏相关的病症如威尔逊氏病的方法。

Description

治疗威尔逊氏病的组合物和方法
交叉引用
本申请要求于2018年11月16日提交的美国临时申请号62/768,744的权益，该临时申请通过引用全文并入本文。
背景技术
威尔逊氏病(Wilson’s disease)是一种铜代谢的常染色体隐性遗传病。威尔逊氏病由铜转运ATP酶2(也称为ATP酶铜转运β)或ATP7B基因的突变引起。ATP7B主要在肝细胞中表达，并在铜的跨膜转运中发挥作用。ATP7B缺乏导致肝细胞向胆汁中排泄的铜减少，并导致铜在包括肝、脑和其他组织在内的各种组织中积累。威尔逊氏病的现有疗法涉及试图降低铜水平的非治愈性螯合方法。可以逆转潜在代谢缺陷的治疗策略如基因疗法将非常有利。但是，ATP7B基因约为4.4kB，接近许多基因疗法载体的包装大小极限，使得采用全长基因的基因疗法途径难以实现。需要可以在治疗水平上提供全长基因表达的基因疗法途径来应对威尔逊氏病。
发明内容
一方面，本申请提供了一种核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列具有(i)与SEQ ID NO：3或4至少80％的序列同一性，或(ii)与SEQ ID NO：5或6至少92％的序列同一性，其中所述核酸分子编码功能性ATP7B蛋白。在某些实施方案中，这样的核酸分子包含与SEQ ID NO：3或4具有至少85％的序列同一性、与SEQ ID NO：3或4具有至少90％的序列同一性或与SEQ ID NO：3-6中任一个具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列。在示例性实施方案中，这样的核酸分子包含具有SEQ ID NO：3-6中任一个的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本文提供的核酸分子进一步包含调控元件。在某些实施方案中，这样的调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少85％、90％、95％或100％同一性的序列。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子，其包含：(i)调控元件，该调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码功能性ATP7B蛋白的核苷酸序列，其中该核苷酸序列已被优化以在肝脏中从病毒载体表达。在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少85％、90％、95％或100％序列同一性的序列。在某些实施方案中，已经对编码功能性ATP7B蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化以在肝脏中表达。在某些实施方案中，已经对编码功能性ATP7B蛋白的核苷酸序列进行了优化以从AAV载体表达。在某些实施方案中，编码功能性ATP7B蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。
在某些实施方案中，本文提供的核酸分子编码ATP7B的功能片段。在其他实施方案中，本文提供的核酸分子编码全长ATP7B蛋白。在其他实施方案中，本文提供的核酸分子编码具有SEQ ID NO：2的ATP7B蛋白。
在某些实施方案中，本文提供的核酸分子导致肝脏中功能性ATP7B蛋白从该核酸分子的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高3倍。在其他实施方案中，肝脏中功能性ATP7B蛋白从该核酸分子的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高5倍或7倍。
在某些实施方案中，本文提供的核酸分子包含调控元件，其中该调控元件包含启动子序列。在某些实施方案中，相对于CMV启动子，该启动子序列在哺乳动物细胞中产生的表达至少高10倍或至少高50倍。在某些实施方案中，调控元件包含增强子序列。在某些实施方案中，调控元件小于150bp、120bp或105bp。
在某些实施方案中，本文提供的核酸分子进一步包含病毒的5’ITR和3’ITR序列。在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR序列是腺伴随病毒(AAV)序列。在某些实施方案中，AAV是AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。
另一方面，本申请提供了包含本文提供的任何核酸分子的表达载体。在某些实施方案中，该表达载体为病毒载体。在某些实施方案中，该病毒载体为AAV载体。
另一方面，本申请提供了包含本文提供的任何核酸分子或任何表达载体的病毒颗粒。在某些实施方案中，该病毒颗粒包含AAV的衣壳蛋白。在某些实施方案中，AAV是AAV5、AAV8或AAV9。
另一方面，本申请提供了包含本文提供的任何核酸分子或任何表达载体的宿主细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含本文所述的任何核酸分子、任何表达载体或任何病毒颗粒，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本申请提供了一种用于在受试者中增加功能性ATP7B蛋白的表达的方法，该方法包括向所述受试者施用本文所述的任何核酸分子、任何表达载体、任何病毒颗粒或任何药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种用于治疗与ATP7B缺乏相关的病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的任何核酸分子、任何表达载体、任何病毒颗粒或任何药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种用于治疗威尔逊氏病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的任何核酸分子、任何表达载体、任何病毒颗粒或任何药物组合物。
另一方面，本申请提供了本文所述的任何核酸分子、任何表达载体、任何病毒颗粒或任何药物组合物，用于增加受试者中功能性ATP7B的表达。
另一方面，本申请提供了本文所述的任何核酸分子、任何表达载体、任何病毒颗粒或任何药物组合物，用于治疗与ATP7B缺乏相关的病症。
另一方面，本申请提供了本文所述的任何核酸分子、任何表达载体、任何病毒颗粒或任何药物组合物，用于治疗威尔逊氏病。
另一方面，本申请提供了一种产生本文提供的病毒颗粒的方法，包括：(i)在培养基中培养本文提供的宿主细胞，以及(ii)从细胞培养上清液或宿主细胞收获病毒颗粒。在某些实施方案中，该宿主细胞进一步包含(a)编码AAV rep和/或cap基因的核酸分子，和/或(b)包含病毒辅助基因的核酸分子。
另一方面，本申请提供了本文所述的任何核酸分子或任何表达载体用于产生病毒颗粒的用途。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子，其包含：(i)调控元件，该调控元件包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少85％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少90％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该调控元件包含具有SEQ ID NO：66-68中的任一个的序列。在某些实施方案中，该调控元件包含SEQ ID NO：67。
在某些实施方案中，该治疗性转基因编码ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11、CDKL5、CNTNAP2、ZEB2、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI或因子XII中的任一个，或其变体或功能片段。在某些实施方案中，该治疗性转基因编码因子VIII，或其变体或功能片段。在某些实施方案中，该治疗性转基因编码ATP7B，或其变体或功能片段。在某些实施方案中，该治疗性转基因包含变体核苷酸序列，该变体核苷酸序列已被密码子优化以在肝脏中表达。在某些实施方案中，该治疗性转基因包含变体核苷酸序列，该变体核苷酸序列已被密码子优化以从AAV载体表达。在某些实施方案中，该治疗性转基因包含与SEQ IDNO：3-18中的任一个具有至少80％序列同一性的变体核苷酸序列。在某些实施方案中，该治疗性转基因包含与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少85％序列同一性的变体核苷酸序列。在某些实施方案中，该治疗性转基因包含与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少90％序列同一性的变体核苷酸序列。在某些实施方案中，该治疗性转基因包含与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少95％序列同一性的变体核苷酸序列。在某些实施方案中，该治疗性转基因包含SEQ ID NO：3-18中的任一个序列。在某些实施方案中，该治疗性转基因包含SEQID NO：5。
在某些实施方案中，调控元件是启动子序列。在某些实施方案中，核酸分子进一步包含增强子序列。
在某些实施方案中，调控元件小于150bp。在某些实施方案中，调控元件小于120bp。在某些实施方案中，调控元件小于105bp。
在某些实施方案中，相对于CMV启动子，该调控元件在哺乳动物细胞中产生的表达至少高10倍。在某些实施方案中，相对于CMV启动子，该调控元件在哺乳动物细胞中产生的表达至少高50倍。
在某些实施方案中，该治疗性转基因编码ATP7B的功能片段。在某些实施方案中，该治疗性转基因编码具有SEQ ID NO：2的ATP7B蛋白。
在某些实施方案中，肝脏中功能性ATP7B蛋白从变体核苷酸序列的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高5倍。在某些实施方案中，肝脏中功能性ATP7B蛋白从变体核苷酸序列的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高7倍。
在某些实施方案中，核酸分子进一步包含病毒的5’ITR和3’ITR序列。在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR序列是腺伴随病毒(AAV)序列。在某些实施方案中，5’ITR和3’ITRAAV序列是AAV2、AAV5、AAV8或AAV9序列。
另一方面，本申请提供了一种包含本文所述的任何核酸分子的表达载体，该核酸分子包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。在某些实施方案中，该表达载体为病毒载体。在某些实施方案中，该病毒载体为AAV载体。
另一方面，本申请提供了一种包含本文所述的任何核酸分子或表达载体的病毒颗粒，该核酸分子或表达载体包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。在某些实施方案中，该病毒颗粒包含AAV的衣壳蛋白。在某些实施方案中，该病毒颗粒包含AAV5、AAV8或AAV9的衣壳蛋白。
另一方面，本申请提供了一种包含本文所述的任何核酸分子的宿主细胞，该核酸分子包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
另一方面，本申请提供了一种包含核酸分子、表达载体或病毒颗粒以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，该核酸分子、表达载体或病毒颗粒包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
另一方面，本申请提供了一种用于在受试者中增加功能性ATP7B蛋白的表达的方法，该方法包括向所述受试者施用核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
另一方面，本申请提供了一种用于治疗与ATP7B缺乏相关的病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
另一方面，本申请提供了一种用于治疗威尔逊氏病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，用于增加受试者中功能性ATP7B的表达，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，用于增加对与ATP7B缺乏相关的病症的治疗，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，用于治疗威尔逊氏病，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
另一方面，本申请提供了一种产生病毒颗粒的方法，该方法包括(i)在培养基中培养宿主细胞，其中该宿主细胞包含表达载体，该表达载体包含(a)调控元件，其包含与SEQID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(b)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接，以及(ii)从细胞培养上清液或宿主细胞收获病毒颗粒。在某些实施方案中，该宿主细胞进一步包含(a)编码AAV rep和/或cap基因的核酸分子，和/或(b)包含病毒辅助基因的核酸分子。
另一方面，本申请提供了核酸分子或表达载体用于产生病毒颗粒的用途，该核酸分子或表达载体包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中该治疗性转基因与调控元件可操作地连接。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子，该核酸分子包含：(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ IDNO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：24具有至少85％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：24具有至少90％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：24具有至少95％序列同一性的序列。在某些实施方案中，其中该调控元件包含具有SEQ ID NO：24的序列。在某些实施方案中，该变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少85％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该变体核苷酸序列包含具有SEQ ID NO：5的序列。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子，该核酸分子包含：(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ IDNO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：67具有至少85％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：67具有至少90％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该调控元件包含与SEQ ID NO：67具有至少95％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该调控元件包含具有SEQ ID NO：67的序列。在某些实施方案中，该变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少85％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的序列。在某些实施方案中，该变体核苷酸序列包含具有SEQ ID NO：5的序列。
在某些实施方案中，变体核苷酸序列编码ATP7B的功能片段。在某些实施方案中，该变体核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2的ATP7B蛋白。
在某些实施方案中，该核酸分子进一步包含病毒的5’ITR和3’ITR序列。在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR序列是腺伴随病毒(AAV)序列。在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR序列是AAV2、AAV5、AAV8或AAV9序列。
另一方面，本申请提供了一种包含核酸分子的表达载体，该核酸分子包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。在某些实施方案中，该表达载体为病毒载体。在某些实施方案中，该病毒载体为AAV载体。
另一方面，本申请提供了一种包含核酸分子或表达载体的病毒颗粒，该核酸分子或表达载体包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。在某些实施方案中，该病毒颗粒包含AAV的衣壳蛋白。在某些实施方案中，AAV是AAV5、AAV8或AAV9。
另一方面，本申请提供了一种包含核酸分子或表达载体的宿主细胞，该核酸分子或表达载体包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
另一方面，本申请提供了一种包含核酸分子、表达载体或病毒颗粒的药物组合物，该核酸分子、表达载体或病毒颗粒包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本申请提供了一种用于在受试者中增加功能性ATP7B蛋白的表达的方法，该方法包括向所述受试者施用核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ IDNO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
另一方面，本申请提供了一种用于治疗与ATP7B缺乏相关的病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
另一方面，本申请提供了一种用于治疗威尔逊氏病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，用于增加受试者中功能性ATP7B的表达，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，用于增加对与ATP7B缺乏相关的病症的治疗，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物，用于治疗威尔逊氏病，该核酸分子、表达载体、病毒颗粒或药物组合物包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
另一方面，本申请提供了一种产生病毒颗粒的方法，该方法包括：(i)在培养基中培养宿主细胞，其中该宿主细胞包含核酸分子或表达载体，该核酸分子或表达载体包含(a)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(b)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白，以及(ii)从细胞培养上清液或宿主细胞收获病毒颗粒。在某些实施方案中，该宿主细胞进一步包含(a)编码AAV rep和/或cap基因的核酸分子，和/或(b)包含病毒辅助基因的核酸分子。
另一方面，本申请提供了核酸分子或表达载体用于产生病毒颗粒的用途，该核酸分子或表达载体包含(i)调控元件，其包含与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及(ii)变体核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
援引并入
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中特别地提出。通过参考以下对利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解。在这些附图中：
图1显示了野生型ATP7B(SEQ ID NO：1)与两个密码子优化的变体(变体2(SEQ IDNO：4)和变体3(SEQ ID NO：5))在HEK293细胞中的表达水平的比较。
图2显示了野生型ATP7B(SEQ ID NO：1)与两个密码子优化的变体(变体2(SEQ IDNO：4)和变体3(SEQ ID NO：5))在小鼠肝脏中的表达水平的比较。
图3A示出了包含不同调控元件(例如，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20)的质粒的标准化萤光素酶值，证明了调控元件对HEK293T细胞中萤光素酶表达的影响。例如，SEQ IDNO：21(包含与最小CMV(minCMV)启动子组合的SEQ ID NO：19)驱使萤光素酶的表达水平比单独minCMV启动子驱动的表达高约1.4倍，并且比SCP启动子驱动的表达高约60倍。
图3B示出了在HEK293T细胞中与SCP、minCMV和CAG相比，每个调控元件(例如，SEQID NO：21和SEQ ID NO：22)的大小标准化的活性(通过将标准化的萤光素酶活性除以碱基对中调控元件的长度来计算)。SEQ ID NO：22(包含连接至minCMV启动子的SEQ ID NO：20)导致的大小标准化的活性水平比单独minCMV启动子高约3.5倍，并且比SCP启动子高约140倍。
图3C示出了与阴性对照和阳性对照(SEQ ID NO：22)相比，调控元件SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39的标准化的萤光素酶表达。所有调控元件均导致高水平的标准化萤光素酶表达，该水平与由SEQ ID NO：22驱动的表达水平相当。
图3D示出了在HEK293T细胞中与阴性对照、阳性对照(SEQ ID NO：22)、CMV+CMVe和单独的CMV相比，调控元件SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的标准化的萤光素酶表达。与单独的CMV和CMV+CMVe相比，每个调控元件均驱动更高的萤光素酶表达。
图3E示出了在HEK293T细胞中与阴性对照相比，调控元件SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的标准化的萤光素酶表达。与阴性对照相比，测试的每个调控元件均驱动更高的萤光素酶表达。
图4示出了用表达盒处理的小鼠中ATP7B的相对表达(Log2)，该表达盒包含具有SEQ ID NO：23序列的调控元件，剂量为1E10(或1010)个基因组拷贝数/小鼠(gc/小鼠)、1E11(或1011)gc/小鼠或1E12(或1012)gc/小鼠。数据显示，包含SEQ ID NO:23的表达盒的剂量与体内ATP7B的表达呈正相关。
图5示出了用表达盒处理的小鼠中EGFP的相对表达(Log10)，该表达盒包含具有SEQ ID NO：26、27、23、25、22、33或24的序列的调控元件，并以5E11(或5x1011)gc/小鼠的剂量施用。数据显示，如通过RNA转录物测定的，调控元件导致小鼠肝脏中体内EGFP表达的水平升高。
图6示出了用表达盒处理的小鼠中表达GFP的肝细胞的百分比，该表达盒包含具有SEQ ID NO：26、27、23、25、22、33或24的序列的调控元件，并以5E11(或5x1011)gc/小鼠的剂量施用。数据显示，所测试的许多调控元件均在小鼠的高百分比的肝细胞中表达，其中SEQID NO：24在大于80％的肝细胞中表达。
图7示出了本公开内容的示例性表达盒、载体或质粒，其包含AAV ITR-L和ITR-R以及本公开内容的一个或多个相对短的人源调控元件(例如，SEQ ID NO：23-43)，该调控元件与大转基因(例如，ATP7B的密码子优化变体)可操作地连接。这羊的rAAV载体可以用于基因疗法治疗。
图8是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的小鼠肝脏中的相对mRNA表达的图。AAV8病毒含有标记浓度的在几个启动子元件的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图9A和图9B是蛋白质印迹分析，显示了在用AAV8病毒或PBS对照处理的雄性(图A)和雌性(图B)野生型和ATP7B KO小鼠的肝脏中的相对蛋白表达。AAV8病毒含有在具有SEQID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图10A和图10B是显示MSD-ELISA分析的图，显示了在雄性(图A)和雌性(图B)小鼠中，用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠的肝脏中的相对蛋白表达。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图11是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中每个二倍体基因组的载体拷贝数的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图12是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的丙氨酸转氨酶(ALT)活性的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。在ATP7B KO+PBS组与ATP7B KO+病毒组之间进行统计学检验(*＝p<0.05，****＝p<1E-5)。
图13是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的天冬氨酸转氨酶(AST)活性的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。在ATP7B KO+PBS组与ATP7B KO+病毒组之间进行统计学检验(**＝p<0.01，***＝p<0.001)。
图14A-图14C是一系列图，显示了用AAV8病毒或PBS对照处理的WT和ATP7B KO小鼠的肝损伤和代谢功能的血清化学分析。(A)ALP、ALT和AST；(B)ALB/Glob、白蛋白、结合胆红素和总胆红素；以及(C)胆固醇和葡萄糖。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图15是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的WT和ATP7B KO小鼠中的TIMP1蛋白水平的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图16是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理后21周，野生型和ATP7B KO小鼠中的尿铜浓度的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ IDNO：5)。
图17是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的WT和ATP7B KO小鼠中的终末血清铜水平的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图18是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的脑铜水平(干重)的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ IDNO：5)。
图19是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的肝脏罗丹明染色的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ IDNO：5)。
图20A-图20C是一系列图，显示了用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的炎症、纤维化和大细胞变化评分。(A)：炎症评分；(B)：纤维化评分，以及(C)：大细胞变化评分。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ IDNO：5)。
图21A和图21B显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的免疫细胞浸润。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ IDNO：5)。白色箭头表示免疫细胞浸润ATP7B KO小鼠。黑色箭头表示胶原纤维，由PBS处理的ATP7B KO小鼠肝组织中的纤维化造成。
图22显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的WT和ATP7B KO小鼠中的α-SMA染色。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。白色箭头表示在PBS处理的ATP7B KO小鼠中观察到的肝星状细胞的活化。
图23A(雄性)和图23B(雌性)是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的WT和ATP7B KO小鼠中基因的差异基因表达的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图24是显示在用不同浓度的AAV5、AAV8或PBS对照处理的小鼠中的ATP7B表达水平的图。AAV5和AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ IDNO：5)。
图25是显示在用不同浓度的AAV5或AAV8病毒或PBS对照处理的野生型小鼠中每个二倍体基因组的载体拷贝数的图。AAV5和AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图26是显示在用不同浓度的AAV5或AAV8病毒或PBS对照处理的野生型小鼠中的ATP7B蛋白浓度的图。AAV5和AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图27是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的铜蓝蛋白活性的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ IDNO：5)。
图28是显示在用AAV5病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的铜蓝蛋白活性的图。如所标记的，AAV5病毒含有在具有SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图29是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的丙氨酸转氨酶(ALT)活性的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图30是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的天冬氨酸转氨酶(AST)活性的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图31是显示在用AAV5病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的丙氨酸转氨酶(ALT)活性的图。如所标记的，AAV5病毒含有在具有SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图32是显示在用AAV5病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的天冬氨酸转氨酶(AST)活性的图。如所标记的，AAV5病毒含有在具有SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图33是显示在用不同浓度的AAV5病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的丙氨酸转氨酶(ALT)活性的图。AAV5病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图34是显示在用不同浓度的AAV5病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的天冬氨酸转氨酶(AST)活性的图。AAV5病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图35是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的WT和ATP7B KO小鼠中的TIMP1蛋白水平的图。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图36是显示在用AAV8病毒或PBS对照处理的WT和ATP7B KO小鼠中的尿铜水平的图。在注射病毒后三周收集尿液样品。AAV8病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图37是显示在用AAV5病毒或PBS对照处理的WT和ATP7B KO小鼠中的尿铜水平的图。在注射病毒后十六周收集尿液样品。如所标记的，AAV5病毒含有在具有SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图38是显示在用不同浓度的AAV5病毒或PBS对照处理的WT和ATP7B KO小鼠中的尿铜水平的图。在注射病毒后四周收集尿液样品。AAV5病毒含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图39是显示在用不同浓度的AAV5病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的剂量依赖性ATP7B表达的图。在注射病毒后八周测量RNA。AAV5病毒含有在具有SEQ IDNO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图40是显示在用AAV5病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的ATP7B蛋白浓度的图。如所标记的，AAV5病毒含有在具有SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图41是显示在用不同浓度的AAV5病毒或PBS对照处理的野生型和ATP7B KO小鼠中的ATP7B蛋白浓度的图。在注射病毒后四或八周测量蛋白质。AAV5病毒含有在具有SEQ IDNO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
图42A和图42B是蛋白质印迹分析，显示了在用AAV5病毒或PBS对照处理的雌性(图A)和雄性(图B)野生型和ATP7B KO小鼠的肝脏中的相对蛋白表达。如所标记的，AAV5病毒含有在具有SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。
具体实施方式
本文提供了ATP7B变体核苷酸序列，包含该序列的载体及其在治疗多种疾病和病症，特别是威尔逊氏病中的用途。
定义
如本文所用，除非上下文另外明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数个指代物。此外，就详细描述和/或权利要求中使用的术语“包括”、“具有”、“带有”或其变体而言，这些术语旨在是包含性的，类似于术语“包含”。在本文所述的任何实施方案中，“包含”可以被替换为“基本上由……组成”或“由……组成”。
术语“AAV”是腺伴随病毒的缩写，可用于指代病毒本身或其衍生物。该术语涵盖所有血清型、亚型、以及天然存在形式和重组形式，除非另有要求。缩写“rAAV”是指重组腺伴随病毒。术语“AAV”包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10及其杂合物，禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和羊AAV。AAV的各种血清型的基因组序列，以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。这样的序列可以在文献中或公共数据库如GenBank中找到。如本文所用，“rAAV载体”是指包含非AAV来源的多核苷酸序列(即与AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，该序列通常是用于细胞遗传转化的感兴趣的序列。通常，异源多核苷酸的侧翼是至少一个，并且通常是两个，AAV反向末端重复序列(ITR)。rAAV载体可以是单链(ssAAV)或自互补(scAAV)。“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”是指由至少一个AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸rAAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常称为“rAAV病毒颗粒”或简称为“rAAV颗粒”。
术语“约”或“大约”是指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，该误差范围部分将取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域的实践，“约”可以指在一个或多个标准偏差内。或者，“约”可以指给定值的至多20％、至多15％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。
术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”、“分析”及其语法等同形式在本文中可以互换使用，以指代任何形式的测量，并且包括确定元素是否存在(例如检测)。这些术语可以包括定量和/或定性确定。评估可以是相对的，也可以是绝对的。
术语“表达”是指从DNA模板转录核酸序列或多核苷酸的过程(例如翻译成mRNA或其他RNA转录物)和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。
“表达盒”是指核酸分子，其包含一个或多个与用于表达的编码序列(例如，一个或多个基因)可操作地连接的调控元件。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指本文所述的组合物的量，其足以影响预期的应用，包括但不限于如下定义的疾病治疗。治疗有效量可以根据预期的治疗应用(细胞内或体内)或所治疗的受试者和疾病状况而变化，例如，受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等，这很容易由本领域普通技术人员确定。该术语还适用于将在靶细胞中诱导特定应答的剂量。具体剂量将根据所选的特定组合物、要遵循的给药方案、是否与其他化合物联合施用、施用时间、该剂量所施用至的组织以及携带该剂量的物理递送系统而变化。
核苷酸或肽序列的“片段”是指小于被认为是“全长”序列的序列。
DNA或蛋白质序列的“功能片段”是指该序列的生物活性片段，比全长或参考DNA或蛋白质序列短，但保留至少一种与全长或参考DNA或蛋白质序列的生物活性基本相似的生物活性(在功能或结构上)。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已引入外源核酸的细胞，包括这样的细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而与传代次数无关。后代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，可能含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物学活性的突变后代包括在本文中。
术语“体外”是指在受试者体外发生的事件。例如，体外测定涵盖在受试者体外进行的任何测定运行。体外测定包括其中使用活细胞或死细胞的基于细胞的测定。体外测定还包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。
术语“体内”是指在受试者体内发生的事件。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常包含该核酸分子的细胞中所包含的核酸分子，但是该核酸分子以染色体外的方式存在，处于不同于其天然染色体位置的染色体位置，或者仅包含编码序列。
如本文所用，“可操作连接”、“可操作的连接”、“可操作地连接”或其语法等同物是指例如启动子、增强子、多聚腺苷酸化序列等遗传元件的并列，其中元件之间的关系允许它们以预期的方式发挥作用。例如，如果可包含启动子和/或增强子序列的调控元件帮助启动编码序列的转录，则该调控元件可操作地连接至编码区。只要维持这种功能关系，在调控元件与编码区之间可以有间插的残基。
“药学上可接受的运载体”是指药物制剂或组合物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的运载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指这样的制剂，其形式为允许其中包含的活性成分的生物活性是有效的，并且不包含对该制剂所施用于的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
通常，可以互换使用的“序列同一性”或“序列同源性”是指两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应性。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过确定它们的“同一性百分比”，也称为“同源性百分比”，来进行比较。与参考序列(例如，核酸或氨基酸序列)的同一性百分比可以计算为两个最佳比对序列之间精确匹配的数目除以参考序列的长度并乘以100。当确定序列同一性的匹配数目时，保守取代不被视为匹配。应当理解，在第一序列(A)的长度不等于第二序列(B)的长度的情况下，A：B序列的同一性百分比将与B：A序列的同一性百分比不同。序列比对，例如出于评估同一性百分比的目的，可以由任何合适的比对算法或程序来执行，包括但不限于Needleman-Wunsch算法(参见，例如，在万维网ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/上获得的EMBOSS Needlealigner)、BLAST算法(参见，例如，在万维网blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上获得的BLAST比对工具)、Smith-Waterman算法(参见，例如，在万维网ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/上获得的EMBOSS Water aligner)，以及Clustal Omega比对程序(参见，例如，万维网clustal.org/omega/和F.Sievers等人,Mol Sys Biol.7:539(2011))。可以使用所选算法的任何合适参数，包括默认参数，来评估最佳比对。BLAST程序基于Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268(1990)的比对方法，有关讨论见Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(1993)；和Altschul等人,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402(1997)。
术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，以指脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人类。本文所述的方法可用于人类治疗、兽医应用和/或疾病或病况的动物模型的临床前研究。
如本文所用，术语“治疗”、“疗法”等是指获得所需的药理和/或生理作用，包括但不限于减轻、延迟或减慢进展，减少影响或症状，预防发作，预防复发，抑制、减轻疾病或病症的发作，获得关于疾病、病症或医学状况的有益或期望结果，例如治疗益处和/或预防益处。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物特别是人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患疾病或有发展出该疾病的风险但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中预防该疾病的发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；以及(c)减轻疾病，即引起疾病消退。治疗益处包括根除或改善所治疗的潜在病症。同样，通过消除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理症状而获得治疗益处，使得在受试者中观察到改善，尽管受试者可能仍患有该潜在病症。在一些情况下，出于预防的目的，将组合物施用于有发展出特定疾病的风险的受试者，或报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使可能尚未对该疾病作出诊断。本公开内容的方法可以用于任何哺乳动物。在一些情况下，治疗可以减少或停止症状。预防作用包括延迟或消除疾病或病况的出现，延迟或消除疾病或病况的症状的发作，减慢、停止或逆转疾病或病况的进展，或其任何组合。
核苷酸序列的“变体”是指与最常见的野生型DNA序列(例如，cDNA或其GenBank登录号所引用的序列)或指定的参考序列相比具有遗传改变或突变的序列。
如本文所用，“载体”是指这样的核酸分子，其可用于介导与其连接的另一核酸分子向该另一核酸分子可得到复制或表达的细胞中的递送。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其所引入至的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。载体的其他实施例包括质粒和病毒载体。
除非另有说明，否则本文所用的所有术语具有对于本领域技术人员而言相同的含义，并且本发明的实施将采用分子生物学、微生物学和重组DNA技术中的常规技术，这些技术均属于本领域技术人员的知识范畴。
ATP7B变体
铜转运ATP酶2或ATP酶铜转运β(ATP7B)是一种P型阳离子转运ATP酶，通过将铜输出细胞而发挥作用。ATP7B负责将铜从细胞内伴侣蛋白转运到分泌途径中，以排泄到胆汁中且并入脱铜铜蓝蛋白(apo-ceruloplasmin)中，从而合成功能性铜蓝蛋白。ATP7B介导的铜转运涉及通过其胞质N末端域来结合铜，以及通过核苷酸结合域结合ATP。然后ATP水解，并且ATP7B变得在位于P域的D1027残基处被瞬间磷酸化。随后的脱磷酸化释放出将铜跨膜转运所需的能量。编码该人类酶的基因位于13号染色体(染色体位置13ql4.3；基因名称ATP7B)。对于ATP7B，已经描述了通过选择性剪接产生的五种同工型。同工型1(长1465个氨基酸)是最长的同工型，在本文中称为规范或野生型序列(NCBI参考序列：NP_000044.2；SEQID NO：1是野生型核苷酸序列，SEQ ID NO：2是本文所用的野生型氨基酸序列)。其他四种同工型为：NCBI参考序列NP_001005918.1、NP_001230111.1、NP_001317507.1、NP_001317508.1。
ATP7B具有八个跨膜域，它们形成穿过细胞膜进行铜转运的路径。ATP7B中存在几个保守基序，这些基序是P型ATP酶蛋白家族的特征。这些基序是ATP催化所必需的，包括包含ATP结合位点的核苷酸结合域(N域)、包含保守的天冬氨酸残基的磷酸化域(P域)和包含磷酸酶域的执行域(actuator domain，A域)。这些基序中存在高度保守的特征残基；N域中的SEHPL、P域中的DKTG和A域中的TGE。该蛋白质还包含铜通过膜转运所需的膜内CPC基序。ATP7B还具有较大的N端，带有六个金属结合域(MBD)(也称为金属结合位点(MBS)或重金属缔合(HMA)位点)，每个结合域包含大约70个氨基酸和高度保守的金属结合基序GMxCxxC(其中x是任何氨基酸)。这些MBD以每个MBD的一个Cu(I)原子的化学计量结合Cu(I)。ATP7B的这些氨基末端MBD与其功能的几个方面相关，包括铜易位、铜在铜酶(cuproenzyme)中的并入、ATP酶活性、定位和运输，以及蛋白质-蛋白质相互作用。从氨基端开始，MDB位点被鉴别为MBD 1域(野生型序列中的氨基酸59-125)、MBD 2域(氨基酸144-210)、MBD 3域(258-327)、MBD 4域(360-426)、MBD 5域(489-555)和MBD 6域(565-631)。
一方面，本申请提供了编码功能性ATP7B蛋白或ATP7B蛋白的功能片段的变体ATP7B核苷酸序列。可以使用任何合适的方法来确定ATP7B蛋白或其片段是否具有功能。在某些实施方案中，功能性ATP7B蛋白或其功能片段是能够表现出野生型蛋白的一种或多种活性，例如，在体外或体内测定中的催化活性和/或铜转运活性的功能性ATP7B蛋白或其功能片段。在某些实施方案中，与野生型ATP7B相比，功能性ATP7B蛋白或其功能片段具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的活性。用于测量ATP7B活性的体外测定的一个实例涉及一种酵母菌株，其中删除了内源性铜转运ATP酶CCC2，从而破坏铜向分泌区室的递送并使铜依赖性铁氧化酶Fet3失活。在这种菌株中表达功能性ATP7B蛋白或功能性片段可恢复Fet3活性。参见R.Tsivkovskii等人,J.Biol.Chem 77(2):976-983(2002)；J.R.Forbes等人,Am J HumGenet.63:1663-1674(1998)；G.Hsi等人,Hum Mutat 29:491-501(2008)；以及L.M.Luoma等人,Hum Mutat 31:569-577(2010)。用于测量ATP7B活性的另一种示例性体外测定包括在Sf9细胞中使用杆状病毒表达系统表达ATP7B或其变体，然后测量催化活性和铜(64Cu)向囊泡中的转运。参见例如，R.Tsivkovskii等人,J.Biol.Chem 77(2):976-983(2002)和D.Huster等人,Gastroenterology 142(4):947-956(2012)。在示例性实施方案中，功能性ATP7B蛋白或其功能片段是能够在体内测定(例如，如下所述的威尔逊氏病小鼠模型)中替代野生型蛋白的功能性ATP7B蛋白或其功能片段。各种终点可用于确定变体ATP7B是具有功能，包括例如，测量非铜蓝蛋白结合的铜(NCC或“游离铜”或铜指数)、血清转氨酶水平(ALT)、血清铜水平、24小时尿铜、肝铜水平以及诸如饮食铜耐受性、肝脏炎症、胆管增生和肝纤维化等各种因素的临床评估。用于评估ATP7B变体是否具有功能的示例性体内测定包括威尔逊氏病的各种动物模型，包括例如，Long Evans Cinnamon大鼠，其ATP7B基因有较大缺失(K.Terada等人,Pediatr Int.41(4):414-8(1999))；Jackson's toxic milk小鼠，其在ATP7B编码序列中具有点突变(E.A.Roberts等人,Mol Genet Metab.93(l):54-65(2008))；以及ATP7B小鼠(D.Huster D等人,Am J Pathol.168(2):423-34(2006))。可以使用标准方法来分析小鼠中的ATP7B活性，例如，(i)血清转氨酶(ALT)的水平可以使用Hitachi 747临床分析仪(Hitachi,Tokyo,Japan)通过DGKC方法(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)确定，(ii)如Schosinsky等人,Clinical Chemistry 20(12):1556-1563(1974)所述，血清铜蓝蛋白活性可以使用邻联茴香胺二盐酸盐(4,4’-二氨基-3,3’-二甲氧基-联苯)作为底物(Sigma-Aldrich,San Louis,MO,United States))并在分光光度计中测量540nm处的吸光度来测定，以及(iii)尿铜含量可以通过原子吸收光谱法(SIMAA6000,Perkin-Eimer GmbH,Bodenseewerk)确定。处死后，可切除肝脏以进行组织学测定和铜含量、炎症、胆管增生和纤维化的分析：(i)可通过原子吸收光谱法(SIMAA6000,Perkin-Elmer GmbH,Bodenseewerk)和Timm硫化银染色(G.Danscher和J.Zimmer,Histochemistry55(1):27-40(1978))测定干燥肝脏组织中的肝铜含量，(ii)可在经苏木精和曙红染色的切片中评估肝脏结构，(iii)采用抗小鼠CD45抗体(例如，BioLegend,San Diego,USA；目录号103102)进行的免疫组织化学法可用于检测肝脏中的炎症浸润，(iv)采用抗小鼠PanCk抗体(例如Invitrogen/Life Technologies,18-0132,克隆AE1/AE3)的免疫组织化学法可用于检测胆管细胞，以及(v)可以使用天狼猩红染色检测胶原蛋白来确定纤维化。参见例如，WO2016/097218、WO2017/103624和WO 2018/126116。通常，威尔逊氏病的ATP7B敲除小鼠模型涉及肝脏中严重的铜积累，这导致肝脏疾病，血清铜水平升高，最终尿铜水平升高至超过在杂合小鼠中观察到的水平。可以将ATP7B变体在这些体外和体内测定中的作用与野生型ATP7B对照进行比较，以寻找所需的作用以及功能活性。
在某些实施方案中，已经对本文所述的变体ATP7B核苷酸序列进行了密码子优化以增加表达。在示例性实施方案中，已经对这样的变体ATP7B核苷酸序列进行了密码子优化以增加在特定细胞或组织类型(例如，肝脏或肝细胞)中的表达。在某些实施方案中，经密码子优化的变体ATP7B序列的功能性ATP7B序列表达相对于来自未被密码子优化的核苷酸序列的相同功能性ATP7B蛋白表达增加至少约2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多倍。在一个实施方案中，经密码子优化的变体ATP7B序列的全长ATP7B序列(例如，SEQ ID NO：2)的表达相对于来自未被密码子优化的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)的全长ATP7B蛋白的表达增加至少约2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多倍。在示例性实施方案中，经密码子优化的变体ATP7B序列增加肝脏或肝细胞中功能性ATP7B序列的表达。当比较密码子优化序列和非密码子优化序列的表达水平时，应使用标准条件进行比较，例如相同或相似的表达载体、细胞类型、培养条件等。在某些实施方案中，经密码子优化的本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含与野生型ATP7B核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)具有小于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％或70％序列同一性的序列，并编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％相同的序列的蛋白质。在示例性实施方案中，经密码子优化的本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含与野生型ATP7B核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)具有小于80％序列同一性的序列，并编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)100％相同的ATP7B蛋白。在某些实施方案中，经密码子优化的本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含与野生型ATP7B核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)具有约60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％序列同一性的序列，并编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％相同的序列的蛋白质。在示例性实施方案中，经密码子优化的本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含与野生型ATP7B核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)具有70-80％序列同一性的序列，并编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)100％相同的ATP7B蛋白。
在某些实施方案中，本文提供的变体ATP7B核苷酸序列有至少350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、859、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425或1450，或约350-1200、350-1100、350-900、350-750、450-1200、450-1100、450-900、450-750、750-1100、750-1200、750-900、900-1200或900-1100个密码子与野生型序列(例如，SEQ ID NO：1)中相同位置上存在的密码子相比已被修饰。在某些实施方案中，本文提供的变体ATP7B核苷酸序列有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或约20-90％、20-80％、20-70％、20-60％、20-50％、20-40％、30-90％、30-80％、30-70％、30-60％、30-50％、40-90％、40-80％、40-70％、40-60％、40-50％、50-90％、50-80％、50-70％、50-60％、60-90％、60-80％或60-79％的密码子与野生型序列(例如，SEQ ID NO：1)中相同位置上存在的密码子相比已被修饰。在示例性实施方案中，经密码子优化的本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含有约500-1100个密码子与野生型序列(例如，SEQ ID NO：1)中相同位置上存在的密码子相比已被修饰的序列，并编码与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)100％相同的ATP7B蛋白。在示例性实施方案中，经密码子优化的本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含有约40-70％的密码子与野生型序列(例如，SEQ ID NO：1)中相同位置上存在的密码子相比已被修饰的序列，并编码与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)100％相同的ATP7B蛋白。
ATP7B序列可以使用本领域已知的任何方法进行密码子优化。例如，产生密码子优化的ATP7B序列可以使用可在线获得的方法(参见例如Integrated DNA Technologies(IDT))、可在万维网idtdna.com上获得的密码子优化工具或可在万维网cs.ubc.ca上获得的密码子优化器软件，使用已公开的方法(参见例如SM Richardson等人,GenomeResearch16:550–556(2006)；A.Villalobos等人,BMC Bioinformatics 7:285(2006)；W.Gao等人,Biotechnology Progress 20:443–448(2004)；S.Jayaraj等人,Nucleic AcidsResearch 33:3011–3016(2005)；G.Wu等人,Protein Expr Purif.47:441–445(2006)；M.Bode等人,Nucleic Acids Research.37:W214–221(2009)，D.Raab等人,Systems andSynthetic Biology 4:215–225(2010)；P.Gaspar等人,Bioinformatics 28:2683–2684(2012)；E.Angov等人,PloS One 3:e2189(2008)；A.Fuglsang,Protein Expr Purif.31:247–249(2003)；W.Qian等人,PLoS Genetics.8:e1002603(2012)；GW Hatfield和DA Roth,Biotechnology Annual Review 13:27–42(2007)；VP Mauro和SA Chappell,TrendsMol.Med.20(11):604-613(2014)；WO2015/-12924；US 2014/0032186和US 2006/0136184)，或使用提供密码子优化服务的公司(参见例如，万维网atum.bio上的ATUM，或万维网genscript.com上的GenScript)。在某些实施方案中，对编码ATP7B的核酸序列的一部分进行密码子优化。在示例性实施方案中，对编码ATP7B的全部序列进行密码子优化。
在某些实施方案中，本文描述的变体ATP7B核苷酸序列已被截短以编码ATP7B的功能片段或域。这样的截短的ATP7B变体核苷酸序列可用于构建包装容量小于约5kb的基因疗法载体，使得全长ATP7B基因接近或超过载体的包装容量。例如，AAV载体的包装容量为约4.7kb，全长ATP7B基因为约4.4kb，从而接近AAV载体的包装容量。在某些实施方案中，ATP7B变体核苷酸序列被截短至少100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或2000bp，或约100-2000bp、100-1500bp、100-1000bp、100-500bp、200-2000bp、200-1500bp、200-1000bp、200-500bp、500-2000bp、500-1500bp、500-1000bp、750-2000bp、750-1500bp、750-1000bp、1000-1500bp或1200-1500bp。在某些实施方案中，这样的变体ATP7B核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白，该蛋白已在N端、C端、ATP7B蛋白内不包含N端或C端的位置、或部分地在N端和C端被截短。在示例性实施方案中，变体ATP7B核苷酸序列编码已在N端被截短的功能性ATP7B蛋白。
在某些实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列已经被密码子优化和截短并且编码ATP7B蛋白的功能片段。在一个实施方案中，变体ATP7B序列已被截短至少100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或2000bp，或约100-2000bp、100-1500bp、100-1000bp、100-500bp、200-2000bp、200-1500bp、200-1000bp、200-500bp、500-2000bp、500-1500bp、500-1000bp、750-2000bp、750-1500bp、750-1000bp、1000-1500bp或1200-1500bp并编码ATP7B的功能片段，并且这样的变体序列已被密码子优化，以使功能性ATP7B片段的表达相对于来自未被密码子优化的核苷酸序列的等同ATP7B蛋白片段(例如，SEQ IDNO：1的片段)的表达增加至少约2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多倍。在示例性实施方案中，本文公开的变体ATP7B序列已在N端处被截短1-1000bp，编码功能性ATP7B片段，并且已被密码子优化以使在肝脏或肝细胞中的表达相对于未被密码子优化的等同ATP7B片段的表达增加至少5倍。
在某些实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含与SEQ ID NO：1-18中任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在示例性实施方案中，这样的变体ATP7B核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白或其片段。在示例性实施方案中，本文提供的变体ATP7B核苷酸序列是非天然存在的序列。
在一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在示例性实施方案中，这样的序列被密码子优化，并编码全长ATP7B蛋白(例如，具有SEQ ID NO：2)。在某些实施方案中，相对于来自未被密码子优化的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)的等同ATP7B蛋白的表达，这样的密码子优化的序列使ATP7B蛋白的表达增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多倍。在另一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含截短的SEQ ID NO：3，其编码ATP7B的功能片段。例如，在某些实施方案中，SEQ ID NO：3可被截短约100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或2000bp，或约100-2000bp、100-1500bp、100-1000bp、100-500bp、200-2000bp、200-1500bp、200-1000bp、200-500bp、500-2000bp、500-1500bp、500-1000bp、750-2000bp、750-1500bp、750-1000bp、1000-1500bp或1200-1500bp，并且所得截短的序列编码ATP7B的功能片段。在一个实施方案中，变体ATP7B序列包含已在N端被截短1-1000bp的SEQ ID NO：3，编码功能性ATP7B片段，并且已被密码子优化以使在肝脏或肝细胞中的表达相对于未被密码子优化的等同ATP7B片段的表达增加至少5倍。在示例性实施方案中，本文公开的变体ATP7B序列包含SEQ ID NO：3。
在一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含与SEQ ID NO：4具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在示例性实施方案中，这样的序列被密码子优化，并编码全长ATP7B蛋白(例如，具有SEQ ID NO：2)。在某些实施方案中，相对于来自未被密码子优化的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)的等同ATP7B蛋白的表达，这样的密码子优化的序列使ATP7B蛋白的表达增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多倍。在另一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含截短的SEQ ID NO：4，其编码ATP7B的功能片段。例如，在某些实施方案中，SEQ ID NO：4可被截短约100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或2000bp，或约100-2000bp、100-1500bp、100-1000bp、100-500bp、200-2000bp、200-1500bp、200-1000bp、200-500bp、500-2000bp、500-1500bp、500-1000bp、750-2000bp、750-1500bp、750-1000bp、1000-1500bp或1200-1500bp，并且所得截短的序列编码ATP7B的功能片段。在一个实施方案中，变体ATP7B序列包含已在N端被截短1-1000bp的SEQ ID NO：4，编码功能性ATP7B片段，并且已被密码子优化以使在肝脏或肝细胞中的表达相对于未被密码子优化的等同ATP7B片段的表达增加至少5倍。在示例性实施方案中，本文公开的变体ATP7B序列包含SEQ ID NO：4。
在一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在示例性实施方案中，这样的序列被密码子优化，并编码全长ATP7B蛋白(例如，具有SEQ ID NO：2)。在某些实施方案中，相对于来自未被密码子优化的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)的等同ATP7B蛋白的表达，这样的密码子优化的序列使ATP7B蛋白的表达增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多倍。在另一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含截短的SEQ ID NO：5，其编码ATP7B的功能片段。例如，在某些实施方案中，SEQ ID NO：5可被截短约100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或2000bp，或约100-2000bp、100-1500bp、100-1000bp、100-500bp、200-2000bp、200-1500bp、200-1000bp、200-500bp、500-2000bp、500-1500bp、500-1000bp、750-2000bp、750-1500bp、750-1000bp、1000-1500bp或1200-1500bp，并且所得截短的序列编码ATP7B的功能片段。在一个实施方案中，变体ATP7B序列包含已在N端被截短1-1000bp的SEQ ID NO：5，编码功能性ATP7B片段，并且已被密码子优化以使在肝脏或肝细胞中的表达相对于未被密码子优化的等同ATP7B片段的表达增加至少5倍。在示例性实施方案中，本文公开的变体ATP7B序列包含SEQ ID NO：5。
在一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含与SEQ ID NO：6具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在示例性实施方案中，这样的序列被密码子优化，并编码全长ATP7B蛋白(例如，具有SEQ ID NO：2)。在某些实施方案中，相对于来自未被密码子优化的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1)的等同ATP7B蛋白的表达，这样的密码子优化的序列使ATP7B蛋白的表达增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多倍。在另一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含截短的SEQ ID NO：6，其编码ATP7B的功能片段。例如，在某些实施方案中，SEQ ID NO：3可被截短约100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或2000bp，或约100-2000bp、100-1500bp、100-1000bp、100-500bp、200-2000bp、200-1500bp、200-1000bp、200-500bp、500-2000bp、500-1500bp、500-1000bp、750-2000bp、750-1500bp、750-1000bp、1000-1500bp或1200-1500bp，并且所得截短的序列编码ATP7B的功能片段。在一个实施方案中，变体ATP7B序列包含已在N端被截短1-1000bp的SEQ ID NO：6，编码功能性ATP7B片段，并且已被密码子优化以使在肝脏或肝细胞中的表达相对于未被密码子优化的等同ATP7B片段的表达增加至少5倍。在示例性实施方案中，本文公开的变体ATP7B序列包含SEQ ID NO：6。
在某些实施方案中，可以与本文公开的调控元件结合使用的变体ATP7B序列包括如WO 2017/103624中公开的密码子优化的ATP7B序列。在这样的实施方案中，变体ATP7B核苷酸序列包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在示例性实施方案中，这样的序列被密码子优化，并编码全长ATP7B蛋白。在另一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含截短的SEQ ID NO：7，其编码ATP7B的功能片段。例如，在某些实施方案中，SEQ ID NO：7可被截短约100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或2000bp，或约100-2000bp、100-1500bp、100-1000bp、100-500bp、200-2000bp、200-1500bp、200-1000bp、200-500bp、500-2000bp、500-1500bp、500-1000bp、750-2000bp、750-1500bp、750-1000bp、1000-1500bp或1200-1500bp，并且所得截短的序列编码ATP7B的功能片段。在一个实施方案中，变体ATP7B序列包含已在N端被截短1-1000bp的SEQ ID NO：7，并编码功能性ATP7B片段。在示例性实施方案中，可以与本文公开的调控序列结合使用的密码子优化的变体ATP7B序列包含SEQ ID NO：7。
在某些实施方案中，可以与本文公开的调控元件结合使用的变体ATP7B序列包括如WO 2018/126116中公开的密码子优化的ATP7B序列。在这样的实施方案中，变体ATP7B核苷酸序列包含与SEQ ID NO：8具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在示例性实施方案中，这样的序列被密码子优化，并编码全长ATP7B蛋白。在另一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含截短的SEQ ID NO：8，其编码ATP7B的功能片段。例如，在某些实施方案中，SEQ ID NO：8可被截短约100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或2000bp，或约100-2000bp、100-1500bp、100-1000bp、100-500bp、200-2000bp、200-1500bp、200-1000bp、200-500bp、500-2000bp、500-1500bp、500-1000bp、750-2000bp、750-1500bp、750-1000bp、1000-1500bp或1200-1500bp，并且所得截短的序列编码ATP7B的功能片段。在一个实施方案中，变体ATP7B序列包含已在N端被截短1-1000bp的SEQ ID NO：8，并编码功能性ATP7B片段。如WO2018/126116中所述，示例性的密码子优化的、截短的变体ATP7B序列包括：已被截短以去除前两个金属结合域的密码子优化的变体ATP7B序列(SEQ ID NO：9)，已被截短以去除前四个金属结合域的密码子优化的变体ATP7B序列(SEQ ID NO：10)，已被截短以去除前五个金属结合域的密码子优化的变体ATP7B序列(SEQ ID NO：11)，已被截短以去除第一个金属结合域的密码子优化的变体ATP7B序列(SEQ ID NO：12)，已被截短以去除第二个金属结合域的密码子优化的变体ATP7B序列(SEQ ID NO：13)，以及已被截短以去除第三个金属结合域的密码子优化的变体ATP7B序列(SEQ ID NO：14)。在示例性实施方案中，可以与本文公开的调控序列结合使用的密码子优化的变体ATP7B序列包含SEQ ID NO：8。在示例性实施方案中，可以与本文公开的调控序列结合使用的密码子优化的、截短的变体ATP7B序列包含SEQ ID NO：9-14中的任一个。
在其他实施方案中，可以与本文公开的调控序列结合使用的密码子优化的、截短的变体ATP7B序列包括已被截短以去除前三个金属结合域的ATP7B序列(参见WO 2018/126116)或已被截短以去除金属结合域1-4和6的ATP7B序列(参见例如，Carter等人,Biochem J.380:805-813(2004)；Gourdon等人,Biol.Chem.393(4):205-216(2012)；Lutsenko等人,Physiological Reviews 87(3):1011-1046(2013)和US2015/0045284)。
在某些实施方案中，可以与本文公开的调控元件结合使用的变体ATP7B序列包括如WO 2016/097218或WO 2016/097219中公开的密码子优化的ATP7B序列。在这样的实施方案中，变体ATP7B核苷酸序列包含与SEQ ID NO：15具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在示例性实施方案中，这样的序列被密码子优化，并编码全长ATP7B蛋白。在另一个实施方案中，本文公开的变体ATP7B核苷酸序列包含截短的SEQ ID NO：15，其编码ATP7B的功能片段。例如，在某些实施方案中，SEQ ID NO：15可被截短约100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp或2000bp，或约100-2000bp、100-1500bp、100-1000bp、100-500bp、200-2000bp、200-1500bp、200-1000bp、200-500bp、500-2000bp、500-1500bp、500-1000bp、750-2000bp、750-1500bp、750-1000bp、1000-1500bp或1200-1500bp，并且所得截短的序列编码ATP7B的功能片段。在一个实施方案中，变体ATP7B序列包含已在N端被截短1-1000bp的SEQ ID NO：15，并编码功能性ATP7B片段。如WO 2016/097219中所述，示例性的密码子优化的、截短的变体ATP7B序列包括一个或多个金属结合位点或重金属相关(HMA)域已被去除的密码子优化的、截短的变体(例如，HMA1包含野生型ATP7B序列的氨基酸59-125，HMA2包含野生型ATP7B序列的氨基酸144-210，HMA3包含野生型ATP7B序列的氨基酸258-327，HMA4包含野生型ATP7B序列的氨基酸360-426，HMA5包含野生型ATP7B序列的氨基酸489-555，以及HMA6包含野生型ATP7B序列的氨基酸565-631)。在示例性实施方案中，变体ATP7B序列已被截短以编码其中已去除前4个金属结合域的蛋白质。在示例性实施方案中，可以与本文公开的调控序列结合使用的密码子优化的变体ATP7B序列包含SEQ ID NO：15。在示例性实施方案中，可以与本文公开的调控序列结合使用的密码子优化的、截短的变体ATP7B序列包含SEQ ID NO：17。在另一个实施方案中，可以与本文公开的调控序列结合使用的变体ATP7B序列是包含SEQ ID NO：16或18的截短的、非密码子优化的序列。
在某些实施方案中，本文提供的变体ATP7B核酸分子不包含任何修饰的基底。在某些实施方案中，本文提供的变体ATP7B核酸分子是DNA分子。在某些实施方案中，本文提供的变体ATP7B核酸分子是不包含任何修饰的碱基的DNA分子。
核酸构建体
在某些实施方案中，本文公开的变体ATP7B构建体是除了变体ATP7B序列之外还包含一个或多个调控元件的核酸构建体的一部分。在示例性实施方案中，本文公开的变体ATP7B构建体是核酸构建体的一部分，该核酸构建体包含位于ATP7B构建体上游的启动子，从而能够驱动细胞中变体ATP7B序列的表达。
在一个实施方案中，本文公开的核酸构建体包含(1)启动子，其具有(i)SEQ IDNO：23-43、48-55或66-70(如以下表2和3所示)中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：23-43、48-55或66-70中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段；可操作地连接至(2)本文公开的任一个变体ATP7B序列，例如，变体ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：1-18(如以下表1所示)中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：1-18中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)其功能片段或变体。
在一个实施方案中，本文公开的核酸构建体包含与本文公开的任一个变体ATP7B序列(例如，包含SEQ ID NO：1-18(如以下表1所示)中的任一个或其功能片段的变体ATP7B序列)可操作地连接的启动子，该启动子具有SEQ ID NO：23-43、48-55或66-70(如以下表2和3所示)中的任一个。在另一个实施方案中，本文公开的核酸构建体包含与本文公开的任一个变体ATP7B序列(例如，包含SEQ ID NO：1-18(如以下表1所示)中的任一个或其功能片段)可操作地连接的调控元件，该调控元件具有SEQ ID NO：19-43或66-68(如以下表2所示)中的任一个的两个或多个(例如，两个或多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或2、3、4或5个)的组合。
在某些实施方案中，本文公开的核酸构建体包含与本文公开的任一个变体ATP7B序列(例如，包含SEQ ID NO：1-18(如以下表1所示)中的任一个或其功能片段的变体ATP7B序列)可操作地连接的启动子，该启动子具有SEQ ID NO：23-43或66-68中的任一个(如以下表2所示)的启动子。在某些实施方案中，相对于来自CMV启动子的相同变体ATP7B序列的表达水平，该启动子序列在哺乳动物细胞中产生的变体ATP7B序列表达至少高5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍或75倍，或至少20-90倍、20-80倍、20-70倍、20-60倍、30-90倍、30-80倍、30-70倍、30-60倍、40-90倍、40-80倍、40-70倍、40-60倍、50-90倍、50-80倍、50-70倍、50-60倍、60-90倍、60-80倍、60-70倍、70-90倍、70-80倍、80-90倍。在某些实施方案中，该启动子序列驱动变体ATP7B序列在高百分比的肝细胞中表达，例如，至少20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更多，或至少20-90％、20-80％、20-70％、30-90％、30-80％、30-70％、40-90％、40-80％、40-70％、50-90％、50-80％、50-70％、60-90％、60-80％、60-70％、70-90％、70-80％、80-100％、80-95％、80-90％、90-100％或90-95％的肝细胞包含表达变体ATP7B构建体的核酸构建体。
在一个实施方案中，本文公开的核酸构建体包含具有SEQ ID NO：23-43、48-55或66-70中的任一个的启动子，该启动子与密码子优化的变体ATP7B序列可操作地连接，该变体ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：3-6中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：3-6任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在一个实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含具有SEQ ID NO：22的启动子，该启动子与密码子优化的变体ATP7B序列可操作地连接，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：3-6中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：3-6任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在一个实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含具有SEQ ID NO：33的启动子，该启动子与密码子优化的变体ATP7B序列可操作地连接，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：3-6中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：3-6任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在一个实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含具有SEQ ID NO：24的启动子，该启动子与密码子优化的变体ATP7B序列可操作地连接，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：3-6中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：3-6任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含具有SEQ ID NO：33的启动子，该启动子与密码子优化的变体ATP7B序列可操作地连接，该ATP7B序列包含(i)SEQ IDNO：4，(ii)与SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含具有SEQ ID NO：33的启动子，该启动子与密码子优化的变体ATP7B序列可操作地连接，该ATP7B序列包含(i)SEQ IDNO：5，(ii)与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含(1)启动子，该启动子包含(i)SEQ ID NO：24，(ii)与SEQ ID NO：24具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段，可操作地连接至(2)密码子优化的变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：5，(ii)与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含具有SEQ ID NO：24的启动子，该启动子与密码子优化的变体ATP7B序列可操作地连接，该ATP7B序列包含(i)SEQ IDNO：4，(ii)与SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含具有SEQ ID NO：24的启动子，该启动子与密码子优化的变体ATP7B序列可操作地连接，该ATP7B序列包含(i)SEQ IDNO：5，(ii)与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含(1)启动子，该启动子包含(i)SEQ ID NO：66-68中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段，可操作地连接至(2)密码子优化的变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：1-18中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：1-18中任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含(1)启动子，该启动子包含(i)SEQ ID NO：66，(ii)与SEQ ID NO：66具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段，可操作地连接至(2)密码子优化的变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：4，(ii)与SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含(1)启动子，该启动子包含(i)SEQ ID NO：66，(ii)与SEQ ID NO：66具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段，可操作地连接至(2)密码子优化的变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：5，(ii)与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含(1)启动子，该启动子包含(i)SEQ ID NO：67，(ii)与SEQ ID NO：67具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段，可操作地连接至(2)密码子优化的变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：4，(ii)与SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含(1)启动子，该启动子包含(i)SEQ ID NO：67，(ii)与SEQ ID NO：67具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段，可操作地连接至(2)密码子优化的变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：5，(ii)与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含(1)启动子，该启动子包含(i)SEQ ID NO：68，(ii)与SEQ ID NO：68具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段，可操作地连接至(2)密码子优化的变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：4，(ii)与SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在示例性实施方案中，本公开内容的核酸构建体包含(1)启动子，该启动子包含(i)SEQ ID NO：68，(ii)与SEQ ID NO：68具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段，可操作地连接至(2)密码子优化的变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：5，(ii)与SEQ ID NO：5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在一个实施方案中，本文公开的核酸构建体包含选自以下的启动子：甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、修饰的甲状腺素结合球蛋白(TBG-S1)启动子、肝特异性运甲状腺素蛋白(TTR)启动子、修饰的运甲状腺素蛋白(mTTR)启动子、α1抗胰蛋白酶(A1AT)启动子、人白蛋白(humAlb)启动子、肝特异性启动子(LSP)和乙型肝炎核心启动子(参见例如，WO2018/126116；Miyatake等人,J.Virol.71:5124-32(1997)和Sandig等人,Gene Ther.3:1002-9(1996))，该启动子可操作地连接至密码子优化的变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ ID NO：3-6中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：3-6任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。
在一个实施方案中，本文公开的核酸构建体包含具有SEQ ID NO：21-43或66-68中任一个的启动子，该启动子可操作地连接至变体ATP7B序列，该ATP7B序列包含(i)SEQ IDNO：7-18中的任一个，(ii)与SEQ ID NO：7-18任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或(iii)上述任一个的功能片段。在某些实施方案中，这样的变体ATP7B核苷酸序列是密码子优化的序列，其编码具有与野生型ATP7B蛋白序列(例如，SEQ ID NO：2)至少90％、95％、98％、99％或100％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，这样的密码子优化的变体ATP7B序列可包含(i)SEQ ID NO：7、8或15中的任一个，或(ii)与SEQ ID NO：7、8或15中任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，其中这样的密码子优化的变体ATP7B序列编码全长ATP7B蛋白，例如具有SEQ ID NO：2的全长ATP7B蛋白。在某些实施方案中，本文公开的核酸构建体包含密码子优化的变体ATP7B核苷酸序列，该序列已被截短以编码ATP7B蛋白的功能片段。示例性的密码子优化的、截短的ATP7B核苷酸序列可包含(i)SEQ ID NO：9-14或17中的任一个，或(ii)与SEQ ID NO：9-14或17中任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，其中这样的密码子优化的、截短的变体ATP7B核苷酸序列编码ATP7B的功能片段。在某些实施方案中，本文公开的核酸构建体包含变体ATP7B核苷酸序列，该序列已被截短以编码ATP7B蛋白的功能片段。示例性截短的ATP7B核苷酸序列可包含(i)SEQ ID NO：16或18中的任一个，或(ii)与SEQ ID NO：16或18中任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，其中这样的截短的变体ATP7B核苷酸序列编码ATP7B的功能片段。
另一方面，本申请提供了包含调控元件的核酸构建体，该调控元件包含与SEQ IDNO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列。在某些实施方案中，这样的调控元件与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在某些实施方案中，调控元件小于150bp、140bp、130bp、125bp、120bp、119bp、118bp、117bp、116bp、115bp、114bp、113bp、112bp、111bp、110bp、105bp、100bp、99bp、98bp、97bp、96bp、95bp、94bp、93bp、92bp、91bp、90bp、85bp、80bp或75bp。在某些实施方案中，调控元件具有约为75-150bp、75-140bp、75-130bp、75-120bp、75-110bp、75-100bp、75-90bp、80-150bp、80-140bp、80-130bp、80-120bp、80-110bp、80-100bp、80-90bp、85-150bp、85-140bp、85-130bp、85-120bp、85-110bp、85-100bp、85-90bp、90-150bp、90-140bp、90-130bp、90-120bp、90-110bp、90-100bp、95-150bp、95-140bp、95-130bp、95-120bp、95-110bp、95-100bp、100-150bp、100-140bp、100-130bp、100-120bp或100-110bp。在某些实施方案中，相对于来自对照启动子(例如，CMV、mTTR或α1抗胰蛋白酶启动子)的相同转基因序列的表达水平，这样的调控元件在哺乳动物细胞中产生的转基因表达高至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍或75倍，或至少20-90倍、20-80倍、20-70倍、20-60倍、30-90倍、30-80倍、30-70倍、30-60倍、40-90倍、40-80倍、40-70倍、40-60倍、50-90倍、50-80倍、50-70倍、50-60倍、60-90倍、60-80倍、60-70倍、70-90倍、70-80倍、80-90倍。在某些实施方案中，这样的调控元件驱动转基因序列在高百分比的肝细胞中表达，例如，至少20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更多，或至少20-90％、20-80％、20-70％、30-90％、30-80％、30-70％、40-90％、40-80％、40-70％、50-90％、50-80％、50-70％、60-90％、60-80％、60-70％、70-90％、70-80％、80-100％、80-95％、80-90％、90-100％或90-95％的肝细胞包含表达该转基因序列的核酸构建体。在某些实施方案中，这样的调控元件与治疗性转基因可操作地连接，该治疗性转基因是，例如，ATP酶铜转运α(ATP7A)、ATP酶铜转运β(ATP7B)、ATP酶磷脂转运8B1(ATP8B1)、ATP结合盒亚家族B成员4(ABCB4)、ATP结合盒亚家族B成员11(ABCB11)、细胞周期蛋白依赖性激酶样5(CDKL5)、接触蛋白相关蛋白样2(CNTNAP2)、锌指E框结合同源框2(ZEB2)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI或因子XII，或其变体或功能片段。在某些实施方案中，该治疗性转基因编码因子VIII或其变体或功能片段。在某些实施方案中，该治疗性转基因编码ATP7B或其变体或功能片段。在某些实施方案中，已经对治疗性转基因进行密码子优化，以在特定细胞或组织类型(例如，肝脏)中表达。
在某些实施方案中，本文所述的核酸构建体除了启动子外还包含另一种调控元件，例如与转录起始或终止相关的序列、增强子序列和有效的RNA加工信号。示例性调控元件包括例如内含子、增强子、UTR、稳定性元件、WPRE序列、Kozak共有序列、翻译后应答元件或多聚腺苷酸化(polyA)序列或其组合。调控元件可以在基因表达的转录阶段、转录后阶段或翻译阶段起到调节基因表达的作用。在RNA水平下，调节可以在翻译(例如稳定mRNA以进行翻译的稳定性元件)、RNA切割、RNA剪接和/或转录终止的水平下发生。在各种实施方案中，调控元件可以将转录因子募集到编码区，该转录因子增加在感兴趣的细胞类型中的基因表达选择性，提高产生RNA转录物的速率，提高产生的RNA的稳定性，和/或提高从RNA转录物合成蛋白质的速率。
在一个实施方案中，本文所述的核酸构建体进一步包含增强子序列。示例性的增强子序列包括，例如，En34增强子(来自人脱脂载脂蛋白肝控制区的34bp核心增强子)，EnTTR增强子(来自运甲状腺素蛋白的100bp增强子序列)，α1-微球蛋白/尿抑胰酶素前体增强子，ABPS增强子(将来自1-微球蛋白/尿抑胰酶素前体的100bp远端增强子缩短到42bp的形式)或ApoE增强子。参见例如，WO 2018/126116和Wu等人,Mol Therapy 16(2):280-289(2008)。在另一个实施方案中，合适的增强子序列是包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的内含子序列。在某些实施方案中，在本文所述的核酸构建体中，增强子序列位于转基因和启动子的上游，或在启动子与转基因之间。
在某些实施方案中，本文所述的核酸构建体进一步包含polyA序列。合适的polyA序列包括例如长度为约75bp的人工polyA(PA75)(参见例如，WO 2018/126116)、牛生长激素polyA、SV40早期polyA信号、SV40晚期polyA信号、兔β球蛋白polyA、HSV胸苷激酶polyA、鱼精蛋白基因polyA、腺病毒5EIb polyA、生长激素polyA或PBGD polyA。在某些实施方案中，在本文所述的核酸构建体中，polyA序列位于转基因的下游。
在某些实施方案中，适合用于根据本文所述的核酸分子的调控元件的长度包括小于500bp、450bp、400bp、350bp、300bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、145bp、140bp、135bp、130bp、125bp、120bp、115bp、110bp、105bp、100bp、95bp、90bp、85bp、80bp或75bp，或约80-300bp、80-275bp、80-250bp、80-200bp、80-150bp、80-125bp、80-120bp、80-115bp、80-110bp、80-105bp、80-100bp、85-300bp、85-275bp、85-250bp、85-200bp、85-150bp、85-125bp、85-120bp、85-115bp、85-110bp、85-105bp、85-100bp、90-300bp、90-275bp、90-250bp、90-200bp、90-150bp、90-125bp、90-120bp、90-115bp、90-110bp、90-105bp、90-100bp、95-300bp、95-275bp、95-250bp、95-200bp、95-150bp、95-125bp、95-120bp、95-115bp、95-110bp、95-105bp、95-100bp、100-300bp、100-275bp、100-250bp、100-200bp、100-150bp、100-125bp、100-120bp、100-115bp、100-110bp或100-105bp。在示例性实施方案中，适合用于根据本文所述的核酸分子的调控元件的长度包括约100-120bp、约117bp或约100bp。
在某些实施方案中，本文所描述的包含ATP7B核酸序列和调控元件的核酸构建体适合在AAV载体(例如包含小于约4.7Kb的AAV载体)中包装。在某些实施方案中，本文所述的包含ATP7B核酸序列和调控元件的核酸构建体包含约4,450-4,550bp、4,450-4,540bp、4,450-4,530bp、4,450-4,520bp、4,450-4,510bp、4,450-4,500bp、4,460-4,550bp、4,460-4,540bp、4,460-4,530bp、4,460-4,520bp、4,460-4,510bp、4,460-4,500bp、4,470-4,550bp、4,470-4,540bp、4,470-4,530bp、4,470-4,520bp、4,470-4,510bp、4,470-4,500bp、4,480-4,550bp、4,480-4,540bp、4,480-4,530bp、4,480-4,520bp、4,480-4,510bp、4,480-4,500bp、4,490-4,550bp、4,490-4,540bp、4,490-4,530bp、4,490-4,520bp、4,490-4,510bp或4,490-4,500bp，或包含约4,498bp或约4,515bp。在示例性实施方案中，这样的核酸构建体编码全长ATP7B蛋白，例如，具有SEQ ID NO：2的ATP7B蛋白。
表达载体
在某些实施方案中，可以将本文所述的变体ATP7B核苷酸序列或表达构建体掺入表达载体中。
表达载体可用于通过转染或转导将核酸分子递送至靶细胞。载体可以是整合载体或非整合载体，该整合是指载体将表达盒或转基因整合到宿主细胞基因组中的能力。表达载体的实例包括但不限于：(a)非病毒载体，如核酸载体，包括线性寡核苷酸和环状质粒；人工染色体，如人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC或PAC)；游离型载体；转座子(例如PiggyBac)；和(b)病毒载体，如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。
表达载体可以是线性寡核苷酸或环状质粒，并且可以通过各种转染方法(包括物理和化学方法)递送至细胞。物理方法通常是指利用物理力抵消细胞膜屏障以促进遗传物质的细胞内递送的递送方法。物理方法的实例包括使用针头、弹道DNA、电穿孔、声孔效应、光穿孔、磁转染和氢穿孔(hydroporation)。化学方法通常是指其中化学运载体将核酸分子递送至细胞的方法并且可以包括无机颗粒、基于脂质的载体、基于聚合物的载体和基于肽的载体。
在一些实施方案中，使用无机颗粒将表达载体施用于靶细胞。无机颗粒可以指纳米颗粒，例如被工程化为各种大小、形状和/或孔隙度以从网状内皮系统脱逸或保护包裹的分子免于降解的纳米颗粒。无机纳米颗粒可以由金属(例如铁、金和银)、无机盐或陶瓷(例如钙、镁或硅的磷酸盐或碳酸盐)制成。可以包覆这些纳米颗粒的表面以促进DNA结合或靶向基因递送。也可以使用磁性纳米颗粒(例如超磁性氧化铁)、富勒烯(例如可溶性碳分子)、碳纳米管(例如圆柱形富勒烯)、量子点和超分子系统。
在一些实施方案中，使用阳离子脂质(例如，阳离子脂质体)将表达载体施用于靶细胞。已经研究了各种类型的脂质用于基因递送，例如脂质纳米乳液(例如，其是一种不混溶液体在另一种不混溶液体中的分散体，由乳化剂稳定)或固体脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，使用基于肽的递送媒介物将表达载体施用于靶细胞。基于肽的递送媒介物可具有保护待递送的遗传物质、靶向特定细胞受体、破坏内体膜和将遗传物质递送至细胞核中的优点。在一些实施方案中，使用基于聚合物的递送媒介物将表达载体施用于靶细胞。基于聚合物的递送媒介物可包含天然蛋白质、肽和/或多糖或合成聚合物。在一个实施方案中，基于聚合物的递送媒介物包含聚乙烯亚胺(PEI)。PEI可以将DNA压缩成带正电荷的颗粒，该颗粒与阴离子细胞表面残基结合，并通过内吞作用被带入细胞。在其他实施方案中，基于聚合物的递送媒介物可以包含聚-L-赖氨酸(PLL)、聚(DL-乳酸)(PLA)、聚(DL-丙交酯-共-糖苷)(PLGA)、聚鸟氨酸、聚精氨酸、组蛋白、鱼精蛋白、树状聚合物、壳聚糖、葡聚糖的合成氨基衍生物和/或阳离子丙烯酸聚合物。在某些实施方案中，基于聚合物的递送媒介物包含聚合物的混合物，例如PEG和PLL。
在某些实施方案中，表达载体可以是适合基因疗法的病毒载体。病毒基因疗法载体或基因递送载体的优选特征可包括可再现、稳定繁殖和纯化至高滴度的能力；介导靶向递送的能力(例如，将转基因特异性递送至感兴趣的组织或器官而没有在他处的广泛载体散播)；以及介导基因递送和转基因表达而不会引起有害的副作用的能力。
通过利用病毒感染途径但避免随后会导致复制和毒性的病毒基因表达，几种类型的病毒，例如被称为腺伴随病毒的非致病性细小病毒，已经设计用于基因疗法的目的。可以通过从病毒基因组中删除全部或部分编码区，但完整保留对于例如将载体基因组包装到病毒衣壳中或将载体核酸(例如DNA)整合至宿主染色质中等功能而言可能必需的序列(例如，末端重复序列)，从而获得这样的病毒载体。
在各种实施方案中，合适的病毒载体包括逆转录病毒(例如，A型、B型、C型和D型病毒)、腺病毒、细小病毒(例如，腺伴随病毒或AAV)、冠状病毒、负链RNA病毒(例如，正粘病毒(例如，流感病毒))、棒状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副黏病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒(例如小RNA病毒和甲病毒)，以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒1型和2型、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘、鸟痘和金丝雀痘)。逆转录病毒的实例包括禽白血病-肉瘤病毒、人嗜T-淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)、牛白血病病毒(BLV)、慢病毒和泡沫病毒。例如，其他病毒包括Norwalk病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。根据整合入宿主基因组的能力，病毒载体可分为两类：整合型和非整合型。致癌逆转录病毒和慢病毒可以整合到宿主细胞的染色质中，而腺病毒、腺伴随病毒和疱疹病毒则主要以染色体外附加体的形式存在于细胞核中。
在某些实施方案中，合适的病毒载体为逆转录病毒载体。逆转录病毒是指逆转录病毒科的病毒。逆转录病毒的实例包括例如鼠白血病病毒(MLV)的致癌逆转录病毒，以及例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的慢病毒。逆转录病毒基因组是单链(ss)RNA，并包含以顺式或反式提供的各种基因。例如，逆转录病毒基因组可以包含顺式作用序列，例如两个长末端重复序列(LTR)，以及用于基因表达、逆转录和整合入宿主染色体的元件。其他组分包括用于将特定RNA包装到新形成的病毒体和聚嘌呤道(PPT)中的包装信号(psi或ψ)，逆转录过程中正链DNA合成的起始位点。此外，逆转录病毒基因组可包含gag、pol和env基因。gag基因编码结构蛋白，pol基因编码与ssRNA伴随并将病毒RNA逆转录为DNA的酶，而env基因编码病毒包膜。通常，gag、pol和env以反式提供，用于病毒复制和包装。
在某些实施方案中，本文提供的逆转录病毒载体可以是慢病毒载体。识别出慢病毒的至少五种血清群或血清型。不同血清型的病毒可以差异地感染某些细胞类型和/或宿主。例如，慢病毒包括灵长类动物逆转录病毒和非灵长类动物逆转录病毒。灵长类动物逆转录病毒包括HIV和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类动物逆转录病毒包括猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和维斯纳病毒(visnavirus)。慢病毒或慢病毒载体可以能够转导休眠细胞。与致癌逆转录病毒载体一样，慢病毒载体的设计可以基于顺式序列与反式序列的分离。
在某些实施方案中，本申请提供了已设计用于通过优化的治疗性逆转录病毒载体进行递送的表达载体。该逆转录病毒载体可以是慢病毒，包含左(5’)LTR；有助于包装和/或核导入病毒的序列；启动子；任选的一种或多种其他调控元件(例如，增强子或polyA序列)；任选的慢病毒反向应答元件(RRE)；变体ATP7B转基因；任选的绝缘子；和右(3’)逆转录病毒LTR。
在示例性实施方案中，本文提供的病毒载体是腺伴随病毒(AAV)。AAV是一种小型、复制缺陷型、无包膜的动物病毒，可感染人类和其他一些灵长类动物。尚不知道AAV会引起人类疾病，但会诱导轻度的免疫反应。AAV载体还可以感染分裂细胞和休眠细胞，而无需整合到宿主细胞基因组中。
AAV基因组由长度约为4.7kb的线性单链DNA组成。基因组由两个开放阅读框(ORF)组成，开放阅读框的侧翼是长度约为145bp的反向末端重复(ITR)序列。ITR由5’端的核苷酸序列(5’ITR)和位于3’端的核苷酸序列(3’ITR)组成，它们包含回文序列。ITR通过折叠而顺式起作用以形成T形发夹结构，该结构通过互补碱基配对在第二条链合成的DNA复制起始过程中起引物作用。这两个开放阅读框编码参与病毒体复制和包装的rep和cap基因。在示例性实施方案中，本文提供的AAV载体不包含rep或cap基因。这样的基因可以反式提供以产生病毒，如下文进一步描述。
在某些实施方案中，AAV载体可以包括填充核酸。在一些实施方案中，填充核酸可以编码绿色荧光蛋白或抗生素抗性基因，例如卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。在某些实施方案中，填充核酸可以位于ITR序列之外(例如，与位于5’序列与3’ITR序列之间的变体ATPB转基因序列和调控序列相比)。
存在各种AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。这些血清型的向性或所感染的细胞类型不同。AAV可包含来自多种血清型(例如，假型)的基因组和衣壳。例如，AAV可以包含包装在来自血清型5或血清型8的衣壳中的血清型2的基因组(例如，ITR)。假型可以提高转导效率并改变向性。
在一些实施方案中，AAV载体或AAV病毒颗粒或病毒体可用于将变体ATP7B转基因递送到细胞、细胞类型或组织中，并且可以在体内、离体或体外完成。在示例性实施方案中，这样的AAV载体是复制缺陷的。在一些实施方案中，对AAV病毒进行工程化或基因修饰，以使其仅在辅助因子存在下才能复制并产生病毒体。
在示例性实施方案中，本申请提供了已被设计用于通过AAV递送的表达载体。AAV可以是任何血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ，或嵌合、杂合或变体AAV。AAV也可以是自互补AAV(scAAV)。在某些实施方案中，设计用于通过AAV递送的表达载体包括5’ITR和3’ITR。在某些实施方案中，设计用于通过AAV递送的表达载体包括5’ITR、启动子、ATP7B转基因和3’ITR。在某些实施方案中，设计用于通过AAV递送的表达载体包括5’ITR、增强子、启动子、ATP7B转基因、polyA序列和3’ITR。在示例性实施方案中，设计用于通过AAV递送的表达载体包括5’ITR、包含SEQ ID NO：21-55中任一个或其变体或功能片段的启动子、包含SEQ ID NO：1-18中任一个或其变体或功能片段的ATP7B转基因和3’ITR。在一个实施方案中，设计用于通过AAV递送的表达载体包括5’ITR、包含SEQ ID NO：21-55中任一个或其变体或功能片段的启动子、包含SEQ ID NO：3-6中任一个或其变体或功能片段的ATP7B转基因和3’ITR。在另一个实施方案中，设计用于通过AAV递送的表达载体包括5’ITR、包含SEQ ID NO：15-17中任一个或其变体或功能片段的启动子、包含SEQ ID NO：4或5中任一个的ATP7B转基因和3’ITR。在另一个实施方案中，设计用于通过AAV递送的表达载体包括5’ITR、包含SEQ ID NO：21-47中任一个或其变体或功能片段的启动子、包含SEQ ID NO：7-18中任一个的ATP7B转基因和3’ITR。在另一个实施方案中，设计用于通过AAV递送的表达载体包括5’ITR、包含SEQ ID NO：23-43中任一个或其变体或功能片段的启动子、包含SEQ ID NO：7、8或15中任一个的ATP7B转基因和3’ITR。
宿主细胞
另一方面，本发明涉及包含核酸分子或表达载体的宿主细胞，该核酸分子或表达载体包含本发明的变体ATP7B序列。宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在示例性实施方案中，宿主细胞是指易受感兴趣的病毒感染并适于体外培养的任何细胞系。
在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞可用于离体基因疗法的目的。在这样的实施方案中，用包含本发明的变体ATP7B序列的核酸分子或表达载体转染细胞，然后将细胞移植到患者或受试者中。移植的细胞可以具有自体的、同种异体的或异源的来源。对于临床用途，通常在良好生产规范(GMP)条件下进行细胞分离。移植前，通常要检查细胞质量以及是否存在微生物或其他污染物，并可以进行肝脏预处理，例如采用放射和/或免疫抑制治疗。此外，可以将宿主细胞与生长因子，例如肝细胞生长因子(HGF)一起移植以刺激细胞增殖和/或分化。
在某些实施方案中，宿主细胞可用于离体基因疗法进入肝脏。优选地，所述细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，哺乳动物包括但不限于人类、非人类灵长动物(例如猿、黑猩猩、猴子和猩猩)、驯养动物(包括狗和猫以及牲畜(例如马、牛、猪、绵羊和山羊))或其他哺乳动物种类，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠等。本领域技术人员将根据要移植的患者或受试者选择更合适的细胞。
在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞可以是具有自我更新和多能性特性的细胞，例如干细胞或诱导性多能性干细胞。干细胞优选是间充质干细胞。间充质干细胞(MSC)能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌细胞中的至少一种，并且可以从任何类型的组织中分离。通常，MSC将从骨髓、脂肪组织、脐带或外周血中分离。其获得方法是本领域技术人员公知的。诱导多能干细胞(也称为iPS细胞或iPSC)是一种多能干细胞，可以直接从成体细胞产生。Yamanaka等通过将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因转移到小鼠和人类成纤维细胞中并迫使细胞表达该基因，诱导了iPS细胞(WO 2007/069666)。Thomson等随后使用Nanog和Lin28代替Klf4和c-Myc产生了人类iPS细胞(WO 2008/118820)。
在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞可以是肝细胞。例如在Filippi和Dhawan,Ann NY Acad Sci.2014,1315 50-55；Yoshida等人,Gastroenterology 1996,111:1654-1660；Irani等人,Molecular Therapy2001,3:3,302-309；以及Vogel等人,J InheritMetab Dis 2014,37:165-176中描述了肝细胞移植手术，包括细胞分离和随后移植到人类或小鼠受体中。将病毒载体离体转导至肝细胞中的方法于例如Merle等人,ScandinavianJournal of Gastroenterology 2006,41:8,974-982中有述。
在示例性实施方案中，本文提供的宿主细胞是包装细胞。所述细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞。包装细胞和辅助载体或病毒或DNA构建体以反式的形式一起提供了病毒载体的完全复制和包装所需的所有缺失功能。
优选地，所述包装细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，包括猿猴、人类、狗和啮齿动物的细胞。人类细胞的实例是PER.C6细胞(WO01/38362)、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCC CCL-75)、HEK-293细胞(ATCC CRL-1573)、HeLa细胞(ATCC CCL2)和胚胎恒河猴肺细胞(ATCC CL-160)。非人类灵长动物细胞的实例是Vero细胞(ATCC CCL81)、COS-1细胞(ATCCCRL-1650)或COS-7细胞(ATCC CRL-1651)。狗细胞的实例是MDCK细胞(ATCC CCL-34)。啮齿动物细胞的实例是仓鼠细胞，例如BHK21-F、HKCC细胞或CHO细胞。
作为哺乳动物来源的替代，用于本发明的细胞系可以来源于禽类来源，例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑或野鸡。禽细胞系的实例包括禽胚胎干细胞(WO01/85938和WO03/076601)、永生化的鸭视网膜细胞(WO2005/042728)和禽胚胎干细胞衍生的细胞，包括鸡细胞(WO2006/108846)或鸭细胞，例如EB66细胞系(WO2008/129058&WO2008/142124)。
在另一个实施方案中，所述宿主细胞是昆虫细胞，例如SF9细胞(ATCC CRL-1711)、Sf21细胞(IPLB-Sf21)、MG1细胞(BTI-TN-MG1)或High FiveTM细胞(BTI-TN-5B1-4)。
在某些实施方案中，本文提供的包含携带本发明的重组AAV载体/基因组(例如，包含变体ATP7B核酸序列)的核酸构建体(例如，质粒)的宿主细胞可进一步包含一种或多种其他核酸构建体，例如，(i)编码rep和cap基因但不携带ITR序列的核酸构建体(例如，AAV辅助质粒)，和/或(ii)提供AAV复制所必需的腺病毒功能的核酸构建体(例如质粒)。在示例性实施方案中，本文提供的宿主细胞包含：i)包含本发明的变体ATP7B序列(即，重组AAV基因组)的核酸构建体或表达载体；ii)编码不携带ITR序列的AAV rep和cap基因的核酸构建体；以及iii)包含腺病毒辅助基因的核酸构建体(如下文进一步描述)。
在某些实施方案中，rep基因、cap基因和腺病毒辅助基因可以组合在一个质粒上(Blouin V等人,J Gene Med.2004；6(suppl):S223-S228；Grimm D.等人,Hum.GeneTher.2003；7:839-850)。因此，在另一个示例性实施方案中，本文提供的宿主细胞包含：i)包含本发明的变体ATP7B序列(即，重组AAV基因组)的核酸分子或表达载体；以及ii)编码不携带ITR序列的AAV rep和cap基因且进一步包含腺病毒辅助基因的质粒。
在另一个实施方案中，本文提供的宿主细胞包含：a)包含本发明的变体ATP7B序列(即，重组AAV基因组)的核酸构建体或表达载体；b)编码不携带ITR序列的AAV rep和cap基因的质粒；以及c)包含腺病毒辅助基因E2a、E4和VARNA的质粒；其中，共转染在优选哺乳动物细胞的细胞，例如HEK-293细胞(ATCC CRL-1573)中进行，该细胞组成型地表达腺病毒E1基因并与腺病毒E1基因反式互补。
在某些实施方案中，适于大规模生产AAV载体的宿主细胞是可以用重组杆状病毒的组合来感染的昆虫细胞(Urabe等人,Hum.Gene Ther.2002；13:1935-1943)。例如，SF9细胞可以用分别表达AAV rep、AAV cap和待包装的AAV载体的三种杆状病毒载体来共感染。重组杆状病毒载体将提供病毒复制和/或包装所需的病毒辅助基因功能。
根据本发明的用于基因疗法的病毒体的构建和生产的进一步指导可在以下文献中找到：Viral Vectors for Gene Therapy,Methods and Protocols.Series:Methods inMolecular Biology,Vol.737.Merten和Al-Rubeai(著),2011Humana Press(Springer)；Gene Therapy.M.Giacca.2010Springer-Verlag；Heilbronn R.和Weger S.Viral Vectorsfor Gene Transfer:Current Status of Gene Therapeutics.In:Drug Delivery,Handbook of Experimental Pharmacology 197；M.Schafer-Korting(著).2010Springer-Verlag；pp.143-170；Adeno-Associated Virus:Methods and Protocols.R.O.Snyder和P.Moulllier(著).2011Humana Press(Springer)；Bunning H.等人,Recent developmentsin adeno-associated virus technology.J.Gene Med.2008；10:717-733；以及Adenovirus:Methods and Protocols.M.Chillon和A.Bosch(著)；第三版.2014HumanaPress(Springer)。
病毒体和生产病毒体的方法
在某些实施方案中，本申请提供了包含病毒载体的病毒颗粒，该病毒载体包含本发明的变体ATP7B序列。术语“病毒颗粒”和“病毒体”在本文中可互换使用，并且涉及感染性的且通常是复制缺陷性的病毒颗粒，其包含包装在衣壳中的病毒基因组(例如，病毒表达载体)，并且视情况而定，例如，对于逆转录病毒，可以是包围衣壳的脂质包膜。“衣壳”是指其中包装病毒基因组的结构。衣壳由几个低聚物结构亚基组成，该亚基由蛋白质构成。例如，AAV具有由三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的相互作用形成的二十面体衣壳。在一个实施方案中，本文提供的病毒体是通过将包含本文所述的变体ATP7B序列的AAV载体包装在蛋白质壳中而获得的重组AAV病毒体或rAAV病毒体。
在某些实施方案中，可以通过将来源于特定AAV血清型的AAV基因组衣壳化在由天然Cap蛋白(对应于相同特定血清型的AAV)形成的病毒颗粒中来制备本文提供的重组AAV病毒体。在其他实施方案中，本文提供的AAV病毒颗粒包含病毒载体，该病毒载体包含包装到来自不同血清型的蛋白质中的给定AAV血清型的ITR。参见例如，Bunning H等人,J GeneMed 2008；10:717-733。例如，具有来自给定AAV血清型的ITR的病毒载体可以包装到：a)由来源于相同或不同AAV血清型的衣壳蛋白构成的病毒颗粒(例如，AAV2 ITR与AAV5衣壳蛋白；AAV2 ITR与AAV8衣壳蛋白等)；b)由来自不同AAV血清型或突变体的衣壳蛋白混合物构成的镶嵌型病毒颗粒(例如，AAV2ITR与AAV1和AAV5衣壳蛋白)；c)由已通过在不同AAV血清型或变体之间进行域交换而被截短的衣壳蛋白构成的嵌合病毒颗粒(例如，AAV2 ITR与具有AAV3域的AAV5衣壳蛋白)；或d)经工程化以展示选择性结合域，从而能够与靶细胞特异性受体严格相互作用的靶向病毒颗粒(例如，AAV4 ITR与通过插入肽配体而被基因截短的AAV2衣壳蛋白；或AAV4 ITR与通过将肽配体偶联至衣壳表面而非基因修饰的AAV2衣壳蛋白)。
技术人员应理解，本文提供的AAV病毒体可包含任何AAV血清型的衣壳蛋白。在一个实施方案中，病毒颗粒包含来自选自以下AAV血清型的衣壳蛋白：AAV1、AAV5、AAV7、AAV8和AAV9，它们更适于递送至肝细胞(Nathwani等人,Blood 2007；109:1414-1421；Kitajima等人,Atherosclerosis 2006；186:65-73)。在具体实施方案中，病毒颗粒包含本发明的核酸构建体，其中该核酸构建体的5’ITR和3’ITR序列是AAV2血清型而衣壳蛋白是AAV8血清型。
用于生产rAAV病毒体的许多方法是本领域已知的，包括转染、稳定细胞系生产以及包括腺病毒-AAV杂种、疱疹病毒-AAV杂种(Conway,J E等人,(1997)J.Virology 71(11):8780-8789)和杆状病毒-AAV杂种在内的感染性杂种病毒生产系统。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物都需要：1)合适的宿主细胞，例如在杆状病毒生产系统的情况下，包括人源细胞系(例如HeLa、A549或293细胞)或昆虫源细胞系(例如SF-9)；2)合适的辅助病毒功能，由野生型或突变型腺病毒(例如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)AAV rep和cap基因及基因产物；4)侧翼为AAV ITR序列的转基因(例如，本文所述的变体ATP7B序列)；以及5)支持rAAV生产的合适的培养基和培养基组分。
在各种实施方案中，本文所述的宿主细胞包含以下三种组分：(1)rep基因和cap基因，(2)提供辅助功能的基因，以及(3)转基因(例如，本文公开的在启动子控制下并且侧翼是ITR的变体ATP7B序列)。AAV rep基因、AAV cap基因和提供辅助功能的基因可通过将所述基因掺入载体(例如，质粒)中并将所述载体引入宿主细胞中而引入细胞中。rep、cap和辅助功能基因可以掺入到相同质粒或不同质粒中。在优选实施方案中，将AAV rep和cap基因掺入一个质粒中，并将提供辅助功能的基因掺入另一质粒中。可以通过使用本领域公知的任何合适的方法将用于创建产生病毒体的宿主细胞的各种质粒(例如，包含AAV rep和cap基因，辅助功能或转基因)引入细胞中。转染方法的实例包括但不限于与磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖、聚凝胺、电穿孔、显微注射、脂质体介导的融合、脂质转染、逆转录病毒感染和基因枪转染。在某些实施方案中，可将提供rep和cap基因、辅助功能和转基因(例如，本文所述的在启动子控制下并且侧翼是ITR的变体ATP7B序列)的质粒同时导入细胞。在另一个实施方案中，提供rep和cap基因以及辅助功能的质粒可以在引入包含转基因的质粒之前或之后被引入细胞中。在示例性实施方案中，用以下三种质粒同时转染细胞(例如，三重转染法)：(1)包含转基因(例如，本文公开的在启动子控制下并且侧翼是ITR的变体ATP7B序列)的质粒，(2)包含AAV rep和cap基因的质粒，以及(3)包含提供辅助功能的基因的质粒。示例性宿主细胞可以是293、A549或HeLa细胞。
在其他实施方案中，(1)AAV rep和cap基因，(2)提供辅助功能的基因和(3)转基因中的一个或多个可以由包装细胞游离地携带和/或以整合到包装细胞的基因组中的方式携带。在一个实施方案中，宿主细胞可以是包装细胞，其中AAV rep和cap基因以及辅助功能稳定地保留在宿主细胞中，并且用含有转基因(例如，本文公开的在启动子控制下并且侧翼是ITR的变体ATP7B序列)的质粒瞬时转染宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是包装细胞，其中AAV rep和cap基因稳定地保留在宿主细胞中，并且用含有转基因(例如，本文公开的在启动子控制下并且侧翼是ITR的变体ATP7B序列)的质粒和包含辅助功能的质粒瞬时转染宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞可以是包装细胞，其中辅助功能稳定地保留在宿主细胞中，并且用含有转基因(例如，本文公开的在启动子控制下并且侧翼是ITR的变体ATP7B序列)的质粒和包含rep和cap基因的质粒瞬时转染宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞可以是用rep和cap基因、辅助功能和转基因序列(例如，本文公开的在启动子控制下并且侧翼是ITR的变体ATP7B序列)稳定转染的生产细胞系。示例性包装和生产细胞可以来源于293、A549或HeLa细胞。
在另一个实施方案中，生产细胞系是昆虫细胞系(通常是Sf9细胞)，其感染了提供Rep和Cap蛋白的杆状病毒表达载体。该系统不需要腺病毒辅助基因(Ayuso E等人,Curr.Gene Ther.2010,10:423-436)。
如本文所用，术语“cap蛋白”是指具有天然AAV Cap蛋白(例如，VP1、VP2、VP3)的至少一种功能活性的多肽。cap蛋白的功能活性的实例包括诱导衣壳形成、促进单链DNA积累、促进AAV DNA包装入衣壳(即衣壳化)、结合细胞受体以及促进病毒体进入宿主细胞的能力。原则上，任何Cap蛋白均可用于本发明。
据报道，Cap蛋白对宿主向性，细胞、组织或器官特异性，受体使用、感染效率和AAV病毒的免疫原性具有影响。因此，可以考虑例如受试者的种类(例如人类或非人类)、受试者的免疫学状态、受试者对于长期或短期治疗的适合性或具体的治疗应用(例如，具体疾病或病症的治疗或向具体细胞、组织或器官的递送)来选择用于rAAV的AAV cap。在某些实施方案中，cap蛋白来源于选自AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAVrh10血清型的AAV。在示例性实施方案中，cap蛋白来源于AAV8。
在一些实施方案中，用于本发明方法的AAV Cap可以通过一种上述AAV cap或其编码核酸的诱变(即通过插入、缺失或取代)来产生。在一些实施方案中，AAV cap与一种或多种上述AAV cap有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更多相似。
在一些实施方案中，AAV cap是嵌合的，包括来自两个、三个、四个或更多个上述AAV cap的域。在一些实施方案中，AAV cap是源自两个或三个不同AAV的VP1、VP2和VP3单体的嵌合体，或重组AAV。在一些实施方案中，rAAV组合物包含一个以上的上述cap。
在一些实施方案中，用于rAAV病毒体的AAV cap被工程化为包含异源序列或其他修饰。例如，可以将赋予选择性靶向或免疫逃避的肽或蛋白序列工程化为cap蛋白。替代地或另外地，可以对cap进行化学修饰，使得rAAV的表面被聚乙二醇化(即peg化)，这可以促进免疫逃避。还可将cap蛋白诱变(例如，以去除其天然受体结合或掩盖免疫原性表位)。
如本文所用，术语“rep蛋白”是指具有天然AAV rep蛋白(例如，rep 40、52、68、78)的至少一种功能活性的多肽。rep蛋白的功能活性的实例包括与该蛋白的生理功能相关的任何活性，包括通过识别来促进DNA复制、结合和切口DNA复制的AAV起始点以及DNA解旋酶活性。其他功能包括调节从AAV(或其他异源)启动子的转录以及AAV DNA进入宿主染色体的位点特异性整合。在特定实施方案中，AAV rep基因可以来自血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAVrh10；更优选地，来自选自AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAVrh10的AAV血清型。
在一些实施方案中，用于本发明方法的AAV rep蛋白可以通过一种上述AAV rep或其编码核酸的诱变(即通过插入、缺失或取代)来产生。在一些实施方案中，AAV rep与一种或多种上述AAV rep有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更多相似。
如本文所用，表达方式“辅助功能”或“辅助基因”是指AAV复制所依赖的病毒蛋白。辅助功能包括AAV复制所需的那些蛋白质，包括但不限于与AAV基因转录激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物合成和AAV衣壳装配相关的那些蛋白质。基于病毒的辅助功能可以来源于任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除单纯疱疹病毒1型以外)和牛痘病毒。辅助功能包括但不限于腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、ULB、UL52和UL29以及疱疹病毒聚合酶。在优选的实施方案中，AAV复制所依赖的蛋白质来源于腺病毒。
在一些实施方案中，用于本发明方法的AAV复制所依赖的病毒蛋白可以通过一种上述病毒蛋白或其编码核酸的诱变(即通过插入、缺失或取代)来产生。在一些实施方案中，该病毒蛋白与一种或多种上述病毒蛋白有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更多相似。
用于测定AAV复制所依赖的cap蛋白、rep蛋白和病毒蛋白的功能的方法是本领域公知的。
表达感兴趣转基因(例如，变体ATP7B序列)的宿主细胞可以在足以装配AAV病毒体的条件下生长。在某些实施方案中，宿主细胞生长一段合适的时间以促进AAV病毒体的装配和病毒体向培养基中的释放。通常，细胞可以生长约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或至多约10天。在约10天后(或更早，取决于培养条件和所用的具体宿主细胞)，生产水平通常会明显下降。通常，从病毒产生的点开始测量培养时间。例如，在AAV的情况下，病毒产生通常在如本文所述的合适的宿主细胞中提供辅助病毒功能时开始。通常，在辅助病毒感染后(或在病毒产生开始之后)约48至约100、优选约48至约96、优选约72至约96、优选约68至约72小时收获细胞。
可以在适合于所使用的具体宿主细胞的多种条件(在宽温度范围内、持续变化的时间长度等)下生长rAAV生产培养物。rAAV生产培养物包括附着-依赖性培养物，其可以在合适的附着-依赖性容器中培养，例如，滚瓶、中空纤维过滤器、微载体以及填充床或流化床生物反应器。rAAV载体生产培养物中还可以包括适应悬浮的宿主细胞，例如HeLa、293和SF-9细胞，其可以通过多种方式培养，包括旋转烧瓶、搅拌罐生物反应器和一次性系统，例如Wave袋系统。
本领域已知的合适的培养基可以用于产生rAAV病毒体。这些培养基包括但不限于Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括改良Eagle培养基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，每一种均通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，rAAV生产培养基可以补充具有0.5％-20％(v/v或w/v)水平的血清或血清衍生重组蛋白。或者，可以在无血清条件下产生rAAV载体，该无血清条件也可以称为没有动物衍生产物的培养基。
在培养宿主细胞以允许产生AAV病毒体后，可以收获并纯化所得的病毒体。在某些实施方案中，(1)可以通过溶解宿主细胞从生产培养物的宿主细胞获得AAV病毒体，和/或(2)可以在转染一段时间(优选72小时)后从所述细胞的培养基中获得AAV病毒体。只要在导致rAAV病毒体从完整细胞释放到培养基中的条件下培养细胞，就可以从生产培养物中用过的培养基收获rAAV病毒体(参见例如，美国专利号6,566,118)。溶解细胞的合适方法在本领域中也是已知的，并且包括例如多个冷冻/融化循环、声波处理、微流化和用化学物质如去污剂和/或蛋白酶处理。
收获后，可以纯化rAAV病毒体。如本文所用，术语“纯化”包括不含至少一些其他组分的rAAV病毒体的制备手段，该其他组分也可以存在于天然出现rAAV病毒体的地方或存在于最初制备rAAV病毒体的地方。因此，例如，可以使用分离技术从源混合物(例如培养物裂解物或生产培养物上清液)中富集rAAV病毒体，来制备纯化的rAAV病毒体。可以通过多种方式来测量富集度，例如通过溶液中存在的DNA酶抗性颗粒(DRP)或基因组拷贝(gc)的比例或通过传染性，或者可以相对于源混合物中存在的第二种潜在干扰物(例如污染物，包括生产培养物污染物或过程中的污染物，包括辅助病毒、培养基组分等)来对其进行测量。
在某些实施方案中，可以将rAAV生产培养物获取物澄清以去除宿主细胞碎屑。在一些实施方案中，可以使用多种标准技术来将生产培养物获取物澄清，例如，离心或通过孔径为0.2μm或更大的过滤器(例如，乙酸纤维素过滤器或一系列深层过滤器)过滤。
在某些实施方案中，将rAAV生产培养物获取物进一步用BenzonaseTM处理以消化生产培养物中存在的任何高分子量DNA。在一些实施方案中，BenzonaseTM消化作用在标准条件下进行，例如，在从环境温度至37℃的温度下，BenzonaseTM的最终浓度为1-2.5单位/ml，时间为30分钟至数小时。
在某些实施方案中，可以使用以下一种或多种纯化步骤来分离或纯化rAAV病毒体：平衡离心；流通式阴离子交换过滤；用于浓缩rAAV颗粒的切向流过滤(TFF)；用磷灰石色谱法捕获rAAV；辅助病毒热灭活；通过疏水相互作用色谱法捕获rAAV；通过大小排阻色谱法(SEC)进行缓冲液交换；纳米过滤；以及通过阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法或亲和色谱法捕获rAAV。这些步骤可以单独、以各种组合或以不同的顺序使用。纯化rAAV颗粒的方法可见于，例如，Xiao等人,(1998)Journal of Virology 72:2224-2232；美国专利号6,989,264和8,137,948；以及WO 2010/148143中。
在某些实施方案中，纯化的AAV病毒体可以用PBS透析、过滤并储存在-80℃。病毒基因组的滴度可以通过定量PCR确定，使用线性化质粒DNA作为标准曲线(参见例如，Lock M等人,Hum.Gene Ther.2010；21:1273-1285)。
药物组合物
在某些实施方案中，本申请提供了包含变体ATP7B序列和药学上可接受的运载体的组合物。在其他实施方案中，本申请提供了包含变体ATP7B序列和药学上可接受的运载体的病毒体。在示例性实施方案中，这样的组合物适用于基因疗法应用。药物组合物优选在生产和储存条件下是无菌的和稳定的。无菌溶液可以通过例如滤过无菌滤膜来实现。
药物组合物中可接受的运载体和赋形剂优选在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。可接受的运载体和赋形剂可包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、EPES和TAE；抗氧化剂，例如抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂，例如氯化六甲双铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚和苯扎氯铵；蛋白质，例如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖和免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸；以及碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和山梨糖醇。本公开内容的药物组合物可以以可注射制剂的形式肠胃外施用。可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物来配制用于注射的药物组合物。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水和生理盐水。
本公开内容的药物组合物可以在微胶囊中制备，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。本公开内容的药物组合物也可以在其他药物递送系统中制备，例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊。用于基因疗法的药物组合物可以在可接受的稀释剂中或者可以包含其中嵌入有基因递送媒介物的缓释基质。
本文提供的药物组合物可以配制用于肠胃外施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、鞘内施用或腹膜内施用。药物组合物也可以配制成用于或通过鼻、喷雾、口腔、气雾剂、直肠或阴道施用。在一个实施方案中，本文提供的药物组合物通过间质途径施用，即通过注射到或注射入组织的间隙。组织靶标可以是特异性的，例如肝脏组织，或者可以是几种组织的组合，例如肌肉和肝脏组织。示例性的组织靶标可以包括肝、骨骼肌、心肌、脂肪沉积物、肾、肺、血管内皮、上皮和/或造血细胞。在优选的实施方案中，本文提供的药物组合物通过肝内注射，即注射到肝脏组织的间质间隙中来施用。这些方法中的一种或多种可以用于施用本公开内容的药物组合物。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含“有效量”或“治疗有效量”。如本文所用，这样的量是指在达到期望的治疗结果所必需的剂量和时间段下有效的量，该治疗结果是例如增加ATP7B表达的水平和/或提高铜转位活性，从而增加胆汁中的铜并减少血清、肝脏、大脑和尿液中的铜。
本公开内容的药物组合物的剂量取决于包括施用途径、待治疗的疾病和受试者的身体特性(例如年龄、体重、总体健康)在内的因素。可以调整剂量以提供最适的治疗反应。通常，剂量可以是有效治疗疾病而不引起明显毒性的量。在一个实施方案中，本文提供的AAV载体可以以5x1011至1x1014gc/kg(基因组拷贝/每千克患者体重(gc/kg))范围内的量或剂量施用于患者以治疗ATP7B缺乏(包括例如威尔逊氏病)。在更具体的实施方案中，AAV载体以包含在约5x1011gc/kg至约3x1013gc/kg、或约1x1012至约1x1014gc/kg、或约1x1012至约1x1013gc/kg或约5x1011gc/kg、1x1012gc/kg、1.5x1012gc/kg、2.0x1012gc/kg、2.5x1012gc/kg、3x1012gc/kg、3.5x1012gc/kg、4x1012gc/kg、4.5x1012gc/kg、5x1012gc/kg、5.5x1012gc/kg、6x1012gc/kg、6.5x1012gc/kg、7x1012gc/kg、7.5x1012gc/kg、8x1012gc/kg、8.5x1012gc/kg、9x1012gc/kg或9.5x1012gc/kg的范围内的量施用。可以通过例如qPCR或数字液滴PCR(ddPCR)来确定gc/kg(参见例如，M.Lock等人,Hum Gene Ther Methods.2014Apr；25(2):115-25)。在另一个实施方案中，本文提供的AAV载体可以以1x109至1x1011iu/kg(载体的感染单位(iu)/受试者或患者体重(kg))范围内的量或剂量施用于患者以治疗ATP7B缺乏(包括例如威尔逊氏病)。在某些实施方案中，药物组合物可以根据需要以单位剂量形成。这样的单剂量单位可包含约1x109gc至约1x1015gc。
本公开内容的药物组合物可以例如每天、每周、每月、每半年、每年或根据医学需要一次或多次(例如1-10次或更多次)施用于有需要的受试者。在示例性实施方案中，单次施用是足够的。在一个实施方案中，药物组合物适合用于人类受试者，并且静脉内施用。在一个实施方案中，药物组合物通过推注经由外周静脉递送。在其他实施方案中，药物组合物通过经约10分钟(±5分钟)、经约20分钟(±5分钟)、经约30分钟(±5分钟)、经约60分钟(±5分钟)或经约90分钟(±10分钟)的输注而经由外周静脉递送。
另一方面，本申请进一步提供了一种试剂盒，其包含在一个或多个容器中的本文所述的核酸分子、载体、宿主细胞、病毒体或药物组合物。试剂盒可包括说明或包装材料，其说明如何将试剂盒中包含的核酸分子、载体、宿主细胞或病毒体施用于患者。试剂盒的容器可以是任何合适的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并且可以是任何合适的大小、形状或构造。在某些实施方案中，试剂盒可包括一个或多个安瓿或注射器，其包含以合适的液体或溶液形式的核酸分子、载体、宿主细胞、病毒体或药物组合物。
治疗方法
另一方面，本申请提供了方法，该方法通过施用包含本文所述的变体ATP7B核酸序列的核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物或病毒体来增加在细胞、组织或受试者中ATP7B的表达；治疗受试者中与ATP7B表达降低或ATP7B功能缺乏相关的疾病或病症；或治疗威尔逊氏病。可以使用任何已知技术将变体ATP7B核酸序列递送至感兴趣的细胞，以在体外、体内或离体赋予或诱导变体ATP7B转基因在感兴趣的细胞、组织或受试者中的表达。
在一个实施方案中，本申请提供了一种使用包含本文所述的变体ATP7B核酸序列的核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物或病毒体来增加细胞、组织或受试者中的ATP7B表达水平的方法。在某些实施方案中，相对于施用包含变体ATP7B核酸序列的核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物或病毒体之前在细胞、组织或受试者中ATP7B的表达水平，在细胞、组织或受试者中ATP7B的表达水平增加至少约1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍或50倍，或至少约2％、5％、10％、20％、25％、50％、75％、80％、90％、100％、125％、150％或200％。可以使用各种方法来确定来自受试者的细胞、组织或样品中ATP7B表达的水平，包括例如qPCR、RNA印迹、蛋白质印迹、ELISA测定法等。在某些实施方案中，待处理的细胞、组织或受试者包含内源基因组ATP7B中的突变，使得ATP7B的表达水平降低和/或功能性ATP7B的表达水平降低。在某些实施方案中，细胞、组织或受试者对于ATP7B是单倍体不足的。在示例性实施方案中，本申请提供了用于在受试者中增加ATP7B表达的方法，其包括向有需要的受试者施用包含与启动子可操作地连接的本文所述的变体ATP7B核酸序列的AAV病毒体。
在另一个实施方案中，本申请提供了用于治疗受试者的与ATP7B表达降低、ATP7B功能缺乏或其中ATP7B表达和/或活性的上调可产生治疗益处的任何其他病症相关的疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用包含本文所述的变体ATP7B核酸序列的核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物或病毒体。其中ATP7B表达和/或功能的增强可能有益的病症的实例包括，例如，与ATP7B依赖性溶酶体胞吐作用减少和溶酶体中铜积累相关的病症，例如胆汁郁积病症、阿尔茨海默病和/或癌症(例如参见，Polishchuck等人,DevCell.29(6),686-700(2014)；Gupta和Lutsenko,Future Med.Chem.1:1125-1142(2009))。在某些实施方案中，受试者包含内源基因组ATP7B中的突变，使得ATP7B的表达水平降低和/或功能性ATP7B的表达水平降低。在某些实施方案中，受试者对于ATP7B是单倍体不足的。在某些实施方案中，受试者具有引起疾病的ATPB变体蛋白。在示例性实施方案中，本申请提供了一种用于治疗受试者的与ATP7B表达降低、ATP7B功能缺乏或其中ATP7B表达和/或活性的上调可产生治疗益处的任何其他病症相关的疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用包含与启动子可操作地连接的本文所述的变体ATP7B核酸序列的AAV病毒体。
在另一个实施方案中，本申请提供了一种用于治疗威尔逊氏病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用包含本文所述的变体ATP7B核酸序列的核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物或病毒体。威尔逊氏病是铜代谢的常染色体隐性遗传病，其中铜无法并入肝脏的铜蓝蛋白中，因此不能从肝脏排泄到胆汁中。铜在肝脏中积累，随后在大脑和肾脏中积累。疾病的特征是神经系统的临床表现和肝硬化体征。威尔逊氏病是遗传的代谢错误，主要由ATP7B基因突变引起，而ATP7B基因编码铜转运P型ATP酶。ATP7B负责将铜从细胞内伴侣蛋白转运到分泌途径中，以排泄到胆汁中且并入脱铜铜蓝蛋白中，从而合成功能性铜蓝蛋白。威尔逊氏病的发展归因于受影响组织中铜的积累(参见例如，EASL Clinical PracticeGuidelines:Wilson’s disease,EASL Journal of Hepatology,2012,56(671-85)以及WD,Online Mendelian Inheritance in Man，目录登录号OMIN 277900；可在万维网omim.org/entry/277900获取)。hATP7B基因中的各种突变和/或所产生的蛋白质是已知的，它们存在于部分或全部威尔逊氏病患者中。可以在万维网uniprot.org/uniprot/P35670上找到导致威尔逊氏病的已知突变的完整列表。
威尔逊氏病的临床标志是Kayser-Fleischer环，该环存在于95％的有神经系统症状的患者中和略超一半的无神经系统症状的患者中。神经系统体征多变，最常见的是震颤、共济失调和肌张力障碍。威尔逊氏病患者可能会遇到任何类型的肝脏疾病。临床上明显的肝脏疾病可能比神经系统症状早出现达10年，并且大多数具有神经系统症状的患者在就诊时有一定程度的肝脏疾病。肝脏疾病的症状变化可以很大，从无症状、仅有生化异常到明显的肝硬化及其所有并发症。威尔逊氏病也可能表现为急性肝衰竭，有时伴有Coombs-阴性溶血性贫血和急性肾衰竭。参见例如，EASL Clinical Practice Guidelines:Wilson’sdisease,EASL Journal of Hepatology,2012,56(671-85)。
在各种实施方案中，可以根据本文提供的方法治疗患有任何严重程度的威尔逊氏病的受试者。在某些实施方案中，患有威尔逊氏病的受试者可以具有以下一种或多种特征：升高的血清胆红素水平(例如，大于约100μmol/L)、升高的天冬氨酸转氨酶(AST)水平(例如，大于约100U/L)、升高的国际标准化比率(INR)水平(例如，大于约1.3)、升高的白细胞(WBC)计数(例如，大于约6.8x109/L)和/或降低的白蛋白水平(例如，小于约44g/L)。可用于鉴别威尔逊氏病患者的其他合适的测试包括，例如，非铜蓝蛋白结合铜(NCC；也称为“游离铜”或铜指数)、24小时尿铜、肝铜以及遗传突变测试(参见例如McMillin等人,Am J ClinPathol.2009；131(2):160-165(2009)中关于测量铜水平的示例性方法)。
在各种实施方案中，本文提供的包括施用变体ATP7B序列的方法可以减轻、缓解或降低威尔逊氏病的一种或多种症状的严重程度，包括例如，增加和/或恢复全铜蓝蛋白合成、铜蓝蛋白氧化酶活性和/或胆汁中的铜排泄(从而减少血清、肝脏、大脑和尿液中的铜积累)，和/或可以减轻、缓解或减少腹痛、疲劳、黄疸、不受控运动的频率、肌肉僵硬、言语、吞咽或身体协调问题的严重程度。在某些实施方案中，本文提供的包括施用变体ATP7B序列的方法可导致以下结果中的一个或多个：血清铜水平降低25％或更多，每24小时尿铜排泄3-8μmol或更低，血清非铜蓝蛋白结合铜(NCC)正常化(<150μg/L)，血清氨基转移酶正常化(肝脏生物化学，ALT/AST)，尿Cu正常化(<40μg/24小时(0.6μmol/24小时)的正常上限)，血清铜蓝蛋白正常化(>200mg/L)，临床总体印象(CGI)量表的改善。在各种实施方案中，可通过测量非铜蓝蛋白结合铜、24-h尿铜或肝铜水平和/或通过饮食铜耐受性的临床评估来评价结果。在某些实施方案中，本文提供的包括施用变体ATP7B序列的方法可导致血清铜水平降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更多。
在示例性实施方案中，本申请提供了一种用于治疗威尔逊氏病的方法，其包括向有需要的受试者施用包含与启动子可操作地连接的本文所述的变体ATP7B核酸序列的AAV病毒体。
在某些实施方案中，本文提供的涉及施用包含本文所述的变体ATP7B核酸序列的核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物或病毒体的方法可进一步包括施用一种或多种其他治疗剂。例如，在某些实施方案中，本文提供的方法可涉及用螯合剂(如D-青霉胺和曲恩汀)治疗，和/或用其他药剂(如二巯基丁二酸钠、二巯基丁二酸、锌和四硫钼酸盐)治疗。在其他实施方案中，本文提供的方法可以涉及治疗正在进行低铜饮食的受试者。在各种实施方案中，其他治疗剂可以与本文所述的变体ATP7B核酸同时或顺序施用。例如，可以在包含本文所述的变体ATP7B核酸序列的核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物或病毒体的施用之前、之后和/或之前和之后施用其他治疗剂。在其他实施方案中，可以将其他治疗剂与包含本文所述的变体ATP7B核酸序列的核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物或病毒体同时施用。
在各种实施方案中，可根据本文所述的方法治疗的受试者是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、沙鼠、牛、绵羊、猪、山羊、驴、马、狗、猫、美洲驼、猴(例如，猕猴，例如恒河猴或食蟹猴)或人类。在示例性实施方案中，受试者是人类。
序列
表1：ATP7B序列
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表2：调控元件序列
Figure BDA0003164595520000992
Figure BDA0003164595520001001
表3：其他启动子序列
Figure BDA0003164595520001002
Figure BDA0003164595520001011
Figure BDA0003164595520001021
实施例
提供这些实施例仅出于说明的目的，并非限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1
ATP7B密码子优化变体在HEK293细胞中的表达
按照标准方法培养HEK293细胞，并在6孔板的每孔中用3ug的质粒进行转染(PEI)。转染后72h，收集细胞并根据制造商的方案，包括柱上DNA酶处理，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用OligoDT引物(65℃5m、55℃10m、85℃10m)用Superscript IV(Invitrogen)将RNA(3ug)逆转录。通过标准曲线来测试对ATP7B的密码子优化变体有特异性的引物以测试其可靠度，并将cDNA用于在以下条件下的qPCR(Phusion，SYBR Green)：(98℃2m、40X[98℃10s、58℃30s、92℃15s])。
表4：ATP7B构建体和GAPDH的正向引物和反向引物的序列。
Figure BDA0003164595520001022
针对WT ATP7B(SEQ ID NO：1)、ATP7B变体2号(SEQ ID NO：4)和ATP7B变体3号(SEQID NO：5)的引物显示出接近100％的可比扩增效率(数据未显示)。将ATP7B表达相对于GAPDH标准化，并使用δ-δCt方法表示为相对于基线的倍数变化。
结果示于图1。HEK293细胞中ATP7B变体2(SEQ ID NO：4)的表达水平比野生型ATP7B(SEQ ID NO：1)的表达水平高约2.5倍，并且HEK293细胞中ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)的表达水平比野生型ATP7B(SEQ ID NO：1)的表达水平高约5.5倍。
实施例2
ATP7B密码子优化变体在小鼠肝脏中的表达
通过尾静脉向C57BL/6小鼠(n＝10只小鼠/每种条件)注射AAV8载体(1E12 gc/小鼠)，该载体含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的野生型ATP7B(SEQ ID NO：1)或密码子优化ATP7B变体2或3(分别为SEQ ID NO：4和5)。在病毒递送后两周收获肝脏。将左肝叶在RNA later(Invitrogen，AM7020M)中存储过夜，并在去除RNA later后转移至-80℃下，用于通过RT-qPCR分析人类ATP7B RNA。
表5：ATP7B(WT或密码子优化变体)在转染小鼠肝脏中的表达
Figure BDA0003164595520001031
Figure BDA0003164595520001041
如表5和图2所示，小鼠肝脏中ATP7B变体2(SEQ ID NO：4)的表达水平比野生型ATP7B(SEQ ID NO：1)的表达水平高约5倍，并且小鼠肝脏中ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)的表达水平比野生型ATP7B(SEQ ID NO：1)的表达水平高约7.8倍。
实施例3
HEK293T细胞中从短启动子的高表达
在几种不同调控元件(即无启动子对照、SCP、CMV、SEQ ID NO：21(与minCMV可操作地连接的SEQ ID NO：19)、SEQ ID NO：22(与minCMV可操作地连接的SEQ ID NO：20)和CAG)之一的控制下，用含有萤光素酶基因的质粒DNA转染HEK293T细胞。每个构建体的标准化萤光素酶值在图3A中示出。每个构建体的大小标准化的活性值在图3B中示出。上面的表2和表3提供了本文使用的调控元件和启动子的序列。与单独的minCMV和单独的SCP相比，与minCMV启动子连接的调控元件SEQ ID NO：19和与minCMV启动子连接的调控元件SEQ IDNO：20驱动更高水平的萤光素酶表达。与没有调控元件(即SEQ ID NO：19或20)的对照、SCP或minCMV启动子相比，当与minCMV启动子连接时，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20都驱动HEK293T肾细胞中萤光素酶的高表达。
如图3C、图3D和图3E所示，用另外的对照和调控序列进行了相似的标准化萤光素酶表达实验。还测定了萤光素(Firefly)表达，以确保在所有测试样品中具有相似的转染效率。在图3C中，将调控元件SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO 37、SEQID NO：38和SEQ ID NO：39的标准化萤光素酶表达与两个阴性对照(即，已知不驱动任何表达的序列)进行比较。所测试的每种调控元件均导致高水平的萤光素酶表达，例如与阴性对照相比，至少10、50或100或更多倍。
在图3D中，将来自包含调控元件SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQID NO：32或SEQ ID NO：33的质粒的标准化萤光素酶表达与阴性对照以及包含与萤光素酶可操作连接的CMV连接CMVe或CMV的相似质粒进行比较。与阴性对照、单独的CMV和CMV+CMVe相比，所测试的每个调控元件(即SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33)均导致更高的萤光素酶表达。与包含连接至萤光素酶的CMV启动子或CMV+CMVe的质粒相比，测试的相对较短的调控元件显示出至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或超过50倍的标准化萤光素酶表达。
在图3E中，将与萤光素酶可操作地连接的包含调控元件SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43的质粒的标准化萤光素酶表达与阴性对照(即，已知没有表达活性的序列)进行比较。每个调控元件(即SEQ IDNO：28、29和40-43)驱动的萤光素酶表达均高于阴性对照，而SEQ ID NO：41驱动的标准化萤光素酶表达高于102，或比阴性对照的萤光素酶表达至少高100倍。
实施例4
肝脏中从短启动子的野生型ATP7B表达
向C57BL6/J小鼠静脉内注射含有在SEQ ID NO：23控制下的野生型ATP7B的AAV8载体。在病毒递送后两周收获肝脏。将肝冲压物(liver punches)破坏并在补充有10ul/mLβ-巯基乙醇的600ul RLT中匀浆，并使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案(包括柱上DNA酶处理)提取RNA。对于每个样品，使用OligoDT引物(65℃5m、55℃10m、85℃10m)用Superscript IV(Invitrogen)将RNA(3ug)逆转录。用标准曲线针对人类ATP7B(5’-CATTCCAGGACTGTCCATTCT-3’(SEQ ID NO：64)；5’-GGCCTGAACGTAGAAGTACCA-3’(SEQ ID NO：65)和GAPDH(5’ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(SEQ ID NO：44)；5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(SEQ ID NO：45))验证了引物以确保可靠度，并用于在以下扩增条件下的qPCR(Phusion、SYBR Green)：(98℃2m、40X[98℃10s、67℃30s、92℃15s])。将ATP7B表达相对于GAPDH标准化并使用δ-δCt方法表示为相对于基线的倍数变化。如图4和表6所示，SEQ ID NO：23在三种不同剂量下均驱动肝脏中ATP7B的表达，并显示出剂量响应性，最高病毒剂量导致最高的ATP7B表达。
表6：转染小鼠的肝脏中的ATP7B表达
Figure BDA0003164595520001061
实施例4说明，包含与ATP7B转基因可操作地连接的本文公开的一种或多种调控元件的表达盒可用于治疗有需要的动物、哺乳动物或人类受试者中与ATP7B缺乏相关的病症或病况，例如威尔逊氏病。进一步地，这样的表达盒可以使用rAAV8通过例如静脉内注射或输注在体内全身递送。
实施例5
肝脏中的高EGFP转录
在各种调控元件：SEQ ID NO：22、23、24、25、26、27和33的控制下，向C57BL6/J小鼠静脉内注射含有EGFP的AAV8载体。每个AAV8载体以5x1011 gc/小鼠的剂量施用。在病毒递送后两周收获肝脏。将肝冲压物破坏并在补充有10ul/mLβ-巯基乙醇的600ul RLT中匀浆，并使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案(包括柱上DNA酶处理)提取RNA。对于每个样品，使用OligoDT引物(65℃5m、55℃10m、85℃10m)用Superscript IV(Invitrogen)将RNA(3ug)逆转录。将针对EGFP(5’-GCTACCCCGACCACATGAAG-3’(SEQ ID NO：46)；5’-TCTTGTAGTTGCCGTCGTCC-3’(SEQ ID NO：47))和GAPDH(SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45)的引物用于在以下扩增条件下的qPCR(Phusion，SYBR Green)：(98℃2m、40X[98℃10s、65℃30s、92℃15s])。将EGFP表达相对于GAPDH标准化并使用δ-δCt方法表示为相对于基线的倍数变化(图5)。如图5中所示，如通过RNA转录物所测量的，所测试的每个调控元件均在肝脏中增加了EGFP表达。进一步地，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：24产生了相当水平的EGFP。
实施例5说明，如通过RNA转录物所测量的，本公开内容的相对短的调控元件可导致肝脏中高水平的转基因表达。
实施例6
高百分比的肝细胞表达EGFP
向野生型(C57B16/J)小鼠静脉内(尾静脉)注射包含在候选调控元件控制下的融合至KASH核栓系域的EGFP(EGFP-KASH)的AAV 8(5x1011 gc/小鼠)，或PBS对照。注射后四周，处死动物并从右肝侧叶收集4mm肝冲压物并将其储存在RNAlater中。
将肝冲压物(N＝5个，1个/每只动物)匀浆于裂解缓冲液中以释放细胞核。通过离心获得粗细胞核制品，并用DAPI染色以确认细胞核完整性。使用PBS-注射的对照样品定义选通策略，通过流式细胞术(LSRII流式细胞仪)分析细胞核的GFP表达。对于每个样品，记录了10,000个事件，并使用FlowJo软件分析数据。确定GFP+和GFP-细胞核，以使＜99.5％的对照样品视为GFP阳性。数据表示为总DAPI+事件中被检测为GFP+的百分比(图6)。如图6所示，所测试的许多调控元件在小鼠的高百分比的肝细胞中表达，其中SEQ ID NO:24在大于80％的肝细胞中表达。
实施例7
在小鼠模型中治疗威尔逊氏病
可以在多种小鼠品系中测试使用本文所述的核酸构建体对威尔逊氏病和/或其症状的治疗，该小鼠品系是例如Long Evans Cinnamon大鼠品系，其ATP7B基因缺失300bp，导致蛋白质丢失(K.Terada等人,Pediatr Int.41(4):414-8(1999))；Jackson’s toxic milk小鼠品系(txj)，其在ATP7B编码序列中具有Gly712Asp错义突变，该突变对应于编码蛋白的第二个推定的跨膜域，并产生功能失调的ATP7B蛋白(EA Roberts等人,Mol GenetMetab.93(l):54-65(2008))；ATP7B敲除小鼠(ATP7B KO，ATP7B-/-或WD小鼠)，其通过在小鼠ATP7B mRNA中引入早期终止密码子而产生的，这是通过对ATP7B外显子2的一部分被定向在相对转录框的新霉素盒的置换进行工程化来实现的(Buikova O.I.等人,Human MolecularGenetics 8(9):1665-1671(1999))；以及ATP7B小鼠品系(D.Huster D等人,Am JPathol.168(2):423-34(2006))。ATP7B敲除小鼠在肝脏中未显示ATP7B表达，在尿中显示高Cu排泄，在血清中全铜蓝蛋白的水平低，转氨酶水平高，在肝脏中Cu浓度高，以及病态的肝脏组织学。这些小鼠除了神经系统受累外，还表现出人类威尔逊氏病的典型生化特征。
为了测试本文所述的ATP7B变体组合物，包括AAV基因疗法和使用这样的基因疗法的治疗，向上述每种小鼠品系的威尔逊氏病模型小鼠和对照小鼠(例如具有野生型ATP7B基因的小鼠)注射(例如，通过静脉内注射来施用)对照(例如，PBS、空AAV或表达eGFP或另一报告基因的AAV)或包含变体ATP7B序列(例如，如以上表1所述的任一个变体ATP7B序列)的表达盒。一些AAV可以进一步包含如以上表2中所述的一个或多个调控元件序列。
注射AAV后，随时间定期监测以下一项或多项测量值：血清丙氨酸转氨酶(ALT)、血清天冬氨酸转氨酶(AST)和总血清胆红素水平、血清铜水平、血清铜蓝蛋白活性和/或尿液铜水平。
可以确定血清ALT、AST和/或胆红素水平，例如，通过收集血液样品并经由AntechDiagnostics(Irvine,CA,USA)或经由使用Hitachi747临床分析仪(Clinical Analyzer)(Hitachi,Tokyo,Japan)的DGKC方法(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)进行分析。血清铜蓝蛋白活性可以例如以邻联茴香胺二盐酸盐(4,4’-二氨基-3,3’-二甲氧基-联苯)为底物(Sigma-Aldrich,San Louis,MO,United States)，并且如Schosinsky(ClinicalChemistry 1974；20(12):1556-1563)所述在分光光度计中测量540nm处的吸光度来确定。血清和尿铜含量可以例如通过原子吸收光谱法(SIMAA 6000,Perkin-Elmer GmbH,Bodenseewerk)、通过电感耦合等离子体质谱仪或通过Exova(Edinburgh,UK)来确定。此外，可以通过蛋白质印迹来评价血液样品中铜蓝蛋白的铜结合形式和非铜结合形式的水平。
此外，在用AAV处理小鼠后，可使用各种PCR和/或测序方法随时间监测ATP7B的表达水平，以显示ATP7B AAV处理可导致ATP7B表达的增加。还可使用RNA印迹分析和原位杂交来分析体内的ATP7B表达。还可在处理后监测ATP7B蛋白质的水平，以显示ATP7B mRNA表达的增加与ATP7B蛋白表达的增加相关。ATP7B蛋白质可以用各种方法来测定，包括但不限于蛋白质印迹分析、免疫组织化学法、荧光免疫组织化学法和/或ELISA测定。
在施用载体后6-7个月处死动物，并可以切除肝脏用于组织学分析。例如，可通过原子吸收光谱法(SIMAA6000,Perkin-Elmer GmbH,Bodenseewerk)和Timm硫化银染色(Danscher G.和Zimmer J.,Histochemistry 1978；55(1):27-40)测定干燥的肝脏组织中的肝铜含量。可例如在经苏木精和曙红染色的切片中评估肝脏结构。用抗小鼠CD45抗体(BioLegend,San Diego,USA；目录号103102)进行的免疫组织化学法可用于检测肝脏中的炎症浸润。此外，也可以进行采用抗小鼠PanCk抗体(Invitrogen/Life Technologies,18-0132,克隆AE1/AE3)的免疫组织化学法，以检测胆细胞。可以使用常规的天狼猩红染色作为胶原蛋白的测定方法来确定肝纤维化。
可向小鼠施用不同剂量的包含表达盒的AAV以确定每种基因疗法治疗的安全性和功效特征。这些临床前研究还可以为用于治疗威尔逊氏病的基因疗法提供最佳剂量。
实施例8
AAV8递送的ATP7B的肝表达
通过将终止密码子插入小鼠ATP7B(ATP7B KO)编码区的外显子2中来生成ATP7B无效小鼠。通过使用三重转染对贴壁HEK293T细胞进行瞬时转染，用AAV5衣壳蛋白生成AAV8病毒并进行假型化。重组载体通过超速离心和柱色谱法纯化，然后装瓶之前进行无菌过滤。通过尾静脉向C57BL6雄性小鼠(约8周大)静脉内注射AAV8，其浓度为1x1011 gc/小鼠或2x1011gc/小鼠，含有在各种调控元件(SEQ ID NO：24、66、67、68、69和70)控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。在病毒递送后四周收获肝脏。从右肝侧叶收集四毫米肝冲压物，并从这些样品中收集RNA样品。使用RNA样品进行QPCR分析，以建立ATP7B转基因表达的水平。简而言之，使用RNeasy试剂盒从肝脏样品中提取RNA，然后使用SuperScript IV第一链合成系统从输入的RNA样品生成cDNA。根据制造商的方案，使用KAPA SYBR Fast qPCR master mix建立QPCR反应，并在Roche LightCycler 96系统上进行反应。使用GAPDH作为内部对照将表达水平标准化。观察到，当针对注射病毒的浓度标准化时，具有SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：67候选物的启动子候选物在所有测试的候选物中显示出最高水平的ATP7B表达(图8)。使用来自PBS处理的动物的肝脏样品未观察到可检测水平的hATP7B RNA。
表7：ATP7B构建体和GAPDH的正向和反向引物序列。
Figure BDA0003164595520001111
还通过蛋白质印迹分析测量了ATP7B蛋白表达。通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为1x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在病毒递送后五个月收获肝脏。从右肝侧叶收集四毫米肝冲压物，并在液氮中冷冻。将肝冲压物(每只动物1个)浸入裂解缓冲液中以释放和溶解蛋白质。在离心以清理裂解物后，进行蛋白质印迹分析以测量ATP7B表达。将约15微克的总蛋白质加载到凝胶上以进行蛋白质印迹，并使用Abcam重组抗ATP7B抗体(EPR6793，目录号ab131208)来检测ATP7B蛋白。病毒处理导致ATP7B KO雄性和雌性中有稳健且持久的ATP7B表达(图9)。没有观察到胱天蛋白酶3蛋白丰度或裂解的明显差异。每个泳道代表来自标记组中单个动物的样品。
还通过MSD-ELISA分析测量了ATP7B蛋白表达。通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为1x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在病毒递送后五个月收获肝脏。从右肝侧叶收集四毫米肝冲压物，并在液氮中冷冻。将肝冲压物(每只动物1个)浸入裂解缓冲液中以释放和溶解蛋白质。在离心以清理裂解物后，进行MSD-ELISA分析以测量ATP7B表达。沿标准曲线，将研究样品接种在涂有抗ATP7B mAb(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的MSD板上，并使用第二抗ATP7B pAb(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)以三明治ELISA形式进行检测。然后，向板添加SULFOTAG报告抗体(Meso Scale Diagnostics,Rockville,MD)。在添加1X读取缓冲液时进行读出，并在MSD机器上读取该板。通过相对于标准曲线反算电化学发光信号来获得ATP7B的样品浓度。在雄性和雌性ATP7B KO小鼠中，病毒处理都导致了稳健且持久的ATP7B表达(图10A和10B)。
最后，测量了体内肝脏载体的拷贝数。通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为1x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在病毒递送后五个月收获肝脏，并如上所述收集并处理肝冲压物以产生基因组DNA制品。在所得的基因组DNA制品中定量病毒DNA的含量。用DNeasy Blood&Tissues试剂盒(Qiagen)分离小鼠肝脏DNA。测定DNA量并使用UV分光光度计标准化。将20ng肝脏DNA与ddPCR Super Mix for Probes(无dUTP)(Bio-Rad)和TaqMan引物以及针对ATP7B密码子优化序列的区域的探针一起添加到20μl反应中。产生微滴并使用自动微滴发生器(Bio-Rad)和热循环仪(Bio-Rad)将模板扩增。PCR后，加载样品并通过QX2000液滴读取仪进行读取以确定肝脏中的载体拷贝数。小鼠基因组Tfrc(Tfrc)序列用作用于将基因组DNA含量标准化的内部对照(Thermo Fisher Scientific)，并在同一反应中进行了扩增。病毒处理导致ATP7B KO雄性和雌性动物的肝脏中稳健且持久的病毒含量(图11)。TaqManTM拷贝数参考测定，小鼠，Tfrc；使用目录号4458367(Thermo FisherScientific)进行拷贝数分析。
表8：ATP7B构建体的正向和反向引物和探针的序列。
构建体 引物/探针序列 SEQ ID NO
ATP7B变体3正向引物 5’-GTGATGGAGGACTATGCCGG-3’ 73
ATP7B变体3反向引物 5’-TTCTGGTCAGCTTGCTCTCG-3’ 74
探针 5’-TGGCAACATCGAGCTGACCATCACAGGCA-3’ 75
实施例9
ATP7B的病毒施用减轻ATP7B KO动物中的肝毒性
测量丙氨酸转氨酶(ALT)活性以评估ATP7B动物的肝损伤。ALT活性是肝损伤的常用血清生物标志物，其中ALT活性升高表明正在进行的肝损伤。通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为1x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在病毒注射后每3周收集血清样品，持续注射后前三个月。还在尸检过程中收集了终末血清样品。用血清样品进行ALT测量。ALT活性是根据制造商的手册使用临床分析仪进行测量的。病毒处理显著减轻了ATP7B KO动物中ALT的诱导，表明ATP7B KO模型中肝损伤的正常化(图12)。
天冬氨酸转氨酶(AST)活性是动物肝损伤的另一种常用血清生物标志物，其中AST活性升高表明正在进行的肝损伤。测量AST活性以评估ATP7B动物的肝损伤。通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为1x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ IDNO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在病毒注射后每3周收集血清样品，持续注射后前三个月。还在尸检过程中收集了终末血清样品。用血清样品进行AST测量。ALT活性是根据制造商的手册使用临床分析仪进行测量的。病毒处理显著减轻了ATP7B KO动物中AST的诱导，表明ATP7B KO模型中肝损伤的正常化(图13)。
还评价了野生型和ATP7B KO小鼠肝脏的炎症、纤维化和大细胞变化。如上所述，用含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)的AAV8或PBS对照处理小鼠。在注射病毒后五个月收集终末血清样品。对终末血清样品进行全面的血清化学组(panel)分析，以测量肝损伤和代谢功能，包括ALP、ALT、AST、白蛋白、胆红素、胆固醇和葡萄糖水平的测量。使用临床分析仪按照制造商的手册进行血清化学组分析。在ATP7B KO动物中观察到广泛的生化变化。用含有ATP7B变体3的AAV8处理将这些变化完全正常化至WT水平(图14)。
还根据制造商的说明，使用小鼠TIMP1 ELISA试剂盒(Sigma RAB0468-1KT)对终末血清样品进行了ELISA分析，以得到TIMP1蛋白的丰度。TIMP1是肝纤维化的基于血清的生物标志物。在PBS处理的ATP7B KO动物中观察到血清TIMP1显著增加，与正在进行的肝纤维化一致。病毒处理使ATP7B KO动物中的血清TIMP1水平完全正常化至WT水平(图15)。
实施例10
ATP7B的病毒施用减轻ATP7B KO动物体内铜浓度的增加
通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为1x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在注射病毒后21周收集尿液样品。根据制造商的手册，使用PerkinElmer SciexElan6000ICP质谱仪通过电感耦合等离子体质谱测量铜浓度。与WT动物相比，ATP7B KO动物的尿铜浓度显著增加。但是，病毒处理显著减轻了在ATP7B KO小鼠中观察到的尿铜浓度的增加(图16)。
还测量了注射含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ IDNO：5)的AAV8或注射PBS对照的ATP7B KO小鼠的终末血清和脑样品中的铜浓度。在注射病毒后五个月收集终末血清和脑样品，并进行铜测量。ATP7B KO动物在血清和脑中的铜水平均升高。然而，病毒处理使在ATP7B KO动物中观察到的增加的铜含量正常化(图17和18)。
还用罗丹明将肝组织染色，以评估WT和ATB7B KO小鼠的铜沉积水平。罗丹明是一种螯合剂，对组织切片中的蛋白质铜沉积物具有很强的亲和力，通常用于检测威尔逊氏病患者的样品中的铜沉积物。在注射病毒后五个月，处理WT和ATP7B KO小鼠的肝组织以进行组织学分析。收获组织，用福尔马林固定24小时，然后石蜡包埋并切成5um厚的切片。对石蜡切片进行脱蜡处理，并用苏木精和曙红(H&E)、天狼猩红(PSR)、罗丹明和抗αSMA染色。常规组织学按照J.A.Keirnan,Histological and Histochemical Methods第五版中的程序进行。H&E在第149-150页，PSR在第190-191页而罗丹明在第331页。对于免疫组织化学，脱蜡处理后，将组织在95℃下在pH 6的柠檬酸盐缓冲液中加热，然后用抗αSMA(abcam ab5694)染色，抗αSMA用抗兔HRP(Thermo A16110)和随后的Akoya TSA-Fitc检测。组织在AkoyaPolaris上以20倍的放大率成像。DAPI染色允许细胞核卵裂和在CellProfiler中进行计数，并且对αSMA染色的区域进行定量并相对于细胞核计数标准化。罗丹明染色显示，与WT动物的肝组织相比，PBS处理的ATP7B KO动物的肝组织显示铜沉积显著增加，这与铜积累是威尔逊氏病肝脏的主要特征这一事实相符。然而，用含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)的AAV8病毒进行的处理减轻了ATP7b KO小鼠肝脏中的铜沉积(图19)。
还评价了野生型和ATP7B KO小鼠肝脏的炎症、纤维化和大细胞变化。如上所述，用含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)的AAV8或PBS对照处理小鼠。在注射病毒后五个月，处理WT和ATP7B KO小鼠的肝组织以进行组织学分析。独立病理学家的盲病理学评价强调了PBS处理的ATP7B KO动物中的肝脏炎症增加、纤维化增加和大细胞变化。病毒处理将这些变化完全正常化至WT水平。肝脏炎症的评分遵循基于该研究的评分系统(Brunt,Hepatology 31(1):241-246(2000))，使用从0到4的递增量表：0(不存在)、1(轻度)、2(中度)、3(显著)和4(严重)。肝纤维化的评分遵循基于该研究的评分系统(T.Gilat等人,Hepatology 38(2):436-442(2003))，使用从0到4的递增量表。大细胞变化的评分遵循基于该研究的评分系统(B.Thoolen等人,Toxicologic Pathology 38(7):5S-81S(2010))，使用从0到4的递增量表。图中的每个点代表单个动物的得分(图20)。
实施例11
ATP7B的病毒施用减轻ATP7B KO动物的肝损伤
通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为1x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在注射后五个月，如上所述处理肝组织用于组织学分析。病毒处理显著减轻了ATP7BKO动物中免疫细胞浸润的诱导(图21A)。
还使用天狼猩红(PSR)染色试剂盒(Abcam ab150681)中所述的标准染色程序进行肝组织PSR染色。PSR染色显示，与WT动物的肝组织相比，PBS处理的ATP7B KO动物的肝组织显示纤维化明显增加(黑色箭头)。然而，用含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)的AAV8病毒进行的病毒处理使ATP7B KO动物中免疫细胞浸润的诱导正常化(图21B)。
进一步对肝组织进行α-SMA染色分析。α-SMA是活化的肝星状细胞的标志物，阳性信号表明正在进行的肝损伤/纤维化反应。在PBS处理的ATP7B KO动物中观察到肝星状细胞的显著激活(由白色箭头显示)，与正在进行的肝纤维化和免疫浸润相一致。用含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)的AAV8病毒进行的病毒处理将这些变化完全正常化，回到WT水平(图22)。
实施例12
ATP7B KO动物中的转录组分析
通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为1x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。从肝脏样品中收集RNA样品，并进行全转录组分析。根据制造商的手册，使用IlluminaTruSeq链式mRNA样品制备试剂盒生成多聚腺苷酸RNA测序文库，并在NextSeq 500系统上进行测序。每个样品产生约2000万次读取。使用Hisat2、StringTie和DEseq2根据各自的手册进行了读取映射、转录组装配和基因表达分析。在比较WT处理的ATP7B KO动物和PBS处理的ATP7B KO动物的多种生物学途径中，鉴别了显著变化。病毒处理使ATP7B KO动物的先天免疫和肝脏代谢途径的转录组水平变化显著正常化，回到WT水平。
还使用转录组数据集进行了主成分分析(PCA)。PCA分析用于描述高维数据集的相似性和方差，并且是定义RNA测序样品的相似性(即鉴别亚组或异常值)的常用方法。根据用户手册，使用R中的DESeq2包进行PCA分析。与WT动物相比，在PBS处理的ATP7B KO动物中鉴别到转录组特征的重大变化。病毒处理使ATP7B KO动物中的转录组特征正常化，回到WT水平。
为了验证在转录组分析中显示差异表达的关键基因，对RNA样品进一步进行QPCR分析。实例包括Col1A1、Col3A1、Col4A1、Col16A1，所有这些都是编码对胶原合成和肝纤维化重要的组分的基因。MMP2是一种金属蛋白酶，对于细胞外基质重塑很重要，并且在肝纤维化中具有促纤维发生的作用。IL6是一种调节炎症的细胞因子，HMGCR是参与肝脏胆固醇生物合成的关键酶。在QPCR验证与转录组谱分析数据之间观察到高度一致性，其中ATP7B KO动物显示出参与肝纤维化的胶原和促炎基因的显著诱导，以及代谢基因(例如HMGCR)的减少。病毒处理使ATP7B KO动物中的基因表达谱正常化，回到WT水平(图23)。
表9：针对Col1A1、Col3A1、Col4A1、Col16A1、MMP2、IL-6和HMGCR的用于QPCR的正向和反向引物序列。
Figure BDA0003164595520001171
实施例13
在AAV5和AAV8中的ATP7B的小鼠肝表达
通过尾静脉向C57BL6雄性小鼠(约8周大)静脉内注射AAV8或AAV5，其浓度为1x1011gc/小鼠、5x1011 gc/小鼠或2.5x1012 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：67的启动子控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)。在病毒递送后四周收获肝脏。从右肝侧叶收集四毫米肝冲压物，并从这些样品中收集RNA样品。使用RNA样品进行QPCR分析，以建立ATP7B转基因表达的水平。简而言之，使用RNeasy试剂盒从肝脏样品中提取RNA，然后使用SuperScript IV第一链合成系统从输入的RNA样品生成cDNA。根据手册使用KAPA SYBR Fast qPCR master mix建立QPCR反应，并在Roche LightCycler 96系统上进行该反应。使用GAPDH作为内部对照将表达水平标准化。我们观察到，施用AAV8病毒导致最高水平的ATP7B表达，而施用AAV5病毒也显示出ATP7B表达增加(图24)。使用来自PBS处理的动物的肝脏样品未观察到可检测水平的hATP7B RNA。以上表7列出了本研究中用于ATP7B构建体和GAPDH的正向和反向引物。
在注射了含有在具有SEQ ID NO：67的启动子控制下的ATP7B变体#3(SEQ ID NO：5)的AAV8或AAV5病毒(浓度为1x1011 gc/小鼠、5x1011 gc/小鼠或2.5x1012 gc/小鼠)的小鼠中，测量了体内肝载体拷贝数。在病毒递送后四周收获肝脏，并如上所述处理以产生基因组DNA制品。在所得的基因组DNA制品中将病毒DNA的含量定量。用DNeasy Blood&Tissues试剂盒(Qiagen)分离小鼠肝脏DNA。测定DNA量并使用UV分光光度计标准化。将20ng肝脏DNA与ddPCR Super Mix for Probes(无dUTP)(Bio-Rad)和TaqMan引物以及针对ATP7B密码子优化序列的区域的探针一起添加到20μl反应中。产生微滴并使用自动微滴发生器(Bio-Rad)和热循环仪(Bio-Rad)将模板扩增。PCR后，加载样品并通过QX2000液滴读取仪进行读取以确定肝脏中的载体拷贝数。小鼠基因组Tfrc(Tfrc)序列用作用于将基因组DNA含量标准化的内部对照(Thermo Fisher Scientific)，并在同一反应中进行了扩增。病毒处理导致WT动物的肝脏中有稳健且持久的病毒含量(图25)。TaqManTM拷贝数参考测定，小鼠，Tfrc；使用目录号4458367(Thermo Fisher Scientific)进行拷贝数分析。
表10：ATP7B构建体的正向和反向引物和探针的序列。
Figure BDA0003164595520001181
Figure BDA0003164595520001191
如上所述，还通过MSD-ELISA分析测量了ATP7B蛋白表达。通过尾静脉向C57BL6雄性小鼠(约8周大)静脉内注射不同浓度的AAV8或AAV5，其含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在病毒递送后四周，处理肝脏并进行MSD-ELISA分析以测量ATP7B表达。病毒处理导致WT动物中剂量依赖性的ATP7B表达(图26)。
实施例14
ATP7 KO动物中的铜蓝蛋白活性
铜蓝蛋白活性是肝脏ATP7B活性的生物标志物，高度依赖于肝脏中正常的铜转运/代谢。通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为5x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在注射病毒后每3周收集血清样品。铜蓝蛋白活性是根据制造商的手册使用铜蓝蛋白比色活性试剂盒(Arbor assays K035-H1)进行测量的。与WT动物相比，PBS处理的ATP7B KO动物表现出明显较低的铜蓝蛋白活性。病毒处理使ATP7B KO动物中的铜蓝蛋白活性缺陷正常化，表明ATP7B KO模型中铜代谢的正常化(图27)。
类似地在静脉内(尾静脉)注射AAV5(5x1012 gc/小鼠)或PBS对照的4-6周大ATP7BKO小鼠中测量铜蓝蛋白活性，该AAV5含有在具有SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3。在病毒注射后每3周收集血清样品，并如上所述测定铜蓝蛋白活性。与WT动物相比，PBS处理的ATP7B KO动物表现出明显较低的铜蓝蛋白活性，而病毒处理使ATP7B KO动物的铜蓝蛋白活性缺陷正常化。这证实了被施用AAV5病毒的ATP7B KO小鼠的铜代谢正常化(图28)。
实施例15
ATP7B的病毒施用减轻ATP7B KO动物的肝毒性
在静脉内(尾静脉)注射AAV8(5x1011 gc/小鼠)或PBS对照的4-6周大的ATP7B KO小鼠中测量ALT和AST活性，该AAV8含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3。在病毒注射后每3周收集血清样品，持续注射后前三个月。还在尸检过程中收集了终末血清样品。如上所述用血清样品进行ALT和AST测量。病毒处理显著减轻了ATP7B KO动物中ALT和AST的诱导，表明ATP7B KO模型中肝损伤的正常化(图29和30)。
类似地在静脉内(尾静脉)注射AAV5(5x1012 gc/小鼠)或PBS对照的4-6周大的ATP7B KO小鼠中测量ALT和AST活性，该AAV5含有在具有SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3。在病毒注射后每3周收集血清样品，持续注射后前三个月。还在尸检过程中收集了终末血清样品。如上所述，用血清样品进行ALT和AST测量。病毒处理显著减轻了ATP7B KO动物中ALT和AST的诱导，表明ATP7B KO模型中肝损伤的正常化(图31和32)。
接下来在静脉内(尾静脉)注射AAV5(2x1012 gc/小鼠或5x1012gc/小鼠)或PBS对照的4-6周大的ATP7B KO小鼠中测量ALT和AST活性，该AAV5含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3。在注射病毒后每3-4周收集血清样品。如上所述，用血清样品进行ALT和AST测量。病毒处理显著减轻了ATP7B KO动物中ALT和AST的诱导，进一步证实ATP7BKO模型中肝损伤的正常化(图33和34)。
还对静脉内(尾静脉)注射AAV8(5x1011 gc/小鼠)或PBS对照的ATP7B KO小鼠的血清样品进行了TIMP1蛋白丰度的ELISA分析，该AAV8含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3。根据制造商的手册使用小鼠TIMP1 ELISA试剂盒(Sigma RAB0468-1KT)。TIMP1是肝纤维化的基于血清的生物标志物。在PBS处理的ATP7B KO动物中观察到血清TIMP1显著增加，与正在进行的肝纤维化一致。病毒处理使ATP7B KO动物中的血清TIMP1水平完全正常化，回到WT水平(图35)。
实施例16
ATP7B的病毒施用减轻ATP7B KO动物体内铜浓度的增加
通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV8，其浓度为5x1011 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在注射病毒后3周收集尿液样品。根据制造商的手册，使用PerkinElmer SciexElan6000ICP质谱仪通过电感耦合等离子体质谱测量铜浓度。与WT动物相比，ATP7B KO动物的尿铜浓度显著增加。但是，病毒处理显著减轻了在ATP7B KO小鼠中观察到的尿铜浓度的升高(图36)。
还测量了注射AAV5病毒的小鼠的尿铜浓度。通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV5，其浓度为5x1012 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在注射后16周收集尿液样品。如上所述测量铜浓度。与WT动物相比，ATP7B KO动物的尿铜浓度显著增加，并且病毒处理使尿铜浓度显著正常化(图37)。
然后通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV5，其浓度为2x1012gc/小鼠或5x1012 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQID NO：5)，或注射PBS对照。在注射后4周收集尿液样品。如上所述测量铜浓度。与WT动物相比，ATP7B KO动物的尿铜浓度显著增加，并且病毒处理使尿铜浓度显著正常化(图38)。
实施例17
ATP7B在AAV5小鼠中的肝表达
向ATP7B敲除(KO)小鼠(约4-6周大)静脉内(尾静脉)注射AAV5(2x1012 gc/小鼠或5x1012 gc/小鼠)，其含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ IDNO：5)，或注射PBS对照。在病毒递送后八周处理肝脏，并将其储存在RNAlater试剂中。从保存的肝脏样品中纯化RNA样品，并如上所述，通过QPCR将ATP7B变体3的转录物丰度定量。病毒处理导致ATP7B KO动物中剂量依赖性的ATP7B表达(图39)。
如上所述，通过MSD-ELISA分析测量了ATP7B蛋白表达。通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV5，其浓度为5x1012 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24、SEQID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在病毒递送后五个月，如上所述处理肝脏，并进行MSD-ELISA分析以测量ATP7B表达。病毒处理导致ATP7BKO动物中稳健且持久的ATP7B表达(图40)。
还通过MSD-ELISA分析在以5×1012gc/小鼠或2×1012gc/小鼠的浓度被施用AAV5的小鼠中测量了ATP7B蛋白表达。向ATP7B敲除(KO)小鼠(约4-6周大)静脉内(尾静脉)注射含有在具有SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)的AAV5，或PBS对照。在病毒递送后四周或八周，如上所述处理肝脏，并如前所述进行MSD-ELISA分析以测量ATP7B表达。病毒处理导致ATP7B KO动物中剂量依赖性的ATP7B表达(图41)。
还通过蛋白质印迹分析测量了ATP7B蛋白表达。通过尾静脉向ATP7B KO小鼠(约4-6周大)静脉内注射AAV5，其浓度为5x1012 gc/小鼠，含有在具有SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：67的启动子的控制下的ATP7B变体3(SEQ ID NO：5)，或注射PBS对照。在病毒递送后五个月收获肝脏。从右肝侧叶收集四毫米肝冲压物，并在液氮中冷冻。将肝冲压物(每只动物1个)浸入裂解缓冲液中以释放和溶解蛋白质。在离心以清理裂解物后，进行蛋白质印迹分析以测量ATP7B表达。将约15ug的总蛋白加载到凝胶上以进行蛋白质印迹，并使用Abcam重组抗ATP7B抗体(EPR6793，目录号ab131208)检测ATP7B蛋白。病毒处理导致ATP7B KO雄性和雌性稳健且持久的ATP7B表达(图42)。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (173)

1.一种核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列具有(i)与SEQ ID NO：3或4至少80％的序列同一性，或(ii)与SEQ ID NO：5或6至少92％的序列同一性，其中所述核酸分子编码功能性ATP7B蛋白。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：3或4具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：3或4具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：3-6中任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含具有SEQ ID NO：3-6中任一个的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码ATP7B的功能片段。
7.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有SEQ ID NO：2的ATP7B蛋白。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的核酸分子，其中肝脏中所述功能性ATP7B蛋白从所述核酸分子的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高3倍。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中肝脏中所述功能性ATP7B蛋白从所述核酸分子的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高5倍。
10.根据权利要求9所述的核酸分子，其中肝脏中所述功能性ATP7B蛋白从所述核酸分子的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高7倍。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的核酸分子，其进一步包含调控元件。
12.根据权利要求11所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少85％序列同一性的序列。
13.根据权利要求12所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少90％序列同一性的序列。
14.根据权利要求13所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。
15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中所述调控元件包含具有SEQ ID NO：19-43中的任一个的序列。
16.根据权利要求11-15中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件包含启动子序列。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中相对于CMV启动子，所述启动子序列在哺乳动物细胞中产生的表达至少高10倍。
18.根据权利要求16所述的核酸分子，其中相对于CMV启动子，所述启动子序列在哺乳动物细胞中产生的表达至少高50倍。
19.根据权利要求11-18中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件进一步包含增强子序列。
20.根据权利要求11-19中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件小于150bp。
21.根据权利要求11-19中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件小于120bp。
22.根据权利要求11-19中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件小于105bp。
23.根据权利要求1-22中的任一项所述的核酸分子，其进一步包含病毒的5’ITR和3’ITR序列。
24.根据权利要求23所述的核酸分子，其中所述5’ITR和3’ITR序列是腺伴随病毒(AAV)序列。
25.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述AAV是AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。
26.一种表达载体，其包含权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子。
27.根据权利要求26所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
28.根据权利要求27所述的表达载体，其中所述病毒载体是AAV载体。
29.一种病毒颗粒，其包含权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子或权利要求26-28中的任一项所述的表达载体。
30.根据权利要求29所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含AAV的衣壳蛋白。
31.根据权利要求30所述的病毒颗粒，其中所述AAV是AAV5、AAV8或AAV9。
32.一种宿主细胞，其包含权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子或权利要求26-28中的任一项所述的表达载体。
33.一种药物组合物，其包含权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子、权利要求26-28中的任一项所述的表达载体或权利要求29-31中的任一项所述的病毒颗粒，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
34.一种用于在受试者中增加功能性ATP7B蛋白的表达的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子、权利要求26-28中的任一项所述的表达载体、权利要求29-31中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求33所述的药物组合物。
35.一种用于治疗与ATP7B缺乏相关的病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子、权利要求26-28中的任一项所述的表达载体、权利要求29-31中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求33所述的药物组合物。
36.一种用于治疗威尔逊氏病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子、权利要求26-28中的任一项所述的表达载体、权利要求29-31中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求33所述的药物组合物。
37.权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子、权利要求26-28中的任一项所述的表达载体、权利要求29-31中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求33所述的药物组合物用于增加受试者中功能性ATP7B的表达的用途。
38.权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子、权利要求26-28中的任一项所述的表达载体、权利要求29-31中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求33所述的药物组合物用于增加对与ATP7B缺乏相关的病症的治疗的用途。
39.权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子、权利要求26-28中的任一项所述的表达载体、权利要求29-31中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求33所述的药物组合物用于治疗威尔逊氏病的用途。
40.一种生产根据权利要求29-31中的任一项所述的病毒颗粒的方法，其包括：(i)在培养基中培养根据权利要求32所述的宿主细胞，以及(ii)从细胞培养上清液或所述宿主细胞收获所述病毒颗粒。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述宿主细胞进一步包含(a)编码AAV rep和/或cap基因的核酸分子，和/或(b)包含病毒辅助基因的核酸分子。
42.权利要求1-25中的任一项所述的核酸分子或权利要求26-28中的任一项所述的表达载体用于生产病毒颗粒的用途。
43.一种核酸分子，其包含：
(i)调控元件，所述调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及
(ii)编码功能性ATP7B蛋白的变体核苷酸序列，其中所述变体核苷酸序列已被优化以在肝脏中从病毒载体表达。
44.根据权利要求43所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少85％序列同一性的序列。
45.根据权利要求44所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少90％序列同一性的序列。
46.根据权利要求45所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：19-43中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。
47.根据权利要求46所述的核酸分子，其中所述调控元件包含具有SEQ ID NO：19-43中的任一个的序列。
48.根据权利要求43-47中的任一项所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列已被密码子优化以在肝脏中表达。
49.根据权利要求43-48中的任一项所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列已被优化以从AAV载体表达。
50.根据权利要求43-49中的任一项所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列与SEQID NO：3-18中的任一个具有至少80％的序列同一性。
51.根据权利要求50所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少85％的序列同一性。
52.根据权利要求51所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少90％的序列同一性。
53.根据权利要求52所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少95％的序列同一性。
54.根据权利要求53所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列包含SEQ ID NO：3-18中的任一个。
55.根据权利要求43-54中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件是启动子序列。
56.根据权利要求43-55中的任一项所述的核酸分子，其进一步包含增强子序列。
57.根据权利要求43-56中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件小于150bp。
58.根据权利要求43-56中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件小于120bp。
59.根据权利要求43-56中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件小于105bp。
60.根据权利要求43-59中的任一项所述的核酸分子，其中相对于CMV启动子，所述调控元件在哺乳动物细胞中产生的表达至少高10倍。
61.根据权利要求43-60中的任一项所述的核酸分子，其中相对于CMV启动子，所述调控元件在哺乳动物细胞中产生的表达至少高50倍。
62.根据权利要求43-61中的任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码ATP7B的功能片段。
63.根据权利要求43-61中的任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有SEQID NO：2的ATP7B蛋白。
64.根据权利要求43-63中的任一项所述的核酸分子，其中肝脏中所述功能性ATP7B蛋白从所述变体核苷酸序列的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高5倍。
65.根据权利要求43-63中的任一项所述的核酸分子，其中肝脏中所述功能性ATP7B蛋白从所述变体核苷酸序列的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高7倍。
66.根据权利要求43-65中的任一项所述的核酸分子，其进一步包含病毒的5’ITR和3’ITR序列。
67.根据权利要求66所述的核酸分子，其中所述5’ITR和3’ITR序列是腺伴随病毒(AAV)序列。
68.根据权利要求67所述的核酸分子，其中所述AAV是AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。
69.一种表达载体，其包含权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子。
70.根据权利要求69所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
71.根据权利要求70所述的表达载体，其中所述病毒载体是AAV载体。
72.一种病毒颗粒，其包含权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子或权利要求69-71中的任一项所述的表达载体。
73.根据权利要求72所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含AAV的衣壳蛋白。
74.根据权利要求73所述的病毒颗粒，其中所述AAV是AAV5、AAV8或AAV9。
75.一种宿主细胞，其包含权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子或权利要求69-71中的任一项所述的表达载体。
76.一种药物组合物，其包含权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子、权利要求69-71中的任一项所述的表达载体或权利要求72-74中的任一项所述的病毒颗粒，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
77.一种用于在受试者中增加功能性ATP7B蛋白的表达的方法，其包括向所述受试者施用权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子、权利要求68-70中的任一项所述的表达载体、权利要求72-74中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求76所述的药物组合物。
78.一种用于治疗与ATP7B缺乏相关的病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子、权利要求69-71中的任一项所述的表达载体、权利要求72-74中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求76所述的药物组合物。
79.一种用于治疗威尔逊氏病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子、权利要求69-71中的任一项所述的表达载体、权利要求72-74中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求76所述的药物组合物。
80.权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子、权利要求69-71中的任一项所述的表达载体、权利要求72-74中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求76所述的药物组合物用于增加受试者中功能性ATP7B的表达的用途。
81.权利要求41-68中的任一项所述的核酸分子、权利要求69-71中的任一项所述的表达载体、权利要求72-74中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求76所述的药物组合物用于增加对与ATP7B缺乏相关的病症的治疗的用途。
82.权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子、权利要求69-71中的任一项所述的表达载体、权利要求72-74中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求76所述的药物组合物用于治疗威尔逊氏病的用途。
83.一种生产根据权利要求72-74中的任一项所述的病毒颗粒的方法，其包括：(i)在培养基中培养根据权利要求75所述的宿主细胞，以及(ii)从细胞培养上清液或所述宿主细胞收获所述病毒颗粒。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述宿主细胞进一步包含(a)编码AAV rep和/或cap基因的核酸分子，和/或(b)包含病毒辅助基因的核酸分子。
85.权利要求43-68中的任一项所述的核酸分子或权利要求69-71中的任一项所述的表达载体用于生产病毒颗粒的用途。
86.一种核酸分子，其包含：
(i)调控元件，所述调控元件包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少80％序列同一性的序列，以及
(ii)编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中所述治疗性转基因与所述调控元件可操作地连接。
87.根据权利要求86所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少85％序列同一性的序列。
88.根据权利要求87所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少90％序列同一性的序列。
89.根据权利要求88所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：66-68中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。
90.根据权利要求89所述的核酸分子，其中所述调控元件包含具有SEQ ID NO：66-68中的任一个的序列。
91.根据权利要求90所述的核酸分子，其中所述调控元件包含SEQ ID NO：67。
92.根据权利要求86-91中的任一项所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因编码ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11、CDKL5、CNTNAP2、ZEB2、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI或因子XII中的任一个，或其变体或功能片段。
93.根据权利要求92所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因编码因子VIII或其变体或功能片段。
94.根据权利要求90所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因编码ATP7B或其变体或功能片段。
95.根据权利要求86-94中的任一项所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因包含变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列已被密码子优化以在肝脏中表达。
96.根据权利要求86-95中的任一项所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因包含变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列已被优化以从AAV载体表达。
97.根据权利要求86-96中的任一项所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因包含变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少80％的序列同一性。
98.根据权利要求97所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因序列包含变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少85％的序列同一性。
99.根据权利要求98所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因序列包含变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少90％的序列同一性。
100.根据权利要求99所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因序列包含变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列与SEQ ID NO：3-18中的任一个具有至少95％的序列同一性。
101.根据权利要求100所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因序列包含SEQ ID NO：3-18中的任一个。
102.根据权利要求101所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因序列包含SEQ ID NO：5。
103.根据权利要求86-102中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件是启动子序列。
104.根据权利要求86-103中的任一项所述的核酸分子，其进一步包含增强子序列。
105.根据权利要求86-104中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件小于150bp。
106.根据权利要求86-104中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件小于120bp。
107.根据权利要求86-104中的任一项所述的核酸分子，其中所述调控元件小于105bp。
108.根据权利要求86-107中的任一项所述的核酸分子，其中相对于CMV启动子，所述调控元件在哺乳动物细胞中产生的表达至少高10倍。
109.根据权利要求86-108中的任一项所述的核酸分子，其中相对于CMV启动子，所述调控元件在哺乳动物细胞中产生的表达至少高50倍。
110.根据权利要求86-109中的任一项所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因编码ATP7B的功能片段。
111.根据权利要求86-109中的任一项所述的核酸分子，其中所述治疗性转基因编码具有SEQ ID NO：2的ATP7B蛋白。
112.根据权利要求86-111中的任一项所述的核酸分子，其中肝脏中所述功能性ATP7B蛋白从所述治疗性转基因序列的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高5倍。
113.根据权利要求112所述的核酸分子，其中肝脏中所述功能性ATP7B蛋白从所述治疗性转基因序列的表达水平相对于肝脏中ATP7B蛋白从包含SEQ ID NO：1的核酸分子的表达水平至少高7倍。
114.根据权利要求86-113中的任一项所述的核酸分子，其进一步包含病毒的5’ITR和3’ITR序列。
115.根据权利要求114所述的核酸分子，其中所述5’ITR和3’ITR序列是腺伴随病毒(AAV)序列。
116.根据权利要求115所述的核酸分子，其中所述AAV是AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。
117.一种表达载体，其包含权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子。
118.根据权利要求117所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
119.根据权利要求118所述的表达载体，其中所述病毒载体是AAV载体。
120.一种病毒颗粒，其包含权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子或权利要求117-119中的任一项所述的表达载体。
121.根据权利要求120所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含AAV的衣壳蛋白。
122.根据权利要求121所述的病毒颗粒，其中所述AAV是AAV5、AAV8或AAV9。
123.一种宿主细胞，其包含权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子或权利要求117-119中的任一项所述的表达载体。
124.一种药物组合物，其包含权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子、权利要求117-119中的任一项所述的表达载体或权利要求120-122中的任一项所述的病毒颗粒，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
125.一种用于在受试者中增加功能性ATP7B蛋白的表达的方法，其包括向所述受试者施用权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子、权利要求117-119中的任一项所述的表达载体、权利要求120-122中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求124所述的药物组合物。
126.一种用于治疗与ATP7B缺乏相关的病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子、权利要求117-119中的任一项所述的表达载体、权利要求120-122中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求124所述的药物组合物。
127.一种用于治疗威尔逊氏病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子、权利要求117-119中的任一项所述的表达载体、权利要求120-122中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求124所述的药物组合物。
128.权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子、权利要求117-119中的任一项所述的表达载体、权利要求120-122中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求124所述的药物组合物用于增加受试者中功能性ATP7B的表达的用途。
129.权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子、权利要求117-119中的任一项所述的表达载体、权利要求120-122中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求124所述的药物组合物用于增加对与ATP7B缺乏相关的病症的治疗的用途。
130.权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子、权利要求117-119中的任一项所述的表达载体、权利要求120-122中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求124所述的药物组合物用于治疗威尔逊氏病的用途。
131.一种生产根据权利要求120-122中的任一项所述的病毒颗粒的方法，其包括：(i)在培养基中培养根据权利要求123所述的宿主细胞，以及(ii)从细胞培养上清液或所述宿主细胞收获所述病毒颗粒。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述宿主细胞进一步包含(a)编码AAV rep和/或cap基因的核酸分子，和/或(b)包含病毒辅助基因的核酸分子。
133.权利要求86-116中的任一项所述的核酸分子或权利要求117-119中的任一项所述的表达载体用于生产病毒颗粒的用途。
134.一种核酸分子，其包含：
(i)调控元件，所述调控元件包含与SEQ ID NO：24具有至少80％序列同一性的序列，以及
(ii)变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
135.根据权利要求134所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：24具有至少85％序列同一性的序列。
136.根据权利要求135所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：24具有至少90％序列同一性的序列。
137.根据权利要求136所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：24具有至少95％序列同一性的序列。
138.根据权利要求137所述的核酸分子，其中所述调控元件包含具有SEQ ID NO：24的序列。
139.根据权利要求134-138中的任一项所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少85％序列同一性的序列。
140.根据权利要求139所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的序列。
141.根据权利要求140所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的序列。
142.根据权利要求141所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列包含具有SEQ IDNO：5的序列。
143.一种核酸分子，其包含：
(i)调控元件，所述调控元件包含与SEQ ID NO：67具有至少80％序列同一性的序列，以及
(ii)变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性，其中所述变体核苷酸序列编码功能性ATP7B蛋白。
144.根据权利要求143所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：67具有至少85％序列同一性的序列。
145.根据权利要求144所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：67具有至少90％序列同一性的序列。
146.根据权利要求145所述的核酸分子，其中所述调控元件包含与SEQ ID NO：67具有至少95％序列同一性的序列。
147.根据权利要求146所述的核酸分子，其中所述调控元件包含具有SEQ ID NO：67的序列。
148.根据权利要求143-147中的任一项所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少85％序列同一性的序列。
149.根据权利要求148所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的序列。
150.根据权利要求149所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的序列。
151.根据权利要求150所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列包含具有SEQ IDNO：5的序列。
152.根据权利要求134-152中的任一项所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列编码ATP7B的功能片段。
153.根据权利要求134-152中的任一项所述的核酸分子，其中所述变体核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2的ATP7B蛋白。
154.根据权利要求134-153中的任一项所述的核酸分子，其进一步包含病毒的5’ITR和3’ITR序列。
155.根据权利要求154所述的核酸分子，其中所述5’ITR和3’ITR序列是腺伴随病毒(AAV)序列。
156.根据权利要求155所述的核酸分子，其中所述AAV是AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。
157.一种表达载体，其包含权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子。
158.根据权利要求157所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
159.根据权利要求158所述的表达载体，其中所述病毒载体是AAV载体。
160.一种病毒颗粒，其包含权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子或权利要求157-159中的任一项所述的表达载体。
161.根据权利要求160所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含AAV的衣壳蛋白。
162.根据权利要求161所述的病毒颗粒，其中所述AAV是AAV5、AAV8或AAV9。
163.一种宿主细胞，其包含权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子或权利要求157-159中的任一项所述的表达载体。
164.一种药物组合物，其包含权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子、权利要求157-159中的任一项所述的表达载体或权利要求160-162中的任一项所述的病毒颗粒，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
165.一种用于在受试者中增加功能性ATP7B蛋白的表达的方法，其包括向所述受试者施用权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子、权利要求157-159中的任一项所述的表达载体、权利要求160-162中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求164所述的药物组合物。
166.一种用于治疗与ATP7B缺乏相关的病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子、权利要求157-159中的任一项所述的表达载体、权利要求160-162中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求164所述的药物组合物。
167.一种用于治疗威尔逊氏病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子、权利要求157-159中的任一项所述的表达载体、权利要求160-162中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求164所述的药物组合物。
168.权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子、权利要求157-159中的任一项所述的表达载体、权利要求160-162中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求164所述的药物组合物用于增加受试者中功能性ATP7B的表达的用途。
169.权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子、权利要求157-159中的任一项所述的表达载体、权利要求160-162中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求164所述的药物组合物用于增加对与ATP7B缺乏相关的病症的治疗的用途。
170.权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子、权利要求157-159中的任一项所述的表达载体、权利要求160-162中的任一项所述的病毒颗粒或权利要求164所述的药物组合物用于治疗威尔逊氏病的用途。
171.一种生产根据权利要求160-162中的任一项所述的病毒颗粒的方法，其包括：(i)在培养基中培养根据权利要求163所述的宿主细胞，以及(ii)从细胞培养上清液或所述宿主细胞收获所述病毒颗粒。
172.根据权利要求171所述的方法，其中所述宿主细胞进一步包含(a)编码AAV rep和/或cap基因的核酸分子，和/或(b)包含病毒辅助基因的核酸分子。
173.权利要求134-156中的任一项所述的核酸分子或权利要求157-159中的任一项所述的表达载体用于生产病毒颗粒的用途。
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