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CN117947035A - 一种增强基因表达的启动子 - Google Patents

一种增强基因表达的启动子 Download PDF

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CN117947035A
CN117947035A CN202410347741.0A CN202410347741A CN117947035A CN 117947035 A CN117947035 A CN 117947035A CN 202410347741 A CN202410347741 A CN 202410347741A CN 117947035 A CN117947035 A CN 117947035A
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林卿
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Shanghai Lingyi Biotechnology Co ltd
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Abstract

本公开涉及一种新型启动子多核苷酸。此外，本公开还涉及包含本公开中所述的多核苷酸在驱使基因转录表达的核酸构建体、载体、病毒颗粒和组合物，以及在制备用于治疗相关疾病的基因疗法中的用途。

Description

一种增强基因表达的启动子
技术领域
本公开属于生物医学领域，尤其涉及到一种新型启动子的多核苷酸。此外，本公开还涉及包含本公开中所述的多核苷酸在驱使基因转录表达的核酸构建体、载体、病毒颗粒和组合物，以及在制备用于治疗相关疾病的基因疗法中的用途。
背景技术
肝豆状核变性（Wilson disease，WD）是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，主要影响肝脏、神经系统和其他组织。该疾病的根本原因是位于第13号染色体上的ATP7B基因突变，导致ATP7B蛋白功能异常。ATP7B基因编码一种P型铜转运ATP酶，主要在肝细胞中表达，用于铜离子的跨膜转运。ATP7B蛋白功能异常导致肝细胞减少铜排泄到胆汁中，导致肝脏和其他组织中铜离子的积累。在异常铜代谢下，铜蓝蛋白无法结合足够的铜离子，导致额外的溶血性贫血等症状。ATP7B具有基本的P型ATP酶结构，包括一个复杂的细胞质N-末端尾部，其中具有六个独立折叠的约70 个氨基酸长的铜离子响应元件（CREs），以及一个由八个跨膜结构域形成的铜离子跨膜通道。
基因治疗作为一项前沿的生物医学领域，旨在通过调整、修复或替代患者体内的缺陷基因来治疗一系列遗传性疾病和慢性疾病。自20世纪90年代以来，基因治疗已经取得了显著的进展，并在一些临床试验中取得了成功。这种治疗方法的核心思想是利用外源DNA或RNA来修复或替代受影响的基因，从而纠正细胞内的遗传缺陷。因此，研究人员通常选择从其他生物体或人工合成的外源性启动子以确保目的基因能够在体内高效表达。和外源性启动子相比，内源性启动子来源于目的基因上游，它们通常具有更好的生物相容性，与目的基因的协同作用更明显，而且使用内源性启动子表达目的基因可以保留内源的组织特异性、生理和分子调控性等。为了充分利用内源性启动子的优势，本公开开发了不同形式的ATP7B内源性启动子，并通过实验证明其中优选的启动子可以高效驱使ATP7B基因的表达，可用于基因治疗载体以治疗肝豆状核变性。本公开提供了一种潜在的解决方案，能够充分发挥内源性启动子的优势，旨在保留内源组织特异性、生理调控和分子调控等功能的基础上，高效地驱使基因表达，为遗传疾病的治疗方式带来了新的可能性。
发明内容
本公开提供了一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含选自由SEQ ID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：11组成的组的核酸序列所示组成的组的核酸序列。
本公开提供了一种核酸构建体，其包含：
1）感兴趣的多核苷酸序列；
2）与感兴趣的多核苷酸序列可操作连接的转录调控元件，其中所述转录调控元件包含如前所述的多核苷酸，并且，所述转录调控元件位于所述感兴趣的多核苷酸序列的上游。
在一些实施方式中，其中所述感兴趣的多核苷酸序列是编码ATP7B或其变体的核酸序列。
另一方面，本公开提供了一种载体，其包含如前所述的多核苷酸或如前所述的核酸构建体。
在一些实施方式中，其中所述载体是病毒载体，优选地，所述病毒载体是腺相关病毒（AAV）载体、腺病毒载体或慢病毒载体。
另一方面，本公开提供了一种AAV颗粒，其包含如前所述的载体和衣壳蛋白。
在一些实施方式中，其中所述AAV选自由血清型1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、rh10或hu37以及从人类和非人类哺乳动物或其变体中分离的任何一种AAV血清型组成的组。
另一方面，本公开提供了一种药物组合物，包括如前所述的载体、或如前所述的AAV颗粒，以及药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本公开提供了如前所述的多核苷酸、如前所述的核酸构建体、如前所述的载体、如前所述的AAV颗粒或如前所述的药物组合物在制备在受试者中治疗或预防疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中，向受试者施用有效量的如前所述的载体、如前所述的AAV颗粒或如前所述的药物组合物。
在一些实施方式中，其中所述疾病是ATP7B相关疾病，优选地，所述疾病是肝豆状核变性。
在一些实施方式中，其中所述受试者是哺乳动物，优选地，所述受试者是人。
附图说明
参考下述附图，本公开可以被更完全地理解。
图1示出了不同的ATP7B内源性启动子驱使ATP7B基因表达后呈现出的铜转运能力，其中部分启动子和阴性对照相比具有显著优势。更高的相对萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性的比值表示细胞内有更高的铜离子蓄积，对应着更低的铜转运能力。图表中呈现的数据以均值±标准误差（SEM）表示，每组样本大小（n）为3，组间差异标记ns代表p>0.05，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。
具体实施方式
下面关于本公开的描述仅仅旨在说明本公开的各种不同的实施方式。因此，所讨论的特定修改不应被解释为对本公开范围的限制。对本领域技术人员来说，显然可以在不脱离本公开范围的情况下做出各种不同的等效、改变和修改方案，并且应当理解这些等效实施方式将被包含在本文中。本文引用的包含出版物、专利和专利申请在内的所有参考文献均通过引用整体并入本文。
除非另有技术人员通常理解相同的含义。
本文所使用的术语“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基、基本上由所述碱基组成或由所述碱基组成的聚合物。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：1-13的核酸序列。
本文所使用的术语“启动子”意指一种控制序列，其是多核苷酸序列的控制编码序列例如基因或转入基因的转录起始和速率的区域。启动子可以是组成型、诱导型、阻遏型或组织特异性的。在一些实施方式中，所述启动子是截短的内源性启动子，其包含选自SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：11组成的组的核酸序列。
本文所使用的术语“载体”是指包含完整复制子或末端反向重复序列（ITR）、基本上由其组成或由其组成的核酸，使得当所述载体通过例如转染、感染或转化过程置于细胞内时可以被保存和（或）复制。在本领域中应该理解，一旦进入细胞内，载体可以作为染色体外（游离体）元件保存和（或）复制，或者可以整合到宿主细胞染色体中。载体可以包括源自反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒、修饰的杆状病毒、乳头状病毒、AAV病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体等的核酸，优选地，本文所述的载体选自AAV载体、腺病毒载体、或慢病毒载体。
本文所使用的术语“腺相关病毒”或“AAV”是指与该名称相关并属于细小病毒科依赖性细小病毒属的病毒类别的成员。腺相关病毒是一种单链DNA病毒，仅在细胞中生长，其中某些功能由共同感染的辅助病毒提供。所有AAV血清型均明显表现出由同源rep基因介导的非常相似的复制特性；并且都带有三种相关的衣壳蛋白。在本领域中已知至少13种顺序编号的天然存在的AAV血清型。用于本文公开的方法中的非限制性示例性血清型包括这13种血清型中的任一者，例如AAV2、AAV8、AAV9，或变体血清型例如AAV-DJ和AAV PHP.B。AAV颗粒包含三种主要病毒蛋白VP1、VP2和VP3，基本上由所述蛋白组成或由所述蛋白组成。在实施方式中，所述AAV包含选自由AAVPHP.B、AAVrh74、AAV 110、AAV 204、AAV 214、AAV 214A、AAV 214e、AAV 214e8、AAV 214e9、AAV 214el0、AAV ITB102_45和AAV 214AB组成的组的AAV衣壳蛋白。在实施方式中，AAV是指血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13、AAVrh10、AAVhu37或从人类和非人哺乳动物分离的AAV血清型中的任一者或其变体。在实施方式中，AAV颗粒包含选自由AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV Shuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAV Shuffle 10-6、AAVShuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型（true type）AAV（ttAAV）、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAVCBr-7.1、AAV 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CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAVCLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAVCLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAVCSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B（PHP.B）、AAV-PHP.A（PHP.A）、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP（3）、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其变体组成的组。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、大鼠、小鼠、两栖动物、爬行动物等。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”可互换使用。在本公开中，优选的受试者是人类。
如本文所用，术语“治疗”是指向受试者施用有效量的具有根据本文所述的多核苷酸、核酸构建体、载体、AAV颗粒或药物组合物，以使得所述受试者具有所述疾病的至少一种症状的减少或所述疾病的改善，例如，有益的或所需的临床结果。出于本公开的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定（即不恶化）、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解（无论是部分缓解还是全部缓解），无论是可检测的或是不可检测的。治疗可指与未接受治疗情况下的预期存活期相比，延长存活期。因此，本领域的技术人员意识到治疗可改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。如本文所用，术语“治疗”包括预防。或者，治疗在疾病的进展减少或停止的情况下是“有效的”。“治疗”还可意指与在未接受治疗情况下的预期存活期相比，延长存活期。在一些实施方式中，需要治疗的病人包括已经被诊断具有ATP7B相关疾病的病症。在一些实施方式中，需要治疗的病人包括已经被诊断具有肝豆状核变性的病症，以及由于遗传易感性或其他因素可能发展这种病症。
如本文所用，术语“有效量”意指足以达到所需效果的量。在用于治疗或预防的情况下，有效量取决于所讨论的病症的类型和严重程度以及个体受试者的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。在基因治疗中，例如在一些实施方式中，有效量是足以调节相关基因的部分或全部功能的量。在其他实施例中，AAV病毒颗粒的有效量是足以调节受试者中表达基因的量。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的数量。
双荧光素酶检测方法
实验中使用了报告质粒pGL4×MRE-LUC来评估不同ATP7B内源性启动子驱使ATP7B基因转录表达后的铜转运能力。该报告质粒包含了4个金属响应元件（MREs），这些MREs派生自小鼠金属硫蛋白-1启动子，并经过串联克隆至极简E1B启动子的上游共同驱使萤火虫荧光素酶的基因表达，构建成pGL4×MRE-LUC的报告质粒。在实验中，对HEK293T细胞同时转染pGL4×MRE-LUC和包含不同内源性启动子的ATP7B表达载体，同时使用空载质粒作为阴性对照。转染时，所有细胞均转染了相当量的pCMV-RL质粒，以使用海肾荧光素酶的表达作为转染参考。转染24小时后，细胞在含75 µM硫酸铜的完全培养基环境下额外培养24小时，同时包括了未经硫酸铜处理的基线对照组。最后，使用北京全式金生物技术股份有限公司的TransDetect®双荧光素报告试剂盒对萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性进行测量。相对荧光强度单位通过将萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性进行归一化来计算。
统计分析
使用Prism 8（Graph Pad）软件进行统计分析。通过单因素方差分析进行组间差异分析。显著性差异和样本大小在图表或图例中均有明确标示。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的，并且不打算以任何方式限制本公开的范围或内容。
实施例1：对ATP7B转录起始位点上游5000 bp至下游100 bp中转录因子结合位点进行分析，以确定不同ATP7B内源性启动子的设计
转录因子是一种能够特异性结合到目的基因上下游的特定序列上，以确保在特定时间和空间内以特定强度表达目的基因的蛋白质分子。转录因子通过识别特定的DNA序列来控制染色体结构和转录，从而形成一个复杂的系统来指导基因组的表达，这些特定的DNA序列即是转录因子结合位点。
在实验中，选择了33个已知与增强转录活性正相关的转录因子，对ATP7B转录起始位点上游5000 bp至下游100 bp中的这些转录因子结合位点进行了预测分析。如表1所示，结果表明，这些转录因子的结合位点主要富集在ATP7B转录起始位点上游1000 bp至上游3500 bp的区域。
表1.ATP7B转录起始位点上游5000 bp至下游100 bp中和增强活性正相关的转录因子结合位点
注：负值代表转录因子结合位点位于转录起始位点的上游，正值代表转录因子结合位点位于转录起始位点的下游，数字代表转录因子结合位点距离转录起始位点的碱基数，: :代表前后两个转录因子形成的复合体
实施例2：不同的ATP7B内源性启动子均能驱使ATP7B基因转录表达，并表现出显著的铜转运能力
综合考虑ATP7B转录起始位点上下游中转录因子结合位点的富集区域和金属响应元件（MREs）序列的分布，设计了13种不同长度截短的启动子，如表2所示。使用pcDNA3.1作为质粒载体骨架，将全长野生型的ATP7B序列（Genebank NM_000053.4）克隆到了13种启动子的下游。如前文所述，铜转运能力的测试采用了双荧光素酶检测方法，较低的相对萤火虫荧光素酶活性与海葵荧光素酶活性的比值代表更高的铜转运能力。如图1所示，启动子-1、启动子-2、启动子-3、启动子-4、启动子-5、启动子-6、启动子-7、启动子-8、启动子-9、启动子-11、启动子-12和启动子-13均能驱使ATP7B基因转录表达，并表现出良好的铜转运能力，其中启动子-1、启动子-2、启动子-4、启动子-5、启动子-6、启动子-7和启动子-9表现出最优的转录活性。
表2. 不同ATP7B启动子的序列
通过引用并入
本文中提到的每个专利和科学文献的全部内容为所有目的通过引用并入本文。
等同性
本公开可以以其他特定方式体现，而不背离其精神或本质特征。因此，上述实施方式在所有情况下应该被当作是说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。因此，本公开的范围由随附的权利要求书而不是由上述描述指明，并打算将在权利要求书的等同性意义和范围之内的所有变化涵盖在其中。

Claims (10)

1.一种多核苷酸，其中所述多核苷酸选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：11组成的组的核酸序列所示。
2.一种核酸构建体，其包含：
1）感兴趣的多核苷酸序列；
2）与感兴趣的多核苷酸序列可操作连接的转录调控元件，其中所述转录调控元件包含如权利要求1所述的多核苷酸，并且，所述转录调控元件位于所述感兴趣的多核苷酸序列的上游。
3.一种载体，其包含如权利要求1所述的多核苷酸或如权利要求2所述的核酸构建体。
4.如权利要求3所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
5.如权利要求4所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒（AAV）载体、腺病毒载体、或慢病毒载体。
6.一种AAV颗粒，其包含权利要求3至5中任一项所述的载体和衣壳蛋白。
7.如权利要求6所述的AAV颗粒，其中所述AAV选自由血清型1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、rh10或hu37以及从人类和非人类哺乳动物或其变体中分离的任何一种AAV血清型组成的组。
8.一种药物组合物，包括如权利要求3至5中任一项所述的载体、或如权利要求6或7中任一项所述的AAV颗粒，以及药学上可接受的赋形剂。
9.如权利要求1所述的多核苷酸、如权利要求2中所述的核酸构建体、如权利要求3至5中任一项所述的载体、如权利要求6或7所述的AAV颗粒或如权利要求8所述的药物组合物在制备在受试者中治疗或预防疾病的药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述疾病是ATP7B相关疾病。
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