[go: up one dir, main page]

WO2023022633A1 - Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 - Google Patents

Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 Download PDF

Info

Publication number
WO2023022633A1
WO2023022633A1 PCT/RU2022/050257 RU2022050257W WO2023022633A1 WO 2023022633 A1 WO2023022633 A1 WO 2023022633A1 RU 2022050257 W RU2022050257 W RU 2022050257W WO 2023022633 A1 WO2023022633 A1 WO 2023022633A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
capsid
protein
amino acid
modified
acid sequence
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/050257
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Анна Николаевна СТРЕЛКОВА
Сергей Александрович ЛЕГОЦКИЙ
Татьяна Евгеньевна ШУГАЕВА
Павел Михайлович ГЕРШОВИЧ
Александр Владимирович ПРОКОФЬЕВ
Мария Павловна ПЕРЕПЕЛКИНА
Павел Андреевич ЯКОВЛЕВ
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Original Assignee
Акционерное общество "БИОКАД"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2021124727A external-priority patent/RU2820088C1/ru
Priority to CR20240088A priority Critical patent/CR20240088A/es
Priority to IL310961A priority patent/IL310961A/en
Priority to AU2022329630A priority patent/AU2022329630A1/en
Priority to MX2024002199A priority patent/MX2024002199A/es
Priority to EP22858843.0A priority patent/EP4389759A1/en
Application filed by Акционерное общество "БИОКАД" filed Critical Акционерное общество "БИОКАД"
Priority to CA3229587A priority patent/CA3229587A1/en
Priority to PE2024000276A priority patent/PE20241345A1/es
Priority to CN202280056600.2A priority patent/CN117881689A/zh
Priority to US18/684,921 priority patent/US20250127923A1/en
Priority to MA64619A priority patent/MA64619A1/fr
Publication of WO2023022633A1 publication Critical patent/WO2023022633A1/ru
Priority to CONC2024/0001681A priority patent/CO2024001681A2/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/075—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • This application relates to the field of gene therapy and molecular biology. More specifically, the present invention relates to an isolated modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid VP1 protein, which contains one or more amino acid substitutions compared to the wild-type AAV5 capsid VP1 protein, which increase the efficiency of transduction, increase the efficiency of packaging of viral genomes by AAV drugs on based on rAAV5, as well as increase the efficiency of production (assembly) of the vector based on recombinant adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5), capsid and vector based on the above VP1, as well as their use.
  • AAV5 isolated modified adeno-associated virus serotype 5
  • Adeno-associated virus is a small (25 nm), incapable of self-replication, non-enveloped virus. Many different AAV serotypes have been described in humans and primates.
  • the genome of the adeno-associated virus contains (+ or -) single-stranded DNA (ssDNA) with a length of about 4.7 thousand nucleotides. At the ends of the genomic DNA molecule are inverted terminal repeats (ITRs).
  • ITRs inverted terminal repeats
  • the genome contains two open reading frames (ORFs): Rep and Cap, which contain several alternative reading frames encoding various protein products. Rep products are essential for AAV replication, with the Cap gene encoding 3 capsid proteins (VP1, VP2, and VP3) among other alternative products.
  • Proteins VP1, VP2 and VP3 are in a ratio of 1:1:10, forming an icosahedral capsid (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99: 10405-10410).
  • AAV-2 adeno-associated virus
  • rAAV recombinant AAV vector
  • an expression cassette flanked by ITR is packaged into an AAV capsid.
  • the genes required for AAV replication are not included in the cassette.
  • Recombinant AAV is considered the safest and one of the most widely used viral vectors for in vivo gene transfer.
  • the vectors can infect cells of a variety of tissue types, allowing efficient and stable expression of the transgene. They are also non-pathogenic and have a low immunogenicity profile (High KA et al., "rAAV human trial experience” Methods Mol Biol. 2011; 807:429-57).
  • One of the urgent goals of research in the development of effective gene therapy is the optimization of vectors to improve certain properties of these vectors.
  • AAV2 AAV2 binds to heparan sulfate proteoglycans and sialic acid.
  • AAV4 and AAV5 bind to N- and O-linked sialic acids, respectively.
  • AAV5 activates the platelet growth factor receptor.
  • AAV adeno-associated virus
  • WO2013158879 describes an adeno-associated virus (AAV) vector for delivering to a subject a heterologous nucleic acid sequence containing a VP1 capsid protein that contains one or more lysine substitutions, where one lysine substitution is K137R, where said lysine substitution is effective to inhibit ubiquitinylation said capsid protein, thereby increasing the transduction of said AAV vector in the target cell.
  • AAV adeno-associated virus
  • AAVs with improved properties compared to wild-type AAVs which have increased transducing capacity, increased packaging efficiency of AAV viral genomes, and increased production efficiency due to highly efficient production (assembly) of encapsidated viral vectors based on recombinant adeno-associated virus (rAAV).
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • the inventors have surprisingly found that the presence of one or more amino acid substitutions in the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid, which are selected from the group:
  • S2A, T614V and T711S results in an increase in the efficiency of transduction of target cells using an AAV serotype 5 vector with this modification(s) and a significant increase in the efficiency of transgene delivery by rAAV vectors with the above mutations.
  • the inventors have surprisingly found that the presence of one or more amino acid substitutions in the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid, which are selected from the group:
  • S2A, T614V, and T711S leads to improved packaging efficiency of AAV viral genomes with rAAV5-based drugs.
  • the inventors have surprisingly found that the presence of one or more amino acid substitutions in the VP1 protein of the wild-type AAV5 capsid, which are selected from the group:
  • S2A, T614V and T711S leads to increased production (assembly) of encapsidated viral vectors based on recombinant adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) compared with the assembly of encapsidated wild-type rAAV5 viral vectors (without the above mutations), i.e., when assembling encapsidated rAAV5 viral vectors containing the above modifications in the AAV5 capsid, rAAV5-based viral vectors are obtained that contain a transgene (encapsidated heterologous nucleic acid). acid), significantly more often than when assembling encapsidated viral vectors based on wild-type rAAV5 (without the above mutations).
  • rAAV5-based viral vectors that contain a transgene (encapsidated heterologous nucleic acid). acid), significantly more often than when assembling encapsidated viral vectors based on wild-type rA
  • the present invention relates to an isolated modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid VP1 protein for obtaining viral vectors based on recombinant adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5), which contains the amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid protein VP1 encoded by the Cap gene, with one or more substitutions that are selected from the group:
  • amino acid sequence of wild-type AAV5 capsid protein VP1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein includes a substitution at position G226V.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein includes S2A, G226V, and T711S substitutions. In some embodiments, the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein comprises a Tb 14A replacement.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein comprises S2A, T614A, and T711S substitutions.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein comprises a T614V substitution.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein comprises substitutions S2A, T614V, and T711S.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the present invention provides an isolated nucleic acid that encodes any of the above modified adeno-associated virus serotype 5 capsid VP1 proteins used to generate recombinant adeno-associated virus serotype 5 viral vectors.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitution G226V, which is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 11 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus capsid VP1 protein. 5 serotype with amino acid substitutions S2A, G226V and T711 S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 12 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitution T614A and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 13 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, T614A, and T711 S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 14 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitution T614V and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 15 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, T614V, and T711S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 16 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • the present invention relates to an isolated capsid for the production of viral vectors based on recombinant adeno-associated virus serotype 5, which includes any of the above modified adeno-associated virus serotype 5 capsid VP1 proteins.
  • the isolated capsid comprises any of the above modified adeno-associated virus serotype 5 capsid VP1 proteins, the AAV5 capsid VP2 protein or a modified variant, and the AAV5 capsid VP3 protein or a modified variant thereof. In some embodiments, the isolated capsid comprises wild-type AAV5 capsid protein VP2.
  • the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid protein VP2 that has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • the isolated capsid comprises a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP2.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains a G90V substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the G90V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the G90V and T575S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the G90V and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains a T478A substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478A substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478A and T575S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 protein that contains the T478A and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains a T478V substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478V and T575S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478V and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24.
  • the isolated capsid comprises wild-type AAV5 capsid protein VP3.
  • the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid protein VP3 that has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33.
  • the isolated capsid comprises a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP3.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains a G34V substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the G34V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the G34V and T519S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the G34V and T519S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains a T422A substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422A substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422A and T519S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422A and T519S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains a T422V substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422V and T519S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422V and T519S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid that encodes any of the above capsids used to obtain viral vectors based on recombinant adeno-associated virus serotype 5.
  • the present invention relates to a recombinant adeno-associated virus serotype 5 vector for delivering a heterologous nucleic acid sequence to a subject, which comprises:
  • heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells.
  • the rAAV5-based vector comprises a heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product, wherein the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is a therapeutic polypeptide or a reporter polypeptide.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for delivering a gene product to a subject in need, which contains: a) any of the above rAAV5 vectors; and b) a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the present invention relates to a method for delivering a gene product to a subject in need thereof, which comprises administering to the subject any of the above rAAV5-based vectors or the above pharmaceutical composition.
  • the present invention relates to the use of any of the above rAAV5 vectors or the above pharmaceutical composition for the treatment of a disease in a subject in need thereof.
  • the disease is selected from the group: blood diseases; diseases of the central nervous system; metabolic diseases; muscle diseases; hereditary diseases.
  • the present invention relates to a method for producing any of the above rAAV5-based vectors, which comprises transfecting producer cells, respectively, of any of the above nucleic acids, which contain a sequence encoding a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1, or the above nucleic acid encoding the capsid.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • Figure 1 is a circular diagram of the pAAV-linker plasmid for cloning libraries of random serotype AAV capsid gene variants.
  • T2A - a sequence encoding a peptide capable of self-cutting from a polypeptide chain obtained from thosea asigna virus
  • AmpR is the sequence of the beta-lactamase gene that provides resistance to ampicillin in E. coli, pUC origin is a high-copy origin of bacterial replication.
  • Figure 2 is a circular diagram of the pAAV-GFP plasmid.
  • EGFP is a modified green fluorescent protein coding sequence.
  • AmpR is the sequence of the beta-lactamase gene that provides resistance to ampicillin in E. coli, pUC origin is a high-copy origin of bacterial replication.
  • Figure 3 is a circular diagram of the plasmid pAAV-Rep, intended for the production of recombinant viral preparations of wild-type AAV serotype five from a library of random variants.
  • AmpR - beta-lactamase gene sequence providing resistance to ampicillin in E. coli, pUC origin - high-copy origin of bacterial replication,
  • AAV Rep genes the sequence encoding the Rep proteins required for the life cycle of the virus.
  • Figure 4 is a ring diagram of the pHelper plasmid for generating recombinant AAV serotype five wild-type viral preparations from a library of random variants.
  • AmpR is a beta-lactamase gene that provides resistance to ampicillin
  • Ori is the origin of replication in bacteria.
  • Adeno VARNA is a helper adenovirus gene sequence responsible for stimulating the translation of both early and late viral genes.
  • Figure 5 is a graph that shows an analysis of the transduction efficiency of CHO-K1-S cells with rAAV5-GFP-based viral preparations with mutations in the VP1 protein sequence using various MOIs (viral genomes per cell).
  • AAV5-01Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A and T711S mutations.
  • AAV5-02Mut-GFP refers to a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified UR protein! AAV5 capsid with mutations T614V, S2A H T71 1 S.
  • AAV5-03Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with T614A, S2A H T711 S mutations.
  • AAV5-04Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with G226V, S2A and T711S mutations.
  • AAV5-NullMut-GFP denotes an adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising wild-type AAV5 capsid protein VP1.
  • Figure 6 is a diagram of the location of hybridization probes on the vector genome.
  • Probe 3 - detection point of the ssDNA region which is located in the middle of the expression cassette minus the chain (-2400-2500 bp) of DNA;
  • Probe 5 - detection point of the ssDNA region which is located directly at the 5' ITR minus the DNA strand.
  • Probe 2 is a point of detection of the ssDNA region, which is located directly at the 5' ITR plus the DNA strand.
  • Probe 4 - detection point of the ssDNA region which is located in the middle of the expression cassette plus strand (-2400-2500 bp) of DNA;
  • Probe 6 is a detection point for a region of ssDNA that is located directly at the 3' ITR plus strand. DNA.
  • Figure 7 is Southern blot vector DNA hybridization data.
  • pDNA-GFP - Standard sample two-fold serial dilution of pAAV-GFP standard plasmid DNA.
  • vgDNA-NullMut-GFP - Control sample two-fold serial dilution of vector genomic DNA extracted from the control preparation rAAV5 with wild-type capsid protein VP1.
  • vgDNA -02Mut-GFP Two-fold serial dilution of vector genomic DNA extracted from the rAAV5 preparation with VP1 capsid protein containing mutations S2A, T614V H T711 S.
  • FIG. 8 is a diagram of the position of structural AAV5 capsid proteins in the amino acid sequence of the Cap gene.
  • Figure 9 is a graph that shows the analysis of the production efficiency of vectors based on the modified adeno-associated virus 5 serotype (rAAV5).
  • AAV5-01Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with S2A and T711S mutations.
  • AAV5-02Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with T614V, S2A and T711S mutations.
  • AAV5-03Mut-GFP denotes a vector based on a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) comprising a modified AAV5 capsid VP1 protein with TB14A, S2A and T711S mutations.
  • rAAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • AAV5-04Mut-GFP denotes a modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector containing a modified AAV5 capsid VP1 protein with G226V, S2A and T711S mutations.
  • AAV5-NullMut-GFP denotes an adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector comprising wild-type AAV5 capsid protein VP1.
  • Vg/ml kzh denotes the number of viral genomes per milliliter of culture fluid.
  • isolated means altered or removed from the natural state.
  • a nucleic acid or peptide naturally present in living organisms is not “isolated”, but the same nucleic acid or peptide, partially or completely separated from the materials accompanying it in its natural state, is “isolated”.
  • An isolated nucleic acid or protein may exist in a substantially purified form, or may exist in a non-natural environment such as, for example, a genetically modified cell.
  • Naturally occurring is used to describe an object that can be found in nature as being different from that produced artificially.
  • a protein or nucleotide sequence present in an organism that can be isolated from a source in nature, and that is not intentionally modified by a person skilled in the laboratory, is naturally occurring.
  • genome refers to the complete genetic material of an organism.
  • peptide refers to a compound consisting of amino acid residues covalently linked by peptide bonds.
  • a protein or peptide must contain at least two amino acids, and there is no limit to the maximum number of amino acids that a protein or peptide sequence can contain.
  • Polypeptides include any peptide or protein containing two or more amino acids connected to each other by peptide bonds.
  • the term refers to both short chains, also commonly referred to in the art, such as peptides, oligopeptides, and oligomers, and longer chains, commonly referred to in the art as proteins, of which many types exist.
  • Polypeptides include, but are not limited to, for example, biologically active fragments of substantially homologous polypeptides, oligopeptides, homodimers, heterodimers, polypeptide variants, modified polypeptides, derivatives, analogs, fusion proteins. Polypeptides include natural peptides, recombinant peptides, synthetic peptides, or combinations thereof.
  • nucleic acid refers to a distinct sequence of nucleotides, whether or not modified. modified, defining a fragment or region of a nucleic acid, containing or not containing non-natural nucleotides and being either double-stranded DNA or RNA, or single-stranded DNA or RNA, or transcription products of these DNA.
  • polynucleotides include, but are not limited to, all nucleic acid sequences obtained by any means available in the art, including, but not limited to, recombinant methods, i. cloning nucleic acid sequences from a recombinant library or cell genome, using conventional cloning technology and TTPR, and the like, and synthetic methods.
  • nucleotide sequences in their natural chromosomal environment i.e. in a natural state.
  • the sequences of the present invention have been isolated and/or purified, i. were taken directly or indirectly, for example, by copying, while their environment was at least partially modified.
  • isolated nucleic acids obtained by genetic recombination for example by means of host cells, or obtained by chemical synthesis, are also to be understood here.
  • nucleotide sequence embraces its complement unless otherwise indicated.
  • a nucleic acid having a specific sequence is to be understood as spanning its complementary strand with its complementary sequence.
  • AAV Adeno-associated virus
  • Viruses of the Parvoviridae family are small DNA-containing animal viruses.
  • the family Parvoviridae can be divided into two subfamilies: Parvovirinae, whose members infect vertebrates, and Densovirinae, whose members infect insects.
  • Parvovirinae whose members infect vertebrates
  • Densovirinae whose members infect insects.
  • 11 serotypes had been described adeno-associated virus (Mori, S. ET AL., 2004, "Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein", Virology, T. 330 (2): 375-83).
  • Adeno-associated virus type 12 (AAV12): a novel AAV serotype with sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity, J Virol. 2008 Feb;82 (3): 1399-406 doi: 10.1128/JVI.02012-07). All known serotypes can infect cells in many tissue types. Tissue specificity is determined by the serotype of the capsid proteins, so adeno-associated virus-based vectors are constructed by specifying the required serotype. Additional information on parvoviruses and other members of the Parvoviridae is described in the literature (Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)).
  • the genomic organization of all known AAV serotypes is very similar.
  • the AAV genome is a linear single stranded DNA molecule that is less than about 5000 nucleotides (nt) in length.
  • Inverted terminal repeats (ITRs) flank the unique coding nucleotide sequences of proteins (Rep) necessary for the life cycle of the virus, as well as sequences of overlapping capsid proteins (Cap).
  • the Cap gene encodes VP proteins (VP1, VP2 and VP3) that form the capsid, as well as AAP proteins (Protein that activates the assembly of adeno-associated virus (AAV) Research F, Kother K, Schmidt K, et al.
  • the assemblyactivating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes J Virol 2011;85(23): 12686-12697 doi: 10.1128/JVI.05359-ll) and MAAP (Membrane Binding Accessory Protein Ogden PJ, Kelsic ED, Yale S, Church GM Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design Science 2019;366(6469): 1139-1143 doi: 10.1126/science.aaw2900).
  • the flanking sequences of the AAV genome are self-complementary and arranged in such a way that an energetically stable intramolecular duplex can be formed, forming a T-shaped hairpin structure.
  • Such hairpin structures function as origins of viral DNA replication, serving as primers for the cellular DNA polymerase complex.
  • Rep genes eg, Rep78 and Rep52
  • both Rep proteins have a specific function in viral genome replication.
  • Splicing in the Rep open reading frame (Rep ORF) results in the expression of actually four Rep proteins (eg, Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40).
  • Rep78 and Rep52 proteins is sufficient for the production of the AAV vector in mammalian cells.
  • Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector
  • vector means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked.
  • vector in this present document means a viral particle capable of transporting a nucleic acid.
  • expression is defined as the transcription and/or translation of a particular nucleotide sequence driven by its promoter.
  • Gene therapy is the insertion of genes into the cells and/or tissues of a subject to treat a disease, usually hereditary diseases, wherein the defective mutant allele is replaced or supplemented with a functional allele.
  • Treatment refers to a method of alleviating or eliminating a biological disorder and/or at least one of its accompanying symptoms.
  • references herein to “treatment” include references to curative, palliative, and prophylactic therapy.
  • the subject of treatment or patient is a mammal, preferably a human subject.
  • the above subject may be male or female of any age.
  • disorder means any condition that can be improved as a result of the treatment of the present invention.
  • Disease is a state of health of the subject, where the subject cannot maintain homeostasis, and where, if the disease is not alleviated, then the subject's health continues to deteriorate.
  • subject refers to any animal that is amenable to the methods presented herein.
  • patient refers to any animal that is amenable to the methods presented herein.
  • patient refers to any animal that is amenable to the methods presented herein.
  • patient refers to any animal that is amenable to the methods presented herein.
  • patient is a human.
  • the above subject may be male or female of any age.
  • Isolated modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1
  • the present invention relates to an isolated modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid VP1 protein for obtaining viral vectors based on recombinant adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5), which contains the amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid protein VP1 encoded by the Cap gene, with one or more substitutions that are selected from the group:
  • amino acid sequence of the wild type AAV5 capsid protein VP1 has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein comprises a substitution at position G226V.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein includes S2A, G226V, and T711S substitutions.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein comprises a Tb 14A replacement.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence represented by
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein comprises a T614V substitution.
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence represented by MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGL DRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGK AVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSG SQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVV TKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDW QRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVG NGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGN
  • the isolated modified AAV5 capsid VP1 protein has the amino acid sequence represented by
  • the “right side” of the (+)-strand of the adeno-associated virus genomic DNA contains overlapping sequences encoding three capsid proteins, VP 1 , VP2, and VP3. Transcription of these genes begins with a single promoter, p40. The molecular weight of the corresponding proteins is 87, 72 and 62 kDa, respectively. All three proteins are translated from the same mRNA. After transcription, the pre-mRNA can be spliced in two different ways, whereby a longer or shorter intron is excised and mRNAs of 2300 or 2600 nucleotides in length are formed.
  • the introduction of mutations in the Cap gene will affect not only the VP1 protein of the AAV5 capsid, but also VP2 and VP3 of the AAV5 capsid.
  • Figure 8 shows a schematic representation of the position of the AAV5 capsid structural proteins in the AAV Capsid gene sequence:
  • the T614A amino acid substitution in VP1 will correspond to: the amino acid substitution at position T478A in VP2; amino acid substitution at position T422A in VP3.
  • the T614V amino acid substitution in VP1 would correspond to: the amino acid substitution at position T478V in VP2; amino acid substitution at position T422V in VP3.
  • the G226V amino acid substitution in VP1 would correspond to: the amino acid substitution at position G90V in VP2; amino acid substitution at position G34V in VP3.
  • the T711S amino acid substitution in VP1 will correspond to: the amino acid substitution at position T575S in VP2; amino acid substitution at position T519S in VP3.
  • T614A in VP1 T478A in VP2/ T422A in VP3
  • IPEAGAHFHP IPEAGAHFHP
  • T614V in VP1 T478V in VP2/ T422V in VP3
  • IPEVGAHFHP IPEVGAHFHP
  • G226V in VP1 G90V in VP2/ G34V in VP3
  • TWMVDRV TWMVDRV
  • the amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid VP2 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains the G90V substitution.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains the G90V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains the G90V and T575S substitutions.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains the G90V and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains the T478A substitution.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains T478A and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains T478A and T575S substitutions.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains the T478A and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains the T478V substitution. In some embodiments, the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains the substitution T478V and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains T478V and T575S substitutions.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP2 protein contains the T478V and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24.
  • the amino acid sequence of the wild-type AAV5 capsid VP3 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains a G34V substitution.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the G34V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the G34V and T519S substitutions.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the G34V and T519S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the T422A substitution.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the T422A substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains T422A and T519S substitutions. In some embodiments, the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the T422A and T519S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the substitution T422V.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the substitution T422V and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the substitutions T422V and T519S.
  • the amino acid sequence of the modified AAV5 capsid VP3 protein contains the T422V and T519S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40.
  • the present invention relates to an isolated capsid for the production of viral vectors based on recombinant adeno-associated virus serotype 5, which includes any of the above modified adeno-associated virus serotype 5 capsid VP1 proteins.
  • the isolated capsid comprises any of the above modified adeno-associated virus serotype 5 capsid VP1 proteins, the AAV5 capsid VP2 protein or a modified variant, and the AAV5 capsid VP3 protein or a modified variant thereof.
  • the isolated capsid comprises wild-type AAV5 capsid protein VP2.
  • the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid protein VP2 that has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • the isolated capsid comprises a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP2. In some embodiments, the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains a G90V substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the G90V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the G90V and T575S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the G90V and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains a T478A substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478A substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478A and T575S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 protein that contains the T478A and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains a T478V substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478V and T575S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP2 protein that contains the T478V and T575S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24.
  • the isolated capsid comprises wild-type AAV5 capsid protein VP3. In some embodiments, the isolated capsid comprises a wild-type AAV5 capsid protein VP3 that has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33.
  • the isolated capsid comprises a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP3.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains a G34V substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the G34V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the G34V and T519S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the G34V and T519S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains a T422A substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422A substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422A and T519S substitutions.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422A and T519S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains a T422V substitution.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422V substitution and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39.
  • the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422V and T519S substitutions. In some embodiments, the isolated capsid comprises a modified AAV5 capsid VP3 protein that contains the T422V and T519S substitutions and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40.
  • the present invention provides an isolated nucleic acid that encodes any of the above modified adeno-associated virus serotype 5 capsid VP1 proteins used to generate recombinant adeno-associated virus serotype 5 viral vectors.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitution G226V, which is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 11 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with amino acid substitution G226V is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different The DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 3. Those skilled in the art are well aware of obtaining such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, G226V, and T711S and is represented by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 12 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, G226V and T711S is meant a nucleic sequence that alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 12 because, given the degeneracy of the genetic code, a wide variety of different DNA sequences can encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 4. The preparation of such alternative DNA sequences is well known to those skilled in the art. sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitution T614A and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 13 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with amino acid substitution T614A is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 13, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different The DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 5. Those skilled in the art are well aware of obtaining such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, T614A, and T711 S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 14 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, T614A and T711S is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 14, since, given the degeneracy of the genetic code a wide range of different DNA- sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 6. Those skilled in the art are well aware of the generation of such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitution T614V and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 15 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with amino acid substitution T614V is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 15, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different The DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 7. Those skilled in the art are well aware of obtaining such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, T614V, and T711S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 16 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1 with amino acid substitutions S2A, T614V and T711S is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 16, since, given the degeneracy of the genetic code for a wide variety of different DNA sequences can encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 8. Those skilled in the art it is well known to obtain such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid encoding the above modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2.
  • AAV5 adeno-associated virus serotype 5
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with the G90V amino acid substitution and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 27 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with G90V amino acid substitution is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 27, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different The DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 19. Those skilled in the art are well aware of obtaining such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitutions G90V and T575S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 28 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitutions G90V and T575S is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 28, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide a number of different DNA sequences can encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 20. It is well known to those skilled in the art to generate such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid VP2 protein with amino acid substitution T478A and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 29 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitution T478A is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 29, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different The DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 21. Those skilled in the art are well aware of obtaining such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitutions T478A and T575S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 30 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitutions T478A and T575S is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 30, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide a number of different DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 22. It is well known to those skilled in the art to obtain such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitution T478V and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 31 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitution T478V is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 31, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different The DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 23. Those skilled in the art are well aware of obtaining such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitutions T478V and T575S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 32 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP2 with amino acid substitutions T478V and T575S is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 32, since, given the degeneracy of the genetic code, the a number of different DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 24. Those skilled in the art are well aware of the generation of such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid encoding the above modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitution G34V and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 43 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with G34V amino acid substitution is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 43, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of The DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 35. Those skilled in the art are well aware of obtaining such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitutions G34V and T519S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 44 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitutions G34V and T519S is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 44, since, given the degeneracy of the genetic code, the a number of different DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 36. It is well known to those skilled in the art to obtain such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with the amino acid substitution T422A and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 45 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitution T422A is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 45, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different The DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 37. Those skilled in the art are well aware of obtaining such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitutions T422A and T519S and is represented by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 46 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitutions T422A and T519S is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic sequence of SEQ ID NO: 46, since, given the degeneracy of the genetic code, the a number of different DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 38. Those skilled in the art are well aware of the generation of such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitution T422V and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 47 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • another sequence encoding the corresponding amino acid sequence of the modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitution T422V is meant a nucleic sequence that is alternative to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 47, since, given the degeneracy of the genetic code, a wide range of different The DNA sequences may encode the amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 39. Those skilled in the art are well aware of obtaining such alternative DNA sequences encoding the same amino acid sequences. Such variant DNA sequences are within the scope of the present invention.
  • the isolated nucleic acid encodes a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP3 with amino acid substitutions T422V and T519S and is represented by the nucleic sequence of SEQ ID NO: 48 or any other sequence encoding the corresponding amino acid sequence.
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • nucleic acid encoding the above capsid comprises any or combination of the above nucleic acid sequences.
  • rAAV5 recombinant adeno-associated virus serotype 5
  • the present invention relates to a recombinant adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector for delivering a heterologous nucleic acid sequence to a subject, which comprises:
  • heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells.
  • the present invention relates to a recombinant adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector for delivering a heterologous nucleic acid sequence to a subject, which comprises:
  • heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells.
  • the present invention relates to a recombinant adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) vector for delivering a heterologous nucleic acid sequence to a subject, which comprises:
  • heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells.
  • the terms "recombinant adeno-associated virus serotype 5 vector”, “recombinant AAV5 virus”, “AAV5 virus-like particle”, “recombinant AAV5 viral strain”, “recombinant AAV5 vector” or “rAAV5 vector” in the context of this descriptions have the same meaning.
  • the rAAV5-based vector comprises a heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product, wherein the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is a therapeutic polypeptide or a reporter polypeptide.
  • the rAAV-based vector of the invention does not contain the nucleotide sequences of the genes encoding the protein sequences (Rep) necessary to ensure the life cycle of the virus, as well as the sequences of overlapping capsid proteins (Cap).
  • regulatory sequences that allow expression of the product encoded by a heterologous nucleic acid sequence in target cells is meant within the scope of this invention polynucleotide sequences that are necessary to influence the expression and processing of the coding sequences to which they are cloned.
  • Expression control sequences include the appropriate transcription initiation, termination, promoter and enhancer sequences; efficient RNA processing signals such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA; sequences that increase translation efficiency (ie Kozak consensus sequence); sequences that enhance protein stability; and, optionally, sequences that enhance protein secretion.
  • regulatory sequences vary depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and transcription termination sequences; in eukaryotes, such control sequences typically include promoters and transcription termination sequences.
  • the term "regulatory sequences" includes, at a minimum, all components whose presence is essential for expression and processing, and may also include additional components whose presence is beneficial, such as leader peptide sequences.
  • promoter refers to a nucleic acid fragment that controls the transcription of one or more coding sequences, and which is structurally identified by the presence of a binding site for DNA-dependent RNA polymerase, transcription initiation sites and other DNA sequences, including, without limitation, transcription factor binding sites, protein repressor and activator binding sites, as well as any other nucleotide sequences known to those skilled in the art that directly or indirectly regulate the level of transcription with a given promoter.
  • a “constitutive” promoter is one that is active in most tissues under normal physiological and developmental conditions.
  • An “inducible” promoter is a promoter that is subject to physiological or developmental regulation, such as by exposure to a chemical inducer.
  • a "tissue-specific” promoter is only active in specific tissue or cell types.
  • CMV cytomegalovirus
  • a promoter or promoter/enhancer derived from the immediate early (IE) region of human cytomegalovirus (hCMV) is particularly suitable as a promoter for the rAAV5 vector of the present invention.
  • hCMV human cytomegalovirus
  • IE immediate early region
  • functional expression triggering and/or functional expression enhancing fragments derived therefrom are, for example, described in EP0173177 and EP0323997 and are well known in the art.
  • fragments of the hCMV immediate early (IE) region can be used as a promoter and/or a promoter/enhancer.
  • Enhancer elements may refer to a DNA sequence that is located adjacent to a DNA sequence encoding a recombinant product.
  • Enhancer elements are usually located 5' from the promoter element or may be located below or within a DNA coding sequence (eg, a DNA sequence transcribed or translated into a recombinant product or products).
  • the enhancer element can be located 100 base pairs, 200 base pairs, or 300 or more base pairs before or after the DNA sequence that encodes the recombinant product.
  • Enhancer elements can increase the amount of expressed recombinant product from a DNA sequence, exceeding the expression due to a single promoter element. Many enhancer elements are available to those skilled in the art.
  • a heterologous nucleic acid sequence containing regulatory sequences that allow expression of the product encoded by the heterologous nucleic acid sequence in target cells may include the following elements in the direction from the 5'end to the 3'end: left (first) ITR (inverted terminal repeats);
  • CMV cytomegalovirus
  • CMV cytomegalovirus
  • hBGl gene intron hemoglobin gamma-1 subunit gene
  • a nucleic acid encoding a product hGHl polyadenylation signal (human growth hormone gene polyadenylation signal); right (second) ITR.
  • the nucleic acid encoding the product is at least one gene encoding a protein.
  • the transgene encodes at least one small inhibitor nucleic acid.
  • the transgene encodes at least one reporter molecule.
  • the small inhibitory nucleic acid is miRNA.
  • the small inhibitory nucleic acid is a sponge miRNA or TuD-RNA that inhibits the activity of at least one miRNA in an animal.
  • the miRNA is expressed in a cell of the target tissue.
  • the target tissue is liver, central nervous system (CNS), eye, gastrointestinal, respiratory, breast, pancreatic, urinary tract, or uterine tissue.
  • the rAAV5-based vector has an expression product of a heterologous nucleic acid sequence that is a therapeutic polypeptide or a reporter polypeptide.
  • the rAAV5-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a product that is a therapeutic polypeptide, where the therapeutic polypeptide is a blood coagulation factor selected from the group consisting of factor VIII, factor IX, or a functional variant thereof.
  • the rAAV5-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a factor VIII product or a functional variant thereof.
  • the rAAV5-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a factor IX product or a functional variant thereof.
  • the rAAV5-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a product that is an SMN 1 protein (motor neuron survival protein)
  • the rAAV5-based vector contains a heterologous nucleic acid sequence encoding a product that is an RBD-S (recombinant glycoprotein S receptor-binding domain) polypeptide of the SARS-cov2 virus (type 2 coronavirus that causes severe acute respiratory syndrome).
  • RBD-S recombinant glycoprotein S receptor-binding domain
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for delivering a gene product to a subject in need, which contains: a) any of the above rAAV5 vectors; and b) a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition is used to deliver a gene product to a person in need.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the rAAV5 virus particle of the invention in a pharmaceutically acceptable carrier or other drug compounds, pharmaceutical agents, carriers, adjuvants, diluents, and the like.
  • the injection carrier is usually liquid.
  • Carrier for other ways administration may be either solid or liquid, such as sterile pyrogen-free water or sterile pyrogen-free phosphate buffered saline.
  • the carrier is respirable and is preferably in solid or liquid particulate form.
  • water containing additives conventional for injection solutions such as stabilizing agents, salts or saline solutions and/or buffers.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a cell in which the rAAV5-based vector is integrated into the genome, in a pharmaceutically acceptable carrier or other drug compounds, pharmaceutical agents, carriers, adjuvants, diluents, etc.
  • “Pharmaceutical composition” means a composition comprising the above rAAV5 vector according to the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients such as excipients, diluents, diluents, carriers , auxiliary, distributing, delivery vehicles, preservatives, stabilizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, delayed delivery regulators, the choice and ratio of which depends on the nature and method of administration and dosage.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention and methods for their manufacture will be undeniably obvious to those skilled in the art.
  • the production of pharmaceutical compositions should preferably comply with GMP (Good Manufacturing Practice) requirements.
  • the composition may include a buffer composition, tonic agents, stabilizers and solubilizers.
  • “Pharmaceutical acceptable” means a material that has no biological or other contraindications, for example, the material can be administered to a subject without any undesirable biological effects.
  • such pharmaceutical compositions can be used, for example, to transfect a cell ex vivo, or to administer in vivo a viral particle or cell directly to a subject.
  • excipient or "adjuvant” is used herein to describe any component other than those previously described in this invention. These are substances of inorganic or organic origin used in the production process, the manufacture of medicines to give them the necessary physical and chemical properties.
  • stabilizer is meant an excipient or a mixture of two or more excipients which provide physical and/or chemical stability to the active agent.
  • buffer refers to a solution capable of maintaining the pH value due to the interaction of the acidic and alkaline components that make up its composition, which enables the rAAV5-based vector preparation to be resistant to changes in pH.
  • pH values of the pharmaceutical composition between 4.0 and 8.0 are preferred.
  • buffer agents for example, acetate, phosphate, citrate, histidine, succinate, and the like can be used. buffer solutions, but not limited to.
  • a pharmaceutical composition is "stable" if the active agent retains its physical stability and/or chemical stability and/or biological activity during the stated shelf life at a storage temperature, for example, at 2-8°C.
  • the active agent retains both physical and chemical stability, as well as biological activity.
  • the storage period is selected based on the results of a stability study with accelerated and natural storage.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated, packaged, or widely sold as a single unit dose or multiple unit dose units in the form of a finished dosage form.
  • unit dosage unit means a discrete amount of a pharmaceutical composition containing a predetermined amount of an active ingredient.
  • the amount of active ingredient is usually equal to the dosage of the active ingredient to be administered to the subject, or a convenient fraction of such dosage, for example, half or one third of such dosage.
  • the present invention relates to a method for delivering a gene product to a subject in need thereof, which comprises administering to the subject any of the above rAAV5-based vectors or the above pharmaceutical composition.
  • subject any living organism that is amenable to the methods presented in the present description.
  • the subject is a human.
  • the above subject may be male or female of any age. Any method of introducing the rAAV5-based vector accepted in the art can be appropriately used for the above rAAV5-based vector of the present invention.
  • routes of administration include topical, intranasal, inhalation, transmucosal, transdermal, enteral (e.g., oral, rectal), parenteral (e.g., intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular) administration, as well as injection directly into a tissue or organ.
  • Injectable preparations can be prepared in conventional dosage forms: as liquid solutions or suspensions, solid forms suitable for preparation of solutions or suspensions in liquid prior to injection, or as emulsions.
  • the above recombinant AAV5 virus of the present invention may be administered locally rather than systemically, for example as a depot or in sustained release formulations.
  • the recombinant AAV5 virus is administered to the body in an effective amount.
  • the recombinant AAV5 virus is preferably administered to the body in a biologically effective amount.
  • a "biologically effective" amount of a recombinant virus is an amount that is sufficient to cause infection (or transduction) and expression of the nucleic acid sequence in a cell.
  • a "biologically effective" amount of the viral vector is an amount that is sufficient to cause transduction and expression of the nucleic acid sequence in the target cell.
  • the cell for administration of the above recombinant AAV5 virus of the invention may be any type of cell, including, but not limited to, motor neurons or other tissues of the nervous system, epithelial cells (e.g., skin, respiratory, and intestinal epithelial cells), liver cells, muscle cells, spleen cells, fibroblasts, endothelial cells and the like.
  • epithelial cells e.g., skin, respiratory, and intestinal epithelial cells
  • liver cells e.g., muscle cells, spleen cells, fibroblasts, endothelial cells and the like.
  • the above recombinant AAV5 virus of the invention is not used to modify the genetic integrity of human germline cells.
  • the present invention relates to the use of any of the above rAAV5 vectors or the above pharmaceutical composition for the treatment of a disease in a subject in need thereof.
  • the disease is selected from the group: blood diseases, diseases of the central nervous system, metabolic diseases, muscle diseases, hereditary diseases.
  • subject any animal that is amenable to the methods presented in the present description.
  • the subject is a human.
  • the above subject may be male or female of any age.
  • Administration of the rAAV5 vector of the present invention to a human or animal subject in need thereof may be carried out by any method known in the art for the administration of viral vectors.
  • routes of administration include topical, intranasal, inhalation, transmucosal, transdermal, enteral (e.g., oral, rectal), parenteral (e.g., intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular) administration, as well as injection directly into a tissue or organ.
  • Injectable preparations can be prepared in conventional dosage forms: as liquid solutions or suspensions, solid forms suitable for preparation of solutions or suspensions in liquid prior to injection, or as emulsions.
  • the above recombinant AAV5 virus of the present invention may be administered locally rather than systemically, for example as a depot or in sustained release formulations.
  • the disease is selected from the group: blood diseases; diseases of the central nervous system; metabolic diseases; muscle diseases; hereditary diseases.
  • the disease is a blood disease.
  • the disease is a muscle disease.
  • the disease is an inherited disease.
  • the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is factor IX or a functional variant thereof.
  • the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is factor VIII or a functional variant thereof. In some embodiments, the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is the SMN 1 (motor neuron survival protein) protein.
  • the expression product of the heterologous nucleic acid sequence is the RBD-S (recombinant glycoprotein S receptor-binding domain) polypeptide of the SARS-cov2 virus (severe acute respiratory syndrome type 2 coronavirus).
  • any of the above rAAV5 vectors or the above pharmaceutical composition are used in a therapeutically effective amount.
  • terapéuticaally effective amount is meant an amount that is sufficient to alleviate (eg, alleviate, reduce, decrease) at least one of the symptoms associated with the pathological condition.
  • a “therapeutically effective” amount is an amount that is sufficient to provide some improvement in the condition of the subject.
  • Dosages of the above recombinant AAV5 virus of the present invention will depend on the route of administration, the particular viral vector, and may be determined by routine methods. Exemplary doses to achieve a therapeutic effect are viral titers of at least about 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 , IO 10 , 10 11 , 10 12 , 10°, 10 14 , 10 15 , 10 16 transducing units or more, preferably from about 10 9 to 10 15 transducing units, even more preferably 10 14 transducing units per kilogram.
  • the recombinant AAV5 virus, reagents and methods of the present invention can be used to target a nucleic acid to dividing or non-dividing cells and to stably express the heterologous nucleic acid in these cells.
  • this vector system it became possible to introduce into cells in vivo genes that encode proteins that affect cell physiology.
  • the vectors of the present invention may be useful in gene therapy for pathological conditions.
  • the present invention can be used to deliver any foreign nucleic acid with a biological effect to treat or relieve symptoms associated with any gene expression disorder.
  • pathological conditions include, without limitation, cystic fibrosis (and other lung diseases), hemophilia A, hemophilia B, thalassemia, anemia, and other disorders.
  • AIDS Alzheimer's disease
  • Parkinson's disease Huntington's disease
  • amyotrophic lateral sclerosis epilepsy and other neurological disorders
  • diabetes mellitus muscular dystrophies (eg, Duchenne, Becker, spinal muscular atrophy (SMA)), Gaucher's disease, Hurler's disease, adenosine deaminase deficiency, glycogen storage diseases and other metabolic defects, diseases of solid organs (eg, brain, liver, kidney, heart), and the like.
  • muscular dystrophies eg, Duchenne, Becker, spinal muscular atrophy (SMA)
  • Gaucher's disease Hurler's disease
  • adenosine deaminase deficiency glycogen storage diseases and other metabolic defects
  • diseases of solid organs eg, brain, liver, kidney, heart
  • Gene transfer has significant potential for understanding and developing treatments for pathological conditions.
  • pathological conditions There are a number of hereditary diseases for which defective genes have been studied and cloned. In some cases, the function of these cloned genes is known.
  • the pathological conditions mentioned above fall into two classes: deficient conditions, usually enzyme deficiencies, which are usually inherited in a recessive manner, and imbalanced conditions, sometimes involving at least regulatory or structural proteins, which are inherited in a dominant manner.
  • deficient diseases gene transfer can be used to introduce a normal gene into diseased tissues for replacement therapy.
  • pathological conditions of imbalance gene transfer can be used to create a pathological condition in a simulated system, which can then be used to develop measures against this pathological condition.
  • the methods of the present invention allow the treatment of genetic diseases.
  • the pathological condition is treated by partially or completely eliminating the defect or imbalance that causes the disease or aggravates its severity. It is also possible to use site-specific integration of nucleic sequences to trigger mutations or repair defects.
  • the present invention relates to a method for producing any of the above rAAV5-based vectors, which includes transfection of producing cells of any of the above nucleic acids encoding a modified adeno-associated virus serotype 5 (AAV5) capsid protein VP1, or the above nucleic acid encoding a capsid .
  • AAV5 modified adeno-associated virus serotype 5
  • the capsid proteins can be expressed from a recombinant virus, an expression vector, or from a cell line into which the described modified AAV capsid genes or coding sequences are stably integrated.
  • the invention provides for the production of AAV capsids with the described mutations in vitro from AAV capsid proteins and the construction of packaged capsids in vitro.
  • invention also provides modified AAV capsids that have been genetically engineered to express heterologous epitopes of clinically important antigens to elicit an immune response.
  • a method for creating a somatic transgenic animal model.
  • the method includes administering any of the aforementioned rAAVs to a non-human animal, wherein the rAAV contains at least one transgene, and wherein the rAAV infects target tissue cells of the non-human animal.
  • the described capsid variants it is possible to use the described capsid variants to create a somatic transgenic animal model that includes administering any of the aforementioned rAAVs to a non-human animal, wherein the rAAV contains at least one transgene.
  • the transgene is at least one gene encoding a protein.
  • the transgene encodes at least one small inhibitor nucleic acid.
  • the transgene encodes at least one reporter molecule.
  • the somatic transgenic animal model may be a mammal such as a mouse, rat, rabbit, dog, cat, sheep, pig, non-human primate.
  • a putative therapeutic agent can be administered to a somatic transgenic animal model to determine the effect of the putative therapeutic agent on the animal's condition.
  • the desired gene segments were obtained from oligonucleotides created by chemical synthesis. Gene segments from 300 to 4000 m in length. i., which are flanked by unique restriction sites, were collected by annealing and ligation of oligonucleotides, including TTPR amplification and subsequent cloning through these restriction sites. The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing.
  • DNA sequences were determined by Sanger sequencing.
  • the SnapGene software package version 5.1.4.1 was used to create, map, analyze, annotate and illustrate sequences.
  • Results are presented as mean ⁇ standard deviation (SD), analysis of variance (ANOVA) was used to compare test and control results and were determined to be statistically significant.
  • rAAV5 capsid variants were obtained by random mutagenesis of the Cap gene sequence (Davidsson M. et al., 2016). Briefly, the sequence of the Cap gene of the fifth serotype containing the S2A and T711S mutations in VP1 obtained in the previous round of selection (patent application No. having corrective activity (as a result, random mutations occurred in the sequence). Full-length mutant variants were cloned into the carrier plasmid pAAV-linker ( Figure 1) at AscI/EcoRI restriction sites in a common reading frame with green fluorescent protein (GFP), producing a diverse random rAAV5 capsid library, which was then used to select for capsid variants with increased transducing activity.
  • GFP green fluorescent protein
  • the predominant combinations of mutations were S2A, T711S, T614V in VP1 AAV5 - about 30% of clones.
  • plasmids For the production and subsequent selection of recombinant viral particles from the obtained sequence library, a series of plasmids was developed: a carrier plasmid, a plasmid containing the Rep gene sequence, and a construct containing adenoviral genes necessary for the replication of viral particles.
  • the carrier plasmid pAAV-linker ( Figure 1) for cloning libraries of random variants of the AAV capsid gene of the fifth serotype in the same reading frame with the reporter protein was obtained by replacing the modified green fluorescent protein sequence in the original pAAV-GFP construct ( Figure 2), with using the restriction ligase cloning method at the Hindll/EcoRI sites, onto the T2A-GFP sequence synthesized de novo with the addition of EcoRI restriction sites from the 5'-end and Hindlll from the 3'-end.
  • the pA AV-Rep plasmid containing the Rep gene sequence ( Figure 3) was obtained by de novo cloning of the synthesized AAV serotype 2 Rep gene sequence (GenBank III AF043303.1) at the Pcil/Psil restriction sites followed by T4 DNA Polymerase digestion to obtain blunt ends into pGem-T Easy plasmid (Promega, USA) also treated with Pcil/Psil restriction endonucleases.
  • the pHelper construct ( Figure 4) containing AmpR was used.
  • - beta-lactamase gene providing resistance to ampicillin, Origin of replication in bacteria
  • Adeno E2A - adenovirus helper gene sequence involved in viral DNA replication Adeno E4 - adenovirus helper gene sequence involved in viral DNA replication
  • Adeno VARNA gene sequence helper adenovirus responsible for stimulating the translation of both early and late viral genes.
  • Example 3 Method for obtaining vectors based on modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5)
  • a plasmid containing the nucleotide sequences of adenovirus encoding proteins and RNA necessary for the assembly of rAAV particles (helper plasmid);
  • VP2 may have any of the amino acid sequences of SEQ ID No: 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24;
  • a VP3 may have any of the amino acid sequences of SEQ III No: 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40;
  • This set of genes ensures the assembly of rAAV viral particles and encapsidation of the target genome in them within 72 hours. 72 hours after transfection, the producer cells are lysed to release rAAV particles and purified by successive filtration and chromatography steps. The titer of purified rAAV particles is checked by enzyme immunoassay and quantitative PNR
  • Example 4 Increased cell transduction efficiency with rAAV5-based drugs in the presence of S2A, T614V/T614A/G226V, T711S mutations in the VP1 protein of the AAV5 capsid of the wild type.
  • the inventors unexpectedly found that the presence of one or more mutations that are selected from the group T614V, T614A and G226V in the wild-type rAAV5 capsid VP1 protein or in the rAAV5 capsid VP1 protein already containing S2A and T711S mutations, led to a significant increase in the efficiency of transgene delivery.
  • rAAV-based vectors with the indicated mutations T614V, T614A and G226V).
  • the number of cells expressing GFP increased by 1.31 times from 24.92% to 32.84% at MOI 500, by 1.47 times from 43.44 % to 63.89% at MOI 1250 and 1.17 times from 65.56% to 78.01% at MOI 2500 vg/cell compared with the control preparation rAAV5 with the VP1 protein of the capsid containing only mutations S2A and T711S (AAV5 -01Mut-GFP).
  • the number of cells expressing GFP increased by 2.74 times from 11 .97% to 32.84% at MOI 500, 3.18 times from 20.11% to 63.89% at MOI 1250 and 1.85 times from 42.26% to 78.01% at MOI 2500
  • the number of cells expressing GFP increased by 1.18 times from 24.92% to 29.62% at MOI 500, by 1.27 times from 43.44 % to 55.22% at MOI 1250 and 1.1 times from 65.56% to 72.05% at MOI 2500 vg/cell compared with the control preparation rAAV5 with capsid VP1 protein, containing only mutations S2A and T711S (AAV5-01Mut-GFP).
  • the number of cells expressing GFP increased by 2.47 times from 11.97% to 29.62% at MOI 500, 2.74 times from 20.11% to 55.22% at MOI 1250 and 1.7 times from 42.26% to 72.05% at MOI 2500 .
  • the number of cells expressing GFP was 1.41 times lower from 24.92% to 17.67% at MOI 500, 1.09 times from 43, 44% to 39.69% at MOI 1250 and 1.05 times from 65.56% to 61.85% at MOI 2500 vg/cell compared to the control rAAV5 preparation with the VP1 protein of the capsid containing only S2A and T711S mutations ( AAV5-01Mut-GFP).
  • the number of cells expressing GFP increased by 1.48 times from 11 .97% to 17.67% at MOI 500, 1.97 times from 20.11% to 39.69% at MOI 1250, and 1.46 times from 42.26% to 61.85% at MOI 2500.
  • Example 5 Efficiency of packaging of AAV viral genomes with rAAV5-based drugs in the presence of S2A, T614V/G226V, T711S mutations in the VP1 protein of the AAV5 capsid wild type.
  • vector genome and "vector DNA” should be understood as ssDNA packaged in the capsid of a recombinant adeno-associated virus (rAAV).
  • ssDNA can be either sense (hereinafter plus DNA strand) or antisense (hereinafter minus DNA strand).
  • the rAAV preparation is a mixture of capsids, some of which contain the plus strand of ssDNA, and some contain the minus strand of ssDNA.
  • the vector genome of rAAV is a nucleotide sequence of the expression cassette surrounded by a sequence of inverted terminal repeats - ITR (inverted terminal repeats, hereinafter ITR).
  • sample or "test sample” should be understood as ssDNA extracted from the corresponding preparation of rAAV.
  • AAV capsids efficiently pack cassettes up to 4.8 kb, while larger cassettes are fragmented from the 5' or 3' ends of DNA during packaging into the capsid and, as a result, are packaged with less efficiency, forming a heterogeneous population of rAAV viral genomes.
  • the 5'-end of single-stranded DNA hereinafter ssDNA
  • ssDNA single-stranded DNA
  • oligonucleotide probes were selected for DNA regions as close as possible to the 5'-ITR and 3'-ITR sequences. The probes must bind strictly specifically to the selected ssDNA regions. Probes were also selected for DNA regions corresponding to the middle of the expression cassette (-2400-2500 bp), such a detection point is a control point for the studied ssDNA chain, since this region is less likely to undergo fragmentation when packaged in a capsid (Fig. 6.). Oligonucleotide probes were selected for both plus and minus DNA strands of the expression cassette. Probes differ from conventional oligonucleotides in that they have a biotin molecule at the 5' end of the sequence.
  • test sample - DNA extracted from the analyzed rAAV preparations was applied to a nitrocellulose membrane pre-moistened in 20XSSC buffer and hybridized with the selected probes.
  • a separate membrane with test samples was used, thus 6 membranes were processed, each of which contained test DNA samples extracted from 2.5 * 10 10 viral particles (measured as GC - genome copy) with pre-treatment of the DNAse I viral preparation to remove non-encapsidated DNA impurities and subsequent treatment with Proteinase K, according to the protocol described in the article (Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice Mariacarmela Allocca, J Clin Invest. 2008 May 1; 118(5 ): 1955-1964.)
  • Standard pDNA should be understood as plasmid DNA (hereinafter referred to as pDNA) cleaved at Smal sites, the nucleotide sequence of which exactly corresponds to the nucleotide sequence of the studied vector genome.
  • the probes used for hybridization are synthesized and labeled with biotin. Hybridization was performed overnight at 10°C below the melting point of each probe.
  • the membranes were washed first with a solution of 2 x SSC/0.1% SDS, and then with TBSTxl. Next, the membranes were incubated with 1% BSA and TBSTxl for 40 minutes and washed again with TBSTxl. Then, the membranes were incubated with HRP-conjugated streptavidin for one hour to bind the biotinylated probe to HRP-conjugated streptavidin. After the final washing of the membranes with 1% BSA TBSTxl, a substrate for chemiluminescent detection was added and a luminescent signal was detected on the membranes (Figure 7). Further processing of the obtained images was carried out using the Image Lab software.
  • the intensity of the luminescent signal from the probes was assessed by the intensity level of the luminescent signal of the standard pDNA.
  • the intensity of the luminescent signal of dilutions of the standard pDNA was taken as a calibration curve (hereinafter referred to as the standard sample).
  • the inventors have found that the selected biotinylated probes bind to the DNA template located on the membrane with the same efficiency, which is evident from the staining of dilutions of the standard pDNA at each point. Detection of DNA fragments corresponding to the 5' and 3' ends of the plus strand and the 5' and 3' ends of the minus strand of the studied DNA was observed for all tested samples. At the same DNA loading of the studied samples on the membranes, differences were observed in the intensity of the detected luminescence signals.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-04Mut-GFP sample corresponds to the intensity of the luminescence signal of the third dilution of the pDNA-GFP standard sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-04Mut-GFP sample is detected at the sixth dilution, the seventh dilution of this sample is detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-02Mut-GFP sample is in the range of the intensity of the luminescence signals of the third and fourth dilutions of the standard pDNA-GFP sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-02Mut-GFP sample is detected at the fifth dilution, the sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-NullMut-GFP sample corresponds to the intensity of the luminescence signal of the fourth dilution of the pDNA-GFP standard sample.
  • detection limit of the vgDNA-NullMut-GFP sample is detected at the fourth dilution, the fifth, sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the samples vgDNA-04Mut-GFP and vgDNA-02Mut-GFP When comparing the intensity of the luminescence signals of the samples in the detection area of the “Probe 1” probe, the samples vgDNA-04Mut-GFP and vgDNA-02Mut-GFP have a higher luminescence signal strength compared to the control sample vgDNA-NullMut-GFP. And it is detected at later dilutions relative to the vgDNA-NullMut-GFP control sample.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-04Mut-GFP sample is outside the dilution range of the standard pDNA-GFP sample.
  • the intensity of the luminescence signal at the second dilution point of the vgDNA-04Mut-GFP sample is in the range of the intensity of the luminescence signals of the first and second dilutions of the standard pDNA-GFP sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-04Mut-GFP sample is detected at the fifth dilution, the sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-02Mut-GFP sample is outside the dilution range of the standard pDNA-GFP sample.
  • the intensity of the luminescence signal at the second dilution point of the vgDNA-02Mut-GFP sample is in the range of the intensity of the luminescence signals of the first and second dilutions of the standard pDNA-GFP sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-02Mut-GFP sample is detected at the fifth dilution, the sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-NullMut-GFP sample is outside the dilution range of the standard pDNA-GFP sample.
  • the intensity of the luminescence signal at the second dilution point of the vgDNA-NullMut-GFP sample is in the range of the intensity of the luminescence signals of the second and third dilutions of the pDNA-GFP standard sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-NullMut-GFP sample is detected at the fourth dilution, the fifth, sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the samples vgDNA-04Mut-GFP and vgDNA-02Mut-GFP have a higher luminescence signal strength compared to the control sample vgDNA-NullMut-GFP. And it is detected at later dilutions relative to the vgDNA-NullMut-GFP control sample.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-04Mut-GFP sample corresponds to the signal intensity luminescence of the fifth dilution of the pDNA-GFP standard sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-04Mut-GFP sample is detected at the fourth dilution, the fifth, sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-02Mut-GFP sample corresponds to the intensity of the luminescence signal of the fourth dilution of the pDNA-GFP standard sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-02Mut-GFP sample is found at the seventh dilution.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-NullMut-GFP sample corresponds to the intensity of the luminescence signal of the fifth dilution of the pDNA-GFP standard sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-NullMut-GFP sample is detected at the fifth dilution, the sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the vgDNA-04Mut-GFP sample does not differ from the control vgDNA-NullMut-GFP sample.
  • the vgDNA-02Mut-GFP sample had a higher luminescence signal strength compared to the vgDNA-NullMut-GFP control sample. And it is detected at later dilutions relative to the vgDNA-NullMut-GFP control sample.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-04Mut-GFP sample is in the range of the intensity of the luminescence signals of the fourth and fifth dilutions of the standard pDNA-GFP sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-04Mut-GFP sample is detected at the fourth dilution, the fifth, sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-02Mut-GFP sample is in the range of the intensity of the luminescence signals of the fourth and fifth dilutions of the standard pDNA-GFP sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-02Mut-GFP sample is detected at the fifth dilution, the sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-NullMut-GFP control sample is in the range of the intensity of the luminescence signals of the fourth and fifth dilutions of the pDNA-GFP standard sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-NullMut-GFP sample is detected at the fourth dilution, the fifth, sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the vgDNA-04Mut-GFP sample does not differ from the control vgDNA-NullMut-GFP sample.
  • the vgDNA-02Mut-GFP sample had a higher luminescence signal strength compared to the vgDNA-NullMut-GFP control sample. And it is detected at later dilutions relative to the vgDNA-NullMut-GFP control sample.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-04Mut-GFP sample is outside the dilution range of the standard pDNA-GFP sample.
  • the intensity of the luminescence signal at the second dilution point of the vgDNA-04Mut-GFP sample is in the range of the intensity of the luminescence signals of the first and second dilutions of the standard pDNA-GFP sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-04Mut-GFP sample is detected at the sixth dilution, the seventh dilution of this sample is detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-02Mut-GFP sample is in the range of the luminescence signal intensity of the first and second dilutions of the standard pDNA-GFP sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-02Mut-GFP sample is detected at the sixth dilution, the seventh dilution of this sample is detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-NullMut-GFP sample is in the range of the luminescence signal intensity of the first and second dilutions of the pDNA-GFP standard sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-NullMut-GFP sample is detected at the fifth dilution, the sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the samples vgDNA-04Mut-GFP and vgDNA-02Mut-GFP have a higher luminescence signal strength compared to the control sample vgDNA-NullMut-GFP. And it is detected at later dilutions relative to the vgDNA-NullMut-GFP control sample.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-04Mut-GFP sample is in the range of the luminescence signal intensity of the fourth and fifth dilutions of the standard pDNA-GFP sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-04Mut-GFP sample is detected at the sixth dilution, the sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-02Mut-GFP sample corresponds to the signal intensity luminescence of the fourth dilution of the pDNA-GFP standard sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-02Mut-GFP sample is detected at the fourth dilution, the fifth, sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the intensity of the luminescence signal at the first dilution point of the vgDNA-NullMut-GFP sample corresponds to the intensity of the luminescence signal of the fourth dilution of the pDNA-GFP standard sample.
  • the limit of detection of the vgDNA-NullMut-GFP sample is detected at the fourth dilution, the fifth, sixth and seventh dilutions of this sample are detected at the background signal level.
  • the vgDNA-02Mut-GFP sample does not differ from the control vgDNA-NullMut-GFP sample, and the vgDNA-04Mut-GFP sample has a higher luminescence signal strength and is detected at later dilutions compared to vgDNA-NullMut-GFP control.
  • the highest intensity of the luminescence signal has the 3' region of the minus DNA strand (Probe 1), which corresponds to the intensity of the luminescence signal of the third dilution of the pDNA-GFP standard sample, compared with the detectable 5' region of the minus DNA strand (Probe5), which corresponds to the intensity of the luminescence signal of the fifth dilution of the pDNA-GFP standard sample.
  • the highest intensity of the luminescence signal is in the 3' region of the minus DNA strand, which is in the intensity range of the luminescence signals of the third and fourth dilutions of the pDNA-GFP standard sample, compared with the detected 5' region of the minus DNA strand, which corresponds to the intensity of the luminescence signal of the fourth dilution of the standard sample pDNA-GFP.
  • the packing efficiency of minus strands was estimated by differences in the intensity of the luminescence signal in the detection region of the 3'-end of the minus DNA strand and the intensity of the luminescence signal in the detection region of the 5'- the minus end of the DNA strand.
  • a trend was shown for the predominance of the luminescence signal intensity in the region of detection of the 3'-end minus the DNA strand over the intensity of the luminescence signal in the region of detection of the 5'-end minus the DNA strand.
  • the vgDNA-02Mut-GFP sample has more efficient minus strand packaging compared to vgDNA-04Mut-GFP and the vgDNA-NullMut-GFP control, as in the region of detection of the 3'-end minus the DNA strand, the intensity of the luminescence signal is in the range of the intensity of the luminescence signals of the third and fourth dilutions of the pDNA-GFP standard sample, and the intensity of the luminescence signal in the region of detection of the 5'-end of the minus DNA strand corresponds to the intensity of the luminescence signal of the fourth dilution of the standard of the pDNA-GFP sample, while for the vgDNA-04Mut-GFP and vgDNA-NullMut-GFP samples, the intensity of the luminescence signal in the detection region of the 5'-end minus the DNA strand is significantly inferior to the intensity of the luminescence signal in the detection region of the 3'-end minus the DNA strand
  • the luminescence intensities of these points are in the intensity range of the luminescence signal of the fourth and fifth dilutions of the pDNA-GFP standard sample.
  • the luminescence intensity of these points are in the intensity range of the luminescence signal of the fourth and fifth dilutions of the standard pDNA-GFP sample.
  • the luminescence intensities of these points are in the intensity range of the luminescence signal of the fourth and fifth dilutions of the pDNA-GFP standard sample.
  • the packing efficiency of plus strands was estimated from the intensity of luminescence signals in the detection region of the 3' end of the DNA plus strand and in the detection region of the 5' end of the DNA plus strand. It was found that for all samples in the detection area of the 3'-end plus the DNA strand, the luminescence signal of the studied samples is detected in the intensity range of the luminescence signal of the fourth and fifth dilutions of the pDNA-GFP standard sample, as well as the luminescence signal from the detection of the 5' region plus the DNA strand of the studied samples. samples are detected in the intensity range of the luminescence signal of the fourth and fifth dilutions of the pDNA-GFP standard sample. Thus, packing plus strands of DNA in the studied samples has equal efficiency.
  • Example 6 The efficiency of production of vectors based on modified adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5)
  • HEK293 producing cells were transfected with polyethyleneimine simultaneously with 3 plasmids:
  • a plasmid containing the nucleotide sequences of adenovirus encoding proteins and RNA necessary for the assembly of rAAV particles (helper plasmid);
  • This set of genes ensures the assembly of rAAV viral particles and encapsidation of the target genome in them within 72 hours. 72 hours after transfection, the producing cells were lysed to release rAAV particles, the resulting vectors were treated with DNase I for 2 hours at 37°C, then another 2 hours with proteinase K at 56°C.
  • the titer of the obtained rAAV particles was determined by quantitative PCR with using a set of oligonucleotides consisting of a forward primer 5'- ACCACATGAAGCAGCACGAC -3', a reverse primer 5' - TCAGCTCGATGCGGTTCAC -3', and a probe 5'-HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1 -3' specific to the GFP sequence.
  • the quantitative PCR method it was possible to detect a change in the number of copies of the packaged heterologous genome of the rAAV particle encoding the target GFP gene (Figure 9).
  • the number of packaged viral genomes increased by 7.09 times from 2.51E + 09 vg / ml to 1.78E + 10 vg / ml compared with the control preparation rAAV5 with wild-type capsid protein VP1 (AAV5-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.31 times from 1.36E+10 vg/ml to 1.78E+10 vg/ml
  • the number of packaged viral genomes increased by 4.78 times from 2.51E+09 vg/ml to 1.20E+10 vg/ml compared to the control preparation rAAV5 with wild-type capsid protein VP1 (AAV5-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased 6.77 times from 2.51E+09 vg/ml to 1.70E+10 vg/ml compared to a control rAAV5 preparation with wild-type capsid protein VP1 (AAV5-NullMut-GFP).
  • the number of packaged viral genomes increased by 1.25 times from 1.36E+10 vg/ml to 1.70E+10 vg/ml.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящая заявка относится к области генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который содержит одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые повышают эффективность трансдукции, повышают эффективность упаковки вирусных геномов AAV препаратами на основе rAAV5, а также повышают эффективность продукции (сборки) вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), капсиду и вектору на основе вышеуказанного VP1, а также к их применению.

Description

ВЫДЕЛЕННЫЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БЕЛОК УР! КАПСИДА AAV5
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая заявка относится к области генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который содержит одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые повышают эффективность трансдукции, повышают эффективность упаковки вирусных геномов AAV препаратами на основе rAAV5, а также повышают эффективность продукции (сборки) вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), капсиду и вектору на основе вышеуказанного VP1, а также к их применению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой (25 нм), неспособный к самостоятельной репликации, безоболочечный вирус. У человека и приматов описано множество различных серотипов AAV. Геном аденоассоциированного вируса содержит (+ или -) одноцепочечную ДНК (ssDNA) длиной около 4,7 тысяч нуклеотидов. На концах молекулы геномной ДНК располагаются инвертированные концевые повторы (англ, inverted terminal repeats, ITRs). Геном содержит две открытые рамки считывания (англ. ORF): Rep и Сар, содержащие в себе несколько альтернативных рамок считывания, кодирующих различные белковые продукты. Продукты Rep имеют важное значение для репликации AAV, при этом ген Сар, помимо других альтернативных продуктов, кодирует 3 капсидных белка (VP1, VP2 и VP3). Белки VP1, VP2 и VP3 находятся в соотношении 1 : 1 :10, образуя икосаэдрический капсид (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99: 10405-10410). При образовании рекомбинантного вектора AAV (rAAV) кассета экспрессии, фланкированная ITR, упаковывается в капсид AAV. Гены, необходимые для репликации AAV, не входят в кассету. Рекомбинантный AAV считается самым безопасным и одним из наиболее широко используемых вирусных векторов для переноса генов in vivo. Векторы могут инфицировать клетки множества типов тканей, обеспечивая эффективную и устойчивую экспрессию трансгена. Они также являются непатогенными и имеют низкий профиль иммуногенности (High КА et al., «rAAV human trial experience» Methods Mol Biol. 2011; 807:429-57). Одной из насущных целей исследований в области разработки эффективной генотерапии является оптимизация векторов для улучшения тех или иных свойств данных векторов.
Известно, что различные серотипы AAV характеризуются сродством к различным рецепторам на поверхности клеток-хозяев, к которым они обладают тропизмом. Так основным известным рецептором для AAV2 является гепарансульфат- протеогликан, корецепторами выступают интегриновый гетеродимер aVp5, рецептор фактора роста фибробластов первого типа и рецептор фактора роста гепатоцитов, с- Met. AAV12 связывается с гепарансульфат-протеогликанами и сиаловой кислотой. AAV4 и AAV5 связываются с N- и О-связанными сиаловыми кислотами соответственно. AAV5 задействует рецептор фактора роста тромбоцитов. При этом установлена связь между аминокислотной последовательностью белков капсида AAV с процессом его сборки, инкапсидирования генома и сродством к различным типам рецепторов, репрезентированных на поверхности клеток-хозяев (Govindasamy L. et. al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 2013 Oct;87(20): 11187- 99).
В международной заявке W02012145601 описаны вирионы аденоассоциированного вируса (AAV) с вариантным капсидным белком, где вирионы AAV демонстрируют большую инфекционность ретинальных клеток, когда вводятся интравитреальной инъекцией, по сравнению с AAV дикого типа.
В международной заявке WO2013158879 описан вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей капсидный белок VP1, который содержит одну или несколько замен лизина, где одна замена лизина представляет K137R, где упомянутая замена лизина является эффективной для ингибирования убиквитинилирования упомянутого капсидного белка, и тем самым увеличивается трансдукция упомянутого вектора AAV в клетке-мишени.
На данный момент существует потребность в AAV с улучшенными свойствами по сравнению с AAV дикого типа, например, которые обладают увеличенной трансдуцирующей способностью, увеличенной эффективностью упаковки вирусных геномов AAV, а также увеличенной эффективностью наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV). Улучшение тканевой трансдукции позволяет минимизировать дозы вводимого субъекту вектора.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких аминокислотных замен в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S, приводит к повышению эффективности трансдукции клеток-мишеней с помощью вектора на основе AAV серотипа 5 с данной(ыми) модификацией(ями) и существенному увеличению эффективности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких аминокислотных замен в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S, приводит к повышению эффективности упаковки вирусных геномов AAV препаратами на основе rAAV5.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких аминокислотных замен в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S, приводит к увеличению продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) по сравнению со сборкой инкапсидированных вирусных векторов на основе rAAV5 дикого типа (без вышеуказанных мутаций), то есть при сборке инкапсидированных вирусных векторов на основе rAAV5, содержащих вышеуказанные модификации в капсиде AAV5, получают вирусные вектора на основе rAAV5, которые содержат трансген (инкапсидированную гетерологичную нуклеиновую кислоту), значительно чаще чем при сборке инкапсидированных вирусных векторов на основе rAAV5 дикого типа (без вышеуказанных мутаций).
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), который содержит аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одной или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S, где аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену в положении G226V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, G226V и Т711S. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену Тб 14 А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, Т614А и T711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену T614V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, T614V и T711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, использующихся для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой G226V, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 11 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, G226V и T711 S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 12 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой Т614А и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 13 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, Т614А и T711 S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 14 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой T614V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 15 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, T614V и T711 S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 16 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному капсиду для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа, который включает любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены Т478А и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок AAV5, который содержит замены Т478А и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует любой из вышеуказанных капсидов, использующихся для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа или любой из вышеуказанных капсидов, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор на основе rAAV5 включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, которая содержит: a) любой из вышеуказанных векторов на основе rAAV5; и b) фармацевтически приемлемый эксципиент. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
В некоторых вариантах осуществления применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5, который включает трансфекцию клеток- продуцентов, соответственно, любой из вышеуказанных нуклеиновых кислот, которые содержат последовательность, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), или вышеуказанной нуклеиновой кислотой, кодирующей капсид.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-linker, предназначенной для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV девятого серотипа.
GFP- последовательность, кодирующая зеленый флуоресцентный белок,
Poly А - сигнал полиаденилирования,
ITR - инвертированный концевой повтор аденоассоциированного вируса,
Т2А - последовательность, кодирующая пептид способный к самовырезанию из полипептидной цепи получен от вируса thosea asigna,
HBG intron - интрон бета-глобина человека,
CMVpromoter - промотор цитомегаловируса человека,
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину, pUC origin - высококопийный ориджин репликации бактерий.
Фигура 2 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-GFP.
EGFP- последовательность кодирующая модифицированный зеленый флуоресцентный белок,
Poly А - сигнал полиаденилирования,
ITR - инвертированный концевой повтор аденоассоциированного вируса, HBG intron - интрон бета-глобина человека,
CMV promoter - промотор цитомегаловируса человека,
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину, pUC origin - высококопийный ориджин репликации бактерий.
Фигура 3 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-Rep, предназначенной для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV пятого серотипа из библиотеки случайных вариантов.
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину, pUC origin - высококопийный ориджин репликации бактерий,
AAV Rep genes - последовательность кодирующая белки Rep, необходимые для жизненного цикла вируса.
Фигура 4 представляет собой кольцевую схему плазмиды pHelper, предназначенной для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV пятого серотипа из библиотеки случайных вариантов.
AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину,
Ori- ориджин репликации в бактериях,
Adeno Е2А - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno Е4 - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno VARNA - последовательность гена хелперного аденовируса, отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов.
Фигура 5 представляет собой график, который показывает анализ эффективности трансдукции клеток CHO-K1-S вирусными препаратами на основе rAAV5-GFP с мутациями в последовательности белка VP1 при использовании различных MOI (вирусных геномов на клетку).
AAV5-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и T711S.
AAV5-02Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок УР! капсида AAV5 с мутациями T614V, S2A H T71 1 S. AAV5-03Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями Т614А, S2A H T711 S.
AAV5-04Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями G226V, S2A и T711S.
AAV5-NullMut-GFP обозначает вектор на основе аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающий белок VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Фигура 6 представляет собой схему расположения гибридизации зондов на векторном геноме.
Probe 1 - точка детекции участка оцДНК, на последовательности непосредственно у 3’ ITR минус цепи ДНК;
Probe 3 - точка детекции участка оцДНК, который располагается на середине экспрессионной кассеты минус цепи (-2400-2500 по) ДНК;
Probe 5 - точка детекции участка оцДНК, который располагается непосредственно у 5’ ITR минус цепи ДНК.
Probe 2 - точка детекции участка оцДНК, который располагается непосредственно у 5’ ITR плюс цепи ДНК.
Probe 4 - точка детекции участка оцДНК, который располагается на середине экспрессионной кассеты плюс цепи (-2400-2500 по) ДНК;
Probe 6 - точка детекции участка оцДНК, который располагается непосредственно у 3’ ITR плюс цепи. ДНК.
Фигура 7 представляет собой данные Саузерн блот гибридизации векторной ДНК. pDNA-GFP - Стандартный образец, двукратное серийное разведение стандартной плазмидной ДНК pAAV-GFP. vgDNA-NullMut-GFP - Контрольный образец, двукратное серийное разведение векторной геномной ДНК экстрагированной из контрольного препарата rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа. vgDNA -02Mut-GFP - Двукратное серийное разведение векторной геномной ДНК экстрагированной из препарата rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего мутации S2A, T614V H T711 S. vgDNA -04Mut-GFP - Двукратное серийное разведение векторной геномной ДНК экстрагированной из препарата rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего мутации S2A, G226V H T711 S. Фигура 8 представляет собой схему положения структурных белков капсида AAV5 в аминокислотной последовательности гена Сар.
1-725 ак - VP1
137-725 ак - VP2
193-725 ак - VP3
Фигура 9 представляет собой график, который показывает анализ эффективности наработки векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5).
AAV5-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и Т711S.
AAV5-02Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями T614V, S2A и Т711S.
AAV5-03Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями Тб 14 A, S2A и Т711S.
AAV5-04Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями G226V, S2A и Т711S.
AAV5-NullMut-GFP обозначает вектор на основе аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающий белок VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Vg/ml кж обозначает количество вирусных геномов на миллилитр культуральной жидкости.
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
«Выделенный» означает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природе присутствующие в живых организмах, не являются «выделенными», но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, сопутствующих им в их природном состоянии, являются «выделенными». Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать, по существу, в очищенной форме или могут существовать в неприродном окружении, таком как, например, генетически модифицированной клетке.
Определения «встречающийся в природе», «нативный» или «дикого типа» используют для описания объекта, который можно обнаружить в природе как отличающийся от получаемого искусственно. Например, белок или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирус), которые можно изолировать из источника в природе, и которые не модифицированы умышленно специалистом в лаборатории, являются встречающимися в природе.
Термин «геном» относится к полному генетическому материалу организма.
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.
Белок (Пептид)
В настоящем описании термины «пептид», «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не существует ограничений по максимальному количеству аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Как применяют в настоящем описании, термин относится и к коротким цепям, также общепринято обозначаемым в этой области, например, как пептиды, олигопептиды и олигомеры, и к более длинным цепям, как правило, обозначаемым в этой области как белки, множество типов которых существует. «Полипептиды» включают, помимо прочего, например, биологически активные фрагменты, по существу, гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитные белки. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.
Молекулы нуклеиновых кислот
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», « полину клеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.
Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ТТПР и т.п., и способами синтеза.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.
Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью .
Аденоассоциированный вирус (AAV)
Вирусы семейства Parvoviridae представляют собой небольшие ДНК-содержащие вирусы животных. Семейство Parvoviridae может быть разделено на два подсемейства: Parvovirinae, представители которого инфицируют позвоночных животных, и Densovirinae, представители которого инфицируют насекомых. К 2006 году были описаны 11 серотипов аденоассоциированного вируса (Mori, S. ET AL., 2004, «Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein», Virology, T. 330 (2): 375-83). В 2008 году был описан 12 серотип аденоассоциированного вируса (Michael Schmidt ET AL., Adeno-associated virus type 12 (AAV12): a novel AAV serotype with sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity, J Virol. 2008 Feb;82(3): 1399-406. doi: 10.1128/JVI.02012-07). Все известные серотипы могут инфицировать клетки многих видов тканей. Тканевая специфичность определяется серотипом белков капсида, поэтому векторы на основе аденоассоциированого вируса конструируют, задавая необходимый серотип. Дополнительная информация по парвовирусам и другим представителям Parvoviridae описана в литературе (Kenneth I. Berns, «Parvoviridae: The Viruses and Their Replication», Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)).
Геномная организация всех известных серотипов AAV очень сходна. Геном AAV представляет собой линейную одноцепочечную молекулу ДНК, которая содержит менее чем примерно 5000 нуклеотидов (нт) в длину. Инвертированные концевые повторы (ITR) фланкируют уникальные кодирующие нуклеотидные последовательности белков (Rep), необходимых для обеспечения жизненного цикла вируса, а также последовательности перекрывающихся белков капсида (Сар). Ген Сар кодирует белки VP (VP1, VP2 и VP3), которые образуют капсид, а также белки ААР (белок, активирующий сборку аденоассоциированного вируса (AAV) Sonntag F, Kother К, Schmidt К, et al. The assemblyactivating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 2011;85(23): 12686-12697. doi: 10.1128/JVI.05359-l l) и МААР (вспомогательный белок связывания с мембраной Ogden PJ, Kelsic ED, Sinai S, Church GM. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 2019;366(6469): 1139-1143. doi: 10.1126/science.aaw2900). Фланкирующие последовательности генома AAV длиной в 145 нуклеотидов являются самокомплементарными и организованы таким образом, что может быть сформирован энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпилечную структуру. Такие шпилечные структуры функционируют как точки начала репликации ДНК вируса, являясь праймерами для клеточного ДНК-полимеразного комплекса. После инфекции клеток млекопитающих AAV дикого типа (wtAAV) гены Rep (например, Rep78 и Rep52) экспрессируются с помощью Р5 промотора и Р19 промотора, соответственно, и оба белка Rep выполняют определенную функцию в репликации генома вируса. Сплайсинг в открытой рамке считывания Rep (Rep ORF) приводит к экспрессии фактически четырех белков Rep (например, Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40). Однако было показано, что несплайсированная мРНК, кодирующая белки Rep78 и Rep52, является достаточной для продукции вектора AAV в клетках млекопитающих.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV)
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Кроме того, термин «вектор» в данном настоящем документе означает вирусную частицу, способную транспортировать нуклеиновую кислоту.
Как применяют в настоящем описании, термин «экспрессия» определяют как транскрипцию и/или трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемую ее промотором.
Применение
«Генная терапия» представляет собой вставку генов в клетки и/или ткани субъекта для лечения заболевания, обычно, наследственных заболеваний, при этом дефектный мутантный аллель заменяется или дополняется функциональным аллелем.
«Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению.
«Заболевание» является состоянием здоровья субъекта, где субъект не может поддерживать гомеостаз, и где, если заболевание не облегчают, то здоровье субъекта продолжает ухудшаться.
Термин «субъект», «пациент», «индивидуум» и т.п. используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к любому животному, которое поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект, пациент или индивидуум является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Подробное описание изобретения
Выделенной модифицированной белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), который содержит аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одной или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S, где аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGL DRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGK AVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSG SQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVV TKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDW QRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVG NGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTY NFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNW FPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLI KNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQ FVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 1).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену в положении G226V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGL DRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGK AVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSG SQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVV TKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDW QRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVG NGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTY NFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNW FPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLI KNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQ FVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID N0: 3).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, G226V и Т711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNG LDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGK AVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSG SQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVV TKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDW QRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVG NGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTY NFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNW FPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLI KNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQ FVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID N0: 4).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену Тб 14 А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGL DRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGK AVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSG SQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVV TKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDW QRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVG NGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTY NFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNW FPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLI KNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQ FVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, Т614А и T711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNG LDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGK AVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSG SQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVV TKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDW QRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVG NGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTY NFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNW FPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLI KNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQ FVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 6).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену T614V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGL DRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGK AVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSG SQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVV TKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDW QRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVG NGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTY NFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNW FPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLI KNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQ FVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 7). В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, T614V и T711 S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNG LDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGK AVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSG SQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVV TKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDW QRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVG NGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTY NFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNW FPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLI KNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQ FVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 8).
Выделенные модифицированные белки VP2 и VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5)
«Правая часть» (+)-цепи геномной ДНК аденоассоциированного вируса содержит перекрывающиеся последовательности, кодирующие три белка капсида — VP 1 , VP2 и VP3. Транскрипция этих генов начинается с одного промотора, р40. Молекулярная масса соответствующих белков составляет 87, 72 и 62 кДа, соответственно. Все три белка транслируются с одной мРНК. После транскрипции пре-мРНК может подвергаться сплайсингу двумя разными способами, при этом вырезается более длинный или более короткий интрон и образуются мРНК длиной 2300 или 2600 нуклеотидов.
Таким образом, введение мутаций в ген Сар будет влиять не только на белок VP1 капсида AAV5, но и на VP2 и VP3 капсида AAV5.
На фигуре 8 приведено схематичное изображение положения структурных белков капсида AAV5 в последовательности гена Cap AAV:
1-725 ак - VP1
137-725 ак - VP2
193-725 ак - VP3
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена Т614А в VP1 будет соответствовать: аминокислотной замене в положении Т478А в VP2; аминокислотной замене в положении Т422А в VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена T614V в VP1 будет соответствовать: аминокислотной замене в положении T478V в VP2; аминокислотной замене в положении T422V в VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена G226V в VP1 будет соответствовать: аминокислотной замене в положении G90V в VP2; аминокислотной замене в положении G34V в VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена S2A в VP1 будет отсутствовать в VP2 и VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена Т711S в VP1 будет соответствовать: аминокислотной замене в положении T575S в VP2; аминокислотной замене в положении T519S в VP3.
Заявитель также считает целесообразным указать окружение найденных мутаций путем указания краткой аминокислотной последовательности, включающей данные мутации в VP1/VP2/VP3:
Для Т614А в VP1 (Т478А в VP2/ Т422А в VP3) - IPEAGAHFHP;
Для T614V в VP1 (T478V в VP2/ T422V в VP3) - IPEVGAHFHP; Для G226V в VP1 (G90V в VP2/ G34V в VP3) - TWMVDRV;
Для S2A в VP1 (отсутствует в VP2 и в VP3) - MAFVDHP;
Для Т7118 в VP1 (T575S в VP2/ T519S в VP3) - EYRSTRP.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность белка VP2 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену G90V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену G90V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены G90V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены G90V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену Т478А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит Т478А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены Т478А и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены Т478А и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену T478V. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену T478V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены T478V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены T478V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность белка VP3 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену G34V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену G34V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены G34V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены G34V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену Т422А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену Т422А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены Т422А и T519S. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены Т422А и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену T422V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену T422V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены T422V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены T422V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40.
Капсид
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному капсиду для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа, который включает любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены Т478А и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок AAV5, который содержит замены Т478А и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40.
Выделенная нуклеиновая кислота
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, использующихся для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой G226V, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 11 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G226V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 11, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 3. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, G226V и T711 S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 12 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, G226V и T711S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 12, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК- последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 4. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой Т614А и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 13 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т614А» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 13, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 5. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, Т614А и T711 S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 14 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, Т614А и T711S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 14, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК- последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 6. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой T614V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 15 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T614V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 15, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 7. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, T614V и T711 S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 16 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, T614V и T711S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 16, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК- последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 8. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G90V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 27 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G90V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 27, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 19. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами G90V и T575S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 28 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами G90V и T575S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 28, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 20. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т478А и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 29 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т478А» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 29, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 21. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами Т478А и T575S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 30 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами Т478А и T575S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 30, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 22. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T478V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 31 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T478V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 31, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 23. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами T478V и T575S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 32 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами T478V и T575S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 32, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 24. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G34V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 43 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G34V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 43, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 35. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами G34V и T519S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 44 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами G34V и T519S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 44, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 36. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т422А и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 45 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т422А» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 45, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 37. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами Т422А и T519S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 46 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами Т422А и T519S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 46, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 38. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T422V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 47 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T422V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 47, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 39. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами T422V и T519S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 48 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами T422V и T519S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 48, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 40. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения. В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный капсид, включает любую из вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот или их комбинацию.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5)
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) или любой из вышеуказанных капсидов, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных капсидов, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках. Термины «вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа», «рекомбинантный вирус на основе AAV5», «вирусоподобная частица на основе AAV5», «рекомбинантный вирусный штамм AAV5», «рекомбинантный вектор AAV5» или «вектор на основе rAAV5» в контексте настоящего описания имеют одинаковое значение.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор на основе rAAV5 включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
Вектор на основе rAAV по изобретению не содержит нуклеотидные последовательности генов, кодирующих последовательности белков (Rep), необходимых для обеспечения жизненного цикла вируса, а также последовательности перекрывающихся белков капсида (Сар).
Характеристика капсида подробно описана в вышеуказанном разделе описания.
Под «регуляторными последовательностями, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках» подразумевается в рамках данного изобретения полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они клонированы. Регулирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких регулирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «регуляторные последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, последовательности лидерных пептидов.
В контексте настоящего описания термин «промотор» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который контролирует транскрипцию одной или нескольких кодирующих последовательностей, а также который структурно идентифицируется по наличию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и других последовательностей ДНК, включающих, без ограничения, сайты связывания фактора транскрипции, сайты связывания репрессора и активатора белка, а также любые другие последовательности нуклеотидов, известные специалистам в данной области, которые непосредственно или опосредованно регулируют уровень транскрипции с данным промотором. «Конститутивный» промотор представляет собой такой промотор, который активен в большинстве тканей в обычных физиологических условиях и условиях развития. «Индуцибельный» промотор представляет собой промотор, который подвергается физиологической регуляции или регуляции в ходе развития, например, при воздействии химического индуктора. «Тканеспецифичный» промотор активен только в конкретных типах тканей или клеток.
Промоторы, которые используются для продукции высокого уровня полипептидов в эукариотических клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, должны быть сильными и, предпочтительно, должны быть активными в широком диапазоне типов клеток. Сильные конститутивные промоторы, которые способны запускать экспрессию во многих типах клеток, хорошо известны в данной области и, поэтому, нет необходимости в их подробном описании в данном документе. В соответствии с идеей настоящего изобретения предпочтительно использовать промотор цитомегаловируса (CMV). Промотор или промотор/энхансер, полученные из немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека, в особенности подходят в качестве промотора для вектора на основе rAAV5 по настоящему изобретению. Немедленная ранняя (IE) область цитомегаловируса (hCMV) человека и полученные из нее функциональные запускающие экспрессию фрагменты и/или функциональные усиливающие экспрессию фрагменты, например, описаны в ЕР0173177 и ЕР0323997, а также хорошо известны в данной области. Таким образом, несколько фрагментов немедленной ранней (IE) области hCMV могут использоваться в качестве промотора и/или промотора/энхансера.
Термины «энхансеры» или «энхансер», используемые в изобретении, могут относиться к последовательности ДНК, которая расположена как смежная с последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантный продукт. Энхансерные элементы обычно расположены в 5'-направлении от промоторного элемента или могут быть расположены ниже или в пределах кодирующей последовательности ДНК (например, последовательности ДНК, транскрибированной или транслированной в рекомбинантный продукт или продукты). Таким образом, энхансерный элемент может быть расположен на расстоянии 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или больше пар оснований перед последовательностью ДНК, которая кодирует рекомбинантный продукт, или после этой последовательности. Энхансерные элементы могут увеличивать количество экспрессируемого рекомбинантного продукта от последовательности ДНК, превышая экспрессию, обусловленную одиночным промоторным элементом. Специалистам в данной области техники доступно множество энхансерных элементов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках может включать следующие элементы в направлении от 5'-конца к З'-концу: левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);
CMV (цитомегаловирусный) энхансер;
CMV (цитомегаловирусный) промотер; интрон гена hBGl (ген субъединицы гемоглобина гамма- 1); нуклеиновая кислота, кодирующая продукт; сигнал полиаденилирования hGHl (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека); правый (второй) ITR.
В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, кодирующая продукт (трансген) представляет собой по меньшей мере один ген, кодирующий белок. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну небольшую нуклеиновую кислоту-ингибитор. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну репортерную молекулу. В некоторых вариантах реализации малая ингибирующая нуклеиновая кислота представляет собой miRNA. В некоторых вариантах реализации малая ингибирующая нуклеиновая кислота представляет собой sponge miRNA или TuD-RNA, которая ингибирует активность по меньшей мере одной miRNA у животного. В некоторых вариантах реализации miRNA экспрессируется в клетке ткани- мишени. В некоторых вариантах реализации ткань-мишень представляет собой ткань печени, центральной нервной системы (ЦНС), глаз, желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, молочной железы, поджелудочной железы, мочевыводящих путей или ткани матки. В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 имеет продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой терапевтический полипептид, где терапевтический полипептид представляет собой фактор свертывания крови, выбираемый из группы, состоящей из фактора VIII, фактора IX или их функционального варианта.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой белок SMN 1 (белок выживаемости моторных (двигательных) нейронов)
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой полипептид RBD-S (рекомбинантный рецептор-связывающий домен гликопротеина S) вируса SARS-cov2 (коронавирус 2 типа, вызывающий тяжёлый острый респираторный синдром).
Фармацевтическая композиция
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, которая содержит: a) любой из вышеуказанных векторов на основе rAAV5; и b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вирусную частицу на основе rAAV5 по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или в других лекарственных соединениях, фармацевтические агенты, носители, адъюванты, разбавители и т.д. Носитель для инъекций обычно является жидким. Носитель для других способов введения может быть или твердым, или жидким, таким как стерильная апирогенная вода или стерильный апирогенный фосфатно-солевой буферный раствор. Для введения путем ингаляции носитель является вдыхаемым и предпочтительно находится в твердой или жидкой дисперсной форме. В качестве инъекционной среды предпочтительно использовать воду, содержащую добавки, общепринятые для инъекционных растворов, такие как стабилизирующие агенты, соли или солевые растворы и/или буферы.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей клетку, в которой вектор на основе rAAV5 интегрирован в геном, в фармацевтически приемлемом носителе или других лекарственных соединениях, фармацевтических агентах, носителях, адъювантах, разбавителях и т.д.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя вышеуказанный вектор на основе rAAV5, согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксципиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики). Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы.
«Фармацевтически приемлемым» считается материал, который не имеет биологических или других противопоказаний, например, материал можно вводить субъекту без каких-либо нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такие фармацевтические композиции можно использовать, например, для трансфекции клетки ех vivo или для введения in vivo вирусной частицы или клетки непосредственно субъекту.
Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств. Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента.
Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение pH, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату вектора на основе rAAV5, проявлять устойчивость к изменениям pH. В общем случае, преимущественными являются значения pH фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8 °C. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.
Способ доставки генного продукта
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции.
Под субъектом подразумевают любой живой организм, который поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста. Любой способ введения вектора на основе rAAV5, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для вышеуказанного вектора на основе rAAV5, по данному изобретению.
Примеры способов введения включают в себя местное применение, интраназальное, ингаляционное, чрезслизистое, трансдермальное, энтеральное (например, пероральное, ректальное), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное) введения, а также инъекции непосредственно в ткань или в орган.
Инъекционные препараты могут быть приготовлены в общепринятых лекарственных формах: в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для приготовления растворов или суспензий в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Альтернативно, можно вводить вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV5 по данному изобретению локально, а не системно, например, в виде депо или в композиции с замедленным высвобождением.
Рекомбинантный вирус на основе AAV5 вводят в организм в эффективном количестве. Рекомбинантный вирус на основе AAV5 предпочтительно вводят в организм в биологически эффективном количестве. «Биологически эффективное» количество рекомбинантного вируса представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать инфекцию (или трансдукцию) и экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке. Если вирус вводят в клетку in vivo (например, вирус вводят субъекту, как описано ниже), «биологически эффективное» количество вирусного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать трансдукцию и экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-мишени.
Клетка для введения вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе AAV5 по изобретению может быть клеткой любого типа, включая в себя без ограничения, моторные нейроны или прочие ткани нервной системы, эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки кожи, дыхательных путей и кишечника), печеночные клетки, мышечные клетки, клетки селезенки, фибробласты, эндотелиальные клетки и тому подобное.
Вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV5 по изобретению не используется для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.
Применение
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В некоторых вариантах осуществления применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови, заболевания центральной нервной системы, заболевания метаболизма, заболевания мышц, наследственные заболевания.
Под субъектом подразумевают любое животное, которое поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Введение вектора на основе rAAV5 по настоящему изобретению субъекту -человеку или животному, нуждающемуся в этом, можно проводить любым известным в данной области способом для введения вирусных векторов.
Примеры способов введения включают в себя местное применение, интраназальное, ингаляционное, чрезслизистое, трансдермальное, энтеральное (например, пероральное, ректальное), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное) введения, а также инъекции непосредственно в ткань или в орган.
Инъекционные препараты могут быть приготовлены в общепринятых лекарственных формах: в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для приготовления растворов или суспензий в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Альтернативно, можно вводить вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV5 по данному изобретению локально, а не системно, например, в виде депо или в композиции с замедленным высвобождением.
В некоторых вариантах применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание крови.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание мышц.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой наследственное заболевание.
В некоторых вариантах осуществления применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах осуществления применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой белок SMN 1 (белок выживаемости моторных (двигательных) нейронов)
В некоторых вариантах осуществления применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой полипептид RBD-S (рекомбинантный рецептор-связывающий домен гликопротеина S) вируса SARS- cov2 (коронавирус 2 типа, вызывающий тяжёлый острый респираторный синдром).
В некоторых вариантах осуществления применения любой из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции используются в терапевтически эффективном количестве.
Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается количество, которое достаточно для облегчения (например, для смягчения, уменьшения, снижения) по меньшей мере одного из симптомов, связанных с патологическим состоянием. Другими словами, «терапевтически эффективное» количество представляет собой количество, которое достаточно для обеспечения некоторого улучшения состояния субъекта.
Дозировки вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе AAV5 по данному изобретению будут зависеть от способа введения, конкретного вирусного вектора и их можно определять рутинными способами. Примерными дозами для достижения терапевтического эффекта являются вирусные титры, составляющие по меньшей мере примерно 105, 106, 107, 108, 109, IO10, 1011, 1012, 10°, 1014, 1015, 1016 трансдуцирующих единиц или больше, предпочтительно приблизительно от 109 до 1015 трансдуцирующих единиц, еще более предпочтительно 1014 трансдуцирующих единиц на килограмм.
Таким образом, рекомбинантный вирус на основе AAV5, реагенты и способы по настоящему изобретению можно использовать для направления нуклеиновой кислоты в делящиеся или неделящиеся клетки и для стабильной экспрессии в этих клетках гетерологичной нуклеиновой кислоты. С использованием этой векторной системы стало возможно вводить в клетки в условиях in vivo гены, которые кодируют белки, влияющие на физиологию клеток. Таким образом, векторы по настоящему изобретению могут быть полезными в генной терапии при патологических состояниях.
Настоящее изобретение можно использовать для доставки любой чужеродной нуклеиновой кислоты с биологическим эффектом для лечения или ослабления симптомов, связанных с каким-либо расстройством, обусловленным генной экспрессией. Примеры патологических состояний включают в себя без ограничения кистозный фиброз (и другие заболевания легких), гемофилию А, гемофилию В, талассемию, анемии и другие нарушения свертываемости крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, сахарный диабет, мышечные дистрофии (например, Дюшенна, Беккера, спинальная мышечная атрофия (SMA)), болезнь Гоше, болезнь Херлера, дефицит аденозиндеаминазы, болезни накопления гликогена и другие метаболические дефекты, заболевания солидных органов (например, мозга, печени, почек, сердца) и тому подобное.
Перенос генов обладает значительным потенциалом применения для понимания и создания способов лечения патологических состояний. Существует ряд наследственных заболеваний, для которых были изучены и клонированы дефектные гены. В некоторых случаях известна функция этих клонированных генов. В целом упомянутые выше патологические состояния делятся на два класса: дефицитные состояния, как правило, дефицит ферментов, которые обычно наследуются рецессивным образом, и состояния нарушения баланса, иногда с вовлечением по меньшей мере регуляторных или структурных белков, которые наследуются доминантным образом. При дефицитных заболеваниях можно использовать перенос генов, чтобы внести нормальный ген в пораженные ткани для заместительной терапии. При патологических состояниях нарушения баланса перенос генов можно использовать для создания патологического состояния в смоделированной системе, которую затем можно использовать для разработки мер против этого патологического состояния. Таким образом, способы по настоящему изобретению позволяют лечить генетические заболевания. Согласно изобретению, патологическое состояние лечится путем частичного или полного устранения дефекта или дисбаланса, который вызывает заболевание или усугубляет степень его тяжести. Также возможно использование сайт-специфичной интеграции нуклеиновых последовательностей для запуска мутаций или исправления дефектов.
Способ получения вектора на основе г АЛ V5
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5, который включает трансфекцию клеток- продуцентов любой из вышеуказанных нуклеиновых кислот, кодирующей модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), или вышеуказанной нуклеиновой кислотой, кодирующей капсид.
Белки капсида могут быть экспрессированы из рекомбинантного вируса, вектора экспрессии или из линии клеток, в которую стабильно интегрированы гены описанных модифицированных капсидов AAV или кодирующие последовательности. Кроме того, изобретение обеспечивает получение капсидов AAV с описанными мутациями in vitro из белков капсидов AAV и конструирование упакованных капсидов in vitro. Изобретение также обеспечивает получение модифицированных капсидов AAV, которые были генетически сконструированы для экспрессии гетерологичных эпитопов клинически важных антигенов, чтобы вызвать иммунный ответ.
Способ получения вектора на основе rAAV5 подробно описан в примерах.
Трансгенное животное
Согласно некоторым аспектам раскрытия предоставляется способ создания модели соматических трансгенных животных. В некоторых вариантах реализации способ включает введение любого из вышеупомянутых rAAV не являющемуся человеком животному, где rAAV содержит по меньшей мере один трансген, и где rAAV инфицирует клетки ткани- мишени животного, не являющегося человеком.
В некоторых вариантах возможно использование описанных вариантов капсидов для создания модели соматических трансгенных животных, которые включают введение любого из вышеупомянутых rAAV не относящемуся к человеку животному, где rAAV содержит по меньшей мере один трансген. В некоторых вариантах реализации трансген представляет собой по меньшей мере один ген, кодирующий белок. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну небольшую нуклеиновую кислоту- ингибитор. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну репортерную молекулу.
Соматической трансгенной животной моделью может быть млекопитающее, такое как мышь, крыса, кролик, собака, кошка, овца, свинья, примат, не являющийся человеком.
В некоторых вариантах реализации предполагаемый терапевтический агент можно вводить модели соматического трансгенного животного для определения эффекта предполагаемого терапевтического агента на патологическое состояние животного.
Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Материалы и общие методы Методы рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.
Синтез генов
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 и. и., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ТТПР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.
Определение последовательностей ДНК
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру.
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях
Применяли пакет программ SnapGene версии 5.1.4.1 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.
Статистический анализ данных
Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), для сравнения результатов теста и контроля использовали дисперсионный анализ (ANOVA), и они были определены как статистически значимые.
Пример 1. Получение библиотек вариантов капсидов rAAV5
Получение библиотек вариантов капсидов rAAV5 производили методом случайного мутагенеза последовательности гена Cap (Davidsson М. et al., 2016). Вкратце, последовательность гена Сар пятого серотипа содержащую мутации S2A и T711S в VP1 полученные в предыдущем раунде отбора (заявка на патент № RU2019126509), фрагментировали с использованием урацил-ДНК-гликозилазы, полученные фрагменты собирали в полноразмерный ген Сар с помощью ДНК-полимеразы, не обладающей корректирующей активностью (в результате в последовательности возникали случайные мутации). Полноразмерные мутантные варианты клонировали в плазмиду-носитель pAAV- linker (Фигура 1) по сайтам рестрикции AscI/EcoRI в общую рамку считывания с зеленым флуоресцентным белком (GFP), продуцируя многообразную случайную библиотеку капсидов rAAV5, которую затем использовали для отбора вариантов капсидов с повышенной трансдуцирующей активностью. Положительный отбор вирусных частиц с повышенной трансдуцирующей активностью проводили in vitro на клетках линии CHO-K1-S. При этом для трансдукции использовали частицы, очищенные с помощью УЦФ в градиенте йодиксанола. Спустя 48 часов клетки собирали и выделяли геномную ДНК для последующей амплификации последовательностей геномов вирусов, способных к эффективной трансдукции. Полученные последовательности затем переклонировали и повторно нарабатывали для последующих итераций отбора с целью обогащения библиотеки вариантами с наибольшей эффективностью трансдукции. После 5 раундов отбора капсидные гены 100 клонов просеквенировали для определения наиболее успешных мутаций и их сочетаний. По результатам секвенирования преобладающими сочетаниями мутаций оказались S2A, T711S, T614V в VP1 AAV5- порядка 30% клонов. Также были отобраны варианты капсидов, содержащие мутации S2A, T711S, Т614А в VP1 AAV5 и S2A, T711S, G226V в VP1 AAV5. Данные варианты капсидов клонировали в вектора для наработки вирусных частиц и в дальнейшем использовали для визуализации и сравнения профилей трансдукции относительно AAV5 дикого типа.
Пример 2. Наработка и последующий отбор рекомбинантных вирусных частиц из полученной библиотеки последовательностей
Для наработки и последующего отбора рекомбинантных вирусных частиц из полученной библиотеки последовательностей была разработана серия плазмид: плазмида- носитель, плазмида, содержащая последовательность гена Rep, а также конструкция, содержащая аденовирусные гены, необходимые для репликации вирусных частиц.
Плазмида-носитель pAAV-linker (Фигура 1) предназначенная для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV пятого серотипа в одну рамку считывания с репортерным белком, была получена путем замены последовательности модифицированного зеленого флуоресцентного белка в исходной конструкции pAAV-GFP (Фигура 2), с помощью рестриктазно-лигазного метода клонирования по сайтам Hindlll/EcoRI, на последовательность T2A-GFP, синтезированную de novo с добавлением сайтов рестрикции EcoRI с 5 ’-конца и Hindlll с 3 ’-конца.
Плазмида р A AV-Rep, содержащая последовательность гена Rep (Фигура 3), была получена путем клонирования de novo синтезированной последовательности гена Rep AAV второго серотипа (GenBank Ш AF043303.1) по сайтам рестрикции Pcil/Psil с последующей обработкой Т4 DNA Polymerase для получения «тупых» концов, в плазмиду pGem-T Easy (Promega, США) так же обработанную рестриктазами Pcil/Psil.
В качестве источника аденовирусных генов для наработки рекомбинантных вирусных частиц была использована конструкция pHelper (Фигура 4), содержащая AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, Оп- ориджин репликации в бактериях, Adeno Е2А - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno Е4 - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno VARNA последовательность гена хелперного аденовируса отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов.
Пример 3. Способ получения векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5)
Для получения частиц rAAV с модифицированным капсидом 5 серотипа, клетки- продуценты трансфецировали одновременно 3 плазмидами:
1) Плазмидой, содержащей нуклеотидные последовательности аденовируса, кодирующие белки и РНК, необходимые для сборки частиц rAAV (хелперная плазмида);
2) Плазмидой, содержащей нуклеотидную природную последовательность гена Rep аденоассоциированного вируса, а также последовательность модифицированного гена Сар, которую выбирают из группы: нуклеотидная последовательность SEQ Ш NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или любая другая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, и белки VP2 и VP3 с альтернативных рамок считывания используемой нуклеотидной последовательности, где
VP2 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24; a VP3 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ Ш No: 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40;
3) Плазмидой, содержащей гетерологичный геном частицы rAAV, кодирующий целевой ген, предназначенный для доставки в клетки пациента.
Данный набор генов обеспечивает сборку вирусных частиц rAAV и инкапсидирование в них целевого генома в течение 72 часов. Через 72 часа после трансфекции клетки-продуценты подвергают лизису с высвобождением частиц rAAV и очищают последовательными стадиями фильтрации и хроматографии. Титр очищенных частицы rAAV проверяют с помощью иммуноферментного анализа и количественной ПНР
Пример 4. Увеличение эффективности трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5 при наличии мутаций S2A, T614V/T614A/G226V, T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Дизайн эксперимента: В лунки 12-лу ночных планшетов были посеяны клетки линии CHO-K1-S. Посев проводили в ростовую среду: ДМЕМ/Р12 с глутамином, содержание глюкозы 4,5 г/л, 5% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10 000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 500, 1250 и 2500 вг/клетка. Все образцы были поставлены в трех повторностях. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
В роли контрольных препаратов были использованы препараты на основе rAAV5 с мутациями S2A H T71 1 S B белке капсида VP 1 , а также препарат на основе г AAV 5 с капсидом дикого типа. Ранее было показано (заявка на патент № RU2019126509), что наличие в белке VP1 капсида AAV5 мутаций S2A и Т711S приводит к достоверно большей эффективности трансдукции клеток CHO-K1-S по сравнению с капсидом дикого типа.
Анализ эффективности трансдукции проводили с помощью проточного цитометра Guava EasyCyte и программного обеспечения GuavaSoft.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы T614V, Т614А и G226V в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, уже содержащего мутации S2A и Т711S, приводило к существенному увеличению эффективности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными мутациями (T614V, Т614А и G226V). К примеру, при помощи метода проточной цитометрии удалось выявить изменение количества GFP позитивных клеток спустя 48 часов после трансдукции линии CHO-K1-S препаратами на основе rAAV5 с белком VP1 дикого типа, с белком VP1, содержащего мутации S2A и Т711S или белком VP1, несущим мутации S2A, Т711S и T614V или Т614А или G226V (Фигура 5).
При наличии мутаций T614V, S2A и T711S (AAV5-02Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,31 раза с 24,92% до 32,84% при MOI 500, в 1,47 раза с 43,44% до 63,89% при MOI 1250 и в 1,17 раза с 65,56% до 78,01% при MOI 2500 вг/клетка по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации T614V, S2A и T711S (AAV5-02Mut- GFP), и капсида VP1 дикого типа (AAV5-NullMut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,74 раза с 11,97% до 32,84% при MOI 500, в 3,18 раза с 20,11% до 63,89% при MOI 1250 и в 1,85 раза с 42,26% до 78,01% при MOI 2500
При наличии мутаций Т614А, S2A и T711S (AAV5-03Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,18 раза с 24,92% до 29,62% при MOI 500, в 1,27 раза с 43,44% до 55,22% при MOI 1250 и в 1,1 раза с 65,56% до 72,05% при MOI 2500 вг/клетка по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации Т614А, S2A и Т71 lS(AAV5-03Mut- GFP), и капсида VP1 дикого типа (AAV5-NullMut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,47 раза с 11,97% до 29,62% при MOI 500, в 2,74 раза с 20,11% до 55,22% при MOI 1250 и в 1,7 раза с 42,26% до 72,05% при MOI 2500.
При наличии мутаций G226V, S2A и T711S (AAV5-04Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, было ниже в 1,41 раза с 24,92% до 17,67% при MOI 500, в 1,09 раза с 43,44% до 39,69% при MOI 1250 и в 1,05 раза с 65,56% до 61,85% при MOI 2500 вг/клетка по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации Т614А, S2A и T711S (AAV5-03Mut- GFP), и капсида VP1 дикого типа (AAV5-NullMut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,48 раза с 11,97% до 17,67% при MOI 500, в 1,97 раза с 20,11% до 39,69% при MOI 1250 и в 1,46 раза с 42,26% до 61,85% при MOI 2500.
Пример 5. Эффективность упаковки вирусных геномов AAV препаратами на основе rAAV5 при наличии мутаций S2A, T614V/G226V, T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа.
В данном изобретении под понятиями «векторный геном» и «векторная ДНК» следует понимать оцДНК упакованную в капсид рекомбинантного аденоассоциированного вируса (далее rAAV). Такая оцДНК может быть как смысловой (далее плюс цепь ДНК), так и антисмысловой (далее минус цепь ДНК). Препарат rAAV является смесью капсидов часть из которых содержит плюс цепь оцДНК, а часть содержит минус цепь оцДНК. Векторный геном rAAV представляет собой нуклеотидную последовательность экспрессионной кассеты, окруженную последовательностью инвертированных концевых повторов - ITR (inverted terminal repeats, далее ITR).
В данном изобретении под понятием «образец» или «исследуемый образец» следует понимать оцДНК экстрагированную из соответствующего препарата rAAV.
По данным литературы AAV капсиды эффективно упаковывают кассеты до 4.8 kb, кассеты же большего размера в процессе упаковки в капсид фрагментируются с 5’ - или 3’- концов ДНК и в результате упаковываются с меньшей эффективностью, образую неоднородную популяцию вирусных геномов rAAV. При этом чаще всего делетированию подвергается 5’- конец одноцепочечной ДНК (далее оцДНК) (Zhijian Wu, 2010.). Таким образом, значительная часть препаратов rAAV содержат фрагментированные цепи оцДНК, что в свою очередь приводит к снижению эффективности экспрессии. Для оценки эффективности упаковки оцДНК капсидами rAAV был использован метод саузерн-дот блота. Для проверки целостности 5’ - и 3’ - концов оцДНК в исследуемом образце на участки ДНК максимально близкие к последовательности 5’ - ITR и 3’ - ITR подбирали олигонуклеотидные зонды. Зонды должны строго специфично связываться с выбранными участками оцДНК. Также зонды были подобраны на участки ДНК, соответствующие середине экспрессионной кассеты (-2400-2500 по), такая точка детекции является контрольной для исследуемой цепи оцДНК, т. к. данная область реже подвергается фрагментации при упаковке в капсид (Фиг. 6.). Олигонуклеотидные зонды подбирали как для «плюс», так и для «минус» цепи ДНК экспрессионной кассеты. Зонды отличаются от обычных олигонуклеотидов тем, что на их 5 ’-конце последовательности находится молекула биотина.
В процессе выполнения работ, исследуемый образец - ДНК экстрагированная из анализируемых rAAV препаратов, наносили на предварительно смоченную в 20XSSC буфере нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовали с выбранными зондами. Для каждого зонда использовалась отдельная мембрана с исследуемыми образцами, таким образом обработке подвергались 6 мембран, на каждой из которых находились исследуемые образцы ДНК экстрагированные из 2.5* 1010 вирусных частиц (измеренных как GC - genome сору) с предварительной обработкой вирусного препарата DNAse I для удаления примесей не инкапсидированной ДНК и последующей обработкой Протеиназой К, согласно протоколу описанному в статье (Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice Mariacarmela Allocca, J Clin Invest. 2008 May 1; 118(5): 1955-1964.)
Нанесение образцов на мембрану осуществлялось с помощью вакуумного коллектора Bio-Dot® Microfiltration Apparatus (Bio-Rad). Экстрагированную ДНК из 2,3 х Ю9 векторных геномов наносили в первую лунку коллектора. В оставшиеся шесть лунок коллектора наносили двукратные серийные разведения данного образца, получая таким образом ряд разведений, соответствующий 7, 3.5, 1.7, 0.86, 0.43, 0.21 и 0.11 нг векторной ДНК. Стандартную пДНК, полученную при расщеплении pAAV-GOI по сайтам Smal, разбавляли таким же образом. Количество стандартной пДНК, в калибровочной кривой, составляло 50, 25, 12.5, 6.25, 3.1, 1.6, 0.78 соответственно.
В данном изобретении под термином «Стандартная пДНК» следует понимать расщепленную по сайтам Smal плазмидную ДНК (далее пДНК), нуклеотидная последовательность которой в точности соответствует нуклеотидной последовательности исследуемого векторного генома. Зонды, используемые для гибридизации, синтезированы и помечены биотином. Гибридизацию проводили в течение ночи при температуре на 10 ° С ниже температуры плавления каждого зонда.
На следующий день мембраны отмывали сначала раствором 2 х SSC/0,1% SDS, а затем TBSTxl. Далее мембраны инкубировали с 1% BSA и TBSTxl в течение 40 минут и снова отмывали TBSTxl. Затем, мембраны инкубировали с HRP-конъюгированным стрептавидином в течение часа для связывания биотинилированного зонда с HRP- конъюгированным стрептавидином. После финальной отмывки мембран 1% BSA TBSTxl добавляли субстрат для хемилюминесцентной детекции и детектировали люминесцентный сигнал на мембранах (Фигура 7). Дальнейшую обработку полученных изображений проводили с помощью ПО «Image Lab». Оценку интенсивности люминесцентного сигнала от зондов определяли по уровню интенсивности люминесцентного сигнала стандартной пДНК. Интенсивность люминесцентного сигнала разведений стандартной пДНК принимали за калибровочную кривую (далее стандартный образец).
Авторами изобретения было установлено, что подобранные биотинилированные зонды связываются с ДНК-матрицей, находящейся на мембране с одинаковой эффективностью, что очевидно из окрашивания разведений стандартной пДНК в каждой точке. Детекция фрагментов ДНК, соответствующих 5’- и 3’ -концам плюс цепи и 5’- и 3’- концам минус цепи исследуемой ДНК наблюдалась для всех испытуемых образцов. При одинаковой нагрузке ДНК исследуемых образцов на мембраны наблюдались различия в интенсивности детектируемых сигналов люминесценции.
В области детекции зонда “Probe 1” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции третьего разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на шестом разведении, седьмое разведение данного образца детектируется на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 1” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции третьего и четвертого разведений стандартного образца pDNA- GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 1” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируется на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда “Probe 1”, образцы vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA- NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведения относительно контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP.
В области детекции зонда “Probe 3” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится за пределами разведения стандартного образца pDNA-GFP. Интенсивность сигнала люминесценции во второй точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции первого и второго разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 3” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится за пределами разведения стандартного образца pDNA-GFP. Интенсивность сигнала люминесценции во второй точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции первого и второго разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 3” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP находится за пределами разведения стандартного образца pDNA-GFP. Интенсивность сигнала люминесценции во второй точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции второго и третьего разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируется на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда “Probe 3”, образцы vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA- NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведения относительно контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP.
В области детекции зонда “Probe 5” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции пятого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 5” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на седьмом разведении.
В области детекции зонда “Probe 5” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции пятого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда “Probe 5”, образец vgDNA-04Mut-GFP не отличается от контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP. Образец vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведениях относительно контрольного образца vgDNA- NullMut-GFP.
В области детекции зонда “Probe 2” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA- GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 2” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA- GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируется на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 2” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала. При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда “Probe 2”, образец vgDNA-04Mut-GFP не отличается от контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP. Образец vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведения относительно контрольного образца vgDNA- NullMut-GFP.
В области детекции зонда “Probe 4” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится за пределами разведения стандартного образца pDNA-GFP. Интенсивность сигнала люминесценции во второй точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции первого и второго разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на шестом разведении, седьмое разведение данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 4” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции первого и второго разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на шестом разведении, седьмое разведение данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 4” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции первого и второго разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда “Probe 4”, образцы vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA- NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведениях относительно контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP.
В области детекции зонда “Probe 6” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на шестом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 6” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда “Probe 6” интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда “Probe 6”, образец vgDNA-02Mut-GFP не отличается от контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP, а образец vgDNA-04Mut-GFP имеет большую силу сигнала люминесценции и детектируется на более поздних разведениях в сравнении с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-04Mut- GFP в точках детекции зонда “Probe 1” (3’ область минус цепи ДНК) и “Probe5” (5’ область минус цепи ДНК). Наибольшую интенсивность сигнала люминесценции имеет 3’ - область минус цепи ДНК (Probe 1), которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции третьего разведения стандартного образца pDNA-GFP, по сравнению с детектируемой 5’ областью минус цепи ДНК (Probe5), которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции пятого разведения стандартного образца pDNA-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-02Mut- GFP в точках детекции зонда “Probe 1” (3’ область минус цепи ДНК) и “Probe5” (5’ область минус цепи ДНК). Наибольшую интенсивность сигнала люминесценции имеет 3’ - область минус цепи ДНК, которая находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции третьего и четвертого разведений стандартного образца pDNA-GFP, по сравнению с детектируемой 5 ’ областью минус цепи ДНК, которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP в точках детекции зонда “Probe 1” (3’ область минус цепи ДНК) и “Probe5” (5’ область минус цепи ДНК). Наибольшую интенсивность сигнала люминесценции имеет 3’ - область минус цепи ДНК, которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP, по сравнению с детектируемой 5’ областью минус цепи ДНК, которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции пятого разведения стандартного образца pDNA- GFP. Для образцов vgDNA-04Mut-GFP, vgDNA-02Mut-GFP, vgDNA-NullMut-GFP эффективность упаковки минус цепей оценивалась по отличиям в интенсивности сигнала люминесценции в области детекции 3’ -конца минус цепи ДНК и интенсивности сигнала люминесценции в области детекции 5 ’-конца минус цепи ДНК. Для всех исследуемых образцов показана тенденция к преобладанию интенсивности сигнала люминесценции в области детекции 3’ -конца минус цепи ДНК над интенсивностью сигнала люминесценции в области детекции 5 ’-конца минус цепи ДНК. Однако, при сравнении интенсивности сигналов люминесценции в области детекции 3’ -конца минус цепи ДНК и интенсивностью сигналов люминесценции в области детекции 5 ’-конца минус цепи ДНК образцов выявлено, что образцы vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-02Mut-GFP имеют более эффективную упаковку минус цепи ДНК по сравнению с контрольным образцом vgDNA- NullMut-GFP, т.к. имеют имеет большую силу сигнала люминесценции как для области детекции 3’ -конца минус цепи ДНК, так и для области детекции 5 ’-конца минус цепи ДНК и детектируется на более поздних разведениях относительно контрольного образца vgDNA- NullMut-GFP. Образец vgDNA-02Mut-GFP имеет более эффективную упаковку минус цепи ДНК по сравнению с vgDNA-04Mut-GFP и контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP, т.к. в области детекции 3 ’-конца минус цепи ДНК интенсивность сигнала люминесценции находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции третьего и четвертого разведений стандартного образца pDNA-GFP, а интенсивность сигнала люминесценции в области детекции 5 ’-конца минус цепи ДНК соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP, тогда как для образцов vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-NullMut-GFP интенсивность сигнала люминесценции в области детекции 5 ’-конца минус цепи ДНК значительно уступает интенсивности сигнала люминесценции в области детекции 3 ’ -конца минус цепи ДНК этих образцов. Данный факт свидетельствует о более эффективной упаковке полноразмерных минус цепей ДНК в образце vgDNA-02Mut-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-04Mut- GFP в точках детекции зонда “Probe 6” (3’ область плюс цепи ДНК) и “Probe 2” (5’ область плюс цепи ДНК) различий не обнаружено, интенсивности люминесценции этих точек находятся в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-02Mut- GFP в точках детекции зонда “Probe 6” (3’ область плюс цепи ДНК) и “Probe 2” (5’ область плюс цепи ДНК) различий не обнаружено, интенсивности люминесценции этих точек находятся в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-NullMut- GFP в точках детекции зонда “Probe 6” (3’ область плюс цепи ДНК) и “Probe 2” (5’ область плюс цепи ДНК) различий не обнаружено, интенсивности люминесценции этих точек находятся в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP.
Для образцов vgDNA-04Mut-GFP, vgDNA-02Mut-GFP, vgDNA-NullMut-GFP эффективность упаковки плюс цепей оценивалась по интенсивности сигналов люминесценции в области детекции 3’ -конца плюс цепи ДНК и в области детекции 5 ’-конца плюс цепи ДНК. Выявлено, что для всех образцов в области детекции 3’ -конца плюс цепи ДНК сигнал люминесценции исследуемых образцов детектируется в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP также, как и сигнал люминесценции от детекции 5’ области плюс цепи ДНК исследуемых образцов детектируется в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP. Таким образом упаковка плюс цепей ДНК в исследуемых образцах имеет равную эффективность.
Пример 6. Эффективность наработки векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5)
Для получения частиц rAAV с модифицированным капсидом 5 серотипа, клетки- продуценты НЕК293 трансфецировали с использованием полиэтиленимина одновременно 3 плазмидами:
1) Плазмидой, содержащей нуклеотидные последовательности аденовируса, кодирующие белки и РНК, необходимые для сборки частиц rAAV (хелперная плазмида);
2) Плазмидой, содержащей нуклеотидную природную последовательность гена Rep аденоассоциированного вируса, а также последовательность модифицированного гена Сар, которую выбирают из группы: нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или любая другая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, и белки VP2 и VP3 с альтернативных рамок считывания используемой нуклеотидной последовательности, где
VP2 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24; a VP3 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ Ш No: 34,
35, 36, 37, 38, 39 или 40; 3) Плазмидой, содержащей гетерологичный геном частицы rAAV, кодирующий целевой ген, предназначенный для доставки в клетки пациента.
Данный набор генов обеспечивает сборку вирусных частиц rAAV и инкапсидирование в них целевого генома в течение 72 часов. Через 72 часа после трансфекции клетки- продуценты подвергали лизису с высвобождением частиц rAAV, полученные вектора обрабатывали ДНКазой I в течение 2 часов при 37 ° С, затем еще 2 часа протеиназой К при 56 ° С. Титр полученных частиц rAAV определяли с помощью количественной ПЦР с использованием сета олигонуклеотидов состоящего из прямого праймера 5’- ACCACATGAAGCAGCACGAC -3’, обратного праймера 5’ - TCAGCTCGATGCGGTTCAC -3’, и зонда 5’- HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1 -3’ специфичного к последовательности GFP.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, выбранных из группы, которая состоит из T614V, Т614А или G226V, в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, уже содержащего мутации S2A и T711S, приводило к существенному повышению выхода инкапсидированных вирусных частиц на основе rAAV5 с указанными мутациями (T614V, Т614А и G226V) по сравнению с капсидом rAAV5 дикого типа. К примеру, при помощи метода количественной ПЦР удалось выявить изменение количества копий упакованного гетерологичного генома частицы rAAV, кодирующего целевой ген GFP (Фигура 9).
При наличии мутаций T614V, S2A и T711S (AAV5-02Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 7,09 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,78Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации T614V, S2A и T711S (AAV5-02Mut-GFP), и капсида VP1 содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,31 раза с 1,36Е+10 вг/мл до 1,78Е+10 вг/мл
При наличии мутаций Т614А, S2A и T711S (AAV5-03Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,78 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,20Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации Т614А, S2A и T711S (AAV5-03Mut-GFP), и капсида VP1 содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, статистически достоверно не изменялось.
При наличии мутаций G226V, S2A и T711S (AAV5-04Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 6,77 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,70Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации G226V, S2A и T711S (AAV5-04Mut-GFP), и капсида VP1 содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,25 раза с 1 ,36Е+10 вг/мл до 1,70Е+10 вг/мл.

Claims

Формула изобретения
1. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), содержащий аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одной или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711 S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711 S,
T614V, или
S2A, T614V и T711 S, где аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.
2. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по и. 1, который включает замену в положении G226V.
3. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по и. 2, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.
4. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по и. 1, который включает замены S2A, G226V и T711 S.
5. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по и. 4, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4.
6. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п.1, который включает замену Т614А.
7. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 6, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5.
8. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1, который включает замены S2A, Тб 14 А и T711 S.
9. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 8, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6.
10. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п.1, который включает замену T614V.
11. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 10, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7.
64
12. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1, который включает замены S2A, T614V и T711S.
13. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 12, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.
14. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа по любому из пи. 1-13, который используется для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
15. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой G226V, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 11 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
16. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, G226V и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 12 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
17. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой Т614А, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 13 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
18. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, Т614А и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 14 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
19. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой T614V, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 15 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
65
20. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, T614V и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 16 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
21. Выделенный капсид для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа, который включает модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа по любому из пи. 1-13.
22. Выделенный капсид по и. 21, который включает модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа по любому из пи. 1-13, белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
23. Выделенный капсид по и. 22, который включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
24. Выделенный капсид по и. 23, который включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.
25. Выделенный капсид по и. 22, который включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
26. Выделенный капсид по и. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V.
27. Выделенный капсид по и. 26, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19.
28. Выделенный капсид по и. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S.
29. Выделенный капсид по и. 28, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.
30. Выделенный капсид по и. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А.
31. Выделенный капсид по и. 30, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
66
32. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены Т478А и T575S.
33. Выделенный капсид по п. 32, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены Т478А и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22.
34. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V.
35. Выделенный капсид по п. 34, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23.
36. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S.
37. Выделенный капсид по п. 36, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24.
38. Выделенный капсид по п. 22, который включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
39. Выделенный капсид по и. 38, который включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33.
40. Выделенный капсид по и. 22, который включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
41. Выделенный капсид по и. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V.
42. Выделенный капсид по и. 41, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35.
43. Выделенный капсид по и. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S.
44. Выделенный капсид по и. 43, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36.
45. Выделенный капсид по и. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А.
67
46. Выделенный капсид по п. 45, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37.
47. Выделенный капсид по п. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S.
48. Выделенный капсид по п. 47, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38.
49. Выделенный капсид по п. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V.
50. Выделенный капсид по п. 49, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39.
51. Выделенный капсид по п. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S.
52. Выделенный капсид по п. 51, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40.
53. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая капсид по любому из пп. 21- 52, который используется для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
54. Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа по любому из пп. 1-13 или капсид по любому из пп. 21-52, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
55. Вектор на основе rAAV5 по и. 54, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
56. Фармацевтическая композиция для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, содержащая:
68 a) вектор на основе rAAV5 по любому из пп. 54-55; и b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
57. Способ доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту вектора на основе rAAV5 по любому из пп. 54-55 или фармацевтической композиции по и. 56.
58. Применение вектора на основе rAAV5 по любому из пп. 54-55 или фармацевтической композиции по и. 56 для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
59. Применение по и. 58, где заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
60. Способ получения вектора на основе rAAV5 по любому из пп. 54-55, который включает трансфекцию клеток-продуцентов нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, по любому из пп. 14-20 или нуклеиновой кислотой, кодирующей капсид, по и. 53.
PCT/RU2022/050257 2021-08-20 2022-08-21 Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 WO2023022633A1 (ru)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MA64619A MA64619A1 (fr) 2021-08-20 2022-08-21 Protéine modifiée séparée vp1 de capside aav5
IL310961A IL310961A (en) 2021-08-20 2022-08-21 Isolated modified capsid protein VP1 from adeno-associated virus serotype 5 (AAV5), capsid and vector based thereon
AU2022329630A AU2022329630A1 (en) 2021-08-20 2022-08-21 Isolated modified aav5 capsid protein vp1
MX2024002199A MX2024002199A (es) 2021-08-20 2022-08-21 Proteina vp1 modificada y aislada de la capside del virus adenoasociado del serotipo 5 (aav5), capside y vector basados en esta.
EP22858843.0A EP4389759A1 (en) 2021-08-20 2022-08-21 Isolated modified aav5 capsid protein vp1
CR20240088A CR20240088A (es) 2021-08-20 2022-08-21 Proteína VP1 modificada y aislada de la cápside del virus adenoasociado del serotipo 5 (AAV5), cápside y vector basados en esta
CA3229587A CA3229587A1 (en) 2021-08-20 2022-08-21 Isolated modified capsid protein vp1 from adeno-associated virus serotype 5 (aav5), capsid and vector based thereon
PE2024000276A PE20241345A1 (es) 2021-08-20 2022-08-21 Proteina vp1 modificada y aislada de la capside del virus adenoasociado del serotipo 5 (aav5), capside y vector basados en esta
CN202280056600.2A CN117881689A (zh) 2021-08-20 2022-08-21 分离的修饰的aav5衣壳蛋白vp1
US18/684,921 US20250127923A1 (en) 2021-08-20 2022-08-21 Isolated modified capsid protein VP1 from adeno-associated virus serotype 5 (AAV5), capsid and vector based thereon
CONC2024/0001681A CO2024001681A2 (es) 2021-08-20 2024-02-16 Proteína vp1 modificada y aislada de la cápside del virus adenoasociado del serotipo 5 (aav5), cápside y vector basados en esta

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021124727 2021-08-20
RU2021124727A RU2820088C1 (ru) 2021-08-20 Выделенный модифицированный белок VPI капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023022633A1 true WO2023022633A1 (ru) 2023-02-23

Family

ID=85240919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/050257 WO2023022633A1 (ru) 2021-08-20 2022-08-21 Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20250127923A1 (ru)
EP (1) EP4389759A1 (ru)
CN (1) CN117881689A (ru)
AR (1) AR126840A1 (ru)
AU (1) AU2022329630A1 (ru)
CA (1) CA3229587A1 (ru)
CL (1) CL2024000503A1 (ru)
CO (1) CO2024001681A2 (ru)
CR (1) CR20240088A (ru)
EC (1) ECSP24013075A (ru)
IL (1) IL310961A (ru)
MA (1) MA64619A1 (ru)
MX (1) MX2024002199A (ru)
PE (1) PE20241345A1 (ru)
TW (1) TW202315947A (ru)
WO (1) WO2023022633A1 (ru)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0173177A1 (de) 1984-08-24 1986-03-05 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Enhancer für eukaryotische Expressionssysteme
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
US20070238684A1 (en) * 1998-06-19 2007-10-11 Medigene Aktiengesellschaft AAV scleroprotein, production and use thereof
WO2012145601A2 (en) 2011-04-22 2012-10-26 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2013158879A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 The Children's Hospital Of Philadelphia Composition and methods for highly efficient gene transfer using aav capsid variants
US20150023924A1 (en) * 2013-07-22 2015-01-22 The Children's Hospital Of Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
US20160201088A1 (en) * 2001-12-17 2016-07-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences, vectors containing same, and uses therefor
RU2019126509A (ru) 2019-08-22 2021-06-04 Общество С Ограниченной Ответственностью "Анабион" Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0173177A1 (de) 1984-08-24 1986-03-05 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Enhancer für eukaryotische Expressionssysteme
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
US20070238684A1 (en) * 1998-06-19 2007-10-11 Medigene Aktiengesellschaft AAV scleroprotein, production and use thereof
US20160201088A1 (en) * 2001-12-17 2016-07-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences, vectors containing same, and uses therefor
WO2012145601A2 (en) 2011-04-22 2012-10-26 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2013158879A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 The Children's Hospital Of Philadelphia Composition and methods for highly efficient gene transfer using aav capsid variants
US20150023924A1 (en) * 2013-07-22 2015-01-22 The Children's Hospital Of Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
RU2019126509A (ru) 2019-08-22 2021-06-04 Общество С Ограниченной Ответственностью "Анабион" Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice Mariacarmela Allocca", J CLIN INVEST., vol. 118, no. 5, 1 May 2008 (2008-05-01), pages 1955 - 1964
GOVINDASAMY L.: "Structural insights into adeno-associated virus serotype 5", J VIROL., vol. 87, no. 20, October 2013 (2013-10-01), pages 11187 - 99, XP055865805, DOI: 10.1128/JVI.00867-13
HIGH KA ET AL.: "rAAV human trial experience", METHODS MOL BIOL., vol. 807, 2011, pages 429 - 57
KENNETH I. BERNS: "Fields Virology", 1996, article "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication"
MICHAEL F. NASO, BRIAN TOMKOWICZ, WILLIAM L. PERRY, WILLIAM R. STROHL: "Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy", BIODRUGS, ADIS INTERNATIONAL LTD., NZ, vol. 31, no. 4, 1 August 2017 (2017-08-01), NZ , pages 317 - 334, XP055547503, ISSN: 1173-8804, DOI: 10.1007/s40259-017-0234-5 *
MICHAEL SCHMIDT ET AL.: "Adeno-associated virus type 12 (AAV12): a novel AAV serotype with sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity", J VIROL., vol. 82, no. 3, February 2008 (2008-02-01), pages 1399 - 406
MORI, S. ET AL.: "Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein", VIROLOGY, T., vol. 330, no. 2, 2004, pages 375 - 83, XP004676906, DOI: 10.1016/j.virol.2004.10.012
OGDEN PJKELSIC EDSINAI SCHURCH GM: "Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design", SCIENCE, vol. 366, no. 6469, 2019, pages 1139 - 1143, XP093141725, DOI: 10.1126/science.aaw2900
SAMBROOK, J. ET AL.: "Molecular cloning: A laboratory manual", 2012, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SONNTAG FKOTHER KSCHMIDT K ET AL.: "The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes", J VIROL., vol. 85, no. 23, 2011, pages 12686 - 12697, XP055187887, DOI: 10.1128/JVI.05359-11
XIE Q. ET AL.: "The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 99, 2002, pages 10405 - 10410, XP002255705, DOI: 10.1073/pnas.162250899

Also Published As

Publication number Publication date
CR20240088A (es) 2024-07-29
TW202315947A (zh) 2023-04-16
AR126840A1 (es) 2023-11-22
US20250127923A1 (en) 2025-04-24
IL310961A (en) 2024-04-01
CN117881689A (zh) 2024-04-12
MX2024002199A (es) 2024-04-29
CA3229587A1 (en) 2023-02-23
MA64619A1 (fr) 2024-04-30
EP4389759A1 (en) 2024-06-26
AU2022329630A1 (en) 2024-04-04
PE20241345A1 (es) 2024-07-03
ECSP24013075A (es) 2024-03-01
CO2024001681A2 (es) 2024-06-27
CL2024000503A1 (es) 2024-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10723768B2 (en) Capsid modified rAAV vectors and methods of use
RU2751592C2 (ru) Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе
CA3187635A1 (en) Method for engineering novel hybrid aav capsids through hypervariable regions swapping
EP3218475A2 (en) Factor ix gene therapy
AU2022213262A1 (en) Synergistic effect of smn1 and mir-23a in treating spinal muscular atrophy
WO2021246909A1 (ru) Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая белок smn1
RU2820088C1 (ru) Выделенный модифицированный белок VPI капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе
RU2825667C2 (ru) Выделенный модифицированный белок VPI капсида аденоассоциированного вируса 9 серотипа (AAV9), капсид и вектор на его основе
US20250127923A1 (en) Isolated modified capsid protein VP1 from adeno-associated virus serotype 5 (AAV5), capsid and vector based thereon
EP4389760A1 (en) Isolated modified aav9 capsid protein vp1
EA048149B1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (aav5), капсид и вектор на его основе
EA048714B1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида аденоассоциированного вируса 9 серотипа (aav9), капсид и вектор на его основе
EA045824B1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5
HK40075924A (en) Isolated modified vp1 capsid protein of aav5
OA21075A (en) Codon-optimized nucleic acid that encodes SMN1 protein, and use thereof
CN116179605A (zh) 一种重组腺相关病毒载体及其应用
EA045749B1 (ru) Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая белок smn1, и ее применение

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22858843

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2401000985

Country of ref document: TH

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: NC2024/0001681

Country of ref document: CO

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12024550452

Country of ref document: PH

Ref document number: 202280056600.2

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 000276-2024

Country of ref document: PE

Ref document number: 310961

Country of ref document: IL

Ref document number: 3229587

Country of ref document: CA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112024003220

Country of ref document: BR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: DZP2024000147

Country of ref document: DZ

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202417016562

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202490528

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022858843

Country of ref document: EP

Ref document number: 2022329630

Country of ref document: AU

Ref document number: 809352

Country of ref document: NZ

Ref document number: AU2022329630

Country of ref document: AU

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022329630

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20220821

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022858843

Country of ref document: EP

Effective date: 20240320

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11202401105V

Country of ref document: SG

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112024003220

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20240219

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: NC2024/0001681

Country of ref document: CO

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 18684921

Country of ref document: US