CN116554309A - 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明创造提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用，编码所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。本发明通过选取与人源类似且结构简单更易表达的脯氨酸羟化酶与人源Ⅲ型胶原蛋白相连，降低了成本且简单方便生产。本发明通过选取表达良好的人源Ⅲ型胶原蛋白片段，解决了Ⅲ型胶原蛋白不好表达的问题，且选取片段表达成功率高，具有Ⅲ型胶原蛋白的生物学功能。

Description

一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

胶原蛋白是人体和动物中含量非常丰富的细胞外基质蛋白，除了是皮肤骨骼的构成之外，还丰富的存在于结缔组织中。胶原蛋白在体内支撑各种组织的结构完整，维护器官功能，并且对伤口愈合恢复有着显著效果。胶原蛋白中含有多种氨基酸，含有独特的结构和特异的组织分布。这部分结构为三螺旋结构，发挥其生物学功能。III型胶原蛋白是一种右手螺旋成纤维胶原，由三条相同的α1肽链组成，肽链上大量存在着一种重复氨基酸结构（Gly-X-Y）。胶原蛋白在人体内合成需要脯氨酸羟化酶。脯氨酸羟基化酶催化α链上的脯氨酸发生羟基化修饰，从而确保有活性的三螺旋结构形成。

因为胶原蛋白有助于细胞的生长和机体的止血，促进伤口愈合。不仅在食品工程上，在美容和医疗等领域均有广泛应用。胶原蛋白作为生物材料同时还具有低免疫原性，几乎不具有抗原性；细胞和组织之间起着很好的相互作用，成膜保护伤口。

现在主要使用的胶原蛋白一般从动物的皮肤肌腱等地方中提取（主要为皮胶原）。这些过程有很多难以克服的缺点：具有病毒和抗原性，容易导致免疫排斥反应；提取方法复杂且污染严重；而且原材料获取困难且难以长时间储存，制造成本高难以大规模量产。

重组人胶原蛋白基于人类胶原蛋白的主要功能序列，通过基因工程重组 DNA，设计和编码该基因序列和分泌序列进入工程菌内。在不改变胶原蛋白的功能特性下，克服了动物源胶原蛋白的大多数缺点。利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)为工程菌的外源蛋白表达系统，成本低易于培养且表达量高。只额外引入脯氨酸羟化酶的基因，即可构建出可以表达人源胶原蛋白的工程菌。而且毕赤酵母作为真核表达系统可以对外源蛋白进行修饰，同时去除了细菌内毒素的问题。

重组人胶原蛋白的工程菌表达量高安全性高，且不含有任何伦理问题，可以解决上述问题。

发明内容

有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

本发明的第一方面，提供了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白，编码所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明的第二方面，提供了一种包含如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的重组表达载体。

优选地，所述重组表达载体由如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列插入空载体后得到，所述空载体为p PICZα A质粒。

本发明的第三方面，提供了一种包含上述重组表达载体的重组宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为GS115毕赤酵母菌。

本发明的第四方面，提供了一种上述重组人源Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

S1、构建含有小球菌病毒脯氨酸羟化酶和人源Ⅲ型胶原alpha 1链片段的重组表达载体；

S2、将上述的重组表达载体转化至毕赤酵母菌中获得重组毕赤酵母；

S3、从菌株中筛选出含有目的基因的重组毕赤酵母菌株；

S4、对所述重组毕赤酵母菌株进行诱导表达，得到重组人源Ⅲ型胶原蛋白。

优选地，所述步骤S1中通过将小球菌病毒脯氨酸羟化酶和人源Ⅲ型胶原alpha 1链片段用2A自剪肽连接在pPICZαA质粒上得到重组表达载体。

优选地，所述步骤S1具体包括如下步骤：

S11、合成含小球菌病毒脯氨酸羟化酶的DNA片段序列；

S12、设计引物，对步骤S11得到的DNA片段序列进行扩增，得到两端含有酶切位点和2A自剪肽前半部分序列的扩增片段；

S13、合成人源Ⅲ型胶原alpha 1链和his标签的DNA片段序列；

S14、设计引物，对步骤S13中的DNA片段序列进行扩增，得到两端有酶切位点和2A自剪肽后半部分序列的扩增片段；

S15、进行Touch down两步重叠PCR，获取目的基因序列；

S16、使用限制性内切酶对步骤S12和步骤S14获得扩增片段和pPICZαA质粒进行酶切；

S17、使用连接酶对步骤S12和步骤S14获得扩增片段和所述pPICZαA质粒进行连接，过夜培养，得到含有脯氨酸羟化酶和人源Ⅲ型胶原蛋白基因的重组表达载体。

优选地，步骤S2的具体步骤包括：

制作感受态GS115毕赤酵母，使用SalI限制性内切酶将含有含有脯氨酸羟化酶和人源Ⅲ型胶原蛋白基因的质粒进行线性化，然后电击转化至GS115毕赤酵母菌即得重组毕赤酵母。

本发明的第五方面，提供了一种制品，包含上述重组人源Ⅲ型胶原蛋白、上述方法制备的重组人源Ⅲ型胶原蛋白，所述制品包括但不局限于药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品或化妆品。

Ⅲ型胶原蛋白由三条相同的α1肽链组成三螺旋结构。而确保其能形成有活性的三螺旋结构，需要α链上的脯氨酸发生羟基化修饰。这一过程需要脯氨酸羟基化酶催化完成。毕赤酵母细胞不表达此种羟化酶，所以需要额外引入此种酶的基因。小球藻病毒1（PBCV-1）的脯氨酸羟基化酶基因与人源脯氨酸羟基化酶基因类似，且易于表达。本实验选取将脯氨酸羟化酶与人源重组Ⅲ型胶原蛋白用2A自剪肽连接，使两种蛋白表达后自行断开。

相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：

（1）本发明重组人源Ⅲ型胶原蛋白将小球菌病毒脯氨酸羟化酶和人源Ⅲ型胶原alpha 1链片段用2A自剪肽连接在表达载体pPICZαA质粒上后进行表达得到。此种方法简易且后续生产成本低，2A自剪肽在翻译后自动将两种蛋白分离。

（2）本发明所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白的制备方法简易且后续生产简单成本低，质粒可通过大肠杆菌批量克隆，获取途径简单。重组蛋白为胞外分泌，方便收集和纯化。所得重组蛋白可发挥其作为Ⅲ型胶原蛋白的生物学功能。

附图说明

图1是实施例的用于表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白的重组质粒的构建示意图；

图2是实施例的扩增片段的DNA凝胶电泳图；

图3是实施例重组蛋白的WB结果图；

图4为实施例所述的重组蛋白的溶液。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例

本发明中使用的2A自剪肽平均长度为18-22个氨基酸，前后两组蛋白会在2A自剪肽C端的甘氨酸-脯氨酸残基处分离。导致前一个蛋白的尾部留下20个左右氨基酸残基的多肽，后一个蛋白的N端留下一个多余的脯氨酸。用SOE-PCR将三者相连。本实施例选取P2A，当然也可以选择使用T2A、E2A或F2A，前面的GSG 是为了提高切割效率而增加的序列，P2A的序列如下：

氨基酸序列：（GSG）ATNFSLLKQAGDVEENPGP（SEQ ID NO:1）。

基因序列：GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCC（SEQID NO:2）。

1、引物设计

设计小球菌病毒脯氨酸羟化酶的引物HU和HD，HU前连接酶切位点，HD前连接2A剪切肽的前半部分。进行SOE-PCR，得到产物HA。

设计胶原蛋白的引物CU和CD，CU前连接2A剪切肽的后半部分，CD前连接his纯化标签和酶切位点。进行SOE-PCR,得到产物CA。

反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃5 min，对所得产物进行电泳检测及产物纯化。

引物序列：

CU：GAAGAAAACCCCGGGCCGGTAACACTGGTGCTCCTGGCAGCC（SEQ ID NO:3）；

CD：TCTAGATAAAAAGCAAACAGGGCCA（SEQ ID NO:4）；

HU：GAATTCCGGCGAGAGGGGTTTGAA（SEQ ID NO:5）；

HD：AACAGAGAGAAGTTCGTGGCTTTAACAGCACGGATCCATTG（SEQ ID NO:6）；

进行Touch down两步重叠PCR，反应体系为：2x Phanta Max Master Mix 12.5 μL，引物CU 2 μL，引物 HD 2 μL，DA 1 μL，CA 1 μL。

反应条件：95 ℃ 3 min；92 ℃ 15 s，74 ℃ 150 s，5 个循环；95 ℃ 15 s，72 ℃150 s，5 个循环；95 ℃ 15 s，70 ℃ 150 s，5 个循环；95 ℃ 15 s，68 ℃ 150 s，25 个循环；68 ℃ 5 min。

将所得产物进行电泳检测，结果如图2所示，确定正确的目的条带后，将其切胶回收。

用限制性内切酶对密码子优化后的重组基因(SEQ ID NO:1所示)和质粒pPICZα A进行酶切，然后将两个片段用T4连接酶连接。

密码子优化后重组基因序列：

AGAAGAGAAGGTTTTGAAACTTCTGATAGACCTGGTGTTTGTGATGGTAAATACTACGAAAAAATCGATGGTTTTCTGTCTGATATTGAATGTGATGTTTTGATTAACGCTGCTATTAAGAAAGGTTTGATTAAGTCTGAAGTCGGTGGTGCTACTGAAAATGATCCTATTAAGTTGGATCCTAAGTCTCGTAACTCTGAACAAACTTGGTTCATGCCTGGTGAACATGAAGTTATTGATAAGATTCAAAAGAAGACCAGAGAATTTTTGAACTCTAAAAAGCATTGCATCGATAAGTACAACTTTGAAGATGTTCAAGTTGCTAGATACAAGCCAGGTCAATACTATTACCATCATTACGATGGTGACGATTGTGATGATGCTTGTCCTAAAGATCAAAGATTGGCTACTTTGATGGTTTACTTGAAAGCTCCTGAAGAAGGTGGTGGTGGTGAAACTGATTTTCCAACTTTGAAGACTAAGATTAAGCCTAAGAAAGGTACTTCTATTTTCTTCTGGGTTGCTGATCCAGTTACTAGAAAATTGTATAAGGAAACTCTGCATGCTGGTTTGCCTGTTAAATCTGGTGAAAAGATTATTGCTAACCAATGGATTAGAGCTGTTAAAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCGCGGGTAACACTGGTGCTCCTGGCAGCCCTGGAGTGTCTGGACCAAAAGGTGATGCTGGCCAACCAGGAGAGAAGGGATCGCCTGGTGCCCAGGGCCCACCAGGAGCTCCAGGCCCACTTGGGATTGCTGGGATCACTGGAGCACGGGGTCTTGCAGGACCACCAGGCATGCCAGGTCCTAGGGGAAGCCCTGGCCCTCAGGGTGTCAAGGGTGAAAGTGGGAAACCAGGAGCTAACGGTCTCAGTGGAGAACGTGGTCCCCCTGGACCCCAGGGTCTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCTGGTGAACCTGGAAGAGATGGAAACCCTGGATCAGATGGTCTTCCAGGCCGAGATGGATCTCCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAAATGGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGTCATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGTGGCCCTGCTGGCCCTGCTGGTGCTCCCGGTCCTGCTGGTTCCCGAGGTGCTCCTGGTCCTCAAGGCCCACGTGGTGACAAAGGTGAAACAGGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAAAGGACATCGAGGATTCCCTGGTAATCCAGGTGCCCCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAGGGTGCAATCGGCAGTCCAGGACCTGCAGGCCCCAGAGGACCTGTTGGACCCAGTGGACCTCCTGGCAAAGATGGAACCAGTGGACATCCAGGTCCCATTGGACCACCAGGGCCTCGAGGTAACAGAGGTGAAAGAGGATCTGAGGGCTCCCCAGGCCACCCAGGGCAACCAGGCCCTCCTGGACCTCCTGGTGCCCCTGGTCCTTGCTGTGGTGGTGTTGGAGCCGCTGCCATTGCTGGGATTGGAGGTGAAAAAGCTGGCGGTTTTGCCCCGTATTATGGAGATGAACCAATGGATTTCAAAATCAACACCGATGAGATTATGACTTCACTCAAGTCTGTTAATGGACAAATAGAAAGCCTCATTAGTCCTGATGGTTCTCGTAAAAACCCCGCTAGAAACTGCAGAGACCTGAAATTCTGCCATCCTGAACTCAAGAGTGGAGAATACTGGGTTGACCCTAACCAAGGATGCAAATTGGATGCTATCAAGGTATTCTGTAATATGGAAACTGGGGAAACATGCATAAGTGCCAATCCTTTGAATGTTCCACGGAAACACTGGTGGACAGATTCTAGTGCTGAGAAGAAACACGTTTGGTTTGGAGAGTCCATGGATGGTGGTTTTCAGTTTAGCTACGGCAATCCTGAACTTCCTGAAGATGTCCTTGATGTGCATCTGGCATTCCTTCGACTTCTCTCCAGCCGAGCTTCCCAGAACATCACATATCACTGCAAAAATAGCATTGCATACATGGATCAGGCCAGTGGAAATGTAAAGAAGGCCCTGAAGCTGATGGGGTCAAATGAAGGTGAATTCAAGGCTGAAGGAAATAGCAAATTCACCTACACAGTTCTGGAGGATGGTTGCACGAAACACACTGGGGAATGGAGCAAAACAGTCTTTGAATATCGAACACGCAAGGCTGTGAGACTACCTATTGTAGATATTGCACCCTATGACATTGGTGGTCCTGATCAAGAATTTGGTGTGGACGTTGGCCCTGTTTGCTTTTTA（SEQ ID NO:7）。

2、转菌

制作感受态毕赤酵母。取100μL的酵母菌液，加入YPD液体培养基过夜培养，培养到OD值在1.3-1.5之间。两次离心弃上清用无菌水重悬后两次离心弃上清用冰浴1M的山梨醇重悬。

验证后使用SalI限制性内切酶将含有目的基因的质粒进行线性化，然后电击转化至酵母菌，电压1700V、时间8mS、电击2次。做阳性克隆子筛选，30°C培养3天。将不同量的混合液涂布于100ug/ml Zeocin抗生素YPD平板上，30度，48h，待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有10ml YPD液体培养基试管中(抗生素Zeocin浓度100ug/ml)，30度，180rpm过夜培养。

3、小试培养

取阳性的菌株（10棵菌株）进行小试培养，先分别接入装有10ml YPD的试管中，24h后取500uL接入到50ml YPD液体培养基中。Zeocin 浓度200ug/mL,30°C。48h从培养基中取样，离心收集上清液。对上清使用对应试剂检测，携带6×His标签蛋白，选择对应的anti-his抗体的Dot-Bot。结果分析，选出阳性信号最强的菌株，使用此菌株放大培养。

4、发酵纯化

进行1L摇瓶诱导表达，接种至含有博来霉素的BMGY液体培养基中，震荡培养24小时，之后加入含有1％甲醇的BMMY液体培养基中进行72小时的诱导表达。收集上清。

His-tag标签融合蛋白选取Ni柱亲和纯化，选取低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min流速上样至结合缓冲液（50 mM NaH2PO4，10 mM咪唑，0.3 M NaCl，pH8.0）预平衡的Ni-IDA -Besds 6FF亲和层析柱。随后用结合缓冲液以0.5 mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。然后用冲洗缓冲液（50 mM NaH2PO4，20 mM咪唑，0.3 M NaCl，pH8.0）以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。最后用洗脱缓冲液（50 mM NaH2PO4，250 mM咪唑，0.3 M NaCl，pH8.0）以1 mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。将收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用结合缓冲液进行透析过夜。回收率大于70%，纯度大于95%，水溶性良好，如图4所示。将透析得到的胶原蛋白进行冻干（-80°C，24h），得到胶原蛋白粉末。

5. 验证

5.1． SDS-PAGE电泳：目的蛋白的分子量

选取10%的SDS 聚丙烯酰胺凝胶，三组10μl重组蛋白溶液上样后开始电泳，浓缩胶100V，15-20min，分离胶200V，50-50min。

5.2免疫印迹：验证重组蛋白为Ⅲ型胶原蛋白。

取电泳后凝胶转至提前浸泡过的硝酸纤维素膜，加冰块60V2h，转膜后染色备用。放入TBS封闭1h。PBST稀释过的一抗，室温下孵育1.5h后，PBST洗4次，每次10 min。二抗同步骤后进行显色处理。当能够清晰的看到显色带时，用蒸馏水清洗3次，每次10min。结果如图3所示，可在约55KDA看到明显条带。

5.3. 包被细胞培养板：蛋白生物学功能和细胞毒性。

接种人皮肤成纤维细胞，37°C培养3至7天，采用无重组蛋白包被的细胞板作为对照。观察并用CCK8试剂盒和酶标仪测其在450n m处光吸收值计算增殖率。

将实验组的吸收值/对照组的吸收值后×100%，结果见下表，可以看出添加不同浓度重组胶原蛋白的实验组的细胞增殖率均大于100%，证明细胞毒性为0，且可以促进皮肤细胞增殖。

表1 不同浓度组的光吸收值和细胞增殖率

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白，其特征在于：编码所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.一种包含如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由如SEQ IDNO:7所示核苷酸序列插入空载体后得到，所述空载体为p PICZα A质粒。

4.一种包含权利要求2或3所述的重组表达载体的重组宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为GS115毕赤酵母菌。

6.一种权利要求1所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、构建含有小球菌病毒脯氨酸羟化酶和人源Ⅲ型胶原alpha 1链片段的重组表达载体；

S2、将上述的重组表达载体转化至毕赤酵母菌中获得重组毕赤酵母；

S3、从菌株中筛选出含有目的基因的重组毕赤酵母菌株；

S4、对所述重组毕赤酵母菌株进行诱导表达，得到重组人源Ⅲ型胶原蛋白。

7.根据权利要求6所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中通过将小球菌病毒脯氨酸羟化酶和人源Ⅲ型胶原alpha 1链片段用2A自剪肽连接在pPICZα A质粒上得到重组表达载体。

8.根据权利要求6所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括如下步骤：

S11、合成含小球菌病毒脯氨酸羟化酶的DNA片段序列；

S12、设计引物，对步骤S11得到的DNA片段序列进行扩增，得到两端含有酶切位点和2A自剪肽前半部分的扩增片段；

S13、合成人源Ⅲ型胶原alpha 1链和his标签的DNA片段序列；

S14、设计引物，对步骤S13中的DNA片段序列进行扩增，得到两端有酶切位点和2A自剪肽后半部分的扩增片段；

S15、进行Touch down两步重叠PCR，获取目的基因序列；

S16、使用限制性内切酶对步骤S12和步骤S14获得扩增片段和pPICZαA质粒进行酶切；

S17、使用连接酶对步骤S12和步骤S14获得扩增片段和所述pPICZαA质粒进行连接，过夜培养，得到含有脯氨酸羟化酶和人源Ⅲ型胶原蛋白基因的重组表达载体。

9.根据权利要求6所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤S2的具体步骤包括：

制作感受态GS115毕赤酵母，使用SalI限制性内切酶将含有脯氨酸羟化酶和人源Ⅲ型胶原蛋白基因的质粒进行线性化，然后电击转化至GS115毕赤酵母菌即得重组毕赤酵母。

10.一种制品，其特征在于：所述制品包含权利要求1所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白或权利要求6-9任一项所述方法制备的重组人源Ⅲ型胶原蛋白，所述制品包括但不局限于药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品或化妆品。