[go: up one dir, main page]

CN118834284A - 一种重组iii型人源胶原蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

一种重组iii型人源胶原蛋白及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN118834284A
CN118834284A CN202410816522.2A CN202410816522A CN118834284A CN 118834284 A CN118834284 A CN 118834284A CN 202410816522 A CN202410816522 A CN 202410816522A CN 118834284 A CN118834284 A CN 118834284A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
collagen
type iii
col3a1
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410816522.2A
Other languages
English (en)
Inventor
张沛沛
张继业
马骁
杨晨
雷佳星
张启玥
王飞飞
曲丽萍
袁永雷
郭振宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Yunke Characteristic Plant Extraction Laboratory Co ltd
Yunnan Beitani Biotechnology Group Co ltd
Original Assignee
Yunnan Yunke Characteristic Plant Extraction Laboratory Co ltd
Yunnan Beitani Biotechnology Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Yunke Characteristic Plant Extraction Laboratory Co ltd, Yunnan Beitani Biotechnology Group Co ltd filed Critical Yunnan Yunke Characteristic Plant Extraction Laboratory Co ltd
Priority to CN202410816522.2A priority Critical patent/CN118834284A/zh
Publication of CN118834284A publication Critical patent/CN118834284A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有促伤口愈合功能的重组III型人源胶原蛋白，包含SEQ IDNo.1所示的序列，该序列包含形成α螺旋折叠结构的基序、促进胶原单链见相互作用形成三螺旋结构的半胱氨酸富集基序以及能够和人血小板相互作用的基序。此外，提供了一种能够实现重组III型胶原蛋白自组装为三螺旋活性结构的制备方法。具体包括，分别构建含有人脯氨酸4‑羟化酶α亚基P4HA1和SEQ ID No.1所示序列的COL3A1的基因克隆，使酵母中产生能够特异性羟基化COL3A1中脯氨酸残疾的活性酶，促进COL3A1翻译后修饰和三螺旋结构的自组装。本发明提供的重组III型人源胶原蛋白具备空间结构稳定性，且水溶性良好，能够促进细胞的增殖和迁移，特别地，促进伤口愈合并有效阻止伤口愈合过程中疤痕的形成。

Description

一种重组III型人源胶原蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种具有促伤口愈合功能的重组III型人源胶原蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
胶原蛋白一般为白色、透明、无分支的原纤维，是皮肤和骨骼的基础支撑物，其是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，是细胞外基质的重要组成成分。人体中胶原蛋白含量占总蛋白的25％～30％，是一种重要的结构蛋白，起着保护机体、支撑器官的重要作用。胶原蛋白种类较多，常见类型为I型、II型、III型、V型和XI型。其中，III型胶原蛋白(COL3A1)是中空器官，如大血管、子宫和肠的主要结构成分，也是正常皮肤组织中的撑起表皮的关键。此外，COL3A1也能促进表皮细胞正常生长，具有独特的自动修复功能，引导上皮细胞迁入缺损区，刺激细胞分裂，其降解产物能被新生细胞利用合成新的胶原，填充在新生细胞之间的胶原能减少生长细胞的接触性抑制，促进皮肤及神经增长，并在细胞迁移时起支持和润滑作用，且COL3A1在凝血级联中与血小板相互作用，局部加强了血小板的黏附与聚集，进而启动了内源性的凝血途径。因此，COL3A1是创伤愈合和组织重建过程中的重要信号分子。
COL3A1的生物活性形式是同三聚体，由三个相同的肽链组成的三螺旋结构的蛋白质，每个肽链称为COL3A1的α1链具有α螺旋折叠。实际上，COL3A1是一种细胞外基质蛋白，由细胞合成为前胶原蛋白，然后再经过多次翻译后修饰，包括：三螺旋结构域中145个脯氨酸被脯氨酸-4-羟化酶羟基化为4-羟基脯氨酸；部分赖氨酸残基被羟基化或糖基化；还有部分赖氨酸和羟基赖氨酸残基在赖氨酸氧化酶的催化下发生氧化脱胺反应；随后，在组织的胞外区域COL3A1单体聚集成大分子胶原纤维，此时再次进行翻译后修饰，即分子两端的大球状结构域被C-和N-端蛋白酶去除，生成三螺旋型COL3A1。这些胶原纤维聚集成纤维，为需要抗拉强度的组织提供强大的支撑结构，促进伤口愈合和组织再生。
目前胶原蛋白主要有动物组织提取以及基因工程方法制备两种途径来源。天然提取的胶原蛋白是多种不同分子量胶原蛋白组成的混合物，纯度较低且不溶于水，生物相容性较差。并且由于来源于动物组织，对于动物源疾病或者人传染疾病有交叉感染的风险。因此，动物组织提取方法极大限制了胶原在化妆品、食品、药品等各类产品中的广泛应用；并且加工提取时需要使用酸、碱或酶来处理，会产生巨量废水，严重伤害环境。通过基因工程方法制备的胶原蛋白，可以解决传统方式提取的胶原蛋白带来的疾病感染风险，并且通过对胶原蛋白氨基酸序列的优化，使制备的胶原蛋白同时兼具良好的组织相容性、安全性、高活性和稳定性。但重组的全长COL3A1蛋白的生产一直受到胶原生物合成所需的大量翻译后修饰的阻碍。
目前为止文献报道使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中获得的三螺旋结构的全长COL3A1。但杆状病毒表达系统获得的COL3A1单体不能在37℃下形成稳定的三螺旋结构。这是由于要形成稳定的三螺旋结构的胶原分子需要脯氨酸4-羟化酶在形成胶原纤维的胶原中羟基化每个α链上约100个脯氨酸残基，而昆虫细胞中没有足够的脯氨酸4-羟化酶。基于脯氨酰4-羟化酶在稳定胶原结构中的重要作用，研究人员利用三种杆状病毒共感染昆虫细胞，其中一种杆状病毒编码重组胶原多肽链，另两种分别编码脯氨酸4-羟化酶α和β亚基。感染了这三种杆状病毒的昆虫细胞成功表达了具有稳定三螺旋结构的胶原，且蛋白酶消化的胶原蛋白在胰蛋白酶-凝乳胰蛋白酶实验中具有41℃的热稳定性，与天然COL3A1的结果相当。但该方法表达的COL3A1产量低，仅为0.1mg/ml，且细胞培养成本高，不适合工业化生产。在众多重组蛋白表达系统中，毕赤酵母表达系统不仅能够实现蛋白翻译后修饰，以促进胶原单体自组装生成三螺旋III型胶原，并且酵母发酵细胞密度高，发酵成本低，能够实现COL3A1的高产量生产。但酵母中不含有脯氨酸4-羟化酶，致使酵母重组表达的全长COL3A1的热稳定性低，容易发生降解和聚集。研究人员又尝试在毕赤酵母中共表达人脯氨酸4-羟化酶α亚基和β亚基。实验证明人脯氨酸4-羟化酶α亚基和β亚基在毕赤酵母中的共表达可产生完全活性的重组酶四聚体，并且重组酶不仅在毕赤酵母提取物中有活性，在酵母细胞内也有活性。随后研究人员又在毕赤酵母中共表达了全长COL3A1和人脯氨酸4-羟化酶α亚基和β亚基，虽成功获得了具有活性的三螺旋结构的COL3A1，但产量(0.015mg/ml)远低于昆虫细胞获得的COL3A1。但值得注意的是，在这项研究中发现，COL3A1的表达促进了人脯氨酸4-羟化酶α亚基和β亚基组装成活性的酶四聚体。
这些结果提示，利用毕赤酵母表达COL3A1时，需要选择合适的胶原结构域，并对选择的胶原结构域的氨基酸序列进行合理的优化，以便能够提高胶原蛋白的制备效率。此外，开发能够促进蛋白正确折叠的重组表达制备方法，以确保制备的COL3A1具有正确的空间结构也是获得稳定且高活性COL3A1的重要策略。。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中异源胶原蛋白生物相容性差以及容易携带病原，通过基因工程手段制备稳定的且具备空间三螺旋结构的原始基因序列COL3A1难度大的问题，提供一种重组III型人源胶原蛋白，空间结构稳定性，且水溶性良好，能够促进细胞的增殖和迁移，特别地，促进伤口愈合并有效阻止伤口愈合过程中疤痕的形成。
本发明的另外一个目的是提供一种重组III型人源胶原蛋白的制备方法和用途，通过真核工程菌制备，能够实现重组III型胶原蛋白自组装为三螺旋活性结构，制备方法简单，在低成本下即可获得较高产量的胶原蛋白。
实现上述目的一种技术方案是：一种重组III型人源胶原蛋白，外源表达具有稳定的三螺旋结构且有效促进伤口愈合功能，所述重组COL3A1包含以SEQ ID No.1序列，其序列特征：
(1)为人源原始序列的COL3A1序列的991-1394(COL3A1991-1394)，包含404个氨基酸，分子量为40.2kDa；
(2)该序列能够与人血小板相互作用，局部加强了血小板的黏附与聚集，进而启动了内源性的凝血途径；
(3)该序列中COL3A1991-1196具有α螺旋折叠，是自组装为三螺旋结构的基础；
(4)该序列中COL3A11197-1394含有7个半胱氨酸，通过在三条肽链间形成二硫键促进三螺旋结构的形成。
SEQ ID No.1
虽然毕赤酵母中没有脯氨酸4-羟化酶，但人脯氨酸4-羟化酶的β亚基的序列与人蛋白质二硫键异构酶(hPDI)的序列一致。重要的是毕赤酵母GS115菌株中也有蛋白质二硫键异构酶pPDI，且与hPDI的氨基酸序列不仅具有较高的同源性，而且同是负责分泌蛋白在分子内或分子间形成二硫键从而形成其天然构象的蛋白酶，因此，对于提高毕赤酵母重组COL3A1产量而言，组成四聚体人脯氨酸4-羟化酶的α亚基(P4HA1)是关键，且文献也表明人脯氨酸4-羟化酶α亚基是人脯氨酸4-羟化酶的关键催化活性区域。因此，本发明提供了一种能够在胞内表达分子量为61kDa的重组人脯氨酸4-羟化酶α亚基(P4HA1,SEQ ID No.2)，同时分泌表达上述具有SEQ ID No.1序列的重组COL3A1蛋白的制备方法。本发明的重组COL3A1蛋白制备方法，具有如下特征：
(1)使用毕赤酵母GS115作为工程菌株；
(2)将编码人脯氨酸4-羟基化酶的关键酶活性区域α亚基的DNA序列整合至毕赤酵母基因组中的组成型启动子GAP序列之下，使人脯氨酸4-羟基化酶α亚基随毕赤酵母生长而表达。
(3)将编码SEQ ID No.1的DNA序列整合至毕赤酵母基因组中的诱导型启动子AOX1序列之下，且在AOX1和编码SEQ ID No.1的DNA序列之间插入分泌信号序列(α-factor)，在甲醇诱导下由AOX1启动重组COL3A1蛋白外秘表达。
(4)胞内表达的人脯氨酸4-羟基化酶α亚基促进胞内合成的重组COL3A1蛋白中脯氨酸残基羟基化，使分泌出的重组COL3A1蛋白单体能够自组装成三聚体。
(5)胞内表达人脯氨酸4-羟基化酶α亚基，分泌表达重组COL3A1蛋白的重组蛋白共表达方式，使分泌出的重组COL3A1蛋白纯化过程简单，适合工业生产。
SEQ ID No.2
MIWYILIIGILLPQSLAHPGFFTSIGQMTDLIHTEKDLVTSLKDYIKAEEDKLEQIKKWAEKLDRLTSTATKDPEGFVGHPVNAFKLMKRLNTEWSELENLVLKDMSDGFISNLTIQRQYFPNDEDQVGAAKALLRLQDTYNLDTDTISKGNLPGVKHKSFLTAEDCFELGKVAYTEADYYHTELWMEQALRQLDEGEISTIDKVSVLDYLSYAVYQQGDLDKALLLTKKLLELDPEHQRANGNLKYFEYIMAKEKDVNKSASDDQSDQKTTPKKKGVAVDYLPERQKYEMLCRGEGIKMTPRRQKKLFCRYHDGNRNPKFILAPAKQEDEWDKPRIIRFHDIISDAEIEIVKDLAKPRLRRATISNPITGDLETVHYRISKSAWLSGYENPVVSRINMRIQDLTGLDVSTAEELQVANYGVGGQYEPHFDFARKDEPDAFKELGTGNRIATWLFYMSDVSAGGATVFPEVGASVWPKKGTAVFWYNLFASGEGDYSTRHAACPVLVGNKWVSNKWLHERGQEFRRPCTLSELE
上述重组III型人源胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1，重组表达载体的构建：请参阅图1，构建含有正确连接序列的COL3A1991-13964_pPIC9K和P4HA1_pGAPZ质粒；具体为：
S11，根据GenBank中III型人源胶原蛋白COL3A1基因序列和人脯氨酸4-羟基化酶α亚基基因序列(P4HA1)，合成编码原始III型人源胶原蛋白COL3A1991-1394的基因序列(C端带有终止密码子)(SEQ ID NO.3)和编码人脯氨酸4-羟基化酶α亚基的基因序列P4HA1(SEQ IDNO.4)(C端无终止密码子)。
SEQ ID NO.3(C端带有终止密码子)：
GAACGTGGTCCCCCTGGACCCCAGGGTCTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCTGG
TGAACCTGGAAGAGATGGAAACCCTGGATCAGATGGTCTTCCAGGCCGAGAT
GGATCTCCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAAATGGCTCTCCTGGTGCCCC
TGGCGCTCCTGGTCATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGCTGGAAAGA
GTGGTGACAGAGGAGAAAGTGGCCCTGCTGGCCCTGCTGGTGCTCCCGGTCC
TGCTGGTTCCCGAGGTGCTCCTGGTCCTCAAGGCCCACGTGGTGACAAAGGT
GAAACAGGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAAAGGACATCGAGGATTCCCTG
GTAATCCAGGTGCCCCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAGGGTGCAATC
GGCAGTCCAGGACCTGCAGGCCCCAGAGGACCTGTTGGACCCAGTGGACCTC
CTGGCAAAGATGGAACCAGTGGACATCCAGGTCCCATTGGACCACCAGGGCC
TCGAGGTAACAGAGGTGAAAGAGGATCTGAGGGCTCCCCAGGCCACCCAGGG
CAACCAGGCCCTCCTGGACCTCCTGGTGCCCCTGGTCCTTGCTGTGGTGGTGT
TGGAGCCGCTGCCATTGCTGGGATTGGAGGTGAAAAAGCTGGCGGTTTTGCCC
CGTATTATGGAGATGAACCAATGGATTTCAAAATCAACACCGATGAGATTATGA
CTTCACTCAAGTCTGTTAATGGACAAATAGAAAGCCTCATTAGTCCTGATGGTT
CTCGTAAAAACCCCGCTAGAAACTGCAGAGACCTGAAATTCTGCCATCCTGAA
CTCAAGAGTGGAGAATACTGGGTTGACCCTAACCAAGGATGCAAATTGGATGC
TATCAAGGTATTCTGTAATATGGAAACTGGGGAAACATGCATAAGTGCCAATCC
TTTGAATGTTCCACGGAAACACTGGTGGACAGATTCTAGTGCTGAGAAGAAA
CACGTTTGGTTTGGAGAGTCCATGGATGGTGGTTTTCAGTTTAGCTACGGCAAT
CCTGAACTTCCTGAAGATGTCCTTGATGTGCATCTGGCATTCCTTCGACTTCTC
TCCAGCCGAGCTTCCCAGAACATCACATATCACTGCAAAAATAGCATTGCATAC
ATGGATCAGGCCAGTGGAAATGTAAAGAAGGCCCTGAAGCTGATGGGGTAA
SEQ ID NO.4
ATGATCTGGTATATATTAATTATAGGAATTCTGCTTCCCCAGTCTTTGGCTCATCC
AGGCTTTTTTACTTCAATTGGTCAGATGACTGATTTGATCCATACTGAGAAAGA
TCTGGTGACTTCTCTGAAAGATTATATTAAGGCAGAAGAGGACAAGTTAGAAC
AAATAAAAAAATGGGCAGAGAAGTTAGATCGGCTAACTAGTACAGCGACAAA
AGATCCAGAAGGATTTGTTGGGCATCCAGTAAATGCATTCAAATTAATGAAAC
GTCTGAATACTGAGTGGAGTGAGTTGGAGAATCTGGTCCTTAAGGATATGTCA
GATGGCTTTATCTCTAACCTAACCATTCAGAGACAGTACTTTCCTAATGATGAA
GATCAGGTTGGGGCAGCCAAAGCTCTGTTACGTCTCCAGGATACCTACAATTT
GGATACAGATACCATCTCAAAGGGTAATCTTCCAGGAGTGAAACACAAATCTT
TTCTAACGGCTGAGGACTGCTTTGAGTTGGGCAAAGTGGCCTATACAGAAGCA
GATTATTACCATACGGAACTGTGGATGGAACAAGCCCTAAGGCAACTGGATGA
AGGCGAGATTTCTACCATAGATAAAGTCTCTGTTCTAGATTATTTGAGCTATGCG
GTATATCAGCAGGGAGACCTGGATAAGGCACTTTTGCTCACAAAGAAGCTTCT
TGAACTAGATCCTGAACATCAGAGAGCTAATGGTAACTTAAAATATTTTGAGTA
TATAATGGCTAAAGAAAAAGATGTCAATAAGTCTGCTTCAGATGACCAATCTGA
TCAGAAAACTACACCAAAGAAAAAAGGGGTTGCTGTGGATTACCTGCCAGAG
AGACAGAAGTACGAAATGCTGTGCCGTGGGGAGGGTATCAAAATGACCCCTC
GGAGACAGAAAAAACTCTTTTGCCGCTACCATGATGGAAACCGTAATCCTAAA
TTTATTCTGGCTCCAGCTAAACAGGAGGATGAATGGGACAAGCCTCGTATTATT
CGCTTCCATGATATTATTTCTGATGCAGAAATTGAAATCGTCAAAGACCTAGCA
AAACCAAGGCTGAGCCGAGCTACAGTACATGACCCTGAGACTGGAAAATTGA
CCACAGCACAGTACAGAGTATCTAAGAGTGCCTGGCTCTCTGGCTATGAAAAT
CCTGTGGTGTCTCGAATTAATATGAGAATACAAGATCTAACAGGACTAGATGTT
TCCACAGCAGAGGAATTACAGAAAGATGAGCCAGATGCTTTCAAAGAGCTGG
GGACAGGAAATAGAATTGCTACATGGCTGTTTTATATGAGTGATGTGTCTGCAG
GAGGAGCCACTGTTTTTCCTGAAGTTGGAGCTAGTGTTTGGCCCAAAAAAGG
AACTGCTGTTTTCTGGTATAATCTGTTTGCCAGTGGAGAAGGAGATTATAGTAC
ACGGCATGCAGCCTGTCCAGTGCTAGTTGGCAACAAATGGGTATCCAATAAAT
GGCTCCATGAACGTGGACAAGAATTTCGAAGACCTTGTACGTTGTCAGAATTG
GAA
S12，设计扩增引物，扩增SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。其中，用于扩增SEQ IDNO.3的正向(F)引物融合了pPIC9K质粒中编码α-factor的基因序列3’端19nt同源序列，反向(R)扩增引物融合了pPIC9K质粒中AOX1 terminator序列5’端的18nt同源序列；用于扩增SEQ ID NO.4的正向(F)引物融合了pGAPZ质粒中GAP启动子3’端的15nt用源序列，反向(R)引物融合了pGAPZ质粒中Myc-tag序列5’端的15nt同源序列。
COL3A1991-1394_F:GAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAACGTGGTCCCCCTGG
COL3A1991-1394_R:CAGTCATGTCTAAGGCGAATTACCCCATCAGCTTCAGGGC P4HA1_F:CAATTGAACAACTATATGATCTGGTATATATTAATTATAGGAATTCTGC P4HA1_R:GATGAGTTTTTGTTCTCATTCCAATTCTGACAACGTAC
S13，利用Reverse PCR扩增线性化载体Linearized pPIC9K和Linearized pGAPZ。Linearized pPIC9K_F:TTCGCCTTAGACATGACTGTTCC
Linearized pPIC9K_R:AGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG
Linearized pGAPZ_F:TCAAGAGGATGTCAGAATGCC
Linearized pGAPZ_R:ATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGGGAC
S14，使用Gibson assembly试剂盒将扩增的COL3A1991-1394基因序列与线性载体Linearized pPIC9K质粒混合，将扩增的P4HA1与线性载体Linearized pGAPZ质粒混合，50℃，孵育15min，随后将连接物分别转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养板上筛选含有COL3A1991-13964_pPIC9K质粒的阳性克隆，在含有博莱霉素的LB培养板上筛选含有P4HA1_pGAPZ质粒的阳性克隆。测序确认含有正确连接序列的COL3A1991-13964_pPIC9K和P4HA1_pGAPZ质粒。
S2，毕赤酵母基因重组工程菌的构建：使用限制性内切酶Pme I酶切COL3A1991-1394_pPIC9K质粒，获得线性化COL3A1991-1394_pPIC9K基因表达盒；使用限制性内切酶BsrDI酶切P4HA1_pGAPZ质粒，获得线性化P4HA1_pGAPZ基因表达盒；随后制备毕赤酵母GS115感受态细胞，电击转化线性化的COL3A1991-1394_pPIC9K和P4HA1_pGAPZ质粒，并在不含有组氨酸且含有博莱霉素的最小葡萄糖培养基(MD)平板上筛选阳性克隆；筛选出的阳性克隆进一步以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，挑取对应的阳性克隆保存菌株的同时，取部分菌落在YPD培养基中培养扩增后，提出基因组并测序，测序正确的毕赤酵母基因工程菌-80℃保存。
S3，制备基因重组人源胶原：用BMGY培养基于30℃，220rpm培养毕赤酵母基因工程菌16～18小时，1:5(体积比)接种于发酵罐中，罐中通氧，保持氧气在75％以上，培养至OD600＝200时，加入1％甲醇诱导，30℃，诱导72小时；发酵结束后，离心收集上清，采用100kDa截流膜包进行纯化，洗脱缓冲液为PBS(pH7.4)，收集<100kDa的样品溶液；随后使用30kDa的截流膜包进行纯化，收集<100kDa且>30kDa的样品溶液；采用超滤系统(PALL)脱盐、浓缩；浓缩液经冷冻干燥制得基因重组III型人源胶原蛋白。
本发明还提供了上述的重组III型人源胶原蛋白在制备具有促进皮肤修复和伤口愈合作用的产品中的用途。
上述的重组III型人源胶原蛋白的用途，所述产品为组织工程产品、化妆品、保健品或药物。
上述的重组III型人源胶原蛋白的用途，所述产品的剂型为气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、凝胶剂、乳膏剂或注射剂，所述重组III型人源胶原蛋白作为各剂型产品的活性成分。
采用本发明的重组III型人源胶原蛋白及其制备方法和用途的技术方案，具有以下有益效果：
(1)本发明的重组胶原蛋白序列包含α螺旋结构域、血小板黏附结构域以及促进重组胶原单体自组装为三聚体的富集半胱氨酸的C端结构域，促进人源胶原蛋白重组表达过程中自发的正确折叠；
(2)本发明的基因重组III型人源胶原蛋白序列来自与原始III型人源胶原蛋白序列，无任何标签和多余序列引入，可有效避免人体的过敏反应，具备较好的安全性。
(3)相比传统胶原，完全人源化的基因重组胶原蛋白避免了动物胶原带来的免疫排斥反应，杜绝了生物安全隐患，工艺过程对环境友好；
(4)相比较现有来自昆虫细胞的胶原，产量高，成本低，且纯化过程简单。
(5)相比较现有原核工程菌的胶原，基因重组人源胶原蛋白无内毒素隐患，且能实现重组人源胶原蛋白的翻译后修饰；
(6)相比较现有来自真核工程菌的胶原，本发明采用胞内表达促进人源胶原蛋白正确折叠的蛋白酶，胞外分泌表达目标重组胶原蛋白，不仅能够帮助重组胶原蛋白形成三聚体，并且方便纯化。
附图说明
图1为质粒构建示意图，((A)P4HA1_pGAPZ质粒,(B)COL3A1991-1394_pPIC9K质粒)；
图2为SDS-PAGE检测毕赤酵母GS115分泌表达的重组COL3A1蛋白(重组蛋白的序列为III型人源胶原蛋白原始序列的第991-1394氨基酸)；
图3为SDS-PAGE检测GS115细胞裂解液中的P4HA1蛋白和Western blot检测P4HA1蛋白的热稳定性图(A：SDS-PAGE检测GS115细胞裂解液中的P4HA1蛋白；B：anti-Myc检测GS115细胞裂解液在不同温度孵育后加入胰蛋白酶消化后的蛋白样品，未进行酶消化处理的4℃孵育的样品为对照组)；
图4为复溶的冻干重组III型人源胶原蛋白COLA1991-1394的圆二色谱图；
图5为MTT检测重组III型人源胶原蛋白COLA1991-1394对L929细胞增殖的影响图(n＝5)，(无COLA1991-1394处理的细胞为Control组，****：P＜0.0001，***：P＝0.0001，ns：无统计学差异)；
图6为重组III型人源胶原蛋白COLA1991-1394对L929细胞迁移率的影响图(n＝3)，(无重组蛋白细胞孔为对照组)；
图7为BALB/c小鼠全层皮肤破损后第14天和28天的H&E染色代表图像(n＝5)，(Control：无菌PBS处理组。箭头为组织中的毛囊)；
图8为BALB/c小鼠全层皮肤破损后第14天和28天的免疫组化染色表征En-1蛋白在细胞中的表达水平图(n＝5)。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
实施例1：重组III人源胶原蛋白COL3A1991-1394的制备
S1，重组表达载体的构建，具体为：
S11，根据GenBank中III型人源胶原蛋白COL3A1基因序列和人脯氨酸4-羟基化酶α亚基基因序列(P4HA1)，合成编码原始III型人源胶原蛋白COL3A1991-1394的基因序列(C端带有终止密码子)(SEQ ID NO.3)和编码人脯氨酸4-羟基化酶α亚基的基因序列P4HA1(SEQ IDNO.4)。
(1)扩增SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。其中，用于扩增SEQ ID NO.3的正向(F)引物融合了pPIC9K质粒中编码α-factor的基因序列3’端19nt同源序列，反向(R)扩增引物融合了pPIC9K质粒中AOX1 terminator序列5’端的18nt同源序列；用于扩增SEQ ID NO.4的正向(F)引物融合了pGAPZ质粒中GAP启动子3’端的15nt用源序列，反向(R)引物融合了pGAPZ质粒中Myc-tag序列5’端的15nt同源序列。引物序列如下：
COL3A1991-1394_F:GAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAACGTGGTCCCCCTGG
COL3A1991-1394_R:CAGTCATGTCTAAGGCGAATTACCCCATCAGCTTCAGGGC P4HA1_F:CAATTGAACAACTATATGATCTGGTATATATTAATTATAGGAATTCTGC P4HA1 R:GATGAGTTTTTGTTCTCATTCCAATTCTGACAACGTAC(i)按下列组成配置PCR反应液扩增COL3A1991-1394:
扩增P4HA1:
(ii)PCR扩增反应条件分别为：扩增COL3A1991-1394:
2～4步骤，重复30个循环。
扩增P4HA1:
2～4步骤，重复30个循环。
(iii)利用琼脂糖凝胶回收：
配置1％琼脂糖凝胶，缓冲液为0.5％ TAE，电压恒压100V，回收特异性条带。
(iv)利用Gel extraction试剂盒，按照说明书步骤纯化PCR回收产物。
S12,设计引物，利用Reverse PCR扩增线性化载体Linearized pPIC9K和Linearized pGAPZ。
Linearized pPIC9K_F:TTCGCCTTAGACATGACTGTTCC
Linearized pPIC9K_R:AGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG
Linearized pGAPZ_F:TCAAGAGGATGTCAGAATGCC
Linearized pGAPZ_R:ATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGGGAC
(i)按下列组成配置PCR反应液：
扩增Linearized pPIC9K:
扩增Linearized pGAPZ:
(ii)反应条件分别为：
扩增Linearized pPIC9K:
2～4步骤，重复35个循环。
扩增Linearized pGAPZ:
2～4步骤，重复35个循环。
(ii)配置0.8％琼脂糖凝胶，缓冲液为0.5％ TAE，电压恒压100V，回收特异性条带，采用Gel extraction试剂盒，按照说明书步骤纯化PCR回收产物。
S13,构建COL3A1991-1394_pPIC9K和P4HA1_pGAPZ质粒
(i)使用Gibson assembly试剂盒，根据说明书将上述3μl COL3A1991-1394 PCR纯化产物(30ng/μl)和1μl线性化pPIC9K质粒(50ng/μl)混合，加入Gibson assembly连接试剂1μl，在50℃条件下孵育15min，进行连接；将上述3μl P4HA1 PCR纯化产物(30ng/μl)和1μl线性化pGAPZ质粒(50ng/μl)混合，加入Gibson assembly连接试剂1μl，在50℃条件下孵育15min，进行连接。
(ii)将连接物分别转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养板上筛选携带COL3A1991-1394_pPIC9K的阳性克隆，在含有博莱霉素的LB培养板上筛选含有P4HA1_pGAPZ质粒的阳性克隆。
(iii)挑取阳性克隆，提取质粒进行测序，并确认含有正确连接序列的COL3A1991 -1394_pPIC9K质粒和P4HA1_pGAPZ质粒。
S14,构建COL3A1991-1394和P4HA1基因表达盒
取限制性内切酶Pme I酶10μl，COL3A1991-1394_pPIC9K质粒20μg，加入50μl10×NEBbuffer，加水补足至500μl，37℃孵育1h，终止反应前取5μl反应液，以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全，酶切完全后，65℃加热20min终止反应；取限制性内切酶BsrD I酶10μl，P4HA1_pGAPZ质粒20μg，加入50μl 10×NEB buffer2.1，加水补足至500μl，37℃孵育1h，终止反应前取5μl反应液，以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全，酶切完全后，65℃加热20min终止反应。采用质粒提取试剂盒对线性质粒进行提取回收，回收质粒即为基因表达盒。
S2,毕赤酵母基因重组工程菌的构建,具体为：
S21,毕赤酵母(GS115)感受态细胞的制备
(i)挑取酵母单菌落，接种至含5ml YPD培养基的摇菌管中，30℃，220rpm，培养过夜。取50μl至含有50ml新鲜培养基的250ml三角烧瓶中，30℃培养至OD600为1.0。
(ii)4℃，4000rpm离心5min，收集上述培养物，用预冷的50ml无菌水重悬沉淀。
(iii)按照(ii)离心收集，用25ml预冷的1mol/l的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。
(iv)按照(ii)离心收集，用0.5ml的冰1mol/l的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。
(v)每100μl分装一份，-80℃保存，用于之后的电转化。
S22,毕赤酵母(GS115)的电转化
(i)将10μg COL3A1991-1394基因表达盒和10μg P4HA1基因表达盒加入1份毕赤酵母感受态细胞中，冰育10min。
(ii)将上述细胞和基因表达核混合物加入预冷的0.2cm的电转杯中，电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，点击时间为4～10mSec。
(iii)电击完毕后，加入1ml冰预冷的1mol/l的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml离心管中，冰育10min。
(iv)将冰育后的细胞于30℃孵育2h后，均匀涂布于含有博莱霉素的MD平板上，每100μl涂布一块平板。筛选His+且同时抵抗博莱霉素的转化子。
S23,多拷贝插入重组子的筛选
(i)在生长有转化子的MD平板表面加入2ml灭菌双蒸水，无菌涂布器在His+转化子表面轻涂刮，并转移至50ml离心管中。
(ii)使用灭菌双蒸水调至为105/ml个细胞，取1ml涂布于含有0.5mg/ml G418的YPD平板上，倒置，30℃培养72h，筛选转化子。
(iii)挑取0.5mg/ml G418平板上的转化子，分别接种于含有200μl YPD培养液的96孔板中，混合均匀，30℃培养48h。
(iv)培养48h小时后取每孔中的培养液10μl，分别加入每孔含有190μl YPD培养液的新96孔板中，30℃培养24h。
(v)按照(iv)继续培养24h后，取出1μl菌液分别点在含有1.0mg/ml和4.0mg/mlG418的YPD平板上，30℃培养96h。酵母GS115转化子若能在含约越高浓度G418的培养基上生长，说明该转化子含有越多拷贝的目的基因，即有多个COL3A1991-1394_pPIC9K片段融合在酵母GS115的染色体上。
S3,制备重组人源胶原蛋白
(i)挑取单个上述筛选的多拷贝酵母转化子于5ml YPD培养基中30℃，220rpm培养16～18小时。
(ii)将上述菌液接种到200ml BMGY培养基于30℃，220rpm继续在30℃，220rpm培养16～18小时。
(iii)将在BMGY中培养的GS115接种于含有1.5L BMGY培养基的发酵罐中(1:10的体积比接种)，罐中通氧，保持氧气在75％以上，30℃搅拌培养。
(iv)培养至OD600＝200时，加入1％甲醇诱导，30℃，继续培养，诱导72小时。
(v)发酵结束后，离心收集上清，采用100kDa截流膜包进行纯化，洗脱缓冲液为PBS(pH7.4)，收集<100kDa的样品溶液。随后使用30kDa的截流膜包进行纯化，收集<100kDa且>30kDa的样品溶液。采用超滤系统(PALL)脱盐、浓缩。浓缩液经冷冻干燥制得基因重组人源胶原蛋白COLA1991-1394。
SDS-PAGE检测分泌表达的重组III型人源胶原蛋白
请参阅图2，精密称取冻干粉10mg，加入10ml PBS(pH 7.4)溶解冻干粉，取20μl蛋白溶解，加入5μl 5×上样缓冲液，100℃加热5min，随后将上述样品在200V电压下进行SDS-PAGE验证COLA1991-1394的表达，实验结果如图2所示。
SDS-PAGE和Western blot检测毕赤酵母胞内脯氨酸4-羟化酶α亚基蛋白的表达情况
请参阅图3，取步骤S3的(v)中离心后的毕赤酵母细胞，加入蜗牛酶，在30℃孵育1h，使毕赤酵母细胞充分裂解，离心收集上清。取20μl上清液，加入5μl 5×上样缓冲液，100℃加热5min，随后将上述样品在200V电压下进行SDS-PAGE验证P4HA1的表达。
取上述500μl上清液，平均分成5份，分别在4℃，30℃，37℃，42℃和45℃孵育10min。向30℃，37℃，42℃和45℃孵育的样品中加入胰蛋白酶进行消化30min。4℃孵育后的样品不进行蛋白酶消化。取上述各样品20μl，加入5μl 5×上样缓冲液，100℃加热5min，随后将上述样品在200V电压下进行SDS-PAGE电泳，电泳后采用anti-Myc进行Western blot检测。实验结果如图3，图3A中显示毕赤酵母GS115细胞裂解液中可溶性重组P4HA1蛋白显著表达，且图3B中显示，与对照组样品(未进行酶消化处理的4℃孵育的样品)相比，重组P4HA1蛋白在不同温度条件下孵育后，经胰蛋白酶消化后在30℃和37℃未见明显降解，表明该重组蛋白在毕赤酵母培养条件下(30℃)和应用于创伤愈合时(37℃)能够保持稳定性。
重组人源胶原蛋白二级结构检测
请参阅图4，圆二色光谱(CD)测定蛋白质折叠和分析蛋白质二级结构。采用上述所述冻干蛋白配置浓度为0.6μM的蛋白溶液，蛋白缓冲液1mM PBS,pH 7.4。
使用Jasco J815分光偏光计记录蛋白CD图谱。根据CD图谱分析基因重组III型人源胶原蛋白是否具备二级结构以及二级结构所属类型。
CD检测结果如附图4所示，图4中显示COL3A1991-1394重组III型人源胶原蛋白在208nm和222nm处存α螺旋结构的特征峰，表明冻干后复溶的COL3A1991-1394蛋白具有α折叠。
实施例2：重组III型人源胶原蛋白COL3A1991-1394对细胞增殖和迁移的促进作用实施例。
(1)MTT检测基因重组III型人源胶原蛋白对细胞增殖的影响
1)胰酶消化对数期小鼠成纤维细胞L929，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。
2)将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，加入96孔板中，每孔加入100μl,这样待测细胞的密度为5000/孔，边缘孔用无菌PBS填充。
3)将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的基因重组蛋白COLA1991-1394，2倍稀释梯度，每孔100μl，设3个复孔，蛋白首孔终浓度为120ng/ml，蛋白稀释液为MEM培养液。
4)5％ CO2，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。
5)每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％ MTT)，继续培养4h。离心后弃去培养液，用PBS冲洗2-3遍后，将上清去掉。
6)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。
7)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞+培养液)。
8)实验结果如附图5所示，与对照组相比(MEM培养基组)基因重组III人源胶原蛋白COLA1991-1394在浓度7.5～120ng/ml之间对L929细胞的增殖具有显著地促进作用。
(2)细胞划痕实验检测基因重组III型人源胶原蛋白对细胞迁移的影响
1)胰酶消化对数期小鼠成纤维细胞L929，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。
2)培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记。将上述细胞接入12孔板，每孔接种2ml，放置培养箱中培养，至细胞铺满板底后，用1ml枪头垂直于孔板细胞划痕。
3)吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。
4)对照组加入无血清培养基2ml，蛋白处理组分别加入2ml含有COLA1991-1394，120ng/ml、30ng/ml和7.5ng/ml的无血清培养基，拍照记录。
5)将培养板放入培养箱中继续培养，于0h，4h，8h和12h取出拍照记录。
6)根据收集图片，测量相对0h记录的细胞划痕的距离的细胞迁移。
7)实验结果如图6，基因重组III型人源胶原蛋白COLA1991-1394在30ng/ml和120ng/ml显著促进小鼠成纤维细胞L929的迁移。
实施例3:重组III型人源胶原蛋白促进伤口愈合和组织修复的实施例。
1.建立小鼠全层皮肤损伤模型
雄性BALB/c小鼠，体重22～25g/只，共40只。将小鼠背部中央剃毛备皮，使用75％的酒精进行消毒，腹腔注射适量水合氯醛麻醉，用无菌圆形活检穿孔器(直径10mm)在剃毛消毒的背部中央进行全层皮肤切除，形成圆形的皮肤全层创口，黏胶圈在破损伤口周围。
2.重组III型人源胶原蛋白对小鼠伤口愈合和组织修复的影响
(1)动物实验
将上述小鼠随机分为4组，每组10只，每天给与1ml无菌PBS溶液以及无菌PBS溶液复溶的不同浓度的COLA1991-1934重组蛋白(7.5ng/ml，30ng/ml和120ng/ml)直至28天或伤口愈合，无菌PBS溶液组为对照组(Control)
分别在第14天和第28天每组各取5只小鼠，取模型处组织进行HE染色考察组织病理学变化，免疫组化考察成纤维细胞中Engrailed-1蛋白的表达从而考察伤口愈合情况。
(2)实验结果如图7显示，相比于无菌PBS溶液处理组的小鼠伤口愈合情况，COLA1991-1394重组蛋白120ng和30ng显著加快了小鼠伤口的愈合速度。且在28天观测时，120ng剂量组小鼠伤口愈合处形正常皮肤组织的毛囊，且角质层光滑平整，表明重组的COLA1991-1934蛋白有效促进伤口愈合，且阻止疤痕形成。
进一步地对组织细胞中促进疤痕形成的En-1蛋白进行免疫组化染色，评价重组COLA1991-1934蛋白对伤口愈合过程中疤痕形成的影响，结果如图8所示，在第28天时，120ng/ml重组COL3A1991-1394蛋白显著抑制En-1蛋白的表达，进一步证明重组COL3A1991-1394有效阻止创伤愈合过程中疤痕的形成。
综上所述，本发明的重组III型人源胶原蛋白，具备空间结构稳定性，且水溶性良好，能够促进细胞的增殖和迁移，特别地，促进伤口愈合并有效阻止伤口愈合过程中疤痕的形成。本发明的重组III型人源胶原蛋白的制备方法，制备方法简单，在低成本下即可获得较高产量的胶原蛋白。本发明的重组III型人源胶原蛋白可用于制备具有促进皮肤修复和伤口愈合作用的的产品。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。

Claims (9)

1.一种具有促伤口愈合功能的重组III型人源胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列包含SEQ ID No.1所示序列。
2.如权利要求1所述的一种具有促伤口愈合功能的重组III型人源胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型人源胶原蛋白为人源原始序列的COL3A1序列的991-1394(COL3A1991 -1394)，包含404个氨基酸，分子量为40.2kDa。
3.如权利要求1所述的一种具有促伤口愈合功能的重组III型人源胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型人源胶原蛋白具有α螺旋折叠结构，且含有促进三条肽链间形成二硫键从而形成三螺旋结构的半胱氨酸富集结构域。
4.如权利要求1所述的一种具有促伤口愈合功能的重组III型人源胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型人源胶原蛋白序列与人血小板相互作用，局部加强了血小板的黏附与聚集，进而启动了内源性的凝血途径。
5.一种如权利要求1至4任意一项所述的重组III型人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，重组表达载体的构建：构建含有正确连接序列的COL3A1991-13964_pPIC9K和P4HA1_pGAPZ质粒；
S2，毕赤酵母基因重组工程菌的构建：使用限制性内切酶Pme I酶切COL3A1991-1394_pPIC9K质粒，获得线性化COL3A1991-1394_pPIC9K基因表达盒；使用限制性内切酶BsrDI酶切P4HA1_pGAPZ质粒，获得线性化P4HA1_pGAPZ基因表达盒；随后制备毕赤酵母GS115感受态细胞，电击转化线性化的COL3A1991-1394_pPIC9K和P4HA1_pGAPZ质粒，并在不含有组氨酸且含有博莱霉素的最小葡萄糖培养基(MD)平板上筛选阳性克隆；筛选出的阳性克隆进一步以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，挑取对应的阳性克隆保存菌株的同时，取部分菌落在YPD培养基中培养扩增后，提出基因组并测序，测序正确的毕赤酵母基因工程菌-80℃保存；
S3，制备基因重组人源胶原：用BMGY培养基于30℃，220rpm培养毕赤酵母基因工程菌16～18小时，1:5(体积比)接种于发酵罐中，罐中通氧，保持氧气在75％以上，培养至OD600＝200时，加入1％甲醇诱导，30℃，诱导72小时；发酵结束后，离心收集上清，采用100kDa截流膜包进行纯化，洗脱缓冲液为PBS(pH7.4)，收集<100kDa的样品溶液；随后使用30kDa的截流膜包进行纯化，收集<100kDa且>30kDa的样品溶液；采用超滤系统(PALL)脱盐、浓缩；浓缩液经冷冻干燥制得基因重组III型人源胶原蛋白。
6.如权利要求5所述的重组III型人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，
(1)使用毕赤酵母GS115作为工程菌株；
(2)将编码人脯氨酸4-羟基化酶的关键酶活性区域α亚基的DNA序列整合至毕赤酵母基因组中的组成型启动子GAP序列之下，使人脯氨酸4-羟基化酶α亚基(P4HA1)随毕赤酵母生长而表达；
(3)将编码SEQ ID No.1的DNA序列整合至毕赤酵母基因组中的诱导型启动子AOX1序列之下，且在AOX1和编码SEQ ID No.1的DNA序列之间插入分泌信号序列α-factor，在甲醇诱导下由AOX1启动重组COL3A1蛋白外秘表达；
(4)胞内表达的人脯氨酸4-羟基化酶α亚基促进胞内合成的重组COL3A1蛋白中脯氨酸残基羟基化，使分泌出的重组COL3A1蛋白单体自组装成三聚体；
(5)胞内表达人脯氨酸4-羟基化酶α亚基，分泌表达重组COL3A1蛋白的重组蛋白共表达方式，使分泌出的重组COL3A1蛋白纯化过程简单，适合工业生产。
7.一种如权利要求1至4任意一项所述的重组III型人源胶原蛋白在制备具有促进皮肤修复和伤口愈合作用的产品中的用途。
8.如权利要求7所述的重组III型人源胶原蛋白的用途，其特征在于，所述产品为组织工程产品、化妆品、保健品或药物。
9.如权利要求7所述的重组III型人源胶原蛋白的用途，其特征在于，所述产品的剂型为气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、凝胶剂、乳膏剂或注射剂，所述重组III型人源胶原蛋白作为各剂型产品的活性成分。
CN202410816522.2A 2024-06-24 2024-06-24 一种重组iii型人源胶原蛋白及其制备方法和用途 Pending CN118834284A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410816522.2A CN118834284A (zh) 2024-06-24 2024-06-24 一种重组iii型人源胶原蛋白及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410816522.2A CN118834284A (zh) 2024-06-24 2024-06-24 一种重组iii型人源胶原蛋白及其制备方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118834284A true CN118834284A (zh) 2024-10-25

Family

ID=93149027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410816522.2A Pending CN118834284A (zh) 2024-06-24 2024-06-24 一种重组iii型人源胶原蛋白及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118834284A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110606896B (zh) 重组人源III型胶原蛋白α1链及其应用
KR102559311B1 (ko) 재조합 인간 xvii형 콜라겐, 제조방법 및 응용
CN114805551B (zh) 一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法
JP7300060B2 (ja) ヒトコラーゲンｘｖｉｉ型ポリペプチド、その製造方法および使用
CN111944057B (zh) 一种重组人胶原蛋白肽及其应用
CN113717290B (zh) 一种复合透皮重组纤连蛋白及其应用
WO2017206326A1 (zh) 一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法
ES2401856T3 (es) Un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tiene actividad insulinotrópica
JP2016514708A (ja) 三重らせんタンパク質の精製
JPH10502360A (ja) ヒトインターロイキン４のアンタゴニストもしくは部分的アゴニストとして用いられる新規ｈＩＬ−４突然変異蛋白質
CN118047857B (zh) 一种生物合成人体结构性材料的制备方法
CN117986355B (zh) 一种重组人源化iii型胶原蛋白及其制备方法和用途
CN117986353B (zh) 重组人xvii型胶原蛋白、其制备方法及应用
CN111423516B (zh) 一种蛋白及其在创口修复及抑菌中的应用
CN118324899B (zh) 一种重组xvii型人源化胶原蛋白、制备方法及其应用
CN101063124A (zh) 人白介素－11与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品
CN116640231B (zh) 一种重组人源化17型胶原多肽及其制备方法
CN116836263B (zh) 一种重组人源iii型胶原蛋白及其毕赤酵母重组表达系统
CN118834284A (zh) 一种重组iii型人源胶原蛋白及其制备方法和用途
CN116554309A (zh) 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用
CN107904251A (zh) TAT‑hEGF融合蛋白的制备及其在隐形面膜的应用
US20230002468A1 (en) N-terminal extension sequence for expression of recombinant therapeutic peptides
CN118852408A (zh) 一种重组iii型人源胶原蛋白及其制备方法和用途
CN118955692B (zh) 一种具有透皮效果的重组胶原蛋白及其制备方法和应用
CN119552240B (zh) 一种基于在大肠杆菌中表达与纯化的重组人源化i型胶原蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Country or region after: China

Address after: 650106 No. 53, medical Road, hi tech Zone, Yunnan, Kunming

Applicant after: Yunnan Beitani Biotechnology Group Co.,Ltd.

Applicant after: Yunnan Characteristic Plant Extraction Laboratory Co.,Ltd.

Address before: 650106 No. 53, medical Road, hi tech Zone, Yunnan, Kunming

Applicant before: Yunnan Beitani Biotechnology Group Co.,Ltd.

Country or region before: China

Applicant before: Yunnan Yunke characteristic plant extraction laboratory Co.,Ltd.