CN101063124A - 人白介素－11与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品 - Google Patents
人白介素－11与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品 Download PDFInfo
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Abstract
人白介素－11(IL－11)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，连接IL－11cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA－IL－11cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主系统中进行表达。本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人白介素－11至少85％序列同源的第二区，两区直接连接，中间不加入任何连接肽，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明的融合蛋白在保持了人白介素－11的生理特性的基础上，延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。
Description
技术领域
人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。
背景技术
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 261：6747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和/或外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et Biophysica Acta，2003640：119-128)。David S.Park等构建的Half HSA(截取HSA的前297个氨基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，199948：169-174)，细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N-连接糖基化(见Uniprot中的protein ALBU HUMAN)。Peters的观点认为大分子蛋白的优点是减少其在内循环时经肾排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，1985 37：161-245)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。
人白介素-11(Interleukin-11，IL-11)于20世纪80年代发现，是一种由造血微环境基质细胞产生的具有多种功能的细胞因子，源于灵长类骨髓基质细胞，与造血系统和免疫系统密切相关。
IL-11cDNA序列含有597个核苷酸的单一长开放阅读框架，预期编码199个氨基酸的多肽，其前21个氨基酸为信号肽。成熟的IL-11由178个氨基酸组成，分子量约22kDa，不含有半胱氨酸和可能的糖基化位点，等电点pI为11.7，IL-11基因含有5个外显子和4个内含子，定位于19号染色体长臂上。诱导IL-11分泌的刺激因子较多，一般为IL-1、TGF-β1-3、TNF和PTH等。IL-11多肽结构中无半胱氨酸残基或潜在糖基化位点，无二硫键结构，高度螺旋化结构。IL-11是重要的造血调节因子，刺激巨核系、红系和粒系造血。研究发现，在无血清培养下，单独IL-11对CD34+DR+(主要为CFU-MK)和CD34+DR-(主要为BFU-MK)骨髓细胞集落形成作用极弱，但在IL-3存在下，IL-11促进FU-MK形成。IL-11对巨核细胞增殖、成熟和分化均有作用，与IL-3等细胞因子协同作用可缩短早期造血细胞的G0期，使骨髓巨核系集落体积增大，数量增多，同时巨核细胞高倍体也增多。
IL-11能刺激骨髓中巨核细胞的形成和发育，明显提高癌症病人化疗后外周血中血小板的数量。
发明内容
本发明的目的是提供一种人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品。
本发明的技术方案：从人骨髓基质细胞中分离细胞，提取RNA，通过RT-PCR反转录扩增得到IL-11cDNA，通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSAcDNA；利用重叠PCR技术，连接IL-11cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IL-11cDNA融合基因插入到克隆载体；HSA-IL-11cDNA融合基因在宿主系统进行表达，HSA-IL-11cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中。
IL-11-cDNA的克隆，IL-11cDNA的扩增，HSA cDNA的克隆，HSA cDNA的扩增，IL-11cDNA和HSA cDNA的连接，融合蛋白HSA-IL-11的酵母表达系统构建，融合蛋白HSA-IL-11的表达的步骤详见实施例。
用上述方法制备的人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人白介素-11至少85％序列同源的第二区；所述与人白介素-11同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人白介素-11同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
优选的是所述融合蛋白包括与人白介素-11至少95％序列同源的第二区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区。
所述融合蛋白的第一区可以由人血清白蛋白部分结构域组成、或经结构域重排后的人血清白蛋白组成，包括其所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述【名为HSA(1-n)，n为369-419】。
所述融合蛋白包括与人白介素-11氨基酸残基序列相同的第二区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区，或上述二区的功能等同物。
所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
本发明的另一内容是提供表达融合蛋白编码区的宿主。
宿主表达系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞表达系统。优选的是酵母。优选的酵母是毕赤酵母。优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。
IL-11cDNA和HSA cDNA也可以通过人工合成的方法获得。该法可以人为地选择宿主偏好的密码子，以使目的基因高效表达。利用重叠PCR技术，连接IL-11cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫原性方面的问题，得到的IL-11cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存。
IL-11cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多个系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫等)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体中或插入到质粒中。本发明优选的是酵母表达系统，更优选的是毕赤酵母表达系统，更优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。
毕赤酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcZa，pYAM75P6；胞内型表达载体主要有：pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(invitrogen)等，优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有His缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOX1启动子、MFα分泌信号肽和G418抗性基因(可作为筛选重组子的标记)等元件。AOX1启动子是一个强启动子，可以高效的启动目的基因的表达。在毕赤酵母里共编码两种乙醇氧化酶，AOX1和AOX2，细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇为唯一碳源培养的细胞中，该酶可占细胞总蛋白的30％以上。AOX2与AOX1的同源性虽然高达97％，但酶活很低。当AOX1基因缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，细胞利用甲醇能力降低，细胞在甲醇为唯一碳源的培养基上生长很慢。
带有融合cDNA的表达载体可以通过转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法转化宿主细胞。成功转化的细胞，即带有本发明构建的DNA的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取DNA，然后进行Southern杂交和PCR鉴定，也可在诱导表达后用HSA抗体和IL-11抗体检测培养液上清。
本发明的有益效果：利用重叠PCR技术，连接IL-11 cDNA和HAS cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的问题。
优选的酵母表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕赤酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕赤酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
可以通过培养带有本发明构建的DNA的宿主细胞，来生产本发明的融合蛋白。宿主细胞培养优选在生物反应器上进行，培养分两个阶段，第一阶段主要用于宿主细胞生长，第二阶段主要用于产物合成。可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐析、沉淀、超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的组合。
附图说明
图1.pPIC9K-HSA-IL-11构建。
图2.标准曲线的建立。
图3.融合蛋白的SDS-PAGE分析，1、样品，上样量7μl；2，标准分子量。
图4.融合蛋白的IL-11抗体检测Western blot分析；1，样品；2，标准分子量。
具体实施方法
实施例1：IL-11-cDNA的克隆
以RT-PCR反转录得到的IL-11cDNA第一链为模板，通过PCR扩增出IL-11cDNA，所用的引物如下：
P1：5’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCC-3’
P2：5’-GCGGCCGCTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAG-3’
PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的P1和P2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，IL-11cDNA第一链1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：94℃变性5分钟，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环28次，最后72℃延伸5分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段，对目标片段产物进行T-A克隆到pMD19T-Vector中，重组质粒命名为pMD-IL-11。
实施例2：HSA-cDNA的克隆
利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：
PH1：5’AG
GTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’
PH2：5’-GCC
AAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’
PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃C变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptII KS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA。
实施例3：IL-11cDNA和HSA cDNA片段的扩增、融合、克隆
从pMD-IL-11质粒中用PCR的方法扩增，引物如下
IL-3：5’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCC-3’
IL-4：5’-GCGGCCGCTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAG-3’
PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物IL-3和引物IL-4各2μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pMD-IL-11 1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标条带，纯化好的目标片段备用。
HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下：
HI-1：5’-GAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTTG-3’
HI-2：5’-GGGCCAGGTGGTGGCCCAGGTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’
PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的HI-1和HI-2的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl(dNTP、反应缓冲液和pfu DNA聚合酶均购自上海生物工程技术服务公司)，pBlue-HAS 1μg，加双蒸水补齐50μl。在MJ Research公司的PTC-100TMPCR仪上，PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸150秒，循环30次。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标条带，纯化好的目标片段备用。
利用重叠PCR融合IL-11cDNA和HSA cDNA，具体方法如下：
将IL-11的PCR反应产物和HSA的PCR反应产物纯化后，按照1∶1体积比混合后作为模板。于50μl的反应体系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×TaqBuffer 5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl(dNTP、反应缓冲和Taq DNA聚合酶均购自上海生物工程技术服务公司)，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl。在MJ Research公司的PTC-100TMPCR仪上，PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸3分钟。循环10次后，向反应体系中加入10μmol/L的HI-1和IL-4的引物各2.5μl，继续做30次上述循环。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现预期大小(约2.3kb)的条带。用PCR片段胶回收试剂盒(购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)纯化出2.3kb的目标片段。纯化好的目标片段HSA-IL-11cDNA，再EcoRI和NotI双酶切纯化好的片段和载体pMD19-T按照1∶7的体积比用T4连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌XL-1 blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。通过PCR和EcoRI、NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对EcoRI-NotI区进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃。重组质粒命名为pMD 19-HSA-IL-11，阳性重组子命名为XL-1Blue/pMD19-HSA-IL-11。
实施例4：融合蛋白HSA-IL-11酵母表达系统构建
取一支冻存的XL-1Blue/pMD19-HSA-IL-11，接种到20ml含氨苄青霉素(100μg/μl)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。质粒pMD19-HSA-IL-11和酵母表达载体pPIC9K经EcoRI、NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收。取双酶切后纯化好的pMD19-HSA-IL-11片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜。连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞，转化物涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取若干个菌落，接种于20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒。通过PCR和EcoRI、NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃。重组质粒命名为pPIC-HSA-IL-11，阳性重组子命名为XL-1Blue/pPIC-HSA-IL-11。提取XL-1Blue/pPIC-HSA-IL-11中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71。转化物涂布于含有1mol/L山梨醇的MD平板上，于30℃，培养6天。每块平板上用2ml水洗涤，收集洗涤液。取部分收集到的洗涤液，分别涂布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG418的YPD平板，于30℃，培养3～6天。挑取在最高浓度G418的YPD平板上的长出菌落，接种于20ml MD培养基中，30℃培养24小时，用常规方法提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子。阳性重组子命名为KM71/pPIC-HSA-IL-11。
实施例5：HSA-IL-11融合蛋白的表达
将KM71/pPIC-HSA-IL-11接种至装有100ml BMGY(100mM磷酸钾，pH6.0、1.34％无氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、1％甘油)的500ml三角瓶中，250rpm、29℃培养至OD600nm为2～6，离心收集菌体。将收集到的菌体接种至装有20ml BMMY(100mM磷酸钾，pH 6.0、1.34％无氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、0.5％甲醇)的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％，诱导7天。离心收集上清，按照不同的稀释度稀释，用来做ELLISA，以确定融合蛋白的表达量和其中IL-11的抗原性；Western杂交鉴定融合蛋白HSA-IL-11分子的HSA的免疫源性。
生物学活性分析：用IL-6依赖细胞株7TD1和MTT色素还原法测定酵母表达的IL-11的生物学活性，表明有免疫源性。
Diaclone公司IL-11试剂盒，按照说明的操作步骤，确立标准曲线，见表1和图2。
离心收集上清，稀释样品10-5倍，A值是0.175，所以按照IL-11计算，应该是12200ng/mL，以融合蛋白来讲，是68.9μg/mL的浓度。
表1标准品的倍比稀释及A值
| 标准品倍比稀释pg/mL | A492 |
| 100050025012562.531.2515.12 | 1.0870.5470.2970.1780.120.0930.078 |
Claims (10)
1、人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是从人骨髓基质细胞中分离细胞，提取RNA，通过RT-PCR反转录扩增得到IL-11 cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接IL-11 cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IL-11cDNA融合基因插入到克隆载体；HSA-IL-11 cDNA融合基因在宿主系统中进行表达，HSA-IL-11 cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中；
(1)IL-11-cDNA克隆
以RT-PCR反转录得到的IL-11 cDNA第一链为模板，通过PCR扩增出IL-11cDNA，所用的引物如下：
P1：5’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCC-3’
P2：5’-GCGGCCGCTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAG-3’
PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的P1和P2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，IL-11cDNA第一链1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：94℃变性5分钟，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环28次，最后72℃延伸5分钟；
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段，对目标片段产物进行T-A克隆到pMD19T-Vector中，重组质粒命名为pMD-IL-11；
(2)HSA-cDNA的克隆：
利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：
PH1：5’-AG
GTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’
PH2：5’-GCC
AAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’
PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptIIKS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HAS；
(3)IL-11-c DNA的扩增：
从pMD-IL-11质粒中用PCR的方法扩增，引物如下：
IL-3：5’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCC-3’
IL-4：5’-GCGGCCGCTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAG-3’
PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物IL-3和引物IL-4各2μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pMD-IL-11质粒1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标条带，纯化好的目标片段备用；
(4)HSA cDNA的PCR扩增，所用的引物为：
HI-1：5’-GAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTTG-3’
HI-2：5’-GGGCCAGGTGGTGGCCCAGGTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’
PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物HI-1和引物HI-2各2μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HAS质粒1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸150秒，循环30次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标条带，纯化好的目标片段备用；
(5)HSA cDNA和IL-11cDNA的连接：
利用重叠PCR融合IL-11 cDNA和HSA cDNA，将IL-11 cDNA的PCR扩增产物纯化后和HAS cDNA的PCR扩增产物纯化后按照1∶1的体积比混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×Taq Buffer 5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环10次后，向反应体系中加入10μmol/L的HI-1和IL-4的引物各2.5μl，继续做30次上述循环；
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.3kb的目标条带，纯化好的目标片段HSA-IL-11 cDNA，再EcoRI和NotI双酶切纯化好的片段和载体pMD19-T按照1∶7的体积比用T4连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pMD19-HSA-IL-11，阳性重组子命名为XL-1Blue/pMD19-HSA-IL-11；
(6)融合蛋白HSA-IL-11的酵母表达系统构建：
取一支冻存的XL-1Blue/pMD19-HSA-IL-11，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，质粒pMD19-HSA-IL-11和酵母表达载体pPIC9K分别经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pPIC9K-HSA-IL-11，阳性重组子命名为XL-1Blue/pPIC9K-HSA-IL-11；提取XL-1Blue/pPIC9K-HSA-IL-11中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71，提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71/pPIC9K-HSA-IL-11；
(7)融合蛋白HSA-IL-11的表达：
将KM71/pPIC9K-HSA-IL-11接种至装有100ml BMGY的500ml三角瓶中，250rpm、29℃培养至OD600nm为2～6，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有20ml BMMY的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％，诱导7天，离心收集上清，过滤除菌，ELISA法测定上清中的融合蛋白HSA-IL-11含量，Western杂交鉴定融合蛋白HSA-IL-11分子的IL-11的免疫源性。
2、用权利要求1所述方法制备的人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人白介素-11至少85％序列同源的第二区；所述与人白介素-11同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人白介素-11同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
3、根据权利要求2所述的人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人白介素-11至少95％序列同源的第二区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区。
4、根据权利要求2所述的人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第一区由人血清白蛋白部分结构域组成或经结构域重排后的人血清白蛋白组成。
5、根据权利要求2所述的人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人白介素-11氨基酸残基序列相同的第二区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区，或上述二区的功能等同物。
6、根据权利要求5所述的人白介素-11与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征是：宿主表达系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞表达系统。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征是优选的宿主表达系统是酵母。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征是优选的酵母是毕赤酵母。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征是优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102220256A (zh) * | 2011-04-14 | 2011-10-19 | 暨南大学 | 一种表达HSA-vMIP-Ⅱ融合蛋白的酵母表达体系及其构建方法 |
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- 2007-04-17 CN CN 200710020891 patent/CN101063124A/zh active Pending
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