CN118546240A - 一种重组人纤连蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组人纤连蛋白及其制备方法和应用，属于蛋白质工程和基因工程技术领域。本发明经模拟软件筛选拼接成一种具有整合素结合位点及胶原蛋白结合域的活性高、稳定性高、水溶性好的重组人纤连蛋白，其编码基因经毕赤酵母密码子偏好性优化，并通过多位点整合质粒介导的重组菌株构建方法，构建了一株高产重组人纤连蛋白的工程酵母菌株，该菌株较单位点整合重组菌株发酵上清液目标蛋白的浓度提高了1.5倍。本发明制备得到的重组人纤连蛋白与市售的重组纤连蛋白产品相比，其皮肤屏障修复效果更好，因此具有良好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程和基因工程技术领域，具体涉及一种重组人纤连蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种细胞外基质中的高相对分子质量的糖蛋白，广泛参与细胞的多种生理活动，包括细胞的迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程。纤连蛋白还能调动吞噬细胞系统清除损伤组织处的有害物质，有利于伤口快速修复，具有生长因子的作用。纤连蛋白也能显著提高DNA、RNA及蛋白质合成速度，成为应用规模细胞培养技术生产新药品的基础物质。
纤连蛋白应用广泛，但天然纤连蛋白产量极为有限，成本昂贵，限制了其应用；传统纤连蛋白主要是通过动物血浆逐级分离纯化得来的，生产工艺耗时长、提取流程复杂，且最终得率极低，同时，动物原料的安全性问题也限制了传统提取方法的应用。随着合成生物学的不断发展，利用基因工程技术设计具有特定生物功能的重组纤连蛋白片段，实现其在微生物表达系统中的高效表达，解决了传统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时也改善了纤连蛋白的亲水性、免疫排异性等，对促进纤连蛋白在工业化生产中的应用具有重要意义。动物、植物等表达体系成本高、周期长，难以满足产业化需求，相比之下，微生物发酵生产重组纤连蛋白成本低、周期短、培养较容易，更易于商业化生产。但是细菌表达系统容易造成热原残余，致使表达产物不纯，难以应用于临床，而且目的蛋白通常以包涵体的形式表达，产物纯化过程复杂，另外原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等缺点影响产品的品质。
毕赤酵母是最常见的外源蛋白表达系统之一，其生长快速，具备明确的遗传背景，操作简单，是在短时间内生产大量蛋白质的理想宿主。此外，毕赤酵母还具备系统的基因编辑系统、完备的蛋白分泌表达机制及外源蛋白翻译后修饰能力，是现今广泛应用于食药领域的异源宿主。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组人纤连蛋白及其制备方法和应用。本发明基于天然人纤连蛋白氨基酸序列，经模拟软件分析，设计得到一种具有整合素结合位点及胶原蛋白结合域的活性高、稳定性高、水溶性好的重组人纤连蛋白。
本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供了一种重组人纤连蛋白，所述重组人纤连蛋白：
a1)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，
a2)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白。
本发明的第二个方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子能够编码上述重组人纤连蛋白。
本发明一种优选的技术方案，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核酸分子。
本发明一种优选的技术方案，所述重组表达载体的质粒载体为pPIC9K或pGAPZαA。
本发明的第四个方面，提供了一种工程菌株，所述工程菌株含有本发明第三方面所述的重组表达载体或者含有本发明第二方面所述的核酸分子或者能够表达本发明第一方面所述的重组人纤连蛋白。
本发明一种优选的技术方案，所述工程菌株的宿主菌为毕赤酵母；进一步优选为毕赤酵母GS115。
本发明一种优选的技术方案，所述工程菌株中编码重组人纤连蛋白的核酸分子整合到宿主菌基因组中，在单启动子调控下表达或者在多启动子共同调控下同时表达。
本发明的第五个方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的重组人纤连蛋白的方法，步骤包括：培养本发明第四方面所述的工程菌株，从而表达出所述重组人纤连蛋白；分离纯化所述重组人纤连蛋白。
本发明的第六个方面，提供了上述重组人纤连蛋白在制备食品、药品或日化用品中的应用。
本发明的第七个方面，提供了一种化妆品，所述化妆品至少包含上述第一方面所述的重组人纤连蛋白。
有益效果：
本发明经模拟软件筛选拼接成一种具有整合素结合位点及胶原蛋白结合域的活性高、稳定性高、水溶性好的重组人纤连蛋白，其编码基因经毕赤酵母密码子偏好性优化，并通过多位点整合质粒介导的重组菌株构建方法，构建了一株高产重组人纤连蛋白的工程酵母菌株，该菌株较单位点整合重组菌株发酵上清液目标蛋白的浓度提高了1.5倍。本发明制备得到的重组人纤连蛋白与市售的重组纤连蛋白产品相比，其皮肤屏障修复效果更好，因此具有良好的实际应用价值。
附图说明
图1为实施例3中重组毕赤酵母发酵上清液的SDS-PAGE蛋白电泳图及Western-Blot检测图；其中，A图为SDS-PAGE蛋白电泳图，泳道M代表分子量为180kDa的标准蛋白；泳道1代表重组毕赤酵母GS115/pPIC9K发酵上清液；泳道2代表重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt发酵上清液；B图为Western-Blot检测图。
图2为实施例5中重组毕赤酵母发酵上清液的SDS-PAGE蛋白电泳图；其中，泳道M代表分子量为180kDa的标准蛋白；泳道1代表重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt发酵上清液；泳道2代表重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt/pGAPZαA-FN1opt以甲醇为碳源的发酵上清液；泳道3代表重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt/pGAPZαA-FN1opt以甘油为碳源的发酵上清液。
图3为实施例6中不同纤连蛋白作用下HaCaT细胞中FLG的mRNA相对表达量柱状图；其中，对照组1代表空白对照组；对照组2代表市售重组纤连蛋白组；实验组代表本发明制备的重组人纤连蛋白FN1组；图中，与对照组1相比，P<0.01(**)，P<0.0001(****)，被认为具有显著性差异。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实施例中涉及的试剂及材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
实施例中涉及的培养基：
YPD培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；
BMGY培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO4 11.8g/L，YNB3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10g/L；
BMMY培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO4 11.8g/L，YNB3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇10mL/L；
BMGYP培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO4 11.8g/L，YNB3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10-4g/L，甘油40g/L。
市售重组纤连蛋白购自上海泽叶生物，产品货号：ZY637Ra01P。
实施例1：重组人纤连蛋白的序列选择
基于天然人纤连蛋白氨基酸序列(NCBI登录号：P02751.5)，经模拟软件分析，设计得到一种具有整合素结合位点及胶原蛋白结合域的活性高、稳定性高、水溶性好的重组人纤连蛋白FN1，该重组人纤连蛋白含有254个氨基酸，在该氨基酸序列羧基端加入6×HIS标签，方便下游纯化。最终重组人纤连蛋白FN1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列与天然人纤连蛋白序列近100％同源，免疫原性低。
实施例2：含重组人纤连蛋白编码基因(FN1opt)表达系统的构建
根据毕赤酵母密码子偏好性对重组人纤连蛋白FN1的编码基因进行序列优化，优化后的重组人纤连蛋白编码基因FN1opt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中，序列5’端的gaattc为EcoRI酶切位点，3’端的gcggccgc为NotI酶切位点。密码子优化的重组人纤连蛋白编码基因FN1opt委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组表达载体pPIC9K-FN1opt。经DNA测序比对，重组序列正确。重组表达质粒pPIC9K-FN1opt经SalI快切酶线性化后电转入毕赤酵母GS115宿主细胞中，重组转化子经遗传霉素G418筛选获得高拷贝重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt。
实施例3：重组人纤连蛋白FN1工程酵母菌株摇瓶发酵
对实施例2获得的重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt进行摇瓶发酵培养，以转入空载pPIC9K的重组毕赤酵母GS115/pPIC9K作为对照。
发酵步骤如下：挑取单克隆接种于40mL的YPD培养基中，30℃、200rpm培养24h。按10％的接种量转接于40mL的初始表达培养基BMGY培养基中，30℃、200rpm培养24h。离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体后全部接种至40mL诱导表达培养基BMMY培养基中，30℃、200rpm培养，每隔24h向培养基中添加纯甲醇至终浓度为1.0％(v/v)，诱导表达96h。
将重组毕赤酵母的发酵上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，电泳分析结果如图1的A图所示。在理论蛋白分子量29.1kDa附近(SDS-PAGE显示的表观分子量比理论分子量大)，重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt发酵上清液(泳道2)多出一条蛋白条带(箭头位置所示)，进一步通过Western-Blot检测，检测结果如图1的B图所示，确定了该位置条带为构建的重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt表达的重组人纤连蛋白FN1。
实施例4：高产重组人纤连蛋白FN1的工程酵母菌株的构建
采用多位点整合质粒介导的方式提高重组人纤连蛋白FN1的产量，构建双启动子表达的重组菌株。
对重组载体pPIC9K-FN1opt进行EcoRI和NotI双酶切，收集重组人纤连蛋白编码基因FN1opt，与经相同酶切处理的线性表达载体pGAPZαA连接，连接产物转化至大肠杆菌TOP10中，在确保阅读框不移码的前提下获得重组质粒pGAPZαA-FN1opt，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒pGAPZαA-FN1opt经限制性内切酶AvrII线性化后电转入重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt细胞中，重组转化子经博来霉素Zeocin筛选得到高拷贝重组人纤连蛋白编码基因的重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt/pGAPZαA-FN1opt，在该重组毕赤酵母中，重组人纤连蛋白编码基因在双启动子的共同调控下同时表达。
实施例5：高产重组人纤连蛋白FN1的工程酵母菌株的摇瓶发酵
对获得的重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt/pGAPZαA-FN1opt按照实施例3的方法进行摇瓶发酵培养。对重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt/pGAPZαA-FN1opt发酵上清液(泳道2)与重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt发酵上清液(泳道1)进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果如图2所示，泳道2的条带亮度明显要大于泳道1，经BioAnaly生物分析软件得，双启动子调控的重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt/pGAPZαA-FN1opt的蛋白表达量相比单启动子调控的重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt提高了1.5倍。
同时，将重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-FN1opt/pGAPZαA-FN1opt以甘油为碳源进行摇瓶发酵培养，发酵步骤如下：挑取单克隆接种于40mL的YPD培养基中，30℃、200rpm培养24h。按10％的接种量转接于40mL的表达培养基BMGYP培养基中，30℃、200rpm培养96h。
以甘油为碳源的发酵上清液SDS-PAGE结果如图2的泳道3所示，在理论分子量29.1kDa左右有一条明显的蛋白条带，说明了该重组毕赤酵母既可以以甲醇为碳源，也可以以甘油为碳源生产重组人纤连蛋白FN1。
实施例6：重组人纤连蛋白FN1的屏障修复实验
丝聚蛋白(Filaggrin，FLG)是角化包膜的重要组成成分之一，保障了皮肤屏障的完整性。FLG缺乏会导致脂质双分子层结构紊乱、成熟延迟，同时造成角质层细胞紧密度降低，细胞间渗透性增强和光保护作用下降，最终导致皮肤屏障受损。
收集人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)，并用高糖DMEM细胞培养液制备细胞悬液，于6孔板中每孔加入2mL细胞悬液，细胞数目为2.6×105/孔。实验设置空白对照组(对照组1)、市售重组纤连蛋白对照组(对照组2)、本发明制备的重组人纤连蛋白组(实验组)，每组设置3个复孔。将6孔板置于细胞培养箱(5％CO2、37℃)中孵育24h，待细胞融合率达到50％～60％时，弃去培养液，空白对照组每孔加入2mL高糖DMEM细胞培养液；其余组别分别加入2mL含有相应重组纤连蛋白的高糖DMEM细胞培养液，其中，重组纤连蛋白在高糖DMEM细胞培养液中的浓度为1mg/mL。将6孔板放置于培养箱(5％CO2、37℃)中孵育培养24h后，每孔用2mL的PBS缓冲液清洗细胞两次，按照Total RNA提取试剂盒，加入1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后收样，依据试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR检测实验，检测屏障相关蛋白FLG的mRNA相对表达量，采用2-△△CT方法进行计算。
不同纤连蛋白促进HaCaT细胞中FLG的mRNA表达能力的结果如图3所示，与空白对照组(对照组1)相比，市售重组纤连蛋白(对照组2)及本发明制备的重组人纤连蛋白FN1(实验组)均可提高FLG的mRNA相对表达量，本发明制备的重组人纤连蛋白FN1比市售重组纤连蛋白提高FLG的mRNA相对表达量的能力要强，故本发明制备的重组人纤连蛋白FN1具备比市售重组纤连蛋白更明显的皮肤屏障修复功能。
Claims (10)
1.一种重组人纤连蛋白，其特征在于，所述重组人纤连蛋白：
a1)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，
a2)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子能够编码权利要求1所述的重组人纤连蛋白。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的核酸分子。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的质粒载体为pPIC9K或pGAPZαA。
6.一种工程菌株，其特征在于，所述工程菌株含有权利要求4所述的重组表达载体或者含有权利要求2所述的核酸分子或者能够表达权利要求1所述的重组人纤连蛋白。
7.如权利要求6所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株的宿主菌为毕赤酵母；进一步优选为毕赤酵母GS115；
优选的，所述工程菌株中编码重组人纤连蛋白的核酸分子整合到宿主菌基因组中，在单启动子调控下表达或者在多启动子共同调控下同时表达。
8.一种制备权利要求1所述的重组人纤连蛋白的方法，其特征在于，步骤包括：培养权利要求6所述的工程菌株，从而表达出所述重组人纤连蛋白；分离纯化所述重组人纤连蛋白。
9.权利要求1所述的重组人纤连蛋白在制备食品、药品或日化用品中的应用。
10.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品至少包含权利要求1所述的重组人纤连蛋白。
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