CN116640205B - 重组xvii型胶原蛋白及其表达菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组XVII型胶原蛋白及其表达菌株。所述的重组XVII型胶原蛋白序列是将人XVII型胶原蛋白中与细胞整合素结合的功能域进行组合所得，分别位于人XVII型胶原蛋白的胶原域和非胶原域，共包含2个非胶原域和4个胶原域，经密码子优化后转化到毕赤酵母中，并经G418抗性梯度筛选获得的高拷贝毕赤酵母基因工程菌能够稳定表达重组XVII型胶原蛋白。本发明的表达重组XVII型胶原蛋白具有优异的促进人毛囊干细胞和人成纤维细胞的细胞增殖、迁移和黏附性能，可用于皮肤和毛囊组织的修复，提升皮肤和毛囊的抵抗力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种重组XVII型胶原蛋白及其表达菌株。
背景技术
胶原蛋白XVII又称BP180，是一种位于真表皮交界处的II型跨膜蛋白，作为半桥粒(位于真皮-表皮基底膜区的多蛋白复合体，可介导角质形成细胞与下层膜的粘附)中关键的结构成分，对维持基底膜与细胞外基质间的紧密连接具有重要作用。人体中存在两种同源三聚体形式的XVII型胶原蛋白，但均由COL17α1基因所编码，分别为全长形式的跨膜蛋白(1497个氨基酸)和截短形式的可溶胞外域(又称LAD-1，1009个氨基酸)。其中，胞外域主要介导与层粘连蛋白和IV型胶原蛋白的结合，是参与维持基底膜稳定性的重要部分。在XVII型胶原蛋白胞外域中共存在15个胶原域和16个非胶原域，这些胶原域和非胶原域共同参与执行了与细胞外基质间的相互作用。有研究表明XVII型胶原蛋白的表达可有助于抑制毛囊干细胞的老化，进而延缓脱发。不仅如此，在抗衰方面，有研究发现XVII型胶原蛋白可促进清除衰老细胞，从而延缓机体的衰老。由于XVII型胶原蛋白在人和动物体内含量极低，利用传统的胶原蛋白分离提取工艺显然无法满足市场的需求，开发高效的绿色制造平台大批量生产重组XVII型胶原蛋白对推进稀有胶原蛋白在日化、护肤、保健和医疗等领域的应用具有重要意义。
随着合成生物学的快速发展，人为设计构建生物系统已成为现今生物学的主流趋势，而从头设计基因元件模块是合成生物学的基础。基于此理念，结合蛋白质工程理性改造策略，合理设计具有高生物学性能的重组XVII型胶原蛋白，并实现其在异源宿主中的高效表达，将极大有助于XVII型胶原蛋白在工业化生产中的应用。
毕赤酵母(Pichia pastoris)是至今仅次于大肠杆菌最常见的真核表达系统，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到了成功表达，同时它也被美国FDA认定为GRAS(Generally Recognized As Safe)微生物。此外，毕赤酵母还具备系统的基因编辑系统和完备的蛋白分泌表达机制，是现今广泛应用于食品和医药领域的异源宿主。因此，利用毕赤酵母分泌表达重组XVII型胶原蛋白将大大推进XVII型胶原蛋白在美容护肤、医疗器械和组织工程等领域的发展。
发明内容
本发明提供一种重组XVII型胶原蛋白及其表达菌株。
本发明的技术方案如下：
本发明所述的重组XVII型胶原蛋白涉及5个基础功能域，包括SEQ No.1、SEQNo.2、SEQ No.3、SEQ No.4和SEQ No.5所示的氨基酸序列，由2个非胶原域和4个胶原域组成。
本发明所述的重组XVII型胶原蛋白为由SEQ No.1、SEQ No.2、SEQ No.3和SEQNo.4的氨基酸序列按顺序组合所形成的氨基酸序列如SEQ No.6所示的重组XVII型胶原蛋白1，或由SEQ No.1、SEQ No.2、SEQ No.3、SEQ No.4和SEQ No.5的氨基酸序列按顺序组合所形成的氨基酸序列如SEQ No.7所示的重组XVII型胶原蛋白2。
本发明根据毕赤酵母的密码子偏好性，对5个基础功能域进行密码子优化，得到SEQ No.1、SEQ No.2、SEQ No.3、SEQ No.4和SEQ No.5对应的核苷酸序列依次为SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。
本发明根据毕赤酵母的密码子偏好性，对重组XVII型胶原蛋白进行密码子优化，得到的重组XVII型胶原蛋白1的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，和重组XVII型胶原蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
进一步地，本发明构建表达重组XVII型胶原蛋白的菌株，为合成重组XVII型胶原蛋白1或重组XVII型胶原蛋白2的核苷酸序列，然后扩增并无缝克隆到pPIC9K空载体中，经菌落PCR和测序验证正确后富集重组质粒，酶切线性化后转化到毕赤酵母中，通过G418抗性梯度筛选获得的表达重组XVII型胶原蛋白1或重组XVII型胶原蛋白2的毕赤酵母基因工程菌。
更进一步地，本发明提供上述重组XVII型胶原蛋白的表达方法，具体为：将表达重组XVII型胶原蛋白1或重组XVII型胶原蛋白2的毕赤酵母基因工程菌接种在BMMY培养基中，30℃下经甲醇诱导表达72～120小时，收集上清，纯化得到重组XVII型胶原蛋白1或重组XVII型胶原蛋白2。
本发明通过筛选人源XVII型胶原蛋白中与细胞整合素结合的基础功能域，并将上述基础功能域进行特殊组合，构成重组XVII型胶原蛋白序列，并经密码子优化后扩增克隆到pPIC9K载体中，酶切线性化后转化到毕赤酵母细胞中，通过G418抗性梯度筛选高拷贝重组子从而获得能表达重组XVII型胶原蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株。本发明的重组XVII型胶原蛋白1和2能够显著增强人成纤维细胞和人毛囊干细胞增殖、迁移和黏附能力，且重组XVII型胶原蛋白2的效果优于重组XVII型胶原蛋白1。本发明的重组XVII型胶原蛋白可用于皮肤和毛囊组织的修复，提升皮肤和毛囊的抵抗力，适用于制备护发、护肤及相关医药领域应用的产品。
附图说明
图1为含重组XVII型胶原蛋白1的重组质粒示意图。
图2为含重组XVII型胶原蛋白2的重组质粒示意图。
图3为各质粒的核酸电泳图，其中泳道1：pPIC9K空载质粒线性化片段；泳道2：pPIC9K+重组XVII型胶原蛋白1质粒线性化片段；泳道3：pPIC9K+重组XVII型胶原蛋白2质粒线性化片段。
图4为高拷贝毕赤酵母基因工程菌XVII.1和XVII.2培养基上清(甲醇诱导72小时)的SDS-PAGE图，其中泳道1-泳道2：高拷贝菌株XVII.2上清SDS-PAGE，泳道3-泳道4：高拷贝菌株XVII.1上清SDS-PAGE。
图5为不同浓度的重组XVII人源胶原蛋白1、2和胎牛血清(BSA)对人毛囊干细胞的增殖影响图。
图6为不同浓度的重组XVII人源胶原蛋白1、2和BSA对人成纤维细胞的增殖影响图。
图7为不同浓度的重组XVII人源胶原蛋白1、2和BSA对人毛囊干细胞的迁移率影响图。
图8为不同浓度的重组XVII人源胶原蛋白1、2和BSA对人成纤维细胞的迁移率影响图。
图9为不同浓度的重组XVII人源胶原蛋白1、2和BSA对人毛囊干细胞的相对粘附性影响图。
图10为不同浓度的重组XVII人源胶原蛋白1、2和BSA对人成纤维细胞的相对粘附性影响图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，毕赤酵母(Pichia pastoris)采用GS115作为出发菌株。重组XVII型胶原蛋白1和2的表达载体以pPIC9K为整合载体，将委托上海擎科生物技术有限公司合成的SEQ ID No.13和SEQ ID No.14的核苷酸序列进行PCR扩增和纯化，并无缝克隆至pPIC9K上。
实施例1
高拷贝毕赤酵母基因工程菌的构建：
(1)利用生物信息学和蛋白结构预测工具(NCBI，Uniprot，AlphaFold)从人源XVII型胶原蛋白中筛选能与细胞整合素结合的5个基础功能域(氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示)，其中包含2个胞外域中的非胶原域和4个胞外域中的胶原域。
(2)将5个基础功能域按1-2-3-4的顺序排布得到氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的重组XVII型胶原蛋白1，按1-2-3-4-5的顺序排布得到氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的重组XVII型胶原蛋白2。
(3)将2个重组XVII型胶原蛋白的氨基酸序列以毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的重组XVII型胶原蛋白1的核苷酸序列，如SEQ ID No.13所示，和重组XVII型胶原蛋白2的核苷酸序列，如SEQ ID No.14所示。
(4)将重组XVII型胶原蛋白1和2的核苷酸序列委托上海擎科生物科技有限公司进行基因合成，用引物P1(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)和引物P2(核苷酸序列如SEQ IDNo.16所示)扩增SEQ ID No.13目标序列，用引物P1(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)和引物P3(核苷酸序列如SEQ ID No.17所示)扩增SEQ ID No.14目标序列，将高保真PCR扩增经核酸凝胶纯化后，利用Gibson assembly技术无缝克隆到pPIC9K质粒的α因子分泌信号肽下游，经菌落PCR和测序验证正确后富集重组质粒1(结构示意图如图1所示)和2(结构示意图如图2所示)，用SalI对重组质粒1和2酶切线性化后电转化到毕赤酵母感受态中，用YPD培养基对电转细胞进行2-3个小时的活化培养，随后涂布到YNB选择培养基中放置于30℃培养箱中倒置培养2-3天，待长出转化子，首先通过菌落PCR对转化子单克隆进行验证，将验证正确的转化子分别涂布到含1g/L、2g/L、3g/L和4g/L G418的筛选平板上，经2-4天培养后挑取在高浓度G418平板上长势较好的转化子进行纯化和复筛验证，对复筛得到的转化子进行基因组提取并验证正确后即甘油保种，得到表达重组XVII型胶原蛋白1的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株XVII.1和表达重组XVII型胶原蛋白2的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株XVII.2。图3为各质粒的核酸电泳图，其中泳道1：pPIC9K空载质粒线性化片段；泳道2：pPIC9K+重组XVII型胶原蛋白1质粒线性化片段；泳道3：pPIC9K+重组XVII型胶原蛋白2质粒线性化片段。
实施例2
高拷贝毕赤酵母基因工程菌株的发酵和重组XVII型胶原蛋白1和2的表达：
将高拷贝毕赤酵母基因工程菌株XVII.1和XVII.2接种于30mLBMGY培养基(该培养基由20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，10×YNB 100ml，10×磷酸钾缓冲液pH6.0100ml，10×甘油100ml组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养16-20小时，然后以初始OD600为1的接种量接种于30mL BMMY培养基(该培养基由20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，10×YNB100ml，10×磷酸钾缓冲液pH 6.0100ml组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)进行培养，每隔24小时补充300μL过滤除菌的甲醇，72小时取2mL样品离心收集上清，吸取500μL上清在尺寸为10kDa的超滤管中进行浓缩获得约50μL浓缩液，将24μL浓缩液和6μL 5×loadingbuffer混合均匀后置于沸水中处理10-15min，离心15min后吸取10-15μL上清上样到SDS-PAGE中，完成对重组XVII型胶原蛋白1和2的定性分析。SDS-PAGE检测的结果参见图4。图4中，泳道1-泳道2为高拷贝菌株XVII.2上清SDS-PAGE，泳道3-泳道4为高拷贝菌株XVII.1上清SDS-PAGE，从图中可以看出本发明获得了能成功表达重组XVII型胶原蛋白1和2的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株XVII.1和XVII.2。
实施例3
1.细胞增殖试验
采用MTT法，以人毛囊干细胞和人成纤维细胞为实验细胞，检测重组XVII型胶原蛋白1、2和BSA促进细胞增殖的能力。结果如图5和6所示，可以看出，重组XVII型胶原蛋白1、2相较于BSA表现出更为优异地促进细胞增殖能力，且重组XVII型胶原蛋白2促进细胞增殖能力最高。
2.细胞迁移试验
利用细胞划痕法测定细胞迁移运动，以人毛囊干细胞和人成纤维细胞为实验细胞，检测重组XVII型胶原蛋白1、2和BSA促进细胞迁移的能力。结果如图7和8所示，可以看出，重组XVII型胶原蛋白1、2相较于BSA表现出更为优异地促进细胞迁移能力，且重组XVII型胶原蛋白2促进细胞迁移能力最高。
3.细胞黏附试验
利用离心法，以人毛囊干细胞和人成纤维细胞为实验细胞，检测重组XVII型胶原蛋白1、2和BSA促进细胞粘附的能力。结果如图9和10所示，可以看出，重组XVII型胶原蛋白1、2相较于BSA表现出更为优异地促进细胞粘附能力，且重组XVII型胶原蛋白2促进细胞粘附能力最高。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1. 重组XVII型胶原蛋白，其特征在于，为由SEQ No.1、SEQ No.2、SEQ No.3和SEQ No.4的氨基酸序列按顺序组合所形成的氨基酸序列如SEQ No.6所示的重组XVII型胶原蛋白1，或由SEQ No.1、SEQ No.2、SEQ No.3、SEQ No.4和SEQ No.5的氨基酸序列按顺序组合所形成的氨基酸序列如SEQ No.7所示的重组XVII型胶原蛋白2。
2. 编码权利要求1所述的重组XVII型胶原蛋白的基因，其特征在于，编码重组XVII型胶原蛋白1的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，编码重组XVII型胶原蛋白2的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
3.表达权利要求1所述的重组XVII型胶原蛋白的菌株，其特征在于，合成权利要求1中所述的重组XVII型胶原蛋白1或重组XVII型胶原蛋白2的核苷酸序列，然后扩增并无缝克隆到pPIC9K空载体中，经菌落PCR和测序验证正确后富集重组质粒，酶切线性化后转化到毕赤酵母中，通过G418抗性梯度筛选获得的表达重组XVII型胶原蛋白1或重组XVII型胶原蛋白2的毕赤酵母基因工程菌。
4.重组XVII型胶原蛋白的表达方法，具体为：将权利要求3中所述的表达权利要求1所述的重组XVII型胶原蛋白1或重组XVII型胶原蛋白2的毕赤酵母基因工程菌接种在BMMY培养基中，30℃下经甲醇诱导表达72~120小时，收集上清，纯化得到重组XVII型胶原蛋白1或重组XVII型胶原蛋白2。
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