WO2007069666A1

WO2007069666A1 - 核初期化因子

Info

Publication number: WO2007069666A1
Application number: PCT/JP2006/324881
Authority: WO
Inventors: Shinya Yamanaka
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2006-12-06
Publication date: 2007-06-21
Also published as: DK1970446T3; EA014166B1; EP4223769A3; BRPI0619794B1; CN101356270A; IL191903A0; EP3418297A1; JP4411362B2; AU2006325975B2; EP2208786B1; JP5467223B2; AU2006325975A1; JP2014000083A; BRPI0619794B8; EP2206778B1; BRPI0619794A2; HK1125967A1; EP1970446A1; JP2009165478A; EA018039B1

Abstract

胚やES細胞を利用せずに分化細胞の初期化を誘導し、ES細胞と同様な多能性や増殖能を有する誘導多能性幹細胞を簡便かつ再現性よく樹立するための手段として、下記の3種の遺伝子：Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子の各遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が提供される。

Description

明紬書核初期化因子技術分野

本発明は、分化した体細胞を初期化して誘導多能性幹細胞を誘導する作用を有する核初期化因子に関するものである。背景技術

胚 ^:性幹細胞（ES 細胞）はヒトゃマウスの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を維持したまま長期にわたって培養することができるという特徴を有している。この性質を利用して七ト ES細胞はパーキンソン病、若年性糖尿病、白血病など多くの疾患に対する細胞移植療法の資源として期待されている。しかしながら、 ES 細胞の移植は臓器移植と同様に拒絶反応を惹起してしまうという問題がある。また、ヒト胚を破壊して樹立される ES 細胞の利用に対しては倫理的見地から反対意見も多い。患者自身の分化体細胞を利用して脱分化を誘導し、 ES 細胞に近い多能性や増殖能を有する細胞（この細胞を本明細書において「誘導多能性幹細胞」（iPS 細胞）と言うが、「胚性幹細胞様細胞」又は「ES 様細胞」と呼ばれる場合もある）を樹立することができれば、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として利用できるものと期待される。

体細胞核を初期化する方法として、例えば、体細胞の核を卵子に移植し作製したクローン胚から ES細胞を樹立する技術が報告されている（W. S. Hwang et al. , Science, 303, pp. 1669 - 74, 2004； W. S. Hwang et al. , Science, 308, pp. 1777-83, 2005 :ただし、これらの論文はいずれも捏造されたものであることが判明し、後日取り下げられた）。しかしながら、この技術は ES細胞を樹立する目的のためだけにク ΰ一ン胚を作製することから、不妊治療で生じる余剰胚を用いる通常の ES 細胞に比して倫理的問題がかえって大きい。また、体細胞と ES細胞とを融合させることにより体細胞核を初期化する技術が報告されている（M. Tada et al. , Curr. Biol. , 11 , pp. 1553-1558, 2001； C. A. Cowan et al. , Science, 309, pp. 1369-73, 2005)。しかしながら、この方法においても結局ヒト ES細胞を用いることになり倫理的問題の解決とはならないという問題がある。さらに、ヒ卜に発生した生殖細胞腫瘍由来細胞株の抽出液と分化細胞どを反応させることにより細胞核を初期化する技術が報告されている（C. K. Taranger et al. , Mol. Biol. Cel l, 16, pp. 5719-35, 2005 )。この方法は抽出液中のどの成分が初期化を誘導しているかが全く不明であり、技術の確実性や安全性に問題がある。

一方、分化した体細胞を初期化して誘導多能性幹細胞を誘導する作用を有する核初期化因子をスクリーニングする方法が提案されている（国際公開 W0 2005/80598)。この方法は ECAT遺伝子（ES細胞で特異的に発現する遺伝子群： ES cel l associated transcript) の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマ一力一遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と被検物質とを接触させ、マ一力一遺伝子発現細胞の出現の有無を調べて該細胞を出現させた被検物質を体細胞の核初期化因子の候補として選択する工程を含んでいる。また、この刊行物の実施例 6などには体細胞を初期化する方法が示されている。しかしながら、上記刊行物には、核初期化因子を実際に同定したとの報告はない。

特許文献 1 国際公開 W0 2005/80598 発明の開示

本発明の課題は核初期化因子を提供することにある。より具体的には、本発明の課題は、卵子、胚ゃ ES細胞を利用せずに分化細胞の初期化を誘導し、 ES細胞と同様な多能性や増殖能を有する誘導多能性幹細胞を簡便かつ再現性よく樹立するための手段を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すベく鋭意研究を行い、国際公開 W0 2005/80598 に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を用いて核初期化因子の同定を試みた。その結果、核初期化に関連する遺伝子として 24種類の候補遺伝子を見出し、それらのうち 3種類の遺伝子が核初期化に必須の遺伝子であることを確認した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。

すなわち、本発明により、体細胞の核初期化因子であって、下記の 3種類の遣伝子： Octファミリ一遺伝子、 Klf ファミリ一遺伝子、及び Mycファミリ一遺伝子の各遺伝子産物を含む因子が提供される。この発明の好ましい態様によれば、下記の 3種の遺伝子： 0ct3/4、 Klf4、及び c-Mycの各遺伝子産物を含む上記の因子が提供される。 '

また、別の好ましい態様によれば、下記の遺伝子： Sox フアミリー遺伝子の遣伝子產物をさらに含む上記の因子も提供され、より好ましい態様として Sox2の遺伝子産物を含む上記の因子が提供される。

さらに別の好ましい態様によれば、 Mycフアミリー遺伝子の遺伝子産物とともに、あるいは Myc フアミリー遺伝子の遺伝子産物に換えてサイトカインを含む上記の因子が提供され、より好ましい態様としてサイ卜力インが basic fibroblast growth factor (bFGF)及び/又は Stem Cel l Factor (SCF) である上記の因子が提供される。

特に好ましい態様によれば、 Octファミリー遺伝子、 Klf ファミリー遺伝子、 Myc フアミリー遺伝子、及び Soxフアミリー遺伝子の各遺伝子産物に加えて、 TERT遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びに Octファミリー遺伝子、 Klf フアミリー遺伝子、 Mycファミリ一遺伝子、 Soxフアミリー遺伝子、及び TERT 遺伝子の各遺伝子産物に加えて、下記の遺伝子： SV40 Large T ant igen, HPV16 E6、 HPV16 E7、及び Bmi lからなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子の遺伝子産物を含む因子が提供される。

これらの因子に加えて、下記の群： Fbx l5、 Nanog、 E as, ECAT15_2、 Tel l , 及び) 3 -cateninからなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子の遺伝子産物をさらに含む上記の因子が提供される。

また、上記発明の別の好ましい態様によれば、下記の群： ECAT1、 Esgl、 Dnmt3し、 ECAT8、 Gdf3、 Soxl5、 ECAT15- 1、 Fthll7、 Sall4、 Rexl、 UTF1、 Stel la, Stat3、及び Grb2からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子の遺伝子産物をさらに含む上記の因子も提供される。

別の観点からは、本発明により、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法であって、体細胞に上記の核初期化因子を接触させる工程を含む方法が提供される。

この発明の好ましい態様によれば、体細胞の培養物中に上記の核初期化因子を添加する工程を含む上記の方法；体細胞に上記の核初期化因子をユードする遺伝子を導入する工程を含む上記の方法；上記の核初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも 1種以上含む組換えベクターを用いて体細胞に該遺伝子を導入するェ程を含む上記の方法；及び体細胞として患者から採取した体細胞を用いる上記の方法が提供される。

さらに別の観点からは、本発明により、上記の方法により得られた誘導多能性幹細胞が提供される。また、上記の誘導多能性幹細胞から分化誘導された体細胞も本発明により提供される。

さらに本発明により、幹細胞療法であって、患者から分離採取した体細胞を用いて上記の方法により得られた誘導多能性幹細胞を分化誘導して得られる体細胞を該患者に移植する工程を含む療法が提供される。

さらに本発明により、上記の方法により得られた誘導多能性幹細胞を分化誘導して得られる各種細胞を用いて、化合物、薬剤、毒物などの生理作用や毒性を評価する方法が提供される。

また、本発明により、細胞の分化能及び又は増殖能を改善する方法であって、細胞に対して上記の核初期化因子を接触させる工程を含む方法、並びに上記方法により得られた細胞及び上記方法により得られた細胞から分化誘導された体細胞が提供される。

本発明により提供された核初期化因子を用いることにより、胚ゃ ES細胞を利用せずに簡便かつ再現性よく分化細胞核の初期化を誘導することができ、 ES細胞と同様の分化及び多能性や増殖能を有する未分化細胞である誘導多能性幹細胞を樹立することができる。例えば、本発明の核初期化因子を用いて患者自身の体細胞から高い増殖能及び分化多能性を有する誘導多能性幹細胞を作製することができ、この細胞を分化させることにより得られる細胞（例えば心筋細胞、インスリン産生細胞、又は神経細胞など）は、心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病や脊髄損傷など多用な疾患に対する幹細胞移植療法に利用することができ、ヒト胚を用いる倫理的問題や移植後の拒絶反応を回避できるので極めて有用である。また誘導多能性幹細胞を分化させてできる各種細胞（例えば心筋細胞、肝細胞など）は化合物、薬剤、毒物などの薬効や毒性を評価するためのシステムとして極めて有用である。図面の簡単な説明

図 1は、 Fbxl5遺伝子に 3 geoをノックインしたマウスの胎児線維芽細胞（MEF) を用いた初期化因子のスクリーニング方法を示した図である。

図 2は、表 1に示す 24遺伝子の導入により得られた iPS細胞の形態を示した写真である。対照として分化細胞（MEF) 及び正常な胚性幹細胞（ES) の形態も示した。 ' ■

図 3は、 iPS細胞におけるマーカー遺伝子の発現を示した図である。 iPS細胞、 ES細胞、及び MEF細胞から抽出したトータノレ RNAを铸型にして RT - PCRを行った結果を示した。

図 4は、 iPS細胞における DNAメチル化状態を示した図である。 iPS細胞、 ES細胞、及び MEF細胞から抽出したゲノム DNA をバイサルファイト処理し、目的 DNA を PCR増幅後、プラスミドに挿入した。各遺伝子ごとに 10クローンのプラスミドを単離し、シークェンスを決定した。メチル化 CpGは黒丸で、非メチル化 CpGは白丸で示した。

図 5は、 24遺伝子群、及び 24遺伝子群から 1遺伝子ずつ除外した 23遺伝子群の導入により得られた G418 細胞のコロニー数を示した図である。グラフ下側は G418選択後 1週間で得られたコロニー数を示し、グラフ上側は 3週間で得られたクローン数を示す。四角で囲んだ遺伝子（遺伝子の番号は表 1に示したものと同一である）を除外した場合、コロニーは全く得られないか、 3週間後に少数のみ認められた。

図 6は、 10遺伝子群、及び 10遺伝子群から 1遺伝子ずつ除外した 9遺伝子群の導入により得られた G418細胞のコロニー数を示した図である。 #14、 #15、又は #20 の各遺伝子を除外した場合にはコロニーは一つも得られなかった。 #22の遺伝子を除外した場合には少数の G418耐性コロニーが得られたが、細胞は分化した形態を示しており明らかに iPS細胞とは異なっていた。

図 7は、 10遺伝子群、 4遺伝子群、 3遺伝子群、又ほ 2遺伝子群による G418耐性コロニー（初期化コロニー）め出現数を示した図である。各コロニーの代表的な形態を大きさを示す。

図 8は、 MEF由来の iPS細胞をヌードマウス皮下に移植し形成された腫瘍をへマトキシリンェォジン（H & E)染色した結果を示した写真である。三胚葉系の各種組織への分化が認められる。

図 9は、，成体皮膚線維芽細胞に由来する iPS細胞をマウス胚盤胞に移植し、偽妊娠マウスの子宮に移植することにより作製した胎児を示した写真である。上図、左側の胎児において、 iPS 細胞に由来する細胞（緑色蛍光を発する）、全身に分布していることがわかる。下図では、同胎児の心臓、肝臓、脊髄のほぼすベての細胞が GFP陽性であり、 iPS細胞に由来することがわかる。 .

図 1 0は、 ES細胞マーカー遺伝子の発現を RT- PCRで確認した結果を示した写真である。図中、 Sox2 minusは MEFに 3遺伝子を導入し樹立された iPS細胞を、 4ECATは MEFに 4遺伝子を導入し樹立した iPS細胞を、 10ECATは MEFに 10遺伝子を導入し樹立した iPS細胞を、 10ECAT Skin fibroblastは、皮膚線維芽細胞に 10 遺伝子を導入し樹立した iPS細胞を、 ES細胞はマウス ES細胞を、そして MEFは遺伝子導入を行っていない MEF細胞を示す。その下の番号はクローン番号を示す。図 1 1は、 MEFからの iPS細胞樹立における bFGFの効果を示した図である。通常のフィーダ一細胞（ST0細胞）（左）及び bFGF発現ベクターを導入した ST0細胞（右）上で培養した Fbxl5^{3 ee}°^{/ S 8e}°マウス由来の MEFに、 4因子（上段）又は c- Myc 以外の 3因子（下段）をレトロウイルスにて導入した。 2週間、 G418による選択を行い、クリスタルブルーで染色後、写真撮影を行った。数字はコロニー数を表す。

図 1 2は、 Nanog-EGFP-IRES- Puroマウスを用いた実験について説明した図である。 A. マウス Nanog遺伝子を中央に含む大腸菌人工染色体（BAC)を単離し、 Nanog のコードリング領域の上流に EGFP-IRES-Puro カセットをリコンビニアリングにより挿入した。 B. 改変 BACからトランスジエニックマウスを作製した。 GFPの発現は胚盤胞の內部細胞塊や、生殖腺に限局して認められた。

図 1 3は、 Nanog-EGFP-IRES-Puroマウスを用いた実験について説明した図である。 Nanog-EGFP- IRES-Puroマウスの胎児 (受精後 13. 5 日）から、頭部、内臓、及び生殖腺を除去し、 MEF を樹立した。セルソーターによる解析の結果、 Nanog-EGFP-IRES- Puroマウス由来の MEF (Nanog)においても、 Fbxl5 ^e。^{/ 0 se}。マウス由来の MEF (Fbxl5)や野生型マウス由来の MEF (Wild)と同様に、 GFP陽性細胞はほとんど存在しなかった。

図 1 4は、 Nanog-EGFP-IRES-Puro マウス MEF (左）及び Fbxl5 ^e。^{/ /! se}。マウス MEF (右）から樹立した iPS細胞の写真である。それぞれピュー口マイシン及び G418 で選択した。

図 1 5 は、 iPS 細胞の増殖の結果を示した図である。 ES 細胞、 Nanog- EGFP-IRES-Puroマウス MEF (左）由来の iPS細胞（Nanog iPS) 及び Fbxl5 e。/ 。。マウス由来の ips細胞（Fbx iPS)をそれぞれ 10万個ずつ 24ゥヱルプレートにまき、 3 日ごとに継代し、細胞数を測定した結果を示した。数字は倍加時間の平均を表す。

図 1 6は、 iPS 細胞の遺伝子発現を示した図である。 MEF、 ES 細胞、 Nanog-EGFP_IRES-Puroマウス MEF (左）由来の iPS細胞（Nanog iPS) 及び Fbxl5 e。マウス _MEF 由来の _{i PS}細胞（Fbx iPS)におけるマーカー遺伝子の発現を RT-PCRにて解析した。下の数字は、継代数を表す。

図 1 7は、 Nanog iPS細胞からの奇形腫形成を示した図である。 100万個の ES 細胞又は Nanog iPS細胞をヌードマウスの背部に皮下注射し、 3週間後にできた腫瘍の外観（左）及び組織像（右、 H&E染色）を示す。

図 1 8は、 Nanog iPS細胞からのキメラマウスの作成を示した図である。 Nanog iPS細胞（クローン NPMF4EK- 24、継代数 6 ) を胚盤胞に移植し、誕生したキメラマウス。 90個の移植胚から 4匹のキメラマウスが誕生した。

図 1 9は、 Nanog iPS 細胞からのジャームライントランスミツションを示した図である。図 1 8に示すキメラマウスと C57BL/6マウスの交配により誕生したマウスをゲノム DNAを PCR解析したところ、すべてのマウスにおいて 0ct3/4と Klf4 の卜ランスジーンが存在していたことから、ジャームライントランスミッションが確認された。 ,

図 2 0は、 iPS 細胞からの神経細胞分化誘導を示した図である。皮膚線維芽細胞由来 iPS細胞から in vitroで分化させた神経細胞（上、 II Iチュプリン陽性）、オリゴデンドロサイト（左、 04陽性)、ァストロサイ卜（右、 GFAP陽性）を示す。図 2 1は、薬剤選択を用いない iPS細胞の樹立について説明した図である。 MEF を 10cmディッシュあたり 1万から 10万個まき、 4因子をレトロウイルスで導入した。コントロール（Mock)ではコロニーは生じなかったが（左）、 4因子を導入したディッシュでは扁平な形質転換コロニーに加えて、盛り上がった iPS細胞に類似したコロニーが得られた（中央）。これらを継代培養すると、 iPS 細胞に類似した細胞が得られた（右）。

図 2 2は、薬剤選択無しで樹立した細胞の遺伝子発現を示した図である。図 2 1に示す樹立した細胞から RNAを抽出し、 ES細胞マーカ一遺伝子の発現を、 RT- PCR にて解析した。

図 2 3は、ヒト線維芽細胞由来の iPS細胞様細胞を示した図である。ヒト胎児由来線維芽細胞に 4因子のヒト相同遺伝子をレトロウイルスで導入し、得られたコロニー（左）、及び 2回継代後の細胞（右）を示す。図 2 4は、ヒト成体皮膚線維芽細胞からの iPS細胞の樹立を示した図である。マウスレトロウィルス受容体をレンチウィルスで感染させたヒ卜成体皮膚線維芽細胞に、左段に示した因子をレトロウイルスで導入した。写真はウィルス感染後 8日目の位相差像（対物 X 1 0 ) を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の核初期化因子は、下記の 3種類の遺伝子： Octファミリ一遺伝子、 lf フアミリー遺伝子、及び Mycフアミリー遺伝子の各遺伝子産物を含むことを特徴としており、好ましい態様では、上記の 3種の遺伝子に加えて Soxファミリー遺伝子の遺伝子産物を含むことを特徴としている。

本発明の核初期化因子を確認する手段としては、例えば、国際公開 W0 2005/80598 に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を利用ずることができる。上記刊行物の全ての開示を参照により本明細書の開示に含める。当業者は上記刊行物を参照することにより核初期化因子をスクリ一二ングし、本発明の初期化因子の存在及び作用を確認することができる。

例えば、初期化現象を容易に観察する実験系として Fbx l5遺伝子座に /3 geo (ベ —タガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子）をノックインしたマウスを利用することができる。その詳細を本明細書の実施例に示した。マウス Fbx l5遺伝子は ES細胞や初期胚などの分化多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。マウス Fbx l5遺伝子に 0 geoをノックインし、 Fbxl5の機能を欠失したホモ変異マウスでは、通常、分化多能性や発生を含めて異常な表現型は観察されない。このマウスにおいては、 /3 geoが Fbxl5遺伝子のェンハンサーゃプロモ一ターにより発現制御されており、分化した体細胞では 3 geoは発現せず、 G418に感受性を示す。一方、 /3 geoをノックインしたホモ変異 ES細胞は極めて高濃度（12 mg/ml以上）の G418に耐性を示す。この現象を利用し、体細胞の初期化を可視化する実験系を構築することができる。

上記実験系を利用して、まず /3 geoをノックインしたホモ変異マウスの胎児（受精後 13. 5日）から線維芽細胞（Fb_X15 ^^e。^{/ 0 se}°の WEF) を単離することができる。 MEF は Fbx l5遺伝子を発現しないため、 ^ geoも発現せず、 G418に感受性を示す。ところが、この MEFと遺伝子操作を加えていない ES細胞（やはり G418に感受性を示す）を融合させると、 MEFの核が初期化する結果、 /3 _ge0が発現して G418耐性となる。従って、この実験系を利用することにより、初期化現象を G418耐性に置き換えて可視化できる。

上記の実験系を用いて核初期化因子を選択することができる。核初期化因子に関連する遺伝子の候補として、 ES細胞で特異的な発現を示す遺伝子及び ES細胞の分化多能性維持における重要な役割が示唆される遺伝子を複数選択し、それらの候補遺伝子が単独で、あるいは適宜組み合わせることにより核初期を惹起するか否かを確認することができる。例えば、選択された 1次候補遺伝子を全て組み合わせることにより分化細胞を ES細胞に近い状態に初期化誘導できることを確認した後、その組み合わせのなかから 1 個ずつの遺伝子を除いた組み合わせを用意して同様の作用を確認し、その遺伝子が存在しない場合に初期化誘導能が減弱し、あるいは初期化誘導能が失われる 2次候補遺伝子を選択することができる。そのようにして選択された 2次候補遺伝子について同様のステップを繰り返すことにより、必須の核初期化遺伝子の組み合わせを選択することができ、 Octフアミリー遺伝子、 Klf ファミリ一遺伝子、及び Mycファミリ一遺伝子の 3種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせが核初期化因子として作用することを確認することができ、さらにこれらの 3 種類の遺伝子の遺伝子産物に加えて Sox ファミリー遺伝子の遺伝子産物を組み合わせが核初期化因子として極めて優れた性質を有することを確認することができる。核初期化因子の選択方法の具体例は本明細書の実施例に具体的に示されており、当業者は上記の一般的説明及び実施例の具体的説明を参照することにより、これら 3種の遺伝子の組み合わせが体細胞の初期化を誘導すること、及びこれら 3種の遺伝子産物の組み合わせが核初期化に必須であることを容易に確認することができる。

本発明により提供される核初期化因子は、少なくとも Octファミリー遺伝子、 Klf ファミリ一遺伝子、及び Mycフアミリ一遺伝子の遺伝子産物の組合せを含み、例えば 0ct3/4、 Klf4、及び c-Mycの 3種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含む。 Octファミリー遺伝子としては、例えば、 0ct3/4、 Oct lA, 及び 0ct6などを挙げることができる。 0ct3/4は P0Uフアミリーに属する転写因子であり、未分化マーカ一として報告されている（K. Okamoto et al. , Cel l, 60, ρρ461_72, 1990)。また、 0ct3/4は多能性維持に関与しているとの報告もある（J. Nichols et al. , Cell, 95, pp379- 91 , 1998)。 Klf フアミリー遺伝子としては、 Klf l、 Klf2、 Klf4、及び Klf5 などを挙げることができる。 Klf4 (Kruppel l ike factor-4) は腫瘍抑制因子として報告されている（A. M. Ghaleb et al. , Cel l Res. , 15, pp92_6, 2005)。 Myc ファミリ一遺伝子としては、 c-Myc, N-Myc、及び L_Mycなどを挙げることができる。 c-Myc は細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子であり（S. Adhikary, M. Ei lers, Nat. Rev. ol. Cel l Biol. , 6, pp635-45, 2005)、多能性維持に関与しているとの報告がある（P. Cartwright et al. , Development, 132, pp885- 96, 2005)。 0ct3/4、 Klf 4、及び c-Myc以外の各ファミリ一遺伝子の NCB1ァセッション番号は以下のとおりである。

マウスヒ卜

これらの遺伝子はいずれもヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において上記遺伝子産物を利用するためには、任意の哺乳類動物由来（例えばマウス、ラット、ゥシ、ヒッジ、ゥマ、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることが可能である。また、野生型の遺伝子産物のほか、数個（例えば 1〜10個、好ましくは 1 ~6個、より好ましくは 1〜4個、さらに好ましくは 1 〜3個、特に好ましくは 1又は 2個）のアミノ酸が置換、挿入、及び Z又は欠失した変異遺伝子産物であって、野生型の遺伝子産物と同様の機能を有する遺伝子産物も利用可能である。例えば、 c-Myc の遺伝子産物としては野生型のほか安定型 (T58A)などを用いてもよい。他の遺伝子産物についても同様である。本発明の核初期化因子は、上記の 3種の遺伝子産物のほか、他の遺伝子産物を含むことができる。そのような遺伝子産物として、 Soxファミリー遺伝子の遺伝子産物を挙げることができる。 Sox ファミリー遺伝子としては、例えば、 Sox l、 Sox3、 Sox7、 Sox l5、 Sox l 7、及び Sox l8、好ましくは Sox2を挙げることができる。少なくとも Octフアミリー遺伝子（例えば 0ct3/4)、Klf フアミリー遺伝子（例えば K l f4)、 Mycフアミリー遺伝子（例えば c- Myc：)、及び Soxフアミリー遺伝子（例えば Sox2) の 4 種の遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含む核初期化因子は初期化の効率の観点から本発明の好ましい態様であり、特に万能性の獲得のために Soxファミリー遺伝子の遺伝子産物を組み合わせることが好ましい場合がある。 Sox2は初期発生過程で発現し、転写因子をコードする遺伝子である（A. A. Av i l ion et al. , Genes Dev. , 17, pp 126-40, 2003)。 Sox2以外の Soxファミリ一遣伝子の NCBIァセッシヨン番号は以下のとおりである。 ' 表 2

マウスヒト

また、 Mycフアミリー遺伝子の遺伝子産物はサイトカインで置き換えることができる場合がある。サイトカインとしては、例えば、 SCF又は bFGFなどが好ましいが、これらに限定されることはない。

さらに好ましい態様として、上記の 3 種類の遺伝子産物、好ましくは上記の 4 種類の遺伝子産物に加えて、細胞の不死化を誘導する因子をあげることができる。たとえば、 TERT遺伝子の遺伝子産物を含む因子と、下記の遺伝子： SV40 Large T antigen, HPV 16 E6、 HPV 16 E7、及び Bmi lからなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子の遺伝子産物を含む因子を、組み合わせることを挙げることができる。 TERT は DNA複製時における染色体末端テロメァ構造維持のために必須であり、ヒ卜では幹細胞や腫瘍細胞では発現するが、多くの体細胞においては発現が認められない (I. Horikawa, et al.， Proc Natl Acad Sci USA. 102, ppl8437 - 442， 2005)。 SV40 Large T ant igen, HPV16 E6、 HPV16 E7、または Brai lは、 Large T ant igen と組み合わせることにより、ヒト体細胞の不死化をもたらすことが報告されている (S. Akiraov et al. , Stem Cel l s, 23, ppl423-1433, 2005； P. Sa lmon et al. , Mol. Ther. , 2, pp404 - 414, 2000)。これらの因子は、特にヒド細胞がら iPS細胞を誘導する場合において極めて有用である。 TERTおよび Brai l遺伝子の NCBIァセッシヨン番号は以下のとおりである。表 3

マウスヒト

さらに、下記の群： Fbx l5、 Nanog、 ERas、 ECAT15_2、 Tel l、及び /? - catenin からなる群から選ばれる遺伝子のうちの 1種又は 2種以上を遺伝子産物を組み合わせてもよレ、。初期化の効率の観点から特に好ましい態様として、 Fb_X15、Nari₀g、ERas、 ECAT15- 2、 Tcl l、及び j3 _cateninの遺伝子産物を上記 4種類の遺伝子産物と組み合わせた合計 10 種類の遺伝子産物を含む核初期化因子を挙げることができる。 Fbx l5 (Y. Tokuzawa et al. , Mol Cel l Biol.， 23, pp2699-708 , 2003)、 Nanog (K. Mi tsui et al. , Cel l, 1 13， pp63ト 42, 2003)、 ERas (K. Takahashi, K. Mi tsui, S. Yamanaka, Nature, 423, pp541-5, 2003)、及び ECAT15 - 2 (A. Bortv in et al. , Development, 130, ppl673_80, 2003) は ES 細胞特異的発現遺伝子であり、 Tel l ほ Aktの活性化に関与しており (A. Bortvin et al. , Development, 130, ρρ1673_80, 2003)、 β -cateninは Wntシグナル伝達経路の重要な構成因子であり、多能性維持に関与しているとの報告もある（N. Sato et al, Nat. Med. , 10, pp55- 63， 2004) ₀ さらに、本発明の核初期化因子は、例えば、下記の群： ECAT1、 Esgl、 Dnmt3し、 ECAT8、 Gdf3、 Soxl5、 ECAT15- 1、 Fthl l7、 Sal l4、 Rexl、 UTF1、 Stel la, Stat3、及び Grb2からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子の遺伝子産物を含んでいてもよい。 ECAT1、 Esgl、 ECAT8、 Gdf3、及び ECAT15- 1は ES細胞特異的発現遺伝子であり (K. Mi tsui et al. , Cel l , 1 13, ρρ631-42, 2003)、 Dnmt3Lは DNAメチル化酵素関連囟子であり、 Sox l5は初期発生過程で発現し転写因子をコードする一群の遺伝子である（M. Maruyama et al. , J Biol Chem. , 280, pp24371 - 9， 2005)。 Fthl l7 は Ferri tin heavy polypept ide - l ike 17をコードしており (A. colLoriot, T. Boon, C. De Smet, Int J Cancer, 105, pp371 - 6, 2003)、 Sal l4 'は胚性幹細胞で高発現する Znフィンガータンパク質をコードしており (J. Kohlhase et al. , Cytogenet Genome Res. , 98, pp274- 7, 2002)、 Rex l は 0ct3/4 の下流にある転写因子をコードしており (Ε· Ben-Shushan, J. R. Thompson, L. J. Gudas, Y. Bergman, Mol Cel l Biol. , 18, ppl866- 78, 1998)。 UTF1 は 0ct3/4 の下流に位置する転写補助因子であり、これを抑制すると ES細胞の増殖を抑制するとの報告がある（A. Okuda et al. , EMBO J.， 17, pp2019-32, 1998)。 Stat3は細胞增殖 .分化のシグナル因子であり、 Stat3 の活性化により LIF が働き、多能性維持に重要な役割を果たしている（H. Niwa, T. Burdon, I. Chambers, A. Smith, Genes Dev. , 12, pp2048 - 60, 1998) ₀ Grb2は細胞膜に存在するさまざまな成長因子受容体と Ras/MAPKカスケ一ドとの間を仲介するタンパク質をコードしている（A. M. Cheng et al. , Cel l, 95, pp 793-803, 1998) ₀

もっとも、本発明の核初期化因子に含むことができる遺伝子産物は上記に具体的に説明した遺伝子の遺伝子産物に限定されることはない。本発明の核初期化因子には、核初期化因子として機能することができる他の遺伝子産物のほか、分化、発生、又は増殖などに関係する因子あるいはその他の生理活性を有する因子を 1 又は 2 以上含むことができ、そのような態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。核初期化因子として機能することができる他の遺伝子産物は、例えば、 0ct3/4、 Klf4、及び c-Mycの 3種の遺伝子のうち 1種又は 2種のみを発現させた体細胞を用い、この細胞に対して核初期化を誘導することができる遺伝子産物をスクリーニングすることによって特定することができる。本発明により、新たな核初期化因子のスクリーユング方法として上記のスクリーニング方法も提供される。また、本発明の核初期化因子に含まれる遺伝子産物は、例えば上記遺伝子から産生されるタンパク質自体のほか、該タンパク質とその他のタンパク質又はべプチドなどとの融合遺伝子産物の形態であってもよレ、。例えば、緑色蛍光タンパク質 (GFP) との融合タンパク質やヒスチジンタグなどのべプチドとの融合遺伝子産物を用レ、ることもできる。また、 HIVウィルスに由来する TATペプチドとの融合タンパク質を調製して用いることにより、細胞膜からの核初期化因子の細胞内取り込みを促進させることができ、遺伝子導入などの煩雑な操作を回避して、融合タンパク質を培地に添加するだけで初期化を誘導することが可能になる。このような融合遺伝子産物の調製方法は当業者によく知られているので、当業者は目的に応じて適宜の融合遺伝子産物を容易に設計して調製することが可能である。

本発明の核初期化因子を用いて体細胞の核を初期化して誘導多能性幹細胞を得ることができる。本明細書において「誘導多能性幹細胞」と.は ES細胞に近い性質を有する細胞のことであり、より具体的には、未分化細胞であって多能性及び増殖能を有する細胞を包含するが、この用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。核初期化因子を用いて誘導多能性幹細胞を調製する方法については国際公開 W02005/80598に説明されており（上記公報においては ES様細胞という用語が用いられている）、誘導多能性幹細胞の分離手段についても具体的に説明されている。従って、当業者は上記刊行物を参照することにより、本発明の核初期化因子を用いて誘導多能性幹細胞を容易に調製することが可能である。本発明の核初期化因子を用いて体細胞から誘導多能性幹細胞を調製する方法は特に限定されず、体細胞及び誘導多能性幹細胞が増殖可能な環境において核初期化因子が体細胞と接触可能であれば、いかなる方法を採用してもよい。例えば、本発明の核初期化因子に含まれる遺伝子産物を培地中に添加してもよく、あるいは本発明の核初期化因子を発現可能な遺伝子を含むベクターを用いて該遺伝子を体細胞に導入するなどの手段を採用してもよい。このようなベクターを用いる場合には、ベクターに 2 種以上の遺伝子を組み込んでそれぞれの遺伝子産物を体細胞において同時に発現させてもょレ、。初期化すべき体細胞において本発明の核初期化因子に含まれる遺伝子産物の 1種又は 2種以上がすでに発現されている場合には、本発明の核ネ刀期化因子から該遺伝子産物を除くこともできるが、このような態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。

本発明の核初期化因子を用いて誘導多能性幹細胞を調製するにあたり、初期化すべき体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成熟した体細胞を用いてもよい。誘導多能性幹細胞を疾病の治療に用いる場合には、患者から分離した体細胞を用いるこどがましく、例えば、疾病に関与する体細胞や疾病治療に関与する体細胞などを用いることができる。本発明の方法により培地中に出現した誘導多能性幹細胞を選択する方法も特に限定されず、例えば、マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子などを用いて薬剤耐性を指標として誘導多能性幹細胞を分離するなどの周知の手段を適宜採用できる。 ES 細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地又はその性質を維持することができない培地は当業界で種々知られており、適宜の培地を組み合わせて用いることにより、誘導多能性幹細胞を効率よく分離することができる。分離された誘導多能性幹細胞の分化能及び増殖能は ES細胞について汎用されている確認手段を利用することにより当業者が容易に確認可能である。

本発明の方法により調製される誘導多能性幹細胞の用途は特に限定されず、 ES 細胞を利用して行われているあらゆる試験 ·研究や ES細胞を用いた疾病の治療などに使用することができる。例えば、本発明の方法により得られた誘導多能性幹細胞をレチノイン酸、 EGFなどの増殖因子、又はダルココルチコィドなどで処理することにより、所望の分化細胞（例えば神経細胞、心筋細胞、血球細胞など）を誘導することができ、そのようにして得られた分化細胞を患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。もっとも、本発明の誘導多能性幹細胞の用途は上記の特定の態様に限定されることはない。

実施例

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

例 1 ：初期化因子の選択

.初期化因子を同定するためには初期化現象を容易に観察する実験系が必要である。実験系として Fbxl5遺伝子座に i3 geo (ベータガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子）をノックインしたマウスを利用した。マウス Fbxl5 遺伝子は ES細胞や初期胚といった分化多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。しかしマウス Fbxl5遺伝子に i3 geoをノックインし、 Fbxl5の機能を欠失したホモ変異マウスにおいては、分化多能性や発生を含めて異常な表現型は観察されなかった。このマウスにおいては、 geoが Fbxl5遺伝子のェンハンサーゃプ口モーターにより発現制御される。すなわち、分化した体細胞では ]3 _geoは発現せず、 G418に感受性を示す。一方、 /3 geoをノックインしたホモ変異 ES細胞は極めて高濃度（12 mg/ml以上）の G418に耐性を示す。この現象を利用し、体細胞の初期化を可視化する実験系を構築した。

上記実験系において、まず /3 geoをノックインしたホモ変異マウスの胎児（受精後 13. 5日）から線維芽細胞ヒ乂15^°^/^°の\¾ ) を単離した。 EFは Fbxl5遺伝子を発現しないため、 3 geo も発現せず、 G418 に感受性を示す。一方、この MEF と遺伝子操作を加えていない ES細胞（やはり G418に感受性を示す）を融合させると、 MEFの核が初期化する結果、）3 ge₀が発現して G418耐性となる。すなわち、この実験系により初期化現象を G418 耐性に置き換えて可視化できる（国際公開 W0 2005/80598)。上記実験系を用いて初期化因子の探索を行ない（図 1 )、初期化因子の候補として ES細胞で特異的な発現を示す遣伝子、及び ES細胞の分化多能性維持における重要な役割が示唆される遺伝子を合計 24種類選択した。これらの遺伝子を下記の表 4及び表 5に示す。なお #21の j3 -eaten in及び #22の c_Mycに関しては活性型の変異体（catenin : S33Y， c- Myc : T58A) を用いた。表 4

表 4 (続き)

表 5

NCBI accession number

き)

表 5 (続き)

これらの遺伝子の cDNAをレトロウィルスベクター p X-gwに Gatewayテクノロジ一により挿入した。まず 24遺伝子を一つずつ Fbxl5^{0 se}° ^ee。の MEFに感染させ、その後、 ES細胞培養条件で G418選択を行った。しかし G418耐性コロニーは一つも得られなかった。次に、全 24遺伝子のレトロウィルスを同時に Fbxl5^{e sc}。^{/ e}。のMEF に感染させた。 ES細胞培養条件で G418選択を行ったところ、複数の薬剤耐性コロニーが得られた。これらのコロニーを単離し培養を継続した。これらの細胞は長期間にわたって培養が可能であり、また E S細胞に類似した形態を示すことが分かつた（図 2 )。図中、 iPS 細胞は誘導多能性幹細胞（ES 様細胞、 ES-l ike 細胞、 ESL 細胞とも呼ぶ）、 ESは胚性幹細胞を示し、 MEFは分化細胞（胎児線維芽細胞）を示す。

マーカー遺伝子の発現を RT-PCRにより検討したが、 Nanog、 0ct3/4などの未分化マーカーが発現していた（図 3 )。 Nanogの発現は ES細胞に近いが、 0ct3/4の発現は ES細胞より低いことがわかった。また、 DNA メチル化状態をバイサルフアイトシクエンス法で確認したが、 Nanog遺伝子や Fbx 15遺伝子は MEFにおいて高メチル化状態にあるが、 iPS 細胞においては脱メチル化されていることがわかった (図 4 )。インプリンティング遺伝子である IGF2遺伝午は EFと iPS '細胞の両者で約 50%がメチル化されていた。 Fbxl5^58e。^{/ S se}。の MEFを採取した受精後 13. 5日の始原生殖細胞においてはインプリンティング記憶が消去され IGF2遺伝子はほぼ完全に脱メチル化されていることが知られているので、 iPS細胞は 1«15 。° ⁶°の\¾ に混入してレ、た始原生殖細胞に由来するものではないと結論された。以上の'結果より、 24種類の因子の組み合わせにより、分化細胞（MEF)を ES細胞に近い状態に初期ィ匕誘導できることが示された。

次に、 24 種類の遺伝子の全てが初期化のために必要であるか否かを検討した。

1遺伝子ずつ除外した 23遺伝子を 1> 15 ^(!°^/^°の £ に感染させた。その結果、 10 遺伝子については、' それを除外した時に、コロニーの形成が阻害されることがわかった（図 5 ：遺伝子の番号は表 4に示した遺伝子の番号に対応しており、 #3、 #4、 #5、 #11、 #14、 #15、 #18、 #20、 #21、及び #22の 10種類の遺伝子である）。これらの 10遺伝子を同時に Fbx 15 ^{β eeo/ e}。の MEFに感染させたところ、 24遺伝子を同時に感染させた場合に比して有意に効率よく G418耐性コロニーが得られた。

さらに、この 10遺伝子から 1遺伝子ずつ除外した 9遺伝子を ^ ^^ ^の！^ドに感染させた。その結果、 4種の遣伝子（#14、 #15, #20, 又は #22) をそれぞれ除外した場合には G418耐性の iPS細胞コロニーが形成されないことがわかった（図

6 )。従って、 10遺伝子のうち、これら 4種の遺伝子が初期化誘導にとって特に重要な役割を果たすことが示唆された。

例 2 ： 4種類の遺伝子群の組合せによる初期化誘導 10種類の遺伝子群のなかで特に重要性が示唆された 4遺伝子により体細胞の初期化の誘導が可能であるか否かを検討した。 Fbxl5遺伝子に 3 _geoをノックインした MEF細胞に上記 10種類の遺伝子の組み合わせ、上記 4種類の遺伝子の組み合わせ、上記 4種類のうち 3種類のみの遺伝子の組み合わせ、及び上記 4種類のうち 2種類のみの遺伝子の組み合わせを用いて、これらの遺伝子群をレトロウィルスにより体細胞に導入した。その結果、 4 種類の遺伝子を導入した場合には 160 個の G418耐性コロニーが得られた。この結果は、 10種類の遺伝子を導入した場合の結果（179コロニー）とほぼ同数であつたが、 4遺伝子導入の場合には 10遣伝子導入の場合に比べてコロニーが小ざかった。また、これらのコロニーを継代培養した場合、 iPS細胞の形態を示したコロニーは 10遺伝子導入の場合に 12クローン中 9クローンであつたのに対して、 4遺伝子導入の場合には 12クローン中 7クローンと若干少ない傾向にあった。 4遺伝子としては、マウス由来のもの、ヒト由来のもの、どちらでもほぼ同じ数の iPS細胞が得られた。

上記 4遺伝子の中から選択された 3遺伝子を導入した場合、ある組合せ（#14、 #15及び #20) では 36個の扁平なコロニーが得られたが、継代培養しても iPS細胞は観察されなかった。別の組合せ（#14、 #20、及び #22) では 54個の小さいコロニーが得られたこれらのうち、比較的大きいコロニーを 6つ継代培養したところ、 6クローンのすべてで ES細胞に類似した細胞が得られた。しかしながら、 ES細胞に比べると細胞同士ゃ培養シャーレへの接着が弱いと思われた。また細胞増殖の速度も 4遺伝子を導入した場合に比べて遅かった。また 4遺伝子 3遺伝子の他の 2通りの組み合わせではそれぞれ 1つずつコロニーが形成されたが、継代培養しても細胞の增殖は認められなかった。 4遺伝子のなかから選択された 2遣伝子の組み合わせ（6通り）では、いずれの場合にも G418耐性コロニーが 1つも形成されなかった。以上の結果を図 7に示す。

また、図 10には ES細胞マ一カー遺伝子の発現を RT-PCRで確認した結果を示した。方法の詳細は以下のとおりである。 FbxlS³^ の MEFに 3遺伝子（0ct3/4、 Klf4及び c- Myc、 Sox2 minus と表記）、 4遺伝子（ 3遺伝子に Sox2を加えたもの、 4ECAT と表記）、 10 遺伝子（4遺伝子に表 1の #3、 #4、 #5、 #1 1、 #18、 #21 を加えたもの、 10ECATと表記）を導入し樹立した iPS細胞、 Fbx l 5遺伝子に 3 geo をノックインした成体マウスの尾部皮膚より樹立した線維芽細胞に 10 遺伝子を導入して樹立した iPS細胞（10ECAT Sk i n f ibroblast と表記）、マウス ES細胞及び遺伝子導入していない MEF細胞より Total RNAを精製し、 DNasel処理によりゲノム DNAの混入を除去した。逆転写反応により Fi rst strand cDNAを作成し、 PCRにより ES細胞マーカー遺伝子の発現を検討した。なお 0ct3/4、 Nanog、 ERas に関しては導入したレト口ウィルスからではなく、内在性遣伝子からの転写産物のみを増幅するプライマーを用いて PCRを行った。プライマー配列を表 6に示す。表 6

表 6 (続き)

この図に示された結果から、 3遺伝子を導入した場合、 ERasや Fgf4は効率よく発現誘導されるが、多能性維持に必須の因子である 0ct3/4と Nanogの誘導は起こらないか、おこっても非常に弱いことがわかった。一方、 4遺伝子を導入した場合、 0ct3/4と Nanogが比較的強く誘導されているクローンが調べた 4クローン中で 1クローン（#7) が存在した。さらに 10遺伝子を導入した場合は、調べた 5 クローン中、 3クローンにおいて、 0c t3/4と Nanogの強い誘導が認められた。これらの結果から、初期化のためには少なくとも 3遺伝子の組合せ（#14、 #20、及び #22) が必須であり、それらの 3種の遺伝子を含む 4遺伝子群及び 10遺伝子群では遺伝子の数を増やすにつれて初期化の効率が上昇することが明らかとなつた。

例 3 ：初期化した細胞の多分化能の解析

樹立した iPS細胞の分化多能性を評価するため、 24因子、 10因子、および 4 因子で樹立された iPS細胞をヌードマウスの皮下に移植した。その結果、 ES細胞と同様の大きさの腫瘍が全例で形成された。組織学的に見ると腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、軟骨組織、神経組織、筋肉組織、脂肪組織、および腸管様組織（図 8 ) が認められたことから、 iPS 細胞の多能性が証明された。一方、 3 因子で樹立した細胞をヌードマウスに移植すると腫瘍は形成されたが、組織学的には未分化細胞からのみ形成されていた。したがって、分化多能性の誘導. のためには、 Soxファミリーが必須であることがわかった。

例 4 ：成体マウスの尾部に由来する線維芽細胞の初期化：

マウス胎児線維芽細胞（MEF)で同定した 4因子を Fbx l5遺伝子に /5 geoをノックインし、さらに全身で緑色蛍光蛋白質（GFP)を発現する成体マウスの尾部に由来する線維芽細胞に導入した。その後、フィーダ一細胞上で ES細胞培養条件と同様の条件で培養して G418による選択を行った。薬剤選択開始後約 2週間で複数の iPS 細胞コ口-一が得られた。これらの細胞をヌードマウスの皮下に移植すると三胚葉系の様々な組織からなる奇形腫を形成した。また成体皮膚線維芽細胞に由来する iPS細胞を胚盤胞に移植し、偽妊娠マウスの子宮に移植したところ、受精後 13. 5日目の胚において、全身で GFP陽性細胞の分布しているものが認められた（図 9 )。これは iPS細胞が多能性を有しており、マウス胚発生に寄与できることを示している。この結果は、同定した因子群が胎児期の体細胞だけではなく成熟したマウスの体細胞に対しても初期化を誘導する能力のあることを示している。成体皮膚由来の細胞で初期化誘導できることは実用上極めて重要である。

例 5

iPS 細胞樹立におけるサイト力インの影響を検討した。フィーダ一細胞（ST0 細胞）に塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF) 又は幹細胞因子（SCF) の発現べクタ一 (pMX レトロウイルスベクター）を導入し、これらのサイト力インを恒常的に発現する細胞を樹立した。 Fbxl5 ^8e。 ⁸ マウス由来 MEF (50万個/ 100讓ディッシュ）をこれらの ST0細胞上で培養し、 4因子を導入後 G418 による選択を行ったところ、通常の ST0細胞上で培養した時と比べて、コ口ニー形成数が bFGF (図 11)、 SCF (data not shown) を産生する ST0細胞上では 20倍以上上昇した。また c- Myc 以外の 3因子を導入しても通常の ST0細胞上では iPS細胞コロニーは精製されなかったが、 bFGF (図 11)、 SCF (data not shown) を産生する ST0細胞上では、コロニーの形成が認められた。これらの結果から、サイ小力インの刺激により、 MEF からの iPS細胞の樹立効率が上昇すること、及び c-Mycに換えてサイトカインを用いることにより核初期化が可能になることが明らかとなつた。

例 6 ' '

0ct3/4、 Klf4、 c-Myc, 及び Sox2遺伝子にはすべてファミリ一遺伝子（表 1及び 2) が存在する。そこで 4遺伝子に換えてファミリー遺伝子によっても iPS細胞が樹立できるかを検討した。表 7に 2回の実験の結果を合わせたものを示す。 Soxフアミリーについては、 Soxlは G418耐性コロニー数及び iPS細胞樹立効率とともに Sox2と同程度であった。 Sox3は G418.耐性コロニー数は Sox2の 10分の 1 程度であつたが、ひろったコロニーからの iPS細胞樹立効率は Sox2よりむしろ高かった。 Soxl5は G418耐性コロニー数及び iPS細胞樹立効率とともに Sox2より低かった。 Soxl7は G418耐性コロニーは Sox2と同程度であつたが、 iPS細胞樹立効率は低かった。 Klf ファミリーについては、 Klf2は Klf4より少ない G418耐性コロニーが生じたが、 iPS細胞の樹立効率は同程度であった。 Mycファミリ一については、まず野生型の C- Mycが T58A変異体と G418耐性コロニー数、 iPS細胞樹立効率の両者において同程度であることを確認した。さらに N-Myc及びし- Myc (ともに野生型）は、ともに c-Mycと G418耐性コロニー数、 iPS細胞樹立効率の両者において同程度であった。表 7

例 7 .

Fbx l5- /3 geo 以外のレポーターで iPS 細胞が樹立できるかを検討した。まず Nanog遺伝子を中央部に含む大腸菌人工染色体（BAC) を単離し、大腸菌内の組み換えにより、 GFP 遺伝子及びピューロマイシン耐性遺伝子をノックインした（図 12A)。ついで同改変 BACを ES細胞に導入し、未分化状態特異的に GFP陽性となることを確認した（data not shown)。ついで同 ES細胞のマウス胚盤胞に移植することによりキメラマウスを経てトランスジエニックマウスを作出した。このマウスにおいては GFP陽性細胞は胚盤胞の内部細胞塊や受精後 13. 5 日胚の生殖腺において特異的に認められた（図 12B)。受精後 13. 5日胚（DBA、 129及ぴ C57BL/6 マウスの雑種）から生殖腺を除去し、 MEF を単離した。フローサイトメトリーにより、単離した MEFは GFP陰性であることを確認した（図 13)。この MEFに 4因子をレトロウイルスで導入し、ピューロマイシンによる選択を行ったところ、複数の耐性コロニーが得られた。その中の約 1 0〜20%のみが GFP陽性であった。 GFP陽性コロニーを継代培養すると ES細胞に類似した形態（図 14) や増殖（図 15) を示した。また遺伝子発現を見ると Fbxl5 ^{eQ/ e}。の MEFから G418選択により単離した iPS細胞より、さらに ES細胞に近い発現パターンであることがわかつた（図 16)。この細胞をヌードマウスに移植すると奇形腫が形成されたことから iPS細胞であることが確認された（図 17)。さらに Nanog- GFP選択による iPS細胞を C57BL/6マウスの胚盤胞に移植することによりキメラマウスが誕生した（図 18)。さらにこのキメラマウス同士を交配させることによりジャームライントランスミッシヨンが確認された（図 19)。この Nanog- GFP選択により樹立されたより ES細胞に近い iPS細胞においては、レトロウィルスからの 4因子の発現はほぼ完全にサイレンシングを受けており、内在性の 0ct3/4や Spx2により自己複製が維持されていることが示唆された。 '

例 8 .

10cm コンフルェントの iPS細胞を、トリプシン処理し、 ES 細胞用培地に懸濁した（ST0細胞は懸濁後 10〜20分ゼラチンコー卜したディッシュに接着させることによって除去した）。 2 X 10⁶の細胞を、 HEMA (2-hydroxyethyl raethacrylate) でコーティングした大腸菌培養用ディッシュで 4日間浮遊培養し、 Embryoid body (EB) を形成させた（dayl-4)。 EB形成 4曰目（day 4)に、 EBを全量 10cm組織培養用ディッシュに移し ES 細胞用培地で 24時間培養して接着させた。 24時間後（day 5)に ITS/fibronectin含有培地に交換した。 7 日間培養し（ 2日毎に培地交換を行う）、 nestin 陽性細胞を選択した（無血清下で培養すると、他の系譜の細胞がある程度死んでいく）（day5-12)。次に A2B5陽性細胞の誘導を行った。 7 日後（day 12)にトリプシン処理して細胞をばらばらにし、残存する EBは除去した。 1 X 10⁵ 個の細胞を poly -し- ornithine/fibronectinがコーティングされている 24ウエノレプレー卜に撒き、 N2/ bFGF 含有培地で四日間培養した（二日毎に培地交換 (dayl2- 16)。四日後（day 16)に N2/bFGF/EGF 含有培地へ交換し、四日間培養した (二日毎に.培地交換）（dayl6-20)。四日後（day 20)に N2/bFGF/PDGF含有培地に交換して、四日間培養した（二日毎に培地交換）（day20-24)。この期間（day 12- 24)に細胞が増えすぎてコンフルェン卜になった場合は随時継代し、 1〜2 X 10⁵個の細胞を撒いた。（継代時期によって数は変更する）。四日後（day 24)に N2/T3 培地に交換して、 7 日間培養し（day24-31)し、 2 日毎に培地交換を行った。 day 31 に固定し、免疫染色した。その結果、 iPS細胞から、 3 Π Ιチュプリン陽性の神経細胞、 04陽性のオリゴデンドロサイト、 GFAP陽性のァストロサイ卜への分化が確認された（図 20)。

例 9

Fbxl5- ^ geo ノックインマウス以外の任意のマウス体細胞から iPS細胞を樹立するために、薬剤選択を用いない樹立方法を開発した。 lOcraディッシュ（ST0フィーダ一細胞上）にマウス胎児線維芽細胞（MEF) を、これまでより少数（1 万、 5万又は 10万個）培養し、レトロウィルスによりコントロール DNA又は' 4因子を導入した。 ES細胞培地にて 2週間培養（G418選択無し）行ったところ、コント口ール DNAを導入したディッシュではコロニー形成が認められなかったが、 4因子を導入したディッシュにおいては形質転換したと思われる扁平なコロニー加えて、複数のコンパク卜なコロニーが形成された（図 21)。これらから 24コロニーをピックアップし培養を続けたところ、 55細胞^¾の形態が認められた。その遺伝子発現を RT- PCRにて検討したところ、 7クローンにおいて ES細胞マーカーである Esgl の発現が認められた。またクロ一ン 4においては Nanog、 ERas、 GDF3、 0ct3/4、 Sox2などの多くの ES細胞マーカ一の誘導が認められたことから iPS細胞であると考えられた（図 22)。以上の結果より、 iPS細胞樹立には Fbxl5 - /3 geo ノックインなどを用いた薬剤選択は必須でなく、任意のマウス由来体細胞から iPS細胞を樹立できることが示された。本技術により疾患モデルマウスの体細胞からも iPS細胞が樹立できる可能性が示された。

例 1 0

iPS 細胞を誘導する細胞として、線維芽細胞以外の細胞である、肝細胞及び胃粘膜細胞を検討した。 Fbxl5 ^^{D/ e}。マウスの肝臓から肝細胞を還流により単離した。この肝細胞に 4因子をレトロウィルスで投与し、 G418による選択を行ったところ複数の iPS細胞コロニーが得られた。 DNAマイクロアレーによる遺伝子発現パターン解析の結果、肝臓由来の iPS細胞は皮膚線維芽細胞や胎児線維芽細胞由来の iPS細胞より、さらに ES細胞に類似していることが明らかとなった。胃粘膜細胞からも、肝細胞からと同様に iPS細胞が得られた。

例 1 1

PD98059は MAPキナーゼの阻害薬であり、多くの分化細胞においては増殖を抑制するが、 ES細胞においては、未分化状態維持と増殖を促進することが知られている。そこで iPS 細胞樹立における PD98059 の効果を検討した。 Nanog-EGFP-IRES-Puroの選択マーカーをもつマウスから樹立した MEFに 4因子をレトロウイルスで投与し、ピューロマイシンによる選択を行った。 PD98059 を投与しない場合、得られた iPS細胞コロニーの中で、 GFP陽性の割合は 8 %であつた。一方、 PD98059 (最終濃度 25 μ Μ) をレトロウイルス感染の翌日から持続的に投与した群では、得られたコロニーの 45%が GFP陽性であった。これは PD98059 が GFP陽性の、より ES細胞に近い iPS細胞の增殖を促進するが、 GFP陰性の iPS 細胞や、分化細胞の増殖は抑制するためであると考えられた。このことから PD98059は、より ES細胞に近い iPS細胞の樹立や、薬剤選択を用いない iPS細胞の樹立に利用できることが示された。

例 1 2

胎児由来の Human dermal fibroblast (HDF) にマウスェコトロピックウィルスレセプターである solute carrier fami ly 7 (Slc7al、 NCBIァクセッション番号 N _007513) をレンチウィルスで発現させた細胞に、マウス 0ct3/4遺伝子プロモ一ター下流に赤色蛍光蛋白質遺伝子を、および PGKプロモーター下流にハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドをヌクレオフエクションで導入した, ハイグロマイシンによる選択を行い、安定発現株を樹立した。 800000個の細胞をマイ卜マイシン処理した ST0細胞の上にまき、翌日レトロウィルスにより 0ct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc (いずれもヒト由来）を導入した。 3週間後に得られたコロニ一（図 23左）を 24個拾い、 ST0細胞を播種した 24 - we 11 plateに移して培養した。 2週間後に増えてきた 1クローンを STO細胞を播種した 6iel l plateに継代して培養した結果、 ES細胞に形態上において類似した細胞が得られ（図 23右）、 iPS細胞であることが示唆された。培地は常にマウス ES細胞用培地を用いた。例 1 3

ヒト成体皮膚線維芽細胞（adult HDF) にレンチウィルスで Slc7al (マウスレトロウィルス受容体）を導入した細胞を 800000個のフィーダ一細胞（マイトマィシン処理 STO細胞）上にまき、以下の組み合わせでレトロウイルスにより遺伝子を導入した。

1. 0ct3/4, Sox2, Klf4, c- -Myc, TERT, SV40 Large T antigen

2. 0ct3/4, Sox2, Klf4, c- -Myc, TERT, HPV16 E6

3. 0ct3/4, Sox2, Klf4, c- -Myc, TERT, HPV16 E7 '

4. 0ct3/4, Sox2, Klf4, c- -Myc, TERT, HPV16 E6， HPV16 E7

5. 0ct3/4, Sox2, Klf4, c- -Myc, TERT, Bmi l

(0ct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERTはヒト由来、 Bmi lはマウス由来）

マウス ES細胞の培養条件下で、薬剤選択無しで培養を続けたところ、 1の組み合わせで因子を導入したディッシュにおいて、ウィルス感染 8日後において、 iPS 細胞と思われるコロニーが出現した（図 24) 。他の組み合わせ（2から 5) においても、 1の組み合わせの場合ほどは明瞭ではないが、 iPS細胞様のコロニーが出現した。 4因子のみを導入しても、'全くコロニーは出現しなかった。産業上の利用可能性

本発明により提供された核初期化因子を用レ、ることにより、胚ゃ ES細胞を利用せずに簡便かつ再現性よく分化細胞核の初期化を誘導することができ、 ES細胞と同様の分化及び多能性や増殖能を有する未分化細胞である誘導多能性幹細胞を樹立することができる。

Claims

1 . 体細胞の核初期化因子であって、下記の 3種類の遺伝子： Oct ファミリ一遺伝子、 Klf ファミリ一遺伝子、及び Myc ファミリ一遺伝子の各遺伝子産物を含む因子。

2 . 下記の 3種の遺伝子： 0ct3/4、 Klf4、及び c- Mycの各遺伝子産物を含む請求項 1に記載の因子。

3 . 下記の遺伝子： Sox ファミリ f P青ー遺伝子の遺伝子産物をさらに含む請求項 1又は 2に記載の因子。

4 . Sox2の遺伝子産物を含む請求項 3に記載の因子。

5 . Mycファミリー遺伝子の遺伝子産物とともに囲、あるいは Mycファミリー遺伝子の遺伝子産物に換えてサイトカインを含む請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載の因子。

6 . サイト力インが bFGF及び/又は SCFである請求項 5に記載の因子 _ώ

7 . 下記の遺伝子： TERT遺伝子の遺伝子産物をさらに含む請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の因子。

8 . 下記の遺伝子： SV40 Large T antigen, HPV16 E6、 HPV16 E7、及び Bmi lからなる群から選ばれる 1 種以上の遺伝子の遺伝子産物をさらに含む請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の因子。

9 . Fbxl5、 Nanog、 ERas、 ECAT15- 2、 Tel l , 及び /3 _catenin からなる群から選ばれる 1 種以上の遺伝子の遺伝子産物をさらに含む請求項 1ないし 8のいずれか 1 項に記載の因子。

1 0 . ECAT1、 Esgl、 Dnmt3し、 ECAT8、 Gdf3、 Soxl5、 ECAT15 - 1、 Fthll7、 Sall4、 Rexl、 UTF1、 Stella, Stat3、及ぴ Grb2からなる群から選ばれる 1種以上の遺伝子の遺伝子産物をさらに含む請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の因子。

1 1 . 体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法であって、体細胞に対して請求項 1ないし 1 0のいずれか 1項に記載の核初期化因子を接触させる工程を含む方法。

1 2. 体細胞がヒト細胞である請求項 1 1に記載の方法。

1 3. 請求項 1 1又は 1 2に記載の方法により得られた誘導多能性幹細胞。

1 4. 請求項 1 3に記載の誘導多能性幹細胞から分化誘導された体細胞。

1 5. 細胞の分化能及び/又は増殖能を改善する方法であって、細胞に対して請求項 1ないし 10のいずれか 1項に記載の核初期化因子を接触させる工程を含む方法。

1 6. 細胞がヒト細胞である請求項 1 5に記載の方法。

1 7. 請求項 1 5又は 1 6に記載の方法により得られた細胞。

1 8. 請求項 1 7に記載の細胞から分化誘導された体細胞。