CN112996524B

CN112996524B - 医药品组合物以及化妆品组合物

Info

Publication number: CN112996524B
Application number: CN201980073251.3A
Authority: CN
Inventors: 田边刚士; 须藤健太
Original assignee: Epping World Co ltd
Current assignee: Epping World Co ltd
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2019-10-04
Publication date: 2024-10-22
Anticipated expiration: 2039-10-04
Also published as: JP7111313B2; CN119139353A; US20240316117A1; US12036245B2; JPWO2020095592A1; JP2022048238A; US20220088087A1; WO2020095592A1; JP7046421B2; CN112996524A

Abstract

提供一种包含诱导培养多能性干细胞后的培养基的上清的医药品组合物或医药品组合物原料。

Description

医药品组合物以及化妆品组合物

技术领域

本发明涉及医药品组合物和化妆品组合物。

背景技术

胚胎干细胞(ES细胞)是由人类或小鼠的早期胚胎建立的干细胞。ES细胞具有能够向生物体内所存在的所有细胞分化的多能性。现在，人类ES细胞可以应用于针对帕金森病、幼年型糖尿病和白血病等众多疾病的细胞移植疗法中。然而，在ES细胞的移植中也存在障碍。特别是，ES细胞的移植可能引起与随着不成功的器官移植而产生的排斥反应同样的免疫排斥反应。另外，对于破坏人类胚胎而建立的ES细胞的利用而言，从伦理性观点来看，批判或反对意见多。

在此种背景的状况下，京都大学的山中伸弥教授通过将4种基因：OCT3/4、KLF4、c-MYC和SOX2导入至体细胞，从而成功地建立诱导性多能干细胞(iPS细胞)。由此，山中教授获得了2012年的诺贝尔生理学或医学奖(例如参照专利文献1)。iPS细胞是没有排斥反应和伦理性问题的理想的多能性细胞。因此，期待将iPS细胞应用于细胞移植疗法中。另一方面，有将用于iPS细胞培养的培养基再利用于医药品组合物的报道(例如，参照专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4183742号公报

专利文献2：日本特开2016-128396号公报

发明内容

技术问题

但是，本发明者们经过验证，认为在专利文献2所记载的培养方法中，由于iPS细胞分化，因此实际上再利用的培养基不是培养iPS细胞后的培养基而是培养已分化的细胞后的培养基。本发明的目的之一在于提供有效利用了iPS细胞的培养基的医药品组合物和化妆品组合物。

技术方案

根据本发明的实施方式，提供一种医药品组合物或医药品组合物原料，其包括重编程体细胞时所使用的培养基的上清。

根据本发明的实施方式，提供包括上述的医药品组合物或医药品组合物原料的针对皮肤的斑点、皱纹和松弛中任一种的形成防止和改善剂。

根据本发明的实施方式，提供包括重编程体细胞时所使用的培养基的上清的化妆品组合物或化妆品组合物原料。

根据本发明的实施方式，提供包括上述的化妆品组合物或化妆品组合物原料的针对皮肤的斑点、皱纹和松弛中任一种的形成防止和改善剂。

根据本发明的实施方式，提供包括重编程体细胞时所使用的培养基的上清的胶原产生促进剂或胶原产生促进剂原料。

根据本发明的实施方式，提供包括重编程体细胞时所使用的培养基的上清的生发剂、生发剂原料、育发剂或育发剂原料。

根据本发明的实施方式，提供包括重编程体细胞时所使用的培养基的上清的毛乳头细胞的活化剂或毛乳头细胞的活化剂原料。

根据本发明的实施方式，提供包括重编程体细胞时所使用的培养基的上清的成纤维细胞生长因子家族产生促进剂或成纤维细胞生长因子家族产生促进剂原料。

根据本发明的实施方式，提供包括重编程体细胞时所使用的培养基的上清的血管内皮细胞增殖因子产生促进剂或血管内皮细胞增殖因子产生促进剂原料。

根据本发明的实施方式，提供包括重编程体细胞时所使用的培养基的上清的创伤治疗剂或创伤治疗剂原料。

根据本发明的实施方式，提供包括重编程体细胞时所使用的培养基的上清的表皮细胞增殖促进剂或表皮细胞增殖促进剂原料。

根据本发明的实施方式，提供包括干细胞的提取物的医药品组合物或医药品组合物原料。

在上述的医药品组合物或医药品组合物原料中，干细胞的提取物可以是糊状，或干细胞的提取物可以经冷冻干燥而成。

根据本发明的实施方式，提供包括上述的医药品组合物或医药品组合物原料的针对皮肤的斑点、皱纹和松弛中的任一种的形成防止和改善剂。

根据本发明的实施方式，提供包括干细胞的提取物的化妆品组合物或化妆品组合物原料。

在上述的化妆品组合物或化妆品组合物原料中，干细胞的提取物可以是糊状，或干细胞的提取物可以是经冷冻干燥而成。

根据本发明的实施方式，提供包括上述的化妆品组合物或化妆品组合物原料的针对皮肤的斑点、皱纹和松弛中的任一种的形成防止和改善剂。

根据本发明的实施方式，提供包括干细胞的提取物的胶原产生促进剂或胶原产生促进剂原料。

在上述的胶原产生促进剂或胶原产生促进剂原料中，干细胞的提取物可以是糊状，或干细胞的提取物可以是经冷冻干燥而成。

根据本发明的实施方式，提供包括干细胞的提取物的生发剂、生发剂原料、育发剂或育发剂原料。

在上述的生发剂、生发剂原料、育发剂或育发剂原料中，干细胞的提取物可以是糊状，或干细胞的提取物可以是经冷冻干燥而成。

根据本发明的实施方式，提供包括干细胞的提取物的毛乳头细胞的活化剂或毛乳头细胞的活化剂原料。

在上述的毛乳头细胞的活化剂或毛乳头细胞的活化剂原料中，干细胞的提取物可以是糊状，或干细胞的提取物可以是经冷冻干燥而成。

根据本发明的实施方式，提供包括干细胞的提取物的成纤维细胞生长因子家族产生促进剂或成纤维细胞生长因子家族产生促进剂原料。

在上述的成纤维细胞生长因子家族产生促进剂或成纤维细胞生长因子家族产生促进剂原料中，干细胞的提取物可以是糊状，或干细胞的提取物可以是经冷冻干燥而成。

根据本发明的实施方式，提供包括干细胞的提取物的血管内皮细胞增殖因子产生促进剂或血管内皮细胞增殖因子产生促进剂原料。

在上述的血管内皮细胞增殖因子产生促进剂或血管内皮细胞增殖因子产生促进剂原料中，干细胞的提取物可以是糊状，或干细胞的提取物可以是经冷冻干燥而成。

根据本发明的实施方式，提供包括干细胞的提取物的创伤治疗剂或创伤治疗剂原料。

在上述的创伤治疗剂或创伤治疗剂原料中，干细胞的提取物可以是糊状，或干细胞的提取物可以是经冷冻干燥而成。

根据本发明的实施方式，提供包括干细胞的提取物的表皮细胞增殖促进剂或表皮细胞增殖促进剂原料。

在上述的表皮细胞增殖促进剂或表皮细胞增殖促进剂原料中，干细胞的提取物可以是糊状，或干细胞的提取物可以是经冷冻干燥而成。

根据本发明的实施方式，提供抗紫外线物质的筛选方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞制作而成；对皮肤细胞照射紫外线；将经紫外线照射的皮肤细胞在多个不同的溶液中的每个溶液进行培养；以及选择因紫外线导致的皮肤细胞的损伤少的培养基或遭受紫外线的皮肤细胞的修复快的溶液。

根据本发明的实施方式，提供抗干燥物质的筛选方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞制作而成；将皮肤细胞进行干燥；将经干燥的皮肤细胞在多个不同的溶液中的每个溶液进行培养；以及选择皮肤细胞的存活率高的溶液。

根据本发明的实施方式，提供抗干燥物质的筛选方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞制作而成；将皮肤细胞进行干燥；将经干燥的皮肤细胞在多个不同的溶液中的每个溶液进行培养；以及选择皮肤细胞的紧密连接的损伤小的溶液。

在上述的方法中，可以对紧密连接中的闭合蛋白和密蛋白中的至少一者进行分析。

根据本发明的实施方式，提供抗氧化应激物质的筛选方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞制作而成；给予皮肤细胞氧化应激；将经给予氧化应激的皮肤细胞在多个不同的溶液中的每个溶液进行培养；以及选择皮肤细胞的存活率高的溶液。

根据本发明的实施方式，提供保湿促进物质的筛选方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞制作而成；将皮肤细胞在多个不同的溶液中的每个溶液进行培养；以及从多个不同的溶液中选择来源于皮肤细胞的天然保湿因子量多的溶液。

在上述的方法中，天然保湿因子可以是神经酰胺和丝聚蛋白中的至少一者。

根据本发明的实施方式，提供皮肤的紫外线耐受性检查方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于受试者的体细胞制作而成；以及检查因紫外线导致的皮肤细胞的损伤。

根据本发明的实施方式，提供皮肤的干燥耐受性检查方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于受试者的体细胞制作而成；将皮肤细胞进行干燥；以及检查皮肤细胞的存活率。

根据本发明的实施方式，提供皮肤的干燥耐受性检查方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于受试者的体细胞制作而成；将皮肤细胞进行干燥；以及检查皮肤细胞的紧密连接的损伤。

在上述的方法中，在检查皮肤细胞的紧密连接的损伤中，可以对紧密连接中的闭合蛋白和密蛋白中的至少一者进行分析。

根据本发明的实施方式，提供皮肤的氧化应激耐受性检查方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于受试者的体细胞制作而成；给予皮肤细胞氧化应激；以及检查皮肤细胞的存活率。

根据本发明的实施方式，提供一种皮肤的保湿能力的检查方法，其包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于受试者的体细胞制作而成；对皮肤细胞进行培养；以及对来源于皮肤细胞的天然保湿因子的量进行检查。

发明效果

根据本发明，能够提供有效利用了iPS细胞的培养基的医药品组合物和化妆品组合物。

附图说明

图1是示出实施例2的基于成纤维细胞的透明质酸产生试验的结果的图表。

图2是示出实施例4的基于成纤维细胞的I型胶原产生试验的结果的图表。

图3是示出实施例4的基于成纤维细胞的I型胶原产生试验的结果的表。

图4是示出实施例5的发毛乳头细胞的增殖性试验的结果的图表。

图5是示出实施例5的发毛乳头细胞的增殖性试验的结果的表。

图6是示出实施例6的基于毛乳头细胞的VEGF产生试验的结果的图表。

图7是示出实施例6的基于毛乳头细胞的VEGF产生试验的结果的表。

图8是示出实施例7的基于毛乳头细胞的FGF-7产生试验的结果的图表。

图9是示出实施例7的基于毛乳头细胞的FGF-7产生试验的结果的表。

图10是示出实施例8的成纤维细胞的迁移性试验的结果的照片。

图11是示出实施例8的成纤维细胞的迁移性试验的结果的照片。

图12是示出实施例10的皮肤成纤维细胞的UV照射试验的结果的图表。

图13是示出实施例11的皮肤成纤维细胞的干燥刺激试验的结果的图表。

图14是示出实施例12的皮肤成纤维细胞的氧化应激试验的结果的图表。

图15是示出实施例12的皮肤成纤维细胞的氧化应激试验的结果的图表。

图16是参考例的细胞的显微镜照片。

图17是参考例的细胞的显微镜照片。

图18是示出参考例的细胞的流式细胞仪的结果的分布图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行详细地说明。应予说明，以下示出的实施方式例示了用于将本发明的技术思想具体化的装置和/或方法，本发明的技术思想的构成部件的组合等并不特定于下述内容。本发明的技术思想可以在权利要求书中进行各种变更。

(第一实施方式)

第一实施方式的各个医药品组合物、医药品组合物原料、化妆品组合物和化妆品组合物原料包括将体细胞重编程为iPS细胞等多能性干细胞时所使用的培养基的上清。第一实施方式的各个医药品组合物、医药品组合物原料、化妆品组合物和化妆品组合物原料可以包括将体细胞重编程为iPS细胞等多能性干细胞时所使用的培养基的上清的冷冻干燥物。第一实施方式的各个医药品组合物、医药品组合物原料、化妆品组合物和化妆品组合物原料也可以将体细胞重编程为iPS细胞等多能性干细胞时所使用的培养基的上清包含在纳米胶囊等胶囊或纳米乳液等乳液中。

iPS细胞是通过将OCT3/4、KLF4、c-MYC和SOX2等初始化因子导入至例如血液细胞和成纤维细胞等的分化细胞等体细胞中诱导而得。有时将诱导为iPS细胞称为重编程、初始化、转化(transformation)、转分化(Transdifferentiation or Lineage reprogramming：转分化或谱系重编程)和细胞命运改变(Cell fate reprogramming)。多能性干细胞可以在进行悬浮培养等三维培养的同时进行诱导。在三维培养时，可以使用凝胶培养基，也可以使用液体培养基。多能性干细胞为例如，TRA1-60、OCT3/4、SSEA3、SSEA4、TRA1-81和NANOG中的任一种的阳性率在30％以上、50％以上、优选在80％以上。凝胶培养基可以不包含饲养细胞。

作为诱导培养时的培养基，可以使用例如TeSR2(干细胞技术有限公司(STEMCELLTechnologies))等人类ES/iPS培养基。但是，培养基不限于此，可以使用各种干细胞培养基。可以使用例如灵长类ES细胞培养基(Primate ES Cell Medium)、Reprostem、ReproFF、ReproFF2、ReproXF(Reprocell公司)、mTeSR1、TeSRE8、ReproTeSR(干细胞技术有限公司)、PluriSTEM(注册商标)人类ES/iPS培养基(默克公司(Merck))、用于人类iPS和ES细胞的NutriStem(注册商标)XF/FF培养基(NutriStem XF/FF Culture Medium for Human iPSand ES Cells)、Pluriton重编程培养基(Pluriton reprogramming medium)(Stemgent公司)、PluriSTEM(注册商标)、Stemfit AK02N、Stemfit AK03(味之素公司(Ajinomoto))、用于hESC/iPS的ESC-Sure(注册商标)血清和无饲养层培养基(应用干细胞公司(AppliedStemcell))、L7(注册商标)hPSC培养基系统(龙沙公司(LONZA))和灵长类ES细胞培养基(ReproCELL公司)等。

凝胶培养基例如是通过向上述的培养基加入脱酰基结冷胶使其最终浓度为0.5重量％至0.001重量％、0.1重量％至0.005重量％、或者0.05重量％至0.01重量％调制而成。

凝胶培养基可以包含由结冷胶、透明质酸、中性树胶(Rhamsan gum)、定优胶(diutan gum)、黄原胶、卡拉胶、岩藻多糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸类肝素、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李糖以及它们的盐组成的组中选择的至少一种高分子化合物。另外，凝胶培养基也可以包含甲基纤维素。由于含有甲基纤维素，可以更加抑制细胞之间的聚集。

或者，凝胶培养基也可以包含从聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(poly(glycerolmonomethacrylate)，PGMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟丙基酯)(poly(2-hydroxypropylmethacrylate)，PHPMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(Poly(N-isopropylacrylamide)，PNIPAM)、胺封端(amine terminated)、羧酸封端(carboxylic acid terminated)、马来酰亚胺封端(maleimide terminated)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯封端(N-hydroxysuccinimide ester terminated)、三乙氧基硅烷封端(triethoxysilaneterminated)、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酰胺)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸丁酯)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-甲基丙烯酸)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-甲基丙烯酸-共聚-丙烯酸十八烷基酯(Poly(N-isopropylacrylamide-co-methacrylicacid-co-octadecyl acrylate))和N-异丙基丙烯酰胺(N-Isopropylacrylamide)中选择的少量温敏凝胶。

或者，第一实施方式的各个医药品组合物、医药品组合物原料、化妆品组合物和化妆品组合物原料包括干细胞的提取物。提取物可以是液体。即，提取物可以是提取液。干细胞包括iPS细胞那样的多能性干细胞、以及胚胎干细胞(ES细胞)。干细胞为例如，TRA1-60或OCT3/4的阳性率在30％以上、50％以上、优选在80％以上。在将干细胞以未分化状态维持培养的情况下，培养基包含10ng/mL以上、优选40ng/mL以上的b-FGF。各个医药品组合物、医药品组合物原料、化妆品组合物和化妆品组合物原料中，干细胞的提取物可以是干细胞糊。干细胞糊是通过研碎iPS细胞而得。干细胞的提取物也可以是冷冻干燥物。另外，干细胞的提取物也可以是粉体。或者干细胞的提取物还可以是干细胞的溶解物。

第一实施方式的医药品组合物可以是皮肤涂敷组合物。第一实施方式的医药品组合物也可以是皮肤疾病治疗剂。作为能够用第一实施方式的皮肤疾病治疗剂治疗的疾病的示例，可列举寻常性痤疮、寻常性牛皮癣、瘢痕瘤、脂溢性皮炎、接触性皮炎、特应性皮炎、特应性干燥皮炎、皮肤松弛症(dermatoporosis)、光线性弹性纤维病、日光性角化病、眼睑下垂病、簇状脱发病、头发脱发病、睫毛稀疏症、褐黄斑、老年性色斑、痱子、雀斑、迟发性两侧性太田母斑、脂漏性角化病、早衰症导致的皮肤疾病、以及单纯疱疹等。

作为用第一实施方式的化妆品组合物能够改善或消除的状态的示例，可列举斑点、雀斑、皱纹、松弛、干涩、皮肤弹性降低、暗沉、敏感肌肤、干燥肌肤和毛发稀疏等。作为第一实施方式的化妆品组合物的效果，可列举调整肌肤、调整肌肤纹理、保持皮肤健康、防止肌肤粗糙、紧致肌肤、滋润皮肤、补充并保持皮肤的水分和油分、保持皮肤的柔软性、保护皮肤、防止皮肤干燥、使肌肤柔嫩、给予肌肤弹性、给予肌肤光泽、使肌肤光滑、给肌肤带来弹力、淡化斑点、抑制皱纹和使肌肤发亮等。而且，作为第一实施方式的化妆品组合物的与头皮或者头发有关的效果，可列举保持头皮健康、育发、预防头发稀疏、预防发痒、预防脱发、促进毛发生长、促进生发、预防病后或产后脱发、以及养发等。

第一实施方式的医药品组合物可以是创伤治疗剂、表皮细胞增殖促进剂、表皮再生促进剂、生发剂、育发剂和睫毛稀疏症治疗药。第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物也可以是胶原产生促进剂、透明质酸产生促进剂、生发剂、成纤维细胞生长因子(FGF)家族产生促进剂和血管内皮细胞增殖因子(VEGF)产生促进剂。

在毛发生长中，毛根的毛母细胞分裂，由此产生的细胞不断构成毛发。另一方面，毛发的生长中，有被称作毛发周期的周期，反复进行生长期、退行期和休止期。毛乳头细胞通过增殖因子的产生和释放，来影响毛囊上皮干细胞的增殖和分化，控制毛发周期。可以说毛乳头细胞和毛母细胞的活化对毛发生长的机制带来贡献。另外，与毛发周期相对应地，毛囊中会活跃地进行血管重塑，但如果这时血管新生出现问题，则用于毛发形成的营养和氧气的供给会变得不足。可以说来自毛囊血管网的血流不足与男性型脱发症(AGA)的病情有关。

关于毛乳头细胞的基因与生发和毛发生长，已知以下情况。即，已知有FGF-7和IGF-1等作为乳头细胞向毛母细胞分泌的增殖因子。这些因子有维持毛囊生长的作用。血管内皮生长因子(VEGF)由毛乳头细胞分泌，并与毛囊血管增生有关，另外，具有以自分泌使毛乳头细胞增殖的效果，但随着从生长期向退行期转移，表达量减少。VEGF基因在AGA(男性型脱发症)的毛组织中表达量降低。VEGFB竞相与VEGF作用的受体即VEGFR-1结合。虽然VEGFB保持血管内皮细胞的增殖和渗透性亢进活性，但在毛囊的效果尚不明确。

第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物具有如下效果：通过直接作用于毛乳头，提高作为生发促进因子的FGF-7的产生量而促进生发，从而延长毛发周期的生长期，从细软的毛发养育为粗韧的毛发的效果、以及提高血管内皮生长因子(VEGF)，由毛乳头细胞分泌而与毛囊血管增生相关、另外以自分泌而使毛乳头细胞增殖的效果。因此，第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物可以作为毛乳头细胞的活化剂使用。

第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物在作为育发剂或生发剂使用的情况下，可以包括米诺地尔(minoxidil)、当药、泛酸醇乙基醚(Pantothenyl ethylether)、生育酚乙酸酯、甘草酸二钾及腺苷等其他有效成分。

作为可以用第一实施方式的创伤治疗剂治疗的创伤的示例，可列举烫伤、擦伤、裂伤、挫伤、缝合创、褥疮和皮肤缺损创伤等。

第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物包括有效量的在重编程体细胞时所使用的培养基的上清。或者，第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物包括有效量的干细胞的提取物。这里，有效量是指能够作为医药品组合物或者化妆品组合物而发挥效用的量。有效量根据患者的年龄、对象疾病、有无其他成功成分、以及其他配合物的量而适当设定。

第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物可以包括制剂上允许的载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂和生理盐水等。作为赋形剂的例子，可列举乳糖、淀粉、山梨糖、D-甘露醇和白糖。作为崩解剂的例子，可列举羧甲基纤维素和碳酸钙。作为缓冲剂的例子，可列举磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐。作为乳化剂的例子，可列举阿拉伯橡胶、海藻酸钠和黄芪胶。

作为悬浮剂的例子，可列举单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素和月桂基硫酸钠。作为无痛化剂的例子，可列举苯甲醇、氯丁醇和山梨醇。作为保存剂的例子，可列举丙烯醇和抗坏血酸。作为稳定剂的例子，可列举酚、氯化苯磺、苯甲醇、氯丁醇和甲苯甲酯。作为防腐剂的例子，可列举氯化苯甲酸、对羟基苯甲酸和氯丁醇。

另外，可以在实现第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物的目的的范围内，在第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物中配合以下成分，所述成分包括：水、乙醇、表面活性剂(阳离子、阴离子、非离子和两性表面活性剂等)、保湿剂(甘油、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、戊二醇、聚季铵盐、氨基酸、脲、吡咯烷酮羧酸盐、核酸类、单糖类和低聚糖等，以及它们的衍生物等)、增稠剂(多糖类、聚丙烯酸盐、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、甲壳质、壳聚糖、海藻酸、角叉菜胶、黄原胶和甲基纤维素等，以及它们的衍生物等)、蜡、凡士林、烃饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸和硅油等、以及它们的衍生物、三(辛酸/癸酸)甘油酯、以及三辛酸甘油酯等甘油三酯类、硬脂酸异丙酯等酯油类、天然油脂类(橄榄油、山茶油、鳄梨油、杏仁油、可可脂、月见草油、葡萄籽油、澳洲坚果油、桉树油、玫瑰果油、角鲨烷、橙花油、羊毛脂及神经酰胺等)、防腐剂(羟基苯甲酸衍生物、脱氢乙酸盐、感光素、山梨酸和苯氧基乙醇等，以及它们的衍生物等)、杀菌剂(硫黄、三氯甲酰苯胺、水杨酸、吡啶硫酮锌和桧木醇等，以及它们的衍生物等)、紫外线吸收剂(对氨基苯甲酸和甲氧基肉桂酸等、以及它们的衍生物等)、抗炎药(尿囊素、红没药醇、ε-氨基己酸、乙酰基苯甲酰半胱氨酸和甘草酸等，以及它们的衍生物等)、抗氧化剂(生育酚、BHA、BHT和虾青素等，以及它们的衍生物等)、螯合剂(乙二胺四乙酸和羟基乙烷二膦酸等，以及它们的衍生物等)、动植物提取物(八丈草、芦荟、营实、黄芩、黄柏、海藻、木瓜、洋甘菊、甘草、猕猴桃、黄瓜、桑、白桦、当归、大蒜、牡丹、啤酒花、七叶树、薰衣草、迷迭香、桉树、牛奶、各种肽、胎盘、蜂王浆、裸藻提取物、水解裸藻提取物和裸藻油等，以及它们的含有成分提纯物或发酵物等)、pH调节剂(无机酸、无机酸盐、有机酸和有机酸盐等，以及它们的衍生物等)、维生素类(维生素A类、维生素B类、维生素C、维生素D类、泛醌和烟酰胺等，以及它们的衍生物等)、酵母、曲菌及乳酸菌的发酵液、半乳酶培养液、美白剂(氨甲环酸、氨甲环酸鲸蜡酯盐酸盐、4-正丁基间苯二酚、熊果苷、曲酸、鞣花酸、甘草类黄酮、烟酰胺、及维生素C衍生物等)、神经酰/神经酰胺衍生物、抗皱剂(视黄醇和视黄醛，以及它们的衍生物、烟酰胺和寡肽等，以及它们的衍生物等，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制、以及MMP-1及MMP-2抑制作用的某种天然及合成成分等)、氧化钛、滑石、云母、二氧化硅、氧化锌、氧化铁、硅、及对它们进行加工处理而得到的粉体类等。

应予说明，可以添加在第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物的成份不限于上述内容，只要是能够用于医药品组合物和化妆品组合物的成份就可以自由选择。在将第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物作为湿敷剂使用的情况下，除上述成分外，可以在实现目的的范围内配合基质(高岭土和膨润土等)、胶凝剂(聚丙烯酸盐和聚乙烯醇等)。在将第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物作为沐浴露使用的情况下，可以在实现目的的范围内适当配合硫酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、色素和保湿剂并调制成粉末型、液剂型。

第一实施方式的医药品组合物和化妆品组合物可以用本技术领域中众所周知的惯用方法制造。

(第二实施方式)

第二实施方式的抗紫外线物质的筛选方法包括：准备从iPS细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该iPS细胞从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞制作而成；对任意分化诱导而得的皮肤细胞照射紫外线；将经紫外线照射的皮肤细胞在多个不同的溶液中的每个溶液进行培养；以及选择因紫外线导致的皮肤细胞的损伤少的溶液或遭受紫外线的皮肤细胞的修复快的溶液。应予说明，患者不限于人类，也包括非人类的动物。

虽然列举沃纳综合症、色素性干皮症和科凯恩综合症作为早衰症的例子，但没有特别的限定。来源于早衰症患者的体细胞虽然为例如成纤维细胞、血液细胞、上皮细胞、成体干细胞、角质细胞、毛乳头细胞和牙髓干细胞，但是没有特别的限定。iPS细胞是通过将OCT3/4、KLF4、c-MYC和SOX2等初始化因子导入来源于早衰症患者的体细胞诱导而得。从iPS细胞分化诱导皮肤细胞时，例如，在加入了不含bFGF的培养液的细胞低粘附培养皿中接种iPS细胞。然后，每隔2天更换培养基，将8天后形成的类胚体(EB)接种到培养皿，使细胞粘附于培养皿，用10％FBS培养基培养细胞。即使细胞达到汇合，也用胰蛋白酶将细胞从培养皿剥离，进行传代培养。同样地重复传代培养1个月。然后，使用CD13等成纤维细胞标志物来确认细胞已分化为成纤维细胞。另外，也可以使用TRA 1-60等iPS细胞标志物来确认细胞中是否残留有未分化的iPS细胞。虽然被分化诱导的皮肤细胞例如为皮肤成纤维细胞，但没有特别的限定。

使分化诱导而成的皮肤细胞在适当培养后照射紫外线(UV)。紫外线的强度、波长范围和照射时间根据所筛选的抗紫外线物质的用途、用法和用量等适当地设定。被照射了UV的皮肤细胞在分别含有成为筛选对象的不同物质的多个不同溶液中的每个溶液中进行培养。溶液可以是培养基。溶液中的筛选对象物质和培养时间等根据所筛选的抗紫外线物质的用途、用法和用量等适当地设定。

然后，选择皮肤细胞的损伤少的溶液或皮肤细胞的修复快的溶液作为含有抗紫外线物质的溶液。例如，对在多个溶液中的每个溶液培养出的皮肤细胞进行分析，选择损伤少的皮肤细胞的培养所使用的一个或一组溶液，并排除损伤多的皮肤细胞的培养所使用的一个或一组溶液。或者，对在多个溶液中的每个溶液培养出的皮肤细胞进行分析，选择一个或一组快速修复好的皮肤细胞的培养所使用的溶液，并排除一个或一组缓慢修复好的皮肤细胞或未修复好的皮肤细胞的培养所使用的溶液。

根据本发明人们的观点，与健康者的皮肤细胞相比，由从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞诱导的iPS细胞诱导而得的皮肤细胞，具有对UV照射没有抵抗力的倾向。因此，通过使用由从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞诱导出的iPS细胞诱导而得的皮肤细胞，能够筛选有效的抗紫外线物质。

(第三实施方式)

第三实施方式的皮肤的紫外线耐受性检查方法包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于受试者的体细胞制作而成；对皮肤细胞照射紫外线；以及检查因紫外线导致的皮肤细胞的损伤。

受试者可以是疾病患者，也可以是健康者。来源于受试者的体细胞预先从受试者获得，该方法可以不包括从受试者获取体细胞的步骤。如果因紫外线导致的皮肤细胞的损伤大，则可以判定为受试者的皮肤细胞不具有紫外线耐受性。如果因紫外线导致的皮肤细胞的损伤小，则可以判定为受试者的皮肤细胞具有紫外线耐受性。根据该方法，能够基于因紫外线导致的皮肤细胞的损伤的检查结果，检查受检者的皮肤细胞是否具有紫外线耐受性。

(第四实施方式)

第四实施方式的抗干燥物质的筛选方法包括：准备从iPS细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该iPS细胞从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞制作而成；将皮肤细胞进行干燥；将经干燥的皮肤细胞在多个不同的溶液中的每个溶液进行培养；以及选择皮肤细胞的存活率高的溶液。

将与第二实施方式同样地分化诱导而得的皮肤细胞在适当培养后进行干燥。在干燥皮肤细胞时，除去例如皮肤细胞周围的培养基。另外，可以对皮肤细胞施加气流，也可以使用干燥剂等使皮肤细胞干燥。皮肤细胞的干燥方法和干燥时间根据所筛选的抗干燥物质的用途、用法和用量等适当地设定。经干燥的皮肤细胞在分别含有成为筛选对象的不同物质的多个不同溶液中每个溶液中进行培养。溶液可以是培养基。溶液中的筛选对象物质和培养时间等根据所筛选的抗干燥物质的用途、用法和用量等适当地设定。

然后，检测在多个溶液中的每个溶液中培养的皮肤细胞的存活率，选择皮肤细胞的存活率高的溶液作为包括抗干燥物质的溶液。例如，检测在多个溶液中的每个溶液中培养的皮肤细胞的存活率，选择存活率高的皮肤细胞的培养所使用的一个或一组溶液，并排除存活率低的皮肤细胞的培养所使用的一个或一组溶液。

应予说明，也可以选择皮肤细胞的紧密连接(tight junction)的损伤小的溶液来代替选择皮肤细胞的存活率高的溶液。此时，可以分析紧密连接中的闭合蛋白和密蛋白中的至少一者，选择闭合蛋白和密蛋白中的至少一者的量多的溶液。通常，如果皮肤细胞干燥，则紧密连接受损，闭合蛋白和密蛋白的量减少。因此，例如，对在多个溶液中的每个溶液培养的皮肤细胞的紧密连接进行分析，选择紧密连接的损伤小的皮肤细胞的培养所使用的一个或一组溶液，并排除紧密连接的损伤大的皮肤细胞的培养所使用的一个或一组溶液。

根据本发明人们的观点，与健康者的皮肤细胞相比，由从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞诱导出的iPS细胞诱导而得的皮肤细胞，具有对干燥没有抵抗力的倾向。因此，通过使用由从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞诱导出的iPS细胞诱导而得的皮肤细胞，能够筛选有效的抗干燥物质。

(第五实施方式)

第五实施方式的皮肤的干燥耐受性检查方法包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于受试者的体细胞制作而成；对皮肤细胞进行干燥；以及检查皮肤细胞的存活率。

受试者可以是疾病患者，也可以是健康者。来源于受试者的体细胞预先从受试者处获得，该方法也可以不包括从受试者获取体细胞的步骤。如果皮肤细胞的存活率高，则可以判定为受试者的皮肤细胞具有干燥耐受性。如果皮肤细胞的存活率低，则可以判定为受试者的皮肤细胞不具有干燥耐受性。根据该方法，能够基于皮肤细胞的存活率的检查结果，检查受试者的皮肤细胞是否具有干燥耐受性。

应予说明，也可以检查皮肤细胞的紧密连接的损伤来代替检查皮肤细胞的存活率。在紧密连接的损伤小的情况下，可以判定为受试者的皮肤细胞具有干燥耐受性，在紧密连接的损伤大的情况下，可以判定为受试者的皮肤细胞不具有干燥耐受性。

(第六实施方式)

第六实施方式的抗氧化应激物质的筛选方法包括：准备从iPS细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该iPS细胞从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞制作而成；对皮肤细胞给予氧化应激；将经给予氧化应激的皮肤细胞在多个不同的溶液中的每个溶液中进行培养；以及选择皮肤细胞的存活率高的溶液。

对与第二实施方式同样地分化诱导而成的皮肤细胞在适当培养后给予氧化应激。给予皮肤细胞氧化应激的方法虽然没有特别的限定，但包括例如，向正在培养皮肤细胞的培养基中添加双氧水等氧化物质。给予皮肤细胞氧化应激的方法和给予皮肤细胞氧化应激的时间根据所筛选的抗氧化应激物质的用途、用法和用量等适当地设定。经给予氧化应激的皮肤细胞在除去例如给予氧化应激的物质后，在分别含有成为筛选对象的不同物质的多个不同溶液中的每个溶液中进行培养。溶液可以是培养基。溶液中的筛选对象物质和培养时间等根据所筛选的抗氧化应激物质的用途、用法和用量等适当地设定。

然后，检测在多个溶液中的每个溶液培养出的皮肤细胞的存活率，选择皮肤细胞的存活率高的溶液作为包括抗氧化应激物质的溶液。例如，检测在多个溶液中的每个溶液中培养出的皮肤细胞的存活率，选择存活率高的皮肤细胞的培养所使用的一个或一组溶液，并排除存活率低的皮肤细胞的培养所使用的一个或一组溶液。

根据本发明人们的观点，与健康者的皮肤细胞相比，由从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞诱导出的iPS细胞诱导而得的皮肤细胞，具有对氧化应激没有抵抗力的倾向。因此，通过使用由从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞诱导出的iPS细胞诱导而得的皮肤细胞，能够筛选有效的抗氧化应激物质。

(第七实施方式)

第七实施方式的皮肤的氧化应激耐受性检查方法包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于受试者的体细胞制作而成；给予皮肤细胞氧化应激；以及检查皮肤细胞的存活率。

受试者可以是疾病患者，也可以是健康者。来源于受试者的体细胞预先从受试者处获得，该方法可以不包括从受试者获取体细胞的步骤。如果因氧化应激导致的皮肤细胞的损伤大，则可以判定为受试者的皮肤细胞不具有氧化应激耐受性。如果因氧化应激导致的皮肤细胞的损伤小，则可以判定为受试者的皮肤细胞具有氧化应激耐受性。根据该方法，能够基于因氧化应激导致的皮肤细胞的损伤的检查结果，检查受试者的皮肤细胞是否具有氧化应激耐受性。

(第八实施方式)

第八实施方式的保湿促进物质的筛选方法包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞制作而成；将皮肤细胞在多个不同的溶液中的每个溶液进行培养；以及从多个不同的溶液中选择来源于皮肤细胞的天然保湿因子的量多的溶液。

将与第二实施方式同样地分化诱导出的皮肤细胞在分别含有成为筛选对象的不同物质的多个不同溶液中的每个溶液中进行培养。溶液中的筛选对象物质和培养时间等根据所筛选的保湿促进物质的用途、用法和用量等适当地设定。

然后，检测多个溶液中的每个溶液中的来源于皮肤细胞的天然保湿因子的量。作为天然保湿因子，虽然没有特别的限定，但可列举神经酰胺和丝聚蛋白。选择天然保湿因子的量多的溶液作为含有保湿促进物质的溶液。例如，检测多个溶液中的每个溶液中天然保湿因子的量，选择天然保湿因子的量多的一个或一组溶液，并排除天然保湿因子的量少的一个或一组溶液。

根据本发明人们的观点，如果老化和/或皮肤疾病进展，则皮肤细胞中的保湿促进物质的表达量有降低的倾向。因此，通过使用由从来源于早衰症患者和皮肤疾病患者等老化疾病患者或皮肤疾病患者的体细胞诱导出的iPS细胞诱导而得的皮肤细胞，能够筛选有效的保湿促进物质。

(第九实施方式)

第九实施方式的皮肤的保湿能力的检查方法包括：准备从多能性干细胞分化诱导而得的皮肤细胞，该多能性干细胞从来源于受试者的体细胞制作而成；培养皮肤细胞；以及检查来源于皮肤细胞的天然保湿因子的量。

受试者可以是疾病患者，也可以是健康者。来源于受试者的体细胞预先从受试者处获得，该方法可以不包括从受试者获取体细胞的步骤。如果来源于皮肤细胞的天然保湿因子的量大，则可以判定为受试者的皮肤细胞的保湿能力高。如果来源于皮肤细胞的天然保湿因子的量小，则可以判定为受试者的皮肤细胞的保湿能力低。根据该方法，能够基于来源于皮肤细胞的天然保湿因子的量，检查受试者的皮肤细胞是否具有保湿能力。

实施例

(实施例1：将血液细胞重编程为iPS细胞的同时进行培养的培养基的制备)

在无血清且来源于动物的成分的造血系统细胞培养基(Stemspan ACF，干细胞技术有限公司)中添加生长因子，而制备出造血系统细胞培养基。在12孔培养皿的各孔中接种2×10⁵个血液细胞(末梢血单核细胞)，在各个孔中滴加造血系统细胞凝胶培养基，使血液细胞悬浮于造血系统细胞凝胶培养基中。然后，将12孔培养皿静置于37℃的CO₂培养箱中，对细胞进行悬浮培养。

从开始培养细胞起3天后，在各个孔中适当追加造血系统细胞凝胶培养基。从开始培养细胞起6天后，在各个孔中，以使病毒效价(Titer)成为1～20的方式，将iPS细胞制作用仙台病毒载体试剂盒(CytoTune 2.0 Reprogramming Kit(重编程试剂盒)，注册商标，赛默飞世尔科技公司)加入到培养液中，从而导入基因，或者将附加体质粒(赛默飞世尔科技公司)进行电穿孔从而导入基因后，在各个孔中加入凝胶培养基，并培养细胞。

以使最终浓度为0.02％的方式向hES培养基中添加结冷胶，制备出干细胞凝胶培养基。从感染两天后起，每两天一次地向各个孔中加入2mL的干细胞凝胶培养基。感染14天后，确认诱导出iPS细胞团，回收凝胶培养基上清。用过滤器将回收的凝胶培养基上清过滤并灭菌，将通过过滤器的凝胶培养基上清作为实施例1的重编程培养基的上清。

(参考例1：将iPS细胞维持未分化状态的同时进行培养的培养基的制备)

使用mTeSR1(注册商标，干细胞技术有限公司)或StemFit(注册商标、味之素公司)，在用Matrigel(注册商标，康宁公司)或层粘连蛋白511包被的粘附培养用培养皿上，对人类iPS细胞进行粘附维持培养。人类iPS细胞每1周进行传代。传代时，用ES细胞解离液(TrypLE Select，注册商标，赛默飞世尔科技公司)进行处理。

使用ES细胞解离液(TrypLE Select，注册商标，赛默飞世尔科技公司)将如上所述维持培养出的人类iPS细胞从粘附培养用培养皿剥离，并分割成单细胞。然后，在添加结冷胶和10μmol/L的ROCK抑制剂(Selleck公司)而凝胶化的干细胞用培养基中接种人类iPS细胞，将人类iPS细胞悬浮培养14天。在悬浮培养14天的情况下，每两天一次地向培养器中补充凝胶化的干细胞用培养基。

然后，用筛网过滤器过滤悬浮有人类iPS细胞的凝胶化干细胞用培养基，除去细胞团。进而，将经过滤的凝胶化干细胞用培养基在1500g离心5分钟，从而使细胞和凝胶沉淀，将离心后的干细胞用培养基的上清再次回收后，在3000转速下离心3分钟，用0.22μm的过滤器过滤离心后的干细胞用培养基的上清。将过滤后的干细胞用培养基的上清作为参考例1的维持培养iPS细胞后的培养基的上清。

另外，确认了维持培养而得的iPS细胞的作为未分化标志物的NANOG、OCT3/4和TRA1-60为阳性。

(实施例2：基于成纤维细胞的透明质酸产生试验)

准备了添加有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基作为增殖培养基A。然后，将来源于成人的正常人类成纤维细胞(KF-4109，Strain No.(菌株编号)01035、日本仓敷纺绩株式会社)以浓度变为5×10³细胞/0.1mL/孔的方式悬浮于增殖培养基A，并接种于96孔板，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)培养1天。

准备了添加有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基作为试验培养基A。然后，将实施例1和参考例1的上清溶液分别与试验培养基A混合，得到浓度为10％的实施例1和参考例1的上清添加培养基A。将正培养成纤维细胞的一部分的孔内的增殖培养基A分别替换为实施例1和参考例1的上清添加培养基A。另外，将一部分的孔的增殖培养基A替换为未添加FBS、青霉素-链霉素和上清的DMEM培养基(无添加试验培养基A)作为阴性对照。

更换培养基后，培养成纤维细胞3天，回收培养基的上清，使用DueSetHyaluronan(DueSet透明质酸检测试剂盒)(型号(Cat.No.)：DY3614，安迪生物公司(R&D Systems))检测培养基的上清的透明质酸浓度。结果在图1示出。确认了：与在添加有参考例1的维持培养了iPS细胞的培养基的上清的培养基中培养出的成纤维细胞相比，在添加有实施例1的重编程培养基的上清的培养基中培养出的成纤维细胞产生了成倍以上的透明质酸。

(实施例3：iPS细胞的提取液的制备)

将iPS细胞在各个基质胶包被和层粘连蛋白包被上使用各个Teser1、Teser2、StemFit、Essential8、Teser-E8、Nutri Stem进行培养。在iPS细胞达到80％汇合的阶段，使用Tryple Select(细胞解离液)将iPS细胞从培养器剥离，将包含被剥离的iPS细胞的溶液以200g离心5分钟，将iPS细胞收集于1.5mL的试管中。然后，用碾槌(Pestle in G-Tube、赛默飞世尔科技公司)研磨iPS细胞的细胞团，用液氮将包含被磨碎的iPS细胞糊的iPS细胞的提取液瞬间冷冻。在使用iPS细胞的提取液时，将iPS细胞的提取液悬浮于5mL的培养液中，在4℃下孵育一夜，次日将悬浮液在1500g离心10分钟，从溶液中除去细胞碎片。然后，用过滤器过滤溶液，将通过过滤器的溶液作为iPS细胞的提取液。

(实施例4：基于成纤维细胞的I型胶原产生试验)

与实施例2同样地使用增殖培养基A培养来源于成人的正常人类成纤维细胞。另外，与实施例2同样地准备试验培养基A。然后，将实施例3的iPS细胞的提取液与试验培养基A混合，得到含有浓度为50.0v/v％或100.0v/v％的实施例3的iPS细胞的提取液的提取液添加培养基A。将正在培养成纤维细胞的一部分孔内的增殖培养基A替换为提取液添加培养基A。另外，将一部分孔的增殖培养基A替换为未添加FBS、青霉素-链霉素、和iPS细胞的提取液的DMEM培养基(无添加试验培养基A)作为阴性对照。

更换培养基后，培养成纤维细胞3天，回收培养基的上清并于-80℃下保存。然后，将培养基的上清解冻，用人类Ⅰ型胶原酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(型号：EC1-E105)检测培养基的上清的I型胶原的浓度。将结果在图2和图3示出。确认了与用未添加iPS细胞的提取液的培养基培养出的成纤维细胞相比，添加了iPS细胞的提取液的培养基培养出的成纤维细胞产生了大量的胶原。

(实施例5：毛乳头细胞的增殖性试验)

准备已添加专用添加剂(胎牛血清、胰岛素-转铁蛋白-三碘甲状腺原氨酸混合液、牛垂体提取液、醋酸环丙氯地孕酮(cyproteron acetate))的毛乳头细胞专用培养基(型号：TMTPGM-250、东洋纺公司(TOYOBO))作为增殖培养基B。接下来，将正常人类毛乳头细胞(型号：CA60205a、批号(Lot.No.)：2868、东洋纺公司)以浓度达到1.2×10⁴细胞/0.3mL/孔的方式悬浮于增殖培养基B，并接种于I型胶原包被的48孔板中，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)培养1天。

将实施例3的iPS细胞的提取液和未添加添加剂的毛乳头细胞专用培养基(无添加试验培养基B)混合，得到含有浓度为50.0v/v％或100.0v/v％的实施例3的iPS细胞的提取液的提取液添加培养基B。将一部分孔的增殖培养基B替换为未添加添加剂和iPS细胞的提取液的毛乳头细胞专用培养基(无添加试验培养基B)作为阴性对照。

在替换后的培养基中培养毛乳头细胞3天，用WST-8法进行活细胞数检测。将结果在图4和图5示出。确认了与使用了不含iPS细胞的提取液的无添加试验培养基B的情况相比，使用了含有实施例3的iPS细胞的提取液的无添加试验培养基B的情况下毛乳头细胞增殖情况更优。因此，启示iPS细胞的提取液具有治疗毛发稀少、预防脱发、促进毛发生长和促进生发等育发和生发的效果。

(实施例6：基于毛乳头细胞的VEGF产生试验)

与实施例5同样地在增殖培养基B中培养正常人类毛乳头细胞1天。然后，以浓度成为10.0v/v％和20.0v/v％的方式在一部分孔内的增殖培养基B中添加实施例1的重编程培养基的上清。另外，以浓度成为50.0v/v％和100.0v/v％的方式在一部分孔内的增殖培养基B中添加实施例3的iPS细胞的提取液。

将一部分孔的增殖培养基B替换为无添加试验培养基B来作为阴性对照。另外，将一部分孔的增殖培养基B分别替换为在毛乳头细胞专用培养基中添加100μmol/L腺苷而得的腺苷添加培养基、以及在毛乳头细胞专用培养基中添加30μmol/L米诺地尔而得的米诺地尔添加培养基作为参考对照。另外，将一部分孔的增殖培养基B替换为在毛乳头细胞专用培养基中添加0.1％DMSO而得的DMSO添加培养基作为米诺地尔的赋形剂对照(vehiclecontrol)。

更换培养基后，培养毛乳头细胞3天，回收培养基的上清，并在-80℃下保存。然后，将培养基的上清解冻，使用人类ELISA试剂盒(型号：ab100519、艾博抗公司(Abcam))检测培养基的上清的血管内皮生长因子(VEGF)浓度。结果在图6和图7示出。显示出诱导培养了iPS细胞的培养基的上清和iPS细胞的提取液促进毛乳头细胞产生VEGF。由此，启示诱导培养了iPS细胞的培养基的上清和iPS细胞的提取液对育发、生发和荣发有效。

(实施例7：基于毛乳头细胞的FGF-7产生试验)

将一部分孔的增殖培养基B替换为无添加试验培养基B作为阴性对照。另外，将一部分孔的增殖培养基B分别替换为在毛乳头细胞专用培养基中添加100μmol/L腺苷而得的腺苷添加培养基、以及在毛乳头细胞专用培养基中添加30μmol/L米诺地尔而得的米诺地尔添加培养基作为参考对照。另外，将一部分孔的增殖培养基B替换为在毛乳头细胞专用培养基中添加0.1％DMSO而得的DMSO添加培养基作为米诺地尔的赋形剂对照。

更换培养基后，培养毛乳头细胞3天，回收培养基的上清，并在-80℃下保存。然后，将培养基的上清解冻，使用FGF-7人类ELISA试剂盒(型号：ab100519、艾博抗公司)检测培养基的上清的成纤维细胞生长因子7(FGF-7)浓度。结果在图8和图9示出。显示出诱导培养了iPS细胞的培养基的上清和iPS细胞的提取液促进毛乳头细胞产生FGF-7。由此，启示诱导培养了iPS细胞的培养基的上清和iPS细胞的提取液对育发、生发和荣发有效。

(实施例8：成纤维细胞的迁移性试验)

将来源于成人的正常人类成纤维细胞以浓度成为1×10⁵～2×10⁵细胞/孔的方式悬浮于10％FBS培养基中，并接种于检测迁移能力的试剂盒(Radius Cell MigrationAssay，注册商标)的板中。接下来，用10μg/mL的丝裂霉素C(型号：20898-21、Nacalaitesque公司)处理人类成纤维细胞2小时，使人类成纤维细胞的细胞停止分裂。然后，将人类成纤维细胞在CO₂培养箱(5％CO₂、37℃)中培养1天。

将一部分板内的培养基替换为在10％FBS培养基中以浓度成为10v/v％的方式添加实施例3的iPS细胞的提取液而得的培养基。另外，将一部分板内的培养基替换为在10％FBS培养基中以浓度成为10.0v/v％及20.0v/v％的方式添加实施例1所述的重编程培养基的上清而得的培养基。

将一部分板上的增殖培养基B替换为作为阴性对照而未添加增殖添加剂的表皮细胞培养基(无添加试验培养基B)。

按照试验方案处理人类成纤维细胞，从而实施迁移试验。在创伤治愈的过程中，人类成纤维细胞向创伤迁移而创伤收缩。在本实施例中，使用酶标仪分析人类成纤维细胞是否迁移至迁移试验前被塞子塞住而未粘附人类成纤维细胞的部分。具体来说，从替换培养基起23小时后，用Hechest对表皮细胞进行染色并观察。

结果在图10和图11示出。确认了iPS细胞的提取液和诱导培养了iPS细胞的培养基的上清促进人类成纤维细胞的迁移能力。因此，显示出iPS细胞的提取液和诱导培养了iPS细胞的培养基的上清对创伤治愈有效。

(实施例9：准备来源于早衰症患者的细胞)

来源于沃纳综合症患者的成纤维细胞(AG04110)、来源于色素性干皮症患者的成纤维细胞(GM16684和GM16687)和来源于柯凯恩综合症患者的成纤维细胞(GM01098)购自科里耶尔医学研究所(Coriell Institute for Medical Research)。将来源于这些早衰症患者的成纤维细胞诱导为iPS细胞。进一步将iPS细胞分化诱导为皮肤成纤维细胞。

(实施例10：皮肤成纤维细胞的UV照射试验)

将各来源于成人的正常人类皮肤成纤维细胞和在实施例9中准备的从早衰症患者的体细胞诱导的皮肤成纤维细胞以浓度成为2×10⁵细胞/孔的方式悬浮于试验培养基A，并接种于6孔板，在CO₂培养箱内(5％CO₂、37℃)培养1天。

第二天，使用UV照射机对孔内的各皮肤成纤维细胞照射302nm的紫外线15分钟。接下来，将参考例1的上清溶液和试验培养基A以按照体积比计为10.00：90.00的方式混合，得到浓度为10.00v/v％的参考例1的上清添加培养基A。将一部分孔内的试验培养基A替换为参考例1的上清添加培养基A。第二天，用胰蛋白酶从孔中剥离所有细胞，将细胞用7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色后，使用流式细胞仪检测死亡细胞率。

其结果是，如图12所示，对于任一种皮肤成纤维细胞而言，与未被照射UV的细胞相比，照射了UV的细胞的死亡细胞率均上升。另外，与正常皮肤成纤维细胞相比，由早衰症患者的体细胞诱导而得的皮肤成纤维细胞的因UV照射引起的死亡率更高。但是，与未添加维持培养iPS细胞时的培养基的上清的培养基中的皮肤成纤维细胞相比，添加了维持培养iPS细胞时的培养基的上清的培养基中的皮肤成纤维细胞的存活率更高。因此，启示由早衰症患者的体细胞诱导而得的皮肤成纤维细胞对于UV照射是敏感的，适用于抗UV物质的筛选。

(实施例11：皮肤成纤维细胞的干燥刺激试验)

与实施例10同样地，使用试验培养基A培养各来源于成人的正常人类皮肤成纤维细胞和在实施例9中准备好的由早衰症患者的体细胞诱导而得的皮肤成纤维细胞培养1天。第二天，在超净台的通风口内使各孔干燥40秒。接下来，将一部分孔内的试验培养基A替换为参考例1的上清添加培养基A。另外，将实施例1的上清溶液与试验培养基A以按照体积比计为10.00：90.00的方式混合，得到浓度为10.00v/v％的实施例1的上清添加培养基A。将一部分孔内的试验培养基A替换为实施例1的上清添加培养基A。第二天，用胰蛋白酶从孔中剥离全部细胞，将细胞用7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色后，使用流式细胞仪检测死亡细胞率。

其结果是，如图13所示，与正常皮肤成纤维细胞相比，由早衰症患者的体细胞诱导而得的皮肤成纤维细胞的因干燥刺激引起的死亡率更高。但是，与未添加维持培养iPS细胞时的培养基的上清的培养基中的皮肤成纤维细胞相比，添加了维持培养iPS细胞时的培养基的上清的培养基中的皮肤成纤维细胞的存活率更高。另外，与添加了维持培养iPS细胞时的培养基的上清的培养基中的皮肤成纤维细胞相比，添加了将血液细胞诱导培养为iPS细胞时的培养基的上清的培养基中的皮肤成纤维细胞的存活率更高。因此，启示由早衰症患者的体细胞诱导而得的皮肤成纤维细胞对干燥刺激敏感，适用于抗干燥刺激物质的筛选。

(实施例12：皮肤成纤维细胞的氧化应激试验)

与实施例10同样地，使用试验培养基A，培养各来源于成人的正常人类皮肤成纤维细胞和在实施例9中准备好的由早衰症患者的体细胞诱导而得的皮肤成纤维细胞培养1天。第二天，向各孔的试验培养基A中以浓度成为0.03％的方式加入过氧化氢。10分钟后，将一部分孔内的培养基倒回到不含过氧化氢的试验培养基A中。另外，将一部分孔内的培养基分别替换为实施例1和参考例1的上清添加培养基A。进一步地，将一部分孔内的培养基替换为包含实施例3的iPS细胞的提取液的培养基。第二天，用胰蛋白酶从孔中剥离全部细胞，将细胞用7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色后，使用流式细胞仪检测死亡细胞率。

其结果是，如图14和图15所示，与正常皮肤成纤维细胞相比，由色素性干皮病患者的体细胞诱导而得的皮肤成纤维细胞的因干燥刺激所致的死亡率更高。图15表示由色素性干皮病患者的体细胞诱导而得的皮肤成纤维细胞的死亡细胞率。如图15所示，与无添加的试验培养基A中的皮肤成纤维细胞相比，添加了维持培养iPS细胞时的培养基的上清的培养基、添加了将血液细胞诱导培养为iPS细胞时的培养基的上清的培养基、以及添加了iPS细胞的提取液的培养基中的皮肤成纤维细胞的存活率更高。因此，启示由色素性干皮病患者的体细胞诱导而得的皮肤成纤维细胞对于氧化应激敏感，适用于抗氧化应激物质的筛选。

(参考例)

按照日本特开2016-128396号公报中记载的实施例培养人类iPS细胞。即，使用与实施例1相同的干细胞用培养基，在粘附培养用培养皿上的饲养细胞上对人类iPS细胞进行粘附维持培养。人类iPS细胞每周进行传代。在传代时，用含有0.25％胰蛋白酶、0.1mg/mL胶原酶IV、1mmol/LCaCl₂和20％KSR的剥离溶液处理人类iPS细胞。

使用ES细胞解离液(TrypLE Select、注册商标、赛默飞世尔科技公司)从粘附培养用培养皿剥离如上所述培养出的人类iPS细胞。将剥离出的人类iPS细胞在加入非粘附培养用培养皿中的未凝胶化的人类iPS细胞中悬浮培养1周。其结果是形成了类胚体(EB)。将形成的类胚体接种在粘附培养用培养皿上，并使其在含有10％FBS和1％アンチアンチ(注册商标、抗真菌剂)的DMEM中生长(outgrowth)1周。

接下来，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液从粘附培养用培养皿剥离细胞，将分割成单细胞的细胞接种于新的粘附培养用培养皿。然后，使用含有10％FBS的DMEM作为培养基培养细胞1周。

在确认细胞达到70％～80％以上汇合后，对细胞进行观察。将在本参考例中培养出的细胞的照片示于图16的(a)。通常，未分化的iPS细胞的形态为如图16的(b)所示的照片那样。因此，在形态上观察到本参考例中培养出的细胞并未维持未分化状态。另外，将本参考例的细胞培养21天后，用经荧光试剂标记的抗OCT3/4抗体和经荧光试剂标记的抗NANOG抗体处理细胞后，用显微镜观察细胞，并将结果在图17示出。图17的(a)示出不使用激发光观察到的细胞的照片。图17的(b)示出使用结合于抗OCT3/4抗体的荧光试剂所对应的激发光而观察到的细胞的照片。图17的(c)示出使用结合于抗NANOG抗体的荧光试剂所对应的激发光观察到的细胞的照片。确认了在图17的(b)和图17的(c)中未观察到荧光，细胞是OCT3/4阴性和NANOG阴性。而且，用流式细胞仪检查细胞后，确认了培养出的细胞的作为未分化标志物的NANOG、OCT3/4和TRA1-60为阴性。由此，确认了细胞并未维持未分化状态，而是进行了分化。

Claims

1.一种使单核细胞重编程至iPS细胞团时所使用的培养基的上清在制备用于防止形成和改善皮肤的斑点、皱纹和松弛中的任一种的医药品组合物中的用途。

2.一种使非人类的动物的单核细胞重编程至iPS细胞团时所使用的培养基的上清在防止形成和改善皮肤的斑点、皱纹和松弛中的任一种的化妆品组合物中的用途。

3.一种使单核细胞重编程至iPS细胞团时所使用的培养基的上清在制备育发、生发、荣发药物中的用途。

4.一种使单核细胞重编程至iPS细胞团时所使用的培养基的上清在制备创伤治疗药物中的用途。