CN102242146B

CN102242146B - 组合物和用其产生诱导全能干细胞的方法

Info

Publication number: CN102242146B
Application number: CN201110116758.8A
Authority: CN
Inventors: 刘承权; 文哉喜; 金俊成; 尹炳善; 李重翰; 全恩暻; 许峻硕; 金智儇; 黄志惠; 权秀贤
Original assignee: Industry Academy Collaboration Foundation of Korea University
Current assignee: Korea University Research and Business Foundation
Priority date: 2010-05-10
Filing date: 2011-05-06
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2031-05-06
Also published as: US20110275157A1; US8518700B2; CN102242146A

Abstract

本发明涉及组合物和用其产生诱导型全能干细胞的方法。公开了一种用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞的组合物，所述组合物包含：a)Bmi1(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码Bmi1蛋白的核酸分子；和b)至少一种低分子量物质，所述至少一种低分子量物质选自由MEK/ERK(有丝分裂原激活蛋白激酶/细胞外调节激酶)抑制剂与GSK(糖原合成酶激酶)抑制剂组、G9a？HMT酶(G9a组蛋白甲基转移酶)抑制剂与DMNT(DNA甲基转移酶)抑制剂组以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂组成的组。此外，提供了一种使用所述组合物对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞的方法。

Description

组合物和用其产生诱导全能干细胞的方法

技术领域

本发明涉及使体细胞重编程以产生胚胎干细胞样细胞的组合物，以及使用所述组合物产生胚胎干细胞样细胞的方法，所述组合物包含Bmi1和低分子量物质。更具体而言，本发明涉及通过将Bmi1导入体细胞并用包含MEK抑制剂和GSK抑制剂的低分子量物质对细胞进行处理而使体细胞重编程以产生胚胎干细胞样细胞的组合物，以及使用所述组合物产生胚胎干细胞样细胞的方法。

背景技术

与普通的体细胞不同，干细胞具有自我更新性(即经过多个细胞分裂循环依然保持未分化状态的能力)和潜能(即在合适的条件下分化为专门细胞类型的能力)。潜能(potency)特指干细胞的分化潜力，并通常分为全能、多能和单能。因此，使干细胞在细胞培养物中进行自我更新并将它们转化为专门细胞的技术在各种疾病的细胞疗法中具有较高的潜在功用。

包括造血干细胞、骨髓干细胞和神经干细胞在内的各种干细胞存在于成人体中，并且可以将其从患者自身分离，因而可用于医疗而不会诱发免疫排斥响应。使用成体干细胞的细胞疗法解决了妥善保管器官移植供体的难题。

然而，迄今为止，已知成体干细胞保留了多能性。即，组织特异性干细胞能分化为多种细胞，但仅仅是密切相关的细胞家族中的那些细胞。许多报道提到了以下效果，即分离自中枢神经系统(Science255,1707-1710，1992;Science287,1433-1438，2000)、骨髓(Science276,71-74,1997;Science287,1442-1446,2000;Science284,143-147,1999)、视网膜(Science287,2032-2036,2000)和骨骼肌(Proc.Natl.Acad.Sci.USA96,14482-14486,1999;Nature401,390-394,1999)的干细胞分化为密切相关的组织细胞。例如，造血干细胞能被分化为血液相关细胞，神经干细胞能被分化为神经元或神经胶质细胞，以及骨髓干细胞能被分化为中胚层细胞。此外，尽管理论上它们能够进行无限的自我更新，但成体干细胞据报道难以在体外增殖。实践中很难从患者分离大量细胞。

全能干细胞是克服成体干细胞缺点的理想资源。全能干细胞能分化为几乎任何细胞并且能在体外无限复制。迄今已知的全能干细胞有胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和胚胎癌细胞，大多数研究集中于胚胎干细胞用于分化为特定细胞、在疾病动物模型中的功能性以及针对各种疾病的治疗潜在功效。

尽管如此，与成体干细胞相似，胚胎干细胞的临床使用也遇到必须克服的障碍。首先，由于分离胚胎干细胞将导致已受精的人胚胎的死亡，这引发了伦理问题。而且，当将源自胚胎干细胞的已分化细胞植入患者时会有免疫排斥问题。

针对上述问题已提出各种尝试方法，其中最受关注的是将已分化的细胞重编程为分化之前的细胞。重编程是表达诱导分化的细胞以去分化为全能干细胞(诸如胚胎干细胞)的通用术语，其通常通过1)核转移、2)细胞融合、3)细胞提取物处理和4)用于诱导全能干细胞(iPS细胞)的去分化技术(Cell132,567-582,2008)实现。

与任何其他技术相比，iPS细胞技术成功产生更接近于胚胎干细胞的细胞。自2006年首次产生iPS细胞以来，已经发表了大量研究文章。原则上，通过将四种基因(重编程诱导基因；Oct4、Sox2、Klf4和C-Myc/Oct4、Sox2、Nanog和Lin28)转染到小鼠或人的体细胞中，随后在胚胎干细胞专用条件下长时间培养，就可得到与胚胎干细胞相似的干细胞，例如iPS细胞。这些iPS细胞已显示出在其基因表达方式、表观遗传状况、向所有三种胚层的体外/体内分化、畸胎瘤形成、嵌合小鼠生成和嵌合小鼠的种系传递能力(Cell126,663-676,2006;Science318,1917-1920,2007)等方面与胚胎干细胞相类似。

然而，重编程使用了过多的遗传因子导致难以理解重编程所基于的分子机理。为了在实践临床应用中发挥iPS细胞的全部潜能，必要的是改善所述已建立起来的重编程技术，并且对每种产生的iPS细胞系的安全和功效进行评估。

最近的研究报道指出肿瘤抑制基因p53的失活显著地提高iPS的效率(Nature460,1132-1135,2009)。p19^Arf和p16^Ink4a均由Arf/Ink4a基因座的替代性阅读框进行编码，已知其分别诱导p53和Rb的表达。相对于只降低p19^Arf表达所能获得的iPS细胞形成，通过同时减少p16^Ink4a和p19^Arf的表达能增加iPS细胞形成(Nature,460,1140-1144,2009)。

多梳组(PcG)蛋白是表观遗传学基因沉默子。Bmi1是PcG蛋白之一，参与p16^Ink4a和p19^Arf的下调，这导致对P53和Rb表达的抑制(GenesDev,2678-2690,1999)。此外，已知Bmi1通过重塑染色质组织而调节靶标基因的表达。这些功能使得Bmi1在神经干细胞和造血干细胞的自我更新中起到重要作用。基于此，本发明人通过在星形胶质细胞中过表达Bmi1而成功地对星形胶质细胞进行重编程，从而诱导出神经干细胞。所诱导的神经干细胞在许多方面与从小鼠分离的神经干细胞相类似。尤其是，发现所诱导的神经干细胞具有提高的Sox2表达水平，Sox2是作为重编程诱导基因之一的神经干细胞自我更新所必需的基因(BiochemBiophysResCommun.371,267-272,2008)。

体细胞需要四种(Oct4、Sox2、Klf4、C-Myc)或三种(Oct4、Sox2、Klf4)基因以用于其去分化。已知可以不将这些基因额外导入内源性表达这些基因的细胞。已代表性地证实单独导入Oct4可诱导由小鼠/人神经干细胞生成iPS细胞，这是由于小鼠/人神经细胞显示出Sox2、Klf4和C-Myc的内源性表达(Nature,461,649-653,2009)。

据报道，添加MEK抑制剂PD0325901和GSK3β抑制剂CHIR99021能够诱导前iPS细胞的分化，所述前iPS细胞是成为完全重编程的细胞的去分化过程的中间状态(PLoSOne,6,2237-2247,2008)。

另外，已知在去分化过程中使用G9aHMT酶抑制剂和DMNT抑制剂提高了重编程的效率(CellStemCell,3,568-574,2008)。

重编程的效率也可通过作为分化过程的一部分的用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(VPA)的处理而得到改善(CellStemCell,4,301-312,2009)。

然而，已知在本领域中还没有通过导入Bmi1基因并用低分子量物质进行处理来诱导去分化和形成全能胚胎干细胞样细胞的方法。

发明内容

本发明人此前发现，通过Oct4的过表达结合可导致Sox2诱导以及p16^Ink4a和p19^Arf下调的Bmi1过表达，以及通过控制培养条件，能够诱导小鼠体细胞分化成为上胚层干细胞样细胞。在这种情况下，将形成的细胞鉴定为干细胞样细胞可通过用GFP进行选择而实现，所述GFP来自其中导入了Oct4启动子GFP的细胞。然而，由此形成的细胞显示出与前iPS类似的性状。当将这些细胞用低分子量物质PD0325901和CHIR99021处理，并且在小鼠干细胞的培养条件下培养时，据显示其可进一步去分化为表现出胚胎干细胞性状的iPS细胞。

此外还发现，用低分子量物质BIX02194(G9a组蛋白甲基转移酶(G9aHMT酶)抑制剂)和RG108(DNA甲基转移酶(DMNT)抑制剂)组合的处理或者用VPA(丙戊酸，组蛋白去乙酰化酶抑制剂)的处理以及小鼠胚胎干细胞培养条件诱导经Bmi1转导的小鼠细胞去分化为具有与胚胎干细胞的性状类似的性状的干细胞系。

基于这些发现，Bmi1转导的细胞用低分子量物质进行处理并在用于胚胎干细胞的条件培养。因此，建立了类似胚胎干细胞的细胞系。已经发现所建立的细胞系与小鼠胚胎干细胞之间的各种性质均高度相似，所述性质包括基因表达、表观遗传学和畸胎瘤形成。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于对体细胞进行重编程从而产生胚胎干细胞样细胞的组合物，所述组合物包含Bmi1基因和至少一种低分子量物质，所述至少一种低分子量物质选自：MEK抑制剂与GSK抑制剂组；G9aHMT酶抑制剂与DMNT抑制剂组；以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂(VPA)。

本发明的另一个目的是提供使用Bmi1基因和低分子量物质对体细胞进行重编程从而产生显示出胚胎肝细胞性状的诱导全能干细胞的方法。

本发明的又一个目的是提供通过所述方法建立的胚胎干细胞样细胞。

附图说明

通过以下详细描述并结合附图，能更清楚地理解本发明的上述以及其他目的、特点和其它优点，所述附图中：

图1A和1B显示了在特定的培养条件下将Bmi1转导的小鼠体细胞转变为胚细胞样细胞；

图1A是显示在特定的培养条件下Bmi1转导的小鼠体细胞变为胚细胞样细胞的随时间推移的形态变化的显微照片；

图1B是显示在特定条件下培养的Bmi1转导的小鼠体细胞的与胚细胞样细胞相同的基因表达模式的RT-PCR照片；

图2A～2C显示低分子量物质PD0325901和CHIR99021对Bmi1转导的小鼠体细胞重编程以产生iPS细胞的影响；

图2A是显示iPS细胞的荧光显微照片，所述iPS细胞通过在特定条件下培养Bmi1转导的小鼠体细胞以形成上胚层干细胞样细胞、将Oct4启动子GFP导入细胞中以选择Oct4阳性细胞、用0.5μMPD0325901和3μMCHIR99021处理Oct4阳性细胞并将这些细胞在用于胚胎肝细胞的条件下培养而建立(所建立的细胞命名为BC-iPS①)；

图2B显示在通过以PD0325901和CHIR99021处理而建立的iPS细胞中的胚胎干细胞特异性标记物的表达，其由免疫化学染色检测。AP阳性集落通过AP染色检测；

图2C显示在通过以PD0325901和CHIR99021处理而建立的iPS细胞中胚胎干细胞的特征性基因的表达，其由蛋白质印迹分析测定；

图3显示在通过以PD0325901和CHIR99021处理而建立的iPS细胞中，均参与胚胎干细胞自我更新的Oct4和Nanog的启动子区域的去甲基化；

图4显示通过以PD0325901和CHIR99021处理而建立的iPS细胞的胚体自发分化为代表三种胚层的各细胞；

图5显示就iPS细胞中的畸胎瘤形成而言对体内分化为所有三种胚层的诱导，所述iPS细胞通过以PD0325901和CHIR99021样胚胎干细胞处理而建立。将所述iPS细胞在肾包膜下注射到Balb/c裸鼠中，8周～10周后，小鼠发育出畸胎瘤，以备H&E染色；

图6A是显示胚胎干细胞样细胞的荧光显微照片，所述胚胎干细胞样细胞通过在特定条件下培养Bmi1转导的小鼠体细胞以形成上胚层干细胞样细胞、用BIX01294和RG1080处理细胞并在用于胚胎干细胞的条件下培养它们而建立(所建立的细胞命名为BC-iPS②)；

图6B显示胚胎干细胞特异性标记物在通过以BIX01294和RG1080处理而建立的iPS细胞中的表达，其由免疫化学染色检测。AP阳性集落通过AP染色检测；

图6C显示在通过以BIX01294和RG1080处理而建立的iPS细胞中胚胎干细胞的特征性基因的表达，其由蛋白质印迹分析测定；

图7显示在通过以BIX01294和RG1080处理而建立的iPS细胞中的均参与胚胎干细胞自我更新的Oct4和Nanog的启动子区域的去甲基化；

图8显示通过以BIX01294和RG1080处理而建立的iPS细胞的胚体自发分化为代表三种胚层的各细胞；

图9显示就iPS细胞中的畸胎瘤形成而言对体内分化为所有三种胚层的诱导，所述iPS细胞通过以BIX01294和RG1080样胚胎干细胞处理而建立。将所述iPS细胞在肾包膜下注射到Balb/c裸鼠中，8周～10周后，小鼠发育出畸胎瘤，以备H&E染色；

图10A是显示胚胎干细胞样细胞的荧光显微照片，所述胚胎干细胞样细胞通过在特定条件下培养Bmi1转导的小鼠体细胞以形成神经球样细胞、用VPA处理细胞并在用于胚胎干细胞的条件下培养它们而建立(所建立的细胞命名为BC-iPS④)；

图10B显示胚胎干细胞特异性标记物在通过以VPA处理而建立的iPS细胞中的表达，其由免疫化学染色检测。AP阳性集落通过AP染色检测；

图10C显示在通过以VPA处理而建立的iPS细胞中胚胎干细胞的特征性基因的表达，其由蛋白质印迹分析测定，以及由FASC测定的SSEA1和Oct4的表达；

图11显示在通过以VPA处理而建立的iPS细胞中的均参与胚胎干细胞自我更新的Oct4和Nanog的启动子区域的去甲基化；

图12显示在通过以VPA处理而建立的iPS细胞中(如同在胚胎干细胞中)的畸胎瘤形成而言对体内分化为所有三种胚层的诱导。将所述iPS细胞在肾包膜下注射到Balb/c裸鼠中，8周～10周后，小鼠发育出畸胎瘤，以备H&E染色。

具体实施方式

在本发明中，Bmi1转导的小鼠体干细胞在特定条件下培养以形成上胚层干细胞样细胞，Oct4启动子GFP随后被导入该细胞中以选择Oct4阳性细胞。已发现这些细胞在用低分子量物质（例如，PD0325901和CHIR99021组）处理并在用于胚胎干细胞的条件下培养时去分化为全能胚胎干细胞样细胞。

此外，本发明人发现，通过在特定条件下培养Bmi1转导的小鼠体细胞而形成的上胚层干细胞样细胞在用低分子量物质（例如，G9aHMT酶抑制剂和DMNT抑制剂组）处理并在用于胚胎干细胞的条件下培养时能够被诱导以去分化为全能胚胎干细胞样细胞。

根据本发明的一个方面，本发明提供一种用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞的组合物，所述组合物包含：a)Bmi1(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码Bmi1蛋白的核酸分子；和b)至少一种低分子量物质，所述至少一种低分子量物质选自由以下物质组成的组：MEK/ERK（有丝分裂原激活蛋白激酶/细胞外调节激酶）抑制剂与GSK（糖原合成酶激酶）抑制剂组；G9aHMT酶抑制剂（G9a甲基转移酶抑制剂）与DMNT抑制剂（DNA甲基转移酶抑制剂）组；以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

根据其另一个方面，本发明提供一种用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞的方法，所述方法包括：i)将Bmi1(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码Bmi1蛋白的核酸分子引入到所述体细胞中；ii)在用于培养神经干细胞的条件下培养经Bmi1转导的所述体细胞；和iii)用至少一种低分子量物质处理所述细胞，所述至少一种低分子量物质选自由以下物质组成的组：MEK/ERK抑制剂与GSK抑制剂组；G9aHMT酶（组蛋白甲基转移酶）抑制剂与DMNT（DNA甲基转移酶）抑制剂组；以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

在步骤ii)中，将体细胞培养七天或更久。只有在培养七天或更久之后细胞才显示出与胚胎干细胞的特征性基因类似的表达模式，而且在用于细胞疗法时能够改善其分化效率。

根据本发明的一个实施方式，所述方法还包括在胚胎干细胞的培养条件下培养所述细胞。用于胚胎干细胞的培养条件包括通常用于培养胚胎干细胞的任何培养基。在本发明的一个实施方式中，在饲养细胞(feedercell)存在下，在补充有15%FBS(胎牛血清)+1%非必需氨基酸+1%青霉素/链霉素+0.1mMβ-巯基乙醇+1000单位/ml小鼠LIF(白血病抑制因子)的高葡萄糖DMEM中培养Bmi1转导的细胞，每2至3天传代一次。

如本文中所使用，术语“胚胎干细胞(ESC)样细胞”意指以ESC细胞的性质为特征的全能细胞，所述ESC细胞的性质包括但不限于在不转化时增殖、无限复制、自我更新和分化为所有三种胚层。在上下文中，胚胎干细胞样细胞可以与胚胎干细胞或诱导全能干细胞互换使用。

当诱导产生胚胎干细胞样细胞时，对于起始体细胞没有特别限制。只要所述体细胞被诱导进行去分化，可以采用任何体细胞。例如，可以采用胚胎时期的体细胞或成熟体细胞。当所述胚胎干细胞样细胞应用于疾病治疗时，理想的是它们源自患者的体细胞，例如与疾病相关或者参与疾病治疗的体细胞。优选的是，所述体细胞是成纤维细胞，所述成纤维细胞可分离自动物，优选分离自哺乳动物，包括人、小鼠、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗等。所述胚胎时期的体细胞不来自人。

在用于重编程之前，在培养基中培养成纤维细胞。所述培养基可以是任何通常用来培养成纤维细胞的培养基。典型的，所述培养基含有碳源、氮源和痕量元素。在本发明的优选实施方式中，在补充有10%FBS(胎牛血清)、0.1mM非必需氨基酸、1%青霉素/链霉素和0.1mMβ-巯基乙醇的DMEM(高葡萄糖，w/o型丙酮酸钠)中培养成纤维细胞。

根据本发明的一个实施方式，Bmi1可以是蛋白形式，也可以是编码Bmi1蛋白的核酸分子形式。可用于本发明的Bmi1的实例包括来自例如人、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗等动物的那些Bmi1，优选人Bmi1。另外，可用于去分化为胚胎干细胞样细胞的Bmi1蛋白可以具有其自身的野生型氨基酸序列或其变体。

Bmi1蛋白变体指这样的蛋白：由于在一个或多个氨基酸残基处的缺失、插入、非保守或保守取代或它们的组合而具有不同于野生型蛋白的氨基酸序列，但仍保持在生物学上和功能上与之等同，并且生理化学性质上发生改变或未发生改变的蛋白。如果发生改变，所述变体在面对物理和化学条件时可具有更高的结构稳定性，并且可能具有更高的生理活性。

Bmi1优选为作为编码Bmi1蛋白的核苷酸序列提供。

所述核苷酸序列可以编码Bmi1的野生型蛋白或其变体蛋白，如上所述，所述变体蛋白在一个或多个核苷酸残基处通过取代、缺失、插入或它们的组合而被修饰。它们可以从自然界分离或者化学合成。

编码Bmi1蛋白的核苷酸序列可以是单链或双链形式的DNA分子(基因组DNA、cDNA)或RNA分子。

在本发明中，采用本领域中已知技术可以将编码Bmi1蛋白的核苷酸序列诸如以裸DNA载体的形式(Wolff等，Science,1990；Wolff等，JCellSci.103:1249-59,1992)或借助于脂质体或阳离子聚合物引入到宿主细胞中。脂质体是用于基因转移的磷脂膜，由诸如DOTMA和DOTAP等阳离子磷脂的混合物构成。当阳离子脂质体与阴离子核酸分子以一定的比例混合时，形成适用于跨细胞膜基因转移的脂质体复合体。

在本文中所使用的术语“载体”指DNA构建体，其中将所关注的基因可操作地与调节元件相连，从而使得所述基因能在其中锚定有所述载体的适当宿主中表达。

本文中所使用的术语“可操作地相连”意指调节元件和编码所关注的蛋白的核苷酸序列之间以所述元件能用于启动并介导核苷酸序列转录的功能性关系进行的功能性连接。在重组载体中，所述功能性连接可以采用本领域中已知的基因重组技术得到。使用典型酶能实现位点特异性DNA切割和连接。

根据本发明的目的，本发明所用载体的调节元件可以包括用于膜靶定或分泌的信号序列或前导序列，以及表达调节元件如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和增强子。所述启动子可以是组成型或诱导型。此外，所述表达载体可以含有选择标记，从而选取其转化的宿主细胞。如果表达载体可复制，所述表达载体将含有复制起始点。所述载体可以为可自我复制的载体或者可以整合到宿主细胞的染色体中。

质粒、粘粒和病毒载体可落入用于本发明的载体的范围。优选病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于源自诸如HIV(人类免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽肉瘤/造白细胞组织增生)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳氏肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)等逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒的那些病毒载体。在本发明的一个实施方式中，Bmi1基因插入到pBbepuro载体中，即带有嘌呤霉素选择标记的基于MLV(莫洛尼白血病病毒)的病毒载体。

在本发明的一个实施方式中，将通过将编码Bmi1蛋白的核苷酸序列(NCBI登录号L13689)插入到pBabepuro载体而构建的重组载体(pBabepuroBmi1)转染到PT67包装细胞系中以产生表达Bmil的病毒，随后将所述病毒用于感染成纤维细胞。从PT67细胞包装的病毒显示出高病毒滴度并且能用于感染大范围的哺乳动物细胞。

在本发明的优选实施方式中，对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞的方法包括：i)将Bmi1(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码Bmi1蛋白的核酸分子引入到所述体细胞中；ii)在用于神经干细胞的条件下在bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的存在下培养所述体细胞；iii)选出表达Oct4的细胞和iv)用MEK/ERK抑制剂和GSK抑制剂组处理所述细胞。

在所述方法中，步骤(ii)中用于神经干细胞的条件可包括任何通常用于培养神经干细胞的培养基，只要其中含有bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)即可。优选的培养基不含EGF（表皮生长因子）而只含bFGF。在本发明的优选的实施方式中，DMEM/F12+B27+N2+1%青霉素/链霉素+20ng/mlbFGF用作神经干细胞的培养条件。在这些条件下培养时，体细胞转化为胚细胞样细胞（图1A和1B）。

当胚胎干细胞样细胞用于细胞疗法时，如步骤iii)中对表达Oct4的细胞的选择提供了进一步增大分化效率的优点。能够使用各种公知方法来选择表达Oct4的细胞。在本发明的一个实施方式中，通过在引入之后选择GFP表达细胞建立了Oct4阳性去分化干细胞(Nature448,318-324)。

用于步骤iv)的术语“MEK/ERK抑制剂”是指靶向ERK1/2及其上游分子MEK1/2的物质，其均参与MEK/ERK（有丝分裂原激活蛋白激酶/细胞外调节激酶）信号转导途径。

MEK(有丝分裂原激活蛋白激酶)是在MAP激酶信号转导途径的末端发挥作用的酶，其充当将细胞外信号传递到细胞核中的介导物。所述酶特异性地使体外的髓鞘碱性蛋白的苏氨酸(Thr)残基磷酸化。ERK是高等生物体中存在的典型的MAP激酶，它的功能是在响应细胞外信号时磷酸化苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基。据报道，苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化在MAP激酶的激活中起着关键作用，因而当这些残基被不同的氨基酸残基取代时所述酶不被激活。

优选的是，本发明的组合物中所含有的MEK/ERK抑制剂是指PD0325901或U0126。U0126的IUPAC名称为,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双[2-氨基苯硫基]丁二烯。对于本领域的技术人员显而易见的是，所有针对MEK/ERK信号转导途径的抑制剂，连同所述化合物在内，均落入本发明的范围之内。ERK1/2由MEK1/2激活，并可通过调节MEK1/2而失活。因此，MEK1/2是ERK1/2上游紧邻的信号转导分子。

正如本文中使用的，术语“GSK抑制剂”意指靶向GSK1/2的物质，GSK1/2是GSK（糖原合成酶激酶）信号转导途径的上游分子。在本发明中，GSK优选是指GSK3β。本发明的组合物中含有的GSK抑制剂优选CHIR99021，一种氨基嘧啶。然而，对于本领域的技术人员显而易见的是，包括所述氨基嘧啶在内的所有的GSK抑制剂均落入本发明的范围内。

包括MEK/ERK抑制剂和GSK抑制剂的低分子量物质可商购获得，也可以化学合成。用所述抑制剂进行处理能够诱导前iPS细胞去分化为完全重编程的细胞(PLoSOne,6,2237-2247)。

MEK/ERK抑制剂和GSK抑制剂可添加至培养基中。所述培养基包含有效浓度的所述抑制剂，该有效浓度可随着包括培养基的种类、培养方法等公知因素而变化。在本发明的一个实施方式中，培养基包含浓度为0.5μM的PD0325901和浓度为3μM的CHIR99021。

根据本发明的优选实施方式，本发明提供一种用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞的方法，所述方法包括：i)将Bmi1(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码所述Bmi1蛋白的核酸分子引入所述体细胞中；ii)在用于神经干细胞的条件下在bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的存在下培养所述体细胞；iii)用G9aHMT酶抑制剂和DMNT抑制剂组处理所述细胞。

步骤iii)中使用的术语G9aHMT酶抑制剂是指起着干扰G9a组蛋白甲基转移酶的作用并促进H3K9me2生成的物质。

G9aHMT酶（G9a组蛋白甲基转移酶）是以对于组蛋白的赖氨酸残基的特异选择性诱导赖氨酸甲基化并包含显示出特异性酶活性的SET(Suvar3-9,Enhancer-of-zeste,Trithorax)域的酶。

优选的是，用于本发明的组合物中的G9aHMT酶抑制剂可以是BIX01294，其IUPAC名称为2-(六氢-4-甲基-1H-1,4-二氮杂-1-基)-6,7-二甲氧基-N-[1-(苯基甲基)-4-哌啶基]4-喹唑啉胺。不过，本领域的技术人员应当理解，除了该化合物之外的任何其他的G9aHMT酶抑制剂均落入本发明的范围内。

如本文所用，术语“DMNT抑制剂”是指抑制DMNT（DNA甲基转移酶）的活性的物质。优选的是，用于本发明的组合物中的DMNT抑制剂可以是RG108，其IUPAC名称为N-邻苯二甲酰-L-色氨酸。不过，本领域的技术人员应当理解，除了该化合物之外的任何其他的DMNT抑制剂均落入本发明的范围内。

包括G9aHMT酶抑制剂和DMNT抑制剂的低分子量物质可商购获得(Stemolecule^TM)，也可以化学合成。用这些抑制剂进行处理改善了去分化效率(CellStemCell,3,568-574,2008)。

G9aHMT酶抑制剂和DMNT抑制剂可添加至培养基中。所述培养基包含有效浓度的所述抑制剂，该有效浓度可随着包括培养基的种类、培养方法等公知因素而变化。在本发明的一个实施方式中，培养基包含浓度为1μM的BIX01294和浓度为0.5μM的RG108。

根据本发明的优选实施方式，本发明提供一种用于对体细胞进行重编程从而形成胚胎干细胞样细胞的方法，所述方法包括：i)将Bmi1(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码所述Bmi1蛋白的核酸分子引入到所述体细胞中；ii)在用于神经干细胞的条件下培养所述体细胞；iii)用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理所述细胞。

在所述方法中，步骤(ii)中用于神经干细胞的条件可包括任何通常用于培养神经干细胞的培养基。在本发明的优选实施方式中，DMEM/F12+B27+N2+1%青霉素/链霉素+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF用作神经干细胞培养条件。在该条件中培养时，体细胞转化为神经干细胞。

用于步骤iii)的组蛋白去乙酰化酶抑制剂是指干扰组蛋白去乙酰化酶的功能的物质。组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导超乙酰化(hyperacetylated)的核小体核心组蛋白积聚在染色质的大多数区域中，这导致了细胞静止因子和分化所必需的一些基因的上调。换言之，组蛋白去乙酰化酶抑制剂是通过诱导在G1期的细胞周期的停滞、肿瘤细胞的分化和凋亡并抑制血管形成来抑制肿瘤细胞增殖的细胞静止剂。

组蛋白去乙酰化酶(HDAC)起到通过pRB/E2F的介导抑制基因转录的作用。组蛋白乙酰化作用的抑制与各种癌症的发生有关。在诸如缺氧症、低血糖症、细胞肿瘤发生等特定环境条件下被诱导过表达的HDAC使细胞静止因子下调，导致细胞增殖。已知HDAC充当细胞肿瘤发生和分化调节中的重要因子。

可用于本发明的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂包括VPA(丙戊酸，2-丙烯戊酸)、曲古柳菌素(trichostatin,TSA)及其衍生物，优选VPA。

已知VPA能够耗尽肌醇、抑制GSK-3β、激活ERK途径和刺激PPAR活性。曲古柳菌素是源自链霉菌属的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。不仅是曲古柳菌素，而且其体外或体内显示出针对HDAC的抑制活性的衍生物均包括在本发明的范围内。另外，曲古柳菌素衍生物的各种无机盐和有机盐如果是药物可接受性的也可用于本发明。在本发明的组合物中，可以以300μM～900μM的浓度并优选500μM～800μM的浓度包含曲古柳菌素或其衍生物。浓度过低不能带来所期望的效果。另一方面，如果浓度过高，则组合物变得对细胞有毒。因此，必须根据细胞种类确定适宜的浓度。

应当了解，所述组合物之外的任何其他组蛋白去乙酰化酶抑制剂均落入本发明的范围之内。

包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂的低分子量物质可以商购获得(Stemolecule^TM)，也可以化学合成。用这些抑制剂进行处理改善了去分化效率(CellStemCell,4,301-312,2009)。

可将组蛋白去乙酰化酶抑制剂添加至培养基中。所述培养基包含有效浓度的所述抑制剂，该有效浓度可随着包括培养基的种类、培养方法等公知因素而变化。在本发明的一个实施方式中，培养基包含浓度为0.5μM的VPA。

根据本发明的另一方面，本发明提供通过所述方法制备的胚胎干细胞样细胞。

已发现通过本发明的重编程方法制备的胚胎干细胞样细胞在基因表达、表观遗传学、向所有三种胚层的体外和体内分化、畸胎瘤形成和嵌合小鼠形成等方面展现出与典型的胚胎干细胞相同的多能性。

本发明的胚胎干细胞样细胞是用于各种细胞类型的理想资源。例如，在用于细胞分化的条件下培养时，可将胚胎干细胞样细胞诱导以分化为造血细胞、神经元、β细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道上皮细胞及其类似细胞。

关于用于胚胎干细胞分化的条件、培养基和方法，可参考Palacios等,PNAS.USA,92:7530-7537(1995)、Pedersen,J.Reprod.Fertil.Dev.,6;543-552(1994)和Bain等,Dev.Biol,168:342-357(1995)。通过植入，所述胚胎干细胞可用于治疗大量疾病，包括糖尿病、帕金森症、阿尔茨海默病、癌症、脊髓损伤、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症（卢伽雷氏症）、肌肉营养不良、肝病、高胆固醇血症、心脏病、软骨疾病、创伤、足部溃疡、胃肠功能紊乱、血管疾病、肾脏疾病、子宫疾病、衰老有关的疾病等。此外，本发明的胚胎干细胞样细胞能用于药物评价。

通过以下实施例能更好地理解本发明，对所述实施例的阐述出于描述性，而不应解释为是对本发明的限制。

实施例

实施例1

小鼠体细胞的培养以及其中Bmi1基因的导入

使用小鼠体细胞、具体而言为小鼠的胚胎成纤维细胞来产生胚胎干细胞样细胞。于13.5日胚龄由CF1系小鼠取得胚胎。在组织培养瓶中，细胞在补充有10%FBS(胎牛血清)、0.1mM非必需氨基酸、1%青霉素/链霉素和0.1mMβ-巯基乙醇的DMEM(高葡萄糖，w/o型丙酮酸钠)中培养，其后，将第三代传代的成纤维细胞以2×10⁵细胞/孔的密度接种在6孔板中。

为用于基因转移，由PT67包装细胞系制备逆转录病毒颗粒。在该背景中，将pBabepuroBmi1(来自G.P.Dimri博士,EvanstonNorthwesternHealthcareResearchInstitute,FeinbergSchoolofMedicine,NorthwesternUniversity,Evanston,IL60201,美国)在Turbofect(Fermentas)的辅助下转染到PT67包装细胞系(Clontech)内，随后用嘌呤霉素(3μg/ml,BDbioscience)进行药物选择，所述pBabepuroBmi1通过将人Bmi1基因(NCBI登记号L13689)插入pBabepuro载体而构建。所述PT67包装细胞系使得可以产生能感染大范围哺乳动物宿主细胞的高滴度病毒。

各基因的表达由RT-PCR进行监控。当细胞生长至80%融合时，取上清液，经0.45μm过滤器(Millipore)过滤以除去细胞碎片，并在凝聚胺(6μg/ml,sigma)存在下加入细胞中。以12小时的固定间隔反复感染三次。

实施例2

在特定的培养条件下将Bmi1转导的体细胞重编程为胚细胞样细胞

在用于神经干细胞的不含EGF的条件（DMEM/F12+B27+N2+1%青霉素/链霉素+20ng/mlbFGF）下培养时，对其中用逆转录病毒导入Bmi1基因的小鼠体细胞进行重编程以形成与神经球类似的细胞，这些细胞随后发展成为胚细胞样细胞（图1A）。通过RT-PCR分析，发现这些细胞表达胚细胞的基因（图1B）。

实施例3

使用Oct4-启动子-GFP的Oct4阳性细胞的选择、通过用低分子量物质PD0325901和CHIR99021处理的向iPS细胞的重编程以及胚胎干细胞的表征

1)使用Oct4-启动子-GFP的Oct4阳性细胞的选择

为了弥补据观察实施例2中建立的去分化的干细胞未形成嵌合体这一事实，导入(参考Nature448,318-324)，然后用GFP选择Oct4阳性细胞。

选出的细胞能够进一步发展为能够形成嵌合体的细胞。不过，它们不能视为完全重编程细胞，因为它们在基因表达方面异于胚胎干细胞。

2)通过用低分子量物质PD0325901和CHIR99021处理的向iPS细胞的重编程

Oct4阳性细胞用0.5μMPD0325901和3μMCHIR99021处理，然后在小鼠胚胎干细胞的培养条件下被诱导重编程以建立诱导的干细胞，称为BC-iPS①。小鼠胚胎干细胞的条件能够使得细胞在饲养细胞的存在下在补充有10%FBS(胎牛血清)+1%非必需氨基酸+1%青霉素/链霉素+β-巯基乙醇+1000单位/ml小鼠LIF(白血病抑制因子)的高葡萄糖DMEM中培养，每2至3天传代一次。

3)胚胎干细胞的表征

将以低分子量物质处理的细胞转移至饲养细胞并培养以形成集落。据观察，所建立的iPS细胞具有与胚胎干细胞类似的形态，如图2A所示。

如AP染色所测定，重编程的细胞据观察呈AP阳性，并且表达胚胎干细胞的特征性标记物，如免疫染色所测定（图2B）。

此外，如蛋白质印迹法所分析，胚胎干细胞的标志基因在重编程的细胞中表达。FACS分析显示了SSEA1的表达，其是胚胎干细胞的代表性指标（图2C）。由该数据清楚可知，导入Bmi1基因和用低分子量物质处理能够诱导体干细胞去分化为胚胎干细胞样细胞。

4)对iPS细胞和胚胎干细胞中主要基因启动子的甲基化的测试

在诱导干细胞中对胚胎干细胞的自我更新所必需的基因的启动子进行测试。就此而言，进行亚硫酸氢盐测序以检测Oct4和Nanog启动子区域的甲基化状态。在小鼠体细胞中它们大部分被甲基化，而在诱导干细胞中则与胚胎干细胞中相似地被去甲基化（图3），表明通过重编程方法建立的细胞具有与胚胎干细胞相同的性质。

5)诱导干细胞的分化潜能的测试

在体外对诱导干细胞的分化潜能进行检测。将胚体(EB)接种在0.1%明胶涂覆板上，并使其在EB培养基中自发分化七天。发现EB表达三种胚层的特征性基因。免疫化学染色测试检测到典型的标记物，证明向三种胚层的体外分化（图4）。

为了研究iPS细胞体内分化潜能，对其进行畸胎瘤形成测试。1×10⁶细胞于8000rpm离心5分钟，将由此所获沉淀在胚胎干细胞用增殖培养基中培养24小时，随后于肾包膜下将这些细胞注入6周龄Balb/c裸鼠的脊侧。8周至10周后，切除肾脏，以石蜡包埋并进行H&E染色。结果显示iPS细胞分化为对应于三种胚系的细胞，证实其畸胎瘤的形成(图5)。这些结果证实，iPS细胞具有与胚胎干细胞类似的性质。

实施例4

通过用低分子量物质BIX01294和RG108处理的向iPS细胞的重编程以及胚胎干细胞的表征

1)通过用低分子量物质处理的向iPS细胞的重编程

在用于神经干细胞的不含EGF的条件(DMEM/F12+B27+N2+1%青霉素/链霉素+20ng/mlbFGF)下培养时，对Bmi1转导的小鼠体细胞进行重编程以形成与神经球类似的细胞，这些细胞随后用低分子量物质BIX01294和RG108处理。更详细而言，将神经球样细胞作为单一细胞接种在0.1%明胶涂覆板上，并在用于小鼠胚胎干细胞的条件下用1μMBIX01294和0.5μMRG108温育一周，由此建立命名为BC-iPS②的iPS细胞。关于用于小鼠胚胎干细胞的条件，细胞在饲养细胞的存在下在补充有15%FBS(胎牛血清)+1%非必需氨基酸+1%青霉素/链霉素+β-巯基乙醇+1000单位/ml小鼠LIF(白血病抑制因子)的高葡萄糖DMEM中培养，每2至3天传代一次。

2)胚胎干细胞的表征

将以低分子量物质处理的细胞转移至饲养细胞并培养以形成集落。据观察，所建立的iPS细胞具有与胚胎干细胞类似的形态，如图6A所示。

如AP染色所测定，重编程的细胞据观察呈AP阳性，并且表达胚胎干细胞的特征性标记物，如免疫染色所测定（图6B）。

此外，如蛋白质印迹法所分析，胚胎干细胞的标志基因在重编程的细胞中表达。FACS分析显示了SSEA1的表达，其是胚胎干细胞的代表性指标（图6C）。由该数据清楚可知，导入Bmi1基因和用低分子量物质处理能够诱导体干细胞去分化为胚胎干细胞样细胞。

3)对iPS细胞和胚胎干细胞中主要基因启动子的甲基化的测试

在诱导干细胞中对胚胎干细胞的自我更新所必需的基因的启动子进行测试。就此而言，进行亚硫酸氢盐测序以检测Oct4和Nanog启动子区域的甲基化状态。在小鼠体细胞中它们大部分被甲基化，而在诱导干细胞中则与胚胎干细胞中相似地被去甲基化（图7），表明通过重编程方法建立的细胞具有与胚胎干细胞相同的性质。

4)诱导干细胞的分化潜能的测试

在体外对诱导干细胞的分化潜能进行检测。将胚体(EB)接种在0.1%明胶涂覆板上，并使其在EB培养基中自发分化七天。发现EB表达三种胚层的特征性基因。免疫化学染色检验检测到典型的标记物，证明向三种胚层的体外分化（图8）。

为了研究iPS细胞体内分化潜能，对其进行畸胎瘤形成测试。将1×10⁶细胞于8000rpm离心5分钟，将由此得到的沉淀在胚胎干细胞用增殖培养基中培养24小时，随后于肾包膜下将这些细胞注入6周龄Balb/c裸鼠的脊侧。8周至10周后，切除肾脏，以石蜡包埋并进行H&E染色。结果显示iPS细胞分化为对应于三种胚系的细胞，证实其畸胎瘤的形成(图9)。这些结果证实，iPS细胞具有与胚胎干细胞类似的性质。

实施例5

在特定的培养条件下Bmi1转导的体细胞的向神经干细胞样细胞的重编程

在用于神经干细胞的条件（DMEM/F12+B27+N2+1%青霉素/链霉素+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF）下培养时，对其中用逆转录病毒导入Bmi1基因的小鼠体细胞进行重编程以形成与神经球类似的细胞，这些细胞随后发展成为神经干细胞样细胞。通过RT-PCR分析，发现这些细胞表达神经干细胞样细胞的基因（图1B）。

实施例6

通过用低分子量物质VPA(丙戊酸)处理的向iPS细胞的重编程以及胚胎干细胞的表征

1)通过用低分子量物质VPA(丙戊酸)处理的向iPS细胞的重编程

在用于神经干细胞的条件下培养1周后，对Bmi1转导的小鼠体细胞进行重编程以形成与神经球类似的细胞，这些细胞随后用低分子量物质VPA(丙戊酸)处理。更详细而言，神经球样细胞作为单一细胞接种在0.1%明胶涂覆板上，并在用于小鼠胚胎干细胞的条件下用2mMVPA温育一周。关于用于小鼠胚胎干细胞的条件，细胞在饲养细胞的存在下在补充有15%FBS(胎牛血清)+1%非必需氨基酸+1%青霉素/链霉素+β-巯基乙醇+1000单位/ml小鼠LIF(白血病抑制因子)的高葡萄糖DMEM中培养，每2至3天传代一次。结果建立了iPS细胞，命名为BC-iPS④。

2)胚胎干细胞的表征

将以低分子量物质处理的细胞转移至饲养细胞并培养以形成集落。据观察，所建立的iPS细胞具有与胚胎干细胞类似的形态，如图10A所示。

如AP染色所测定，重编程的细胞据观察呈AP阳性，并且表达胚胎干细胞的特征性标记物，如免疫染色所测定（图10B）。

此外，如蛋白质印迹分析所显示，胚胎干细胞的标志基因在重编程的细胞中表达。FACS分析显示了SSEA1和Oct4的表达，均是胚胎干细胞的代表性指标和标记物（图10C）。由该数据清楚可知，导入Bmi1基因和用低分子量物质处理能够诱导体干细胞去分化为胚胎干细胞样细胞。

3)对iPS细胞和胚胎干细胞中主要基因启动子的甲基化的测试

在诱导干细胞中对胚胎干细胞的自我更新所必需的基因的启动子进行测试。就此而言，进行亚硫酸氢盐测序以检测Oct4和Nanog启动子区域的甲基化状态。在小鼠体细胞中它们大部分被甲基化，而在诱导干细胞中则与胚胎干细胞中相似地被去甲基化（图11），表明通过重编程方法建立的细胞具有与胚胎干细胞相同的性质。

4)诱导干细胞的分化潜能的测试

为了研究iPS细胞体内分化潜能，对其进行畸胎瘤形成测试。将1×10⁶细胞于8000rpm离心5分钟，将由此得到的沉淀在胚胎干细胞用增殖培养基中培养24小时，随后于肾包膜下将这些细胞注入6周龄Balb/c裸鼠的脊侧。8周至10周后，切除肾脏，以石蜡包埋并进行H&E染色。结果显示iPS细胞分化为对应于三种胚系的细胞，证实其畸胎瘤的形成(图12)。这些结果证实，iPS细胞具有与胚胎干细胞类似的性质。

如上所述，通过导入Bmi1结合用至少一种低分子量物质进行处理，然后在用于胚胎干细胞的条件下培养，可以使体细胞被诱导而经历去分化成为全能干细胞，其中所述至少一种低分子量物质选自：MEH/ERK抑制剂和GSK抑制剂组；G9aHMT酶抑制剂和DMNT抑制剂组；以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂。在合适的条件下，根据本发明制备的诱导胚胎干细胞样细胞能分化为例如心肌细胞、胰岛素生产细胞或神经元，因而它们可用于各种疾病的细胞疗法，包括心功能障碍、胰岛素依赖性糖尿病、帕金森综合征、脊椎损伤等。因此，对于伴随人类胚胎发生的问题(即人类胚胎死亡和免疫排斥)而言，诱导胚胎干细胞样细胞是有前景的解决方案。此外，由iPS细胞分化的各种细胞(例如，心肌细胞、肝细胞等)可用作评估化学品、药物、毒素等的医疗效果或毒性的系统。

此外，本发明允许简单地通过仅导入Bmi1基因然后用低分子量物质处理来执行的方法来产生诱导全能干细胞。因此，本发明提供了一种有用的技术，基于该技术能提供无需导入任何基因即可产生iPS细胞的方法。

尽管出于说明性目的而披露了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员可以理解，可以在不背离在所附权利要求书中所公开的本发明的范围和精神的情况下进行各种修改、添加和替代。

Claims

1.一种用于对非人的体细胞进行重编程从而产生胚胎干细胞样细胞的组合物，所述组合物包含：

a)Bmi1(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码Bmi1蛋白的核酸分子；和

b)MEK/ERK(有丝分裂原激活蛋白激酶/细胞外调节激酶)抑制剂与GSK(糖原合成酶激酶)抑制剂。

2.一种用于对非人的体细胞进行重编程从而产生胚胎干细胞样细胞的方法，所述方法包括：

i)将Bmi1(B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1)蛋白或编码Bmi1蛋白的核酸分子引入到所述体细胞中；

ii)在用于培养神经干细胞的条件下培养经Bmi1转导的所述体细胞；和

iii)用MEK/ERK(有丝分裂原激活蛋白激酶/细胞外调节激酶)抑制剂与GSK(糖原合成酶激酶)抑制剂处理所述细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其中，步骤ii)中用于培养神经干细胞的条件是包含bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)但不含EGF(表皮生长因子)的培养基。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述方法还包括在步骤ii)后选择Oct4表达细胞，并在步骤iii)中用MEK/ERK(有丝分裂原激活蛋白激酶/细胞外调节激酶)抑制剂与GSK(糖原合成酶激酶)抑制剂组对所述细胞进行处理。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述MEK抑制剂是PD0325901，所述GSK抑制剂是抑制GSK3β的CHIR99021。