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JP2013515508A - Ｒｏｎ結合構築体およびその使用方法 - Google Patents

Ｒｏｎ結合構築体およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、１つ以上の抗体定常領域ドメイン等の１つ以上の他のドメインを有する抗体ならびに単一特異的および多特異的一本鎖結合タンパク質を含む、ヒトマクロファージ刺激受容体（ＭＳＴ１Ｒ、本明細書においてｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ＮａｎｔａｉｓｅまたはＲＯＮとも称される）に特異的に結合する免疫グロブリン結合分子を提供する。癌および炎症性障害の治療等の治療におけるそのような結合タンパク質の適用も提供される。
【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、２００９年１２月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／２９０，８４０号、２０１０年７月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／３６５，２６６号、および２０１０年７月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／３６６，７４３号の利益を主張するものであり、それぞれ、参照によりその全体が組み込まれる。
配列表に関する記述
本出願に関連した配列表が、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、９１０１８０＿４２４ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは７４６ＫＢであり、２０１０年１２月２９日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。
本開示は、概して、結合分子の分野および治療におけるその適用に関し、より具体的には、本明細書においてマクロファージ刺激１受容体またはＭＳＴ１Ｒとも称されるＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ Ｎａｎｔａｉｓｅ）に結合する結合ドメイン、および１つ以上の抗体定常領域ドメイン等の１つ以上の他のドメインを含む、結合ポリペプチドに関する。
ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ Ｎａｎｔａｉｓｅ、ＭＳＴ１Ｒとしても既知である）は、胚発生に不可欠であり、かつ炎症応答において重要な役割も果たす受容体型タンパク質チロシンキナーゼである（非特許文献１）。ＲＯＮは、炎症中のマクロファージの応答の制御に関与し得る（非特許文献２）。ＲＯＮは、主に上皮由来細胞型において発現し、いくつかの他の受容体型チロシンキナーゼと同様、ＲＯＮが悪性上皮癌の進行に関与し得ることが示唆されている（非特許文献３）。
受容体型タンパク質チロシンキナーゼは、概して、成長因子およびホルモン等の細胞外リガンドに結合する細胞外ドメイン、ならびにキナーゼ機能ドメインを有する細胞内ドメインから成る。受容体型タンパク質チロシンキナーゼは、いくつかのクラスに細分化されており、ＲＯＮは、受容体チロシンキナーゼのＭＥＴファミリーのメンバーであり、Ｓｔｋ、ｃ−Ｍｅｔ、およびｃ−Ｓｅａも含む（非特許文献１）。ＲＯＮおよびｃ−Ｍｅｔは、ヒト中に見られるファミリーの唯一のメンバーであり、それらは、全体的に約６５％の相同性を共有する。Ｃ−Ｍｅｔは、肝細胞成長因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）の受容体であり、プロトオンコジーンとしてかなりよく特徴付けられている。
ＲＯＮは、一本鎖前駆体に由来する１つの鎖から成り、いくつかのジスルフィド結合によってともに保持される膜貫通ヘテロ二量体である。ＲＯＮの細胞内の部分は、キナーゼドメインおよび調節要素を含有する。細胞外領域は、セマフォリン（Ｓｅｍａ）ドメインの存在（いくつかの高度に保存されたシステイン残基を有する一続きの約５００個のアミノ酸）、ＰＳＩ（プレキシン、セマフォリン、インテグリン）ドメインの存在、および４つの免疫グロブリン様の折り畳みを特徴とする。
ＲＯＮのリガンドであるマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）も同定されており、ｃ−ＭｅｔリガンドであるＨＧＦ／ＳＦと約４０％の相同性を共有するＭＳＰおよびＨＧＦは、クリングルドメインを特徴とするプラスミノーゲン−プロトロンビンファミリーに属する。ＭＳＰは、癌にも関連している。例えば、Ｗｅｌｍらは、ＭＳＰと乳癌の転移および予後不良との間の関連性を認めた（ＰＮＡＳ１０４：７５０７−７５７５（２００７））。
ＲＯＮおよびｃ−Ｍｅｔは、細胞外Ｓｅｍａドメインを有する唯一の受容体チロシンキナーゼであり、ＲＯＮのＳｅｍａドメインがそのリガンド結合部位を含むことが示されている。ＭＳＰのＲＯＮへの結合は、ＲＯＮのキナーゼドメイン内でリン酸化を引き起こし、ＲＯＮキナーゼ活性の増加につながる。あるいは、β１インテグリンは、Ｓｒｃ依存経路を通ってＲＯＮをリン酸化および活性化することができる（非特許文献１）。ＲＯＮの活性化は、ＰＩ３−Ｋ、Ｒａｓ、ｓｒｃ、β−カテニン、およびＦａｋシグナル伝達を含むいくつかの経路のシグナル伝達を開始する。ＲＯＮによって活性化されるシグナル伝達経路の多くは、アポトーシスの増殖および阻害等の癌に関連した過程に関与する。
ＲＯＮそれ自体も、いくつかの理由から癌の進行に関与している。例えば、ＲＯＮは、乳癌、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、および膵臓癌を含むいくつかのヒト腫瘍において発現される。加えて、ＲＯＮは、生体外で細胞増殖および運動を増加させることが示されている。さらに、ＲＯＮは、ＲＯＮトランスジェニックマウスにおいて腫瘍成長および転移を誘発する（非特許文献４）。したがって、ＲＯＮシグナル伝達経路を阻害する分子の必要性が存在する。
Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．（２００５）１２：２７３−２８１ Ｃｏｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｆｕｎｃｔ．１９９７ Ｆｅｂ；１（１）：６９−８３ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓｉｓ（２００３）２３：１２９１−１２９７ Ｗａｌｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６）６６：１１９６７−１１９７４
本開示の一態様は、ヒトＲＯＮに特異的に結合する免疫グロブリン結合ポリペプチドを提供し、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、（ａ）ｉ．配列番号６７のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６８のＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６９のＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくはｉｉ．配列番号１４１のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４２のＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１４３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｂ）ｉ．配列番号７０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７１のＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７２のＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくはｉｉ．配列番号１４４のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４５のＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１４６のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨドメイン、または（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨを含む。一実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号８０または１５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号８１、１５３、および１７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインは、ヒト化される。ある特定の実施形態において、ヒト化ＶＬは、配列番号８２、８３、および１５４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ヒト化ＶＨドメインは、配列番号８４〜８６、１５５および１５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、抗体または抗体の抗原結合断片である。この点において、抗体または抗体の抗原結合断片は、非ヒト、キメラ、ヒト化、またはヒトである。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドの一実施形態において、非ヒトもしくはキメラ抗体または非ヒトもしくはキメラ抗体の抗原結合断片は、配列番号８０および１５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、配列番号８１、１５３、および１７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインとを有する。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドの一実施形態において、ヒト化抗体またはヒト化抗体の抗原結合断片は、配列番号８２、８３、および１５４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、配列番号８４〜８６、１５５、および１５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインとを有する。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドの別の実施形態では、抗体または抗体の抗原結合断片は、配列番号８０、８２、８３、１５２、および１５４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも約９０％同一のＶＬドメインを含み、かつ配列番号８１、８４〜８６、１５３、１５５、１５６、および１７６のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも約９０％同一のＶＨドメインを含む。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドのある特定の実施形態において、結合ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、およびＦｖ断片からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号８０および１５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインを有し、かつ配列番号８１、１５３および１７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインを有する。別の実施形態では、ｓｃＦｖはヒト化され、配列番号８２、８３、および１５４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインを有し、かつ配列番号８４〜８６、１５５、および１５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインを有する。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドの一実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、小モジュラー式免疫製薬（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）タンパク質である。ある特定の実施形態において、ＳＭＩＰタンパク質は、非ヒト、キメラ、ヒト化、またはヒトである。ある特定の実施形態において、非ヒトまたはキメラＳＭＩＰタンパク質は、配列番号８０および１５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、配列番号８１、１５３、および１７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインとを有する。ある特定の他の実施形態において、ヒト化ＳＭＩＰタンパク質は、配列番号８２、８３、および１５４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、配列番号８４〜８６、１５５、および１５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインとを有する。さらなる実施形態において、本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、配列番号３４９〜３６６および４２０〜４７５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するヒンジドメインを含む。別の実施形態では、本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２ＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン定常サブ領域ドメインを含む。さらなる実施形態において、免疫グロブリン定常サブ領域ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２は、配列番号２４１のアミノ酸配列を含み、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＳＭＩＰタンパク質は、配列番号９４〜１１４および１６０〜１６８から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドのある特定の実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、第１のヘテロ二量化ドメインと同一ではない第２のヘテロ二量化ドメインを含む第２の一本鎖ポリペプチドと会合することができる第１のヘテロ二量化ドメインを含む第１の一本鎖ポリペプチド中に含有され、会合した第１および第２の一本鎖ポリペプチドは、ポリペプチドヘテロ二量体を形成する。ある特定の実施形態において、ポリペプチドヘテロ二量体は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド；配列番号１７２のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号２７のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド；配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド；配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド；配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド；配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号２７のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド；配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド；または配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチドを含む。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドの一実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間に配置される免疫グロブリン定常サブ領域ドメインを含む一本鎖多特異的結合タンパク質中に含有され、第１の結合ドメインは、本明細書に記載のヒトＲＯＮ結合ドメインであり、第２の結合ドメインは、本明細書に記載のヒトＲＯＮ結合ドメインであるか、あるいはヒトＲＯＮ以外の標的分子に対して特異的である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリン定常サブ領域は、ＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３である。さらなる実施形態において、免疫グロブリン定常サブ領域は、第１のリンカーペプチドと第２のリンカーペプチドとの間に配置される。さらなる実施形態において、第１および第２のリンカーペプチドは独立して、配列番号６１０〜７７７に提供されるリンカーから選択される。またさらなる実施形態では、第１のリンカーペプチドは、免疫グロブリンヒンジ領域を含み、第２のリンカーペプチドは、ＩＩ型Ｃレクチンストーク領域を含む。
一実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、以下の構造：Ｎ−ＢＤ１−Ｘ−Ｌ２−ＢＤ２−Ｃを含み、式中、ＢＤ１は、ヒトＲＯＮに対して特異的なｓｃＦｖを含み、−Ｘ−は、−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−であり、式中、Ｌ１は、配列番号３４９〜３６６、４２０〜４７５のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＩｇＧ１ヒンジであり、−ＣＨ２ＣＨ３−は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３領域または１つ以上のエフェクター機能を欠くその変異体であり、Ｌ２は、配列番号６１０〜７７７のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有するリンカーペプチドであり、ＢＤ２は、ヒトＲＯＮまたはヒトＲＯＮ以外の標的分子に対して特異的な結合ドメインである。
本開示の一態様は、本明細書に記載の１つ以上の免疫グロブリン結合ポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチドを発現することができる発現ベクターを提供する。本開示のさらなる態様は、本明細書に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチドを発現することができる発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本開示の別の態様は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載の１つ以上の免疫グロブリン結合ポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む治療的に有効な量の組成物を投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。この点において、癌は、膵臓癌、肺癌、結腸癌、および乳癌、または本明細書に記載の他の癌からなる群から選択される。
本開示の別の態様は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載の１つ以上の免疫グロブリン結合ポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む治療的に有効な量の組成物を投与することを含む、炎症性障害を治療するための方法を提供する。
ＲＯＮ−ｅ０１およびＲＯＮ−ｆ０１マウス抗体は、ヒトＲＯＮに特異的に結合し、かつアカゲザルＲＯＮと交差反応する。空ベクター（破線）、ヒトＲＯＮ（点線）、またはアカゲザルＲＯＮ（実線）でトランスフェクトしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、二次抗体のみ（Ａ）、１ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（Ｂ）、１ｍｇ／ｍＬのＤＸ０７抗ＲＯＮ抗体（Ｃ）、ＲＯＮ−ｅ０１抗ＲＯＮハイブリドーマ上清（Ｄ）、またはＲＯＮ−ｆ０１抗ＲＯＮハイブリドーマ上清（Ｅ）で染色した。 ＲＯＮ−ｅ０１およびＲＯＮ−ｆ０１マウス抗体は、ヒトＲＯＮに特異的に結合し、かつアカゲザルＲＯＮと交差反応する。空ベクター（破線）、ヒトＲＯＮ（点線）、またはアカゲザルＲＯＮ（実線）でトランスフェクトしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、二次抗体のみ（Ａ）、１ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（Ｂ）、１ｍｇ／ｍＬのＤＸ０７抗ＲＯＮ抗体（Ｃ）、ＲＯＮ−ｅ０１抗ＲＯＮハイブリドーマ上清（Ｄ）、またはＲＯＮ−ｆ０１抗ＲＯＮハイブリドーマ上清（Ｅ）で染色した。 ＲＯＮ−ｅ０１およびＲＯＮ−ｆ０１マウス抗体は、ヒトＲＯＮに特異的に結合し、かつアカゲザルＲＯＮと交差反応する。空ベクター（破線）、ヒトＲＯＮ（点線）、またはアカゲザルＲＯＮ（実線）でトランスフェクトしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、二次抗体のみ（Ａ）、１ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（Ｂ）、１ｍｇ／ｍＬのＤＸ０７抗ＲＯＮ抗体（Ｃ）、ＲＯＮ−ｅ０１抗ＲＯＮハイブリドーマ上清（Ｄ）、またはＲＯＮ−ｆ０１抗ＲＯＮハイブリドーマ上清（Ｅ）で染色した。 ＲＯＮ−ｅ０２およびＲＯＮ−ｆ０２マウスＳＭＩＰは、４ＭＢｒ−５細胞の表面上で天然アカゲザルＲＯＮに結合する。４ＭＢｒ−５細胞を、二次抗体のみ（破線）、Ｍ００７７抗ＣＤ７９ｂ ＳＭＩＰ（点線）、または抗ＲＯＮ ＳＭＩＰ（実線）で染色した。 ＲＯＮ−ｅおよびＲＯＮ−ｆマウスＳＭＩＰおよびインターセプターは、ＢｘＰＣ−３細胞の表面で天然ヒトＲＯＮに結合する。ＢｘＰＣ−３細胞を、種々の濃度のＲＯＮ−ｅ（Ａ）またはＲＯＮ−ｆ（Ｂ）分子で染色した。ＳＭＩＰおよびインターセプターならびに関連した配列番号の記述について、表３および表４を参照されたい。 ＲＯＮ−ｅ０１およびＲＯＮ−ｆ０１マウス抗体は、ＲＯＮの細胞外ドメイン内で異なるエピトープに結合する。ハイブリドーマクローン上清（１〜５）由来のＲＯＮ−ｅ０１抗体は、組換えＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩタンパク質に結合せず、ＲＯＮ−ｅ０１によって認識されるエピトープの一部または全てがＳｅｍａおよびＰＳＩドメインの外側に位置することを示す。組換えＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩタンパク質結合は、測定可能な濃度のＩｇＧを含有する全てのＲＯＮ−ｆ０１ハイブリドーマクローン上清（Ａ〜Ｍ）において観察される。「希釈液のみ」の試料は、血清希釈液のみが試料として流された時に、それぞれのアッセイにおいてバックグラウンド結合を表す。ＩｇＧ測定および組換えＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩ結合の陽性対照として、２５０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＲＯＮ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号ＭＡＢ６９１，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を両方のＥＬＩＳＡにおいて試験した。 ＲＯＮ−ｅおよびＲＯＮ−ｆ分子は、異なるエピトープでＲＯＮに結合する。ＲＯＮ−ｅ０１：マウス抗体、ＲＯＮ−ｆ０２：抗ＲＯＮ ＳＭＩＰ、ＤＸ０７：抗ＲＯＮ β−鎖抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）。 ＲＯＮ−ｅ０１抗体およびＲＯＮ−ｅ０５ＹＡＥインターセプターは、ＲＯＮ、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫのＭＳＰ誘発性リン酸化を阻害することができる。 ＲＯＮ−ｆ０１抗体、ＲＯＮ−ｆ０２ＳＭＩＰ、およびＲＯＮ−ｆ０３ ２世代インターセプターは、ＲＯＮ、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫのＭＳＰ誘発性リン酸化を阻害することができる。 ＲＯＮ−ｅおよびＲＯＮ−ｆヒト化ＳＭＩＰは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の表面で天然ヒトＲＯＮに結合する。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を、種々の濃度のＲＯＮ−ｅ（Ａ）またはＲＯＮ−ｆ（Ｂ）分子で染色する。ヒト化ＳＭＩＰは、それらのマウス対応物と同等の結合活性を有する。 ＲＯＮ−ｆヒト化ＳＭＩＰは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞におけるＲＯＮ、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫのＭＳＰ誘発性リン酸化を阻害することができる。ＲＯＮ−ｆヒト化ＳＭＩＰは、ブロッキングステップ（１時間）およびその後の模擬刺激中に適用される時、ＲＯＮの最小限のリン酸化を引き起こすが、ＡｋｔまたはＭＡＰＫの最小限のリン酸化は引き起こさない。 ＲＯＮ−ｆ０２マウスＳＭＩＰのヒト化は、刺激ステップ（２０分間）中のＳＭＩＰ適用を受けて、受容体のリン酸化を減少させる。ＲＯＮ−ｆ０２マウスＳＭＩＰは、ＲＯＮのリン酸化を刺激するが、下流ＡｋｔまたはＭＡＰＫのリン酸化は刺激しない。ヒト化ＳＭＩＰ、ＲＯＮ−ｆ０７ｈ２４、およびＲＯＮ−ｆ０８ｈ２５は、マウスＳＭＩＰと比較して、減少したＲＯＮのリン酸化をもたらす。興味深いことに、ＭＳＰ誘発性ＲＯＮ活性化を受けて観察される高レベルの下流エフェクタータンパク質のリン酸化は、ＲＯＮ受容体のＳＭＩＰ誘発性リン酸化後には観察されない。 ヒト化ＲＯＮ−ｆ結合ドメインと抗ＣＤ３結合ドメインを一対にする二重特異性タンパク質は、ＲＯＮ抗原を発現する標的細胞の細胞毒性Ｔ細胞死滅を特異的に指向する。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（Ａ）またはＤａｕｄｉ（Ｂ）標的細胞をクロム−５１で装填し、１０：１比の精製ヒトＴ細胞対標的細胞の存在下において、増加した濃度の二重特異性タンパク質でインキュベートした。３７℃で４時間のインキュベーション後、標的細胞の溶解を、アッセイ上清へのクロム−５１の放出によって評価した。ヒト転移性乳癌株であるＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞は、ＲＯＮを発現するが、ＣＤ１９は発現しせず、一方で、ヒトバーキットリンパ腫株であるＤａｕｄｉ細胞は、ＣＤ１９を発現するが、ＲＯＮは発現しない。両方の標的細胞株は、Ｔ細胞および標的細胞によって発現される抗原に結合する二重特異性タンパク質をともにインキュベートする時のみ死滅する。二重特異性タンパク質が標的細胞（すなわち、Ｄａｕｄｉ細胞に二重特異的な抗ＲＯＮ×抗ＣＤ３）に結合しない場合、標的細胞の細胞毒性は観察されない。データは、複製物の平均＋／−平均標準誤差（ＳＥＭ）を表す。 ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（Ａ）および単離Ｔ細胞（Ｂ）への二重特異性抗ＲＯＮならびに抗ＣＤ３構築体（ポリペプチドヘテロ二量体０２６８およびＳｃｏｒｐｉｏｎタンパク質Ｓ０２６６）の結合を示す。 ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（Ａ）および単離Ｔ細胞（Ｂ）への二重特異性抗ＲＯＮならびに抗ＣＤ３構築体（ポリペプチドヘテロ二量体０２６８およびＳｃｏｒｐｉｏｎタンパク質Ｓ０２６６）の結合を示す。 （Ａ）Ｄａｕｄｉ（ＲＯＮ−、ＣＤ１９＋）細胞または（Ｂ）ＢｘＰＣ−３（ＲＯＮ＋、ＣＤ１９−）細胞でのクロム（５１Ｃｒ）放出アッセイにおける、二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、ＴＳＣ０７９、およびＳ０２６８によって誘発されるＴ細胞指向性細胞毒性を示す。 （Ａ）Ｄａｕｄｉ（ＲＯＮ−、ＣＤ１９＋）細胞または（Ｂ）ＢｘＰＣ−３（ＲＯＮ＋、ＣＤ１９−）細胞でのクロム（５１Ｃｒ）放出アッセイにおける、二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、ＴＳＣ０７９、およびＳ０２６８によって誘発されるＴ細胞指向性細胞毒性を示す。
本明細書で使用される項の見出しは、構成目的のみであり、記載される主題を制限すると解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書物、および論文を含むが、それらに限定されない全ての文書、または文書の一部、引用される本明細書は、任意の目的のために参照によりそれら全体が本明細書に明確に組み込まれる。組み込まれる文書または文書の一部のうちの１つ以上が本出願における用語の定義に矛盾する用語を定義する場合、本出願に掲載される定義が支配する。
本開示は、概して、結合分子の分野および治療におけるその適用、より具体的には、マクロファージ刺激１受容体（ＭＳＴ１Ｒ、本明細書においてｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ＮａｎｔａｉｓｅまたはＲＯＮとも称される）に結合する結合ドメインおよび１つ以上の抗体定常領域ドメイン等の１つ以上の他のドメインから成る免疫グロブリン結合ポリペプチドに関する。本明細書でさらに詳述されるように、結合タンパク質は、抗体およびその抗原結合断片、ＳＭＩＰ（商標）、ＰＩＭＳ、Ｘｃｅｐｔｏｒ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）、およびインターセプター融合タンパク質形式等のいくつかの異なる形式のうちのいずれかであり得る。
本記述において、任意の濃度の範囲、割合の範囲、比率の範囲、または整数の範囲は、別途示されない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１０分の１および１００分の１等）を含むことが理解される。また、ポリマーサブユニット、寸法、または厚さ等の任意の物理的特性に関して本明細書に列挙される任意の数の範囲は、別途示されない限り、列挙される範囲内の任意の整数を含むことが理解される。本明細書で使用される「約」は、別途示されない限り、指示範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、別途示されない限り、列挙される成分のうちの「１つ以上」を指すことを理解されたい。代替物（例えば、「または」）の使用は、代替物のうちの１つ、両方、またはそれら任意の組み合わせを意味することを理解されたい。本明細書で使用される「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同意語として使用される。加えて、成分（例えば、ドメイン）および本明細書に記載の置換基の種々の組み合わせ由来の個々の融合タンパク質は、それぞれの融合タンパク質が個別に説明された場合と同一の範囲内において本出願により開示されることを理解されたい。したがって、個々の融合タンパク質の特定の成分の選択は、本開示の範囲内である。
本明細書で使用される時、ポリペプチドまたはタンパク質の他の部分（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシル末端におけるアミノ酸または２つのドメインの間のアミノ酸）が組み合わさって、ポリペプチドまたはタンパク質の長さの最大２０％（例えば、最大１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％）に寄与し、かつ種々のドメインの活性（例えば、結合ドメインの標的結合親和性、Ｆｃ領域部分の活性、およびヘテロ二量化を促進するヘテロ二量化ドメインの能力）に実質的に影響を及ぼさない（すなわち、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％超等の５０％を超えて活性を減少させない）場合、ポリペプチドまたはタンパク質は、いくつかのドメイン（例えば、標的に特異的に結合する結合ドメイン、ヒンジ、二量化またはヘテロ二量化ドメイン、およびＦｃ領域定常ドメイン部分）「から本質的に成る」。ある特定の実施形態において、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、融合ポリペプチドまたは一本鎖融合ポリペプチド）は、標的に特異的に結合する結合ドメイン、ヘテロ二量化ドメイン、ヒンジ、およびＦｃ領域部分から本質的に成り、かつタンパク質のアミノ末端および／もしくはカルボキシル末端における結合アミノ酸または２つの異なるドメインの間（例えば、結合ドメインとヘテロ二量化ドメインとの間、ヘテロ二量化ドメインとヒンジとの間、および／もしくはヒンジとＦｃ領域部分との間）の結合アミノ酸を含み得る。
本明細書で使用される「結合ドメイン」または「結合領域」は、標的（例えば、ＲＯＮ）を特異的に認識し、かつそれに結合する能力を有するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、もしくはペプチドを指す。結合ドメインは、生体分子または別の目的の標的における任意の自然発生、合成、半合成、または組換えによって産生される結合パートナーを含む。例示的な結合ドメインは、一本鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、受容体細胞外ドメイン（例えば、ＲＯＮ）、またはリガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）を含む。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢｉａｃｏｒｅ分析を含む、特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための多種多様のアッセイが既知である。
試験試料に存在する他の成分を著しく結合せず、１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍ単位での特定の結合相互作用の均衡会合定数）で標的に結合する時、結合ドメイン（または結合ドメインを含むポリペプチド）は、標的を「特異的に結合する」。結合ドメイン（または結合ドメインを含むポリペプチド）は、「高親和性」結合ドメインおよび「低親和性」結合ドメインに分類され得る。「高親和性」結合ドメイン（または結合ドメインを含むポリペプチド）は、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメイン（または結合ドメインを含むポリペプチド）は、最大１０７Ｍ−１、最大１０６Ｍ−１、最大１０５Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Ｍ単位の特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）と定義され得る。本開示による結合ドメインポリペプチドおよび融合タンパク質の親和性を、従来の技術を用いて容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０、および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等物を参照のこと）。
本明細書で使用される「免疫グロブリン結合ポリペプチド」または「免疫グロブリン結合タンパク質」は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン等の少なくとも１つの免疫グロブリン領域を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン領域は、野生型免疫グロブリン領域または改変免疫グロブリン領域であり得る。例示的な免疫グロブリン結合ポリペプチドは、一本鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−８３，１９８８を参照のこと）、小モジュラー式免疫製薬（ＳＭＩＰ（商標））タンパク質（米国特許公開第２００３／０１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号、および同第２００５／０１３６０４９号を参照のこと）、ＰＩＭＳタンパク質（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００９／０２３３８６号を参照のこと）、ならびに多機能結合タンパク質（ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）およびＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質等）（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００７／１４６９６８号、米国特許出願公開第２００６／００５１８４４号、および米国特許第７，１６６，７０７号を参照のこと）を含む。
本発明の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、少なくとも１つのＲＯＮ結合ドメインを含む。例えば、抗体構築体、ＳＭＩＰ（商標）タンパク質構築体、ＳＣＯＲＰＩＯＮ／Ｘｃｅｐｔｏｒ構築体、およびヘテロ二量体構築体を含む、複数の免疫グロブリン結合ポリペプチド構築体が本明細書に開示される。別途具体的に提示されない限り、「免疫グロブリン結合ポリペプチド」、「結合ポリペプチド」、「結合ドメインポリペプチド」、「融合タンパク質」、「融合ポリペプチド」、「免疫グロブリン由来の融合タンパク質」、および「ＲＯＮ結合ポリペプチド」という用語は、同義であると見なされるべきである。
抗体テクノロジー分野の当業者によって理解される用語はそれぞれ、本明細書において別様に明確に定義されない限り、当分野で理解される意味が付与される。抗体が可変領域、ヒンジ領域、および定常ドメインを有することは既知である。免疫グロブリン構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）で概説されている。
例えば、「ＶＬ」および「ＶＨ」という用語は、それぞれ、抗体軽鎖および重鎖由来の可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として既知の別個の明確に定義されたサブ領域で構成される。「ＣＬ」という用語は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖由来の定常領域を指す。「ＣＨ」という用語は、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）にさらに分けることができる「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指す。「Ｆａｂ」（断片抗原結合）は、抗原に結合し、かつ鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖に連結される重鎖の可変領域およびＣＨ１を含む抗体の一部分である。
本明細書で使用される「Ｆｃ領域定常ドメイン部分」または「Ｆｃ領域部分」は、抗体由来のＦｃ断片（「結晶化可能な断片」領域またはＦｃ領域）の重鎖定常領域断片を指し、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはそれらの任意の組み合わせ等の１つ以上の定常ドメインを含み得る。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域部分は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ抗体、およびそれらの任意の組み合わせのＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、またはＩｇＭ、もしくはＩｇＥ抗体、およびそれらの任意の組み合わせのＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む。一実施形態において、ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ３ＣＨ４構造は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ等の同一の抗体アイソタイプ由来である。背景として、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存細胞媒介性細胞毒性）、ＡＤＣＰ（抗体依存細胞食作用）、ＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）および補体固定、Ｆｃ受容体への結合（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＦｃＲｎ）、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドと比較してより大きい生体内半減期、タンパク質Ａ結合、および恐らくさらには胎盤通過等の免疫グロブリンのエフェクター機能に関与する（Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５（１９８９）を参照のこと）。ある特定の実施形態において、本開示のポリペプチドヘテロ二量体で見出されるＦｃ領域部分は、これらのエフェクター機能のうちの１つ以上を媒介することができる。
加えて、抗体は、典型的にはＦａｂ領域とＦｃ領域との間に位置付けられるヒンジ配列を有する（が、ヒンジの下部は、Ｆｃ領域のアミノ末端部分を含み得る）。背景として、免疫グロブリンヒンジは、柔軟なスペーサーの役割を果たし、Ｆａｂ部分がスペース内を自由に移動することを可能にする。定常領域とは対照的に、ヒンジは、構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス間およびさらには免疫グロブリンサブクラス間の配列および長さの両方において異なる。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域は、自由に柔軟であり、このことは、Ｆａｂ断片がそれらの対称軸を中心に回転し、かつ２つの重鎖間ジスルフィド架橋のうちの最初の架橋を中心とする球体内を移動することを可能にする。比較すると、ヒトＩｇＧ２ヒンジは、比較的短く、４つの重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化される強固なポリプロリン二重らせんを含有し、これは、柔軟性を制限する。ヒトＩｇＧ３ヒンジは、その独特の延長したヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジよりも約４倍長い）という点で他のサブクラスとは異なり、Ｆａｂ断片がＦｃ断片から比較的離れているという理由から、６２個のアミノ酸（２１個のプロリンおよび１１個のシステインを含む）を含有し、柔軟性のないポリプロリン二重らせんを形成し、かつより優れた柔軟性を提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジは、ＩｇＧ１よりも短いが、ＩｇＧ２と同一の長さを有し、その柔軟性は、ＩｇＧ１の柔軟性とＩｇＧ２の柔軟性の中間である。
結晶学的研究によると、ＩｇＧヒンジドメインを、３つの領域：上部、中心または中間、および下部ヒンジ領域に機能的および構造的に細分することができる（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ１３０：８７（１９９２））。例示的な上部ヒンジ領域は、ＩｇＧ１で見出されるＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１９４）、ＩｇＧ２で見出されるＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号１９５）、ＩｇＧ３で見出されるＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴ ＨＴ（配列番号１９６）またはＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号１９７）、およびＩｇＧ４で見出されるＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号１９８）を含む。例示的な中間または中心ヒンジ領域は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２で見出されるＣＰＰＣＰ（配列番号１９９）、ＩｇＧ３で見出されるＣＰＲＣＰ（配列番号２００）、およびＩｇＧ４で見出されるＣＰＳＣＰ（配列番号２０１）を含む。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４抗体はそれぞれ、単一の上部および中間ヒンジを有するように見える一方で、ＩｇＧ３は、タンデムに４つ有し、１つはＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号２０２）であり、３つはＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号２０３）である。
ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体は、ＩｇＧ様の中心領域を欠くように見え、ＩｇＤは、タンデムに２つの上部ヒンジ領域を有するように見える（配列番号２０４および２０５を参照のこと）。ＩｇＡ１およびＩｇＡ２抗体で見出される例示的な野生型上部ヒンジ領域は、配列番号２０６および２０７に示される。
対照的に、ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体は、典型的なヒンジ領域を欠き、代わりに、ヒンジ様の特性を有するＣＨ２ドメインを有する。ＩｇＥおよびＩｇＭの例示的な野生型ＣＨ２上部ヒンジ様の配列は、それぞれ、配列番号２０８（ＶＣＳＲＤＦＴＰＰＴＶＫＩＬＱＳＳＳＤＧＧＧＨＦＰＰＴＩＱＬＬＣＬＶＳＧＹＴＰＧＴＩＮＩＴＷＬＥＤＧ ＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡＳＴＴＱＥＧＥＬＡＳＴＱＳＥＬＴＬＳＱＫＨＷＬＳＤＲＴＹＴＣＱＶＴＹＱＧＨＴＦＥ ＤＳＴＫＫＣＡ）および配列番号２０９（ＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣ ＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩ ＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰ）に示される。
本明細書で使用される「ヒンジ領域」または「ヒンジ」は、（ａ）野生型および改変免疫グロブリンヒンジを含む免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、上部および中心領域で構成される）もしくはその機能的な変異体、（ｂ）レクチンドメイン間領域もしくはその機能的な変異体、（ｃ）クラスター分化（ＣＤ）分子ストーク領域もしくはその機能的な変異体、または（ｄ）免疫グロブリンＶ様もしくは免疫グロブリンＣ様のドメインに結合する細胞表面受容体の一部分（ドメイン間領域）を指す。
本明細書で使用される「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤについて）ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に挿入され、かつそれらを結合するか、あるいは（ＩｇＥおよびＩｇＭについて）ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとの間に挿入され、かつそれらを結合する、抗体の重鎖で見出される自然発生の上部および中間ヒンジアミノ酸配列を指す。ある特定の実施形態において、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列はヒトであり、ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧヒンジ領域を含む。例示的なヒト野生型免疫グロブリンヒンジ領域は、配列番号２０６（ＩｇＡ１ヒンジ）、２０７（ＩｇＡ２ヒンジ）、２１０（ＩｇＤヒンジ）、２１１（ＩｇＧ１ヒンジ）、２１２（ＩｇＧ２ヒンジ）、２１３（ＩｇＧ３ヒンジ）、および２１４（ＩｇＧ４ヒンジ）に示される。
「改変野生型免疫グロブリンヒンジ領域」または「改変免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％のアミノ酸置換または欠失）、あるいは（ｂ）約５個のアミノ酸（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸）〜最大約１２０個のアミノ酸（例えば、約１０〜約４０個のアミノ酸もしくは約１５〜約３０個のアミノ酸もしくは約１５〜約２０個のアミノ酸もしくは約２０〜約２５個のアミノ酸の長さを有する）の長さを有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分を指し、最大約３０％のアミノ酸変化（例えば、最大約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％のアミノ酸置換または欠失あるいはその組み合わせ）を有し、かつ配列番号１９９〜２０１に示されるＩｇＧ中心ヒンジ領域を有する。ある特定の実施形態において、野生型または改変免疫グロブリンヒンジ領域中の１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン）によって置換され得る。さらなる実施形態において、改変免疫グロブリンヒンジ領域は、あるいは、またはさらに、別のアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン）によって置換されるプロリン残基を有する。例示的な改変野生型免疫グロブリンヒンジ領域は、配列番号２１５〜２２７に示される領域を含む。
ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドの構築体設計（例えば、融合ポリペプチドをコードする核酸分子の構築中の制限酵素部位の使用に由来するアミノ酸残基）に起因して、ヒンジとＦｃ領域部分との間に１個以上（例えば、約２〜８個）のアミノ酸残基が存在し得る。本明細書に記載される時、そのようなアミノ酸残基は、「結合アミノ酸」または「結合アミノ酸残基」と称され得る。例示的な結合アミノ酸は、配列番号１４〜１７に提供されるヒンジ変異体配列に示される（例えば、配列番号１４において、Ｃ末端ＳＧ残基は結合アミノ酸と見なされ、配列番号１５において、Ｎ末端ＳＳ残基は結合残基と見なされ、配列番号１６において、Ｎ末端ＳＳおよびＣ末端ＳＧ残基は結合アミノ酸と見なされ、配列番号１７において、Ｎ末端ＲＴおよびＣ末端ＳＧは結合アミノ酸である）。
ある特定の実施形態において、結合アミノ酸は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域部分とヘテロ二量化ドメイン（ＣＨ１またはＣＬ）との間に存在する。これらの結合アミノ酸は、ＣＨ３のＣ末端とＣＨ１またはＣＬのＮ末端との間に存在する時、「ＣＨ３とＣＨ１またはＣＬとの間のリンカー」とも称される。そのようなリンカーは、例えば、約２〜１０１２個のアミノ酸長であり得る。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域部分は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、その中でヒトＩｇＧ１ ＣＨ３のＣ末端リジン残基が欠失される。ＣＨ３とＣＨ１との間の例示的なリンカーは、配列番号７９９〜８０１に示されるリンカーを含む。ＣＨ３とＣκとの間の例示的なリンカーは、配列番号８０２〜８０４に示されるリンカーを含む（その中で、リンカー中のカルボキシル末端アルギニンは、代替的に、Ｃκの第１のアルギニンと見なされ得る）。ある特定の実施形態において、そのようなリンカーまたはリンカー対（例えば、ヘテロ二量体の一方の一本鎖ポリペプチド中の配列番号７９９のＣＨ３−ＣＨ１リンカーおよびヘテロ二量体の他方の一本鎖ポリペプチド中の配列番号８０２のＣＨ３−Ｃκリンカー、配列番号８００のＣＨ３−ＣＨ１リンカーおよび配列番号８０３のＣＨ３−Ｃκリンカー、ならびに配列番号８０１のＣＨ３−ＣＨ１リンカーおよび配列番号８０４のＣＨ３−Ｃκリンカー）の存在は、ヘテロ二量体のそれら両方の一本鎖ポリペプチドにおいて配列番号７９８に示される参照ＫＳＲ配列等の参照リンカーの存在と比較して、ヘテロ二量体の産生を改善する。
「ペプチドリンカー」または「可変ドメインリンカー」は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結し、かつ結果として得られるポリペプチドが同一の軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同一の標的分子に対して特異的結合親和性を保持するように、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供するアミノ酸配列を指す。ある特定の実施形態において、可変ドメインリンカーは、約５〜約３５個のアミノ酸から成り、ある特定の実施形態では、約１５〜約２５個のアミノ酸を含む。
「野生型免疫グロブリン領域」または「野生型免疫グロブリンドメイン」は、種々の免疫グロブリンクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭを含む）ならびに種々の種（例えば、ヒト、ヒツジ、マウス、ラット、および他の哺乳動物を含む）からの自然発生の免疫グロブリン領域またはドメイン（例えば、自然発生のＶＬ、ＶＨ、ヒンジ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）を指す。例示的な野生型ヒトＣＨ１領域は配列番号２０、２２８〜２３５に示され、野生型ヒトＣκ領域は配列番号２３６に示され、野生型ヒトＣλ領域は配列番号２３７〜２４０に示され、野生型ヒトＣＨ２ドメインは配列番号２４１〜２４９に示され、野生型ヒトＣＨ３ドメインは配列番号２５０〜２５８に示され、および野生型ヒトＣＨ４ドメインは配列番号２５９〜２６０に示される。
「改変免疫グロブリン領域」または「改変免疫グロブリンドメイン」は、野生型免疫グロブリン領域またはドメイン（例えば、野生型ＶＬ、ＶＨ、ヒンジ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４）に対して、少なくとも約７５％（例えば、約８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）の配列同一性を有する免疫グロブリン領域を指す。例えば、「改変免疫グロブリンＣＨ１領域」または「改変ＣＨ１領域」は、野生型免疫グロブリンＣＨ１領域（例えば、ヒトＣＨ１）に対して、少なくとも約７５％（例えば、約８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％）の配列同一性を有するＣＨ１領域を指す。同様に、「改変免疫グロブリンＣＨ２ドメイン」または「改変ＣＨ２ドメイン」は、野生型免疫グロブリンＣＨ１領域（例えば、ヒトＣＨ２）に対して、少なくとも約７５％（例えば、約８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％）の配列同一性を有するＣＨ２ドメインを指す。
本明細書で使用される「配列同一性」は、必要である場合、最大の割合の配列同一性を達成するために、配列を整列させ、かつギャップを導入した後の、別の参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である１つの配列中のアミノ酸残基の割合を指し、任意の保存的置換を配列同一性の一部と見なさない。配列同一性の割合値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって定義されるＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２．０ソフトウェアによってもたらされ、パラメータは初期値に設定される。
ある特定の実施形態において、改変免疫グロブリンドメインは、野生型免疫グロブリンドメインの保存的アミノ酸置換のみを含有する。ある特定の他の実施形態において、改変免疫グロブリンドメインは、野生型免疫グロブリンドメインの非保存的アミノ酸置換のみを含有する。さらに他の実施形態において、改変免疫グロブリンドメインは、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方を含有する。
「保存的置換」は、当分野において、１つのアミノ酸から同様の特性を有する別のアミノ酸への置換として認識される。例示的な保存的置換が当分野において周知である（例えば、１９９７年３月１３日に公開された国際特許第ＷＯ９７／０９４３３号１０ページ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７、Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９０），ｐ．８を参照のこと）。ある特定の実施形態において、保存的置換は、ロイシンからセリンへの置換を含む。
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、酵素を有するか、あるいは有さないかのいずれかの化学的または生物学的手段、例えば、グリコシル化、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成による、ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の修飾を指す。概して、「誘導体」は、「誘導体」を生成するために親ポリペプチドが出発物質であり得る一方で、「類似体」を生成するために親ポリペプチドが必ずしも出発物質として使用されないという点において、「類似体」とは異なる。誘導体は、親ポリペプチドの異なる化学的、生物学的、または物理的特性を有し得る。例えば、誘導体は、親ポリペプチドと比較して、より親水性であり得るか、あるいは改変反応性を有し得る（例えば、標的に対するその親和性を改変するアミノ酸変化を有するＣＤＲ）。
本明細書で使用される時、別途提供されない限り、免疫グロブリン分子の可変領域におけるアミノ酸残基の位置は、カバット番号付け慣例（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９９１））に従って番号付けされ、免疫グロブリン分子の定常領域におけるアミノ酸残基の位置は、ＥＵ命名法（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｔｈｅｒａｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４）に従って番号付けされる。
「受容体」は、シグナル分子（すなわち、ホルモン、神経伝達物質、毒素、サイトカイン等のリガンド）が付着する細胞の原形質膜または細胞質に存在するタンパク質分子である。受容体との単一分子の結合は、通常、細胞応答を開始する受容体の立体構造変化をもたらす。しかしながら、いくつかのリガンドは、任意の応答を誘発することなく単に受容体を阻止する（例えば、アンタゴニスト）。いくつかの受容体タンパク質は、表在性膜タンパク質であり、多くのホルモンおよび神経伝達物質受容体は、細胞膜のリン脂質二重層中に組み込まれる膜貫通タンパク質であり、別の主要クラスの受容体は、ステロイドおよびイントラクリンペプチドホルモン受容体に対するタンパク質等の細胞内タンパク質である。
「生物学的試料」という用語は、血液試料、生検標本、組織移植片、器官培養、生物学的流体（例えば、血清、尿、脳脊髄液）、または任意の他の組織もしくは細胞、あるいは対象または生物学的供給源由来の他の調製物を含む。対象または生物学的供給源は、例えば、ヒトもしくは非ヒト動物、染色体に組み込まれた核酸配列もしくはエピソーム組換え核酸配列を含有し得る遺伝子組換え細胞株を含む初代細胞培養または培養適応細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、不死化細胞株または不死化可能な細胞株、分化した細胞株または分化可能な細胞株、形質転換細胞株等であり得る。本開示のさらなる実施形態において、対象または生物学的供給源は、悪性疾患、障害、もしくは状態、またはＢ細胞障害を含む疾患、障害、もしくは状態を有するか、あるいは有する危険性があると疑われ得る。ある特定の実施形態において、対象または生物学的供給源は、過剰増殖性疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患を有するか、あるいは有する危険性があると疑われ得、本開示のある特定の他の実施形態では、対象または生物学的供給源は、そのような疾患、障害、または状態の危険性または存在がないことが既知であり得る。
「治療」、「治療する」、または「改善する」は、治療処置または予防的／予防処置のいずれかを指す。治療は、治療を受ける個人における疾患の少なくとも１つの症状が改善される場合、または治療が個人における進行性疾患の悪化を遅らせ得るか、あるいはさらなる関連した疾患の発症を予防し得る場合、治療的である。
「治療的に有効な量（または用量）」または「有効量（または用量）」の特異的結合分子または化合物は、統計的に有意な様式で治療される疾患の１つ以上の症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量を指す。単独で投与される個々の活性成分に言及する時、治療的に有効な用量は、その成分のみを指す。組み合わせに言及する時、治療的に有効な用量は、連続的投与または同時投与に関わらず、（同一の製剤または同時に別個の製剤において）治療効果をもたらす活性成分の組み合わせの量を指す。
「薬学的に許容される」という用語は、当分野において周知の経路を用いて投与される時にアレルギー性または他の重度の拒絶反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。
「必要とする患者」は、本明細書に提供される免疫グロブリン結合ポリペプチドまたはその組成物での治療もしくは改善に適している疾患、障害、もしくは状態の危険性があるか、あるいはそれらに罹患している患者を指す。
本明細書で使用される「免疫グロブリン由来の融合タンパク質」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン等の少なくとも１つの免疫グロブリン領域を含む融合タンパク質を指す。免疫グロブリン領域は、野生型免疫グロブリン領域または改変免疫グロブリン領域であり得る。
さらなる定義が本開示を通して提供される。
結合ドメインを含む構築体
本開示は、結合ドメイン、具体的には、ＲＯＮに特異的に結合する結合ドメインを含むポリペプチドを提供する。本開示の結合ドメインを含むポリペプチドは、本明細書に記載の結合ドメインを含み、かつＦｃ領域ドメイン、リンカー、ヒンジ、二量化／ヘテロ二量化ドメイン、結合アミノ酸、タグ等の多種多様の他の成分／ドメインのうちのいずれかをさらに含む融合タンパク質であり得る。免疫グロブリンポリペプチドのこれらの成分は、以下でさらに詳細に説明される。
さらに、本明細書に開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、多種多様の異なる形式のうちのいずれかの抗体または融合タンパク質の形態であり得る（例えば、融合タンパク質は、ＳＭＩＰ（商標）、ＰＩＭＳ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）／Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質、またはインターセプタータンパク質の形態であり得る）。
結合ドメイン
上述のように、本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、標的（例えば、ＲＯＮ）に特異的に結合する結合ドメインを含む。結合ドメインによる標的の結合は、標的（例えば、ＲＯＮ等の受容体またはリガンド）と別の分子との間の相互作用を阻止し、したがって、標的のある特定の機能（例えば、シグナル変換）を妨害、減少、または排除し得る。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドの一次標的がＲＯＮタンパク質であることに留意されたい。しかしながら、ある特定の実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、ＲＯＮ、またはＲＯＮ以外の標的（例えば、異種標的）に結合する１つ以上のさらなる結合ドメインを含み得る。これらの異種標的分子は、例えば、特定の細胞型、毒素、さらなる細胞受容体、抗体等に対する結合ドメインポリペプチドを標的とする特定のサイトカインまたは分子を含み得る。
ある特定の実施形態において、例えば、インターセプター分子の一部としての結合ドメインは、ＲＯＮを発現する標的細胞へのＴ細胞の動員のためにＴＣＲ結合ドメインを含み得る（例えば、実施例８を参照のこと）。ある特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドヘテロ二量体は、ＴＣＲ複合体またはその成分（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε）に特異的に結合する結合ドメインならびにＲＯＮに特異的に結合する別の結合ドメインを含み得る。
したがって、結合ドメインは、目的の標的（例えば、ＲＯＮ）に特異的に結合する任意のペプチドであり得る。結合ドメインの供給源は、ヒト、齧歯類、鳥類、および羊を含む、（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または可溶性ＶＨドメインもしくはドメイン抗体としてフォーマットされ得る）種々の種由来の抗体可変領域を含む。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変領域（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）を含む（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：４８４−４９０）。結合ドメインのさらなる供給源は、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、またはラマ、Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４（３）：５２１−５２６、Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）２８４：３２７３−３２８４、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４４６、およびＮｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７５：４１３）、テンジクザメ（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：１１８０４）、スポッテッドラットフィッシュ（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５４：３９）、またはｌａｍｐｒｅｙ（Ｈｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５：２０４０−２０４５およびＡｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：３１９−３２７）等の他の種由来の抗体の可変領域を含む。これらの抗体は、外見上、重鎖可変領域のみを用いて抗原結合領域を形成することができ、すなわち、これらの機能的抗体は、重鎖のみのホモ二量体（「重鎖抗体」と称される）である（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：１１６１−１１６５、Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３−２８５７、Ｂａｒａｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １２：５８０−５８４、およびＢａｒｔｈｅｌｅｍｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８３：３６３９−３６５４）。
本開示の結合ドメインの代替の供給源は、ランダムペプチドライブラリをコードする配列、またはフィブリノゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３８８を参照のこと）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８を参照のこと）、アンキリン反復タンパク質（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３３２：４８９−５０３およびＢｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：５７５−５８２）、フィブロネクチン結合ドメイン（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２６：１４７５−１４８８、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １８（９）：４３５−４４４、およびＨａｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３８１：１２３８−１２５２）、システインノットミニタンパク質（Ｖｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：６４０４−６４０８、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：７１−７６、およびＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １３：７５５−７６８）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１：４９７−５０８およびＣｏｒｔａｊａｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１６１−１６６）、ロイシンリッチ反復ドメイン（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３３２：４７１−４８７）、リポカリンドメイン（例えば、国際特許第ＷＯ２００６／０９５１６４号、Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９６：１８９８−１９０３、およびＳｃｈoｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０６：８１９８−８２０３を参照のこと）、Ｖ様のドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照のこと）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｚｅｌｅｎｓｋｙ ａｎｄ Ｇｒｅａｄｙ（２００５）ＦＥＢＳ Ｊ．２７２：６１７９、Ｂｅａｖｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：７５３−７５７、およびＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：７７７９−７７８４）、ｍＡｂ２またはＦｃａｂ（商標）（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００７／０９８９３４号、同第ＷＯ２００６／０７２６２０号を参照のこと）、もしくは同等物（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８（６）：６０１−６０８、Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：７７２−７７７、Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６８（１５）：４２６９−４２７７、およびＢｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１２５７−１２６８）等の代替の非抗体足場のループ領域中に工学的に作製される多様なアミノ酸をコードする配列を含む。
本開示の結合ドメインは、本明細書に記載されるように、または当分野で既知の多種多様の方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号および同第６，２９１，１５８号を参照のこと）によって生成され得る。例えば、本開示の結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合するＦａｂ断片についてＦａｂファージライブラリをスクリーニングすることによって同定され得る（Ｈｏｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４を参照のこと）。さらに、好都合な系（例えば、マウス、ＨＵＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウス（商標）、ＫＭ−マウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ等）において、免疫原として目的の標的を用いるハイブリドーマ開発のための従来の戦略は、本開示の結合ドメインを開発するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、結合ドメインは、目的の標的に対して特異的なＶＨおよびＶＬ領域を含む一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ある特定の実施形態において、ＶＨおよびＶＬドメインは、ヒトである。例示的なＶＬおよびＶＨ領域は、本明細書に記載の４Ｃ０４および１１Ｈ０９抗体由来のＶＬおよびＶＨ領域を含む。４Ｃ０４の軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１５２に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１４１〜１４３に示される。４Ｃ０４の重鎖アミノ酸配列は、配列番号１５３に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１４４〜１４６に示される。１１Ｈ０９ ｓｃＦｖの軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８０に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６７−６９に示される。１１Ｈ０９ ｓｃＦｖの重鎖アミノ酸配列は、配列番号８１に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７０〜７２に示される。
ある特定の実施形態において、結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号８０および１５２）もしくは重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、配列番号８１および１５３）、またはそれら両方と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、もしくは１００％同一である配列を含むか、あるいはその配列である。ある特定の実施形態において、それぞれのＣＤＲは、目的の標的（例えば、ＲＯＮ）に特異的に結合するモノクローナル抗体もしくは断片またはその誘導体由来のＣＤＲと比較して、１つ以下、２つ以下、もしくは３つ以下の置換、挿入、または欠失を含む。さらなる実施形態において、結合ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（例えば、本明細書に記載の４Ｃ０４および１１Ｈ０９抗体由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含み、本ＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つは、本明細書に記載のＣＤＲの３、４、５、６、７、８、もしくは９個のアミノ酸を有するＣＤＲの断片等の本明細書に開示のＣＤＲの断片を含む。
ある特定の実施形態において、結合ドメインは、ヒト化バージョンの軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、配列番号８０および１５２）またはヒト化バージョンの重鎖可変領域（ＶＨ）（例えば、配列番号８１および１５３）、またはそれら両方である配列を含むか、あるいはその配列である。例示的なヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８２、８３、および１５４に提供される。例示的なヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８４〜８６および１５５〜１５６に提供される。
ある特定の実施形態において、本開示の結合ドメインＶＨ領域は、既知のモノクローナル抗体（例えば、ＤＸ０７抗ＲＯＮ抗体）のＶＨに由来し得るか、あるいはそれに基づき得、既知のモノクローナル抗体のＶＨと比較して、約１つ以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、約１つ以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、約１つ以上（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）、または上述の変化の組み合わせを含有する。挿入、欠失、または置換は、それぞれのＣＤＲが、変化を含まないか、あるいは最大１つ、２つ、または３つの変化を含み、かつ修正されたＶＨ領域を含有する結合ドメインが、野生型結合ドメインに類似した親和性を有するその標的に依然として特異的に結合することができるという条件で、この領域のアミノ末端もしくはカルボキシル末端またはそれら両方の末端部を含むＶＨ領域のいたるところに存在し得る。
さらなる実施形態において、本開示の結合ドメイン中のＶＬ領域は、既知のモノクローナル抗体のＶＬに由来するか、あるいはそれに基づき、既知のモノクローナル抗体のＶＬと比較して、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、または上述の変化の組み合わせを含有する。挿入、欠失、または置換は、それぞれのＣＤＲが、変化を含まないか、あるいは最大１つ、２つ、または３つの変化を含み、かつ修正されたＶＬ領域を含有する結合ドメインが、野生型結合ドメインに類似した親和性を有するその標的に依然として特異的に結合することができるという条件で、この領域のアミノ末端もしくはカルボキシル末端またはそれら両方の末端部を含むＶＬ領域のいたるところに存在し得る。
ＶＨおよびＶＬドメインは、いずれかの配向（すなわち、アミノ末端からカルボキシ末端、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＨ）で配置され得、２つのサブ結合ドメインが相互作用して、機能的結合ドメインを形成することができるように、可変ドメインリンカー、例えば、スペーサー機能を提供することができるアミノ酸配列（例えば、約５〜約３５個のアミノ酸長を有する）によって任意で連結され得る。ある特定の実施形態において、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するアミノ酸配列（本明細書において「可変ドメインリンカー」とも称される）は、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ等の（ＧｌｙｎＳｅｒ）ファミリーに属する配列を含み、ｎは、１〜５の整数である。ある特定の実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ（配列番号１７９）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８０）である。ある特定の実施形態において、これらの（ＧｌｙｎＳｅｒ）ベースのリンカーは、結合ドメインにおいてＶＨドメインとＶＬドメインを連結するために使用されるが、結合ドメインを任意の他のドメイン、例えば、ヘテロ二量化ドメイン、またはＦｃ領域部分に連結するために使用されない。
例示的なＲＯＮに対して特異的な結合ドメインは、配列番号１５７に示されるような４Ｃ０４ ｓｃＦｖ、または配列番号１５８および１５９に示されるようなそのヒト化バージョン、および配列番号８７に示されるような１１Ｈ０９ ｓｃＦｖ、または配列番号８８〜９３に示されるようなそのヒト化バージョンを含む。
４Ｃ０４ ｓｃＦｖの軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１５２に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１４１〜１４３に示される。４Ｃ０４ ｓｃＦｖの重鎖アミノ酸配列は、配列番号１５３に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１４４〜１４６に示される。
１１Ｈ０９ ｓｃＦｖの軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８０に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６７〜６９に示される。１１Ｈ０９の重鎖アミノ酸配列は、配列番号８１に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７０〜７２に示される。
ある特定の実施形態において、ＲＯＮ結合ドメインは、ＲＯＮリガンドマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、またはそのＲＯＮ結合部分を含む。ＭＳＰタンパク質の配列は、当分野において既知であり、ＧＥＮＢＡＮＫ等の公開データベースから入手可能である。例証的なＭＳＰのアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＡＡ５９８７２ ｇｉ３９８０３８（配列番号７８５）および配列番号８０９に示されるようなＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６６２７８で見出され得る（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８（２１），１５４６１−１５４６８（１９９３）も参照のこと）。
本開示の結合ポリペプチドまたはそのポリペプチドヘテロ二量体中に含有される結合ドメインによって特異的に結合される標的分子は、目的の細胞（「標的細胞」）上に見出され得るか、あるいはそれと会合して見出され得る。例示的な標的細胞は、癌細胞、自己免疫疾患もしくは障害に関連した細胞または炎症性疾患もしくは障害に関連した細胞、および感染性の細胞（例えば、感染性の細菌）を含む。哺乳類寄生虫等の感染性の生物の細胞も、標的細胞として企図される。標的分子も細胞と会合されなくてもよい。細胞に会合されない例示的な標的分子は、可溶性タンパク質、分泌タンパク質、沈着タンパク質、および細胞外構造（マトリックス）タンパク質を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の免疫グロブリン結合タンパク質の結合ドメインは、腫瘍細胞、単球／マクロファージ細胞標的、および上皮細胞から選択される標的を認識する。さらなる実施形態において、本開示の結合ポリペプチドの結合ドメインは、表在性膜受容体タンパク質または膜貫通受容体タンパク質等の受容体タンパク質に結合する。
ある特定の実施形態において、本開示の免疫グロブリン結合タンパク質は、ＲＯＮに特異的に結合する。
二量化／ヘテロ二量化ドメインを有する免疫グロブリン結合ポリペプチド
ある特定の実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、二量化またはヘテロ二量化ドメインを含み得る。本明細書で使用される「ポリペプチドヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体」は、２つの異なる一本鎖ポリペプチドから形成される二量体を指す。
２つの一本鎖ポリペプチドからホモまたはヘテロ二量体を形成することが所望される場合に、二量化／ヘテロ二量化ドメインが使用され得、１つまたは両方の一本鎖ポリペプチドが結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、本明細書に記載のある特定のヘテロ二量体の１つの一本鎖ポリペプチドメンバーは、結合ドメインを含有しない場合もあることに留意されたい。例えば、表４に要約されるＲＯＮ−ｆ０３−ｆ０６インターセプター分子を参照されたい。結合ドメインを欠くこれらの一本鎖ポリペプチドメンバーは、本明細書に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチドの成分（例えば、Ｆｃ領域、ヒンジ、リンカー、二量化／ヘテロ二量化ドメイン、結合アミノ酸等）のうちのいずれかを含有し得る。
ある特定の実施形態において、結合ポリペプチドは、「二量化ドメイン」を含み、水素結合、静電相互作用、塩橋、ファンデルワールス力、ジスルフィド結合、疎水性相互作用等、またはそれらの任意の組み合わせによって、非共有結合性または共有結合性相互作用を介する少なくとも２つの一本鎖ポリペプチドまたはタンパク質の会合を促進することができるアミノ酸配列を指す。例示的な二量化ドメインは、免疫グロブリン重鎖定常領域またはサブ領域を含む。二量化ドメインが、二量体またはより高次の多量体複合体（三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体等）の形成を促進し得ることを理解されたい。
ヘテロ二量化が所望される時、ポリペプチドヘテロ二量体のヘテロ二量化ドメインは相互とは異なり、したがって、両方の鎖のヘテロ二量化を促進し、かつどちらかの鎖のホモ二量化を最小限に抑えるために、特異的に修飾され得る。本明細書に提供されるヘテロ二量化ドメインは、異なるポリペプチド間の効率的なヘテロ二量化を可能にし、かつ結果として得られるポリペプチドヘテロ二量体の精製を促進する。
本明細書に提供される時、本開示による２つの異なる一本鎖ポリペプチド（例えば、１つが短く、１つが長い）のヘテロ二量化を促進するのに有用なヘテロ二量化ドメインは、免疫グロブリンＣＨ１、ならびにＣＬドメイン、例えば、ヒトＣＨ１およびＣＬドメインを含む。ある特定の実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ ＣＨ１領域等の野生型ＣＨ１領域である。さらなる実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、それぞれ、配列番号１８１〜１８９に示されるような野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ ＣＨ１領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、配列番号２０に示されるような野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域であり、ある特定の実施形態では、本明細書において末端「ＲＴ」残基なしで構築体中に使用され得る。
さらなる実施形態において、改変ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ ＣＨ１領域等の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、改変免疫グロブリンＣＨ１領域である。ある特定の実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、改変ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ ＣＨ１領域である。なおさらなる実施形態において、野生型免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）でのジスルフィド結合の形成に関与する野生型ＣＨ１領域（例えば、ヒトＣＨ１）のシステイン残基は、ジスルフィド結合が改変ＣＨ１領域と野生型ＣＬドメインとの間に形成されないように、改変免疫グロブリンＣＨ１領域において欠失または置換される。
ある特定の実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、野生型Ｃκドメインまたは野生型Ｃλドメイン等の野生型ＣＬドメインである。特定の実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、それぞれ、配列番号１９０および１９１に示されるような野生型ヒトＣκまたはヒトＣλドメインである。さらなる実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、改変ＣκまたはＣλドメイン、例えば、改変ヒトＣκまたはヒトＣλドメイン等の改変免疫グロブリンＣＬドメインである。
ある特定の実施形態において、野生型免疫グロブリンＣＨ１領域（例えば、ヒトＣＨ１）でのジスルフィド結合の形成に関与する野生型ＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）のシステイン残基は、改変免疫グロブリンＣＬドメインにおいて欠失または置換される。そのような改変ＣＬドメインは、それらのアミノ末端でのアミノ酸欠失をさらに含み得る。例示的なＣκドメインは、配列番号２１に示され、その中で野生型ヒトＣｋドメインの最初のアルギニンおよび最後のシステインの両方が欠失される。例示的なＣλドメインは、配列番号１９２に示され、その中で野生型ヒトＣλドメインの最初のアルギニンは欠失され、ＣＨ１領域におけるシステインでのジスルフィド結合の形成に関与するシステインは、セリンによって置換される。
さらなる実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、野生型Ｃκドメインと比較して、Ｃκ−Ｃκ界面での鎖間水素結合ネットワークの形成に関与し得る位置での１つ以上のアミノ酸置換を含有する改変Ｃκドメインである。例えば、ある特定の実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、異なるアミノ酸で置換される位置Ｎ２９、Ｎ３０、Ｑ５２、Ｖ５５、Ｔ５６、Ｓ６８またはＴ７０で１つ以上のアミノ酸を有する改変ヒトＣκドメインである。アミノ酸の番号付けは、配列番号２１に示されるような改変ヒトＣκ配列中のそれらの位置に基づく。ある特定の実施形態において、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、位置Ｎ２９、Ｎ３０、Ｖ５５、またはＴ７０で１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換を有する改変ヒトＣκドメインである。上述の位置で置換体として使用されるアミノ酸は、アラニン、またはアルギニン、トリプトファン、チロシン、グルタミン酸塩、グルタミン、またはリジン等のバルク側鎖部分を有するアミノ酸残基であり得る。例示的な改変ヒトＣκドメインは、配列番号２６１〜２９７に示され改変ヒトＣｋドメインの例は、アミノ酸残基３０、５５、および７０が修飾された配列番号２２および２３に提供される。これらの２つのＣｋ変異体は、３つの置換残基を参照して、それぞれ、Ｃｋ（ＹＡＥ）およびＣｋ（ＥＡＥ）と称される。ある特定の改変ヒトＣκドメインは、ＣＨ１領域でヘテロ二量化を促進し得るが、別のＣκドメインでホモ二量化を最小限に抑え得る。代表的な改変ヒトＣκドメインは、配列番号２９８（Ｎ２９Ｗ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）、２９９（Ｎ２９Ｙ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）、３００（Ｔ７０Ｅ Ｎ２９Ａ Ｎ３０Ａ Ｖ５５Ａ）、３０１（Ｎ３０Ｒ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）、３０２（Ｎ３０Ｋ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）、３０３（Ｎ３０Ｅ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）、３０４（Ｖ５５Ｒ Ｎ２９Ａ Ｎ３０Ａ）、３０５（Ｎ２９Ｗ Ｎ３０Ｙ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）、３０６（Ｎ２９Ｙ Ｎ３０Ｙ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）、２３（Ｎ３０Ｅ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）、および２２（Ｎ３０Ｙ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）に示される。
さらなる実施形態において、他の改変ヒトＣκドメインは、Ｎ３０Ｄ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ（ＤＡＥ）、Ｎ３０Ｍ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ（ＭＡＥ）、Ｎ３０Ｓ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ（ＳＡＥ）、およびＮ３０Ｆ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ（ＦＡＥ）を含む。
さらなる実施形態において、特異的改変ＣＨ１ドメインは、ホモ二量化を不安定化するために、特定の改変ヒトＣκドメインと適切に対にされ得る。この点において、例証的な改変ドメイン対は、Ｃκ Ｌ２９Ｅ＋ＣＨ１ Ｖ６８ＫおよびＣκ Ｌ２９Ｋ＋ＣＨ１ Ｖ６８Ｅを含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載のＣｋドメインにおける変異に加えて、またはその代替として、ポリペプチドヘテロ二量体の両方の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（すなわち、免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメイン）は、結果として得られる免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインが、変異部位のアミノ酸残基間に塩橋（すなわち、イオン相互作用）を形成するように、変異を有する。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、変異Ｃｋドメインとの組み合わせの変異ＣＨ１ドメインであり得る。変異ＣＨ１ドメインにおいて、野生型ヒトＣＨ１ドメインの位置６８におけるバリン（Ｖ６８）は、負電荷を有するアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩）によって置換され、一方で、最初のアルギニンおよび最後のシステインが欠失された変異ヒトＣｋドメインの位置２９におけるロイシン（Ｌ２９）は、正電荷を有するアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）によって置換される。結果として得られる変異ＣＨ１ドメインの負電荷を有するアミノ酸残基と結果として得られる変異Ｃｋドメインの正電荷を有するアミノ酸残基との間の電荷間相互作用は、塩橋を形成し、変異ＣＨ１ドメインと変異Ｃｋドメインとの間のヘテロ二量体界面を安定化する。あるいは、野生型ＣＨ１のＶ６８は、正電荷を有するアミノ酸残基によって置換され得、一方で、最初のアルギニンおよび最後のシステインが欠失された変異ヒトＣｋドメインのＬ２９は、負電荷を有するアミノ酸残基によって置換され得る。Ｖ６８が負電荷または正電荷のいずれかを有するアミノ酸によって置換される例示的な変異ＣＨ１ドメインは、Ｖ６８ＫおよびＶ６８Ｅ置換ＣＨ１ドメインを含む。Ｌ２９が負電荷または正電荷のいずれかを有するアミノ酸によって置換される例示的な変異Ｃκドメインは、Ｌ２９ＥおよびＬ２９Ｋ置換Ｃκドメインを含む。ある特定の実施形態において、野生型Ｃκに存在する末端システイン残基は、欠失される。
ヒトＣＨ１ドメインのＶ６８およびヒトＣｋドメインのＬ２９以外の位置は、ＣＨ１ドメインのＶ６８およびＣｋドメインのＬ２９における変異に加えて、またはその代替として、アミノ酸間にイオン相互作用を引き起こすために、反対の電荷を有するアミノ酸で置換され得る。そのような位置は、ランダム変異誘発を含む任意の好適な方法、ＣＨ１−Ｃｋ界面におけるアミノ酸残基を同定するためのＣＨ１−Ｃｋ対の結晶構造の分析、および一連の基準（例えば、イオン相互作用に関与する傾向、可能性のあるパートナー残基への接近等）を用いて、ＣＨ１−Ｃｋ界面におけるアミノ酸残基間の好適な位置をさらに同定することによって同定され得る。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドヘテロ二量体が所望される時、使用される一本鎖ポリペプチドは、一対のみのヘテロ二量化ドメインを含有し得る。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の第１の鎖は、ヘテロ二量化ドメインとしてＣＨ１領域を含み得る一方で、第２の鎖は、ヘテロ二量化ドメインとしてＣＬドメイン（例えば、ＣκまたはＣλ）を含み得る。あるいは、第１の鎖は、ヘテロ二量化ドメインとしてＣＬ領域（例えば、ＣκまたはＣλ）を含み得る一方で、第２の鎖は、ヘテロ二量化ドメインとしてＣＨ１領域を含み得る。本明細書に示されるように、第１および第２の鎖のヘテロ二量化ドメインは、会合して本開示のポリペプチドヘテロ二量体を形成することができる。
ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、二対のヘテロ二量化ドメインを有し得る。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の第１の鎖は、２つのＣＨ１領域を含み得る一方で、第２の鎖は、第１の鎖中の２つのＣＨ１領域と会合する２つのＣＬドメインを有し得る。あるいは、第１の鎖は、２つのＣＬドメインを含み得る一方で、第２の鎖は、第１の鎖中の２つのＣＬドメインと会合する２つのＣＨ１領域を有し得る。ある特定の実施形態において、第１の鎖ポリペプチドは、ＣＨ１領域およびＣＬドメインを含む一方で、第２の鎖ポリペプチドは、それぞれ、第１の鎖ポリペプチド中のＣＨ１領域およびＣＬドメインと会合するＣＬドメインおよびＣＨ１領域を含む。
ポリペプチドヘテロ二量体が一対のみのヘテロ二量化ドメイン（すなわち、それぞれの鎖中に１つのヘテロ二量化ドメイン）を含む実施形態において、それぞれの鎖のヘテロ二量化ドメインは、その鎖のＦｃ領域部分のアミノ末端に位置付けられ得る。あるいは、それぞれの鎖中のヘテロ二量化ドメインは、その鎖のＦｃ領域部分のカルボキシル末端に位置付けられ得る。
ポリペプチドヘテロ二量体が二対のヘテロ二量化ドメイン（すなわち、それぞれの鎖中に２つのヘテロ二量化ドメイン）を含む実施形態において、それぞれの鎖中の両方のヘテロ二量化ドメインは、その鎖のＦｃ領域部分のアミノ末端に位置付けられ得る。あるいは、それぞれの鎖中の両方のヘテロ二量化ドメインは、その鎖のＦｃ領域部分のカルボキシル末端に位置付けられ得る。さらなる実施形態において、それぞれの鎖中の一方のヘテロ二量化ドメインは、その鎖のＦｃ領域部分に対してアミノ末端に位置付けられ得る一方で、それぞれの鎖中の他方のヘテロ二量化ドメインは、その鎖のＦｃ領域部分のカルボキシル末端に位置付けられ得る。言い換えると、それらの実施形態において、Ｆｃ領域部分は、それぞれの鎖の２つのヘテロ二量化ドメイン間に置かれる。
Ｆｃ領域部分
本明細書に示されるように、本開示の結合構築体は、結合ドメインを含むか否かに関わらず、Ｆｃ領域定常ドメイン部分（Ｆｃ領域部分とも称される）を含み得る。Ｆｃ領域部分の包含は、対象への投与後、循環からの結合タンパク質の排除を遅らせる当分野において既知であり、かつ本明細書に記載されるように、変異または他の改変によって、Ｆｃ領域部分はさらに、結合ポリペプチド、または二量体もしくはそのヘテロ二量体のエフェクター機能の比較的容易な調節を可能にし（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体固定、およびＦｃ受容体への結合）、治療される疾患に応じて増加するか、あるいは減少するかのいずれかであり得る。ある特定の実施形態において、本開示の結合ポリペプチドのＦｃ領域部分は、これらのエフェクター機能のうちの１つ以上を媒介することができる。
一本鎖ポリペプチド中に存在するＦｃ領域部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。例えば、Ｆｃ領域部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインの両方、２つのＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、または２つのＣＨ４ドメインを含み得る。
本開示の一本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分を形成し得るＣＨ２ドメインは、ある特定の免疫グロブリンクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＤ）ならびに種々の種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳動物を含む）由来の野生型免疫グロブリンＣＨ２ドメインまたはその改変免疫グロブリンＣＨ２ドメインであり得る。
ある特定の実施形態において、ＣＨ２ドメインは、それぞれ、配列番号２４１、２４６〜２４８、および２４２〜２４４に示されるようなヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの野生型ＣＨ２ドメイン等の野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ２ドメインである。ある特定の実施形態において、ＣＨ２ドメインは、配列番号２４１に示されるような野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインである。
ある特定の実施形態において、ＣＨ２ドメインは、位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換（例えば、アスパラギンからアラニン）を含む改変免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）である。そのようなアミノ酸置換は、この部位におけるグリコシル化を減少させるか、あるいはそれを排除し、ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの効率的なＦｃ結合を抑制する。位置２９７でのＡｓｎからＡｌａへの置換を有する改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインの配列は、配列番号３０７に示される。
ある特定の実施形態において、ＣＨ２ドメインは、位置２３４〜２３８での少なくとも１つの置換または欠失を含む改変免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、位置２３４〜２３８での２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸の位置２３４、２３５、２３６、２３７、もしくは２３８、位置２３４および２３５、位置２３４および２３６、位置２３４および２３７、位置２３４および２３８、位置２３４〜２３６、位置２３４、２３５、および２３７、位置２３４、２３６、および２３８、位置２３４、２３５、２３７、および２３８、位置２３６〜２３８、または任意の他の組み合わせでの置換を含み得る。さらに、またはあるいは、改変ＣＨ２領域は、位置２３４〜２３８での１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のアミノ酸欠失、例えば、位置２３６または位置２３７のうちの１つでの欠失を含み得る一方で、他の位置は置換される。上述の変異は、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃ受容体結合能力を減少させるか、あるいはそれを排除する。ある特定の実施形態において、位置２３４〜２３８のうちの１つ以上でのアミノ酸残基は、１つ以上のアラニン残基に置換されている。さらなる実施形態において、位置２３４〜２３８でのアミノ酸残基のうちの１つのみが欠失されている一方で、位置２３４〜２３８での残りのアミノ酸のうちの１つ以上は、別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）で置換され得る。
ある特定の他の実施形態において、ＣＨ２ドメインは、位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、および３３１での１つ以上のアミノ酸置換を含む改変免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、もしくは３３１、位置３１８および３２０、位置３１８および３２２、位置３１８、３２０、および３２２、または位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、および３３１のうちの任意の他の組み合わせでの２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのアミノ酸置換を含み得る。上述の変異は、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を減少させるか、あるいは排除する。
ある特定の他の実施形態において、位置２９７でのアミノ酸置換に加えて、改変ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）は、位置２３４〜２３８での１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のさらなる置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、位置２３４および２９７、位置２３４、２３５、および２９７、位置２３４、２３６、および２９７、位置２３４〜２３６、および２９７、位置２３４、２３５、２３７、および２９７、位置２３４、２３６、２３８、および２９７、位置２３４、２３５、２３７、２３８、および２９７、位置２３６〜２３８、および２９７、または位置２９７に加えて位置２３４〜２３８のうちの任意の組み合わせでの２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸置換を含み得る。さらに、またはあるいは、改変ＣＨ２領域は、位置２３６または位置２３７等の位置２３４〜２３８での１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ）のアミノ酸欠失を含み得る。
さらなる変異は、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃ受容体結合能力を減少させるか、あるいは排除する。ある特定の実施形態において、位置２３４〜２３８のうちの１つ以上でのアミノ酸残基は、１つ以上のアラニン残基に置換されている。さらなる実施形態において、位置２３４〜２３８でのアミノ酸残基のうちの１つのみが欠失されている一方で、位置２３４〜２３８での残りのアミノ酸のうちの１つ以上は、別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）で置換され得る。
ある特定の実施形態において、位置２３４〜２３８での１つ以上（例えば、２、３、４、または５）のアミノ酸置換に加えて、本開示の融合タンパク質中の変異ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）は、補体固定（例えば、位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、またはＰ３３１での）に関与する１つ以上の位置での１つ以上（例えば、２、３、４、５、または６）のさらなるアミノ酸置換（例えば、アラニンで置換）を含有し得る。変異免疫グロブリンＣＨ２領域の例には、位置２３４、２３５、２３７（存在する場合）、３１８、３２０、および３２２でのアラニン置換を伴うヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ならびにマウスＩｇＧ２ａ ＣＨ２領域が挙げられる。例示的な変異免疫グロブリンＣＨ２領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２（配列番号３０８）でのアラニン置換を伴うマウスＩＧＨＧ２ｃ ＣＨ２領域である。
なおさらなる実施形態において、位置２９７でのアミノ酸置換ならびに位置２３４〜２３８でのさらなる欠失または置換に加えて、改変ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）は、位置２５３、３１０、３１８、３２０、３２２、および３３１での１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ）のさらなる置換をさらに含み得る。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、（１）位置２９７での置換、（２）位置２３４〜２３８での１つ以上の置換もしくは欠失またはそれらの組み合わせ、ならびに位置Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２での１つ、２つ、３つの置換等の位置Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、およびＰ３３１での１つ以上（例えば、２、３、４、５、または６）のアミノ酸置換を含み得る。一実施形態において、上述の位置でのアミノ酸は、アラニンまたはセリンによって置換される。
ある特定の実施形態において、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは、（ｉ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、ならびに位置２３４、２３５、２３６、もしくは２３７での１つのアミノ酸置換、（ｉｉ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、ならびに位置２３４〜２３７のうちの２つでのアミノ酸置換、（ｉｉｉ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、ならびに位置２３４〜２３７のうちの３つでのアミノ酸置換、（ｉｖ）位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換、位置２３４、２３５、および２３７でのアミノ酸置換、ならびに位置２３６でのアミノ酸欠失、（ｖ）位置２３４〜２３７のうちの３つでのアミノ酸置換、ならびに位置３１８、３２０、および３２２でのアミノ酸置換、または（ｖｉ）位置２３４〜２３７のうちの３つでのアミノ酸置換、位置２３６でのアミノ酸欠失、ならびに位置３１８、３２０、および３２２でのアミノ酸置換を含む。
位置２９７のアスパラギンにおけるアミノ酸置換を伴う例示的な改変免疫グロブリンＣＨ２領域には、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、およびＮ２９７でのアラニン置換を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ２領域、ならびにＧ２３６（配列番号３０９）での欠失、Ｖ２３４、Ｇ２３６、およびＮ２９７（配列番号３１０）でのアラニン置換を伴うヒトＩｇＧ２ ＣＨ２領域、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、およびＮ２９７でのアラニン置換を伴うヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域、ならびにＧ２３６（配列番号３１１）での欠失、Ｆ２３４およびＮ２９７（配列番号３１２）でのアラニン置換を伴うヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域、Ｌ２３５およびＮ２９７（配列番号３１３）でのアラニン置換を伴うヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域、Ｇ２３６およびＮ２９７（配列番号３１４）でのアラニン置換を伴うヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域、ならびにＧ２３７およびＮ２９７（配列番号３１５）でのアラニン置換を伴うヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域が挙げられる。
ある特定の実施形態において、上述のアミノ酸置換に加えて、改変ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）は、上述の位置以外の１つ以上の位置での１つ以上のさらなるアミノ酸置換を含有し得る。そのようなアミノ酸置換は、保存的または非保存的アミノ酸置換であり得る。例えば、ある特定の実施形態において、Ｐ２３３は、改変ＩｇＧ２ ＣＨ２領域（例えば、配列番号３１０を参照のこと）においてＥ２３３に変化し得る。さらに、またはあるいは、ある特定の実施形態において、改変ＣＨ２領域は、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、またはそれら両方を含有し得る。挿入、欠失、または置換は、ヒンジを介するＣＨ２領域と別の領域（例えば、結合ドメインまたはヘテロ二量化ドメイン）との連結に起因する野生型免疫グロブリンＣＨ２領域のＮ末端またはＣ末端等の免疫グロブリンＣＨ２領域の任意の位置であり得る。
ある特定の実施形態において、本開示のポリペプチドヘテロ二量体中の改変ＣＨ２領域は、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域等の野生型免疫グロブリンＣＨ２領域と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含むか、あるいはその配列である。
本開示のポリペプチドヘテロ二量体中の改変免疫グロブリンＣＨ２領域は、種々の種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳動物を含む）由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、およびＩｇＤ等の種々の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ２領域に由来し得る。ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質中の改変免疫グロブリンＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域に由来し得、その配列は、配列番号２４１、２４６、２４８、および３１６に示される。
ある特定の実施形態において、改変ＣＨ２ドメインは、位置２３５、３１８、３２０、および３２２でのアラニン置換（すなわち、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ置換を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）（配列番号３１７）、ならびに任意でＮ２９７変異（例えば、アラニンへの変異）を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインである。ある特定の他の実施形態において、改変ＣＨ２ドメインは、位置２３４、２３５、２３７、３１８、３２０、および３２２でのアラニン置換（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ置換を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）（配列番号３１８）、ならびに任意でＮ２９７変異（例えば、アラニンへの変異）を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインである。
ある特定の実施形態において、改変ＣＨ２ドメインは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体固定、Ｆｃ受容体結合、またはそれらの任意の組み合わせ等の免疫学的活性を高める当分野で既知の変異を伴う改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインである。
本開示の結合ポリペプチドのＦｃ領域部分を形成し得るＣＨ３ドメインは、種々の種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳動物を含む）のある特定の免疫グロブリンクラスもしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）由来の野生型免疫グロブリンＣＨ３ドメインまたはその改変免疫グロブリンＣＨ３ドメインであり得る。ある特定の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、それぞれ、配列番号３１９〜３２８に示されるヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの野生型ＣＨ３ドメイン等の野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインである。ある特定の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、配列番号３１９に示される野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである。ある特定の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体の野生型ＣＨ３ドメインに基づくか、あるいはそれに由来する改変ＣＨ３ドメイン等の改変ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインである。例えば、改変ＣＨ３ドメインは、位置Ｈ４３３およびＮ４３４における１つまたは２つの変異を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインであり得る（位置はＥＵ番号付けに従って番号付けられる）。そのような位置での変異は、補体固定に関与し得る。ある特定の他の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインであり得るが、位置Ｆ４０５またはＹ４０７での１つもしくは２つのアミノ酸置換を伴う。そのような位置でのアミノ酸は、別のＣＨ３ドメインとの相互作用に関与する。ある特定の実施形態において、改変ＣＨ３ドメインは、その最後のリジンが欠失した改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインであり得る。この改変ＣＨ３ドメインの配列は、配列番号３２９に示される。
ある特定の実施形態において、特にポリペプチドヘテロ二量体が所望される場合、ヘテロ二量体のポリペプチドは、いわゆる「ノブからホールへの（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」変異を含むＣＨ３対を含む（Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ２６：６４９−５８，２００５、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：６１７−２１，１９６６を参照のこと）。より具体的には、変異は、ＣＨ３／ＣＨ３会合に必要とされる立体相補性がこれらの２つのＣＨ３ドメインを相互に対となるよう義務付けるように、２つのＣＨ３ドメインのそれぞれに導入され得る。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の１つの一本鎖ポリペプチド中のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ変異（小さいアミノ酸を大きいアミノ酸に置換する「ノブ」変異）を含有し得、ポリペプチドヘテロ二量体の他の一本鎖ポリペプチド中のＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ａ変異（大きいアミノ酸をより小さいアミノ酸に置換する「ホール」変異）を含有し得る。他の例示的なノブからホールへの変異には、（１）一方のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異、および他方のＣＨ３ドメインにおけるＹ４０７Ｔ変異、ならびに（２）一方のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異、および他方のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異が挙げられる。
結合ドメインを含有し得るか、あるいは含有し得ない一本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分を形成し得るＣＨ４ドメインは、ＩｇＥまたはＩｇＭ分子由来の野生型免疫グロブリンＣＨ４ドメインまたはその改変免疫グロブリンＣＨ４ドメインであり得る。ある特定の実施形態において、ＣＨ４ドメインは、それぞれ、配列番号３３０および３３１に示されるヒトＩｇＥおよびＩｇＭ分子の野生型ＣＨ４ドメイン等の野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインである。ある特定の実施形態において、ＣＨ４ドメインは、ＩｇＥまたはＩｇＭ Ｆｃ領域に関連付けられることで既知の免疫学的活性を増加または減少させる変異を有するヒトＩｇＥまたはＩｇＭ分子のＣＨ４ドメインに基づくか、あるいはそれに由来する改変ＣＨ４ドメイン等の改変ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインである。
ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域定常ドメイン部分は、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４ドメインの組み合わせ（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４から選択される２つ以上の定常サブドメイン）を含む。例えば、Ｆｃ領域部分は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含み得る。ある特定の他の実施形態において、Ｆｃ領域部分は、２つのＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２またはＣＨ４ドメインを含まない場合もある（すなわち、２つ以上のＣＨ３のみ）。Ｆｃ領域部分を形成する複数の定常サブドメインは、同一の免疫グロブリン分子、または同一のクラスもしくはサブクラスの免疫グロブリン分子に基づくか、あるいはそれに由来し得る。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域部分は、ＩｇＧ ＣＨ２ＣＨ３（例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３、ＩｇＧ２ ＣＨ２ＣＨ３、およびＩｇＧ４ ＣＨ２ＣＨ３）であり、ある特定の実施形態において、ヒト（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４）ＣＨ２ＣＨ３である。例えば、ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域部分は、（１）野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、（２）Ｎ２９７Ａ置換を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（すなわち、ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ））および野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、または（３）ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）および最後のリジンが欠失した改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３を含む。
あるいは、複数の定常サブドメインは、異なる免疫グロブリン分子、または異なるクラスもしくはサブクラス免疫グロブリン分子に基づくか、あるいはそれに由来し得る。例えば、ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域部分は、ヒトＩｇＭ ＣＨ３ドメインおよびヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの両方を含む。Ｆｃ領域部分を形成する複数の定常サブドメインは、ともに直接連結され得るか、あるいは１個以上（例えば、２〜８個）のアミノ酸を介して相互に連結され得る。
例示的なＦｃ領域部分は、配列番号１８〜１９、３３２〜３４１に示される。
本明細書に開示のヘテロ二量体に関して、ある特定の実施形態において、ポリペプチドヘテロ二量体の両方の一本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、相互に同一である。ある特定の他の実施形態において、ポリペプチドヘテロ二量体の一方の一本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分は、ヘテロ二量体の他方の一本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分とは異なる。例えば、一方のＦｃ領域部分は、「ノブ」変異を伴うＣＨ３ドメインを含有し得る一方で、他方のＦｃ領域部分は、「ホール」変異を伴うＣＨ３ドメインを含有し得る。
ヒンジ
本明細書に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチドのうちのいずれか、例えば、場合によっては結合ドメインを有する本開示による一本鎖ポリペプチドに含有されるヒンジ領域は、（ａ）Ｆｃ領域部分の直ぐアミノ末端側（例えば、アイソタイプに応じて、Ｆｃ領域部分がＣＨ２ＣＨ３であるＣＨ２ドメインのアミノ末端、またはＦｃ領域部分がＣＨ３ＣＨ４であるＣＨ３ドメインのアミノ末端）に位置付けられるか、（ｂ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とヘテロ二量化ドメインとの間に挿入され、かつそれらを結合するか、（ｃ）ヘテロ二量化ドメインとＦｃ領域部分との間に挿入され、かつそれらを結合するか（例えば、アイソタイプまたは複数のアイソタイプに応じて、Ｆｃ領域部分がＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ３ＣＨ４である）、（ｄ）Ｆｃ領域部分と結合ドメインとの間に挿入され、かつそれらを結合するか、（ｅ）一本鎖ポリペプチドのアミノ末端に位置付けられるか、あるいは（ｆ）一本鎖ポリペプチドのカルボキシル末端に位置付けられ得る。
ある特定の実施形態において、ヒンジは、野生型ヒト免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、配列番号３４２〜３４８に示されるヒト免疫グロブリンヒンジ領域）である。ある特定の他の実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基は、融合タンパク質構築体設計の一環として、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ末端またはカルボキシル末端で付加され得る。例えば、ヒンジアミノ末端におけるさらなる結合アミノ酸残基は、「ＲＴ」、「ＲＳＳ」、「ＳＳ」、「ＴＧ」、または「Ｔ」であり得るか、あるいはヒンジカルボキシル末端においては、「ＳＧ」であり得るか、あるいはヒンジ欠失は、カルボキシル末端で付加される「ＳＧ」を有するΔＰ等の付加と組み合わせられ得る。例証的な変異体ヒンジは、配列番号１４〜１７に提供される。
ある特定の実施形態において、ヒンジは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域中の１つ以上のシステイン残基が１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）で置換される改変免疫グロブリンヒンジである。例えば、ヒンジは、配列番号３４９に示される野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジに基づくか、あるいはそれに由来す改変免疫グロブリンヒンジであり得、アミノ末端からカルボキシル末端まで、上部ヒンジ領域（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ、配列番号１９４）および中心ヒンジ領域（ＣＰＰＣＰ、配列番号１９９）を含む。例示的な改変免疫グロブリンヒンジには、１つ、２つ、または３つの異なるアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）によって置換される野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ中に見出される１つ、２つ、または３つのシステイン残基を有する免疫グロブリンヒトＩｇＧ１ヒンジ領域が挙げられる。改変免疫グロブリンヒンジはさらに、別のアミノ酸（例えば、セリンまたはアラニン）で置換されるプロリンを有し得る。例えば、上述の改変ヒトＩｇＧ１ヒンジはさらに、プロリンを、別のアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン）によって置換される野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の３つのシステインに対してカルボキシル末端に位置付け得る。一実施形態において、中心ヒンジ領域のプロリンは置換されない。例示的な改変免疫グロブリンヒンジは、配列番号３５０〜３７７に示される。一実施形態において、改変ＩｇＧ１ヒンジは、第１のシステインがセリンによって置換される改変ヒトＩｇＧ１ヒンジである。この例示的な改変ＩｇＧ１ヒンジの配列は、配列番号３５４に示され、かつ「ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ」または「ＳＣＣ−Ｐヒンジ」と称される。ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、「ＲＴ」、「ＲＳＳ」、もしくは「Ｔ」）は、融合タンパク質構築体設計の一環として、変異免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ末端またはカルボキシル末端で付加され得る。
ある特定の実施形態において、ヒンジポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ、または野生型ヒトＩｇＧ４ヒンジ等の野生型免疫グロブリンヒンジ領域と少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一の配列を含むか、あるいはその配列である。
さらなる実施形態において、ヒンジは、免疫グロブリンヒンジに基づかないか、あるいはそれに由来しない（すなわち、野生型免疫グロブリンヒンジまたは改変免疫グロブリンヒンジではない）ヒンジであり得る。一実施形態において、非免疫グロブリンベースのヒンジのこれらの種類は、本明細書に記載のポリペプチドのカルボキシル末端上またはその近くで（例えば、Ｆｃ領域部分に対してカルボキシル末端に位置付けられる）使用される。そのようなヒンジの例には、配列番号３７８−３８３に示されるＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄのストーク領域等のＩＩ型ＣレクチンまたはＣＤ分子のドメイン間またはストーク領域由来のペプチドが挙げられる。さらなる例示的なヒンジは、配列番号３８４〜４１９に示されるヒンジを含む。
本明細書において使用され得る代替のヒンジは、免疫グロブリンＶ様のドメインまたは免疫グロブリンＣ様のドメインに結合する細胞表面受容体（ドメイン間領域）の部分由来である。細胞表面受容体が複数のＩｇ Ｖ様のドメインをタンデムに含有するＩｇ Ｖ様のドメイン間の領域、および細胞表面受容体が複数のタンデムＩｇ Ｃ様の領域を含有するＩｇ Ｃ様のドメイン間の領域も、ポリペプチドヘテロ二量体の一本鎖ポリペプチドにおいて有用なヒンジとして企図される。ある特定の実施形態において、細胞表面受容体ドメイン間領域を含むヒンジ配列は、ポリペプチドヘテロ二量体形成を安定化するために１つ以上のジスルフィド結合を与えるＩｇＧ中心ヒンジ配列等の自然発生または付加モチーフをさらに含有し得る。ヒンジの例には、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ６６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５０、ＣＤ１６６、およびＣＤ２４４のＩｇ Ｖ様の領域とＩｇ Ｃ様の領域との間のドメイン間領域が挙げられる。
ある特定の実施形態において、ヒンジ配列は、約５〜１５０個のアミノ酸、約５〜１０個のアミノ酸、約１０〜２０個のアミノ酸、約２０〜３０個のアミノ酸、約３０〜４０個のアミノ酸、約４０〜５０個のアミノ酸、約５０〜６０個のアミノ酸、約５〜６０個のアミノ酸、約５〜４０個のアミノ酸、例えば、約８〜２０個のアミノ酸、または約１２〜１５個のアミノ酸を有する。ヒンジは、主に柔軟であり得るが、より強固な特性も提供し得、あるいは主に最小限のβシート構造を有するαらせん構造を含有し得る。ヒンジの長さまたは配列は、ヒンジが直接または間接的に（ヘテロ二量化ドメイン等の別の領域またはドメインを介して）結合される結合ドメインの結合親和性、ならびにヒンジが直接または間接的に結合されるＦｃ領域部分の１つ以上の活性に影響を及ぼし得る。
ある特定の実施形態において、ヒンジ配列は、血漿および血清において安定しており、かつタンパク質分解切断に耐性を示す。ＩｇＧ１上部ヒンジ領域中の第１のリジンは、タンパク質分解切断を最小限に抑えるために変異され得る。例えば、リジンは、メチオニン、トレオニン、アラニン、またはグリシンで置換され得るか、あるいは欠失される（例えば、アミノ末端での結合アミノ酸、例えば、ＲＴを含み得る配列番号４２０〜４７５を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、ヒンジ配列は、分子のカルボキシル末端を安定化するために、ジスルフィド結合もしくは複数のジスルフィド結合を形成する能力を与える免疫グロブリンヒンジ中心構造ＣＰＰＣ（配列番号４７６）等の自然発生または付加モチーフを含有し得る。他の実施形態において、ヒンジ配列は、１つ以上のグリコシル化部位を含有し得る。
改変免疫グロブリンヒンジを含む例示的なヒンジは、配列番号３８９〜４７５および４７７〜６０６に示される。変異体ヒンジを含むさらなる例証的なヒンジは、配列番号７９０〜７９７および８０５〜５０６に示される。
ある特定の実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、１つ以上のヒンジを含む。例えば、２つの結合ドメインのうちの一方がアミノ末端において、および他方がカルボキシル末端において２つの結合ドメインを有する一本鎖ポリペプチドは、２つのヒンジを有し得る。一方のヒンジは、アミノ末端で、またはその近くで、結合ドメインに直接もしくは間接的に（例えば、ヘテロ二量化ドメインを介して）結合され得、他方のヒンジは、カルボキシル末端で、またはその近くで、他方の結合ドメインに結合（例えば、直接的に結合）され得る。ある特定の実施形態において、一本鎖ポリペプチドが１つの結合ドメインのみを有する場合でさえも、それは、例えば、そのアミノまたはカルボキシル末端において１つ以上のヒンジを有し得る。ヘテロ二量体化が所望される場合等のある特定の実施形態において、そのようなヒンジは、２つの鎖のヘテロ二量化を促進または強化するために１つ以上の鎖間ジスルフィド結合を形成する等、ヘテロ二量体の第２の鎖中の対応するヒンジと相互作用し得る。ポリペプチドヘテロ二量体のＳＣＰ−Ｉのヒンジ（Ｈ−Ｉ）およびヘテロ二量体のＳＣＰ−ＩＩのヒンジ（Ｈ−ＩＩ）がそれらのそれぞれの一本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分の同一の末端上に位置付けられる時、Ｈ−ＩはＨ−ＩＩに「相当する」。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体は、以下の２つの一本鎖ポリペプチドを含み得る：アミノ末端からカルボキシル末端までの第１の鎖ポリペプチドは、第１の結合ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含み、アミノ末端からカルボキシル末端までの第２の鎖ポリペプチドは、ＣＫ、第１のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、第２のヒンジ、および第２の結合ドメインを含む。第１の鎖中のヒンジおよび第２の鎖の第１のヒンジともにそれらが結合されるＦｃ領域部分のアミノ末端であるため、第１の鎖中のヒンジは、第２の鎖の第１のヒンジに「相当する」と見なされるであろう。
特に免疫グロブリン結合ポリペプチドがそのカルボキシル末端において、またはその近くで結合ドメインを含むある特定の実施形態において、ヒンジは、結合ドメインとポリペプチドの別の部分（例えば、Ｆｃ領域部分またはヘテロ二量化ドメイン）を連結するために存在し得る。ある特定の実施形態において、そのようなヒンジは、非免疫グロブリンヒンジ（すなわち、野生型免疫グロブリンヒンジに基づかないか、あるいはそれに由来しないヒンジ）であり得、かつＩＩ型ＣレクチンまたはＣＤ分子のストーク領域、細胞表面受容体のＩｇＶ様のまたはＩｇＣ様のドメインに結合するドメイン間領域、または誘導体もしくはその機能的な変異体であり得る。「後端」ヒンジと称されることもある例示的なカルボキシル末端ヒンジは、配列番号３８４、３８９〜４１９、５９３〜５９６に示されるヒンジを含む。
他の成分または修飾
ある特定の実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、１つ以上のさらなるドメインまたは領域を含有し得る。そのようなさらなる領域は、アミノ末端における発現したポリペプチドの分泌のためのリーダー配列（「シグナルペプチド」とも称される）であり得る。本開示の例示的なリーダーペプチドは、配列番号１９３および１３に示される配列等の天然リーダー配列または他の配列を含む。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、リーダーペプチド（シグナルペプチド）を含まない成熟タンパク質を利用する。したがって、結合ドメインタンパク質（ＲＯＮ等）の本明細書に提供されるある特定の配列がリーダーペプチドを含む一方で、当業者は、シグナルペプチドを含む配列からの成熟タンパク質配列の決定方法を容易に理解するであろう。ある特定の実施形態において、このことは、リーダー配列を含むのに有用であり得る。
さらなる領域は、一本鎖ポリペプチドを同定または精製するために、カルボキシル末端において配列決定され得る（例えば、ヒスチジンタグ、ビオチン、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ、またはそれらの任意の組み合わせ等の検出または精製のためのエピトープタグ）。
さらに任意の領域は、１〜約８個のアミノ酸長（例えば、約２〜５個のアミノ酸）を有するさらなるアミノ酸残基（「結合アミノ酸」または「結合アミノ酸残基」と称される）であり得、本開示のポリペプチドのための特異的発現系または構築体設計の使用に起因し得る。そのようなさらなるアミノ酸残基（例えば、約１個、２個、３個、４個、または５個のさらなるアミノ酸）は、アミノ末端もしくはカルボキシル末端、あるいは結合ドメインとヘテロ二量化ドメインとの間、ヘテロ二量化ドメインとヒンジとの間、ヒンジとＦｃ領域部分との間、Ｆｃ領域部分のドメインの間（例えば、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間もしくは２つのＣＨ３ドメインの間）、結合ドメインとヒンジとの間、または可変ドメインとリンカーとの間等の種々の領域もしくはドメインの間に存在し得る。ヒンジへの例示的な結合アミノ酸アミノ末端には、ＲＤＱ（配列番号６０７）、ＲＴ、ＳＳ、ＳＡＳＳ（配列番号６０８）、およびＳＳＳ（配列番号６０９）が挙げられる。ヒンジへの例示的な結合アミノ酸カルボキシル末端には、アミノ酸ＳＧが挙げられる。さらなる例示的な結合アミノ酸には、ＳＲが挙げられる。
本開示のポリペプチドは、本明細書に記載の種々のドメイン間にリンカーも含み得る。例示的なリンカーは、配列番号６１０〜７７７に提供されるリンカーのうちのいずれかを含み得る。ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端とＣＨ１またはＣκドメインのアミノ末端との連結に有用な例証的なリンカーは、７９８〜８０５に提供される。
ある特定の実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＨ４領域）は、免疫グロブリン参照配列と相対的な改変グリコシル化パターンを有し得る。例えば、多種多様の遺伝子組換え技術のうちのいずれかが、ＣＨ２ドメインのＮ２９７（ＥＵ番号付け）等のグリコシル化部位を形成する１つ以上の特定のアミノ酸残基を改変するために採用され得る（Ｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１３６１、Ｊａｃｑｕｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４：１０４７、Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：７９３４、Ｗａｒｎｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：８３１を参照のこと）。あるいは、免疫グロブリン結合ポリペプチドを産生する宿主細胞は、改変グリコシル化パターンを産生するために操作され得る。当分野で既知の１つの方法は、例えば、ＡＤＣＣを増加させる両断型非フコシル化変異体の形態で改変グリコシル化を提供する。変異体は、オリゴ糖修飾酵素を含有する宿主細胞における発現に起因する。あるいは、ＢｉｏＷａ／Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏのポテリジェント技術が、本開示によるグリコシル化分子のフコース含量を減少させるために企図される。１つの既知の方法において、免疫グロブリンＦｃ領域のグリコシル化パターンを改変する組換え免疫グロブリン産生のためのＣＨＯ宿主細胞が、ＧＤＰ−フコースの産生を介して提供される。
あるいは、本開示の融合ポリペプチドのグリコシル化パターンを改変するために化学的技術が使用される。例えば、多種多様のグリコシダーゼおよび／またはマンノシダーゼ阻害剤が、ＡＤＣＣ活性の増加、Ｆｃ受容体結合の増加、およびグリコシル化パターンの改変の所望の効果のうちの１つ以上を提供する。ある特定の実施形態において、本開示の融合ポリペプチドを発現する細胞を、該宿主細胞によって産生される免疫糖タンパク質分子のＡＤＣＣを増加させる濃度で炭水化物修飾因子を含む培地中で成長させ、該炭水化物修飾因子は８００μＭ未満の濃度である。一実施形態において、これらのポリペプチドを発現する細胞を、カスタノスペルミンまたはキフネンシン、例えば、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、または８００μＭ等の１００〜８００μＭの濃度のカスタノスペルミンを含む培地中で成長させる。カスタノスペルミン等の炭水化物修飾因子を用いてグリコシル化を改変するための方法は、米国特許第７８４６４３４号またはＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／０５２０３０号に提供される。
免疫グロブリン結合ポリペプチド構造配置／形式：
免疫グロブリン結合ポリペプチド：抗体
本開示は、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓＦｖ、およびｓｃＦｖ等の抗体またはその抗原結合断片の形態の結合ドメインタンパク質を提供する。ＲＯＮまたは他の目的の標的に対して特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの技術、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６、ならびにその改善、Ｗａｙｎｅｒ ＥＡ、Ｈｏｆｆｓｔｒｏｍ ＢＧ．２００７．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４２６：１１７−１５３、およびＬａｎｅ ＲＤ．１９８５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：２２３−２２８等の当分野において周知の技術を用いて調製され得る。
これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生することができる不死化細胞株の調製を含む。そのような細胞株は、例えば、上述のように免疫を与えられた動物から入手される脾臓細胞から産生され得る。次に、脾臓細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、免疫を与えられた動物と同系である融合パートナーとの融合によって不死化される。多種多様の融合技術が採用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、非イオン洗剤と数分間合わせられ、その後、ハイブリッド細胞の成長を支援するが、骨髄腫細胞の成長を支援しない選択培地上に低密度でプレーティングされ得る。１つの選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。十分な時間、通常、約１〜２週間後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一のコロニーが選択され、それらの培養上清は、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
モノクローナル抗体は、成長するハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。加えて、ハイブリドーマ細胞株のマウス等の好適な脊椎動物宿主の腹膜腔への注入等の種々の技術が、収率を高めるために採用され得る。その後、モノクローナル抗体は、腹水または血液から採取される。汚染物質は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降、および抽出等の従来の技術によって抗体から除去され得る。
免疫グロブリン結合ポリペプチド：ＳＭＩＰ／ＰＩＭＳ分子
ある特定の実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、「小分子免疫薬」（ＳＭＩＰ（商標））を含み得る。この点において、ＳＭＩＰ（商標）という用語は、モノクローナル抗体および組換え抗体に対して強化された薬物特性を有する高度のモジュール化合物クラスを指す。ＳＭＩＰは、エフェクター細胞（例えば、マクロファージおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等）の所望のクラスの特異的動員ならびに／または補体媒介性死滅の動員を可能にする可変Ｆｃ領域と結合して、例えば、抗体可変ドメインに基づく標的特異的結合ドメインを含む単一のポリペプチド鎖を含む。標的およびヒンジ領域の選択に応じて、ＳＭＩＰは、細胞表面受容体を介してシグナル伝達し得るか、あるいはシグナル伝達を阻止し得る。したがって、概して、ＳＭＩＰタンパク質は、典型的にはそれらのアミノ末端からカルボキシル末端までを含む結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質であり、結合ドメインは、免疫グロブリン（例えば、ｓｃＦｖ）、ヒンジ領域、およびエフェクタードメイン（例えば、ＩｇＧ ＣＨ２およびＣＨ３領域）に由来する。本明細書で使用される「小分子免疫薬」または「ＳＭＩＰ（商標）生成物」は、米国特許公開第２００３／１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号、および同第２００５／０１３６０４９号、ならびに国際特許公開第ＷＯ０２／０５６９１０号、同第ＷＯ２００５／０３７９８９号、および同第ＷＯ２００５／０１７１４８号に記載されるものである。２つの同一のＳＭＩＰは、相互にホモ二量体を形成し得る。
いくつかの実施形態において、ＲＯＮ結合ドメインを含む本発明の融合タンパク質は、米国特許公開第２００９／０１４８４４７号および国際特許公開第ＷＯ２００９／０２３３８６号に記載の分子等のＰＩＭＳ（商標）分子とも称される、逆配向のＳＭＩＰ（商標）を含み得る。
免疫グロブリン結合ポリペプチド：Ｓｃｏｒｐｉｏｎ／Ｘｃｅｐｔｏｒ分子
ある特定の実施形態において、本発明のＲＯＮ結合ドメインは、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００７／１４６９６８号および米国２００９／０５９４４６号に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド等の免疫グロブリン結合ポリペプチド内に存在し得る。この実施形態では、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ／Ｘｃｅｐｔｏｒポリペプチドとも称される免疫グロブリン結合ポリペプチド、および本明細書における多特異的融合タンパク質は、ＲＯＮ結合ドメインおよびＲＯＮ以外の分子に結合するドメイン（「異種結合ドメイン」）を含み得る。ある特定の実施形態において、異種結合ドメインは、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＣＤ３、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｃ−Ｍｅｔ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧ）、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−Ｒ１、ＩＧＦ−Ｒ２、ＣＤ７２、ＥＧＦ、ＥＲＢＢ３、ＨＧＦ、ＣＤ４４、ＣＤ１５１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＴＲＯＰ２、ＤＲ５、ｃＫＩＴ、ＣＤ２７、ＩＬ６、ＣＤ４０、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＴＧＦＢ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、Ｗｎｔ、および成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）を含むが、それらに限定されない標的分子に特異的に結合する。
ＲＯＮ結合ドメインが多特異的融合タンパク質のアミノ末端にあり、異種結合ドメインがカルボキシル末端にあり得ることが企図される。異種結合ドメインがアミノ末端にあり、ＲＯＮ結合ドメインがカルボキシル末端にあり得ることも企図される。本明細書に記載されるように、本開示の結合ドメインは、介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン定常領域またはそのサブ領域）のそれぞれの末端に融合され得る。さらに、２つ以上の結合ドメインはそれぞれ、本明細書に記載のリンカーを介して介在ドメインに連結され得る。
本明細書で使用される「介在ドメイン」は、融合タンパク質が組成物中の一本鎖ポリペプチドとして、主に（例えば、約５０％以上の融合タンパク質の集団）または実質的に（例えば、約９０％以上の融合タンパク質の集団）存在するように、単に１つ以上の結合ドメインの足場として機能するアミノ酸配列を指す。例えば、ある特定の介在ドメインは、構造機能（例えば、スペーシング、柔軟性、剛性）または生物学的機能（例えば、ヒト血液等の血漿における増加した半減期）を有し得る。血漿中の本開示の融合タンパク質の半減期を増加させ得る例示的な介在ドメインは、アルブミン、トランスフェリン、血清タンパク質等またはその断片に結合する足場ドメインを含む。
ある特定の実施形態において、本開示の多特異的融合タンパク質中に含有される介在ドメインは、本明細書の他の箇所で説明される二量化ドメインである。ある特定の実施形態において、２つの同一の多特異的融合タンパク質は、相互にホモ二量体を形成し得る。
本明細書においてＸｃｅｐｔｏｒ分子と称されるＲＯＮ結合ドメインを含むポリペプチドの例示的な構造は、Ｎ−ＢＤ１−Ｘ−ＢＤ２−Ｃ、Ｎ−ＢＤ２−Ｘ−ＢＤ１−Ｃを含み、式中、ＮおよびＣは、それぞれ、アミノ末端およびカルボキシル末端を表し、ＢＤ１は、免疫グロブリン様もしくは免疫グロブリン可変領域結合ドメイン、または細胞外ドメイン等のＲＯＮ結合ドメインであり、Ｘは、介在ドメインであり、ＢＤ２は、異種結合ドメイン、すなわち、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＣＤ３、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｃ−Ｍｅｔ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧ）、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−Ｒ１、ＩＧＦ−Ｒ２、ＣＤ７２、ＥＧＦ、ＥＲＢＢ３、ＨＧＦ、ＣＤ４４、ＣＤ１５１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＴＲＯＰ２、ＤＲ５、ｃＫＩＴ、ＣＤ２７、ＩＬ６、ＩＬ６−Ｒ、ｈｙｐｅｒＩＬ６、ＣＤ４０、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＴＧＦＢ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、Ｗｎｔ、および成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）等であるが、それらに限定されないＲＯＮ以外のタンパク質に結合する結合ドメインである結合ドメインである。ある特定の実施形態において、ＢＤ１およびＢＤ２の両方ともに、免疫グロブリン様または免疫グロブリン可変領域結合ドメインであり、ポリペプチドは、「Ｓｃｏｒｐｉｏｎ」タンパク質とも称され得る。いくつかの構築体において、Ｘは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間に配置される免疫グロブリン定常領域またはサブ領域を含み得る。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端までを含む介在ドメイン（Ｘ）を有し、構造は、以下：−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−であり、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約２〜約１５０個のアミノ酸を含むリンカーであり、Ｘは、免疫グロブリン定常領域またはサブ領域である。さらなる実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、アルブミン、トランスフェリン、または別の血清タンパク質結合タンパク質である介在ドメインを有し、融合タンパク質は、組成物中の一本鎖ポリペプチドとして主にまたは実質的に残存する。
なおさらなる実施形態において、本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、以下の構造：Ｎ−ＢＤ１−Ｘ−Ｌ２−ＢＤ２−Ｃを有し、式中、ＢＤ１は、配列番号８７〜９３および１５７〜１５９に提供される結合ドメイン等のＲＯＮ結合ドメインと少なくとも約９０％同一の結合ドメイン等のＲＯＮ結合ドメインであり、−Ｘ−は、−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−であり、式中、Ｌ１は、第１または第２のシステインを置換することによって任意で変異される第１のＩｇＧ１ヒンジであり、−ＣＨ２ＣＨ３−は、ＩｇＧ１ ＦｃドメインのＣＨ２ＣＨ３領域であり、Ｌ２は、配列番号６１０〜７７７から選択されるリンカーであり、ＢＤ２は、ＲＯＮ以外の分子に結合する異種結合ドメインである。
ある特定の実施形態において、本開示は、複数のＲＯＮ結合ドメインを含むＳｃｏｒｐｉｏｎ／Ｘｃｅｐｔｏｒを提供する。一実施形態において、複数のＲＯＮ結合ドメインは、上述の本明細書の構造において説明されるように、タンデムに連結され、かつＢＤ１またはＢＤ２として機能し得る。別の実施形態では、ＳｃｏｒｐｉｏｎまたはＸｃｅｐｔｏｒ分子の結合ドメインの両方ともに、ＲＯＮ結合ドメインであり得る（例えば、ＢＤ１およびＢＤ２の両方ともにＲＯＮ結合ドメインである）。
免疫グロブリン結合ポリペプチド：ヘテロ二量体分子
本発明の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、本明細書の実施例；米国仮出願第６１／２９０，８４０号、同第６１／３６５，２６６号、および同第６１／３６６，７４３号；発明者Ｊｏｈｎ Ｗ．ＢｌａｎｋｅｎｓｈｉｐおよびＰｈｉｌｉｐ Ｔａｎの名の下に２０１０年１２月２９日出願の国際出願、表題「ＨＥＴＥＲＯＤＩＭＥＲ ＢＩＮＤＩＮＧ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」；ならびに発明者Ｊｏｈｎ Ｗ．ＢｌａｎｋｅｎｓｈｉｐおよびＰｈｉｌｉｐ Ｔａｎの名の下に２０１０年１２月２９日出願の国際出願、表題「ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ ＨＥＴＥＲＯＤＩＭＥＲＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」においてさらに説明されるポリペプチドヘテロ二量体等の、免疫グロブリンＣＨ１領域および免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）の自然のヘテロ二量化を介する２つの異なる一本鎖ポリペプチドの間に形成されるポリペプチドヘテロ二量体も含む。
本明細書で使用される「ポリペプチドヘテロ二量体」、「ヘテロ二量体」、または「インターセプター」は、２つの異なる一本鎖融合ポリペプチドから形成される二量体を指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチドヘテロ二量体は、他（短鎖）よりも長い少なくとも１つの鎖（長鎖）を含む。本用語は、４つの一本鎖ポリペプチド（すなわち、２つの軽鎖および２つの重鎖）から形成される抗体を含まない。「二量体」は、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）ならびに他の相互作用（例えば、静電相互作用、塩橋、水素結合、および疎水性相互作用）を含む分子内力の１つ以上の形態を介して相互に会合した２つのサブユニットからなり、かつ適切な条件下（例えば、生理学的条件下、組換えタンパク質を発現、精製、および／もしくは保存するのに好適な水溶液中、または非変性および／もしくは非還元電気泳動の条件下）で安定している生物学的実体を指す。
「一本鎖ポリペプチド」または「一本鎖融合ポリペプチド」は、共有結合的に連結したアミノ酸の一本の線形の近接配置である。これは、鎖間ジスルフィド結合を介して等の非線形様式でともに連結する２つのポリペプチド鎖を含まない（例えば、ジスルフィド結合を介して軽鎖が重鎖と連結する半分の免疫グロブリン分子）。ある特定の実施形態において、一本鎖ポリペプチドは、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を有するか、あるいはそれを形成し得る。一本鎖ポリペプチドは、場合によっては上述の結合ドメインを有し得る。例えば、ある特定の実施形態において、２つの一本鎖ポリペプチドは、それらがヘテロ二量体を形成するように構築され、ヘテロ二量体対の１つの一本鎖ポリペプチドメンバーは、結合ドメインを含有し、その対の他のメンバーは、結合ドメインを含有しない。したがって、本実施形態において、形成されるヘテロ二量体は、ヘテロ二量体メンバーポリペプチド鎖のうちの１つの結合ドメインの機能によって、結合分子として機能する。
本明細書で使用される「免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン」は、異なる免疫グロブリンドメイン（「第２の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン」）と優先的に相互作用または会合する免疫グロブリンドメイン（「第１の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン」）を指し、異なるヘテロ二量化ドメインの相互作用は、ヘテロ二量化（すなわち、ヘテロ二量体とも称される、２つの異なるポリペプチド間の二量体の形成）に実質的に寄与するか、あるいはそれを効率的に促進する。本開示の代表的な免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインは、本明細書に提供される免疫グロブリンＣＨ１領域、免疫グロブリンＣＬ領域（例えば、ＣκまたはＣλアイソタイプ）、またはその誘導体を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドヘテロ二量体は、（ｉ）第１の免疫グロブリンヘテロ二量化ドメインを有する一本鎖ポリペプチド（「第１の一本鎖ポリペプチド」）、および（ｉｉ）第１のヘテロ二量化ドメインと同一ではない第２のヘテロ二量化ドメインを有する別の一本鎖ポリペプチド（「第２の一本鎖ポリペプチド」）を含み、第１および第２のヘテロ二量化ドメインは、ポリペプチドヘテロ二量体の形成に実質的に寄与するか、あるいはそれを効率的に促進する。第１のヘテロ二量化ドメインおよび／または第２のヘテロ二量化ドメインの不在下で第１の一本鎖ポリペプチドと第２の一本鎖ポリペプチドとの間の二量化に統計的に有意な減少がある場合、第１のヘテロ二量化ドメインと第２のヘテロ二量化ドメインとの間の相互作用は、第１および第２の一本鎖ポリペプチドのヘテロ二量化に実質的に寄与するか、あるいはそれを効率的に促進する。ある特定の実施形態において、第１および第２の一本鎖ポリペプチドが共発現される場合、少なくとも約６０％、少なくとも約６０％〜約７０％、少なくとも約７０％〜約８０％、少なくとも約８０％〜約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％、および少なくとも約９０％〜約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の第１および第２の一本鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体を相互に形成する。
本明細書に記載のヘテロ二量化技術は、以下の利点：（１）二量体が免疫グロブリンＣＨ１領域および免疫グロブリンＣＬ領域の自然のヘテロ二量化を介して形成されるため、ポリペプチドヘテロ二量体の最小限の免疫原性、（２）本開示のポリペプチドヘテロ二量体の効率的な産生および精製は、実施例に示されるように、２つの異なる一本鎖ポリペプチドを共発現することによって可能であること、（３）本開示によるポリペプチドヘテロ二量体のそれぞれの鎖が、Ｆｃ領域部分（例えば、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を有するため、変異誘発によって上下に調節され得るＦｃエフェクター機能（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ）をおよびより長い血清半減期媒介する能力、ならびに（４）固形悪性腫瘍等へのより良好な組織透過性を可能にし得る、抗体分子よりも典型的には小さい寸法を有する本開示のポリペプチドヘテロ二量体のうちの１つ以上を有する。
一態様において、本開示は、単一の結合ドメインのみ、すなわち、ＲＯＮ結合ドメインを含むヘテロ二量体を提供する。ヘテロ二量体は、（ＲＯＮ結合ドメインを有する）より長い一本鎖ポリペプチドおよび（任意の結合ドメインを有さない）より短い一本鎖ポリペプチドから成る。加えて、ヘテロ二量体の両方の鎖はそれぞれ、Ｆｃ領域部分（例えば、免疫グロブリンＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）をさらに含む。
より具体的には、本開示は、単一のＲＯＮ結合ドメインを含有し、かつＣκ−ＣＨ１もしくはＣλＣＨ１、またはこれらの対の組み合わせのヘテロ二量化ドメイン対を有する一本鎖ポリペプチドおよびそのポリペプチドヘテロ二量体を提供する。最も単純な形態において、ポリペプチドヘテロ二量体（インターセプターとも称される）は、一方の鎖がＣκまたはＣλドメインを有し、他方の鎖がＣＨ１領域を有する２つの不均衡な鎖を共発現することによって作製される。例えば、長鎖と指定される第１の鎖ポリペプチドが、ｓｃＦｖの形態のＲＯＮ結合ドメインおよびＣＨ１ヘテロ二量化ドメインを有する一方で、短鎖と指定される他方の鎖は、結合ドメインを欠くが、Ｃκヘテロ二量化ドメインを有する。ポリペプチドヘテロ二量体（インターセプター）は、概して、ＲＯＮ標的タンパク質に一価的に結合し、受容体／リガンドまたは受容体／受容体の相互作用を阻止し、受容体架橋結合を介する細胞活性化を防止するのに理想的である。例えば、Ｆａｂの他の種々の利点には、より長い血清半減期およびＦｃドメインが存在することによる精製の容易さが含まれる。インターセプターは、アミノ末端またはカルボキシル末端でＲＯＮ結合ドメインを有し得る。
別の態様において、本開示は、２つの異なる一本鎖ポリペプチドの会合によって形成されるポリペプチドヘテロ二量体（「多特異的ヘテロ二量体」）を提供し、１つ以上の結合ドメイン、具体的には、少なくとも１つのＲＯＮ結合ドメインおよびＲＯＮ以外の標的に結合する少なくとも１つの結合ドメインが存在する。ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体は、二重特異性であり得るか、あるいは多特異性であり得る。本態様において、本開示は、ポリペプチドヘテロ二量体を提供し、ポリペプチドヘテロ二量体が少なくとも２つの異なる標的に特異的に結合する少なくとも２つの結合ドメインを含むという条件で、第１の一本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−Ｉ）が、１〜４つの標的、ヒンジ（Ｈ−Ｉ）、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−Ｉ）、およびＦｃ領域部分（ＦＲＰ−Ｉ）、に特異的に結合する１〜４つの結合ドメインを含むか、それから本質的に成るか、あるいはそれから成る一方で、第２の一本鎖ポリペプチド（ＳＣＰ−ＩＩ）は、０〜４つの標的、ヒンジ（Ｈ−ＩＩ）、免疫グロブリンヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ−ＩＩ）、およびＦｃ領域部分（ＦＲＰ−ＩＩ）に特異的に結合する０〜４つの結合ドメインを含むか、それから本質的に成るか、あるいはそれから成る。Ｈ−ＩおよびＨ−ＩＩは、同一の配列を有し得るが、異なる場合もある。ＦＲＰ−ＩおよびＦＲＰ−ＩＩは、同一の配列を有し得るが、異なる場合もある。本開示のポリペプチドヘテロ二量体の個々の成分は、本明細書に詳細に記載される。
多特異的ヘテロ二量体の一本鎖ポリペプチドが、単一の結合ドメインを含む場合、結合ドメインは、一本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分に対してアミノ末端またはカルボキシル末端に位置付けられ得る。例えば、２つの結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドは、一本鎖ポリペプチドのＦｃ領域部分に対して一方の結合ドメインをアミノ末端に位置付け、かつ他方の結合ドメインをカルボキシル末端に位置付け得るか、あるいはＦｃ領域部分に対して両方の結合ドメインがアミノ末端であり得るか、または両方の結合ドメインがカルボキシル末端であり得る。別の例では、一本鎖ポリペプチドは、３つの結合ドメインを含み得、（ａ）２つの結合ドメインが異なる一本鎖タンパク質上のアミノ末端であり、第３の結合ドメインがＳＣＰ−ＩまたはＳＣＰ−ＩＩのいずれかのＦｃ領域部分に対するカルボキシル末端であり、（ｂ）２つの結合ドメインが異なる一本鎖タンパク質上のカルボキシル末端であり、第３の結合ドメインがＳＣＰ−ＩまたはＳＣＰ−ＩＩのいずれかのＦｃ領域部分に対するアミノ末端である。なおさらなる例において、ポリペプチドヘテロ二量体は、４つの結合ドメインを含み得、２つの結合ドメインは、異なる一本鎖タンパク質上のＦｃ領域部分に対してアミノ末端に位置付けられ、他の２つの結合ドメインは、異なる鎖上のＦｃ領域部分に対してカルボキシル末端に位置付けられる。あるいは、これらの実施形態のうちのいずれかにおいて、２つの結合ドメインは、相互にタンデムに連結され得、かつ存在する結合ドメインの数に応じてＳＣＰ−ＩもしくはＳＣＰ−ＩＩまたはそれら両方に位置付けられ得、タンデムスタッキングは、組み合わせられた５〜８つの結合ドメインがＳＣＰ−ＩおよびＳＣＰ−ＩＩ中に存在する時に使用される。
したがって、ある特定の実施形態において、ヘテロ二量体は、少なくとも１つのＲＯＮ結合ドメインを含み、かつＴＣＲ、ＣＤ３、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｃ−Ｍｅｔ、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧ）、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−Ｒ１、ＩＧＦ−Ｒ２、ＣＤ７２、ＥＧＦ、ＥＲＢＢ３、ＨＧＦ、ＣＤ４４、ＣＤ１５１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＴＲＯＰ２、ＤＲ５、ｃＫＩＴ、ＣＤ２７、ＩＬ６、ＩＬ６−Ｒ、ｈｙｐｅｒＩＬ６、ＣＤ４０、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＴＧＦＢ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、Ｗｎｔ、および成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）等であるが、それらに限定されない異種標的タンパク質に結合する１つ以上のさらなる結合ドメインを含み得る。特定の一実施形態において、第１の一本鎖ポリペプチドは、抗ＲＯＮ結合ドメインを含み、第２の一本鎖ポリペプチドは、ＣＤ３結合ドメイン等のＴＣＲ結合ドメインを含む。さらなる実施形態において、第１の一本鎖ポリペプチドは、抗ＲＯＮ結合ドメインを含み、第２の一本鎖ポリペプチドは、抗ｃ−Ｍｅｔ結合ドメインを含む。さらなる実施形態において、第１の一本鎖ポリペプチドは、抗ＲＯＮ結合ドメインを含み、第２の一本鎖ポリペプチドは、抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。
結合ドメインによる標的の結合は、標的（例えば、抗原、受容体、またはリガンド）と別の分子との間の相互作用を調節する。ある特定の実施形態において、結合ドメインによる標的（例えば、受容体）の結合は、標的のある特定の機能（例えば、シグナル変換）を刺激するか、あるいは生物学的効果において異なる標的を近づける（例えば、Ｔ細胞を順にＴ細胞を活性化する腫瘍に指向する）。ある特定の他の実施形態において、結合ドメインによる標的の結合は、標的と別の分子との間の相互作用を阻止し、したがって、標的のある特定の機能を妨害するか、減少させるか、あるいは排除する。
関連した態様において、本開示は、２つ以上の結合ドメインを含み、それぞれがＲＯＮを結合する２つの異なる一本鎖ポリペプチドの会合によって形成されるポリペプチドヘテロ二量体を提供する。そのようなポリペプチドヘテロ二量体は、少なくとも２つの異なる標的に結合する多特異的ヘテロ二量体の結合ドメインとは対照的に、その結合ドメインがＲＯＮのみに結合することを除いて、本明細書に記載の多特異的ヘテロ二量体と同様であり得る。
免疫グロブリン結合ポリペプチドの作製
本明細書に記載の結合ポリペプチドのうちのいずれかを効率的に産生するために、リーダーペプチドを用いて、発現したポリペプチドの分泌を促進し得る。初期に発現したポリペプチドを分泌経路に指向し、かつリーダーペプチドとポリペプチドとの間の結合部で、またはその近くで、成熟ポリペプチドからのリーダーペプチドの切断をもたらすために、従来のリーダーペプチド（シグナル配列）のうちのいずれかを用いることが予想される。特定のリーダーペプチドは、そのような導入された配列が、初期に発現したタンパク質からのリーダーペプチドの任意の所望の処理を容認し難いほど妨害しないか、あるいはリーダーペプチドがポリペプチドの成熟中に切断されない場合、ポリペプチドの任意の所望の機能を容認し難いほど妨害しないかのいずれかのアミノ酸を特定するという条件で、分子工学を促進するために、リーダーペプチドのコード配列の最初または最後における制限エンドヌクレアーゼ切断部位の容易な包含を可能にするポリヌクレオチドによってコードされる配列の使用等の当分野で既知の考察に基づいて選択される。本開示の例示的なリーダーペプチドは、天然リーダー配列（すなわち、天然タンパク質で発現された配列）、または式中、Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎが０〜３（配列番号７７８〜７８１）であるＨ３Ｎ−ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ（Ｘ）ｎ−ＣＯ２ＨもしくはＨ３Ｎ−ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ−ＣＯ２Ｈ（配列番号７８２）等の異種リーダー配列の使用を含む。
本明細書に注記されるように、細胞外ドメイン、軽鎖および重鎖可変領域、および本明細書に記載のＣＤＲ等の結合ドメインの変異体および誘導体が企図される。一例において、挿入変異体が提供され、１つ以上のアミノ酸残基は、特異的結合剤アミノ酸配列を補完する。挿入は、タンパク質の一方または両方の末端に位置付けられ得るか、あるいは特異的結合剤アミノ酸配列の内部領域内に位置付けられ得る。本開示の変異体生成物は、成熟特異的結合剤生成物、すなわち、特異的結合剤生成物も含み、リーダー配列またはシグナル配列が除去され、結果として得られるタンパク質がさらなるアミノ末端残基を有する。さらなるアミノ末端残基は、別のタンパク質に由来し得るか、あるいは特異的タンパク質に由来するため同定可能ではない１つ以上の残基を含み得る。位置−２および−１でさらなるメチオニンおよびリジン残基を有する本開示のポリペプチドのような、位置−１でさらなるメチオニン残基を有するポリペプチドが企図される。さらなるＭｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、もしくはＬｙｓ残基（または概して、１つ以上の塩基性残基）を有する変異体は、細菌性宿主細胞中での組換えタンパク質産生を高めるのに特に有用である。
本明細書で使用される「アミノ酸」は、天然（自然発生）アミノ酸、置換天然アミノ酸、非天然アミノ酸、置換非天然アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせを指す。天然アミノ酸の表示は、標準の１文字コードまたは３文字コードのいずれかとして本明細書で示される。天然極性アミノ酸には、アスパラギン（ＡｓｐまたはＮ）およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ならびにアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、およびその誘導体等の塩基性アミノ酸、ならびにアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、およびその誘導体等の酸性アミノ酸が含まれる。天然疎水性アミノ酸には、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、およびその誘導体、ならびにグリシン（ＧＩｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、およびその誘導体等の他の非極性アミノ酸が含まれる。中間極性の天然アミノ酸には、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、およびその誘導体が含まれる。別途明記されない限り、本明細書に記載の任意のアミノ酸は、Ｄ構成またはＬ構成のいずれかであり得る。
置換変異体は、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基は除去され、代替の残基に置換されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、置換は本来保存的であるが、本開示は、非保存的ではない置換も包含する。アミノ酸は、二次および三次タンパク質構造の物理的特性およびそれらへの寄与に従って分類され得る。保存的置換は、当分野において、１つのアミノ酸の同様の特性を有する別のアミノ酸への置換として認識される。例示的な保存的置換は、直下の表１に提示される（１３、１９９７年３月１３日公開の国際特許第ＷＯ９７／０９４３３号１０ページを参照のこと）。
あるいは、保存的アミノ酸は、直下の表２に提示されるように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７）に記載されるようにグループ分けされ得る。
変異体または誘導体は、特異的発現系の使用から生じるさらなるアミノ酸残基も有し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合生成物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用は、所望のポリペプチドからのＧＳＴ成分の切断後に位置−１でさらなるグリシン残基を有する所望のポリペプチドを提供する。他のベクター系における発現に起因する変異体も企図され、ヒスチジンタグが概して配列のカルボキシル末端および／またはアミノ末端でアミノ酸配列に組み込まれる変異体を含む。
欠失変異体も企図され、本開示の結合ドメイン中の１つ以上のアミノ酸残基が除去される。欠失は、融合タンパク質の１つまたは両方の末端でもたらされ得るか、あるいはアミノ酸配列内の１つ以上の残基の除去からもたらされ得る。
ある特定の例証的な実施形態において、本発明の免疫グロブリン結合ポリペプチドはグリコシル化され、グリコシル化のパターンは、タンパク質が発現される宿主細胞および培養条件を含む多種多様の要因に依存する（組換え宿主細胞中で調製される場合）。
本開示は、免疫グロブリン結合ポリペプチドの誘導体も提供する。ある特定の実施形態において、修飾は、本来共有結合性であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機、および無機部分との化学的結合を含む。本開示の誘導体は、特異的結合ドメインポリペプチドの循環半減期を増加させるよう調製され得るか、あるいは所望の細胞、組織、または器官に対するポリペプチドの標的能力を改善するよう設計され得る。
本開示は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、および同第４，１７９，３３７号に記載のポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコール等の１つ以上の水溶性ポリマー付着を含むために、共有結合的に修飾または誘導体化される結合ポリペプチドをさらに包含する。当分野で既知のさらに他の有用なポリマーは、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、および他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにこれらのポリマーの混合物を含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化タンパク質が特に好ましい。水溶性ポリマーは、特異的位置、例えば、本開示によるタンパク質およびポリペプチドのアミノ末端で結合され得るか、あるいはポリペプチドの１つ以上の側鎖にランダムに付着し得る。治療的能力を改善するためのＰＥＧの使用は、米国特許第６，１３３，４２６号に記載されている。
一実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、免疫グロブリンまたはＦｃ融合タンパク質を含む融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、特にＦｃドメインが新生Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎと相互作用することができる場合において、例えば、数時間、数日以上、またはさらには１週間以上の長い半減期を有し得る。Ｆｃドメイン中のＦｃＲｎの結合部位は、細菌タンパク質ＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質間の強力結合は、例えば、タンパク質精製中にタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを採用しながら本開示の抗体または融合タンパク質を精製するための手段として使用され得る。ある特定の実施形態において、融合タンパク質のＦｃドメインは、任意で変異され、ＦｃＲｎ相互作用を保持しながらＦｃγＲＩ−ＩＩＩとの相互作用を排除する。
タンパク質精製技術は、当業者には周知である。これらの技術は、１つのレベルにおけるポリペプチドの粗分画および非ポリペプチド画分を含む。部分的もしくは完全な精製（または均質になるまで精製）を達成するためにクロマトグラフ技術および電気泳動技術を用いるさらなる精製が高い頻度で所望される。純ポリペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、および等電点電気泳動法である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣである。
本開示のある特定の態様は、精製、特定の実施形態において、ポリペプチドの実質的な精製に関する。「精製ポリペプチド」および「精製融合タンパク質」という用語は、本明細書において同義に使用され、他の成分から単離可能であり、かつその自然に得られる状態と比較して任意の程度に精製される組成物を指す。したがって、精製ポリペプチドは、それが自然発生し得る環境を含まないポリペプチドも指す。
概して、「精製された」は、種々の他の成分を除去するために分画に供したポリペプチド組成物を指し、その組成物は、その発現した生物学的活性を実質的に保持する。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、この表記は、組成物中、約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約９５重量％、約９９重量％以上のポリペプチド等を構成する、ポリペプチドが組成物の主な成分を形成するポリペプチド組成物を指す。
精製の程度を定量化するための種々の方法は、本開示の観点から当業者には既知である。これらは、例えば、活性画分の特異的結合活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分中のポリペプチドの量を評価することを含む。タンパク質画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の結合活性を計算すること、それを最初の抽出物と比較すること、したがって、本明細書において「〜倍の精製」によって評価される精製の程度を計算することである。結合活性の量を表すために使用される実際の単位は、言うまでもなく、精製を追跡するために選択される特定のアッセイ技術、および発現した融合タンパク質が検出可能な結合活性を呈するか否かに依存する。
タンパク質精製での使用に好適な種々の技術が当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等での沈降、または熱変性、その後、遠心分離による沈降、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、および親和性クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー工程、等電点電気泳動法、ゲル電気泳動、ならびにこれらおよび他の技術組み合わせが含まれる。概して当分野において既知であるように、種々の精製ステップの実行の順序が変更され得るか、あるいはある特定のステップが省略されても、依然として実質的に精製されたタンパク質の調製のための好適な方法をもたらし得ると考えられる。
結合ポリペプチドが常にその最も精製された状態で提供されることは一般要求事項ではない。実際には、より低い程度で実質的に精製されたタンパク質がある特定の実施形態において実用性を有することが企図される。部分的精製は、より少ない精製ステップを組み合わせて用いることによって、または同一の一般的な精製計画の異なる形態を利用することによって達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実行される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、概して、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同一の技術よりも良好な精製をもたらすことが理解される。より低い程度の相対精製を呈する方法は、タンパク質生成物の全回収、または発現したタンパク質の結合活性の維持における利点を有し得る。
ポリペプチドの移動が、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる状態を伴って、場合によっては著しく変化し得ることが既知である（Ｃａｐａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．７６：４２５）。したがって、異なる電気泳動状態下で、精製または部分的に精製された融合タンパク質発現生成物の見かけの分子量が変化し得ることが理解される。
ポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
本開示は、本明細書に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター（を含むクローニングベクターおよび発現ベクター）、ならびに本開示によるポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換もしくはトランスフェクトした細胞（例えば、宿主細胞）をコードするポリヌクレオチド（単離もしくは精製されたポリヌクレオチドまたは純ポリヌクレオチド）を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示の結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、または１つ以上のそのような結合ドメインを含有するポリペプチドが企図される。融合タンパク質構築体をコードする発現カセットは、本明細書に添付の実施例および配列表に提供される。
本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含むベクター、具体的には、組換え発現構築体にも関する。一実施形態において、本開示は、そのようなタンパク質コード配列の転写、翻訳、および処理を引き起こすか、あるいはそれらを促進する他のポリヌクレオチド配列に加えて、ＲＯＮ結合ドメインまたは他の結合ドメインおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを企図する。
原核生物および真核生物宿主との使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されている。例示的なクローニング／発現ベクターには、プラスミド、ファージミド、ファスミド、コスミド、ウイルス、人工染色体、またはそこに含有されるポリヌクレオチドの増幅、転移、および／もしくは発現に好適な当分野で既知の任意の核酸媒体に基づき得る、クローニングベクター、シャトルベクター、および発現構築体が挙げられる。
本明細書で使用される「ベクター」は、別の核酸を連結された核酸に輸送することができる核酸分子を意味する。例示的なベクターには、プラスミド、酵母人工染色体、およびウイルスゲノムが挙げられる。ある特定のベクターが宿主細胞内で自発的に複製する一方で、他のベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。加えて、ある特定のベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称され、これは、発現制御配列に動作可能に連結される核酸配列を含有し、したがって、それらの配列の発現を指向することができる。
ある特定の実施形態において、発現構築体は、プラスミドベクターに由来する。例証的な構築体には、アンピシリン耐性遺伝子をコードする核酸配列、ポリアデニル化シグナル、およびＴ７プロモーター部位を有する修飾ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ＣＨＥＦ１プロモーターを有するｐＤＥＦ３８およびｐＮＥＦ３８（ＣＭＣ ＩＣＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにＣＭＶプロモーターを有するｐＤ１８（Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。他の好適な哺乳類発現ベクターが周知である（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照されたく、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪの目録も参照のこと）。融合タンパク質の産生レベルの増大を促進するのに好適な調節管理下でジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）コード配列を含む有用構築体が調製され得、そのレベルは、適切な選択薬（例えば、メトトレキサート）の適用後の遺伝子増幅に起因する。
概して、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択可能なマーカー、ならびに上述の下流構造配列の転写を指向するための高度に発現した遺伝子に由来するプロモーターを含む。本開示によるポリヌクレオチドと動作可能に連結したベクターは、クローニングまたは発現構築体を産出する。例示的なクローニング／発現構築体は、少なくとも１つの発現制御要素、例えば、本開示のポリヌクレオチドに動作可能に連結したプロモーターを含有する。エンハンサー、因子特異的結合部位、ターミネーター、およびリボソーム結合部位等のさらなる発現制御要素も、本開示によるベクターおよびクローニング／発現構築体において企図される。本開示によるポリヌクレオチドの異種構造配列は、適切な相において翻訳開始および終止配列とともに構築される。したがって、例えば、本明細書に提供されるタンパク質コード核酸は、宿主細胞内でそのようなタンパク質を発現するための組換え発現構築体として、多種多様の発現ベクター構築体のうちのいずれか１つの中に含まれ得る。
適切なＤＮＡ配列は、例えば、多種多様の手順によってベクターに挿入され得る。概して、ＤＮＡ配列は、当分野で既知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挿入される。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅、および精製のための標準の技術、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を伴う酵素反応のための標準の技術、ならびに種々の分離技術が企図される。いくつかの標準の技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１９９３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，１９８２）、Ｇｌｏｖｅｒ（Ｅｄ．）（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９８５）、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄｓ．）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９８５）、およびその他の箇所に記載されている。
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指向するために少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、構成的プロモーターまたは調節プロモーター）に動作可能に連結される。そのような発現制御配列の代表的な例には、上述の真核細胞またはそれらのウイルスのプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、選択可能なマーカーを有するＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択され得る。真核生物プロモーターは、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内であり、本開示によるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結した少なくとも１つのプロモーターまたは調節プロモーターを含むある特定の特に好ましい組換え発現構築体の調製は、本明細書に記載されている。
本開示のポリヌクレオチドの変異体も企図される。変異体ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の定義された配列のポリヌクレオチドのうちの１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．９％同一であるか、あるいは約６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、定義された配列のそれらのポリヌクレオチドのうちの１つにハイブリダイズする。ポリヌクレオチド変異体は、本明細書に記載の機能性を有する結合ドメインまたはその融合タンパク質をコードする能力を保持する。
「ストリンジェント」という用語は、ストリンジェントとして当分野で一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に、濃度ホルムアミド等の変性剤の温度、イオン強度、および濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄におけるストリンジェントな条件の例は、約６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと）。
よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高い濃度のホルムアミドまたは他の変性剤等）も使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度に影響を及ぼす。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが考察される例において、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３７℃（１４塩基のオリゴヌクレオチドにおいて）、４８℃（１７塩基のオリゴヌクレオチドにおいて）、５５℃（２０塩基のオリゴヌクレオチドにおいて）、および６０℃（２３塩基のオリゴヌクレオチドにおいて）での６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を含む。
本開示のさらなる態様は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築体で形質転換もしくはトランスフェクトした宿主細胞、あるいはさもなければそれらのいずれかを含有する宿主細胞を提供する。本開示のポリヌクレオチドまたはクローニング／発現構築体は、形質転換、トランスフェクション、および形質導入を含む当分野で既知の任意の方法を用いて、好適な細胞に導入される。宿主細胞は、例えば、生体外遺伝子治療を含む生体外細胞治療を受ける対象の細胞を含む。本開示の態様として企図される真核生物宿主細胞は、本開示によるポリヌクレオチド、ベクター、またはタンパク質を持つ時、対象自身の細胞（例えば、ヒト患者自身の細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（発現した多価結合分子のグリコシル化パターンを修飾することができる修飾ＣＨＯ細胞を含み、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号を参照のこと）、ＣＯＳ細胞（等のＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、ヨトウガ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、出芽酵母細胞、および本開示によるタンパク質またはペプチドを発現し、かつ任意で単離するのに有用な当分野で既知の任意の他の真核細胞を含む。大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、放線菌、または本開示によるタンパク質またはペプチドを発現し、かつ任意で単離するのに有用な当分野で既知の任意の原核細胞を含む原核細胞も企図される。タンパク質またはペプチドを原核細胞から単離する時、具体的には、封入体からタンパク質を抽出するための当分野で既知の技術を使用し得ることが企図される。適切な宿主の選択は、本明細書における教示から当業者の範囲内である。本開示の融合タンパク質をグリコシル化する宿主細胞が企図される。
「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを含有する細胞を指す。そのような用語が、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫も指すよう意図されることを理解されたい。ある特定の修飾が変異または環境の影響によって後の世代で発生し得るため、そのような子孫は、実際、親細胞と同一ではない場合もあるが、依然として、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
組換え宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換細胞を選択するか、あるいは特定の遺伝子を増幅するのに適切であるように修飾された従来の栄養培地中で培養され得る。温度、ｐＨ等の発現のために選択される特定の宿主細胞の培養条件は、当業者に容易に明らかである。組換えタンパク質を発現するために、種々の哺乳類細胞培養系も採用され得る。哺乳類発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５によって説明されるサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株、ならびに適合性ベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーター、および任意でエンハンサーを含み、かつ任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび受容体部位、転写終結配列、ならびに５’−フランキング非転写配列、例えば、多価結合タンパク質発現構築体の調製に関して本明細書に記載の配列も含む。ＳＶ４０スプライスに由来するＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位は、必須の非転写遺伝要素を提供するために使用され得る。宿主細胞への構築体の導入は、当業者が精通している多種多様の方法によってもたらされ得、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、または電気穿孔法（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を含む。
一実施形態において、宿主細胞は、本開示によるタンパク質またはポリペプチドの発現を指向する組換えウイルス構築体によって形質導入される。形質導入された宿主細胞は、ウイルスの出芽中にウイルス粒子によって組み込まれる宿主細胞膜の部分に由来する発現したタンパク質またはポリペプチドを含有するウイルス粒子を産生する。
免疫グロブリン結合ポリペプチドを用いるための組成物および方法
本開示は、本明細書に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチドのうちのいずれかを含む組成物をさらに提供する。本発明の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、ＲＯＮ結合ポリペプチドである。「免疫グロブリン結合ポリペプチド」、「結合ポリペプチド」、「ＲＯＮ結合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、および「融合ポリペプチド」という用語は、特に明記されない限り、本明細書で同義に使用される。
本開示は、免疫グロブリン結合ポリペプチド（例えば、抗ＲＯＮ抗体、ＳＭＩＰ（商標）、ＰＩＭＳ、Ｘｃｅｐｔｏｒ（商標）、ホモ二量体およびヘテロ二量体インターセプター）の任意の形式を含む薬学的組成物および単位用量形態、ならびに本明細書に記載のＲＯＮ結合ポリペプチドの任意の形式を含む組成物を用いるための方法も提供する。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドの組成物は、概して、薬学的に許容される賦形剤、を含む薬学的に許容される担体および希釈剤と組み合わせて、本明細書に記載の任意の形式の結合ポリペプチド（例えば、抗ＲＯＮ抗体、ＳＭＩＰ（商標）、ＰＩＭＳ（商標）、Ｘｃｅｐｔｏｒ（商標）、ホモ二量体およびヘテロ二量体インターセプター）を含む。薬学的に許容される賦形剤は、採用される用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。それらは、薬学分野において周知であり、例えば、Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｕｓｅｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，２００６に記載されている。
治療用の薬学的に許容される担体も薬学分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．）１９８５）に記載されている。例示的な薬学的に許容される担体は、生理学的ｐＨの無菌食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水を含む。防腐剤、安定剤、染料等は、薬学的組成物中に提供され得る。加えて、酸化防止剤および懸濁化剤も使用され得る。
薬学的組成物は、緩衝液等の希釈剤、アスコルビン酸等の酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、ブドウ糖、ショ糖、デキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤も含有し得る。中性緩衝食塩水または非特異的血清アルブミンと混合された食塩水は、例示的な希釈剤である。一実施形態において、生成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例えば、ショ糖）を用いて、凍結乾燥物として製剤化される。
本開示は、治療を必要とする患者に、治療的に有効な量の本明細書に記載のＲＯＮ結合タンパク質のうちのいずれかを投与することを含む、例えば、過度の受容体媒介性シグナル変換と関連した疾患または障害を治療するための方法も提供する。
過度の受容体媒介性シグナル変換に関連した例示的な疾患または障害には、癌（例えば、固形悪性腫瘍および血液悪性腫瘍）、ならびに多種多様の炎症性障害が挙げられる。
一実施形態において、本開示は、炎症または炎症性疾患を治療するか、その重症度を減少させるか、あるいはそれを予防するための方法を提供する（例えば、Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１２：２７３−２８１（２００５）、Ｃｏｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｆｕｎｃｔ．１９９７ Ｆｅｂ；１（１）：６９−８３を参照のこと）。例えば、本発明の一実施形態は、クローン病、結腸炎、皮膚炎、乾癬、憩室炎、肝臓炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、リウマチ性関節炎、喘息、紅斑性狼瘡、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、関節炎、ならびにアテローム性動脈硬化症および脈管炎等の種々の心臓血管疾患を含むが、それらに限定されない、炎症または炎症性疾患の治療のための方法を提供する。ある特定の実施形態において、炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、糖尿病、痛風、クリオピリン関連周期性症候群、および慢性閉塞性肺疾患からなる群から選択され、患者に、治療的に有効な量の本発明の免疫グロブリン結合ポリペプチドまたは本発明の組成物を投与することを含む。この点において、一実施形態は、治療を必要とする患者に、治療的に有効な量の本明細書に開示のＲＯＮ結合タンパク質を投与することによって、炎症または炎症性疾患を治療するか、その重症度を減少させるか、あるいはそれを予防する方法を提供する。
いくつかの研究は、ＲＯＮを先天性免疫およびＴＮＦ−アルファ関連病状に加担させた（Ｎｉｋｏｌａｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎｏｖ １８，Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ．（印刷物に先駆けた電子公開）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：２３０３）。さらなる研究は、ＲＯＮが単球／マクロファージ内でＨＩＶ−１転写を阻害することを示す（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：６８６４）。したがって、ある特定の実施形態において、本開示のＲＯＮ結合タンパク質は、敗血症、腹膜炎、潰瘍性大腸炎、エイズ、リウマチ性関節炎、および他のＴＮＦ−アルファ関連病状の治療で使用され得る。
一態様において、本開示は、悪性腫瘍（例えば、固形悪性腫瘍もしくは血液悪性腫瘍）の成長、転移、または転移成長を阻害するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に記載の任意の形式のＲＯＮ結合ポリペプチドまたはその組成物を投与することを含む、方法を提供する。
固形悪性腫瘍および血液悪性腫瘍を含む多種多様の癌が、本明細書に開示の組成物および方法に適している。治療され得る癌の種類には、乳腺癌、前立腺腺癌、膵臓腺癌、結腸腺癌、および直腸腺癌；肺気管支癌の全ての形態（扁平上皮癌、腺癌、小細胞肺癌、および非小細胞肺癌を含む）；脊髄；黒色腫；肝臓癌；神経芽細胞腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；ならびに癌腫（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウンピアース癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス２癌、メルケル細胞癌、粘液癌、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭癌、スキルス癌、細気管支癌、気管支癌、扁平上皮癌、および移行上皮癌）が含まれるが、それらに限定されない。治療され得るさらなる癌の種類には、組織球障害、白血病、悪性組織球症、ホジキン病、免疫増殖性小腸疾患、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、絨毛性腫瘍が含まれる。さらに、以下の種類の癌：アデノーマ、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚腫、肝臓癌、汗腺腫、島細胞腫、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経繊維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、および多形性膠芽腫も治療に適しているとして企図される。治療され得る癌の種類には、角化血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫、腫瘍、神経線維腫症、および子宮頸部異形成も含まれるが、それらに限定されない。
本明細書に開示の組成物および方法にも適しているさらなる例示的な癌は、Ｂ細胞リンパ腫を含むＢ細胞癌（ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または中枢神経系リンパ腫の種々の形態等）、白血病（急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、および慢性骨髄芽球性白血病等）、ならびに骨髄腫（多発性骨髄腫等）である。さらなるＢ細胞癌には、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性化の可能性をもつＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、および移植後リンパ増殖性疾患が含まれる。
本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドまたはその組成物の任意の形式は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入噴霧によって、経膣的に、直腸的に、もしくは頭蓋内注入によって、またはそれらの任意の組み合わせで投与され得る。一実施形態において、ＲＯＮ結合タンパク質またはその組成物は、非経口的に投与される。本明細書で使用される「非経口的」という用語は、皮下注入、静脈内注入、筋肉内注入、嚢内注入、または注入技術を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内、球後、肺内注入による投与、および／または特定の部位での外科的移植も企図される。例えば、本発明は、患者に、治療的に有効な量の本発明の免疫グロブリン結合ポリペプチドまたは本発明の組成物を静脈内注入で投与することを含む、患者を治療する方法を含む。
治療的に有効な用量は、疾患の種類、使用する組成物、投与経路、治療される対象の種類、治療を考慮中の特定の対象の物理的特性、並行薬物治療、および医療分野における当業者が認識する他の要因に依存する。例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、約５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、または約５００〜１０００ｍｇ／ｋｇ）体重（１日１回、週１回、月１回、または任意の適切な間隔で単一の用量として投与され得る）の活性成分が、本開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドの効力に応じて投与され得る。
第２の薬剤との併用で、免疫グロブリン結合ポリペプチドまたはその組成物の投与も企図される。第２の薬剤は、癌または炎症性障害等における特定の疾患状態もしくは障害への標準の治療として当分野で許容されるものであり得る。企図される例示的な第２の薬剤には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、免疫グロブリン由来の融合タンパク質、化学療法剤、電離放射線、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、抗感染症薬、または他の活性剤および補助剤、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
多種多様の他の治療薬が、本明細書に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチドとの投与での使用を見出し得る。一実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドは、抗炎症薬とともに投与される。抗炎症薬または薬物には、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含むアスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、免疫選択性抗炎症誘導体（ｉｍＳＡＩＤ）、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミド、およびミコフェノレートが含まれるが、それらに限定されない。
本明細書に提供される免疫グロブリン結合タンパク質またはその組成物との組み合わせにおいて有用な第２の薬剤には、抗生物質、抗ウイルス薬、および抗真菌薬等の抗感染症薬が含まれる。例示的な抗生物質には、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、マクロライド、キノロン、およびテトラサイクリンが挙げられる。例示的な抗ウイルス薬には、例えば、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、抗体、およびインターフェロンが挙げられる。例示的な抗真菌薬には、例えば、ポリエン抗真菌剤（例えば、ナタマイシンおよびリモシジン）、イミダゾール、トリアゾール、またはチアゾール抗真菌剤（例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、およびアバファンジン）、アリルアミン（例えば、テルビナフィン、ナフチフィン）、ならびにエキノカンジン（例えば、アニデュラファンギンおよびカスポファンギン）が挙げられる。
ある特定の実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドおよび第２の薬剤は、相乗的に作用する。言い換えると、これらの２つの化合物は、単独で投与される時に、化合物の複合効果がそれぞれの化合物の個々の効果の合計よりも大きくなるように相互作用する（例えば、Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．４１：９３，１９８９を参照のこと）。
ある特定の他の実施形態において、免疫グロブリン結合ポリペプチドおよび第２の薬剤は、付加して作用する。言い換えると、これらの２つの化合物は、単独で投与される時に、化合物の複合効果がそれぞれの化合物の個々の効果の合計と同一になるように相互作用する。
本明細書に提供される免疫グロブリン結合タンパク質またはその組成物との組み合わせにおいて有用な第２の薬剤は、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス、デホロリムス、エベロリムス、ゾタロリムス、クルクミン、ファルネシルチオサリチル酸）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、代謝拮抗物質（例えば、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル）、ポリクローナル抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン）、モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ、バシリキシマブ、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ））、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、アバタセプトまたはベラタセプト）であり得る。
固形悪性腫瘍の成長を阻害するか、固形悪性腫瘍の転移もしくは転移成長を阻害するか、あるいは血液悪性腫瘍を治療または改善するのに有用な第２の薬剤には、化学療法剤、電離放射線、および他の抗癌剤が含まれる。さらなる治療薬として企図される化学療法剤の例には、ナイトロジェンマスタード等のアルキル化剤（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシル）；二官能性化学療法薬（例えば、ベンダムスチン）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ））；プロテアソーム阻害剤（例えば、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）（ボルテゾミブ））；チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブ）およびＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ））；エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレンチオホスホルアミド（チオテパ）、およびヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン））；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）；ならびにトリアジン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ））；葉酸類似体等の代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、トリメトレキサート、およびペメトレキセド（マルチターゲット抗葉酸））；ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、および２，２’−ジフルオロデオキシシチジン等）；ならびにプリン類似体（例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ））；カンプトセシン（ＣＰＴ）、トポテカン、およびイリノテカン等のＩ型トポイソメラーゼ阻害剤；エピポドフィロトキシン等の天然産物（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；ならびにビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）；アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、およびブレオマイシン等の抗腫瘍抗生物質；５−ブロモデオキシウリジン、５−ヨードデオキシウリジン、およびブロモデオキシシチジン等の放射線増感剤；シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン等の白金配位複合体；ヒドロキシ尿素等の置換尿素；ならびにＮ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジン等のメチルヒドラジン誘導体が挙げられる。
ある特定の実施形態において、悪性腫瘍の成長、転移、または転移成長を阻害するのに有用な第２の薬剤には、ＲＯＮ以外の癌細胞標的に結合する本開示による多特異的結合ポリペプチドまたは結合ポリペプチドヘテロ二量体を含む。ある特定の他の実施形態において、そのような治療に有用な第２の薬剤は、癌細胞標的に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および免疫グロブリン由来の融合タンパク質を含む。
本開示によって企図されるさらなる治療薬は、治療される個人の免疫系を抑制または被覆する働きをする免疫抑制剤と称される。免疫抑制剤には、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、グルココルチコイド、関節炎の治療用の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、または生物学的反応修飾物質が含まれる。ＤＭＡＲＤに記述の組成物は、リウマチ性関節炎に加えて多くの他の自己免疫疾患の治療においても有用である。
例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）およびＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコクシブ）等のＣｏｘ−２阻害剤、ならびにシアル酸からなる群から選択される。例示的な鎮痛剤は、アセトアミノフェン、オキシコドン、塩酸プロポキシフェンのトラマドールからなる群から選択される。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群から選択される。例示的な生物学的反応修飾物質には、細胞表面マーカーに指向される分子（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５等）、ＴＮＦアンタゴニスト等のサイトカイン阻害剤（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）））、ケモカイン阻害剤、ならびに接着分子阻害剤が含まれる。生物学的反応修飾物質には、モノクローナル抗体、ならびに分子の組換え型が含まれる。例示的なＤＭＡＲＤには、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）および筋肉内）、ならびにミノサイクリンが挙げられる。
結合分子組成物および第２の活性薬剤が同一の製剤で同時に与えられ得ることが企図される。あるいは、第２の薬剤は、別個の製剤で投与され得るが同時ではない（すなわち、相互の１時間未満以内に与えられ得る）。
ある特定の実施形態において、第２の活性薬剤は、ＲＯＮ結合ポリペプチドまたはその組成物の投与前に投与され得る。事前投与とは、ＲＯＮ結合タンパク質またはその組成物での治療の少なくとも１時間前の第２の薬剤の投与を指す。活性薬剤が結合分子組成物の投与後に投与され得ることがさらに企図される。事後投与とは、結合分子またはその組成物の投与から少なくとも１時間後の投与を説明するよう意図されている。
本開示は、本開示の薬学的組成物を含む計量装置を企図する。そのような計量装置には、例えば、一方が凍結乾燥形態の本開示の薬学的組成物を含み、他方が再構成のための希釈剤を含む２成分バイアルまたはシリンジを含む、単回投与または複数回投与バイアルまたはシリンジが含まれる。複数回投与計量装置は、例えば、静脈内注入デバイスへの接続のための袋または管であり得る。
さらなる態様として、本開示は、本開示の方法を実践するためにそれらの使用を促進する様式で包装される、本開示の方法において有用な１つ以上の化合物または組成物を含むキットを含む。最もシンプルな実施形態において、そのようなキットは、密閉瓶または容器等の容器内に包装される本開示の方法の実践に有用な本明細書に記載の化合物または組成物を含み、本開示の方法を実践するために化合物または組成物の使用を記述するラベルが容器に貼られるか、あるいは包装内に含まれる。好ましくは、化合物または組成物は、単位剤形で包装される。キットは、好ましい投与経路による組成物の投与、またはスクリーニングアッセイの実践に好適なデバイスをさらに含み得る。キットは、本開示の方法における結合分子組成物の使用を記述するラベルを含み得る。
実施例１
ＲＯＮ結合分子の生成
下記のように、抗ＲＯＮ抗体を生成し、これらの抗体由来の抗ＲＯＮ結合ドメインを含有する種々の組換え分子を構築した。
全長ＲＯＮを用いてＲＯＮ発現細胞株を生成し、ＭＳＴ１Ｒを、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（番号ＳＣ３０９９１３，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受入番号ＮＭ＿００２４４７ ｇｉ：１５３９４６３９２、配列番号７８４に提供されるアミノ酸配列をコードする配列番号７８３）から入手した。全長アカゲザルＲＯＮを、Ｅｎｓｅｍｂｌ配列ＥＮＳＭＭＵＴ０００００００４７３８に基づいてＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）で合成した。ヒトおよびマカクＲＯＮオープンリーディングフレーム配列の両方を、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、ポリエチレンイミン技術（Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７２９７−７３０１）を用いて、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）中でＢｃｇ Ｉ−（ヒト）またはＢｇｌ ＩＩ−（マカク）線形化した全長ＲＯＮでトランスフェクトした。一時的にトランスフェクトしたプール由来の安定した細胞株過剰発現ヒトまたはマカク全長ＲＯＮをクローン化した。ＲＯＮ陰性細胞株を対照として、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、超螺旋ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｙｇｒｏ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）でトランスフェクトし、上述のように安定した細胞株を生成するためにクローン化した。
ＲＯＮに対して新規の抗体を、以前に確立されたプロトコル（Ｗａｙｎｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｓｔｒｏｍ２００７）および免疫原として上で説明されるＲＯＮ発現細胞株を用いて生成した。ＲＯＮ−ｅ０１抗体について、細胞株のブースト後、マウスは、５０μｇの組換えＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号１９４７−ＭＳ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のブーストを受けた。このタンパク質は、カルボキシル末端ヒスチジンタグに結合し、かつＮＳ０マウス骨髄腫細胞株中で発現したヒトＲＯＮ（Ｇｌｕ２５−Ｌｅｕ５７１）のＳｅｍａおよびＰＳＩドメインを含む。ＲＯＮ−ｆ０１抗体について、細胞株のブースト後、マウスは、２０μｇの組換えＲＯＮタンパク質のブーストを受けた。１つのさらなるブーストおよび事前融合ブーストを、マカクＲＯＮを安定的に発現する５０μＬの充填ＮＩＨ／３Ｔ３細胞で実行した。
ハイブリドーマを、標準の方法（Ｌａｎｅ１９８５）を用いて、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．１９７９）（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３．３．１２．１１指定）のクローンを有する免疫を与えられた動物の脾臓由来のＢ細胞の融合で生成した。
ハイブリドーマ培養上清を、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中のマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって引き起こされるＲＯＮリン酸化を阻害する能力についてスクリーニングした。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の９６ウェル組織培養コーティングマイクロプレート中の５×１０４細胞／ウェルで一晩プレーティングした。翌日、培地を吸引し、ハイブリドーマ上清でのインキュベーション前に３７℃で３時間の血清飢餓のために無血清ＤＭＥＭに置き換えるか、あるいは３７℃で１時間のブロッキングステップのためにハイブリドーマ上清に直接置き換えるかのいずれかを行った。ブロッキング処理物を吸引し、細胞を室温で１０分間、１００μＭのＮａ３ＶＯ４を含有する無血清ＤＭＥＭ中の３ｎＭのＭＳＰで刺激した。ＭＳＰ刺激の直後、細胞を、ＨＡＬＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、ＨＡＬＴ（商標）ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、および１ｍＭのＮａ３ＶＯ４で補充した１Ｘ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）中に氷上で溶解させた。細胞溶解物を、ＤｕｏＳｅｔ ＩＣ Ｈｕｍａｎ ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＳＰ Ｒ／Ｒｏｎ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）上で分析した。
その後、ＲＯＮリン酸化アッセイにおいて同定されたハイブリドーマプール由来の上清を、ＲＯＮ陰性ＮＩＨ／３Ｔ３細胞対ＮＩＨ／３Ｔ３細胞過剰発現ヒトまたはマカクＲＯＮ上で、抗ＲＯＮ抗体の存在をフローサイトメトリーによって試験した。
両方のスクリーニングを通過したプール由来の目的のハイブリドーマをＨＡＴ選択から引き離してヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）に入れ、ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の存在下で、希釈を制限することによってクローン化した。クローンを結合および機能活性の両方について再試験した。さらなる試験のために、ＲＯＮ−ｅ０１（１１Ｈ０９ハイブリドーマ）およびＲＯＮ−ｆ０１（４Ｃ０４ハイブリドーマ）をこの段階で選択した。両方の抗体のＶＬおよびＶＨ領域を５’−ＲＡＣＥ（迅速増幅ｃＤＮＡ末端）で同定し、ＳＭＩＰおよびインターセプター形式に変換した。
ＲＯＮに対して特異的な結合ドメインは、配列番号４３（ポリヌクレオチド）および８７（アミノ酸）に示される１１Ｈ０９ ｓｃＦｖ、ならびに配列番号１２７（ポリヌクレオチド）および１５７（アミノ酸）に示される４Ｃ０４ ｓｃＦｖを含む。４Ｃ０４ ｓｃＦｖ ＲＯＮ結合ドメインのヒト化バージョンは、配列番号１２８〜１２９（ポリヌクレオチド）および１５８〜１５９（アミノ酸）に示され、１１Ｈ０９ ｓｃＦｖ ＲＯＮ結合ドメインのヒト化バージョンは、配列番号４４〜４９（ポリヌクレオチド）および８８〜９３（アミノ酸）に示される。
４Ｃ０４ ｓｃＦｖの軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１５２に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１４１〜１４３に示される。４Ｃ０４ ｓｃＦｖの重鎖アミノ酸配列は、配列番号１５３に示され、およびそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１４４〜１４６に示される。４Ｃ０４ ｓｃＦｖの重鎖アミノ酸配列の変異体は、末端ロイシンがセリン残基に変化した配列番号１７６に示される。この変異体重鎖配列を、配列番号１６０〜１７５に開示される結合ドメイン構築体等の本明細書に記載の多数の結合ドメイン構築体において使用する。
１１Ｈ０９ ｓｃＦｖの軽鎖アミノ酸配列は、配列番号８０に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６７〜６９に示される。１１Ｈ０９ ｓｃＦｖの重鎖アミノ酸配列は、配列番号８１に示され、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７０〜７２に示される。
４Ｃ０４由来のＲＯＮ結合ドメインを含むＳＭＩＰ分子が、配列番号１３０〜１３２（ポリヌクレオチド）および１６０〜１６８（アミノ酸）に提供される。配列番号１６０、１６３、および１６６は、２０アミノ酸Ｖｋ３リーダー配列を含み、配列番号１６１、１６２、１６４、１６５、１６７、および１６８は、リーダー配列を含まず、配列番号１６２、１６５、および１６８は、末端リジン残基を除去させる。配列番号１３１、１３２、および１６３〜１６８はヒト化される。Ｖｋ３リーダー配列は、配列番号１のポリヌクレオチド配列によってコードされる配列番号１３に示される。
１１Ｈ０９由来のＲＯＮ結合ドメインを含むＳＭＩＰ分子が、配列番号５０〜５６（ポリヌクレオチド）および９４〜１１４に提供される。配列番号９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、および１１２は、配列番号１３の２０アミノ酸Ｖｋ３リーダー配列を含有し、配列番号９５〜９６、９８〜９９、１０１〜１０２、１０４〜１０５、１０７〜１０８、１１０〜１１１、および１１３〜１１４は、リーダー配列を含有せず、配列番号９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４は、末端リジン残基を除去させる。配列番号９９〜１１４はヒト化される。
以下の表３は、生成された４Ｃ０４および１１Ｈ０９ ＲＯＮ結合抗体およびＳＭＩＰ分子を要約し、対応する配列番号を列記する。
４Ｃ０４−および１１Ｈ０９由来のＲＯＮ結合ドメインを用いて生成されたインターセプター対が、以下の表４に要約される。
実施例２
ＲＯＮ−Ｅ０１およびＲＯＮ−Ｆ０１マウス抗体ならびにそれらに由来する結合分子は、ヒトＲＯＮに特異的に結合し、かつアカゲザルＲＯＮと交差反応する
実施例１に記載されるように生成された抗体、ＳＭＩＰ、およびインターセプター結合分子は、ヒトＲＯＮに結合し、かつアカゲザル（Ｍａｍｕ）ＲＯＮと交差反応することが示された。
ヒトもしくはマカクＲＯＮまたは空ベクターでトランスフェクトしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞をトリプシンで解離し、１．６×１０５細胞／試料で、染色緩衝液（ダルベッコのＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）中に希釈されたハイブリドーマ上清または精製抗体を用いて氷上で染色した。非標識マウスＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）およびＤＸ０７抗ＲＯＮ β−鎖抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を、それぞれ、陰性対照および陽性対照として採用した。マウス抗体を、Ｒ−ＰＥ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で検出した。試料を、ＰｌａｔｅＭａｎａｇｅｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、ＨＴＳを装着したＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上で分析した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いてプロットした。
アカゲザル肺４ＭＢｒ−５細胞（ＡＴＣＣ）を、酵素を含まないＰＢＳベースの細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解離し、１．１×１０５細胞／試料で、染色緩衝液中に希釈された精製分子を用いて染色した。ＳＭＩＰをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出し、死細胞を二次抗体染色中に２０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムで標識化した。試料を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上で分析した。データ（死細胞は除外）をＦｌｏｗＪｏにおいてプロットした。
ヒト膵臓腺癌ＢｘＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ）をトリプシンで解離し、ヒト転移性乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（ＡＴＣＣ）をゴム製の細胞スクレーパーを用いて手作業で採取した。細胞を、３×１０５細胞／試料で、染色緩衝液中に希釈された精製分子を用いて氷上で染色した。ＳＭＩＰおよびインターセプターを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。試料を、ＰｌａｔｅＭａｎａｇｅｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを用いて、ＨＴＳを装着したＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上で分析した。
図１に示されるように、ＲＯＮ−ｅ０１および−ｆ０１マウス抗体は、ヒトＲＯＮに特異的に結合し、アカゲザル（Ｍａｍｕ）ＲＯＮと交差反応する。空ベクター（破線）、ヒトＲＯＮ（点線）、またはアカゲザルＲＯＮ（実線）でトランスフェクトしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、二次抗体のみ（図１Ａ）、１ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（図１Ｂ）、１ｍｇ／ｍＬのＤＸ０７抗ＲＯＮ抗体（図１Ｃ）、ＲＯＮ−ｅ０１抗ＲＯＮハイブリドーマ上清（図１Ｄ）、またはＲＯＮ−ｆ０１抗ＲＯＮハイブリドーマ上清（図１Ｅ）で染色した。
図２に示されるように、ＲＯＮ−ｅ０２および−ｆ０２ ＳＭＩＰは、４ＭＢｒ−５細胞の表面で天然Ｍａｍｕ ＲＯＮに結合する。４ＭＢｒ−５細胞を、二次抗体のみ（破線）、Ｍ００７７抗ＣＤ７９ｂ ＳＭＩＰ（点線）、または抗ＲＯＮ ＳＭＩＰ（実線）で染色した。
さらに、図３は、ＲＯＮ−ｅおよびＲＯＮ−ｆ ＳＭＩＰならびにインターセプター結合分子は、ＢｘＰＣ−３細胞の表面で天然ヒトＲＯＮに結合することを示す。ＢｘＰＣ−３細胞を、種々の濃度のＲＯＮ−ｅ（図３Ａ）またはＲＯＮ−ｆ（図３Ｂ）分子で染色した。ＳＭＩＰおよびインターセプター構築体ならびに関連した配列番号の記述に関して、表３および表４を参照されたい。ＲＯＮインターセプターは、それらのＳＭＩＰ対応物よりも高い飽和レベルで結合する。飽和レベルにおけるこの差異は、恐らく、ＲＯＮ受容体占有における差異を反映する。それぞれのインターセプターが１つの結合ドメインを含有し、かつ単一のＲＯＮ分子に結合する（１：１の結合比）一方で、それぞれのＳＭＩＰは、２つの結合ドメインを含有し、かつ最大２つのＲＯＮ分子を同時に占有し得る（１：２の比）。
さらに、ＲＯＮ−ｅ（図７ａ）およびＲＯＮ−ｆ（図７Ｂ）ヒト化ＳＭＩＰは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の表面で天然ヒトＲＯＮに結合する。種々の濃度のヒト化ＲＯＮ−ｅ ＳＭＩＰ構築体ＲＯＮ−ｅ０７ｈ６８、ＲＯＮ−ｅ０８ｈ７８、ＲＯＮ−ｅ０９ｈ６９、ＲＯＮ−ｅ１０ｈ７９、ＲＯＮ−ｅ１１ｈ６０、ＲＯＮ−ｅ１２ｈ７０、ならびにＲＯＮ−ｆ ＳＭＩＰ ＳＭＩＰ構築体ＲＯＮ−ｆ０７ｈ２４およびＲＯＮ−ｆ０８ｈ２５を、ＭＤＡ−ＭＢ＿４５３細胞でインキュベートし、それぞれ、マウスＲＯＮ−ｅ０２およびＲＯＮ−ｆ０２対照と比較した。ヒト化ＲＯＮ ＳＭＩＰは、それらのマウス対応物と同等の結合活性を有する。
これらの実験は、ＲＯＮ−ｅ０１およびＲＯＮ−ｆ０１ベースの結合分子が、それらの未変性コンホメーションにおいて、ヒトおよびマカクＲＯＮ分子に特異的に結合することを実証する。
実施例３
ＲＯＮ−Ｅ０１およびＲＯＮ−Ｆ０１マウス抗体は、ＲＯＮの細胞外ドメイン内で異なるエピトープに結合する
抗ＲＯＮマウス抗体を、ＥＬＩＳＡを用いて、ＲＯＮのＳｅｍａ−ＰＳＩドメインへの結合について試験した。
ハイブリドーマ上清クローン中の相対抗体濃度を測定するために、血清希釈液（ＤＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／０．１％ＢＳＡ）中で１から１００に希釈されたハイブリドーマ上清を添加する前に、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）をヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で被覆し、ＤＰＢＳ中の１０％ＦＢＳでブロックした。被覆抗体によって捕捉されたマウス抗体を、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で検出し、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で発展させ、１Ｎ硫酸で停止させた。プレートを、ＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で、４５０ｎｍで読み取った。
ＲＯＮのＳｅｍａ−ＰＳＩドメインへのマウス抗体の結合を判定するために、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡマイクロプレートを、１μｇ／ｍＬの組換えＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号１９４７−ＭＳ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で被覆した。このタンパク質は、カルボキシル末端ヒスチジンタグに結合し、かつＮＳ０マウス骨髄腫細胞株中で発現したヒトＲＯＮのＳｅｍａおよびＰＳＩドメイン（Ｇｌｕ２５−Ｌｅｕ５７１、配列番号７８４を参照のこと）を含む。プレートを、血清希釈液中で１から５に希釈されたハイブリドーマ上清を添加する前に、ＤＰＢＳ中の１０％ＦＢＳでブロックした。組換えＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩに結合したマウス抗体を上述のように検出した。
図４に示されるように、測定可能な濃度のＩｇＧを含有するハイブリドーマクローン上清（１〜５）由来のＲＯＮ−ｅ０１抗体は、組換えＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩタンパク質に結合せず、このことは、ＲＯＮ−ｅ０１によって認識されるエピトープの一部または全てがＳｅｍａおよびＰＳＩドメインの外側に位置することを示す。しかしながら、組換えＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩタンパク質結合は、測定可能な濃度のＩｇＧを含有する全てのＲＯＮ−ｆ０１ハイブリドーマクローン上清（Ａ〜Ｍ）において観察され、このことは、ＲＯＮ−ｆ０１によって認識されるエピトープの一部または全てが、ＲＯＮ ＳｅｍａおよびＰＳＩドメイン内に含有されることを示唆する。「希釈液のみ」の試料は、血清希釈液のみを試料として流した時のそれぞれのアッセイにおけるバックグラウンド結合を表す。ＩｇＧ測定および組換えＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩ結合の陽性対照として、２５０ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＲＯＮ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号ＭＡＢ６９１、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、両方のＥＬＩＳＡにおいて試験した。
実施例４
ＲＯＮ−ＥおよびＲＯＮ−Ｆ結合分子は、細胞表面結合において相互に競合しない
トリプシンで解離したＢｘＰＣ−３細胞を、染色緩衝液（ＤＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）中で希釈された分子を用いて、氷上で染色した。３×１０５細胞を、それぞれ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８共役抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧ二次抗体での検出前に、氷上で１時間、５００ｎＭの競合分子でインキュベートし、洗浄し、１００ｎＭの一次マウス抗体またはＳＭＩＰで染色した（ＲＯＮ−ｅ０１：マウス抗体、ＲＯＮ−ｆ０２：抗ＲＯＮ ＳＭＩＰ、ＤＸ０７：抗ＲＯＮ β−鎖抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ））。試料を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを用いて、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上で分析した。
図５に示されるように、ＲＯＮ−ｅおよびＲＯＮ−ｆ分子は、細胞表面結合において相互に競合せず、このことは、ＲＯＮ−ｅおよびＲＯＮ−ｆ分子が異なるエピトープでＲＯＮに結合することを示す実施例３の結果を確証する。ＤＸ０７およびＲＯＮ−ｆ分子は、相互の細胞表面結合を妨害し、このことは、それらがＲＯＮの同様の領域に結合するか、あるいは立体障害を介して結合を阻止し得ることを示唆する。
実施例５
ＲＯＮ−ＥおよびＲＯＮ−Ｆ結合分子は、ＲＯＮ、ＡＫＴ、およびＭＡＰＫのＭＳＰ誘発性リン酸化を阻害し得る
リンタンパク質のウエスタンブロット分析を用いて、ＲＯＮ結合分子がＲＯＮ、ＡＫＴ、およびＭＡＰＫのＭＳＰ誘発性リン酸化を阻害し得るかを判定した。
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の６ウェルプレート中の２．５×１０６細胞／ウェルで一晩プレーティングした。翌日、培地を吸引し、３７℃で１時間、無血清ＲＰＭＩ中で調製された１０ｎＭまたは２００ｎＭのブロッキング処理物に置き換えた。ブロッキング処理物を吸引し、細胞を３７℃で３０分間、ＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で刺激した。リガンドおよび３ｎＭのＭＳＰ処理物の両方ともに、１００μＭのＮａ３ＶＯ４を有する無血清ＲＰＭＩ培地中で調製しなかった。細胞を、氷で冷やしたＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で一回洗浄し、ＨＡＬＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル、ＨＡＬＴ（商標）ホスファターゼ阻害剤カクテル、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、および０．９ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルで補充した１５０μＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に氷上で溶解した。溶解物を、４℃で遠心分離によって浄化し、変性電気泳動のために処理した。１７．５μＬのＲＩＰＡ溶解物をレーン毎に装填し、６％（ＲＯＮ）または４〜２０％（ＡｋｔおよびＭＡＰＫ）のＴｒｉｓ−グリシンゲル上で分離した。ゲルをニトロセルロース膜上にブロットした。全ての抗ＲＯＮ抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手し、および全ての抗ＡｋｔおよびＭＡＰＫ抗体をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から入手した。二次抗体をＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）から購入した。
チロシンリン酸化ＲＯＮを、抗リンＲＯＮ抗体を用いて、それぞれ、リン−チロシン１２３８／１２３９または１３５３およびＩＲＤｙｅ８００ＣＷロバ抗ウサギまたは抗ヤギ二次抗体に対して複製ブロット上で検出した。抗リン−チロシン１２３８／１２３９および／または１３５３ブロットを、ＲＯＮ β Ｃ−２０抗体およびＩＲＤｙ６８０（図６）または８００ＣＷ（図８）ロバ抗ウサギ二次抗体を用いて、全体のＲＯＮについて再探査した。リン−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）およびリン−ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）を、それぞれ、ＩＲＤｙｅ６８０ロバ抗ウサギまたはＩＲＤｙｅ８００ＣＷロバ抗マウス二次抗体を用いて、同一のブロット上で検出した。複製ブロット（図６）または抗リン−Ａｋｔ／ＭＡＰＫブロット（図８）のいずれかを、それぞれ、ＩＲＤｙｅ６８０ロバ抗マウスまたはＩＲＤｙｅ８００ＣＷロバ抗ウサギ二次抗体、Ｆｈで検出したパンＡｋｔ４０Ｄ４およびｐ４４／４２ＭＡＰＫ抗体を用いて、全体のＡｋｔおよびＭＡＰＫについて探査した。ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）赤外線撮像システム（ＬＩ−ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を用いてブロットを分析した。
図６Ａに示されるように、ＲＯＮ−ｅ０１抗体およびＲＯＮ−ｅ０５ＹＡＥインターセプターが、ＲＯＮ、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫのＭＳＰ誘発性リン酸化を阻害することができる一方で、ＲＯＮ−ｅ０２ ＳＭＩＰは、その平凡なブロッキング活性を呈する。さらに、ＲＯＮ−ｆ０１抗体、ＲＯＮ−ｆ０２ ＳＭＩＰ、およびＲＯＮ−ｆ０３インターセプターは、ＲＯＮ、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫのＭＳＰ誘発性リン酸化を阻害することができる（図６Ｂ）。
図８Ａに示されるように、ＲＯＮ−ｆヒト化ＳＭＩＰ（ＲＯＮ−ｆ０７ｈ２４およびＲＯＮ−ｆ０８ｈ２５）は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中のＲＯＮ、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫのＭＳＰ誘発性リン酸化を阻害することができる。ＲＯＮ−ｆヒト化ＳＭＩＰは、ブロッキングステップおよびその後の模擬刺激中に適用される時、ＲＯＮの最小限のリン酸化を引き起こすが、ＡｋｔまたはＭＡＰＫの最小限のリン酸化は引き起こさない。図８Ｂは、ＲＯＮ−ｆ０２マウスＳＭＩＰのヒト化が、刺激ステップ中のＳＭＩＰ適用を受けて受容体リン酸化を減少させることを示す。ＲＯＮ−ｆ０２マウスＳＭＩＰは、ＲＯＮリン酸化を刺激するが、下流ＡｋｔまたはＭＡＰＫリン酸化は刺激しない。引き起こされたヒト化ＳＭＩＰ（ＲＯＮ−ｆ０７ｈ２４およびＲＯＮ−ｆ０８ｈ２５）は、マウスＳＭＩＰ ＲＯＮ−ｆ０２と比較して、ＲＯＮリン酸化を減少させた。興味深いことに、ＭＳＰ誘発性ＲＯＮ活性化を受けて観察される高レベルの下流エフェクタータンパク質リン酸化は、ＲＯＮ受容体のＳＭＩＰ誘発性リン酸化後には観察されない。
したがって、本明細書に記載のＲＯＮ結合分子は、ＭＳＰ誘発性シグナル伝達経路を阻害するために使用され得、したがって、膵臓癌等であるが、それらに限定されない種々の癌の治療を含む多種多様の治療場面において有用である。
実施例６
ＲＯＮ−ＥおよびＲＯＮ−Ｆ結合分子の結合反応速度
ＲＯＮ−ｅおよびＲＯＮ−ｆ結合分子の結合反応速度を、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて決定した。
ＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩ−ＡＦＨタンパク質を、アビジン、３Ｘ ＦＬＡＧ（登録商標）、および６Ｘヒスチジンタグを含むＣ末端タグに融合したＲＯＮのＳｅｍａ−ＰＳＩ領域（ａ．ａ．２５〜５６８）を包囲する構築体で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）中に産生した。可溶性ＲＯＮタンパク質は、アミノ酸３０５〜３０９で天然切断部位（ＫＲＲＲＲ、配列番号１７８）に置換されたトロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧ、配列番号１７７）を含んだ。タンパク質を、抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２親和性アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて上清から精製し、３Ｘ ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶出し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でさらに精製した。
可溶性ＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩ−ＡＦＨへのＲＯＮ−ｆマウス抗体、ＳＭＩＰ、およびインターセプターの結合反応速度を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて決定した。抗ＲＯＮマウス抗体を、固定化抗マウスＦｃポリクローナル抗体を用いて捕捉した一方で、ＳＭＩＰおよびインターセプターを、抗ヒトＦｃモノクローナル抗体で捕捉した。両方ともにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ由来の捕捉抗体を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、アミンを介してカルボキシメチルデキストラン表面（ＣＭ４）に共有結合的に共役させた。活性化表面の占有されていない部分をエタノールアミンによってブロックした。捕捉抗体は、一連のアッセイ中、捕捉された抗ＲＯＮ分子からの識別可能な解離を示さなかった。それぞれの周期中に単一の濃度の可溶性ＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩ−ＡＦＨを注入し、その後、解離させた。それぞれの周期の終わりに、捕捉抗体に結合されたタンパク質を解離する３ＭのＭｇＣｌ２を用いて、表面を徐々に再生成した。参照細胞への結合に関連したシグナルを使用してバルク屈折変化を差し引き、空の（緩衝液のみの）注入を使用して、ドリフトおよびシステムノイズを補正した。
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて動力学的パラメータおよび親和性を決定した。相互作用のｋａ（Ｍ−１ｓ−１）およびｋｄ（ｓ−１）速度を使用して、抗体／受容体相互作用の親和定数、ＫＤ（Ｍ）を計算した。ＫＤは、ｋｄおよびｋａ定数（ｋｄ／ｋａ）の比と定義される。ＲＯＮ−ｆ０１マウス抗体を単一の実験において試験し、一方で、ＲＯＮ−ｆ０２ＳＭＩＰおよびＲＯＮ−ｆ０３インターセプター分子をそれぞれ３つの独立した実験において試験した。代表的な実験からの速度および親和定数が、表５に示される。ＲＯＮ−ｆ分子が固定化抗Ｆｃでセンサーチップ上に捕捉された一方で、可溶性ＲＯＮ Ｓｅｍａ−ＰＳＩ−ＡＦＨタンパク質は、その表面上に様々な濃度で流された。
実施例７
ＲＯＮ−ｅおよびＲＯＮ−ｆ結合分子は、ＢｘＰＣ−３細胞の完全なＭＳＰ誘発性創傷治癒を予防する
生体外機能的アッセイを用いて、ＭＳＰ誘発性創傷治癒を予防するＲＯＮ結合分子の能力を試験した。
ＢｘＰＣ−３細胞を、１ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中のコラーゲンで被覆した２４ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中に５×１０５細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃で１８時間インキュベートした。翌日、培地を細胞から吸引し、１ｍＬの無菌ＤＰＢＳに置き換えた。細胞単層をそれぞれのウェルの中心に垂直方向に１ｍＬのピペット先端で引っ掻いた。引っ掻いた後、ＤＰＢＳおよび任意の取り除かれた細胞をウェルから慎重に吸引した。それぞれのウェルは、５００μＬの無血清ＲＰＭＩまたは無血清ＲＰＭＩ中に１００μＭで希釈されたブロッキング試薬を受けた。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。ブロッキングステップ中、明視野設定および４倍対物レンズを有するＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ１０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、プレートを０時間時点において撮像した。ＭＳＰリガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を無血清ＲＰＭＩ中で５μｇ／ｍＬに希釈した。ブロッキングインキュベーション後、１０μＬの無血清ＲＰＭＩ（リガンド制御なし）、あるいは希釈されたＭＳＰを、１００ｎｇ／ｍＬのＭＳＰ／ウェルの最終濃度になるようそれぞれのウェルに添加した。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、０時間時点と同一の設定を用いてＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒで再度撮像した。完全な治癒（ブロッキング処理物の不在下でＭＳＰ刺激を伴って観察される）または不完全な治癒（ＭＳＰ刺激の不在下で観察される）のために創傷を切り込んだ。それぞれの処理を二重に実行した。結果は、表６および７に要約される。
表６および７に要約されるように、抗ＲＯＮ−ｅ０１抗ＲＯＮ−ｆ０１抗体、ＲＯＮ−ｅ０２およびＲＯＮ−ｆ０２ ＳＭＩＰ、およびＲＯＮ−ｅ０３およびＲＯＮ−ｆ０３インターセプター分子、およびヒト化ＲＯＮ−ｅおよびＲＯＮ−ｆ ＳＭＩＰを含むＲＯＮ結合ドメイン分子は全て、ＢｘＰＣ−３細胞のＭＳＰ誘発性創傷治癒を阻止した。
実施例８
二重特異性ヒト化ＲＯＮ−Ｆ結合ドメイン／抗ＣＤ３結合ドメイン分子は、ＲＯＮ抗原を発現する標的細胞の細胞毒性Ｔ細胞死滅を特異的に指向する
本実施例において、指向されたＴ細胞毒性アッセイを用いて、ＲＯＮ結合ドメインおよび抗ＣＤ３結合ドメインを有する二重特異性分子が、ＲＯＮを発現する標的細胞の細胞毒性Ｔ細胞媒介性死滅を指向し得ることを実証した。２つの異なる抗ＲＯＮ結合ドメイン分子形式を用いた。具体的には、ＲＯＮ結合ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子およびＲＯＮ結合インターセプター分子を構築した。ｆ１０ｈ２４ ＲＯＮ結合インターセプター分子は、表４に記載され、この構築体のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７８７および７８９に示される。一本鎖抗ＣＤ３インターセプター対ポリペプチドは、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：ＣＲＩＳ７（抗ＣＤ３モノクローナル抗体）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）を含む。この構築体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８０７および８０８に示される。ＳＣＯＲＰＩＯＮ構築体は、ヒト化４Ｃ０４ ＳｃＦｖおよびヒト化Ｃｒｉｓ７ ＳｃＦｖから成り、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を抑制する変異を有するＦｃドメインを含有する。ＳＣＯＲＰＩＯＮ構築体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７８６および７８８に示される。
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ）およびＤａｕｄｉ（ＡＴＣＣ）標的細胞を、１００万個の細胞当たり０．０５ｍＣｉのクロム−５１で装填した。標的細胞を洗浄し、アッセイ培地［ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５５μＭの２−メルカプトエタノール］中で再懸濁して、２×１０５細胞／ｍＬの濃度にした。パンＴ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて、健常なドナーのＴ細胞を末梢血単核球から単離した。刺激されていないＴ細胞を洗浄し、アッセイ培地中で１ｘ１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。９６ウェルＵ底プレート中に、５０μＬの標的細胞（１０，０００細胞／ウェル）を５０μＬの４倍の処理物（アッセイ培地のみ、ＮＰ−４０洗剤、または二重特異性タンパク質）と合わせ、室温で１５分間インキュベートした。１００μＬのアッセイ培地またはＴ細胞（１００，０００細胞／ウェル）を必要に応じてウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を徐々にペレット化し、２５μＬの細胞を含まない上清を、シンチレーター被覆ＬＵＭＡＰＬＡＴＥ（商標）９６プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に移した。シンチレーションプレートを一晩乾燥させ、それぞれの試料のカウント毎分（ｃｐｍ）をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に記録した。標的細胞およびＴ細胞を含有し、かつ処理物を含有しないウェルで自然放出を測定した。標的細胞および０．２％ＮＰ−４０洗剤を含有するウェルで全溶解を測定した。データを、以下の等式によって決定された全溶解％としてプロットした：
図９Ａおよび図９Ｂに示されるように、両方の標的細胞株は、Ｔ細胞および標的細胞によって発現される抗原に結合する二重特異性タンパク質とともにインキュベートした時に、Ｔ細胞のみによって死滅させられた。二重特異性タンパク質が標的細胞（すなわち、Ｄａｕｄｉ細胞に二重特異な抗ＲＯＮ×抗ＣＤ３またはＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞に二重特異的な抗ＣＤ１９）に結合しない時、標的細胞毒性は観察されなかった。したがって、ヒト化ＲＯＮ−ｆ結合ドメインと抗ＣＤ３結合ドメインを組み合わせる二重特異性タンパク質は、ＲＯＮ抗原を発現する標的細胞の細胞毒性Ｔ細胞死滅を特異的に指向する。これらの実験は、細胞毒性Ｔ細胞を動員してＲＯＮを発現する標的細胞を死滅させるために、本明細書に記載の抗ＣＤ３結合ドメイン分子と組み合わせられたＲＯＮ結合分子が治療場面において使用され得ることを実証する。
実施例９
抗ＲＯＮおよび抗Ｃ−ＭＥＴ結合ドメインを有するポリペプチドヘテロ二量体
抗ＲＯＮ結合ドメインを有する二価ポリペプチドヘテロ二量体（ＯＲＮ１５１）、ならびに抗ＲＯＮおよび抗ｃＭｅｔ結合ドメインを含む２つの二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体（ＯＲＮ１５２およびＯＲＮ１５３）を作製した。
二価ポリペプチドヘテロ二量体ＯＲＮ１５１は、一本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４５（４Ｃ０４ ＣＨ２ ＣＨ３ ＣＨ１）およびＯＲＮ１４８（１１Ｈ０９ ＣＨ２ ＣＨ３ Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。一本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４５は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：４Ｃ０４（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ ＣＨ１を含む。ＯＲＮ１４５のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８１０および８１１に示される。一本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４８は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：１１Ｈ０９（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）を含む。ＯＲＮ１４８のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８１２および８１３に示される。
二重特異的（ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ）ポリペプチドヘテロ二量体ＯＲＮ１５２は、一本鎖ポリペプチドＯＲＮ１１６（ＭＥＴ０２１ ＣＨ２ ＣＨ３ ＣＨ１）およびＯＲＮ１４６（４Ｃ０４ ＣＨ２ ＣＨ３ Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。一本鎖ポリペプチドＯＲＮ１１６は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：ＭＥＴ０２１（抗ｃ−Ｍｅｔ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３およびヒトＩｇＧ１ ＣＨ１を含む。ＯＲＮ１１６のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８１４および８１５に示される。一本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４６は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：４Ｃ０４（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）を含む。ＯＲＮ１４６のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８１６および８１７に示される。
二重特異的（ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ）ポリペプチドヘテロ二量体ＯＲＮ１５３は、一本鎖ポリペプチドＯＲＮ１１６（ＭＥＴ０２１ ＣＨ２ ＣＨ３ ＣＨ１）およびＯＲＮ１４８（１１Ｈ０９ ＣＨ２ ＣＨ３ Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。
ポリペプチドヘテロ二量体ＯＲＮ１５１、ＯＲＮ１５２、およびＯＲＮ１５３は、以下の方法に従って発現される。以下の発現レベルを得た：ＯＲＮ１５１において１．９μｇタンパク質／ｍＬの培養、ＯＲＮ１５２において３．１μｇ／ｍＬ、およびＯＲＮ１５３において４．９μｇ／ｍＬ。
発現
トランスフェクションの前日、ＨＥＫ２９３細胞を０．５ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞濃度でフリースタイル２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ）中に懸濁した。大きいトランスフェクションでは２５０ｍＬの細胞を使用したが、小さいトランスフェクションでは６０ｍＬの細胞を使用した。トランスフェクション当日、３２０μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、８ｍＬの培地と混合した。同時に、２つの鎖のそれぞれの２５０μｇのＤＮＡも８ｍＬの培地と混合し、５分間インキュベートした。１５分間のインキュベーション後、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ混合物を２５０ｍＬの２９３細胞に添加し、３７ｏＣで振盪器に戻し、１２０ＲＰＭの速度で振盪した。６０ｍＬの細胞を用いたより小さいトランスフェクションでは、ＤＮＡ、２９３ｆｅｃｔｉｎ、および培地の４分の１を使用した。
実施例１０
二重特異性抗ＲＯＮ／抗ＣＤ３ポリペプチドヘテロ二量体の細胞結合
抗ＲＯＮおよび抗ＣＤ３結合ドメインを有するポリペプチドヘテロ二量体Ｓ０２６８を構築した。Ｓ０２６８は、一本鎖ポリペプチドＯＲＮ１４５（４Ｃ０４ ＣＨ２ ＣＨ３ ＣＨ１）およびＴＳＣ０１９（Ｇ１９−４ ＣＨ２ ＣＨ３ Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０１９は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ０１９のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８１８および８１９に示される。ＯＲＮ１４５一本鎖ポリペプチドのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８１０および８１１に示される。
腫瘍細胞抗原およびＴ細胞を標的化する二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体分子の有効性を比較するために、Ｓ０２６８の細胞上での結合特性を、同一の結合ドメインを含有する異なる二重特異的足場（ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）タンパク質）、Ｓ０２６６と比較した。Ｓ０２６６のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ＳＣＯＲＰＩＯＮタンパク質は、それぞれ、配列番号８２０および８２１に示される。ヒト２９３細胞における一過性トランスフェクションは、Ｓ０２６６では６．９μｇタンパク質／ｍＬの培養、Ｓ０２６８では２．３μｇ／ｍＬの培養、ＴＳＣ０２０では３．０μｇ／ｍＬの培養、およびＴＳＣ０２１では３．２μｇ／ｍＬの培養を産生した。
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＲＯＮ＋）乳癌細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、提供されたプロトコルに従って培養した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のパンＴ細胞単離キットＩＩを用いて、Ｔ細胞をドナーＰＢＭＣから単離した。ビオチン共役モノクローナル抗体および抗ビオチン磁気マイクロビーズで間接的かつ磁気的に標識化することによって、非Ｔ細胞をＰＢＭＣから分離した。次に、これらの細胞を、それらを磁界で取り囲まれたカラム内に保持することによって枯渇させた。Ｔ細胞をカラム内に保持せず、貫流中に収集した。
５×１０５Ｔ細胞または標的（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）細胞を４℃で３０分間、１００ｎＭから０．１ｎＭの濃度で連続的に希釈した（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞および単離Ｔ細胞への）二重特異性分子Ｓ０２６６（αＲＯＮ×αＣＤ３ ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）タンパク質）またはＳ０２６８（αＲＯＮ×αＣＤ３ポリペプチドヘテロ二量体）でインキュベートすることによって、結合を評価した。細胞を３回洗浄し、その後、４℃でさらに３０分間、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：２００希釈）でインキュベートした。次に、細胞を再度３回洗浄し、１％のパラホルムアルデヒド中に固定し、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ計器上で読み取った。
ＦｌｏｗＪｏ ｖ７．５（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）におけるＦＳＣの高い小集団、ＳＳＣの高い小集団の分析は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３および単離Ｔ細胞の両方への二重特異性分子Ｓ０２６６およびＳ０２６８の用量依存結合を示した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。意外にも、Ｓ０２６８ポリペプチドヘテロ二量体は、任意の結合活性の可能性を欠いたが、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞およびＴ細胞の両方の細胞上で、同等のＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）分子（Ｓ０２６６）と同様の親和性で結合した。ポリペプチドヘテロ二量体を用いて両方の標的細胞型上でより高い飽和も観察され、これは、ポリペプチドヘテロ二量体が同等のＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）（二価Ｓｃｏｒｐｉｏｎ対表面抗原の見込まれる１：２の結合）よりも高い化学量論（ポリペプチドヘテロ二量体対表面抗原の１：１の結合）で結合された場合であろう。
実施例１１
ポリペプチドヘテロ二量体によって再指向されるＴ細胞毒性
標的依存性Ｔ細胞毒性を誘発する異なる二重特異性ポリペプチドヘテロ二量体分子の有効性を比較するために、４つの異なる二重特異性分子を、クロム（５１Ｃｒ）放出アッセイにおいて比較した。共通の抗ＣＤ１９結合ドメイン（ＨＤ３７）および３つの異なる抗ＣＤ３結合ドメイン（ＴＳＣ０５４ではＧ１９−４、ＴＳＣ０７８ではＯＫＴ３、ＴＳＣ０７９ではＨｕＭ２９１）を有する３つの異なる二重特異性分子（ＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、ＴＳＣ０７９）を、抗ＲＯＮ結合ドメイン（４Ｃ０４）および抗ＣＤ３結合ドメイン（Ｇ１９−４）を有する第４の二重特異性分子（Ｓ０２６８、実施例１０を参照のこと）と同時に試験した。二価ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ０５４は、一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）ＣＨ３ ＣＨ１）およびＴＳＣ０５３（Ｇ１９−４ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）ＣＨ３ Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ置換を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ２）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ ＣＨ１を含む。ＴＳＣ０４９のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８２２および８２３に示される。一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０５３は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：Ｇ１９−４（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ置換を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ２）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ０５３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８２４および８２５に示される。
二価ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ０７８は、一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）ＣＨ３ ＣＨ１）およびＴＳＣ０７６（ＯＫＴ３ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）ＣＨ３ Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０７６は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ０７６のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８２６および８２７に示される。
二価ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ０７９は、一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（ＨＤ３７ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）ＣＨ３ ＣＨ１）およびＴＳＣ０７７（Ｎｕｖｉｏｎ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）ＣＨ３ Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０７７は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：Ｎｕｖｉｏｎ（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ０７７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８２８および８２９に示される。
ヒト２９３細胞における一過性トランスフェクションは、ＴＳＣ０５４では約２．３３μｇ／ｍＬのタンパク質、ＴＳＣ０７８では約０．６７μｇ／ｍＬタンパク質、およびＴＳＣ０７９では約３．５μｇ／ｍＬタンパク質を産生した。
Ｄａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞（ＣＤ１９＋、ＲＯＮ−）およびＢｘＰＣ−３細胞（ＣＤ１９−、ＲＯＮ＋）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、提供されたプロトコルに従って培養した。標準のフィコール勾配を用いて、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をヒト血液から単離した。単離した細胞を食塩水緩衝液中で洗浄した。製造業者のプロトコル（詳細については、実施例５も参照のこと）を用いて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のパンＴ細胞単離キットＩＩでＴ細胞をさらに単離した。
細胞毒性を５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。約５×１０６のＤａｕｄｉ細胞またはＢｘＰＣ−３細胞を０．３ｍＣｉの５１Ｃｒで処理し、３７℃で７５分間インキュベートした。７５分後、細胞を培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で３回洗浄し、１１．５ｍＬの培地中に再懸濁した。この懸濁から、１ウェル当たり５０μＬを９６ウェルＵ底プレート（約２０，０００個の細胞／ウェル）に分注した。１０ｎＭ〜０．１ｐＭにわたる二重特異性分子の濃度を標的（Ｄａｕｄｉ、ＢｘＰＣ−３）細胞に添加し、全容積を１００μＬ／ウェルにした。標的細胞を室温で１５分間インキュベートした。次に、１００μＬの単離Ｔ細胞（約２００，０００）を添加し、Ｔ細胞を１０：１の標的細胞比にした。５０μＬの０．８％ＮＰ−４０を、標的細胞を含有する対照ウェルに添加し、１５分間放置し、その後、１００μＬの培地を添加して、全溶解対照を得た。
プレートを４時間インキュベートし、１５００ｒｐｍで３分間回転させ、２５μＬの上清を、それぞれのウェルから９６ウェルＬｕｍａ試料プレートの対応するウェルに移した。試料プレートを化学的に安全なカバー内で１８時間空気乾燥させ、その後、標準のプロトコルを用いて放射能をＴｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンターで読み取った。
細胞毒性データの分析は、抗ＲＯＮ指向性二重特異性分子Ｓ０２６８由来のＤａｕｄｉ（ＲＯＮ）細胞上でのオフターゲットの細胞毒性の欠如を示した（図１１Ａ）。同様に、Ｔ細胞の不在下でＴＳＣ０５４でのＤａｕｄｉ細胞の処理から観察されたように、指向細胞毒性を欠如した（図１１Ａ）。しかしながら、強力なＴ細胞指向性細胞毒性は、Ｔ細胞および抗ＣＤ１９指向性二重特異性分子（ＴＳＣ０５４）の存在下でＤａｕｄｉ細胞から観察され、１０〜１００ｐＭの濃度で最大の溶解に達した（図１１Ａ）。同様に、第２のＴ細胞ドナー（図１１Ｂ）を用いて、ＢｘＰＣ−３（ＣＤ１９−）細胞のオフターゲットの細胞毒性は、ＣＤ１９指向性二重特異性分子ＴＳＣ０５４、ＴＳＣ０７８、もしくはＴＳＣ０７９、またはＣＤ１９指向性ＢｉＴＥ ｂｓｃ１９×３から観察されなかった。抗ＲＯＮ指向性Ｓ０２６８二重特異性分子は、ＢｘＰＣ−３（ＲＯＮ＋）細胞中の細胞毒性を誘発し、１０〜１００ｐＭの最大の溶解に達した（図１１Ｂ）。
実施例１２
二重特異性抗ＲＯＮ／抗ＣＤ１９ポリペプチドヘテロ二量体
二価抗ＲＯＮ／抗ＣＤ１９ポリペプチドヘテロ二量体、ＴＳＣ０９９を構築した。ＴＳＣ０９９は、一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９（抗ＣＤ１９）（ＨＤ３７ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）ＣＨ３ ＣＨ１）およびＴＳＣ０９７（４Ｃ０４ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）ＣＨ３ Ｃｋ（ＹＡＥ））を含む。一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０９７は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：４Ｃ０４（抗ＲＯＮ）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣｋ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ０９７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８３０および８３１に示される。一本鎖ポリペプチドＴＳＣ０４９は、そのアミノ末端からカルボキシル末端まで：ＨＤ３７（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（ＡＤＣＣ／ＣＤＣ無）（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ置換を伴うヒトＩｇＧ１ ＣＨ２）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＩｇＧ１ ＣＨ１を含む。ＴＳＣ０４９のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８２２および８２３に示される。
上述の種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照され、かつ／あるいは出願データシートに列記される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許出版物の全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、種々の特許、出願、および出版物の概念を採用し、またさらなる実施形態を提供するために、必要に応じて修正することができる。
上述の詳細な記述を考慮に入れて、これらおよび他の変更を実施形態に加えることができる。概して、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に制限すると解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利付与される均等物の全範囲に加えて、全ての考えられる実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって制限されない。

Claims (35)

  1. ヒトＲＯＮに特異的に結合する免疫グロブリン結合ポリペプチドであって、前記免疫グロブリン結合ポリペプチドは、
    （ａ） ＶＬドメインであって、
    ｉ． 配列番号６７のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６８のＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６９のＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくは
    ｉｉ． 配列番号１４１のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４２のＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１４３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む、ＶＬドメイン、または
    （ｂ） ＶＨドメインであって、
    ｉ． 配列番号７０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７１のＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７２のＣＤＲ３アミノ酸配列、もしくは
    ｉｉ． 配列番号１４４のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４５のＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１４６のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含む、ＶＨドメイン、または
    （ｃ） （ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨ
    を含む、免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  2. 前記ＶＬドメインは、配列番号８０または１５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、前記ＶＨドメインは、配列番号８１、１５３、および１７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  3. 前記ＶＬドメインおよび前記ＶＨドメインはヒト化される、請求項１に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  4. ヒト化された前記ＶＬは、配列番号８２、８３、および１５４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ヒト化された前記ＶＨドメインは、配列番号８４〜８６、１５５、および１５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  5. 前記免疫グロブリン結合ポリペプチドは、抗体または抗体の抗原結合断片である、請求項１に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  6. 前記抗体または前記抗体の抗原結合断片は、非ヒトのもの、キメラのもの、ヒト化されたもの、またはヒトのものである、請求項５に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  7. 非ヒトの前記抗体もしくはキメラの前記抗体または非ヒトの前記抗体もしくはキメラの前記抗体の抗原結合断片は、配列番号８０および１５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、配列番号８１、１５３、および１７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、を有する、請求項６に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  8. ヒト化された前記抗体またはヒト化された前記抗体の抗原結合断片は、配列番号８２、８３、および１５４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、配列番号８４〜８６、１５５、および１５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、を有する、請求項６に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  9. 前記抗体または前記抗体の抗原結合断片は、配列番号８０、８２、８３、１５２、および１５４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも約９０％同一のＶＬドメインを含み、かつ配列番号８１、８４〜８６、１５３、１５５、１５６、および１７６のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも約９０％同一のＶＨドメインを含む、請求項６に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  10. 前記結合ポリペプチドは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、およびＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  11. 前記ｓｃＦｖは、配列番号８０および１５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインを有し、かつ配列番号８１、１５３、および１７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインを有する、請求項１０に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  12. 前記ｓｃＦｖは、ヒト化されており、かつ配列番号８２、８３、および１５４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインを有し、かつ配列番号８４〜８６、１５５、および１５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインを有する、請求項１０に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  13. 前記免疫グロブリン結合ポリペプチドは、小モジュラー式免疫製薬（ＳＭＩＰ）タンパク質である、請求項１に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  14. 前記ＳＭＩＰタンパク質は、非ヒトのタンパク質、キメラのタンパク質、ヒト化されたタンパク質、またはヒトのタンパク質である、請求項１３に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  15. 非ヒトの前記ＳＭＩＰタンパク質またはキメラの前記ＳＭＩＰタンパク質は、配列番号８０および１５２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、配列番号８１、１５３、および１７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、を有する、請求項１４に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  16. ヒト化された前記ＳＭＩＰタンパク質は、配列番号８２、８３、および１５４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、配列番号８４〜８６、１５５、および１５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、を有する、請求項１４に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  17. 配列番号３４９〜３６６および４２０〜４７５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するヒンジドメインを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  18. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２ＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン定常サブ領域ドメインを含む、請求項１７に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  19. ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３を含む免疫グロブリン定常サブ領域ドメインを含む、請求項１８に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  20. 前記ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２は、配列番号２４１のアミノ酸配列を含み、前記ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  21. 前記ＳＭＩＰタンパク質は、配列番号９４〜１１４および１６０〜１６８から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  22. 前記免疫グロブリン結合ポリペプチドは、第１のヘテロ二量化ドメインを含む第１の一本鎖ポリペプチド中に含有され、前記第１のヘテロ二量化ドメインは、前記第１のヘテロ二量化ドメインと同一ではない第２のヘテロ二量化ドメインを含む第２の一本鎖ポリペプチドと会合することができ、会合した前記第１の一本鎖ポリペプチドおよび前記第２の一本鎖ポリペプチドは、ポリペプチドヘテロ二量体を形成する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  23. 前記ポリペプチドヘテロ二量体は、
    配列番号１７０のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド、
    配列番号１７２のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号２７のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド、
    配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド、
    配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド、
    配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド、
    配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号２７のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド、
    配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド、または
    配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１の一本鎖ポリペプチド、および配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２の一本鎖ポリペプチド
    を含む、請求項２２に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  24. 前記免疫グロブリン結合ポリペプチドは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間に配置される免疫グロブリン定常サブ領域ドメインを含む一本鎖多特異的結合タンパク質中に含有され、前記第１の結合ドメインは、請求項１〜２１に記載のヒトＲＯＮ結合ドメインであり、前記第２の結合ドメインは、請求項１〜２１に記載のヒトＲＯＮ結合ドメインであるか、あるいはヒトＲＯＮ以外の標的分子に対して特異的である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  25. 前記免疫グロブリン定常サブ領域は、ＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３である、請求項２４に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  26. 前記免疫グロブリン定常サブ領域は、第１のリンカーペプチドと第２のリンカーペプチドとの間に配置される、請求項２４に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  27. 前記第１のリンカーペプチドおよび前記第２のリンカーペプチドは独立して、配列番号６１０〜７７７に提供されるリンカーから選択される、請求項２６に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  28. 前記第１のリンカーペプチドは、免疫グロブリンヒンジ領域を含み、前記第２のリンカーペプチドは、ＩＩ型Ｃレクチンストーク領域を含む、請求項２６または２７に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  29. 以下の構造：
    Ｎ−ＢＤ１−Ｘ−Ｌ２−ＢＤ２−Ｃ
    を含み、式中、ＢＤ１は、ヒトＲＯＮに対して特異的なｓｃＦｖを含み、
    −Ｘ−は、−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−であり、式中、Ｌ１は、配列番号３４９〜３６６、４２０〜４７５のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＩｇＧ１ヒンジであり、−ＣＨ２ＣＨ３−は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３領域または１つ以上のエフェクター機能を欠くその変異体であり、
    Ｌ２は、配列番号６１０〜７７７のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を有するリンカーペプチドであり、
    ＢＤ２は、ヒトＲＯＮまたはヒトＲＯＮ以外の標的分子に対して特異的な結合ドメインである、
    請求項２４に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチド。
  30. 請求項１〜２９のうちのいずれか一項に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、組成物。
  31. 請求項１〜３０のいずれか一項に記載の免疫グロブリン結合ポリペプチドを発現することができる、発現ベクター。
  32. 請求項３１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  33. 治療を必要とする対象に、治療的に有効な量の請求項３０に記載の組成物を投与することを含む、癌を治療するための方法。
  34. 前記癌は、膵臓癌、肺癌、結腸癌、および乳癌からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 治療を必要とする対象に、治療的に有効な量の請求項３０に記載の組成物を投与することを含む、炎症性障害を治療するための方法。
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