KR102831164B1 - 단일특이적 항체로부터 다중특이적 항체의 생체내 생성 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에는, 정확하게 조립된 전체 길이 이중- 또는 다중특이적 항체의 생성을 촉진하는 비대칭 교란 돌연변이에 의해 절반으로 불안정화된 2 개의 2/3-IgG 또는 2 개의 2/3-BiFab 사이의 반-항체 교환 반응에 의해 작용 부위에서의 세포-표면 상에서 직접 다중특이적 항체를 생성하는 방법이 보고되어 있다. 상기 방법은 출발 2/3-IgG 또는 2/3-BiFab 에서의 힌지 영역 디술피드 결합의 부재하에서 수행된다.
Description
본원에는, 신규의 반-항체 교환 방법을 사용하는 다중특이적, 예컨대 이중특이적 항체의 세포상, 생체내 조립 방법이 보고되어 있다. 본 발명의 방법은 완전한 항체, 즉, CH2-CH3 도메인을 포함하며, 여기에서 이펙터 기능을 갖는 항체에도 적합하다.
단일특이적 항체 유도체의 조립된 이중특이적 항체로의 생화학적 전환을 위한 현재의 기술 상태의 방법은 (i) 반-항체 상보 반응 및 (ii) IgG-IgG 교환 반응을 적용한다.
이들 기술은, 예를 들어 WO 2015/046467, Rispens et al., J. Biol. Chem. 289 (2014) 6098-6109, US 9,409,989, WO 2013/060867, WO 2011/131746, WO 2011/133886, WO 2011/143545, WO 2010/151792, Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285 (2010) 19637-19646, WO 2009/041613, WO 2009/089004, WO 2008/119353, WO 2007/114325, US 8,765,412, US 8,642,745, WO 2006/047340, WO 2006/106905, WO 2005/042582, WO 2005/062916, WO 2005/000898, US 7,183,076, US 7,951,917, Segal, D.M., et al., Curr. Opin. Immunol. 11 (1999) 558-562, WO 98/50431, WO 98/04592, Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681, WO 96/27011, Carter, P., et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73, WO 93/11162, 및 Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 에 개시되어 있다.
단일특이적 항체 또는 항체 유도체를 bsAb 로 전환시키기 위한 기술 상태의 방법은, 예를 들어 조립 후 bsAb 제제의 처리 및 조성에 관한 제한과 같은 단점을 가진다.
예를 들어, 반-항체 기술은 단일특이적 및 1 가 항체 측을 2 가 IgG 에 조립한다. 입력 분자의 발현 및 교환 반응 자체는 반-항체 뿐만 아니라, 2 가 (단일특이적) 항체 유도체와 같은 IgG 를 생성한다. 응집체는 또한 입력 물질 및 조립 반응의 산출물에도 존재한다. 둘 모두 (2 가 단일특이적 항체 및 응집체) 는 정교한 정제 접근법을 통해 조립된 bsAb 로부터 정량적으로 제거되거나, 또는 (정량적 제거가 높은 처리량 방식으로는 달성하기 어렵기 때문에) 이들은 bsAb 제제를 어느 정도 '오염시키는' 것이 필요하다.
Fab-arm 교환 기술은, 예를 들어 단일특이적 2 가 IgG-유도체로부터 이중특이적 2 가 IgG 를 조립한다. 따라서, 교환 반응으로의 입력은 2 가, 즉, 기본적으로 활성화된 결합력이다. 결합력 또는 작용제 항체 스크리닝에 적용되어야 하는 교환 반응에서 남아있는 2 가 단일특이적 입력 물질의 완전한 부재를 보장하기 위해서, 임의의 남아있는 2 가 입력 및 교환 반응 동안에 형성될 수 있는 임의의 응집체의 완전한 제거를 보장해야 할 것이다. 입력 및 bsAb 의 높은 유사성으로 인해, 정량적 제거를 위한 정교한 절차가 필요하거나 (높은 처리량에서는 달성하기가 매우 어렵다), 또는 남아있는 2 가 입력 및 응집체는 최종 bsAb 제제를 어느 정도 오염시킬 것이다.
Labrijn, A.F., et al. 은 제어된 Fab-arm 교환에 의한 안정한 이중특이적 IgG1 의 효율적인 생성을 개시하고 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150).
WO 2014/081955 는 이종이합체성 항체 및 사용 방법을 개시하고 있다.
WO 2009/089004 는 정전 스티어링 효과를 사용하는 항체 Fc-이종이합체성 분자의 제조 방법을 개시하고 있다. 여기에서는, 도메인-도메인 상호 작용에 관여하는 4 개의 고유 전하 잔기 쌍 (Asp356---Lys439', Glu357---Lys370', Lys392---Asp399', Asp399---Lys409') 중에서, 단지 Lys409---Asp399' 만이 이들 잔기가 구조적으로 보존되고 묻히기 때문에, 공학에 적합한 것으로 개시되어 있다. 다른 3 개의 쌍의 경우, 파트너 중 하나 이상은 용매 노출된다 (% ASA > 10).
WO 2018/155611 은 공유 결합에 의해 결합하지 않는 제 1 항원-결합 분자 및 제 2 항원-결합 분자의 조립을 개시하고 있으며, 이는 액체로 혼합될 때, 동종이합체보다 더욱 용이하게 이종이합체를 형성한다. 여기에서는, 하나의 구현예에 있어서, EU 번호 부여 시스템에서의 위치 226 및 위치 229 중 하나 또는 둘 모두에서 시스테인 잔기에서의 다른 아미노산에 의한 치환이, EU 번호 부여 시스템에서의 위치 357 또는 위치 397 중 하나 이상에서 다른 아미노산 잔기에 의한 제 1 CH3 및 제 2 CH3 중 하나 또는 둘 모두의 치환과 조합되는 것으로 개시되어 있다.
Mayer, K., et al. (Int. J. Mol. Sci. 16 (2015) 27497-27506) 은 TriFab 를 3 가 IgG-형상의 이중특이적 항체 유도체, 이들의 설계, 생성, 특성화 및 표적화된 페이로드 전달을 위한 적용으로서 개시하고 있다.
발명의 요약
본원에는, 표적 세포의 표면 상에서 직접 반-항체 교환 반응에 의한 다중특이적 항체의 생성 방법이 보고되어 있다. 이것은, 무엇보다도, 의도된 작용 부위에서 직접, 비활성 프로-결합 부위로부터 기능성 결합 부위의 형성을 가능하게 한다. 이러한 현장 형성은 전신 부반응의 위험을 제거한다.
출발 물질로서, 중쇄-중쇄 상호 작용이 바람직하게는 중쇄 단편에서 비대칭 교란 돌연변이에 의해 불안정화되고, 중쇄-중쇄 간 공유/디술피드 결합, 예컨대 힌지-영역 디술피드 결합 또는 CH3 도메인 간 디술피드 결합이 존재하지 않는, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및 항체 중쇄 단편을 포함하는 2/3-IgG 또는 2/3-BiFab 와 같은 비-완전 항체가 유리한 것으로 밝혀졌다. 이러한 비대칭 교란 돌연변이는 한편으로는 출발 비-완전 항체의 해리 및, 다른 한편으로는 정확하게 조립된 전체 길이 이중특이적 항체의 생성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄-중쇄 간 공유 결합의 부재는, 반응이 환원제의 부재하에서, 즉, 생체내에서 또는 생리학적 조건하에서 수행될 수 있도록 한다.
본 발명에 따른 방법은 환원제의 부재하에서 수행된다. 따라서, 출발 항체는, 예를 들어 힌지 영역 디술피드 결합과 같은 중쇄-중쇄 디술피드 결합을 갖지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 사슬-교환 반응 및 방법은 초기 환원 없이 이중특이적 항체의 조립을 허용하여, 이 방법을 생체내 적용에 적합하게 한다. 그러므로, 출발 분자의 중쇄 사이의 자연 발생 분자내 디술피드 결합은, 예를 들어 돌연변이 유발 PCR 에 의해 제거된다. 중쇄 사이의 모든 분자 간 디술피드 결합의 결여에도 불구하고, 안정한, 즉, 단리 가능한 항체의 정확한 형성이 발생한다. 따라서, 이들 출발 분자를 사용하여, 무-환원 자발적 사슬-교환 반응을 이용하는 이중특이적 항체의 생체내 생성을 실현하는 것이 가능하였다. 전체적으로, 본 발명에 따른 무-환원 사슬 교환 방법은 생체내에서 세포의 표면 상에서의 직접적인 기능성 이중특이적 항체의 효율적인 생성을 가능하게 한다.
본원에는, 하기의 단계를 포함하는 (다중특이적) 결합제/다합체성 폴리펩티드의 제조 방법이 보고되어 있다:
- (N-말단에서 C-말단 방향으로) 항체 가변 도메인 (직접), 다음에 인간 면역글로불린 (IgG1) CH3 도메인을 모두가 포함하는 제 1 (단량체성) 폴리펩티드 및 제 2 (단량체성) 폴리펩티드를 포함하는 제 1 결합제(단일- 또는 이중특이적 및 이종단량체성임)/다합체성 폴리펩티드,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 결합 부위 또는 결합 부위의 적어도 일부를 포함하고,
여기에서 제 2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의/제 1 교란 돌연변이 (E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택됨) 를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 서로 비-공유적으로 연결되고/비-공유 이합체를 형성하고/서로 비-공유적으로 연결되고/비-공유 이합체임 (여기에서 제 2 폴리펩티드 및 제 1 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때, 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 불안정화 상호 작용을 야기함),
및
(N-말단에서 C-말단 방향으로) 항체 가변 도메인, 직후에 인간 면역글로불린 (IgG1) CH3 도메인을 모두가 포함하는 제 3 (단량체성) 폴리펩티드 및 제 4 (단량체성) 폴리펩티드를 포함하는 제 2 결합제(단일- 또는 이중특이적 및 이종단량체성임)/다합체성 폴리펩티드,
여기에서 i) 제 3 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 3 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고, 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고,
여기에서 i) 제 3 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 4 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 3 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 4 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하며, 여기에서 i) 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, 제 4 폴리펩티드는 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드가 돌연변이 노브를 포함하는 경우, 제 4 폴리펩티드는 돌연변이 홀을 포함하고,
여기에서 제 4 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 결합 부위 또는 결합 부위의 적어도 일부를 포함하고,
여기에서 제 3 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의/제 2 교란 돌연변이 (E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택됨) 를 포함하며, 여기에서 제 4 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하며, 여기에서 제 3 폴리펩티드에서의 돌연변이는 제 2 폴리펩티드에서의 돌연변이와 상이한 위치에 있으며,
여기에서 제 3 폴리펩티드 및 제 4 폴리펩티드는 서로 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결되고/공유 또는 비-공유 이합체를 형성하고/서로 비-공유적으로 또는 공유적으로 연결되고/비-공유 또는 공유 이합체이고 (여기에서 제 3 폴리펩티드 및 제 4 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때, 제 3 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 불안정화 상호 작용을 야기함),
여기에서 제 2 폴리펩티드에서의 (제 1) 교란 돌연변이 및 제 3 폴리펩티드에서의 (제 2) 교란 돌연변이는 제 2 폴리펩티드 및 제 3 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때, 인력 상호 작용을 야기함,
를 인큐베이션하는 단계,
여기에서 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 기능성 (항원 결합 적격) 결합 부위 (항체 가변 도메인의 쌍 (VH/VL 쌍)) 를 형성하고, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 3 폴리펩티드의 가변 도메인은 비-기능성 (항원 결합 적격이 아님) 가변 도메인의 쌍을 형성함,
및
- 제 1 폴리펩티드 및 제 4 폴리펩티드를 포함하는 결합제를 회수하여, (다중특이적) 결합제/다합체성 폴리펩티드를 제조하는 단계.
하나의 구현예에 있어서, 제 1 내지 제 4 폴리펩티드는 각각 N-말단에서 C-말단 방향으로 i) 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), ii) 인간 IgG1 가변 도메인으로부터 유래된 항체 가변 도메인, 및 iii) 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, i) 제 1 및 제 4 폴리펩티드는 각각 인간 IgG1 CH1 도메인 ((변이체) 인간 IgG1 CH1 도메인) 으로부터 유래된 CH1 도메인 및 (서로 독립적으로) 추가의 (중쇄 또는 경쇄) 가변 도메인을 추가로 포함하거나, 또는 ii) 제 1 또는 제 4 폴리펩티드는 인간 IgG1 CH1 도메인 ((변이체) 인간 IgG1 CH1 도메인) 으로부터 유래된 CH1 도메인을 포함하고, 각각의 다른 폴리펩티드는 경쇄 불변 도메인 ((변이체) 인간 카파 또는 람다 CL 도메인) 으로부터 유래된 도메인을 포함하고, 각각의 폴리펩티드는 추가의 가변 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 제 1 폴리펩티드의 추가의 가변 도메인 및 제 4 폴리펩티드의 추가의 가변 도메인은 (상이한) 중쇄 가변 도메인이다. 하나의 구현예에 있어서, 제 1 폴리펩티드의 추가의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 제 4 폴리펩티드의 추가의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이거나, 또는 그 반대이다.
하나의 구현예에 있어서, 제 1 및 제 4 폴리펩티드는 동일하거나 또는 상이한 N- 내지 C-말단 서열을 가질 수 있으며, 제 1 및 제 4 폴리펩티드가 동일한 경우, 이들은 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 폴리펩티드의 하기의 군에서 선택되고, 제 1 및 제 4 폴리펩티드가 상이한 경우, 이들은 N-말단에서 C-말단 방향으로 포함하는 폴리펩티드의 하기의 군에서 서로 독립적으로 선택된다:
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인.
하나의 구현예에 있어서, 제 1 및 제 4 폴리펩티드 중 하나는 N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), 제 3 중쇄 가변 도메인, 제 1 경쇄 불변 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하고, 제 1 및 제 4 폴리펩티드 중 다른 하나는 N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 2 개의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 결합제는 제 1 경쇄 가변 도메인 및 제 2 경쇄 불변 도메인 (제 1 중쇄 가변 도메인과 쌍을 이룸) 을 포함하는 제 1 경쇄, 및 제 2 경쇄 가변 도메인 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인) (제 2 중쇄 가변 도메인과 쌍을 이룸) 을 포함하는 (도메인 교환된) 제 2 경쇄를 추가로 포함하고, 다른 결합제는 제 1 경쇄를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 제 1 및 제 4 폴리펩티드 중 하나는 N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), 제 2 경쇄 가변 도메인, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인을 포함하고, 제 1 및 제 4 폴리펩티드 중 다른 하나는 N-말단에서 C-말단 방향으로 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 2 개의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 결합제는 제 3 가변 경쇄 도메인 및 제 1 경쇄 불변 도메인 (제 1 중쇄 가변 도메인과 쌍을 이룸) 을 포함하는 제 1 경쇄, 및 제 3 중쇄 가변 도메인 및 제 2 경쇄 불변 도메인 (제 1 경쇄 가변 도메인과 쌍을 이룸) 을 포함하는 (도메인 교환된) 제 2 경쇄를 추가로 포함하고, 다른 결합제는 제 1 경쇄를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 제 1 및 제 2 결합제는 항체 경쇄를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에 있어서,
제 1 결합제는
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드:
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
여기에서 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함함,
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드:
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 1 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 서로 비-공유적으로 연결되고/비-공유 이합체를 형성함 (여기에서 제 2 폴리펩티드 및 제 1 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때, 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 불안정화 상호 작용을 야기함),
및
추가의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합됨
를 포함하고,
제 2 결합제는
제 4 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드:
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
여기에서 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 돌연변이 노브를 포함하거나, 또는 제 2 폴리펩티드가 돌연변이 노브를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 5 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하며, 여기에서 제 4 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 상이한 위치에 있음,
및
제 5 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드:
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
여기에서 제 4 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 4 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 i) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 4 폴리펩티드 및 제 5 폴리펩티드는 서로 비-공유적으로 연결되고/비-공유 이합체를 형성함 (여기에서 제 4 폴리펩티드 및 제 5 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때, 제 4 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 불안정화 상호 작용을 야기함),
및
경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 6 폴리펩티드, 여기에서 제 6 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 4 폴리펩티드에 공유 결합됨
를 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 인큐베이션 단계는 환원제의 부재하에 있다.
하나의 구현예에 있어서, i) 제 2 폴리펩티드 및 제 3 폴리펩티드, 또는 ii) 제 2 폴리펩티드 및 제 5 폴리펩티드는 (C-말단) 태그를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 태그는 아미노산 서열 HHHHHH (SEQ ID NO: 67) 또는 HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68) 를 가지며, 회수는 금속 (니켈) 킬레이트 친화성 크로마토그래피 컬럼 상에서의 크로마토그래피에 의한다.
하나의 구현예에 있어서,
제 1 결합제는
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드:
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
여기에서 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함함,
및
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드:
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 돌연변이 노브를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K370E, 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 1 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 서로 비-공유적으로 연결되고/비-공유를 형성함 (여기에서 제 2 폴리펩티드 및 제 1 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때, 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 불안정화 상호 작용을 야기함),
및
경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합됨
를 포함하고,
제 2 결합제는
제 4 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드:
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
여기에서 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 2 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K370E, 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 5 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하며, 여기에서 제 4 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 상이한 위치에 있음,
및
제 5 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드:
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
여기에서 제 4 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 돌연변이 노브를 포함하고, 제 4 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 4 폴리펩티드 및 제 5 폴리펩티드는 서로 비-공유적으로 연결되고/비-공유 이합체를 형성하고 (여기에서 제 4 폴리펩티드 및 제 5 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때, 제 4 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 불안정화 상호 작용을 야기함),
여기에서 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 기능성 (항원 결합 적격) 결합 부위 (항체 가변 도메인의 쌍 (VH/VL 쌍)) 를 형성하고, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 3 폴리펩티드의 가변 도메인은 비-기능성 (항원 결합 적격이 아님) 가변 도메인의 쌍을 형성함,
및
경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 6 폴리펩티드, 여기에서 제 6 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 4 폴리펩티드에 공유 결합됨
를 포함한다.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 하기의 단계를 포함하는 결합제 조합의 식별 방법이다:
- 제 1 의 다수의 결합제에서 선택되는 제 1 결합제 및 제 2 의 다수의 결합제에서 선택되는 제 2 결합제의 각각의 조합을 본 발명에 따른 방법에 적용하여 다수의 결합제를 제조하는 단계,
- 제조된 다수의 결합제의 각각의 결합제의 2 개 이상의 항원에 대한 동시 결합 (의 양) 을 ELISA 분석에서 개별적으로 측정하는 단계, 및
- ELISA 의 결과에 기초하여 다수의 결합제로부터 결합제를 선택함으로써, 결합제 조합을 식별하는 단계.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 다합체성 폴리펩티드이다:
여기에서 두 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로 서로 직후에 임의로 가변 도메인과 CH3 도메인 사이의 펩티드 링커를 사용하여) 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), 항체 가변 도메인, 및 인간 면역글로불린 (IgG1) CH3 도메인을 포함하고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 결합 부위 또는 결합 부위의 적어도 일부를 포함하고,
여기에서 제 2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이 (E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택됨) 를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 서로 비-공유적으로 연결되고/비-공유 이합체를 형성하고 (여기에서 제 2 폴리펩티드 및 제 1 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때, 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 불안정화 상호 작용을 야기함),
제 1 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 기능성 또는 비-기능성 (항원 결합이 아님) 가변 도메인의 쌍을 형성함.
하나의 구현예에 있어서, 제 1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
(및 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함함),
제 2 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 다합체성 폴리펩티드는 (추가의) 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드 (의 CH1 도메인) 에 공유 결합된다.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 다음을 포함하는 조성물이다:
다음을 포함하는 제 1 이종삼합체성 폴리펩티드:
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
(노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함함),
및
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함함,
및
제 3 폴리펩티드로서, 추가의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합됨,
및
다음을 포함하는 제 2 이종삼합체성 폴리펩티드:
제 1 (제 4) 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 2 (제 5) 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하며, 여기에서 제 1 (제 4) 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 상이한 위치에 있음,
및
제 2 (제 5) 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 (제 4) 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 (제 4) 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 i) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 5 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 5 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인임,
및
제 3 (제 6) 폴리펩티드로서, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 여기에서 제 6 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 (제 4) 폴리펩티드에 공유 결합됨,
여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하며, 여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 (제 5) 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 (제 5) 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드 및 제 2 이종삼합체 (제 4) 폴리펩티드의 제 1 폴리펩티드는 동일한 위치에서 교란 돌연변이를 포함하지 않으며/상이한 위치에서 교란 돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 5 폴리펩티드의 가변 도메인은 기능성 (항원 결합 적격) 결합 부위 (항체 가변 도메인의 쌍 (VH/VL 쌍)) 를 형성하고, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 비-기능성 (항원 결합 적격이 아님) 가변 도메인의 쌍을 형성함.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 다합체성 폴리펩티드이다:
여기에서 두 폴리펩티드는 인간 면역글로불린 (IgG1) CH3 도메인을 포함하고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 결합 부위 또는 결합 부위의 적어도 일부를 포함하고,
여기에서 제 2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이 (E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택됨) 를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 서로 비-공유적으로 또는 공유적으로 연결되고/비-공유 또는 공유 이합체를 형성함 (제 2 폴리펩티드 및 제 1 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때, 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 불안정화 상호 작용을 야기함).
하나의 구현예에 있어서, 제 1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 중쇄 가변 도메인,
iv) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
v) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
vi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 경쇄 가변 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
x) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인),
xi) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인, 및
xii) 결합 도메인의 제 1 부분, 임의로 제 1 펩티드 링커, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 제 2 펩티드 링커, 및 결합 도메인의 제 2 부분, 여기에서 (동일한 폴리펩티드의) 결합 도메인의 제 1 부분 및 결합 도메인의 제 2 부분은 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 (연결 및) 형성하고; 하나의 구현예에 있어서, 결합 도메인의 제 1 부분은 항체 중쇄 Fab 단편 (VH-CH1 또는 CH1-VH) 이고, 결합 도메인의 제 2 부분은 경쇄 Fab 단편 (VL-CL 또는 CL-VL) 이거나, 또는 그 반대임
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
여기에서 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함함,
및
제 2 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 돌연변이 노브 또는 홀-돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 다합체성 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합된, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 다음을 포함하는 조성물이다:
다음을 포함하는 제 1 이종삼합체성 폴리펩티드:
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 중쇄 가변 도메인,
iv) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인,
v) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
vi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 경쇄 가변 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
x) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인),
xi) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인, 및
xii) 결합 도메인의 제 1 부분, 임의로 제 1 펩티드 링커, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 제 2 펩티드 링커, 및 결합 도메인의 제 2 부분, 여기에서 (동일한 폴리펩티드의) 결합 도메인의 제 1 부분 및 결합 도메인의 제 2 부분은 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 (연결 및) 형성하고; 하나의 구현예에 있어서, 결합 도메인의 제 1 부분은 항체 중쇄 Fab 단편 (VH-CH1 또는 CH1-VH) 이고, 결합 도메인의 제 2 부분은 경쇄 Fab 단편 (VL-CL 또는 CL-VL) 이거나, 또는 그 반대임
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함함,
및
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함함,
및
제 3 폴리펩티드로서, 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합된, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드,
및
다음을 포함하는 제 2 이종삼합체성 폴리펩티드:
제 1 (제 4) 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 2 (제 5) 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하며, 여기에서 제 1 (제 4) 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 상이한 위치에 있음,
및
제 2 (제 5) 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 중쇄 가변 도메인,
iv) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인,
v) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
vi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 경쇄 가변 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
x) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인),
xi) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인, 및
xii) 결합 도메인의 제 1 부분, 임의로 제 1 펩티드 링커, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 제 2 펩티드 링커, 및 결합 도메인의 제 2 부분, 여기에서 (동일한 폴리펩티드의) 결합 도메인의 제 1 부분 및 결합 도메인의 제 2 부분은 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 (연결 및) 형성하고; 하나의 구현예에 있어서, 결합 도메인의 제 1 부분은 항체 중쇄 Fab 단편 (VH-CH1 또는 CH1-VH) 이고, 결합 도메인의 제 2 부분은 경쇄 Fab 단편 (VL-CL 또는 CL-VL) 이거나, 또는 그 반대임
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 (제 4) 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 (제 4) 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함함,
및
제 3 (제 6) 폴리펩티드로서, 디술피드 결합에 의해 제 1 (제 4) 폴리펩티드에 공유 결합된, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드,
여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하며, 여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 (제 5) 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 (제 5) 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드 및 제 2 이종삼합체 (제 4) 폴리펩티드의 제 1 폴리펩티드는 동일한 위치에서 교란 돌연변이를 포함하지 않으며/상이한 위치에서 교란 돌연변이를 포함함.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 본원에서 기술한 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물을 포함하는 약학 제제이며, 이는 이러한 2/3-IgG 또는 2/3-BiFab 를 혼합함으로써 제조된다.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 의약으로서 사용하기 위한, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물이다.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 의약의 제조 또는 조제에서의, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물의 용도이다.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물의 유효량을 질환을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 방법이다.
하나의 구현예에 있어서, 상기 조성물은 제 1, 제 2, 및 제 3 단량체성 폴리펩티드를 포함하는 제 1 이종삼합체성 폴리펩티드, 및 제 4, 제 5, 및 제 6 단량체성 폴리펩티드를 포함하는 제 2 이종삼합체성 폴리펩티드를 포함한다 (즉, 각각의 이종삼합체성 폴리펩티드는 3 개의 (동일하지 않은) 단량체성 폴리펩티드 (총 6 개의 (동일하지 않은) 단량체성 폴리펩티드 (즉, 동일하지 않은 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5 및 제 6 단량체성 폴리펩티드) 를 함께 포함함) 를 포함한다),
여기에서 제 1, 제 2, 제 4 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드는 각각 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), (ii) 제 1 항체 가변 도메인, 및 (iii) 인간 면역글로불린 (IgG1) CH3 도메인을 포함하고, 여기에서 (i), (ii) 및 (iii) 은 서로 독립적으로 직접 또는 펩티드 링커를 통해 서로 접합되고,
여기에서 i) 제 1 및 제 2 (단량체성) 폴리펩티드, 및 ii) 제 1 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드, iii) 제 2 및 제 4 (단량체성) 폴리펩티드, 및 iv) 제 5 및 제 4 (단량체성) 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인은 VH/VL 쌍이고 (즉, 제 1 (단량체성) 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이고, 여기에서 이것이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고, 또는 이것이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 제 5 (단량체성) 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 4 (단량체성) 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고, 또는 제 5 (단량체성 폴리펩티드) 의 제 1 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 이것은 중쇄 가변 도메인이다),
여기에서 i) 제 1 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드, 및 ii) 제 1 및 제 2 (단량체성) 폴리펩티드, iii) 제 2 및 제 4 (단량체성) 폴리펩티드, 및 iv) 제 5 및 제 4 (단량체성) 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-인투-홀 쌍이고 (즉, 제 1 (단량체성) 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함하며, 여기에서 이것이 노브-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 이것이 홀-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 5 (단량체성) 폴리펩티드의 CH3 도메인이 홀-돌연변이를 포함하는 경우, 제 4 (단량체성) 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 5 (단량체성 폴리펩티드) 의 CH3 도메인이 노브-돌연변이를 포함하는 경우, 이것은 홀-돌연변이를 포함한다),
여기에서 제 1 (단량체성) 폴리펩티드 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로 N- 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두에서 서로 독립적으로 scFv, 또는 scFab, 또는 Fab 를 포함하고,
여기에서 제 2 및 제 4 (단량체성) 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이 (E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택됨) 를 포함하며, 여기에서 제 1 (단량체성) 폴리펩티드는 제 2 (단량체성) 폴리펩티드의 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하며, 여기에서 제 5 (단량체성) 폴리펩티드는 제 4 (단량체성) 폴리펩티드의 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하며, 여기에서 제 2 (단량체성) 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 4 (단량체성) 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 아미노산 서열에서 동일한 위치에 있지 않으며, 여기에서 제 2 (단량체성) 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이 및 제 4 (단량체성) 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 2 폴리펩티드 및 제 4 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때 인력 (전하) 상호 작용을 야기하고, 여기에서 제 2 및 제 4 (단량체성) 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 각각 제 2 (단량체성) 폴리펩티드가 제 1 (단량체성) 폴리펩티드와 이종이합체를 형성하고, 제 4 (단량체성) 폴리펩티드가 제 5 (단량체성) 폴리펩티드와 이종이합체를 형성할 때 반발 (전하) 상호 작용을 야기하고,
여기에서 제 1 및 제 2 (단량체성) 폴리펩티드는 비-공유 이합체를 형성하고, 제 4 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드는 비-공유 이합체를 형성하고, 제 3 및 제 1 (단량체성) 폴리펩티드는 디술피드-연결된 이합체를 형성하고, 제 6 및 제 5 (단량체성) 폴리펩티드는 디술피드-연결된 이합체를 형성하고,
여기에서 제 3 및 제 6 (단량체성) 폴리펩티드는 항체 경쇄임.
하나의 구현예에 있어서, 제 1 (단량체성) 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택된다:
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인.
하나의 구현예에 있어서, 제 2 (단량체성) 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택된다:
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함함,
및
제 3 폴리펩티드로서, 추가의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합됨.
하나의 구현예에 있어서, 제 4 (단량체성) 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택된다:
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 2 (제 5) 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함하며, 여기에서 제 1 (제 4) 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 상이한 위치에 있음.
하나의 구현예에 있어서, 제 5 (단량체성) 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택된다:
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인),
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인), 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 1 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 제 2 CH1 도메인),
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인 (으로부터 유래된 CH1 도메인), SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인 (으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인), 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
여기에서 제 1 (제 4) 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 (제 4) 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 i) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 5 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 5 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인임.
하나의 구현예에 있어서, 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 5 폴리펩티드의 가변 도메인은 기능성 (항원 결합 적격) 결합 부위 (항체 가변 도메인의 쌍 (VH/VL 쌍)) 를 형성하고, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 4 폴리펩티드의 가변 도메인은 기능성 또는 비-기능성 (항원 결합 적격이 아님) 가변 도메인의 쌍을 형성한다.
본 발명의 하나의 양태는 다음을 포함하는 (단리된) 비-공유적 복합체/다합체성 폴리펩티드이다:
다음을 포함하는 제 1 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 1 항체 가변 도메인, 및 b) 제 1 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
및
ii) 제 1 항체 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 제 1 CH3 도메인에 대한 C-말단에 위치하는 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍,
다음을 포함하는 제 2 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 2 항체 가변 도메인, 및 b) 제 2 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
여기에서 제 1 항체 가변 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인이거나; 또는 제 1 항체 가변 도메인이 항체 경쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 교란 돌연변이가 D356K 인 경우에 위치 439 에서 아미노산 잔기 K, 또는
b) 교란 돌연변이가 E357K 인 경우에 위치 370 에서 아미노산 잔기 K, 또는
c) 교란 돌연변이가 K370E 인 경우에 위치 357 에서 아미노산 잔기 E, 또는
d) 교란 돌연변이가 K439E 인 경우에 위치 356 에서 아미노산 잔기 D
를 포함함,
및
ii) 임의로 제 2 항체 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 제 2 CH3 도메인에 대한 C-말단에 위치하는 제 2 표적 또는 제 4 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍, 여기에서 상기 위치는 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인의 상기 쌍의 위치와 무관함,
여기에서 모든 번호 부여는 Kabat EU 지수에 따름.
모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 CH3 도메인 및 제 2 CH3 도메인은 이종이합체 형성을 촉진하기 위해서, 즉, 이하의 섹션 D) 이종이합체화에서 기술하는 바와 같이, 본원에 개시된 아미노산 돌연변이를 포함한다.
모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 CH3 도메인 및 제 2 CH3 도메인은 상기 제 1 CH3 도메인과 상기 제 2 CH3 도메인 사이에 이종이합체 형성을 촉진하기 위해서, 교란 돌연변이와 상이한 추가의 돌연변이를 포함한다.
모든 양태의 하나의 구현예에 있어서,
제 1 CH3 도메인은
a) 돌연변이 T366W, 또는
b) 돌연변이 T366S/L368A/Y407V
를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은
a) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366W 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366S/L368A/Y407V, 또는
b) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366W
를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 다음을 포함하는 (단리된) 비-공유적 복합체/다합체성 폴리펩티드이다:
다음을 포함하는 제 1 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 1 항체 가변 도메인, 및 b) 제 1 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 돌연변이 T366W, 또는 돌연변이 T366S/L368A/Y407V,
및
b) 임의로 돌연변이 Y349C 또는 S354C
를 포함함,
및
ii) 제 1 항체 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 제 1 CH3 도메인에 대한 C-말단에 위치하는 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍,
다음을 포함하는 제 2 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 2 항체 가변 도메인, 및 b) 제 2 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
여기에서 제 1 항체 가변 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인이거나; 또는 제 1 항체 가변 도메인이 항체 경쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은
a) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366W 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366S/L368A/Y407V, 또는
b) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366W
를 포함하고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 교란 돌연변이가 D356K 인 경우에 위치 439 에서 아미노산 잔기 K, 또는
b) 교란 돌연변이가 E357K 인 경우에 위치 370 에서 아미노산 잔기 K, 또는
c) 교란 돌연변이가 K370E 인 경우에 위치 357 에서 아미노산 잔기 E, 또는
d) 교란 돌연변이가 K439E 인 경우에 위치 356 에서 아미노산 잔기 D
를 포함함,
및
ii) 임의로 제 2 항체 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 제 2 CH3 도메인에 대한 C-말단에 위치하는 제 2 표적 또는 제 4 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍, 여기에서 상기 위치는 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인의 상기 쌍의 위치와 무관함,
여기에서 모든 번호 부여는 Kabat EU 지수에 따름.
본 발명의 하나의 양태는 다음을 포함하는 (단리된) 비-공유적 복합체/다합체성 폴리펩티드이다:
다음을 포함하는 제 1 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 1 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 및 b) 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 1 항체 가변 도메인,
및
ii) 제 1 항체 CH3 도메인에 대한 N-말단 또는 제 1 항체 가변 도메인에 대한 C-말단에 위치하는 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍,
다음을 포함하는 제 2 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 2 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 및 b) 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 2 항체 가변 도메인,
여기에서 제 1 항체 가변 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인이거나; 또는 제 1 항체 가변 도메인이 항체 경쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 교란 돌연변이가 D356K 인 경우에 위치 439 에서 아미노산 잔기 K, 또는
b) 교란 돌연변이가 E357K 인 경우에 위치 370 에서 아미노산 잔기 K, 또는
c) 교란 돌연변이가 K370E 인 경우에 위치 357 에서 아미노산 잔기 E, 또는
d) 교란 돌연변이가 K439E 인 경우에 위치 356 에서 아미노산 잔기 D
를 포함함,
및
ii) 임의로 제 2 CH3 도메인에 대한 N-말단 또는 제 2 가변 도메인에 대한 C-말단에서 제 2 표적 또는 제 4 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍, 여기에서 상기 위치는 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인의 상기 쌍의 위치와 무관함,
여기에서 모든 번호 부여는 Kabat EU 지수에 따름.
모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 CH3 도메인 및 제 2 CH3 도메인은 이종이합체 형성을 촉진하기 위해서, 즉, 이하의 섹션 D) 이종이합체화에서 기술하는 바와 같이, 본원에 개시된 아미노산 돌연변이를 포함한다.
모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 CH3 도메인 및 제 2 CH3 도메인은 상기 제 1 CH3 도메인과 상기 제 2 CH3 도메인 사이에 이종이합체 형성을 촉진하기 위해서, 교란 돌연변이와 상이한 추가의 돌연변이를 포함한다.
모든 양태의 하나의 구현예에 있어서,
제 1 CH3 도메인은
a) 돌연변이 T366W, 또는
b) 돌연변이 T366S/L368A/Y407V
를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은
a) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366W 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366S/L368A/Y407V, 또는
b) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366W
를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 다음을 포함하는 (단리된) 비-공유적 복합체/다합체성 폴리펩티드이다:
다음을 포함하는 제 1 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 1 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 및 b) 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 1 항체 가변 도메인,
여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 돌연변이 T366W, 또는 돌연변이 T366S/L368A/Y407V,
및
b) 임의로 돌연변이 Y349C 또는 S354C
를 포함함,
및
ii) 제 1 항체 CH3 도메인에 대한 N-말단 또는 제 1 항체 가변에 대한 C-말단에 위치하는 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍,
다음을 포함하는 제 2 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 2 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 및 b) 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 2 항체 가변 도메인,
여기에서 제 1 항체 가변 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인이거나; 또는 제 1 항체 가변 도메인이 항체 경쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은
a) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366W 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366S/L368A/Y407V, 또는
b) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366W
를 포함하고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 교란 돌연변이가 D356K 인 경우에 위치 439 에서 아미노산 잔기 K, 또는
b) 교란 돌연변이가 E357K 인 경우에 위치 370 에서 아미노산 잔기 K, 또는
c) 교란 돌연변이가 K370E 인 경우에 위치 357 에서 아미노산 잔기 E, 또는
d) 교란 돌연변이가 K439E 인 경우에 위치 356 에서 아미노산 잔기 D
를 포함함,
및
ii) 임의로 제 2 CH3 도메인에 대한 N-말단 또는 제 2 가변 도메인에 대한 C-말단에서 제 2 표적 또는 제 4 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍, 여기에서 상기 위치는 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인의 상기 쌍의 위치와 무관함,
여기에서 모든 번호 부여는 Kabat EU 지수에 따름.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 비-공유 이합체이다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 가변 도메인 및 제 2 가변 도메인은 비-기능성 결합 부위를 연결하고/연결되며, 형성한다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 각각 제 1 CH3 도메인이 제 1 가변 도메인에 대해 C-말단에 위치하는 경우에 제 1 및 제 2 가변 도메인 각각에 대해 N-말단에, 또는 제 1 가변 도메인이 제 1 및 제 2 CH3 도메인에 대해 C-말단에 위치하는 경우에 제 1 및 제 2 CH3 도메인 각각에 대해 N-말단에, 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) 또는 DKTHT (SEQ ID NO: 94) 또는 GGGS (SEQ ID NO: 69) 또는 DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) 를 포함한다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 인간 면역글로불린 G 는 인간 IgG1 또는 인간 IgG2 또는 인간 IgG3 또는 인간 IgG4 이다. 본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 인간 면역글로불린 G 는 인간 IgG1 이다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인은 인간 IgG1 CH3 도메인 또는 인간 IgG2 CH3 도메인 또는 인간 IgG3 CH3 도메인 또는 인간 IgG4 CH3 도메인이다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서,
i) 제 1 CH3 도메인은 돌연변이 T366W 및 위치 439 에서 아미노산 잔기 K 를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 D356K 및 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하거나, 또는
ii) 제 1 CH3 도메인은 돌연변이 T366W 및 위치 370 에서 아미노산 잔기 K 를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 E357K 및 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하거나, 또는
iii) 제 1 CH3 도메인은 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 및 위치 357 에서 아미노산 잔기 E 를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 K370E 및 돌연변이 T366W 를 포함하거나, 또는
iv) 제 1 CH3 도메인은 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 및 위치 356 에서 아미노산 잔기 D 를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 K439E 및 돌연변이 T366W 를 포함한다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1, 제 2 및 제 3 표적은 상이하다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 표적 또는 제 3 표적은 인간 CD3 이다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍은 Fv, scFc, Fab, scFab, dsscFab, CrossFab, 이중특이적 Fab, sdAb, 및 VHH 로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 4 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍은, Fv, scFc, Fab, scFab, dsscFab, CrossFab, 이중특이적 Fab, sdAb, 및 VHH 로 이루어진 군에서 선택되는 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍과 독립적으로 선택된다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함한다:
항체 중쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄 가변 도메인,
인간 면역글로불린 G CH1 도메인 또는 인간 항체 경쇄 불변 도메인,
임의로 추가의 항체 중쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄 가변 도메인, 및 추가의 인간 면역글로불린 G CH1 도메인 또는 인간 항체 경쇄 불변 도메인,
SEQ ID NO: 66 또는 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 69 또는 SEQ ID NO: 77 또는 SEQ ID NO: 75 또는 SEQ ID NO: 76 또는 SEQ ID NO: 79 또는 SEQ ID NO: 97 의 아미노산 서열,
제 1 항체 가변 도메인,
임의로 인간 면역글로불린 G CH2 도메인,
제 1 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
임의로 아미노산 서열 SEQ ID NO: 69 또는 SEQ ID NO: 77 또는 SEQ ID NO: 75 또는 SEQ ID NO: 76 또는 SEQ ID NO: 79,
임의로 Fab 또는 도메인 교환된 Fab 또는 scFv 또는 scFab.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음을 포함한다:
항체 중쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄 가변 도메인,
인간 면역글로불린 G CH1 도메인 또는 인간 항체 경쇄 불변 도메인,
임의로 추가의 항체 중쇄 가변 도메인 또는 항체 경쇄 가변 도메인, 및 추가의 인간 면역글로불린 G CH1 도메인 또는 인간 항체 경쇄 불변 도메인,
SEQ ID NO: 66 또는 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 69 또는 SEQ ID NO: 77 또는 SEQ ID NO: 75 또는 SEQ ID NO: 76 또는 SEQ ID NO: 79 또는 SEQ ID NO: 97 의 아미노산 서열,
임의로 인간 면역글로불린 G CH2 도메인,
제 1 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
제 1 항체 가변 도메인,
임의로 아미노산 서열 SEQ ID NO: 69 또는 SEQ ID NO: 77 또는 SEQ ID NO: 75 또는 SEQ ID NO: 76 또는 SEQ ID NO: 79,
임의로 Fab 또는 도메인 교환된 Fab 또는 scFv 또는 scFab.
본 발명의 하나의 양태는 본 발명에 따른 제 1 다합체성 폴리펩티드 및 본 발명에 따른 제 2 다합체성 폴리펩티드를 포함하는 조성물이고, 여기에서,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 D356K 를 포함하고, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 K439E 를 포함하거나, 또는
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 E357K 를 포함하고, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 K370E 를 포함하고,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인은 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍이고,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 항체 가변 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 가변 도메인은 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍이고,
제 2 및 제 4 표적은 서로 독립적으로 세포 표면 항원이다.
모든 조성물 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 CH3 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 이종이합체 형성을 촉진하기 위해서 동일한 돌연변이를 포함하고, 제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 1 CH3 도메인은 이종이합체 형성을 촉진하기 위해서 동일한 돌연변이를 포함한다.
모든 조성물 양태의 하나의 구현예에 있어서,
제 1 폴리펩티드의 제 1 CH3 도메인은
a) 돌연변이 T366W, 또는
b) 돌연변이 T366S/L368A/Y407V
를 포함하고,
제 1 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은
a) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366W 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366S/L368A/Y407V, 또는
b) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366W
를 포함한다.
본 발명에 따른 하나의 양태는 본 발명에 따른 제 1 다합체성 폴리펩티드 및 본 발명에 따른 제 2 다합체성 폴리펩티드를 포함하는 (약학) 조성물이고,
여기에서,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 CH3 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 모두 돌연변이 T366W 또는 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하고,
여기에서,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 D356K 를 포함하고, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 K439E 를 포함하거나, 또는 그 반대이고,
또는
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 E357K 를 포함하고, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 K370E 를 포함하거나, 또는 그 반대이고,
임의로 여기에서,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인이고,
또는
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인이 항체 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인이고,
여기에서,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인은 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍이고,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 항체 가변 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 항체 가변 도메인은 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍이고,
여기에서,
제 2 및 제 4 표적은 서로 독립적으로 세포 표면 항원이다.
본 발명에 따른 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 표적 또는 제 3 표적은 인간 CD3 이다.
본 발명의 하나의 양태는 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드 또는 (약학) 조성물이다.
본원에서 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드 또는 (약학) 조성물을, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 적어도 부분적으로, 출발 물질로서, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및 항체 중쇄 단편을 포함하는 2/3-IgG 또는 2/3-BiFab 와 같은 비-완전 항체를 사용하여, 반-항체 교환 반응에 의해 다중특이적 항체가 수득될 수 있다는 발견에 기초하며, 여기에서 중쇄-중쇄 상호 작용은 바람직하게는 중쇄 단편에서 비대칭 교란 돌연변이에 의해 불안정화되고, 교란 돌연변이는 한편으로는 출발 비-완전 항체의 해리를 촉진하고, 다른 한편으로는 정확하게 조립된 전체 길이 이중-/다중특이적 항체의 생성을 조장한다. 또한, 이러한 출발 화합물을 사용함으로써, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합이 출발 비-완전 항체로부터 제거되는 경우, 본 발명의 방법은 환원제의 부재하에서도 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (출발 물질의 생성, 뿐만 아니라, 교환 반응 및 다중특이적 항체의 제조가 여전히 효율적으로 작동한다).
보다 상세하게는, 본 발명은, 적어도 부분적으로, 결합 부위의 세포상 활성화와 조합된 다중특이적 항체가 출발 물질로서, 비-완전, 즉, 이중특이적으로 결합하지 않는 항체를 사용하여, 반-항체 교환 반응에 의해 수득될 수 있다는 발견에 기초한다. 출발 분자는 각각 서로 연결되어 이합체/다합체를 형성하는 항체 CH3 도메인의 쌍, 기능성 결합을 형성하지 않는 항체 중쇄 가변 도메인과 항체 경쇄 가변 도메인의 쌍, 생체내에서 세포 표면 표적화를 위한 부위 및 하나 이상의 기능성 결합 부위를 포함한다. 따라서, 상기 CH3 도메인의 쌍은 항체 중쇄의 쌍, 융합 폴리펩티드의 쌍 등과 같은, 보다 커다란 분자의 일부일 수 있다. 본원에서 기술한 바와 같은 변형을 갖는 CH3 도메인의 쌍은 본 발명에 따른 교환 반응에 필요한 최소 구조 요소를 정의한다. 비-완전 출발 항체에 있어서, CH3 도메인은 여전히 서로 연결되어 있으며 (이합체 또는 다합체의 형성을 야기함), 그러나 상기 CH3 도메인의 쌍 사이의 인력은 CH3 도메인 중 하나에만 존재하는 비대칭 교란 (전하) 돌연변이에 의해 감소되고, 즉, 불안정화된다. 각각의 다른 CH3 도메인은 연결된 야생형 CH3 도메인 쌍에서와 같이, 돌연변이된 위치와의 위치 상호 작용에서 야생형 잔기를 여전히 가진다. 상기 교란 돌연변이는 출발 비-완전 항체의 해리를 촉진하고, 제 2/추가의 보다 양호한 일치하는 상보적인 비-완전 항체가 존재하는 경우에만, 정확하게 조립된 완전 이중특이적 항체의 생성을 조장한다. 불안정화된 출발 물질은 i) CH3 도메인 사이에 불안정화 돌연변이의 존재; 및 ii) 출발 비-완전 이중특이적 항체의 폴리펩티드를 포함하는 2 개의 CH3 도메인 사이에 디술피드 결합의 부재에도 불구하고, 세포 배양 상청액으로 단리될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 상기에서 기술한 바와 같은 출발 화합물을 사용함으로써, 교환 반응 및 완전하고 기능적인 이중특이적 항체의 형성이 환원제의 부재하에서 발생하고, 즉, 생체내에서 수행될 수 있다는 추가의 발견에 기초한다. 즉, 출발 분자의 폴리펩티드를 함유하는 CH3 도메인 사이의 디술피드 결합은 필요하지 않다. 따라서, 힌지 영역 디술피드 결합 및 다른 중쇄-중쇄 디술피드 결합은 출발 비-완전 항체로부터 제거될 수 있다.
I. 정의
본원에서 사용되는 바와 같은, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 Kabat, et al., Seqeunces of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 에 기재된 Kabat 번호 부여 시스템에 따라 번호 부여되고, 본원에서 "Kabat 에 따른 번호 부여" 로 지칭된다. 특히, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 의 Kabat 번호 부여 시스템 (647-660 페이지 참조) 은 카파 및 람다 이소타입의 경쇄 불변 도메인 CL에 대해 사용되고, Kabat EU 지수 번호 부여 시스템 (661-723 페이지 참조) 은 불변 중쇄 도메인 (이 경우에 본원에서 "Kabat EU 지수에 따른 번호 부여" 로 지칭하여 더 명확히 되는 CH1, 힌지, CH2 및 CH3) 에 대해 사용된다.
항체의 중쇄에서의 CH3 도메인은, 예를 들어 WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681 에서 몇가지 예로 상세하게 설명되어 있는 "노브-인투-홀" 기술에 의해 변경될 수 있다. 이러한 방법에서, 2 개의 CH3 도메인의 상호 작용 표면은 이들 2 개의 CH3 도메인 및 여기에서 이들을 포함하는 폴리펩티드의 이종이합체화를 증가시키도록 변경된다. (2 개의 중쇄의) 2 개의 CH3 도메인의 각각은 "노브" 일 수 있는 반면, 다른 하나는 "홀" 이다. 디술피드 브릿지의 도입은 이종이합체를 추가로 안정화시키고 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35), 수율을 증가시킨다. 그러나, 이것은 본 발명의 분자에는 존재하지 않는다.
(항체 중쇄의) CH3 도메인에서의 돌연변이 T366W 는 "노브-돌연변이" 또는 "돌연변이 노브" 로서 표시되고, (항체 중쇄의) CH3 도메인에서의 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 는 "홀-돌연변이" 또는 "돌연변이 홀" 로서 표시된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여). 또한, 예를 들어 "노브-돌연변이" ("노브-cys 돌연변이" 또는 "돌연변이 노브-cys" 로서 표시됨) 를 사용하여 S354C 돌연변이를 중쇄의 CH3 도메인에 도입함으로써, 및 "홀-돌연변이" ("홀-cys 돌연변이" 또는 "돌연변이 홀-cys" 로서 표시됨) 를 사용하여 Y349C 돌연변이를 중쇄의 CH3 도메인에 도입함으로써 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여), CH3 도메인 사이의 추가의 사슬간 디술피드 브릿지가 사용될 수 있다 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681). 그러나, 이것은 본 발명의 분자에는 존재하지 않는다.
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 에 제공되어 있다.
본 발명을 수행하는데 유용한 방법 및 기술은, 예를 들어 하기 문헌들에 기재되어 있다: Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987).
재조합 DNA 기술의 사용은 핵산 유도체의 생성을 가능하게 한다. 이러한 유도체는 예를 들어, 치환, 변경, 교환, 결실 또는 삽입에 의해서 각각 또는 몇몇개 뉴클레오티드 위치가 변형될 수 있다. 변형 또는 유도체화는, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발법을 통해서 수행될 수 있다. 이러한 변형은 당업자가 용이하게 수행할 수 있다 (예를 들어, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England 참조).
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같은, 단수형 "한", "하나" 및 "그" 는 달리 명확하게 명시하지 않으면 복수 인용을 포함한다는 것을 주의해야만 한다. 따라서, 예를 들어, "한 세포" 에 대한 언급은 다수의 이러한 세포 및 당업자에게 공지된 이의 균등물 등을 포함한다. 역시, 용어 "한" (또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나" 는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "포함하는", "포괄하는", 및 "가지는" 도 역시 상호 교환적으로 사용될 수 있다는 것에 주의한다.
용어 "MHCFcRP" 는 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이 및 하나 이상의 교란 (즉, 불안정화) 돌연변이를 포함하는 면역글로불린 불변 도메인 3 (CH3) 를 적어도 포함하는 돌연변이된 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 ( m utated h eavy c hain Fc - r egion p olypeptide) 를 의미하며, 이는 야생형 서열과 관련하여 하나의 (즉, 단일 및/또는 추가의) 반발 전하가 도입된다. 즉, MHCFcRP 가 제 2 CH3-도메인 함유 폴리펩티드와 쌍을 이룰 때, 제 2 CH3-도메인은 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 (야생형 면역글로불린에서) 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 교란 돌연변이는 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여) 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택된다. 하나의 바람직한 구현예에 있어서, 교란 돌연변이는 D356K, E357K, K370E, 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택된다.
용어 "BiFab" 는 2 쌍의 V1-C1/V2-C2 를 포함하는 분자를 의미하며, 여기에서 V 는 항체 가변 도메인을 나타내고, C 는 항체 불변 도메인을 나타내며, 이들은 서로 연결되어 있다. 예를 들어, 이러한 쌍은 VH1-CH1/VL1-CL 및 VH2-CH31/VL2-CH32 일 수 있다. 마찬가지로, 용어 "TriFab" 는 3 쌍의 V1-C1/V2-C2 를 포함하는 분자를 의미하며, 여기에서 V 는 항체 가변 도메인을 나타내고, C 는 항체 불변 도메인을 나타내며, 이들은 서로 연결되어 있다. 예를 들어, 이러한 쌍은 VH1-CH1/VL1-CL, VH2-CH1/VL2-CL, 및 VH3-CH31/VL3-CH32 일 수 있다.
용어 "약" 은 이후에 후속되는 수치값의 +/- 20 % 범위를 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, 용어 '약' 은 이후에 후속되는 수치값의 +/- 10 % 범위를 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, 용어 '약' 은 이후에 후속되는 수치값의 +/- 5 % 범위를 의미한다.
용어 "아미노산 치환" 또는 "아미노산 돌연변이" 는 상이한 "대체" 아미노산 잔기로의 사전결정된 부모 아미노산 서열의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 대체를 의미한다. 대체 잔기 또는 잔기들은 "천연 발생 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 코딩됨)일 수 있고 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val) 으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 대체 잔기는 시스테인이 아니다. 하나 이상의 비천연 발생 아미노산 잔기에 의한 치환이 또한 본원에서의 아미노산 치환의 정의에 포괄된다. "비천연 발생 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 사슬 내에 인접한 아미노산 잔기에 공유적으로 결합할 수 있는, 상기 열거된 천연 발생 아미노산 잔기 이외의 잔기를 의미한다. 비천연 발생 아미노산 잔기의 예에는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, aib 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336 에 기술된 것들이 포함된다. 이러한 비천연 발생 아미노산 잔기를 생성시키기 위해서, Noren 등 (Science 244 (1989) 182) 및/또는 Ellman 등 (상동) 의 절차가 사용될 수 있다. 간략하게, 이들 절차는 서프레서 tRNA의 비천연 발생 아미노산 잔기에 의한 화학적 활성화 이후 RNA의 생체외 전사 및 번역을 포함한다. 비천연 발생 아미노산은 또한 펩티드에, 화학적 펩티드 합성 및 재조합적으로 제조된 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 단편과 이들 펩티드의 후속 융합을 통해 통합될 수 있다.
용어 "항체-의존적 세포의 세포 독성 (ADCC)" 은 Fc 수용체 결합에 의해 매개되는 기능이며, 이펙터 세포의 존재하에서 항체 Fc-영역에 의해 매개되는 표적 세포의 용해를 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, ADCC는 이펙터 세포 예컨대 신선하게 단리된 PBMC (말초 혈액 단핵 세포) 또는 단핵구 또는 NK (자연 살해) 세포와 같은 버피 코트로부터 정제된 이펙터 세포의 존재하에서 본원에서 보고하는 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 Fc-영역으로의 표적 발현 적혈구 세포 (예를 들어, 재조합 표적을 발현하는 K562 세포) 의 조제물의 처리에 의해 측정된다. 표적 세포는 Cr-51 로 표지되고, 이후에 본원에서 보고하는 바와 같은 폴리펩티드와 인큐베이션된다. 표지된 세포는 이펙터 세포와 인큐베이션되고 상청액을 방출된 Cr-51 에 대해 분석한다. 대조군은 본원에서 보고하는 바와 같은 폴리펩티드 없이 이펙터 세포와 표적 내피 세포의 인큐베이션을 포함한다. ADCC 를 매개하는 초기 단계를 유도시키는 폴리펩티드의 능력은 Fcγ 수용체 발현 세포, 예컨대 FcγRI 및/또는 FcγRIIA를 재조합적으로 발현하는 세포 또는 NK 세포 (본질적으로 FcγRIIIA를 발현함) 와의 결합을 측정하여 조사된다. 하나의 바람직한 구현예에 있어서, NK 세포 상의 FcγR과의 결합이 측정된다.
용어 "CH1 도메인" 은 대략 EU 위치 118 에서 EU 위치 215 (EU 번호 부여 시스템) 로 연장된 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부분을 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, CH1 도메인은
의 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "CH2 도메인" 은 대략 EU 위치 231 에서 EU 위치 340 (Kabat 에 따른 EU 번호 부여 시스템) 으로 연장된 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부분을 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, CH2 도메인은
의 아미노산 서열을 포함한다. CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍형성하지 않는다는 점에서 독특하다. 대신에, 2 개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬이 온전한 천연 Fc-영역의 2 개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 탄수화물은 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대체물을 제공할 수 있고 CH2 도메인을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있을 것으로 추측되었다. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206.
용어 "CH3 도메인" 은 대략 EU 위치 341 에서 EU 위치 446 으로 확장된 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부분을 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, CH3 도메인은
의 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "포함하는" 은 또한 용어 "이루어지는" 을 포함한다.
용어 "보체-의존적 세포 독성 (CDC)" 은 보체의 존재하에서 본원에서 보고되는 바와 같은 항체의 Fc-영역에 의해 유도되는 세포의 용해를 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, CDC 는 보체의 존재하에서 본원에서 보고되는 바와 같은 폴리펩티드로 표적 발현 인간 내피 세포를 처리하여 측정된다. 하나의 구현예에 있어서, 세포는 칼세인으로 표지화된다. CDC 는, 폴리펩티드가 30 ㎍/mL 의 농도에서 20 % 또는 그 이상의 표적 세포의 용해를 유도하면 확인된다. 보체 인자 C1q 와의 결합은 ELISA 로 측정할 수 있다. 이러한 분석에 있어서, 이론적으로 ELISA 플레이트는 폴리펩티드의 농도 범위로 코팅되고, 여기에서 정제된 인간 C1q 또는 인간 혈청을 첨가한다. C1q 결합은 C1q 에 대해 유도된 항체, 이후 퍼옥시다아제-표지된 접합체에 의해 검출된다. 결합의 검출 (최대 결합 Bmax) 은 퍼옥시다아제 기질 ABTS® (2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-술포네이트]) 에 대한 405 nm (OD405) 에서의 광학 밀도로서 측정된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는" 과 같은 이의 문법적 변형) 는 치료되는 개체의 자연 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 의미하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안에 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는, 비제한적으로, 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질환의 진행 속도의 감소, 질환 상태의 경감 또는 완화, 및 관해 또는 예후의 개선을 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 본원에서 보고되는 바와 같은 항체는 질환의 전개를 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추기 위해서 사용된다.
"이펙터 기능" 은 항체의 Fc-영역에 기인하는 그들의 생물학적 활성을 의미하고, 이것은 그것이 유래되는 항체 클래스에 따라 다양하다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포 독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포 독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B-세포 활성화를 포함한다.
Fc 수용체 결합 의존적 이펙터 기능은 조혈 세포 상의 특수화된 세포 표면 수용체인, Fc 수용체 (FcR) 와 항체의 Fc-영역의 상호 작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하고, 항체-의존적 세포 매개된 세포 독성 (ADCC) 을 통해, 적혈구 및 Fc-영역을 제시하는 다양한 다른 세포 표적 (예를 들어, 종양 세포) 의 용해, 및 면역 복합체의 식균 작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거 둘 모두를 매개하는 것으로 확인되었다 (예를 들어, Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524 참조). FcR 은 면역글로불린 이소타입에 대한 그들의 특이성으로 정의되고: IgG 유형 Fc-영역에 대한 Fc 수용체를 FcγR 로 지칭한다. Fc 수용체 결합은, 예를 들어 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248 에 기술되어 있다.
IgG 유형 항체의 Fc-영역에 대한 수용체 (FcγR) 의 가교는 식균 작용, 항체-의존적 세포의 세포 독성, 및 염증성 매개 인자의 방출을 비롯하여, 면역 복합체 청소 및 항체 생산의 조절을 포함하는 광범위하게 다양한 이펙터 기능을 촉발시킨다. 인간에서, 3 가지 클래스의 FcγR 이 특징 규명되었고, 다음과 같다:
- FcγRI (CD64) 은 높은 친화성으로 단량체 IgG 에 결합하고 마크로파지, 단핵구, 호중구 및 호산구 상에서 발현된다. Fc-영역 IgG 에서 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329 (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호 부여) 중 적어도 하나의 변형은 FcγRI 와의 결합을 감소시킨다. IgG1 및 IgG4 로 치환된 위치 233-236 의 IgG2 잔기는 FcγRI 와의 결합을 103 배 만큼 감소시켰고 항체-감작된 적혈 세포에 대한 인간 단핵구 반응을 제거시켰다 (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).
- FcγRII (CD32) 는 중간 내지 낮은 친화성으로 복합 IgG 에 결합하고 광범위하게 발현된다. 이러한 수용체는 2 개의 아형, FcγRIIA 및 FcγRIIB 로 분류될 수 있다. FcγRIIA 는 사멸에 관여되는 많은 세포 (예를 들어, 마크로파지, 단핵구, 호중구) 상에서 발견되며 사멸 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRIIB 는 억제 과정에서 역할을 하는 것으로 보이고 B 세포, 마크로파지 및 비만 세포 및 호산구 상에서 발견된다. B 세포 상에서, 이것은 추가의 면역글로불린 생산 및 예를 들어 IgE 클래스로의 이소타입 전환을 억제하는 기능을 하는 것으로 보인다. 마크로파지 상에서, FcγRIIB 는 FcγRIIA 를 통한 매개로서 식균 작용을 억제하는 작용을 한다. 호산구 및 비만 세포 상에서, B-형태는 이의 별개 수용체와 IgE 결합을 통해서 이들 세포의 활성화를 억제하는데 도움을 줄 수 있다. FcγRIIA 에 대한 감소된 결합이 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292, 및 K414 (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호 부여) 중 적어도 하나에 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체에서 발견된다.
- FcγRIII (CD16) 은 중간 내지 낮은 친화성으로 IgG 에 결합하고 2개의 유형으로서 존재한다. FcγRIIIA 는 NK 세포, 마크로파지, 호산구 및 일부 단핵구 및 T-세포 상에서 발견되며 ADCC 를 매개한다. FcγRIIIB 는 호산구 상에서 고도로 발현된다. FcγRIIIA 에 대한 감소된 결합은 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376 (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호 부여) 중 적어도 하나에 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체에 대해서 확인된다.
Fc 수용체에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위의 맵핑, 상기 언급된 돌연변이 부위 및 FcγRI 및 FcγRIIA 와의 결합 측정 방법은 Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 에 기술되어 있다.
용어 "힌지 영역" 은 야생형 항체 중쇄에서, CH1 도메인 및 CH2 도메인을 연결하는, 예를 들어 Kabat 의 EU 번호 체계에 따라서 약 위치 221 에서 약 위치 230 까지, 또는 Kabat 의 EU 번호 체계에 따라서 약 위치 226 에서 약 위치 230 까지의 항체 중쇄 폴리펩티드의 일부분을 의미한다. 다른 IgG 서브클래스의 힌지 영역은 IgG1 서브클래스 서열의 힌지-영역 시스테인 잔기와의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
힌지 영역은 통상적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 폴리펩티드로 이루어진 이합체성 분자이다. 힌지 영역은 통상적으로 아미노산 서열 DKTHTCPXCP (SEQ ID NO: 30) (X 는 S 또는 P 이다), 또는 HTCPXCP (SEQ ID NO: 31) (X 는 S 또는 P 이다), 또는 CPXCP (SEQ ID NO: 32) (X 는 S 또는 P 이다) 를 가진다.
하나의 구현예에 있어서, 힌지 영역은 내부 디술피드 결합을 갖지 않는다. 이것은, SEQ ID NO: 32 (및 마찬가지로, SEQ ID NO: 30 및 31) 의 서열에서의 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환함으로써, 또는 CPXC 스트레치 (SEQ ID NO: 95) 를 SEQ ID NO: 30, 31 또는 32 의 힌지 영역으로부터 결실시킴으로써 달성된다.
용어 "펩티드 링커" 는 천연 및/또는 합성 기원의 링커를 의미한다. 펩티드 링커는 아미노산의 선형 사슬로 이루어지며, 여기에서 20 개의 천연 발생 아미노산은 펩티드 결합에 의해 연결된 단량체 빌딩 블록이다. 이 사슬은 1 내지 50 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 28 개의 아미노산 잔기, 특히 바람직하게는 3 내지 25 개의 아미노산 잔기의 길이를 가진다. 펩티드 링커는 천연 발생 폴리펩티드의 서열 또는 반복적인 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 펩티드 링커는 융합 폴리펩티드의 도메인이, 이 도메인이 올바르게 폴딩될 수 있고 적절하게 존재할 수 있도록 함으로써 그들의 생물학적 활성을 수행할 수 있도록 보장하는 기능을 가진다. 바람직하게는, 펩티드 링커는 글리신, 글루타민, 및/또는 세린 잔기가 풍부하도록 지정된 "합성 펩티드 링커" 이다. 이들 잔기는 예를 들어, 최대 5 개의 아미노산의 작은 반복 단위, 예컨대 GGGS (SEQ ID NO: 69), GGGGS (SEQ ID NO: 70), QQQG (SEQ ID NO: 71), QQQQG (SEQ ID NO: 72), SSSG (SEQ ID NO: 73) 또는 SSSSG (SEQ ID NO: 74) 로 배열된다. 이러한 소형 반복 단위는 다합체 단위, 예를 들어 (GGGS)2 (SEQ ID NO: 75), (GGGS)3 (SEQ ID NO: 76), (GGGS)4 (SEQ ID NO: 77), (GGGS)5 (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 79), (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 80), 또는 (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 81) 를 형성하도록 2 회 내지 5 회 반복될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO: 69 내지 82 의 링커의 군에서 선택된다. 하나의 구현예에 있어서, 각각의 펩티드 링커는 SEQ ID NO: 69 내지 82 로 이루어진 링커의 군에서 서로 독립적으로 선택된다. 하나의 바람직한 구현예에 있어서, 펩티드 링커/각각의 펩티드 링커는 SEQ ID NO: 75 내지 81 로 이루어진 링커의 군에서 (서로 독립적으로) 선택된다. 다합체 단위의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단에서, 최대 6 개의 추가적인 임의의, 천연 발생 아미노산이 첨가될 수 있다. 다른 합성 펩티드 링커는 예를 들어 링커 GSSSSSSSSSSSSSSSG (SEQ ID NO: 82) 에서의 세린처럼, 10 회 내지 20 회 반복되는 단일 아미노산으로 구성되고, 아미노-말단 및/또는 카복시-말단에, 최대 6 개의 추가적인 임의의 천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 모든 펩티드 링커는 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있으며 따라서 재조합적으로 발현될 수 있다. 링커는 그 자체가 펩티드이므로, 항융합성 펩티드가 2 개의 아미노산 사이에 형성되는 펩티드 결합에 의해 링커에 연결된다.
"항체 단편" 은 미손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 미손상 항체의 일부를 포함하는 미손상 항체 외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fv, scFv, Fab, scFab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 비제한적으로 포함한다. 특정 항체 단편의 검토를 위해서는, Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 를 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해서는, 예를 들어 Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315; 또한 WO 93/16185; US 5,571,894 및 US 5,587,458 을 참조한다.
디아바디는 2 가 또는 이중특이적일 수 있는 2 개의 항원-결합 위치를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134) 에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, US 6,248,516 참조).
항체 단편은 미손상 항체의 단백질분해 소화 뿐 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 대장균 (E. coli) 또는 파지) 에 의한 생성을 비제한적으로 포함하는 각종 기법에 의해 만들어질 수 있다.
용어 "항체 단편" 은 또한 2 개의 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 (Dual Acting) Fab" 또는 "DAF" 를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
"단일특이적 항체" 는 하나의 항원에 대해 단일 결합 특이성을 갖는 항체를 의미한다. 단일특이적 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2) 또는 이의 조합 (예를 들어, 전체 길이 항체 + 추가의 scFv 또는 Fab 단편) 으로서 제조될 수 있다.
"다중특이적 항체" 는 동일한 항원 또는 2 개의 상이한 항원 상의 2 개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체를 의미한다. 다중특이적 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체) 또는 이의 조합 (예를 들어, 전체 길이 항체 + 추가의 scFv 또는 Fab 단편) 으로서 제조될 수 있다. 또한, 2 개, 3 개 또는 그 이상 (예를 들어, 4 개) 의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 보고되어 있다 (예를 들어, US 2002/0004587 A1 참조). 하나의 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이합체성 분자를 제조하기 위한 정전 스티어링 효과를 조작함으로써 제조될 수 있다 (WO 2009/089004).
용어 "∼ 와의 결합" 은 이의 표적에 대한 결합 부위의 결합, 예를 들어 개별 항원에 대한 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 결합 부위의 결합을 의미한다. 이러한 결합은, 예를 들어 BIAcore® 어세이 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 를 사용하여 결정할 수 있다. 즉, 용어 "(항원에) 결합" 은 생체외 분석에서의 항체의 결합을 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, 결합은, 항체가 표면에 결합되고 항체에 대한 항원의 결합이 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 측정되는 결합 분석에서 결정된다. 결합은, 예를 들어 10-8 M 이하, 일부 구현예에 있어서 10-13 내지 10-8 M, 일부 구현예에 있어서 10-13 내지 10-9 M 의 결합 친화성 (KD) 을 의미한다. 용어 "결합" 은 또한 용어 "특이적으로 결합" 을 포함한다.
결합은 BIAcore 어세이 (GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에 의해 조사될 수 있다. 결합의 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터 항체의 결합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수), 및 KD (kd/ka) 로 정의된다.
예를 들어, BIAcore® 어세이의 하나의 가능한 구현예에 있어서, 항원은 표면에 결합되고 항체 결합 부위의 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 으로 측정된다. 결합의 친화성은 용어 ka (결합 상수: 복합체를 형성하는 결합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수: 복합체의 해리에 대한 속도 상수), 및 KD (kd/ka) 로 정의된다. 대안적으로, SPR 센서그램의 결합 신호는 공명 신호 높이 및 해리 거동에 대해서, 기준 반응 신호와 직접적으로 비교할 수 있다.
용어 "결합 부위" 는 표적에 대해 결합 특이성을 나타내는 임의의 단백질성 엔터티를 의미한다. 이것은, 예를 들어 수용체, 수용체 리간드, 안티칼린, 애피바디, 항체 등일 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "결합 부위" 는, 제 2 폴리펩티드에 의해 특이적으로 결합하거나 또는 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 하나의 구현예에 있어서, 결합 부위는 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 가변 도메인의 쌍, 수용체 또는 이의 기능성 단편, 수용체 리간드 또는 이의 기능성 단편, 효소 또는 이의 기질로 이루어진 폴리펩티드의 군에서 선택된다.
항체의 경우에 있어서, 결합 부위는 3 개 이상의 HVR (예를 들어, VHH 의 경우) 또는 6 개의 HVR (예를 들어, 자연 발생, 즉, 천연 항체의 경우) 을 포함한다. 일반적으로, 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기는 결합 부위를 형성하고 있다. 이들 잔기는 통상적으로 항체 중쇄 가변 도메인 및 동족 항체 경쇄 가변 도메인의 쌍에 함유된다. 항체의 항원-결합 부위는 "초가변 영역" 또는 "HVR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은, 본원에서 정의하는 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 영역 FR1, HVR1/CDR1, FR2, HVR2/CDR2, FR3, HVR3/CDR3, 및 FR4 (면역글로불린 프레임워크) 를 포함한다. 특히, 중쇄 가변 도메인의 HVR3/CDR3 영역은, 항원 결합에 가장 기여하고 항체의 결합 특이성을 정의하는 영역이다. "기능성 결합 부위" 는 이의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 용어 "특이적으로 결합" 은 생체외 분석에서, 하나의 구현예에 있어서 결합 분석에서, 이의 표적에 대한 결합 부위의 결합을 의미한다. 이러한 결합 분석은 결합 이벤트가 검출될 수 있는 한, 임의의 분석일 수 있다. 예를 들어, 항체가 표면에 결합하고 항원이 항체에 결합하는 분석은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 측정된다. 대안적으로, 브릿징 ELISA 가 사용될 수 있다. 결합은 10-8 M 이하, 일부 구현예에 있어서 10-13 내지 10-8 M, 일부 구현예에 있어서 10-13 내지 10-9 M 의, 이의 표적에 대한 항체 (결합제) 로부터의 결합 친화성 (KD) 을 의미한다.
항체의 "클래스" 는, 이의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 5 가지 주요 클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 이 있으며, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가로 나뉠 수 있다 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, β, ε, γ, 및 μ 으로 불린다.
용어 "Fc-영역" 은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 나타낸다. 하나의 구현예에 있어서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Asp221 로부터, 또는 Cys226 으로부터, 또는 Pro230 으로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 리신 (Lys447) 은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. Fc-영역은, 사슬 사이의 디술피드 결합을 형성하는 힌지 영역 시스테인 잔기를 통해 서로 공유적으로 연결될 수 있는 2 개의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드로 구성된다.
본원에서 보고되는 바와 같은 다합체성 폴리펩티드/결합제는 완전한 Fc-영역, 하나의 구현예에 있어서, 인간 기원으로부터 유래된, 그러나 힌지 영역 시스테인 잔기는 갖지 않는 Fc-영역을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, Fc-영역은 인간 불변 영역의 모든 부분을 포함하지만, 힌지 영역 시스테인 잔기는 갖지 않는다. 항체의 Fc-영역은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관여한다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 특정한 조건에 의존하는 반면, C1q 와의 결합은 Fc-영역에서의 정의된 결합 부위에 의해 야기된다. 이러한 결합 부위는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434 에 기재되어 있다. 이러한 결합 부위는, 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호 부여) 이다. 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3 의 항체는 통상적으로 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내는 반면, IgG4 는 보체 시스템을 활성화시키지 않고, C1q 에 결합하지 않으며, C3 을 활성화시키지 않는다. "항체의 Fc-영역" 은 당업자에게 충분히 공지된 용어이며, 항체의 파파인 절단을 기반으로 정의된다. 하나의 구현예에 있어서, Fc-영역은 인간 Fc-영역이다. 하나의 구현예에 있어서, Fc-영역은 돌연변이 S228P 및/또는 L235E (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호 부여) 를 포함하는 인간 IgG4 서브클래스의 것이다. 하나의 구현예에 있어서, Fc-영역은 돌연변이 L234A 및 L235A 및 임의로 P329G (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호 부여) 를 포함하는 인간 IgG1 서브클래스의 것이다.
용어 "전체 길이 항체" 는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 나타낸다. 전체 길이 항체는 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 각각 포함하는 2 개의 전체 길이 항체 경쇄, 및 중쇄 가변 도메인, 제 1 불변 도메인, 힌지 영역, 제 2 불변 도메인 및 제 3 불변 도메인을 각각 포함하는 2 개의 전체 길이 항체 중쇄를 포함한다. 전체 길이 항체는 추가의 도메인, 예를 들어 전체 길이 항체의 사슬 중 하나 이상에 접합된 추가의 scFv 또는 scFab 를 포함할 수 있다. 이들 접합체는 또한 용어 전체 길이 항체에 의해 포함된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물" 은 상호 교환적으로 사용되고, 그러한 세포의 자손을 포함하여, 외생성 핵산이 도입된 세포를 의미한다. 숙주 세포는 초대 형질 전환된 세포 및 계대수와 무관하게 그로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질 전환체" 및 "형질 전환된 세포" 를 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 내용물이 완전하게 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래의 형질 전환된 세포에서 스크리닝 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에서 포함된다.
용어 "유래된" 은, 변이체 아미노산 서열이 하나 이상의 위치에서 변형/돌연변이를 도입함으로써 부모 아미노산 서열로부터 수득되는 것을 나타낸다. 따라서, 유래된 아미노산 서열은 하나 이상의 상응하는 위치에서 상응하는 부모 아미노산 서열과 상이하다. 하나의 구현예에 있어서, 부모 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 상응하는 위치에서 1 내지 15 개의 아미노산 잔기가 상이하다. 하나의 구현예에 있어서, 부모 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 상응하는 위치에서 1 내지 10 개의 아미노산 잔기가 상이하다. 하나의 구현예에 있어서, 부모 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 상응하는 위치에서 1 내지 6 개의 아미노산 잔기가 상이하다. 마찬가지로, 유래된 아미노산 서열은 이의 부모 아미노산 서열과 높은 아미노산 서열 동일성을 가진다. 하나의 구현예에 있어서, 부모 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 80 % 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 하나의 구현예에 있어서, 부모 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 90 % 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 하나의 구현예에 있어서, 부모 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 95 % 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진다.
하나의 구현예에 있어서, 하나 또는 둘 모두의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 01 의 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유래되고, SEQ ID NO: 01 의 Fc-영역 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이 또는 결실을 가진다. 하나의 구현예에 있어서, Fc-영역 폴리펩티드는 약 1 내지 약 10 개의 아미노산 돌연변이 또는 결실을 포함하고/가지며, 하나의 구현예에 있어서, 약 1 내지 약 5 개의 아미노산 돌연변이 또는 결실을 포함한다/가진다. 하나의 구현예에 있어서, Fc-영역 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 01 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드와 약 80 % 이상의 상동성을 가진다. 하나의 구현예에 있어서, Fc-영역 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 01 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드와 약 90 % 이상의 상동성을 가진다. 하나의 구현예에 있어서, Fc-영역 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 01 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드와 약 95 % 이상의 상동성을 가진다.
SEQ ID NO: 01, 또는 02, 또는 03, 또는 04 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 함유되는 아미노산 변형에 의해 추가로 정의된다. 따라서, 예를 들어, 용어 P329G 는 SEQ ID NO: 01, 또는 02, 또는 03, 또는 04 의 인간 Fc-영역 폴리펩티드에 비해, 아미노산 위치 329 에서 프롤린의 글리신으로의 돌연변이를 갖는 인간 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유래된 Fc-영역 폴리펩티드를 나타낸다.
인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
하기의 Fc-영역은 야생형 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 변이체이다.
돌연변이 L234A, L235A 를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
L234A, L235A 돌연변이 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
L234A, L235A 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
P329G 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
L234A, L235A 돌연변이 및 P329G 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
P329G 돌연변이 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
P329G 돌연변이 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
L234A, L235A, P329G 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
L234A, L235A, P329G 돌연변이 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
하기의 Fc-영역은 야생형 인간 IgG4 Fc-영역으로부터 유래된 변이체이다.
S228P 및 L235E 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
S228P, L235E 돌연변이 및 P329G 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
S228P, L235E 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
S228P, L235E 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
P329G 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
P329G 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
P329G 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
S228P, L235E, P329G 및 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
S228P, L235E, P329G 및 S354C, T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 유래된 Fc-영역 폴리펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
"인간화" 항체는 비인간 HVR 유래의 아미노산 잔기 및 인간 FR 유래의 아미노산 잔기를 포함하는 항체를 의미한다. 특정한 구현예에 있어서, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2 개의 가변 도메인 중 실질적으로 전부를 포함하게 될 것이며, 여기에서 HVR (예를 들어, CDR) 의 전체 또는 실질적으로 전체는 비인간 항체의 것에 해당되며, FR 의 전체 또는 실질적으로 전체는 인간 항체의 것에 해당된다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래되는 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 거친 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열이 초가변성 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 이고/이거나 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프") 를 형성하고/하거나, 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉부") 를 함유하는, 아미노산 잔기 스트레치를 포함하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 의미한다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR 을 포함하는데, 3 개는 중쇄 가변 도메인 VH (H1, H2, H3) 에 존재하고, 3 개는 경쇄 가변 도메인 VL (L1, L2, L3) 에 존재한다.
HVR 은
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에 존재하는 초가변 루프 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3) 에 존재하는 CDR (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3) 에 존재하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3) 를 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c) 의 조합
을 포함한다.
달리 표시하지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 Kabat 등 (상동) 에 따라서 본원에서 번호 부여된다.
용어 "경쇄" 는 천연 IgG 항체의 보다 짧은 폴리펩티드 사슬을 의미한다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 불리는 2 가지 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 대해서는 SEQ ID NO: 33, 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인에 대해서는 SEQ ID NO: 34 를 참조한다.
용어 "파라토프" 는 표적과 결합 부위 사이의 특이적 결합에 요구되는 소정의 항체 분자의 부분을 의미한다. 파라토프는 연속적일 수 있고, 즉, 결합 부위에 존재하는 인접한 아미노산 잔기에 의해 형성될 수 있거나, 또는 불연속적일 수 있으며, 즉, HVR/CDR 의 아미노산 서열에서 처럼, 1 차 서열에서 순차적으로 상이한 위치에 있지만, 결합 부위가 채택하는 3 차 구조에서 밀접하게 가까운 아미노산 잔기에 의해 형성될 수 있다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에 있어서, 항체는, 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 맞춤법 (IEF), 모세관 전기영동, CE-SDS) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 결정시, 95 % 또는 99 % 를 초과하는 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 고찰을 위해서는, 예를 들어 Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87 을 참조한다.
"단리된" 핵산은 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산은 대개는 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 이의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "단일 클론 항체" 는 실질적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 수득된 항체를 의미하고, 즉, 그 개체군을 포함하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하지만, 천연 발생 돌연변이를 함유하거나 또는 단일 클론 항체 제제의 제조 동안에 발생되는 가능한 변이체 항체는 예외적이며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정부 (에피토프) 에 대하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단일 클론 항체 제제의 각각의 단일 클론 항체는 항원 상의 단일 결정부에 대해 유도된다. 따라서, 한정어 "단일 클론" 은 실질적으로 균질한 항체 개체군으로부터 수득되는 항체의 특징을 의미하며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석하지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용되는 단일 클론 항체는 비제한적으로, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자 이식 동물을 이용하는 방법을 포함하여, 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단일 클론 항체를 제조하기 위한 이러한 방법 및 다른 예시적인 방법은 본원에서 기술된다.
"천연 항체" 는 다양한 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 의미한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사합체성 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역 (VH) 과 후속하여 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3) 을 가진다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역 (VL) 과 후속하여 불변 경쇄 (CL) 도메인을 가진다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 라고 불리는 2 개의 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "약학 제제" 는 그에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태이고, 제제가 투여되는 대상에게 허용 불가능하게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체" 는 활성 성분 이외에, 대상에게 무해한 약학 제제 중의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로, 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "재조합 항체" 는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체 (키메라, 인간화 및 인간) 를 의미한다. 이것은 NS0, HEK, BHK 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포로 형질 전환된 재조합 발현 플라스미드를 사용하여 발현된 항체를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "가" 는 (항체) 분자에서의 특정한 수의 결합 부위의 존재를 의미한다. 이와 같이, 용어 "2 가", "4 가", 및 "6 가" 는 각각 (항체) 분자에서의 2 개의 결합 부위, 4 개의 결합 부위, 및 6 개의 결합 부위의 존재를 의미한다. 본원에서 보고되는 바와 같은 이중특이적 항체는 하나의 바람직한 구현예에 있어서 "3 가" 이다. 본원에서 보고되는 바와 같은 삼중특이적 항체는 하나의 바람직한 구현예에 있어서 "3 가" 이다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체와 이의 항원과의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 유전적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 프레임 영역 (FR) 및 3 개의 초가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해서 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628 참조.
용어 "변이체" 는 부모 분자의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 분자를 의미한다. 전형적으로, 이러한 분자는 하나 이상의 변경, 삽입, 또는 결실을 가진다. 하나의 구현예에 있어서, 변형된 항체 또는 변형된 융합 폴리펩티드는, 자연적으로 발생하지 않는 Fc-영역의 적어도 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 분자는 Fc-영역의 부모 도메인과 100 % 미만의 서열 동일성을 가진다. 하나의 구현예에 있어서, 변이체는 부모 도메인 또는 Fc-영역의 아미노산 서열과 약 75 % 내지 100 % 미만, 특히 약 80 % 내지 100 % 미만, 특히 약 85 % 내지 100 % 미만, 특히 약 90 % 내지 100 % 미만, 및 특히 약 95 % 내지 100 % 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다. 하나의 구현예에 있어서, 부모 도메인 또는 Fc-영역 및 변이체 도메인 또는 Fc-영역은 1 개 (단일), 2 개 또는 3 개의 아미노산 잔기가 상이하다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "도메인 교차" 는 항체 중쇄 VH-CH1 단편 및 이의 상응하는 동족 항체 경쇄의 쌍에서, 즉 항체 결합 아암 (arm) (즉, Fab 단편) 에서, 도메인 서열은 적어도 하나의 중쇄 도메인이 이의 상응하는 경쇄 도메인에 의해 치환되고 그 반대의 경우이기도 하다는 점에서 도메인 서열이 천연 서열로부터 벗어나는 것을 의미한다. 3 가지 일반적인 유형의 도메인 교체가 존재하는데, (i) VL-CH1 도메인 서열을 갖는 도메인 교차 경쇄 및 VH-CL 도메인 서열을 갖는 도메인 교차 중쇄 단편 (또는 VH-CL-힌지-CH2-CH3 도메인 서열을 갖는 전체 길이 항체 중쇄) 을 야기시키는 CH1 및 CL 도메인의 교차, (ii) VH-CL 도메인 서열을 갖는 도메인 교차 경쇄 및 VL-CH1 도메인 서열을 갖는 도메인 교차 중쇄 단편을 야기시키는 VH 및 VL 도메인의 도메인 교차, 및 (iii) VH-CH1 도메인 서열을 갖는 도메인 교차 경쇄 및 VL-CL 도메인 서열을 갖는 도메인 교차 중쇄 단편을 야기시키는 완전한 경쇄 (VL-CL) 및 완전한 VH-CH1 중쇄 단편의 도메인 교차 ("Fab 교차") 가 있다 (모든 상기에 언급된 도메인 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 표시됨).
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 상응하는 중쇄 및 경쇄 도메인에 대하여 "서로 대체되는" 은 상기 언급된 도메인 교차를 의미한다. 이와 같이, CH1 및 CL 도메인이 "서로 대체되는" 경우, 이것은 항목 (i) 및 최종 중쇄 및 경쇄 도메인 서열 하에서 언급된 도메인 교차를 의미한다. 따라서, VH 및 VL 이 "서로 대체되는" 경우에, 이것은 항목 (ii) 하에 언급된 도메인 교차를 의미하고, CH1 및 CL 도메인이 "서로 대체되고", VH1 및 VL 도메인이 "서로 대체되는" 경우, 이것은 항목 (iii) 하에 언급된 도메인 교차를 의미한다. 도메인 교차를 포함하는 이중특이적 항체는, 예를 들어 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 및 Schaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192 에 보고되어 있다.
본원에서 보고되는 바와 같은 방법으로 제조된 다중특이적 항체는 또한 상기 항목 (i) 하에 언급된 바와 같은 CH1 및 CL 도메인의 도메인 교차, 또는 상기 항목 (ii) 하에 언급된 VH 및 VL 도메인의 도메인 교차를 포함하는 Fab 단편을 포함할 수 있다. 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 단편은 동일한 도메인 서열의 것이도록 제작된다. 그러므로, 도메인 교차가 있는 하나를 초과하는 Fab 단편이 다중특이적 항체에 함유되는 경우에, 상기 Fab 단편은 동일한 항원에 특이적으로 결합한다.
II. 본 발명에 따른 교환 반응에 의한 이중-/다중특이적 항체의 생성
A) 단일특이적 1 가 IgG 유도체를 이중특이적 2 가 IgG 로 전환시키는 방법
하기에서 기술하는 바와 같은 교환 방법은 단일특이적 (1 가) 항체 또는 항체 단편을 2 가 이중특이적 항체 (bsAb) 로, 또는 이미 다중특이적인 항체를 보다 고차의 다중특이적 항체, 예를 들어 삼중- 또는 사중특이적 항체에서의 이중특이적 항체로 전환시키는 것을 달성할 수 있다.
2 개의 비-기능적 반-항체 (즉, 세포 표적에 대해 오직 단일특이적) 는 출발 물질로서 사용된다. 예시적으로, 2/3-IgG 가 사용될 수 있다. 2/3-IgG 는 제 1 세트의 노브-인투-홀 (KiH) 돌연변이를 갖는 중쇄, 이에 상보적인 경쇄, 및 Fc-영역으로 구성되며, 이는 각각의 상보적인 제 2 세트의 노브-인투-홀 돌연변이에 의해 중쇄의 Fc-영역에 상보적이게 된다. 상보적 Fc-영역은, 예를 들어 Fc-영역 중쇄 단편 또는 제 2 중쇄 (임의로 결합 특이성을 갖지 않음) 일 수 있다. 원하는 이중-(다중-)특이적 항체의 정확한 조립을 추가로 촉진하기 위해서, 상보적 Fc-영역은 제 2 의 상보적 세트의 KiH 돌연변이 이외에, 추가의 교란 (불안정화) 반발 전하 돌연변이를 포함한다. 추가로, 상보적 Fc-영역은 이의 생성 후에, 바람직하지 않은 추출물 및 부산물의 효율적인 제거를 위해 친화성 태그 (예를 들어, His6 또는 C-Tag) 를 포함할 수 있다. 제 2 의 비-기능적 단일특이적 항체는 상보적 교란 돌연변이를 포함한다. 이들 2 개의 교란 돌연변이는, 항체-반이 예를 들어 상호 작용시에 서로 교환되면 인력 돌연변이로 변하며, 세포 표면 상에 결합하고 있다.
본 발명에 따른 다합체성 분자로 수행될 수 있는 세포상 교환 반응/방법은 다음의 단계를 포함한다:
- 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 제 1 (출발) 다합체성 폴리펩티드 및 제 3 폴리펩티드 및 제 4 폴리펩티드를 포함하는 제 2 (출발) 다합체성 폴리펩티드를 세포의 표면 상에 근접시켜 제 2 및 제 3 폴리펩티드를 교차 교환하여, 제 3 다합체성 폴리펩티드 (제 1 및 제 4 폴리펩티드를 포함) 및 제 4 다합체성 폴리펩티드 (제 2 및 제 3 폴리펩티드를 포함) 를 형성하는 단계,
여기에서,
i) 제 2 폴리펩티드는, 제 2 폴리펩티드에서의 상기 돌연변이를 제외하고, 상기 제 1 다합체성 폴리펩티드와 동일한 (다합체성) 폴리펩티드와 비교하여, 제 1 다합체성 폴리펩티드의 불안정화를 야기하는 (제 1 교란) 돌연변이를 포함하고,
ii) 제 3 폴리펩티드는, 제 3 폴리펩티드에서의 상기 돌연변이를 제외하고, 상기 제 2 (다합체성) 폴리펩티드와 동일한 다합체성 폴리펩티드와 비교하여, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 불안정화를 야기하는 (제 2 교란) 돌연변이를 포함하고,
iii) 제 2 폴리펩티드에서의 (제 1 교란) 돌연변이 및 제 3 폴리펩티드에서의 (제 2 교란) 돌연변이는 제 1 (출발) 다합체성 폴리펩티드 및/또는 제 2 (출발) 다합체성 폴리펩티드와 비교하여, 상기 제 2 폴리펩티드 및 상기 제 3 폴리펩티드를 포함하는 제 3 (교환된) 다합체성 폴리펩티드의 안정화를 야기하고,
iv) 제 4 (교환된) 다합체성 폴리펩티드는 제 1 (출발) 다합체성 폴리펩티드 및/또는 제 2 (출발) 다합체성 폴리펩티드와 비교하여, 보다 안정하고,
v) 제 1 다합체성 폴리펩티드 및 제 2 다합체성 폴리펩티드는 각각 기능적이지 않은, 즉, 이의 표적에 결합할 수 없는 1 또는 2 개의 새로운 결합 부위의 일부 만을 포함하고,
vi) 제 3 및/또는 제 4 다합체성 폴리펩티드는 기능적 형태, 즉, 이의 각각의 표적에 대해 특이적인 결합을 허용하는 형태의 1 또는 2 개의 새로운 결합 부위를 포함하며, 여기에서 1 또는 2 개의 새로운 기능성 결합 부위는 제 1 다합체성 폴리펩티드와 제 2 다합체성 폴리펩티드 사이에서 제 2 및 제 3 폴리펩티드의 교환에 의해 생성/활성화되고, 즉, 상기 1 또는 2 개의 새로운 결합 부위의 비-기능적 부분을 함께 가져옴으로써 1 또는 2 개의 새로운 기능성 결합 부위가 형성됨.
따라서, 본 발명은, 적어도 부분적으로, (이종-)다합체성 폴리펩티드에 단일 (한쪽, 쌍이 아님) 불안정화 (교란) 돌연변이를 추가하는 것이, 불안정화 돌연변이가 교환 및 재조합시에 인력 돌연변이로 변할 때, 둘 모두 새로 형성된 교환된 (이종-)다합체성 폴리펩티드가 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드와 비교하여 개선된 안정성 (즉, 보다 낮은 CH3-CH3 결합 자유 에너지) 을 갖는 것을 야기하기 때문에, 또한 하나의 단일 (한쪽, 쌍이 아님) 불안정화 (교란) 돌연변이를 포함하는 제 2 (이종-)다합체성 폴리펩티드와의 폴리펩티드 사슬 교환을 촉진하는데 충분하다는 발견에 기초한다. 따라야 하는 유일한 단서는, 불안정화 (교란) 돌연변이가 각각의 폴리펩티드가 서로 연결되면 서로 상호 작용하는 위치에서 도입된다는 것이다.
이 방법은 상기에서 설명한 바와 같은 기준을 충족시키는 임의의 (이종-)다합체성 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
그럼에도 불구하고, 본 발명에 따른 방법은 약학 분야에서 특히 유용하다.
(이종-)다합체성 폴리펩티드의 생성을 위한 상이한 방법이 당업계로부터 공지되어 있다. 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드의 형성에 요구되는 돌연변이가 본 발명에 따른 교환 반응에 필요한 (교란) 불안정화 돌연변이를 방해하지 않거나 또는 이와 중첩되지 않는 한, 임의의 이들 방법이 사용될 수 있다.
약학 분야로 돌아오면, 항체는 가장 널리 사용되는 부류의 결합제이다. 항체는 이들의 불변 영역에서, 특히 중쇄의 CH3 도메인 사이에서의 상호 작용을 통해 이합체화된다.
따라서, 본 발명은, 적어도 부분적으로, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해, 한 쌍의 CH3 도메인 중 하나의 CH3 도메인에 단일 불안정화 돌연변이를 도입하는 것이 충분하다는 발견에 기초한다. 보다 상세하게는, 제 1 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드의 오직 하나의 CH3 도메인에 위치 357 에서 제 1 불안정화 돌연변이의 도입, 및 제 2 출발 폴리펩티드의 오직 하나의 CH3 도메인에 위치 370 에서 제 2 불안정화 돌연변이의 도입은, 2 개의 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드 사이에서 공간적인 접근시에, 이들 출발 폴리펩티드 사이의 폴리펩티드 사슬의 자발적 교환을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 생성된 교환된 폴리펩티드 중 하나는 각각 위치 357 및 370 에서 돌연변이를 갖는 CH3 도메인 쌍을 포함하며, 이는 교환된 (이종-)다합체의 안정화를 야기한다. 위치 356 및 439 에서의 돌연변이에 의해 유사물이 달성될 수 있다. 모든 위치의 번호 부여는 Kabat 의 EU 지수에 따른다. 하나의 바람직한 돌연변이의 쌍은 E357K 및 K370E 이다. 또다른 바람직한 돌연변이의 쌍은 D356K 및 K439E 이다. 본 발명에 따른 방법은 당해 잔기가 고도로 보존되기 때문에, 임의의 IgG 서브클래스, 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 에 적용될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에 있어서, CH3 도메인은 IgG1 서브클래스의 것이다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드의 폴리펩티드 사슬이 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드의 형성 및 단리를 허용하기 위해서, 예를 들어 디술피드 결합을 통해 서로 공유적으로 연결되는 것을 필요로 하지 않는다는 발견에 기초한다. 보다 상세하게는, 출발 폴리펩티드는 이미 이종이합체이기 때문에, 이들은 이종이합체화를 위한 추가의 돌연변이를 포함할 것이다. 이들 돌연변이는 특이적인 불안정화 (교란) 단일의 한쪽 돌연변이의 존재하에서도, 출발 이종이합체를 안정화시키는데 충분한 것으로 밝혀졌다. 여기에서, 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드에서 사슬의 공유 연결에 대한 필요성은 더 이상 제공되지 않는다. 따라서, 하나의 구현예에 있어서, 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드를 함유하는 힌지 영역의 경우, 이들 힌지 영역은 돌연변이 C226S 및 C229S, 또는 전체 CPXC (SEQ ID NO: 95) 서열 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여) 의 결실을 포함한다.
(이종-)다합체성 출발 폴리펩티드의 사슬을 포함하는 Fc-영역 사이의 디술피드 결합의 생략에 의해, 교환 반응을 개시하기 위해서 환원제가 요구되지 않는다. 이것은, 교환 반응이 온화한 생체내 조건하에서 발생하도록 한다. 또한, 다른 디술피드 결합은, 이들이 교환 반응 (폴리펩티드를 포함하는 CH3 도메인과 함께 공유 결합) 을 방해하지 않는 한, 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드, 예를 들어 Fab 단편에서 존재할 수 있다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 교환된 (이종-)다합체성 폴리펩티드, 예를 들어 기능적 및 표적 결합 부위 만을 포함하는 것은, 교환 반응 후에만 디술피드 결합의 형성에 의해 추가로 안정화될 수 있다는 발견에 기초한다. 예를 들어, (이종-)다합체성 항체의 형성을 위해 충분히 확립된 돌연변이는 노브-인투-홀 돌연변이이다. 이들은 2 개의 변이체로 존재한다: 추가의 디술피드 결합을 가짐 및 갖지 않음. 따라서, 하나의 대안적인 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드는 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드의 형성을 위한 노브-인투-홀 돌연변이를 포함하며, 표적 결합 부위를 보유하는 폴리펩티드 사슬에서만 노브-인투-홀 시스테인 잔기를 제공한다. 여기에서, 두 표적 결합 부위를 포함하는 교환된 (이종-)다합체성 폴리펩티드에서만, 상응하는 매칭 위치에서 디술피드 결합의 형성에 요구되는 두 시스테인 잔기가 존재한다. 따라서, 상기 교환된 생성물에서만, 디술피드 결합이 형성된다. 이것은 표적 교환된 (이종-)다합체성 폴리펩티드의 추가의 안정화를 야기하여, 해리 및/또는 역-반응을 방지한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "(이종-)다합체성" 은, 아미노산 서열에서 부분적으로 또는 완전히 동일하지 않으며, 본 발명의 요건을 충족시키는 2 개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어는 또한 이들 중 적어도 2 개가 본 발명에 따른 (이종-)다합체성이기만 하면, 3 개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 용어 "다합체성" 은, 적어도 2 개가 (이종-)다합체성이며, 본 발명의 요건을 충족시키는 3 개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "교란 돌연변이" 는 (이종)이합체성 폴리펩티드의 불안정화를 야기하는 돌연변이를 의미한다. 이러한 불안정화는 일반적으로 아미노산 잔기의 전하를 변화시킴으로써, 예를 들어 양으로 하전된 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하거나, 또는 그 반대로 함으로써 달성된다. 이러한 교환은 CH3-CH3 도메인 계면의 상호 작용하는 위치에서 유사한 변화 및, 따라서 전하 반발을 야기한다. 하나의 바람직한 돌연변이의 쌍은 E357K 및 K370E 이다. 또다른 바람직한 돌연변이의 쌍은 D356K 및 K439E 이다. 추가로, 본 발명에 따른 방법은 당해 잔기가 고도로 보존되기 때문에, 임의의 IgG 서브클래스, 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 에 적용될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에 있어서, CH3 도메인은 IgG1 서브클래스의 것이다.
이합체 안정성에 대한 CH3 도메인 돌연변이의 효과를 평가하는 방법은 WO 2009/089004 (본원에 참고로 포함됨) 에 개시되어 있다. 여기에, EGAD 소프트웨어를 사용하여 CH3-CH3 도메인 결합 자유 에너지를 평가하는 방법이 요약되어 있다 (또한, Pokala, N. and Handel, T.M., J. Mol. Biol. 347 (2005) 203-227 참조, 전체가 본원에 참고로 포함됨):
EGAD 는 CH3 도메인 계면에서 만들어진 다양한 돌연변이의 결합 자유 에너지를 대략적으로 비교하는데 사용될 수 있다. 돌연변이체의 결합 자유 에너지는 ΔΔGmut = μ (ΔGmut - ΔGwt) (mut = 돌연변이체, wt = 야생형) 으로서 정의된다. 여기에서 μ (= 0.1, 일반적으로) 은 실험 에너지와 비교할 때, 결합 친화성의 예측된 변화를 1 의 기울기를 갖도록 정규화하는데 사용되는 계수 인자이다. 자유 해리 에너지 (ΔG) 는 복합체 (ΔGbound) 와 자유 상태 (ΔGfree) 사이의 에너지 차이로서 정의된다.
본 발명은 구체적이고, 예시적인 출발 물질, 즉, 2/3-IgG 를 사용하여 하기에서 예시된다. 이것은 일반적인 기본 개념의 예시로서 제공되며, 본 발명의 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 본 발명의 실제 범위는 청구범위에 기재되어 있다.
도 1 은 본 발명에 따른 방법에서 예시적인 출발 화합물로서 사용되는 2/3-IgG 의 설계 및 모듈 조성을 보여준다. 2/3-IgG 는 다음의 3 개의 개별 사슬로 구성된다: 하나의 경쇄 (통상적으로 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 전체 길이 경쇄), 하나의 중쇄 (통상적으로 중쇄 가변 도메인 및 시스테인 잔기를 갖는 또는 갖지 않는 힌지 영역을 포함하는 모든 중쇄 불변 도메인을 포함하는 전체 길이 중쇄), 및 하나의 상보적 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (통상적으로 적어도 일부의 힌지 및 CH2-CH3 를 포함하는 중쇄 Fc-영역 단편, 힌지 영역은 시스테인 잔기를 갖지 않음). 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 기능성 결합 부위, 즉, VH/VL 쌍을 형성한다.
본 발명에 따른 방법에서 예시적인 출발 화합물로서 또한 사용될 수 있는 2/3-BiFab 의 설계 및 모듈 조성은 유사하다. 2/3-BiFab 는 다음의 3 개의 개별 사슬로 구성된다: 하나의 경쇄 (통상적으로 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 전체 길이 경쇄), 하나의 중쇄 (통상적으로 제 1 중쇄 가변 도메인, CH1 도메인, 제 2 가변 도메인, 및 시스테인 잔기를 갖는 또는 갖지 않는 힌지 영역을 포함하는 CH3 도메인을 포함하는 변이체 전체 길이 중쇄), 및 하나의 상보적 중쇄 폴리펩티드 (통상적으로 힌지-가변 도메인-CH3, 시스테인 잔기를 갖는 또는 갖지 않는 힌지 영역을 포함하는 중쇄 단편). 경쇄의 가변 도메인 및 중쇄의 제 1 가변 도메인은 기능성 결합 부위, 즉, VH/VL-쌍을 형성하고, 중쇄의 제 2 가변 도메인 및 상보적 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 가변 도메인은 또한 통상적으로 비-기능성인, 즉, 결합 적격이 아닌 VH/VL-쌍을 형성한다.
중쇄 (통상적으로 인간 IgG1 서브클래스의 중쇄) 는 노브-인투-홀 Fc-영역 이종이합체의 형성을 가능하게 하기 위해서 CH3 도메인에, i) 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이 (항체 중쇄의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366W 는 "노브-돌연변이" 로서 표시되고, 항체 중쇄의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V 는 "홀-돌연변이" 로서 표시된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여)), 또는 ii) 노브-cys-돌연변이 또는 홀-cys-돌연변이 (항체 중쇄의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366W 및 S354C 는 "노브-cys-돌연변이" 로서 표시되고, 항체 중쇄의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, Y349C 는 "홀-cys-돌연변이" 로서 표시되며; 역전된 설정이 마찬가지로 가능하다: T366W/Y349C 및 T366S/L368A/Y407V/S354C (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여)) 를 함유한다.
상보적 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 또는 상보적 중쇄 폴리펩티드는 또한 '더미-Fc' 또는 '더미-HC', 즉, VH 및 CH1 이 결여되고, 힌지 영역 서열 (또는 이의 단편) 로 N-말단에서 시작하며, CH2 도메인 또는 가변 도메인이 후속하고, CH3 도메인이 후속하며, 임의로 이의 C-말단에 정제 태그, 예를 들어 His6 또는 His8 또는 C-tag 를 포함하는 IgG1 유도체로서 표시될 수 있다. 또한, 이러한 상보적 폴리펩티드는 이의 CH3 도메인에, 중쇄에서의 돌연변이에 따라 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 함유한다. 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이 이외에, 상보적 폴리펩티드는 야생형 서열과 관련하여 하나의 (즉, 단일의 추가의) 또는 그 이상의 반발 전하를 도입하는 하나 이상의 교란 (즉, 불안정화) 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 각각 돌연변이 K370E 또는 K439E 와 조합된 각각 돌연변이 D356K 또는 E357K (도 2 참조). 이러한 돌연변이된 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 ( m utated h eavy c hain Fc - r egion p olypeptide) 는 이하에서 MHCFcRP 로서 표시된다.
중쇄 및 MHCFcRP 는 내부의 노브-인투-홀 돌연변이의 분포에 따라 다음의 2 가지 유형의 이종이합체를 형성할 수 있다:
i) 중쇄-노브::MHCFcRP-홀, 및
ii) 중쇄-홀::MHCFcRP-노브.
따라서, 2/3-IgG 및 2/3-BiFab 는 관련된 경쇄를 갖는 이종이합체, 즉, 이종삼합체이다. 그러나, 이들은 MHCFcRP 에서의 전하 돌연변이가 중쇄에 대응하는 반대 부분을 갖지 않으며, 중쇄에 존재하는 경우, MHCFcRP 의 전하 교란 돌연변이가 대응하는 중쇄 반대 부분을 갖지 않기 때문에, 다소 '결함' 이 있다.
2/3-IgG 는 정상 IgG 와 유사한 수율로 발현 및 정제될 수 있는 1 가, 비-이합체화/응집성, 1-아암 항체 유도체이다 (도 3 참조). 이것은 출발 물질의 1 가를 보장한다. 2 가 2/3-IgG 가 사용되는 경우, 이것은 단일특이적일 뿐만 아니라, 이중특이적일 수 있다.
그러나, 이들 결함이 있는 2/3-IgG 를 구성하는 폴리펩티드는 도 4 에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 항체로 재배열될 수 있다.
2 개의 출발 분자 사이의 교환 반응은 KiH (노브-인투-홀) 중쇄 (H-사슬) 의 서로에 대한 보다 양호한 상보성에 의해 (유리 시스테인 잔기가 존재하는 경우, 전하 반발 및 임의로 디술피드 결합의 형성 없음), 뿐만 아니라 2 개의 MHCFcRP 의 서로에 대한 보다 양호한 상보성에 의해 유도된다. 상기 반응에서, 2 개의 출발 분자의 Fc-영역 복합체는 폴리펩티드를 해리 및 교환하여, 2 개의 보다 바람직한 복합체를 형성한다. 이것은 다음과 같이 반응을 주도한다:
2/3-IgG(A)-tag + 2/3-IgG(B)-tag
(출발 이종이합체성 폴리펩티드)
→
bsAb(AB) + MHCFcRP(A)-MHCFcRP(B)-tag
(교환된 이종이합체성 폴리펩티드).
도 4 에 도시된 예에서, 출발 2/3-IgG A 의 중쇄 (노브-cys) 및 출발 2/3-IgG B 의 중쇄 (홀-cys) 는 대응하는 이중특이적 항체 이종사합체 (2xHC + 2xLC) 를 형성한다.
힌지-영역-디술피드-결합-비함유 2/3-IgG 는 이러한 세포상/생체내 상황에서 사용되기 때문에, 환원 단계가 필요하지 않다. 사슬 재배열은 자발적으로 발생한다.
2/3-BiFab 에도 동일하게 적용된다.
실시예 1 내지 5 참조.
B) 1 가- 및/또는 2 가 단일- 또는 이중특이적 IgG 유도체를 2 가-, 3 가- 또는 4 가의 이중-, 삼중- 또는 사중특이적 항체로 전환시키는 방법
본 발명에 따른 방법으로, 상이한 결합 특이성을 조합할 뿐만 아니라, 동시에 상이한 포맷 내에서 및 상이한 가로 이들 조합을 생성하는 것이 가능하다. 이것은, 이전 섹션에서 설명한 바와 같은 방법에 사용된 출발 물질을 확장함으로써 달성된다.
예를 들어, 이전 섹션에서 설명한 바와 같은 2/3-IgG 로부터 출발하여, MHCFcRP 는 변경되지 않고 유지되지만, 중쇄는 상이한 포맷으로 사용된다. 이러한 포맷은, 예를 들어 C-말단 또는 N-말단에 하나의 결합 부위 또는 2 개의 결합 부위 (N-말단에 하나 및 C-말단에 하나) 를 갖는 사슬일 수 있다 (예를 들어, 도 9 및 10 참조).
이러한 실시예에 있어서, 상이한 출발 포맷 (예를 들어, N-말단 결합 부위, C-말단 결합 부위, 또는 N- 및 C-말단 결합 부위를 가짐) 은 본 발명에 따른 방법에서 서로 조합되어, 개별 결합 부위의 상이한 가, 상이한 형태 및 상이한 3 차원 배열/위치를 갖는 상이한 항체 포맷의 생성을 허용한다 (본 실시예에서는 9 개, 도 11 참조).
다중특이적 항체의 생성을 위해, 교환 구동 원리 (결함 입력 분자를 대응하는 출력 분자로 전환) 는 변경되지 않는다. 또한, MHCFcRP 도 유지된다. 따라서, 중쇄 만이 변화된다.
예를 들어, 도 1 및 9-10 은 3 개의 상이한 출발 분자 (N-말단, C-말단, 및 N- 및 C-말단 결합 부위(들)를 갖는 2/3-IgG) 가 교환 반응에서, 즉, 본 발명에 따른 방법에서 서로 조합되어, 9 개의 상이한 이중특이적 포맷을 야기할 수 있다는 것을 보여준다. 이들은 개별 결합 부위의 가, 형태 및 위치가 상이하다.
이러한 이론에 구애되지 않고, 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 2/3-BiFab 의 결함이 있는 이종다합체의 일시적 분리에 기초한 교환 반응은, 우선적으로 대응하는 Fc-영역 이종이합체를 함유하는 생성물을 야기할 것으로 추정된다. 그러므로, 교환은 2/3-IgG 를 4 개-사슬 IgG (상이한 포맷) 뿐만 아니라, 상응하는 Fc-영역 이종이합체로 전환시킨다.
힌지-영역 디술피드 결합이 생체외에 존재하는 경우, 교환 반응은 사슬간 힌지 영역 디술피드 결합을 파괴하기 위해서 환원 단계에 의해 개시되며, 이는 힌지-영역 디술피드 결합을 갖지 않는 세포상/생체내 상황에서 생략될 수 있다. 사슬 재배열은 자발적으로 발생한다.
실시예 6 및 7 참조.
C) Fc-Fc 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 및 환원 단계를 갖지 않는 반응
중쇄 사슬간 디술피드 결합은 항체를 안정화시키고, 힌지에 연결된 Fab 아암의 유연성을 정의한다. 출발 항체를 포함하는 힌지-영역의 교환 접근법은, 교환 반응이 완료될 때 환원제를 제거할 뿐만 아니라, 교환 반응 전 또는 동안에 이들 디술피드의 환원을 필요로 한다 (실시예 3 및 7 참조).
따라서, 본원에는, 힌지 영역을 갖지만, 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 출발 분자의 교환 반응이 보고되어 있다.
이것을 예시하기 위해서, Fc-영역에서의 모든 디술피드 결합이 제거된 2/3-IgG 및 2/3-BiFab 를 생성하였다. 이러한 디술피드-고갈된 2/3-분자는 이들 사슬간 디술피드 결합 없이도, 효과적인 방식으로 생성 및 정제될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 도 15 및 20 참조). 이러한 디술피드-결합-고갈된 2/3-분자를 출발 분자로서 사용하는 경우, 이들 분자를 세포상 교환 반응 및 생체내 적용에 특히 적합하게 하기 위한 환원 단계가 더 이상 필요하지 않기 때문에, 본 발명에 따른 방법은 생체내에서 수행하는 것이 가능하다. 이들 디술피드-결합-고갈된 2/3-IgG 및 2/3-BiFab 로부터 생성된 다중특이적 항체는 기능적이고 안정하며, 사슬간 디술피드 없이, 비-공유적 Fc-Fc 상호 작용에 의해 함께 유지된다 (도 15 및 16 참조).
따라서, Fc-Fc 사슬간 디술피드의 제거는 환원 및 재-산화의 필요없이, 즉, 생리학적 조건하에서 상응하는 Fc-영역 불일치 구동 교환 반응을 허용한다. 이것은 제조 및 (높은 처리량) 스크리닝 절차를 용이하게 한다. 이것은 또한 생리학적 조건하에서, 예를 들어 생존 세포의 표면 상에서 도메인-교환 반응이 발생할 수 있도록 한다.
실시예 8 참조.
하나의 구현예에 있어서, 힌지 영역은 디술피드-결합-비함유이다. 디술피드-결합-비함유 힌지 영역은 SEQ ID NO: 32 의 서열에서 시스테인 잔기 대신에 세린 잔기를 포함한다.
디술피드 결합의 제거 이외에, 또한 힌지 영역은 단축될 수 있다. 이러한 변형된 힌지 영역을 사용함으로써, 개별 결합 부위 사이에 상이한 거리를 제공하는 이중특이적 항체가 수득될 수 있다 (도 51 참조). 따라서, 하나의 구현예에 있어서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 31 (HTCPXCP, X = S 또는 P), 또는 SEQ ID NO: 95 (HTSPXSP, X = S 또는 P), 또는 SEQ ID NO: 94 (HTPAPE; SEQ ID NO: 31 의 CPXC 가 삭제됨) 또는 DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) 의 아미노산 서열을 가진다.
III. 본 발명에 따른 방법
본원에는, 들쑥날쑥한 작용 부위에서 세포의 표면을 직접 이온화하는 새로운 기능, 바람직하게는 치료 효과를 갖는 기능을 생성하기 위한, 2 개의 차별적으로 표적화된 항체-프로드러그 유도체의 세포상 조립/반-항체 교환 방법이 보고되어 있다.
본 발명에 따른 방법은 구체적이고, 예시적인 출발 물질, 즉, 2/3-IgG 및 2/3-BiFab 를 사용하여 하기에서 예시된다. 이것은 일반적인 기본 개념의 예시로서만 제공되며, 본 발명의 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 본 발명의 실제 범위는 청구범위에 기재되어 있다.
A) 1 가 단일특이적 항체의 2 가 IgG 로의 세포상 전환
1 가 항체는 2 가 항체와 비교하여, 세포 표면에 대해 감소된 결합 능력을 나타낼 수 있다. 이러한 이론에 구애되지 않고, 그 이유는, 세포 표면에 대한 명백한 친화성의 2 가-유도된 증강, 즉, 결합활성 효과인 것으로 추정된다. 세포 표면 상에서의 결합활성-강화된 결합 및/또는 유지는 동일한 항원/에피토프를 항체의 2 개의 결합 부위/2 개의 아암과 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 단일특이적 설정에서, 2 가 결합은 낮은 항원 밀도 (두 아암이 결합할 가능성 감소) 를 갖는 세포와 비교하여, 다량의 동족 항원 (두 아암이 결합할 가능성 증가) 을 보유하는 세포에 대한 결합 특이성을 증가시킬 수 있다.
세포 표면 상에서의 결합활성-강화된 결합 및/또는 유지는 또한 2 개의 상이한 항원을 이중특이적 항체의 상이한 결합 부위/상이한 아암과 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 이론에 구애되지 않고, 이 이중특이적 설정에서, 2 가 결합은 항원 중 하나 만 (하나의 결합 부위/하나의 아암 만이 결합할 수 있음) 을 제공 및/또는 발현하는 세포와 비교하여, 두 항원 (두 결합 부위/두 아암이 결합함) 을 제공 및/또는 발현하는 세포에 대해 증가된 결합 특이성을 야기하는 것으로 추정된다.
결합의 결합활성-매개된 개선을 해결하기 위한 최신 기술은 2 개의 표적을 인식하는 미리 형성된 bsAb 를 적용한다. 특이성을 달성하기 위해서, 1 가 방식으로 충분한 결합 강도가 결합활성 효과를 무효화하는 것을 회피하기 위해서, 각각의 1 가 아암의 다소 낮은 친화성을 갖는 것이 필요하다. 이러한 전제 조건이 충족되면, bsAb 는 두 항원을 제공 및/또는 발현하는 세포에 대해 증가된 특이성으로 결합할 수 있다.
현재 이용 가능한 결합활성-주도의 결합 개선 개념의 한가지 단점은, 세포 표면 상에서의 두 항원의 밀도가 미리 형성된 bsAb 자체의 결합을 위한 필수 전제 조건이 아닐 수 있다는 것이다 (모두가 제공되며, 접근 가능한 한). 항원 밀도는 항원을 발현하는 세포에 결합하는 bsAb 의 양을 결정할 수 있다.
그러므로, 매우 높은 효능 (및/또는 잠재적 독성 문제) 을 갖는 엔터티는 두 표적 항원의 높은, 뿐만 아니라, 낮은 수준을 제공/발현하는 세포에 결합하는 - 영향을 미치는 위험성을 가진다. 예를 들어, 고유의 또는 부가된 세포 독성 기능을 갖는 bsAb 는 높은 항원 수준을 나타내는 종양 세포, 뿐만 아니라, 낮은 항원 수준을 갖는 비-표적 정상 세포에 영향을 미칠 수 있다.
이중특이적 항체가 1 가, 단일특이적 항체의 세포상 전환에 의해 형성되는 본원에서 보고되는 바와 같은 방법은, 교환 반응이 2 개의 단일특이적 교환 파트너의 물리적인 상호 작용을 필요로 하기 때문에, 상기에서 기술한 문제점을 해결하기 위해서 적용될 수 있다. 이러한 상호 작용의 가능성은 농도 의존적으로, 즉, 낮은 농도에서는 상호 작용 및 교환 가능성이 낮고, 높은 농도에서는 상호 작용 및 교환 가능성이 높다. 따라서, 예를 들어, 상이한 특이성을 갖는 단일특이적 항체의 개별 (연속) 적용은, 다량의 두 항원을 나타내는 세포 상에서 두 단일특이적 성분의 증가된 축적 (낮은 친화성) 을 유도한다. 결과적으로, 이러한 세포는 개별 항체의 증가된 농도를 축적할 뿐만 아니라, 이들을 bsAb 로 훨씬 더 효과적으로 전환시킬 것이다. 이들 bsAb 는 세포 표면 항원에 대한 이들의 2 개의 결합 부위에 의한 결합활성 결합으로 인해 표적 세포 상에서 유지되는 반면, 비-교환된 전구체 항체는 해리될 것이다.
B) 프로드러그 기능을 갖는 BiFab 의 생성 및 기능성 TriFab 로의 세포상 전환
본원에서 보고되는 교환 반응의 원동력은, "결함이 있는" CH3-계면을 갖는 2 개의 입력 분자의, 대응하는 CH3-계면을 갖는 2 개의 생성물로의 전환이다. 이들 CH3-계면을 지정하는 설계는 MHCFcRP 의 조성에 있다. MHCFcRP 는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 그러나, MHCFcRP 의 특별한 조성에 기여하는 모든 돌연변이는 CH3 도메인에 위치한다. 따라서, MHCFcRP 의 CH2 도메인 뿐만 아니라, 연관된 중쇄의 CH2 도메인을 다른 상이한 도메인으로 대체하는 것이 가능하다. 이들은 "결함이 있는" 분자를 생성하기 위해서, 여전히 중쇄-MHCFcRP 이종이합체화를 허용 (또는 심지어 지원) 해야 한다.
IgG 유사 분자의 CH2 도메인을 다른 이종이합체화 가능한 도메인으로 대체하는 가능성은 TriFab 포맷으로 설명되었다 (WO 2016/087416; 도 18 참조). TriFab 는 CH2 도메인의 각각 VH 및 VL 로의 교환에 기인하여, 이중특이적 기능을 나타낸다. 이러한 분자의 Fc-유사 '스템-영역' 은 온전한 KiH CH3 도메인에 의해 함께 유지된다. KiH CH3 도메인은 MHCFcRP 의 변형된 CH3 도메인과 상용성이기 때문에, 이들은 또한 교환-가능한 특징을 갖는 2/3-BiFab 유사체를 함유하는 MHCFcRP 의 생성을 가능하게 할 수 있다.
TriFab 는, 하나의 CH2 도메인이 VH 도메인으로 대체되고, 다른 하나의 CH2 도메인이 상보적 VL 도메인으로 대체되기 때문에, Fc-영역의 CH2 도메인 대신에 기능적 Fv 를 보유한다. 2/3-BiFab 유도체는 관련이 없는, 즉, 비-동족의 VH 또는 VL 도메인 (전자의 CH2 위치에서) 을 갖는 MHCFcRP 를 함유하며, 즉, 이들은 표적에 결합하지 않는다. 2/3-BiFab 는 하나의 기능적 1 가 결합 아암을 보유하지만, 스템 영역에서의 제 3 결합 부위의 절반을 함유한다 (도 18 참조). 2 개의 상보적 2/3-BiFab 분자의 교환 반응은 TriFab 포맷을 재구성할 뿐만 아니라, '스템-위치' 에서 추가의 제 3 결합 기능성의 재구성 (CH2 대체) 을 유도한다. 그러므로, 교환 반응은 2 개의 2/3-BiFab 프로드러그를 완전히 기능성인 TriFab 로 전환시킨다.
2/3-IgG 에 대해 상기에서 기술한 바와 같은 Fc-Fc 사슬간 디술피드 결합 (힌지 영역 및 CH3 도메인) 의 제거는, 제어된 환원 및 재-산화에 대한 필요없이, MHCFcRP 주도의 교환 반응을 가능하게 한다. 따라서, 이러한 분자의 교환 반응은, 특히 개별 (단일특이적) 엔터티가 표적 세포 표면에 결합하는 조건을 포함하는 생리학적 조건하에서 발생하는 것이 가능하다. 동일한 원리를 적용함으로써, 2/3-BiFab 는 이들의 기능성 Fab 아암/기능성 결합 부위의 결합시에 표적 세포 상에 축적된다. 2 개의 상보적 2/3-BiFab (둘 모두는 결합-비활성이지만, 서로 상보적인 스템-Fv 를 가짐) 가 동일한 세포의 표면에 결합하는 경우, 사슬 교환 반응은 상기 세포의 표면 상에서 직접 발생한다. 이러한 교환은 세포상/동일계/생체내에서, 즉, 의도된 작용 부위의 세포 표면 상에서 직접, 적어도 이중 또는 심지어 삼중 특이성을 갖는 완전히 기능성인 TriFab 를 세포 표면 상에서 직접, 즉, 작용 부위에서 생성한다. 2/3-BiFab 유래의 프로드러그 활성화 원리는, 하나 이상의 표적 항원을 충분한 밀도로 발현하는 세포의 표면 상에서만 결합 기능성을 생성한다. 이것은 원하는 세포 상에서만 기능성 (매우 높은 효능 및/또는 잠재적인 PK 또는 독성 문제를 포함) 의 생성을 가능하게 한다.
본 발명의 방법으로, 낮은 아핀 단일특이적 결합제를 사용하여 세포 상에서 직접 높은 아핀 결합활성 결합제를 생성하고, 동시에 치료적 결합 부위를 활성화시키는 것이 가능하다.
IV. 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 다중특이적 분자
A) 다합체성 폴리펩티드
본 발명에 따른 세포상 교환 반응/방법에서 사용되는 다합체성 폴리펩티드는 다음과 같이 정의된다:
- 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 포함하고, 여기에서 각각은 면역글로불린 CH3 도메인 및 결합 부위의 비-기능적 부분을 포함하며, 여기에서 이 결합 부위의 비-기능적 부분은 두 폴리펩티드에서의 CH3 도메인에 대해 N-말단 또는 C-말단에 위치하고; 폴리펩티드 중 하나 이상은 세포 표면 표적, 바람직하게는 비-내재화 세포 표면 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 포함함,
- CH3 도메인 중 하나에만 (교란) 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 2 폴리펩티드에서의 상기 돌연변이를 제외하고, 상기 불안정화된 다합체성 폴리펩티드와 동일한 (다합체성) 폴리펩티드와 비교하여, 다합체성 폴리펩티드의 불안정화를 야기함,
- 이종이합체의 형성을 위한 돌연변이를 포함함, 및
- 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사이에 디술피드-결합이 부재함.
따라서, 본 발명은, 적어도 부분적으로, (이종-)다합체성 폴리펩티드에 단일 (한쪽, 쌍이 아님) 불안정화 (교란) 돌연변이를 추가하는 것이, 불안정화 돌연변이가 교환 및 재조합시에 인력 돌연변이로 변할 때, 둘 모두 새로 형성된 교환된 (이종-)다합체성 폴리펩티드가 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드와 비교하여 개선된 안정성 (즉, 보다 낮은 CH3-CH3 결합 자유 에너지) 을 갖는 것을 야기하기 때문에, 또한 하나의 단일 (한쪽, 쌍이 아님) 불안정화 (교란) 돌연변이를 포함하는 제 2 (이종-)다합체성 폴리펩티드와의 폴리펩티드 사슬 교환을 촉진하는데 충분하다는 발견에 기초한다. 따라야 하는 유일한 단서는, 불안정화 (교란) 돌연변이가 각각의 폴리펩티드가 서로 연결되면 서로 상호 작용하는 위치에서 도입된다는 것이다.
이러한 방법은 상기에서 기술한 바와 같은 기준을 충족시키는 임의의 (이종-)다합체성 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 다합체성 폴리펩티드는 추가의 도메인 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 제 1 및 제 2 폴리펩티드에서, CH3 도메인에 대한 (직접) N-말단 또는 (직접) C-말단에 면역글로불린 CH2 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에 있어서, 추가의 면역글로불린 CH2 도메인은 CH3 도메인에 대해 N-말단이다.
하나의 구현예에 있어서, 다합체성 폴리펩티드는 힌지 영역 및 돌연변이 C226S 및 C229S, 또는 CPXC (SEQ ID NO: 95) 서열 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여) 을 갖지 않는 힌지 영역을 포함하거나, 또는 힌지 영역을 포함하지 않는다.
(이종-)다합체성 폴리펩티드의 생성을 위한 상이한 방법이 당업계로부터 공지되어 있다. 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드의 형성에 요구되는 돌연변이가 본 발명에 따른 교환 반응에 필요한 (교란) 불안정화 돌연변이를 방해하지 않거나 또는 이와 중첩되지 않는 한, 임의의 이들 방법이 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 적어도 부분적으로, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해, 한 쌍의 CH3 도메인 중 하나의 CH3 도메인에 단일 불안정화 돌연변이를 도입하는 것이 충분하다는 발견에 기초한다. 보다 상세하게는, 제 1 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드의 오직 하나의 CH3 도메인에 위치 357 에서 제 1 불안정화 돌연변이의 도입, 및 제 2 출발 폴리펩티드의 오직 하나의 CH3 도메인에 위치 370 에서 제 2 불안정화 돌연변이의 도입은, 2 개의 출발 (이종-)다합체성 폴리펩티드 사이에서 공간적인 접근시에, 이들 출발 폴리펩티드 사이의 폴리펩티드 사슬의 자발적 교환을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 생성된 교환된 폴리펩티드 중 하나는 각각 위치 357 및 370 에서 돌연변이를 갖는 CH3 도메인 쌍을 포함하며, 이는 교환된 (이종-)다합체의 안정화를 야기한다. 위치 356 및 439 에서의 돌연변이에 의해 유사물이 달성될 수 있다. 모든 위치의 번호 부여는 Kabat 의 EU 지수에 따른다. 하나의 바람직한 돌연변이의 쌍은 E357K 및 K370E 이다. 또다른 바람직한 돌연변이의 쌍은 D356K 및 K439E 이다. 본 발명에 따른 방법은 당해 잔기가 고도로 보존되기 때문에, 임의의 IgG 서브클래스, 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 에 적용될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에 있어서, CH3 도메인은 IgG1 서브클래스의 것이다.
하나의 구현예에 있어서, 다합체성 폴리펩티드는 다음을 포함한다:
다음을 포함하는 제 1 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 1 항체 가변 도메인, 및 b) 제 1 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 돌연변이 T366W, 또는
b) 돌연변이 T366S/L368A/Y407V
를 포함함,
및
ii) 제 1 항체 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 제 1 CH3 도메인에 대한 C-말단에서 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍,
다음을 포함하는 제 2 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 2 항체 가변 도메인, 및 b) 제 2 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
여기에서 제 1 항체 가변 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인이거나; 또는 제 1 항체 가변 도메인이 항체 경쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은
a) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366W 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366S/L368A/Y407V, 또는
b) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366W
를 포함하고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 교란 돌연변이가 D356K 인 경우에 위치 439 에서 아미노산 잔기 K, 또는
b) 교란 돌연변이가 E357K 인 경우에 위치 370 에서 아미노산 잔기 K, 또는
c) 교란 돌연변이가 K370E 인 경우에 위치 357 에서 아미노산 잔기 E, 또는
d) 교란 돌연변이가 K439E 인 경우에 위치 356 에서 아미노산 잔기 D
를 포함함,
및
ii) 임의로 제 2 항체 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 제 2 CH3 도메인에 대한 C-말단에서 제 2 또는 제 4 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍,
여기에서 모든 번호 부여는 Kabat EU 지수에 따름.
하나의 구현예에 있어서, 다합체성 폴리펩티드는 다음을 포함한다:
다음을 포함하는 제 1 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 1 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 및 b) 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 1 항체 가변 도메인,
여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 돌연변이 T366W, 또는
b) 돌연변이 T366S/L368A/Y407V
를 포함함,
및
ii) 제 1 CH3 도메인에 대한 N-말단 또는 제 1 가변 도메인에 대한 C-말단에서 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍,
다음을 포함하는 제 2 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 2 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 및 b) 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 2 항체 가변 도메인,
여기에서 제 1 항체 가변 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인이거나; 또는 제 1 항체 가변 도메인이 항체 경쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은
a) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366W 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366S/L368A/Y407V, 또는
b) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366W
를 포함하고,
여기에서 제 2 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 교란 돌연변이가 D356K 인 경우에 위치 439 에서 아미노산 잔기 K, 또는
b) 교란 돌연변이가 E357K 인 경우에 위치 370 에서 아미노산 잔기 K, 또는
c) 교란 돌연변이가 K370E 인 경우에 위치 357 에서 아미노산 잔기 E, 또는
d) 교란 돌연변이가 K439E 인 경우에 위치 356 에서 아미노산 잔기 D
를 포함함,
및
ii) 임의로 제 2 CH3 도메인에 대한 N-말단 또는 제 2 가변 도메인에 대한 C-말단에서 제 2 또는 제 4 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍,
여기에서 모든 번호 부여는 Kabat EU 지수에 따름.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 비-공유 이합체이다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 가변 도메인 및 제 2 가변 도메인은 비-기능성 결합 부위를 형성한다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 각각 제 1 및 제 2 가변 도메인에 대한 N-말단에서 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) 또는 DKTHT (SEQ ID NO: 94) 또는 GGGS (SEQ ID NO: 69) 또는 DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) 를 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서,
i) 제 1 CH3 도메인은 돌연변이 T366W 및 위치 439 에서 아미노산 잔기 K 를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 D356K 및 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하거나, 또는
ii) 제 1 CH3 도메인은 돌연변이 및 위치 370 에서 아미노산 잔기 K 를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 E357K 및 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하거나, 또는
iii) 제 1 CH3 도메인은 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 및 위치 357 에서 아미노산 잔기 E 를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 K370E 및 돌연변이 T366W 를 포함하거나, 또는
iv) 제 1 CH3 도메인은 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 및 위치 356 에서 아미노산 잔기 D 를 포함하고,
제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 K439E 및 돌연변이 T366W 를 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1, 제 2 및 제 3 표적은 상이하다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 표적 또는 제 3 표적은 인간 CD3 이다.
모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 2 및, 존재하는 경우, 제 4 표적은 동일하거나 또는 상이하고, 둘 모두는 동일한 (표적) 세포의 표면 상에 위치한다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍은 Fv, scFc, Fab, scFab, dsscFab, CrossFab, 이중특이적 Fab, sdAb, 및 VHH 로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 4 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍은 Fv, scFc, Fab, scFab, dsscFab, CrossFab, 이중특이적 Fab, sdAb, 및 VHH 로 이루어진 군에서 선택되는 제 2 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍과 독립적으로 선택된다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 CH3 도메인에 대해 N-말단에 면역글로불린 G CH2 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 인간 면역글로불린 G 는 인간 IgG1 또는 인간 IgG2 또는 IgG3 또는 인간 IgG4 이다.
B) 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물
본 발명에 따른 2 개의 다합체성 분자를 포함하는 조성물로 수행될 수 있는 세포상 교환 반응/방법은 다음의 단계를 포함한다:
- 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 제 1 (출발) 다합체성 폴리펩티드 및 제 3 폴리펩티드 및 제 4 폴리펩티드를 포함하는 제 2 (출발) 다합체성 폴리펩티드를 세포의 표면 상에 근접시켜 제 2 및 제 3 폴리펩티드를 교차 교환하여, 제 3 다합체성 폴리펩티드 및 제 4 다합체성 폴리펩티드를 형성하는 단계,
여기에서,
i) 제 2 폴리펩티드는, 제 2 폴리펩티드에서의 상기 돌연변이를 제외하고, 상기 제 1 다합체성 폴리펩티드와 동일한 (다합체성) 폴리펩티드와 비교하여, 제 1 다합체성 폴리펩티드의 불안정화를 야기하는 (제 1 교란) 돌연변이를 포함하고,
ii) 제 3 폴리펩티드는, 제 3 폴리펩티드에서의 상기 돌연변이를 제외하고, 상기 제 2 (다합체성) 폴리펩티드와 동일한 다합체성 폴리펩티드와 비교하여, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 불안정화를 야기하는 (제 2 교란) 돌연변이를 포함하고,
iii) 제 2 폴리펩티드에서의 (제 1 교란) 돌연변이 및 제 3 폴리펩티드에서의 (제 2 교란) 돌연변이는 제 1 (출발) 다합체성 폴리펩티드 및/또는 제 2 (출발) 다합체성 폴리펩티드와 비교하여, 상기 제 2 폴리펩티드 및 상기 제 3 폴리펩티드를 포함하는 제 3 (교환된) 다합체성 폴리펩티드의 안정화를 야기하고,
iv) 제 4 (교환된) 다합체성 폴리펩티드는 제 1 (출발) 다합체성 폴리펩티드 및/또는 제 2 (출발) 다합체성 폴리펩티드와 비교하여, 안정하고,
v) 제 1 다합체성 폴리펩티드 및 제 2 다합체성 폴리펩티드는 각각 기능적이지 않은, 즉, 이의 표적에 결합할 수 없는 1 또는 2 개의 새로운 결합 부위의 일부 만을 포함하고,
vi) 제 3 및/또는 제 4 다합체성 폴리펩티드는 기능적 형태, 즉, 이의 각각의 표적에 대해 특이적인 결합을 허용하는 형태의 1 또는 2 개의 새로운 결합 부위를 포함하고, 이는 제 1 다합체성 폴리펩티드와 제 2 다합체성 폴리펩티드 사이에서 폴리펩티드의 교환에 의해 생성/활성화되고, 즉, 상기 1 또는 2 개의 새로운 결합 부위의 비-기능적 부분을 함께 가져옴으로써 1 또는 2 개의 새로운 기능성 결합 부위가 형성됨.
본 발명의 하나의 양태는 본 발명에 따른 제 1 다합체성 폴리펩티드 및 본 발명에 따른 제 2 다합체성 폴리펩티드를 포함하는 조성물이고, 여기에서,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 CH3 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 T366W 또는 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하고,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 D356K 를 포함하고, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 K439E 를 포함하거나, 또는
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 E357K 를 포함하고, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 K370E 를 포함하고,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인은 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍이고,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 항체 가변 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 항체 가변 도메인은 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍이고,
제 2 및 제 4 표적은 서로 독립적으로 세포 표면 항원이다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 제 1 및/또는 제 3 표적은 인간 CD3 이다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물이고, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 상기 조성물은 의약으로서 사용하기 위한 것이다.
C) Fc-영역 변이체
특정한 구현예에 있어서, 하나 이상의 추가의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 Fc-영역에 도입되어, Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형 (예를 들어, 치환) 을 포함하는 인간 Fc-영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역) 을 포함할 수 있다.
특정한 구현예에 있어서, 본 발명은 생체내 반감기가 중요하지만 일정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC) 은 불필요하거나 또는 유해한 적용에 바람직한 후보가 되게 하는, 이펙터 기능의 전부가 아닌 일부를 보유하는 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드 변이체를 고려한다. 생체외 및/또는 생체내 세포독성 어세이를 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 어세이를 수행하여, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드가 FcγR 결합은 결여되었지만 (여기에서 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음), FcRN 결합 능력을 보유한다는 것을 보장할 수 있다. ADCC의 매개를 위한 주요 세포, NK 세포는 오직 FcγRIII 만을 발현하지만, 그에 반해 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492 의 464 페이지의 표 3 에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 생체외 분석의 비제한적인 예는 US 5,500,362 (예를 들어, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 및 Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 참조); US 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 참조) 에 기술되어 있다. 대안적으로, 비방사능 어세이 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어, 유세포 측정을 위한 ACTI™ 비방사능 세포독성 어세이 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비방사능 세포독성 어세이 (Promega, Madison, WI) 참조). 이러한 어세이에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어 Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656 에 개시된 바와 같은 동물 모델에서, 생체내에서 평가될 수 있다. C1q 결합 어세이는 또한 항체가 C1q 에 결합할 수 없으며, 그래서 CDC 활성이 결여된 것을 확인하기 위해 수행될 수 있다 (예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소/반감기 결정은 또한 당분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 Fc-영역을 포함하는 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 Fc-영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (US 6,737,056). 이러한 Fc-영역 돌연변이체는 알라닌으로 잔기 265 및 297 의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc-영역 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에 치환을 갖는 Fc-영역 돌연변이체를 포함한다 (US 7,332,581).
특정한 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 FcR 에 대한 개선되거나 또는 축소된 결합을 갖는 Fc-영역 변이체를 포함한다 (예를 들어, US 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 참조).
특정한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 ADCC 를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc-영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 에서의 치환 (잔기의 EU 번호 부여) 을 갖는 Fc-영역 변이체를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 예를 들어, US 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선되거나 또는 축소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 을 일으키는 변경이 Fc-영역에 만들어진다.
태아에 모체 IgG 의 전달을 담당하는, 신생 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체 (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, 및 Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) 가 US 2005/0014934 에 기술되어 있다. 그들 항체는 FcRn 에 대한 Fc-영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc-영역을 그 안에 포함한다. 이러한 Fc-영역 변이체는 Fc-영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc-영역 잔기 434 의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (US 7,371,826).
또한, Fc-영역 변이체의 다른 예에 관해서는, Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351 을 참조한다.
모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 다음을 포함한다 (Kabat 의 EU 지수에 따른 모든 위치):
i) 둘 모두의 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 P329G, L234A 및 L235A 를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 Fc-영역, 또는
ii) 둘 모두의 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 P329G, S228P 및 L235E 를 갖는 인간 IgG4 서브클래스의 Fc-영역, 또는
iii) 둘 모두의 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A, 및 H435A 를 갖는, 또는 둘 모두의 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 P329G, L234A, L235A, H310A, H433A, 및 Y436A 를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 Fc-영역, 또는
iv) 둘 모두의 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 P329G, L234A 및 L235A 를 포함하는 인간 IgG1 서브클래스의 이종이합체성 Fc-영역 및
a) 하나의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366W 를 포함하고, 다른 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하거나, 또는
b) 하나의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366W 및 Y349C 를 포함하고, 다른 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 S354C 를 포함하거나, 또는
c) 하나의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366W 및 S354C 를 포함하고, 다른 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C 를 포함함,
또는
v) 둘 모두의 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 P329G, S228P 및 L235E 를 포함하는 인간 IgG4 서브클래스의 이종이합체성 Fc-영역 및
a) 하나의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366W 를 포함하고, 다른 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 포함하거나, 또는
b) 하나의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366W 및 Y349C 를 포함하고, 다른 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 S354C 를 포함하거나, 또는
c) 하나의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366W 및 S354C 를 포함하고, 다른 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C 를 포함함,
또는
vi) i), ii), 및 iii) 중 하나와 iv), 및 v) 중 하나의 조합.
본원에서 보고되는 바와 같은 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, CH3 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 추가적인 C-말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, Kabat EU 지수에 따른 번호 부여) 를 포함한다. 본원에서 보고되는 바와 같은 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, CH3 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 추가적인 C-말단 글리신 잔기 (G446, Kabat EU 지수에 따른 번호 부여) 를 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 돌연변이 PVA236, L234A/L235A, 및/또는 GLPSS331 (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호 부여) 를 갖는 인간 서브클래스 IgG1, 또는 서브클래스 IgG4 인 것을 특징으로 하는 Fc-영역을 포함한다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 임의의 IgG 클래스의 Fc-영역, 하나의 구현예에 있어서, E233, L234, L235, G236, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 및/또는 P329 (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호 부여) 에 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는, IgG1 또는 IgG4 서브클래스의 Fc-영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, 또는 돌연변이 S228P 및 L235E (Angal, S., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108) (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호 부여) 를 함유하는 인간 IgG4 서브클래스의 Fc-영역을 포함한다.
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드에 포함되는 Fc-영역 폴리펩티드의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK 로 종결된 완전한 C-말단일 수 있다. C-말단은 C-말단 아미노산 잔기 중 하나 또는 두개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에 있어서, C-말단은 아미노산 잔기 PG 로 종결된 단축된 C-말단이다.
D) 이종이합체화
이종이합체화를 지원하기 위한 CH3-변형에 대한 몇몇 접근법이 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291 에 기술되어 있다.
전형적으로, 당분야에 공지된 접근법에서, 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인은 둘 모두 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄가 동일 구조의 다른 중쇄와 더 이상 동종이합체화될 수 없도록 상보적인 방식으로 조작된다 (예를 들어, CH3-조작된 제 1 중쇄는 더 이상 다른 CH3-조작된 제 1 중쇄와 동종이합체화될 수 없고, CH3-조작된 제 2 중쇄는 더 이상 다른 CH3-조작된 제 2 중쇄와 동종이합체화될 수 없음). 그리하여, 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄는 상보적인 방식으로 조작된 CH3 도메인을 포함하는 다른 중쇄와 이종이합체화된다. 이러한 구현예의 경우에 있어서, 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인이 아미노산 치환에 의해 상보적인 방식으로 조작되고, 그 결과로 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 이종이합체화되는 반면, 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 더 이상 동종이합체화되지 않는다 (예를 들어, 입체적 이유로).
상기에서 인용되고 포함된 당분야에 공지된 중쇄 이종이합체화를 지원하기 위한 상이한 접근법들은, 본원에서 보고되는 바와 같은 이종이합체성/다합체성 폴리펩티드 (예를 들어, 2/3-IgG) 를 제공하는데 사용되는 상이한 대안으로서 고려된다.
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 CH3 도메인은, 예를 들어 WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681 에서 몇가지 예로 상세하게 설명되어 있는 "노브-인투-홀" 기술에 의해 변경될 수 있다. 이러한 방법에서, 2 개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이들 2 개의 CH3 도메인을 함유하는 양 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 모두의 이종이합체화를 증가시키도록 변경된다. (2 개의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의) 각각의 2 개의 CH3 도메인은 "노브" 일 수 있는 반면, 나머지는 "홀" 이다. 디술피드 브릿지는 이종이합체를 더욱 안정화시키고 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35), 본 발명에 따른 교환 반응에서 수율을 증가시킨다.
하나의 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 "노브 사슬" 의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이, 및 "홀-사슬" 의 CH3 도메인에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여) 를 포함한다. 또한, CH3 도메인 사이의 추가적인 사슬간 디술피드 브릿지가, 예를 들어 노브 사슬의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 돌연변이, 및 홀 사슬의 CH3 도메인 중 하나에 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 도입함으로써 사용될 수 있다 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681) (본 발명에 따른 교환 반응에서는 2 개의 다합체가 출발 물질로서 사용되며, 상기 다합체의 CH3 도메인 중 하나만이 추가의 시스테인 잔기를 포함하여, 교환된 생성물에서만 추가의 디술피드 결합이 형성된다). 따라서, 또다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 제 1 다합체의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이, 및 제 2 다합체의 각각의 상보적인 CH3 도메인에 E356C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나; 또는 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 제 1 다합체의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이, 및 제 2 다합체의 각각의 상보적인 CH3 도메인에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다 (하나의 CH3 도메인 내 추가적인 Y349C 돌연변이 및 상응하는 CH3 도메인 내 추가적인 E356C 또는 S354C 돌연변이는 사슬간 디술피드 브릿지를 형성함) (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
그러나 또한, EP 1 870 459A1 에 기술된 바와 같은 다른 노브-인-홀 기술이 대안적으로 또는 추가적으로 사용될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 "노브 사슬" 의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이, 및 "홀-사슬" 의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 "노브 사슬" 의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인에 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이, 그리고 추가적으로 "노브 사슬" 의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 상보적인 CH3 도메인에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 상보적인 CH3 도메인에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이, 그리고 추가적으로 "노브 사슬" 의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
"노브-인투-홀 기술" 이외에, 이종이합체화가 강화되도록 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 중쇄의 CH3 도메인을 변형시키기 위한 다른 기술이 당분야에 공지되어 있다. 이들 기술은 특히 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 및 WO 2013/096291 에 기술된 것들이 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드와 조합하여 "노브-인투-홀 기술" 에 대한 대안으로서 본원에서 고려된다.
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, EP 1 870 459 A1 에 기술된 접근법을 사용하여 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 이종이합체화를 지원한다. 이러한 접근법은 제 1 및 제 2 중쇄 둘 모두 사이의 CH3/CH3-도메인-계면 내 특이적 아미노산 위치에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입을 기반으로 한다.
따라서, 이러한 구현예는 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드에 관한 것으로서, 여기에서 다합체의 3 차 구조에서 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인은 각각의 CH3 도메인 사이에 위치하는 계면을 형성하고, 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인의 각각의 아미노산 서열은 각각 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 3 차 구조의 상기 계면 내에 위치하는 아미노산 세트를 포함하며, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인의 계면에 위치하는 아미노산 세트로부터 제 1 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인의 계면에 위치하는 아미노산 세트로부터 제 2 아미노산은 음으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 이러한 구현예에 따른 다합체성 폴리펩티드는 본원에서 또한 "CH3(+/-)-조작된 다합체성 폴리펩티드" 라고 한다 (여기에서 약어 "+/-" 는 각각의 CH3 도메인에 도입된 반대로 하전된 아미노산을 의미함).
본 발명에 따른 상기 CH3(+/-)-조작된 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, 양으로 하전된 아미노산은 K, R 및 H 에서 선택되고, 음으로 하전된 아미노산은 E 또는 D 에서 선택된다.
본 발명에 따른 상기 CH3(+/-)-조작된 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, 양으로 하전된 아미노산은 K 및 R 에서 선택되고, 음으로 하전된 아미노산은 E 또는 D 에서 선택된다.
본 발명에 따른 상기 CH3(+/-)-조작된 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, 양으로 하전된 아미노산은 K 이고, 음으로 하전된 아미노산은 E 이다.
본원에서 보고되는 바와 같은 상기 CH3(+/-)-조작된 2/3-IgG 의 하나의 구현예에 있어서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 409 의 아미노산 R 은 D 로 치환되고, 위치 370 의 아미노산 K 는 E 로 치환되며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 399 의 아미노산 D 는 K 로 치환되고, 위치 357 의 아미노산 E 는 K 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, WO 2013/157953 에 기술된 접근법이 다합체성 폴리펩티드의 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 이종이합체화를 지원하는데 사용된다. 본 발명에 따른 상기 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 366 의 아미노산 T 는 K 로 치환되고, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 351 의 아미노산 L 은 D 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여). 본 발명에 따른 상기 다합체성 폴리펩티드의 또다른 구현예에 있어서, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 366 의 아미노산 T 는 K 로 치환되고, 위치 351 의 아미노산 L 은 K 로 치환되며, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 351 의 아미노산 L 은 D 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
본 발명에 따른 상기 다합체성 폴리펩티드의 또다른 구현예에 있어서, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 366 의 아미노산 T 는 K 로 치환되고, 위치 351 의 아미노산 L 은 K 로 치환되며, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 351 의 아미노산 L 은 D 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여). 추가로, 하기의 치환 중 하나 이상은 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에 포함된다: 위치 349 의 아미노산 Y 는 E 로 치환되고, 위치 349 의 아미노산 Y 는 D 로 치환되며, 위치 368 의 아미노산 L 은 E 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여). 하나의 구현예에 있어서, 위치 368 의 아미노산 L 은 E 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, WO 2012/058768 에 기재된 접근법이 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 제 1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 Fc-영역 폴리펩티드의 이종이합체화를 지원하는데 사용된다. 상기 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 351 에서의 아미노산 L 은 Y 로 치환되고, 위치 407 에서의 아미노산 Y 는 A 로 치환되고, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 366 에서의 아미노산 T 는 A 로 치환되고, 위치 409 에서의 아미노산 K 는 F 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여). 또다른 구현예에 있어서, 상기에서 언급한 치환 이외에, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 411 (본래 T), 399 (본래 D), 400 (본래 S), 405 (본래 F), 390 (본래 N) 및 392 (본래 K) 에서의 아미노산 중 하나 이상은 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여). 바람직한 치환은 다음과 같다:
- 위치 411 에서의 아미노산 T 를 N, R, Q, K, D, E 및 W 에서 선택되는 아미노산으로 치환 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여);
- 위치 399 에서의 아미노산 D 를 R, W, Y, 및 K 에서 선택되는 아미노산으로 치환 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여);
- 위치 400 에서의 아미노산 S 를 E, D, R 및 K 에서 선택되는 아미노산으로 치환 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여);
- 위치 405 에서의 아미노산 F 를 I, M, T, S, V 및 W 에서 선택되는 아미노산으로 치환 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여);
- 위치 390 에서의 아미노산 N 을 R, K 및 D 에서 선택되는 아미노산으로 치환 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여); 및
- 위치 392 에서의 아미노산 K 를 V, M, R, L, F 및 E 에서 선택되는 아미노산으로 치환 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드 (WO 2012/058768 에 따라서 조작됨) 의 또다른 구현예에 있어서, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 351 의 아미노산 L 은 Y 로 치환되고, 위치 407 의 아미노산 Y 는 A 로 치환되며, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 366 의 아미노산 T 는 V 로 치환되고, 위치 409 의 아미노산 K 는 F 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여). 본 발명에 따른 상기 다합체성 폴리펩티드의 또다른 구현예에 있어서, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 407 의 아미노산 Y 는 A 로 치환되고, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 366 의 아미노산 T 는 A 로 치환되며, 위치 409 의 아미노산 K 는 F 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여). 상기 마지막 언급한 구현예에 있어서, 상기 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 392 의 아미노산 K 는 E 로 치환되고, 위치 411 의 아미노산 T 는 E 로 치환되며, 위치 399 의 아미노산 D 는 R 로 치환되고, 위치 400 의 아미노산 S 는 R 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, WO 2011/143545 에 기술된 접근법이 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 제 1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 Fc-영역 폴리펩티드의 이종이합체화를 지원하는데 사용된다. 본 발명에 따른 상기 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, 둘 모두의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인 내 아미노산 변형은 위치 368 및/또는 409 에 도입된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, WO 2011/090762 에 기술된 접근법이 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 제 1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 Fc-영역 폴리펩티드의 이종이합체화를 지원하는데 사용된다. WO 2011/090762 는 "노브-인투-홀" 기술에 따른 아미노산 변형에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 CH3(KiH)-조작된 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 366 의 아미노산 T 는 W 로 치환되고, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 407 의 아미노산 Y 는 A 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여). 본 발명에 따른 상기 CH3(KiH)-조작된 다합체성 폴리펩티드의 또다른 구현예에 있어서, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 366 의 아미노산 T 는 Y 로 치환되고, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 407 의 아미노산 Y 는 T 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
IgG2 이소타입인, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, WO 2011/090762 에 기술된 접근법이 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 제 1 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 이종이합체화를 지원하는데 사용된다.
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, WO 2007/147901 에 기술된 접근법이 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 제 1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 Fc-영역 폴리펩티드의 이종이합체화를 지원하는데 사용된다. 본 발명에 따른 상기 다합체성 폴리펩티드의 구현예에 있어서, 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 253 의 아미노산 K 는 E 로 치환되고, 위치 282 의 아미노산 D 는 K 로 치환되며, 위치 322 의 아미노산 K 는 D 로 치환되고, 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드의 CH3 도메인에서 위치 239 의 아미노산 D 는 K 로 치환되며, 위치 240 의 아미노산 E 는 K 로 치환되고, 위치 292 의 아미노산 K 는 D 로 치환된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여).
본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 하나의 구현예에 있어서, WO 2007/110205 에 기재된 접근법은 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드의 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드의 이종이합체화를 지원하는데 사용된다.
본원에서 보고되는 바와 같은 모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 IgG 유형 항체의 불변 도메인 구조를 가진다. 본원에서 보고되는 바와 같은 모든 양태의 하나의 또다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 상기 다합체성 폴리펩티드가 인간 서브클래스 IgG1 의 Fc-영역, 또는 돌연변이 L234A 및 L235A 및 임의로 P329G 를 갖는 인간 서브클래스 IgG1 의 Fc-영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본원에서 보고되는 바와 같은 모든 양태의 하나의 또다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 상기 다합체성 폴리펩티드가 인간 서브클래스 IgG2 의 Fc-영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본원에서 보고되는 바와 같은 모든 양태의 하나의 또다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 상기 다합체성 폴리펩티드가 인간 서브클래스 IgG3 의 Fc-영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본원에서 보고되는 바와 같은 모든 양태의 하나의 또다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 상기 다합체성 폴리펩티드가 인간 서브클래스 IgG4 의 Fc-영역, 또는 추가의 돌연변이 S228P 및 L235E 및 임의로 P329G 를 갖는 인간 서브클래스 IgG4 의 Fc-영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
모든 양태의 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 다합체성 폴리펩티드는 제 1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하고, 여기에서,
i) 제 1 및 제 2 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 Y436A 를 포함하거나, 또는
ii) 제 1 및 제 2 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A 를 포함하거나, 또는
iii) 제 1 및 제 2 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A 를 포함하거나, 또는
iv) 제 1 및 제 2 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D 를 포함하거나, 또는
v) 제 1 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 Y436A 를 포함하고, 제 2 Fc-영역 폴리펩티드는
a) 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A, 또는
b) 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A, 또는
c) 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D
를 포함하거나, 또는
vi) 제 1 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A 를 포함하고, 제 2 Fc-영역 폴리펩티드는
a) 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A, 또는
b) 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D
를 포함하거나, 또는
vii) 제 1 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A 를 포함하고, 제 2 Fc-영역 폴리펩티드는
a) 돌연변이 L251D, L314D 및 L432D
를 포함한다.
V. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어 US 4,816,567 에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 본원에서 기술한 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 또다른 구현예에 있어서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 또다른 구현예에 있어서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 구현예에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 림프 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0 세포) 이다. 하나의 구현예에 있어서, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 의 제조 방법이 제공되며, 여기에서 상기 방법은 상기에서 제공되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 임의로 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 회수하는 것을 포함한다.
중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 의 재조합 생성을 위해, 예를 들어 상기에서 기술한 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 코딩하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다.
중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG- 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab-코딩 벡터의 클로닝 및/또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에서 기술한 바와 같은 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다.
예를 들어, 항체는 박테리아에서, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 때, 생성될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523 을 참조한다. (또한, Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 참조, 대장균에서의 항체 단편의 발현을 설명함). 발현 후, 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있으며, 추가로 정제될 수 있다.
원핵 생물 이외에, 사상성 진균 또는 효모와 같은 진핵 생물 미생물은, 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 부분적 또는 전체적 인간 글리코실화 패턴으로 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 의 생성을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하는, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG- 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab-코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참조.
중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 글리코실화된 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 글리코실화된 2/3-BiFab 의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추 동물 및 척추 동물) 로부터 유래한다. 무척추 동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질 주입에 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429 참조 (형질 전환 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 설명).
척추 동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유 동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유 동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 (COS-7) 에 의해 형질 전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 주 (예를 들어, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들어, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유 동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 을 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정한 포유 동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268 을 참조한다.
VI. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정한 구현예에 있어서, 본원에 제공된 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 는 생물학적 샘플에서 이들의 표적의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "검출" 은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정한 구현예에 있어서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 가 제공된다.
특정한 구현예에 있어서, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 표지된 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 표지된 2/3-BiFab 가 제공된다. 표지는, 비제한적으로, 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학 발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라, 간접적으로, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호 작용을 통해 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 부분을 포함한다. 예시적인 표지는, 비제한적으로, 방사성 동위 원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라아제, 예를 들어 반딧불 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제 (US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당 옥시다아제, 예를 들어 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나아제, HRP, 락토퍼옥시다아제 또는 마이크로퍼옥시다아제와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해서 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된, 우리카아제 및 크산틴 옥시다아제와 같은 헤테로시클릭 옥시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함한다.
VII. 면역 접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포 독성제, 예컨대 화학 요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위 원소에 접합된, 본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 포함하는 면역 접합체를 제공한다.
하나의 구현예에 있어서, 면역 접합체는, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 가, 비제한적으로, 마이탄시노이드 (US 5,208,020, US 5,416,064 및 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸 아우리스타틴 약물 부분 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (US 5,635,483, US 5,780,588, 및 US 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 이의 유도체 (US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001, 및 US 5,877,296; Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; 및 Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343; 및 US 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065 를 포함하는 하나 이상의 약물에 접합된, 항체-약물 접합체 (ADC) 이다.
또다른 구현예에 있어서, 면역 접합체는, 비제한적으로, 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된, 본원에서 기술한 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 포함한다. 예를 들어, WO 93/21232 (Oct. 28, 1993 공개) 참조.
또다른 구현예에 있어서, 면역 접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사 접합체를 형성하는, 본원에서 기술한 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 포함한다. 다양한 방사성 동위 원소가 방사 접합체의 생성에 이용 가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu 의 방사성 동위 원소를 포함한다. 방사 접합체가 검출을 위해 사용될 때, 이것은 섬광 조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 TC99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상 (자기 공명 영상, MRI 로도 알려짐) 을 위한 스핀 라벨, 예컨대 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 및 세포 독성제의 접합체는 다양한 이관능성 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역 독소는 Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조. 링커는 세포에서 세포 독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단 가능한 링커" 일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광-불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; US 5,208,020) 가 사용될 수 있다.
면역 접합체 또는 ADC 는 본원에서, 비제한적으로, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A. 에서 입수 가능함) 를 포함하는 가교제 시약으로 제조된 이러한 접합체를 비제한적으로 고려한다.
또한, 본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아마이신, 마이탄신 (US 5,208,020), 트리코텐, 및 CC1065 의 접합체가 본원에서 고려된다. 본 발명의 하나의 구현예에 있어서, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 는 하나 이상의 마이탄신 분자에 접합된다 (예를 들어, 길항제 분자 당 약 1 내지 약 10 개의 마이탄신 분자). 마이탄신은, 예를 들어 May-SS-Me 로 전환될 수 있으며, 이는 May-SH3 로 환원되고, 변형된 길항제 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) 와 반응하여, 마이탄시노이드-항체 접합체를 생성할 수 있다.
대안적으로, 본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 는 하나 이상의 칼리케아마이신 분자에 접합된다. 칼리케아마이신 계열의 항생제는 피코몰 이하의 농도에서 이중-가닥 DNA 절단을 생성할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조적 유사체는, 비제한적으로, γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1 을 포함한다 (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) 및 Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).
본 발명은 핵산 분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 과 접합된, 본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 추가로 고려한다.
대안적으로, 본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 포함하는 융합 단백질, 및 세포 독성제는, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.
VIII. 약학 제제
본원에서 기술한 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물의 약학 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 이러한 2/3-IgG (들) 또는 2/3-BiFab (들)를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용 가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)) 와 혼합함으로써, 동결 건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비-독성이며, 다음의 것을 비제한적으로 포함한다: 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예컨대, 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당, 이당, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 본원에서 침입형 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 을 추가로 포함한다. rhuPH20 을 포함하는 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어 있다. 하나의 양태에 있어서, sHASEGP 는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결 건조된 항체 제제는 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것을 포함하며, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
피하 투여에 적합한 동결 건조된 제제는 WO 97/04801 에 기재되어 있다. 이러한 동결 건조된 제제는 적합한 희석제에 의해 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있으며, 재구성된 제제는 본원에서 치료되는 포유 동물에 피하 투여될 수 있다.
본원에서의 제제는 또한 치료되는 특정한 징후에 필요한 2 개 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐에서, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 에서 또는 마크로에멀젼에서 포획될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980) 에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐 알코올)), 폴리락티드 (US 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 제제는 등장성이다.
IX. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공되는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물 중 임의의 것이 상기 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양태에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정한 구현예에 있어서, 상기 치료 방법에서 사용하기 위한, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따른 "개체" 는 바람직하게는 인간이다.
또다른 양태에 있어서, 본원에는 의약의 제조 또는 조제에서의, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
또다른 양태에 있어서, 본원에는 질환의 치료 방법이 제공된다. 하나의 구현예에 있어서, 상기 방법은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물의 유효량을 질환을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에 있어서, 상기 방법은 하기에서 제시하는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
또다른 양태에 있어서, 본원에는, 예를 들어 상기 치료 방법 중 임의의 방법에서 사용하기 위한, 본원에서 제공되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 본원에서 제공되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 본원에서 제공되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물 중 임의의 것을 포함하는 약학 제제가 제공된다. 하나의 구현예에 있어서, 약학 제제는 본원에서 제공되는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물 중 임의의 것 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 또다른 구현예에 있어서, 약학 제제는 본원에서 제공되는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물 중 임의의 것 및, 예를 들어 하기에서 제시하는 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물은 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물은 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다.
상기에서 나타낸 이러한 조합 요법은 병용 투여 (2 개 이상의 치료제가 동일하거나 또는 별도의 제제에 포함되는 경우), 및 개별 투여를 포함하며, 이 경우, 본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물의 투여는 추가의 치료제의 투여 전에, 동시에, 및/또는 이후에 발생할 수 있다. 본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물은 또한, 비제한적으로, 방사선 요법, 행동 요법, 또는 당업계에 공지되어 있으며, 치료 또는 예방되는 신경학적 장애에 적절한 다른 요법과 같은 다른 중재 요법과 함께 사용될 수 있다.
본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물 (및 임의의 추가의 치료제) 은 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국소 치료에 필요한 경우, 병변내 투여를 비롯한, 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 투여가 단기인지 또는 만성인지에 부분적으로 의존하여, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의한 것일 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 비제한적으로 포함하는 다양한 투여 일정이 본원에서 고려된다.
본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물은 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 요소는 치료되는 특정한 장애, 치료되는 특정한 포유 동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 요인을 포함한다. 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물은, 반드시 필요하지는 않지만, 해당 장애를 예방 또는 치료하기 위해서 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 임의로 제제화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제제에 존재하는 치료제의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에서 논의한 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에서 기술한 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로로, 또는 본원에서 기술한 투여량의 약 1 내지 99 % 의 투여량으로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정되는 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
BBB 를 따라 화합물을 수송하는 지질-기반 방법은, 비제한적으로, BBB 의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 1 가 결합 엔터티에 커플링되는 리포좀에서 융합 구조물 또는 화합물을 캡슐화하고 (예를 들어, US 2002/0025313 참조), 저밀도 지단백질 입자 (예를 들어, US 2004/0204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들어, US 2004/0131692 참조) 에서 1 가 결합 엔터티를 코팅하는 것을 포함한다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용되는 경우) 의 적절한 투여량은 치료되는 질환의 유형, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전의 치료, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 것이다. 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물은 한번에 또는 일련의 치료 동안에 환자에게 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 의 항체가, 예를 들어 하나 이상의 개별 투여에 의하든, 또는 연속 주입에 의하든, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 상기에서 언급한 인자에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 상태에 따라 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 중 하나 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3 주 마다 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20 회, 또는 예를 들어 약 6 회 투여량의 항체를 수용하도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 투여량에 이어서, 하나 이상의 보다 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 계획이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
상기 제제 또는 치료 방법 중 임의의 것은, 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab, 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2 개의 상이한 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물 대신에 또는 이에 추가하여, 본원에서 보고되는 바와 같은 면역 접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 보고되는 바와 같은 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG 또는 중쇄-중쇄 간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 를 포함하는 조성물은 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 요소는 치료되는 특정한 질환 또는 장애, 치료되는 특정한 포유 동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환 또는 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 요인을 포함한다. 투여되는 치료적 유효량은 이러한 고려 사항에 의해 좌우될 것이다.
그러나, 상기에서 언급한 바와 같이, 이들 제안된 투여량은 많은 치료적 재량에 따른다. 적절한 투여량 및 일정을 선택하는데 있어서 핵심 요소는 상기에서 나타낸 바와 같이 수득된 결과이다. 예를 들어, 진행성 및 급성 질환의 치료를 위해 초기에 비교적 높은 투여량이 필요할 수 있다. 질환 또는 장애에 따라 가장 효과적인 결과를 수득하기 위해서, 길항제는 질환 또는 장애의 첫번째 징후, 진단, 출현 또는 발생에 가능한 한 가깝게, 또는 질환 또는 장애의 완화 동안에 투여된다.
추가의 치료제를 항체에 접합시키기 위한 일반적인 기술은 충분히 공지되어 있다 (예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62 (1982) 119-58 참조).
X. 제조 물품
본원에서 보고되는 바와 같은 또다른 양태에 있어서, 상기에서 기술한 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 보틀, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는, 그 자체이거나 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또다른 조성물과 조합되는 조성물을 보유하며, 멸균 액세스 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본원에서 보고되는 바와 같은 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은, 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 본원에서 보고되는 바와 같은 항체를 포함하는 조성물이 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포 독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서의 제조 물품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들 및 시린지를 비롯한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 제조 물품 중 임의의 것은 본원에서 보고되는 바와 같은 이중특이적 항체 대신에 또는 이에 추가하여, 본원에서 보고되는 바와 같은 면역 접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
XI. 본 발명의 특정한 구현예의 세트
제 1 세트:
1. 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 다합체성 2/3-BiFab 폴리펩티드:
여기에서 두 폴리펩티드는 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66), 항체 가변 도메인, 및 인간 면역글로불린 (IgG1) CH3 도메인을 포함하고,
여기에서 i) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 결합 부위 또는 결합 부위의 적어도 일부를 포함하고,
여기에서 제 2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 서열 (CH3 도메인) 에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 비-공유 이합체이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 비-기능성 결합 부위를 형성함.
2. 구현예 1 에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
제 2 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
여기에서 CH3 도메인은 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (CH3 도메인) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하는
다합체성 2/3-BiFab 폴리펩티드.
3. 구현예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 다합체성 폴리펩티드가 추가의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합되는 다합체성 2/3-BiFab 폴리펩티드.
4. 다음을 포함하는 조성물:
다음을 포함하는 제 1 이종삼합체성 2/3-BiFab 폴리펩티드:
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
및
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 CH3 도메인은 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함함,
및
제 3 폴리펩티드로서, 추가의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합됨,
및
다음을 포함하는 제 2 이종삼합체성 2/3-BiFab 폴리펩티드:
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 CH3 도메인은 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 2 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함함,
및
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인임,
및
제 3 폴리펩티드로서, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 여기에서 제 6 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합됨,
여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하며, 여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드 및 제 2 이종삼합체 폴리펩티드의 제 1 폴리펩티드는 상이한 위치에서 교란 돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 2 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 기능성 결합 부위를 형성하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 2 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인은 가변 도메인의 비-기능적 쌍을 형성함.
5. 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 다합체성 2/3-IgG 폴리펩티드:
여기에서 두 폴리펩티드는 인간 면역글로불린 CH3 도메인을 포함하고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 결합 부위 또는 결합 부위의 적어도 일부를 포함하고,
여기에서 제 2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (CH3 도메인) 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 비-공유 또는 공유 이합체임.
6. 구현예 5 에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 중쇄 가변 도메인,
iv) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
v) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
vi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 경쇄 가변 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
x) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인,
xi) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인, 및
xii) 결합 도메인의 제 1 부분, 임의로 제 1 펩티드 링커, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 제 2 펩티드 링커, 및 결합 도메인의 제 2 부분, 여기에서 결합 도메인의 제 1 부분 및 결합 도메인의 제 2 부분은 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 포함함
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
제 2 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 돌연변이 노브 또는 홀-돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하는
다합체성 2/3-IgG 폴리펩티드.
7. 구현예 5 또는 6 중 어느 하나에 있어서, 다합체성 폴리펩티드가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합되는 다합체성 2/3-IgG 폴리펩티드.
8. 다음을 포함하는 조성물:
다음을 포함하는 제 1 이종삼합체성 2/3-IgG 폴리펩티드:
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 중쇄 가변 도메인,
iv) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
v) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
vi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 경쇄 가변 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
x) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인,
xi) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인, 및
xii) 결합 도메인의 제 1 부분, 임의로 제 1 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 제 2 펩티드 링커, 및 결합 도메인의 제 2 부분, 여기에서 결합 도메인의 제 1 부분 및 결합 도메인의 제 2 부분은 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 형성함
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함함,
및
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함함,
및
제 3 폴리펩티드로서, 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합된, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드,
및
다음을 포함하는 제 2 이종삼합체성 2/3-IgG 폴리펩티드:
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 CH3 도메인은 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 2 폴리펩티드는 제 2 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인의) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함함,
및
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 중쇄 가변 도메인,
iv) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
v) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
vi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 경쇄 가변 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
x) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인,
xi) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인, 및
xii) 결합 도메인의 제 1 부분, 임의로 제 1 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 제 2 펩티드 링커, 및 결합 도메인의 제 2 부분, 여기에서 결합 도메인의 제 1 부분 및 결합 도메인의 제 2 부분은 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 포함함
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함함,
및
제 3 폴리펩티드로서, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합됨,
여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하며, 여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드 및 제 2 이종삼합체 폴리펩티드의 제 1 폴리펩티드는 상이한 위치에서 교란 돌연변이를 포함함.
9. 구현예 5, 6, 및 7 중 어느 하나에 따른 2/3-IgG, 또는 구현예 1, 2, 및 3 중 어느 하나에 따른 2/3-BiFab, 또는 구현예 4, 및 8 중 어느 하나에 따른 조성물, 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 제제.
10. 다음을 포함하는 약학 제제:
제 1, 제 2, 및 제 3 단량체성 폴리펩티드를 포함하는 제 1 이종삼합체성 폴리펩티드,
및
제 4, 제 5, 및 제 6 단량체성 폴리펩티드를 포함하는 제 2 이종삼합체성 폴리펩티드,
여기에서 제 1, 제 2, 제 4 및 제 5 단량체성 폴리펩티드는 각각 N-말단에서 C-말단 방향으로
(i) 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66),
(ii) 제 1 항체 가변 도메인, 및
(iii) 인간 면역글로불린 (IgG1) CH3 도메인
을 포함하고,
여기에서 (i), (ii) 및 (iii) 은 서로 독립적으로 직접 또는 펩티드 링커를 통해 서로 접합되고,
여기에서 i) 제 1 및 제 2 단량체성 폴리펩티드, 및 ii) 제 1 및 제 4 단량체성 폴리펩티드, iii) 제 2 및 제 5 단량체성 폴리펩티드, 및 iv) 제 4 및 제 5 단량체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인은 각각 VH/VL 쌍이고,
여기에서 i) 제 1 및 제 4 단량체성 폴리펩티드, 및 ii) 제 1 및 제 2 단량체성 폴리펩티드, iii) 제 2 및 제 5 단량체성 폴리펩티드, 및 iv) 제 4 및 제 5 단량체성 폴리펩티드의 CH3 도메인은 각각 노브-인투-홀 쌍이고,
여기에서 제 1 단량체성 폴리펩티드 및 제 4 단량체성 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로 이들의 N- 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두에서 서로 독립적으로 scFv, 또는 scFab, 또는 Fab 를 포함하고,
여기에서 제 2 및 제 5 단량체성 폴리펩티드는 각각 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 단량체성 폴리펩티드는 제 2 단량체성 폴리펩티드의 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하며, 여기에서 제 4 단량체성 폴리펩티드는 제 5 단량체성 폴리펩티드의 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하며, 여기에서 제 2 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 5 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 아미노산 서열에서 동일한 위치에 있지 않으며, 여기에서 제 2 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이 및 제 5 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 2 단량체성 폴리펩티드 및 제 5 단량체성 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때 인력 (전하) 상호 작용을 야기하고, 여기에서 제 2 및 제 5 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 각각 제 2 단량체성 폴리펩티드가 제 1 단량체성 폴리펩티드와 이종이합체를 형성하고 제 5 단량체성 폴리펩티드가 제 4 단량체성 폴리펩티드와 이종이합체를 형성할 때 반발 (전하) 상호 작용을 야기하고,
여기에서 제 1 및 제 2 단량체성 폴리펩티드는 비-공유 이합체이고, 제 4 및 제 5 단량체성 폴리펩티드는 비-공유 이합체이고, 제 3 및 제 1 단량체성 폴리펩티드는 디술피드-연결된 이합체이고, 제 6 및 제 4 단량체성 폴리펩티드는 디술피드-연결된 이합체이고,
여기에서 제 3 및 제 6 단량체성 폴리펩티드는 항체 경쇄임.
11. 구현예 10 에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되고,
제 3 폴리펩티드가 추가의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드이고, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합되는
약학 제제.
12. 구현예 10 및 11 중 어느 하나에 있어서, 제 2 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 CH3 도메인은 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하는
약학 제제.
13. 구현예 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 제 5 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되고,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 CH3 도메인은 E345R, Q347K, Y349W, Y349E, L351F, L351Y, S354E, S354V, D356S, D356A, D356K, E357S, E357A, E357L, E357F, E357K, K360S, K360E, Q362E, S364V, S364L, T366I, L368F, L368V, K370E, N390E, K392E, K392D, T394I, V397Y, D399A, D399K, S400K, D401R, F405W, Y407W, Y407L, Y407I, K409D, K409E, K409I, K439E, L441Y, Y349C, S366T, A368L, V407Y, S354C, 및 W366T 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 5 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하며, 여기에서 제 5 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 상이한 위치에 있는
약학 제제.
14. 구현예 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 제 4 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되고,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 4 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 4 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
제 6 폴리펩티드가 추가의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드이고, 여기에서 제 6 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 4 폴리펩티드에 공유 결합되는
약학 제제.
15. 구현예 10 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인 및 제 4 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인이 기능성 결합 부위를 형성하고, 제 2 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인 및 제 5 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인이 가변 도메인의 비-기능적 쌍을 형성하는 약학 제제.
제 2 세트:
1. 다음을 포함하는 다합체성 폴리펩티드:
N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 가변 도메인 및 인간 면역글로불린 G CH3 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 가변 도메인 및 인간 면역글로불린 G CH3 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드,
여기에서 i) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 서열 (CH3 도메인) 에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 비-공유 이합체이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 비-기능성 결합 부위를 형성하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드는 기능성 결합 부위를 추가로 포함함.
2. 구현예 1 에 있어서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 각각이 가변 도메인에 대해 N-말단에 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) 또는 DKTHT (SEQ ID NO: 94) 또는 GGGS (SEQ ID NO: 69) 또는 DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) 를 포함하는 다합체성 폴리펩티드.
3. 다음을 포함하는 다합체성 폴리펩티드:
N-말단에서 C-말단 방향으로 인간 면역글로불린 G CH3 도메인 및 항체 가변 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩티드,
N-말단에서 C-말단 방향으로 인간 면역글로불린 G CH3 도메인 및 항체 가변 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩티드,
여기에서 i) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 서열 (CH3 도메인) 에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 비-공유 이합체이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인 및 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 비-기능성 결합 부위를 형성하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드는 기능성 결합 부위를 추가로 포함함.
4. 구현예 4 에 있어서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 각각이 CH3 도메인에 대해 N-말단에 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) 또는 GGGS (SEQ ID NO: 69) 또는 DKTHT (SEQ ID NO: 94) 또는 DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) 를 포함하는 다합체성 폴리펩티드.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, i) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인이 노브-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인이 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인이 홀-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인이 노브-돌연변이를 포함하는 다합체성 폴리펩티드.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, i) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인이 노브-cys-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인이 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인이 홀-cys-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인이 노브-돌연변이를 포함하는 다합체성 폴리펩티드.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 교란 돌연변이가 D356K, E357K, K370E 및 K439E 를 포함하는 돌연변이의 군에서 선택되는 다합체성 폴리펩티드.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인이 인간 IgG1 CH3 도메인 또는 인간 IgG2 CH3 도메인 또는 인간 IgG3 CH3 도메인 또는 인간 IgG4 CH3 도메인인 다합체성 폴리펩티드.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서,
i) 제 1 폴리펩티드가 노브- 또는 노브-cys-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드가 교란 돌연변이 D356K 및 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는
ii) 제 1 폴리펩티드가 노브- 또는 노브-cys-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드가 교란 돌연변이 E357K 및 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는
iii) 제 1 폴리펩티드가 홀- 또는 홀-cys-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드가 교란 돌연변이 K370E 및 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는
iv) 제 1 폴리펩티드가 홀- 또는 홀-cys-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드가 교란 돌연변이 K439E 및 노브-돌연변이를 포함하는
다합체성 폴리펩티드.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
ii) 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
vi) 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 중쇄 가변 도메인,
x) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 경쇄 가변 도메인,
xiii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
xiv) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인,
xv) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 중쇄 가변 도메인,
xvi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인,
xvii) 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인,
xviii) 경쇄 가변 도메인, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및
xiv) 중쇄 가변 도메인, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
제 2 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인,
또는
ii) 임의로 SEQ ID NO: 66 또는 69 또는 94 또는 97, 인간 면역글로불린 G CH3 도메인 및 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
여기에서 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E, 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (CH3 도메인) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하는
다합체성 폴리펩티드.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 다합체성 폴리펩티드가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합되는 다합체성 폴리펩티드.
12. 다음을 포함하는 조성물:
구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 제 1 다합체성 폴리펩티드,
및
구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 제 2 다합체성 폴리펩티드,
여기에서,
i) 제 1 다합체성 폴리펩티드에서 교란 돌연변이는 D356K 이고, 제 2 다합체성 폴리펩티드에서 교란 돌연변이는 K439E 이고,
또는
ii) 제 1 다합체성 폴리펩티드에서 교란 돌연변이는 E357K 이고, 제 2 다합체성 폴리펩티드에서 교란 돌연변이는 K370E 임.
13. 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 다합체성 폴리펩티드:
여기에서 두 폴리펩티드는 인간 면역글로불린 CH3 도메인을 포함하고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드는 하나 이상의 기능성 결합 부위 또는 결합 부위의 적어도 일부를 포함하고,
여기에서 제 2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (CH3 도메인) 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하고,
여기에서 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드는 비-공유 또는 공유 이합체임.
14. 구현예 13 에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 중쇄 가변 도메인,
iv) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
v) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
vi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 경쇄 가변 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
x) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인,
xi) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인, 및
xii) 결합 도메인의 제 1 부분, 임의로 제 1 펩티드 링커, SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 제 2 펩티드 링커, 및 결합 도메인의 제 2 부분, 여기에서 결합 도메인의 제 1 부분 및 결합 도메인의 제 2 부분은 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 포함함
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
제 2 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 65 또는 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 돌연변이 노브 또는 홀-돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드이고,
여기에서 D356K, E357K, K370E, 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하는
다합체성 폴리펩티드.
15. 구현예 13 또는 14 중 어느 하나에 있어서, 다합체성 폴리펩티드가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합되는 다합체성 폴리펩티드.
16. 다음을 포함하는 조성물:
다음을 포함하는 제 1 다합체성 폴리펩티드:
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 중쇄 가변 도메인,
iv) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
v) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
vi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 경쇄 가변 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
x) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인,
xi) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인, 및
xii) 결합 도메인의 제 1 부분, 임의로 제 1 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 제 2 펩티드 링커, 및 결합 도메인의 제 2 부분, 여기에서 결합 도메인의 제 1 부분 및 결합 도메인의 제 2 부분은 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 포함함
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 포함함,
및
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 D356K, E357K, K370E, 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린 (IgG1) 에서 상호 작용하는 아미노산 위치에서의 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 (IgG1) 야생형 아미노산 잔기를 포함함,
및
제 3 폴리펩티드로서, 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합된, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드,
및
다음을 포함하는 제 2 다합체성 폴리펩티드:
제 1 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E, 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 2 폴리펩티드는 제 2 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인의) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함함,
및
제 2 폴리펩티드로서, N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 중쇄 가변 도메인,
iv) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
v) 제 1 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
vi) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 경쇄 가변 도메인,
ix) 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
x) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인,
xi) 제 1 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인, 및
xii) 결합 도메인의 제 1 부분, 임의로 제 1 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 인간 IgG1 CH2 도메인으로부터 유래된 CH2 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 제 2 펩티드 링커, 및 결합 도메인의 제 2 부분, 여기에서 결합 도메인의 제 1 부분 및 결합 도메인의 제 2 부분은 표적에 특이적으로 결합하는 기능성 결합 부위를 포함함
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되는 폴리펩티드,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함함,
및
제 3 폴리펩티드로서, 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합됨,
여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드의 CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고, 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드의 CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하며, 여기에서 i) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 ii) 제 1 이종삼합체의 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, 제 2 이종삼합체 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드 및 제 2 이종삼합체 폴리펩티드의 제 1 폴리펩티드는 상이한 위치에서 교란 돌연변이를 포함함.
17. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 다합체성 폴리펩티드, 또는 구현예 16 에 따른 조성물, 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 제제.
18. 다음을 포함하는 약학 제제:
제 1, 제 2, 및 제 3 단량체성 폴리펩티드를 포함하는 제 1 이종삼합체성 폴리펩티드,
및
제 4, 제 5, 및 제 6 단량체성 폴리펩티드를 포함하는 제 2 이종삼합체성 폴리펩티드,
여기에서 제 1, 제 2, 제 4 및 제 5 단량체성 폴리펩티드는 각각 N-말단에서 C-말단 방향으로
(i) 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66),
(ii) 제 1 항체 가변 도메인, 및
(iii) 인간 면역글로불린 (IgG1) CH3 도메인
을 포함하고,
여기에서 (i), (ii) 및 (iii) 은 서로 독립적으로 직접 또는 펩티드 링커를 통해 서로 접합되고,
여기에서 i) 제 1 및 제 2 단량체성 폴리펩티드, 및 ii) 제 1 및 제 4 단량체성 폴리펩티드, iii) 제 2 및 제 5 단량체성 폴리펩티드, 및 iv) 제 4 및 제 5 단량체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인은 각각 VH/VL 쌍이고,
여기에서 i) 제 1 및 제 4 단량체성 폴리펩티드, 및 ii) 제 1 및 제 2 단량체성 폴리펩티드, iii) 제 2 및 제 5 단량체성 폴리펩티드, 및 iv) 제 4 및 제 5 단량체성 폴리펩티드의 CH3 도메인은 각각 노브-인투-홀 쌍이고,
여기에서 제 1 단량체성 폴리펩티드 및 제 4 단량체성 폴리펩티드는 각각 서로 독립적으로 이들의 N- 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두에서 서로 독립적으로 scFv, 또는 scFab, 또는 Fab 를 포함하고,
여기에서 제 2 및 제 5 단량체성 폴리펩티드는 각각 CH3 도메인에서 하나 이상의 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 단량체성 폴리펩티드는 제 2 단량체성 폴리펩티드의 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하며, 여기에서 제 4 단량체성 폴리펩티드는 제 5 단량체성 폴리펩티드의 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하며, 여기에서 제 2 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 5 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 아미노산 서열에서 동일한 위치에 있지 않으며, 여기에서 제 2 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이 및 제 5 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 2 단량체성 폴리펩티드 및 제 5 단량체성 폴리펩티드가 이종이합체를 형성할 때 인력 (전하) 상호 작용을 야기하고, 여기에서 제 2 및 제 5 단량체성 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 각각 제 2 단량체성 폴리펩티드가 제 1 단량체성 폴리펩티드와 이종이합체를 형성하고 제 5 단량체성 폴리펩티드가 제 4 단량체성 폴리펩티드와 이종이합체를 형성할 때 반발 (전하) 상호 작용을 야기하고,
여기에서 제 1 및 제 2 단량체성 폴리펩티드는 비-공유 이합체이고, 제 4 및 제 5 단량체성 폴리펩티드는 비-공유 이합체이고, 제 3 및 제 1 단량체성 폴리펩티드는 디술피드-연결된 이합체이고, 제 6 및 제 4 단량체성 폴리펩티드는 디술피드-연결된 이합체이고,
여기에서 제 3 및 제 6 단량체성 폴리펩티드는 항체 경쇄임.
19. 구현예 18 에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되고,
제 3 폴리펩티드가 추가의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드이고, 여기에서 제 3 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 1 폴리펩티드에 공유 결합되는
약학 제제.
20. 구현예 18 및 19 중 어느 하나에 있어서, 제 2 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 2 폴리펩티드의 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E, 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 1 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하는
약학 제제.
21. 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제 5 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되고,
여기에서 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 이종삼합체의 제 2 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우, CH3 도메인은 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 CH3 도메인은 D356K, E357K, K370E, 및 K439E 로 이루어진 돌연변이의 군에서 선택되는 제 2 교란 돌연변이를 포함하며, 여기에서 제 5 폴리펩티드는 교란 돌연변이에서의 아미노산 잔기와 야생형 면역글로불린에서 상호 작용하는 아미노산 위치(들)에서의 (CH3 도메인) 아미노산 서열에 인간 면역글로불린 야생형 아미노산 잔기(들)를 포함하며, 여기에서 제 5 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이는 제 2 폴리펩티드에서의 교란 돌연변이와 상이한 위치에 있는
약학 제제.
22. 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제 4 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로
i) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
ii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 중쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH1 도메인,
iii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 중쇄 가변 도메인,
iv) scFv, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
v) scFab, 임의로 펩티드 링커, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 및 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인,
vi) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
vii) SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
viii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
ix) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인,
x) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFv,
xi) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 및 scFab,
xii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인, 및 제 2 경쇄 가변 도메인,
xiii) 제 2 중쇄 가변 도메인, 제 1 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 2 경쇄 가변 도메인, 및 제 2 인간 IgG1 CH1 도메인,
xiv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 제 3 중쇄 가변 도메인, 및 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및
xv) 제 2 중쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH1 도메인, SEQ ID NO: 66 의 힌지 영역, 제 1 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1 CH3 도메인으로부터 유래된 CH3 도메인, 임의로 펩티드 링커, 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인, 및 제 3 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 폴리펩티드의 군에서 선택되고,
여기에서 제 1 폴리펩티드가 홀-돌연변이를 포함하는 경우 노브-돌연변이를 포함하거나, 또는 제 1 폴리펩티드가 노브-돌연변이를 포함하는 경우 홀-돌연변이를 포함하고,
여기에서 i) 제 1 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인이 경쇄 가변 도메인인 경우, 제 4 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이고, 또는 ii) 제 1 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인이 중쇄 가변 도메인인 경우, 제 4 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이고,
제 6 폴리펩티드가 추가의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드이고, 여기에서 제 6 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 제 4 폴리펩티드에 공유 결합되는
약학 제제.
23. 구현예 18 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 제 1 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인 및 제 4 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인이 기능성 결합 부위를 형성하고, 제 2 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인 및 제 5 폴리펩티드의 제 1 가변 도메인이 가변 도메인의 비-기능적 쌍을 형성하는 약학 제제.
하기의 실시예, 서열 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해서 제공되며, 그 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서, 기술된 절차에서 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
도 1: 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 예시적인 2/3-IgG 의 설계 및 모듈 조성.
도 2: 노브-cys 및 홀-cys 중쇄 (상부) 및 노브-cys 중쇄 및 MHCFcRP (중간부 및 하부) 사이의 상호 작용. 공유적 디술피드 결합은 점선으로 표시되고, 인력 상호 작용 쌍은 전체 구 사이의 선으로 표시되며, 반발성 상호 작용 또는 결과적인 입체 장애는 이중 화살표로 표시된다.
도 3A, 3B, 3C 및 3D: 상이한 MHCFcRP 를 갖는 정제된 2/3-IgG 의 SEC 크로마토그램: 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A 추출 후 2/3-IgG 제제의 SEC 프로파일이 도시되고; 각각의 프로파일의 주요 피크는 2/3-IgG 를 나타내며; 플루오레세인 (fluos; 항-fluos) 또는 비오틴 (bio; 항-bio) 결합 부위/특이성을 가짐 (실시예 2 참조). 도 3A: D356K (홀); 도 3B: K370E (노브); 도 3C: E357K (홀); 도 3D: K439E (노브).
도 4: 2/3-IgG 로 예시된 본 발명에 따른 교환 반응에 의한 bsAb (이중특이적 항체) 의 생성.
도 5: TCEP (2/3 입력 IgG 와 관련한 x 몰 당량) 는 힌지-디술피드 결합을 (부분적으로) 감소시키기 위해서 적용된다. SEC 는 2/3-IgG 출발 분자, 생성된 bsAb 및 이합체성 MHCFcRP 를 구별한다. 상이한 TCEP 농도에서의 모든 반응은 동일한 인큐베이션 시간 (삼각형: bsAb; 교차: 2/3-IgG, 다이아몬드: 이합체성 MHCFcRP) 후에 중단하였다.
도 6: 반응이 생체외에서 수행되는 경우, 원하는 bsAb 생성물로부터 원하지 않는 비-반응 입력 분자 및 부산물의 제거 계획.
도 7A 및 7B: 도 7A: 교환 반응 계획; 도 7B: NiNTA-정제의 SDS-Page; NiNTA-결합 (상부 패널) 은 NiNTA 로부터 용리된 단백질을 나타내고, NiNTA 통과액 (하부 패널) 은 His-6 또는 His-8 Tag 를 함유하지 않는 단백질이다; n.r. = 비-환원, r. = 환원; M = 마커.
도 8: 본 발명에 따른 교환 반응에 의해 생성된 bsAb 의 이중특이적 기능성. 기능성은 이중특이적 항체의 결합 부위의 동시 결합을 검출할 수 있는 브릿징 ELISA 에 의해 평가하였다. ELISA 플레이트에 코팅된 항원 A 는 플루오레세인 (fluos-BSA, FITC-BSA) 이었고, 항원 B 는 비오틴 (bio-Cy5) 이었으며, 이는 이의 형광에 의해 검출된다.
도 9: 중쇄의 C-말단에 결합 부위를 갖는 2/3-IgG-교환 반응에 대한 예시적인 2/3-IgG.
도 10: 중쇄의 N-말단 및 C-말단에 결합 부위를 갖는 2/3-IgG-교환 반응에 대한 예시적인 2/3-IgG.
도 11: 2/3-IgG 로 예시된, 상이한 결합 특이성 및 포맷의 출발 물질을 사용하여 IgG-교환 반응에 의해 나타낸 본 발명에 따른 방법의 일반적인 적용 가능성.
도 12: 예시적인 2/3-IgG 를 사용하여 본 발명에 따른 교환 반응을 통해 생성된 상이한 bsAb 포맷 매트릭스. 매트릭스는 플루오레세인 결합 엔터티 및 바이오시티나미드 결합 엔터티로 생성하였다. 입력 분자 및 교환-유도된 출력 분자는 도 11 에 도시되어 있다. 생성된 bsAb 의 기능성은 포획 항원으로서 fluos-BSA 및 bio-Cy5 를 사용해 ELISA 를 브릿징하여 이중특이적 결합 기능성을 검출함으로써 평가하였다. 브릿징 ELISA 로부터 유도된 신호는 모든 포맷이 이중특이적 결합 효능을 가진다는 것을 보여준다.
도 13: 소형화된 높은 처리량 및 자동화 호환성 접근법을 사용하는 본 발명에 따른 교환 반응을 통한 bsAb 다양성의 생성 및 특성화를 위한 매트릭스.
도 14: HTS 기술과 본 발명의 방법에 따른 교환 반응을 통한 이중특이적 항체 형성. 이중특이적 항체 형성을 나타내는 농도 의존성 형광 신호를 보여주는 예시적인 브리징 ELISA 의 신호가 도시되어 있다. Fluos-bio 브리징 ELISA, 교차: fluos [홀 / K370E] + bio [노브 / E357K], 다이아몬드: bio [홀 / K370E] + fluos [노브 / E357K]. 모든 다른 곡선: 동족 교환 파트너가 없는 2/3-IgG 입력 분자 (이들은 하나의 결합 부위만 존재하기 때문에, 브릿징 신호를 나타내지 않는다).
도 15: 힌지-영역 및 CH3 도메인 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG 로 예시된 본 발명에 따른 교환 반응의 반응식. 이것은 환원제를 첨가할 필요없이 본 발명에 따른 방법에서의 사슬-교환 반응을 가능하게 한다.
도 16: 사슬간 디술피드 브릿지가 없는 2/3-IgG 를 표준 IgG 와 같은 배양 상청액에 분비하고, 표준 단백질 A 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제하고, 발현 생성물로서 원하는 100 kDa 2/3-IgG 를 확인하는 SDS-PAGE 로 분석한다. 이것은 사슬간 디술피드 브릿지가 없는 정제된 2/3-IgG-유도체의 정확한 조립, 뿐만 아니라, 원하지 않는 이합체 및 응집체의 부재를 입증한다. i) 항-bio 항체 경쇄 (SEQ ID NO: 39) + 힌지 영역 시스테인 잔기가 없는 항-bio 항체 중쇄-노브 (SEQ ID NO: 57) + 힌지 영역 시스테인 잔기가 없는 MHCFcRP-홀-E357K (SEQ ID NO: 62) (왼쪽에 표시) 및 ii) 항-fluos 항체 경쇄 (SEQ ID NO: 42) + 힌지 영역 디술피드 결합을 갖지 않는 항-fluos 항체 전체 길이 중쇄-홀 (SEQ ID NO: 60) + 힌지 영역 시스테인 잔기가 없는 MHCFcRP-노브-K370E (SEQ ID NO: 63) (오른쪽에 표시) 의 정제.
도 17: 힌지-영역 디술피드 결합을 갖지 않는 출발 물질을 사용한 본 발명에 따른 교환 반응의 결과: 양성 대조군으로서 정제된 bsAb 를 갖는 입력 분자의 2.5 ㅅM 농도는 Fc-영역 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 단일특이적 2/3-IgG 입력 분자와의 사슬 교환을 통한 성공적인 bsAb 생성을 증명한다.
도 18: BiFab 에서 TriFab 로의 설계 및 조성 및 사슬 교환 원리.
도 19A 및 19B: 2/3-BiFab 의 발현 및 정제: 도 19A: KappaSelect; 도 19B: LeY-proDig (노브)-MHCFcRP (홀) 에 대한 SEC 프로파일이 예시적으로 도시되어 있다.
도 20A 및 20B: 2/3-BiFab 의 발현 및 정제: SDS-Page; n.r = 비-환원; r = 환원; L = 분자량 마커. 도 20A: LeY-proDig (노브)-MHCFcRP (홀), LeY-proDig (홀)-MHCFcRP (노브), MSLN-proDig (홀)-MHCFcRP (노브); 도 20B: LeY-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀), LeY-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브), LeY-proCD-AG-2 (노브)-MHCFcRP (홀), LeY-proCD-AG-2 (홀)-MHCFcRP (노브).
도 21: 출발 분자 및 본 발명에 따른 교환 반응에 의해 수득된 분자에 노출된 세포의 FACS 분석.
도 22: 세포 표면 상에서의 2/3-BiFab 교환 반응은 재배열되어, 스템-영역에서의 제 3 결합 부위 (Fv) 를 활성화시킨다.
도 23: 상이한 항원 표적화 및 상이한 스템-Fv 함유 TriFab-유사 프로드러그의 세포 결합 삼중특이적 TriFab 로의 세포상 전환.
도 24: CD3-신호 전달 리포터 분석에 의한 CD3 결합 기능성의 세포상 활성화의 검출의 원리.
도 25: 표적 세포 상에서의 2/3-BiFab 교환에 의한 CD3 결합 기능성의 활성화.
도 26: 상이한 항원 표적화 2/3-BiFab 프로드러그의 완전 기능성 세포 결합 활성화 삼중특이적 TriFab 로의 세포상 전환의 원리.
도 27: 상이한 항원 표적화 2/3-BiFab 프로드러그의 세포상 전환. A431-H9 세포 상에서의 LeY 및 MSLN 표적화 항체. 37 ℃ 에서 6 시간 동안 인큐베이션.
도 28: 완전 기능성 삼중특이적 엔터티로 재배열될 수 있는 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 TriFab 유도체.
도 29: 완전 기능성 사중특이적 엔터티로 재배열될 수 있는 단일-사슬 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 2/3-BiFab 유도체.
도 30A 및 30B: 2 개의 상이한 공여체로부터의 PBMC및 MCF7 과 항-LeY-proCD3 2/3-BiFab 의 공동-배양. LDH 방출은 표적화된 종양 세포의 세포-매개된 사멸에 대한 지표로서 작용한다. 도 30A: 공여체 1 의 PBMC; 도 30B: 공여체 2 의 PBMC.
도 31A 및 31B: 도 31A: PBMC 및 A431 세포와 항-EGFR-proCD3 2/3-BiFab 의 공동-배양. 도 31B: PBMC 및 HELA 세포와 항-AG-4-proCD3 2/3-BiFab 의 공동-배양. LDH 방출은 표적화된 종양 세포의 세포-매개된 사멸에 대한 지표로서 작용한다.
도 32A, 32B, 32C, 32D 및 32E: 4 nM 의 몰 농도에서 PBMC 및 HELA 와 항-AG-4-proCD3 2/3-BiFab 의 공동-배양 후의 상청액에서의 사이토킨의 양. 도 32A: IL-2 양; 도 32B: IFNγ 양; 도 32C: 그랜자임 B 양; 도 32D: TNFα 양; 도 32E: 범례.
도 33: HELA 세포 상에서의 표면 항원 AG-4 및 EGFR 의 발현 수준.
도 34: 각각의 proCD3 2/3-BiFab 에 의한 AG-4 및 EGFR 의 이중 표적화 및 Jurkat 리포터 분석에서의 생성된 T-세포 활성화.
도 35: 완전 기능성 디곡시게닌 및 비오틴 결합 엔터티로 재배열될 수 있으며, Dig-Cy5 및 Bio-488 결합에 의해 FACS 로 분석될 수 있는 단일-사슬 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 2/3-BiFab 유도체.
도 36A 및 36B: TriFab 유도체 전환시 세포 표면 상에서의 염료 결합의 FACS 분석. 도 36A: Dig-Cy5; 도 36B: Bio-488.
도 37: 완전 기능성 CD3 및 CD-AG-2 결합제로 재배열될 수 있는 단일-사슬 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 2/3-BiFab 유도체.
도 38: 완전 기능성 CD3 및 CD-AG-2 결합제로 재배열될 수 있는 단일-사슬 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 2/3-BiFab 유도체는 CD3 신호 전달 리포터 분석에서 T-세포를 활성화시킨다.
도 39: MHCFcRP 는 가변 단편 (VH 또는 VL) 을 구비할 수 있으며, 2/3-BiFab 전환시에 부산물로서 CD-AG-2 결합 Fab 분자를 생성한다.
도 40: Jurkat 세포 표면에 대한 생성물 결합에 의한 FACS 분석 CD-AG-2-MHCFcRP.
도 41: MHCFcRP 내에서 2 개의 proCD3/proCD-AG-2 가변 영역과 조합하여, 표적화 Fab 엔터티의 MHCFcRP 에의 N-말단 첨가는, CD3 및 CD-AG-2 결합을 가능하게 하는 2 가지 유형의 삼중특이적 TriFab 의 세포상 조립을 유도한다.
도 42: CD3 신호 전달 분석에서 삼중특이적 TriFab 의 T-세포 활성화 능력.
도 43: CH2 도메인 및 여기에서 이펙터 기능 적격 Fc-영역을 함유하는 대안적인 2/3-BiFab 포맷; 가변 도메인은 각각 Fc-영역의 C-말단에 있다.
도 44: 추가의 CH2 도메인 및 여기에서 이펙터 기능 적격 Fc-영역을 함유하는 대안적인 2/3-BiFab 포맷; 가변 도메인은 각각 Fc-영역과 표적화 Fab 사이 또는 N-말단에 있다.
도 45: CH2 적격 2/3-BiFab 분자의 CH2-의존적 결합을 입증하기 위해서 분석 FcRn 친화성 크로마토그래피를 수행하였다.
도 46A 및 46B: CH2-함유 2/3-BiFab 의 적용시 세포 표면 상에서 Dig-Cy5 결합의 FACS 분석. Dig 결합 부위는 2 개의 각각의 BiFab 의 적용시에 바로 전환된다. 위에서 아래로: MCF-7+Dig-Cy5; 노브-추출물; 홀-추출물; 세포상 셔플링/교환 반응; 생성물 제어. 도 46A: Fc-영역의 C-말단에서의 가변 도메인; 도 46B: Fc-영역과 표적화 Fab 사이의 가변 도메인.
도 47: 기능성 CD3 결합 부위의 세포상 생성을 위한 CH2-함유 BiFab 의 분자 설정.
도 48: T-세포 리포터 분석은 T-세포 활성화를 유도하는 CH2-함유 2/3-BiFab 의 능력을 보여준다. KN = 노브; HL = 홀.
도 49A, 49B 및 49C: 음성 착색 투과 전자 현미경 (NS-TEM) 분석은 2/3-BiFab 의 분자 형상 및 유연성을 보여준다. 도 49A: 항-AG-4-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브); 도 49B: AG-3-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀); 도 49C: 항-AG-4/CD3/AG-3-항체.
도 50: 표적-독립적 셔플링은 고농도 (300 nM) 에서만 낮은 수준으로 발생한다.
도 51: IgG1 힌지 영역의 변형, 즉, 디술피드 결합의 제거 또는 힌지 영역의 단축에 의해, 개별 결합 부위 사이의 상이한 거리가 조작될 수 있다.
도 2: 노브-cys 및 홀-cys 중쇄 (상부) 및 노브-cys 중쇄 및 MHCFcRP (중간부 및 하부) 사이의 상호 작용. 공유적 디술피드 결합은 점선으로 표시되고, 인력 상호 작용 쌍은 전체 구 사이의 선으로 표시되며, 반발성 상호 작용 또는 결과적인 입체 장애는 이중 화살표로 표시된다.
도 3A, 3B, 3C 및 3D: 상이한 MHCFcRP 를 갖는 정제된 2/3-IgG 의 SEC 크로마토그램: 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A 추출 후 2/3-IgG 제제의 SEC 프로파일이 도시되고; 각각의 프로파일의 주요 피크는 2/3-IgG 를 나타내며; 플루오레세인 (fluos; 항-fluos) 또는 비오틴 (bio; 항-bio) 결합 부위/특이성을 가짐 (실시예 2 참조). 도 3A: D356K (홀); 도 3B: K370E (노브); 도 3C: E357K (홀); 도 3D: K439E (노브).
도 4: 2/3-IgG 로 예시된 본 발명에 따른 교환 반응에 의한 bsAb (이중특이적 항체) 의 생성.
도 5: TCEP (2/3 입력 IgG 와 관련한 x 몰 당량) 는 힌지-디술피드 결합을 (부분적으로) 감소시키기 위해서 적용된다. SEC 는 2/3-IgG 출발 분자, 생성된 bsAb 및 이합체성 MHCFcRP 를 구별한다. 상이한 TCEP 농도에서의 모든 반응은 동일한 인큐베이션 시간 (삼각형: bsAb; 교차: 2/3-IgG, 다이아몬드: 이합체성 MHCFcRP) 후에 중단하였다.
도 6: 반응이 생체외에서 수행되는 경우, 원하는 bsAb 생성물로부터 원하지 않는 비-반응 입력 분자 및 부산물의 제거 계획.
도 7A 및 7B: 도 7A: 교환 반응 계획; 도 7B: NiNTA-정제의 SDS-Page; NiNTA-결합 (상부 패널) 은 NiNTA 로부터 용리된 단백질을 나타내고, NiNTA 통과액 (하부 패널) 은 His-6 또는 His-8 Tag 를 함유하지 않는 단백질이다; n.r. = 비-환원, r. = 환원; M = 마커.
도 8: 본 발명에 따른 교환 반응에 의해 생성된 bsAb 의 이중특이적 기능성. 기능성은 이중특이적 항체의 결합 부위의 동시 결합을 검출할 수 있는 브릿징 ELISA 에 의해 평가하였다. ELISA 플레이트에 코팅된 항원 A 는 플루오레세인 (fluos-BSA, FITC-BSA) 이었고, 항원 B 는 비오틴 (bio-Cy5) 이었으며, 이는 이의 형광에 의해 검출된다.
도 9: 중쇄의 C-말단에 결합 부위를 갖는 2/3-IgG-교환 반응에 대한 예시적인 2/3-IgG.
도 10: 중쇄의 N-말단 및 C-말단에 결합 부위를 갖는 2/3-IgG-교환 반응에 대한 예시적인 2/3-IgG.
도 11: 2/3-IgG 로 예시된, 상이한 결합 특이성 및 포맷의 출발 물질을 사용하여 IgG-교환 반응에 의해 나타낸 본 발명에 따른 방법의 일반적인 적용 가능성.
도 12: 예시적인 2/3-IgG 를 사용하여 본 발명에 따른 교환 반응을 통해 생성된 상이한 bsAb 포맷 매트릭스. 매트릭스는 플루오레세인 결합 엔터티 및 바이오시티나미드 결합 엔터티로 생성하였다. 입력 분자 및 교환-유도된 출력 분자는 도 11 에 도시되어 있다. 생성된 bsAb 의 기능성은 포획 항원으로서 fluos-BSA 및 bio-Cy5 를 사용해 ELISA 를 브릿징하여 이중특이적 결합 기능성을 검출함으로써 평가하였다. 브릿징 ELISA 로부터 유도된 신호는 모든 포맷이 이중특이적 결합 효능을 가진다는 것을 보여준다.
도 13: 소형화된 높은 처리량 및 자동화 호환성 접근법을 사용하는 본 발명에 따른 교환 반응을 통한 bsAb 다양성의 생성 및 특성화를 위한 매트릭스.
도 14: HTS 기술과 본 발명의 방법에 따른 교환 반응을 통한 이중특이적 항체 형성. 이중특이적 항체 형성을 나타내는 농도 의존성 형광 신호를 보여주는 예시적인 브리징 ELISA 의 신호가 도시되어 있다. Fluos-bio 브리징 ELISA, 교차: fluos [홀 / K370E] + bio [노브 / E357K], 다이아몬드: bio [홀 / K370E] + fluos [노브 / E357K]. 모든 다른 곡선: 동족 교환 파트너가 없는 2/3-IgG 입력 분자 (이들은 하나의 결합 부위만 존재하기 때문에, 브릿징 신호를 나타내지 않는다).
도 15: 힌지-영역 및 CH3 도메인 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG 로 예시된 본 발명에 따른 교환 반응의 반응식. 이것은 환원제를 첨가할 필요없이 본 발명에 따른 방법에서의 사슬-교환 반응을 가능하게 한다.
도 16: 사슬간 디술피드 브릿지가 없는 2/3-IgG 를 표준 IgG 와 같은 배양 상청액에 분비하고, 표준 단백질 A 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제하고, 발현 생성물로서 원하는 100 kDa 2/3-IgG 를 확인하는 SDS-PAGE 로 분석한다. 이것은 사슬간 디술피드 브릿지가 없는 정제된 2/3-IgG-유도체의 정확한 조립, 뿐만 아니라, 원하지 않는 이합체 및 응집체의 부재를 입증한다. i) 항-bio 항체 경쇄 (SEQ ID NO: 39) + 힌지 영역 시스테인 잔기가 없는 항-bio 항체 중쇄-노브 (SEQ ID NO: 57) + 힌지 영역 시스테인 잔기가 없는 MHCFcRP-홀-E357K (SEQ ID NO: 62) (왼쪽에 표시) 및 ii) 항-fluos 항체 경쇄 (SEQ ID NO: 42) + 힌지 영역 디술피드 결합을 갖지 않는 항-fluos 항체 전체 길이 중쇄-홀 (SEQ ID NO: 60) + 힌지 영역 시스테인 잔기가 없는 MHCFcRP-노브-K370E (SEQ ID NO: 63) (오른쪽에 표시) 의 정제.
도 17: 힌지-영역 디술피드 결합을 갖지 않는 출발 물질을 사용한 본 발명에 따른 교환 반응의 결과: 양성 대조군으로서 정제된 bsAb 를 갖는 입력 분자의 2.5 ㅅM 농도는 Fc-영역 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 단일특이적 2/3-IgG 입력 분자와의 사슬 교환을 통한 성공적인 bsAb 생성을 증명한다.
도 18: BiFab 에서 TriFab 로의 설계 및 조성 및 사슬 교환 원리.
도 19A 및 19B: 2/3-BiFab 의 발현 및 정제: 도 19A: KappaSelect; 도 19B: LeY-proDig (노브)-MHCFcRP (홀) 에 대한 SEC 프로파일이 예시적으로 도시되어 있다.
도 20A 및 20B: 2/3-BiFab 의 발현 및 정제: SDS-Page; n.r = 비-환원; r = 환원; L = 분자량 마커. 도 20A: LeY-proDig (노브)-MHCFcRP (홀), LeY-proDig (홀)-MHCFcRP (노브), MSLN-proDig (홀)-MHCFcRP (노브); 도 20B: LeY-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀), LeY-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브), LeY-proCD-AG-2 (노브)-MHCFcRP (홀), LeY-proCD-AG-2 (홀)-MHCFcRP (노브).
도 21: 출발 분자 및 본 발명에 따른 교환 반응에 의해 수득된 분자에 노출된 세포의 FACS 분석.
도 22: 세포 표면 상에서의 2/3-BiFab 교환 반응은 재배열되어, 스템-영역에서의 제 3 결합 부위 (Fv) 를 활성화시킨다.
도 23: 상이한 항원 표적화 및 상이한 스템-Fv 함유 TriFab-유사 프로드러그의 세포 결합 삼중특이적 TriFab 로의 세포상 전환.
도 24: CD3-신호 전달 리포터 분석에 의한 CD3 결합 기능성의 세포상 활성화의 검출의 원리.
도 25: 표적 세포 상에서의 2/3-BiFab 교환에 의한 CD3 결합 기능성의 활성화.
도 26: 상이한 항원 표적화 2/3-BiFab 프로드러그의 완전 기능성 세포 결합 활성화 삼중특이적 TriFab 로의 세포상 전환의 원리.
도 27: 상이한 항원 표적화 2/3-BiFab 프로드러그의 세포상 전환. A431-H9 세포 상에서의 LeY 및 MSLN 표적화 항체. 37 ℃ 에서 6 시간 동안 인큐베이션.
도 28: 완전 기능성 삼중특이적 엔터티로 재배열될 수 있는 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 TriFab 유도체.
도 29: 완전 기능성 사중특이적 엔터티로 재배열될 수 있는 단일-사슬 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 2/3-BiFab 유도체.
도 30A 및 30B: 2 개의 상이한 공여체로부터의 PBMC및 MCF7 과 항-LeY-proCD3 2/3-BiFab 의 공동-배양. LDH 방출은 표적화된 종양 세포의 세포-매개된 사멸에 대한 지표로서 작용한다. 도 30A: 공여체 1 의 PBMC; 도 30B: 공여체 2 의 PBMC.
도 31A 및 31B: 도 31A: PBMC 및 A431 세포와 항-EGFR-proCD3 2/3-BiFab 의 공동-배양. 도 31B: PBMC 및 HELA 세포와 항-AG-4-proCD3 2/3-BiFab 의 공동-배양. LDH 방출은 표적화된 종양 세포의 세포-매개된 사멸에 대한 지표로서 작용한다.
도 32A, 32B, 32C, 32D 및 32E: 4 nM 의 몰 농도에서 PBMC 및 HELA 와 항-AG-4-proCD3 2/3-BiFab 의 공동-배양 후의 상청액에서의 사이토킨의 양. 도 32A: IL-2 양; 도 32B: IFNγ 양; 도 32C: 그랜자임 B 양; 도 32D: TNFα 양; 도 32E: 범례.
도 33: HELA 세포 상에서의 표면 항원 AG-4 및 EGFR 의 발현 수준.
도 34: 각각의 proCD3 2/3-BiFab 에 의한 AG-4 및 EGFR 의 이중 표적화 및 Jurkat 리포터 분석에서의 생성된 T-세포 활성화.
도 35: 완전 기능성 디곡시게닌 및 비오틴 결합 엔터티로 재배열될 수 있으며, Dig-Cy5 및 Bio-488 결합에 의해 FACS 로 분석될 수 있는 단일-사슬 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 2/3-BiFab 유도체.
도 36A 및 36B: TriFab 유도체 전환시 세포 표면 상에서의 염료 결합의 FACS 분석. 도 36A: Dig-Cy5; 도 36B: Bio-488.
도 37: 완전 기능성 CD3 및 CD-AG-2 결합제로 재배열될 수 있는 단일-사슬 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 2/3-BiFab 유도체.
도 38: 완전 기능성 CD3 및 CD-AG-2 결합제로 재배열될 수 있는 단일-사슬 프로드러그 교환 모듈을 함유하는 2/3-BiFab 유도체는 CD3 신호 전달 리포터 분석에서 T-세포를 활성화시킨다.
도 39: MHCFcRP 는 가변 단편 (VH 또는 VL) 을 구비할 수 있으며, 2/3-BiFab 전환시에 부산물로서 CD-AG-2 결합 Fab 분자를 생성한다.
도 40: Jurkat 세포 표면에 대한 생성물 결합에 의한 FACS 분석 CD-AG-2-MHCFcRP.
도 41: MHCFcRP 내에서 2 개의 proCD3/proCD-AG-2 가변 영역과 조합하여, 표적화 Fab 엔터티의 MHCFcRP 에의 N-말단 첨가는, CD3 및 CD-AG-2 결합을 가능하게 하는 2 가지 유형의 삼중특이적 TriFab 의 세포상 조립을 유도한다.
도 42: CD3 신호 전달 분석에서 삼중특이적 TriFab 의 T-세포 활성화 능력.
도 43: CH2 도메인 및 여기에서 이펙터 기능 적격 Fc-영역을 함유하는 대안적인 2/3-BiFab 포맷; 가변 도메인은 각각 Fc-영역의 C-말단에 있다.
도 44: 추가의 CH2 도메인 및 여기에서 이펙터 기능 적격 Fc-영역을 함유하는 대안적인 2/3-BiFab 포맷; 가변 도메인은 각각 Fc-영역과 표적화 Fab 사이 또는 N-말단에 있다.
도 45: CH2 적격 2/3-BiFab 분자의 CH2-의존적 결합을 입증하기 위해서 분석 FcRn 친화성 크로마토그래피를 수행하였다.
도 46A 및 46B: CH2-함유 2/3-BiFab 의 적용시 세포 표면 상에서 Dig-Cy5 결합의 FACS 분석. Dig 결합 부위는 2 개의 각각의 BiFab 의 적용시에 바로 전환된다. 위에서 아래로: MCF-7+Dig-Cy5; 노브-추출물; 홀-추출물; 세포상 셔플링/교환 반응; 생성물 제어. 도 46A: Fc-영역의 C-말단에서의 가변 도메인; 도 46B: Fc-영역과 표적화 Fab 사이의 가변 도메인.
도 47: 기능성 CD3 결합 부위의 세포상 생성을 위한 CH2-함유 BiFab 의 분자 설정.
도 48: T-세포 리포터 분석은 T-세포 활성화를 유도하는 CH2-함유 2/3-BiFab 의 능력을 보여준다. KN = 노브; HL = 홀.
도 49A, 49B 및 49C: 음성 착색 투과 전자 현미경 (NS-TEM) 분석은 2/3-BiFab 의 분자 형상 및 유연성을 보여준다. 도 49A: 항-AG-4-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브); 도 49B: AG-3-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀); 도 49C: 항-AG-4/CD3/AG-3-항체.
도 50: 표적-독립적 셔플링은 고농도 (300 nM) 에서만 낮은 수준으로 발생한다.
도 51: IgG1 힌지 영역의 변형, 즉, 디술피드 결합의 제거 또는 힌지 영역의 단축에 의해, 개별 결합 부위 사이의 상이한 거리가 조작될 수 있다.
실시예
실시예 1
2/3-IgG 의 설계 및 모듈 조성
일반 적요
도 1 은 본 발명에 따른 방법에 사용되는 2/3-IgG 의 설계 및 모듈 조성을 보여준다. 이들 2/3-IgG 는 다음의 3 개의 개별 사슬로 구성된다: 하나의 경쇄 (통상적으로 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 전체 길이 경쇄), 하나의 중쇄 (통상적으로 중쇄 가변 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 모든 중쇄 불변 도메인을 포함하는 전체 길이 중쇄), 및 하나의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (통상적으로 힌지-CH2-CH3 을 포함하는 중쇄 Fc-영역 단편). 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 기능성 결합 부위를 포함한다. 중쇄 (통상적으로 인간 IgG1 서브클래스로부터 유래됨) 는 노브-인투-홀 Fc-영역 이합체의 형성을 가능하게 하기 위해서 CH3 도메인에 노브-cys-돌연변이 또는 홀-cys-돌연변이를 함유한다 (항체 중쇄의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366W 및 S354C 는 "노브-cys-돌연변이" 로서 표시되며, 항체 중쇄의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, Y349C 는 "홀-cys-돌연변이" 로서 표시된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여)). 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 소위 '더미-Fc'/MHCFcRP (하기 참조), 즉, VH 및 CH1 이 결여되고, 힌지 영역 서열의 적어도 일부로 N-말단에서 시작하며, 이의 C-말단에 His6 태그가 있는 IgG1 유도체이다. 또한, 2/3-IgG 의 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 이의 CH3 도메인에 노브-돌연변이 또는 홀-돌연변이를 함유한다 (항체 중쇄의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366W 는 "노브-돌연변이" 로서 표시되며, 항체 중쇄의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 는 "홀-돌연변이" 로서 표시된다 (Kabat EU 지수에 따른 번호 부여)). 노브- 또는 홀-돌연변이(들) 이외에, 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 야생형 서열과 관련하여 하나의 (즉, 단일의 추가의) 반발 전하를 도입하는 불안정화 돌연변이를 포함한다: D356K 또는 E357K 또는 K370E 또는 K439E; SEQ ID NO: 35 내지 38; 이러한 돌연변이된 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 이하에서 MHCFcRP 로서 표시된다.
중쇄 및 MHCFcRP 는 노브-인투-홀 돌연변이의 분포에 따라 다음의 2 가지 유형의 이종이합체를 형성할 수 있다:
i) 중쇄-노브::MHCFcRP-홀, 및
ii) 중쇄-홀::MHCFcRP-노브.
그러나, 이들 이종이합체는, 상보적 Fc-영역이 중쇄에 사슬간 디술피드를 형성하는데 필요한 추가의 CH3 시스테인이 결여되어 있으며, 또한 이들은 대응하는 중쇄 반대부분이 없는 전하 돌연변이를 함유하기 때문에, 다소 '결함' 이 있다.
실시예 2
2/3-IgG 의 발현 및 정제
2/3-IgG 의 발현은 첨단 기술을 통해 경쇄, 중쇄 (노브 또는 홀 돌연변이를 가짐) 및 대응하는 MHCFcRP (홀 또는 노브) 를 코딩하는 플라스미드를 포유 동물 세포 (예를 들어, HEK293) 에 공동-형질 주입함으로써 달성하였다.
보다 상세하게는, 예를 들어, 일시적 형질 주입 (예를 들어, HEK293 세포에서) 에 의한 2/3-IgG 의 제조를 위해, CMV-Intron A 프로모터를 갖거나 갖지 않는 cDNA 조직 또는 CMV 프로모터를 갖는 게놈 조직에 기초한 발현 플라스미드를 적용하였다.
항체 발현 카세트 이외에, 플라스미드는 다음을 함유하였다:
- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 복제의 기점,
- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마아제 유전자, 및
- 진핵 세포에서 선택 가능한 마커로서 생쥐로부터의 디하이드로폴레이트 리덕타아제 유전자.
각각의 항체 유전자의 전사 단위는 하기의 요소로 구성되었다:
- 5'-말단에 고유한 제한 부위(들),
- 인간 시토메갈로바이러스로부터의 즉각적인 초기 인핸서 및 프로모터,
- 이어서, cDNA 조직의 경우에 Intron A 서열,
- 인간 항체 유전자의 5'-비번역 영역,
- 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- cDNA 로서의 또는 게놈 조직에서의 항체 사슬 (면역글로불린 엑손-인트론 조직이 유지됨),
- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3'-비번역 영역, 및
- 3'-말단에 고유한 제한 부위(들).
항체 사슬을 포함하는 융합 유전자는 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 생성하였으며, 공지의 재조합 방법 및 기술로 해당하는 핵산 세그먼트의 연결에 의해, 예를 들어 각각의 플라스미드에서 고유한 제한 부위를 사용하여 조립하였다. 서브클로닝된 핵산 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 일시적 형질 주입을 위해, 형질 전환된 대장균 배양물 (Nucleobond AX, Macherey-Nagel) 로부터 플라스미드 제조에 의해 다량의 플라스미드를 제조하였다.
표준 세포 배양 기술은 Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. 에 기재된 바와 같이 사용하였다.
2/3-IgG 는 제조사의 지시에 따라서 HEK293-F 시스템 (Invitrogen) 을 사용하여 각각의 플라스미드로 일시적 형질 주입에 의해 생성하였다. 간략하게, 무혈청 FreeStyle™ 293 발현 배지 (Invitrogen) 에서의 진탕 플라스크에서 또는 교반 발효기에서 현탁액 중에 성장하는 HEK293-F 세포 (Invitrogen) 에, 각각의 발현 플라스미드 및 293fectin™ 또는 펙틴 (Invitrogen) 을 형질 주입하였다. 2 L 진탕 플라스크 (Corning) 의 경우, HEK293-F 세포를 600 mL 에 1*106 세포/mL 의 밀도로 시딩하고, 120 rpm, 8 % CO2 에서 인큐베이션하였다. 다음날, 세포에, A) 600 ㎍ 총 플라스미드 DNA (1 ㎍/mL) 를 갖는 20 mL Opti-MEM (Invitrogen) 및 B) 20 ml Opti-MEM + 1.2 mL 293fectin 또는 펙틴 (2 ㎕/mL) 의 약 42 mL 혼합물을 대략 1.5*106 세포/mL 의 세포 밀도로 형질 주입하였다. 글루코오스 소비에 따라서, 글루코오스 용액을 발효 과정 동안에 첨가하였다. 정확히 조립된 2/3-IgG 를 표준 IgG 와 같은 배양 상청액에 분비하였다. 분비된 2/3-IgG 를 함유하는 상청액을 5-10 일 후에 수확하고, 2/3-IgG 를 상청액으로부터 직접 정제하거나, 또는 상청액을 냉동 및 저장하였다.
2/3-IgG 는 Fc-영역을 함유하기 때문에, 이들은 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 적용하여 정제하였다: MabSelectSure-Sepharose™ (GE Healthcare, Sweden) 및 Superdex 200 크기 배제 (GE Healthcare, Sweden) 크로마토그래피를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 2/3-IgG 를 정제하였다.
간략하게, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형화된 MabSelectSuRe 수지 상에서 포획하고, 평형 완충액으로 세정하고, pH 3.0 의 25 mM 나트륨 시트레이트로 용출시켰다. 용출된 항체 분획을 모으고, 2 M Tris, pH 9.0 으로 중화시켰다. 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 으로 평형화된 Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden) 컬럼을 사용한 크기 배제 크로마토그래피로 항체 풀을 추가로 정제하였다. 2/3-IgG 함유 분획을 모으고, Vivaspin 한외 여과 장치 (Sartorius Stedim Biotech S.A., France) 를 사용하여 필요한 농도로 농축시키고, -80 ℃ 에서 저장하였다.
순도 및 완전성은 미세 유체 Labchip 기술 (Caliper Life Science, USA) 을 사용한 CE-SDS 에 의한 각각의 정제 후에 분석하였다. 제조사의 지침에 따라 HT Protein Express Reagent Kit 를 사용한 CE-SDS 분석을 위해 단백질 용액 (5 ㎕) 을 제조하고, HT Protein Express Chip 을 사용한 LabChip GXII 시스템 상에서 분석하였다. LabChip GX 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
예를 들어, 하기의 2/3-IgG 는 상응하는 L-사슬, H-사슬 및 MHCFcRP 코딩 플라스미드의 공동-발현에 의해 생성하였다:
상응하는 SEC 크로마토그램을 도 3 에 나타낸다.
실시예 3
2/3-IgG-교환 반응에 의한 이중특이적 항체 (bsAb) 의 생성
경쇄, 중쇄 및 MHCFcRP 를 함유하는 2/3-IgG 는 다음의 2 가지 유형의 KiH 이종이합체에서 생성되었다: 전체 길이 중쇄-노브::MHCFcRP-홀 및 전체 길이 중쇄-홀::MHCFcRP-노브. 두 유형의 2/3-IgG 는, MHCFcRP 가 중쇄에 사슬간 디술피드를 형성하는데 필요한 추가의 CH3 시스테인이 결여되어 있으며, MHCFcRP 가 전체 길이 중쇄에서 대응하는 반대 부분이 없는 전하 돌연변이를 함유하기 때문에, 다소 '결함' 이 있다. 그러나, 이러한 결함이 있는 이종이합체를 구성하는 모듈은 도 4 에 나타낸 바와 같이, 대응하는 전하를 갖는 이중특이적 이종이합체에 재배열될 수 있다. 2/3-IgG A 의 전체 길이 중쇄 (노브-cys) 및 2/3-IgG B 로부터의 전체 길이 중쇄 (홀-cys) 는 대응하는 이종이합체를 형성한다. 대응하는 이종이합체는 또한 MHCFcRP (홀-전하) 가 MHCFcRP (노브-전하) 와 상호 작용할 때 형성된다. 따라서, 2 개의 상이한 2/3-IgG 의 출발 이종이합체의 일시적 분리에 기초한 교환 반응은 우선적으로 (전하) 대응하는 이종이합체를 함유하는 생성물을 야기하였다. 그러므로, 교환 반응은 2 개의 단일특이적 2/3-IgG 를 하나의 이중특이적 IgG 및 하나의 MHCFcRP 이종이합체로 전환시켰다:
교환 반응은 특히 힌지-영역 사슬간 디술피드 결합을 파괴하기 위해서 환원 단계 (예를 들어, 다양한 농도의 2-MEA 또는 TCEP 의 적용) 에 의해 개시되었다. 이후에, 사슬 재배열이 자발적으로 발생하였다.
그러므로, 항-플루오레세인-2/3-IgG 및 항-바이오시티나미드-2/3-IgG 입력 분자를, 384 웰 REMP® 플레이트 (Brooks, #1800030) 상에서 표시된 TCEP 농도를 갖는 총 부피 40 ㎕ 의 1xPBS + 0.05 % Tween 20 에서 100 ㎍/ml 의 단백질 농도로 동몰량으로 혼합하였다. 원심 분리 후, 플레이트를 밀봉하고, 27 ℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
이어서, 비오틴 - 플루오레세인 브릿징 ELISA 를 사용하여 이중특이적 항체를 정량화하였다. 그러므로, 백색 Nunc® MaxiSorp™ 384 웰 플레이트를 1 ㎍/ml 알부민-플루오레세인 이소티오시아네이트 접합체 (FITC, Sigma, #A9771) 로 코팅하고, 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 90 ㎕ PBST-완충액 (PBST, bidest water, 10xPBS + 0.05 % Tween 20) 으로 3 회 세정한 후, 차단 완충액 (1xPBS, 2 % 젤라틴, 0.1 % Tween-20) 을 90 ㎕/well 로 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ PBST-완충액으로 3 회 세정한 후, 25 ㎕ 의 각각의 교환 반응의 1:10 희석액을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 90 ㎕ PBST-완충액으로 다시 3 회 세정하였다. 0.5 % BSA, 0.025 % Tween-20, 1xPBS 중의 25 ㎕/well 비오틴-Cy5 접합체를 0.1 ㎍/ml 의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ PBST-완충액으로 6 회 세정한 후, 25 ㎕ 1xPBS 를 각각의 웰에 첨가하였다. Cy5 형광은 Tecan Safire 2 Reader 상에서 670 nm 의 방출 파장 (649 nm 에서 여기) 에서 측정하였다.
도 5 는 2/3-IgG-교환에 의한 bsAb 의 생성에 대한 산화 환원 조건의 분석 결과를 보여준다. TCEP 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 사이, 즉, 전체 길이 반-IgG 와 MHCFcRP 사이의 힌지-디술피드 결합을 (부분적으로) 환원시키기 위해서 적용된다. 사슬 교환은 2/3-IgG 입력, bsAb 출력 및 MHCFcRP 부산물을 차별화하는 SEC 에 의해 식별할 수 있다. 2/3-IgG 와 TCEP 사이의 비율에 따른 교환 반응의 수율이 도 5 에 도시되어 있다 (비교를 위해, 모든 반응은 동일한 반응 시간 후에 분석하였다).
모든 2/3-IgG 출발 분자, 모든 원하지 않는 부산물, 뿐만 아니라, 교환 반응 동안에 우선적으로 생성된 모든 응집체는 친화성 태그 (His6 또는 His8) 를 가진다. 교환 반응에서 제조된 바람직한 bsAb 는 His-tag 를 갖지 않는 유일한 분자이다. 그러므로, 간단한 NiNTA 흡수 단계를 적용하여, 모든 원하지 않는 분자를 제거하였다 (도 6 및 7 참조). 남아있는 bsAb (NiNTA 흡수에 의해 고갈되지 않음) 는 스크리닝 절차 및 분석에 직접 적용하여, 바람직한 기능을 갖는 bsAb 를 확인하였다.
실시예 4
2/3-IgG-교환 반응에 의해 생성된 이중특이적 항체 (bsAb) 의 기능 평가
2/3-IgG-교환 반응의 생성물로서 생성된 bsAb 의 이중특이적 기능성은 브릿징-ELISA 분석에 의해 평가하였다. 도 8 은 본원에서 보고되는 바와 같은 교환 반응에 의해 생성된 항-플루오레세인/바이오시티나미드 이중특이적 항체에 대한 결합 결과를 일례로서 보여준다. 반응에서, 출발 분자로서 바이오시티나미드 (bio)-결합 2/3-IgG 및 플루오레세인 (fluos)-결합 2/3-IgG 를 사용하였다. 항-fluos/bio 이중특이적 항체의 fluos-결합 arm 은 fluos-BSA 코팅된 ELISA 플레이트에 결합한다. 이후에, bio-Cy5 에의 노출은 bsAb 의 bio-결합 arm 을 통한 bio-Cy5 의 bsAb-매개된 포획시에만 신호를 생성한다. 브릿징-매개된 신호는 bsAb 에 의해서만 발생하며, 단일특이적 형광 또는 생체 결합제에 의해서는 발생하지 않기 때문에, 분석에서 2/3-IgG 만을 사용하는 경우 신호가 관찰되지 않았다. 이 때문에, 및 교환 반응이 분자 응집을 강제하지 않기 때문에, 이러한 결합 ELISA 는 비-bsAb 분자의 사전 NiNTA-매개된 고갈을 요구하지 않으면서, 교환 반응 혼합물에서 직접 수행될 수 있다. 반응 혼합물을 적용할 때 관찰된 신호는 기능성 bsAb 의 성공적인 생성 및 존재를 나타냈다. 결합 ELISA 를 통한 신호 생성은 교환 반응에 사용된 입력 엔터티의 양에 의존하였다.
실시예 5
교환 반응은 출발 2/3-IgG 의 결합 특이성 또는 V-영역 조성과 무관하게 기능적이다
2/3-IgG 제조 및 교환 반응이 이들의 결합 특이성 및 V-영역 조성과 무관하게, 상이한 항체에 대해, 뿐만 아니라, 상이한 항체 조합에 대해 작용하는 지를 평가하기 위해서, 다양한 2/3-IgG 를 제조하였다.
그러므로, 바이오시티나미드 (bio), 디곡시게닌 (dig), 플루오레세인 (fluos), LeY-탄수화물 (LeY), VEGF 및 PDGF 에 대해 결합 특이성을 갖는 2/3-IgG 를 사용하였다. 이들은 상기에서 기술한 바와 같은 전체 길이 경쇄, 노브- 또는 홀-전체 길이 중쇄 및 돌연변이된 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 코딩하는 발현 플라스미드의 공동-형질 주입에 의해 제조되었다.
SEQ ID NO: 49-52 는 dig, VEGF, PDGF 및 LeY 에 대해 특이성을 갖는 2/3-IgG 의 VH-CH1 영역을 기술한다. 이들은 SEQ ID NO: 40 및 41 의 힌지-CH2-CH3 영역에 융합되어 (즉, bio VH-CH1 영역을 대체함), 원하는 특이성을 갖는 완전한 H-사슬을 생성하였다. 이들 분자를 생성하기 위해 적용된 MHCFcRP 는 SEQ ID NO: 35-38 로서 나열된다.
이들 2/3-IgG 모두는 비슷한 조건하에서 표준 IgG 와 유사한 수율로 제조 및 정제될 수 있다 (실시예 2 참조). 상이한 결합 특이성을 갖는 이들 2/3-IgG 의 발현에 대한 예를 하기 표에 나타낸다.
상이한 특이성의 bsAb 를 생성하기 위해서 적용된 교환-매트릭스에 있어서, 하기 표에 나타낸 바와 같은 모든 조합의 플루오레세인, 바이오시티나미드, VEGF, PDGF 및 디곡시게닌에 대해 결합 특이성을 갖는 2/3-IgG 의 조합을 사용하였다.
출발 2/3-IgG 의 사슬 교환 및 원하는 특이성 조합을 갖는 bsAb 의 생성을 브릿징 ELISA 에 의해 모니터하였으며 (실시예 4 참조), 여기에서 상이한 bsAb 특이성 조합과 일치하는 플레이트-코팅된 항원 및 신호-생성 항원-접합체/복합체가 적용되었다.
상이한 bsAb 조합의 기능성을 평가하기 위해서 적용된 브릿징 ELISA 의 결과를 하기 표에 나타낸다. 포획 또는 검출 항원으로서 존재하는 이들의 접합체 항원 쌍을 인식하는 bsAb 만이 브릿징 ELISA 에서 신호를 생성한다. 매트릭스에서 생성되는 다른 bsAb 는 하나 이상의 특이성의 부재로 인해 음성이다.
표: 브릿징 ELISA 는 생성된 bsAb 의 기능성을 확인한다. 입력 분자 농도 1.3 μM 에서 하나의 분석 내에서의 상대적 신호 강도가 표시된다. 가장 높은 값은 기준으로서 100 % 로 설정된다. N.a. = 이용 불가.
VEGF 함유 이중특이적 항체의 경우, 동일한 분석이 수행되었다. 이들은 또한 각각의 조합에 대한 상기 배경 레벨 이상의 신호 만을 나타냈다.
본 발명에 따른 교환 반응은 일반적으로 적용 가능한 방법임을 알 수 있다: 교환 반응은 출발 분자의 결합 특이성 또는 V-영역 조성과 무관하게 기능적 bsAb 를 야기한다.
실시예 6
포맷 변이체의 설계, 조성 및 생성
실시예 4 의 2/3-IgG-교환 반응을, 중쇄의 C-말단에 하나의 결합 부위, 또는 N-말단 뿐만 아니라 C-말단에 결합 부위를 갖는 중쇄 중 하나를 가지는 출발 분자로 확장하였다. 교환된 bsAb 의 생성을 위해, 교환 구동 원리 (결함이 있는 입력 이종이합체를 대응하는 출력-이종이합체로 전환) 는 변경되지 않았다. MHCFcRP 의 조성은 또한 상기에서 기술한 바와 같이 유지되었다.
도 1, 9 및 10 은 상이한 bsAb 포맷을 생성하기 위해서 적용된 3 개의 2/3-IgG 포맷의 모듈 조성을 나타낸다. 2/3-IgG 중 하나는 N-말단 위치에 하나의 Fab 아암을 가진다. 2/3-IgG 중 또다른 하나는 유연한 링커를 통해 중쇄의 C-말단에 부착된 Fab 아암을 가진다 (즉, 이것은 힌지-영역을 갖는 N-말단에서 시작한다). 세번째의 2/3-IgG 는 C-말단 Fab 아암 뿐만 아니라, N-말단 Fab 아암을 가진다.
이들 2/3-IgG 변이체의 발현은 경쇄, 중쇄 (노브 또는 홀) 및 상응하는 MHCFcRP (홀 또는 노브) 를 코딩하는 플라스미드를 포유 동물 세포 (예를 들어, HEK293) 에 공동-형질 주입함으로써 달성하였다 (실시예 2 참조).
상이한 bsAb 포맷의 생성에 사용된 변형된 전체 길이 중쇄의 서열은 다음과 같다:
2/3-IgG 는 표준 IgG 와 같은 배양 상청액에 분비하고, 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (실시예 2 참조). 크기 배제 및 질량-분광 분석은 정제된 2/3-IgG 변이체의 정확한 조립, 뿐만 아니라, 원하지 않는 이합체 및 응집체의 부재를 밝혀냈다. 2/3-IgG 의 발현 수율은 동일한 발현 시스템에서 표준 IgG 로 관찰된 것과 유사하였다. 각각의 데이터를 하기 표에 나타낸다.
실시예 7
상이한 가, 화학양론 및 형태에서 조합된 결합 기능성을 갖는 bsAb 의 특성화
3 개의 상이한 출발 분자 (N-말단, C-말단, N- 및 C-말단 결합 부위(들)를 갖는 2/3-IgG) 를 본 발명에 따른 방법에서 서로 조합하여 9 개의 상이한 bsAb 포맷을 야기할 수 있다. 이들은 개별 결합 부위의 가, 형태 및 위치가 상이하다. 이들 상이한 bsAb 를 생성하기 위한 교환 반응은 실시예 3 에서 기술한 바와 동일한 조건하에서 수행하였다.
모든 유형의 입력 포맷은, MHCFcRP 가 중쇄에 사슬간 디술피드를 형성하는데 필요한 추가의 CH3 시스테인이 결여되어 있으며, 이것은 반발 전하 돌연변이 (즉, 대응하는 전체 길이 중쇄 반대부분이 없는 전하) 를 함유하기 때문에, '결함' 이 있다. 이러한 "결함이 있는" 이종이합체를 구성하는 중쇄는 본 발명에 따른 방법에서 재배열되어 (전하 및 디술피드) 대응하는 이종이합체를 형성한다. 상이한 유형의 전체 길이 중쇄 (홀-cys 를 갖는 노브-cys) 는 대응하는 이종이합체를 형성한다. 대응하는 이종이합체는 또한 MHCFcRP (노브-전하를 갖는 홀-전하) 로부터 형성된다.
이러한 이론에 구애되지 않고, 2 개의 상이한 2/3-IgG 의 결함이 있는 이종이합체의 일시적 분리에 기초한 교환 반응은 대응하는 전하를 갖는 우선적으로 완벽하게 대응하는 이종이합체 및, 존재하는 경우, 디술피드 결합의 형성을 위한 시스테인 잔기를 함유하는 생성물을 야기할 것으로 추정된다. 그러므로, 교환은 단일특이적 2/3-IgG 를 이중특이적 IgG (상이한 포맷) 뿐만 아니라, 상응하는 (가변 영역 없음, 즉, 비-표적 결합 적격) Fc-영역 이종이합체로 전환시킨다.
교환 반응의 설명을 위해, 입력 분자는 다음과 같이 지칭된다:
- 전체 길이 중쇄 (H-사슬) 의 정상 N-말단에 Fab 아암을 갖는 분자의 경우, 'nA 또는 nB',
- H-사슬의 C-말단에 Fab 아암을 갖는 분자의 경우, 'cA 또는 cB',
- H-사슬의 N-말단 뿐만 아니라, C-말단에 Fab 아암을 갖는 분자의 경우, 'ncA 또는 ncB'.
상이한 포맷-교환 반응은 다음과 같다:
교환 반응은 사슬간 (힌지-영역) 디술피드 결합을 파괴하기 위해서 환원 단계에 의해 개시되고, 이후에 사슬 재배열이 자발적으로 발생한다. 교환 반응 동안에 잠재적으로 형성될 수 있는 모든 입력 분자, 모든 부산물, 뿐만 아니라, 응집체는 친화성 태그 (예를 들어, His6- 또는 His8-tag) 를 보유한다. 그러나, 교환 반응의 bsAb 생성물은 친화성 태그를 갖지 않으며, 따라서 친화성 (예를 들어, NiNTA) 흡수 크로마토그래피를 통해 분리될 수 있다. bsAb (상이한 포맷) 는 최적의 기능성을 갖는 상이한 bsAb 포맷을 식별하고 순위를 지정하기 위해서 스크리닝 절차 및 분석에 직접 적용될 수 있다.
이중특이적 포맷은 상기에서 기술한 입력 2/3-IgG 를 384 웰 MTP 포맷으로 교환한 후, ELISA 를 브릿징하여 기능적 조립을 평가함으로써 생성되었다. 그러므로, 교환 파트너 (홀-cys-돌연변이를 함유하는 전체 길이 중쇄 및 MHCFcRP-노브-K370E 로 이루어진 2/3-IgG 분자 1; 노브-cys-돌연변이를 함유하는 전체 길이 중쇄 및 MHCFcRP-홀-E357K 로 이루어진 2/3-IgG 분자 2) 를 총 부피 100 ㎕ 의 1xPBS + 0.05 % Tween 20 에서 동몰량 (4 μM) 으로 혼합하였다. 단백질 용액을 384-딥 웰 플레이트 (Greiner 384 masterblock®) 에서 11 회 1:2 로 희석시켰다. 희석 시리즈로부터의 20 ㎕ 의 각각의 샘플을 20 ㎕ 의 0.5 mM TCEP 용액과 384 웰 REMP® 플레이트 (Brooks, #1800030) 에서 최종 단백질 농도 200 - 0.2 ㎍/ml 및 0.25 mM TCEP 로 혼합하였다. 원심 분리 후, 플레이트를 밀봉하고, 37 ℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
대조예로서, 한 쪽에 bio-결합 기능성 및 다른 쪽에 플루오레세인-결합 기능성을 함유하는 bsAb 를 사용하였다. 생성된 bsAb 의 기능성은 비오틴-플루오레세인 브릿징 ELISA 에 의해 평가하였다. 그러므로, 백색 Nunc® MaxiSorp™ 384 웰 플레이트를 1 ㎍/ml 알부민-플루오레세인 이소티오시아네이트 접합체 (Sigma, #A9771) 로 코팅하고, 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 90 ㎕ PBST-완충액 (PBST, 이중 증류수, 10xPBS Roche #11666789001 + 0.05 % Tween 20) 으로 3 회 세정한 후, 90 ㎕/well 차단 완충액 (1xPBS, 2 % BSA, 0.1 % Tween 20) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ PBST-완충액으로 3 회 세정한 후, 25 ㎕ 의 각각의 교환 반응의 1:4 희석액을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 90 ㎕ PBST-완충액으로 다시 3 회 세정하였다. 0.5 % BSA, 0.025 % Tween 20, 1xPBS 중의 25 ㎕/well 비오틴-Cy5 접합체를 0.1 ㎍/ml 의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ PBST-완충액으로 6 회 세정한 후, 25 ㎕ 1xPBS 를 각각의 웰에 첨가하였다. Cy5 형광은 Tecan Safire 2 Reader 상에서 670 nm 의 방출 파장 (649 nm 에서 여기) 에서 측정하였다.
하나의 플루오레세인 결합 엔터티 및 하나의 바이오시티나미드 결합 엔터티를 사용하여, 상이한 포맷의 2/3-IgG 의 교환을 통한 상이한 bsAb 포맷을 생성하였다. 입력 분자 및 교환-유도된 출력 분자는 도 11 에 도시되어 있다.
생성된 bsAb 의 기능성은 포획 항원으로서 fluos-BSA 및 bio-Cy5 를 사용해, 도 12 에 나타낸 바와 같이 ELISA 를 브릿징하여 이중특이적 브릿징 결합 기능성을 검출함으로써 평가하였다. 모든 상이한 포맷은 브릿징 ELISA 신호를 야기한다.
이들 결과는 강력하고 높은 처리량의 호환성 방식으로 사슬 교환 반응을 통해 본 발명에 따른 방법을 사용하여 상이한 포맷을 생성할 가능성을 보여준다.
실시예 8
2/3-IgG-교환에 의한 기능적 bsAb 의 생성 및 원하는 기능성을 갖는 bsAb 의 스크리닝/식별은 소형화 및 높은 처리량, 뿐만 아니라, 자동화 기술과 호환성이다
결합 부위 서열 및/또는 포맷이 다른 많은 수의 상이한 bsAb 를 취급하기 위해서, 높은 처리량 및 자동화 기술의 적용이 요구되며, 많은 경우에 있어서 필요하다. 그러므로, 본 발명에 다른 2/3-IgG 교환 방법을 통한 bsAb 생성, 뿐만 아니라, 이에 의해 생성된 이중특이적 항체의 기능성, 즉, 이중특이적 결합의 분석/스크리닝이 높은 처리량 및 자동화 기술과 호환성이 되도록 소형화될 수 있는 지를 분석하였다.
그러므로, 2/3-IgG 교환 반응을 수행하였으며, 반응 생성물을 348 웰 플레이트에서 소형화된 규모로 분석하였다.
매트릭스 스크린은 384 웰 MTP 포맷에서 다음과 같이 설정하였다: 교환 파트너 (홀-cys-돌연변이를 함유하는 전체 길이 중쇄 및 MHCFcRP-노브-K370E 로 이루어진 2/3-IgG 분자 1; 노브-cys-돌연변이를 함유하는 전체 길이 중쇄 및 MHCFcRP-홀-E357K 로 이루어진 2/3-IgG 분자 2) 를 총 부피 30 ㎕ 의 1xPBS + 0.05 % Tween 20 에서 동몰량 (4 μM) 으로 혼합하였다. 단백질 용액을 384-딥 웰 플레이트 (Greiner 384 masterblock®) 에서 4 회 1:3 으로 희석시켰다. 희석 시리즈로부터의 20 ㎕ 의 각각의 샘플을 20 ㎕ 의 0.5 mM TCEP 용액과 384 웰 REMP® 플레이트 (Brooks, #1800030) 에서 최종 단백질 농도 2 μM - 0.025 μM 및 0.25 mM TCEP 로 혼합하였다. 원심 분리 후, 플레이트를 밀봉하고, 37 ℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.
이어서, 이에 의해 생성된 bsAb 의 기능성을 소형화된 높은 처리량 포맷으로 브릿징 ELISA (상기 참조) 를 통해 평가하였다: 백색 Nunc® MaxiSorp™ 384 웰 플레이트를 1 ㎍/ml 알부민-플루오레세인 이소티오시아네이트 접합체 (Sigma, #A9771), 1 ㎍/ml PDGF (CST, #8912) 또는 1 ㎍/ml VEGF121 로 코팅하고, 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 90 ㎕ PBST-완충액 (PBST, 이중 증류수, 10xPBS + 0.05 % Tween 20) 으로 3 회 세정한 후, 차단 완충액 (1xPBS, 2 % BSA, 0.1 % Tween 20) 을 90 ㎕/well 로 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ PBST-완충액으로 3 회 세정한 후, 25 ㎕ 의 각각의 교환 반응의 1:4 희석액을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 90 ㎕ PBST-완충액으로 다시 3 회 세정하였다. 0.5 % BSA, 0.025 % Tween 20, 1xPBS 중의 25 ㎕/well 비오틴-Cy5 접합체 또는 dig-Cy5 접합체를 0.1 ㎍/ml 의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 90 ㎕ PBST-완충액으로 6 회 세정한 후, 25 ㎕ 1xPBS 를 각각의 웰에 첨가하였다. Cy5 형광은 Tecan Safire 2 Reader 상에서 670 nm 의 방출 파장 (649 nm 에서 여기) 에서 측정하였다. 교환 반응, 및 VEGF 또는 PDGF 또는 dig 또는 bio 또는 fluos 에 결합하는 2/3-IgG 모듈을 사용한 이들 분석의 브릿징 ELISA 의 세부 내용은 도 13 에 나타나 있다. 하나의 예시적인 이들 분석의 결과는 도 14 에 나타나 있으며, 2/3-IgG-교환 반응 및 후속하는 기능적 분석이 수행될 수 있고, 높은 처리량 및 자동화 기술과 호환성임을 증명한다.
실시예 9
하나의 결합 부위를 갖는 제 1 항원 및 2 개의 다른 결합 부위를 갖는 추가의 항원을 표적화하는 3 개의 결합 부위를 갖는 bsAb 의 생성
본 발명에 따른 방법은 T-세포 이중특이적 항체 (TCB) 의 생성에 사용될 수 있다. 이들은 상기에서 기술한 바와 같은 포맷을 가질 수 있다 (예를 들어, WO 2013/026831 참조). TCB-교환 접근법의 경우, 하나의 H-사슬 (상기에서 기술한 바와 같은 노브-cys 또는 홀-cys 를 가짐) 은 이의 힌지의 CD3-결합 CrossFab-유도된 엔터티 N-말단을 함유하며, 추가로 또다른 항체-유도된 표적화 엔터티에 의해 N-말단에서 확장된다. 교환 반응은 상기에서 기술한 동일한 조건하에서 수행되며, CD3 결합 엔터티 및 2 개의 추가의 결합 엔터티를 보유하는 TCB 를 야기한다. 이들은 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 이들 분자는 T-세포 상의 CD3 및 표적 (예를 들어, 종양) 세포 상의 항원에 동시에 결합하여, 표적 세포의 사멸을 유도할 수 있다.
실시예 10
본 발명에 따른 Fc-영역 사슬간 디술피드 결합 (힌지 영역 및 CH3 도메인에서) 을 갖지 않는 2/3-IgG 의 설계 및 생성
2/3-IgG 를 함유하는 Fc-영역 (힌지 영역) 디술피드와의 사슬 교환은 사슬 분리 및 원하는 bsAb 의 후속 조립을 가능하게 하기 위한 초기 단계로서 환원을 필요로 한다. 환원 단계 및 환원제를 제거하기 위한 관련된 필요성을 회피하기 위해서, 힌지 영역 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG 가 생성되었다. 원리는 도 15 에 도시되어 있다. 힌지-디술피드 형성을 담당하는 힌지 영역에서의 시스테인 잔기는 세린으로의 돌연변이에 의해 제거되었다. 또한, KiH 관련된 디술피드 결합을 형성하는 위치 354 또는 349 의 CH3-시스테인은 생략되었다. 각각의 아미노산 서열은 다음과 같다:
상기 2/3-IgG 의 발현은 경쇄, 전체 길이 중쇄 (노브 또는 홀) 및 상응하는 MHCFcRP (홀 또는 노브) 를 코딩하는 플라스미드를 포유 동물 세포 (예를 들어, HEK293) 에 공동-형질 주입함으로써 달성하였다 (실시예 2 참조). 2/3-IgG 는 표준 IgG 와 같은 배양 상청액에 분비하고, 이어서 표준 단백질 A 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (실시예 2 참조). 이어서, 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 를 통해 원하는 100 kDa 2/3-IgG 발현 생성물을 분석하였다 (도 16). 이것은 2/3-IgG 의 정확한 조립, 뿐만 아니라, 원하지 않는 이합체 및 응집체의 부재를 입증한다. 이러한 분자는 Fc-영역 (힌지 영역 및 CH3 도메인) 사이의 디술피드에 의해 안정화되지 않기 때문에, 이것은 놀라운 일이다. Fc-영역 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 항-fluos- 및 항-bio-2/3-IgG 의 정제 수율을 하기 표에 나타낸다.
실시예 11
본 발명에 따른 방법에서 환원이 없는 2/3-IgG-교환 반응에 의한 기능적 bsAb 의 생성
Fc-영역 사슬간 디술피드 결합을 함유하지 않는 2/3-IgG 를, 초기 환원 단계를 생략한 것을 제외하고는, 상기에서 기술한 바와 같은 사슬 교환 반응 (실시예 3 참조) 에 적용시켰다. 2/3-IgG 는 전체 길이 중쇄와 MHCFcRP 사이에 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 fluos- 또는 bio-결합 부위 및 Fc-영역을 함유하였다. 이들 2/3-IgG 의 조성 및 제조는 실시예 10 에 기재되어 있다. 환원의 개시가 없는 교환 반응 후, 브릿징 ELISA 를 수행하여 bsAb 의 이중특이적 기능성을 입증하였다. 브릿징 ELISA 는 고정화된 fluos-BSA 에 교환 반응 생성물의 첨가, 이어서 세정 단계, 및 bsAb 의 제 2 결합 arm 의 존재를 조사하기 위한 bio-Cy5 의 후속 첨가를 포함하였다 (브릿징 ELISA 의 세부 사항에 대해서는 이전 실시예 참조). 정확히 조립된 기능성 bsAb 만이 이들의 fluos-결합 부위에 의해 분석 플레이트에 결합할 수 있고, 유지되며, bio-Cy5 를 포획 및 보유함으로써 신호를 생성한다. 이중특이성이 없는 분자는 플레이트에 결합할 수 없거나 (bio-전용 결합제), 또는 bio-Cy5 를 발생하는 신호를 포획할 수 없기 (fluos-전용 결합제) 때문에, 신호를 생성하지 않는다. 이들 분석의 결과 (이 실시예에서는, 양성 대조군으로서 정제된 bsAb 를 사용하여 2.5 μM 농도의 입력 분자에서 교환 반응을 수행) 는 도 17 에 도시되어 있다. 결과는 Fc-영역 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 단일특이적 2/3-IgG 입력 분자와의 사슬 교환을 통한 성공적인 bsAb 생성을 입증한다. 생산적인 사슬 교환은 초기 환원의 필요없이 진행되었다. 따라서, Fc-영역간 폴리펩티드 디술피드 결합의 제거는 초기 환원 단계의 필요성을 제거하였다. 생성된 bsAb 는 비-공유적 Fc-Fc 상호 작용에 의해 함께 유지된다. 따라서, Fc-Fc 사슬간 디술피드의 제거는 환원의 필요없이 상응하는 Fc-영역 불일치 구동 교환 반응을 허용하며, 여기에서 생체내 적용을 허용한다.
실시예 12
사슬 교환 반응은 부분적으로 불안정화된 전체 길이 중쇄 -
MHCFcRP 계면에 의해 유도된다
2/3-IgG 를 bsAb 로 전환시키기 위한 원동력은 전체 길이 중쇄와 MHCFcRP 사이에 설계된 '결함이 있는' 계면이다. 이러한 인공 반발 계면은 MHCFcRP 의 노브- 또는 홀-CH3 도메인에 도입된 돌연변이의 결과이다. MHCFcRP 는 2/3 IgG 의 발현 동안에 상응하는 ("정상") 노브- 또는 홀-파트너와 여전히 연결되어 있다 (상기 실시예 참조). 이들 분자는 바람직하지 않은 응집 경향없이 충분히 거동하는 분자로서 2/3-IgG 를 제공하는데 충분한 안정성을 가진다.
이러한 이론에 구애되지 않고, 2 개의 상보적 2/3-IgG 가 근접하며, 전체 길이 항체 중쇄::MHCFcRP 쌍이 서로 옆으로 부분적으로 방출될 때, bsAb 로 이어지는 본 발명에 따른 교환 반응이 발생한다. 전체 길이 항체 중쇄 (CH3) 계면이 완벽하기 때문에, 이러한 조건하에서는 대응하는, 즉, 비-하전된, 비-반발된 노브-홀 전체 길이 중쇄의 재조립이 선호되어야 한다. 따라서, 형성된 bsAb 의 전체 길이 중쇄는 부분적으로 불완전한 (전하 불일치) 2/3-IgG 분자의 재형성보다 우선적으로 연결되어 있다. 따라서, 설계된 부분적으로 불안정화된 (전하 반발) CH3 계면은 성공적인 직접 사슬 교환 반응을 위한 핵심 매개변수이다.
Fc 계면, 특히 CH3-CH3 계면의 부분적인 불안정화는, 전체 길이 항체 중쇄 상에서 상호 작용 잔기를 유지하면서, MHCFcRP 의 CH3 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
전체 길이 항체 중쇄::MHCFcRP 계면에 영향을 미치는 MHCFcRP 의 CH3 도메인에 도입될 수 있는 예시적인 돌연변이가 하기 표에 제공된다.
일부 돌연변이는 계면에 변경된 전하를 놓는 교환을 포함한다. 전하 돌연변이는 이미 존재하는 안정화 전하 쌍을 약화 또는 파괴하거나, 또는 반발 효과를 야기하거나, 또는 둘 다를 초래한다.
유사하게, 상이한 크기의 측쇄를 갖는 아미노산이 도입되어 입체 반발 효과를 생성할 수 있다. 이러한 돌연변이는 존재하는 소수성 계면 상호 작용을 약화 또는 방해하거나, 또는 입체 장애를 발생시키거나, 또는 이들을 조합시킨다.
전하 및/또는 입체 효과를 통해 부분적으로 불안정화되는 돌연변이는 또한 서로 조합될 수 있다.
또한, MHCFcRP 에 도입되는 전하 및/또는 입체 변경을 함유하는 제 1 의 2/3-IgG 는, 제 1 의 2/3-IgG 로부터의 MHCFcRP 의 것에 대응하는 MHCFcRP 에 도입되는 상이한 전하 및/또는 입체 변경을 함유하는 제 2 의 2/3-IgG 와 조합될 수 있다.
2/3-IgG 뿐만 아니라, 생성된 bsAb 는, 쌍을 이룬 CH3 도메인이 한 쪽에 노브-돌연변이 및 다른 쪽에 홀-돌연변이을 보유하는 방식으로 조립된다. 그러므로, MHCFcRP 의 상응하는 노브- 또는 홀-잔기의 야생형 조성에 대한 '역-돌연변이' 는 또한 계면 장애를 발생한다. 노브- 또는 홀-CH3-도메인과 야생형 도메인의 이러한 조합을 하기 표에 나타낸다.
이들 역 돌연변이는 CH3-CH3-계면을 부분적으로 불안정화시키기 위해서 적용될 수 있다.
이들 역 돌연변이는 또한 상기 표에 기재된 것을 포함하는 다른 교란 돌연변이와 조합하여 적용될 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같은 모든 부분적으로 교란하는 개별 돌연변이 또는 돌연변이의 조합은 또한, 이들이 2/3-IgG 를 부분적으로 불안정화시키고, 교환 반응의 제 2 생성물로서의 노브-MHCFcRP::홀-MHCFcRP 이종이합체를 여전히 안정화시키며, 여기에서 반응 평형을 생성물 측으로 추가로 이동시키는 방식으로 선택될 수 있다 (교환 반응).
실시예 13
본 발명에 따른 1 가 2/3-IgG 유도체의 2 가 bsAb 로의 세포상 전환
중쇄와 MHCFcRP 사이에 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-IgG 유도체는 교환 반응을 개시하기 위해서 환원을 필요로 하지 않는다. 그러므로, 아마도 개별 2/3-IgG 가 세포 표면에 결합되어 있는 경우에도, 또한 생리학적 조건하에서 교환이 달성될 수 있는 가능성이 있다. 2/3-IgG 의 기능적 Fab 아암이 세포 표면에 결합하는 경우, 이들은 표적 세포 상에 축적된다. 2 개의 상보적 2/3-IgG 가 동일한 세포의 표면에 결합하는 경우, 상기 세포의 표면 상에 직접 결합하는 동안에 사슬 교환이 발생할 수 있다. 이러한 교환은 세포 표면 상에 직접 이중 특이성을 갖는 완전 기능성 bsAb 를 생성한다.
이러한 동일계 세포상 사슬 교환을 입증하기 위해서, 항원 LeY 또는 Her1 에 결합하는 2 개의 상보적 2/3-IgG 는 높은 수준의 LeY, 높은 수준의 Her1, 또는 높은 수준의 이들 둘 다를 나타내는 세포에 적용된다. FACS 분석에서, 개별적으로 적용되는 2/3-BiFab 는 이들의 동족 항원을 발현하면서 세포에 결합하는 것으로 나타날 수 있다. 두 2/3-BiFab 의 동시-적용 (동시 또는 연속) 은 두 항원을 발현하는 세포에 대해서만 증가된 결합을 야기한다. 이것은 1 가 2/3-BiFab (프로드러그) 의 세포상 교환 반응에 의한 기능적 2 가 bsAb 생성물 (결합활성-매개된 개선된 결합을 가짐) 의 성공적인 생성을 나타낸다.
실시예 14
본 발명에 따른 중쇄:MHCFcRP 디술피드 결합을 갖지 않는 2/3-BiFab 의 설계 및 조성 및 기능성
TriFab 는, IgG CH2 도메인의 각각 VH 및 VL 로의 교환으로 인해 이중특이적 기능성을 보유하는 항체 유도체이다. 이러한 분자의 Fc-유사 '스템-영역' 은 온전한 KiH CH3 도메인에 의해 함께 유지된다. 이것은, 잠재적으로 교환-가능 특징을 갖는 BiFab 유사체를 함유하는 MHCFcRP 의 생성을 가능하게 한다. 도 18 은 2/3-IgG-BiFab 유도체를 함유하는 MHCFcRP 의 설계 및 조성을 보여준다. 2/3-IgG 와 동일한 일반적인 원리를 적용함으로써, 조작된 2/3-BiFab 유사체는 CH2 도메인 및 대응하는 CH3 KiH 도메인 대신에, 관련없는 항체의 상보적인 VL 또는 VH 도메인을 보유하는 KiH 중쇄 및 MHCFcRP 엔터티로 구성된다. 따라서, 2/3-IgG 에서의 중쇄 및 MHCFcRP 의 CH2 도메인은 VH 또는 VL 도메인으로 대체된다. 또한, 그리고 실시예 1 에 기재된 2/3-IgG 와의 추가의 차이로서, 이들 2/3-BiFab 유도체의 중쇄 및 MHCFcRP-스템은 중쇄:MHCFcRP 공유 연결 (실시예 10 의 2/3-IgG 유도체와 유사함) 을 촉진하는 시스테인을 보유하지 않는다. 2/3-IgG (사슬간 디술피드를 갖지 않음) 와 동일한 원리를 기반으로 하여, 2/3-BiFab 는 교환 모듈, 즉, CH3 도메인을 보유하기 때문에, 교환 반응은 2/3-IgG 에 대해 기술하고 나타낸 바와 동일한 방식으로 발생할 수 있다. 2/3-BiFab 관련된 교환 반응의 일반적인 원리는 도 18 에 도시되어 있다. 2/3-BiFab 를 생성하기 위해서 적용된 경쇄, 노브- 또는 홀-중쇄, 및 MHCFcRP 홀- 또는 노브-사슬의 서열은 다음과 같다:
실시예 15
본 발명에 따른 2/3-BiFab 의 발현 및 정제
2/3-BiFab 의 발현은 상기에서 기술한 첨단 기술의 상태 (WO 2016/087416) 를 통해, 경쇄, 변형된 스템-중쇄 (노브 또는 홀) 및 대응하는 MHCFcRP-스템 (홀 또는 노브) 을 코딩하는 플라스미드를 포유 동물 세포 (예를 들어, HEK293) 에 공동-형질 주입함으로써 달성하였다. 2/3-BiFab 는 표준 IgG 와 같은 배양 상청액에 분비한다. 이들은 CH2 도메인이 결여됨에 따라 기능적 Fc-영역의 부재로 인해, 2/3-BiFab 는 도 19 및 20 에 나타낸 바와 같이, 표준 단백질 L (KappaSelect) 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 2/3-BiFab 는, 이들이 스템 영역에 기능적 V 영역을 보유하지 않더라도 (비-대응하는 VH 및 VL 로 구성됨에 따름), 그리고 이들이 사슬의 공유 연결을 위한 사슬간 디술피드를 함유하지 않더라도, 효과적인 방식으로 생성 및 정제될 수 있다는 것은 놀라운 일이다. 크기-배제 및 고유 질량-분광 분석은 정제된 2/3-BiFab-유도체의 정확한 조립, 뿐만 아니라, 원하지 않는 이합체 및 응집체의 부재를 보여주었다. 최적화되지 않은 일시적 발현 조건하에서 2/3-BiFab 의 발현 수율을 하기 표에 나타낸다.
실시예 16
본 발명에 따른 무환원 사슬 교환에 의한 기능적 TriFab 의 생성
2/3-IgG 에 대해 상기에서 나타낸 바와 같은 Fc-Fc 사슬간 디술피드의 제거는, 제어된 환원 및 재-산화에 대한 필요없이, 즉, 생리학적 조건하에서 MHCFcRP 주도의 교환 반응을 가능하게 한다. 따라서, 잠재적으로 표적 세포 표면에 이미 결합한 경우에도, 생리학적 조건하에서 이러한 분자를 "셔플" 하는 것이 가능하다.
그러므로, 2/3-BiFab 교환 반응은 교환 반응의 초기 트리거로서 환원없이 수행하였다. 이들 교환 반응으로의 입력 분자는 상기에서 기술한 바와 같은 기능적 LeY 결합 아암 및 '스프릿' Dig-결합 스템 영역 (proDig) 을 갖는 LeY-결합 2/3-BiFab 이었다. 이어서, 미반응 2/3-BiFab 및 MHCFcRP 부산물의 고갈을 NiNTA 수지 상에서 원하지 않는 His8-함유 단백질의 흡수를 통해 달성하였다. 이어서, FACS 분석을 적용하여 2/3-BiFab 전구체 분자와 비교한, 생성된 TriFab 의 결합 기능성을 평가하였다. 그러므로, LeY-항원 발현 MCF7 세포를 개별 LeY-결합 2/3-BiFab 또는 교환 반응의 TriFab에 노출시켰다. 이어서, Dig-Cy5 를 첨가하고, 세포의 형광을 분석하였다. 도 21 은 두 엔터티가 세포 표면 탄수화물 LeY 를 인식하는 온전한 Fab 아암을 보유하더라도, 2/3-BiFab 에 노출된 세포와의 낮은 Dig-Cy5 관련 신호를 보여준다.
2/3-BiFab 가 디곡시게닐화된 페이로드에 결합할 수 없는 이유는, 이들이 이들의 스템 영역에 기능적 Dig-결합 Fv 를 보유하지 않기 때문이다. 그러나, 사슬 교환 반응의 TriFab 생성물은 Dig-Cy5 관련 신호, 즉, Dig-결합 기능성을 명백하게 나타냈다. 이것은, 이들의 '스템-Fv' 의 비활성화된 결합 기능성을 갖는 2/3-BiFab 전구체 분자가 사슬 교환을 통해 완전 기능성 TriFab 로 전환되는 것을 입증한다.
실시예 17
본 발명에 따른 2/3-BiFab 프로드러그의 완전 기능성 세포 결합 활성화 이중- 또는 삼중특이적 TriFab 로의 세포상 전환
2/3-BiFab 는, 이들이 하나의 완전 기능성 Fab 아암을 포함하기 때문에, 단지 부분적으로 비-결합 적격이다. 이것은 비-상보적 VH 및 VL 도메인 (상이한 항체의, 또는 동족 항원, 결합 부위의 전구체 비활성 프로-형태에 대한 결합을 방해하는 돌연변이를 함유하는) 으로 구성되기 때문에, 스템 영역의 끝에서의 Fv 만이 비-기능적이다. 기능적 Fab 아암이 세포 표면에 결합하는 경우, 2/3-BiFab 는 표적 세포 상에 축적된다. 2 개의 상보적 2/3-BiFab (둘 모두 비활성화된 서로 상보적인 스템-Fv 를 보유함) 가 동일한 세포의 표면에 결합하는 경우, 사슬 교환 반응은 상기 세포의 표면 상에 직접 결합하면서 발생할 수 있다. 이어서, 이러한 교환은 세포 표면 상에 직접 적어도 이중 특이성을 갖는 완전 기능성 TriFab 를 생성한다 (도 22).
동일계 세포상 사슬 교환을 실험적으로 입증하기 위해서, 본 발명자들은 개별 2/3-BiFab 모듈, 뿐만 아니라, MCF7 세포에의 생화학적 사슬 셔플링 (상기 실시예에서 기술함), 이어서 FACS 분석을 실시한 것을 적용하였다. MCF7 세포는 이들의 세포 표면 상에서 LeY 항원을 보유하며, 따라서 개별 2/3-BiFab 를 이들의 기능적 Fab 아암과 결합시킨다. 도 23 은 개별적으로 적용된 2/3-BiFab 가 MCF7 세포에 결합하지만, 제 2 표적 Dig-Cy5 를 포획할 수 없다는 것을 보여준다 (도 23, 2 및 3 행). 이것은 2/3-BiFab 에서 기능적 스템-Fv 의 부재, 및 따라서 하나의 2/3-BiFab 에만 결합하는 세포 상에서 기능적 스템-Fv 의 부재를 반영한다. 그러나, 두 (상보적인) 2/3-BiFab 의 동시 적용은 MCF7 세포의 표면 상에서 Dig-Cy5 를 포획하고 유지할 수 있다 (도 23, 4 행). 이것은 스템-Fv 의 Dig-결합 기능성을 갖는 기능적 TriFab 의 성공적인 사슬 재배열/교환 및 생성을 나타낸다. 스템 영역의 성공적인 사슬 교환 및 기능적 스템-Fv (Dig-Cy5 관련 표적화된 FACS 신호) 의 회복은 또한 상보적 2/3-BiFab 의 연속적인 적용시에 관찰되었다. 세포 결합을 가능하게 하기 위한 제 1 엔터티의 적용, 이어서 미결합 분자를 제거하기 위한 광범위한 세정, 및 제 2 엔터티의 후속 적용은 또한 항원 양성 세포 상에서 FACS 신호를 생성한다. 이것은, 성공적인 교환 반응 (동시 또는 순차 적용에 의함) 이 표적 세포의 표면 상에서 생리학적 조건하에 발생할 수 있다는 것을 확증한다.
실시예 18
본 발명에 따른 표적화된 항-CD3-프로드러그 2/3-BiFab 의 완전 기능성 이중특이적 항체로의 세포상 사슬 전환
2/3-BiFab 프로드러그의 세포상 전환이 상이한 결합 특이성에 적용될 수 있는 일반적인 원리인 것을 입증하기 위해서, CD3-결합 항체의 VH 또는 VL 도메인을 함유하는 2/3-BiFab 를 생성하였다. T-세포 이중특이적 항체 (T-세포 모집자라고도 함) 는 CD3-결합 기능성을 갖는 종양 세포의 표면 상의 항원을 인식하는 결합 엔터티와 조합되는 단백질이다. 이러한 분자는 이들의 종양-항원-결합 엔터티를 통해 종양 세포에, 뿐만 아니라, (CD3-결합 기능성을 통해) T-세포에 결합한다. 이것은 또한 궁극적으로는 항체 결합-유도된 T-세포 공격에 의해 매개되는 종양 세포 용해/사멸을 야기하는 (활성화) 신호 및 과정을 생성한다.
항-CD3-프로드러그 기능성, 즉, CD3 결합 부위를 갖는 2/3-BiFab 는 스템 영역에 위치하고, 따라서, 2/3-BiFab 추출물에서 결합 적격이 아니며, 상기에서 기술한 바와 같이 설계되었다 (실시예 14 및 15 참조). 경쇄, 노브- 또는 홀-중쇄 및 대응하는 MHCFcRP 를 공동-발현시켜, 2/3-BiFab LeY-proCD3(홀)-MHCFcRP(노브) 및 2/3-BiFab LeY-proCD3(노브)-MHCFcRP(홀) 을 생성하였다. 2/3-BiFab 를 상기에서 기술한 바와 같이 정제하고 (실시예 15 에서의 표 참조), 세포상 사슬 교환 반응에 적용하였다.
항-CD3-프로드러그 기능성을 갖는 2/3-BiFab 의 세포상 사슬 교환을 실험적으로 입증하기 위해서, 이들을 MCF7 세포에 적용하였다. 이어서, CD3-수용체 결합시 신호를 생성하는 세포-기반 리포터 분석을 통해 CD3-결합 기능성의 존재 및 부재를 결정하였다 (Promega T-cell Activation Bioassay (NFAT), cat. # J1621, Figure 24).
MCF7 세포는 이들의 세포 표면 상에 LeY 항원을 보유하며, 따라서 개별 2/3-BiFab 는 이들의 기능적 Fab 아암과 결합할 수 있다. 도 25 에서, 개별적으로 적용된 2/3-BiFab 는 MCF7 세포와 결합하지만, CD3 리포터 신호를 생성하지 않거나 적게 생성한다는 것을 알 수 있다. 이것은 이들 분자에서 CD3-결합 기능성의 부재를 반영한다. 그러나, 두 (상보적인) 2/3-BiFab 의 동시 적용은 효율적인 CD3-결합을 반영하는 유의한 신호를 생성하였다. 이것은 세포 상에서 CD3-결합 기능성을 갖는 기능적 TriFab 의 성공적인 세포상/생체내 사슬 재배열/교환 및 생성을 나타낸다.
스템 영역의 성공적인 사슬 교환 및 기능적 스템-Fv (CD3-신호) 의 회복은 또한 상보적 2/3-BiFab 의 연속적인 적용시에 관찰되었다. 세포 결합을 가능하게 하기 위한 제 1 엔터티의 적용, 이어서 미결합 분자를 제거하기 위한 광범위한 세정, 및 제 2 엔터티의 후속 적용은 또한 항원 양성 세포 상에서 신호를 생성하였다. 이것은, 성공적인 교환 및 표적화된 항-CD3 프로드러그 분자 반응의 활성화가 표적 세포의 표면 상에서 생리학적 조건하에 발생할 수 있다는 것을 확증한다.
실시예 19
본 발명에 따른 상이한 항원 표적화 2/3-BiFab 프로드러그의 완전 기능성 세포 결합 활성화 삼중특이적 TriFab 로의 세포상 전환
2/3-BiFab 매개된 사슬 교환 및 프로드러그-유사 항체 유도체의 후속 활성화는 이중 항원 결합 원리와 조합될 수 있다. 이것은 도 26 에서 도시한 바와 같이, 프로드러그-활성화 특이성을 향상시킨다: 사슬 교환시 기능적 TriFab 를 생성하는 2/3-BiFab 의 쌍은 동일한 특이성의 스템-Fv 상보적 기능성 (예를 들어, CD3 (=CD-항원 1) 또는 CD-AG-2 (=CD-항원 2), 또는 표적화된 프로드러그 접근법으로부터 혜택을 받는 다른 결합제) 을 포함하지만, 상이한 특이성의 세포 표면 결합 Fab 아암을 포함할 수 있다. 여기에서, 생산적인 사슬 교환 및 스템-Fv 기능성의 회복은 두 항원을 발현하는 세포 상에서만 발생한다. 이러한 설정에 있어서, 교환 반응은 각각의 2/3-BiFab 로부터 유래된 하나의 Fab 아암 및 양쪽으로부터의 상보적 VH 및 VL 로부터 회복된 스템-Fv 를 갖는 삼중특이적 TriFab 를 세포 표면 상에서 생성한다. 스템-Fv 기능성은 개별 2/3-BiFab 에서, 또는 하나의 2/3-BiFab 에만 결합하는 세포 상에서 부재하기 때문에, 프로드러그-활성화의 높은 특이성이 제공된다. 두 상보적 2/3-BiFab (충분한 밀도) 에 대한 표적 항원을 보유하는 세포 만이 사슬 교환을 가능하게 하며, 여기에서 기능적 스템-Fv 영역의 재생성을 가능하게 한다. 이중특이적 결합 기능성의 세포상 생성은 또한, 이것이 1 가에서 2 가 세포 표면 결합제로 전환됨에 따라, 결합활성에 기여한다. 따라서, 이것은 표적 세포의 표면 상에서 TriFab 유도체의 결합을 증가시키고, 안정화시킨다 (디술피드-결여 2/3-IgG 에 대해서도 나타낸 바와 같은 결합활성-매개된 개선).
따라서, 세포 표면 농도은 보다 높으며, 여기에서 추가의 특이성이 얻어진다.
도 27 은 상이한 항원 표적화 2/3-BiFab 프로드러그의, 완전 기능성, 세포 결합된, 활성화된, 삼중특이적 TriFab 로의 세포상 전환에 대한 실험 결과를 보여준다. 세포 표면 항원 LeY 또는 세포 표면 항원 메소텔린 (MSLN) 에 결합하는 상보적 2/3-BiFab 를 생성하고, 두 항원을 동시에 발현하는 세포주 상에서 6 시간 동안 조합하였다. 두 구성물의 (비활성화된) 스템-Fv 는 Dig-결합 항체의 VH 또는 VL 을 보유하였다. FACS 분석은 LeY-결합 2/3-BiFab 단독 또는 메소텔린-결합 2/3-BiFab 단독의 적용시에, 관련 Dig-결합 활성의 결여를 나타냈다 (도 27, 2 및 3 행). 그러나, 둘의 동시-적용은 이들 세포의 증가된 형광에 의해 나타나는 바와 같이, Dig-결합 세포 표면 관련 기능성의 생성을 야기한다 (도 27, 4 행).
실시예 20
본 발명에 따른 상이한 항원 표적화 TriFab 프로드러그의 삼중특이적 TriFab 로의 세포상 전환
출발 분자로서 2/3-BiFab 유도체는 MHCFcRP 로서 이들의 N-말단에 Fab 아암을 갖지 않는 변형된 스템-Fv 영역을 포함한다. 이들 엔터티에 대한 Fab 아암의 부착 및 중쇄와 조합된 이의 발현은 도 28 에 도시한 바와 같이, 교환-가능한 2/3-TriFab-유도체를 생성한다. 이들 분자는 - 이들의 상응하는 파트너의 발견시 - 기능적 삼중특이적 TriFab 로 교환되는 잠재적으로 항원-결합 적격 사슬로 변경된 이들의 MHCFcRP 를 가진다.
따라서, 세포 표면 표적 결합 특이성 'A' 를 갖는 2/3-TriFab 유도체는, 특이성 'X' 를 갖는 VH 및 특이성 'Y' 의 VL 로 구성된 비-기능적 스템-Fv 를 보유하는 것으로 생성될 수 있다. 상응하게, 세포 표면 표적 결합 특이성 'B' 를 갖는 상보적 2/3-TriFab 유도체는, 특이성 'Y' 를 갖는 VH 및 특이성 'X' 의 VL 로 구성된 비-기능적 스템-Fv 를 보유하는 것으로 생성될 수 있다. 이러한 분자의 세포상 사슬 교환은, 둘 다 (결합활성-강화된) 이중특이적 세포 결합 Fab 아암 (둘 다 A+B) 을 보유하는 2 가지 유형의 삼중특이적 TriFab 를 생성한다. 이들 TriFab 중 하나는 제 1 특이성의 완전 활성 스템-Fv 기능성을 보유하고, 다른 하나의 TriFab 는 제 2 스템 Fv 기능성 (완전 활성 'X' TriFab 또는 완전 활성 'Y' TriFab) 을 함유한다. 예를 들어, 이러한 TriFab-프로드러그 쌍의 적용은, 2 개의 한정된 (암) 표면 항원을 충분한 밀도로 동시에 발현하는 세포 상에서만 선택적으로 비활성 CD3 에서 활성 CD3, 뿐만 아니라, CD-AG-2 결합제 (또는 결합활성-강화된 특이적 프로드러그 활성화로부터 혜택을 받는 다른 결합제 쌍) 로의 동시 전환을 가능하게 해야 한다.
실시예 21
본 발명에 따른 삼중- 또는 사중특이적 2/3-BiFab 프로드러그 유도체
2/3-BiFab 유도체는 본원에서 보고되는 바와 같은 교환 반응을 위한 출발 분자로서 설계되었고, 생성될 수 있으며, 여기에서 MHCFcRP 는, 예를 들어 (G4S)6 링커와 같은 펩티드 링커를 통해 중쇄의 C-말단에 공유적으로 접합된다. 이것은 도 29 에 도시한 바와 같이, TriFab 의 단일-사슬 스템-모듈과 유사한 '비-기능적' 엔터티를 생성한다. 이들 단일-사슬 스템 모듈에 대한 Fab 아암의 부착은 교환-가능한 TriFab-유도체를 생성한다. 이들 중 2 개는 도 29 에 도시한 바와 같이, 기능적 삼중- 또는 사중특이적 항체 유도체로 교환될 수 있다.
LeY 결합 영역은 다른 항원과 결합할 수 있는 서열과 교환되어, 세포 상에서 상이한 항원과 결합하고, 도 28 에서 기술한 바와 동일한 방식으로 재배열되는 항체-프로드러그를 생성할 수 있다.
실시예 22
본 발명에 따른 표적화된 항-CD3-프로드러그 2/3-BiFab 의 세포상 사슬 전환은 종양 세포의 효과적인 T-세포 -매개된 사멸을 가능하게 한다
이 실시예는, 2/3-BiFab 프로드러그의 CD3-결합 TriFab 로의 세포상 전환이 표적화된 종양 세포의 T-세포 매개된 사멸을 가능하게 한다는 것을 입증한다: LeY-종양 항원 결합 2/3-BiFab 는 CD3-결합 항체의 VH 또는 VL 도메인을 함유하는 것으로 생성되었다. 이들 2/3-BiFab 프로드러그의 설계 및 생성은 상기 실시예에 기재되어 있다. 이들 2/3-BiFab 프로드러그의 CD3-결합제의 VH 및 VL 서열은 US 2015/0166661 A1 에 기재되어 있다.
이들 분자가 동시 결합시 세포-매개된 사멸을 유도한다는 것을 입증하기 위해서, 이들을 LeY 양성 MCF7 세포에 상이한 농도로 적용하였다. 그러므로, MCF7 세포를 96 웰 플레이트에 파종하고, 밤새 인큐베이션한 후, 이들 세포를 2/3-BiFab 항-LeY-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀) 및 2/3-BiFab 항-LeY-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브) 에 노출시켰다. 이들 성분은 개별적으로/순차적으로 또는 조합하여 첨가하였다. T-세포 매개된 사멸을 평가하기 위해서, 건강한 공여체의 전혈로부터의 PBMC (최신 Ficoll 정제를 통해 단리됨) 를 5:1 비율로 첨가하였다. 이어서, 배양물을 37 ℃, 5 % CO2 에서 48 시간 동안 유지시킨 후, 종양 세포 용해의 정도를 평가하였다 (최신 LDH 방출 분석을 적용).
이들 분석의 결과를 도 30 에 나타낸다.
MCF7 세포는 이들의 세포 표면 상에 LeY 항원을 보유하며, 따라서 개별 2/3-BiFab 는 이들의 기능적 Fab 아암과 결합할 수 있다. 개별적으로 적용되는 2/3-BiFab, 즉, 항-LeY-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀) 또는 2/3-BiFab 항-LeY-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브) 의 투여는 높은 몰 농도에서도 관련 T-세포-매개된 사멸 (LDH 의 방출 없음) 을 야기하지 않는다. 이것은 이들 분자의 CD3-결합 기능성 (T-세포 매개된 세포 용해에 필요) 의 부재를 반영한다.
대조적으로, 두 (상보적인) 2/3-BiFab 의 동시 적용은 유의한 LDH 방출을 야기하였다. 이것은 이미 매우 낮은 농도에서 유의한 종양 세포 용해를 반영한다. 그 이유는, 종양 세포 표면 상에서의 성공적인 사슬 재배열/교환 및 CD3-결합 기능성을 갖는 기능적 TriFab 의 생성이다. 이어서, 이들 기능적 CD3-결합 TriFab 는 또한 T-세포를 모집하고, 관여시켜, 표적화된 종양 세포 용해를 유도한다.
실시예 23
본 발명에 따른 AG-4 및 EGFR-표적화된 항-CD3-프로드러그 2/3-BiFab 의 세포상 사슬 전환은 종양 세포의 효과적인 T-세포-매개된 사멸 및 강력한 사이토카인 방출을 가능하게 한다
실시예 22 에서 기술한 실험 설정과 유사하게, AG-4 발현 HELA 세포 및 EGFR 발현 A431 세포는 각각의 2/3-BiFab 로 표적화되었다.
항-AG-4-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀) 또는 2/3-BiFab 항-AG-4-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브) 의 HELA 세포에의 투여는 관련 세포-매개된 사멸 (LDH 의 방출 없음) 을 야기하지 않는다. 이것은 이들 분자의 CD3-결합 기능성 (T-세포 매개된 세포 용해에 필요) 의 부재를 반영한다.
또한, 항-EGFR-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀) 또는 2/3-BiFab 항-EGFR-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브) 의 A431 세포에의 투여는 관련 세포-매개된 사멸 (LDH 의 방출 없음) 을 야기하지 않는다.
대조적으로, 두 (상보적인) 2/3-BiFab 의 동시 적용은 두 표적 세포 설정에서 유의한 LDH 방출을 야기하였다. 이것은 이미 매우 낮은 농도에서 유의한 종양 세포 용해를 반영한다 (도 31). 그 이유는, 종양 세포 표면 상에서의 2/3-BiFab 사이의 성공적인 사슬 교환 및 CD3-결합 기능성을 갖는 기능적 TriFab 의 생성이다.
또한, 도 32 는 HELA 세포 상에서 AG-4 표적화에 대해 4 nM 의 농도에서, 분비된 사이토카인의 양을 보여준다. 항-AG-4-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀) 및 2/3-BiFab 항-AG-4-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브) 둘 다가 적용된 설정에서 유의하게 많은 양의 IL-2, IFN-γ, 그랜자임 B 및 TNFα 가 존재하며, 이는 사이토카인 수준에 대해서도 강력한 면역 반응을 반영한다 (도 32).
실시예 24
HELA 세포 상에서 EGFR 및 AG-4 의 이중 표적화는 본 발명에 따른 항-CD3-프로드러그 2/3-BiFab 의 세포상 사슬 전환 및 효과적인 T-세포 활성화를 가능하게 한다
이중 표적화는, CD3-수용체 결합시 신호를 생성하는 리포터 세포주를 사용하여 기능적 분석에서 평가하였다 (Promega T-cell Activation Bioassay (NFAT), cat. # J1621).
세포 표면 항원 4 (AG-4) 및 표피 성장 인자 (EGFR) 둘 다를 발현하는 HELA 세포 (도 33) 를 2/3-BiFab 표적화 AG-4 또는 EGFR 로 처리하였다. 두 구성물의 (비활성화된) 스템-Fv 는 CD3-결합 항체의 VH 또는 VL 을 보유하였다. 결과는 EGFR-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀) 단독 또는 AG-4-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브) 단독의 적용시, 관련 CD3-결합 활성의 결여를 나타냈다. 그러나, 둘의 동시-적용은 CD3 에 대한 유의한 결합 및 리포터 세포주의 활성화를 유도한다 (도 34). 대조군으로서, EGFR-proCD3 (홀)-MHCFcRP (노브) 및 AG-3-proCD3 (노브)-MHCFcRP (홀) 분자를 분석하였다. 항원 발현과 관련하여, HELA 세포는 AG-3 음성이며, 따라서 EGFR 표적화된 2/3-BiFab 만이 결합할 수 있다. 이 대조군은, 셔플링 반응이 세포 표면 상에서, 그리고 두 2/3-BiFab 가 세포 표면에 결합된 경우에만 발생한다는 또다른 증거로서의 역할을 한다. 전환이 배지에서 저 농도에서도 효율적일 경우, 전환 생성물 EGFR/AG-3/CD3 TriFab 는 EGFR-결합 엔터티를 통해 세포 표면에 결합하며, 따라서 CD3-매개된 활성화를 유도할 수 있을 것이다 - 이것은 검출되지 않았다.
실시예 25
단일-사슬 스템 모티브를 갖는 삼중특이적 2/3 Fab 프로드러그 유도체는 본 발명에 따른 세포상 전환을 겪으며, 여기에서 2 개의 추가의 결합 부위를 생성하고, T-세포를 강하게 활성화시킨다
2/3-BiFab 유도체는 본원에서 보고되는 바와 같은 교환 반응을 위한 출발 분자로서 설계되었고, 생성되었으며, 여기에서 MHCFcRP 는, 예를 들어 (G4S)6 링커 (SEQ ID NO: 81 x 6) 와 같은 펩티드 링커를 통해 중쇄의 C-말단에 공유적으로 접합되었다. 이것은 도 29 에 도시한 바와 같이, TriFab 의 단일-사슬 스템-모듈과 유사한 '비-기능적' 엔터티를 생성하였다. 이들 단일-사슬 스템 모듈에 대한 Fab 아암의 부착은 교환-가능한 TriFab-유도체를 생성하였다. 이들 중 2 개는 도 29 에 도시한 바와 같이, 기능적 삼중특이적 항체 유도체로 교환되는 것으로 나타났다.
도 35 는 유세포 분석을 통한 결합 연구를 위한 설정을 도시한다. 수득된 결과는 도 36 에 도시되어 있다. 반면에, 구조물 중 하나 만으로는 Dig-Cy5 또는 Bio-488 의 결합을 유도하지 않았으며 (도 36A: 2 및 3 행; 도 36B: 2 및 3 행), 그러나 둘의 동시-적용은 이들 세포의 증가된 형광에 의해 나타나는 바와 같이, Dig 및 Bio-결합 세포 표면 관련 기능성의 생성을 유도한다 (도 36A: 4 행; 도 36B: 4 행).
따라서, 삼중특이적 항체는 단일 사슬 항-LeY-CD3-TriFab 중쇄 (노브)-CD-AG-2-VL (홀) 및 단일 사슬 항-LeY-CD3-TriFab 중쇄 (홀)-CD-AG-2-VH (노브) 를 조합함으로써, CD3 및 CD-AG-2 결합 엔터티로 생성되었다 (도 37). T-세포를 활성화시키는 이들 분자의 능력은 (Promega T-cell Activation Bioassay (NFAT), cat. # J1621) 을 사용하여 입증되었으며, 도 38 에 도시되어 있다.
실시예 26
본 발명에 따른 표적화된 항-CD3-프로드러그 2/3-BiFab 의 세포상 사슬 전환의 부산물로서의 추가의 결합 부위를 갖는 Fab-형상화 MHCFcRP 이합체
도 18 에 도시한 바와 같이, 특이성 4 를 갖는 MHCFcRP 부산물은 비-결합일 수 있다. 그러나, 기능적 결합 엔터티의 VH 또는 각각의 VL 을 MHCFcRP 에 첨가함으로써, 교환 반응 동안에 기능적, 즉, 결합 적격, Fab 분자가 생성되었다. MHCFcRP 부산물의 결합 기능성을 나타내기 위해서, CD-AG-2 MHCFcRP 를 보유하는 LeY-표적화 2/3-BiFab 쌍을 단독으로 또는 조합하여 배지에 첨가하였다. 또한, CD-AG-2 를 발현하는 LeY-음성 Jurkat 세포를 첨가하였다. 전체 설정은 도 39 에 도시되어 있다. MHCFcRP 부산물은 PE-항 His6 항체로 검출하였다. Jurkat 세포가 LeY 음성이며, 2/3-BiFab 가 세포 표면에 결합할 수 없다는 사실 때문에, 2/3-BiFab (도 40, 2 및 3 행) 단독은 검출 항체의 His6 결합을 유도하지 않았다. 2 개의 2/3-BiFab 의 조합은 MHCFcRP 부산물의 생성을 유도하고, 이는 CD-AG-2 에 결합할 수 있었으며, 유세포 분석에 의한 항-His6 항체를 통해 검출할 수 있었다 (도 40, 4 행). 미반응 2/3-BiFab 는 LeY 발현의 부재 때문에, 세포에 결합할 수 없었다.
실시예 27
표적화 엔터티로서 추가의 N-말단 융합된 Fab 를 갖는 MHCFcRP 는 본 발명에 따른 2 가 세포 표적화, 매개 세포상 전환 및 3 가 MHCFcRP 부산물의 생성을 허용한다
출발 분자로서 2/3-BiFab 유도체는 MHCFcRP 로서 이들의 N-말단에 Fab 아암을 갖지 않는 변형된 스템-Fv 영역을 포함한다. 이들 엔터티에 대한 Fab 아암의 부착 및 중쇄와 조합된 이의 발현은 도 41 에 도시한 바와 같이, 교환-가능한 2/3-TriFab-유도체를 생성한다. 이들 분자는 - 이들의 상응하는 파트너의 발견시 - 기능적 삼중특이적 TriFab 로 교환되는 LeY-결합 적격 사슬로 변경된 이들의 MHCFcRP 를 가진다.
따라서, LeY 표적 결합 특이성을 갖는 2/3-TriFab 유도체는, CD3 특이성을 갖는 VH 및 CD-AG-2 특이성의 VL 로 구성된 비-기능적 스템-Fv 를 보유하는 것으로, 또는 그 반대의 것으로 생성될 수 있다. 이러한 분자의 세포상 사슬 교환은, 둘 다 (결합활성-강화된) 이중특이적 LeY Fab 아암을 보유하는 2 가지 유형의 삼중특이적 TriFab 를 생성한다. 이들 TriFab 중 하나는 CD3 특이성의 완전 활성 스템-Fv 기능성을 보유하고, 다른 하나의 TriFab 는 CD-AG-2 스템 Fv 기능성을 함유한다. 예를 들어, 이러한 TriFab-프로드러그 쌍의 LeY-발현 MCF7 세포에의 적용은, 비활성 CD3 에서 활성 CD3, 뿐만 아니라, CD-AG-2 결합제로의 동시 전환을 가능하게 한다.
결과는 도 42 에 도시되어 있다. 결과는 LeY-proCD3 (노브)-LeY-proCD-AG-2-MHCFcRP(홀) 또는 LeY-proCD3 (홀)-LeY-proCD-AG-2-MHCFcRP(노브) 의 단독 적용시, 관련 T-세포 활성화 엔터티의 결여를 나타냈다. 그러나, 둘의 동시-적용은 유의한 T-세포 활성화를 유도한다.
실시예 28
대안적인 2/3-BiFab 유도체는 CH2-의존적 FcRn 결합을 그대로 유지하고 본 발명에 따른 세포상 사슬 전환을 나타낸다
출발 분자로서 2/3-BiFab 유도체는 MHCFcRP 로서 변형된 스템-Fv 영역을 포함한다. 통상적인 IgG 로부터 CH2 도메인을 유지하고, 따라서 FcRn 에 결합하는 능력을 연장된 반감기 동안 유지하기 위해서, 가변 단편은 도 43 에 도시한 바와 같이, CH2-CH3 이합체의 C-말단 단부에 부착될 수 있다. CH3 도메인에서의 부분적 불안정화 돌연변이는 2/3-BiFab 에서와 동일하다. 대안적으로, 가변 단편은 도 44 에 도시한 바와 같이, Fc-부분 (CH2+CH3) 과 Fab 부분 사이에 도입될 수 있다. 모든 항체는 양호한 수율 (72 mg/L 내지 161 mg/L) 로 상기에서 기술한 바와 같이 발현되었다. 도 45 는 초기 2/3-BiFab 와 비교하여, 확장된 혈청 반감기를 나타내는 FcRn 에 대해 보다 높은 결합을 나타내는 CH2 함유 포맷의 능력을 확증한다 (분석 FcRn 친화성 크로마토그래피는 Schlothauer, T., et al., MAbs 5 (2013) 576-586 에 기재된 바와 같이 수행하였다).
세포상 사슬 전환을 제공하는 CH2 함유 2/3-BiFab 의 능력은 상기에서 기술한 바와 같이 유세포 분석에 의해 분석하였다. 이어서, 2 개의 추출물 분자를 (그 사이에 2 회 세정함) MCF7 세포에 적용하였다. 사슬 교환시, 기능적 항-디곡시게닌 결합 부위가 조립되었으며, 따라서 세포 표면 상에서 디곡시게닐화된 Cy5 에 결합할 수 있었고, 이것은 FACS 에 의해 검출되었다. 두 분자는 도 43 및 44 에 따라서 분류하고, 도 46 에 도시한 바와 같이 본 발명에 따른 사슬 교환 반응을 성공적으로 수행하였다.
실시예 29
2/3-BiFab 를 함유하는 CH2 도메인은 본 발명에 따른 방법에서 기능적 CD3-결합 부위로 전환되어 T-세포 활성화를 매개할 수 있다
C-말단 단부에 부착된 가변 단편을 갖는 CH2-함유 2/3-BiFab (도 47) 를, 상기에서 기술한 바와 같이 Jurkat 활성화 분석을 사용하여 기능적 CD3 결합제를 생성하는 이들의 능력에 대해 분석하였다. MCF7 세포는 표적 세포로서 제공되었으며, LeY 는 표적 항원으로서 제공되었다. 2/3-BiFab 는 유의한 Jurkat 활성화를 유도하지 못한 반면, 둘의 조합은 투여량-의존적 활성화 및 리포터 시스템 (RLU) 에서 발광을 야기하였다 (도 48).
실시예 30
투과 전자 현미경은 2/3-BiFab 의 제안된 구조 및 상응하는 생성물을 확증하고 이들이 고도로 유연하다는 것을 나타낸다
본 발명에 따른 방법에서 수득한 2/3-BiFab 및 각각의 사슬 교환 생성물의 형상 및 구조를 분석하기 위해서, 음성 착색 투과 전자 현미경 (NS-TEM) 을 수행하였다. 결과 (도 49) 는 단단한 도메인 내 특성, 그러나 높은 도메인 내 유연성을 나타낸다.
그리드 제조: 새로 해동된 샘플을 약 5 mg/ml 의 농도로 D-PBS 에 희석시킨다. 4 ㎕ 의 희석된 샘플을 글로 방전된 400 메쉬 탄소 코팅된 파로디온 구리 그리드에 흡착시키고, 3 방울의 물로 세정하고, 3 ㎕ 의 TMV 함유 용액과 함께 인큐베이션하고, 2 방울의 물로 추가로 세정하고, 마지막으로 2 방울의 우라닐 아세테이트 2 % 로 염색하였다.
투과 전자 현미경: 120 kV 에서 작동하는 Tecnai12 투과 전자 현미경 (FEI, Eindhoven, The Netherlands) 을 사용하여 샘플을 영상화하였다. 전자 현미경 사진을 2048x2048 픽셀 전하-결합 장치 카메라 (Veleta Gloor Instruments) 상에서 195,000x 의 공칭 배율로 기록하여, 표본 수준에서 0.296 nm 의 최종 픽셀 크기를 산출하였다. 대안적으로, 80 kV 에서 작동하는 FEI Tecnai G2 Spirit TEM (FEI, Eindhoven, The Netherlands) 을 사용하여 샘플을 영상화하였다. 이어서, 전자 현미경 사진을 2048x2048 픽셀 전하-결합 장치 카메라 (Veleta Soft Imaging Systems) 상에서 135,000x 의 공칭 배율로 기록하여, 표본 수준에서 0.33 nm 의 최종 픽셀 크기를 산출하였다.
영상 처리: EMAN2 영상 처리 패키지를 사용하여, 기록된 영상으로부터 수동으로 선택된 입자에 대해 무참조 정렬을 수행하였다 (예를 들어, G. Tang, L., et al., J. Struct. Biol. 157 (2007) 38-46 참조). 추출된 입자를 다변량 통계 분석에 의해 정렬하고, 분류하여, 2D 클래스 평균을 산출하였다. 또한, 클래스 평균화가 가능하지 않은 경우, Photoshop 을 사용하여 선명도를 위해 입자의 원시 이미지를 수동으로 염색하였다.
실시예 31
표적-관련되지 않은 사슬 전환은 고 농도에서만 비효율적으로 발생한다
사슬 전환이 또한 배지에서 고 농도에서 발생하는지를 다루기 위해서, 2/3-BiFab 를 PBMC 와 공동-배양된 HELA 세포에 적용하였다. 제 1 설정에서, 항-AG-4-proCD3(홀)-MHCFcRP(노브) 및 EGFR-proCD3(노브)-MHCFcRP(홀) 를 적용하였다 (두 표적이 HELA 세포 상에서 발현되기 때문에, 세포상 전환이 일어난다). 제 2 설정에서, 항-AG-4-proCD3(홀)-MHCFcRP(노브) 및 AG-3-proCD3(노브)-MHCFcRP(홀) 를 적용하였다 (AG-3 은 HELA 세포 상에서 발현되지 않으며, 따라서 세포상 전환은 가능하지 않아야 한다). 그러나, 300 nM 의 농도에서 사멸의 백분율은, 배지에서의 전환 및 AG-4 결합 부위를 통한 HELA 세포 표면에의 1 가 결합이 거의 발생하지 않으며, 표적 세포의 사멸을 낮은 백분율로만 매개한다는 것을 보여준다 (도 50).
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Method for in vivo generation of multispecific antibodies from
monospecific antibodies
<130> P34507-WO
<150> EP17199086.4
<151> 2017-10-30
<160> 97
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 2
<211> 324
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro
<210> 3
<211> 375
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
370 375
<210> 4
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
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145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu
225
<210> 20
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a S228P,
L235E and S354C, T366W mutations
<400> 20
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu
225
<210> 21
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a S228P,
L235E and Y349C, T366S, L368A, Y407V mutations
<400> 21
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Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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180 185 190
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195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu
225
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<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a P329G
mutation
<400> 22
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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65 70 75 80
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210 215 220
Leu Ser Leu
225
<210> 23
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a P239G
and Y349C, T366S, L368A, Y407V mutations
<400> 23
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Leu Ser Leu
225
<210> 24
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a P329G
and S354C, T366W mutations
<400> 24
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu
225
<210> 25
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a S228P,
L235E, P329G and Y349C, T366S, L368A, Y407V mutations
<400> 25
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
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Leu Ser Leu
225
<210> 26
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IgG4 Fc-region derived Fc-region polypeptide with a S228P,
L235E, P329G and S354C, T366W mutations
<400> 26
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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35 40 45
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195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu
225
<210> 27
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<213> Homo sapiens
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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<213> Homo sapiens
<400> 28
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
65 70 75 80
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
85 90 95
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
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65 70 75 80
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=S or P
<400> 30
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=S or P
<400> 31
His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=S or P
<400> 32
Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFcRP-hole-D356K-His8
<400> 35
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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<210> 36
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFcRP-hole-E357K-His8
<400> 36
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
225 230 235 240
<210> 37
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFcRP-knob-K370E-His8
<400> 37
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
225 230 235 240
<210> 38
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFcRP-knob-K439E-His8
<400> 38
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
225 230 235 240
<210> 39
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-bio antibody full length light chain
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<213> Artificial Sequence
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 60
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-fluos antibody full length heavy chain-hole without
hinge-cysteine residues
<400> 60
Gly Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Met Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Phe Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Ala Ser Tyr Gly Met Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 61
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFcRP-hole-D356K-His8 without hinge-cysteine residues
<400> 61
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
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100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
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<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFcRP-hole-E357K-His8 without hinge-cysteine residues
<400> 62
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1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
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35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
225 230 235 240
<210> 63
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFcRP-knob-K370E-His8 without hinge-cysteine residues
<400> 63
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1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
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100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
225 230 235 240
<210> 64
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFcRP-knob-K439E-His8 without hinge-cysteine residues
<400> 64
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
225 230 235 240
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cys-free hinge region
<400> 66
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hexa-histidine tag
<400> 67
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> octa-histidine tag
<400> 68
His His His His His His His His
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 71
Gln Gln Gln Ser
1
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 72
Gln Gln Gln Gln Ser
1 5
<210> 73
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 73
Ser Ser Ser Gly
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 74
Ser Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 75
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 76
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<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 77
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 78
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 79
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 81
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 81
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptidic linker
<400> 82
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 83
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-LeY antibody full light chain
<400> 83
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ile Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 474
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-LeY-antibody heavy chain with anti-dig antibody variable
domain as CH2 domain-knob
<400> 84
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
245 250 255
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
260 265 270
Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
275 280 285
Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp
290 295 300
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr
340 345 350
Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 85
<211> 456
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-LeY-antibody heavy chain with anti-dig antibody variable
domain as CH2 domain-hole
<400> 85
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
245 250 255
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys
260 265 270
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
275 280 285
Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
290 295 300
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 86
<211> 461
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-MSLN-antibody heavy chain with anti-dig antibody variable
domain as CH2 domain-hole
<400> 86
Gln Val Lys Leu Lys Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Val Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Thr Ser Lys Val Arg Ser Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ser His Tyr Tyr Gly Tyr Arg Thr Gly Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
245 250 255
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
260 265 270
Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
275 280 285
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly
290 295 300
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
305 310 315 320
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
325 330 335
Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
340 345 350
Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
355 360 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 87
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-MSLN antibody light chain
<400> 87
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 88
<211> 468
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-LeY-antibody heavy chain with anti-CD3 antibody variable
domain as CH2 domain-knob
<400> 88
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro
245 250 255
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
260 265 270
Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
275 280 285
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln
290 295 300
Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr
305 310 315 320
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly
340 345 350
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 89
<211> 455
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-LeY-antibody heavy chain with anti-CD3 antibody variable
domain as CH2 domain-hole
<400> 89
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser
245 250 255
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
260 265 270
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp
275 280 285
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser
290 295 300
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
305 310 315 320
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
325 330 335
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 90
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFCRP with non-binding variable domain as CH2 domain-hole
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ser Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Gly Ser Ala Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Ser Gly Gly Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His
210 215 220
His His His
225
<210> 91
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHCFcRP with non-binding variable domain as CH2 domain-knob
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ala Gly Thr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His
225 230 235 240
<210> 92
<211> 720
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> single chain anti-LeY-Dig TriFab heavy chain (knob) - Bio VL
(hole)
<400> 92
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
245 250 255
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
260 265 270
Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
275 280 285
Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp
290 295 300
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr
340 345 350
Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
485 490 495
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln
500 505 510
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
515 520 525
Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln
530 535 540
Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Lys Thr Leu
545 550 555 560
Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
565 570 575
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr
580 585 590
Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
595 600 605
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
610 615 620
Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
625 630 635 640
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
645 650 655
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
660 665 670
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
675 680 685
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
690 695 700
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715 720
<210> 93
<211> 709
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> single chain anti-LeY-Dig TriFab heavy chain (hole) - Bio VH
(knob)
<400> 93
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
245 250 255
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys
260 265 270
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
275 280 285
Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
290 295 300
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
485 490 495
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser
500 505 510
Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala
515 520 525
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly
530 535 540
Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala
545 550 555 560
Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
565 570 575
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala
580 585 590
Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
595 600 605
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
610 615 620
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Glu Gly Phe
625 630 635 640
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
645 650 655
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
660 665 670
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
675 680 685
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
690 695 700
Thr Gln Lys Ser Leu
705
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Asp Lys Thr His Thr
1 5
<210> 95
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X = S or P
<400> 95
Cys Pro Xaa Cys
1
<210> 96
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated hinge
<400> 96
His Thr Ser Pro Pro Ser
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> new linker
<400> 97
Asp Lys Thr His Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
Claims (22)
- 하기를 포함하는 조성물:
a) 다음을 포함하는 제 1 다합체성 폴리펩티드:
다음을 포함하는 제 1 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 1 항체 가변 도메인, 및 b) 제 1 CH3 도메인, 여기에서 제 1 CH3 도메인은 인간 IgG1 CH3 도메인임,
ii) 제 1 항체 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 제 1 CH3 도메인에 대한 C-말단에서 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍,
다음을 포함하는 제 2 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 2 항체 가변 도메인, 및 b) 제 2 CH3 도메인, 여기에서 제 2 CH3 도메인은 인간 IgG1 CH3 도메인임,
여기에서 제 1 항체 가변 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인이거나; 또는 제 1 항체 가변 도메인이 항체 경쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인이고;
여기에서 제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 D356K 또는 E357K 를 포함하며, 여기에서 모든 번호 부여는 Kabat EU 지수에 따르며, 여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 교란 돌연변이가 D356K 인 경우에 위치 439 에서 아미노산 잔기 K, 또는
b) 교란 돌연변이가 E357K 인 경우에 위치 370 에서 아미노산 잔기 K
를 포함함; 및
b) 다음을 포함하는 제 2 다합체성 폴리펩티드:
다음을 포함하는 제 1 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 1 항체 가변 도메인, 및 b) 제 1 CH3 도메인, 여기에서 제 1 CH3 도메인은 인간 IgG1 CH3 도메인임,
ii) 제 1 항체 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 제 1 CH3 도메인에 대한 C-말단에서 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍,
다음을 포함하는 제 2 폴리펩티드:
i) N-말단에서 C-말단 방향으로 a) 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에서 선택되는 제 2 항체 가변 도메인, 및 b) 제 2 CH3 도메인, 여기에서 제 2 CH3 도메인은 인간 IgG1 CH3 도메인임,
여기에서 제 1 항체 가변 도메인이 항체 중쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인이거나; 또는 제 1 항체 가변 도메인이 항체 경쇄 가변 도메인인 경우에 제 2 항체 가변 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인이고;
여기에서 제 2 CH3 도메인은 교란 돌연변이 K370E 또는 K439E 를 포함하며, 여기에서 모든 번호 부여는 Kabat EU 지수에 따르며, 여기에서 제 1 CH3 도메인은
a) 교란 돌연변이가 K370E 인 경우에 위치 357 에서 아미노산 잔기 E, 또는
b) 교란 돌연변이가 K439E 인 경우에 위치 356 에서 아미노산 잔기 D
를 포함함,
여기에서 제 1 다합체성 폴리펩티드 및 제 2 다합체성 폴리펩티드는 다음을 특징으로 함
- 제 1 다합체성 폴리펩티드 및 제 2 다합체성 폴리펩티드는 힌지-영역 디술피드 결합 또는 CH3 도메인 간 디술피드 결합을 갖지 않고,
- 제 1 폴리펩티드의 제 1 CH3 도메인이
a) 돌연변이 T366W, 또는
b) 돌연변이 T366S/L368A/Y407V
를 포함하고,
제 2 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인이
a) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366W 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366S/L368A/Y407V, 또는
b) 제 1 CH3 도메인이 돌연변이 T366S/L368A/Y407V 를 포함하는 경우에 돌연변이 T366W
를 포함하고,
- 제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 D356K 를 포함하고, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 K439E 를 포함하거나, 또는
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 E357K 를 포함하고, 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인은 돌연변이 K370E 를 포함하고;
- 제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 1 항체 가변 도메인은 제 1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍이고,
제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 항체 가변 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 항체 가변 도메인은 제 3 표적에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 쌍임. - 제 1 항에 있어서, 제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 1 CH3 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인이 이종이합체 형성을 촉진하기 위해서 동일한 돌연변이를 포함하고; 제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 CH3 도메인 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 1 CH3 도메인이 이종이합체 형성을 촉진하기 위해서 동일한 돌연변이를 포함하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드 및 제 2 폴리펩티드가 서로 비-공유적으로 연결되어 이합체를 형성하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 항체 가변 도메인 및 제 2 항체 가변 도메인이 비-기능성 결합 부위를 형성하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 각각이 제 1 및 제 2 항체 가변 도메인 각각에 대해 N-말단에, 아미노산 서열 DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66) 또는 DKTHT (SEQ ID NO: 94) 또는 GGGS (SEQ ID NO: 69) 또는 DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97) 를 포함하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 및 제 3 표적이 상이한 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 각각이 CH3 도메인에 대해 바로 N-말단에 면역글로불린 G1 CH2 도메인을 추가로 포함하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 및 제 3 표적이 인간 CD3 인 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 다합체성 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드 및 제 2 다합체성 폴리펩티드의 제 2 폴리펩티드는 제 2 항체 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 제 2 CH3 도메인에 대한 C-말단에서 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍을 포함하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 조성물이 약학 조성물이고, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
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