DE69328430T2 - Zielgerichte liposome zur blut-hirne schranke - Google Patents

Description

Zielgerichtete Liposome zur Blut-Hirn-Schranke Beschreibung:
• Die Erfindung betrifft im allgemeinen die Zuführung von Medikamenten zum Gehirn durch Transzytose durch die Blut-Hirn-Schranke. Insbesondere betrifft die Erfindung zielgerichtete, Medikamente enthaltende Liposome zur Blut-Hirn- Schranke mittels Antikörpern und deren Bindungsfragmenten, die an Rezeptoren an Kapillar-Endothelzellen des Gehirns binden.
• Die Zuführung vieler Medikamente, insbesondere nicht-lipophiler Medikamente, zum Säugetiergehirn wird durch die Blut-Hirn-Schranke eingeschränkt. Die Schranke ist teilweise auf dichte interzelluläre Verbindungen zwischen Kapillar- Endothelzellen des Gehirns zurückzuführen und verhindert die passive Überführung vieler Stoffe vom Blut zum Gehirn. Die Endothelzellen des Gehirns weisen keine kontinuierlichen Öffnungen oder Kanäle auf, die die luminalen und abluminalen Membranen verbinden, die andernfalls den Durchtritt von mit dem Blut beförderten Molekülen in das Hirngewebe erlauben würden. Statt dessen stellt das Vorhandensein spezifischer Transportsysteme innerhalb der Kapillar- Endothelzellen, wie die für Insulin, Aminosäuren, Glukose und Transferrin, den regulierten Transport von Verbindungen sicher, die für das Funktionieren des Gehirns erforderlich sind.
• Verschiedene Strategien sind entwickelt worden, um dem Gehirn Medikamente zuzuführen, die andernfalls die Blut-Hirn-Schranke nicht überschreiten können. Obwohl ziemlich unerwünscht, wird gewöhnlich ein intraventrikulärer Katheter chirurgisch implantiert, um dem Gehirn ein Medikament direkt zuzuführen. Dies erfordert nicht nur ein invasives Verfahren, das für den Patienten möglicherweise selber schädlich ist. Vielmehr wird das auf diese Weise zugeführte Medikament innerhalb des Gehirns nur oberflächlich verteilt.
• Es wurden andere Strategien erfunden, um die Blut-Hirn-Schranke zu umgehen. Einige pharmakologische Versuche schließen eine chemische Umwandlung hydrophiler Medikamente in lipidlöslichere Formen ein, so daß sie leichter durch die Schranke transportiert werden. Eine andere Vorgehensweise betrifft das vorübergehende Öffnen der Schranke durch intraarterielle Infusion hypertonischer Stoffe ein, um den Durchtritt hydrophiler Medikamente zu ermöglichen, obwohl hypertonische Stoffe toxisch sein und die Schranke sogar beschädigen können.
• Erst vor kurzem ist vorgeschlagen worden, hydrophile neuropharmazeutische Mittel, wie Neuropeptide, an andere Peptide zu binden, die selbst geeignet sind, die Blut-Hirn-Schranke durch Transzytose zu überwinden. In US-A-4,801,575 von Pardridge ist die Erzeugung von chimeren Peptiden durch Kopplung oder Konjugation des pharmazeutischen Mittels an ein transportierbares Peptid beschrieben. Das chimere Peptid tritt angeblich über die Rezeptoren für das transportierbare Peptid durch die Schranke. Transportierbare Peptide oder Vektoren, die als zur Kopplung an das pharmazeutische Mittel geeignet erwähnt wurden, schließen Insulin, Transferrin, insulinähnliche Wachstumsfaktoren I und II, basisches Albumin und Prolactin ein. Wie jedoch von Pardridge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Band 259, Seiten 66-70 (1991) erwähnt ist, kann die Verwendung von Insulin als Vektor zur Blut-Hirn-Schranke durch hypoglykämische Nebenwirkungen und durch schnelle Beseitigung des Peptids durch die Leber beschränkt sein. Transferrin kann als Vektor durch seine hohe Konzentration im Plasma beschränkt sein. Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 86, Seiten 4771-4775 (1991), haben vorgeschlagen, daß mit Antitransferrin-Rezeptor-Antikörpern konjugierte Medikamente die Blut-Hirn- Schranke überwinden.
• Es ist auch vorgeschlagen worden, die Zuführung von Medikamenten zum Gehirn durch die Blut-Hirn-Schranke durch Liposome zu steigern (siehe beispielsweise Umezawa und Eto, Biochem. Biophys. Res. Comm., Band 153, Seiten 1038-1044 (1988); Chan et al., Ann. Neurol., Band 21, Seiten 540-547 (1987); Laham et al., Life Sciences, Band 40, Seiten 2011-2016 (1987) und Yagi et al., J. Appl. Biochem., Band 4, Seiten 121-125 (1982)). Liposome sind kleine Vesikel (normalerweise in Submikrongröße), die aus einer oder mehreren konzentrischen Doppelschichten von durch wäßrige Zwischenräume getrennten Phospholipiden bestehen. Obwohl berichtet worden ist, daß Liposome nach intravenöser Injektion die Aufnahme bestimmter Medikamente in das Gehirn steigern (Chan et al. und Laham et al., a.a.O.), ist erst kürzlich gezeigt worden, daß Liposome die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden (Schackert et al., Select. Cancer Theraneut., Band 5, Seiten 73-79 (1989) und Micklus et al., Biochim. Biophvs. Acta, Band 1124, Seiten 7-12 (1992)). Wie von Micklus et al., a.a.O. erwähnt, werden im Plasma zirkulierende Liposome schließlich von der Leber aufgenommen, verdaut und die Lipidkomponenten freigesetzt und zu anderen Organen verteilt (siehe auch Derksen et al., Biochim. Biophys. Acta, Band 971, Seiten 127-136 (1988)). Die Radioaktivität, die im Anschluß an intravenöse Injektion von markierten Liposomen von Umezawa und Eto, a.a.O., und anderen im Gehirn gefunden wurde, kann in der Tat von verdauten Lipiden und nicht von den intakten Liposomen selber abgeleitet werden.
• Viele Medikamente, insbesondere Neuropeptide, Wachstumsfaktoren und dergleichen, werden vor Erreichen des Gehirns in der systemischen Zirkulation schnell abgebaut oder durchdringen die Blut-Hirn-Schranke nur minimal. Viele dieser Peptide könnten, wenn sie dem Gehirn in kleinen Mengen wirksam zugeführt würden, eine dramatische therapeutische Wirkung haben (siehe beispielsweise Banks und Kastin, Am. J. Physiol., Band 259, Seiten E1-E10 (1990)). Gegenwärtig müssen jedoch große Mengen verabreicht werden, um Zutritt von selbst minimalen Mengen zu ermöglichen, die für eine pharmakologische Wirkung erforderlich sind.
• Was auf dem Fachgebiet benötigt wird, ist ein wirksames Mittel, um pharmazeutische Mittel, wie Neuropeptide, dem Hirngewebe durch die Blut-Hirn- Schranke zuzuführen. Die Verfahren und deren Arzneimittel sollten das pharmazeutische Mittel wünschenswerterweise zum ganzen Gehirn gleichmäßig zuführen und für den Patienten ein möglichst geringes Risiko darstellen. In ziemlich überraschender Weise erfüllt die vorliegende Erfindung diese und andere verwandte Erfordernisse.
• Mit der vorliegenden Erfindung werden Immuno-Liposome und deren pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die zur zielgerichteten Zuführung pharmakologischer Verbindungen zum Gehirn geeignet sind. Die Liposome sind mit einem Antikörper-Bindungsfragment, wie Fab, F(ab')&sub2;, Fab' oder einer einzelnen Antikörper-Polypeptidkette, gekoppelt, das an ein an vaskulären Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke eines Säugetiers vorhandenes Rezeptormolekül bindet. Typischerweise wird das Antikörper-Bindungsfragment aus einem monoklonalen Antikörper hergestellt. Der Rezeptor stammt vorzugsweise von dem Hirn-Peptid-Transportsystem und ist beispielsweise der Transferrin-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, IGF-I- oder IGF-II-Rezeptor. Das Antikörper- Bindungsfragment ist vorzugsweise durch eine kovalente (unpolare) Bindung mit dem Liposom gekoppelt.
• Für diese Erfindung besonders nützliche pharmakologische Verbindungen sind solche, die typischerweise durch die Blut-Hirn-Schranke schlecht transportiert werden, wie hydrophile Peptide, und die häufig in kleinen Mengen im Gehirn höchst wirksam sind. Diese schließen zum Beispiel Peptidneurotroph-Faktoren, Neurotransmitter und Neuromodulatoren ein, beispielsweise β-Endorphine und Enkephaline. Zur optimalen Zuführung und um die Möglichkeit schädlicher Nebenwirkungen als Folge des Liposoms zu vermindern, ist der Durchmesser des Liposoms kleiner als 1 Mikrometer und typischerweise kleiner als etwa 0,45 Mikrometer.
• Ein die pharmakologische Verbindung enthaltendes Liposom ist mit einem Antikörper-Bindungsfragment gekoppelt, das an ein an vaskulären Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke eines Säugetiers vorhandenes Rezeptormolekül bindet, wie an den Transferrin-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, IGF-I- oder IGF-II- Rezeptor. Das das Pharmazeutikum enthaltende Immuno-Liposom wird dem Lebewesen dann in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um die Erkrankung wirksam zu behandeln oder zu verhindern. Das Präparat wird gewöhnlich parenteral, beispielsweise intravenös oder intraarteriell verabreicht.
• Mit der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen zur zielgerichteten Zuführung von Medikamenten zur und durch die Blut-Hirn-Schranke bereitgestellt. Die Zusammensetzungen, einschließlich Arzneimittel, enthalten ein Liposom, ein pharmazeutisches Mittel, das zum Gehirn transportiert werden soll, und ein Antikörper-Bindungsfragment, das an ein an vaskulären Endothelzellen des Gehirns vorhandenen Rezeptor bindet. Vorzugsweise ist der Rezeptor der Transferrin-Rezeptor, und der an den Rezeptor bindende Antikörper ist ein Bindungsfragment, dem ein Teil des Fc-Teils des Moleküls oder dessen gesamter Teil fehlt, um die Beseitigung der Zusammensetzung durch das retikuloendotheliale System (RES) zu minimieren.
• Erfindungsgemäß werden Liposome eingesetzt, um das interessierende pharmazeutische Mittel zur Blut-Hirn-Schranke zu befördern, damit es schließlich durch die Schranke und in das Gehirn gelangt. In erfindungsgemäßer Weise und wie auf dem Fachgebiet anerkannt, schließen Liposome alle synthetischen (d. h. nicht natürlich vorkommenden) Strukturen ein, die aus ein Volumen einschließenden Lipid-Doppelschichten bestehen. Die Liposome umfassen Emulsionen, Schäume, Mizellen, unlösliche Monolagen, Flüssigkristalle, Phospholipid-Dispersionen, lamellare Schichten und dergleichen. In die erfindungsgemäßen Liposom-Präparate wird das durch die Blut-Hirn- Schranke zuzuführende pharmazeutische Mittel als Teil eines Liposoms in Verbindung mit dem die Blut-Hirn-Schranke überwindenden Molekül eingebaut.
• Als Rezeptor, auf den das Antikörper-Fragment/Liposom gerichtet ist, kommen ein Rezeptor oder mehrere Rezeptoren in Frage, die im Vaskular-Endothelium des Gehirns vorhanden sind. Der Rezeptor sollte ausreichend zugänglich sein, um an das mit dem Liposom gekoppelte Antikörper-Fragment gebunden zu werden. Rezeptoren, die in den Hirnkapillaren in größeren Mengen vorhanden sind als andere, werden zur Steigerung der Transportmengen durch die Blut- Hirn-Schranke bevorzugt. Angezielte Rezeptoren schließen zum Beispiel den Transferrin-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, die Rezeptoren der Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (IGF-I und IGF-II) und andere Rezeptoren des Hirn-Peptid-Transportsystems, wie allgemein von Pardridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, New York, NY (1991) und in US-A-4,801,575 beschrieben, sowie den Glukosetransport-Rezeptor und dergleichen ein.
• Vorzugsweise ist der durch das Antikörper-Bindungsfragment angezielte Rezeptor der Transferrin-Rezeptor. Der Transferrin-Rezeptor ist am Endothelium des Hirn-Mikrovaskular-Endotheliums verschiedener Säugetiere, einschließlich der Menschen, selektiv angereichert und stellt den Hauptweg für Eisen dar, um in das Gehirn zu gelangen. Eisenbeladenes Transferrin, ein 80 kDa-Glykoprotein, das hauptsächliche Eisentransport-Protein im Kreislauf, wird über den Transferrin-Rezeptor der Transzytose durch die Blut-Hirn- Schranke unterzogen. Die Struktur und die Funktion des Transferrin-Rezeptors sind von Seligman, Prog. Hematol., Band 13, Seiten 131-147 (1983), dessen Inhalt hier einbezogen wird, beschrieben worden. Es wird angenommen, daß der Transferrin-Rezeptor größtenteils in den extrazellulären Raum hineinragt. Er kann unter Verwendung bekannter Verfahren aus Hirngewebe isoliert und gereinigt werden. Die Reinigung, Klonierung und Expression des menschlichen Insulin-Rezeptors und die Erzeugung monoklonaler Antikörper dafür sind in US-A-4,761,371 beschrieben.
• Der angezielte Rezeptor, der aus Gehirn gereinigt oder durch rekombinante DNS-Verfahren exprimiert wurde, kann verwendet werden, um Antikörper und vorzugsweise monoklonale Antikörper herzustellen, die dann eingesetzt werden können, um die erfindungsgemäß brauchbaren Antikörper-Fragmente herzustellen. Die Antikörper werden gegen das Rezeptormolekül oder einen Teil des Rezeptormoleküls hergestellt, wie der Domäne oder den Domänen, die zur Ligandenbindung beisteuern. Vorzugsweise bindet der Antikörper an einen extrazellulären Teil des Rezeptors, der sich in der Nähe der Bindungsstelle des natürlichen Liganden des Rezeptors, beispielsweise Transferrin oder Insulin, befindet. In besonders bevorzugten Ausführungsformen blockiert der Antikörper den Rezeptor im wesentlichen nicht oder konkurriert nicht mit der Bindung des Liganden an den Rezeptor.
• Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen den Transferrin-Rezeptor, einschließlich des in den untenstehenden Beispielen beschriebenen monoklonalen OX-26-Antikörpers, ist von Jeffries et al., Immunology, Band 54, Seiten 333-341 (1985), dessen Inhalt hier einbezogen wird, beschrieben. Andere monoklonale Antikörper gegen den Transferrin-Rezeptor sind beschrieben worden (siehe beispielsweise den ATCC Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7. Auflage, 1992, in dem HB21, ein Maus-IgG1-Antikörper, der den menschlichen Transferrin-Rezeptor präzipitiert, HB84, ein monoklonaler Maus- IgG2a-Antikörper gegen den menschlichen Transferrin-Rezeptor, und TIB219 und TIB220, Ratte-anti-Maus-Transferrin-Rezeptor-Antikörper, beschrieben sind). Von monoklonalen Antikörpern gegen den menschlichen Insulin-Rezeptor wurde ebenfalls berichtet, einschließlich Zelllinien, die von ATCC erhältlich sind, wie ATCC HB175 (J. Biol. Chem., Band 258, Seiten 6561-6566 (1983)) und ATCC CRL 1827 (Curr. Top. Cell. Rep., Band 27, Seiten 83-94 (1985)).
• Verfahren zur Erzeugung monoklonaler Antikörper sind bekannt und können, wie vorstehend diskutiert, zum Beispiel durch Immunisierung eines Tieres mit Zellen ausgeführt werden, die den Rezeptor exprimieren, im wesentlichen den gereinigten Rezeptor oder dessen Fragmente. Antikörper produzierende Zellen, die von immunisierten Tieren erhalten werden, werden immortalisiert und gescreent oder für die Produktion des an das Rezeptorprotein bindenden Antikörpers zuerst gescreent und dann immortalisiert.
• Da einem erfindungsgemäß verwendeten Antikörper-Fragment im allgemeinen der immunogene Fc-Teil fehlt, ist es im wesentlichen nicht notwendig, menschliche monoklonale Antikörper zu verwenden. Jedoch kann es zur Erzeugung von im wesentlichen menschlichen Fab'-Molekülen wünschenswert sein, Antigen-Bindungsregionen der nicht-menschlichen Antikörper, beispielsweise die hypervariablen Regionen, durch rekombinante DNS-Verfahren in menschliche Gerüstregionen zu transferieren. Solche Verfahren sind auf dem Fach gebiet allgemein bekannt und werden zum Beispiel in EP-A-0 173 494 und EP-A-0 239 400 beschrieben, deren Inhalt hier einbezogen wird. Die Erzeugung von Bindungsmolekülen aus einer einzelnen Polypeptidkette, auch als Single- Chain-Antikörper bezeichnet, durch rekombinante DNS-Verfahren ist in US-A-4,946,778 ausführlich beschrieben:
• Der Antikörper gegen das Hirnrezeptor-Molekül kann intakt oder insbesondere bevorzugt als dessem Bindungsfragment verwendet werden. Bindungsfragment bedeutet, daß das Fragment die Eignung zur spezifischen Bindung an ein Epitop des interessierenden Zielmoleküls, wie zum Beispiel des Transferrin- oder Insulin-Rezeptors, behält. Antikörper-Bindungsfragmente schließen wenigstens die hypervariable oder die complementarity determining region (CDR), die in einem geeigneten Gerüst liegt, ein, um eine Konformation zu bilden, die an die Antigen-Determinante bindet. Diese Bindungsfragmente schließen Fv, Fab, F(ab')&sub2;, Fab' und Bindungsmoleküle aus einer einzelnen Polypeptidkette ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
• Antikörper-Bindungsfragmente können aus intakten Antikörper-Molekülen mit verschiedenen bekannten Verfahren erzeugt werden. Beispielsweise werden Antikörper gewöhnlich durch teilweisen Verdau mit Papain fragmentiert, wobei zwei Fab-Fragmente gebildet werden. Pepsin-Behandlung kann eingesetzt werden, um die F(ab')&sub2;-Fragmente zu erzeugen, wenn die beiden Antigen- Bindungsdomänen noch immer miteinander verbunden sind, d. h. als mehrwertiges Bindungsmolekül. Eine weitere Reduktion des F(ab')&sub2;-Fragments, beispielsweise mit Dithiothreitol, kann anwendet werden, um die Antigen- Bindungsdomänen zu trennen und zwei F(ab')-Fragmente zu erzeugen. Die Erzeugung der verschiedenen Antikörper-Fragmente wird beispielsweise von Harlow und Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1988, Seiten 626-631 und von Parham, Cellular Immunology, 4. Auflage, (Hrsg. D.M. Weir), Band 1, Kapitel 14, Blackwell Scientific Publ., CA 1986, ausführlich beschrieben. Die Polypeptidketten der gewünschten Fragmente können auch durch verschiedene rekombinante DNS-Verfahren erzeugt und intra- oder extrazellulär zusammen gesetzt werden.
• Sobald der gewünschte Antikörper oder insbesondere bevorzugt ein Antikörper- Bindungsfragment erhalten worden ist, wird es mit dem Liposom gekoppelt oder darin eingebaut. Erfindungsgemäße verwendete Liposome können aus Standard-Vesikel-formenden Lipiden erzeugt werden, die im allgemeinen neutrale und negativ geladene Phospholipide und ein Sterol, wie Cholesterin, enthalten. Die Auswahl von Lipiden ist im allgemeinen bestimmt beispielsweise von der Liposomgröße und dessen Stabilität im Blutkreislauf. Daher können als erfindungsgemäß verwendbare Lipide beispielsweise Cholesterin-Hemisuccinat und dessen Salze, Tocopherol-Hemisuccinat und dessen Salze, ein Glykolipid, ein Phosphofipid, wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidsäure, Phosphatidylinositol, Sphingomyelin und dergleichen alleine oder in Kombination eingesetzt werden. Die Phospholipide können synthetisch sein oder aus natürlichen Quellen, wie Ei oder Soja, gewonnen werden. Phosphatidylcholine mit verschiedenen Acylkettenresten unterschiedlicher Kettenlänge und unterschiedlichem Sättigungsgrad sind erhältlich oder können nach bekannten Verfahren isoliert oder synthetisiert werden. Im allgemeinen werden weniger gesättigte Phosphatidylcholine leichter klassiert, insbesondere wenn die Liposome unterhalb von etwa 0,3 Mikrometern klassiert werden. Die Phospholipid-Acylketten-Zusammensetzungen können auch die Stabilität von Liposomen im Blut beeinflussen. Sterole, wie Cholesterin, können mit den Phospholipiden kombiniert werden. Die verwendeten Phospholipide und die Menge an vorhandenem Sterol hängen von einer Anzahl von Faktoren, wie der Lipophilie jedes beliebigen, hinzugefügten pharmazeutischen Mittels, dem angezielten Antikörper-Fragment und den erforderlichen Eigenschaften des Liposoms ab. Diese Faktoren sind allgemein bekannt.
• Eine breite Vielfalt von Verfahren zur Erzeugung von zur erfindungsgemäßen zielgerichteten Zuführung zur Blut-Hirn-Schranke geeigneten Liposomen ist verfügbar (siehe beispielsweise Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., Band 9, Seite 467 (1980), Liposome Technology, Hrsg. G. Gregoriadis, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1984), US-A-4,235,871, US-A-4,501,728, US-A-4,837,028, US-A-4,957,735 und US-A-5,019,369). Weil die erfindungsgemäßen zielgerichteten Liposome durch das retikuloendotheliale System nicht aufgenommen werden sollen, werden die Lipidkomponenten weiter selektiert, um die Zeit im Blutkreislauf zu erhöhen.
• Im Anschluß an die Liposom-Erzeugung können die Liposome klassiert werden, um einen gewünschten Größenbereich und eine relativ enge Verteilung von Liposomgrößen zu erreichen. Zur Zuführung zum Gehirn sollten Liposome im allgemeinen eine Größe von weniger als etwa 1,0 Mikrometern aufweisen, insbesondere bevorzugt von etwa 0,2 bis 0,45 Mikrometern. Dies ermöglicht die Sterilisation der Liposom-Suspension durch Filtration. Zum Klassieren der Liposome kann eine Liposom-Suspension durch Bad oder Sonde bis hinab zu kleinen Vesikeln mit Größen von weniger als etwa 0,05 Mikrometern beschallt werden. Eine Homogenisierung kann ebenfalls angewendet werden, bei der Scherenergie eingesetzt wird, um große Liposome in kleinere zu fragmentieren. Als bequem verwendbare Homogenisierer können Mikrowirbler eingesetzt werden, die von Microfluidics of Boston, MA hergestellt werden. In einem typischen Homogenisierungsverfahren werden Liposome durch einen Standard-Emulsionshomogenisierer im Kreislauf umgepumpt, bis ausgewählte Liposomgrößen, typischerweise zwischen 0,1 und 0,5 Mikrometern, beobachtet werden. Bei beiden Verfahren kann die Teilchengrößenverteilung durch herkömmliche Laserstrahl-Teilchengrößen-Meßmethoden gemessen werden.
• Die Extrusion von Liposomen durch eine Polycarbonatmembran mit kleinen Poren oder eine asymmetrische Keramikmembran stellt ein wirksames Verfahren zur Verringerung der Liposomgrößen auf eine relativ wohldefinierte Größenverteilung dar. Typischerweise wird die Suspension ein- oder mehrmals zyklisch durch die Membran geführt, bis die gewünschte Liposom-Größenverteilung erreicht ist. Die Liposome können mit Membranen mit immer kleineren Poren extrudiert werden, um eine graduelle Verringerung der Liposomgröße zu erreichen.
• Verfahren zum Koppeln von Antikörpern mit Liposomen schließen im allgemeinen jede kovalente Vernetzung zwischen einem liposomalen Lipid und einem nativen oder modifizierten Antikörper (oder dessen Bindungsfragment) ein. Bei einer anderen Vorgehensweise wird ein mit einem hydrophoben Anker, wie einer Fettsäure, kovalent derivatisierter Antikörper in ein vorgeformtes Lipid eingebaut.
• Verschiedene Vernetzungsmittel können eingesetzt werden, um eine kovalente Verbindung zwischen einem Lipid und dem Antikörper zu erzeugen. Ein Protokoll schließt die Derivatisierung des freien Aminorestes eines PE mit einem aminoreaktiven bifunktionellen Vernetzer ein. Das derivatisierte PE wird dann zusammen mit anderen Lipiden verwendet, um Liposome nach den vorstehend beschriebenen Verfahren zu erzeugen. Sobald das derivatisierte PE in die Liposome eingebaut ist, kann es durch Verwendung der zweiten reaktiven Stelle am Vernetzungsreagenz mit dem Antikörper umgesetzt werden. Die Verwendung von heterobifunktionellen Reagenzien ist besonders nützlich, weil Homokopplung zwischen Liposomen oder zwischen Antikörpern vermieden wird. Verwendbare heterobifunktionelle Vernetzer schließen N-Hydroxysuccinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionat (SPDP), m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid (MBS) und dergleichen ein. Homobifunktionelle Vernetzer umfassen Toluol-2,4-diisocyanat (TDIC) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDCI) ein. Die Verwendung von Glutaraldehyd gehört ebenfalls zu den chemischen Vernetzungsverfahren. Diese und andere Reagenzien werden von Connor und Huang, Pharmac. Ther., Band 28, Seiten 341-365 (1985) beschrieben.
• Indem Antikörper-Fragmente an Liposome durch Vernetzung kovalent gebunden werden, ergibt sich der Vorteil, daß mit geringem oder ohne Verlust von eingeschlossenem Wassergehalt bei Anwendung dieser Verfahren eine große Menge von Antikörper-Bindungsfragmenten an die Liposomoberfläche gebunden werden kann. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, daß die Vernetzungsbedingungen nicht so hart sind, daß die Antikörper-Bindung beeinträchtigt wird oder daß die Liposome und deren Inhalt beschädigt werden. Um die Orientierung von Antikörper-Molekülen, die ihnen die Bindung an das Antigen unmöglich macht, zu vermeiden, kann gegebenenfalls ein Spacerarm zwischen dem Antikörper und dem Lipid vorgesehen werden.
• Eine nicht-vernetzende Verbindung von Antikörpern oder deren Bindungsfragmenten mit Liposomen kann auch eingesetzt werden. Diese Vorgehensweise ermöglicht mehr als eine Art von Antikörper-Bindungsspezifität pro Liposom, beispielsweise Antikörper oder Fragmente an verschiedene Antigen- Determinanten am Transferrin-Molekül oder sogar Antikörper, die an verschiedene Rezeptoren binden. Die Flexibilität des Moleküls minimiert sterische Hinderung, die eine Bindung des Antikörpers an das Antigen blockieren kann. Ebenso sind die bei den nicht-kovalenten Verfahren verwendeten Reagenzien relativ mild und kommen mit dem Inhalt der Liposome nicht in direkten Kontakt, so daß eine mögliche Beschädigung der Liposom-Komponenten vermieden wird.
• Bei einem Verfahren kann die nicht-kovalente Verbindung des Antikörpers oder Fragments mit dem Liposom durch Derivatisierung der Antikörperkomponente mit einem hydrophoben Rest erreicht werden. Der derivatisierte Antikörper wird dann durch Insertion des hydrophoben Ankers in die Doppelschicht in die Vesikel eingebaut. Zu den Derivatisierungsverfahren gehört auch die Umsetzung des Antikörpers mit dem N-Hydroxysuccinimidester der Palmitinsäure (NHSP) in Gegenwart von 1-2% Detergenz, typischerweise Desoxycholat, wie von Huang et al., Biochem. Biophys. Acta, Band 716, Seiten 140-150 (1982) beschrieben ist. In einer anderen Ausführungsform kann Palmitinsäure-Chloranhydrid NHSP als Acylierungsreagenz ersetzen.
• Ein anderes Verfahren zum Acylieren des Antikörpers schließt die Derivatisierung der Kopfgruppe eines PE oder ähnlichen Moleküls ein, so daß es zur Umsetzung mit einem Sulfhydrylrest geeignet ist. Die Disulfidbindungen des Antikörpers werden dann mit Dithiothreitol (DTT) reduziert und anschließend mit dem derivatisierten PE inkubiert. In noch einem anderen, brauchbaren erfindungsgemäßen Verfahren wird ein freies PE- oder ähnliches Molekül durch Carbodümid mit den Carboxylresten eines Antikörpers vernetzt, wie von Jansons und Mallett, Analyt. Biochem., Band 11, Seiten 54-59 (1981) beschrieben ist. Dadurch werden die freien Aminoreste des Antikörpers vor dem Vernetzen geschützt, um Homokopplung zwischen Antikörper-Molekülen zu verhindern.
• Sobald der Antikörper oder dessen Bindungsfragment derivatisiert ist, kann er/es durch verschiedene bestehende Protokolle mit den Liposomen verbunden werden. Zum Beispiel wird der derivatisierte Antikörper in Gegenwart von Detergenz mit dem Liposom gemischt und das Detergenz dann durch Dialyse entfernt, um die Immuno-Liposome zu erzeugen. Ein anderes Verfahren schließt eine Modifizierung des Reversephase-Verdampfungs-Vesikel-Herstellungsverfahrens ein, bei dem die vorgeformten Vesikel in Gegenwart von Ether in einer Desoxycholat-Lösung mit Antikörper (Lipid : Antikörper = 10 : 1 wlw) gemischt werden, und sowohl das Detergenz als auch der Ether nachfolgend durch ausgedehnte Dialyse entfernt werden (siehe beispielsweise Huang et al., Meths. Enzymol. (1985)). Die Herstellung von Immuno-Liposomen wird auch in US-A-4,957,735 beschrieben. Vorzugsweise wird der Antikörper oder dessen Bindungsfragment an das Liposom gebunden, nachdem das Liposom erzeugt worden ist.
• Verschiedene Medikamente oder andere pharmakologische Wirkstoffe sind zum Einbau in das Liposom und zur Zuführung zur Blut-Hirn-Schranke geeignet. Die Verwendung von Liposomen als Vehikel zur Zuführung von Medikamenten wird eingehend von Gregoriadis, (Hrsg.), Liposomes as Drug Carriers: Recent Trends and Progress, John Wiley & Sons, NY (1988) beschrieben. Zuführbare therapeutische Mittel schließen Protein-Neurothroph-Faktoren, beispielsweise Nervenwachstumsfaktor zur Behandlung von Hirnverletzungen und degenerativen Krankheiten, Enzyme zum Ersatz von durch genetische Defekte verlorenen Enzymen, wenn die genetischen Defekte metabolische Einlagerungskrankheiten verursachen, beispielsweise die Tay-Sachs-Krankheit, Neurotransmitter und Neuromodulatoren, beispielsweise Dopamin und β-Endorphin zur Behandlung der Parkinson'schen Krankheit, von mit Schmerz, Bewe gungsstörungen oder Wahrnehmung und dem Verhalten verbundenen Zuständen, Antibiotika, chemotherapeutische Mittel, diagnostische bilderzeugende Mittel, usw. ein. Besonders brauchbar in der vorliegenden Erfindung sind Medikamente, wie Peptide, die spezifische Wirkungen im Gehirn hervorrufen, die normalerweise aber sehr schlecht in das Gehirn übertreten, und keine oder nur eine geringe Wirkung auf andere Organe haben. Diese Verbindungen zerfallen häufig leicht im Blutkreislauf und ziehen daher aus dem durch Einkapselung in ein erfindungsgemäßes Liposom gebotenen Schutz Nutzen. Sogar eine kleine in das Gehirn übertretende Menge kann, wenn sie, wie hier beschrieben, auf ein Hirn-Transportsystem gerichtet ist, eine gewünschte pharmakologische Wirkung haben.
• Eine Hauptklasse von Medikamenten schließt wasserlösliche, liposom-durchlässige Verbindungen ein, die zur Verteilung vorzugsweise in die wäßrigen Kompartimente der Liposom-Suspension und zum Equilibrieren mit der Zeit zwischen den inneren liposomalen Räumen und der äußeren Massenphase der Suspension neigen. Repräsentative Medikamente in dieser Klasse schließen Propanolol, Ibuprofin, Gentamicin, Tobramycin, Penicillin, Theophyllin, Bleomycin, Etoposid, n-Acetylcystein, Verapamil, Vitamine und strahlenundurchlässige und teilchenemittierende Mittel, wie chelatgebundene Metalle, ein. Wegen der Neigung dieser Mittel zum Equilibrieren mit der wäßrigen Zusammensetzung des Mediums wird die Liposom-Zusammensetzung bevorzugt in lyophilisierter Form mit Rehydratisierung kurz vor der Verabreichung gelagert. In einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung in konzentrierter Form hergestellt und kurz vor der Verabreichung verdünnt werden.
• Eine zweite Hauptklasse von Medikamenten sind solche, die wasserlöslich, aber liposom-undurchlässig sind. Meistens handelt es sich hierbei um Peptid- oder Protein-Moleküle, wie Peptid-Hormone, Enzyme, Enzym-Inhibitoren, Apolipo-Proteine und Kohlenhydrate mit höherem Molekulargewicht, die durch eine Langzeitstabilität der Einkapselung gekennzeichnet sind. Repräsentative Verbindungen in dieser Klasse schließen unter anderem Nervenwachstumsfaktor, Interferon (α, β oder γ), Oxytocin, Vasopressin, Insulin, Interleukine (beispielsweise IL-1, IL-2, usw.), Superoxid-Dismutase, Tumor-Nekrosefaktor, Somatostatin, Thyreotropin-Releasing-Hormon und Makrophagenkoloniestimulierender Faktor ein. Peptidmoleküle und -hormone, die typischerweise sehr wirksam sind und daher auch in kleinen die Blut-Hirn-Schranke überwindenden Mengen die Funktion beeinflussen können, sind insbesondere in erfindungsgemäßen zielgerichteten Verfahren und Zusammensetzungen brauchbar. Sie schließen zum Beispiel die β-Endorphine und Analoga, die Enkephaline (relativ lipidlöslich), wie Leu- und Met-Enkephaline und Analoga, Melanozyten-stimulierendes Hormon und Melanozyten-stimulierendes Hormon inhibierender Faktor, β-Casomorphin, Glukagon, Deltaschlaf-induzierendes Peptid und andere ein. Einige von diesen werden von Banks und Kastin, a.a.O., beschrieben.
• Eine dritte Klasse von Medikamenten sind lipophile Moleküle, die zur Verteilung in die Lipid-Doppelschichtphase des Liposoms neigen und die deshalb mit den Liposomen überwiegend in einer membraneingeschlossenen Form verbunden sind. Die Medikamente in dieser Klasse sind durch einen Öl/Wasser-Verteilungskoeffizienten von größer als 1 und vorzugsweise größer als etwa 5 definiert, gemessen in einem Standard-Öl/Wasser-Gemisch, wie Octanol/Wasser. Repräsentative Medikamente schließen Prostaglandine, Amphotericin B, Methotrexat, cis-Platin und dessen Derivate, Vincristin, Vinblastin, Progesteron, Testosteron, Östradiol, Doxorubicin, Epirubicin, Beclomethason und dessen Ester, Vitamin E, Cortison, Dexamethason und dessen Ester, Betamethasonvaleret und andere Steroide, usw. ein.
• Im Anschluß an die Behandlung zum Entfernen von freiem Medikament und/oder dem zielgerichteten Antikörper-Molekül wird die Liposom-Suspension zur Verabreichung an den Patienten in einer physiologisch verträglichen Trägersubstanz auf eine gewünschte Konzentration gebracht. Die Arzneimittel sind zur parenteralen, topischen, oralen oder örtlichen Verabreichung bestimmt, sie werden aber vorzugsweise parenteral, beispielsweise intravenös, intraarteriell oder intramuskulär verabreicht. Daher werden mit der Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung zur Überwindung der Blut-Hirn- Schranke bereitgestellt, die eine Lösung eines ausgewählten in den Liposomen enthaltenen Pharmazeutikums umfassen, wobei die Liposome mit einem Antikörper-Molekül oder einem seiner Bindungsfragmente verbunden sind, die an ein Hirnrezeptormolekül, vorzugsweise das Transferrin-Rezeptormolekül binden. Das in den Liposomen enthaltene Pharmazeutikum ist in einer physiologisch verträglichen Trägersubstanz gelöst, vorzugsweise in einer wäßrigen Trägersubstanz. Verschiedene wäßrige Trägersubstanzen können verwendet werden, beispielsweise Wasser, wäßrige Puffer, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%iges Glyzin und dergleichen, enthaltend Glykoproteine zur Erhöhung der Stabilität, wie Albumin, Lipoprotein, Globulin, usw. Diese Zusammensetzungen können durch vorstehend erwähnte Verfahren sterilisiert oder unter sterilen Bedingungen hergestellt werden. Die so erhaltenen wäßrigen Lösungen können zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wäßrigen Lösung vereinigt wird. Die Zusammensetzungen können physiologisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten, wenn dies zur Annäherung an physiologische Bedingungen erforderlich ist, wie ein pH-Einstellungs- und Puffermittel, tonizitätseinstellende Mittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, usw.
• Die Konzentration der Liposome in diesen Formulierungen kann in weiten Bereichen variieren, d. h. von weniger als etwa 0,5 Gew.-%, gewöhnlich bei oder wenigstens etwa 1 Gew.-% bis zu 15 oder 20 Gew.-% und wird in erster Linie durch Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten, usw. gemäß der ausgewählten, speziellen Verabreichungsweise ausgewählt. Gegenwärtige Verfahren zur Erzeugung parenteral verabreichbarer Liposom-Formulierungen sind bekannt oder sind für den Fachmann offenkundig und sind ausführlich zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Science, 17. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985) und bei Gregoriadis (1988), a.a.O., beschrieben.
• Die verwendete Dosis und der verwendete Weg der Verabreichung sowie die verwendete Trägersubstanz können, basierend auf der zu behandelnden Krankheit und im Hinblick auf bekannte Behandlungen solcher Krankheiten, variieren. Für eine bestimmte Verwendung wirksame Mengen hängen von der Schwere der Krankheit und dem Gewicht und dem Allgemeinzustand des zu behandelnden Patienten ab. Es muß bedacht werden, daß die erfindungsgemäßen Stoffe bei ernsthaften Krankheitszuständen verwendet werden können, d. h. in lebensbedrohlichen oder potentiell lebensbedrohlichen Situationen. In solchen Fällen ist es im Hinblick auf die Eignung der Liposome, die Blut- Hirn-Schranke zu überwinden, und auf die minimale Immunogenität der Antikörper-Bindungsfragmente möglich und kann durch den behandelnden Arzt für wünschenswert gehalten werden, diese Zusammensetzungen in kräftigem Überschuß zu verabreichen.
• Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung, nicht zur Beschränkung.
Beispiel I Erzeugung von Fab'-zielgerichteten anti-Transferrin-Rezeptor-Immuno-Liposomen
• In diesem Beispiel wird die Erzeugung von auf den Transferrin-Rezeptor zielgerichteten Fab'-gekoppelten Immuno-Liposomen beschrieben.
A. Erzeugung der Liposome
• Liposome wurden mit einem Heat Systems W 380 Schalenschalltrichter- Schallerzeuger (Farmington, NY) nach einem von Barrow und Lentz, Biochim. Biophys. Acta, Band 597, Seiten 92-99 (1980), modifizierten Verfahren erzeugt. L-a-Phosphatidylcholin (PC) und N-[4-p-Maleimidophenylbutyryl]-dioleoylphosphatidylethanolamin (MPB-PE) wurden von Avanti Polar Lipids, Inc. (Pelham, AL) und Cholesterin (Chol) von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Aliquots von Chloroform- (oder Chloroform/Methanol-) Lösung, die die geeigneten Lipide (PC/Chol/MPB-PE-Lipide mit einem molaren Verhältnis von 10/5/l) enthielten, wurden in 5-ml Glasteströhrchen pipettiert. [¹&sup4;C]-markiertes Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) (bezogen von Amersham, Arlington Heights, IL) wurde hinzugefügt, so daß eine wäßrige Endkonzentration von 0,5 uCi/ml erhalten wurde. Lösungsmittel wurden unter Stickstoff verdampft, und Lösungsmittelspuren wurden unter Vakuum entfernt. Lipidfilme wurden in 0,9%iger (w/v) Kochsalzlösung (oder Hepes-gepufferter 0,9%iger Kochsalzlösung) dispergiert, in 1-2 ml Aliquots in 10-ml Polycarbonat-Teströhrchen überführt und 2-3 min lang bei 50ºC bis zur sichtbaren Klarheit kontinuierlich beschaflt. Die Liposome wurden durch Filtration durch Zelluloseacetatfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 Mikrometern (Millipore, Boston, MA) auf Durchmessergröße überprüft.
B. Erzeugung von Antikörper-Fragmenten
• F(ab')&sub2;-Fragmente wurden aus monoklonalen "OX-26"-anti-Transferrin- Rezeptor-Antikörpern (bezogen von Bioproducts for Science, Inc. (Indianapolis, IN)) von Loftrand Lab LTD (Gaithersburg, MD)) hergestellt. Unspezifische Kaninchen-IgG-F(ab')&sub2; wurden von Organon Teknika-Cappel (Durham, NC) bezogen. Fab'-Fragmente wurden aus OX-26-F(ab')&sub2;- (10 mg/ml) und unspezifischen Kaninchen-F(ab')&sub2;-Fragmenten 10 mg/ml) durch 60minütige Reduktion mit 20 mM DTT (Sigma) in 20 mM HEPES (pH 6,5) erzeugt. Fab'-Fragmente wurden von überschüssigem DTT auf Sephadex G-25-Minisäulen (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) abgetrennt, die aus den Zylindern von 3- ml Kunststoffspritzen nach dem Verfahren von Fry et al., Anal. Biochem., Band 90, Seiten 809-815 (1987), hergestellt wurden. Aliquots von einem halben ml reduzierter Fab' wurden auf vorher zentrifugierte Minisäulen aufgebracht und 10 min lang bei 1000 Upm zentrifugiert. Der Grad der Reduktion wurde nach dem Verfahren von Ellman, Arch. Biochem. Biophys., Band 82, Seiten 70-77 (1959) bestimmt.
C. Koppeln von Fab'-Fragmenten mit Liposomen
• Frisch reduzierte Fab'-Fragmente wurden zu äquivalenten Volumina frisch erzeugter Liposome (in 20 mM Hepes-gepufferter Kochsalzlösung, pH 6,5) hinzugefügt und bei Raumtemperatur über Nacht mechanisch gerührt.
• Fab'-gekoppelte Liposome wurden aus dem Reaktionsgemisch durch Flotation an einem Metrizamid- (Sigma) Gradienten nach dem Verfahren von Heath et al., Biochim. Biophys. Acta, Band 640, Seiten 66-81 (1981) isoliert. Kurzgesagt wurde 1 ml liposomaler Suspension mit 1 ml 1 M Metrizamid-Lösung in 0,9%iger Kochsalzlösung in einem 5 ml Nitrozellulose-Zentrifugenröhrchen gemischt. Diese Lösung wurde mit 3 ml 0,3 M Metrizamid in 0,9%iger Kochsalzlösung vorsichtig überschichtet und mit 0,5 ml 0,9%iger Kochsalzlösung bedeckt. Die Lösung wurde 1 h lang bei 40.000 Upm in einer L8-80M Ultrazentrifuge (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) zentrifugiert. Die Liposome wurden vom Gradienten abpipettiert, und das Metrizamid wurde, wie vorher beschrieben, auf einer Sephadex G-25-Minisäule entfernt.
• Die Proteinkonzentrationen vom OX-26-anti-Transferrin-IgG-Fab' und vom unspezifischen Kaninchen-IgG-Fab' (Kontrolle), die mit den verwandten liposomalen Formulierungen verbunden waren, wurden kolorimetrisch (Sigma Protein Assay Kit) auf 60 bzw. 140 ug/ml geschätzt.
• Fab'-gekoppelte liposomale Formulierungen wurden nicht auf Rezeptorbindungsstellen getestet. Jedoch konnte gezeigt werden, daß aus SATA-modifizierten Proteinen erzeugte Konjugate die Enzymaktivität oder -funktion behalten haben (Duncan et al., Anal. Biochem., Band 132, Seiten 68-73 (1983)).
Beispiel II Lokalisierung von auf den Transferrin-Rezeptor zielgerichteten Immuno-Liposomen im Gehirn
• Mit diesem Beispiel wird demonstriert, daß kovalent mit Fab'-Fragmenten gekoppelte Liposome an Transferrin-Rezeptoren in Hirnkapillaren binden können. Ratten wurden in diesen Untersuchungen verwendet, um die Lokalisierung der Antikörper-Fragment-zielgerichteten Liposome zu demonstrieren.
• Ratten haben ein Hirnkapillarsystem, das sich von dem eines menschlichen Hirns nicht wesentlich unterscheidet, obwohl es insgesamt kleiner als das des menschlichen Hirns ist. Ferner ist gezeigt worden, daß radioaktiv markierter monoklonaler OX-26-Antikörper an isolierte Hirnkapillaren aus Ratten und Menschen in ungefähr demselben Umfange bindet (Pardridge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Band 259, Seiten 66-70 (1991)).
Infusion in die Halsschlagader von Ratten
• Drei Monate alten männlichen Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Breeding Laboratories, Lakeview, NJ), die ungefähr 200-300 g wogen, wurde freier Zugriff auf Futter und Wasser gegeben. Sie wurden wenigstens 2 Tage lang an den Tierraum des Laboratory of Neurosciences gewöhnt, wo Temperatur, Feuchtigkeit und Lichtzyklus (6-18 h) reguliert wurden. Experimente, die mit den NIH-Richtlinien übereinstimmten, wurden unter einem Protokoll geführt, das durch das NICHD Animal Care and Use Committee genehmigt wurde.
• Intraarterielle liposomale Verabreichung wurde durchgeführt, um die Liposomzuführung und -bindung an das ipsilaterale Hirngefäßsystem zu maximieren. Der Vorteil dieses Verabreichungsweges ergibt sich nur während des anfänglichen Durchtritts von Liposomen durch das ipsilaterale Gehirn. Liposome treten dann in den systemischen Blutkreislauf ein und zeigen pharmakokinetisches Verhalten, das den intravenös verabreichten Liposomen ähnlich ist (Greig, N., Implications of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Band 1: "Basic Science Aspects", (Neuwelt, E., Hrsg.), Seiten 311-368, Plenum Press, New York, NY (1989).
• Durch i.p.-Injektion mit 50 mg/kg Na-Pentabarbital (Ayerst, New York, NY) anästesierte Ratten wurden mit Natriumheparin (100 I.U. in isotonischer Kochsalzlösung) gefüllten Kathetern (Größe PE-50) versehen, die nach dem Verfahren von Rapoport et al., Am. J. Physiol., Band 238, Seiten R421-R431 (1980) in die rechte äußere Halsschlagader und Oberschenkelarterien eingeführt wurden.
• Liposomale, Spurenmengen (0,5 uCi/ml) von [¹&sup4;C]-markiertem DPPC enthaltende Formulierungen wurden 5 min lang durch Infusion in den Halsschlagader- Arterienkatheter mit einer Rate von 0,2 ml/min verabreicht (Infusionspumpe No. 944, Harvard Instruments, Millis, MA). Die Halsschlagader-Gabelung wurde beobachtet, um sicherzustellen, daß das Infusat kopfwärts in die innere Halsschlagader-Arterie eintritt und nicht rückläufig in der gemeinen Halsschlagader- Arterie hinunterfließt. Durch Verbinden des Halsschlagader-Katheters mit einem Druckmeßwandler (Statham Instruments, Oxnard, CA) wurde der Druck der Halsschlagader-Arterie überwacht, um sicherzustellen, daß keine hypertonische Öffnung der Blut-Hirn-Schranke stattfand. Nach 1 oder 10 min wurden die Ratten durch Enthauptung getötet. Das Gehirn, die Nieren, die Leber und die Milz wurden von jedem Tier entfernt und gewogen. Von Plasma, Gehirn (ipsilaterales und zur Infusionsstelle kontralaterales Großhirn sowie Kleinhirn), anderen Organproben und Aliquots von liposomalen Formulierungen wurde nach dem Verfahren von Greig et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Band 245, Seiten 1-7 (1988) die Radioaktivität (TriCarb 2200 CA Flüssigkeits-Szintillationsanalysator, Packard Instruments, Downers Grove, IL) gemessen.
B. Berechnungen
• Die Radioaktivität in Organproben wurde als mittlere DPM/injizierte Gesamt- DPM berechnet. Verteilungsvolumina (Vd) für [¹&sup4;C]-DPPC-markierte liposomale Formulierungen wurden wie folgt berechnet: Vd-DPM pro Gramm Gewebe- Naßgewicht/DPM pro ml Plasma · 100 (% Naßgewicht). Bei der Berechnung der Radioaktivitätsverteilungen wurde angenommen, daß das Blutvolumen 6,5% des Gesamtkörpergewichts sei (Altman, Blood and Other Bodv Fluids, Biological Handbook Series, Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., Wash., D.C. (1961)). Zählimpulse vom Gewebe wurden um Zählimpulse korrigiert, die vom Restblut stammten (0,01 im Gehirn, 0,1 in der Milz, den Nieren und der Leber (a.a.O.)).
• Unter der Annahme, daß der liposomale Durchmesser ungefähr 1000 Å, die Lipid-Doppelschichtdicke 37 Å (Mason und Huang, Ann. N.Y. Acad. Sci., Band 308, Seiten 29-48 (1978)) und die Lipid- (liposomale) Dichte 0,9 g/cm³ betragen, wurde die Anzahl der an die Blut-Hirn-Schranke gebundenen Liposome und die durch die gebundenen Liposome eingenommene Oberfläche geschätzt. Die Kapillaroberfläche in Rattenhirn wurde auf 135 cm²/g Hirnnaßgewicht geschätzt (Altman, a.a.O.).
• Dunnett's Test wurde durchgeführt, um zwei Mittelwerte miteinander zu vergleichen (Miller, R., Simultaneous Statistical Interferences, Seiten 67-87, McGraw-Hill, New York, NY (1966)). Ein paarweiser Student-Test wurde verwendet, um die durchtränkten mit den nichtdurchtränkten Seiten des Gehirns jeder Ratte zu vergleichen. Der Wert für die statistische Signifikanz betrug in allen Tests P < 0,05.
• Die Organverteilungen von [¹&sup4;C]-DPPC-markierten liposomalen Formulierungen im Anschluß an die rechtsseitige Halsschlagader-Infusion in 10 Ratten für jede Untersuchung sind in Tabelle I zusammengefaßt. OX-26-Liposome zeigten bei 1 und 10 min eine 50% größere Bindung an das Gehirn als die entsprechenden unspezifischen Fab'-Kontrollen. Die Radioaktivitätsspiegel im Gehirn von Ratten, denen OX-26-Liposome eingeflößt wurden, waren bei 1 min. aber nicht bei 10 min. statistisch größer als bei den Kontrollexperimenten (P < 0,05, Dunnett's Test). Obwohl die Hirnspiegel bei 10 min im wesentlichen unverändert waren, wurde wegen größerer Variabilität, die mit den Daten bei 10 min verbunden war, keine statistische Signifikanz erreicht.
• Links-rechts-Unterschiede in den Großhirnverteilungswerten bei einzelnen Tieren wurden durch einen paarweisen Student-Test festgestellt. Obwohl die Werte für das zur Infusion ipsilaterale (rechte) Großhirn größer waren als die des kontralateralen (linken) Großhirns, erreichten diese keine statistische Signifikanz. OX-26- und OX-26-Kontroll-Liposome wiesen ähnliche Leberaufnahmen auf; die Milzaufnahme von OX-26-Liposomen bei 1 und 10 min betrug jedoch ungefähr 300% der Kontrollen. OX-26-Liposome wurden aus dem Plasma schneller beseitigt als die Kontroll-Liposome. Durch die Niere wurden alle liposomalen Formulierungen nur in unbedeutendem Umfange aufgenommen. Eine Wiedergewinnung aller liposomaler Formulierungen betrug durch schnittlich 75 ± 4% (SEM) der injizierten Dosis.
• Vd-Werte, Radioaktivität pro g Naßgewicht jedes Organs, geteilt durch die Radioaktivität pro ml Plasma, normalisieren die Variabilität der Plasma-Pharmakokinetik und der liposomalen Plasma-Beseitigung bei den Ratten. Die Vd-Werte der liposomalen Formulierungen (Tabelle II) für OX-26 im Gehirn waren signifikant größer als ihre jeweiligen Kontroll-Werte sowohl bei 1 als auch bei 10 min. und zwar um ungefähr das 2-fache bei 1 min und um das 6-8-fache bei 10 min (p < 0,05, Dunnett's Test). Obwohl der Vd-Wert für das rechte Großhirn bis zu 3,5-fach größer war als für das linke Großhirn, erreichte dies keine statistische Signifikanz (paarweiser Student-Test). Bei 1 und 10 min stellten sich hohe Spiegel der OX-26-Liposome in Leber und Milz ein, was eine liposomale Ansammlung in diesen Organen anzeigt. Vd-Werte aller Formulierungen im Gehirngewebe stiegen zwischen 1 und 10 min nicht an, was anzeigt, daß Liposome die Blut-Hirn-Schranke nicht meßbar überschritten.
• Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen, daß kovalent mit Antikörper-Bindungsfragmenten gekoppelte Liposome und insbesondere Fab'-Fragmente an Transferrin-Rezeptoren in den Hirnkapillaren binden können. Die gebundenen Liposome wurden auf ungefähr 0,03% der injizierten Dosis oder 0,025 umol Liposome geschätzt. Kontroll-Liposome, die mit dem Rattenhirn verbunden waren, wurden von der Gesamthirn-Aufnahme der OX-26-Liposome abgezogen, weil die Hirn-Radioaktivitätsspiegel nach Infusion in die Halsschlagader leicht erhöht waren (oberhalb des Untergrunds) (Micklus et al., Biochim. Biophys. Acta, Band 1124, Seiten 7-12 (1992)). Die Transferrin-Rezeptor- Dichte im Rattenhirn wurde auf etwa 0,02 umol pro Gramm Gehirn geschätzt (Pardridge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Band 259, Seiten 66-70 (1991)), was im allgemeinen äquivalent zu 0,034 umol pro Gehirn für die in den vorliegenden Experimenten verwendeten Ratten oder ungefähr 1 Liposom pro 1,3 Rezeptor war. Die liposomale OX-26-Hirnaufnahme blieb nach 1 min eher konstant als daß sie anstieg, was darauf hindeutete, daß nach 1 min im wesentlichen alle Rezeptorstellen besetzt waren. Dieses Ergebnis stimmt mit der Beobachtung überein, daß OX-26-Antikörper 5 min nach der Injektion signifi kante Bindung an Kapillaren zeigen (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 88, Seiten 4771-4775 (1991)). Es wurde keine Zunahme der liposomalen Hirnaufnahme während des kurzen in dieser Untersuchung verwendeten Zeitraums von 10 min beobachtet.
• Ein Vergleich von Großhirnverteilungen innerhalb eines Tieres von links nach rechts und Vd-Werte unserer liposomalen Präparate zeigten keine statistische Differenz, woraus sich ergab, daß die Rezeptorstellen in beiden Großhirnhemisphären schnell gesättigt werden. Dies deutet darauf hin, daß eine ähnliche Sättigung der Rezeptorstellen durch (1) intravenöse Verabreichung von Liposomen und/oder (2) eine Verringerung der liposomalen Dosis erreicht werden kann.
• Die Kapillaroberfläche in der Ratten-Hirnrinde beträgt etwa 135 cm² pro Gramm Gehirn (Naßgewicht) oder 230 cm² für Ratten bei der vorliegenden Untersuchung; deshalb wurde geschätzt, daß etwa 0,7% der Hirnkapillaroberfläche mit Liposomen bedeckt war. Die liposomale Bindung an das Gehirn kann durch Hochregulieren des Transferrin-Rezeptors oder durch Anzielen anderer Rezeptoren erhöht werden, um die gesamte Kapillaroberfläche zu bedecken. Beispielsweise würde dies einer 3,8 umol liposomalen Hirnaufnahme in einer 270 g Ratte, wie sie in dieser Untersuchung verwendet wurde, entsprechen.
• Der Transport des Fab'-zielgerichteten Liposoms durch die Blut-Hirn-Schranke wird in Experimenten demonstriert, die nach dem Hirnkapillar-Entleerungsverfahren durchgeführt wurden, wie von Pardridge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Band 259, Seiten 66-70 (1991) und Triguero et al., J. Neurochem., Band 54, Seiten 1882-1888 (1990) beschrieben wurde.
• Unter anderen Gesichtspunkten zeigten die OX-26-Fab'-gekoppelten Liposome eine merkliche Aufnahme durch Leber und Milz bei 1 und 10 min nach der Infusion. OX-26-Liposome legten mit in der Milz vorhandenen 6% ihrer Gesamtradioaktivität nach 1 min und 12% nach 10 min eine ungewöhnlich hohe Milzaufnahme dar. Diese gesteigerte Milzaufnahme ist wahrscheinlich auf die vielen Transferrin-Rezeptoren in der Milz oder an roten Blutzellen zurückzuführen, die nach Bindung an OX-26-Liposome durch die Milz schnell beseitigt werden. Dies deutet darauf hin, daß OX-26-Liposome verwendet werden können, um therapeutische Mittel wirksam zur Milz zu lenken.
Beispiel III Auf den Insulin-Rezeptor zielgerichtete Liposome
• Mit diesem Beispiel wird die Eignung von auf Insulin gelenkten Liposomen und im Vergleich dazu Kontrollpräparate verglichen, markierte Formulierungen im Gehirn zu verteilen. Obwohl die Hirnverteilung von Insulin-gekoppelten Liposomen statistisch von den Kontroll-Formulierungen nicht verschieden waren, waren die Vd-Werte, mit denen die Daten um die Plasmaklärung berichtigt werden, für Insulin-Liposome im rechten Großhirn bei 1 und 10 min höher als die Kontrollen. Dies deutet darauf hin, daß eine mäßige Bindung an Hirnkapillaren stattfindet.
Formulierungen
• Die [¹&sup4;C]-DPPC-markierten liposomalen Formulierungen, die in dieser Untersuchung ausgewertet wurden, bestanden aus 8 umol/ml Suspensionen von PC/Chol/MPB-PE-Lipiden (molares Verhältnis 10/5/l), die kovalent mit Proteinen koppelten. Die Proteinkonzentrationen von Insulin, von OX-26-anti- Transferrin-lgG-Fab' und von unspezifischem Kaninchen-IgG-Fab' (Kontrolle), die mit den verwandten liposomalen Formulierungen gebunden waren, wurden kolorimetrisch (Sigma Protein Assay Kit) auf 250, 60 bzw. 140 ug/ml geschätzt.
A. Erzeugung von thioliertem Insulin
• Insulin (Schwein, Natrium) und N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (SATA) wurden von Cal Biochem Corp. (La Jolla, CA) bezogen. Insulin wurde mit SATA durch Modifizierung des Verfahrens von Duncan et al., Anal. Biochem., Band 132, Seiten 68-73 (1983) thioliert. 20 ul SATA in Dimethylformamid (DMF) (100 mg/ml) wurden pro 1 ml Insulin-Lösung (10 mg/ml Insulin + 5 ul 5 N NaOH) in deionisiertem Wasser 30 min lang umgesetzt. Thioacetyliertes Insulin wurde durch Umsetzung mit 100 ul (pro ml Insulin-Lösung) wäßrigem 0,5 M Hydroxylamin (pH 6,8) 30 min lang deacetyliert. Thioliertes Insulin wurde auf Sephadex®G-25 Minisäulen, die aus den Zylindern von 3-ml Kunststoffspritzen nach dem Verfahren von Fry et al., Anal. Biochem., Band 90, Seiten 809-815 (1987), hergestellt wurden, von gelösten Stoffen mit niederem Molekulargewicht abgetrennt. Aliquots von einem halben ml thiolierter Insulin-Lösung wurden auf vorher zentrifugierte Minisäulen aufgetragen und 10 min lang bei 1000 Upm zentrifugiert. Nach dem Hinzufügen von 0,2 ml Kochsalzlösung wurde dieser Zentrifugierschritt wiederholt. Der Umfang der Thiolierung wurde nach dem Verfahren von Ellman, a.a.O., bestimmt.
8. Kopplung von Insulin mit Liposomen
• Frisch thioliertes fnsulin wurde zu einem äquivalenten Volumen frisch erzeugter Liposome (in 20 mM Hepes-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,5) hinzugefügt und bei Raumtemperatur über Nacht mechanisch gerührt. Insulin-gekoppelte Liposome wurden aus dem Reaktionsgemisch durch Flotation an einem Metrizamid-Gradienten isoliert, wie vorstehend in Beispiel I beschrieben ist.
• Die Proteinkonzentration von Insulin, das an die liposomalen Formulierung gebunden war, wurde kolorimetrisch auf 250 ug/ml geschätzt. Insulin-gekoppelte liposomale Formulierungen wurden nicht auf Rezeptorbindungsstellen getestet. Jedoch konnte gezeigt werden, daß aus SATA-modifizierten Proteinen erzeugte Konjugate die Enzymaktivität oder -funktion behalten haben (Duncan et al., a.a.O.).
• Tieruntersuchungen wurden nach den vorstehend in Beispiel II beschriebenen Verfahren durchgeführt.
• Die in Tabelle I und Tabelle II dargestellten Ergebnisse zeigen, daß Insulin- und Insulinkontroll-Liposome vergleichbare Verteilungen im Gehirn aufwiesen. Ferner gab es in entsprechender Weise keine merklichen Links-rechts-Großhirn-Unterschiede im Anschluß an die Verabreichung jeder Präparation. Insulin- Liposome wurden aus dem Plasma schneller beseitigt als die Kontroll-Liposome und wiesen größere Leber- und Milzaufnahmen auf.
• Im rechten Großhirn waren die Vd-Werte von Insulin-Liposomen bei 1 und 10 min mit um ungefähr das 2-fache (P < 0,05, Dunnett's Test) merklich höher als die Kontrollwerte. Die Werte im linken Großhirn waren von den Kontrollen jedoch nicht verschieden, noch gab es Links-rechts-Unterschiede bei den Großhirn-Vd Werten.
• Die Hirnverteilung von Insulin-gekoppelten Liposomen war statistisch von den Kontroll-Formulierungen nicht verschieden, was darauf hindeutet, daß sie nicht merklich an Rattenhirn-Kapillaren binden. Jedoch waren die Vd-Werte für Insulin-Liposome im rechten Großhirn (ipsilateral zur Liposom-Infusion), die die Daten um die Plasmaklärung berichtigen, bei 1 und 10 min höher als die Kontrollen, was darauf hindeutet, daß eine mäßige Bindung an Hirnkapillaren stattfindet. Mögliche Gründe für solche mäßige Bindung sind (1) geringe Insulin-Bindungsaffinität zwischen Liposom und Kapillarrezeptor, (2) teilweise Inaktivierung des Insulins während der liposomalen Kopplungsreaktion, (3) geringe Insulin-Rezeptordichte am Hirnkapillar und (4) Konkurrenz zwischen Insulin-Liposomen mit endogenem Insulin um Hirnkapillar-Rezeptorstellen.
Beispiel IV Über Antikörper-Fragmente auf Insulin-Rezeptoren gelenkte Liposome
• Ein Liposom wird nach Beispiel I erzeugt, wobei ein auf das Gehirn eines Tieres zielgerichtetes transportierbares Neuropeptid eingebaut wird. Ein monoklonaler Antikörper gegen den menschlichen Insulin-Rezeptor wird verdaut, wobei Fab'-Fragmente erzeugt werden, die mit dem Liposom gekoppelt werden, wie in Beispiel I beschrieben ist. Das so erhaltene zielgerichtete Immuno-Liposom wird mit steriler Kochsalzlösung vereinigt, um eine physiologisch verträgliche Lösung herzustellen. Die erhaltene Lösung wird dem Patienten oder dem Lebewesen parenteral verabreicht.
Beispiel V Über Antikörper-Fragmente auf IGF-I-Rezeptor gelenkte Liposome
• Ein Liposom wird nach Beispiel I erzeugt, wobei eine zur Zuführung zum Gehirn eines Patienten oder eines Lebewesens zielgerichtete pharmakologische Verbindung eingebaut wird. Ein monoklonaler Antikörper gegen den menschlichen IGF-I-Rezeptor wird verdaut, wie in Beispiel I beschrieben ist, um Fab'-Fragmente zu erzeugen. Die Fab'-Fragmente werden mit dem Liposom, wie in Beispiel I beschrieben ist, gekoppelt. Das so erhaltene zielgerichtete Immuno-Liposom wird mit steriler Kochsalzlösung vereinigt, um eine physiologisch verträgliche Lösung bereitzustellen, und wird dem Patienten oder dem Lebewesen parenteral verabreicht.
• Aus den vorstehenden Ergebnissen ergibt sich offensichtlich, daß mit der vorliegenden Erfindung auf Antikörper-Bindungsfragment zielgerichtete liposomale Formulierungen bereitgestellt werden, die bei der Zuführung von therapeutischen und diagnostischen Verbindungen durch die Blut-Hirn-Schranke einsetzbar sind. Insbesondere stellt das Vorhandensein von Antikörper-Bindungsfragmenten in einem Liposom, die spezifisch für einen Hirn-Transportrezeptor sind, wie den Transferrin-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, IGF-I- oder IGF- II-Rezeptor, ein wirksames Mittel zur Steigerung der Aufnahme von bestimmten Medikamenten, wie hydrophiler Medikamente, Peptide und Proteine ins Gehirn dar. Die Antikörper-Bindungsfragment-modifizierten liposomalen Formulierungen können durch verschiedene Mittel hergestellt werden. Daher ergeben sich als Vorteile der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine erhöhte Wirksamkeit, Annehmlichkeit und Wirtschaftlichkeit geringerer Dosierungen sowie weniger häufige Verabreichung zum Erreichen therapeutischer Medikamentspiegel im Gehirn. Tabelle I: Verteilung von [¹&sup4;C]-DPPC-markierten liposomalen Formulierungen in Ratten:%DPM, wiedergewonnenen in Organen 1 und 10 Min nach Injektionen in die Halsschlagader. a
• a Daten stellen Mittelwert ± SEM (n = 10) dar. OX-26-Kontrolle ist unspezifisches Kaninchen-IgG-Fab'. Analyse von Individualunterschieden in rechts/links Großhirn-Werten zeigte keine merklichen Unterschied, wobei P < 0,05 ist (paarweiser Student-Test)
• * kennzeichnet statistischen Unterschied vom Kontrollwert, wobei P < 0,05 ist (Dunnett's Test). Tabelle II: Vd-Werte für [¹&sup4;C]-DPPC-markierte liposomale Formulierungen in Ratten 1 und 10 Min nach Injektion in die Halsschlagader. a
• a Daten stellen Mittelwert ± SEM (n = 10) dar. OX-26-Kontrolle ist unspezifisches Kaninchen-IgG-Fab'. Analyse von Individualunterschieden in rechts/links Großhirn-Werten zeigte keine merklichen Unterschied, wobei P < 0,05 ist (paarweiser Student-Test)
• * kennzeichnet statistischen Unterschied vom Kontrollwert, wobei P < 0,05 ist (Dunnett's Test).

Claims (20)

1. Zusammensetzung, die ein mit einem Antikörper-Bindungsfragment gekoppeltes Liposom enthält, das an ein an vaskulären Endothelzellen der Blut-Hirn- Schranke eines Säugetiers vorhandenes Rezeptor-Molekül bindet.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antikörper-Bindungsfragment Fab, F(ab')&sub2;, Fab' oder eine einzelne Antikörper-Polypeptidkette ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antikörper-Fragment an einen Rezeptor des Hirn-Peptid-Transportsystems bindet.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der Rezeptor der Transferrin- Rezeptor, Insulin-Rezeptor, IGF-I- oder IGF-II-Rezeptor ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antikörper-Bindungsfragment durch eine unpolare Bindung mit dem Liposom gekoppelt ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Liposom eine pharmazeutische Verbindung enthält.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die pharmakologische Verbindung ein hydrophiles Neuropeptid ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 6, die weiterhin eine physiologisch verträgliche Trägersubstanz enthält.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Durchmesser des Liposoms geringer als 1 Mikrometer ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der Durchmesser des Lipo soms kleiner als etwa 0,45 Mikrometer ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das spezifisch an den Transferrin-Rezeptor bindende Antikörper-Bindungsfragment Fab, F(ab')&sub2; oder Fab' ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antikörper-Bindungsfragment aus einem monoklonalen Antikörper hergestellt ist.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Antikörper-Bindungsfragment enthält, das an ein an vaskulären Endothelzellen einer Blut-Hirn-Schranke eines Säugetiers vorhandenes Rezeptor-Molekül bindet, wobei das Antikörper- Bindungsfragment mit einem Liposom gekoppelt ist, das eine zur Behandlung einer das Hirn betreffenden Erkrankung vorgesehene pharmazeutische Verbindung und eine pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanz enthält.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das Antikörper-Bindungsfragment Fab, F(ab')&sub2;, Fab' oder eine einzelne Antikörper- Polypeptidkette ist.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei der Rezeptor der Transferrin-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, IGF-I- oder IGF-II-Rezeptor ist.

16. Verwendung einer ein Liposom enthaltenden Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur zielgerichteten Zuführung der pharmakologischen Verbindung zur Blut-Hirn-Schranke des Säugetiers, wobei das Liposom eine mit einem Antikörper-Bindungsfragment gekoppelte pharmakologische Verbindung enthält, wobei das Antikörper-Bindungsfragment an ein an vaskulären Endothelzellen einer Blut-Hirn-Schranke eines Säugetiers vorhandenes Rezeptor-Molekül bindet.

17. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung intravenös oder intraarteriell verabreicht werden soll.

18. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Antikörper-Bindungsfragment an den Transferrin-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, IGF-I- oder IGF-II-Rezeptor spezifisch bindet.

19. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Antikörper-Bindungsfragment Fab, F(ab')&sub2;, Fab' oder eine einzelne Antikörper- Polypeptidkette ist.

20. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei der Rezeptor der Transferrin-Rezeptor ist.