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ES2819213T3 - Composiciones y métodos para modular la expresión de apolipoproteína (a) - Google Patents

Composiciones y métodos para modular la expresión de apolipoproteína (a) Download PDF

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ES2819213T3
ES2819213T3 ES14791187T ES14791187T ES2819213T3 ES 2819213 T3 ES2819213 T3 ES 2819213T3 ES 14791187 T ES14791187 T ES 14791187T ES 14791187 T ES14791187 T ES 14791187T ES 2819213 T3 ES2819213 T3 ES 2819213T3
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ES
Spain
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compound
modified
oligonucleotide
nucleosides
Prior art date
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Active
Application number
ES14791187T
Other languages
English (en)
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Thazha Prakash
Punit Seth
Eric Swayze
Mark Graham
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Application filed by Ionis Pharmaceuticals Inc filed Critical Ionis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 3901 a 3920 de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a SEQ ID NO: 1; y en donde el grupo conjugado comprende: **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para modular la expresión de apolipoproteína (a)
Antecedentes de la invención
El principio detrás de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido se hibrida con un ácido nucleico diana y modula la cantidad, actividad y/o función del ácido nucleico diana. Por ejemplo, en determinados casos, los compuestos antisentido dan como resultado una transcripción o traducción alterada de una diana. Una modulación de la expresión de este tipo se puede lograr, por ejemplo, mediante degradación o inhibición basada en la ocupación del ARNm diana. Un ejemplo de modulación de la función diana del ARN mediante degradación es la degradación basada en RNasa H del ARN diana tras la hibridación con un compuesto antisentido similar al ADN. Otro ejemplo de modulación de la expresión génica mediante degradación de la diana es el ARN interferente (ARNi). El ARNi se refiere al silenciamiento de genes mediado por antisentido a través de un mecanismo que utiliza el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un ejemplo adicional de modulación de la función diana del ARN es mediante un mecanismo basado en la ocupación tal como el que emplea de forma natural el microARN. Los microARN son pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión de los ARN que codifican proteínas. La unión de un compuesto antisentido a un microARN evita que el microARN se una a sus dianas de ARN mensajero y, por lo tanto, interfiere con la función del microARN. Los imitadores de microARN pueden potenciar la función del microARN nativo. Determinados compuestos antisentido alteran el corte y empalme del pre-ARNm. Independientemente del mecanismo específico, la especificidad de secuencia hace que los compuestos antisentido sean atractivos como herramientas para la validación de la diana y la funcionalización de genes, así como en calidad de agentes terapéuticos para modular selectivamente la expresión de genes implicados en la patogénesis de enfermedades.
La tecnología antisentido es un medio eficaz para modular la expresión de uno o más productos génicos específicos y, por lo tanto, puede resultar especialmente útil en un cierto número de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación. Pueden incorporarse nucleósidos químicamente modificados en compuestos antisentido para potenciar una o más propiedades, tales como resistencia a nucleasas, farmacocinética o afinidad por un ácido nucleico diana. En 1998, el compuesto antisentido, Vitravene® (fomivirsen; desarrollado por Isis Pharmaceuticals Inc., Carlsbad, CA) fue el primer fármaco antisentido en lograr la autorización de comercialización de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de EE.UU., y actualmente es un tratamiento de la retinitis inducida por citomegalovirus (CMV) en pacientes con SIDA.
Las nuevas modificaciones químicas han mejorado la potencia y la eficacia de los compuestos antisentido, descubriendo el potencial para la administración oral, así como potenciando la administración subcutánea, disminuyendo el potencial de efectos secundarios y conduciendo a mejoras en la comodidad del paciente. Las modificaciones químicas que aumentan la potencia de los compuestos antisentido permiten la administración de dosis más bajas, lo cual reduce el potencial de toxicidad, así como disminuye el costo general de la terapia. Las modificaciones que aumentan la resistencia a la degradación dan como resultado una eliminación más lenta del cuerpo, permitiendo una dosificación menos frecuente. Se pueden combinar diferentes tipos de modificaciones químicas en un compuesto para optimizar adicionalmente la eficacia del compuesto.
Las lipoproteínas son partículas globulares, similares a micelas, que consisten en un núcleo no polar de acilgliceroles y ésteres de colesterilo rodeado por una capa anfifílica de proteína, fosfolípidos y colesterol. Las lipoproteínas se han clasificado en cinco grandes categorías sobre la base de sus propiedades funcionales y físicas: quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). Los quilomicrones transportan los lípidos de la dieta desde el intestino hasta los tejidos. Las VLDL, IDL y LDL transportan todas triacilgliceroles y colesterol desde el hígado a los tejidos. Las HDL transportan el colesterol endógeno de los tejidos al hígado.
Las partículas de lipoproteínas se someten a un procesamiento metabólico continuo y tienen propiedades y composiciones variables. Las densidades de las lipoproteínas aumentan sin aumentar el diámetro de las partículas porque la densidad de sus recubrimientos externos es menor que la del núcleo interno. Los componentes proteicos de las lipoproteínas se conocen como apolipoproteínas. Al menos nueve apolipoproteínas se distribuyen en cantidades significativas entre las diversas lipoproteínas humanas.
La partícula de lipoproteína(a) [Lp(a)] se identificó hace casi 50 años y está compuesta de una partícula de LDL muy singular, en la que una proteína apolipoproteína B (apoB) está enlazada mediante un enlace disulfuro a una sola proteína apolipoproteína (a) [apo(a)]. La proteína apo(a) comparte un alto grado de homología con el plasminógeno, particularmente dentro del dominio repetitivo kringle IV tipo 2. Los niveles de Lp(a) circulante son inversamente proporcionales al número de repeticiones variables de kringle IV tipo 2 presentes en la molécula y, dado que ambos alelos se co-expresan dentro de los individuos, pueden mostrar perfiles de isoformas plasmáticas heterocigotas (Kraft et al., Eur J Hum Genet, 1996; 4(2): 74-87). Se cree que este dominio de repetición kringle en apo(a) puede ser responsable de sus propiedades pro-trombóticas y anti-fibrinolíticas, potenciando potencialmente la progresión aterosclerótica.
Apo(a) es regulada transcripcionalmente por IL-6 y en estudios en pacientes con artritis reumatoide tratados con un inhibidor de IL-6 (tocilizumab), los niveles en plasma se redujeron en un 30% después de 3 meses de tratamiento (Schultz et al., PLoS One 2010; 5: e14328).
Se ha demostrado que la apo(a) se une preferentemente a fosfolípidos oxidados y potencia la inflamación vascular (Bergmark et al., J Lipid Res 2008; 49:2230-2239; Tsimikas et al., Circulation. 2009; 119(13):1711-1719).
Además, los estudios sugieren que la partícula de Lp(a) también puede estimular la permeabilidad endotelial, inducir la expresión del inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 y activar la secreción de interleuquina-8 de macrófagos (Koschinsky y Marcovina, Curr Opin Lipidol 2004; 15: 167-174). Es importante destacar que estudios recientes de asociación genética revelaron que la Lp(a) era un factor de riesgo independiente para infarto de miocardio, apoplejía, enfermedad vascular periférica y aneurisma aórtico abdominal (Rifai et al., Clin Chem 2004; 50:1364-71; Erqou et al., JAMA 2009;302:412-23; Kamstrup et al., Circulation 2008;117:176-84). Además, en el reciente estudio de Enfermedad de la Arteria Coronaria Precoz (PROCARDIS), Clarke et al. (Clarke et al., NEJM (2009)361; 2518-2528) describieron asociaciones sólidas e independientes entre la enfermedad coronaria del corazón y las concentraciones plasmáticas de Lp(a). Adicionalmente, Solfrizzi et al., sugirieron que el aumento de Lp(a) en suero puede estar ligado con un riesgo incrementado de enfermedad de Alzheimer (AD) (Solfrizzi et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002, 72:732-736. Actualmente, en el entorno clínico, ejemplos de inhibidores indirectos de la apo(a) para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares incluyen aspirina, Niaspan, Mipomersen, Anacetrapib, Epirotirome y Lomitapide, que reducen los niveles plasmáticos de Lp(a) en un 18%, 39%, 32%, 36%, 43%. y 17%, respectivamente. Adicionalmente, la aféresis de Lp(a) se ha utilizado en la clínica para reducir las partículas de Lp(a) que contienen apo(a).
Hasta la fecha, las estrategias terapéuticas para tratar enfermedades cardiovasculares que fijan directamente como objetivo a los niveles de apo(a) han sido limitadas.. Oligonucleótidos de ribozima (Patente de EE.UU. 5.877.022) y oligonucleótidos antisentido (documentos WO 2005/000201; WO 2003/014397; WO2013/177468; US20040242516; Patentes de EE.UU. N°s 8.138.328, 8.673.632 y 7.259.150; Merki et al., J Am Coll Cardiol 2011; 57:1611-1621), pero ninguno ha sido aprobado para uso comercial
Por tanto, sigue existiendo una clara necesidad médica no satisfecha de nuevos agentes que puedan reducir de forma potente y selectiva los niveles de apo(a) en pacientes con riesgo incrementado de episodios cardiovasculares debido a niveles crónicamente elevados de Lp(a) en plasma.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 3901 a 3920 de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a SEQ ID NO: 1; y en donde el grupo de conjugado comprende:
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La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la invención y un diluyente o soporte farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona el compuesto de la invención para uso en el tratamiento, la prevención o ralentización de la progresión de una enfermedad relacionada con apo(a) elevada y/o Lp(a) elevada.
Sumario de la divulgación
En esta memoria se describen composiciones y métodos para modular la expresión de ARNm y proteína de apo(a). En determinadas realizaciones, el inhibidor específico de apo(a) disminuye la expresión de ARNm y proteína de apo(a). En esta memoria se describen composiciones y métodos para modular la expresión de niveles de Lp(a).
En determinadas realizaciones, la composición es un inhibidor específico de apo(a). En determinadas realizaciones, el inhibidor específico de apo(a) es un ácido nucleico, una proteína o una molécula pequeña. En determinadas realizaciones, el inhibidor específico de apo(a) es un oligonucleótido antisentido que fija como objetivo apo(a) con un conjugado. En determinadas realizaciones, el inhibidor específico de apo(a) es un oligonucleótido modificado y un conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de al menos 8 nucleobases contiguas, complementarias a una porción de igual longitud. de nucleobases 3901 a 3920 de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 80% complementaria a SEQ ID NO: 1. En determinadas realizaciones, el inhibidor específico de apo(a) es un oligonucleótido modificado y un conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o 20 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1-130, 133, 134. En determinadas realizaciones, el inhibidor específico de apo(a) es un oligonucleótido modificado y un conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de SEQ ID NO: 58, donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala en 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y en donde el segmento hueco está situado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en donde cada uno de los nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en donde cada uno de los residuos citosina es una 5-metilcitosina.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una composición que comprende un compuesto antisentido conjugado descrito en esta memoria, o una sal del mismo, y un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En determinadas realizaciones, la modulación de la expresión de apo(a) se produce en una célula o tejido. En determinadas realizaciones, las modulaciones se producen en una célula o tejido de un animal. En determinadas realizaciones, el animal es un ser humano. En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel de ARNm de apo(a). En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel de proteína apo(a). En determinadas realizaciones, se reducen tanto los niveles de ARNm de apo(a) como de proteína apo(a). En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción del nivel de Lp(a). Una reducción de este tipo puede producirse de una manera dependiente del tiempo o dependiente de la dosis.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones antisentido conjugadas y métodos para uso en terapia. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con la apo(a). Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionados con la Lp(a). En determinadas realizaciones,dichas enfermedades, trastornos y afecciones son enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorios, cardiovasculares y/o metabólicos. En determinadas realizaciones, las composiciones y los métodos para la terapia incluyen administrar un inhibidor específico para la apo(a) a un individuo que lo necesite. En determinadas realizaciones, el inhibidor específico de apo (a) es un ácido nucleico. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico es un compuesto antisentido. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado con un conjugado.
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados. En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados que comprenden un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido y reducir la cantidad o actividad de un transcrito de ácido nucleico en una célula.
El receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) se ha descrito previamente. Véase, p. ej., Park et al., PNAS vol. 102, N° 47, págs. 17125-17129 (2005). Receptores de este tipo se expresan en células del hígado, particularmente en hepatocitos. Además, se ha demostrado que compuestos que comprenden racimos de tres ligandos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) son capaces de unirse al ASGP-R, dando como resultado la absorción del compuesto en la célula. Véase, p. ej., Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, págs. 5216-5231 (mayo de 2008).
Por consiguiente, se han utilizado conjugados que comprenden racimos de GalNAc de este tipo para facilitar la captación de determinados compuestos en las células del hígado, específicamente hepatocitos. Por ejemplo, se ha demostrado que determinados conjugados que contienen GalNAc aumentan la actividad de los compuestos de ARNip dúplex en células del hígado in vivo. En tales casos, el conjugado que contiene GalNAc se fija típicamente a la cadena sentido del dúplex de ARNip. Dado que la cadena sentido se descarta antes de que la cadena antisentido se hibride finalmente con el ácido nucleico diana, existe poca preocupación de que el conjugado interfiera con la actividad. Típicamente, el conjugado se une al extremo 3' de la cadena sentido del ARNip. Véase, p. ej., la patente de EE.UU.
8.106.022. Determinados grupos de conjugados descritos en esta memoria son más activos y/o más fáciles de sintetizar que los grupos de conjugados descritos previamente.
En determinadas realizaciones de la presente divulgación, los conjugados se fijan a compuestos antisentido de cadena sencilla, incluidos, pero no limitados a compuestos antisentido basados en RNasa H y compuestos antisentido que alteran el corte y empalme de un ácido nucleico diana pre-ARNm. En este tipo de realizaciones, el conjugado debe permanecer fijado al compuesto antisentido el tiempo suficiente para proporcionar un beneficio (captación mejorada en las células), pero luego debe escindirse o no interferir de otro modo con las etapas posteriores necesarias para la actividad, tal como la hibridación con un nucleico diana e interacción con RNasa H o enzimas asociadas con el corte y empalme o la modulación del corte y empalme. Este equilibrio de propiedades es más importante en el establecimiento de compuestos antisentido de cadena sencilla que en compuestos de ARNip, en que el conjugado puede simplemente fijarse a la cadena sentido. En el presente documento se describen compuestos antisentido de cadena sencilla conjugados que tienen una potencia mejorada en células del hígado in vivo en comparación con el mismo compuesto antisentido que carece del conjugado. Dado el equilibrio requerido de propiedades para estos compuestos, es sorprendente tal potencia mejorada.
En determinadas realizaciones, los grupos de conjugados de esta memoria comprenden un resto escindible. Como se señaló, sin desear estar ligado por un mecanismo, es lógico que el conjugado permanezca en el compuesto el tiempo suficiente para proporcionar una mejora en la absorción, pero después de eso, es deseable que una parte o, de manera ideal, todo el conjugado sea escindido, liberando el compuesto original (p. ej., compuesto antisentido) en su forma más activa. En determinadas realizaciones, el resto escindible es un nucleósido escindible. Realizaciones de este tipo aprovechan las nucleasas endógenas en la célula uniendo el resto del conjugado (el racimo) al oligonucleótido antisentido a través de un nucleósido mediante uno o más enlaces escindibles, tales como los de un enlace fosfodiéster. En determinadas realizaciones, el racimo se une al nucleósido escindible a través de un enlace fosfodiéster. En determinadas realizaciones, el nucleósido escindible se fija al oligonucleótido antisentido (compuesto antisentido) mediante un enlace fosfodiéster. En determinadas realizaciones, el grupo de conjugado puede comprender dos o tres nucleósidos escindibles. En realizaciones de este tipo, dichos nucleósidos escindibles se enlazan entre sí, al compuesto antisentido y/o al racimo mediante enlaces escindibles (tales como los de un enlace fosfodiéster). Determinados conjugados de esta memoria no comprenden un nucleósido escindible y en su lugar comprenden un enlace escindible. Se demuestra que la escisión suficiente del conjugado del oligonucleótido es proporcionada por al menos un enlace que es vulnerable a la escisión en la célula (un enlace escindible).
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son profármacos. Estos profármacos se administran a un animal y finalmente se metabolizan a una forma más activa. Por ejemplo, los compuestos antisentido conjugados se escinden para separar todo o parte del conjugado, dando como resultado la forma activa (o más activa) del compuesto antisentido que carece de todo o parte del conjugado.
En determinadas realizaciones, los conjugados se fijan al extremo 5' de un oligonucleótido. Determinados conjugados 5' de este tipo son escindidos de manera más eficaz que sus homólogos que tienen un grupo de conjugado similar fijado en el extremo 3'. En determinadas realizaciones, la actividad mejorada puede correlacionarse con una escisión mejorada. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 5' tienen mayor eficacia que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 3' (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 56, 81, 83 y 84). Además, la fijación 5' permite una síntesis más sencilla de oligonucleótidos. Típicamente, los oligonucleótidos se sintetizan sobre un soporte sólido en la dirección 3' a 5'. Para preparar un oligonucleótido conjugado en 3', típicamente se fija un nucleósido 3' pre-conjugado al soporte sólido y luego se construye el oligonucleótido como de costumbre. Sin embargo, fijar ese nucleósido conjugado al soporte sólido agrega complicación a la síntesis. Además, utilizando ese enfoque, el conjugado está presente a lo largo de la síntesis del oligonucleótido y puede degradarse durante las etapas posteriores o puede limitar los tipos de reacciones y reactivos que se pueden utilizar. Utilizando las estructuras y técnicas descritas en esta memoria para oligonucleótidos conjugados en 5', se puede sintetizar el oligonucleótido utilizando técnicas automatizadas estándares y se puede introducir el conjugado con el nucleósido final (más 5') o después de que el oligonucleótido se haya escindido del soporte sólido.
A la vista de la técnica y la presente divulgación, un experto ordinario en la técnica puede preparar fácilmente cualquiera de los conjugados y oligonucleótidos conjugados de esta memoria. Además, la síntesis de determinados conjugados y oligonucleótidos conjugados descritos en esta memoria es más fácil y/o requiere unas pocas etapas y, por lo tanto, es menos costosa que la de los conjugados descritos previamente, proporcionando ventajas en la fabricación. Por ejemplo, la síntesis de determinados grupos de conjugados consiste en menos etapas de síntesis, lo que da como resultado un rendimiento incrementado, con relación a los grupos de conjugados descritos previamente. Grupos de conjugados, tales como GalNAc3-10 en el Ejemplo 46 y GalNAc3-7 en el Ejemplo 48, son mucho más simples que los conjugados descritos previamente, tales como los descritos en los documentos US 8.106.022 o US 7.262.177 que requieren ensamblaje de más compuestos intermedios químicos. Por consiguiente, estos y otros conjugados descritos en esta memoria tienen ventajas sobre los compuestos descritos previamente para su uso con cualquier oligonucleótido, incluidos los oligonucleótidos de cadena sencilla y cualquiera de las cadenas de oligonucleótidos de doble cadena (p. ej., ARNip).
De manera similar, en esta memoria se describen grupos de conjugados que tienen solo uno o dos ligandos de GalNAc. Tal como se muestra, grupos de conjugados de este tipo mejoran la actividad de los compuestos antisentido. Dichos compuestos son mucho más fáciles de preparar que los conjugados que comprenden tres ligandos de GalNAc. Grupos de conjugados que comprenden uno o dos ligandos de GalNAc se pueden fijar a cualquier compuesto antisentido, incluyendo oligonucleótidos de cadena sencilla y cualquier cadena de oligonucleótidos de doble cadena (p. ej.o, ARNip).
En determinadas realizaciones, los conjugados de esta memoria no alteran sustancialmente determinadas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en esta memoria se demuestra que los compuestos antisentido conjugados no son más inmunogénicos que los compuestos precursores no conjugados. Dado que se mejora la potencia, realizaciones en las que la tolerabilidad permanece igual (o incluso si la tolerabilidad empeora solo ligeramente en comparación con las ganancias en potencia) tienen propiedades mejoradas para la terapia.
En determinadas realizaciones, la conjugación permite alterar los compuestos antisentido de formas que tengan consecuencias menos atractivas en ausencia de conjugación. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la sustitución de uno o más enlaces fosforotioato de un compuesto antisentido completamente fosforotioato con enlaces fosfodiéster da como resultado una mejora en algunas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en determinados casos, compuestos antisentido de este tipo que tienen uno o más fosfodiésteres son menos inmunogénicos que el mismo compuesto en el que cada uno de los enlaces es un fosforotioato. Sin embargo, en determinados casos, como se muestra en el Ejemplo 26, ese mismo reemplazo de uno o más enlaces fosforotioato con enlaces fosfodiéster también da como resultado una absorción celular reducida y/o pérdida de potencia. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados descritos en esta memoria toleran un cambio de este tipo en los enlaces con poca o ninguna pérdida de captación y potencia en comparación con el homólogo de fosforotioato completo conjugado. De hecho, en determinadas realizaciones, por ejemplo, en los Ejemplos 44, 57, 59 y 86, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado y al menos un enlace internucleosídico fosfodiéster exhiben realmente una potencia incrementada in vivo, incluso en relación con un homólogo de fosforotioato completo que también comprende el mismo conjugado. Además, dado que la conjugación da como resultado aumentos sustanciales en la absorción/potencia, una pequeña pérdida de esa ganancia sustancial puede ser aceptable para lograr una tolerabilidad mejorada. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden al menos un enlace fosfodiéster.
En determinadas realizaciones, la conjugación de los compuestos antisentido de esta memoria da como resultado un suministro, captación y actividad incrementados en los hepatocitos. Por lo tanto, se suministra más compuesto al tejido hepático. Sin embargo, en determinadas realizaciones, ese suministro incrementado por sí solo no explica el aumento total de la actividad. En determinadas realizaciones de este tipo, penetra más compuesto en los hepatocitos. En determinadas realizaciones, incluso esa captación incrementada de hepatocitos no explica todo el aumento de actividad. En realizaciones de este tipo, se incrementa la captación productiva del compuesto conjugado. Por ejemplo, tal como se muestra en el Ejemplo 102, determinadas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc aumentan el enriquecimiento de oligonucleótidos antisentido en hepatocitos frente a células no parenquimatosas. Este enriquecimiento es beneficioso para los oligonucleótidos que fijan como objetivo genes que se expresan en hepatocitos.
En determinadas realizaciones, compuestos antisentido conjugados de esta memoria dan como resultado una exposición renal reducida. Por ejemplo, tal como se muestra en el Ejemplo 20, las concentraciones de oligonucleótidos antisentido que comprenden determinadas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc son menores en el riñón que las de los oligonucleótidos antisentido que carecen de un conjugado que contiene GalNAc. Esto tiene varias implicaciones terapéuticas beneficiosas. Para indicaciones terapéuticas en las que no se busca la actividad en el riñón, la exposición al riñón conlleva el riesgo de toxicidad renal sin el beneficio correspondiente. Además, una alta concentración en el riñón da típicamente como resultado la pérdida de compuesto en la orina, lo que resulta en una eliminación más rápida. Por consiguiente, para las dianas no renales, no se desea la acumulación en el riñón.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son profármacos que tienen la estructura: ASO
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Resto fijador de objetivo de células
La presente divulgación proporciona las siguientes realizaciones numeradas no limitantes:
El compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. El compuesto antisentido puede comprender el oligonucleótido ISIS 494372 modificado con un 5'-X, en donde X es un grupo de conjugado que comprende GalNAc tal como se define en las reivindicaciones. El compuesto antisentido puede consistir en el oligonucleótido ISIS 494372 modificado con un 5'-X, en donde X es un grupo de conjugado que comprende GalNAc tal como se define en las reivindicaciones.
Figure imgf000008_0001
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido comprende el oligonudeótido modificado conjugado ISIS 681251. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en el oligonucleótido modificado conjugado ISIS 681251.
Figure imgf000009_0001
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido comprende el oligonudeótido modificado conjugado ISIS 681257. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en el oligonucleótido modificado conjugado ISIS 681257.
Figure imgf000010_0001
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonudeótido modificado con la SEQ ID NO: 58 con una 5'-GalNAc, tal como se define en las reivindicaciones, con variabilidad en las modificaciones de azúcar de las alas. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en un oligonucleótido modificado con la SEQ ID NO: 58 con una 5'-GalNAc, tal como se define en las reivindicaciones, con variabilidad en las modificaciones de azúcar de las alas.
Figure imgf000011_0001
en donde R1 es -OCH2CH2OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente, en donde R1 es -O- y R2 es -CH2-, -CH(CH3)- o -CH2CH2-, y R1 y R2 están conectados directamente de manera que el puente resultante se seleccione de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
y para cada uno de los pares de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada uno de los anillos: R3 se selecciona de H y -OCH2CH2OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es - CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2-y R3 y R4 están conectados directamente de manera que el puente resultante se seleccione de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
y R5 se selecciona de H y -CH3 ;
y Z se selecciona de S' y O'.
Descripción detallada de la divulgación
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son únicamente ilustrativas y explicativas y no limitan la divulgación. En esta memoria, el uso del singular incluye el plural, a menos que se indique específicamente lo contrario. Tal como se utiliza en esta memoria, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso de la expresión "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los encabezamientos de las secciones que se utilizan en esta memoria son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto.
A. Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de la química analítica, química orgánica de síntesis y química médica y farmacéutica descritas en esta memoria son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se pueden utilizar técnicas estándares para la síntesis química y análisis químico. Determinadas técnicas y procedimientos de este tipo pueden encontrarse, por ejemplo, en "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Editado por Sangvi y Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21a edición, 2005; y "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" Editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; y Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y expresiones tienen los siguientes significados:
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleósido" significa un compuesto que comprende un resto de nucleobase y un resto de azúcar. Los nucleósidos incluyen, pero no se limitan a nucleósidos que se produce de forma natural (tal como se encuentran en el ADN y ARN) y nucleósidos modificados. Los nucleósidos pueden estar enlazados a un resto fosfato.
Tal como se utiliza en esta memoria, "modificación química" significa una diferencia química en un compuesto cuando se compara con un homólogo que se produce de forma natural.. Modificaciones químicas de oligonucleótidos incluyen modificaciones de nucleósidos (incluidas modificaciones de restos de azúcar y modificaciones de nucleobases) y modificaciones de enlaces internucleósidos. En referencia a un oligonucleótido, la modificación química no incluye diferencias solo en la secuencia de nucleobases.
Tal como se utiliza en esta memoria, "furanosilo" significa una estructura que comprende un anillo de 5 miembros que comprende cuatro átomos de carbono y un átomo de oxígeno.
Tal como se utiliza en esta memoria, "resto de azúcar que se produce de forma natural" significa un ribofuranosilo que se encuentra en el ARN que se produce de forma natural o un desoxirribofuranosilo que se encuentra en el ADN que se produce de forma natural.
Tal como se utiliza en esta memoria, "resto de azúcar" significa un resto de azúcar que se produce de forma natural o un resto de azúcar.modificado de un nucleósido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "resto de azúcar modificado" significa un resto de azúcar sustituido o un sustituto de azúcar.
Tal como se utiliza en esta memoria, "resto de azúcar sustituido" significa un furanosilo que no es un resto de azúcar que se produce de forma natural. Restos de azúcar sustituidos incluyen, pero no se limitan a furanosilos que comprenden sustituyentes en la posición 2', la posición 3', la posición 5' y/o la posición 4'. Determinados restos de azúcar sustituidos son restos de azúcar bicíclicos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "resto de azúcar 2'-sustituido" significa un furanosilo que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. A menos que se indique lo contrario, un resto de azúcar 2'-sustituido no es un resto de azúcar bicíclico (es decir, el sustituyente 2' de un resto de azúcar 2'-sustituido no forma un puente con otro átomo del anillo de furanosilo.
Tal como se utiliza en esta memoria,"MOE" significa -OCH2CH2OCH3.
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleósido 2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende flúor en la posición 2 ' . A menos que se indique lo contrario, el flúor en un nucleósido 2'-F está en la posición ribo (reemplazando el OH de una ribosa natural).
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "sustituto de azúcar" significa una estructura que no comprende un furanosilo y que es capaz de reemplazar el resto de azúcar que se produce de forma natural de un nucleósido, de modo que las sub-unidades de nucleósido resultantes son capaces de enlazase juntas y/o enlazarse a otros nucleósidos para formar un compuesto oligomérico que es capaz de hibridarse con un compuesto oligomérico complementario. Estructuras de este tipo incluyen anillos que comprenden un número de átomos diferente al del furanosilo (p. ej., anillos de 4, 6 o 7 miembros); reemplazo del oxígeno de un furanosilo con un átomo que no es oxígeno (p. ej., carbono, azufre o nitrógeno); o tanto un cambio en el número de átomos como un reemplazo del oxígeno. Estructuras de este tipo también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para restos de azúcar sustituidos (p. ej., sustitutos de azúcar carbocíclicos bicíclicos de 6 miembros que comprenden opcionalmente sustituyentes adicionales). Los sustitutos de azúcar también incluyen reemplazos de azúcar más complejos (p. ej., los sistemas sin anillo de ácido nucleico peptídico). Sustitutos del azúcar incluyen, sin limitación, morfolinas, ciclohexenilos y ciclohexitoles.
Tal como se utiliza en esta memoria, "resto de azúcar bicíclico" significa un resto de azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (que incluye, pero no se limita a un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, lo que resulta en una estructura bicíclica. En determinadas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En determinadas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En determinadas realizaciones de este tipo, el puente conecta el carbono 2' y el carbono 4' del furanosilo.
Tal como se utiliza en esta memoria, "ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla (ADNcs), ácidos nucleicos de doble cadena (ADNdc), pequeños ácidos ribonucleicos interferentes (RNAip) y microARN (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender cualquier combinación de estos elementos en una sola molécula.
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleótido" significa un nucleósido que comprende además un grupo de enlace fosfato. Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleósidos enlazados" pueden o no estar enlazados mediante enlaces fosfato y, por lo tanto, incluye, pero no se limita a, "nucleótidos enlazados". Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleósidos enlazados" son nucleósidos que están conectados en una secuencia continua (es decir, no están presentes nucleósidos adicionales entre los que están enlazados).
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleobase" significa un grupo de átomos que se puede enlazar a un resto de azúcar para crear un nucleósido que es capaz de incorporarse en un oligonucleótido, y en donde el grupo de átomos es capaz de unirse con una nucleobase complementaria que se produce de forma natural de otro oligonucleótido o ácido nucleico. Las nucleobases pueden producirse de forma natural o pueden estar modificadas. Tal como se utiliza en esta memoria "secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace o modificación de nucleobase.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "nucleobase no modificada" o "nucleobase que se produce de forma natural" significan las nucleobases heterocíclicas de ARN o ADN que se producen de forma natural: las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) (incluido 5-metil C) y uracilo (U).
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase que no sea una nucleobase que se forme de forma natural.
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleósido modificado" significa un nucleósido que comprende al menos una modificación química en comparación con los nucleósidos de ARN o ADN que se producen de forma natural. Los nucleósidos modificados comprenden un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleósido bicíclico" o "BNA" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico.
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleósido de etilo restringido" o "cEt" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleósido de ácido nucleico bloqueado" o "LNA" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4-CH2-O-2'.
Tal como se utiliza en esta memoria, "nucleósido sustituido en 2'" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. A menos que se indique lo contrario, un nucleósido 2'-sustituido no es un nucleósido bicíclico.
Tal como se utiliza en esta memoria, "desoxinucleósido" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar 2'-H furanosilo tal como se encuentra en los desoxirribonucleósidos (ADN) que se producen de forma natural.. En determinadas realizaciones, un 2'-desoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (p. ej., uracilo).
Tal como se utiliza en esta memoria, "oligonucleótido" significa un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) no modificados y/o desoxirribonucleósidos (ADN) no modificados y/o uno o más nucleósidos modificados.
Tal como se utiliza en esta memoria, "oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el que ninguno de los enlaces internucleosídicos contiene un átomo de fósforo. Tal como se utiliza en esta memoria, los oligonucleótidos incluyen oligonucleósidos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleósido modificado y/o al menos un enlace internucleosídico modificado.
Tal como se utiliza en esta memoria, "enlace" o "grupo de enlace" significa un grupo de átomos que enlazan dos o más otros grupos de átomos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "enlace intemudeosídico" significa un enlace covalente entre nucleósidos adyacentes en un oligonucleótido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "enlace internucleosídico que se produce de forma natural" significa un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
Tal como se utiliza en esta memoria, "enlace internucleosídico modificado" significa cualquier enlace internucleosídico distinto de un enlace internucleosídico que se produce de forma natural.
Tal como se utiliza en esta memoria, "enlace internucleosídico terminal" significa el enlace entre los dos últimos nucleósidos de un oligonucleótido o una región definida del mismo.
Tal como se utiliza en esta memoria, "grupo de enlace de fósforo" significa un grupo de enlace que comprende un átomo de fósforo. Grupos de enlace de fósforo incluyen, sin limitación, grupos que tienen la fórmula:
K I
Rb=P-Rc
Rd
J W V
en donde:
Ra y Rd son, cada uno independientemente, O, S, CH2 , NH o NJ1 , en donde J1 es alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido; Rb es O o S;
Rc es OH, SH, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 , alcoxi C1-C6 sustituido, amino o amino sustituido; y J 1 es Rb es O o S.
Los grupos de enlace de fósforo incluyen, sin limitación, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato, fosforamidato, fosforotioamidato, tionoalquilfosfonato, fosfotriésteres, tionoalquilfosfotriéster y boranofosfato.
Tal como se utiliza en esta memoria, "grupo de enlace de fósforo internucleósido" significa un grupo de enlace de fósforo que enlaza directamente dos nucleósidos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "grupo de enlace de fósforo no internucleósido" significa un grupo de enlace de fósforo que no enlaza directamente dos nucleósidos. En determinadas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleósido enlaza un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En determinadas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "grupo de enlace neutro" significa un grupo de enlace que no está cargado. Grupos de enlace neutros incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), amida-3 (-CH2-C(=O)-N(H)-), amida-4 (-CH2-N(H)-C(=O)-), formacetal (-O-CH2-O-), y tioformacetal (-S-CH2-O-). Otros grupos de enlace neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (Véase, por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi y P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, (págs. 40-65)). Grupos de enlace neutros adicionales incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
Tal como se utiliza en esta memoria, "grupo de enlace neutro internucleósido" significa un grupo de enlace neutro que enlaza directamente dos nucleósidos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "grupo de enlace neutro no internucleósido" significa un grupo de enlace neutro que no enlaza directamente dos nucleósidos. En determinadas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleósido enlaza un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En determinadas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "compuesto oligomérico" significa una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende un oligonucleótido.. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende uno o más grupos de conjugados y/o grupos terminales. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico consiste en un oligonucleótido. Compuestos oligoméricos también incluyen ácidos nucleicos que se producen de forma natural. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende una cadena principal de una o más subunidades monoméricas enlazadas, en que cada una de las subunidades monoméricas enlazadas está fijada directa o indirectamente a un resto de base heterocíclico. En determinadas realizaciones, compuestos oligoméricos también pueden incluir subunidades monoméricas que no están enlazadas a un resto de base heterocíclica, proporcionando con ello sitios abásicos. En determinadas realizaciones, los enlaces que unen las subunidades monoméricas, los restos o sustitutos de azúcar y los restos de bases heterocíclicas pueden modificarse independientemente. En determinadas realizaciones, la unidad de enlace-azúcar, que puede incluir o no una base heterocíclica, puede sustituirse con un mimético tal como los monómeros de los ácidos nucleicos peptídicos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "grupo terminal" significa uno o más átomos fijados a uno o ambos, el extremo 3' o el extremo 5' de un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, un grupo terminal es un grupo de conjugado. En determinadas realizaciones, un grupo terminal comprende uno o más nucleósidos del grupo terminal.
Tal como se utiliza en esta memoria, "conjugado" o "grupo de conjugado" significa un átomo o grupo de átomos unidos a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. En general, los grupos de conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que están fijados, incluyendo, pero sin limitarse a propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o de aclaramiento.
Tal como se utiliza en esta memoria, "enlazador conjugado" o "enlazador" en el contexto de un grupo de conjugado significa una parte de un grupo de conjugado que comprende cualquier átomo o grupo de átomos y que enlaza covalentemente (1) un oligonucleótido a otra parte del grupo de conjugado o (2) dos o más partes del grupo de conjugado.
Grupos de conjugados se muestran en esta memoria como radicales, proporcionando un enlace para formar una unión covalente a un compuesto oligomérico tal como un oligonucleótido antisentido. En determinadas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 3' del grupo hidroxilo 3' del nucleósido 3'-terminal del compuesto oligomérico. En determinadas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 5' del grupo hidroxilo 5' del nucleósido 5'-terminal del compuesto oligomérico. En determinadas realizaciones, el enlace para formar la unión al compuesto oligomérico es un enlace escindible. En determinadas realizaciones de este tipo, dicho enlace escindible constituye todo o parte de un resto escindible.
En determinadas realizaciones, los grupos de conjugados comprenden un resto escindible (p. ej., un enlace escindible o nucleósido escindible) y una porción de racimo de hidratos de carbono, tal como una porción de racimo de GalNAc. Una parte de racimo de hidratos de carbono comprende: un resto fijador de objetivo y, opcionalmente, un enlazador conjugado. En determinadas realizaciones, la parte de racimo de hidratos de carbono se identifica por el número y la identidad del ligando. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la parte de racimo de hidratos de carbono comprende 3 grupos GalNAc y se designa "GalNAc3". En determinadas realizaciones, la parte de racimo de hidratos de carbono comprende 4 grupos GalNAc y se designa "GalNAc4". Partes de racimos de hidratos de carbono específicas (que tienen grupos enlazadores de fijación, ramificación y conjugado específicos) se describen en esta memoria y se designan con un número romano seguido del subíndice "a". Por consiguiente, "GalNac3-1a" se refiere a una parte específica de racimo de hidratos de carbono de un grupo de conjugado que tiene 3 grupos GalNAc y grupos de fijación, ramificación y de enlace dura específicamente identificados. Un fragmento de racimo de hidratos de carbono de este tipo está fijado a un compuesto oligomérico a través de un resto escindible, tal como un enlace escindible o un nucleósido escindible.
Tal como se utiliza en esta memoria, "resto escindible" significa un enlace o grupo que es capaz de dividirse en condiciones fisiológicas. En determinadas realizaciones, un resto escindible se escinde dentro de una célula o compartimientos sub-celulares, tal como un lisosoma. En determinadas realizaciones, un resto escindible es escindido por enzimas endógenas, tales como nucleasas. En determinadas realizaciones, un resto escindible comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles.
Tal como se utiliza en esta memoria, "enlace escindible" significa cualquier enlace químico capaz de dividirse. En determinadas realizaciones, un enlace escindible se selecciona de entre: una amida, una poliamida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster fosfato, un carbamato, un disulfuro o un péptido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "racimo de hidratos de carbono" significa un compuesto que tiene uno o más residuos de hidratos de carbono fijados a un armazón o grupo enlazador.. (véase, p. ej., Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, o Rensen et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798­ 5808, para ejemplos de racimos de hidratos de carbono).
Tal como se utiliza en esta memoria, "hidrato de carbono modificado" significa cualquier hidrato de carbono que tenga una o más modificaciones químicas con respecto a los hidratos de carbono que se producen de forma natural.
Tal como se utiliza en esta memoria, "derivado de hidrato de carbono" significa cualquier compuesto que pueda sintetizarse utilizando un hidrato de carbono como un material de partida o compuesto intermedio.
Tal como se utiliza en esta memoria, "hidrato de carbono" significa un hidrato de carbono que se producen de forma natural, un hidrato de carbono modificado o un derivado de un hidrato de carbono.
Tal como se utiliza en esta memoria, "grupo protector" significa cualquier compuesto o grupo protector conocido por los expertos en la técnica. Pueden encontrarse ejemplos no limitantes de grupos protectores en "Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. Greene, P. G. M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, Nueva York.
Tal como se utiliza en esta memoria, "de cadena sencilla" significa un compuesto oligomérico que no está hibridado con su complemento y que carece de auto-complementariedad suficiente para formar un auto-dúplex estable.
Tal como se utiliza en esta memoria, "de doble cadena" significa un par de compuestos oligoméricos que se hibridan entre sí o un único compuesto oligomérico auto-complementario que forma una estructura de horquilla de pelo. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico de doble cadena comprende un primer y un segundo compuesto oligomérico.
Tal como se utiliza en esta memoria, "compuesto antisentido" significa un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido, al menos una parte del cual es complementaria a un ácido nucleico diana con el que es capaz de hibridarse, dando como resultado al menos una actividad antisentido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "actividad antisentido" significa cualquier cambio detectable y/o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la actividad antisentido incluye la modulación de la cantidad o actividad de un transcrito de ácido nucleico diana (p. ej., ARNm). En determinadas realizaciones, la actividad antisentido incluye la modulación del corte y empalme de pre-ARNm.
Tal como se utiliza en esta memoria, "compuesto antisentido basado en RNasa H" significa un compuesto antisentido en donde al menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible a la hibridación del compuesto antisentido a un ácido nucleico diana y posterior escisión del ácido nucleico diana por RNasa H.
Tal como se utiliza en esta memoria, "compuesto antisentido basado en RISC" significa un compuesto antisentido en el que al menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible al complejo de silenciamiento inducido por Ar N (RISC).
Tal como se utiliza en esta memoria, "detectar" o "medir" significa que se realiza un test o ensayo para detectar o medir. Una detección y/o medición de este tipo puede resultar en un valor de cero. Por lo tanto, si un test de detección o medición da como resultado un hallazgo de ausencia de actividad (actividad de cero), no obstante se ha realizado la etapa de detectar o medir la actividad.
Tal como se utiliza en esta memoria, "actividad detectable y/o medible" significa una actividad estadísticamente significativa que no es cero.
Tal como se utiliza en esta memoria, "esencialmente sin cambios" significa poco o ningún cambio en un parámetro particular, particularmente con relación a otro parámetro que cambia mucho más. En determinadas realizaciones, un parámetro no cambia esencialmente cuando cambia menos del 5%. En determinadas realizaciones, un parámetro no cambia esencialmente si cambia menos de dos veces mientras que otro parámetro cambia al menos diez veces. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una actividad antisentido es un cambio en la cantidad de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones de este tipo, la cantidad de un ácido nucleico no diana no cambia esencialmente si cambia mucho menos que lo hace el ácido nucleico diana, pero el cambio no necesita ser cero.
Tal como se utiliza en esta memoria, "expresión" significa el proceso por el cual un gen da como resultado finalmente una proteína. La expresión incluye, pero no se limita a transcripción, modificación post-transcripcional (p. ej., corte y empalme, poliadenilación, adición de 5'-caperuza) y traducción.
Tal como se utiliza en esta memoria, "ácido nucleico diana" significa una molécula de ácido nucleico con la que se pretende que hibride un compuesto antisentido para dar como resultado una actividad antisentido deseada. Oligonucleótidos antisentido tienen suficiente complementariedad con sus ácidos nucleicos diana para permitir la hibridación en condiciones fisiológicas.
Tal como se utiliza en esta memoria, "complementariedad de nucleobase" o "complementariedad", cuando se hace referencia a nucleobases, significa una nucleobase que es capaz de emparejarse con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, adenina (A) es complementaria a timina (T). Por ejemplo, en el ARN, adenina (A) es complementaria a uracilo (U). En determinadas realizaciones, nucleobase complementaria significa una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejarse con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces la posición de los enlaces hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera que es complementaria en ese par de nucleobases.
Las nucleobases que comprenden determinadas modificaciones pueden mantener la capacidad de emparejarse con una nucleobase homóloga y, por lo tanto, todavía son capaces de complementariedad de nucleobases.
Tal como se utiliza en esta memoria, "no complementaria" en referencia a nucleobases significa un par de nucleobases que no forman enlaces hidrógeno entre sí.
Tal como se utiliza en esta memoria, "complementario" en referencia a compuestos oligoméricos (p. ej., nucleósidos, oligonucleótidos o ácidos nucleicos enlazados) significa la capacidad de compuestos oligoméricos sde este tipo o regiones de los mismos de hibridarse con otro compuesto oligomérico o región del mismo mediante complementariedad de nucleobases. Los compuestos oligoméricos complementarios no necesitan tener complementariedad de nucleobase en cada uno de los nucleósidos. Más bien, se toleran algunos desajustes. En determinadas realizaciones, las regiones o compuestos oligoméricos complementarios son complementarios al 70% de las nucleobases (complementarios al 70%). En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos o regiones complementarios son complementarios en un 80%. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos o regiones complementarios son complementarios en un 90%. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos o regiones complementarios son complementarios en un 95%. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos o regiones complementarios son complementarios en un 100%.
Tal como se utiliza en esta memoria, "emparejamiento erróneo" significa una nucleobase de un primer compuesto oligomérico que no es capaz de emparejarse con una nucleobase en una posición correspondiente de un segundo compuesto oligomérico, cuando el primer y el segundo compuesto oligomérico están alineados. Cualquiera o ambos del primer y segundo compuestos oligoméricos pueden ser oligonucleótidos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "hibridación" significa el emparejamiento de compuestos oligoméricos complementarios (p. ej., un compuesto antisentido y su ácido nucleico diana). Aunque no se limita a un mecanismo particular, el mecanismo más común de emparejamiento implica enlaces hidrógeno, que pueden ser enlaces hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertidos, entre nucleobases complementarias.
Tal como se utiliza en esta memoria, "se hibrida específicamente" significa la capacidad de un compuesto oligomérico de hibridarse con un sitio de ácido nucleico con mayor afinidad de lo que se hibrida con otro sitio de ácido nucleico.
Tal como se utiliza en esta memoria, "completamente complementario" con referencia a un oligonucleótido o parte del mismo significa que cada una de las nucleobases del oligonucleótido o parte del mismo es capaz de emparejarse con una nucleobase de un ácido nucleico complementario o parte contigua del mismo. Por lo tanto, una región completamente complementaria no comprende emparejamientos erróneos ni nucleobases no hibridadas en cualquiera de las cadenas.
Tal como se utiliza en esta memoria, "porcentaje de complementariedad" significa el porcentaje de nucleobases de un compuesto oligomérico que son complementarias a una parte de igual longitud de un ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad se calcula dividiendo el número de nucleobases del compuesto oligomérico que son complementarias a nucleobases en las posiciones correspondientes en el ácido nucleico diana por la longitud total del compuesto oligomérico.
Tal como se utiliza en esta memoria, "porcentaje de identidad" significa el número de nucleobases en un primer ácido nucleico que son del mismo tipo (independientemente de la modificación química) que las nucleobases en las posiciones correspondientes en un segundo ácido nucleico, dividido por el número total de nucleobases en el primero. ácido nucleico.
Tal como se utiliza en esta memoria, "modulación" significa un cambio de cantidad o calidad de una molécula, función o actividad en comparación con la cantidad o calidad de una molécula, función o actividad antes de la modulación. Por ejemplo, la modulación incluye el cambio, ya sea un aumento (estimulación o inducción) o una disminución (inhibición o reducción) en la expresión génica. Como ejemplo adicional, la modulación de la expresión puede incluir un cambio en la selección del sitio de corte y empalme del procesamiento de pre-ARNm, dando como resultado un cambio en la cantidad absoluta o relativa de una variante de corte y empalme particular en comparación con la cantidad en ausencia de modulación.
Tal como se utiliza en esta memoria, "motivo químico" significa un patrón de modificaciones químicas en un oligonucleótido o una región del mismo. Los motivos pueden definirse mediante modificaciones en determinados nucleósidos y/o en determinados grupos de enlace de un oligonucleótido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "motivo de nucleasa" significa un patrón de modificaciones de nucleósidos en un oligonucleótido o una región del mismo. Los enlaces de un oligonucleótido de este tipo pueden modificarse o no modificarse. A menos que se indique lo contrario, los motivos en esta memoria que describen solo nucleósidos están destinados a ser motivos de nucleósidos. Por lo tanto, en tales casos, los enlaces no están limitados.
Tal como se utiliza en esta memoria, "motivo de azúcar" significa un patrón de modificaciones de azúcares en un oligonucleótido o una región del mismo.
Tal como se utiliza en esta memoria, "motivo de enlace" significa un patrón de modificaciones de enlace en un oligonucleótido o una región del mismo. Los nucleósidos de un oligonucleótido de este tipo pueden modificarse o no modificarse. A menos que se indique lo contrario, los motivos en esta memoria que describen solo enlaces están destinados a ser motivos de enlaces. Por lo tanto, en tales casos, los nucleósidos no están limitados.
Tal como se utiliza en esta memoria, "motivo de modificación de nucleobases" significa un patrón de modificaciones de nucleobases a lo largo de un oligonucleótido. A menos que se indique lo contrario, un motivo de modificación de nucleobases es independiente de la secuencia de las nucleobases.
Tal como se utiliza en esta memoria, "motivo de secuencia" significa un patrón de nucleobases a lo largo de un oligonucleótido o una parte del mismo. A menos que se indique lo contrario, un motivo de secuencia es independiente de las modificaciones químicas y, por lo tanto, puede tener cualquier combinación de modificaciones químicas, incluidas modificaciones no químicas.
Tal como se utiliza en esta memoria, "tipo de modificación" con referencia a un nucleósido o un nucleósido de un "tipo" significa la modificación química de un nucleósido e incluye nucleósidos modificados y no modificados. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, un "nucleósido que tiene una modificación de un primer tipo" puede ser un nucleósido no modificado.
Tal como se utiliza en esta memoria, "modificado de manera diferente" significa modificaciones químicas o sustituyentes químicos que son diferentes entre sí, incluida la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, un nucleósido MOE y un nucleósido de ADN no modificado se "modifican de manera diferente", incluso aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. Asimismo, el ADN y el ARN están "modificados de manera diferente", incluso aunque ambos sean nucleósidos no modificados que se producen de forma natural. Los nucleósidos que son iguales, pero que comprenden diferentes nucleobases no se modifican de manera diferente. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2'-OMe y una nucleobase de adenina no modificada y un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2'-OMe y una nucleobase de timina no modificada no se modifican de manera diferente.
Tal como se utiliza en esta memoria, "el mismo tipo de modificaciones" se refiere a modificaciones que son iguales entre sí, incluyendo la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, dos nucleósidos de ADN no modificados tienen "el mismo tipo de modificación", incluso aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. Nucleósidos de este tipo que tienen el mismo tipo de modificación pueden comprender diferentes nucleobases.
Tal como se utiliza en esta memoria, "regiones separadas" significa partes de un oligonucleótido en donde las modificaciones químicas o el motivo de modificaciones químicas de cualquier parte vecina incluyen al menos una diferencia para permitir que las regiones separadas se distingan entre sí.
Tal como se utiliza en esta memoria, "soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sustancia adecuada para su uso en la administración a un animal. En determinadas realizaciones, un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina estéril. En determinadas realizaciones, una solución salina estéril de este tipo es una solución salina de calidad farmacéutica.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "trastorno metabólico" significa una enfermedad o afección caracterizada principalmente por una desregulación del metabolismo - el conjunto complejo de reacciones químicas asociadas con la descomposición de los alimentos para producir energía.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "trastorno cardiovascular" significa una enfermedad o afección caracterizada principalmente por una función alterada del corazón o de los vasos sanguíneos.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "sistema de anillo monocíclico o policíclico" pretende incluir todos los sistemas de anillo seleccionados de sistemas de anillo de radicales simples o policíclicos en los que los anillos están condensados o enlazados y pretende incluir sistemas de anillos simples y mixtos seleccionados individualmente de alifáticos, alicíclico, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroaromático y heteroarilalquilo. Estructuras monocíclicas y policíclicas de este tipo pueden contener anillos que tienen cada uno el mismo nivel de saturación o cada uno, independientemente, tiene grados variables de saturación que incluyen completamente saturados, parcialmente saturados o completamente insaturados. Cada uno de los anillo puede comprender átomos del anillo seleccionados de C, N, O y S para dar lugar a anillos heterocíclicos, así como anillos que comprenden solo átomos de anillo C, que pueden estar presentes en un motivo mixto, tal como, por ejemplo, bencimidazol, en el que un anillo tiene solo átomos de carbono del anillo y el anillo condensado tiene dos átomos de nitrógeno. El sistema de anillos monocíclico o policíclico se puede sustituir adicionalmente con grupos sustituyentes, tales como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos = 0 fijados a uno de los anillos. Sistemas de anillos monocíclicos o policíclicos se pueden fijar a moléculas precursoras utilizando diversas estrategias tal como directamente a través de un átomo del anillo, condensados a través de múltiples átomos del anillo, a través de un grupo sustituyente o a través de un resto de enlace bifuncional.
Tal como se utiliza en esta memoria, "profármaco" significa una forma inactiva o menos activa de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto, se metaboliza para formar el compuesto activo o más activo (p. ej., un fármaco).
Tal como se utiliza en esta memoria, "sustituyente" y "grupo sustituyente" significa un átomo o grupo que reemplaza al átomo o grupo de un compuesto precursor mencionado. Por ejemplo, un sustituyente de un nucleósido modificado es cualquier átomo o grupo que difiera del átomo o grupo que se encuentra en un nucleósido que se produce de forma natural (p. ej., un sustituyente 2' modificado es cualquier átomo o grupo en la posición 2' de un nucleósido distinto de H u OH). Grupos sustituyentes pueden estar protegidos o desprotegidos. En determinadas realizaciones, compuestos de la presente divulgación tienen sustituyentes en una o más de una posición del compuesto precursor. Los sustituyentes también pueden estar sustituidos adicionalmente con otros grupos sustituyentes y pueden fijarse directamente o mediante un grupo de enlace tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo a un compuesto precursor.
Igualmente, tal como se utiliza en esta memoria, "sustituyente", en referencia a un grupo funcional químico, significa un átomo o grupo de átomos que difiere del átomo o un grupo de átomos normalmente presentes en el grupo funcional mencionado. En determinadas realizaciones, un sustituyente reemplaza a un átomo de hidrógeno del grupo funcional (p. ej., en determinadas realizaciones, el sustituyente de un grupo metilo sustituido es un átomo o grupo distinto de hidrógeno que reemplaza a uno de los átomos de hidrógeno de un grupo metilo no sustituido). A menos que se indique lo contrario, los grupos susceptibles de ser utilizados como sustituyentes incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)Raa), carboxilo (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxi sustituido (-O-Raa), arilo, aralquilo, radical heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-N(Rbb)(Rcc)), imino(=NRbb), amido (-C(O)N-(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(O)ORaa), ureido (-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc)), tioureido (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), guanidinilo (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinilo (-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfinilo (-S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2Rbb) y sulfonamidilo (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)S(O)2Rbb). En donde cada uno de los Raa, Rbb y Rcc es, independientemente, H, un grupo funcional químico opcionalmente enlazado o un grupo sustituyente adicional con una lista preferida que incluye, sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. Los sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en esta memoria están presentes en un grado recurrente.
Tal como se utiliza en esta memoria, "alquilo", tal como se utiliza en esta memoria, significa un radical hidrocarbonado saturado, lineal o ramificado, que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo incluyen típicamente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono ( alquilo C1-C12), siendo más preferido de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono.
Tal como se utiliza en esta memoria, "alquenilo" significa un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos alquenilo incluyen, sin limitación, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo, dienos, tales como 1,3-butadieno y similares. Los grupos alquenilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferido de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo, tal como se utiliza en esta memoria, pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en esta memoria, "alquinilo" significa un radical hidrocarbonado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos alquinilo incluyen, sin limitación, etinilo, 1-propinilo, 1 -butinilo y similares. Los grupos alquinilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferido de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo, tal como se utiliza en esta memoria, pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en esta memoria, "acilo" significa un radical formado por la separación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la Fórmula general -C(O)-X, en que X es típicamente alifático, alicíclico o aromático. Ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo, tal como se utiliza en esta memoria, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en esta memoria, "alicíclico" significa un sistema de anillo cíclico, en donde el anillo es alifático. El sistema de anillo puede comprender uno o más anillos en los que al menos un anillo es alifático. Alicíclicos preferidos incluyen anillos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico, tal como se utiliza en esta memoria, puede incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en esta memoria, "alifático" significa un radical hidrocarbonado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono, en donde la saturación entre dos átomos de carbono cualesquiera es un enlace sencillo, doble o triple. Un grupo alifático contiene preferiblemente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferido de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede estar interrumpida con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Grupos alifáticos de este tipo interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitación, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Grupos alifáticos, tal como se utiliza en esta memoria, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en esta memoria, "alcoxi" significa un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno,en donde el átomo de oxígeno se utiliza para fijar el grupo alcoxi a una molécula precursora. Ejemplos de grupos alcoxi incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec.-butoxi, terc.-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Grupos alcoxi, tal como se utiliza en esta memoria, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en esta memoria, "aminoalquilo" significa un radical alquilo C1-C12 sustituido con amino. La porción alquilo del radical forma un enlace covalente con una molécula parental. El grupo amino puede estar ubicado en cualquier posición y el grupo aminoalquilo puede estar sustituido con un grupo sustituyente adicional en las porciones alquilo y/o amino.
Tal como se utiliza en esta memoria, "aralquilo" y "arilalquilo" significan un grupo aromático que está enlazado covalentemente a un radical alquilo C1-C12. La porción de radical alquilo del grupo aralquilo (o arilalquilo) resultante forma un enlace covalente con una molécula precursora. Ejemplos incluyen, sin limitación, bencilo, fenetilo y similares. Grupos aralquilo, tal como se utiliza en esta memoria, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales fijados al alquilo, el arilo o ambos grupos que forman el grupo radical.
Tal como se utiliza en esta memoria, "arilo" y "aromático" significan radicales del sistema de anillo carbocíclico monocíclico o policíclico que tienen uno o más anillos aromáticos. Ejemplos de grupos arilo incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. Sistemas de anillos arilo preferidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Grupos arilo, tal como se utiliza en esta memoria, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en esta memoria, "halo" y "halógeno" significan un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
Tal como se utiliza en esta memoria, "heteroarilo" y "heteroaromático" significan un radical que comprende un anillo aromático monocíclico o policíclico, sistema de anillo o sistema de anillo condensado, en donde al menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. También se pretende que heteroarilo incluya sistemas de anillo condensados que incluyen sistemas en los que uno o más de los anillos condensados no contienen heteroátomos. Grupos heteroarilo incluyen típicamente un átomo del anillo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzooxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo se pueden fijar a una molécula precursora directamente o mediante un resto de enlace, tal como un grupo alifático o heteroátomo. Grupos heteroarilo, tal como se utiliza en esta memoria, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en esta memoria, "compuesto conjugado" significa cualquier átomo, grupo de átomos o grupo de átomos enlazados, adecuado para uso como un grupo de conjugado. En determinadas realizaciones, los compuestos conjugados pueden poseer o impartir una o más propiedades, que incluyen, pero no se limitan a propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o depuración.
Tal como se utiliza en esta memoria, a menos que se indique o modifique lo contrario, la expresión "de doble cadena" se refiere a dos compuestos oligoméricos separados que se hibridan entre sí. Compuestos de doble cadena de este tipo pueden tener uno o más nucleósidos que no hibridan en uno o ambos extremos de una o ambas cadenas (colgantes) y/o uno o más nucleósidos internos que no se hibridan (emparejamientos erróneos), con la condición de que haya suficiente complementariedad para mantener la hibridación bajo condiciones fisiológicamente relevantes.
Tal como se utiliza en esta memoria, "sitio diana 5' " se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular.
Tal como se utiliza en esta memoria, "Aproximadamente" significa dentro de ± 10% de un valor. Por ejemplo, si se indica, "un marcador puede incrementarse en aproximadamente un 50%", esto implica que el marcador puede incrementarse entre un 45%-55%.
Tal como se utiliza en esta memoria, "administrado concomitantemente" se refiere a la co-administración de dos agentes de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan solaparse durante un período de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "administrar" o "administración" significa proporcionar un agente farmacéutico a un individuo e incluye, pero no se limita a administrarlo por un profesional médico y auto-administrarse. La administración de un agente farmacéutico a un individuo puede ser continua, crónica, corta o intermitente. La administración puede ser parenteral o no parenteral.
Tal como se utiliza en esta memoria, "agente" significa una sustancia activa que puede proporcionar un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. "Primer agente" significa un compuesto terapéutico de la invención. Por ejemplo, un primer agente puede ser un oligonucleótido antisentido que fija como objetivo apo(a). "Segundo agente" significa un segundo compuesto terapéutico de la invención (p. ej., un segundo oligonucleótido antisentido que fija como objetivo apo(a)) y/o un compuesto terapéutico que no es apo(a).
Tal como se utiliza en esta memoria, "mejora" o "mejorar" o "que mejora" se refiere a una disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociados. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
Tal como se utiliza en esta memoria, "animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo, pero no limitado a ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, pero no limitados a monos. y chimpancés.
Tal como se utiliza en esta memoria, "apo(a)" significa cualquier secuencia de ácido nucleico o proteína que codifica apo(a). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, apo(a) incluye una secuencia de ADN que codifica apo(a), una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica apo(a) (incluido el ADN genómico que comprende intrones y exones), una secuencia de ARNm que codifica apo(a), o una secuencia peptídica que codifica apo(a).
Tal como se utiliza en esta memoria, "ácido nucleico de apo(a)" significa cualquier ácido nucleico que codifica apo(a). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un ácido nucleico de apo(a) incluye una secuencia de ADN que codifica apo(a), una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica apo(a) (incluyendo el ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica apo(a).
Tal como se utiliza en esta memoria, "ARNm de apo(a)" significa un ARNm que codifica una proteína apo(a).
Tal como se utiliza en esta memoria, "proteína apo(a)" significa cualquier secuencia de proteína que codifica Apo(a).
Tal como se utiliza en esta memoria, "inhibidor específico de apo(a)" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión de un ácido nucleico de apo(a) y/o proteína apo(a). Por ejemplo, inhibidores específicos de apo(a) incluyen ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión de ácido nucleico de apo(a) y/o proteína apo(a).. En determinadas realizaciones, por modular específicamente la expresión del ácido nucleico de apo(a) y/o la expresión de la proteína apo(a), los inhibidores específicos de apo(a) pueden afectar a otros componentes del sistema de transporte de lípidos, incluidos los componentes de aguas abajo. De manera similar, en determinadas realizaciones, inhibidores específicos de apo(a) pueden afectar a otros procesos moleculares en un animal.
Tal como se utiliza en esta memoria, "aterosclerosis" significa un endurecimiento de las arterias que afecta a arterias de tamaño grande y mediano y se caracteriza por la presencia de depósitos grasos. Los depósitos grasos se denominan "ateromas" o "placas", que consisten principalmente en colesterol y otras grasas, calcio y tejido cicatricial, y dañan el revestimiento de las arterias.
Tal como se utiliza en esta memoria, "enfermedad cardíaca coronaria (CHD)" significa un estrechamiento de los pequeños vasos sanguíneos que suministran sangre y oxígeno al corazón, que a menudo es el resultado de la aterosclerosis.
Tal como se utiliza en esta memoria, "diabetes mellitus" o "diabetes" es un síndrome caracterizado por un metabolismo desordenado y un nivel de azúcar en sangre anormalmente alto (hiperglucemia), resultante de niveles insuficientes de insulina o sensibilidad reducida a la insulina. Los síntomas característicos son producción excesiva de orina (poliuria) debido a niveles altos de glucosa en sangre, sed excesiva y aumento de la ingesta de líquidos (polidipsia) que intenta compensar el aumento de la micción, visión borrosa debido a los efectos de la glucosa en sangre alta en la óptica del ojo, pérdida de peso inexplicable, y letargo.
Tal como se utiliza en esta memoria, "dislipidemia diabética" o "diabetes tipo 2 con dislipidemia" significa una afección caracterizada por diabetes tipo 2, HDL-C reducido, triglicéridos (TG) elevados y partículas LDL pequeñas y densas elevadas.
Tal como se utiliza en esta memoria, "diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero que es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, p. ej., una solución salina.
Tal como se utiliza en esta memoria, "dislipidemia" se refiere a un trastorno del metabolismo de lípidos y/o lipoproteínas, que incluye la sobreproducción o deficiencia de lípidos y/o lipoproteínas. Dislipidemias pueden manifestarse por elevación de lípidos tales como quilomicrones, colesterol y triglicéridos, así como lipoproteínas, tales como el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
Tal como se utiliza en esta memoria, "unidad de dosificación" significa una forma en la que se proporciona un agente farmacéutico, p. ej., píldora, comprimido u otra unidad de dosificación conocida en la técnica. En determinadas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido liofilizado. En determinadas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido reconstituido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico proporcionada en una sola administración, o en un período de tiempo específico. En determinadas realizaciones, se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en determinadas realizaciones en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se adapta fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden utilizar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En determinadas realizaciones, el agente farmacéutico se administra mediante infusión durante un período prolongado de tiempo o de forma continua. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes. Las dosis también pueden expresarse como mg/kg o g/kg.
Tal como se utiliza en esta memoria, "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para producir un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación del estado médico del individuo y otros factores relevantes.
Tal como se utiliza en esta memoria, "completamente complementaria" o "100% complementaria" significa que cada una de las nucleobases de una secuencia de nucleobases de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en una segunda secuencia de nucleobases de un segundo ácido nucleico. En determinadas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un segundo ácido nucleico es un ácido nucleico diana.
Tal como se utiliza en esta memoria, "glucosa" es un monosacárido utilizado por las células como fuente de energía e intermedio inflamatorio. "Glucosa en plasma" se refiere a la glucosa presente en el plasma.
Tal como se utiliza en esta memoria, "lipoproteína-C de alta densidad" o "HDL-C" significa colesterol asociado con partículas de lipoproteína de alta densidad. La concentración de HDL-C en suero (o plasma) se cuantifica típicamente en mg/dL o nmol/L. "HDL-C en suero" y "HDL-C en plasma" significan HDL-C en suero y plasma, respectivamente.
Tal como se utiliza en esta memoria, "inhibidor de HMG-CoA reductasa" significa un agente que actúa a través de la inhibición de la enzima HMG-CoA reductasa, tal como atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina y simvastatina.
Tal como se utiliza en esta memoria, "hipercolesterolemia" significa una afección caracterizada por colesterol elevado o colesterol circulante (plasma), colesterol LDL y colesterol VLDL, según las directrices del Informe del Panel de Expertos del Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol (NCEP) de Detección. Evaluación del Tratamiento del colesterol alto en adultos (véase Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).
Tal como se utiliza en esta memoria, "hiperlipidemia" o "hiperlipemia" es una afección caracterizada por lípidos séricos o lípidos circulantes (plasma) elevados. Esta afección manifiesta una concentración anormalmente alta de grasas. Las fracciones lipídicas en la sangre circulante son colesterol, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de muy baja densidad, quilomicrones y triglicéridos. La clasificación de Fredrickson de hiperlipidemias se basa en el patrón de TG y partículas de lipoproteínas ricas en colesterol, medido por electroforesis o ultracentrifugación y se utiliza comúnmente para caracterizar las causas primarias de hiperlipidemias tales como la hipertrigliceridemia (Fredrickson y Lee, Circulation, 1965, 31:321-327; Fredrickson et al., New Eng J Med, 1967, 276 (1): 34-42).
Tal como se utiliza en esta memoria, "hipertrigliceridemia" significa una afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos. Su etiología incluye factores primarios (es decir, causas genéticas) y secundarios (otras causas subyacentes, tales como diabetes, síndrome metabólico/resistencia a la insulina, obesidad, inactividad física, tabaquismo, exceso de alcohol y una dieta muy alta en hidratos de carbono) o, con mayor frecuencia, un combinación de ambos (Yuan et al. CMAJ, 2007, 176:1113-1120).
Tal como se utiliza en esta memoria, "identificar" o "seleccionar un animal con enfermedad metabólica o cardiovascular" significa identificar o seleccionar un sujeto propenso a o que ha sido diagnosticado con una enfermedad metabólica, una enfermedad cardiovascular o un síndrome metabólico; o identificar o seleccionar un sujeto que tenga algún síntoma de una enfermedad metabólica, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico que incluye, pero no se limita a, hipercolesterolemia, hiperglucemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, resistencia incrementada a la insulina, sensibilidad disminuida a la insulina, por encima del peso corporal normal, y/o contenido de grasa corporal superior al normal o cualquier combinación de los mismos. Una identificación de este tipo se puede lograr mediante cualquier método, incluyendo, pero no limitado a tests o evaluaciones clínicas estándares, tales como medir el colesterol sérico o circulante (plasma), medir la glucosa en sangre sérica o circulante (plasma), medir los triglicéridos en suero o circulantes (plasma)., medir la presión arterial, medir el contenido de grasa corporal, medir el peso corporal y similares.
Tal como se utiliza en esta memoria, "resultado cardiovascular mejorado" significa una reducción en la aparición de eventos cardiovasculares adversos, o el riesgo de los mismos. Ejemplos de eventos cardiovasculares adversos incluyen, sin limitación, muerte, reinfarto, apoplejía, choque cardiogénico, edema pulmonar, paro cardíaco y disritmia auricular.
Tal como se utiliza en esta memoria, "inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes, por ejemplo, entre regiones, segmentos, nucleótidos y/o nucleósidos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "aumentar HDL" o "elevar HDL" significa aumentar el nivel de HDL en un animal después de la administración de al menos un compuesto de la invención, en comparación con el nivel de HDL en un animal al que no se le administró compuesto alguno.
Tal como se utiliza en esta memoria, "individuo" o "sujeto" o "animal" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
Tal como se utiliza en esta memoria, "individuo que lo necesita" se refiere a un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia que necesita dicho tratamiento o terapia.
Tal como se utiliza en esta memoria, "inducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "aumentar", "disminuir", "reducir" o similares designan diferencias cuantitativas entre dos estados.. Por ejemplo, "una cantidad eficaz para inhibir la actividad o expresión de apo(a)" significa que el nivel de actividad o expresión de apo(a) en una muestra tratada diferirá del nivel de actividad o expresión de apo(a) en una muestra sin tratar. Dichos términos se aplican, por ejemplo, a niveles de expresión y niveles de actividad
Tal como se utiliza en esta memoria, "afección inflamatoria" se refiere a una enfermedad, estado de enfermedad, síndrome u otra afección que da como resultado una inflamación. Por ejemplo, la artritis reumatoide y la fibrosis hepática son afecciones inflamatorias. Otros ejemplos de afecciones inflamatorias incluyen sepsis, isquemia miocárdica/lesión por reperfusión, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, nefritis, rechazo del injerto, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, arteriosclerosis, aterosclerosis y vasculitis.
Tal como se utiliza en esta memoria, "inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o un bloqueo de la expresión o actividad de un ARN o una proteína y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o actividad.
Tal como se utiliza en esta memoria, "resistencia a la insulina" se define como la afección en la que las cantidades normales de insulina son inadecuadas para producir una respuesta normal de insulina a partir de las células grasas, musculares y hepáticas. La resistencia a la insulina en las células grasas da como resultado la hidrólisis de los triglicéridos almacenados, lo que eleva los ácidos grasos libres en el plasma sanguíneo. La resistencia a la insulina en el músculo reduce la absorción de glucosa, mientras que la resistencia a la insulina en el hígado reduce el almacenamiento de glucosa, y ambos efectos sirven para elevar la glucosa en sangre. Los niveles plasmáticos altos de insulina y glucosa debido a la resistencia a la insulina conducen a menudo al síndrome metabólico y a la diabetes de tipo 2.
Tal como se utiliza en esta memoria, "sensibilidad a la insulina" es una medida de la eficacia con la que un individuo procesa la glucosa. Un individuo que tiene una alta sensibilidad a la insulina procesa eficazmente la glucosa, mientras que un individuo con baja sensibilidad a la insulina no procesa eficazmente la glucosa.
Tal como se utiliza en esta memoria, "hipolipemiante" significa una reducción en uno o más lípidos (p. ej., LDL, VLDL) en un sujeto. "Hiperlipemiante" significa un aumento de un lí pido (p. ej.o, HDL) en un sujeto. Puede ocurrir una hipolipemia o una hiperlipemia con una o más dosis a lo largo del tiempo.
Tal como se utiliza en esta memoria, "terapia hipolipemiante" o "agente hipolipemiante" significa un régimen terapéutico proporcionado a un sujeto para reducir uno o más lípidos en un sujeto. En determinadas realizaciones, se proporciona una terapia hipolipemiante para reducir uno o más de apo(a), CETp , apoB, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no HDL-C, triglicéridos, pequeños partículas densas de LDL y Lp(a) en un sujeto. Ejemplos de terapia hipolipemiante incluyen, pero no se limitan a inhibidores de apoB, estatinas, fibratos e inhibidores de MTP.
Tal como se utiliza en esta memoria, "lipoproteína", tal como VLDL, LDL y HDL, se refiere a un grupo de proteínas que se encuentran en el suero, plasma y linfa y son importantes para el transporte de lípidos. La composición química de cada una de las lipoproteínas difieren, por ejemplo, en que las HDL tienen una mayor proporción de proteínas frente a lípidos, mientras que las VLDL tienen una menor proporción de proteínas que de lípidos.
Tal como se utiliza en esta memoria, "Lp(a)" comprende apo(a) y una partícula de tipo LDL que contiene apoB. La apo(a) está enlazada a la apoB por un enlace disulfuro.
Tal como se utiliza en esta memoria, "colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C)" significa colesterol transportado en partículas de lipoproteínas de baja densidad. La concentración de LDL-C en suero (o plasma) se cuantifica típicamente en mg/dL o nmol/L. "LDL-C en suero" y "LDL-C en plasma" significan LDL-C en suero y plasma, respectivamente.
Tal como se utiliza en esta memoria, "factores de riesgo principales" se refiere a factores que contribuyen a un alto riesgo de una enfermedad o afección particular. En determinadas realizaciones, los principales factores de riesgo de la enfermedad coronaria incluyen, sin limitación, tabaquismo, hipertensión, LDL alto, HDL-C bajo, antecedentes familiares de enfermedad cardíaca coronaria, edad y otros factores descritos en esta memoria.
Tal como se utiliza en esta memoria, "trastorno metabólico" o "enfermedad metabólica" se refiere a una afección caracterizada por una alteración o perturbación en la función metabólica. "Metabólico" y "metabolismo" son términos bien conocidos en la técnica y generalmente incluyen toda la gama de procesos bioquímicos que se producen dentro de un organismo vivo. Los trastornos metabólicos incluyen, pero no se limitan a hiperglucemia, prediabetes, diabetes (tipo 1 y tipo 2), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia debido a diabetes tipo 2.
Tal como se utiliza en esta memoria, "síndrome metabólico" significa una afección caracterizada por una agrupación de factores de riesgo cardiovascular lipídicos y no lipídicos de origen metabólico. En determinadas realizaciones, el síndrome metabólico se identifica por la presencia de cualquiera de los 3 factores siguientes: circunferencia de la cintura mayor que 102 cm en hombres o mayor que 88 cm en mujeres; triglicéridos séricos de al menos 150 mg/dL; HDL-C menos de 40 mg/dL en hombres o menos de 50 mg/dL en mujeres; presión arterial de al menos 130/85 mm de Hg; y glucosa en ayunas de al menos 110 mg/dL. Estos determinantes pueden medirse fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001,285: 2486-2497).
"Administración parenteral" significa la administración mediante inyección o infusión.. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, p. ej., administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.
Tal como se utiliza en esta memoria, "péptido" significa una molécula formada enlazando al menos dos aminoácidos por enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
Tal como se utiliza en esta memoria, "agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido fijado como objetivo a apo(a) es un agente farmacéutico.
Tal como se utiliza en esta memoria, "composición farmacéutica" o "composición" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes activos y un soporte farmacéutico, p. ej., una solución acuosa estéril.
Tal como se utiliza en esta memoria, "derivado farmacéuticamente aceptable" abarca derivados de los compuestos descritos en esta memoria, tales como solvatos, hidratos, ésteres, profármacos, polimorfos, isómeros, variantes marcadas isotópicamente, sales farmacéuticamente aceptables y otros derivados conocidos en la técnica.
Tal como se utiliza en esta memoria, "sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" o "sal" incluye una sal preparada a partir de ácidos o bases no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. "Sales farmacéuticamente aceptables" de los compuestos descritos en esta memoria pueden prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Para una revisión de sales farmacéuticamente aceptables, véase Stahl y Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania 2002). Las sales de sodio de oligonucleótidos antisentido son útiles y están bien aceptadas para la administración terapéutica a seres humanos. Por consiguiente, en una realización, los compuestos descritos en esta memoria están en forma de sal de sodio.
Tal como se utiliza en esta memoria, "parte" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En determinadas realizaciones, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
Tal como se utiliza en esta memoria, "prevenir" o "preveniendo" se refiere a retrasar o prevenir el brote o el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
Tal como se utiliza en esta memoria, "aumentar" significa incrementar en cantidad. Por ejemplo, aumentar los niveles de HDL en plasma significa incrementar la cantidad de HDL en el plasma.
Tal como se utiliza en esta memoria, "reducir" significa disminuir en menor medida, tamaño, cantidad o número. Por ejemplo, reducir los niveles de triglicéridos en el plasma significa disminuir la cantidad de triglicéridos en el plasma.
Tal como se utiliza en esta memoria, "región" o "región diana" se define como una parte del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Por ejemplo, una región diana puede abarcar una 3' UTR, una 5' UTR, un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región definida del ácido nucleico. Las regiones definidas estructuralmente para apo(a) pueden obtenerse mediante el número de acceso de bases de datos de secuencias tales como NCBI. En determinadas realizaciones, una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5 'de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio objetivo 3' de otro segmento diana dentro de la región diana.
Tal como se utiliza en esta memoria, "segundo agente" o "segundo agente terapéutico" significa un agente que puede utilizarse en combinación con un "primer agente". Un segundo agente terapéutico puede incluir, pero no se limita a oligonucleótidos antisentido que fijan como objetivo apo(a) o apoB. Un segundo agente también puede incluir anticuerpos anti-apo(a), inhibidores del péptido apo(a), agentes reductores del colesterol, agentes hipolipemiantes, agentes reductores de glucosa y agentes antiinflamatorios.
Tal como se utiliza en esta memoria, "segmentos" se definen como sub-porciones más pequeñas de regiones dentro de un ácido nucleico. Por ejemplo, un "segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al cual fijan como objetivo uno o más compuestos antisentido. "Sitio diana 5' " se refiere al nucleótido más en 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3' " se refiere al nucleótido más en 3' de un segmento diana. Alternativamente, un "sitio de inicio" puede referirse al nucleótido más en 5' de un segmento diana y un "sitio de parada" se refiere al nucleótido más en 3' de un segmento diana. Un segmento diana también puede comenzar en el "sitio de inicio" de una secuencia y terminar en el "sitio de parada" de otra secuencia.
Tal como se utiliza en esta memoria, "estatina" significa un agente que inhibe la actividad de la HMG-CoA reductasa.
Tal como se utiliza en esta memoria, "administración subcutánea" significa administración justo debajo de la piel.
Tal como se utiliza en esta memoria, "sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
Tal como se utiliza en esta memoria, "síntoma de enfermedad o trastorno cardiovascular" significa un fenómeno que surge de y acompaña a la enfermedad o trastorno cardiovascular y sirve como una indicación del mismo.. Por ejemplo, angina de pecho; dolor en el pecho; dificultad para respirar; palpitaciones debilidad; mareo; náusea; transpiración; taquicardia; bradicardia; arritmia; fibrilación auricular; hinchazón en las extremidades inferiores; cianosis; fatiga; desmayo; entumecimiento de la cara; entumecimiento de las extremidades; claudicación o calambres musculares; hinchazón del abdomen; o fiebre son síntomas de enfermedad o trastorno cardiovascular.
Tal como se utiliza en esta memoria, "fijar como objetivo" o "fijado como objetivo" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
Tal como se utiliza en esta memoria, "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
Tal como se utiliza en esta memoria, "cambio de estilo de vida terapéutico" significa cambios en la dieta y el estilo de vida destinados a reducir la masa de grasa/el tejido adiposo y/o el colesterol. Un cambio de este tipo puede reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad cardíaca y puede incluir recomendaciones para la ingesta dietética de calorías diarias totales, grasas totales, grasas saturadas, grasas poliinsaturadas, grasas monoinsaturadas, hidratos de carbono, proteínas, colesterol, fibra insoluble, así como recomendaciones de actividad física.
Tal como se utiliza en esta memoria, "tratar" o "tratando" se refiere a la administración de un compuesto descrito en esta memoria para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
Tal como se utiliza en esta memoria, "triglicérido" o "TG" significa un lípido o grasa neutra que consiste en glicerol combinado con tres moléculas de ácido graso.
Tal como se utiliza en esta memoria, "diabetes tipo 2" (también conocida como "diabetes mellitus tipo 2", "diabetes mellitus, tipo 2", "diabetes no insulinodependiente", "NIDDM", "diabetes relacionada con la obesidad" o "diabetes de inicio en el adulto") es un trastorno metabólico que se caracteriza principalmente por resistencia a la insulina, deficiencia relativa de insulina e hiperglucemia.
Determinadas Realizaciones de la Divulgación
En determinadas realizaciones, un compuesto comprende un ARNip o un oligonucleótido antisentido fijado como objetivo a la apolipoproteína(a) (apo(a)) conocido en la técnica y un grupo de conjugado descrito en esta memoria. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido fijados como objetivo a apo(a),adecuados para la conjugación, incluyen, pero no se limitan a los descritos en los documentos WO 2013/177468; US 8.673.632; US 7.259.150; y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° US 2004/0242516. En determinadas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia de nucleobases de cualquiera de SEQ ID NOs 12-130, 133, 134 descritas en el documento Wo 2013/177468 y un grupo de conjugado descrito en esta memoria. En determinadas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia de nucleobases de cualquiera de SEQ ID NOs 11-45 y 85-96 descritas en el documento US 8.673.632 y un grupo de conjugado descrito en esta memoria. En determinadas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia de nucleobases de cualquiera de SEQ ID NOs 11-45 descritas en el documento US 7.259.150 y un grupo de conjugado descrito en esta memoria. En determinadas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia de nucleobases de cualquiera de SEQ ID NOs 7-41 descritas en la Publicación de la Solicitud de Patente N° US 2004/0242516 y un grupo de conjugado descrito en esta memoria.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan compuestos y métodos para disminuir la expresión de ARNm de apo(a) y proteínas. En determinadas realizaciones, el compuesto es un inhibidor específico para apo(a) para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada a apo(a). En determinadas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido antisentido que fija como objetivo apo(a). En determinadas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido antisentido que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan compuestos y métodos para disminuir los niveles de Lp(a). En determinadas realizaciones, el compuesto es un inhibidor específico para apo(a) para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada a Lp(a). En determinadas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido antisentido que fija como objetivo apo(a). En determinadas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido antisentido que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo de conjugado consiste en 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, 13 a 25, 14 a 25, 15 a 25 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo de conjugado comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o 30 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo de conjugado consiste en 20 nucleósidos enlazados.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas, complementarias a una parte de igual longitud de cualquiera de SEQ ID Nos: 1-4.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo un segmento de apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas, complementarias a una parte de igual longitud de cualquiera de cualquiera de los segmentos diana mostrados en, por ejemplo, los Ejemplos 114 y 117. En las tablas, el "Sitio de Inicio" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana y "Sitio de Parada" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana. Un segmento diana puede abarcar desde el sitio de inicio hasta el sitio de parada de cada una de las secuencias enumeradas en las tablas. Alternativamente, el segmento diana puede variar desde el sitio de inicio de una secuencia y terminar en el sitio de parada de otra secuencia. Por ejemplo, tal como se muestra en la Tabla 125, un segmento diana puede oscilar entre 3901-3920, el sitio de inicio al sitio de parada de SEQ ID NO: 58. En otro ejemplo, tal como se muestra en la Tabla 125, un segmento diana puede oscilar entre 3900 -3923, el sitio de inicio de Se Q ID NO: 57 al sitio de parada de SEQ ID NO: 61.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% complementaria a cualquiera de SEQ ID NOs: 1-4. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% complementaria a cualquiera de los segmentos diana mostrados, por ejemplo, en los Ejemplos 114 y 117.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y comprende una secuencia de nucleobases que comprende una parte de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o 20 nucleobases contiguas complementarias a una parte de nucleobases 3901 a 3920 de igual longitud de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 80% complementaria a SEQ ID NO: 1.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y comprende una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o 30 nucleobases contiguas complementarias a una parte de nucleobases 3900 a 3923 de igual longitud de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 80% complementaria a SEQ ID NO: 1.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 12­ 130.133, 134. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de una cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NOs: 12-130, 133, 134. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en una cualquiera de SEQ ID NOs: 12-130, 133, 134 y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 12-20, 22-33, 35-44, 47-50, 51, 53, 57-62, 65-66, 68, 70-79, 81, 85-86, 89-90, 92-94, 97, 105-110, 103-104, 133-134. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 12-20, 22-33, 35-44, 47-50, 51, 53, 57-62, 65-66, 68, 70-79, 81, 85-86, 89-90, 92-94, 97, 105-110, 103-104, 133-134 y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 12-19, 26-30, 32, 35, 38-44, 46-47, 50, 57-58, 61, 64-66, 68, 72-74, 76-77, 92-94, 103-110. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 12-19, 26-30, 32, 35, 38-44, 46-47, 50, 57-58, 61, 64-66, 68, 72-74, 76-77, 92-94, 103-110 y un grupo conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 111, 114 -121, 123-129. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 111, 114-121, 123-129 y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 14, 17, 18, 26-28, 39, 71, 106-107. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 14, 17, 18, 26-28, 39, 71, 106-107 y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 14, 26-29, 39-40, 82. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 14, 26-29, 39-40, 82 y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 14, 16-18. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 14, 16-18 y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 26-27, 107. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 26-27, 107 y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 28-29, 39-40, 47. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: : 28-29, 39-40, 47 y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 28, 93, 104, 134. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 28, 93, 104, 134 y un grupo de conjugado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o 20 nucleobases contiguas de cualquiera de la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 58. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado con el grupo de conjugado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 58. En determinadas realizaciones, el compuesto consiste en SEQ ID NO: 58 y un grupo de conjugado.
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido comprende el oligonucleótido ISIS 494372 modificado con un 5'-X, en donde X es un grupo de conjugado que comprende GalNAc tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en el oligonucleótido ISIS 494372 modificado con un 5'-X, en donde X es un grupo de conjugado que comprende GalNAc tal como se define en las reivindicaciones.
Figure imgf000029_0001
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido comprende el oligonucleótido modificado conjugado ISIS 681251. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en el oligonucleótido modificado conjugado ISIS 681251.
Figure imgf000030_0001
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido comprende el oligonudeótido modificado conjugado ISIS 681257. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en el oligonucleótido modificado conjugado ISIS 681257.
Figure imgf000031_0001
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se puede representar mediante la siguiente estructura. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonudeótido modificado con la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 58 con una 5'-GalNAc, tal como se define en las reivindicaciones, con variabilidad en las modificaciones de azúcar de las alas. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido consiste en un oligonucleótido modificado con la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 58 con una 5'-GalNAc, tal como se define en las reivindicaciones, con variabilidad en las modificaciones de azúcar de las alas.
Figure imgf000032_0001
En donde R1 es -OCH2CH2OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente, en donde R1 es -O- y R2 es -CH2-, -CH(CH3)- o -CH2CH2-, y R1 y R2 están conectados directamente de manera que el puente resultante se seleccione de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
y para cada uno de los pares de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada uno de los anillos: R3 se selecciona de H y -OCH2CH2OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es - CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2-y R3 y R4 están conectados directamente de manera que el puente resultante se seleccione de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
y R5 se selecciona de H y -CH3 ;
y Z se selecciona de S' y O'.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado es de cadena sencilla.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico modificado. En determinadas realizaciones, el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato. En determinadas realizaciones, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 enlaces internucleosídicos de dicho oligonucleótido modificado son enlaces internucleósidos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, cada uno de los enlaces internucleosídicos es un enlace internucleosídico fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 enlaces internucleosídicos fosfodiéster. En determinadas realizaciones, cada uno de los enlaces internudeosídicos del oligonucleótido modificado se selecciona de un enlace intemucleosídico fosfodiéster y un enlace intemucleosídico fosforotioato.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada. En determinadas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado comprende al menos un azúcar modificado. En determinadas realizaciones, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En determinadas realizaciones, el azúcar modificado comprende un 2'-O-metoxietilo, un etilo restringido, un 3' fluoro-HNA o un puente 4'-(CH2)n-O-2', en donde n es 1 o 2.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y comprende: (a) un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala en 5' que consiste en nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala en 3' que consiste en nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3' y en donde cada uno de los nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala comprende un azúcar modificado.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y comprende: (a) un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala en 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en donde cada uno de los nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleósido es un enlace fosforotioato y en donde cada uno de los residuos citosina es una 5-metilcitosina.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de SEQ ID Nos: 12-130, 133, 134, en donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala en 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en donde cada uno de los nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleósido es un enlace fosforotioato y en donde cada uno de los residuos citosina es una 5-metilcitosina.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases contiguas de SEQ ID NO: 58, en donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala en 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en donde cada uno de los nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleósido es un enlace fosforotioato y en donde cada uno de los residuos citosina es una 5-metilcitosina.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados con la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 58, en donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados; (b) un segmento de ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; (c) un segmento de ala en 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados; y en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en donde cada uno de los nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleósido es un enlace fosforotioato y en donde cada uno de los residuos citosina es una 5-metilcitosina.
En determinadas realizaciones, el grupo de conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 5' del oligonucleótido modificado. En determinadas realizaciones, el grupo de conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 3' del oligonucleótido modificado.
El grupo de conjugado de la presente invención comprende tres ligandos, en donde cada uno de los ligandos es N-acetil galactosamina.
El grupo de conjugado de la presente invención comprende:
Figure imgf000034_0001
El grupo de conjugado está fijado covalentemente al oligonudeótido modificado.
El compuesto se puede representar mediante la fórmula:
A-B-C-D(E-F)q
en donde:
A es el oligonucleótido modificado;
B es el resto escindible;
C es el enlazador conjugado;
D es el grupo ramificado;
cada uno de los E es una fijación;
cada uno de los F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto tiene una estructura representada por la fórmula:
A-C-D(E-F)q
en donde:
A es el oligonucleótido modificado;
C es el enlazador conjugado;
D es el grupo ramificado;
cada uno de los E es una fijación;
cada uno de los F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
El grupo de conjugado de la presente invención comprende un resto que fija como objetivo células, que comprende:
Figure imgf000034_0002
En determinadas realizaciones, el grupo de conjugado comprende:
Figure imgf000035_0001
en donde Q13 es H u O(CH2)2-OCH3;
A es el oligonucleótido modificado; y
Bx es un resto de base heterocíclico.
En determinadas realizaciones, Bx se selecciona de entre adenina, guanina, timina, uracilo o citosina o 5-metil citosina. En determinadas realizaciones, Bx es adenina. En determinadas realizaciones, Bx es timina. En determinadas realizaciones, Q13 es O(CH2)2-OCH3. En determinadas realizaciones, Q13 es H.
En determinadas realizaciones, el compuesto está en forma de sal. En realizaciones adicionales, el compuesto comprende, además, un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado, o una sal del mismo, y un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una composición que comprende un compuesto antisentido conjugado tal como se describe en esta memoria, en donde el nivel de viscosidad del compuesto es inferior a 40 centipoise (cP). En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados tal como se describen en esta memoria son eficaces en virtud de tener una viscosidad de menos de 40 cP, menos de 35 cP, menos de 30 cP, menos de 25 cP, menos de 20 cP o menos de 15 cP cuando se mide por los parámetros tal como se describe en el Ejemplo 125.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto o composición antisentido conjugado descrito en esta memoria. En determinadas realizaciones, la administración del compuesto antisentido conjugado previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de una enfermedad cardiovascular, metabólica y/o inflamatoria.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para uso en terapia para tratar una enfermedad, trastorno o afección relacionada con la apo(a). Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para uso en terapia para tratar una enfermedad, trastorno o afección relacionada con Lpa), En determinadas realizaciones, los niveles de apo(a) y o Lp(a) son elevados en un animal. En determinadas realizaciones, la composición es un compuesto que comprende un inhibidor específico para apo(a). En determinadas realizaciones, el inhibidor específico de apo (a) es un ácido nucleico. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico es un compuesto antisentido. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a). En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido modificado que fija como objetivo apo(a) y un grupo de conjugado. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado que fija como objetivo apo(a) con el grupo de conjugado se utiliza para tratar, prevenir, ralentizar la progresión, mejorar una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular y/o metabólica. En determinadas realizaciones, las composiciones y los métodos para la terapia incluyen administrar un inhibidor específico para la apo(a) a un individuo que lo necesite.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para reducir los niveles de apo(a). Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan compuestos y métodos para reducir los niveles de Lp(a). En determinadas realizaciones, la reducción de los niveles de apo(a) en un tejido, órgano o sujeto mejora la relación de LDL a HDL o la relación de TG a HDL. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para reducir la expresión de ARNm de apo(a) o proteína en un animal, que comprenden administrar al animal un compuesto o una composición antisentido conjugada descrita en esta memoria para reducir la expresión de ARNm de apo(a) o proteína en el animal. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para reducir los niveles de Lp(a) en un animal, que comprenden administrar al animal un compuesto antisentido conjugado o una composición descrito en esta memoria para reducir la expresión de ARNm de apo(a) o proteína en el animal.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con la apo(a) en un sujeto que lo necesite. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionados con la Lp(a) en un sujeto que lo necesite. En determinadas realizaciones,dichas enfermedades, trastornos y afecciones incluyen enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorios, cardiovasculares y/o metabólicos. Determinadas enfermedades, trastornos o afecciones cardiovasculares incluyen, pero no se limitan a estenosis aórtica, aneurisma (p. ej., aneurisma aórtico abdominal), angina, arritmia, aterosclerosis, enfermedad cerebrovascular, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad cardíaca coronaria, dislipidemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia., hipertensión, hipertrigliceridemia, infarto de miocardio, enfermedad vascular periférica (p. ej., enfermedad arterial periférica, enfermedad oclusiva de la arteria periférica), oclusión vascular retiniana o apoplejía. Determinadas enfermedades, trastornos o afecciones metabólicas de este tipo incluyen, pero no se limitan a hiperglucemia, prediabetes, diabetes (tipo I y tipo II), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia diabética. Determinadas enfermedades, trastornos o afecciones inflamatorias incluyen, pero no se limitan a estenosis aórtica, enfermedad de las arterias coronarias (CAD), enfermedad de Alzheimer y enfermedades, trastornos o afecciones tromboembólicos. Determinadas enfermedades, trastornos o afecciones tromboembólicos incluyen, pero no se limitan a apoplejía, trombosis (p. ej., tromboembolismo venoso), infarto de miocardio y enfermedad vascular periférica. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones y métodos para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar la estenosis aórtica.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un método para reducir al menos un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular. En determinadas realizaciones, los síntomas incluyen, pero no se limitan a angina, dolor de pecho, dificultad para respirar, palpitaciones, debilidad, mareos, náuseas, sudoración, taquicardia, bradicardia, arritmia, fibrilación auricular, hinchazón en las extremidades inferiores, cianosis, fatiga, desmayos, entumecimiento de la cara, entumecimiento de las extremidades, claudicación o calambres musculares, hinchazón del abdomen y fiebre. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un método para reducir al menos un síntoma de estenosis aórtica..
En determinadas realizaciones, la modulación de la expresión de apo(a) o Lp(a) se produce en una célula, tejido u órgano. En determinadas realizaciones, las modulaciones se producen en una célula, tejido u órgano de un animal. En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel de ARNm de apo(a). En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel de proteína apo(a). En determinadas realizaciones, se reducen tanto los niveles de ARNm de apo(a) como de proteína apo(a). En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción del nivel de Lp(a). Una reducción de este tipo puede producirse de una manera dependiente del tiempo o dependiente de la dosis.
En determinadas realizaciones, el sujeto o animal es un ser humano.
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado se administra por vía.parenteral. En realizaciones adicionales, la administración parenteral es subcutánea.
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado o la composición se co-administra con un segundo agente o terapia. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado o la composición y el segundo agente se administran de forma concomitante.
En determinadas realizaciones, el segundo agente es un agente reductor de glucosa. En determinadas realizaciones, el segundo agente es un agente reductor de LDL, TG o colesterol. En determinadas realizaciones, el segundo agente es un agente anti-inflamatorio. En determinadas realizaciones, el segundo agente es un fármaco para la enfermedad de Alzheimer. En determinadas realizaciones, el segundo agente puede ser, pero no se limita a un fármaco antiinflamatorio no esteroide (AINE, p. ej., aspirina), niacina (p. ej., Niaspan), ácido nicotínico, un inhibidor de apoB (p. ej., Mipomersen), un inhibidor de la c Et P (p. ej., Anacetrapib), un inhibidor de apo(a), un análogo de la hormona tiroidea (p. ej., Eprotirome), un inhibidor de la HMG-CoA reductasa (p. ej., una estatina), un fibrato (p. ej., Gemfibrozil) y un inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomal (p. ej., Lomitapide). La terapia puede ser, pero no se limita a aféresis de Lp(a). Los agentes o las terapias pueden co-administrarse o administrarse de forma concomitante. Los agentes o las terapias pueden administrarse secuencial o posteriormente.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a apo(a) para disminuir los niveles de apo(a) en un animal. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a apo(a) para disminuir los niveles de Lp(a) en un animal. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de compuestos antisentido conjugados fijados como objetivo a apo(a) para el tratamiento, la prevención o la mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociado con apo(a). Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de compuestos antisentido conjugados fijados como objetivo a apo(a) para el tratamiento, la prevención o la mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociada con Lp(a).
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a apo(a) en la preparación de un medicamento para disminuir los niveles de apo(a) en un animal. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a apo(a) en la preparación de un medicamento para disminuir los niveles de Lp(a) en un animal. Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto para la preparación de un medicamento para el tratamiento, la prevención o la mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociado con apo(a). Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto antisentido conjugado para la preparación de un medicamento para el tratamiento, la prevención o la mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociada con Lp(a).
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el uso de un compuesto antisentido conjugado tal como se describe en esta memoria en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar, retrasar o prevenir una o más de una enfermedad relacionada con apo(a) y/o Lp(a).
Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un kit para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección tal como se describe en esta memoria, en donde el kit comprende: (i) un inhibidor específico para apo(a) tal como se describe en esta memoria; y, opcionalmente, (ii) un segundo agente o terapia como se describe en esta memoria.
Un kit puede incluir, además, instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, trastorno o afección tal como se describe en esta memoria mediante terapia de combinación como se describe en esta memoria.
B. Determinados Compuestos
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados que comprenden oligonucleótidos antisentido y un conjugado.
a. Determinados Oligonucleótidos Antisentido
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos antisentido. Dichos oligonucleótidos antisentido comprenden nucleósidos enlazados, comprendiendo cada uno de los nucleósidos un resto azúcar y una nucleobase. La estructura de oligonucleótidos antisentido de este tipo puede considerarse en términos de características químicas (p. ej., modificaciones y patrones de modificaciones) y secuencia de nucleobase (p. ej., secuencia de oligonucleótidos antisentido, identidad y secuencia del ácido nucleico diana).
i. Determinadas Características Químicas
El oligonucleótido antisentido comprende una o más modificaciones. En determinadas realizaciones de este tipo, los oligonucleótidos antisentido comprenden uno o más nucleósidos modificados y/o enlaces internucleosídicos modificados. En determinadas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden un resto azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
1. Determinados Restos Azúcar
En determinadas realizaciones, los compuestos de la divulgación comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden un resto azúcar modificado. Compuestos de este tipo que comprenden uno o más nucleósidos modificados con azúcar pueden tener propiedades deseables, tales como estabilidad de nucleasa potenciada o afinidad de unión incrementada con un ácido nucleico diana en relación con un oligonucleótido que comprende solo nucleósidos que comprenden restos azúcar que se producen de forma natural. En determinadas realizaciones,restos azúcar modificados son restos azúcar sustituidos. En determinadas realizaciones,restos azúcar modificados son sustitutos de azúcar. Sustitutos de azúcar de este tipo pueden comprender una o más sustituciones correspondientes a las de restos azúcar sustituidos.
En determinadas realizaciones, los restos azúcar modificados son restos azúcar sustituidos que comprenden uno o más sustituyentes de azúcar que no forman puentes, incluyendo, pero no limitados a sustituyentes en las posiciones 2' y/o 5'. Ejemplos de sustituyentes de azúcar adecuados para la posición 2' incluyen, pero no se limitan a: 2'-F, 2'-OCH3 ("OMe" u "O-metilo"), y 2'-O(CH2)2OCH3 ("MOE"). En determinadas realizaciones, los sustituyentes de azúcar en la posición 2' se selecciona de alilo, amino, azido, tio, O-alilo O-alquilo C1-C10, O-alquilo C1-C10 sustituido; OCF3 , O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en que cada uno de los Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Ejemplos de sustituyentes azúcar en la posición 5' incluyen, pero no se limitan a: 5'-metilo (R o S); 5'-vinilo y 5'-metoxi. En determinadas realizaciones, los azúcares sustituidos comprenden más de un sustituyente de azúcar no puenteante, por ejemplo, restos azúcar 2'-F-5'-metilo (véase, p. ej., la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157, para restos azúcar 5', 2' -bis-sustituidos y nucleósidos adicionales).
A nucleósidos que comprenden restos azúcar 2'-sustituidos se les alude como nucleósidos 2'-sustituidos. En determinadas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido comprende un grupo 2'-sustituyente seleccionado de halo, alilo, amino, azido, SH, CN, OCN, CF3 , OCF3 , O, S o N(Rm)-alquilo; O, S o N(Rm)-alquenilo; O, S o N(Rm)-alquinilo; O-alquilenil-O-alquilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-aralquilo, O(CH2)2SCH3 , O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en que cada uno de los Rm y Rn es, independientemente, H, un grupo protector amino o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Estos grupos 2'-sustituyentes pueden estar sustituidos adicionalmente con uno o más grupos sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro (NO2), tiol, tioalcoxi (S-alquilo), halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.
En determinadas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido comprende un grupo 2'-sustituyente seleccionado de F, NH2 , N3 , OCF3 , O-CH3 , O(CH2)3NH2 , CH2-CH=CH2 , O-CH2-CH=CH2 , OCH2CH2OCH3 , O(CH2)2SCH3 , O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O(CH2)2O(CH2)2N(c H3)2 y acetamida N-sustituida (O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en que cada uno de Rm y Rn es, independientemente, H, un grupo protector amino o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
En determinadas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido comprende un resto azúcar que comprende un grupo 2'-sustituyente seleccionado de F, OCF3 , O-CH3, OCH2CH2OCH3 , O(CH2)2SCH3 , O-(CH2)2-ON(CH3)2, -O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2 y O-CH2-C(=O)-N(H)CH3.
En determinadas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido comprende un resto azúcar que comprende un grupo 2'-sustituyente seleccionado de F, O-CH3 y OCH2CH2OCH3.
Determinados restos azúcar modificados comprenden un sustituyente de azúcar puente que forma un segundo anillo que da como resultado un resto azúcar bicíclico. En determinadas realizaciones de este tipo, el resto azúcar bicíclico comprende un puente entre los átomos del anillo de furanosa 4' y 2'. Ejemplos de sustituyentes azúcar 4' a 2' de este tipo incluyen, pero no se limitan a: -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-; 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2',. 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', y análogos de los mismos (véase, p. ej., Patente de EE.UU. 7.399.845, expedida el 15 de julio de, 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' y análogos del mismo, (véase, p. ej., documento WO2009/006478, publicado el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-n (o CH3)-2' y análogos del mismo (véase, p. ej., documento WO2008/150729, publicado el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-On (Ch 3)-2' (véase, p. ej., documento US2004/0171570, publicado el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-n (r )-0-2'-, en donde cada uno de los R es, independientemente, H, un grupo protector amino o alquilo C1-C12; 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C1-C12 o un grupo protector (véase Patente de EE.UU. 7.427.672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase, p. ej., Chattopadhyaya, et al., J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' y análogos del mismo (véase Solicitud Internacional PCT publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
En determinadas realizaciones, puentes 4' a 2' de este tipo comprenden independientemente de 1 a 4 grupos con enlaces seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, - Si(Ra)2-, -S(=O)x- y -N(Ra)-;
en donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada uno de los Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7 , radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2 , SJ1, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada uno de J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20 arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
A los nucleósidos que comprenden restos azúcar bicíclicos se les alude como nucleósidos bicíclicos o BNAs. Los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA (al que también se alude como ácido nucleico bloqueado o LNA), (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA (al que también se alude como etilo restringido o cEt), (G) metilentio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(r )-2') BNA, (I) metilo carbocíclcico (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA y (J) propileno carbocíclcico (4'-(CH2)3-2') BNA tal como se representa más abajo
Figure imgf000039_0001
en donde Bx es un resto de nucleobase y R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
Se conocen en la técnica restos azúcar bicídicos adicionales, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035­ 10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (4 de julio de 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001,2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes de EE.UU. N°s 7.053.207, 6.268.490, 6.770.748, 6.794.499, 7.034.133, 6.525.191, 6.670.461 y 7.399.845; documentos WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570 y WO 2007/134181; Publicaciones de Patente de EE.UU. N°s US2004/0171570, US2007/0287831 y US2008/0039618; Patentes de EE.UU. N°s de Serie 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787 y 61/099,844; y Publicaciones Internacionales PCT N°s WO/2008/150729, WO/2008/154401 y WO/2009/006478.
En determinadas realizaciones, los restos azúcar bicíclicos y los nucleósidos que incorporan dichos restos azúcar bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2' metilen-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, nucleósidos bicíclicos a-L-metilenoxi (4-CH2-O-2') se han incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
En determinadas realizaciones, los restos azúcar sustituidos comprenden uno o más sustituyentes de azúcar no puenteantes y uno o más sustituyentes de azúcar puenteantes (p. ej., azúcares 5'-sustituidos) y azúcares 4'-2' puenteados) (véasela Publicación Internacional PCT WO 2007/134181), publicado el 22/11/07, en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
En determinadas realizaciones,restos azúcar modificados son sustitutos de azúcar. En determinadas realizaciones de este tipo, el átomo de oxígeno del azúcar que se produce de forma natural está sustituido, p. ej., con un átomo de azufre, carbono o nitrógeno. En determinadas realizaciones de este tipo, dicho resto azúcar modificado también comprende sustituyentes puenteantes y/o no puenteantes tal como se describió arriba. Por ejemplo, determinados sustitutos de azúcar comprenden un átomo de azufre 4' y una sustitución en la posición 2' (véase, p. ej., la Solicitud de Patente de EE.UU. publicada US2005/0130923, publicada el 16 de junio de 2005) y/o la posición 5'. A modo de ejemplo adicional, se han descrito nucleósidos carbocíclicos bicíclicos que tienen un puente 4'-2' (véase, p. ej., Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71,7731-7740).
En determinadas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos distintos de 5 átomos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un sustituto de azúcar comprende un morfolino. Compuestos morfolino y su uso en compuestos oligoméricos se han reseñado en numerosas patentes y artículos publicados (véase, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; y Patentes de EE.UU. 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444 y 5.034.506). Tal como se utiliza aquí, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000040_0001
En determinadas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando diversos grupos sustituyentes de la estructura morfolino anterior. A sustitutos de azúcar de este tipo se les alude en esta memoria como "morfolinos modificados".
Para otro ejemplo, en determinadas realizaciones, un sustituto de azúcar comprende un tetrahidropirano de seis miembros. Tetrahidropiranos de este tipo pueden modificarse o sustituirse adicionalmente. Los nucleósidos que comprenden tales tetrahidropiranos modificados incluyen, pero no se limitan a ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico anitol (ANA), ácido nucleico manitol (MNA) (véase Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10 : 841-854), fluoro HNA (F-HNA) y aquellos compuestos que tienen la Fórmula VI:
Figure imgf000040_0002
VI
en donde independientemente para cada uno de dicho al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VI:
Bx es un resto de nucleobase;
T 3 y T4 son, cada uno independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo nucleosídico de tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo de conjugado enlazado o un grupo terminal 5' o 3';
q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 , alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y
cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente de entre hidrógeno, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2 , SJ1, N3 , OC(=X)J1, OC(=X)NJJ2 , NJ3C(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1, y cada uno de J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En determinadas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos THP modificados de Fórmula VI, en donde q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son, cada uno, H. En determinadas realizaciones, al menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En determinadas realizaciones a, menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo.
En determinadas realizaciones se proporcionan nucleósidos de THP de Fórmula VI, en donde uno de R1 y R2 es F. En determinadas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H, R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos sustitutos de biciclo y triciclo de azúcar que pueden utilizarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (véase, p. ej., artículo de revisión: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, tales como nucleósidos 2'-F-5'-metilo sustituidos (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5', 2'-bis sustituidos descritos) y reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y sustitución adicional en la posición 2' (véase la Solicitud de Patente de EE.UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (véase la Solicitud Internacional PCT W o 2007/134181, publicada el 22/11/07, en donde un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2' está sustituido adicionalmente en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (véase, p. ej., Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos que comprenden nucleósidos modificados. Esos nucleótidos modificados pueden incluir azúcares modificados, nucleobases modificadas y/o enlaces modificados. Las modificaciones específicas se seleccionan de manera que los oligonucleótidos resultantes posean características deseables. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleósidos de tipo ARN. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleósidos de tipo ADN.
2. Determinadas Modificaciones de Nucleobases
En determinadas realizaciones, los nucleósidos de la presente divulgación comprenden una o más nucleobases no modificadas. En determinadas realizaciones, los nucleósidos de la presente divulgación comprenden una o más nucleobases modificadas.
En determinadas realizaciones, las nucleobases modificadas se seleccionan de: bases universales, bases hidrofóbicas, bases promiscuas, bases expandidas por tamaño y bases fluoradas tal como se definen en esta memoria. Pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo; 5-propinilcitosina; 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina, 3-deazaguanina y 3-deazaadenina, bases universales, bases hidrofóbicas, bases promiscuas, bases expandidas por tamaño y bases fluoradas, tal como se definen en esta memoria. Bases nucleicas modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas, tales como fenoxazina citidina ([5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4 ]benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas G, tales como una fenoxazina citidina sustituida (p. ej., 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza por otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen las descritas en la Patente estadounidense N° 3.687.808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; las descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; y las descritas por Sanghvi, Y.S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T. y Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993,273-288.
Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas arriba indicadas, así como otras nucleobases modificadas incluyen, sin limitación, U.S. 3.687.808; 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.681.941; 5.750.692; 5.763.588; 5.830.653 y 6.005.096.
3. Determinados Enlaces Internucleosídicos
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos que comprenden nucleósidos enlazados. En tales realizaciones, los nucleósidos pueden enlazarse entre sí utilizando cualquier enlace internucleosídico. Las dos clases principales de grupos de enlace internucleosídico se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a fosfodiésteres (PO), fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos (PS). Grupos de enlace internucleosídicos representativos que no contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, metilenmetilimino (-CH2-N(CHa)-O-CH2-), tiodiéster (-OC(O)-S-), tionocarbamato (-OC(O)(NH)-S-); siloxano (-O-Si(H)2-O-); y N,N'-dimetilhidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Los enlaces modificados, en comparación con los enlaces fosfodiéster naturales, se pueden utilizar para alterar, típicamente incrementar, la resistencia a nucleasas del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, los enlaces internucleosídicos que tienen un átomo quiral se pueden preparar como una mezcla racémica o como enantiómeros separados. Enlaces quirales representativos incluyen, pero no se limitan a alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces internucleosídicos que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los oligonucleótidos descritos en esta memoria contienen uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, dan lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras configuraciones estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R) o (S), a o b, tal como para anómeros de azúcares, o como (D) o (L), tales como para aminoácidos, etc. Incluidos en los compuestos antisentido proporcionados en esta memoria están todos estos posibles isómeros, así como sus formas racémicas y ópticamente puras.
Enlaces internucleosídicos neutros incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), amida-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), amida-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5') y tioformacetal (3'-S-CH2-O-5 '). Enlaces internucleosídicos neutros adicionales incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (Véase, por ejemplo: Carbohydrate Modifications en Antisense Research; Y.S. Sanghvi y P.D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, 40-65). Enlaces intemudeosídicos neutros adicionales incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
4. Determinados Motivos
En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido comprenden uno o más nucleósidos modificados (p. ej., nucleósidos que comprenden un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada) y/o uno o más enlaces internucleosídicos modificados. Al patrón de este tipo de modificaciones en un oligonucleótido se le alude en esta memoria como un motivo. En determinadas realizaciones, los motivos de azúcares, nucleobases y enlace son independientes entre sí.
a. Determinados motivos de azúcares
En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más tipos de restos azúcar modificados y/o restos azúcar que se producen de forma natural dispuestos a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Motivos de este tipo pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcares comentadas en esta memoria y/u otras modificaciones de azúcares conocidas.
En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una región que tiene un motivo de azúcar gapmero, que comprende dos regiones externas o "alas" y una región central o interna o "hueco". Las tres regiones de un motivo de azúcar gapmero (el ala 5', el hueco y el ala 3') forman una secuencia contigua de nucleósidos en la que al menos algunos de los restos azúcar de los nucleósidos de cada una de las alas difieren de al menos algunos de los restos de azúcar de los nucleósidos del hueco. Específicamente, al menos los restos de azúcar de los nucleósidos de cada una de las alas que están más cerca del hueco (el nucleósido más 3' del ala 5' y el nucleósido más 5' del ala 3') difieren del resto azúcar de los nucleósidos del hueco vecinos, definiendo así el límite entre las alas y el hueco. En determinadas realizaciones, los restos azúcar dentro del hueco son iguales entre sí.. En determinadas realizaciones, el hueco incluye uno o más nucleósidos que tienen un resto azúcar que difiere del resto azúcar de uno o más de otros nucleósidos del hueco. En determinadas realizaciones, los motivos de azúcar de las dos alas son iguales entre sí (gapmero de azúcar simétrico). En determinadas realizaciones, los motivos de azúcar del ala 5' difieren del motivo de azúcar del ala 3' (gapmero asimétrico de azúcar).
i. Determinadas alas 5'
En determinadas realizaciones, el ala 5 'de un gapmero consiste en 1 a 8 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 1 a 7 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 1 a 6 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 1 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 2 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 3 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 4 o 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 1 a 4 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 1 a 3 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 1 a 2 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 2 a 4 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 2 o 3 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 3 o 4 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 1 nucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 2 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 3 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 4 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero consiste en 6 nucleósidos enlazados.
En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos dos nucleósidos bicíclicos. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos tres nucleósidos bicíclicos. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos cuatro nucleósidos bicíclicos. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 5' de un gapmero es un nucleósido bicíclico. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 5' de un gapmero es un nucleósido de etilo restringido. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 5' de un gapmero es un nucleósido de LNA.
En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido 2'-sustituido. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de 2'-MOE. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 5' de un gapmero es un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 5' de un gapmero es un nucleósido 2'-sustituido. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 5' de un gapmero es un nucleósido de 2'-MOE. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 5' de un gapmero es un nucleósido de 2'-OMe.
En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 5' de un gapmero es un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un ribonucleósido. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 5' de un gapmero es un ribonucleósido. En determinadas realizaciones, uno, más de uno o cada uno de los nucleósidos del ala 5' es un nucleósido de tipo ARN.
En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido.
En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas realizaciones, el ala 5' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un 2'-desoxinucleósido.
ii. Determinadas alas 3'
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 1 a 8 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 1 a 7 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 1 a 6 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 1 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 2 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 3 a 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 4 o 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 1 a 4 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 1 a 3 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 1 o 2 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 2 a 4 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 2 o 3 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 3 o 4 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 1 nucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 2 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 3 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 4 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 5 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero consiste en 6 nucleósidos enlazados.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 3' de un gapmero es un nucleósido bicíclico. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 3' de un gapmero es un nucleósido de etilo restringido. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 3' de un gapmero es un nucleósido de LNA.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos dos nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos tres nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos cuatro nucleósidos modificados no bicíclicos. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido 2'-sustituido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de 2'-MOE. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 3' de un gapmero es un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 3' de un gapmero es un nucleósido 2'-sustituido. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 3' de un gapmero es un nucleósido de 2'-MOE. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 3' de un gapmero es un nucleósido de 2'-OMe.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 3' de un gapmero es un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un ribonudeósido. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del ala 3' de un gapmero es un ribonucleósido. En determinadas realizaciones, uno, más de uno o cada uno de los nucleósidos del ala 5' es un nucleósido de tipo ARN.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido y al menos un 2'-desoxinucleósido.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido 2'-MOE. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido 2'-OMe. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA y al menos un 2'-desoxinucleósido.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico, al menos un nucleósido modificado no bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido, al menos un nucleósido modificado no bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA, al menos un nucleósido modificado no bicíclico y al menos un 2'-desoxinucleósido.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico, al menos un nucleósido 2'-sustituido y al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido, al menos un nucleósido 2'-sustituido y al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA, al menos un nucleósido 2'-sustituido y al menos un 2'-desoxinucleósido.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico, al menos un nucleósido 2'-MOE y al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido, al menos un nucleósido 2'-MOE y al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA, al menos un nucleósido 2'-OMe y al menos un 2'-desoxinucleósido.
En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido bicíclico, al menos un nucleósido 2'-OMe y al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de etilo restringido, al menos un nucleósido 2'-OMe y al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el ala 3' de un gapmero comprende al menos un nucleósido de LNA, al menos un nucleósido 2'-OMe y al menos un 2'-desoxinucleósido.
iii. Determinadas Regiones Centrales (huecos)
En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 6 a 20 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 6 a 15 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 6 a 12 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 6 a 10 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 6 a 9 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 6 a 8 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 6 o 7 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 7 a 10 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 7 a 9 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 7 o 8 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 8 a 10 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 8 o 9 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 6 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 7 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 8 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 9 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 10 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 11 nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, el hueco de un gapmero consiste en 12 nucleósidos enlazados.
En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del hueco de un gapmero es un 2'-desoxinucleósido. En determinadas realizaciones, el hueco comprende uno o más nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, cada uno de los nucleósidos del hueco de un gapmero es un 2'-desoxinucleósido o es un nucleósido modificado que es "similar a ADN". En realizaciones de este tipo, "similar a ADN" significa que el nucleósido tiene características similares al ADN, de modo que un dúplex que comprende el gapmero y una molécula de ARN es capaz de activar la RNasa H. Por ejemplo, bajo determinadas condiciones, 2 '-(ara)-F ha demostrado que apoya la activación de RNasa H y, por lo tanto, es similar a ADN. En determinadas realizaciones, uno o más nucleósidos del hueco de un gapmero no es un 2'-desoxinucleósido y no es similar a ADN. En determinadas realizaciones de este tipo, el gapmero soporta no obstante la activación de RNasa H (p. ej., en virtud del número o ubicación de los nucleósidos que no son ADN).
En determinadas realizaciones, los huecos comprenden un tramo de 2'-desoxinucleósido no modificado interrumpido por uno o más nucleósidos modificados, dando por lo tanto como resultado tres sub-regiones (dos tramos de uno o más 2'-desoxinucleósidos y un tramo de uno o más nucleósidos modificados de interrupción). En determinadas realizaciones, ningún tramo de 2'-desoxinucleósidos no modificado tiene más de 5, 6 o 7 nucleósidos. En determinadas realizaciones, estos tramos cortos se consiguen utilizando regiones de huecos cortos. En determinadas realizaciones, estos tramos cortos se consiguen interrumpiendo una región de hueco más larga.
En determinadas realizaciones, el hueco comprende uno o más nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, el hueco comprende uno o más nucleósidos modificados, seleccionados de entre cEt, FHNA, LNA y 2-tio-timidina. En determinadas realizaciones, el hueco comprende un nucleósido modificado. En determinadas realizaciones, el hueco comprende un resto azúcar 5'-sustituido seleccionado entre 5'-Me y 5-(R>Me. En determinadas realizaciones, el hueco comprende dos nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, el hueco comprende tres nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, el hueco comprende cuatro nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, el hueco comprende dos o más nucleósidos modificados, y cada uno de los nucleósidos modificados es el mismo. En determinadas realizaciones, el hueco comprende dos o más nucleósidos modificados, y cada uno de los nucleósidos modificados es diferente.
En determinadas realizaciones, el hueco comprende uno o más enlaces modificados. En determinadas realizaciones, el hueco comprende uno o más enlaces metilfosfonato. En determinadas realizaciones, el hueco comprende dos o más enlaces modificados. En determinadas realizaciones, el hueco comprende uno o más enlaces modificados, y uno o más nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, el hueco comprende un enlace modificado y un nucleósido modificado. En determinadas realizaciones, el hueco comprende dos enlaces modificados y.dos o más nucleósidos modificados.
b. Determinados Motivos de Enlace Internucleosídicos
En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleosídico modificado. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos de la presente divulgación comprenden una región de enlaces internucleosídicos modificados uniformemente. En determinadas realizaciones de este tipo, el oligonucleótido comprende una región que está enlazada uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido está enlazado uniformemente mediante enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, cada uno de los enlaces internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En determinadas realizaciones, cada uno de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y al menos un enlace internucleósido es fosforotioato.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 7 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 9 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 11 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 13 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 14 enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 7 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 8 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 9 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 10 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el al menos un bloque de este tipo está situado en el extremo 3' del oligonucleótido. En determinadas realizaciones de este tipo, el al menos un bloque de este tipo está situado dentro de 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 15 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 14 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 13 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 12 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 11 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 10 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 9 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 8 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 7 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 6 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende menos de 5 enlaces intemucleosídicos de fosforotioato.
c. Determinados Motivos de Modificación de Nucleobases
En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden modificaciones químicas a nucleobases dispuestas a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de nucleobases. En determinadas realizaciones de este tipo, las modificaciones de las nucleobases se disponen en un motivo con huecos. En determinadas realizaciones, las modificaciones de las nucleobases se disponen en un motivo alternante. En determinadas realizaciones, cada una de las nucleobases está modificada. En determinadas realizaciones, ninguna de las nucleobases está químicamente modificada.
En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden un bloque de nucleobases modificadas. En determinadas realizaciones de este tipo, el bloque se encuentra en el extremo 3' del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, el bloque está dentro de 3 nucleótidos del extremo 3' del oligonucleótido. En determinadas realizaciones de este tipo, el bloque está en el extremo 5' del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, el bloque está dentro de 3 nucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido.
En determinadas realizaciones, las modificaciones de las nucleobases son una función de la base natural en una posición particular de un oligonucleótido. Por ejemplo, en determinadas realizaciones cada una de las purinas o cada una de las pirimidinas en un oligonucleótido está modificada. En determinadas realizaciones, cada una de las adeninas está modificada. En determinadas realizaciones, cada una de las guaninas está modificada. En determinadas realizaciones, cada una de las timinas está modificada. En determinadas realizaciones, cada una de las citosinas está modificada. En determinadas realizaciones, cada una de los uracilos está modificado.
En determinadas realizaciones, algunos, todos o ninguno de los restos citosina en un oligonucleótido son restos de 5-metil citosina. En esta memoria, la 5-metil citosina no es una "nucleobase modificada". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, las nucleobases no modificadas incluyen tanto residuos citosina que tienen un 5-metilo como aquellos que carecen de un 5-metilo. En determinadas realizaciones, está especificado el estado de metilación de todas o algunas nucleobases de citosina.
En determinadas realizaciones, las modificaciones químicas de las nucleobases comprenden la unión de determinados grupos conjugados a las nucleobases. En determinadas realizaciones, cada una de las purinas o cada una de las pirimidinas en un oligonucleótido puede modificarse opcionalmente para comprender un grupo de conjugado.
d. Determinadas Longitudes Globales
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos de cualquiera de una diversidad de intervalos de longitudes. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos consisten en nucleósidos enlazados de X a Y, en que X representa el menor número de nucleósidos en el intervalo e Y representa el mayor número de nucleósidos en el intervalo. En determinadas realizaciones de este tipo, X e Y se seleccionan, cada uno independientemente, de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, y 50; con la condición de que X<Y. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el oligonucleótido puede consistir en 8 a 9, 8 a 10, 8 a 11, 8 a 12, 8 a 13, 8 a 14, 8 a 15, 8 a 16, 8 a 17, 8 a 18, 8 a 19, 8 a 20, 8 a 21, 8 a 22, 8 a 23, 8 a 24, 8 a 25, 8 a 26, 8 a 27, 8 a 28, 8 a 29, 8 a 30, 9 a 10, 9 a 11, 9 a 12, 9 a 13, 9 a 14, 9 a 15, 9 a 16, 9 a 17, 9 a 18, 9 a 19, 9 a 20, 9 a 21, 9 a 22, 9 a 23, 9 a 24, 9 a 25, 9 a 26, 9 a 27, 9 a 28, 9 a 29, 9 a 30, 10 a 11, 10 a 12, 10 a 13, 10 a 14, 10 a 15, 10 a 16, 10 a 17, 10 a 18, 10 a 19, 10 a 20, 10 a 21, 10 a 22, 10 a 23, 10 a 24, 10 a 25, 10 a 26, 10 a 27, 10 a 28, 10 a 29, 10 a 30, 11 a 12, 11 a 13, 11 a 14, 11 a 15, 11 a 16, 11 a 17, 11 a 18, 11 a 19, 11 a 20, 11 a 21, 11 a 22, 11 a 23, 11 a 24, 11 a 25, 11 a 26, 11 a 27, 11 a 28, 11 a 29, 11 a 30, 12 a 13, 12 a 14, 12 a 15, 12 a 16, 12 a 17, 12 a 18, 12 a 19, 12 a 20, 12 a 21, 12 a 22, 12 a 23, 12 a 24, 12 a 25, 12 a 26, 12 a 27, 12 a 28, 12 a 29, 12 a 30, 13 a 14, 13 a 15, 13 a 16, 13 a 17, 13 a 18, 13 a 19, 13 a 20, 13 a 21, 13 a 22, 13 a 23, 13 a 24, 13 a 25, 13 a 26, 13 a 27, 13 a 28, 13 a 29, 13 a 30, 14 a 15, 14 a 16, 14 a 17, 14 a 18, 14 a 19, 14 a 20, 14 a 21, 14 a 22, 14 a 23, 14 a 24, 14 a 25, 14 a 26, 14 a 27, 14 a 28, 14 a 29, 14 a 30, 15 a 16, 15 a 17, 15 a 18, 15 a 19, 15 a 20, 15 a 21, 15 a 22, 15 a 23, 15 a 24, 15 a 25, 15 a 26, 15 a 27, 15 a 28, 15 a 29, 15 a 30, 16 a 17, 16 a 18, 16 a 19, 16 a 20, 16 a 21, 16 a 22, 16 a 23, 16 a 24, 16 a 25, 16 a 26, 16 a 27, 16 a 28, 16 a 29, 16 a 30, 17 a 18, 17 a 19, 17 a 20, 17 a 21, 17 a 22, 17 a 23, 17 a 24, 17 a 25, 17 a 26, 17 a 27, 17 a 28, 17 a 29, 17 a 30, 18 a 19, 18 a 20, 18 a 21, 18 a 22, 18 a 23, 18 a 24, 18 a 25, 18 a 26, 18 a 27, 18 a 28, 18 a 29, 18 a 30, 19 a 20, 19 a 21, 19 a 22, 19 a 23, 19 a 24, 19 a 25, 19 a 26, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 29, 19 a 30, 20 a 21, 20 a 22, 20 a 23, 20 a 24, 20 a 25, 20 a 26, 20 a 27, 20 a 28, 20 a 29, 20 a 30, 21 a 22, 21 a 23, 21 a 24, 21 a 25, 21 a 26, 21 a 27, 21 a 28, 21 a 29, 21 a 30, 22 a 23, 22 a 24, 22 a 25, 22 a 26, 22 a 27, 22 a 28, 22 a 29, 22 a 30, 23 a 24, 23 a 25, 23 a 26, 23 a 27, 23 a 28, 23 a 29, 23 a 30, 24 a 25, 24 a 26, 24 a 27, 24 a 28, 24 a 29, 24 a 30, 25 a 26, 25 a 27, 25 a 28, 25 a 29, 25 a 30, 26 a 27, 26 a 28, 26 a 29, 26 a 30, 27 a 28, 27 a 29, 27 a 30, 28 a 29, 28 a 30 o 29 a 30 nucleósidos enlazados. En realizaciones en donde el número de nucleósidos de un oligonucleótido de un compuesto está limitado, ya sea a un intervalo o a un número específico, el compuesto puede, no obstante, comprender, además, otros sustituyentes adicionales. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende 8-30 nucleósidos excluye los oligonucleótidos que tienen 31 nucleósidos, pero, a menos que se indique lo contrario, un oligonucleótido de este tipo puede comprender, además, por ejemplo, uno o más grupos conjugados, grupos terminales u otros sustituyentes.
Además, cuando un oligonucleótido se describe por un intervalo de longitudes global y por regiones que tienen longitudes especificadas, y en que la suma de longitudes especificadas de las regiones es menor que el límite superior del intervalo de longitudes global, el oligonucleótido puede tener nucleósidos adicionales, más allá de los de las regiones especificadas, siempre que el número total de nucleósidos no exceda el límite superior del intervalo de longitudes global.
5. Determinados Motivos de la Química de Oligonucleótidos Antisentido
En determinadas realizaciones, las características estructurales químicas de los oligonucleótidos antisentido se caracterizan por su motivo de azúcar, motivo de enlace internucleosídico, motivo de modificación de nucleobases y longitud global. En determinadas realizaciones, dichos parámetros son independientes entre sí. Por lo tanto, cada uno de los enlaces internucleosídicos de un oligonucleótido que tiene un motivo de azúcar gapmero puede estar modificado o no modificado y puede seguir o no el patrón de modificación gapmero de las modificaciones de azúcar. Por lo tanto, los enlaces internucleosídicos dentro de las regiones de ala de un azúcar-gapmero pueden ser iguales o diferentes entre sí y pueden ser iguales o diferentes de los enlaces internucleosídicos de la región de hueco. Asimismo, oligonucleótidos de azúcar-gapmero de este tipo pueden comprender una o más nucleobases modificada independientemente del patrón del gapmero de las modificaciones del azúcar. Un experto en la técnica apreciará que este tipo de motivos puede combinarse para crear una diversidad de oligonucleótidos.
En determinadas realizaciones, la selección del enlace internucleosídico y la modificación de nucleósidos no son independientes entre sí.
i. Determinadas Secuencias y Dianas
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos antisentido que tienen una secuencia complementaria a un ácido nucleico diana.. Compuestos antisentido de este tipo son capaces de hibridarse a un ácido nucleico diana, dando como resultado al menos una actividad antisentido. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido se hibridan específicamente a uno o más ácidos nucleicos diana. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido que se hibrida específicamente tiene una secuencia de nucleobases que comprende una región que tiene suficiente complementariedad con un ácido nucleico diana para permitir la hibridación y dar como resultado una actividad antisentido y una complementariedad insuficiente con cualquier no diana para evitar o reducir la hibridación no específica a secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea una hibridación específica (p. ej., en condiciones fisiológicas para usos in vivo o terapéuticos, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro). En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son selectivos entre una diana y una no diana, incluso aunque tanto la diana como la no diana comprenden la secuencia diana. En realizaciones de este tipo, la selectividad puede resultar de la accesibilidad relativa de la región diana de una molécula de ácido nucleico en comparación con la otra.
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido que comprenden oligonucleótidos que son completamente complementarios al ácido nucleico diana en toda la longitud del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son complementarios en un 99% al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son complementarios en un 95% al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, oligonucleótidos de este tipo son complementarios en un 90% al ácido nucleico diana.
En determinadas realizaciones, oligonucleótidos de este tipo son complementarios en un 85% al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, oligonucleótidos de este tipo son complementarios en un 80% al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido comprende una región que es completamente complementaria a un ácido nucleico diana y es al menos un 80% complementaria al ácido nucleico diana en toda la longitud del oligonucleótido. En determinadas realizaciones de este tipo, la región de complementariedad completa tiene una longitud de 6 a 14 nucleobases.
En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de hibridación y una región terminal. En determinadas realizaciones de este tipo, la región de hibridación consiste en 12-30 nucleósidos enlazados y es completamente complementaria al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la región de hibridación incluye un emparejamiento erróneo con respecto al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la región de hibridación incluye dos emparejamientos erróneos con respecto al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la región de hibridación incluye tres emparejamientos erróneos con respecto al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la región terminal consiste en 1-4 nucleósidos terminales. En Determinadas realizaciones, los nucleósidos terminales están en el extremo 3'. En determinadas realizaciones, uno o más de los nucleósidos terminales no son complementarios del ácido nucleico diana.
Mecanismos antisentido incluyen cualquier mecanismo que implique la hibridación de un oligonucleótido con un ácido nucleico diana, en donde la hibridación da como resultado un efecto biológico. En determinadas realizaciones, una hibridación de este tipo da como resultado la degradación o la ocupación del ácido nucleico diana con inhibición o estimulación concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, traducción, transcripción o corte y empalme del ácido nucleico diana.
Un tipo de mecanismo antisentido que implica la degradación del ARN diana es el antisentido mediado por RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena sencilla que son "similares a ADN" provocan actividad de RNasa H en células de mamífero. La activación de la RNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión del ARN diana, mejorando con ello en gran medida la eficacia de la inhibición de la expresión génica mediada por oligonucleótidos similares a ADN.
En determinadas realizaciones, un grupo de conjugado comprende un resto escindible. En determinadas realizaciones, un grupo de conjugado comprende uno o más enlaces escindibles. En determinadas realizaciones, un grupo de conjugado comprende un enlazador. En determinadas realizaciones, un enlazador comprende un resto de unión a proteínas. En determinadas realizaciones, un grupo de conjugado comprende un resto que fija como objetivo una célula (al que también se alude como grupo que fija como objetivo una célula). En determinadas realizaciones, un resto que fija como objetivo una célula comprende un grupo de ramificación. En determinadas realizaciones, un resto que fija como objetivo una célula comprende una o más fijaciones. En determinadas realizaciones, un resto que fija como objetivo una célula comprende un hidrato de carbono o racimo de hidratos de carbono.
ii. Determinados Restos Escindibles
En determinadas realizaciones, un resto escindible es un enlace escindible. En determinadas realizaciones, un resto escindible es un enlace escindible. En determinadas realizaciones, el grupo de conjugado comprende un resto escindible. En determinadas realizaciones, el resto escindible se fija al oligonucleótido antisentido. En determinadas realizaciones de este tipo, el resto escindible se fija directamente al resto que fija como objetivo una célula. En determinadas realizaciones de este tipo, el resto escindible se fija al enlazador de conjugado. En determinadas realizaciones, el resto escindible comprende un fosfato o fosfodiéster. En determinadas realizaciones, el resto escindible es un nucleósido o análogo de nucleósido escindible. En determinadas realizaciones, el nucleósido o análogo de nucleósido comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de una purina, purina sustituida, pirimidina o pirimidina sustituida. En determinadas realizaciones, el resto escindible es un nucleósido que comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina y 2-N-isobutirilguanina. En determinadas realizaciones, el resto escindible es 2'-desoxi nucleósido que está fijado a la posición 3' del oligonucleótido antisentido mediante un enlace fosfodiéster y está fijado al enlazador mediante un enlace fosfodiéster o fosforotioato. En determinadas realizaciones, el resto escindible es 2'-desoxi nucleósido que está fijado a la posición 3' del oligonucleótido antisentido mediante un enlace fosfodiéster y está fijado al enlazador mediante un enlace fosfodiéster o fosforotioato. En determinadas realizaciones, el resto escindible es 2'-desoxi nucleósido que está fijado a la posición 3' del oligonucleótido antisentido mediante un enlace fosfodiéster y está fijado al enlazador mediante un enlace fosfodiéster.
En determinadas realizaciones, el resto escindible está fijado a la posición 3' del oligonucleótido antisentido. En determinadas realizaciones, el resto escindible está fijado a la posición 5' del oligonucleótido antisentido. En determinadas realizaciones, el resto escindible está fijado a la posición 2' del oligonucleótido antisentido. En determinadas realizaciones, el resto escindible está fijado al oligonucleótido antisentido mediante un enlace fosfodiéster. En determinadas realizaciones, el resto escindible está fijado al enlazador mediante un enlace fosfodiéster o un enlace fosforotioato. En determinadas realizaciones, el resto escindible está fijado al enlazador mediante un enlace fosfodiéster. En determinadas realizaciones, el grupo de conjugado no incluye un resto escindible. En determinadas realizaciones, el resto escindible se escinde después de que el complejo se haya administrado a un animal solo después de ser internalizado por una célula fijada como objetivo.. Dentro de la célula, el resto escindible se escinde, liberando con ello el oligonucleótido antisentido activo. Sin querer estar ligado por la teoría, se cree que el resto escindible es escindido por una o más nucleasas dentro de la célula. En determinadas realizaciones, la una o más nucleasas escinden el enlace fosfodiéster entre el resto escindible y el enlazador.
Mi. Determinados Enlazadores
El grupo de conjugado de la invención comprende un enlazador. En determinadas realizaciones de este tipo, el enlazador está unido covalentemente al resto escindible. En determinadas realizaciones de este tipo, el enlazador está unido covalentemente al oligonucleótido antisentido. El enlazador está unido covalentemente a un resto que fija como objetivo una célula.
El enlazador es un grupo lineal que comprende grupos alquilo, amida y éter. En determinadas realizaciones, el grupo lineal está fijado covalentemente al resto que fija como objetivo una célula y al resto escindible. En determinadas realizaciones, el grupo enlazador está fijado covalentemente al resto que fija como objetivo una célula y al oligonucleótido antisentido.
El enlazador de conjugado de la presente invención tiene la estructura:
Figure imgf000049_0001
iv. Determinados Restos que Fijan como Objetivo una Célula
El grupo de conjugado de la presente invención comprende restos que fijan como objetivo una célula.: Determinados restos que fijan como objetivo una célula aumentan la captación celular de compuestos antisentido. Los restos que fijan como objetivo una célula comprenden un grupo de ramificación, tres fijaciones y tres ligandos.
1. Determinados Grupos de Ramificación
El grupo de conjugado de la presente invención comprende un resto de fijación de objetivo que comprende un grupo de ramificación y tres ligandos fijados. El grupo de ramificación se fija al enlazador de conjugado. El grupo de ramificación se fija covalentemente al enlazador y a cada uno de los ligandos fijados.
El grupo de ramificación de la presente invención tiene la estructura:
Figure imgf000049_0002
2. Determinadas Fijaciones
El grupo de conjugado de la presente invención comprende tres fijaciones unidas covalentemente al grupo de ramificación. La fijación se une al grupo de ramificación a través de un grupo éter. La fijación se une al ligando a través de un grupo éter.
La fijación de la presente invención tiene la estructura:
Figure imgf000049_0003
3. Determinados Ligandos
Cada uno de los ligandos de la presente invención está fijado covalentemente a una fijación. En determinadas realizaciones, cada uno de los ligandos se selecciona para que tenga afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula diana. En determinadas realizaciones, los ligandos se seleccionan para que tengan afinidad por al menos un tipo de receptor en la superficie de una célula del hígado de mamíferos. En determinadas realizaciones, se seleccionan ligandos que tienen afinidad por el receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGP-R). En determinadas realizaciones de la presente divulgación, cada uno de los ligandos es un hidrato de carbono. Cada uno de los ligandos de la invención es N-acetil galactosamina (GalNAc). En determinadas realizaciones de la presente divulgación, el resto de fijación de objetivo comprende 3 ligandos. El resto de fijación de objetivo de la presente invención comprende ligandos de 3 N-acetil galactosamina.
En determinadas realizaciones, "GalNac" o "Gal-NAc" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, a la que habitualmente se alude en la bibliografía como N-acetilgalactosamina. En determinadas realizaciones, "N-acetil galactosamina" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa. "GalNac" o "Gal-NAc" de la presente invención se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, que está en la forma p: 2-(acetilamino)-2-desoxip-D-galactopiranosa. Además de la presente invención, en esta memoria se describe la forma a: 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, que se representa a continuación como referencia.
Figure imgf000050_0001
2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa
Figure imgf000050_0002
2-(acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa.
Figure imgf000050_0003
2-(acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa.
i. Determinados Conjugados
En determinadas realizaciones, los grupos de conjugado comprenden las características estructurales anteriores que son consistentes con las reivindicaciones adjuntas.
En determinadas realizaciones de este tipo, los grupos de conjugado tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000051_0001
En determinadas realizaciones de este tipo, los grupos de conjugado tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000051_0002
b. Determinados compuestos antisentido conjugados
En determinadas realizaciones, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3' o 5' del nucleósido. El compuesto antisentido conjugado puede tener la siguiente estructura.
A-B-C-D(E-F)q
en donde:
A es el oligonucleótido antisentido;
B es el resto escindible;
C es el enlazador de conjugado;
D es el grupo ramificado;
cada uno de los E es una fijación;
cada uno de los F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones de la presente divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-C-D(E-F)q
en donde:
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el enlazador conjugado;
D es el grupo ramificado;
cada uno de los E es una fijación;
cada uno de los F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones de este tipo, el enlazador de conjugado comprende al menos un enlace escindible. En determinadas realizaciones de este tipo, el grupo de ramificación comprende al menos un enlace escindible. En determinadas realizaciones, cada una de las fijaciones comprende al menos un enlace escindible.
En determinadas realizaciones, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3' o 5' del nucleósido.
En determinadas realizaciones de la presente divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-B-C(E-F)q
en donde:
A es el oligonucleótido antisentido;
B es el resto escindible;
C es el enlazador de conjugado;
cada uno de los E es una fijación;
cada uno de los F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3' o 5' del nucleósido. En determinadas realizaciones de la presente divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-C(E-F)q
en donde:
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el enlazador de conjugado;
cada uno de los E es una fijación;
cada uno de los F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones de la presente divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-B-D(E-F)q
en donde:
A es el oligonucleótido antisentido;
B es el resto escindible;
D es el grupo ramificado;
cada uno de los E es una fijación;
cada uno de los F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones de la presente divulgación, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
A-D(E-F)q
en donde:
A es el oligonucleótido antisentido;
D es el grupo ramificado;
cada uno de los E es una fijación;
cada uno de los F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura.
Figure imgf000053_0001
Patentes de los Estados Unidos, publicaciones de solicitudes de patentes de los Estados Unidos y publicaciones de solicitudes de patentes internacionales representativas que enseñan la preparación de algunos de los conjugados, compuestos antisentido conjugados, fijaciones, enlazadores, grupos de ramificación, ligandos, restos escindibles arriba indicados, así como otras modificaciones, incluyen sin limitación, US 5.994.517, US 6.300.319, US 6.660.720, US 6.906.182, US 7.262.177, US 7.491.805, US 8.106.022, US 7.723.509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 y WO 2012 / 037254. Publicaciones representativas que enseñan la preparación de algunos de los conjugados, compuestos antisentido conjugados, fijaciones, enlazadores, grupos de ramificación, ligandos, restos escindiblesarriba indicados, así como otras modificaciones incluyen, sin limitación, BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618 y Valentijn et al., "Solidphase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden un oligonucleótido basado en RNasa H (tal como un gapmero) o un oligonucleótido modulador de corte y empalme (tal como un oligonucleótido completamente modificado) y cualquier grupo de conjugado que comprenda al menos uno, dos o tres grupos GalNAc.
En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado comprende cualquier grupo de conjugado que se encuentre en cualquiera de las siguientes referencias: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982,257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11,457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013, 21 5275-5281; solicitudes internacionales WO1998/013381; WO2011/038356; WO1997/046098; WO2008/098788 WO2004/101619 WO2012/037254 WO2011/120053 WO2011/100131 WO2011/163121 WO2012/177947 WO2013/033230 WO2013/075035 WO2012/083185 WO2012/083046 WO2009/082607 WO2009/134487 WO2010/144740 WO2010/148013 WO1997/020563 WO2010/088537 WO2002/043771 WO2010/129709 WO2012/068187 WO2009/126933 WO2004/024757 WO2010/054406 WO2012/089352 WO2012/089602 WO2013/166121 WO2013/165816; U.S. Patents 4,751,219; 8,552,163; 6,908,903; 7,262,177; 5,994,517; 6,300,319 8,106,022 7,491,805; 7,491,805 7,582,744; 8,137,695: 6,383,812; 6,525,031; 6,660,720; 7,723,509; 8,541,548 8,344,125 8,313,772; 8,349,308 8,450,467; 8,501,930: 8,158,601; 7,262,177; 6,906,182; 6,620,916; 8,435,491 8,404,862 7,851,615; Publicaciones de Solicitudes de Patente de EE.UU. Publicadas US2011/0097264 US2011/0097265 US2013/0004427 US2005/0164235: US2006/0148740 US2008/0281044 US2010/0240730 US2003/0119724 US2006/0183886 US2008/0206869 US2011/0269814 US2009/0286973 US2011/0207799 US2012/0136042 US2012/0165393 US2008/0281041 US2009/0203135 US2012/0035115 US2012/0095075 US2012/0101148; US2012/0128760 US2012/0157509 US2012/0230938 US2013/0109817 US2013/0121954 US2013/0178512; US2013/0236968; US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801; y US2009/0203132.
C. Determinados Usos y Características
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados exhiben una potente reducción del ARN de Apo(a) in vivo.. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido no conjugados se acumulan en el riñón. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se acumulan en el hígado.. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son bien tolerados. Propiedades de este tipo hacen que los compuestos antisentido conjugados sean particularmente útiles para la inhibición de muchos ARN diana, incluyendo, pero no limitados a los implicados en enfermedades, trastornos o afecciones metabólicas, cardiovasculares y de otro tipo. Por lo tanto, en esta memoria se proporcionan métodos para tratar enfermedades, trastornos o afecciones de este tipo poniendo en contacto tejidos hepáticos con los compuestos antisentido conjugados fijados como objetivo a los ARN asociados con tales enfermedades, trastornos o afecciones. Por lo tanto, también se describen métodos para mejorar cualquiera de una diversidad de enfermedades, trastornos o afecciones metabólicas, cardiovasculares y de otro tipo con los compuestos antisentido conjugados de la presente divulgación.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son más potentes que los homólogos no conjugados a una concentración tisular particular. Sin desear estar ligado por teoría o mecanismo alguno, en determinadas realizaciones, el conjugado puede permitir que el compuesto antisentido conjugado penetre en la célula de manera más eficiente o penetre en la célula de manera más productiva. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados pueden exhibir una mayor reducción de la diana en comparación con su homólogo no conjugado, en donde tanto el compuesto antisentido conjugado como su homólogo no conjugado están presentes en el tejido a las mismas concentraciones. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados pueden exhibir una mayor reducción de la diana en comparación con su homólogo no conjugado, en donde tanto el compuesto antisentido conjugado como su homólogo no conjugado están presentes en el hígado a las mismas concentraciones.
La captación productiva y no productiva de oligonucleótidos se ha comentado previamente (Véase p. ej., Geary, R. S., E. Wancewicz, et al. (2009). "Effect of Dose and Plasma Concentration on Liver Uptake and Pharmacologic Activity of a 2'-Methoxyethyl Modified Chimeric Antisense Oligonucleotide Targeting PTEN." Biochem. Pharmacol. 78(3): 284-91; y Koller, E., T. M. Vincent, et al. (2011). "Mechanisms of single-stranded phosphorothioate modified antisense oligonucleotide accumulation in hepatocytes." Nucleic Acids Res. 39(11): 4795-807). Grupos de conjugados descritos en esta memoria pueden mejorar la captación productiva.
En determinadas realizaciones, los grupos de conjugados descritos en esta memoria pueden mejorar adicionalmente la potencia aumentando la afinidad del compuesto antisentido conjugado por un tipo particular de célula o tejido. En determinadas realizaciones, los grupos de conjugados descritos en esta memoria pueden mejorar adicionalmente la potencia aumentando el reconocimiento del compuesto antisentido conjugado por uno o más receptores de la superficie celular. En determinadas realizaciones, los grupos de conjugados descritos en esta memoria pueden mejorar adicionalmente la potencia facilitando la endocitosis del compuesto antisentido conjugado.
En determinadas realizaciones, el resto escindible puede mejorar adicionalmente la potencia permitiendo que el conjugado se escinda del oligonucleótido antisentido después de que el compuesto antisentido conjugado haya penetrado en la célula. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se pueden administrar en dosis inferiores a las que serían necesarias para los oligonucleótidos antisentido no conjugados.
Previamente se han incorporado enlaces de fosforotioato en oligonucleótidos antisentido. Enlaces fosforotioato de este tipo son resistentes a las nucleasas y, por lo tanto, mejoran la estabilidad del oligonucleótido. Además, los enlaces fosforotioato también se unen a determinadas proteínas, lo que da como resultado la acumulación de oligonucleótidos antisentido en el hígado. Los oligonucleótidos con menos enlaces fosforotioato se acumulan menos en el hígado y más en el riñón (véase, por ejemplo, Geary, R., "Pharmacokinetic Properties of 2'-O-(2-Methoxyethyl)-Modified Oligonucleotide Analogs in Rats," Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 296, N° 3, 890-897; y Pharmacological Properties of 2'-O-Methoxyethyl Modified Oligonucleotides in Antisense a Drug Technology, Capítulo 10, Crooke, S.T., ed., 2008) En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos con menos enlaces internculeosídicos fosforotioato y más enlaces internucleosídicos fosfodiéster se acumulan menos en el hígado y más en el riñón. Cuando se tratan enfermedades en el hígado, esto no es deseable por varias razones (1) menos fármaco llega al sitio de acción deseada (hígado); (2) el fármaco se escapa a la orina; y (3) el riñón está expuesto a una concentración relativamente alta de fármaco que puede resultar en toxicidades en el riñón. Por tanto, para las enfermedades hepáticas, los enlaces fosforotioato proporcionan importantes beneficios.
En determinadas realizaciones, sin embargo, la administración de oligonucleótidos unidos uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato induce una o más reacciones proinflamatorias. (véase por ejemplo: J Lab Clin Med.
1996 Sep; 128(3):329-38. "Amplification of antibody production by phosphorothioate oligodeoxynucleotides". Branda et al.; y véase también, por ejemplo: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, Capítulo 12, páginas 342­ 351, Crooke, S.T., ed., 2008). En determinadas realizaciones, la administración de oligonucleótidos, en donde la mayoría de los enlaces internucleosídicos fosforotioato induce una o más reacciones proinflamatorias.
En determinadas realizaciones, el grado de efecto proinflamatorio puede depender de varias variables (p. ej., modificación de la cadena principal, efectos fuera de diana, modificaciones de nucleobase y/o modificaciones de nucleósidos) véase, por ejemplo: Toxicologic Properties in Antisense a Drug Technology, Capítulo 12, páginas 342­ 351, Crooke, S.T., ed., 2008). En determinadas realizaciones, el grado de efecto proinflamatorio puede mitigarse ajustando una o más variables. Por ejemplo, el grado de efecto proinflamatorio de un oligonucleótido dado puede mitigarse reemplazando cualquier número de enlaces internucleosídicos fosforotioato con enlaces internucleosídicos fosfodiéster y reduciendo con ello el número total de enlaces internucleosídicos fosforotioato.
En determinadas realizaciones, sería deseable reducir el número de enlaces fosforotioato, si se pudiera hacerlo sin perder estabilidad y sin desplazar la distribución del hígado al riñón. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el número de enlaces fosforotioato puede reducirse reemplazando enlaces fosforotioato por enlaces fosfodiéster. En una realización de este tipo, el compuesto antisentido que tiene menos enlaces fosforotioato y más enlaces fosfodiéster puede inducir menos reacciones proinflamatorias o ninguna reacción proinflamatoria. Aunque el compuesto antisentido que tiene menos enlaces fosforotioato y más enlaces fosfodiéster puede inducir menos reacciones proinflamatorias, el compuesto antisentido que tiene menos enlaces fosforotioato y más enlaces fosfodiéster puede no acumularse en el hígado y puede ser menos eficaz a la misma dosis o similar en comparación con un compuesto antisentido que tiene más enlaces fosforotioato.. En determinadas realizaciones, por lo tanto, es deseable diseñar un compuesto antisentido que tenga una pluralidad de enlaces fosfodiéster y una pluralidad de enlaces fosforotioato pero que también posea estabilidad y buena distribución al hígado.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se acumulan más en el hígado y menos en el riñón que sus homólogos no conjugados, incluso cuando algunos de los enlaces fosporotioato son reemplazados por enlaces internucleosídicos fosfodiéster menos proinflamatorios. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se acumulan más en el hígado y no se excretan tanto en la orina en comparación con sus homólogos no conjugados, incluso cuando algunos de los enlaces fosporotioato son reemplazados por enlaces internucleosídicos fosfodiéster menos proinflamatorios. En determinadas realizaciones, el uso de un conjugado permite diseñar fármacos antisentido más potentes y mejor tolerados. De hecho, en determinadas realiaciones, los compuestos antisentido conjugados tienen índices terapéuticos mayores que sus homólogos no conjugados. Esto permite que el compuesto antisentido conjugado sea administrado en una dosis absoluta más alta, porque hay menos riesgo de respuesta proinflamatoria y menos riesgo de toxicidad renal. Esta dosis más alta permite dosificar con menos frecuencia, ya que se espera que el aclaramiento (metabolismo) sea similar. Además, debido a que el compuesto es más potente, tal como se describió arriba, se puede permitir que la concentración disminuya antes de la siguiente dosis sin perder la actividad terapéutica, lo que permite períodos incluso más largos entre dosificaciones.
En determinadas realizaciones, la inclusión de algunos enlaces fosforotioato sigue siendo deseable. Por ejemplo, los enlaces terminales son vulnerables a las exonucleasas y, por tanto, en determinadas realizaciones, esos enlaces son fosforotioato u otro enlace modificado. Los enlaces internucleosídicos que enlazan dos desoxinucleósidos son vulnerables a las endonucleasas y, por lo tanto, en determinadas realizaciones, esos enlaces son fosforotioato u otro enlace modificado. Enlaces internucleosídicos entre un nucleósido modificado y un desoxinucleósido, en que el desoxinucleósido está en el lado 5' del enlace, los desoxinucleósidos son vulnerables a las endonucleasas y, por lo tanto, en determinadas realizaciones, esos enlaces son fosforotioato u otro enlace modificado. Enlaces internucleosídicos entre dos nucleósidos modificados de determinados tipos y entre un desoxinucleósido y un nucleósido modificado de cierto tipo, en que el nucleósido modificado está en el lado 5' del enlace son suficientemente resistentes a la digestión por nucleasas, por lo que el enlace puede ser fosfodiéster.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 16 enlaces fosfortioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 15 enlaces fosfortioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 14 enlaces fosfortioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 13 enlaces fosfortioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 12 enlaces fosfortioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 11 enlaces fosfortioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 10 enlaces fosfortioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 9 enlaces fosfortioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de un compuesto antisentido conjugado comprende menos de 8 enlaces fosfortioato.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido que comprenden uno o más grupos de conjugado descritos en esta memoria tienen una actividad y/o potencia y/o tolerabilidad incrementadas en comparación con un compuesto antisentido precursor que carece de uno o más grupos de conjugado de este tipo. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, es deseable la fijación de dichos grupos conjugados a un oligonucleótido. Dichos grupos de conjugado pueden fijarse en el extremo 5' y/o 3' de un oligonucleótido. En determinados casos, la unión en el extremo 5' es sintéticamente deseable. Típicamente, los oligonucleótidos se sintetizan mediante la fijación del nucleósido 3' terminal a un soporte sólido y el acoplamiento secuencial de nucleósidos de 3' a 5' utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Por consiguiente, si se desea un grupo de conjugado en el extremo 3', se puede (1) fijar el grupo de conjugado al nucleósido 3' terminal y fijar ese nucleósido conjugado al soporte sólido para la preparación posterior del oligonucleótido o (2) fijar el grupo de conjugado al nucleósido 3' terminal de un oligonucleótido completado después de la síntesis. Ninguno de estos enfoques es muy eficiente y, por lo tanto, ambos son costosos. En particular, la fijación del nucleósido conjugado al soporte sólido, aunque se demuestra en los Ejemplos de esta memoria, es un proceso ineficaz. En determinadas realizaciones, la unión de un grupo de conjugado al nucleósido 5' terminal es sintéticamente más fácil que la fijación en el extremo 3'. Se puede unir un nucleósido terminal 3' no conjugado al soporte sólido y preparar el oligonucleótido utilizando reasciones estándares y bien caracterizadas. Entonces, solo se necesita fijar un nucleósido 5' que tenga un grupo de conjugado en la etapa de acoplamiento final. En determinadas realizaciones, esto es más eficaz que fijar un nucleósido conjugado directamente al soporte sólido tal como se hace típicamente para preparar un oligonucleótido 3'-conjugado'. Los Ejemplos de esta memoria demuestran la fijación en el extremo 5'. Además, determinados grupos de conjugados tienen ventajas sintéticas. Por ejemplo, determinados grupos de conjugados que comprenden grupos de enlace fósforo son sintéticamente más simples y se preparan más eficazmente que otros grupos de conjugados, incluidos los grupos de conjugados reseñados previamente (p. ej., documento WO/2012/037254).
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados se administran a un sujeto. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido que comprenden uno o más grupos de conjugado descritos en esta memoria tienen una actividad y/o potencia y/o tolerabilidad incrementadas en comparación con un compuesto antisentido precursor que carece de uno o más grupos de conjugado de este tipo. Sin estar ligado por un mecanismo, se cree que el grupo de conjugado ayuda a la distribución, entrega y/o captación en una célula o tejido diana. En determinadas realizaciones, una vez dentro de la célula o tejido diana, es deseable que todo o parte del grupo de conjugado sea escindido para liberar el oligonucleido activo. En determinadas realizaciones, no es necesario que todo el grupo de conjugado se escinda del oligonucleótido. Por ejemplo, en el Ejemplo 20 se administró un oligonucleótido conjugado a ratones y se detectó un cierto número de especies químicas diferentes, cada una de las cuales comprendía una porción diferente del grupo de conjugado que quedaba en el oligonucleótido (Tabla 23a). Este compuesto antisentido conjugado demostró una buena potencia (Tabla 23). Por lo tanto, en determinadas realizaciones, un perfil de metabolitos de este tipo de escisión parcial múltiple del grupo de conjugado no interfiere con la actividad/potencia.. No obstante, en determinadas realizaciones es deseable que un profármaco (oligonucleótido conjugado) produzca un único compuesto activo. En determinados casos, si se encuentran múltiples formas del compuesto activo, puede ser necesario determinar cantidades relativas y actividades para cada una. En determinadas realizaciones en las que se requiere una revisión regulatoria (p. ej., USFDA u homólogo), es deseable tener una única (o predominantemente única) especie activa. En determinadas realizaciones de este tipo, es deseable que dicha única especie activa sea el oligonudeótido antisentido que carece de cualquier porción del grupo de conjugado. En determinadas realizaciones, es más probable que los grupos de conjugado en el extremo 5' den como resultado un metabolismo completo del grupo de conjugado. Sin estar ligados por un mecanismo, puede ser que las enzimas endógenas responsables del metabolismo en el extremo 5' (p. ej., 5' nucleasas) sean más activas/eficientes que los homólogos 3'. En determinadas realizaciones, los grupos de conjugado específicos son más susceptibles de metabolizarse a una única especie activa. En determinadas realizaciones, determinados grupos de conjugado son más susceptibles de metabolizarse al oligonucleótido.
D. Antisentido
En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos de la presente divulgación son compuestos antisentido. En realizaciones de este tipo, el compuesto oligomérico es complementario a un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, un ácido nucleico es un ARN. En determinadas realizaciones, un ácido nucleico es un ARN no codificante. En determinadas realizaciones, un ácido nucleico diana es una proteína. En determinadas realizaciones, un ácido nucleico diana se selecciona de un ARNm, un pre-ARNm, un microARN, un ARN no codificante, incluyendo ARN pequeño no codificante, y un ARN dirigido por promotor. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos son al menos parcialmente complementarios a más de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, los compuestos oligoméricos pueden ser imitadores de microARN, que típicamente se unen a múltiples dianas.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una parte que tiene una secuencia de nucleobase complementaria al menos en un 70% a la secuencia de nucleobases de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una parte que tiene una secuencia de nucleobase complementaria al menos en un 80% a la secuencia de nucleobases de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una parte que tiene una secuencia de nucleobase complementaria al menos en un 90% a la secuencia de nucleobases de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una parte que tiene una secuencia de nucleobase complementaria al menos en un 95% a la secuencia de nucleobases de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden una parte que tiene una secuencia de nucleobase complementaria al menos en un 98% a la secuencia de nucleobases de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, compuestos antisentido comprenden una parte que tiene una secuencia de nucleobases complementaria al menos en un 100% a la secuencia de nucleobases de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 100% complementarios a la secuencia de nucleobases de un ácido nucleico diana a lo largo de toda la longitud del compuesto antisentido.
Mecanismos antisentido incluyen cualquier mecanismo que implique la hibridación de un compuesto oligomérico con un ácido nucleico diana, en donde la hibridación da como resultado un efecto biológico. En determinadas realizaciones, una hibridación de este tipo da como resultado la degradación o la ocupación del ácido nucleico diana con inhibición o estimulación concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, traducción, transcripción o poliadenilación del ácido nucleico diana o de un ácido nucleico con el que el ácido nucleico diana puede interactuar de otra manera.
Un tipo de mecanismo antisentido que implica la degradación del ARN diana es el antisentido mediado por RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena sencilla que son "similares a ADN" provocan actividad de RNasa H en células de mamífero. La activación de la RNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión del ARN diana, mejorando con ello en gran medida la eficacia de la inhibición de la expresión génica mediada por oligonucleótidos similares a ADN.
Los mecanismos antisentido también incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNi, que utilizan la vía RISC. Mecanismos de ARNi de este tipo incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNcs y microARN. Mecanismos de este tipo incluyen la creación de un imitador de microARN y/o un anti-microARN.
Los mecanismos antisentido también incluyen, sin limitación, mecanismos que hibridan o imitan ARN no codificante distinto de microARN o ARNm. ARN no codificante de este tipo incluye, pero no se limita a, ARN dirigido por promotores y ARN corto y largo que efectúa la transcripción o traducción de uno o más ácidos nucleicos.
En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden conjugados descritos en el presente documento son compuestos de ARNi. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos oligoméricos que comprenden conjugados descritos en esta memoria son compuestos de ARNcs. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden conjugados descritos en esta memoria se emparejan con un segundo compuesto oligomérico para formar un ARNip. En determinadas realizaciones de este tipo, el segundo compuesto oligomérico también comprende un conjugado. En determinadas realizaciones, el segundo compuesto oligomérico es cualquier ácido nucleico modificado o no modificado. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden conjugados descritos en esta memoria son la cadena antisentido en un compuesto de ARNip. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden conjugados descritos en esta memoria son la cadena sentido en un compuesto de ARNip. En realizaciones en las que el compuesto oligomérico conjugado es ARNip de doble cadena, el conjugado puede estar en la cadena sentido, la cadena antisentido o tanto en la cadena sentido como en la cadena antisentido.
C. Apolipoproteína (a) (apo(a))
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados fijan como objetivo cualquier ácido nucleico de apo(a). En determinadas realizaciones, el ácido nucleico diana codifica una proteína diana apo(a) que es clínicamente relevante. En realizaciones de este tipo, la modulación del ácido nucleico diana da como resultado un beneficio clínico.
El proceso de fijación de objetivo incluye habitualmente la determinación de al menos una región, segmento o sitio diana dentro del ácido nucleico diana para que se produzca la interacción antisentido de modo que resulte el efecto deseado.
En determinadas realizaciones, una región diana es una región definida estructuralmente del ácido nucleico. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de este tipo, una región diana puede abarcar una 3' UTR, una 5' UTR, un exón, un intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida o segmento diana.
En determinadas realizaciones, un segmento diana es al menos aproximadamente una parte de 8 nucleobase de una región diana a la que se fija como objetivo un compuesto antisentido conjugado. Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 nucleobases consecutivas desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana (las nucleobases restantes son un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente aguas arriba del extremo 5' del segmento diana y continúa hasta que el ADN o ARN comprenda de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleobases). Los segmentos diana también están representados por secuencias de ADN o a Rn que comprenden al menos 8 nucleobases consecutivas desde el extremo 3' de uno de los segmentos diana (las nucleobases restantes son un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente aguas abajo del extremo 3' del segmento diana y continúa hasta que el ADN o ARN comprenda de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleobases). Los segmentos diana también pueden estar representados por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos 8 nucleobases consecutivas de una parte interna de la secuencia de un segmento diana, y pueden extenderse en una o ambas direcciones hasta que el compuesto antisentido conjugado comprende aproximadamente 8 a aproximadamente 30 nucleobases.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido fijados como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) se pueden modificar como se describe en esta memoria. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido pueden tener un resto azúcar modificado, un resto azúcar no modificado o una mezcla de restos azúcar modificados y no modificados tal como se describe en esta memoria. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido pueden tener un enlace internucleosídico modificado, un enlace internucleosídico no modificado o una mezcla de enlaces internucleosídicos modificados y no modificados tal como se describe en esta memoria. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido pueden tener una nucleobase modificada, una nucleobase no modificada o una mezcla de nucleobases modificadas y no modificadas tal como se describe en esta memoria. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido pueden tener un motivo tal como se describe en esta memoria.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido fijados como objetivo a ácidos nucleicos de apo(a) se pueden conjugar tal como se describe en esta memoria.
Una proteína apo(a) se enlaza mediante un enlace disulfuro a una única proteína apolipoproteína B (apoB) para formar una partícula de lipoproteína(a) (Lp(a)). La proteína apo(a) comparte un alto grado de homología con el plasminógeno, particularmente dentro del dominio repetitivo kringle IV tipo 2. Se cree que este dominio de repetición kringle en apo(a) puede ser responsable de sus propiedades pro-trombóticas y anti-fibrinolíticas, potenciando en potencia la progresión aterosclerótica. Apo(a) es regulada transcripcionalmente por IL-6 y en estudios en pacientes con artritis reumatoide tratados con un inhibidor de IL-6 (tocilizumab), los niveles en plasma se redujeron en un 30% después de 3 meses de tratamiento. Se ha demostrado que la Apo(a) se une preferentemente a los fosfolípidos oxidados y potencia la inflamación vascular. Además, los estudios sugieren que la partícula de Lp(a) también puede estimular la permeabilidad endotelial, inducir la expresión del inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 y activar la secreción de interleuquina-8 de macrófagos. Es importante destacar que estudios recientes de asociación genética revelaron que la Lp(a) era un factor de riesgo independiente de infarto de miocardio, apoplejía, enfermedad vascular periférica y aneurisma aórtico abdominal. Además, en el estudio de Enfermedad Coronaria Precoz (PROCARDIS), Clarke et a/.describieron asociaciones sólidas e independientes entre la enfermedad coronaria y las concentraciones plasmáticas de Lp(a). Adicionalmente, Solfrizzi et al., sugirieron que el aumento de Lp(a) en suero puede estar ligado con un riesgo incrementado de enfermedad de Alzheimer (AD). Compuestos antisentido que fijan como objetivo apo(a) se han descrito previamente en los documentos WO2005/000201 y US2010-0331390. Se evaluó una Apo(a) que fija como objetivo una oligonucleobase antisentido ISIS-APOAr x, en un ensayo clínico de fase I para estudiar su perfil de seguridad.
Determinados Compuestos Antisentido Conjugados Fijados como Objetivo a un Ácido Nucleico Apo(a)
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados fijan como objetivo un ácido nucleico de Apo(a) que tiene la secuencia de GENBANK® N° de acceso NM_005577.2, incorporado en esta memoria como SEQ ID NO: 1; GENBANK n° de acceso NT_007422.12 truncado de los nucleótidos 3230000 a 3380000, incorporado en esta memoria como SEQ ID NO: 2; GENBANK n° de acceso NT_025741.15 truncado de los nucleótidos 65120000 a 65258000, designado en esta memoria como SEQ ID NO: 3; y GENBANK n° de acceso NM_005577.1, incorporado en esta memoria como SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones de este tipo, un compuesto antisentido conjugado es al menos 90%, al menos 95% o 100% complementario a cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID Nos: 1-4.
En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a cualquiera de las secuencias de nucleobases de SEQ ID NOs: 1-4 comprende al menos 8 secuencias de nucleobase consecutivas seleccionadas de la secuencia de nucleobase de cualquiera de SEQ ID NOs 12-130, 133, 134. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a cualquiera de SEQ ID NOs: 1-4 comprende una secuencias de nucleobases seleccionada de la secuencia de nucleobases de cualquiera de SEQ ID NOs 12-130, 133, 134.
Tabla A: Compuestos Antisentido fijados como objetivo a Apo(a) SEQ ID NO: 1
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En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para utilizar un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) para modular la expresión de apo(a) en un sujeto. En determinadas realizaciones, se reduce la expresión de apo(a).
En determinadas realizaciones, en esta memoria se describen métodos para tratar a un sujeto, que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas tal como se describe en esta memoria. En determinadas realizaciones, en esta memoria se describen métodos para utilizar un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) en una composición farmacéutica para tratar a un sujeto. En determinadas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad relacionada con apo(a). En determinadas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad relacionada con Lp(a). En determinadas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad, trastorno o afección inflamatorio, cardiovascular y/o metabólico.
En determinadas realizaciones,el sujeto tiene una enfermedad, trastorno y afección inflamatorio, cardiovascular y/o metabólico.
En determinadas realizaciones, las enfermedades, los trastornos o las afecciones cardiovasculares incluyen, pero no se limitan a estenosis aórtica, aneurisma (p. ej., aneurisma aórtico abdominal), angina, arritmia, aterosclerosis, enfermedad cerebrovascular, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad cardíaca coronaria, dislipidemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, hipertensión, hipertrigliceridemia, infarto de miocardio, enfermedad vascular periférica (p. ej., enfermedad arterial periférica), apoplejía y similares.
En determinadas realizaciones, los compuestos fijados como objetivo a apo(a) descritos en esta memoria modulan marcadores fisiológicos o fenotipos de la enfermedad, trastorno o afección cardiovascular. Por ejemplo, la administración de los compuestos a animales puede disminuir los niveles de LDL y colesterol en esos animales en comparación con los animales no tratados.. En determinadas realizaciones, la modulación de los marcadores fisiológicos o fenotipos se puede asociar con la inhibición de apo(a) por parte de los compuestos.
En determinadas realizaciones, los marcadores fisiológicos de la enfermedad, trastorno o afección cardiovascular pueden ser cuantificables. Por ejemplo, los niveles de LDL o colesterol se pueden medir y cuantificar mediante, por ejemplo, tests de lípidos estándares. Para marcadores de este tipo, en determinadas realizaciones el marcador se puede reducir en aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por cualquiera de dos de estos valores.
También, en esta memoria se describen métodos para prevenir, tratar o mejorar un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección cardiovascular en un sujeto que lo necesite. En determinadas realizaciones, se proporciona un método para reducir la velocidad de aparición de un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección cardiovascular. En determinadas realizaciones, se proporciona un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección cardiovascular. En tales realizaciones, los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) a un individuo que lo necesite.
La enfermedad, el trastorno o la afección cardiovascular puede caracterizarse por numerosos síntomas físicos. Cualquier síntoma conocido por un experto en la técnica que esté asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección cardiovascular puede prevenirse, tratarse, mejorarse o modularse de otro modo con los compuestos y métodos descritos en esta memoria. En determinadas realizaciones, los síntomas pueden ser cualquiera, pero no se limitan a angina, dolor de pecho, dificultad para respirar, palpitaciones, debilidad, mareos, náuseas, sudoración, taquicardia, bradicardia, arritmia, fibrilación auricular, hinchazón en las extremidades inferiores, cianosis, fatiga, desmayos, entumecimiento de la cara, entumecimiento de las extremidades, claudicación o calambres musculares, hinchazón del abdomen y fiebre.
En determinadas realizaciones, las enfermedades, los trastornos o las afecciones metabólicas de este tipo incluyen, pero no se limitan a hiperglucemia, prediabetes, diabetes (tipo I y tipo II), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia diabética.
En determinadas realizaciones, los compuestos fijados como objetivo a apo(a) descritos en esta memoria modulan marcadores fisiológicos o fenotipos de la enfermedad, el trastorno o la afección metabólico. Por ejemplo, la administración de los compuestos a animales puede disminuir los niveles de glucosa y resistencia a la insulina en esos animales en comparación con los animales no tratados.. En determinadas realizaciones, la modulación de los marcadores fisiológicos o fenotipos se puede asociar con la inhibición de apo(a) por parte de los compuestos.
En determinadas realizaciones, los marcadores fisiológicos de la enfermedad, el trastorno o la afección metabólico pueden ser cuantificables. Por ejemplo, los niveles de glucosa o la resistencia a la insulina pueden medirse y cuantificarse mediante tests estándares conocidos en la técnica. Para marcadores de este tipo, en determinadas realizaciones el marcador se puede reducir en aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por cualquiera de dos de estos valores. En otro ejemplo, la sensibilidad a la insulina puede medirse y cuantificarse mediante tests estándares conocidos en la técnica. Para marcadores de este tipo, en determinadas realizaciones el marcador se puede incrementar en aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por cualquiera de dos de estos valores.
También, en esta memoria se describen métodos para prevenir, tratar o mejorar un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección metabólico en un sujeto que lo necesite. En determinadas realizaciones, se proporciona un método para reducir la velocidad de aparición de un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección metabólico. En determinadas realizaciones, se proporciona un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección metabólico. En realizaciones de este tipo, los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) a un individuo que lo necesite.
La enfermedad, el trastorno o la afección metabólico puede caracterizarse por numerosos síntomas físicos. Cualquier síntoma conocido por un experto en la técnica que esté asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección metabólico puede prevenirse, tratarse, mejorarse o modularse de otro modo con los compuestos y métodos descritos en esta memoria. En determinadas realizaciones, el síntoma puede ser cualquiera de, pero no limitado a, producción excesiva de orina (poliuria), sed excesiva y aumento de la ingesta de fluidos (polidipsia), visión borrosa, pérdida de peso inexplicable y letargo.
En determinadas realizaciones, las enfermedades, los trastornos o las afecciones inflamatorias incluyen, pero no se limitan a estenosis aórtica, enfermedad de las arterias coronarias (CAD), enfermedad de Alzheimer y enfermedades, trastornos o afecciones tromboembólicos. Determinadas enfermedades, trastornos o afecciones tromboembólicos incluyen, pero no se limitan a apoplejía, trombosis, infarto de miocardio y enfermedad vascular periférica.
En determinadas realizaciones, los compuestos fijados como objetivo a apo(a) descritos en esta memoria modulan marcadores fisiológicos o fenotipos de la enfermedad, trastorno o afección inflamatorio. Por ejemplo, la administración de los compuestos a animales puede disminuir los niveles de citoquinas inflamatorias u otros marcadores inflamatorios en esos animales en comparación con los animales no tratados. En determinadas realizaciones, la modulación de los marcadores fisiológicos o fenotipos se puede asociar con la inhibición de apo(a) por parte de los compuestos.
En determinadas realizaciones, los marcadores fisiológicos de la enfermedad, el trastorno o la afección inflamatorio pueden ser cuantificables. Por ejemplo, los niveles de citoquinas pueden medirse y cuantificarse mediante tests estándares conocidos en la técnica. Para marcadores de este tipo, en determinadas realizaciones el marcador se puede reducir en al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, o un intervalo definido por cualquiera de dos de estos valores.
También, en esta memoria se describen métodos para prevenir, tratar o mejorar un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección inflamatorio en un sujeto que lo necesite. En determinadas realizaciones, se proporciona un método para reducir la velocidad de aparición de un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección inflamatorio. En determinadas realizaciones, se proporciona un método para reducir la gravedad de un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección inflamatorio. En realizaciones de este tipo, los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) a un individuo que lo necesite.
En determinadas realizaciones, se proporcionan métodos para tratar a un individuo con una enfermedad, trastorno o afección relacionado con apo(a), que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones farmacéuticas tal como se describe en esta memoria. En determinadas realizaciones, el individuo tiene niveles elevados de apo(a). En determinadas realizaciones, se proporcionan métodos para tratar a un individuo con una enfermedad, trastorno o afección relacionado con Lp(a), que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones farmacéuticas tal como se describe en esta memoria. En determinadas realizaciones, el individuo tiene niveles elevados de Lp(a). En determinadas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad, trastorno o afección inflamatorio y/o metabólico. En determinadas realizaciones, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) se acompaña de la monitorización de niveles de apo(a) o Lp(a). En determinadas realizaciones, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) se acompaña de la monitorización de marcadores de enfermedades inflamatorias, cardiovasculares y/o metabólicas, u otros procesos patológicos asociados con la expresión de apo( a), para determinar la respuesta de un individuo al compuesto antisentido. Un médico puede utilizar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido fijado como objetivo a apo(a) para determinar la cantidad y duración de la intervención terapéutica con el compuesto.
En determinadas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) da como resultado la reducción de la expresión de apo(a) en al menos aproximadamente un 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, o un intervalo definido por cualquiera dos de estos valores. En determinadas realizaciones, la expresión de apo(a) se reduce a al menos < 100 mg/dL, < 90 mg/dL, < 80 mg/dL, < 70 mg/dL, < 60 mg/dL, < 50 mg/dL, < 40 mg/dL, < 30 mg/dL, <20 mg/dL o < 10 mg/dL.
En determinadas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) da como resultado la reducción de la expresión de Lp(a) en al menos aproximadamente un 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, o un intervalo definido por cualquiera dos de estos valores. En determinadas realizaciones, la expresión de Lp(a) se reduce a al menos < 200 mg/dL, < 190 mg/dL, < 180 mg/dL, < 175 mg/dL, < 170 mg/dL, < 160 mg/dL, < 150 mg/dL, < 140 mg/dL, < 130 mg/dL, < 120 mg/dL, < 110 mg/dL, < 100 mg/dL, < 90 mg/dL, < 80 mg/dL, < 70 mg/dL, < 60 mg/dL, < 55 mg/dL, < 50 mg/dL, < 45 mg/dL, < 40 mg/dL, < 35 mg/dL, < 30 mg/dL, < 25 mg/dL, < 20 mg/dL, < 15 mg/dL o < 10 mg/dL.
En determinadas realizaciones, en esta memoria se describen métodos para utilizar un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a un ácido nucleico de apo(a) en la preparación de un medicamento. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido conjugado fijado como objetivo a apo(a) se utilizan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a una enfermedad, trastorno o afección inflamatorio, cardiovascular y/o metabólico.
Poblaciones de Tratamiento con Apo(a)
Determinados sujetos con niveles altos de Lp(a) tienen un riesgo significativo de contraer diversas enfermedades (Lippi et al., Clinica Chimica Acta, 2011, 412: 797-801; Solfrizz et al.), En muchos sujetos con niveles altos de Lp(a), los tratamientos actuales no pueden reducir sus niveles de Lp(a) a niveles seguros. Apo(a) juega un papel importante en la formación de Lp(a), por lo que reducir la apo(a) puede reducir Lp(a) y prevenir, tratar o mejorar una enfermedad asociada con Lp(a).
En determinadas realizaciones, el tratamiento con los compuestos y métodos descritos en esta memoria está indicado para un animal humano con niveles elevados de apo(a) y/o de Lp(a). En determinadas realizaciones, el ser humano tiene niveles de apo(a) > 10 mg/dL, > 20 mg/dL, > 30 mg/dL, > 40 mg/dL, > 50 mg/dL, > 60 mg/dL, > 70 mg/dL, > 80 mg/dL, > 90 mg/dL or > 100 mg/dL. En determinadas realizaciones, el ser humano tiene niveles de Lp(a) > 10 mg/dL, > 15 mg/dL, > 20 mg/dL, > 25 mg/dL, > 30 mg/dL, > 35 mg/dL, > 40 mg/dL, > 50 mg/dL, > 60 mg/dL, > 70 mg/dL, > 80 mg/dL, > 90 mg/dL, > 100 mg/dL, > 110 mg/dL, > 120 mg/dL, > 130 mg/dL, > 140 mg/dL, > 150 mg/dL, > 160 mg/dL, > 170 mg/dL, > 175 mg/dL, > 180 mg/dL, > 190 mg/dL, > 200 mg/dL.
D. Determinadas Composiciones Farmacéuticas
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos antisentido de acuerdo con la invención. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica de este tipo comprende un diluyente o soporte adecuado farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica comprende una solución salina estéril y uno o más compuestos antisentido. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica de este tipo consiste en una solución salina estéril y uno o más compuestos antisentido. En determinadas realizaciones, la solución salina estéril es una solución salina de calidad farmacéutica. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos antisentido y agua estéril. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en uno o más compuestos antisentido y agua estéril. En determinadas realizaciones, la solución salina estéril es agua de calidad farmacéutica. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica comprende dos o más compuestos antisentido y solución salina tamponada con fosfato (PBS). En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en uno o más compuestos antisentido y solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril. En determinadas realizaciones, la solución salina estéril es PBS de calidad farmacéutica.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido se pueden mezclar con sustancias activas y/o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de un cierto número de criterios, incluyendo, pero no limitados a, vía de administración, extensión de la enfermedad o dosis a administrar.
Composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualesquiera sales, ésteres o sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido comprenden uno o más oligonucleótidos que, tras la administración a un animal, incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de profármacos de este tipo y otros bioequivalentes. Sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un oligonucleótido que son escindidos por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el oligonucleótido antisentido activo.
Los restos de lípidos se han utilizado en terapias con ácidos nucleicos en una diversidad de métodos. En determinados métodos de este tipo, el ácido nucleico se introduce en liposomas o lipoplexos preformados, hechos de mezclas de lípidos catiónicos y lípidos neutros. En determinados métodos, los complejos de ADN con lípidos mono- o policatiónicos se forman sin la presencia de un lípido neutro. En determinadas realizaciones, se selecciona un resto lipídi
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en esta memoria comprenden uno o más oligonucleótidos modificados y uno o más excipientes. En determinadas realizaciones de este tipo, los excipientes se seleccionan de agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona.
En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en esta memoria comprende un sistema de suministro. Ejemplos de sistemas de suministro incluyen, pero no se limitan a liposomas y emulsiones. Determinados sistemas de suministro son útiles para preparar determinadas composiciones farmacéuticas, incluyendo las que comprenden compuestos hidrofóbicos. En determinadas realizaciones, se utilizan determinados disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido.
En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en esta memoria comprende una o más moléculas de suministro específicas para el tejido, diseñadas para suministrar uno o más agentes farmacéuticos de la presente divulgación a tejidos o tipos celulares específicos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen liposomas recubiertos con un anticuerpo específico para el tejido.
En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en esta memoria comprende un sistema de co-disolvente. Determinados sistemas de co-disolventes de este tipo comprenden, por ejemplo, alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. En determinadas realizaciones, sistemas de co-disolventes de este tipo se utilizan para compuestos hidrofóbicos. Un ejemplo no limitante de un sistema de co.disolventes de este tipo es el sistema de co-disolventes VPD, que es una solución de etanol absoluto que comprende 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del tensioactivo no polar Polysorbate 80™ y 65% p/v de polietilenglicol 300. Las proporciones de sistemas de co-disolventes de este tipo se pueden variar considerablemente sin alterar significativamente sus características de solubilidad y toxicidad. Además, se puede variar la identidad de los componentes del co-disolvente: por ejemplo, se pueden utilizar otros tensioactivos en lugar de Polysorbate 80™; se puede variar el tamaño de la fracción de polietilenglicol; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, p. ej., polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.
En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en esta memoria se prepara para la administración oral. En determinadas realizaciones, composiciones farmacéuticas se preparan para la administración bucal.
En determinadas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para su administración mediante inyección (p. ej., intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). En algunas de realizaciones de este tipo, una composición farmacéutica comprende un soporte y se formula en solución acuosa, tal como agua, o tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. En determinadas realizaciones, se incluyen otros ingredientes (p. ej., ingredientes que ayudan en la solubilidad o sirven como conservantes). En determinadas realizaciones, las suspensiones inyectables se preparan utilizando soportes líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares.. Determinadas composiciones farmacéuticas para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, p. ej., en ampollas o en recipientes multidosis. Determinadas composiciones farmacéuticas para inyección son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Determinados disolventes adecuados para uso en composiciones farmacéuticas para inyección incluyen, pero no se limitan a disolventes lipofílicos y aceites grasos, tal como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, y liposomas. Suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, suspensiones de este tipo también pueden contener estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los agentes farmacéuticos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica se prepara para la administración transmucosal. En determinadas realizaciones de este tipo, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Penetrantes de este tipo son generalmente conocidos en la técnica.
En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en esta memoria comprende un oligonucleótido en una cantidad terapéuticamente eficaz. En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o para prolongar la supervivencia del sujeto que esté siendo tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
En determinadas realizaciones, uno o más oligonucleótidos modificados proporcionados en esta memoria se formulan como un profármaco. En determinadas realizaciones, tras la administración in vivo, un profármaco se convierte químicamente en la forma biológica, farmacéutica o terapéuticamente más activa de un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, los profármacos son útiles porque son más fáciles de administrar que la forma activa correspondiente. Por ejemplo, en determinados casos, un profármaco puede ser más biodisponible (p. ej., mediante administración oral) que la forma activa correspondiente. En determinados casos, un profármaco puede tener una solubilidad mejorada en comparación con la forma activa correspondiente. En determinadas realizaciones, los profármacos son menos solubles en agua que la forma activa correspondiente. En determinados casos, profármacos de este tipo poseen una transmisión superior a través de las membranas celulares, en que la solubilidad en agua es perjudicial para la movilidad. En determinadas realizaciones, un profármaco es un éster. En determinadas realizaciones de este tipo, el éster se hidroliza metabólicamente a ácido carboxílico tras la administración. En determinados casos, el compuesto que contiene ácido carboxílico es la forma activa correspondiente. En determinadas realizaciones, un profármaco comprende un péptido corto (poliaminoácido) unido a un grupo ácido. En algunas realizaciones de este tipo, el péptido se escinde tras la administración para formar la forma activa correspondiente.
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones y métodos para reducir la cantidad o actividad de un ácido nucleico diana en una célula. En determinadas realizaciones, la célula es un animal. En determinadas realizaciones, el animal es un mamífero. En determinadas realizaciones, el animal es un roedor. En determinadas realizaciones, el animal es un primate. En determinadas realizaciones, el animal es un primate no humano. En determinadas realizaciones, el animal es un ser humano.
En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para administrar a un animal una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de la presente divulgación. Vías de administración adecuadas incluyen, pero no se limitan a oral, rectal, transmucosa, intestinal, enteral, tópica, por supositorio, por inhalación, intratecal, intracerebroventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular, intratumoral y parenteral (p. ej., intravenosa, intramuscular, intramedular y subcutáneo). En determinadas realizaciones, intratecales farmacéuticos se administran para lograr exposiciones locales en lugar de sistémicas. Por ejemplo, composiciones farmacéuticas se pueden inyectar directamente en la zona del efecto deseado (p. ej., en el hígado).
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran determinadas realizaciones de la presente divulgación y no son limitantes. Además, cuando se proporcionan realizaciones específicas, los autores de la invención han contemplado la aplicación genérica de esas realizaciones específicas. Por ejemplo, la divulgación de un oligonucleótido que tiene un motivo particular proporciona un soporte razonable para oligonucleótidos adicionales que tienen el mismo motivo o un motivo similar. Y, por ejemplo, cuando aparece una modificación de alta afinidad particular en una posición particular, se consideran adecuadas otras modificaciones de alta afinidad en la misma posición, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1: Método General para la Preparación de Fosforamiditas, Compuestos 1, 1a y 2
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Bx es una base heterocíclica.
Los Compuestos 1, 1a y 2 se prepararon según los procedimientos bien conocidos en la técnica tal como se describe en la memoria descriptiva de este caso (véase, Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011,21(4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); y también véanse las Solicitudes Internacionales PCT publicadas (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478 y WO 2007/090071), y la patente de EE.UU. 7.569.686).
Ejemplo 2: Preparación de Compuesto 7
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Compuesto 3 (2-acetamido-1,3,4,6-tetra-0-acetil-2-desoxi-p-Dgalactopiranosa o pentaacetato de galactosamina) está comercialmente disponible. Compuesto 5 se preparó de acuerdo con procedimientos publicados (Weber et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 2692).
Ejemplo 3: Preparación de Compuesto 11
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Compuestos 8 y 9 están comercialmente disponibles.
Ejemplo 4: Preparación de Compuesto 18
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Compuesto 11 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 3. Compuesto 14 está comercialmente disponible. Compuesto 17 se preparó de acuerdo con procedimientos reseñados por Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
Ejemplo 39: Método general para la preparación de compuesto 83h oligomérico que comprende un Conjugado GalNAc3-3 en el extremo 5' (GalNAc3-1 modificado para la fijación al extremo 5') via Soporte Sólido
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Compuesto 18 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 4. Compuestos 83a y 83b están comercialmente disponibles. El Compuesto 83e oligomérico que comprende una hexilamina enlazada a fosfodiéster se preparó utilizando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos estándares. El tratamiento del compuesto oligomérico protegido con amoniaco acuoso proporcionó el compuesto oligomérico conjugado 5'-GalNAc3-3 (83h).
En donde GalNAc3-3 tiene la estructura:
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La parte de racimo de GalNAc3 del grupo de conjugado GalNAc3-3 (GalNAc3-3a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una diversidad de grupos de conjugado. En donde GalNAc3-3a tiene la fórmula:
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Ejemplo 44: Efecto de los enlaces PO/PS en la inhibición antisentido de ASOs que comprende conjugado de GalNAc 3 -1 (véase el Ejemplo 9) en el extremo 3' que fija como objetivo SRB-1
ISIS 655861 y 655862 que comprenden un conjugado de GalNAc3-1 en el extremo 3' cada uno de los cuales fija como objetivo a SRB-1 se testaron en un estudio de administración única para determinar su capacidad de inhibir SRB-1 en ratones. El compuesto precursor no conjugado, ISIS 353382, se incluyó en el estudio para comparación.
Los ASOs son gapmeros 5-10-5 MOE, en donde la región gap comprende diez 2-desoxirribonucleósidos y cada una de las regiones de ala comprende cinco nucleósidos modificados con 2'-MOE. Los ASOs se prepararon utilizando métodos similares a los ilustrados previamente en el Ejemplo 19 y se describen en la Tabla 36 que figura a continuación.
Tabla 36
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Subíndices: "e" indica nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica enlaces internucleosídicos fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos fosfodiéster (PO); y "o" 'indica -OP(=O)(OH)-. El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas. La estructura de "GalNAc3-1" se muestra en el Ejemplo 9.
Tratamiento
Se inyectaron por vía subcutánea una vez ratones Balb/c machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a la dosis que se muestra a continuación con ISIS 353382, 655861, 655862 o con control tratado con PBS. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 4 animales. Antes del tratamiento, así como después de la última dosis, se extrajo sangre de cada uno de los ratones y se analizaron muestras de plasma. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 hepático utilizando la PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron con relación al ARN total (utilizando Ribogreen), antes de la normalización al control tratado con PBS. Los resultados que figuran a continuación se presentan como el porcentaje medio de niveles de ARNm de SRB-1 para cada uno de los grupos de tratamiento, normalizados al control tratado con PB S y se indican como "% de PBS". Las DEeüs se midieron utilizando métodos similares a los descritos previamente y se presentan a continuación.
Tal como se ilustra en la Tabla 37, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control tratado con PBS. En efecto, los oligonucleótidos antisentido que comprenden el conjugado GalNAc3-1 en el extremo 3' (ISIS 655861 y 655862) mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382).. Además, ISIS 655862 con enlaces mixtos de PS/PO mostró una mejora en la potencia con relación a PS completo (ISIS 655861)
Tabla 37
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Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron con relación a ratones a los que se inyectó solución salina utilizando protocolos estándares. También se evaluaron los pesos de los órganos. Los resultados demostraron que no se observaron elevaciones en los niveles de transaminasas (Tabla 38) o pesos de órganos (datos no mostrados) en ratones tratados con ASOs en comparación con el control de PBS. Además, el ASO con enlaces mixtos de PS/PO (ISIS 655862) mostró niveles de transaminasas similares en comparación con PS completo (ISIS 655861).
Tabla 38
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Ejemplo 45: Preparación de Éster de PFP, Compuesto 110a
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Compuesto 4 (9,5 g, 28,8 mmol) se trató con compuesto 103a o 103b (38 mmol), individualmente, y TMSOTf (0,5 eq.) y tamices moleculares en diclorometano (200 mL) y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. En ese momento, la capa orgánica se filtró a través de celite, luego se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salmuera. Después, la capa orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a presión reducida. El aceite resultante se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (2% -> 10% de metanol/diclorometano) para dar compuestos 104a y 104b con > 80% de rendimiento. La LCMS y la RMN de protones eran consistentes con la estructura.
Compuestos 104a y 104b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar compuestos 105a y 105b con un rendimiento > 90%. La LCMs y la RMN de protones eran consistentes con la estructura.
Compuestos 105a y 105b se trataron individualmente con compuesto 90 en las mismas condiciones que para los compuestos 901a-d, para dar compuestos 106a (80%) y 106b (20%). La LCMS y la RMN de protones eran consistentes con la estructura.
Compuestos 106a y 106b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 96a-d (Ejemplo 47), para dar 107a (60%) y 107b (20%). La LCMS y la RMN de protones eran consistentes con la estructura.
Compuestos 107a y 107b se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 97a-d (Ejemplo 47), para dar compuestos 108a y 108b con un rendimiento de 40-60%. La LCMS y la RMN de protones eran consistentes con la estructura.
Compuestos 108a (60%) y 108b (40%) se trataron en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar compuestos 109a y 109b con un rendimiento > 80%. La LCMS y la RMN de protones eran consistentes con la estructura.
Compuesto 109a se trató en las mismas condiciones que para los compuestos 101a-d (Ejemplo 47), para dar Compuesto 110a con un rendimiento de 30-60%. La LCMS y la RMN de protones eran consistentes con la estructura. Alternativamente, el Compuesto 110b se puede preparar de una manera similar comenzando con Compuesto 109b.
Ejemplo 48: Preparación de Oligonucleótido 119 que Comprende GalNAc3-7
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Compuesto 112 se sintetizó siguiendo el procedimientos descrito en la bibliografía (J. Med. Chem., 2004, 47, 5798­ 5808).
Compuesto 112 (5 g, 8,6 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (22 mL/22 mL). Se añadió hidróxido de paladio sobre carbono (0,5 g). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite y la almohadilla se lavó con metanol/acetato de etilo 1:1. El filtrado y los líquidos de lavado se combinaron y concentraron a sequedad para producir Compuesto 105a (cuantitativo). La estructura fue confirmada por LCMS.
Compuesto 113 (1,25 g, 2,7 mmol), HBTU (3,2 g, 8,4 mmol) y DIEA (2,8 mL, 16,2 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (17 mL) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 min. A esto se añadió una solución de Compuesto 105a (3,77 g, 8,4 mmol) en DMF anhidra (20 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se separó a presión reducida para obtener un aceite. El residuo se disolvió en CH2 O 2 (100 mL) y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 (100 mL) y salmuera (100 mL). La fase orgánica se separó, se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 10 al 20% en diclorometano para producir Compuesto 114 (1,45 g, 30%). La estructura se confirmó mediante LCMS y análisis de 1H RMN.
Compuesto 114 (1,43 g, 0,8 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (4 mL/4 mL). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,14 g). La mezcla de reacción se lavó abundantemente con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los líquidos de lavado se combinaron juntos y se evaporaron a presión reducida para producir Compuesto 115 (cuantitativo). La estructura se confirmó mediante LCMS y análisis de 1H RMN.
Compuesto 83a (0,17 g, 0,75 mmol), HBTU (0,31 g, 0,83 mmol) y DIEA (0,26 mL, 1,5 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (5 mL) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 min. A esto se añadió una solución de Compuesto 115 (1,22 g, 0,75 mmol) en DMF anhidra y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se separó a presión reducida y el residuo se disolvió en CH2Cl2. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 saturado acuoso y salmuera y se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró. La capa orgánica se concentró a sequedad y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 3 a 15% en diclorometano para producir Compuesto 116 (0,84 g, 61%). La estructura se confirmó mediante LC MS y análisis de 1H RMN.
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Compuesto 116 (0,74 g, 0,4 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1:1 (5 mL/5 mL). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,074 g). La mezcla de reacción se lavó abundantemente con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite. La almohadilla de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). El filtrado y los líquidos de lavado se combinaron juntos y se evaporaron a presión reducida para producir compuesto 117 (0,73 g, 98%). La estructura se confirmó mediante LCMS y análisis de 1H RMN.
Compuesto 117 (0,63 g, 0,36 mmol) se disolvió en DMF anhidra (3 mL). A esta solución se añadieron N,N-diisopropiletilamina (70 |jL, 0,4 mmol) y trifluoroacetato de pentafluorofenilo (72 |jL, 0,42 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 h y se vertió en una solución acuosa saturada de NaHCO3. La mezcla se extrajo con diclorometano, se lavó con salmuera y se secó sobre Na2SO4 anhidro. La solución de diclorometano se concentró a sequedad y se purificó con cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 5 a 10% en diclorometano para producir compuesto 118 (0,51 g, 79%). La estructura se confirmó mediante LCMS y 1H y 1H y
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Compuesto oligomérico 119, que comprende un grupo de conjugado GalNAc3-7 se preparó utilizando los procedimientos generales ilustrados en el Ejemplo 46. La parte de racimo de GalNAc3 del grupo de conjugado GalNAc3-7 (GalNAc3-7a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una diversidad de grupos de conjugado. En determinadas realizaciones, el resto escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
La estructura de GalNAc3-7 GalNAc3-7a-CM- se muestra a continuación:
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Ejemplo 51: Preparación de Oligonucleótido 155 que Comprende GalNAc3-6
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Compuesto 146 se sintetizó tal como se describe en la bibliografía (Analytical Biochemistry 1995, 229, 54-60).
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149
Compuesto 4 (15 g, 45,55 mmol) y compuesto 35b (14,3 gramos, 57 mmol) se disolvieron en CH2CI2 (200 ml). Se añadieron tamices moleculares activados (4 A. 2 g, en polvo) y se dejó agitar la reacción durante 30 minutos bajo atmósfera de nitrógeno. Se añadió TMS-OTf (4,1 ml, 22,77 mmol) y se dejó agitar la reacción a temp. ambiente durante la noche. Tras completarse, la reacción se enfrió bruscamente vertiéndola en solución de NaHCO3 acuosa saturada (500 ml) y hielo machacado (~150 g). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró hasta un aceite naranja a presión reducida. El material bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2O 2 para producir Compuesto 112 (16,53 g, 63%). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el compuesto esperado.
Compuesto 112 (4,27 g, 7,35 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (40 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono, 400 mg) y se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada (TLC MeOH al 10% en CH2O 2 y LCMS), el catalizador se separó por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró mediante evaporación rotatoria y se secó brevemente en alto vacío para producir Compuesto 105a (3,28 g). LCMS y 1H RMN eran consistentes con el producto deseado.
Compuesto 147 (2,31 g, 11 mmol) se disolvió en DMF anhidra (100 mL). Se añadió W,W-diisopropiletilamina (DIEA, 3,9 mL, 22 mmol), seguido de HBTU (4 g, 10,5 mmol). Se dejó agitar la mezcla de reacción durante ~ 15 minutos bajo nitrógeno. A esto se añadió una solución de compuesto 105a (3,3 g, 7,4 mmol) en DMF seca y se agitó durante 2 h bajo atmósfera de nitrógeno. La reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un jarabe de naranja. El material bruto se purificó por cromatografía en columna con MeOH al 2-5 % en CH2O 2 para producir Compuesto 148 (3,44 g, 73 %). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el producto esperado.
Compuesto 148 (3,3 g, 5,2 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (75 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (350 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se separó por filtración a través de una almohadilla de celite. El filtrado se concentró mediante evaporación rotatoria y se secó brevemente en alto vacío para producir Compuesto 149 (2,6 g). LCMS fue consistente con el producto deseado. El residuo se disolvió en DMF seco (10 ml) y se utilizó inmediatamente en la siguiente etapa.
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Compuesto 146 (0,68 g, 1,73 mmol) se disolvió en DMF seca (20 ml). A esto se añadieron DIEA (450 |jL, 2,6 mmol, 1,5 eq.) y HBTU (1,96 g, 0,5,2 mmol). Se dejó agitar la mezcla de reacción durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se añadió una solución de compuesto 149 (2,6 g) en DMF anhidra (10 mL). El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de DIEA (si era necesario). Se dejó agitar la reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 h. Tras la compleción, la reacción se diluyó con EtOAc (100 mL) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2O 2 para producir Compuesto 150 (0,62 g, 20 %). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el producto deseado.
Compuesto 150 (0,62 g) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (5 L). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (60 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Tras la compleción (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMs ), el catalizador se separó por filtración (filtro de Teflon con punta de jeringa, 0,45 jm ). El filtrado se concentró mediante evaporación rotatoria y se secó brevemente en alto vacío para producir Compuesto 151 (0,57 g). La LCMS fue consistente con el producto deseado. El producto se disolvió en 4 mL de DMF seca y se utilizó inmediatamente en la siguiente etapa.
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Compuesto 83a (0,11 g, 0,33 mmol) se disolvió en DMF anhidra (5 mL) y se añadieron N,N-diisopropiletilamina (75 |jL, 1 mmol) y PFP-TFA (90 |jL, 0,76 mmol). La mezcla de reacción se volvió magenta al entrar tras contacto y gradualmente se volvió naranja a lo largo de los siguientes 30 minutos. El progreso de la reacción se controló mediante TLC y LCMS. Tras la compleción (formación del éster de PFP), se añadió una solución de compuesto 151 (0,57 g, 0,33 mmol) en DMF. El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de N,N-diisopropiletilamina (si era necesario). La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~ 30 min. Tras la compleción, la mayor parte del disolvente se separó a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2O 2 y se lavó con NaHC03 acuoso saturado, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró hasta un jarabe de naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice ( MeOH al 2-10% en CH2 O 2 ) para producir Compuesto 152 (0,35 g, 55 %). LCMS y 1H RMN fueron consistentes con el producto deseado.
Compuesto 152 (0,35 g, 0,182 mmol) se disolvió en MeOH/EtOAc 1:1 (10 mL). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (35 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Tras la compleción (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se separó por filtración (filtro de Teflon con punta de jeringa, 0,45 jm ). El filtrado se concentró mediante evaporación rotatoria y se secó brevemente en alto vacío para producir Compuesto 153 (0,33 g, cuantitativo). La LCMS fue consistente con el producto deseado.
Compuesto 153 (0,33 g, 0,18 mmol) se disolvió en DMF anhidra (5 mL) con agitación bajo nitrógeno.. A esto se añadieron W,W-diisopropiletilamina (65 jL , 0,37 mmol) y PFP-TFA (35 jL , 0,28 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~ 30 min. La mezcla de reacción se volvió magenta al entrar en contacto y gradualmente se volvió naranja. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a pH = 9-10 añadiendo más N,-diisopropiletilamina. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Tras la compleción, la mayor parte del disolvente se separó a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2Cl2 (50 mL) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró hasta un jarabe de color naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2CI2 para producir Compuesto 154 0,29 , 79 % . LCMS 1H RMN fueron consistentes con el producto deseado.
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Compuesto oligomérico 155, que comprende un grupo de conjugado GalNAc3-6 se preparó utilizando los procedimientos generales ilustrados en el Ejemplo 46. La parte de racimo de GalNAc3 del grupo de conjugado GalNAc3-6 (GalNAc3-6a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una diversidad de grupos de conjugado. En determinadas realizaciones, el resto escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
La estructura de GalNAc3-6 GalNAc3-6a-CM- se muestra a continuación:
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Ejemplo 56: Estudio dependiente de la dosis de oligonucleótidos que comprende un grupo de conjugado 3' o 5' (comparación de GalNAc3-1, 2, 3, 5, 6, 7 y 10) que fija como objetivo SRB-1 in vivo
Los oligonucleótidos enumerados a continuación se testaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.. Se incluyó ISIS 353382 no conjugado como patrón. Cada uno de los diversos grupos de conjugado GalNAc3 se fijó en el extremo 5' del oligonucleótido respectivo mediante un nucleósido de 2'-desoxiadenosina enlazada por fosfodiéster (resto escindible), excepto ISIS 655861 que tenía el grupo de conjugado de GalNAc3 fijado en el extremo 3'
Tabla 42
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Las letras mayúsculas indican la nucleobase de cada uno de los nucleósidos y mC indica una 5-metil citosina. Subíndices: "e" indica nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica un P-D-2-desoxirribonucleósido; "s" indica enlaces internucleosídicos fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos fosfodiéster (PO); y "o" 'indica -OP(=O)(OH)-. Los grupos de conjugado están en negrita.
La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el Ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-2a se mostró previamente en el Ejemplo 37. La estructura de GalNAc3-3a se mostró previamente en el Ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-5a se mostró previamente en el Ejemplo 49. La estructura de GalNAc3-6a se mostró previamente en el Ejemplo 51. La estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el Ejemplo 48. La estructura de GalNAc3-10a se mostró previamente en el Ejemplo 46.
Tratamiento
Se inyectaron por vía subcutánea una vez ratones Balb/c machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a la dosificación que se muestra a continuación con ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 o con solución salina. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 hepático utilizando la PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados que figuran a continuación se presentan como el porcentaje medio de niveles de ARNm de SRB-1 para cada uno de los grupos de tratamiento, normalizados al control de solución salina.
Tal como se ilustra en la Tabla 43, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis. De hecho, los oligonucleótidos antisentido conjugados mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Los oligonucleótidos antisentido conjugados en 5' mostraron un ligero aumento de la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido 3' conjugado.
Tabla 43
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Los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero, se midieron con relación a ratones a los que se inyectó solución salina utilizando protocolos estándares. También se evaluaron bilirrubina total y BUN. El cambio en el peso corporal se evaluó sin cambios significativos con respecto al grupo de solución salina. Los valores de ALT, AST, bilirrubina total y BUN se muestran en la Tabla 44 que figura a continuación.
Tabla 44
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Ejemplo 80: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos que fijan como objetivo Alfa-1 Antitripsina (A1AT) que comprende un Conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 72 que figura a continuación se testaron en un estudio para la inhibición dependiente de la dosis de A1AT en ratones.
Tabla 72
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La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el Ejemplo 9, la estructura de GalNAc3-3a se mostró previamente en el Ejemplo 39, la estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el Ejemplo 48, la estructura de GalNAc3-10a se mostró previamente en el Ejemplo 46 y la estructura de GalNAc3-13a se mostró previamente en el Ejemplo 62.
Tratamiento
Se inyectaron a cada uno de los ratones C57BL/6 machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) por vía subcutánea una vez por semana a la dosificación que se muestra más adelante, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 72 o con PBS. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm hepático de A1AT se determinaron utilizando la PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándares. Los niveles de proteína plasmática de A lA T se determinaron utilizando el ELISA de Alfa 1-Antitripsina de Ratón (catálogo n° 41-A1AMS-E01, Alpco, Salem, NH). Los resultados que figuran a continuación se presentan como el porcentaje promedio de ARNm de hígado de A1AT y niveles de proteína plasmática para cada uno de los grupos de tratamiento, normalizados al control de PBS.
Tal como se ilustra en la Tabla 73, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de A1AT y de proteína plasmática A1AT de una manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron significativamente más potentes que el precursor (ISIS 476366).
Tabla 73
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Los niveles de transaminasa hepática y BUN en plasma se midieron en el momento del sacrificio utilizando protocolos estándares. También se midieron los pesos corporales y de los órganos. Los resultados se muestran en la Tabla 74 que figura a continuación. El peso corporal se muestra como % con respecto al valor de referencia. Los pesos de los órganos se muestran como % del peso corporal con relación al grupo de control PBS.
Tabla 74
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Ejemplo 81: Duración de la acción in vivo de oligonucleótidos que fijan como objetivo A1AT que comprenden un racimo GalNAc3 Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 72 se testaron en un estudio de dosis única para duración de la acción en ratones.
Tratam iento
Se inyectó por vía subcutánea una vez a ratones C57BL/6 machos de seis semanas de edad a cada uno un oligonucleótido enumerado en la Tabla 72 o con PBS. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 4 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a los 5, 12, 19 y 25 días después de la dosis. Los niveles de proteína A1At en plasma se midieron mediante ELISA (véase el Ejemplo 80). Los resultados que figuran a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína A1AT en plasma para cada uno de los grupos de tratamiento, normalizados a los niveles del valor de referencia. Los resultados demuestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc eran más potentes y tenían una duración de acción más prolongada que el precursor que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 476366). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 678381, 678382, 678383 y 678384) eran generalmente incluso más potentes con una duración de acción incluso más prolongada que el oligonucleótido que comprende un conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656326).
Tabla 75
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Ejemplo 82: Inhibición antisentido in v itro por oligonucleótidos que fijan como objetivo SRB-1 que comprende un conjugado de GalNAc3
Se sembraron hepatocitos primarios de hígado de ratón en placas de 96 pocilios a razón de 15.000 células/pocillo 2 horas antes del tratamiento. Se añadieron los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 76 a 2, 10, 50 o 250 nM en medio Williams y las células E se incubaron durante la noche a 37 °C en 5% de CO2. Las células se lisaron 16 horas después de la adición de oligonucleótidos y el ARN total se purificó utilizando RNasa 3000 BioRobot (Qiagen). Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron utilizando la PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándares. Los valores de CI50 se determinaron utilizando el software Prism 4 (GraphPad). Los resultados demuestran que los oligonucleótidos que comprenden una diversidad de diferentes grupos conjugados GalNAc y una diversidad de diferentes restos escindibles son significativamente más potentes en un experimento de absorción libre in vitro que los oligonucleótidos precursores que carecen de un grupo de conjugado GalNAc (ISIS 353382 y 666841).
Tabla 76
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La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el Ejemplo 9, GalNAc3-3a se mostró en el Ejemplo 39, GalNAc3-5a se mostró en el Ejemplo 49, GalNAc3-6a se mostró en el Ejemplo 51, GalNAc3-7a se mostró en el Ejemplo 48, GalNAc3-8a se mostró en el Ejemplo 47, GalNAc3-9a se mostró en el Ejemplo 52, GalNAc3-10a se mostró en el Ejemplo 46, GalNAc3-12a se mostró en el Ejemplo 61, GalNAc3-13a se mostró en el Ejemplo 62, GalNAc3-14a se mostró en el Ejemplo 63, GalNAc3-15a se mostró en el Ejemplo 64, GalNAc3-17a se mostró en el Ejemplo 68, GalNAc3-18a se mostró en el Ejemplo 69, GalNAc3-19a se mostró en el Ejemplo 70, GalNAc3-20a se mostró en el Ejemplo 71 y GalNAc3-23a se mostró en el Ejemplo 76.
Ejemplo 83: Inhibición antisentido in vitro por oligonucleótidos que fijan como objetivo Factor XI que comprende un racimo de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 que figura a continuación se testaron en un estudio para la inhibición dependiente de la dosis de Factor XI en ratones.
Tabla 77
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La estructura de GalNAc3-1a se mostró previamente en el Ejemplo 9, la estructura de GalNAc3-3a se mostró previamente en el Ejemplo 39, la estructura de GalNAc3-7a se mostró en el Ejemplo 48, la estructura de GalNAc3-10a se mostró en el Ejemplo 46 y la estructura de GalNAc3-13a se mostró en el Ejemplo 62.
Tratamiento
Se inyectaron a cada uno de ratones de ocho semanas de edad por vía subcutánea una vez por semana a una dosificación que se muestra más adelante, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado más adelante o con PBS. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la dosis final. Los niveles de ARNm del hígado del Factor XI se midieron utilizando la PCR en tiempo real y se normalizaron a ciclofilina de acuerdo con protocolos estándares. También se midieron transaminasas hepáticas, BUN y bilirrubina. Los resultados que figuran a continuación se presentan como el porcentaje medio para cada uno de los grupos de tratamiento, normalizados al control de PBS.
Tal como se ilustra en la Tabla 78, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo el ARNm de Factor XI de una manera dependiente de la dosis. Los resultados demuestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc eran más potentes que el precursor que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) eran generalmente incluso más potentes que el oligonucleótido que comprende un conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 78
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Ejemplo 84: Duración de la acción in vivo de oligonucleótidos que fijan como objetivo Factor XI que comprende un Conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 se testaron en un estudio de dosis única para la duración de la acción en ratones.
Tratam iento
Se inyectó por vía subcutánea una vez a ratones de seis a ocho semanas de edad a cada uno un oligonucleótido enumerado en la Tabla 77 o con PBS. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 4 animales. Se extrajo sangre por sangrados de la cola el día antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a los 3, 10 y 17 días después de la dosis. Los niveles de proteína del Factor XI en plasma se midieron mediante ELISA utilizando anticuerpos de captura y detección biotinilados de Factor XI de R & D Systems, Minneapolis, MN (n° de catálogo AF2460 y n° BAF2460, respectivamente) y OptEIA Reagent Set B (n° de catálogo 550534, Bd Biosciences, San Jose, CA). Los resultados que figuran a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína Factor XI en plasma para cada uno de los grupos de tratamiento, normalizados a los niveles del valor de referencia.
Los resultados demuestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc eran más potentes con una duración de acción más prolongada que el precursor que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) eran incluso más potentes con una duración de acción incluso más prolongada que el oligonucleótido que comprende un conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 79
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Ejemplo 89: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos que fijan como objetivo Apolipoproteína A (Apo(a)) que comprende un conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 92 que figura a continuación se testaron en un estudio para la inhibición dependiente de la dosis de Apo(a) en ratones transgénicos.
Tabla 92
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La estructura de GalNAc3-7a se mostró en el Ejemplo 48.
Tratamiento
Se inyectaron a cada uno de los ratones C57BL/6 hembras de ocho semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) por vía subcutánea una vez por semana a la dosificación que se muestra más adelante, para un total de seis dosis, con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 92 o con p Bs . Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 3-4 animales. Los sangrados de la cola se realizaron el día antes de la primera dosis y semanalmente después de cada una de las dosis para determinar los niveles de proteína Apo(a) en plasma. Los ratones fueron sacrificados dos días después de la administración final. Los niveles de ARNm hepático de Apo(a) se determinaron utilizando la PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándares. Los niveles de proteína plasmática de Apo(a) se determinaron utilizando ELISA y se determinaron los niveles de transaminasas hepáticas. Los resultados de ARNm y proteína plasmática en la Tabla 93 se presentan como el porcentaje medio del grupo de tratamiento en relación con el grupo tratado con PBS. Los niveles de proteína plasmática se normalizaron adicionalmente al valor de referencia (BL) para el grupo de PBS. Los niveles medios absolutos de transaminasas y los pesos corporales (% en relación con los promedios del valor de referencia) se reseñan en la Tabla 94.
Tal como se ilustra en la Tabla 93, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de Apo(a) y de proteína plasmática de una manera dependiente de la dosis. Además, el oligonucleótido que comprende el conjugado de GalNAc fue significativamente más potente con una acción de mayor duración que el oligonucleótido precursor que carece de un conjugado de GalNAc. Como se ilustra en la Tabla 94, los oligonucleótidos no afectaron los niveles de transaminasas ni los pesos corporales, lo que indica que los oligonucleótidos se toleraron bien.
Tabla 93
Figure imgf000092_0003
Tabla 94
Figure imgf000092_0001
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Ejemplo 93: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos que fijan como objetivo SRB-1 que comprende alas y un conjugado de 5'-GalNAc3 mixtos
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 100 se testaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones..
Tabla 100
Figure imgf000093_0001
La estructura de GalNAc3-3a se demostró previamente en el Ejemplo 39, y la estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el Ejemplo 48. Subíndices: "e" indica nucleósido modificado 2 'MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "k" indica nucleósido bicíclico 6 -SJ-CH3 (cEt); "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos fosfodiéster (PO). El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas.
Tratam iento
Se inyectaron a ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) por vía subcutánea una vez la dosificación que se muestra más adelante, con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 100 o con solución salina. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 4 animales. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm de SRB-1 hepático se midieron utilizando PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de SRB-1 se normalizaron a los niveles de ARNm de ciclofilina de acuerdo con protocolos estándares. Los resultados se presentan como el porcentaje medio de niveles de ARNm de SRB-1 para cada uno de los grupos de tratamiento con relación al grupo control de solución salina. Como se ilustra en la Tabla 101, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis, y los oligonucleótidos gapmero que comprenden un conjugado de GalNAc y que tienen alas que eran modificaciones de cEt completo o azúcares mixtos fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido precursor que carece de un conjugado y que comprende alas modificadas con cEt completo.
También se midieron los pesos corporales, las transaminasas hepáticas, la bilirrubina total y BUN, y los valores medios para cada uno de los grupos de tratamiento se muestran en la Tabla 101. El peso corporal se muestra como el porcentaje de peso corporal medio con relación al peso corporal inicial (% BL) medido justo antes de la dosis de oligonucleótidos.
Tabla 101
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Ejemplo 95: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos que fijan como objetivo SRB-1 que comprende nucleósidos bicíclicos y un conjugado de 5'-GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 104 se testaron en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones..
Tabla 104
Figure imgf000094_0001
Figure imgf000094_0002
Figure imgf000095_0001
El subíndice "g" indica un nucleósido fluoro-HNA, el subíndice "1" indica un nucleósido bloqueado que comprende un puente 2-O-CH 2 -4'. Véase la leyenda de la tabla del Ejemplo 74 para ver otras abreviaturas. La estructura de GalNAc 3 -1 a se mostró previamente en el Ejemplo 9, la estructura de GalNAc 3 -3 a se mostró previamente en el Ejemplo 39 y la estructura de GalNAc 3 -7a se mostró previamente en el Ejemplo 48.
Tratamiento
El estudio se completó utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 93. Los resultados se muestran en la Tabla 105 que figura más adelante y muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc y diversas modificaciones de nucleósidos bicíclicos eran significativamente más potentes que el oligonucleótido precursor que carece de un conjugado y comprende modificaciones de nucleósidos bicíclicos. Además, el oligonucleótido que comprende un conjugado de GalNAc y modificaciones de fluoro-HNA fue significativamente más potente que el precursor que carece de un conjugado y que comprende modificaciones de fluoro-HNA. Los resultados de las mediciones de pesos corporales, transaminasas hepáticas, bilirrubina total y BUN indicaron que todos los compuestos fueron bien tolerados.
Tabla 105
Figure imgf000095_0002
Ejemplo 96: Unión a proteínas plasmáticas de oligonucleótidos antisentido que comprenden un grupo de conjugado GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 70 que fijan como objetivo ApoC-III y oligonucleótidos en la Tabla 106 que fijan como objetivo Apo(a) se testaron en un ensayo de ultra-filtración con el fin de evaluar la unión a proteínas plasmáticas.
Tabla 106
Figure imgf000096_0001
Véase el Ejemplo 74 para la leyenda de la tabla. La estructura de GalNAc3-7a se mostró previamente en el Ejemplo 48.
Las unidades de ultrafiltración Ultrafree-MC (30.000 NMWL, membrana de celulosa regenerada de baja unión, Millipore, Bedford, MA) se pre-acondicionaron con 300 |jL de Tween 80 al 0,5% y se centrifugaron a 2000 g durante 10 minutos, luego con 300 j L de una solución de 300 jg/m L de un oligonucleótido de control en H2O y se centrifugó a 2000 g durante 16 minutos. Con el fin de evaluar la unión a los filtros de cada uno de los oligonucleótidos de ensayo de las Tablas 70 y 106 a ser utilizado en los estudios, 300 j L de una solución 250 ng/mL de oligonucleótido en H2O a pH 7,4 se colocó en los filtros pre-acondicionados y se centrifugó a 2000 g durante 16 minutos. Las muestras no filtradas y filtradas se analizaron mediante un ensayo ELISA para determinar las concentraciones de oligonucleótidos. Se utilizaron tres réplicas para obtener una concentración media para cada una de las muestras. La concentración media de la muestra filtrada con relación a la muestra no filtrada se utiliza para determinar el porcentaje de oligonucleótido que se recupera a través del filtro en ausencia de plasma (% de recuperación).
Las muestras de plasma entero congelado recogidas en K3-EDTA de voluntarios humanos normales, sin fármaco, monos cynomolgus y ratones CD-1, se adquirieron de Bioreclamation LLC (Westbury, NY). Los oligonucleótidos de ensayo se añadieron a partes alícuotas de plasma de 1,2 mL a dos concentraciones (5 y 150 jg/mL). Se colocó una parte alícuota (300 j L) de cada una de las muestras de plasma enriquecida en una unidad de filtro pre-acondicionada y se incubó a 37°C durante 30 minutos, seguido inmediatamente de centrifugación a 2000 g durante 16 minutos. Se analizaron partes alícuotas de muestras de plasma enriquecidas filtradas y no filtradas mediante un ELISA para determinar la concentración de oligonucleótidos en cada una de las muestras. Se utilizaron tres réplicas por concentración para determinar el porcentaje medio de oligonucleótidos unidos y no unidos en cada una de las muestras. La concentración media de la muestra filtrada con relación a la concentración de la muestra no filtrada se utiliza para determinar el porcentaje de oligonucleótido en el plasma que no se une a proteínas de plasma (% no unido). Los valores finales de oligonucleótidos no unidos se corrigen para la unión no específica dividiendo el% no unido por el% de recuperación para cada uno de los oligonucleótidos. Los valores del % final de oligonucleótidos unidos se determinan restando los valores del % final no unido de 100. Los resultados se muestran en la Tabla 107 para las dos concentraciones de oligonucleótidos testadas (5 y 150 jg/mL) en cada especie de plasma. Los resultados demuestran que los grupos de conjugado de GalNAc no tienen un impacto significativo en la unión a proteínas plasmáticas. Además, los oligonucleótidos con enlaces internucleosídicos PS completos y enlaces PO/PS mixtos se unen ambos a proteínas plasmáticas, y aquellos con enlaces PS completos se unen a proteínas plasmáticas en un grado algo mayor que aquellos con enlaces Po /PS mixtos.
Tabla 107
Figure imgf000097_0001
Ejemplo 98: Evaluación de los efectos pro-inflamatorios de oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc en el ensayo de hPMBC
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 109 se testaron para determinar sus efectos pro-inflamatorios en un ensayo de hPMBC tal como se describe en los Ejemplos 23 y 24. (Véanse las Tablas 30, 83, 95 y 108 para las descripciones de los oligonucleótidos). ISIS 353512 es un alto respondedor utilizado como control positivo, y los otros oligonucleótidos se describen en las Tablas 83, 95 y 108. Los resultados mostrados en la Tabla 109 se obtuvieron utilizando sangre de un donante voluntario. Los resultados demuestran que los oligonucleótidos que comprenden enlaces internucleosídicos mixtos de PO/PS produjeron respuestas pro-inflamatorias significativamente menores en comparación con los mismos oligonucleótidos que tienen enlaces PS completos. Además, el grupo de conjugado de GalNAc no tuvo un efecto significativo en este ensayo.
Tabla 109
Figure imgf000097_0002
Ejemplo 99: Afinidades de unión de oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc para el receptor de asialoglicoproteína
Las afinidades de unión de los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 110 (véase la Tabla 76 para descripciones de los oligonucleótidos) para el receptor de asialoglicoproteína se testaron en un ensayo de unión al receptor competitivo. El ligando competidor, a1-glicoproteína ácida (AGP), se incubó en tampón acetato de sodio 50 mM (pH 5) con 1 U de neuraminidasa-agarosa durante 16 horas a 37°C, y se confirmó un > 90% de desialilación mediante un ensayo de ácido siálico. o cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se utilizó monocloruro de yodo para yodar la AGP de acuerdo con el procedimiento de Atsma et al. (véase J Lipid Res. Enero de 1991; 32( 1 ):173-81.) En este método, se añadió a1-glicoproteína ácida desialilada (de-AGP) a cloruro de yodo 10 mM, Na1
0,25 M. Después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, de-AGP marcada con 125I se separó del 125I libre concentrando la mezcla dos veces utilizando una columna giratoria 3 KDMWCO. La proteína se testó para determinar su eficacia y pureza de marcaje en un sistema de HPLC equipado con una columna Agilent SEC-3 (7,8 x 300 mm) y un contador p-RAM. Los experimentos de competencia utilizando de-AGP marcada con 125I y diversas ASOs que contienen racimos de GalNAc-se realizaron como sigue. Células HepG2 humana (106células/ml) se sembraron en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de crecimiento apropiados. Se utilizó medio MEM complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, L-glutamina 2 mM y HEPES 10 mM. Las células se incubaron durante 16-20 horas a 37°C con 5% y 10% de CO2 , respectivamente. Las células se lavaron con medio sin FBS antes del experimento. Las células se incubaron durante 30 min a 37°C con 1 ml de mezcla de competencia que contenía medios de crecimiento adecuados con FBS al 2%, de-AGP marcada con 125I 10'8 M y ASOs que contienen racimos de GalNAc a concentraciones que varían de 10'11 to 10'5 M. La unión no específica se determinó en presencia de azúcar de GalNAc 10'2 M. Las células se lavaron dos veces con medio sin FBS para separar la de-AGP marcada con 125I no unida y el ASO de GalNAc competidor. Las células se lisaron utilizando tampón RLT de Qiagen que contenía 1% de p-mercaptoetanol. Los lisados se transfirieron a tubos de ensayo de fondo redondo después de un breve ciclo de congelación/descongelación de 10 min y se analizaron en un contador Y- La unión no específica se restó antes de dividir los recuentos de proteína 125I por el valor de los recuentos de concentración de GalNAc-ASO más bajos. Las curvas de inhibición se ajustaron de acuerdo con una ecuación de unión competitiva de un solo sitio utilizando un algoritmo de regresión no lineal para calcular las afinidades de unión (Kd 's)..
Los resultados de la Tabla 110 se obtuvieron a partir de experimentos realizados en cinco días diferentes. Los resultados para los oligonucleótidos marcados con un superíndice "a" son la media de experimentos realizados en dos días diferentes. Los resultados demuestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo de conjugado GalNAc en el extremo 5' se unen al receptor de asialoglicoproteína en células HepG2 humanas con una afinidad de 1,5 a 16 veces mayor que los oligonucleótidos que comprenden un grupo de conjugado GalNAc en el extremo 3'.
Tabla 110
Figure imgf000098_0002
Ejemplo 100: Inhibición antisentido in vivo mediante oligonucleótidos que comprenden un grupo de conjugado de GalNAc que fija como objetivo Apo(a) in vivo
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 111a se testaron en un estudio de dosis única para la duración de la acción en ratones.
Tabla
Figure imgf000098_0001
La estructura de GalNAc 3 -7 a se mostró en el Ejemplo 48.
Tratamiento
A cada uno de ratones transgénicos hembras que expresan Apo(a) humana se les inyectó por vía subcutánea una vez por semana, para un total de 6 dosis, un oligonucleótido y la dosificación enumerada en la Tabla 111b o con PBS. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 3 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar los niveles basales de proteína Apo(a) en plasma y a las 72 horas, 1 semana y 2 semanas después de la primera dosis. Se realizarán extracciones de sangre adicionales a las 3 semanas 4 semanas, 5 semanas y 6 semanas después de la primera dosis. Los niveles plasmáticos de proteína Apo(a) se midieron utilizando un ELISA. Los resultados en la Tabla 111b se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína Apo(a) en plasma para cada uno de los grupos de tratamiento, normalizados a los valores de referencia (% BL).Los resultados demuestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo de conjugado de GalNAc exhibieron una potente reducción en la expresión de Apo(a). Este potente efecto se observó para el oligonucleótido que comprende enlaces internucleosídicos PS completos y el oligonucleótido que comprende enlaces mixtos PO y PS.
Tabla 111b
Figure imgf000099_0001
Ejemplo 101: Inhibición antisentido mediante oligonucleótidos que comprenden un racimo de GalNAc enlazado a través de un resto estable
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 112 se testaron para determinar la inhibición de la expresión de APOC-III de ratón in vivo. Se inyectó por vía subcutánea una vez a ratones C57B1/6 a cada uno un oligonucleótido enumerado en la Tabla 112 o con PBS. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 4 animales. Cada uno de los ratones tratados con ISIS 440670 recibió una dosis de 2, 6, 20 o 60 mg/kg. Cada uno de los ratones tratados con ISIS 680772 o 696847 recibió 0,6, 2, 6 o 20 mg/kg. El grupo de conjugado de GalNAc de ISIS 696847 está enlazado mediante un resto estable, un enlace fosforotioato en lugar de un enlace que contiene fosfodiéster fácilmente escindible. Los animales fueron sacrificados 72 horas después de la dosis. Los niveles de ARNm de APOC-III hepático se midieron utilizando la PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de APOC-III se normalizaron a los niveles de ARNm de ciclofilina de acuerdo con protocolos estándares. Los resultados se presentan en la Tabla 112 como el porcentaje medio de niveles de ARNm de APOC-III para cada uno de los grupos de tratamiento con relación al grupo control de solución salina. Los resultados demuestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo de conjugado de GalNAc eran significativamente más potentes que el oligonucleótido que carece de un grupo de conjugado. Además, el oligonucleótido que comprende un grupo de conjugado de GalNAc enlazado al oligonucleótido mediante un resto escindible (ISIS 680772) fue incluso más potente que el oligonucleótido que comprende un grupo de conjugado de GalNAc enlazado al oligonucleótido mediante un resto estable (ISIS 696847).
Tabla 112
Figure imgf000099_0002
La estructura de GalNAc 3 -7 a se mostró en el Ejemplo 48.
Ejemplo 108: Inhibición antisentido in vivo mediante oligonucleótidos que comprenden un grupo de conjugado de GalNAc que fija como objetivo Apo(a) in vivo
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 118 que figura a continuación se testaron en un estudio de dosis única en ratones.
Tabla 118
Figure imgf000100_0001
La estructura de GalNAc3-7a se mostró en el Ejemplo 48.
Tratamiento
A cada uno de ratones transgénicos machos que expresan Apo(a) humana se les inyectó por vía subcutánea una vez un oligonucleótido y la dosificación enumerada en la Tabla 119 o con PBS. Cada uno de los grupos de tratamiento consistía en 4 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar los niveles del valor de referencia de proteína Apo(a) en plasma y a 1 semana después de la primera dosis. Se realizarán extracciones de sangre adicionales semanalmente durante aproximadamente 8 semanas. Los niveles plasmáticos de proteína Apo(a) se midieron utilizando un ELISA. Los resultados en la Tabla 119 se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína Apo(a) en plasma para cada uno de los grupos de tratamiento, normalizados a los valores de referencia (% BL).Los resultados demuestran que los oligonucleótidos antisentido reducían la expresión de proteína Apo(a). Además, los oligonucleótidos que comprenden un grupo de conjugado de GalNAc exhibieron una reducción incluso más potente en la expresión de Apo(a) que el oligonucleótido que no comprende un grupo de conjugado.
Tabla 119
Figure imgf000101_0001

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo de conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y tiene una secuencia de nucleobases que comprende 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 3901 a 3920 de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a SEQ ID NO: 1; y en donde el grupo conjugado comprende:
    Figure imgf000292_0001
    (i) el oligonucleótido modificado comprende al menos un azúcar modificado, opcionalmente en donde: (a) al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico, opcionalmente un etilo restringido o un azúcar que comprende un puente 4'-(CH 2 ) n -O-2', en donde n es 1 o 2, o (b) al menos un azúcar modificado comprende un 2'-O-metoxietilo, o es un 3'-fluoro-HNA,
    (ii) al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada, en donde opcionalmente la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina, y/o
    (iii) cada uno de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido modificado se selecciona de un enlace internucleosídico fosfodiéster y un enlace internucleosídico fosforotioato, opcionalmente en donde el oligonucleótido modificado comprende: (a) al menos 5 enlaces internucleosídicos fosfodiéster o (b) al menos 2 enlaces internucleosídicos fosforotioato.
    3. El compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el oligonucleótido modificado es de cadena sencilla.
    4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el grupo de conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 5' del oligonucleótido modificado.
    5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el grupo de conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 3' del oligonucleótido modificado.
    6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el grupo de conjugado comprende:
    Figure imgf000292_0002
    en donde el resto escindible (CM) es un enlace o grupo que es capaz de dividirse en condiciones fisiológicas.
    7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el grupo de conjugado comprende:
    Figure imgf000293_0001
    8. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
    un segmento de hueco que consiste en desoxinucleósidos enlazados;
    un segmento de ala en 5' que consiste en nucleósidos enlazados;
    un segmento de ala en 3' que consiste en nucleósidos enlazados;
    en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3' y en donde cada uno de los nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala comprende un azúcar modificado.
    9. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
    un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
    un segmento de ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados;
    un segmento de ala en 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados;
    en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3' y en donde cada uno de los nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo y en donde cada uno de los residuos citosina es una 5-metilcitosina.
    10. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos enlazados y tiene la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 58, y en donde el oligonucleótido modificado comprende: un segmento de hueco que consiste en diez desoxinucleósidos enlazados;
    un segmento de ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos enlazados;
    un segmento de ala en 3' que consiste en cinco nucleósidos enlazados;
    en donde el segmento de hueco está situado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3' y en donde cada uno de los nucleósidos de cada uno de los segmentos de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, en donde al menos un enlace internucleósido es un enlace de fosforotioato y en donde cada uno de los residuos de citosina es una 5-metilcitosina.
    11. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:
    Figure imgf000294_0001
    en donde R 1 es -OCH2 CH2 OCH3 (MOE) y R 2 es H; o R 1 y R 2 juntos forman un puente, en donde R 1 es -O- y R 2 es -CH2-, -CH(CH 3 )- o -CH2 CH2 -, y R 1 y R 2 están conectados directamente de manera que el puente resultante se seleccione de: -O-CH2-, -O-CH(CH 3 )- y -O-CH2 CH2-;
    y para cada uno de los pares de R 3 y R 4 en el mismo anillo, independientemente para cada uno de los anillos: R 3 se selecciona de H y -OCH2 CH2 OCH3 y R 4 es H; o R 3 y R 4 juntos forman un puente, en donde R 3 es -O-, y R 4 es - CH2-, -CH(CH 3 )-, o -CH2 CH2-y R 3 y R 4 están conectados directamente de manera que el puente resultante se seleccione de: -O-CH2 -, -O-CH(CH 3 )- y -O-CH2 CH2 -;
    y R 5 se selecciona de H y -CH3 ;
    y Z se selecciona de S ' y O ' .
    12. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:
    Figure imgf000295_0001
    13. El compuesto de cualquier reivindicación precedente, en donde el compuesto está en forma de sal, opcionalmente en donde el compuesto está en forma de sal de sodio y/o sal de potasio.
    14. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, y un diluyente o soporte farmacéuticamente aceptable.
    15. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, o una composición de acuerdo con la reivindicación 14, para uso en el tratamiento, la prevención o la ralentización de la progresión de una enfermedad relacionada con apo(a) elevada y/o Lp(a) elevada.
    16. El compuesto o la composición para uso de la reivindicación 15, en donde la enfermedad es una enfermedad, trastorno o afección inflamatorio, cardiovascular o metabólico.
    17. El compuesto o la composición para uso de la reivindicación 15, en donde la enfermedad es estenosis aórtica o angina.
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