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DE3788914T2 - Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere. - Google Patents

Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.

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DE3788914T2
DE3788914T2 DE3788914T DE3788914T DE3788914T2 DE 3788914 T2 DE3788914 T2 DE 3788914T2 DE 3788914 T DE3788914 T DE 3788914T DE 3788914 T DE3788914 T DE 3788914T DE 3788914 T2 DE3788914 T2 DE 3788914T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
rna
mixed
reaction
oligomer
strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE3788914T
Other languages
English (en)
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DE3788914D1 (de
Inventor
Hideo Inoue
Hirokazu Morisawa
Sachiko Mukai
Touru Nishihara
Eiko Ootsuka
Shibahara Susumu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26349547&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE3788914(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from JP62013726A external-priority patent/JP2555579B2/ja
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Publication of DE3788914D1 publication Critical patent/DE3788914D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3788914T2 publication Critical patent/DE3788914T2/de
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Verbindung, die zur bevorzugten Spaltung einer Phosphodiesterbindung an einer spezifischen Position der RNA verwendet werden kann. Erfindungsgemäß wird also ein nützliches Mittel zur Herstellung z. B. einer Deletionsmutante bereitgestellt. Mit der Erfindung wird also in einem allgemeinen Sinn ein wirksames Mittel zur Behandlung von RNA im Fall von molekularbiologischen Versuchen, die z. B. auf die Massenproduktion nützlicher Proteine, auf die Verbesserung der Eigenschaften von Proteinen, auf Untersuchungen zwischen der Struktur und der Funktion von Proteinen, auf die Entwicklung von Methoden zur Beseitigung toxischer Komponenten in toxischen RNA-Viren, auf die Entwicklung von Methoden zur Behandlung von Krankheiten, die durch toxische Viren verursacht werden, und auf verschiedene Untersuchungen, die die Molekularbiologie betreffen, gerichtet sind, bereitgestellt.
  • Die Erfindung betrifft Oligomere, die in der neuartigen Verbindung verwendet werden sollen, und Ausgangsmaterialien für die Synthese der Oligomere.
  • Ein Verfahren zur bevorzugten Spaltung einer Phosphodiesterbindung an einer gewünschten Position eines RNA-Moleküls dient als geeignete Maßnahme zur Untersuchung der Struktur und Funktion eines funktionellen RNA-Moleküls. zum Beispiel kann ein derartiges Verfahren bei Untersuchungen zur Struktur und Stabilität von mRNA, die ein nützliches Protein oder ein Enzymprotein codiert, in Beziehung zur Translationsrate eingesetzt werden. Es ist auch möglich, ein derartiges Verfahren bei Untersuchungen zur molekularen Struktur und Funktion von RNA-Virusgenen, die für Tiere und Pflanzen schädlich sind, anzuwenden.
  • Es ist eine Anzahl von Verfahren zur Spaltung einer Phosphodiesterbindung in einem RNA-Molekül bekannt. Eines dieser bekannten Verfahren umfaßt die Verwendung basenspezifischer natürlicher Ribonucleasen, wie RNaseT&sub1;, RNaseU&sub2; oder dergleichen. Ein anderes Verfahren umfaßt die Bildung eines Doppelstrangs aus einem RNA-Molekül und einer komplementären DNA und die Spaltung des RNA-Strangs im Doppelstrang unter Verwendung von RNaseH, d. h. Ribonuclease H (H. Donis-Keller, Nucleic Acids Res., Bd. 7 (1979), S. 179). Im Fall des erstgenannten Verfahrens ist es recht schwierig, die Verknüpfung nur an der gewünschten Position des Moleküls zu spalten. Mit anderen Worten kann im Fall des erstgenannten Verfahrens die basenspezifische Spaltung an vielen Stellen des Moleküls auftreten, so daß das Verfahren allgemein für die Bestimmung der Basensequenz eines RNA-Moleküls angewandt wird (H. Donis-Keller et al., Nucleic Acid Res., Bd. 4 (1977), S. 2527). Im Fall des letztgenannten Verfahrens tritt die Spaltung, wenn ein langer DNA-Strang eingesetzt wird, an verschiedenen Stellen auf, und wenn ein kurzer DNA-Strang, der z. B. aus 4 oder 6 Basen besteht, eingesetzt wird, dann ist eine bevorzugte Spaltung zu erwarten. Wenn jedoch der DNA-Strang kurz ist, dann bildet ein derartiger kurzer DNA-Strang einen Doppelstrang an verschiedenen Positionen, und zwar im wesentlichen ohne eine besondere Bevorzugung einer bestimmten Position. Gemäß diesen bekannten Verfahren ist es also praktisch unmöglich, die Phosphodiesterbindung vorzugsweise an einer gewünschten Position eines RNA-Moleküls zu spalten.
  • Es besteht im Bereich der biologischen Wissenschaft ein Bedarfan der Entwicklung eines neuartigen Verfahrens zur bevorzugten Spaltung einer Phosphodiesterbindung in einer gewünschten Position eines RNA-Moleküls ohne eine Beschränkung hinsichtlich der Länge des Strangs und der Basenanordnung der RNA. Es ist offensichtlich, daß ein derartiges neues Verfahren sich als nützliche Maßnahme bei Untersuchungen zur Struktur und Funktion von funktioneller RNA eignet. Derartige Untersuchungen sind z. B. für die Entwicklung von Verfahren zur Massenproduktion nützlicher Proteine und von Verfahren zur Verbesserung der Eigenschaften von Proteinen sowie zur Entwicklung von Verfahren für die Entgiftung schädlicher RNA-Viren und Verfahren für die wirksame Behandlung von Erkrankungen, die durch derartige Viren hervorgerufen werden, von Bedeutung.
  • Es ist bekannt, daß eine 2'-O-Methyl-RNA einen stabilen Doppelstrang mit einem RNA-Molekül mit einer komplementären Sequenz bilden kann (H. Inoue et al., Nucleic Acids Symposium Series, Nr. 16 (1985), S. 161) (1).
  • Wir haben zahlreiche Untersuchungen über RNA durchgeführt und nun auf der Grundlage der vorstehend genannten bekannten Tatsache festgestellt, daß der RNA-Strang und der 2'-O-Methyl- RNA-Strang, die Bestandteil eines Doppelstrangs sind, unter dem Einfluß von RNaseH nicht gespalten werden.
  • Ferner haben wir festgestellt, daß ein gemischtes Oligomer, das eine 2'-O-Methyl-RNA verknüpft mit DNA enthält, in einfacher Weise hergestellt werden kann; daß ein Doppelstrang aus dem gemischten Oligomer und einem komplementären RNA-Molekül gebildet werden kann; und daß, wenn der Doppelstrang mit RNaseH behandelt wird, der DNA-Anteil des gemischten Oligomers als eine Position dient, die spezifisch von RNaseH erkannt wird, und zwar unabhängig von der Tatsache, daß eine oder beide Seiten des DNA-Abschnitts mit der 2'-O-Methyl-RNA verknüpft sind, so daß es möglich ist, die Phosphodiesterbindung vorzugsweise an der Position der RNA zu spalten, die dem DNA-Oligomerabschnitt entspricht.
  • Erfindungsgemäß wird ein Nucleosidderivat der allgemeinen Formel:
  • bereitgestellt, worin X einen Monomethoxytrityl- oder Dimethoxytrityl-Rest bedeutet, Y für -P(OCH&sub3;)-N-(CH(CH&sub3;)2)&sub2;, -P(OCH&sub2;CH&sub2;CN)-N-(CH(CH&sub3;)&sub2;)&sub2; oder -CO(CH&sub2;)m-CO-NH-(CH&sub2;)n- (CPG-Derivat) steht, m und n jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind und R einen Rest einer der folgenden Formeln darstellt:
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Verbindung mit einem Doppelstrang bereitgestellt, die aus einer RNA (+Strang) und einer komplementären DNA (-Strang) besteht, wobei ein Abschnitt der DNA (-Strang) durch ein Oligomer ersetzt ist ,das aus Nucleosidderivaten gemäß dem vorstehenden Aspekt der Erfindung besteht, und wobei dann, wenn die Verbindung der Einwirkung eines Enzyms mit Ribonuclease H-Aktivität unterworfen wird, eine bevorzugte Spaltung in einer Position der RNA (+Strang), die dem nicht-ersetzten Abschnitt der DNA (-Strang) entspricht, auftritt.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt ein Homochromatogramm, das die Strangspaltung einer Verbindung erläutert, die aus einem markierten RNA-Oligomer, einem unmarkierten RNA-Oligomer und einem erfindungsgemäßen komplementären DNA-Oligomer besteht.
  • Fig. 2 und 3 sind Graphen, die die Beziehung zwischen der Spaltungszeit und der Spaltungsrate der gespaltenen Position, die in Fig. 1 gezeigt ist, erläutern.
  • Fig. 4 bis 9 sind jeweils Homochromatogramme, die die Strangspaltung einer Verbindung erläutern, die aus einem markierten RNA-Oligomer, einem unmarkierten RNA-Oligomer und einem komplementären gemischtem Oligomer bestehen.
  • Fig. 10-1, 10-2 und 11 zeigen jeweils ein Autoradiogramm, das den Strangspaltungsprozeß der mit 3'-³²PCp-markierten WS- S(+)RNA und des erfindungsgemäßen gemischten Oligomers erläutert.
  • Fig. 12A und 12B zeigen Autoradiogramme, die die analytischen Ergebnisse der 5'-terminalen Base in einem gespaltenen Fragment erläutern, das durch Einwirkung von RNaseH gebildet wurde, wie es in Fig. 10-1 gezeigt ist.
  • Die Verbindungen mit einem Doppelstrang, der aus RNA (+Strang) und einer komplementären DNA (-Strang) besteht, sind bekannt oder können auf bekannte Weise hergestellt werden. Es ist nicht erforderlich, einen Doppelstrang für den gesamten Abschnitt der RNA (+Strang) mit Hilfe einer DNA (-Strang) zu bilden. Mit anderen Worten kann ein Doppelstrang nur für einen Abschnitt der RNA (+Strang) gebildet werden. Es ist auch möglich, einen Doppelstrang für jeden von zwei oder mehr Abschnitten der RNA zu bilden.
  • Für den Fall, daß ein Abschnitt der DNA (-Strang) durch ein Oligomer ersetzt wird, das aus Nucleotidderivaten gemäß dem ersten vorstehend genannten Aspekt der Erfindung besteht, kann es sich bei "einem Abschnitt von DNA (-Strang)" um einen Abschnitt des DNA-Moleküls handeln, der ein Bestandteil des Doppelstrangs ist, oder, wenn zwei oder mehr doppelsträngige Abschnitte auf dem gleichen RNA-Strang vorliegen, dann kann es sich bei "einem Abschnitt von DNA (-Strang)" um das DNA- Molekül (-Strang) handeln, das in mindestens einem Doppelstrang vorhanden ist.
  • Die Derivate oder die RNA weisen einen Substituenten an mindestens einer 2'-Hydroxygruppe des Zuckerrests der RNA auf.
  • Als Oligomer, in dem ein Abschnitt von DNA (-Strang) teilweise substituiert worden ist, kann zweckmäßigerweise das nachstehend gezeigte gemischte Oligomer verwendet werden.
  • Ein derartiges gemischtes Oligomer kann durch Verknüpfen eines Oligomers von RNA oder eines Derivats davon mit einem DNA-Oligomer in einer solchen Weise, daß die 5'-Hydroxygruppe und die 3'-Hydroxygruppe des Ribose- oder Desoxyribose-Anteils aneinander über eine Phosphodiesterverknüpfung gebunden werden, erhalten werden.
  • Der 2'-O-Methyl-RNA-Oligomerabschnitt des gemischten Oligomers kann nach einem der beiden nachstehenden Verfahren hergestellt werden. Bei einem dieser Verfahren handelt es sich um das Verfahren, das von Inoue in der Veröffentlichung 1 beschrieben wird. Gemäß dem Verfahren von Inoue werden 2'-O- Methyl-N&sup4;-benzoylcytidin (Verbindung I), 2'-O-Methyl-N&sup6;-benzoyladenosin (Verbindung 11), 2'-O-Methyl-N²-isobutyrylguanosin (Verbindung III) und 2'-O-Methyluridin (Verbindung IV) hergestellt. Die 5'-Hydroxygruppe jeder Verbindung ist durch eine Dimethoxytrityl-Gruppe (-DMTr) geschützt, so daß die Verbindungen (Ia, IIIa, IIIa, IVa) erhalten werden. Es ist möglich, die Verbindungen (Ib, IIb, IIIb, IVb) durch Einführen eines o-Chlorphenylphosphatrestes an der 3'-Hydroxygruppe in jede der Verbindungen (Ia bis IVa) gemäß einem bekannten Verfahren (Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 5461) herzustellen. Das vorstehend angegebene Herstellungsverfahren wird nachstehend als "Verfahren A" bezeichnet.
  • Ferner kann die 3'-Hydroxygruppe der Verbindungen (Ia, IIa, IIIa, IVa) mit Chlor-diisopropylamino-methoxy-phosphin oder mit Chlor-diisopropylamino-cyanoethoxy-phosphin gemäß einem bekannten Verfahren (Tetrahedron Lett., Bd. 24 (1983), S. 245 und Nucleic Acids Res., Bd. 11 (1984), S. 4539) behandelt werden, um eine 3'-Phosphoramidit-Verbindung (Ib&sub2;, IIb&sub2;, IIIb&sub2;, IVb&sub2;, Ib&sub3;, IIb&sub3;, IIIb&sub3;, IVb&sub3;) herzustellen ("Verfahren B"; vgl. Beispiele 11 und 12).
  • Die Verbindungen (Ia bis IVa) können jeweils über einen Spacer mit einem zu 1% vernetzten Polystyrolharz unter
  • Bildung der Verbindungen (Ic&sub1;, IIc&sub1;, IIIc&sub1;, IVc&sub1;) gemäß einem bekannten Verfahren (Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 5507) kombiniert werden.
  • Die Verbindungen (Ia, IIa, IIIa, IVa) können gemäß einem bekannten Verfahren (K. Miyoshi et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 5491) behandelt werden, wobei 3'-Succinylderivate (Ie, IIe, IIIe, IVe) in aktive Ester (If, IIf, IIIf, IVf) umgewandelt werden, die dann an ein Langkettenalkylamino-Glas mit kontrollierten Poren (CPG) unter Bildung der Verbindungen (Ic&sub2;, IIc&sub2;, IIIc&sub2;, IVc&sub2;) gebunden werden, wie es in Beispiel 13 erläutert wird.
  • Der DNA-Oligomerabschnitt des gemischten Oligomers kann nach einem bekannten Verfahren (M. Ikehara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 5956; Veröffentlichung 2) durch aufeinanderfolgende Kondensation der Verbindungen (Id&sub1;, IId&sub1;, IIId&sub1;, IVd&sub1;) hergestellt werden (Verfahren A).
  • Ferner ist es möglich, den DNA-Abschnitt durch aufeinanderfolgende Verknüpfung der Verbindungen (Id&sub2;, IId&sub2;, IIId&sub2;, IVd&sub2;) oder durch aufeinanderfolgende Verknüpfung der Verbindungen (Id&sub3;, IId&sub3;, IIId&sub3;, IVd&sub3;) gemäß einem bekannten Verfahren (Science, Bd. 230 (1985), S. 281) herzustellen, wie es in Tabelle 1 erläutert ist (Verfahren B).
  • Die Ausgangsverbindung (IVc&sub1;) kann z. B. nacheinander mit den Verbindungen (IIIb&sub1;, IId&sub1;, IId&sub1;, IVd&sub1;, IIId&sub1;, IIIb&sub1;, IIb&sub1;, Ib&sub1;) in dieser Reihenfolge unter den in Tabelle 2 angegebenen Reaktionsbedingungen umgesetzt werden, wobei das gemischte Oligomer (Verbindung V) der Formel:
  • 3' UmGmAATGGmAmCm5' (V)
  • gebildet wird, worin die Symbole mit dem Suffix m O-Methyl- RNA und die anderen Symbole DNA-Oligomere darstellen.
  • Auf ähnliche Weise können die folgenden gemischten Oligomere (Verbindungen VI bis VIII) hergestellt werden:
  • 3 'UmGmAmATGGmAmCm5' (VI)
  • 3'UmGmAATGGAmCm 5' (VII)
  • 3'UmGmAmAmTGGACm 5' (VIII)
  • Ein DNA-Oligomer (Verbindung IX) mit der gleichen Sequenz wie die vorstehend genannten gemischten Oligomere kann gemäß einem bekannten Verfahren, das in dem Artikel von Ikehara et al. (Veröffentlichung 2) beschrieben wird, hergestellt werden. Ein niedermolekulares RNA-Oligomer (X) mit einer komplementären Sequenz zu der der gemischten Oligomere (Verbindungen V bis IX) kann gemäß einem bekannten Verfahren (S. Iwai et al., Chem. Pharm. Bull., Bd. 33 (1985), S. 4618; Veröffentlichung 3) hergestellt werden.
  • 3 'd(TGAATGGAC) 5' (IX)
  • 5' ACUUACCUG3' (X)
  • Weitere gemischte Oligomere (XI, XII) und weitere komplementäre RNA-Oligomere (XIII, XIV), die nachstehend gezeigt sind, können gemäß den Verfahren hergestellt werden, die in den Veröffentlichungen 2 bzw. 3 beschrieben sind.
  • 3'CmAmTTCAUmAmGm5' (XI)
  • 3' GmUmCCAACmCmAm5' (XII)
  • 5' GUAAGUAUC3' (XIII)
  • 5 'CAGGUUGGU3' (XIV)
  • Eine hochmolekulare RNA WS-S(+) (90-Mer; Verbindung XV) kann durch eine in vitro-Transkriptionsreaktion unter Verwendung von SP6-RNA-Polymerase hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird eine doppelsträngige DNA (XVI), worin eine WS-S(+)- Sequenz direkt an eine SP6-Promotorsequenz gebunden ist, auf chemische/enzymatische Weise gemäß dem in Tabelle 3 gezeigten Schema hergestellt, um die Transkription ausgehend vom 5'- Terminus der Basenanordnung der WS-S(+)RNA durchzuführen.
  • Zuerst wurden die DNA-Oligomere (1 bis 9) gemäß einem bekannten Verfahren (Science, Bd. 230 (1985), S. 281) hergestellt und in zwei Gruppen aufgeteilt. Mittels einer Ligasereaktion wurde doppelsträngige DNA (XVI) erhalten. Eine Subklonierung der doppelsträngigen DNA (XVI) in die SphI- und SmaI-Stellen des M13mp19-Vektors wurde durchgeführt, und E. coli ,IM 103 wurde einer Transformation unterworfen, wobei man einen Vektor M13AJ-1 für die Transkription erhielt.
  • Die synthetische doppelsträngige DNA-Sequenz innerhalb des Vektors M13AJ-1 für die Transkription, der auf diese Weise erhalten wurde, wurde nach der bekannten M13-Didesoxymethode (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463) untersucht. Es wurde durch diesen Test bestätigt, daß die fragliche Basensequenz korrekt war.
  • Sodann wurde M13AJ-1 mit dem Restriktionsenzym SmaI linearisiert, und anschließend wurde in vitro eine RNA-Transkriptionsreaktion mit Hilfe von SP6-Polymerase gemäß einem bekannten Verfahren durchgeführt (Nucleic Acids Res., Bd. 12 (1984), S. 7035), um die gewünschte RNA WS-S(+) (XV) herzustellen, wobei die Transkription exakt am 5'-terminalen Abschnitt begonnen hatte.
  • Um die Spaltungsreaktion der erhaltenen hochmolekularen RNA WS-S(+) (XV) zu untersuchen, wurde die folgenden Schritte durchgeführt. Zuerst wurde ein Versuch durchgeführt, bei dem ein gemischtes Oligomer chemisch gemäß Verfahren B hergestellt wurde, das im Vergleich zu Verfahren A recht einfach ist und daher auf diesem Gebiet allgemein angewandt wird. Bei dem verwendeten Ausgangsmaterial handelt es sich um Verbindung (IVc&sub2;). Unter den in Tabelle 6 angegebenen Reaktionsbedingungen wurde die Verbindung (IVc&sub2;) nacheinander mit den folgenden Verbindungen in der angegebenen Reihenfolge kondensiert: IIIb&sub2;, IIIb&sub2;, IIIb&sub2;, Ib&sub2;, Ib&sub2;, IIIb&sub2;, IIb&sub2;, IVb&sub2;, Ib&sub2;, IVb&sub2;, IId&sub2;, IIId&sub2;, IIId&sub2; und Id&sub2;. Das auf diese Weise erhaltene Rohprodukt wurde auf herkömmliche Weise aufgearbeitet, so daß ein gemischtes Oligomer (XVIII) wie im Fall der DNA- Synthese erhalten wurde.
  • 3 '-UmGmGmGmCmCmGmAmUmCmUmAGGC-5' (XVIII)
  • Auf ähnliche Weise wurden die folgenden gemischten Oligomere (XVII, XIX, XXII bis XXIV) hergestellt:
  • 3'-UmGmGmGmCmCmGmAmUmCmTAGGC-5' (XVIII)
  • 3'-UmGmGmGmCmCmGmAmUmCmUmAmGGC-5' (XIX)
  • 3'-AGGCCmCmAmCmAmCmAm-5' (XXII)
  • 3'-GGCCmCmAmCmAmCmAm-5' (XXIII)
  • 3'-UmGmAAAGCUmCm (XXIV)
  • Sodann wurde die Verbindung (IVd&sub4;) als Ausgangsmaterial verwendet. Die Verbindung (IVd&sub4;) wurde nacheinander mit den folgenden Verbindungen in der angegebenen Reihenfolge kondensiert: IId&sub3;, IIId&sub3;, IIId&sub3;, Ib&sub3;, Ib&sub3;, Ib&sub3;, IIb&sub3;, Ib&sub3;, IIb&sub3;, Ib&sub3; und IIb&sub3;, und zwar unter den in Tabelle 6 und in Beispiel 15 angegebenen Reaktionsbedingungen, wobei ein gemischtes Oligomer (XX) hergestellt wurde:
  • 3'TAGGCmCmCmAmCmAmCmAm5' (XX)
  • Auf ähnliche Weise wurde ein gemischtes Oligomer (XXI) erhalten:
  • 3 TAGGCCmCmmmCmmmCmAm5' (XXI)
  • Die auf diese Weise erhaltenen gemischten Oligomere waren jeweils komplementär zu WS-S(+)RNA (XV). Die Verbindungen (XVII bis XIX) sind gemischte Oligomere, worin nur der 3'-terminale Abschnitt mit der O-Methyl-RNA substituiert ist. Die Verbindungen (XX bis XXIII) sind gemischte Oligomere, worin nur der 5'-terminale Abschnitt mit der O-Methyl-RNA substituiert ist. Die Verbindung (XXIV) ist ein gemischtes Oligomer, worin beide terminale Abschnitte einzeln durch O-Methyl-RNA ersetzt sind, und zwar wie im Fall der bereits genannten Verbindungen (V bis VIII, XI und XII).
  • Die gemischten Oligomere (XVII bis XXIII) wurden für eine Spaltung der Phosphodiesterbindung in der Stammregion zwischen dem 19. und dem 24. Segment (gezählt vom 5'-Terminus) in der WS-S(+)RNA entworfen. Das gemischte Oligomer (XXIV) wurde für eine Spaltung der Phosphordiesterbindung in der Schleifenregion zwischen dem 36. und dem 46. Segment entworfen.
  • Tabelle 4 erläutert die Beziehung der komplementären Anordnung zwischen den gemischten Oligomeren (XVII bis XXIV) und der WS-S(+)RNA (XV) und zeigt auch die Sekundärstruktur der WS-S(+) RNA.
  • Mit Bezug auf die Derivate der Verbindungen (I bis IV), die für die Herstellung der gemischten Oligomere eingesetzt wurden, ist es möglich, als Rest X eine herkömmliche Schutzgruppe, wie Trityl, anstelle von Dimethoxytrityl (-DMTr) oder Monomethoxytrityl (-MMTr) zu verwenden.
  • Im Verfahren A kann der o-Chlorphenylrest als Phosphatschutzgruppe durch eine übliche Schutzgruppe ersetzt werden, die normalerweise bei der Synthese von DNA und RNA verwendet wird, z. B. p-Chlorphenyl, Cyanoethyl, Trichlorethyl oder dergl. Bei Verfahren B ist es möglich, die als Schutzgruppen in den Formeln gezeigten Diisopropylaminoreste R&sub2; und R&sub3; durch andere Schutzgruppen, wie Dimethylamino, Morpholino oder dergl., zu ersetzen. Ferner kann Verfahren B in einer solchen Weise modifiziert werden, daß ein H-Phosphonat anstelle von R&sub2; und R&sub3; verwendet wird, die Acylierung mit Hilfe von Pivaloylchlorid durchgeführt wird und die Aktivierung unter Verwendung von Tetrazol durchgeführt wird. Es ist auch möglich, die Reste R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; durch Methylphosphon-Imidazolid ("methyl phosphonic imidazolide") zu ersetzen, so daß ein Oligomer hergestellt wird, worin der 5'-Hydroxyrest über eine Methylphosphonatgruppe mit dem 3'-Hydroxyrest verknüpft ist.
  • Der Methoxyrest als Gruppe Z kann durch Hydroxy, Alkoxy (das einen substituierten Hydroxyrest mit einem Substituenten, der durch eine chemische Behandlung, die üblicherweise im Gebiet der Nucleinsäurechemie durchgeführt wird, nicht entfernt werden kann, z. B. Ethyl, Propyl, Butyl oder dergl., darstellt) oder -OQ, worin Q eine Schutzgruppe, wie tert.-Butyl-dimethylsilyl oder Tetrahydropyranyl darstellt, die üblicherweise bei der RNA-Synthese eingesetzt werden, ersetzt werden.
  • Die Spaltungsreaktion der niedermolekularen RNA (X, XIII, XIV) und die Analyse der Spaltungsstelle wurden auf die nachstehend beschriebene Weise durchgeführt.
  • Die 5'-Hydroxygruppe des RNA-Moleküls (X, XIII, XIV) wurde mit Hilfe von T4-Polynucleotidkinase und [gamma-³²P]ATP markiert. Anschließend wurde die RNA mit dem komplementären DNA- Oligomer (IX) oder dem komplementären gemischten Oligomer (V bis VIII, XI, XII) gemischt und einer Spaltungsreaktion unter Verwendung von RNaseH unterworfen. Die Reaktionslösung wurde durch Homochromatographie analysiert, um die Spaltungsposition und den Grad der Spaltung, d. h. die Spaltungsrate, zu bestimmen.
  • In der Reaktionsstufe wurde das mit ³²P-markierte RNA-Oligomer (X, XIII, XIV) (30 000 bis 40 000 cpm) mit dem nicht-markierten RNA-Oligomer (X, XIII, XIV) (1 bis 5 mikromolar) und mit dem DNA-Oligomer (IX) (10 mikromolar), das komplementär zur Verbindung (X) oder komplementär zum gemischten Oligomer (V bis VIII, XI, XII) war (10 bis 25 mikromolar), in Gegenwart von 40 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,7), 4 millimolar MgCl&sub2;, 1 millimolar DTT, 4% Glycerin und 0,003% Rinderserumalbumin gemischt. Anschließend wurde eine aus E. coli HB101 abgeleitete RNase H (5 bis 10 Einheiten) (Takara Shuzo Co., Ltd.) zugegeben, und die Reaktion wurde 2 bis 48 Stunden bei 20 oder 30ºC durchgeführt. Die Spaltungsposition wurde gemäß einem Verfahren bestimmt, bei dem das markierte RNA-Molekül (X, XIII, XIV) teilweise mit Schlangengift-Phosphodiesterase verdaut wurde, und das erhaltene Produkt wurde durch Homochromatographie analysiert.
  • Die Spaltungsposition und die Spaltungsrate sind nachstehend angegeben:
  • Doppelstrang (1) Doppelstrang (2) Doppelstrang (3) Doppelstrang (4) Doppelstrang (5) Doppelstrang (6) Doppelstrang (7) (Die Linie "> -" stellt einen 2'-O-Methyl-nucleotidstrang dar, und die Pfeile markieren die Spaltungsposition in einer solchen Weise, daß die Größe abhängig von der qualitativ bestimmten Spaltungsrate variiert.)
  • Bei der Homochromatographie wurden die gebildeten Flecken ausgeschnitten, und die Radioaktivität davon wurde in einem Flüssigscintillationszähler (Packard TRI-CARB 640C) gemäß der Tscherenkow-Methode bestimmt.
  • Aus den vorstehend genannten Versuchen, die die Spaltung des RNA-Moleküls (X) betrafen, wurden die nachstehenden Ergebnisse erhalten. Im Fall des Doppelstrangs (1) mit dem komplementären DNA-Oligomer (IX) wurden die Verknüpfungen an den rechten Seiten des 5., 6. und 7. Segments (gezählt vom 5'- Terminus) gespalten, so daß keine Positionsbevorzugung bei dieser Reaktion festgestellt wurde. Im Fall der Doppelstränge (3) und (4), in denen das komplementäre gemischte Oligomer (V, VII), das das aus 4 oder 5 Basen bestehende DNA-Oligomer enthielt, vorhanden war, war es möglich, bevorzugt die Verknüpfung an der rechten Seite des 6. Segments (gezählt vom 5'-Terminus) zu spalten. Wenn das komplementäre gemischte Oligomer (VIII) eingesetzt wurde, dann wurde die Verknüpfung an der rechten Seite des 8. Segments (gezählt vom 5'-Terminus) vorzugsweise gespalten. Im Fall der Doppelstränge (6) und (7), in denen das andere RNA-Molekül (XIII, XIV) mit einer verschiedenen Basensequenz zusammen mit dem komplementären gemischten Oligomer (XI, XII) vorhanden war, wurde beobachtet, daß die Verknüpfung an der rechten Seite des 6.
  • Segments (gezählt vom 5'-Terminus) vorzugsweise gespalten wurde, wie im Fall des Doppelstrangs (3).
  • Wie vorstehend erklärt wurde, ist es im Fall einer niedermolekularen RNA (9-Mer) erforderlich, ein gemischtes Oligomer mit 3 bis 6 Basen und vorzugsweise mit 4 bis 5 Basen Länge des DNA-Oligomers zu verwenden. Wenn das gemischte Oligomer mit 4 oder 5 im angrenzenden Abschnitt des DNA-Oligomers in seinem zentralen Teil zur Spaltung der RNA eingesetzt wurde, dann konnte die Spaltungsstelle der RNA durch RNaseH vorausgesagt werden, da die Spaltung am 3'-Ende des Tetraribonucleotids oder an der vorletzten Position des Pentaribonucleotids der RNA-DNA-Hybridregionen auftrat. Um den Wirkungsgrad der bevorzugten Spaltung zu erhöhen, können die Reaktionsbedingungen unter Einschluß der Reaktionstemperatur und der Menge des eingesetzten Enzyms auf eine Weise, die üblicherweise auf dem Gebiet der Biochemie angewandt wird, variiert werden.
  • Um zu untersuchen, ob das vorstehend erwähnte RNA-Spaltungsverfahren auch auf eine funktionelle RNA mit einer Struktur höherer Ordnung, wie einer Struktur 2. oder 3. Ordnung, angewandt werden kann, wurde ein Versuch durchgeführt, bei dem eine RNA-Spaltungsreaktion der hochmolekularen RNA WS-S(+) (XV) zusammen mit einem Bestätigungsschritt für die Spaltungsposition durchgeführt wurde. Wie im Fall der niedermolekularen RNA (X) sollte die hochmolekulare RNA mit radioaktivem Phosphor markiert werden. Da die WS-S(+)RNA (XV) durch eine in vitro-Transkription hergestellt wird, weist sie eine Triphosphatkomponente am 5'-Terminus auf. Daher wurde der 3'- Terminus gemäß einem bekannten Verfahren (Nature, Bd. 275 (1978), S. 560) mit ³²PCp mit Hilfe einer RNA-Ligase markiert. Das markierte Produkt wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines 8%igen Polyacrylamidgels mit einem Gehalt am 7 m Harnstoff unterworfen und mittels Autoradiographie analysiert. Das Produkt war ein Gemisch eines 90-Mers und eines 91-Mers. Es ist nicht klar, warum das Produkt als Gemisch erhalten wurde. Das Gemisch wurde durch die gleiche Gelelektrophorese getrennt und aus dem Gel auf herkömmliche Weise extrahiert, so daß die WS-S(+)RNA mit einem markierten 3'-Terminus erhalten wurde. Die markierte RNA wurde in Wasser in einer Konzentration von 0,02 pMol/ul gelöst und für den folgenden Versuch verwendet.
  • Die WS-S(+)RNA mit dem markierten 3'-Terminus (3,3 nanomolar) wurde mit 40 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,7), 4 millimolar MgCl&sub2;, 0,003% BSA, 1 millimolar DTT, 4% Glycerin, dem gemischten Oligomer (83 bis 8,3 ul) und RNaseH (0,17 bis 0,83 Einheiten/ul) gemischt, und eine Reaktion wurde für mehrere Stunden durchgeführt, wobei das Gemisch vor der Zugabe von RNaseH 2 Minuten auf 65ºC erwärmt wurde, um eine Anellierung zu bewirken. Die Reaktion wurde bei 30ºC durchgeführt, und anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit einem Auftragungssol ("loading sol") gemischt (das 10 m Harnstoff, 0,02% Xylolcyanol und 0,02% Bromphenol-Blau enthielt), um die Reaktion abzubrechen. Das Produkt wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines 8%igen Polyacrylamidgels mit einem Gehalt an 7 m Harnstoff unterworfen und anschließend durch Autoradiographie analysiert, um die Spaltungsposition zu bestimmen. Als Größenmarker wurden die Proben, die durch eine alkalische Hydrolyse, einen RNaseT&sub1;-, einen RNaseU&sub2;-, oder einen RNase PhyM-Verdau der WS-S(+)RNA mit dem markierten 3'- Terminus hergestellt wurden, verwendet.
  • Das Ergebnis dieses Versuchs, soweit es die Spaltungsreaktion betrifft, ist in Tabelle 5 angegeben, wobei die Spaltungsposition durch einen Pfeil angezeigt ist.
  • Der Spaltungswirkungsgrad des gemischten Oligomers mit dem DNA-Teil an der 5'-Seite war höher als der des gemischten Oligomers mit dem DNA-Teil an der 3'-Seite. Als Ursache dafür wird in Betracht gezogen, daß im erstgenannten Fall eine komplementäre Anpassungsfähigkeit im Bereich, der die Stränge beider Seiten der Stammstruktur A&sup7; bis U²&sup4; umfaßt, besteht, während im letztgenannten Fall eine komplementäre Anpassungsfähigkeit nur in den Strängen C¹&sup9; bis U²&sup4; im Stamm besteht, und daß ein derartiger Unterschied hinsichtlich der komplementären Anpassungsfähigkeit einen Einfluß auf die Bildung eines stabilen komplementären Doppelstrangs ausübt, der für die Spaltungsreaktion von Bedeutung ist. Mit den vorstehenden Überlegungen läßt sich allerdings der Unterschied des Spaltungsreaktionswirkungsgrads in Abhängigkeit davon, ob der DNA-Teil am 5'-Terminus vorhanden ist, nicht erklären. Es ist das Ergebnis von langem Nachdenken, daß die Sekundärstruktur von DNA einen Einfluß auf die Spaltungsreaktion ausübt. Es wurde z. B. beobachtet, daß die Spaltung rascher bei dem gemischten Oligomer (XXIV) mit einem komplementären Abschnitt in der Schleife im Vergleich mit anderen Oligomeren auftritt.
  • Im Fall der Verbindungen (XVII, XVIII, XIX) mit dem DNA-Teil an der 5'-Seite weisen diese Verbindungen den gleichen komplementären Bereich auf, sie unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der Länge des DNA-Teils und auch in gewissem Maße hinsichtlich der Spaltungsposition. Bei allen vorstehend genannten Versuchen trat die Spaltung im Fall der Verbindung (XVIII) nur an den Positionen zwischen G²¹ und G²² der WS-S(+)RNA auf. Im Fall der Verbindung (XIX), worin der Abschnitt des DNA-Teils um eine Base kürzer ist als der Abschnitt des DNA-Teils in der Verbindung (XVIII), trat die Spaltung an der Position zwischen G²¹ und G²² von WS-S(+)RNA und auch an der anderen Position, die der 5'-Seite (des gemischten Oligomers) um eine Base näher war als die erstgenannte Position zwischen G²¹ und G²², auf. Im Fall der Verbindung (XVII), bei der der Abschnitt des DNA-Teils um eine Base zur 3'-Seite länger ist, trat die Spaltung vorzugsweise in der Position auf, die um eine Base näher war als die Spaltungsposition unter Verwendung von Verbindung (XVIII). Daher kann festgestellt werden, daß bei Verwendung eines gemischten Oligomers, worin eine 2'-O-Methyl-RNA an der 3'-Seite und ein DNA-Teil an der 5'-Seite vorhanden ist, die Spaltung vorzugsweise in der Position auftritt, die einer Position zwischen dem 4. und dem 5. Segment, gezählt von der 3'-Seite des DNA- Teils, auftritt. Dieser Schluß basiert auf dem Ergebnis des Versuchs, bei dem die gemischten Oligomere mit einer O- Methyl-RNA nur an einer Seite verwendet wurden, die bei der Spaltungsreaktion der niedermolekularen RNA (X, XIII, XIV) nicht verwendet wurde. Das vorstehend genannte Ergebnis stimmt mit dem überein, daß bei einem Versuch zur Spaltungsreaktion der niedermolekularen RNA (X) erhalten wurde.
  • Wenn andererseits die gemischten Oligomere (XX, XXI), worin die 2'-O-Methyl-RNA an der 5'-Seite und der DNA-Teil an der 3'-Seite vorhanden waren, verwendet wurden, dann wurden folgende Ergebnisse erhalten. Im Fall der Verbindung (XXI) trat die Spaltung in einer Position mit einem niedrigen Spaltungswirkungsgrad unter dem Einfluß der Struktur zweiter Ordnung von WS-S(+) (XV) auf. Im Fall des Oligomers (XXIV) mit der O- Methyl-RNA an beiden Seiten trat die Spaltung in der Position, die um eine Base näher zur 3'-Seite auf dem RNA-Molekül war als die Spaltungsposition der niedermolekularen RNA (X, XIII, XIV), auf. Die Spaltungsposition des RNA-Moleküls im Fall des gemischten Oligomers (XXIV) unterschied sich also um eine Base von der Spaltungsposition der niedermolekularen RNA (X, XIII, XIV).
  • Die Spaltungsposition wurde gemäß einem Verfahren bestimmt, bei dem der 5'-Terminus des abgespaltenen Fragments mit ³²P markiert wird und anschließend ein Verdau mit Nuclease P&sub1; durchgeführt wird, um die 5'-terminale Nucleotideinheit zu erhalten, die anschließend durch Filterpapierelektrophorese (vgl. Beispiel 23) analysiert wird. Im Fall der Verbindung (XXI) wurde die Spaltungsposition auf der Grundlage der Elektrophoresedaten der Fragmente des gespaltenen Oligomers bestimmt, wie es in Fig. 10-2 gezeigt ist.
  • Wie aus den vorstehenden Angaben ersichtlich, kann die vorstehend genannte Methode zur Entwicklung und Herstellung der gemischten Oligomere im Fall von niedermolekularer RNA, die geschnitten werden soll, angewandt werden, mit der Maßgabe, daß die RNA nicht im Zustand einer Struktur zweiter Ordnung vorliegt.
  • Ferner kann die vorstehend genannte Methode zur Entwicklung und Herstellung der gemischten Oligomere selbst auf die Spaltung hochmolekularer RNA angewandt werden, wobei die folgenden Tatsachen in Betracht gezogen werden müssen. Es ist nämlich erforderlich, ein gemischtes Oligomer unter Berücksichtigung der gewünschten Spaltungsposition, die in der Schleife oder im Stamm vorliegen kann, und auch unter Berücksichtigung der Struktur zweiter Ordnung zu entwickeln. Außerdem ist es erforderlich, zu bestimmen, ob ein gemischtes Oligomer mit einer O-Methyl-RNA an der 3'-Seite oder ein anderes' gemischtes Oligomer mit einer derartigen RNA an der 5'-Seite mehr geeignet ist.
  • Die Anzahl der DNA-Oligomere, die im gemischten Oligomer vorhanden sind, beträgt im allgemeinen zwischen 3 und 6 und vorzugsweise zwischen 4 und 5.
  • Um die Positionsselektivität der Spaltungsreaktion zu erhöhen, können die Reaktionsbedingungen, wie die Reaktionstemperatur und die Menge des verwendeten Enzyms, auf eine im Bereich der Biochemie übliche Weise variiert werden.
  • Erfindungsgemäß wird also ein neuartiges Verfahren zur spezifischen Spaltung eines RNA-Moleküls mit einer breiten Anwendbarkeit bereitgestellt.
  • Nachstehend wird die Erfindung ausführlicher anhand von Beispielen erläutert.
    • Beispiel 1 Herstellung eines gemischten Oligonucleotids 5'CmAmGmGTAAGmUm3' (V), worin m eine O-Methyl-nucleotideinheit darstellt und die anderen Symbole jeweils eine Desoxynucleotideinheit darstellen
  • In einem Reaktionsgefäß mit einem Glasfilter wurden 50 mg eines Polystyrolharzes mit einem Gehalt an 1% Vernetzungen vorgelegt und mit 6 uMol 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-methyluridin gemischt. Dieses Material wurde dreimal mit 2 ml eines Dichlormethan/Methanol-Gemisches (Volumenverhältnis von 7 : 3) gewaschen.
  • Sodann wurden 2 ml einer 2%igen Lösung von Benzolsulfonsäure in einem Dichlormethan/Methanol-Gemisch (Volumenverhältnis von 7 : 3) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 1 Minute geschüttelt. Nach der Reaktion wurde die Reaktionslösung filtriert, und das Harz wurde mit 2 ml eines Dichlormethan/Methanol-Gemisches (Volumenverhältnis von 7 : 3) gewaschen. Eine weitere Reaktion wurde mit Hilfe von weiteren 2 ml 2%iger Benzolsulfonsäurelösung für 1 Minute durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde zweimal mit 2 ml des vorstehend genannten Waschgemisches und anschließend dreimal mit 2 ml Pyridin gewaschen. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 0,3 ml Pyridin gemischt, und das Harz wurde durch Abdestillieren des Pyridins unter verringertem Druck getrocknet.
  • Anschließend wurde zu dem Reaktionssystem eine Lösung von 5'- Dimethoxytrityl-2'-O-methylguanin-3'-o-chlorphenyl-phosphorsäure (IIIb&sub1;) in Pyridin (20 mg/0,3 ml) gegeben, und das Pyridin wurde unter verringertem Druck abdestilliert. Eine Lösung von Mesitylen-sulfonyl-3-nitrotriazol in Pyridin (20 mg/0,3 ml) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde auf eine Temperatur von 40ºC erwärmt und 20 Minuten geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde von dem Harz mittels Filtration abgetrennt, und das Harz wurde zweimal mit 2 ml Pyridin gewaschen.
  • Sodann wurden zu dem Reaktionssystem 1,8 ml einer 0,1 m Dimethylaminopyridin-Lösung und 0,2 ml Essigsäureanhydrid gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Minuten geschüttelt, so daß die nicht umgesetzte 5'-Hydroxygruppe mit einer Acetylgruppe versehen wurde. Nach Abfiltrieren der Reaktionslösung wurde das Harz dreimal mit 2 ml Pyridin gewaschen.
  • Durch Wiederholung der vorstehend beschriebenen Schritte wurden die Nucleotideinheiten IId&sub1;, IId&sub1;, IVd&sub1;, IIId&sub1;, IIIb&sub1;, IIb&sub1; und Ib&sub1; nacheinander mit der zuvor gebildeten Einheit in dieser Reihenfolge gekuppelt, um den Strang zu verlängern. Die Ausbeute jeder Kupplungsreaktion betrug 47 bis 105%. Die Ausbeute wurde nach einem Verfahren bestimmt, bei dem das durch die De-dimethoxytritylierung gebildete Dimethoxytritanol mit einem Perchlorsäure/Ethanol-Gemisch unter Bildung eines gefärbten Produkts behandelt und die Lichtabsorption des gefärbten Produkts bei 500 nm gemessen wurde. Die Gesamtausbeute betrug 25%.
  • Nach dem Abschluß der vorstehend beschriebenen Reaktionen wurde das Harz mit Dioxan gewaschen und mit 0,5 ml einer 1 m Lösung von 2-Pyridinylaldoximtetramethylquanidin in Dioxan, 0,4 ml Dioxan und 0,1 ml Wasser versetzt, und das Reaktionsgemisch wurde bei 30ºC über Nacht geschüttelt. Die Lösung wurde vom Harz durch Filtration abgetrennt. Das Harz wurde dreimal mit 2 ml 50%iger wäßriger Pyridinlösung gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung wurden vereinigt, und das erhaltene Gemisch wurde eingeengt, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde in 1 ml Pyridin gelöst und in ein verschlossenes Röhrchen gegeben. Nachdem 10 ml 28%iges Ammoniakwasser zugegeben worden waren, wurde das Röhrchen dicht verschlossen, und eine Reaktion wurde 5 Stunden bei 60ºC durchgeführt.
  • Die Reaktionslösung wurde unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt und einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer Säule mit einem Durchmesser von 0,7 cm und einer Länge von 12 cm und eines Umkehrphasen-Siliciumdioxidgels ("Bondapack C 18", hergestellt von Waters Co., Ltd.; Teilchengröße: 35 bis 100 um) unterworfen. Als mobile Phase wurde eine 50 millimolar Essigsäure-Triethylamin-Pufferlösung mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 5 bis 35% Acetonitril verwendet. Die quantitative Bestimmung wurde auf der Grundlage der Lichtabsorption bei 254 nm durchgeführt. Durch diesen Chromatographieschritt wurde ein gemischtes 5'- Dimethoxytrityl-oligonucleotid abgetrennt. Nachdem das Lösungsmittel unter verringertem Druck verdampft worden war, wurde 1 ml einer 80%-igen wäßrigen Essigsäurelösung zugegeben, die Reaktionslösung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Die Reaktionslösung wurde unter verringertem Druck eingeengt und anschließend zusammen mit Wasser verdampft, um die Essigsäure zu entfernen.
  • Der Rückstand wurde in Wasser gelöst, mit Ethylacetat gewaschen, und die wäßrige Phase wurde unter verringertem Druck eingeengt und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von "Nucleosil C18" gereinigt. Als mobile Phase wurde eine 0,1 m Essigsäure/Triethylamin-Pufferlösung (pH-Wert: 7,0) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 13 bis 21% bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min verwendet. Der Hauptpeak (d. h. die Hauptfraktion) der eluierten Flüssigkeit wurde aufgefangen, so daß 0,07 uMol eines gemischten Oligonucleotids in einer Ausbeute von 1,17% erhalten wurden.
  • Das auf diese Weise gebildete gemischte Oligonucleotid wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit einer Anionenaustauschsäule "DEAE2SW" analysiert. Bei dieser Analyse wurde ein einzelner Peak beobachtet, so daß bestätigt wurde, daß das Produkt rein war.
  • Es wurde ein Schritt zur Bestätigung der Nucleotidsequenz des gemischten Oligonucleotids gemäß der in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 70 (1973), S. 1209-1213, beschriebenen Methode durchgeführt, wobei 0,050 D-Einheiten des Oligonucleotids verwendet wurden und der endständige 5'-Hydroxyrest mit Hilfe eines Markierungselements, nämlich ³²P, phosphoryliert wurde. Durch Autoradiographie wurde bestätigt, daß die vorstehend genannte Basensequenz korrekt war.
  • Es wurden auch weitere gemischte Oligonucleotide (VI bis VIII, XI, XII) in entsprechender Weise wie vorstehend hergestellt.
    • Beispiel 2 Reaktionen zur Spaltung des Doppelstrangs (1)
  • Ein markiertes RNA-Oligomer (X, 20 000 cpm), ein nicht-markiertes RNA-Oligomer (X, 1 mikromolar) und ein komplementäres DNA-Oligomer (IX, 10 mikromolar), das gemäß dem Verfahren von Ikehara et al. (Veröffentlichung 2) hergestellt worden war, wurden getrennt mit 40 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,7), 4 millimolar MgCl&sub2;, 1 millimolar DTT, 4% Glycerin, 0,003% BSA (Cooper Biochemical Inc., Worthington Biochemicals, Nuclasefrei) und RNaseH (5 Einheiten) gemischt. Das erhaltene Gemisch (insgesamt 20 ul) wurde einer Reaktion bei 20ºC unterworfen. 4 ul der Probe wurden periodisch entnommen und mittels Homochromatographie analysiert (Fig. 1).
  • Sodann wurde jeder Fleck abgetrennt, und die Radioaktivität davon wurde mit einem Scintillationszähler gemessen. Die Spaltungsrate wurde berechnet (Fig. 2). Fig. 3 zeigt einen Graph, der die Beziehung zwischen der Spaltungsposition und der Spaltungsrate zeigt.
  • Im Hinblick auf die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse wurde geschlossen, daß die Spaltung des chemischen Strangs in einer Mehrzahl von Positionen in einem unterschiedlichen Ausmaß, wie es nachstehend durch die Pfeile gezeigt ist, auftrat. Die Spaltung trat nämlich bei der Phosphodiesterbindung zwischen dem 5. und dem 6. Segment, der Bindung zwischen dem 6. und dem 7. Segment und der Bindung zwischen dem 7. und 8. Segment (gezählt vom 5'-Terminus) im RNA-Oligomer (X) auf.
  • Doppelstrang (1) In der vorstehenden Formel zeigen die Pfeile die gespaltenen Positionen, und die Größe der Pfeile zeigt qualitativ den Grad der Spaltungsreaktion.
    • Beispiel 3 Reaktionen zur Spaltung der Doppelstränge (2) und (4)
  • Ein markiertes RNA-Oligomer (X, 40 000 cpm), ein nicht-markiertes RNA-Oligomer (X, 5 mikromolar) und ein komplementäres gemischtes Oligomer (VI oder VII, 25 mikromolar) wurden mit der Pufferlösung wie in Beispiel 2 gemischt, und RNaseH (5 Einheiten) wurde zugegeben. Jedes der erhaltenen Gemische (10 ul) wurde 48 Stunden einer Reaktion bei 20ºC (Fig. 4) oder 16 Stunden einer Reaktion bei 30ºC (Fig. 5) unterworfen. Die Reaktionsprodukte wurden wie im Fall von Beispiel 2 analysiert.
  • Ergebnisse:
  • Doppelstrang (2) Doppelstrang (4) Doppelstrang (2) Doppelstrang (4) worin die Linie "-" den O-Methyl-Oligomer-Anteil bezeichnet.
  • Wie vorstehend gezeigt wurde, war es möglich, bevorzugt die chemische Bindung zwischen dem 6. und 7. Segment (gezählt vom 5'-Terminus) des RNA-Oligomers (X) zu spalten, wenn die Reaktion unter Verwendung im gemischten Oligomer (VII) 16 Stunden bei 30ºC durchgeführt wurde.
    • Beispiel 4 Reaktionen zur Spaltung des Doppelstrangs (3)
  • Ein markiertes RNA-Oligomer (X, 30 000 cpm), ein nicht-markiertes RNA-Oligomer (X, 1 mikromolar) und ein komplementäres gemischtes Oligomer (V, 10 mikromolar) wurden getrennt in der gleichen Pufferlösung wie in Beispiel 2 gemischt, und RNaseH (10 Einheiten) wurde zugegeben.
  • Jedes der auf diese Weise erhaltenen Gemische (20 ul) wurde 17 Stunden einer Reaktion bei 20ºC oder 30ºC unterworfen, und anschließend wurde jedes Reaktionsprodukt wie im Fall von Beispiel 2 analysiert (Fig. 6).
  • Ergebnisse:
  • Doppelstrang (3) Wie vorstehend gezeigt wurde, war es möglich, bevorzugt die chemische Bindung zwischen dem 6. und dem 7. Segment (gezählt vom 5'-Terminus) im RNA-Oligomeren (X) unter Verwendung des gemischten Oligomers (V) zu spalten.
    • Beispiel 5 Reaktionen zur Spaltung des Doppelstrangs (5)
  • Ein markiertes RNA-Oligomer (X, 30 000 cpm), ein nicht-markiertes RNA-Oligomer (X, 1 mikromolar) und ein komplementäres gemischtes Oligomer (VIII, 10 mikromolar) wurden getrennt mit der gleichen Pufferlösung wie in Beispiel 2 gemischt, und RNaseH (10 Einheiten) wurde zugegeben. Die Menge jedes Ausgangsgemisches betrug 20 ul. Jedes Gemisch wurde 17 Stunden einer Reaktion bei 20ºC oder bei 30ºC unterworfen, und anschließend wurden die jeweiligen Produkte wie in Beispiel 2 analysiert (Fig. 7).
  • Ergebnisse:
  • Doppelstrang (5) Wie vorstehend gezeigt wurde, war es möglich, bevorzugt die chemische Bindung zwischen dem 8. und dem 9. Segment (gezählt vom 5'-Terminus) im RNA-Oligomer (X) unter Verwendung des gemischten Oligomers (VIII) zu spalten.
    • Beispiel 6 Reaktionen zur Spaltung des Doppelstrangs (6)
  • Ein markiertes RNA-Oligomer (XIII, 30 000 cpm), ein nichtmarkiertes RNA-Oligomer (XIII, 1 mikromolar) und ein komplementäres gemischtes Oligomer (XI, 10 mikromolar) wurden getrennt mit der gleichen Pufferlösung wie in Beispiel 2 gemischt, und RNaseH (0, 2, 5 oder 10 Einheiten) wurde zugegeben. Die Menge jedes Ausgangsgemisches betrug 20 ul. Die Gemische wurden 1 Stunde einer Reaktion bei 30ºC unterworfen, und die Reaktionsprodukte wurden wie im Fall von Beispiel 2 analysiert (Fig. 8).
  • Ergebnis:
  • Doppelstrang (6) Wie vorstehend gezeigt wurde, war es möglich, bevorzugt die chemische Bindung zwischen dem 6. und dem 7. Segment (gezählt vom 5'-Terminus) im RNA-Oligomer (XIII) zu spalten.
    • Beispiel 7 Reaktionen zur Spaltung des Doppelstrangs (7)
  • Eine markierte RNA (XIV, 30 000 cpm), eine nicht-markierte RNA (XIV, 1 mikromolar) und ein komplementäres gemischtes Oligomer (XII, 10 mikromolar) wurden getrennt mit der gleichen Pufferlösung wie in Beispiel 2 gemischt, und RNaseH (5 Einheiten) wurde zugegeben. Die Menge jedes Ausgangsgemisches betrug 20 ul. Diese Ausgangsgemische wurden 30 Minuten oder 12 Stunden einer Reaktion bei 20ºC oder 30 Minuten oder 12 Stunden einer Reaktion bei 30ºC unterworfen. Die auf diese Weise erhaltenen Reaktionsprodukte wurden wie im Fall von Beispiel 2 analysiert (Fig. 9).
  • Ergebnisse:
  • Doppelstrang (7) Wie vorstehend gezeigt wurde, war es möglich, bevorzugt die chemische Bindung zwischen dem 6. und dem 7. Segment (gezählt vom 5'-Terminus) im RNA-Oligomer (XIV) zu spalten.
    • Beispiel 8 Verfahren zur Markierung der 5'-Hydroxygruppe der RM1-Oligomere (X, XIII und XIV) mit Phosphat mit einem Gehalt an ³²P
  • 20 pMol an RNA-Oligomer (X) [hergestellt gemäß dem Verfahren von Iwai et al.; Veröffentlichung 3) und 30 uCi [gamma-³²P]ATP (3000 Ci/mMol, NEN), 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 8,0), 10 millimolar MgCl&sub2;, 1 millimolar EDTA, 6 millimolar DTT und 0,1 mg/ml Gelatine wurden miteinander unter Bildung von 25 ul eines Gemisches gemischt. Das Gemisch wurde mit T4- Polynucleotidkinase (1 Einheit; hergestellt von Takara Brewery Co., Ltd.) gemischt und 1 Stunde einer Reaktion bei 37ºC unterworfen, um die Phosphorylierung der 5'-terminalen Gruppe zu bewirken.
  • Nach dieser Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit einem Phenol/Chloroform-Gemisch extrahiert. Anschließend wurde eine chromatographische Trennung unter Verwendung einer Sephadex- G-75-Säule (Gesamtvolumen von 10 ml) durchgeführt. Als mobile Phase wurde eine Pufferlösung von 10 millimolar Triethylamin/Bicarbonat (pH-Wert: 7,0) verwendet. Die anfänglichen radioaktiven Fraktionen wurden gesammelt und als markierte RNA-Oligomere verwendet.
  • Wie für die RNA-Oligomere (XIII, XIV) wurde ein entsprechender Schritt durchgeführt, um markierte RNA-Oligomerproben herzustellen.
    • Beispiel 9 Homochromatographie
  • Eine geeignete Menge (in der Größenordnung von 10&sup4; cpm) einer Enzymreaktionslösung wurde auf "Polygram Cel 300 DEAE/HR- 2/15" (Mecherey-Nagel Company) aufgetragen und mit "Homomix- VI" bei 60ºC entwickelt. Anschließend wurde die Exposition eines Röntgenfilms ("Kodak-X-Phomat-RP-Film", bezogen von Eastman Kodak Company) gegenüber dieser Probe über Nacht bei -80ºC durchgeführt.
  • Bei dem hier verwendeten Homomix handelte es sich um einen Homomix, der gemäß dem in dem Artikel von E. Jay et al. (Nucleic Acids Res., Bd. 1 (1974), S. 331) hergestellt worden war.
    • Beispiel 10 Teilweiser Verdau durch Schlangengift-Phosphodiesterase (Herstellung von VDP-Verdauprodukten)
  • Ein an seinem 5'-Terminus markiertes RNA-Oligomer (X, XIII, XIX; 5 bis 7·10&sup4; cpm) wurde mit 0,2 bis 0,3 OD einer Träger-RNA (Tolura-Hefe-RNA Typ VI, bezogen von SIGMA Company), 0,25 m Tris-HCl (pH-Wert: 8,0), 50 millimolar MgCl&sub2; und 0,2 bis 0,3 ug VDPase (Boehringer Company) unter Bildung von 10 ml eines Gemisches gemischt. Dieses Gemisch wurde bei 37ºC einer Reaktion unterworfen. Während der Reaktion wurde eine Probe (2 ul) des Reaktionsgemisches 2 Minuten nach dem Beginn der Reaktion entnommen. Die Probe wurde zu 5 ul 5 millimolar EDTA in einem Eppen-Röhrchen gegeben und 2 Minuten auf 100ºC erwärmt, um die Reaktion der Probe zu beenden. Eine derartige Probenentnahme wurde auch 5, 10, 20 und 30 Minuten nach dem Beginn der Reaktion durchgeführt. Diese Reaktionsgemische wurden gemischt und als Marker bei der Homochromatographie verwendet. (Sie sind als "VPD-Verdauprodukte" in Fig. 1, 4, 5, 6, 7, 8 und 9 gezeigt.)
    • Beispiel 11 Herstellung der 2'-O-Methyl-nucleosid-3'-phosphoramidite (Ib&sub2;, IIb&sub2;, IIIb&sub2;, IVb&sub2;)
  • 344 mg (0,5 mMol) N&sup6;-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O- methyladenosin (Verbindung IIa) wurden in 2 ml wasserfreiem THF gelöst, und die erhaltene Lösung wurde mit 362 ul (2 mMol) Diisopropylethylamin (DIPEA) unter Rühren unter einer Argonatmosphäre bei Raumtemperatur gemischt. Anschließend wurden 300 ul (1,5 mMol) N,N-Diisopropylaminomethoxychlorphosphin innerhalb von 1 Minute zugegeben. Nach 5 Minuten bildete sich DIPEA-Hydrochlorid als weißer Niederschlag. Es wurde bei Raumtemperatur gerührt und nach 45 Minuten wurde das Reaktionsgemisch durch Chromatographie unter Verwendung von Silikagel 60 TLC (mobile Phase: n-Hexan/Aceton (1 : 1) mit einem Gehalt an 5% Triethylamin) analysiert, um festzustellen, ob der Fleck des Ausgangsmaterials (Rf = 0,52) verschwunden war und der Fleck des Produkts (IIb&sub2;) (Rf = 0,76) aufgetreten war. Nach der Bestätigung des letztgenannten Flecks wurden 20 ml Ethylacetat unter Eiskühlung zum Reaktionsgemisch gegeben. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch zweimal mit 15 ml einer eisgekühlten gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und anschließend einmal mit 15 ml einer eisgekühlten gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfatgetrocknet. Nachdem das Natriumsulfat durch Filtration abgetrennt worden war, wurde das Filtrat zur Trockene eingeengt. Der auf diese Weise erhaltene ölige Rückstand wurde unter verringertem Druck getrocknet, in 2 ml Dichlormethan gelöst und tropfenweise unter Rühren zu 200 ml n-Hexan, das auf eine Temperatur von -50ºC gekühlt worden war, gegeben, wobei sich ein weißer Niederschlag bildete.
  • Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert und unmittelbar danach in einen Exsikkator gegeben, um ihn über Nacht bei verringertem Druck zu trocknen. 407 mg des Produkts (IIb&sub2;) wurde in einer Ausbeute von 95% erhalten.
  • Auf entsprechende Weise wurden die folgenden Produkte mit ähnlicher Ausbeute erhalten: N²-Isobutyryl-5'-O-monomethoxytrityl-2'-O-methyl-guanosin-3'-phosphoramidit (IIIb&sub2;), N&sup4;- Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-cytidin-3'-phosphoramidit (Ib&sub2;) und 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-methyl-uridin-3'- O-phosphoramidit (IVb&sub2;).
  • Die spektralen Daten dieser Produkte unter Einschluß der ³¹P- NMR-Spektren, der FAB-Massenspektren und der UV-Absorptionsspektren sind nachstehend angegeben.
  • ³¹P-NMR-Spektren:
  • Lösungsmittel: CDCl&sub3;; externer Standard: Trimethylphosphat (ppm) Ib&sub2; 148,5470; 148,3509
  • IIb&sub2; 149,4520; 148,5998
  • IIIb&sub2; 149,5726; 148,9618
  • IVb&sub2; 148,8788; 148,3132
  • (Diese Daten zeigen aufgrund der Isomere zwei Signale.)
    • FAB-Massenspektrum:
  • M-H&spplus; (m/z)
  • Ib&sub2; 825
  • IIb&sub2; 849
  • IIIb&sub2; 801
  • IVb&sub2; 722
    • UV-Absorptionsspektren: Lösungsmittel: Ethanol (nm)
  • Ib&sub2;: λmax. 305, 261, 236
  • λmin. 290, 249, 224
  • IIb&sub2; λmax. 280, 234
  • λmin. 257, 224
  • IIIb&sub2; λmax. 282, 254, 236
  • λmin. 273, 244, 227
  • IVb&sub2; λmax. 265, 225
  • λmin. 254, 226
    • Beispiel 12 Herstellung der 2'-O-Methyl-nucleosid-3'-β-cyanoethyl-N,N- diisopropyl-aminophosphine (Ib&sub3;, IIb&sub3;, IIIb&sub3;, IVb&sub3;)
  • 344 mg (0,5 mMol) N&sup6;-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O- methyladenosin wurden in 2 ml THF (das in Gegenwart von metallischem Natrium destilliert worden war) gelöst. Zu dem erhaltenen Gemisch wurden 362 ul (2 mMol) Diisopropylethylamin (DIPEA) gegeben. Anschließend wurden 1,5 mMol N,N-Diisopro- Pylamino-β-cyanoethylchlorphosphin zugegeben. Nach 5 Minuten bildete sich ein weißer Niederschlag von DIPEA-Hydrochlorid, und das Rühren wurde weiter fortgesetzt. Nach 30 Minuten wurde ein Anteil des Reaktionsgemisches durch Chromatographie unter Verwendung von Silikagel 60 TLC (mobile Phase: n- Hexan/Aceton (1 : 1) mit einem Gehalt 5% Triethylamin) analysiert, um festzustellen, ob der Fleck der Ausgangsverbindung (IIa) verschwunden war und der Fleck des Amidits (IIb&sub3;) aufgetreten war. Danach wurden 20 ml Ethylacetat zum Reaktionsgemisch unter Eiskühlung gegeben. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch zweimal mit 15 ml gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und mit 15 ml eisgekühlter gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet.
  • Nachdem das Natriumsulfat durch Filtration entfernt worden war, wurde das Filtrat zur Trockene eingeengt und der erhaltene schaumige Rückstand in 2 ml Ethylacetat, das 0,2% Trimethylamin enthielt, gelöst. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde einer chromatographischen Trennung unter Verwendung einer Säule, die mit 2,5 g Siliciumdioxidgel 60 gefüllt war, unterworfen. Die mobile Phase war Ethylacetat mit einem Gehalt 0,2% Triethylamin. Fraktionen, die aus der reinen Verbindung (IIb&sub3;) bestanden, wurden gesammelt und zur Trockene eingeengt. 407 mg (0,485 mMol) der Verbindung (IIb&sub3;) wurden in einer Ausbeute von 97% erhalten.
  • Auf entsprechende Weise wurden die folgenden Verbindungen in fast den gleichen Ausbeuten erhalten: N²-Isobutyryl-5'-O- monomethoxytrityl-2'-O-methylguanosin-3'-phosphoramidit (Verbindung IIIb&sub3;), N&sup4;-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O- methylcytidin-3'-phosphoramidit (Verbindung Ib&sub3;) und 5'-O- Dimethoxytrityl-2'-O-methyluridin-3'-phosphoramidit (Verbindung IVb&sub3;).
  • Die spektralen Daten dieser Verbindungen unter Einschluß der ³¹P-NMR-Spektren, der FAB-Massenspektren und der UV-Absorptionsspektren sind nachstehend angegeben.
    • ³¹P-NMR-Spektren: Lösungsmittel: CDCl&sub3;; externer Standard: Trimethylphosphat (8 ppm) FAB-Massenspektrum:
  • M-H&spplus; (m/z)
  • Verbindung Ib&sub3; 864
  • Verbindung IIb&sub3; 888
  • Verbindung IIIb&sub3; 840
  • Verbindung IVb&sub3; 762
    • UV-Absorptionsspektren: Lösungsmittel: Ethanol Beispiel 13 Herstellung der 2'-O-Methylnucleosid-Polymerträger (Ic&sub2;, IIc&sub2;, IIIc&sub2;, IVc&sub2;)
  • 344 mg (0,5 mMol) N&sup6;-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O- methyladenosin (IIa) und 92 mg (0,75 mMol) 4-N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP) wurden in 2 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 750 mg (0,75 mMol) Bernsteinsäureanhydrid unter Rühren bei 30ºC gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde ferner über Nacht gerührt und anschließend zur Trockene eingeengt. Der auf diese Weise erhaltene ölige Rückstand wurde in 20 ml Chloroform gelöst, und die erhaltene Lösung wurde dreimal mit 20 ml 0,1 m Triethylammonium-Bicarbonat-Pufferlösung (TEAB-Pufferlösung) (pH-Wert: 7,5) gewaschen. Die Chloroformphase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand (ein Gemisch von (IIe) und DMAP) wurde in 2,7 ml DMF gelöst, und die erhaltene Lösung wurde mit 200 mg (0,75 mMol) Pentachlorphenol und 154 mg (0,75 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gemischt und über Nacht bei 30ºC gerührt.
  • Auf diese Weise gebildete unlösliche Stoffe wurden aus dem Reaktionsgemisch durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in 3 ml Chloroform gelöst. Die auf diese Weise gebildete Lösung wurde einer chromatographischen Trennung unter Verwendung einer Säule, die mit Silikagel 60 (20 g; Säulengröße: 4 cm (Durchmesser)·2,5 cm (Länge)) gefüllt und mit Chloroform äquilibriert worden war, unterworfen. Als mobile Phase wurde Chloroform verwendet. Die eluierten Fraktionen, die aus der Verbindung (IIf) (Rf=0,81, gemessen unter der Bedingung von Chloroform:Methanol=20 : 1 bei der Siliciumdioxidgel 60-TLC) bestanden, wurden gesammelt und zur Trockene eingeengt. Man erhielt die Verbindung (IIf) in einer Ausbeute von etwa 90%.
  • Auf entsprechende Weise wurden die Verbindungen (If, IIIf, IVf) mit fast den gleichen Ausbeuten erhalten. Rf (bei der Siliciumdioxidgel 60-TLC) Verbindung Rf Mobile Phase Chloroform : Methanol
  • In einem Reaktionsgefäß, das mit einem Glasfilter ausgestattet war, wurden 680 mg eines Glasträgers mit kontrollierten Poren (CPG/Langkettenalkylamin, Porendurchmesser: 500 Å, Teilchengröße: 122 bis 177 um, NH&sub2;-: 30 uMol/g, Pierce Chemical Co.) vorgelegt, mit 1 ml DMF gewaschen und mit einer Argonatmosphäre 1 Minute getrocknet.
  • Jeder der aktiven Ester (If, IIf, IIIf, IVf) (0,45 mMol) wurde in 4,5 ml DMF gelöst, und 114 ul (0,82 mMol) Triethylamin wurden zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde zum vorstehend genannten CPG gegeben, und das Gefäß wurde dicht verschlossen und über Nacht bei 30ºC geschüttelt.
  • Anschließend wurde das Reaktionsgemisch unter einem Druck von Argongas filtriert. Der Polymerträger wurde dreimal mit 5 ml DMF und anschließend dreimal mit 5 ml THF gewaschen und 1 Minute durch einen Argongasstrom getrocknet.
  • Zu dem Polymerträger wurde ein flüssiges Gemisch, das aus 273 mg DMAP, 940 mg 2,6-Lutidin, 0,44 ml Essigsäureanhydrid und 4 ml THF bestand, gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten bei 30ºC geschüttelt, um die nicht-umgesetzten Aminogruppen zu schützen. Die Reaktionslösung wurde filtriert, dreimal mit 5 ml THF und dreimal mit 5 ml Diethylether gewaschen und in einem Argonstrom und anschließend unter Vakuum getrocknet.
  • Ein kleiner Anteil jedes Nucleotidträgers, der auf diese Weise erhalten wurde (Ic&sub2;, IIc&sub2;, IIIc&sub2;, IVc&sub2;), wurde mit 3% Trichloressigsäure behandelt, um die Dimethoxytritylgruppen (oder die Monomethoxytritylgruppen) zu entfernen, so daß freies Tritanol gebildet wurde. Das Tritanol wurde einer colorimetrischen quantitativen Analyse mit Hilfe einer Perchlorsäure/Ethanol-Lösung unterworfen. In jedem Fall wurde beobachtet, daß die Menge des gebundenen Nucleosids 29 bis 30 uMol/g betrug.
    • Beispiel 14 Herstellung eines gemischten Oligonucleotids der Formel: 5'CGGAUmCmUiLAmGmCmCmGmGmGmUm3' (XVIII) (worin m eine O-Methyl-nucleotideinheit darstellt und die anderen Symbole Desoxynucleotideinheiten darstellen) aus einem Methoxyderivat
  • Eine Patrone wurde mit 8 mg eines Glases mit kontrollierten Poren, an das 0,2 uMol 5'-Dimethoxytrityl-2'-O-methyl-uridin (Verbindung IVc&sub2;) gebunden waren, gefüllt. Die Patrone wurde in einen DNA-Syntheseautomaten Modell 380A (Applied Biosystems Co.) eingesetzt, wobei ein Betrieb wiederholt in 14 Zyklen gemäß dem in Tabelle 6 gezeigten Verfahren durchgeführt wurde, und zwar unter Einsatz der folgenden Phosphoramidite in der angegebenen Reihenfolge: IIIb&sub2;, IIIb&sub2;, IIIb&sub2;, Ib&sub2;, Ib&sub2;, IIIb&sub2;, IIb&sub2;, IVb&sub2;, Ib&sub2;, IVb&sub2;, IId&sub2;, IIId&sub2;, IIId&sub2; und Id&sub2;, um ein geschütztes gemischtes Oligomer herzustellen.
  • Gemäß dem in Tabelle 3 gezeigten Verfahren wurde die Ammoniaklösung, mit der der Polymerträger behandelt worden war, in ein 3 ml fassendes Fläschchen gegossen und nach Verschließen 12 Stunden auf 50ºC erwärmt, um die in der Base enthaltene Acylgruppe zu entfernen. Nach Abkühlen wurde der Ammoniak entfernt, zweimal mit 1 ml Ethylacetat gewaschen, und die wäßrige Schicht wurde zur Trockene eingeengt.
  • Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde in 200 ul 0,1 m Essigsäure-Triethylamin-Pufferlösung mit einem Gehalt an 10% Acetonitril (pH-Wert: 7,0; TEAA) gelöst und einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer Säule (Durchmesser: 1 cm, Länge: 10 cm), die mit einem Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel (Prep PAK-500/C-18, Waters Company) gefüllt war, unterworfen. Als mobile Phase wurde 0,1 m TEAA (pH-Wert: 7,0) mit einem Konzentrationsgradienten im Bereich von 10 bis 35% Acetonitril verwendet. Eine quantitative Analyse wurde durch Bestimmung der Lichtabsorption bei 254 nm durchgeführt. 2,2 OD-Einheiten gemischtes 5'-Dimethoxytrityl-Oligonucleotid wurden isoliert.
  • Nachdem das Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch durch Destillation unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde das Reaktionsgemisch mit 1 ml einer 80%-igen Essigsäurelösung behandelt und 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck aus der Reaktionslösung abdestilliert, und die Essigsäure-Komponente wurde durch gemeinsames Verdampfen mit Wasser unter' verringertem Druck entfernt.
  • Der erhaltene Rückstand wurde in Wasser gelöst und mit Ethylacetat gewaschen. Die wäßrige Phase wurde zur Trockene eingeengt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule der Bezeichnung "YMC pack ODS" (Yamamura Kagaku Co., Ltd.) gereinigt. Als mobile Phase wurde 0,1 m TEAA mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 5 bis 25% Acetonitril (pH-Wert: 7,0) verwendet.
  • Der Hauptpeak wurde bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,2 ml/min eluiert, so daß 0,91 OD-Einheiten (etwa 6 nMol; Ausbeute: 3,0%) des gemischten Oligonucleotids (XVIII) erhalten wurden.
  • Auf entsprechende Weise wurden jeweils die nachstehenden Produkte isoliert.
  • 5'CGGATCmUmAmGmCmCmGmGmGmUm3' (XVI I) (Ausbeute: 2 , 5%)
  • 5'CGGAmUmCmUmAmGmCmCmGmGmGmUm3' (XIX) (Ausbeute: 3,0%)
  • 5'AmCmAmCmAmCmCmCGGA3' (XXII) (Ausbeute: 6,8%)
  • 5'AmCmAmCmAmCmCmCGG3' (XXIII) (Ausbeute: 8,6%)
  • 5'CmUmCGAAAGmUm3' (XXIV) (Ausbeute: 3,2%)
    • Beispiel 15 Herstellung eines gemischten Oligonucleotids der Formel: 5'AmCmAmCmAmCmCmCmGGAT3' (XX) (worin m eine O-Methyl-nucleotideinheit darstellt und die anderen Symbole Desoxynucleotideinheiten darstellen) unter Verwendung eines β-Cyanoethylderivats
  • Eine Patrone wurde mit einem Glas mit kontrollierten Poren (Applied Biosystems Company) mit einem Gehalt an 0,2 uMol 5'- Dimethoxytrityl-thymidin, das daran gebunden war, gefüllt. Ein Betrieb wurde gemäß dem in Tabelle 2 gezeigten Verfahren durchgeführt, und zwar unter Verwendung der folgenden Phosphoramidite in der angegebenen Reihenfolge: IId&sub3;, IIId&sub3;, IIId&sub3;, Ib&sub3;, Ib&sub3;, Ib&sub3;, IIb&sub3;, Ib&sub3;, IIb&sub3;, Ib&sub3; und IIb&sub3;. Die Reaktion wurde wiederholt in 11 Zyklen durchgeführt, so daß ein geschütztes gemischtes Oligomer synthetisiert wurde.
  • Sodann wurde das Oligomer vom Polymerträger (CPG) in Form einer Ammoniaklösung gemäß dem in Tabelle 3 angegebenen Verfahren abgetrennt. Ein 3 ml fassendes Fläschchen wurde mit dem Oligomer gefüllt, dicht verschlossen und 9 Stunden auf 50ºC erwärmt, um die β-Cyanoethylgruppe und die Acylgruppe der Base von dem Oligomer zu entfernen. Nach Abkühlen wurde der Ammoniak entfernt, und das Reaktionsgemisch wurde zweimal mit 1 ml Ethylacetat gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde zur Trockene eingeengt.
  • Der erhaltene Rückstand wurde in 200 ul 0,1 m Essigsäure/Triethylamin-Pufferlösung mit einem Gehalt an 10% Acetonitril (TEAA; pH-Wert: 7,0) gelöst. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde einer säulenchromatographischen Trennung unter Verwendung einer Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 10 cm, die mit einem Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel (Prep. PAK-500/C-18, Waters Company) gefüllt war, unterworfen. Als mobile Phase wurde 0,1 m TEAA mit einem linearen Konzentrationsgradienten im Bereich von 10 bis 35% Acetonitril (pH-Wert: 7,0) verwendet. 9,5 OD-Einheiten gemischtes 5'-Dimethoxytrityl-Oligomer wurden unter Messung der Lichtabsorption bei 254 nm isoliert.
  • Nachdem das Lösungsmittel aus dem Gemisch durch Destillation unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde 1 ml einer 80%-igen wäßrigen Essigsäurelösung zu dem Gemisch gegeben, das anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur gehalten wurde. Die Reaktionslösung wurde einer Destillation unter verringertem Druck unterworfen, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen, und anschließend zusammen mit Wasser unter verringertem Druck verdampft, um die Essigsäure zu entfernen. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst, mit Ethylacetat gewaschen, unter verringertem Druck destilliert und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer "YMC-pack-Säule" (Yamamura Kagaku Co., Ltd.) gereinigt. Die eingesetzte mobile Phase bestand aus 0,1 m TEAA mit einem linearen Konzentrationsgradienten im Bereich von 5 bis 25% Acetonitril (pH-Wert: 7,0). Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 1,2 ml/min. Der Hauptpeak, der eluiert worden war, wurde aufgefangen, so daß man 1,9 OD-Einheiten (etwa 16 nMol; Ausbeute: 8,1%) des gemischten Oligonucleotids (XX) erhielt.
  • Auf entsprechende Weise wurde das folgende gemischte Oligomer erhalten:
  • 5'AmCmAmCmAmCmCmCGGAT3' (XXI) (Ausbeute: 9,3%)
    • Beispiel 16 Herstellung der doppelsträngigen DNA (XVI)
  • DNA-Oligomere (1 bis 9, Stranglänge: 17 bis 47) wurden durch einen DNA-Syntheseautomaten unter Verwendung geeigneter handelsüblicher Verbindungen (Id&sub4; bis IVd&sub4; und Id&sub2; bis IVd&sub2;) (ABI Company) synthetisiert und auf herkömmliche Weise gereinigt.
  • 1 nMol jedes DNA-Oligomers wurde mit 4 ul 0,5 m Tris-HCl (pH- Wert: 7,5), 4 ul 0,1 m MgCl&sub2;, 10 ul 0,2 mMol ATP, 4 ul 0,1 m DTT und 14 ul H&sub2;O gemischt. Die erhaltene Lösung wurde anschließend mit 2 ul (5 Einheiten) T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo Co., Ltd.) gemischt und 40 Minuten einer Reaktion bei 37ºC unterworfen. Anschließend wurde zu dem Reaktionsgemisch die gleiche Menge an Kinase gegeben, und das Gemisch wurde erneut 40 Minuten umgesetzt.
  • Ein Anteil des Reaktionsgemisches wurde mit einer 5'-phosphorylierten Verbindung (1, 2, 5, 6) unter Bildung einer "Lösung A" gemischt, und ein anderer Anteil wurde mit einer Verbindung (3, 4, 7, 8, 9) unter Bildung einer "Lösung B" gemischt. Diese Lösungen wurden in einem Wasserbad bei 80ºC angeordnet und anschließend langsam in einer Zeitspanne von 3 Stunden auf 20ºC gekühlt. Zu Lösung A wurden 40 ul 2 millimolar ATP, 40 ul 0,1 m DTT und 1 ul (175 Einheiten) T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) gegeben, und das erhaltene Gemisch (100 ul) wurde 20 Minuten einer Reaktion bei 15ºC unterworfen. Die Lösung B wurde mit 25 ul 2 millimolar ATP, 25 ul 0,1 in DTT und 0,5 ml (87 Einheiten) Ligase gemischt und einer Reaktion wie im Fall von Lösung A unterworfen.
  • Anschließend wurden diese Reaktionslösungen jeweils mit Phenol behandelt und einer chromatographischen Trennung unter Verwendung einer Gelfiltrationssäule (Superose® 6H10/30) unterworfen. Die mobile Phase bestand aus 0,05 m Tris-HCl und 1 millimolar EDTA (pH-Wert: 8,0). Die folgenden Produkte wurden erhalten: der Doppelstrang A: 590 pMol (1,07 OD); und der Doppelstrang B:; 311 pMol (0,62 OD).
  • 347 pMol des Strangs A wurde mit 311 pMol des Strangs B gemischt, und das erhaltene Gemisch wurde mit 140 ul der Reaktionslösung (50 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,5, 10 millimolar MgCl&sub2;, 0,2 millimolar ATP und 10 millimolar DTT) gemischt und 1 Stunde bei 37ºC gehalten, bei Raumtemperatur anelliert, mit 0,5 ul (87 Einheiten) T4-DNA-Ligase gemischt und 1,5 Stunden einer Reaktion bei 15ºC unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol/Chloroform-Behandlung und einer Ethanol-Fällungsbehandlung unterworfen und anschließend unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt.
  • Der erhaltene Rückstand wurde mit 95 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 6 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5) 6 millimolar MgCl&sub2;, 125 millimolar NaCl und 7 millimolar DTT gemischt. Die Reaktionslösung wurde mit 5 ul (20 Einheiten) SphI gemischt und 30 Minuten einer Reaktion bei 37ºC und 2 Tage einer Reaktion bei Raumtemperatur unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol/Chloroform-Behandlung und Ethanol-Fällungsbehandlung und anschließend einer chromatographischen Trennung unter Verwendung einer Gelfiltrationssäule (Superose® 6H10/30) unterworfen. Nach einer Ethanol- Fällungsbehandlung erhielt man 68 pMol (7,6 ug) der doppelsträngigen DNA (XVI).
    • Beispiel 17 Herstellung eines Vektors für die Transkription (M13-M-1)
  • 2 ul M13mp19 (0,1 ug/ul, Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu 20 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 6 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5), 6 millimolar MgCl&sub2;, 125 millimolar NaCl und 7 millimolar DTT gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde mit SphI (2 Einheiten; Takara Shuzo Co., Ltd.) gemischt und 30 Minuten einer Reaktion bei 37ºC unterworfen. Nachdem eine Phenol/Chloroform-Behandlung und eine Ethanol-Fällungsbehandlung auf herkömmliche Weise durchgeführt worden waren, wurde das Reaktionsgemisch mit 20 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 8,0), 10 millimolar MgCl&sub2;, 20 millimolar KCl und 7 millimolar DTT und anschließend mit SmaI (5 Einheiten; Takara Shuzo Co., Ltd.) gemischt. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 30ºC durchgeführt.
  • Nachdem eine Phenol/Chloroform-Behandlung und eine Ethanol- Fällungsbehandlung auf herkömmliche Weise durchgeführt worden waren, wurde das Reaktionsgemisch unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde zu einer Lösung mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl (pH- Wert: 7,5), 10 millimolar MgCl&sub2;, 0,2 millimolar ATP und 10 millimolar DTT gegeben. 0,04 ug der doppelsträngigen DNA, die in Beispiel 16 beschrieben wird, und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase wurden zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Die Reaktion wurde 3 Stunden bei 16ºC durchgeführt. Die Reaktion wurde ferner über Nacht bei 4ºC durchgeführt. Das erhaltene Produkt (Lösung) wurde in der nachfolgenden Transformationsstufe in einer Menge von 1, 2 oder 4 ul verwendet.
  • Gemäß einem bekannten Verfahren, das in Methods in Enzymology, Bd. 101 (1983), S. 20-78, beschrieben ist, wurde eine Transformation kompetenter Zellen von E. coli JM 103 und ein Absuchen auf weiße Plaques durchgeführt. Aus jedem von etwa 10 weißen Plaques wurde ein Phage entnommen. Der Phage wurde zu 1,5 ml einer Suspension mit einem Gehalt an E. coli JM 103 gegeben, wobei die Suspension durch Inkubieren des Mikroorganismus bei 37ºC über Nacht und Verdünnung mit einem Faktor von 100 hergestellt worden war. Anschließend wurde der Mikroorganismus 6 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Dann wurde 5 Minuten bei einer Geschwindigkeit von 12 000 U/min zentrifugiert, so daß eine klare Überstandsschicht gebildet wurde. Es wurde eine herkömmliche Behandlung durchgeführt, um eine einzelsträngige DNA zu erhalten. Ein synthetischer Strangabschnitt, der inseriert worden war, wurde gemäß der Didesoxymethode sequenziert, so daß man den gewünschten Klon erhielt.
  • 100 ul der vorstehend genannten überstehenden Phagenlösung wurden zu 1 l einer JM 103-Suspension (0,3 OD/570 nm) gegeben. Eine Inkubation wurde 7 Stunden bei 37ºC auf herkömmliche Weise durchgeführt, so daß man 445 ug des gewünschten Vektors M13AJ-1 erhielt.
    • Beispiel 18 Herstellung von WS-S(+)RNA
  • 50 ug M13-AJ-1 wurden zu 100 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 70 Einheiten SmaI (70 Einheiten), 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 8,0), 10 millimolar MgCl&sub2;, 20 millimolar KCl und 7 millimolar DTT gegeben. Die Reaktion wurde 2 Stunden bei 30ºC durchgeführt. Die Bildung eines linearen Strangs wurde mit Hilfe einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel bestätigt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol/Chloroform-Behandlung und anschließend einer Ethanol-Fällungsbehandlung unterworfen, in 1 ml Wasser gelöst und durch UV-Lichtabsorption bei 260 nm analysiert (0,84 OD/ml; 42 ug).
  • Das Reaktionsgemisch wurde erneut unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt und anschließend in 84 ul Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wurde in der nächsten Transkriptionsreaktion verwendet.
  • Gemäß einem bekannten Verfahren, das in Nucleic Acid Res., Bd. 12 (1984), S. 7035, beschrieben ist, wurden in ein 1,5 ml fassendes Eppen-Röhrchen 5 ul jeweils 10 millimolar ATP, GTP, UTP und CTP gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde mit 100 ul [5-³H]-UTP (100 uCi, 2,2·10&sup8; dpm/7,3 nMol, Amasham Company) gemischt und unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt.
  • Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde mit 20 ul eines Puffers für die Transkription (200 millimolar Tris-HCl (pH- Wert: 7,5), 30 millimolar MgCl&sub2; und 10 millimolar Spermidin), 10 ul 100 millimolar DTT, 5 ul (150 Einheiten) RNasin, 30 ul (15 ug) der vorstehend genannten Lösung der mit SmaI geschnittenen DNA, 10 ul (150 Einheiten) SP6-RNA-Polymerase und 25 ul Wasser (das mit Diethylpyrocarbonat behandelt worden war) gegeben, so daß man 100 ul des Gemisches erhielt.
  • Das Gemisch wurde 1 Stunde einer Reaktion bei 40ºC unterworfen. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit 3 ul (45 Einheiten) SP6-Polymerase gemischt und 2 Stunden umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde mit 15 ul (15 Einheiten) RQIDNase und 4 ul (120 Einheiten) RNasin gemischt und 15 Minuten in einer Reaktion bei 37ºC umgesetzt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch einmal mit 100 ul eines Phenol/Chloroform-Gemisches und 100 ul Chloroform und anschließend einmal mit 100 ul Ethylether extrahiert. Danach wurde das Gemisch ,zur Trockene eingeengt. Bei den verwendeten Mitteln handelte es sich um handelsübliche Chemikalien, die ein Reagenzsatz von Promega. Biotech. Company, mit der Ausnahme, daß [³H] UTP vom Amasham Japan Co., Ltd. bezogen wurde.
  • Der erhaltene Rückstand wurde in 200 ul Wasser, das mit NENSORB20 (Du Pont Co.) behandelt worden war, gelöst. 1 ml des 50%-igen Methanols als Eluat wurden unter verringertem Druck eingeengt. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde in 500 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 10 mikromolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5) und 0,25 millimolar EDTA gelöst. 5 ul der erhaltenen Lösung wurden mit einem Flüssigscintillationszähler (TRI-CARB 4640, Paccard Company) vermessen. Durch diese Untersuchung wurde bestätigt, daß die Probe 3 ug WS- S(+)-RNA enthielt. Außerdem wurde durch eine Analyse unter Verwendung der UV-Spektroskopie bei 260 nm festgestellt, daß die Probe etwa 9 ug DNA enthielt.
  • Die WS-S(+)-RNA-Lösung, die in diesem Beispiel erhalten wurde, wurde im nächsten Beispiel 19 verwendet.
    • Beispiel 19 Markierung von WS-S(+)RNA mit 3'-³²PCp WS-S(+)RNA 336 ng (11,2 pMol) 0,56 mikromolar [5'-³²P]PCp (Amasham Japan Co., Ltd.)
  • a
  • 3000 Ci/mMol 0,825 mikromolar
  • ATP 6 mikromolar
  • HEPES (pH-Wert: 8,3) 50 mikromolar
  • MgCl&sub2; 10 mikromolar
  • DTT 3,3 mikromolar
  • DMSO 10% (Vol./Vol.)
  • BSA 10 ug/ml
  • Glycerin 15% (Vol./Vol.)
  • RNA-Ligase (P.L. Pharmacia Company) bei 45ºC für 16 Stunden
  • Gesamtvolumen 20 ul
  • Eine Reaktion wurde unter den vorstehend angegebenen Bedingungen durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten auf 65ºC erwärmt und unmittelbar anschließend vor der Zugabe von RNA-Ligase und [5'-³²P)PCp mit Eis gekühlt.
  • Nach Abschluß der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit 20 ul einer Auftragungslösung mit einem Gehalt an 10% Harnstoff und 0,02% Xylolcyanol und 0,02% Bromphenol-Blau gemischt und anschließend einer Elektrophorese unterworfen, wobei das Reaktionsgemisch auf ein 8%iges Polyacrylamidgel mit einem Gehalt an 7 in Harnstoff (Länge: 50 cm; Dicke: 0,5 mm) aufgetragen und die Elektrophorese 2 Stunden bei 2000 V durchgeführt wurde. Nach dieser Operation wurde das Gel einer Autoradiographie unterworfen, so daß jeder Strang mit einer gegebenen Länge von einem anderen, um ein Segment kürzeren Strang getrennt wurde, und jeder Strang wurde aus dem Gel gemäß dem Maxam-Gilbert-Verfahren extrahiert. Das Extraktionsprodukt wurde mit NENSORBR (Du Pont Co.) entsalzt.
  • 0,725 pMol WS-S(+)RNA mit einer Länge des Strangs, die sich um einen Segment unterschied und die mit 3'-³²PCp markiert war, wurde zusammen mit der gleichen Menge der RNA mit einer Stranglänge, die um ein Segment kürzer war, erhalten (Gesamtmenge: 1,45 pMol; Ausbeute: 13%). Eine quantitative Analyse wurde auf der Grundlage der β-Strahlungsintensitätsmessung gemäß der Tscherenkow-Methode durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit H&sub2;O in einer Konzentration von 0,02 pMol/ul gemischt und bei einer niedrigen Temperatur von -80kaC gelani gert. Die mit ³²PCp markierte WS-S(+)RNA wurde in der nachstehenden Spaltungsreaktion eingesetzt.
    • Beispiel 20 RNA-Strangspaltungsreaktion (Fig. 10-1 und 10-2)
  • 3' -³²PCp-markierte WS-S (+)RNA 3,3 nanomolar
  • gemischtes Oligomer 83 nanomolar - 8,3 mikromolar
  • Tris-HCl (pH-Wert: 7,7) 40 mikromolar
  • MgCl&sub2; 4 mikromolar
  • BSA 0,003%
  • DTT 1 millimolar
  • Glycerin 4%
  • RNaseH (Takara Shuzo Co., Ltd.) 0,17 - 0,83 Einheiten/Öl
  • Gesamtmenge: 6 ul
  • Das in der vorstehenden Tabelle angegebene Gemisch wurde 2 Minuten auf 65ºC erwärmt und anelliert, bevor die RNaseH zugegeben wurde. Die Reaktion fand bei 30ºC statt. Sie wurde zu einem geeigneten Zeitpunkt durch Zugabe von 6 ul einer Auftragungslösung abgebrochen. Sodann wurde eine Elektrophorese mit dem Gemisch (2 ul) unter Verwendung eines 8%igen Polyacrylamidgels mit einem Gehalt an 7 m Harnstoff (Dicke: 0,2 mm; Länge: 35 cm; 2000 V; 2 Stunden) durchgeführt.
  • Eine andere Reaktion wurde 2 Stunden unter Verwendung von 8,3 mikromolar des gemischten Oligomers (diese Menge entsprach dem 2500fachen der Menge an RNA) und 0,17 Einheiten/Öl RNaseH durchgeführt. Danach wurde eine Autoradiographie mit Hilfe von 8% PAGE durchgeführt. Das Ergebnis dieser Arbeit ist in Fig. 10-1 gezeigt.
  • In Spur 8 trat eine Spaltung zwischen dem 43. G und dem 44. A in der Schleife auf. In Spur 10 trat vorzugsweise eine Spaltung zwischen G²¹ und G²² im Stamm auf. In Spur 11 trat eine Spaltung in beiden Positionen auf. Im DNA-44-Mer von Spur 2 war es unmöglich, den Strang spezifisch zu spalten. Beim komplementären DNA-6-Mer von Spur 3 trat keine Spaltung auf.
  • Fig. 10-2 zeigt die Ergebnisse einer entsprechenden Reaktion, mit der Ausnahme, daß die Menge des Enzyms 0,83 Einheiten/Öl betrug. In diesem Fall trat die Spaltung in den Spuren 6 und 7 aufgrund der Erhöhung der Menge des eingesetzten Enzyms auf.
  • Bei dem in Fig. 10-1 gezeigten Versuch wurde die Elektrophorese ohne Erwärmen durchgeführt, während bei dem in Fig. 10-2 gezeigten Versuch die Elektrophorese unter Erwärmen durchgeführt wurde. In den Spuren 9, 10 und 11 ist zu beobachten, daß eine Veränderung der Mobilität aufgrund der Strukturänderung der RNA, die durch das gemischte Oligomer beeinflußt wurde, auftrat.
    • Beispiel 21 In Fig. 11 gezeigter Versuch
  • Ein Versuch wurde unter praktisch den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 20 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Menge des gemischten Oligomers um einen Faktor von 0,1 oder 0,01 verringert wurde (die verringerte Menge entsprach dem 25fachen bzw. dem 250fachen der Menge an RNA) und daß die Menge an eingesetzter RNaseH 0,42 Einheiten/ul betrug. Das Ergebnis des Versuchs ist in Fig. 11 gezeigt.
  • In den Spuren 5, 6 und 7 sowie den Spuren 11, 12 und 13 ist zu beobachten, daß, wenn die gemischten Oligomere (XXIV und XVIII) verwendet wurden, eine Spaltung auftrat und das Ausgangsmaterial verschwand, selbst wenn die verwendete Menge dem 25fachen der Menge an RNA entsprach. Die Spaltungen traten also zwischen G²¹ und G²² und zwischen G²² und G²³ auf. Wenn andererseits das gemischte Oligomer (XXI) verwendet wurde, dann trat die Spaltung in geringem Ausmaß zwischen G²¹ und G²² auf, sofern die eingesetzte Menge dem 2500fachen der Menge an RNA entsprach.
    • Beispiel 22 Herstellung eines RNA-Stranglängenmarkers
  • In diesem Versuch wurden eine 3'-³²PCp-markierte WS-S(+)RNA mit 30 000 bis 60 000 cpm, ein "Expanded RNA sequencing Kit" Pharmacia Company) und eine RNaseT&sub1; (Sankyo Co., Ltd.) verwendet. Die Reaktionen wurden auf herkömmliche Weise durchgeführt. 2 ul der Reaktionslösungen wurden einer Elektrophorese unterworfen.
  • Bei der alkalischen Hydrolyse wurden 1 ul WS-S(+)RNA, die mit ³²P am 3'-Terminus markiert war, und 1 ul Träger-tRNA (2 ug/ul) mit 1 ul einer CO&sub3;/HCO&sub3;-Lösung gemischt, und die erhaltene Lösung wurde 6 Minuten auf 90ºC erwärmt und anschließend auf Eis gekühlt. Das Gemisch wurde anschließend mit 3 ul einer Harnstoff-Farbstoff-Lösung mit einem Gehalt an 5 millimolar Tris-HCl, 5 millimolar Borsäure, 1 millimolar EDTA, 0,01% Xylolcyanol FF, 0,01% Bromphenol-Blau und 10 in Harnstoff gemischt. Ein Anteil (2 ul) des erhaltenen Gemisches wurde einer Elektrophorese unterworfen.
  • Bei dem RNaseT&sub1;-Verdau wurde 1 ul WS-S(+)RNA, die mit ³²P am 3'-Terminus markiert war (etwa 50 000 cpm), mit 3 ul einer Pufferlösung (die 33 millimolar Natriumcitrat (pH-Wert: 5,0), 1,7 millimolar EDTA, 0,04% Xylolcyanol FF, 0,08% Bromphenol-Blau, 1 ug/ml Träger-tRNA und 7 m Harnstoff enthielt), 1 ul destilliertem Wasser und 1 ul RNaseT&sub1; (0,01 Einheiten/ul; Sankyo Company) gemischt. Die Reaktion wurde 12 Minuten bei 55ºC durchgeführt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf Eis gekühlt, und ein Anteil (2 ul) des Gemisches wurde einer Elektrophorese unterworfen.
  • Beim RNaseU&sub2;-Verdau wurde 1 ul WS-S(+)RNA, die mit ³²P am 3'- Terminus markiert war (etwa 50 000 cpm), mit 3 ul einer Pufferlösung (33 millimolar Natriumcitrat (pH-Wert: 3,5), 1,7 millimolar EDTA, 0,04% Xylolcyanol FF, 0,08% Bromphenol- Blau, 1 mg/ml Träger-tRNA und 7 in Harnstoff), 1 ul destilliertem Wasser und 1 ul RNaseU&sub2; (2 Einheiten/ul, Pharmacia Company) gemischt. Die Reaktion wurde 12 Minuten bei 55ºC durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf Eis gekühlt, und ein Anteil (2 ul) des Gemisches wurde einer Elektrophorese unterworfen.
    • Beispiel 23 Analyse der 5'-terminalen Base des mit RNase gespaltenen Produkts (d. h. des Produkts, bei dem 5'CmUmCGAAAGmUm3' (XXIV) verwendet wurde)
  • 0,02 pMol (etwa 200 cpm, gemessen nach der Tscherenkow-Methode) WS-S(+)RNA, die mit ³²PCp am 3'-Terminus markiert war, wurde mit Hilfe von 5'CmUmCGAAAGmUm3' und RNaseH gespalten. 6 ul der Reaktionslösung dieser Spaltungsreaktion wurden mit 200 ul einer Lösung A (die 0,1 m Tris-HCl, 10 millimolar Triethylamin und 1 millimolar EDTA enthielt (pH-Wert: 7,7)) gemischt, und das auf diese Weise gebildete Gemisch wurde in eine Patrone zur Reinigung von Nucleinsäuren gegeben (NENSORBR 20, Du Pont Company). Die Probe wurde mit 3 ml von Lösung A und anschließend mit 1 ml destilliertem Wasser gewaschen und mit 500 ul 50%igem wäßrigem Methanol eluiert. Der Eluent wurde unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt.
  • Der Eluent wurde verwendet, um eine Austauschreaktion des 5'- terminalen Phosphats durch ³²P mit einer hohen spezifischen Aktivität gemäß einem bekannten Verfahren, das in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 252 (1977), S. 3176-3184, beschrieben ist, durchzuführen. Bei dieser Reaktion wurde das ausströmende Medium mit 1 ul 0,5 m Imidazol-Salzsäure-Pufferlösung, 1 ul 0,1 m Magnesiumchlorid, 1 ul 1 millimolar Spermidin, 1 ul 1 millimolar EDTA, 1 ul 50 millimolar Dithiothreit, 2 ul destilliertem Wasser und 1 ul 3 millimolar ADP gemischt, und das auf diese Weise gebildete Gemisch wurde 2 Minuten auf 65ºC erwärmt und anschließend unmittelbar auf Eis gekühlt.
  • Das Gemisch wurde in ein Gefäß gegeben, das bereits [gamma-³²P] ATP (20 pMol, 100 uCi, Amasham Japan Co., Ltd.) enthielt, das zur Trockene eingeengt worden war. 1 ul T4-Polynucleotidkinase (7 Einheiten/ul, Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu dem Gemisch gegeben, und eine Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurde die Reaktionslösung mit 10 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 10 m Harnstoff, 0,02% Xylolcyanol und 0,02% Bromphenol-Blau gemischt. Die gesamte Menge des Gemisches wurde einer Elektrophorese (2000 V, 2 Stunden) unter Verwendung eines 8%-igen Acrylamidgels mit einem Gehalt an 7 m Harnstoff (Dicke: 0,2 mm; Länge: 35 cm) unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde eine Autoradiographie durchgeführt, um eine Bande des Strangs mit einer Länge von etwa 48 Nucleotiden abzutrennen. Anschließend wurde die Probe fein zerkleinert und mit 300 ul einer Lösung mit einem Gehalt an 0,5 m Ammoniumacetat und 0,1 millimolar EDTA gemischt, und das erhaltene Gemisch wurde 1 Tag bei Raumtemperatur belassen. Das Gel wurde durch Zentrifugation abgetrennt, und das Filtrat wurde unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt. Die auf diese Weise erhaltene 48. Strangfraktion wurde mit 200 ul einer Lösung A (die 0,1 m Tris-HCl, 10 millimolar Triethylamin und 1 millimolar EDTA enthielt, pH-Wert: 7,7) und anschließend mit 4 ug einer Träger-tRNA gemischt.
  • Das erhaltene Gemisch wurde anschließend in eine Patrone zur Nucleinsäurereinigung (NENSORB® 20, Du Pont Company) gegeben, mit 3 ml der Lösung A und anschließend mit 1 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Elution wurde mit Hilfe von 500 ul 50%igem wäßrigem Methanol durchgeführt. Das ausströmende Medium (800 cpm, bestimmt gemäß der Tscherenkow-Methode) wurde unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt und mit 8 ul destilliertem Wasser, 1 ul 0,4 m Ammoniumacetat (pH-Wert: 5,0) und Nuclease P1 (0,1 ug/1 ul, Yamasa Shoyu Co., Ltd.) gemischt. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37ºC durchgeführt.
  • Die Reaktionslösung wurde auf ein Filterpapier Nr. 51 (40 cm) aufgetragen, und eine Papierelektrophorese wurde in Gegenwart von 0,2 in Morpholinacetat-Pufferlösung (pH-Wert: 3,5) bei 900 V und 3,5 mA für 90 Minuten durchgeführt. Bei den Proben handelte es sich um 5'CMP, 5'AMP, 5'GMP, 5'UMP und 3'-terminal ³²PCp-markierte Hefe-5SRNA-Verdauprodukte durch Nuclease P1, die unter den gleichen Bedingungen erhalten worden waren.
  • Nach der Elektrophorese wurde eine Autoradiographie durchgeführt. Bei dieser Untersuchung wurde in der Probe 5'AMP gefunden, wie es in Fig. 12-A gezeigt ist. Aus den vorstehenden Angaben kann gesagt werden, daß die Spaltung zwischen dem 43. G und dem 44. A stattfand.
  • Ferner wurden die durch Einsatz der Verbindungen (XVII) und (XVIII) hergestellten Spaltungsprodukte auf ähnliche Weise untersucht. Jede der ³²PCp-markierten WS-S(+)RNAs wurde nämlich in einer Menge von etwa 0,02 pMol (etwa 1000 cpm, bestimmt gemäß der Tscherenkow-Methode) für die Analyse der 5'- terminalen Gruppe eingesetzt. Die gespaltenen Produkte, die 5'-terminales Phosphat ausgetauscht gegen ³²P mit einer hohen spezifischen Aktivität enthielten, wurden in Mengen von etwa 3300 cpm (das gespaltene Produkt der Verbindung (XVII)) und 4800 cpm (das gespaltene Produkt der Verbindung (XVIII)) isoliert. Diese wurden vollständig mit Nuclease P1 verdaut und anschließend einer sauren Papierelektrophorese und danach einer Autoradiographie unterworfen. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Fig. 12-B gezeigt. In jedem Fall war der 5'-Terminus G. Unter Berücksichtigung des Stranglängenmarkers (Fig. 10-2) kann geschlossen werden, daß die Spaltung zwischen C²&sup0; G²¹ von (XVIII) und zwischen G²¹ G²² von (XVIII) stattfand.
    • Wirkungen und Vorteile der Erfindung
  • Wie in den vorstehenden Abschnitten erläutert wurde, ist es erfindungsgemäß möglich, bevorzugt eine spezifische Position in einem RNA-Molekül unabhängig von der Stranglänge des Moleküls zu spalten. Daher nimmt man an, daß, wenn die Erfindung angewandt wird, verschiedene Untersuchungen über die Struktur und Funktion von verschiedenen Arten von RNA-Molekülen einfacher durchgeführt werden können. Ferner ist zu erwarten, daß die Erfindung z. B. bei der Massenproduktion nützlicher Proteine eingesetzt werden kann.
  • Es ist darauf hinzuweisen, daß (1) E. coli JM 103, (2) der Vektor M13AJ-1 und (3) E. coli HB101, auf die vorstehend Bezug genommen wurde, der Öffentlichkeit zugänglich sind. Tabelle 1
  • 1% Divinylbenzol-Styrol-Harz in Kombination mit Spacer Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung)
  • kombiniertes langkettiges Alkylamino-Glas mit kontrollierten Poren durch Spacer Tabelle 2 Ein Zyklus der Kettenverlängerungsreaktion Schritt Beschreibung Volumen · Zahl der Schritte Zeit Dichlormethan-Methanol (7 : 3) (Waschen) Benzolsulfonsäure/Dichlormethan-Methanol (7 : 3) Dichlormethan-Methanol (7 : 3) (Waschen) 2% Benzolsulfonsäure/Dichlormethan-Methanol (7 : 3) Dichlormethan-Methanol (7 : 3) (Waschen) Pyridin (Waschen) Pyridin (gemeinsames Verdampfen) 2'-O-Methylnucleotid/Pyridin gemeinsames Verdampfen Mesitylensulfonyl-3-nitrotriazolid/Pyridin (Kuppeln) Pyridin (Waschen 0,1 m Dimethylaminopyridin/Pyridin Essigsäureanhydrid Pyridin (Waschen) Tabelle 3
  • linearisiert an der SmaI-Stelle Run-off-Transkripton Tabelle 4
  • gezeigt als durchgezogene Linie
  • Nucleotidsequenzen von gemischten, zu WS-S(+)RNA komplementären Oligomeren und die Struktur von WS-S(+)RNA Tabelle 5
  • nicht geschnitten
  • Der Pfeil zeigt die Schnittstelle
  • gezeigt als durchgezogene Linie
  • Die Schnittstellen unter Verwendung der einzelnen gemischten Oligomere Tabelle 6 Ein Zyklus der Kettenverlängerungsreaktion (unter Verwendung von 0,2 mikromolar CPG-Harz) Beschreibung Zeit (sec), Zahl der Schritte Methoxy-phosphoramidit β-Cyanoethyl-phosphoramidit (Waschen) (Trocknen) Phosphoramidit/Tetrazol/CH&sub3;CN Tabelle 7 Entfernen der Schutzgruppen und Abspalten von CPG-Harz (unter Verwendung von 0,2 mikromoler CPG-Harz) Beschreibung Zeit (sec), Zahl der Schritte Methoxy-phosphoramidit β-Cyanoethyl-phosphoramidit (Trocknen) (Warten) (Die Lösung, mit der das CPG-Harz behandelt worden war, wurde nach diesem Schritt in ein Fläschen gefüllt)

Claims (2)

1. Nucleosidderivat der allgemeinen Formel
worin X einen Monomethoxy-trityl- oder Dimethoxy-trityl-Rest bedeutet, Y für -P(OCH&sub3;)-N-(CH(CH&sub3;)&sub2;)&sub2;, -P(OCH&sub2;CH&sub2;CN)-N- (CH(CH&sub3;)&sub2;)&sub2;) oder -CO(CH2)m-CO-NH-(CH&sub2;)n -(CPG-Derivat) steht, in und n jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind und R einen Rest einer der folgenden Formeln darstellt:
2. Verbindung mit einem Doppelstrang, die aus einer RNA (+Strang) und einer komplementären DNA (-Strang) besteht, wobei ein Teil der DNA (-Strang) durch ein Oligomer ersetzt ist, das von Nucleosidderivaten gemäß Anspruch 1 abgeleitet ist, und wobei dann, wenn die Verbindung der Einwirkung eines Enzyms mit Ribonuclease H-Aktivität unterworfen wird, es ermöglicht wird, die RNA (+Strang) bevorzugt an einer Stelle zu spalten, die dem nicht ersetzten Anteil der DNA (-Strang) entspricht.
DE3788914T 1986-09-08 1987-08-27 Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere. Expired - Lifetime DE3788914T2 (de)

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