DE69632456T2

DE69632456T2 - Nukleinsäuresynthese unter verwendung von mittels licht abspaltbaren schutzgruppen

Info

Publication number: DE69632456T2
Application number: DE69632456T
Authority: DE
Inventors: Dr. Michael C. PIRRUNG; W. Steven SHUEY; Jean-Claude Bradley
Original assignee: University of Durham; Duke University
Current assignee: University of Durham; Duke University
Priority date: 1995-03-16
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2016-03-16
Also published as: CA2215657A1; ATE266671T1; EP0815114B1; DE69632456D1; US5908926A; JPH11501936A; EP0815114A1; DK0815114T3; AU5422896A; WO1996028457A1; EP0815114A4

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf ein Verfahren zur Synthese einer Nucleinsäure und insbesondere auf ein Verfahren zum Bewirken einer 5' zu 3'-Synthese einer Nucleinsäure. Das Verfahren kann benutzt werden, um Anordnungen von Oligomeren, die an einen Träger über ihr 5'-Ende gebunden sind, herzustellen. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Mutationsanalyse, das solche Anordnungen benutzt. Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf Verbindungen und Zusammensetzungen, die für einen Gebrauch bei solchen Verfahren geeignet sind.
HINTERGRUND
Auf Grund der Fortschritte auf dem Gebiet der DNA-Technologie in den 80iger Jahren des 20. Jahrhundert, ist es jetzt möglich, das menschliche Genom zu kartographieren, alle darin enthaltenen Gene zu identifizieren und ihre Funktionen zu untersuchen. Sobald alle diese Gene bekannt sind, ist es möglich, zu untersuchen, wie sie zusammenwirken, was zu enormen Fortschritten für das Verständnis von Krankheiten führen wird. Man kann erwarten, dass sich die Medizin in der Tat im nächsten Jahrhundert in zunehmendem Maße auf die DNA konzentrieren wird. Die Fähigkeit, zu synthetisieren, Sequenzen zu bilden und die Bedeutung die DNA zu verstehen wird ein wesentliches Werkzeug in klinischen Laboratorien, der Arzneimittelindustrie und den Forschungslabors darstellen.
Die Entwicklung detaillierter genetischer Karten von jedem der 24 Chromosomen wird dabei helfen, spezifische Krankheitsgene zu verfolgen. Physische Karten des Genoms sind ein wesentlicher intermediärer Schritt zum Erhalten des Gens. Bibliotheken sich überlappender klonierter DAN, für die jedes Gen im Chromosom bekannt ist, stellen geeignete physische Karten dar. Wenn die Gene für einzelne Klone lokalisiert worden sind, können sie sequenziert werden. Da Wildtypsequenzen zur Verfügung stehen werden, kann diese Basisinformation bei der präsymptomatischen Diagnose von genetisch basierten Krankheiten benutzt werden.
Der Schlüssel für den Erfolg bei dem oben beschriebenen Verfahren ist die Zurverfügungstellung schneller, genauer und einfacher DNA-Sequenzierungstechniken. Eines der am meisten begrüßten, laufend vorgeschlagenen Verfahren für die DNA-Analyse ist ein Microchip, der für die Sequenzierung durch Hybridisierung benutzt werden kann (SBH) (Bains et al., J. Theor. Biol. 135: 303 (1988; Drmanac et al., Genomics 4: 414 (1989; Krapko et al. FEBS Lett. 256: 118 (1989)). Theoretisch erlaubt es ein Chip, der einen kompletten Satz von n-mer-Oligonucleotiden trägt, die Sequenzierung von DNA durch Duplexbildung mit seinen Watson-Crick-Komplementen in einer Ziel-DNA durchzuführen, wobei die einzigen Begrenzungen die Wiederholungen derselben Sequenzen und Passagen identischer Basen sind, die länger als n sind.
In der Theorie kann die SBH-Methode entweder mit den immobilisierten Sonden und dem Ziel in Lösung (reverser Blot) oder umgekehrt angewendet werden. In der Tat sind anfänglich beide Experimente benutzt worden, um diese Technologie zu demonstrieren. Eine Lichtsynthese (USP 5,143, 854; WO-A-92110092; Fodor et al., Science 251/767 (1991)), welche es erlaubt, parallel an tausenden von Orten die Chemie der durchzuführenden DNA-Synthese durchzuführen, erfordert eine Immobilisierung der Probe. Die Anzahl der präparierten Sequenzen, die diese Technologie benutzen, überschreitet bei weitem die Anzahl der geforderten chemischen Reaktionen. In der Tat ist für die Licht-DNA-Synthese von Oligomeren der Länge "1" die Anzahl der präparierten Sequenzen 41, aber die Anzahl der erforderlichen Schritte ist nur 4 × 1.
Kürzlich haben Pease et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5022 (1994)) die Ergebnisse anfänglicher Bemühungen bei der Herstellung von DNA-Chips durch eine Lichtsynthese dargelegt und sie für Pseudo-Sequenzierungsversuche benutzt. Unter Benutzung der Phosphoramidit-Chemie, die durch den Einschluss der durch Licht entfernbaren MeNPOC-Gruppe modifiziert worden war, haben Pease und seine Kollegen Anordnungen von 256 Oktameren hergestellt (4 gemischte Nucleotidpositionen, flanklert von zwei CG-Klammern). Sie haben gefunden, dass die fluoreszenz-markierte Ziel-DNA sich selektiv an ihre Komplemente in der Anordnung bindet. Einige einbasige Fehlbindungen zeigen jedoch 20% des Fluoreszenzhybridisierungssignals des vollständigen Komplements. Das ergibt sich aus der Tatsache, dass die Hybridisierung von den genauen Sequenzen der Proben, den Hybridisierungsbedingungen und dem Ort der Fehltreffer abhängt (Ausfransen am 5'-Ende ist üblich bei einer Fehlhybridisierung (Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1585 (1985)). Während eine Fehlhybridisierung für Ziele, die nur ein Komplement in der Anordnung haben, kontrollierbar ist, so könnte es die Interpretierung von hunderten von Hybridisierungspunkten, die bei kompletten Oktamer- oder Dekamer-Anordnungen und Kb DNA-Zielen erzeugt werden, sehr schwierig machen.
Ein zweites neues Verfahren für eine Sequenzierung mit hoher Durchsatzleistung ergab sich auf der Basis des reversiblen Endes des Primeransatzes. Entsprechend diesem Verfahren wird eine DNA-Polymerase-Reaktion mit einem Primer, Template und vier Terminatoren durchgeführt, die herkömmliche Deoxynucleotide mit einer blockierenden Gruppe am 3'-Ende sind. Es sind keine dNTPs enthalten. Auf der Basis der Template/Primer-Sequenzen und der Genauigkeit der Polymerase wird nur ein blockiertes Deoxynucleotid eingebaut. Die Identität der eingebauten Terminatoren kann bestimmt werden, indem sie mit verschiedenartig gefärbten Fluorophoren markiert werden. Die blockierende Gruppe wird entfernt (unter Bedingungen, die die DNA nicht beschädigen), um ein freies 3'-Ende für einen anderen Polymerase-Zyklus zu erhalten. Eine vernünftige Strategie ist der Einbau der basenspezifischen Farbe in die blockierende Gruppe.
Das Verfahren weist eine Anzahl von experimentellen Fallen auf, wobei die wichtigste die Umkehrbarkeit der DNA-Polymerisierung bei Enzymanwesenheit ist. Das bezieht sich nicht auf die 5' zu 3' Exonuklease-Aktivität, die aus vielen kommerziellen Polymerase-Präparierungen technisch entfernt worden ist, sondern vielmehr auf die natürliche Umkehrbarkeit von chemischen Reaktionen. Bei normalen Primeransatz-Bedingungen ist diese Umkehrung unsichtbar, da es die Anwesenheit von dNTP den degradierten Strängen erlaubt, sich wieder zu bilden. Selbst wenn es nur wenig Umkehrungen in einem Zyklus gibt, so wird die Anhäufung solcher Irrtümer doch bedeutsam bei den hunderten oder tausenden von Zyklen, die erforderlich sind, um ein Template mit einer signifikanten Länge zu erhalten.
J. Chem. Soc. Chem. Commun. 495–7 (1995) offenbart eine 5' zu 3'-Synthese von Oligonucleotiden auf einem festen Träger auf der Basis der Phosporamidit-Methode. Die entsprechende Phosphonat-Methode wird näher in Gazz. Chim. Ital. 116, 643 (1986) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung liefert einen neuen Ansatz für eine photochemische Synthese von Nucleinsäuren und für die Herstellung von Anordnungen hoher Qualität von Oligomeren, die eine schnelle Analyse von Genen ermöglicht, wobei die mit eingeschlossen sind, bei denen Mutationen Krankheiten erzeugen. Diese Erfindung liefert also neue photochemisch entfernbare Schutzgruppen, die für den gegenwärtigen Ansatz für die Nucleinsäuresynthese benutzt werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einer Ausgestaltung auf ein Verfahren zur 5' zu 3'-Synthese einer Nucleinsäure.
Das Verfahren umfasst:

i) Anbringen an einem Träger eines Nucleotids, umfassend eine durch Licht entfernbare 3'-Hydroxyl-Schutzgruppe, wobei die Anbringung über das 5'-Hydroxyl des Nucleosids erfolgt;
ii) Bestrahlen des aus Schritt (i) resultierenden, trägergebundenen Nucleosids, so dass die Schutzgruppe entfernt wird und die 3'-Hydroxylgruppe dadurch freigesetzt wird; und
iii) Kontaktieren des aus Schritt (iii) resultierenden, trägergebundenen Nucleosids mit einem Nucleotid, umfassend ein 5'-Phosphoramidit, unter solchen Bedingungen, dass das 5'-Phosporamidit mit einem freien 3'-Hydroxyl reagiert, so dass ein Dinucleotid gebildet wird.

In einer anderen Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur 5' zu 3'-Synthese, das folgende Schritte umfasst:

i) Anbringen eines ersten Nucleotids an einem Träger über das 5'-Hydroxyl des Nucleotids, wobei das Nucleotid einen 3'-Phosphotriester umfasst, wobei einer der Ester der 3'-Phosphotriester eine durch Licht entfernbare Gruppe ist;
ii) Bestrahlen des aus Schritt (i) resultierenden, trägergebundenen Nucleotids, so dass die durch Licht entfernbare Gruppe entfernt wird und dadurch ein 3'-Phosphodiester gebildet wird;
iii) Kontaktieren des aus Schritt (ii) resultierenden, trägergebundenen Nucleotids mit einem zweiten Nucleotid, umfassend eine 5'-Hydroxylgruppe, welche mit dem 3'-Phosphodiester des aus Schritt (ii) resultierenden, trägergebundenen Nucleotids resultiert, so dass ein Dinucleotid gebildet wird.

In noch einer anderen Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Verbindung mit folgender Formel:
worin B eine stickstoffhaltige aromatische heterozyklische Gruppe ist;
X: H, OH oder ein geschütztes OH ist;
Y ein Benzoinylcarbonat ist; und
Z ein Phosphoramidit ist.
In noch einer anderen Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Phosphodiester- oder Phosphotriester, umfassend eine O-Phosphorylaryloxybenzoinylgruppe an der 3'-Position und eine-OH-Gruppe an der 5'-Position.
In noch einer anderen Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Anordnung, umfassend ein Substrat und eine Vielzahl von Nucleotiden oder Nucleosiden, daran angebracht über eine 5'-Hydroxylgruppe der Nucleoside oder Nucleotide.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bewirken einer 5' zu 3'-Synthese einer Nucleinsäure, z. B. einer Nucleinsäure, die auf einem festen Träger angebracht ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Anordnungen von Nucleinsäureoligomeren. Die Oligomere sind auf dem Substrat (Träger) der Anordnung mit ihren 5'-Enden angebracht, wobei ihre 3'-Hydroxylgruppen für eine Reaktion, einschliesslich einer enzymatischen Reaktion, (d. h. Bindung und Polymerisierung) präsentiert werden. Vorzugsweise wird diese Orientierung technisch realisiert, indem Monomernucleotide hergestellt werden, die ein Phosphoramidit auf dem 5'-Sauerstoff, und auf dem 3'-Sauerstoff, ein Dimethyloxynitryl (DMTr), Benzoinylcarbonat (d. h. ein Dimethylbenzoin(DMB)-Carbonat), MeNPOC, Nitrobenzylcarbonat oder eine Styrysilgruppe wie sie in der Anmeldung N° 08/339,216 (siehe auch J. Org. Chem. 58: 6961 (1993)) beschrieben worden ist, tragen. Alternativ kann ein synthetischer umgekehrter (5' zu 3') Phosphotriester-Ansatz benutzt werden, wobei die Monomere z. B. 3'-O-Phosphorylaryloxybenzoinyl- oder Aryloxynitrobenzoinyl-nucleoside oder ein 3'-Phosphorylcyanoethoxybenzoinylnucleosid sind. Anordnungen der Erfindung haben eine Vielzahl von Anwendungen, einschliesslich der Entdeckung von Mutationen bei Nucleinsäurezielproben.
Die Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger erfordert folgendes: chemische Bedingungen bei denen die wachsende Kette an den Träger gebunden wird; chemische Bedingungen zum Bewirken von Bindungen zwischen den Nucleotiden (Bindung zwischen Nucleotiden), einschließlich der Bildung von Verbindungen, und chemische Bedingungen zum Schutz der funktionellen Gruppen an den heterozylischen Basen. Während diese chemischen Bedingungen in diesem Text unter Bezugnahme auf eine DNA-Synthese beschrieben werden, so können die benutzten Ansätze auch für eine RNS-Synthese benutzt werden unter Hinzufügung einer Schutzgruppe für das 2'-Hydroxyl der Ribose (Narang, "Synthese und Anwendung von DNA und RNS" Kapitel 5, Academic Press, New York (1987)). Da Oligo-Anordnungen direkt benutzt werden, ist es wichtig, dass die Oligomere so rein wie möglich sind. Ein Fachmann wird verstehen, dass dafür genaue quantitative Mengen bei jedem Schutzgruppenabspaltungs- und Kupplungs-Schritt erforderlich sind.
Die für das Bewirken der 5' zu 3' Synthese der Phosporamiditnucleinsäure der Erfindung bevorzugten Monomeren zerfallen in drei Klassen:

a) eine zur Initialisierung der Synthese
3'-DMB-Carbonat
b) eine zur Vergrößerung der wachsenden Nucleinsäurekette
3'-DMB-Carbonat-5'-Phosphoramidat
c) eine zur Beendigung des Kettenwachstums
3'-Allylcarbonat

"Base" in den vorhergehenden Strukturen bezieht sich auf jede beliebige der aromatischen heterozyklischen Stickstoff-Substanzen in den Nucleinsäuren, d. h. Adenin, Guanin, Thymin, Cytidin, Inosin, Uracil, usw. Die Aminogruppen werden, wenn sie auf den Basen vorliegen, durch Gruppen geschützt, die ohne Beschädigung des DNA-Gerüsts oder der Anbringung auf dem Träger entfernt werden können. Geeignete Schutzgruppen umfassen Isobutyryl, Acetyl, Phenoxyacetyl oder bevorzugt Allyloxycarbonyl (AOC) (AOC wird leicht durch eine katalytische Menge eines Palladiumkomplexes und eine Vielzahl von Nucleophilen einschließlich Butylammoniumformiat oder Dimedon entfernt (Tsuji et al., Acc. Chem. Res. 20: 140 (1987)). Der Zucker an den die Basen in den obigen Formeln gebunden ist, kann Ribose, Deoxyribose, oder Modifikationen, z. B. 2'O-Alkylribose oder 2'Haloribose, z. B. 2'-Fluoribose sein, "X" in den obigen Strukturen (b) und (c) ist R₂N, wobei die R, die gleich oder verschieden sein können, Alkyl oder Aryl, bevorzugt C₁-C₄-Alkyl (z. B. Isopropyl) oder Phenyl sind. "Z" in den Strukturen (b) und (c) ist O-Allyl, O-Cyanoethyl oder O-Chlorophenyl. "Allyl" in der Struktur (c) ist
worin
R₁ = H, Alkyl (z. B. C₁-C₄ Alkyl) oder Aryl (z. B. Phenyl);
R₂ = H;
R₃ = H, Halogen, Alkyl (z. B. C₁-C₄ Alkyl) oder Aryl (z. B. Phenyl);
R₄ = H;
R₅ = H, Halogen, Alkyl (z. B. C₁-C₄ Alkyl) oder Aryl (z. B. Phenyl) sind. Bevorzugt sind R₁–R₅ Wasserstoff.
Ein Ansatz für die Herstellung der obigen Monomere von AOC-geschützten Basen wird im Folgenden gegeben:
worin TCA Trichloressigsäure, TPDPS Tert-Butyldiphenylsilyl, RMTr Dimethoxytrityl und AOC-Cl CH₂CHCH₂OCOCl ist.
Die Synthese (5' zu 3') kann unter Benutzung der obigen geschützten Spezies (a), (b) und (c) folgendermassen ausgeführt werden. Ein 3'-DMB-Carbonat ((a) oben) wird über einen geeigneten Linker an dem Träger angebracht. Der Träger wird dann mit einer Wellenlänge über 300 nm bestrahlt, um 3'-Hydroxyl vom trägergebundenen Nucleosid zu befreien. Ein zweites Nucleotid wird als 3'-DMB-Carbonat-5'-Phosporamidit ((b) oben) hinzugefügt und es wird eine mit Hilfe von Tetrazol vermittelte Kupplung hergestellt. Der sich ergebende Phosphotriester wird in Phosphat oxidiert (z. B. unter Benutzung von t-Butylhydroperoxid oder I₂/H₂O/Pyridin). Nicht gebundene 3' Enden werden z. B. unter Benutzung von Essigsäureanhydrid/Pyridin gekappt. Eine weitere Bestrahlung hat das Erscheinen eines neuen 3' Endes für die nächste Kupplung zur Folge. Der Bestrahlungs-, Kupplungs-, Kappungs- und Oxydationsprozess wird wiederholt, um die vorletzte Sequenz zu erhalten. Dann wird das letzte Nucleotid hinzugefügt, z. B. 3'-Allylcarbonat. Die Basis und die Phosphat-Schutzgruppen zwischen den Nucleotiden können gleichzeitig mit dem 3'-Allylcarbonat z. B, durch Behandlung mit einem Palladiumkatalysator und Butylammoniumformiat entfernt werden (Hajakawa et al. J. Am. Chem. Soc. 112 1691–1696 (1990)).
Wenn die Phosphotriester-Chemie benutzt wird, um die 5' zu 3'-Synthese einer Nucleinsäure auszuführen, werden die Monomere durch 3'-Phosphotrieser geschützt, von denen einer durch Licht entfernbar ist. Bevorzugte, durch Licht entfernbare Schutzgruppen für Phosphate sind Aryloxybenzoinylgruppen, vorteilhafterweise Dialkoxybenzoinylgruppen (z. B. 3', 5' oder 2',3-Dimethoxybenzoinylgruppen) oder eine Methylnitropiperonylgruppe. Wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, kann der 3'-Phosphotrieser aus den 5'-O-DMT-basisgeschützten Nucleosiden hergestellt werden. Für die Synthese können die Schutzgruppen an der 5'-Position aus den aus dem Stand der Technik bekannten Schutzgruppen einschließlich TBDPS oder DMTr gewählt werden.
Beispielhaft kann die Synthese von zwei Dinucleotiden (5'-G-T-3' und T-T) folgendermassen beschrieben werden. 5'-tert-Butyldiphenylsilyl-N'-allyloxycarbonyl-O⁶-allyldeoxyguanin-3'-cyanoethyl (Dimethoxybenzoin)-phosphat (300 mg, 0,295 mmol) werden in 100 ml Benzol/1 ml Pyridin gelöst. Die Lösung wird durch Durchblasen von Ar entgast und während 30 Minuten in einem Rayonetreaktor mit einer 350 nm-Lampe bestrahlt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand mit 90 : 9 : 1 CH₂Cl₂ : EtOH : Et₃N auf einer mit Triethylamin behandelten Siliziumsäule chromatographiert, um ein Produkt mit einem großen Et₃N·HCl-Anteil zu erhalten, das durch Ausfällung aus Ethylacetat entfernt wird. Es wird eine einzige saubere Phosporlinie bei ³¹P NMR beobachtet und dieses Material für den nächsten Schritt benutzt. Dieses dG-Salz, Deoxythymidin-3'-cyanoethyl(dimethoxybenzoin)phosphat (0.278 g 0,443 mmol) und 4-Ethoxypyridin-N-oxyd (0,205 g 1,48 mmol) werden dreimal aus Pyridin azeotrop destilliert und in 12 ml Dichloroethan aufgenommen. Es wird (Triisopropyl)benzolsulfonylchlorid (0,183 g 1,48 mmol) hinzugefügt und die Mischung unter Ar über Nacht gerührt. TLC zeigt drei Flecken: das 5'-Sulfonat des T-Monomers, das gewünschte Produkt und den Überschuss an dT-Monomer. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand mit 95 : 5 CH₂Cl₂ : EtOH auf Siliziumgel chromatographiert, um das Produkt (5'-G-T-3', 305 mg, 75%) als weissen Schaum zu erhalten, der Spektren und HMRS (FAB) zeigt, die mit der strukturellen Zuordnung übereinstimmen. Die vorhergehende Prozedur kann auch auf 5'-Tert-butyldiphenylsilyldeoxythimidin-3'-cyanoethyl(dimethoxybenzoin)phosphat (0,35 mmol) angewendet werden, um 262 mg (68%) T-T zu ergeben. Das Trinucleotid, 5'-G-T-3', kann durch Lösen von 5'-G-T-3'-Dinucleotid (240 mg, 0,175 mmol) in 100 ml Benzol/1 ml Pyridin und Entgasung mit Ar hergestellt werden. Die Bestrahlung wird wie oben durchgeführt, 1 ml Et₃N wird hinzugefügt und das Lösemittel entfernt. Das Salz, Deoxycytidin-3'-cyanoethyl(dimethoxybenzoin)phosphat (0,35 mmol, und 4-Ethoxypyridin N-oxyd wird dreimal aus Pyridin azeotrop destilliert und dann in 10 ml Dichlorethan aufgenommen. (Triisopropyl)benzolsulfonylchlorid (106 mg, 0,350 mmol) wird hinzugefügt und die Mischung wird über Nacht gerührt. Die oben beschriebene Chromatographie liefert 219 mg (69%) 5'-G-T-C-3'.
Wie oben angegeben, erfordert das vorliegende Verfahren zur Synthese einer Nucleinsäure die Bindung eines ersten Monomers (z. B. (a) oben) an einen Träger (Substrat), direkt oder über einen geeigneten Linker. Die Anbringung auf dem Träger geschieht über das 5'-Hydroxyl des Monomers. Geeignete Träger umfassen ein Glas, dessen Porosität mit Hilfe eines langkettigen Alkylamins kontrolliert wird. In USP 5,143,854 beschriebene Substrate sind für die hierige Benutzung geeignet, ebenso wie die hier beschriebenen Substratoberflächenbehandlungen. Vorgezogen wird ein an die Funktion angepasstes Glasplättchen (z. B. ein mit Aminopropylat behandeltes Glasplättchen).
Linkermoleküle sind, wenn sie benutzt werden, Dicarboxylsäurederivate, wie Bernsteinsäure oder Phthalsäure und Amide, oder Bis-Addukte von Diisocyanaten, wie Toluendiisocyanat. Es wird Succinat vorgezogen. In USP 5,143,854 angegebene Linker sind für eine Benutzung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Ethylenglycololigomere (z. B. Triethylenglycol), Succinate ((z. B. Diglycinsuccinat) und Tris(aminohexonat) werden vorgezogen.
Geeignete Linker für die Benutzung in der vorliegenden Erfindung werden mit einer Schutzgruppe, d. h. einer durch Licht entfernbaren Gruppe (d. h. DMB-Carbonat, MeNPDC, usw.) an einem Endhydroxyl zur Verfügung gestellt. In USP 5,143,854 beschriebene Schutzgruppen sind hier anwendbar. Bevorzugt trägt der Linker ein DMB-Carbonat oder ein DMB-Phosphat, oder eine durch Licht entfernbare Styrylsilylgruppe, wie es in Nr. 08/339,216 beschrieben worden ist (siehe auch J. Org. Chem. 58: 6961 (1993)).
Die Anbringung von Succinatlinkern an dem Substrat kann unter Benutzung von Dicyclohexylcarbodiimid oder anderen Carbodiimiden vorgenommen werden. Es können die z. B. in USP 5,143,854 beschriebenen Anbringungsprotokolle benutzt werden.
Die photochemische 5' zu 3' Synthese von Nucleinsäureanordnungen von den oben beschriebenen Monomeren kann ausgeführt werden, wenn eine direkte streifenförmige Maskierung benutzt wird. Im Allgemeinen wird ein Träger mit der geeigneten funktionellen Gruppendichte mit einem geschützten Nucleosid behandelt, um die erste Basis zu befestigen. Der Träger wird dann durch eine Maske bestrahlt (z. B. eine 5 mm-gestreifte Maske) und mit der nächsten Basis gekoppelt. Der Vorgang wird solange wiederholt, bis ein Oligomer mit der gewünschten Länge (z. B. 8 bis 12 Basen) hergestellt worden ist.
Anordnungen von Oligomeren, die z. B. wie oben beschrieben hergestellt worden sind, können dazu benutzt werden, Mutationen in Proben von Zielnucleinsäuren (z. B. das p53-Tumorsuppressorgen) zu detektieren. Jeder einen Primer (Oligomer) tragende Anordnungsort der komplementär zu einem Ort mit einer Zielnucleinsäure ist, kann benutzt werden, eine Bindung von einer von vier detektierbar markierten Dideoxynucleotiden zu begünstigen, die von einer Polymerase katalysiert worden ist. Wenn die Fluoreszenz als detektierbare Markierung benutzt worden ist, kann man mit Hilfe der Farbe an jedem Ort das Nucleotid am Mutationsort identifizieren. Alternativ kann man die Gegenwart von Fluoreszenzmarkierungen benutzen, um Oligomeranordnungen zu identifizieren, die zum Ziel komplementäre Sequenzen aufweisen. Bei Benutzung dieser Methode geben Oligomere, die keine Markierung annehmen, eine Unstimmigkeit im Ziel an, das auf eine Mutation des Templates zurückzuführen ist. Die Kenntnis der Primersequenz an jeder Nullposition erlaubt die Ortsbestimmung der Mutation.
Außer der vorhergehenden Benutzungen, können die Verfahren der Erfindung und die sich ergebenden Anordnungen dazu benutzt werden, die Anwesenheit einer spezifischen Sequenz in einer Probe, z. B. für ein bakterielles oder virales Pathogen, zu detektieren.
Gewisse Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in den nachfolgenden nicht begrenzenden Beispielen beschrieben. Das Beispiel I bezieht sich auf die 5' zu 3'-Synthese eines Phosphotriesters unter Benutzung von 3'-O-Phosphorylaryloxybenzoinylnucleosiden.
Das Beispiel II bezieht sich auf die Herstellung und Benutzung (als 5'-Schutzstoffe) von Dimethoxybenzoinylcarbonaten und das Beispel III bezieht sich auf die 5' zu 3'-Synthese von Phosporamidit unter Benutzung von Benzoinylcarbonaten als 3'-Hydroxyl-Schutzgruppen. (Siehe auch Pirrung und Shuey, J. Org. Cem. 59: 3890 (1994)).
Beispiel I
Asymetrische Synthese von Dimethoxybenzoinen, Erzeugung von Phospotriestern und die Synthese von Dinucleotid
Es wurde die Methode von Hayashi et al, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1364 (1990) benutzt. Im Wesentlichen wurden Trimethylcyanohydrine durch Behandlung von Dimethoxybenzaldehyd mit Trimethylsilylcyanid, Titanisopropoxid und Diethyltartrat hergestellt. Die Silylcyanohydrine wurden mit 2 Mol-Äquivalenten von Phenylmagnesiumbromid in Diethyläther bei 0°C während 1 h behandelt und in 2 N HCl während 6 h bei Raumtemperatur hydrolysiert, um das substituierte Benzoin zu erhalten (wobei der Alkohol mit DMBOH bezeichnet wird). Die so erzeugten Benzoine wurden auf optische Reinheit unter Benutzung des optisch aktiven NMR-Shiftreagenzes Eu(fod)3 analysiert. Für die Verbindungen, die nicht optisch rein waren, wurde die Kristallisierung der Racemate benutzt, um den enantiomerischen Überschuss zu erhöhen.
Die Bildung von Derivaten der 5'-geschützten, basisgeschützten Nucleosiden wurde folgendermaßen durchgeführt. N-Benzoyl-5'-O-acetyl-adenosin wurde mit dem Letsingerreagenz, Chlordimethylamino(o-chlorphenyl)phosphit (1,2 Äquivalente) in Acetonitril bei Raumtemperatur während 2 h behandelt. Das optisch aktive Benzoin (1,4 Äquivalente) wurde in Anwesenheit von einer katalytischen Menge Tetrazol hinzugefügt, mit einer Kupplungsdurchführung über Nacht. Die Oxidation in einen Phosphotriester wurde mit einer 5%-Lösung von Iodin in 1 : 1 THF/Wasser durchgeführt. Das Produkt wurde durch Hinzufügung von Wasser und Chloroformextraktion isoliert (siehe unten). Nach dem Verdunsten des Lösemittels wurde das Rohprodukt in Methanol suspendiert und einige Tropfen Triethylamin hinzugegeben. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur war die Reaktionsmischung konzentriert und das Produkt aus wasserhaltigem Ethanol kristallisiert. Die NMR-Analyse zeigte eine Verdoppelung der Signale für Methin in der Benzoingruppe und das 3'-Methin in dem Nucleosid wegen des Diastereomerengemisches am Phosphor. Diese konnten nicht durch chromatographische oder Kristallisierungstechniken getrennt werden. Diese Verbindungen sind 3'-O-PArBenz(phosphorylaryloxybenzoinyl)nucleoside.
Die photochemische Synthese von einem Dinucleotid wurde durch das folgende Experiment demonstriert. 5'-O-Acetyl-3'-O-PArBenz-thymidin wurde in Benzol bei einer Leistung von 10 mW/cm² mit 365 nm während 10 Minuten bestrahlt, um 3'-O-Phosphatdiester herzustellen. Zu der Lösung wurde direkt N-Benzoyladenosin-3'-O-PArBenz (1 Äquvalent), Mesitylensulfonylnitrotriazol (MSNT, 1 Äquivalent) und Pyridin-N-oxyd (0,05 Äquivalent) hinzugefügt. Nach dem Rühren während 2 Stunden bei Raumtemperatur, wurde die Mischung in Wasser abgekühlt, mit Chloroform extrahiert und das Produkt durch Evaporation der kombinierten organischen Phasen isoliert. Das Rohmaterial wurde dann in Methanol/Wasser (1 : 1) gelöst und 0,1 M p-Nitrobenzaldehydeoxim/Tetramethylguanin hinzugefügt. Nach dem Umrühren bei 40°C während 2 Stunden zeigte die HPLC-Analyse, dass die O-Chlorophenyl-, Acetyl- und Benzylgruppen vollständig entfernt waren. Das Produkt wurde isoliert mit einer Ausbeute von > 94% durch die Anionenaustauschchromatographie (DEAE-Sephasil), elutiert mit pH 5,5 Triethylammoniumbicarbonat.
Für die Festphasensynthese von Nucleinsäuren wurden Perlen oder Plättchen aus Glas derivatisiert (funktionalisiert) mit 10% Dimethyldichlorosilan und Hexaethylenglycol, gefolgt von einem Tempern bei 110°C während 2 Stunden und Abkühlung unter Argon. Der Träger wurde dann mit Letsinger-Reagenz bei Raumtemperatur während 2 Stunden behandelt, gefolgt von einem 5'-OH-3'-O-ParBenz-Nucleosid bei Raumtemperatur über Nacht. Mit dieser Prozedur wurde das erste Nucleosid auf dem Träger über seine 5'-Hydroxylgruppe angebracht. Der Träger wurde dann während 10 Minuten bei 365 nm mit einer Leistung von 10 mW/cm² im Kontakt mit einer Lösung, die Triethylamin und p-Diethylaminonitrobenzol enthielt, bestrahlt (die Bestrahlungszeit für die Produktion von Phosphodiester für die Kupplung ist wichtig, 6 Minuten wurden als optimal gefunden). Wenn der Träger ein Plättchen ist, kann die Bestrahlung durch eine Maske ausgeführt werden, um der Oberfläche ein Muster aufzuerlegen. Der Träger wurde mit reinem Methylenchlorid gewaschen. Eine Lösung eines 5'-OH-3'-O-PArBenz-Nucleosids und Mesitylensulfonylnitrotriazol (MSNT) (0,1 M Lösung in DMF) wird dann auf dem Träger hinzugefügt und blieb während 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Der Träger wird wieder mit Methylenchlorid zur Vorbereitung des nächsten Bestrahlungszyklus gewaschen. Auf dieser Stufe liegt ein Dinucleotid vor, das eine 3'-O-PArBenzgruppe trägt und die vorhergehende Prozedur kann wiederholt werden, um die gewünschte Sequenz aufzubauen. Nachdem die komplette Sequenz zusammengebaut worden ist, entfernt eine letzte Bestrahlung die 3'-photolabile Gruppe und eine Behandlung mit Nitrobenzaldehydroxin, wie sie vorher beschrieben worden ist, hebt den Schutz des trägergebundenen Oligonucleotids auf.
Die Sequenz dieses Nucleotids wurde auf zwei Arten hergestellt. Träger, die nur eine Sequenz enthielten, wurden mit wässrigem Kaliumfluorid behandelt, um alle DNA-Ketten zu befreien. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt und einer FAB-Massenspektrometrie unterzogen. Diese DNA-Moleküle können auch als PCR-Primer benutzt werden, und durch Vergleich mit bekannten Mengen derselben Sequenz durch konventionelle Methoden hergestellt und gereinigt werden, und es wurde eine Abschätzung der Menge der gewünschten Sequenz und deshalb der Reinheit der erhaltenen Sequenz gemacht.
Die Ergiebigkeit eines Synthesezyklus auf dem Träger wurde durch Kupplung einer Hydroxyloberfläche mit Thymin, das eine 3'-PArBenz-Gruppe trägt, hergestellt. Der Schutz in einem Streifen wurde entfernt und mit einem 3'-Acetylthymin gekoppelt. Die Acetylgruppe wurde mit MeOH/Et₃N und mit 3'-Hydroxyl fluoreszierend gemacht. Das Substrat wurde photochemisch in einem zweiten überlappenden und rechtwinklig zum ersten stehenden Streifen entschützt, und die 3'-Hydroxyle wurden fluoreszierend gemacht. Sofern die Schutzgruppenabspaltung und Kopplung in beiden Schritten vollständig sind, sollte das Ergebnis ein Querschnitt der einheitlichen Gesamtfluoreszenz sein. Falls die Schutzgruppenabspaltung nicht vollständig ist, sollte der Zentralbereich fluoreszierender sein, weil er doppelt gekoppelt war.
Beispiel II
Dimethoxybenzoincarbonate
Durch Methylierung aktiviertes Carbonyliimidazol (Saha et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 4856 (1989)) in Nitomethan ergab eine einzelne Acylierung von DMB (eine Stunde Raumtemperatur), um das untere „1" zu liefern, das sogar stabil bei Rückflusstemperaturen war (gleich 1 unten). Hinzufügung einer Lösung von Alkohol (0,5 Äq.) gefolgt von Pyridin führt zu einer Acylsubstitution, um das DMB-Carbonat innerhalb einer Stunde bei Raumtemperatur zu erzeugen (gleich 2 unten). Primäre, sekundäre und Arylalkohole und -Thiole (einschliesslich Benzylalkohol, Benzylmercaptan, p-Methoxyphenol, Cholesterol, Cyclododecanol und Borneol) wurden bei großer Ausbeute geschützt. Diese Verbindungen wurden leicht von der Schutzgruppe befreit durch eine Bestrahlung mit 350 nm-Lampen (Rayonet-Reaktor) als schwache (≤ 3 mM) Lösungen in Benzol oder Acetonitril. Typische Reaktionszeiten waren eine Stunde auf einer 0,25 mmol Skala (zweimal länger in Acetonitril) und die isolierten Ausbeuten der Alkohole waren einheitlich hoch (> 96%). Parallele Bestrahlungen von DMB-Acetat und Benzyl-DMB-Carbonat bei niedriger Konzentration zeigen im wesentlichen denselben Schutzgruppenabspaltungsgrad, was nahe legt, dass die Mengenausbeute der Schutzgruppenabspaltung für diese Carbonate ähnlich ist wie die, die für Acetat, d. h. 0,64, beschrieben worden ist. Ein bedeutender Vorteil dieser Benzoingruppe verglichen mit den Nitrobenzylen ist das inerte Phenyldimethoxybenzofuran-Nebenprodukt. Sein Absorptionsvermögen für lange Wellenlängen (300 nm) und die intensive 396-nm-Fluoreszenz erlaubt seine Detektion bei so niedrigen Konzentrationen wie 1 μM, wodurch die Ergiebigkeit einer photochemischen Schutzgruppenabspaltung direkt durch optische Verfahren gemessen werden kann.
Es wurden zwei Trimere hergestellt, um die Nützlichkeit von DMB-Carbonatschutzgruppen für die photochemische Synthese von DNA auf festen Trägern zu zeigen. Die Derivatisierung von Thymidin am 5'-Alkohol mit dem DMB-Carbonat und die Konversion des sich ergebenden „3" unten zum 3'-Phosporamidit „4" wurde durch Standardverfahren erreicht (gleich 3 (Gait „Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" IRL Press Oxford 1984; Narang, „Synthesis and Applications of DNA and RNA" Academic Press, New York (1987); Gassen and Lang, „Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments„ Verlag-Chemie, Weinheim (1982); Caruthers, Science 230: 281 (1985)). Kommerzielle Perlen aus Glas mit kontrollierten Poren und langkettigem Alkylamin (lcaa-cpg), die mit 5'-DMTr-T derivatisiert waren, (25 μmol/g) wurden mit Säure behandelt und mit dem unteren „4" gekoppelt bei Tetrazolkatalyse und mit Essigsäureanhydrid/Dimethylaminopyridin (DMAP)-Kappung. Bestrahlung (gleich 4 unten) und Kupplung mit 5'-DMTr-Bz-Cytosin-3'-CE-Phosporamidit gab ein Trinucleotid. Die Schutzgruppen und Bindungen wurden mit Ammoniak gespalten und das Produkt einer HPLC Reinigung unterzogen (umgekehrte Phase, 0,1MEt₃N·HOAc/24–32% CH₃CN). Das Absorptionsvermögen der Fraktion, die die Sequenz 5'-DMTr-CTT enthält, wurde verglichen mit dem einer bekannten Konzentration einer authentischen Probe (durch konventionelle DMTr-Synthese hergestellt), wodurch eine Gesamtausbeute von 76,5% festgestellt wurde. Die Sequenz 5'-ATT-3' wurde hergestellt, indem zuerst ein lcaa-cpg-Träger mit 5'-DMB-CO₂-T beladen wurde (184 nmol durch Freigabe von Benzofuran), und zwar durch sein 3'-Succinat durch Behandlung mit Dicyclohexylcarbodiimid. Die Bestrahlung (t ½ = 2,7 Minuten; Gesamtzeit = 30 Minuten) und Kupplung mit dem unteren „4" wurden wie oben ausgeführt. Eine zweite Bestrahlung (t ½ = 3,3 Minuten, Gesamtzeit = 45 Minuten) und Kupplung (167 nmol durch Freigabe von Benzofuran) mit 5'-DMTr-Bz-Adenosin-3'-CE-Phosphoramidit ergab ein Trinicleotid. Es wurde vom Träger getrennt, durch HPLC analysiert und zeigte einen einzigen Peak. Dieses Produkt wurde auch unter Benutzung einer OPC-Kartusche (Applied Biosystems, Foster City USA) gereinigt und mit Schlangengift-Phosphosiesterase/alkalischer Phosphathase verdaut (Cadet et al., Can. J. Chem. 63: 2861 (1985)). Die Nucleoside in den sich ergebenden Proben wurden durch HPLC analysiert. Es wurde ein Verhältnis von 64,5%/35,5% (T/A) beobachtet, übereinstimmend mit der erwarteten Sequenz. Trotz der benachbarten T-Reste in diesen beiden Sequenzen, ist die photochemische Schutzgruppenabspaltung nicht schädlich für die DNA, was durch die Abwesenheit von irgendwelchem T-T-Dimerprodukt durch Vergleich mit einer authentischen Probe festgestellt wurde. (Greenberg et al. J. Org. Chem. 59: 746 (1994)).
Sekundäre Dimere wurden ebenfalls geschützt mit dem obigen „1" und durch Bestrahlung von der Schutzgruppe befreit.
Beispiel III
Schutz des 3'-Alkohols eines Nucleotids mit einem durch Licht entfernbaren Carbonatderivat, Schutz des 5'-Alkohols mit einem Phosporamidit und Kupplung des 5'-Phosphorderivats mit einem 3'-Alhohol
Carbonyldiimidazol wird in Nitromethan mit Methyltriflat behandelt, um das N-Alkylimidazoliumderivat zu erzeugen (siehe Beispiel II oben). Die in situ-Behandlung dieser Spezies mit 3',5'-Dimethylbenzoin erzeugt eine Carbonatester-/Imidazolmischung. Dann wird ein 5'-geschütztes Nucleosid zugegeben und die Lösung zwei Stunden unter Rückfluss gehalten, um das gemischte Carbonat aus DMB und dem 3'-Hydroxyl des Nucleosids zu erzeugen. Dieses Material kann am 5'- Ende von seiner Schutzgruppe befreit und außerdem am 5'-Hydroxyl mit einem Phosphoramiditreagenz (Caruthers, Science 230: 281 (1985)) derivatisiert werden. Die Kupplung dieses 5'-Phosphorderivats mit einem 3'-Alkohol eines zweiten Nucleosids wird mit einem Tetrazolkatalysator durchgeführt. Die entstehende DNA-Kette wird durch Bestrahlung mit Licht mit einer Wellenlänge > 300 nm, wodurch ein Benzofuranderivat, Kohlendioxyd und die freie 3'-OH-Gruppe erzeugt wird, für einen weiteren anderen Kupplungszyklus vorbereitet. Das vorher Gesagte kann benutzt werden, um andere Alkohole zu schützen, einschließlich den 5'-Alkohol eines Nucleosids (siehe Beispiel II). Ein Thiolschutz kann ebenfalls wie oben beschrieben ausgeführt werden.

Claims

Verfahren zum Bewirken einer 5'- zu 3'-Synthese einer Nucleinsäure, umfassend: i) Anbringen an einem Träger eines Nucleosids, umfassend eine durch Licht entfernbare 3'-Hydroxyl-Schutzgruppe, wobei die Anbringung über das 5'-Hydroxyl des Nucleosids erfolgt; ii) Bestrahlen des aus Schritt (i) resultierenden, trägergebundenen Nucleosids, sodass die Schutzgruppe entfernt wird und die 3'-Hydroxylgruppe dadurch freigesetzt wird; und iii) Kontaktieren des aus Schritt (iii) resultierenden, trägergebundenen Nucleosids mit einem Nucleotid, umfassend ein 5'-Phosphoramidit, unter Bedingungen, sodass das 5'-Phosphoramidit mit dem freien 3'-Hydroxyl reagiert, sodass ein Dinucleotid gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die 3'-Hydroxyl-Schutzgruppe ein Benzoinylcarbonat ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Benzoinylcarbonat ein Dialkoxybenzoinylcarbonat ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Dialkoxybenzoinylcarbonat 3',5'- oder 2',3'-Dimethoxybenzoinylcarbonat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nucleotid eine 3'-Hydroxyl-Schutzgruppe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die 3'-Hydroxyl-Schutzgruppe des Nucleotids durch Licht entfernbar ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die 3'-Hydroxyl-Schutzgruppe des Nucleotids ein Benzoinylcarbonat ist.
Verfahren zum Bewirken einer 5'- zu 3'-Synthese einer Nucleinsäure, umfassend: i) Anbringen eines ersten Nucleotids an einem Träger über das 5'-Hydroxyl des Nucleotids, wobei das Nucleotid einen 3'-Phosphotriester umfasst, wobei einer der Ester der 3'-Phosphotriester eine durch Licht entfernbare Gruppe ist; ii) Bestrahlen des aus Schritt (i) resultierenden, trägergebundenen Nucleotids, sodass die durch Licht entfernbare Gruppe entfernt wird und dadurch ein 3'-Phosphodiester gebildet wird; iii) Kontaktieren des aus Schritt (i) resultierenden, trägergebundenen Nucleotids mit einem zweiten Nucleotid, umfassend eine 5'-Hydroxylgruppe, welche mit dem 3'-Phosphodiester des aus Schritt (ii) resultierenden, trägergebundenen Nucleotids resultiert, sodass ein Dinucleotid gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die durch Licht entfernbare Gruppe eine Aryloxybenzoinylgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die durch Licht entfernbare Gruppe eine Nitrobenzylgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Aryloxybenzoinylgruppe eine Aryloxydialkoxybenzoinylgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Aryloxydialkoxybenzoinylgruppe eine Aryloxydimethoxybenzoinylgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das zweite Nucleotid einen 3'-Phosphotriester umfasst, wobei einer der Ester eine durch Licht entfernbare Gruppe ist.
Verbindung der Formel
worin: B eine stickstoffhaltige aromatische heterocyclische Gruppe ist; X H, OH oder ein geschütztes OH ist; Y ein Benzoinylcarbonat ist; und Z ein Phosphoramidit ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei Y ein Dialkoxybenzoinylcarbonat ist.
Verbindung nach Anspruch 15, wobei Y Di(C₁-C₄)alkoxybenzoinylcarbonat ist.
Verbindung nach Anspruch 16, wobei Y 3',5'- oder 2',3'-Dimethoxybenzoinylcarbonat ist.
Verbindung nach Anspruch 14, wobei B Uracil, Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin oder Inosin ist.
Phosphodiester- oder Phosphotriesternucleosid, umfassend eine O-Phosphorylaryloxybenzoinylgruppe an der 3'-Position und eine -OH-Gruppe an der 5'-Position.
Nucleotid nach Anspruch 19, wobei das Nucleotid ein 3'-O-Phosphorylaryloxydialkoxybenzoinylnucleotid ist.
Nucleotid nach Anspruch 20, wobei das Nucleotid ein 3'-O-Phosphorylaryloxy-di(C₁-C₄)-alkoxybenzoinylnucleotid ist.
Nucleotid nach Anspruch 21, wobei das Nucleotid ein 3'-O-Phosphorylaryloxydimethoxybenzoinylnucleotid ist.
Anordnung, umfassend ein Substrat und eine Vielzahl von Nucleotiden oder Nucleosiden, angebracht daran über eine 5'-Hydroxylgruppe der Nucleoside oder Nucleotide.
Anordnung nach Anspruch 24, wobei ein 3'-Hydroxy der Nucleotide oder Nucleoside eine durch Licht entfernbare Schutzgruppe trägt.