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KR101591887B1 - 장기 지속형 약물 제형 - Google Patents

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KR101591887B1
KR101591887B1 KR1020137000979A KR20137000979A KR101591887B1 KR 101591887 B1 KR101591887 B1 KR 101591887B1 KR 1020137000979 A KR1020137000979 A KR 1020137000979A KR 20137000979 A KR20137000979 A KR 20137000979A KR 101591887 B1 KR101591887 B1 KR 101591887B1
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메드제닉스 메디칼 이스라엘 리미티드
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Abstract

본 발명은 장기 지속형 에리트로포이에틴 치료 제형과 이의 이용 방법에 관한 것으로, 상기 제형은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 에리트로포이에틴을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 유전자 변형된 미세-기관을 포함한다.

Description

장기 지속형 약물 제형{LONG LASTING DRUG FORMULATIONS}
본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 에리트로포이에틴 등의 치료 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 유전자 변형된 미세-기관(micro-organ)을 포함하는 장기 지속형 치료 제형 및 이의 이용 방법에 관한 것이다.
치료제는 경구, 경피, 흡입에 의해, 주입에 의해 또는 서방형 저장체(depot)에 의해 전달될 수 있다. 그러나, 전달 방법은, 제제가 수여자에게 제공되는 프로세스, 투여 빈도 요건 및 이용될 수 있는 분자 크기 한계에 따라, 제한된다. 일부 방법들에서는 치료제의 양이 투여시마다 달라진다.
원하는 핵산 서열/단편을 벡터에 서브-클로닝한 다음 특정 숙주 세포를 추가적인 정제 단계에 적합한 단백질을 생산하게끔 변형시키는 단계를 포함하는 단백질 생산 기법은, 단백질 발현량, 분비량, 번역 후 변형 (예, 당화 및 단백질의 정확한 접힘(folding)) 등에 따라 제한된다. 또한, 높은 수준의 단백질 생산을 달성할 수 있다고 하더라도, 다량의 재조합 단백질을 생산한 다음 오염원이 제거되도록 정제하여야 한다. 정제 방법을 개발하는데에는 매우 많은 시간이 소요된다. 일단 재조합 단백질의 정제가 달성되면, 동물 또는 사람에 도입하기에 안정적이며 허용가능하도록 제형화하여야 한다. 또한, 제형화된 경우라도, 정제된 재조합 단백질은 유지 및 보관 상의 한계로 인해 유효 기간이 한정되어 있으므로; 대개 반복적인 정제와 더 많은 단백질의 제형화가 요구될 수도 있다. 적정 제형을 개발하는 과정 역시 시간이 많이 들고, 어렵고, 고비용이 소요되는 과정이다.
따라서, 생물학적 활성을 보존하기 위해 필수적인 번역후 변형을 포함하며, 전형적으로 높은 수준의 재조합 단백질의 획득에 수반되는 어렵고 비용이 많이 드는 방법을 수행하지 않고도, 저렴하고 신속하게 제조되는, 장기 지속형의 단백질-기반의 치료 분자에 대한 필요성이 널리 인식되어 있다.
몇몇의 연구자들은 유전자 치료를 통해 재조합 유전자 산물을 생체내에서 발현시키고자 시도한 바 있다. 통상적으로, 바이러스 벡터를 사용하여, 재조합 유전자 산물을 발현하도록 생체내에서 세포를 형질전이한다. 이러한 바이러스 기반의 벡터는 타겟 조직을 감염시키는 선천적인 능력과 같은 유용한 특징들을 가지고 있다. 그러나, 레트로바이러스 기반의 벡터는 재조합 산물의 발현이 가능하도록 하기 위해서는 타겟 조직의 게놈내로의 통합이 필수적이며 (존재하는 온코진을 활성화시킬 가능성이 있음), 활발하게 분열하는 조직만 형질전이시킬 수 있다. 또한, 바이러스 벡터는 대개 트랜스유전자의 발현을 장기간 지속시킬 수 없는데, 그 이유는 부분적으로는 이차적인 숙주 면역 반응으로 인한 이들의 제거 때문일 수 있다.
따라서, 당해 기술 분야에서는 수주간 또는 그 이상 지속적으로 일정하게 고수준으로 발현되는 재조합 유전자 산물 제형과 이러한 제형을 사용하여 질병을 치료하는 방법이 요구되고 있다.
본 발명은, 일 구현예에서, 유전자 변형된 미세-기관을 포함하는 장기 지속형 치료 제형으로서, 상기 미세-기관은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 핵산 서열은 치료 폴리펩타이드를 코딩하며, 상기 제형의 투여에 의해 혈중 헤모글로빈("Hb")의 수준이 기저 수준(basal level)에 비해 증가하며, 이러한 증가가 1달 이상 유지되는, 장기 지속형 치료 제형을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터이다. 일 구현예에서, 상기 치료 폴리펩타이드는 에리트로포이에틴이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관을 제공하는 단계; 및 상기 유전자 변형된 미세-기관을 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 장기간 이를 필요로 하는 개체에게 치료 폴리펩타이드를 제공하는 방법으로서, 상기 미세-기관은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 핵산 서열은 치료 폴리펩타이드를 코딩하며, 상기 제형에 의해 Hb 수준이 기저 수준에 비해 증가되며, 이러한 증가가 1달 이상 유지되는 치료 폴리펩타이드를 제공하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 상기 증가는 1달 보다 장기간 유지된다. 일 구현예에서, 벡터는 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터이다. 일 구현예에서, 상기 치료 폴리펩타이드는 에리트로포이에틴이다. 다른 구현예에서, 상기 개체는 빈혈 환자이다. 다른 구현예에서, 상기 개체는 감염 환자이다. 다른 구현예에서, 상기 개체는 암 환자이다.
일 구현예에서, 본 발명은 18 - 150 UI 에리트로포이에틴/개체의 체중 Kg/일의 유효 투여량을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 Hb 수준이 증가된 기간 중 90% 이상의 기간 동안 증가된 Hb 수준을 10 - 12 g/dl Hb 범위로 유지하는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 제형에 의해 시험관내에서 생산되는 최적화된 재조합 인간 인터페론-α(IFNα)의 생산 수준을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 제형에 의해 시험관내에서 생산되는 재조합 인간 에리트로포이에틴(hEPO)의 생산 수준을 나타낸 것이다. HD-Ad-CAG-wt-hEPO GMMO 역가(A). 미세-기관에 HD-Ad-CAG-wt-hEPO 바이러스를 1:25; 1:100; 및 1:1000 희석으로 희석 비율을 증가시켜 형질전이하였다. Ad5/CMV/wt-hEPO는 작업 농도 1:10 및 1:50로 희석하였다. 2개의 상이한 피부 H-I 및 H-2에서 생산되는 GMMO의 비교(B). 미세-기관에 HD-Ad-CAG-wt-hEPO를 1:25로 형질전이하였다. 막대는 수집하고 3-4일마다 교체한 배양 배지에 대한 ELISA로 측정한 hEPO 농도를 보여준다.
도 3은 EPO를 발현하는 gutless 아데노바이러스를 포함하는 최적화된 제형과 EPO-발현성 아데노바이러스-5를 포함하는 미세-기관으로부터, 시험관내 에리트로포이에틴(EPO)의 피크 발현율을 나타낸 것이다. 미세-기관을 HD-Ad-CAG-hEPO로 1:25로 또는 Ad5/CM V/hEPO로 1:10으로 형질전이하였다.
도 4는 최적화된 EPO를 발현하는 gutless 아데노바이러스와 최적화되지 않은 EPO를 발현하는 gutless 아데노바이러스를 포함하는 제형으로부터 시험관내 에리트로포이에틴(EPO) 발현율을 나타낸 것이다. 미세-기관을 바이러스 입자 1:100 희석물로 형질전이하였다. 막대는 수집하고 3-4일마다 교체한 배양 배지에 대한 ELISA로 측정한 hEPO 농도를 나타낸다.
도 5는 CAG 또는 CMV 프로모터 하류에서 EPO를 발현하는 gutless 아데노바이러스를 포함하는 제형으로부터 시험관내 에리트로포이에틴(EPO) 발현율을 나타낸 것이다.
도 6은 SCID 마우스에서 생체내 생산되는 재조합 인간 에리트로포이에틴의 생산율 (A)과 본 발명의 제형에 의한 시험관내 재조합 인간 에리트로포이에틴의 생산율 (B)을 나타낸 것으로, 헤마토크릿 변화도 함께 나타내었다 (A). 그룹 당 10마리의 마우스에 GMMO를 피하 이식하였다. 아데노바이러스-hEPO, 헬퍼-의존형 아데노바이러스-hEPO, 및 헬퍼-의존형 아데노바이러스-최적화된 hEPO로 형질전이된 GMMO와 형질전이되지 않은 GMMO가 이식된 마우스의 혈청에서 측정되는 hEPO 수준 (mU/ml) 및 각각의 헤마토크릿 %를 나타낸다. 혈액은 10일마다 채혈하였다 (A). 헤마토크릿은 원심분리 방법에 의해 측정하고, 혈중 혈청 hEPO 수준은 hEPO ELISA 키트로 측정하였다. 이식하지 않은 GMMO를 배양 상태로 유지시켜, EPO 수준을 측정하였다 (B).
도 7은 인간 환자에서 생체내 전달되는 용량과 혈청내 EPO 피크 수준의 상관관계를 나타낸다.
도 8A는 주사하지 않은 상태의 환자 6명 중 5명에서 1-24개월간 치료 범위(10-12 g/dl)내에서 지속되는 헤모글로빈 반응이 확인된 hEPO-GMMO 저용량 임상 그룹의 결과를 요약 도시한 것이다. 도 8B는 주사하지 않고 3-11개월 동안 환자 7명 중 6명에서 치료 범위(10-12 g/dl)내에서 지속되는 헤모글로빈 반응이 확인된 hEPO-GMMO 중간 용량 임상 그룹의 결과를 요약 도시한 것이다. 도 8C는 주사하지 않고 1-4개월 동안 환자 3명 중 2명에서 치료 범위(10-12 g/dl)내에서 지속되는 헤모글로빈 반응이 확인된 hEPO-GMMO 고용량 임상 그룹의 결과를 요약 도시한 것이다.
도 9는 환자 1의 헤모글로빈 반응을 나타낸 것이다.
도 10A는 환자 2의 지속되는 헤모글로빈 반응을 나타낸 것이고, 도 10B는 환자 2에서 hEPO-GMMO 투여에 대한 반응으로 망상적혈구 수를 나타낸 것이고, 도 10C는 환자 2에서 hEPO-GMMO에 대한 반응으로 혈청내 EPO 수준을 나타낸 것이다.
도 11A는 환자 3의 헤모글로빈 반응을 나타낸 것이다. 도 11B는 투사한 바닥값(projected nadir)으로 hEPO-GMMO를 이식하기 전의 헤모글로빈 수준을 나타낸 것이다.
도 12는 환자 4의 지속되는 헤모글로빈 반응을 나타낸 것이다.
도 13은 환자 6의 지속되는 헤모글로빈 반응을 나타낸 것이다.
도 14는 환자 7의 지속되는 헤모글로빈 반응을 나타낸 것이다.
도 15는 임상 실험 환자들에 대한의 베이스라인 데모그래픽(demographic)이다.
도 16은 용량을 증가시켜 2차 투여한 후 헤모글로빈 및 혈청 EPO 수준을 나타낸 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 에리트로포이에틴과 같은 치료 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 유전자 변형된, 조직 기반의 미세-기관(tissue-based micro-organ)을 포함하는 장기 지속형 치료 제형 및 이의 이용 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 일 구현예에서, 유전자 변형된 미세-기관을 포함하는 장기 지속형 치료 제형으로서, 상기 미세-기관이 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 핵산 서열이 치료 폴리펩타이드를 코딩하며, 상기 치료 제형의 투여에 의해 헤모글로빈 ("Hb")의 수치가 증가하며, 이러한 증가가 1달 이상 유지되는, 장기 지속형 치료 제형을 제공한다. 다른 구현예에서, 상기 헤모글로빈 수준은 증가되며, 이러한 증가는 6달 이상 유지된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 미세-기관을 포함하는 장기 지속형 치료 제형으로서, 상기 미세-기관이 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 핵산 서열이 치료 폴리펩타이드를 코딩하며, 상기 제형의 투여에 의해 혈중 Hb 수준이 기저 수준에 비해 증가하며, 이러한 증가는 1달 이상 유지되고, 상기 벡터가 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터인, 장기 지속형 치료 제형을 제공한다.
본원에서, 용어 "증가된 헤모글로빈 수준"은 이를 필요로하는 개체에게 본 발명의 장기 지속형 치료 제형을 투여함에 따른 반응으로 혈중 Hb 수준이 기저 수준 보다 높게 증가하는 것을 의미한다. 본원에서, 용어 "증가된 헤모글로빈 수준"은 본원에서 "헤모글로빈 반응"으로도 지칭될 수 있다.
일 구현예에서, Hb 반응은 Hb 수준이 FDA에서 권고되는 범위인 10 - 12 gm/dl가 되는 Hb의 수준 증가를 지칭한다. 일 구현예에서, Hb 수준은 9.5 - 12.6 gm/dl의 범위이다. 일 구현예에서, Hb 수준은 9 - 13.2 gm/dl의 범위이다. 일 구현예에서, Hb 수준은 8.5 - 13.8 gm/dl의 범위이다. 일 구현예에서, Hb 수준은 8 - 14.4 gm/dl의 범위이다.
일부 구현예에서, 증가된 Hb 수준은 Hb 수준이 증가되는 기간 중 90% 이상의 기간 동안 정해진 범위내로 유지된다. 다른 구현예에서, Hb 수준은 상기 기간 중 80% 이상의 기간 동안 유지된다. 또 다른 구현예에서, Hb 수준은 상기 기간 중 70% 이상의 기간 동안 유지된다.
적혈구생성 자극제 (ESA)로 기존에 치료받은 환자인 경우, ESA 주사 대신 "인간 에리트로포이에틴-유전자 변형된 미세-기관" ("hEPO-GMMO")을 투여하면 Hb 수준이 이의 본래의 최저점(natural nadir)으로 낮아지는 것이 방지된다. 일 구현예에서, ESA로 치료받은 적 있는 환자의 경우, Hb 반응은 환자의 본래의 최저점과 비교하여, Hb 수준의 상승을 자연스럽게 유도 및 유지시키는, Hb 수준의 감소 방지를 의미한다. 일 구현예에서, hEPO-GMMO의 투여는 Hb 수준 감소를 방지한다. 이러한 방식으로, Hb 수준을 치료 범위 (therapeutic window)내로 유지시킬 수 있다.
본원에서, 용어 "적혈구생성"은 적혈구 세포 생성 또는 생산 과정을 지칭한다. 에리트로포이에틴은 적혈구생성, 즉 적혈구 세포 생산을 조절하는데 필요한 인자이다. 또한, Hb 반응 측정은 적혈구 세포 생성, 즉 적혈구생성의 측정이다.
본원에서, 지속적인 "헤모글로빈 반응"은 또한 모든 성질과 특성의 Hb 반응을 포괄하는 지속적인 "적혈구생성"을 지칭할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 유전자 변형된 미세-기관을 포함하는 장기 지속형 치료 제형으로서, 상기 미세-기관이 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 핵산 서열이 치료 폴리펩타이드를 코딩하며, 이로써 혈중 Hb 수준이 상기 제형 투여 후 기저 수준 보다 증가되며, 이러한 증가가 면역-적격(immuno-competent) 숙주에서 1달 이상 유지되는, 장기 지속형 치료 제형을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 핵산의 발현 수준은 면역-적격 숙주에서 기저 수준 보다 5% 이상 증가하며, 다른 구현예에서, 상기 벡터는 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터이다.
일 구현예에서, 본 발명은, 유전자 변형된 미세-기관을 포함하는, 장기 지속형 치료 제형과 이의 이용 방법을 제공한다. 일 구현예에서, "미세-기관"이라는 용어는, 본원에서, 세포 생존과 기능에 도움이 되는 방식으로 제조되어진, 외식편으로부터 유래되거나 또는 이와 상동한, 분리된 조직 또는 장기 구조물을 의미한다. 일 구현예에서, 미세-기관은 적어도 일부 생체내 구조체를 유지하거나, 또는 다른 구현예에서, 이것이 유래된 조직이나 장기와 유사하게 상호작용한다. 다른 구현예에서, 미세-기관은 유래된 조직이나 장기의 미세-구조(micro-architecture)와 3차 구조를 유지하며, 영양분 부족 및/또는 폐기물의 축적으로 인한 세포 독성과 그로 인한 세포 사멸을 최소화하기 위해, 미세-기관내 세포로 적절한 영양분과 가스를 수동적으로 확산시키고 미세-기관의 세포 밖으로 세포 폐기물을 확산시킬 수 있도록 선택되는 구조를 가진다. 일 구현예에서, 미세-기관은 진피 조직의 조각(sliver)이다.
일 구현예에서, 미세-기관은 1-2 mm 직경 x 30-40 mm 길이이다. 다른 구현예에서, 미세-기관의 직경은, 예컨대 1-3 mm, 1-4 mm, 2-4 mm, 0.5-3.5 mm, 또는 1.5-10 mm일 수 있다. 다른 구현예에서, 미세-기관의 직경은, 예컨대 약 2 mm 또는 약 1.5 mm일 수 있다. 다른 구현예에서, 미세-기관의 길이는 5-100 mm, 10-60 mm, 20-60 mm, 20-50 mm, 20-40 mm, 20-100 mm, 30-100 mm, 40-100 mm, 50-100 mm, 60-100 mm, 70-100 mm, 80-100 mm, 또는 90-100 mm일 수 있다. 다른 구현예에서, 미세-기관의 길이는 약 20 mm, 약 30 mm, 약 40 mm 또는 약 50 mm일 수 있다. 일 구현예에서, 미세-기관은 1.5 cm2 보다 작고, 다른 구현예에서, 1 cm2 보다 작다. 다른 구현예에서, 직경은 1.5 cm 미만이고, 다른 구현예에서, 길이는 1.5 cm 미만이다.
일 구현예에서, 미세-기관은 외식편(explant)이다. 일 구현예에서, 미세-기관은 조직 유래이다. 다른 구현예에서, 미세-기관은 조직의 단편, 일부 또는 한 부분이다. 다른 구현예에서, 미세-기관은 장기의 단편, 일부 또는 한 부분이다. 미세-기관은, 일 구현예에서, 생체내 및 시험관내에서 장기간 생존하도록 특수 고안되었다는 점에서, 다른 구현예에서, 이의 구조가 미세-기관내에서 적절한 영양분과 가스를 세포로 확산가능하고 미세-기관의 세포 외부로 세포 폐기물을 확산시킬 수 있으며, 일 구현예에서, 영양분 부족 및/또는 폐기물의 축적으로 인한 세포 독성과 수반되는 세포 사멸을 최소화할 수 있도록 특이적으로 선택된다는 점에서, 피부 그래프트(graft)와는 구분될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 미세-기관은 피부 그래프트가 아니다. 다른 구현예에서, 미세-기관은, 일 구현예에서, 천연 또는 인공 스캐폴드에서 생장 및 분리된 세포 수집물과는, 이들이 유래된 조직이나 장기의 미세-구조 및 3차 구조를 유지하고 있다는 점에서, 구분할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 미세-기관은 스캐폴드 또는 겔내에서 생장시킨 한가지 이상의 세포 타입이 아니다.
미세-기관에 대한 상세한 내용은 US-2003-0152562에서 확인할 수 있으며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
이전 특허들(WO 03/006669, WO 03/03585, WO 04/099363, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에도 미세-기관에 대해 기술되어 있는데, 이는 대상 유전자 산물을 발현하도록 변형될 수 있으며, 장기간 자율 기능 상태로 체외에서 유지될 수 있으며, 이후 질병 또는 장애를 치료할 목적으로 체내에 피하 또는 다른 위치로 이식될 수 있는 것이다. 일 구현예에서, 대상 유전자 산물을 발현하도록 변형된 미세-기관은 치료학적 미세-기관이다. 치료학적 미세-기관은 예상치 못하게도 시험관내 및 생체내에서 대상 유전자 산물을 훨씬 장기간 발현하는 프로파일을 나타내었다.
본원에서, "외식편(explant)"이라는 용어는 유기체의 천연 생장부로부터 적출되어, 일정 기간 동안 배양 배지에 놓여진, 조직, 장기 또는 이들의 일부분을 의미한다. 일 구현예에서, 조직 또는 장기는 살아있는 것이며, 다른 구현예에서, 대사 활성형이거나, 또는 이들의 조합이다. 본원에서, 용어 "외식편"은 일부 구현예에서, "미세-기관" 또는 "미세-기관 외식편"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에서, "미세구조"라는 용어는, 일 구현예에서, 조직 외식편의 일부 또는 전체 세포가 생체내에서 물리적 및/또는 기능적으로 접촉하는 하나 이상의 세포 또는 비세포성 물질과 시험관내에서 물리적 및/또는 기능적으로 접촉을 유지하고 있는 외식편의 특징을 의미한다.
다른 구현예에서, 미세-기관 외식편은 이들이 유래된 조직이나 장기의 3차 구조를 유지한다. 일 구현예에서, 미세-기관 외식편은 공간적 상호작용, 예컨대, 세포-세포, 세포-매트릭스(matrix) 및 세포-기질(cell-stromal) 상호작용과, 이들이 유래된 조직의 오리엔테이션(orientation)을 유지한다. 일 구현예에서, 전술한 바와 같은 공간적 상호작용의 유지는, 자가분비 인자(autocrine factor)와 측분비 인자(paracrine factor)의 분비 및 그외 세포외 자극 등의, 외식편의 생물학적 기능을 유지시킬 수 있게 하며, 일 구현예에서, 외식편에 장기간의 생존성을 부여할 수 있다. 일 구현예에서, 미세-기관 외식편의 세포들 중 적어도 일부 세포들은, 생체내에서 물리적 및/또는 기능적으로 접촉하는 하나 이상의 세포 또는 비세포성 물질과 시험관내에서 또는 이식 후 생체내에서 물리적 및/또는 기능적 접촉을 유지한다. 일 구현예에서, 일부 세포는 세포 집단의 약 50% 이상, 다른 구현예에서, 약 60% 이상, 다른 구현예에서, 약 70% 이상, 다른 구현예에서, 약 80% 이상, 및 다른 구현예에서, 약 90% 이상이다. 다른 구현예에서, 외식편의 세포는 이들이 분리된 장기나 조직의 한가지 이상의 생물학적 활성을 유지한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 임의 제형은 유전자 변형된 미세-기관(GMMO)를 임의 형태로 또는 본원에 기술된 구현예로 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 임의 제형은 임의 형태의 또는 본원에 기술된 구현예에 따른 유전자 변형된 미세-기관으로 구성될 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 임의 조성물은 임의 형태나 본원에 기술된 구현예에 따른 유전자 변형된 미세-기관으로 필수적으로 구성될 것이다. 일부 구현예에서, "포함한다"라는 용어는 유전자 변형된 미세-기관 등의 지칭된 활성 물질 뿐만 아니라 그외 활성 물질과, 약학 산업 분야에 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 에몰리언트, 안정화제 등의 함유를 의미한다. 일부 구현예에서, "필수적으로 구성되는"이라는 표현은 조성물의 유일한 활성 성분이 언급된 활성 성분인 조성물을 지칭하지만, 제형에는 안정화 또는 보존하기 위한 등의 그외 화합물이 포함될 수 있되, 언급된 활성 성분의 치료 효과에는 직접적으로 관여하진 않는다는 의미이다. 일부 구현예에서, "필수적으로 구성되는"이라는 표현은 활성 성분의 분비를 촉진시키는 성분을 지칭할 수도 있다. 일부 구현예에서, "구성되는"이라는 표현은 활성 성분과 약제학적으로 허용가능한 담체나 부형제를 포함하는 조성물을 지칭한다.
아울러, 본원에서, 용어 "포함하는"은 시스템이 인용된 인자들을 포함하며, 선택적일 수 있는 다른 것을 배제하지 않는다는 의미로 사용된다. "필수적으로 구성된"이라는 표현은, 언급된 인자들을 포함하며, 방법의 성능의 필연적으로 유의한 효과를 나타낼 수 있는 다른 인자들을 배제하는 방식을 의미한다. "구성된"은 즉 다른 미량 인자 이상의 제외를 의미할 것이다. 이들 각각의 변형된 용어들로 규정되는 구현예들은 본 발명의 범위에 포함된다.
마찬가지로, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 벡터 및 사용하기 위한 벡터는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 치료 폴리펩타이드를 코딩한다. 다른 구현예에서, 벡터는 이러한 핵산 서열로 필수적으로 구성되며, 다른 구현예에서, 벡터는 이러한 핵산 서열로 구성된다.
미세-기관을 분리할 수 있는 포유류의 예로는 인간과 그외 영장류, 전체적 또는 부분적 근교계(wholly 또는 partially inbred) 돼지(예, 미니어쳐 돼지 및 형질전환 돼지) 등의 돼지, 설치류 등을 포함한다. 미세-기관은 다양한 장기로부터 유래되는 조직으로부터 가공할 수 있으며, 일 구현예에서, 피부, 진피, 림프계, 췌장, 간, 담낭, 신장, 소화관, 호흡기, 생식계, 배뇨기, 혈액, 방광, 각막, 전립선, 골수, 흉선, 비장 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 이들 장기 유래의 외식편은 외식편이 수득되는 장기의 미세구조와 동일한 미세구조로 배열된, 랑게르한스 섬 세포, 모낭, 선(gland), 상피 및 연결 조직 세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 외식편이 수득되는 장기의 미세구조는 당해 기술 분야에 공지된 물질, 장치 및/또는 방법을 이용하여 미세-기관 외식편으로부터 확인하거나 또는 식별할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 유전자 변형된 미세-기관을 포함하는 제형 및 이의 이용 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 용어 "유전자 변형된 미세-기관" 또는 "GMMO"는 한가지 이상의 재조합 유전자 산물을 발현하는 미세-기관을 의미한다. 다른 구현예에서, 미세-기관에 대한 언급이 반드시 유전자 변형되지 않은 미세-기관을 의미하는 것은 아니지만, 당해 기술 분야에서 자명한 바와 같이, 일부 예로, 유전자 변형된 미세-기관을 의미할 수도 있다. 일 구현예에서, "유전자 산물"이라는 표현은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및 기능성 RNA 분자를 의미한다. 일 구현예에서, 핵산 분자에 의해 코딩되는 유전자 산물은 개체에게 공급하기 바람직한 유전자 산물이다. 이러한 유전자 산물의 예로는, 수여 개체의 세포에서 정상적으로 생산되는, 단백질, 펩타이드, 당단백질 및 지단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 유전자 산물은 미세-기관을 회수한 유기체 및/또는 GMMO가 이식되는 유기체에서 자연적으로 형성되지 않으며, 다른 구현예에서, 유전자 산물은 자연적으로 만든어지는 것이다. 일 구현예에서, GMMO의 유전자 산물은 미세-기관의 하나 이상의 세포에 의해 내인적으로 발현되는 유전자 산물과 비슷하거나 상동하다. 일 구현예에서, 유전자 변형은 유전자 변형되지 않은 미세-기관에서 생산되는 유전자 산물의 양(level)을 증가시킨다. 다른 구현예에서, GMMO에 의해 발현되는 유전자 산물은 미세-기관의 하나 이상의 세포에 의해 내인적으로 발현되는 유전자 산물과 비슷하지 않거나 상동하지 않다. 다른 구현예에서, 핵산 분자에 의해 코딩되는 유전자 산물은 대상 유전자의 발현을 직접 또는 간접적으로 조절하는 분자를 코딩한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자에 의해 코딩되는 유전자 산물은 개체에게 공급될 바람직한 유전자 산물의 발현 수준을 상향 또는 하향 조절한다.
다른 구현예에서, 미세-기관의 유전자 변형은 내인성 유전자의 발현 프로파일을 변형시킬 수 있다. 이는, 예컨대, 내인성 유전자의 발현을 조절하기 위한, 인핸서, 억제성 조절 인자, 또는 유도성 조절 인자를 도입함으로써, 달성할 수 있다.
미세-기관 외식편을 유전자 변형하는데에는 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법을 이용할 수 있다. 다수의 여러가지 벡터들 중 임의 한가지, 예컨대, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 선형 DNA 등을 이용하여, 치료 물질을 코딩하는 외인성 핵산 단편을 타겟 세포 및/또는 조직에 도입할 수 있다. 이러한 벡터는, 예컨대 감염, 형질전이, 형질감염, 칼슘-인산 매개의 형질감염, DEAE-덱스트란 매개의 형질감염, 전기천공, 리포좀-매개 형질감염, 바이올리스틱 유전자 전달(biolistic gene delivery), 융합성 리포좀(fusogenic liposome) 및 음이온성 리포좀(다른 방법으로 양이온성 리포좀을 이용함)을 이용한 리포좀에 의한 유전자 전달, 직접 주입, 수용체-매개의 흡수(receptor-mediated uptake), 마그네토포레이션(magnetoporation), 초음파, 또는 이들의 임의 조합, 뿐만 아니라 당해 기술 분야에 공지된 다른 기법 (자세한 내용은, 예컨대 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989) and in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), 또는 그외 표준 실험 매뉴얼 참조)을 이용하여, 삽입할 수 있다. 대상 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을, 포유류 세포로 형질전이하여 형질전이된 세포내에서 재조합 산물의 발현을 지시하기에 적합한 발현 벡터 시스템에 삽입할 수 있다. 외인성 핵산 단편의 도입은, 미세-기관 주변으로 벡터를 도입함으로써 달성한다. 외인성 핵산 단편이 전술한 기법이나 당해 기술 분야에 공지된 기법들 중 임의 기법을 이용하여 세포에 통합되면, 상기 핵산 단편에 의해 코딩되는 치료 물질의 생산율 및/또는 분비율을 정량화할 수 있다. 일 구현예에서, "외인성"은 외부로부터 기원하는 기질, 예컨대 세포나 조직의 외부로부터 기원하는 핵산을 의미한다.
일 구현예에서, 본 발명의 미세-기관 제형 및 방법은, 일 구현예에서, 재조합 유전자의 발현을 용이하게 하는 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 비-바이러스 벡터 (예, DNA 플라스미드 또는 미니서클 DNA), "gutless (내재 유전자가 거의 제거된 것)", 즉, 내인성 유전자가 없는 바이러스 벡터 (일 구현예에서, 결손에 의한 것이거나, 다른 구현예에서, 유전자 발현을 방해하는 유전자에 대한 삽입, 치환 또는 결손에 의한 것임), 헬퍼-의존형 아데노바이러스 (HDAd) 벡터, 또는 아데노 부속 바이러스 AAV (일 구현예에서, 단일 가닥이거나, 다른 구현예에서, 이중 가닥임) 등의, 비-면역원성 유전자 전달 물질이다. 다른 구현예에서, 상기 제형은, 재조합 유전자 발현으로 미세-기관에 의한 유전자 산물의 면역-매개 거부 반응 또는 독성이 없도록 선택된다. 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 유래이며, 다른 구현예에서, 벡터는 플라스미드이다. 일 구현예에서, 바이러스 유래 벡터는 아데노바이러스 유래이며, 일 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 유래이며, 다른 구현예에서, 바이러스 유래 벡터는 후술되는 바와 같이 아데노바이러스 부속 벡터 유래이다.
일 구현예에서, "벡터" 또는 "발현 벡터"라는 용어는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포에 도입하기 위해 삽입할 수 있는 운반체 분자이다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 RNA로 전사되며, 일부 경우에는, 그런 후 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 번역된다. 그외 경우, RNA 서열은, 예컨대, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산시, 번역되지 않는다. 일 구현예에서, 발현 벡터는 특정 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 전사, 및 가능한 경우에는, 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭하는, 다양한 "조절 서열"을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터는 복제 오리진(origin)을 더 포함한다. 본원에서, 용어 "조절 서열"은 또한 "규제 서열"로도 지칭될 수 있다. 일 구현예에서, 벡터는 원핵 세포와 진핵 세포 둘다에서 증폭할 수 있는 셔틀 벡터일 수 있으며, 또는 다른 구현예에서, 벡터는 선택한 유기체의 게놈내로 이것이 용이하게 통합되도록 구축될 수 있다. 벡터는, 다른 구현예에서, 예컨대, 플라스미드, 벡스미드, 파지미드, 코스미드, 파지, 바이러스 또는 인공 크로모좀일 수 있다. 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이며, 일 구현예에서, 박테리오파지, 포유류 바이러스 또는 식물 바이러스일 수 있다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스는 모든 공지된 혈청형 또는 서브그룹의 바이러스일 수 있다.
유전자 전달 벡터로서 아데노바이러스 벡터를 이용하는 경우의 이점은, 이의 중간 크기의 게놈, 조작 용이성, 고역가, 광범위한 타겟 세포 범위 및 높은 감염성에 있다. 아데노바이러스 게놈의 양 말단은 100-200 bp로 이루어진 인버티드 반복(ITR: inverted repeat)을 포함하며, 이것은 바이러스 DNA 복제와 패키징에 필요한 cis 인자이다. 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제 개시에 의해 분할된 여러가지 전사 유닛들을 포함한다. E1 영역 (E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈과 수개의 세포 유전자의 전사 조절을 담당하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)의 발현시, 바이러스 DNA 복제용 단백질이 합성된다. 이들 단백질들은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 셧-오프(shut-off)에 참여한다. 대부분의 바이러스 캡시드 단백질 등의 후기 유전자의 산물은, 주요 후기 프로모터 (MLP)에 의해 발생되는 단일 1차 전사체의 유의한 가공이 이루어진 후에만, 발현된다. MLP (16.8 m.u.에 위치함)는 특히 감염 후기에 작동하며, 이 프로모터로부터 만들어지는 모든 mRNA는 이를 번역에 선호적인 mRNA가 되게 하는 5'-삼중 리더(TPL: tripartite leader) 서열을 가진다.
다른 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터("HDAD", "HD", "HDAd" 또는 "HD-Ad")이고, 다른 구현예에서, gutless 아데노바이러스, 파괴된(gutted) 아데노바이러스, 미니 아데노바이러스, 완전히 결손된 아데노바이러스, 고효능의 아데노바이러스, Δ, 또는 슈도(pseudo) 아데노바이러스와 동의어이며, 다른 구현예에서, DNA 복제를 뒷받침하는 서열을 제외한, 일 구현예에서, 아데노바이러스의 인버티드 말단 반복과 패키징 서열(ψ)을 포함하는, 모든 바이러스 코딩 서열이 결손된 것이다. 다른 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스는 바이러스 단백질을 발현하지 않는다. 일 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터는 벡터 DNA를 복제하고 패키징하는데 필요한 아데노바이러스의 cis-작용 인자들만 포함한다. 일 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터는 야생형 아데노바이러스 서열 중 약 500 bp를 포함한다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는, 일 구현예에서, 아데노바이러스 캡시드내로의 효율적인 패키징에 필요한, 게놈 크기 27.2 kb에 대해, 최소 요건을 만족시키기 위해 stuffer DNA를 부가적으로 포함한다. 일 구현예에서, 최소 반복 서열을 포함하는 비-코딩 포유류 DNA를 stuffer DNA로 사용한다. 다른 구현예에서, stuffer DNA는 포유류를 제외한 유기체의 DNA를 포함하며, 일 구현예에서, HPRT 및/또는 C346 코스미드 서열이다.
일 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스는, 생체내 고효율적인 형질전이, 일 구현예에서, 바이러스 단백질의 잔류성 발현으로 인한 만성적인 독성을 회피함으로써, 장기적인 트랜스유전자의 발현을 유지시킬 수 있는 높은 수준의 트랜스유전자의 발현, 또는 이의 조합을 나타낸다. 다른 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스는, 고역가 생산, 다양한 범위의 세포 타입의 효율적인 감염, 분열성 및 비-분열성 세포에 대한 감염력, 또는 이들의 조합을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 헬퍼-의존형 아데노바이러스는, 이식된 미세-기관에 대해, 일 구현예에서, 면역적합 숙주에서 아데노-특이적인 MHC 클래스 I 제한성 CD8 세포독성 T 림프구 (CTL)의 생산이 특징적이며, 일 구현예에서, 트랜스유전자 발현의 지속 기간을 제한하게 되며, 다른 구현예에서, 수주내에 아데노바이러스 벡터를 소거시키는, 강력한 후천적 면역 반응을 유도하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 헬퍼-의존형 아데노바이러스는 세포독성 T 세포를 높은 수준으로 유도하지 않으며 (이는 일 구현예에서, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 양성 CD8 염색에 의해 측정할 수 있음), 다른 구현예에서, 헬퍼 T 세포를 고수준으로 유도하지 않는다 (이는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 일 구현예에서, 양성 CD4 염색에 의해 측정할 수 있음).
다른 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스는, 벡터의 게놈이 숙주 세포의 염색체에 삽입되지 않으므로, 생식 세포 전달 및 온코진 전환을 초래할 수 있는 삽입성 돌연변이 유발을 발생시킬 위험성이 보다 낮다. 일 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스의 클로닝 능력은 매우 커 (일 구현예에서, 약 37 kb, 다른 구현예에서, 약 36 kb), 전체 게놈 위치 (whole genomic loci), 다수의 트랜스유전자 및 거대 cis-작용성 요소들을 전달하여, 트랜스유전자의 발현을 강화, 연장 및 조절할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 헬퍼-의존형 아데노바이러스 시스템은 Palmer 및 Ng, 2003 (Mol Ther 8:846)과 Palmer 및 Ng, 2004 (Mol Ther 10:792)에 언급된 바와 유사하며, 이들 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일 구현예에서, 헬퍼 아데노바이러스와 헬퍼-의존형 아데노바이러스 간의 재조합 발생을 최소화함으로써 복제 컴피턴트 아데노바이러스를 제조하기 위해, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 시스템의 헬퍼 바이러스 구성 성분들 중 E3 영역에, stuffer 서열을 삽입한다.
일 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터를 포함하는 본 발명의 제형은 EPO와 IFN-α를 장기간, 시험관내 (도 1, 2 및 6B) 및 생체내 (도 6A)에서 고수준으로 발현시킨다. 다른 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터를 포함하는 본 발명의 제형은 형질전이된 후 적어도 100일 동안 아데노바이러스-5를 포함하는 미세-기관에 비해 증가된 EPO 피크 발현율을 나타낸다 (도 3). 이론으로 결부되는 것은 아니나, 본 발명의 미세-기관으로부터 유전자 산물의 장기간 지속적인 고수준의 발현에 기여할 수 있는 한가지 인자는, 본 발명의 제형내에서 비-면역원성이며, 조직에 무해한, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이다.
또 다른 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터를 포함하는 본 발명의 제형은 1달 이하의 기간 동안 생체내에서 EPO의 피크 발현 수준 %를 증가시키는 것으로 입증되었다 (도 16). 또 다른 구현예에서, 생체내 EPO 피크 발현 수준은 2달 이하 동안 증가된다(도 10C).
다른 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 E1-결손된 형태이며, 다른 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 추가적으로 E2, E3, E4, 또는 이의 조합이 결손된 것이다.
다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노 부속 바이러스 벡터(AAV)이다. 일 구현예에서, AAV는 아데노바이러스 스톡의 오염원으로 발견된 파르보바이러스이다. 이는 어떠한 질병과도 연관성 없는 도처에 존재하는 바이러스 (미국 인구의 85%가 항체를 가지고 있음)이다. 또한, 바이러스의 복제가 아데노바이러스 등의 헬퍼 바이러스의 존재에 의존되기 때문에, 의존바이러스(dependovirus)로 분류된다. 적어도 9가지의 혈청형이 분리되었고, 이중 AAV-2가 가장 잘 특정화되어 있다. AAV는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3에 단일가닥의 선형 DNA가 캡슐화된 직경 20 - 24 nm의 이십면체 비리온을 형성한다.
일 구현예에서, AAV DNA는 약 4.7 kb 길이이다. 일 구현예에서, AAV DNA에는 2개의 오픈 리딩 프레임이 있으며, 측면에 2개의 ITR이 있다. AAV 게놈에는 중요한 2개의 유전자, rep 및 cap이 존재한다. rep 유전자는 바이러스 복제를 담당하는 단백질들을 코딩하며, cap는 캡시드 단백질 VP1-3을 코딩한다. 각 ITR은 T형의 헤어핀 구조를 형성하고 있다. 이들 말단 반복부는 염색체에 삽입하기 위한 AAV의 유일한 필수 cis 요소이다. 따라서, 일 구현예에서, AAV는 바이러스의 모든 코딩 서열이 제거된 것으로, 전달용 유전자 카세트로 치환된 벡터로서 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 발현 벡터로서 재조합 AAV(rAAV)를 이용하는 경우, 벡터는 AAV 게놈의 6%에 불과한 145 bp의 ITR을 포함하며, 일 구현예에서, 4.5 kb DNA 삽입체를 조립하기 위한 공간이 벡터에 남아 있다.
일 구현예에서, AAV는, 병원성이 아니며 어떠한 질병과도 관련성이 없다는 점에서, 안전하다. 바이러스 코딩 서열을 제거하여, 바이러스 유전자 발현에 대한 면역 반응을 최소화함으로써, 따라서, rAAV는 만약에 있다하더라도 최소한의 면역 반응을 야기할 뿐이다. 다른 구현예에서, AAV 벡터는 이중 가닥이며, 다른 구현예에서, AAV 벡터는 자가-상보적(self-complementary)이며, 일 구현예에서, 바이러스의 제2 DNA 가닥을 합성할 필요성이 없으며, 일 구현예에서, 초기 트랜스유전자가 발현된다.
다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스는, 감염된 세포에서 역전사 과정에 의해 자신의 RNA를 이중가닥 DNA로 변환시킬 수 있는 능력으로 특정되는, 단일 가닥의 RNA 바이러스의 일종이다. 만들어진 DNA는 프로바이러스로서 세포 염색체로 안정적으로 삽입되어, 바이러스 단백질의 합성을 지시한다. 삽입되면, 수여체 세포와 이의 자손에서 바이러스 유전자 서열이 유지되게 된다. 레트로바이러스 게놈은 캡시드 단백질, 중합효소 및 외막 성분 각각을 코딩하는 3개의 유전자, gag, pol 및 env를 포함한다. gag 유전자의 상류에서 확인되는 서열은 게놈을 비리온으로 패키징하는 신호를 포함한다. 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열은 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이는 강력한 프로모터와 인핸서 서열을 포함하고 있으며, 또한 숙주 세포의 게놈에 삽입하는데 필요하다.
일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터를 구축하기 위해, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 대상 서열을 코딩하는 핵산을, 특정 바이러스 서열 대신, 바이러스 게놈에 삽입하여, 복제-불능의 바이러스를 제조한다. 비리온을 만들기 위해, gag, pol 및 env 유전자는 포함하지만 LTR과 패키징 인자는 포함하지 않는 패키징 세포주를 구축한다. cDNA를 레트로바이러스의 LTR 및 패키징 서열과 함께 포함하는 재조합 플라스미드를 이 세포주에 (예, 칼슘 포스페이트 침전에 의해) 도입하는 경우, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체를 바이러스 입자로 팩킹시키며, 그런 후 배양 배지로 방출된다. 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수집하고, 선택적으로 농축한 다음, 유전자 전달용으로 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 타입의 세포를 감염시킬 수 있다. 그러나, 삽입과 안정적인 발현을 위해서는 숙주 세포의 분열이 요구된다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터는 백시니아 바이러스, 렌티바이러스, 폴리오바이러스, 헵파티티스 바이러스, 파필로마 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 시미안 바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 바이러스로부터 유래된다.
본 발명의 특정 예에서, 핵산 서열을 포함하는 벡터는 노출형(naked) 재조합 DNA나 플라스미드를 포함할 수 있다. 구조체의 전달은 세포막을 물리적 또는 화학적으로 투과시키는 임의 방법에 의해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 벡터는 미니-서클 DNA이고, 일 구현예에서, 박테리아의 복제 오리진과 항생제 내성 마커를 포함하지 않는 비-바이러스 유전자 전달을 위한 슈퍼코일형 DNA 분자이다. 다른 구현예에서, 미니-서클 DNA는 플라스미드 제조 공정 동안에 유전자 전달 벡터로부터 유래되는 박테리아 조절 영역은 포함하지 않는다. 따라서, 이는 유전자 치료에 사용되는 다른 플라스미드들 보다 더 작고 잠재적으로 더 안전하다. 일 구현예에서, 미니-서클 DNA는 고수율로 제조되며, 정제하기 간단하며, 강건하고 지속적인 트랜스유전자 발현을 제공한다.
표준 재조합 기법을 이용하여 벡터를 구축하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예로, Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, 1990) 및 Ausubel, et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1996)을 참조하며, 이들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
다른 구현예에서, 벡터는 마커 폴리펩타이드를 코딩하는 이종의 핵산 서열의 삽입을 추가적으로 포함한다. 마커 폴리펩타이드는 예컨대 yECitrine, 그린 형광 단백질(GFP), DS-Red (red fluorescent protein), 분비형 알카리 포스파타제(SEAP), β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 루시퍼라제, GFP/EGFP, 인간 성장 호르몬 또는 당해 기술 분야에 공지된 그외 다수의 리포터 단백질을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 대상 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는, 일 구현예에서, 에리트로포이에틴 또는 인터페론 α2b인 대상 유전자를 포함할 수 있으며, 일 구현예에서, 마커를 발현하며, 다른 구현예에서, 프레임(frame)내에 마커와 연결되어 있으며, 일 구현예에서, 대상 유전자 산물의 동정이 가능하며, 다른 구현예에서, 미세-기관(들)의 외부에서 숙주 세포에 의해 내인적으로 제조되는 유사한 유전자 산물과 미세-기관에 의해 제조되는 대상 유전자 산물을 구분시켜준다.
일 구현예에서, 본 발명의 치료 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 미세-기관으로 도입된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한, 카세트 및/또는 벡터를 세포에 도입하는 당해 기술 분야에 공지된 다수의 기법들이 있으며, 예컨대 직접 DNA 수득 기법 (direct DNA uptake technique) 및 바이러스, 플라스미드, 선형 DNA 또는 리포좀 매개 형질전이, 수용체 매개 흡수 및 칼슘 포스페이트 매개 및 DEAE-덱스트란 매개 도입 방법을 사용하는 마그네토포레이션 방법, 전기천공 또는 리포좀 매개 형질감염 등이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다 (보다 상세한 사항은, 예컨대 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989) and in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), 또는 다른 표준 실험 매뉴얼을 참조함).
일 구현예에서, 핵산으로 코팅된 입자 충격(bombardment)이 노출형 DNA 발현 구조체를 세포로 전달하기 위한 방법일 수 있다. 이러한 방법은 DNA-코팅된 미세-추진체가 세포막을 관통하여 세포를 사멸시키지 않으면서 세포에 진입할 수 있는 높은 속도(velocity)로 가속화하는 능력에 의존한다. 소형 입자를 가속화시키는 장치 몇종이 개발되어 있다. 이러한 장치는 전기 전류를 발생시켜 동력을 제공하는 고전압 방전을 기초로 한다. 사용되는 미세-추진체는 텅스텐이나 금 비드 등의 생물학적으로 무활성 또는 생체적합성 물질로 구성된다. 이러한 임의 방법들을 원하는 서열을 세포에 도입하는데 이용할 수 있는 것으로 이해되어야 하며, 이에 따라 제조되는 세포는 본 발명의 방법을 실행하는데 있어 이의 용도와 같이 본 발명의 일부로서 간주된다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법의 벡터는 핵산 서열을 포함한다. 본원에서, "핵산"이라는 용어는 데옥시리보뉴클레산(DNA), 적절한 경우에는, 리보뉴클레산(RNA) 또는 이의 모방체 등의, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 용어는, 또한, 등가체로서, 뉴클레오티드 유사체로부터 제조되는 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 기술된 구현예에 적용가능한 경우, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 것으로 이해된다. 이 용어는, 자연적으로 생성되는 뉴클레오베이스, 당 및 공유 뉴클레오사이드간 결합으로 구성된 올리뉴클레오티드 (벡본), 뿐만 아니라 유사하게 기능하는 자연적으로 생성되지 않는 부분을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 변형 또는 치환된 올리뉴클레오티드는, 예컨대, 세포 흡수 강화, 핵산 타겟에 대한 친화성 강화 및 뉴클레아제 존재 하에서의 안정성 증가 등의 바람직한 특성 때문에, 종종 천연 형태 보다 선호되기도 한다.
일 구현예에서, 용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 원핵 생물의 서열, 진핵 생물의 mRNA, 진핵 생물 mRNA 유래의 cDNA, 진핵 (예, 포유류) DNA 유래의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열 등을 포함할 수 있는 분자를 의미하나, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 이 용어는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체들 중 임의의 것을 포함하는 서열을 지칭한다.
핵산은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 재조합 공정 또는 합성 공정으로 제조할 수 있다. 핵산은 당해 기술 분야에 공지된 기법에 의해 생물리학적 또는 생물학적 특성들을 변이시키기 위해 추가적으로 변형시킬 수 있다. 예컨대, 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키도록 (예, "말단-캡핑"), 용해성을 변형시키도록, 상보 서열에 대한 결합 친화성을 변형시키도록, 변형할 수 있다. 이들 핵산은 벡터, 발현 카세트, 프로모터 서열, 대상 유전자 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 친지성(lipophilicity)이 변형될 수 있으며, 그로 인해 이의 전달에 사용되는 시스템에 변화가 반영될 것이며, 일 구현예에서, 이러한 서열은 피부나 또는 이의 임의 층내에서 유지되거나 또는 이를 통과하는 것이 바람직하지에 따라 좌우될 수 있다. 이러한 고려사항은 기술된 방법 및 시스템에 있어서 본 발명에 사용되는 임의 화합물에 영향을 미칠 수 있다.
일 구현예에서, DNA는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 4가지 뉴클레오티드로부터 전체적으로 또는 부분적으로 화학 합성할 수 있다. 이러한 방법으로는 Caruthers (1985; Science 230:281-285)에 기술된 방법을 포함한다. 또한, DNA는 중첩되는 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 만들고, 갭을 메운 다음, 말단들을 연결하여 합성할 수 있다 (일반적으로, Sambrook et al. (1989; Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Habour Laboratory Press, New York 참조). 다른 구현예에서, 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 천연형 DNA로부터 불활성 돌연변이를 제조할 수 있다 (예, Zoller et al. (1982; DNA. 1984 Dec;3(6):479-88); Zoller (1983); 및 Zoller (1984; DNA. 1984 Dec;3(6):479-88); McPherson (1991; Directed Mutagenesis: A Practical Approach. Oxford University Press, NY 참조). 수득되는 DNA는 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 증폭시킬 수 있다. 적합한 한가지 방법은 Saiki et al. (1988; Science. 1988 Jan 29;239(4839):487-491), Mullis et al., 미국 특허4,683,195, 및 Sambrook et al. (1989)에 기술된 중합효소 연쇄 반응(PCR)이다.
구체적인 목적을 달성하기 위한 핵산의 변형 방법은, 당해 기술 분야, 예컨대 Sambrook et al. (1989)에 기술되어 있다. 또한, 본 발명의 핵산 서열은 대상 단백질을 코딩하지 않는 뉴클레오티드 서열의 한 부분 이상을 포함할 수 있다. 활성, 반감기 또는 이로부터 코딩된 폴리펩타이드의 생산을 강화하기 위해, 점 돌연변이나 유도성 변형 (삽입, 삭제 및 치환을 포함함)에 의해 초래되는, DNA의 서열 변이도, 본 발명에 포함된다.
본 발명의 제형은, 일 구현예에서, 핵산을 포함할 수 있으며, 또는 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 핵산이 벡터의 일부분인 상기 핵산의 전달을 포함할 수 있다.
개별 발현 벡터 시스템과 세포에 핵산을 도입하는 방법의 효율은 후술된 바와 같이 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 표준 방법으로 평가할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 또는 유전자의 단편 또는 유도체도 여전히 전체 야생형 유전자 또는 서열과 동일한 방식으로 기능할 수 있다. 이처럼, 핵산 서열의 형태는, 대상 단백질이나 펩타이드를 또는 이의 단편을 코딩하고 있음에도 불구하고, 천연형 서열과 비교하여 변이를 가질 수 있으며, 이러한 변이에도 불구하고 동일한 생물학적 효능을 보이는 천연형 기능을 유지할 수 있다. 이들 각각은 본 발명의 개별적인 구현예이다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 유전자 침묵 적용(gene silencing application)에 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 특정 유전자의 활성이나 기능은, 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드로 각각 이루어진 화학적으로 구분되는 2 이상의 영역을 포함하는, 키메라 분자인, 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 억제 또는 소실시킨다.
일 구현예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 영역을 포함하며, 상기 올리고뉴클레오타이트는, 뉴클레아제 분해에 대한 내성 증가, 세포로의 흡수 증가 및/또는 타겟 폴리뉴클레오티드에 대한 결합 친화성 증가를 올리고뉴클레오티드에 부여하도록, 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 부가적인 영역을 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소의 기질로서 제공할 수 있으며, 본 발명의 이러한 측면에서, 특이적인 서열의 분해를 통해 유전자를 침묵화하는 수단으로서 제공할 수 있다. RNA 타겟의 절단은 겔 전기영동이나, 필요하다면 당해 기술 분야에 공지된 조합된 핵산 혼성화 기법으로 통상적으로 검출할 수 있다.
키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 당해 기술 분야에 알려진 바와 같이, 일 구현예에서, 2 이상의 올리고뉴클레오티드 및/또는 변형된 올리고뉴클레오티드의 혼성 구조로서 만들어질 수 있으며 (예, 미국 특허 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 및 5,700,922 참조), 다른 구현예에서, 리보자임 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 유전자 발현의 서열-특이적인 저해를 제공하는 소형 간섭 RNA를 이용함으로써, 유전자 발현, 활성 또는 기능의 저해를 구현한다. 유기체에 하나의 유전자에 대응되는 이중가닥/이중 RNA(dsRNA)를 투여하면, 영향을 받은 세포에서의 mRNA의 신속한 분해에 의해 특정 유전자의 발현을 침묵화시킬 수 있다. 이러한 과정을 유전자 침묵화라고 하며, dsRNA는 특이적인 RNA 저해자(RNAi)로서 작용한다. RNAi는 내인성 바이러스 및 트랜스포존 활성에서와 같이 천연 소스로부터 유래될 수 있거나, 또는 세포로의 미세주입 (Fire et al. (1998) Nature 391 : 806-11) 또는 상보적인 RNA나 폴드-벡 (fold-back) RNA를 구축하는 유전자 구조체 또는 다른 벡터로 형질전환하여(Waterhouse, P.M., et al. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964 and Wang, Z., et al. (2000). J. Biol. Chem. 275, 40174-40179), 인공적으로 도입할 수 있다(Elbashir SM, et al (2001). Nature 411 :494-498). mRNA 분해를 매개하는 RNAi는, 일 구현예에서, 두겹 또는 이중 가닥 RNA를 포함하며, 또는 다른 구현예에서, 단일가닥 RNA, 분리된 RNA (부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 제조된 RNA) 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결손 및/또는 변형에 의해 천연적으로 생성되는 RNA와는 상이한 변형된 RNA를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법의 핵산은 치료 폴리펩타이드를 코딩한다. 일 구현예에서, 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드(즉, 아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기들로 이루어진 분자를 의미하며, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 공유 결합으로 연결된 아미노산으로 구성된 단일 체인 또는 다중 체인을 가질 수 있으며, 추가적으로 이황화 결합으로 이루어진 체인간 또는 체인내 연결을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 또한, 어떤 폴리펩타이드는 멀티유닛의 마크로분자 복합체의 서브유닛을 형성할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드가 구조적 선호성(conformational preference)을 가지고 있으며 3차 구조를 취할 것으로 예상될 수 있다. 구조적 선호성 및 3차 구조 둘다 폴리펩타이드의 1차 (즉, 아미노산) 서열 및/또는 이황화 결합 또는 공유 또는 비공유성 체인내 또는 체인간 상호작용의 존재 여부에 의해 통상 정해질 것이다.
일 구현예에서, 용어 "펩타이드"는 천연 펩타이드 (분해 산물, 합성에 의해 합성된 펩타이드 또는 재조합 펩타이드 중 어느 하나) 및/또는 펩타이드모방체 (전형적으로, 합성에 의해 합성된 펩타이드), 예컨대, 체내에서 펩타이드를 더욱 안정적이게 하거나 세포로의 보다 나은 침투력을 부여하는 변형을 가지고 있을 수 있는, 펩타이드의 유사체인 펩토이드와 세미펩토이드를 지칭한다. 이러한 변형으로는, N 말단 변형, C 말단 변형, 비제한적인 예로서 CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH, 벡본 변형 및 잔기 변형 등의 펩타이드 결합 변형이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 펩타이드모방성 화합물의 제조 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Quantitative Drug Design, CA. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)에 구체적으로 기재되어 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
펩타이드에서 펩타이드 결합(-CO-NH-)은, 예컨대, N-메틸화 결합 (-N(CH3)-CO-), 에스테르 결합 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), 케토메틸렌 결합 (-CO-CH2-), 아자 결합 (-NH-N(R)-CO-)으로 치환될 수 있으며, 이때 R은 임의의 알킬, 예컨대 메틸, 카르바 결합 (-CH2-NH-), 하이드록시에틸렌 결합 (-CH(OH)-CH2-), 티오아미드 결합 (-CS-NH-), 올레핀 이중 결합 (-CH=CH-), 레트로 아미드 결합 (-NH-CO-), 펩타이드 유도체 (-N(R)-CH2-CO-)이며, 여기에서 R은 탄소 원자에 본래 존재하는 "정상" 측쇄이다. 이러한 변형은 펩타이드 체인을 따라 임의 결합에서도, 심지어 동시에 여러 곳 (2-3)에서 이루어질 수 있다.
천연 방향족 아미노산인 Trp, Tyr 및 Phe는 TIC, 나프틸알라닌 (Nol), Phe의 고리-메틸화된 유도체, Phe의 할로겐화된 유도체 또는 o-메틸-Tyr 등의 비천연 합성 산으로 치환될 수 있다. 이외에도, 본 발명의 펩타이드는 하나 이상의 변형된 아미노산 또는 하나 이상의 아미노산이 아닌 단량체 (예, 지방산, 컴플렉스 탄수화물 등)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 용어 "아미노산" 또는 "아미노산들"은 20개의 자연적으로 생성되는 아미노산; 예컨대 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌 등의 생체내에서 종종 번역후 변형된 아미노산; 및 비제한적으로, 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 이소데스모신, 노르발린, 노르-루신 및 오르니틴 등의 그외 특수 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 용어 "아미노산"은 D- 및 L-아미노산 모두를 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "아미노산"은 구체적으로 다르게 언급되지 않는다면 아미노산의 D 또는 L 입체이성질체 중 한가지 형태를 지칭한다. 또한, 예컨대, 정제된 야생형 종양 억제자 단백질의 생물학적 활성을 가지고 있는, 등가의 단백질 또는 등가의 펩타이드도 본 발명에 포함되는 것으로 생각된다. "등가의 단백질" 및 "등가의 폴리펩타이드"는, 자연적으로 생성되는 단백질이나 폴리펩타이드의 선형 서열로부터 시작되지만, 생물학적 활성을 변형시키지 않는 아미노산 치환을 가진 화합물을 의미한다. 이들 등가체는, 하나 이상의 아미노산의 관련(related) 아미노산, 예를 들어, 유사하게 하전된 아미노산으로의 치환에 의해, 또는 측쇄나 관능기의 치환 또는 변형에 의해, 천연 서열과 다를 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 이를 코딩하는 DNA 서열은 원핵 또는 진행 생물의 세포 등의 다양한 천연 또는 비천연 소스로부터 수득할 수 있다. 일 구현예에서, 소스 세포는 야생형, 재조합 또는 돌연변이일 수 있다. 다른 구현예에서, 복수의 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 박테리아, 효모 또는 진균 등의 미생물, 바이러스, 동물 (포유류, 척추동물, 파충류, 조류 및 곤충이 포함됨), 또는 식물 세포에 내인성일 수 있다.
다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 비리온 입자의 표면 코트, 특정 세포 용해물(lysat), 조직 추출물 등의 보다 특정한 소스로부터 수득할 수 있거나, 또는 세포 막의 표면 상에 발현되는 폴리펩타이드로 제한될 수 있다.
다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 특정 세포나 조직 타입, 발생 단계, 질병 병태 또는 단계로부터 유래된다. 일 구현예에서, 질병 병태 또는 단계는 암이고, 다른 구현예에서, 질병 병태는 감염이고, 다른 구현예에서, HIV 감염이다. 다른 구현예에서, 질병 병태는 발달 장애이며, 다른 구현예에서, 질병 병태는 대사성 장애이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 임의 크기일 수 있다. 예상할 수 있는 바와 같이, 폴리펩타이드는 매우 다양한 분자량을 나타낼 수 있으며, 일부는 150 - 200 킬로달톤 (kD)을 초과할 수 있다. 전형적으로, 폴리펩타이드는 약 5,000 내지 약 100,000 달톤의 분자량 범위를 가질 수 있다. 다른 예로, 예컨대 약 10,000 - 약 75,000 달톤, 또는 약 20,000 - 약 50,000 달톤의 좁은 범위에 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 1-250개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 10-200개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 50-100개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 1-250개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 1-250개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 최대 크기는 이를 발현하는 벡터에 따라 결정되며, 일 구현예에서, 대략 20 - 37 kD, 20 - 25 kD, 25 - 30 kD, 30 - 37 kD, 또는 35 - 37 kD이다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 34 kD의 당단백질이다.
다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 작용제이다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 길항제이다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 항원이다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 효소이다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 효소의 활성제 또는 기타 기질이다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 효소의 저해제 또는 기타 기질이다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 호르몬이다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 조절 단백질이다. 조절 단백질은, 유전자의 발현과 복제, 효소의 성능, 세포와 이의 환경 간의 상호 작용, 및 그외 다수 현상을 관리하는, 수많은 상호작용을 지시한다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 세포골격 단백질이다. 세포골격 단백질은 세포에 대한 가요성 프래임워크를 형성하며, 기관과 형성된 바디(body)에 대한 접촉점을 제공하며, 가능한 세포 파트들 간에 교류를 형성한다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 톡신이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 치료 핵산은 하나 이상의 자살 유전자를 코딩한다.
다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 작용제, 길항제, 항원, 효소, 효소 활성제, 효소 저해제, 효소 기질, 호르몬, 조절 단백질, 세포골격 단백질 또는 톡신의 기능성 단편이다. "기능성 단편"은 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 나머지 부분이 심지어 없는 상태에서도 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 한가지 이상의 기능을 수행할 수 있는, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 일 부분을 지칭한다. 일 구현예에서, 기능성 단편은 대상 타겟과의 분자간 상호작용을 매개하는데 충분하다.
다른 구현예에서, 펩타이드는 DNA, RNA 또는 이의 단편에 결합한다. 일 구현예에서, DNA, RNA 결합성 펩타이드는 당해 기술 분야에 공지된 수많은 것들 중 어느 하나일 수 있으며, 그 예로는 β-β-α 징크 핑거 단백질, 핵 수용체 단백질, 루프-시트-나선 형의 단백질 및 GAL4 타입의 단백질 등의 징크 핑거 단백질; Cro 및 억제자 단백질, LacI 퓨린 억제자 단백질 (PurR), FokI 제한 엔도뉴클레아제 (DNA-인지 영역), 감마-델타 재조합효소 단백질 (C-말단 도메인), Hin 재조합효소 단백질, Trp 억제자 단백질, 디프테리아 tox 억제자, 이화 분해 산물 유전자 활성제 단백질 (CAP: catabolite gene activator protein), 호메오도메인 단백질, RAP1 단백질, Prd 쌍을 이룬 단백질, Tc3 트랜스포자제(transposase) 단백질, TFIIB 패밀리, 인터페론 조절 인자, 전사 인자 패밀리 및 ETS 도메인 패밀리 박테리오파지 등의 나선-턴-나선 단백질; 및 베이직 지퍼 단백질과 지퍼-타입의 단백질 (helix-loop-helix) 등의 루신 지퍼 단백질이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 구현예에서, DNA 또는 RNA 결합성 펩타이드는 Cre 재조합효소 패밀리, 파필로마바이러스-1 E2 단백질, 히스톤 패밀리, Ebna1 핵 단백질 패밀리, Skn-1 전사 인자, 고이동성 그룹 패밀리(high mobility group family) 및 MADS 박스 패밀리 등의 다른 α-나선 단백질; TATA 박스-결합 단백질 등의 β-시트 단백질; Met 억제자 단백질, Tus 복제 종결자 단백질, 삽입 숙주 인자 단백질 (integration host factor protein), 초고열성 DNA 결합 단백질, Arc 억제자, 전사인자 T 도메인 등의 β-헤어핀/리본 단백질; 및 Rel 상동성 영역 단백질과 Stat 패밀리 등의 그외 단백질 패밀리일 수 있다. 다른 구현예에서, DNA 또는 RNA 결합성 펩타이드는 메틸 트랜스퍼라제 단백질, PvuII 엔도뉴클레아제 단백질, 엔도뉴클레아제 V 단백질, EcoRV 엔도뉴클레아제 패밀리, BamHI 엔도뉴클레아제 패밀리, EcoRI 엔도뉴클레아제 패밀리, DNA 미스매치 엔도뉴클레아제, DNA 중합효소I 단백질, DNA 중합효소 T7, Dnase I 단백질, DNA 중합효소 β 단백질, Uraci-DNA 글리코실라제, 메틸아데닌-DNA 글리코실라제, Homing 엔도뉴클레아제, 및 토포이소머라제 I 등의 효소, 또는 HIV 역전사 등의 바이러스 단백질일 수 있다.
다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 전사 또는 번역 활성자이거나 이의 단편이다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 전사 또는 번역 억제자이거나 또는 이의 단편이다. 다른 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 수용체이거나 이의 단편이다.
일 구현예에서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 전술한 임의의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 동족(cognate) 펩타이드일 수 있다. "동족" 펩타이드는 다른 분자와 상호작용 및/또는 결합하는 임의의 펩타이드이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 재조합 유전자 산물은 대응되는 천연 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 변형된 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
단백질 외에도, 재조합 유전자 산물은 또한 기능성 RNA 분자를 포함할 수도 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 기능성 RNA 분자를 생성하는 미세-기관을 제공할 수 있다. 기능성 RNA 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열, 본원에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 리보자임 및 이에 융합된 리보자임 서열을 포함할 수 있다. 이러한 리보자임은 고상 올리고뉴클레오티드 합성을 이용하여 쉽게 합성가능하다.
리보자임은 대상 단백질을 코딩하는 mRNA를 절단함으로써 유전자 발현을 서열-특이적으로 저해하는데 있어 그 사용이 점점 증가하고 있다 [Welch et al, "Expression of ribozymes in gene transfer systems to modulate target RNA levels." Curr Opin Biotechnol. 1998 October; 9(5):486-96]. 임의의 특이적인 타겟 RNA를 절단하도록 리보자임을 설계할 수 있다는 점으로 인해, 기초 연구와 치료 적용 둘다에서 유용한 도구가 된다. 치료 영역에서, 리보자임은 감염성 질환, 암에서 우성의 온코진 및 유전적 장애에서의 특이적인 상염색체 돌연변이에서 바이러스 RNA를 타겟화하는데 이용되고 있다 [Welch et al., "Ribozyme gene therapy for hepatitis C virus infection." Clin Diagn Virol. JuI. 15, 1998; 10(2- 3): 163-71]. 특히, HIV 환자에 대한 몇가지 리보자임 유전자 요법 프로토콜들이 벌써 1상 임상 시험 중에 있다. 최근 들어, 리보자임은 형질전환 동물 연구, 유전자 타겟 검증(validation) 및 경로 파악에 이용되고 있다. 몇가지 리보자임은 다양한 단계의 임상 시험 중에 있다. ANGIOZYME은 인간 임상 시험을 통해 연구되고 있는 화학 합성된 최초의 리보자임이다. ANGIOZYME은 혈관신생 경로에 중요한 요소인 VEGF-r (Vascular Endothelial Growth Factor receptor)의 형성을 특이적으로 저해한다. Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 사와 기타 회사에서, 동물 모델을 통해 항-혈관신생 치료제의 중요성을 입증한 바 있다. HEPTAZYME은 선택적으로 C형 간염 바이러스(HCV) RNA를 파괴하도록 고안된 리보자임으로, 세포 배양 분석에서 C형 간염 바이러스 RNA를 줄이는데 효과적으로 것으로 확인되었다.
전술한 바와 같이, 일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 치료 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 치료 제형을 제공한다. 일 구현예에서, 용어 "치료"는 필요한 개체에게 제공되었을 때 유익한 효과를 제공하는 분자를 지칭된다. 일부 경우들에서, 분자는 개체에서 이들 분자의 부재 또는 존재 감소를 대체하도록 작용한다는 점에서, 치료성이다. 일 구현예에서, 치료 단백질은 필요한 단백질의 내인성 null 또는 미스-센스 돌연변이를 가진 개체의 경우에서와 같이, 개체에 존재하지 않는 단백질이다. 다른 구현예에서, 내인성 단백질은 돌연변이되어, 기능성 단백질의 제시에 의해 상쇄되는 비-기능성 단백질을 생산한다. 다른 구현예에서, 이종 단백질의 발현은 낮은 내인성 수준에 상가적(additive)이며, 해당 단백질의 발현은 누적적으로 증가된다. 다른 구현예에서, 분자는 숙주나 세포의 기능 발휘에 중요한 요소들 이외의 발현 또는 분비를 제공하는 시그널링 케스케이드를 자극한다.
일 구현예에서, 용어 "치료 제형"은 질병, 장애, 병태 또는 감염의 진단, 또는 다른 구현예에서, 치유, 또는 다른 구현예에서, 완화, 또는 다른 구현예에서, 치료, 또는 다른 구현예에서, 예방 용도로 이용가능한 물질을 의미한다. 일 구현예에서, 본 발명의 "치료 제형"은 적용되는 타겟의 구조나 기능에 영향을 미치는 임의 물질을 나타낸다.
다른 구현예에서, 본 발명의 "치료 제형"은 질병이나 장애를 앓고 있는 개체에 투여하였을 때 증상을 완화하는 분자이다. 일 구현예에서, 본 발명의 "치료 제형"은 합성 분자, 또는 다른 구현예에서, 자연에서 발견되는 소스로부터 분리되는 천연 생성 화합물이다.
일 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 에리트로포이에틴이다. 일 구현예에서, 에리트로포이에틴에 의해 제공되는 유익한 효과는 Hb 수준 증가이다. 일 구현예에서, 에리트로포이에틴에 의해 제공되는 유익한 효과는 빈혈 치료이다.
다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 인터페론 α이고, 일 구현예에서, 인터페론 α2b이다. 일 구현예에서, 상기 치료 폴리펩타이드는 다른 임의의 치료 폴리펩타이드이다.
일 구현예에서, "치료(treatment)"는 치료학적 처리(therapeutic treatment) 및 예방학적 또는 예방적 처지 둘다를 의미하며, 목적은 전술한 바와 같이 표적화된 병리학적 병태나 장애를 방지하거나 약화시키기 위한 것이다. 따라서, 일 구현예에서, 치료는 질병, 장애, 병태 또는 이의 조합과 관련있는 증상에 대한 직접적인 영향, 또는 치유, 억제, 저해, 예방, 중증도 감소, 개시 지연, 경감을 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, "치료"는 특히 진행 지연, 감퇴 촉진, 감퇴 유도, 감퇴 증대, 회복 가속화, 효능 증가 또는 대체 치료제에 대한 내성 감소, 또는 이의 조합을 지칭한다. 일 구현예에서, "예방"은 특히 증상의 개시 지연, 질병의 재발 방지, 재발 횟수 또는 빈도 감소, 증상 발병 간에 잠복기 증가, 또는 이의 조합을 지칭한다. 일 구현예에서, "억제" 또는 "저해"는 특히 증상의 중증도 감소, 갑작스러운 발병의 중증도 감소, 증상의 횟수 감소, 질병-관련 증상의 발병 감소, 증상의 잠복성 감소, 증상의 완화, 이차 증상의 감소, 이차 감염의 감소, 환자 생존성 연장 또는 이의 조합을 지칭한다.
일 구현예에서, 증상은 일차 증상이며, 다른 구현예에서, 이차 증상이다. 일 구현예에서, "일차"는 특정 질환으로 인한 직접적인 결과인 증상을 의미하고, 또는 일 구현예에서, "이차"는 일차 원인으로부터 유래되거나 그 결과로서 발생되는 증상을 의미한다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 화합물은 상기 질환과 관련있는 일차 또는 이차 증상, 또는 이차적인 합병증을 치료한다. 다른 구현예에서, "증상"은 질병이나 병리학적 병태의 임의 발현일 수 있다.
일 구현예에서, 치료 핵산은, 일 구현예에서, 효소, 효소 조인자, 세포독성 단백질, 항체, 채널 단백질, 트랜스포터 단백질, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 수용체, 뮤신, 계면활성제, 앱타머 또는 호르몬을 포함할 수 있는, 치료 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 전술한 바와 같이 한가지 이상의 카테고리에 속하는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 치료 핵산은 후술되는 바와 같이 기능성 RNA를 코딩할 수 있다.
일 구현예에서, 용어 "항체 또는 항체 단편"은 온전한 항체 분자 뿐만 아니라 에피토프에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')2, 및 Fv 등의 이의 기능성 단편을 지칭한다. 일 구현예에서, Fab 단편은, 효소 파파인으로 전체 항체를 분해하여 온전한 경쇄와 하나의 중쇄의 단편을 수득함으로써 제조할 수 있는, 항체 분자의 일가 항원 결합성 단편을 포함하는 단편을 지칭한다. 일 구현예에서, Fab' 단편은 전체 효소를 펩신 처리한 다음 환원시켜, 온전한 경쇄와 중쇄의 단편을 수득함으로써 제조할 수 있는, 항체 분자의 단편을 의미한다. 하나의 항체 분자 당 2개의 Fab' 단편을 수득할 수 있다. 일 구현예에서, (Fab')2는 전체 항체를 효소 펩신으로 처리한 다음 이후의 환원 공정 없이 수득할 수 있는 항체 단편을 의미한다. 다른 구현예에서, F(ab')2는 2개의 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편으로 이루어진 이량체이다. 일 구현예에서, Fv는 경쇄의 가변부와 2개의 체인으로 발현되는 중쇄의 가변부를 포함하는 유전자 조작된 단편을 지칭한다. 일 구현예에서, 항체 단편은, 단쇄 항체 ("SCA"), 즉, 유전자 융합된 단일쇄 분자로서 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 경쇄의 가변부와 중쇄의 가변부를 포함하는 유전자 조작된 분자일 수 있다.
이들 단편의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (예, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
일 구현예에서, 항체는, 다른 구현예에서, 항체의 파라토프(paratope)에 결합하는 항원 상의 항원 결정기 (antigenic determinant)를 지칭하는, 에피토프를 인지할 것이다. 에피토프 결정기는, 다른 구현예에서, 아미노산이나 탄수화물 측쇄 등의 화학적으로 활성인 표면 분자의 그룹핑으로 구성될 수 있으며, 다른 구현예에서, 특이적인 3차 구조 특징을 가질 수 있으며, 및/또는 다른 구현예에서, 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 인지되는 에피토프는, 병원체, 또는 다른 구현예에서, 병원성 세포, 또는 다른 구현예에서, 발현의 위치, 양 또는 이의 조합을 다른 구현예에서 지칭할 수 있는, 비정상적으로 발현되는 단백질 유래이다.
항체 단편의 다른 형태는 단일 상보성 결정부 (CDR)를 코딩하는 펩타이드이다. CDR 펩타이드 ("최소 인지 단위")는 대상 항체의 CDR을 코딩하는 유전자를 구축함으로써 수득할 수 있다. 이러한 유전자는, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응을 이용하여, 항체 생산 세포의 RNA로부터 가변부를 합성함으로써 제조된다. 예로, Larrick and Fry, Methods, 2: 106-10, 1991을 참조한다.
일 구현예에서, 항체는 종양치사제 (tumoricidal)이며, 따라서 특정 암에 대한 치료제이다. 종양치사 활성을 가진 항체는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, IMC-C225, EMD 72000, OvaRex Mab B43.13, 항-강글리오사이드 G(D2) 항체 ch14.18, CO17-1A, 트라스투주맵(trastuzumab), rhuMAb VEGF, sc-321, AF349, BAF349, AF743, BAF743, MAB743, AB1875, 항-Flt-4AB3127, FLT41-A, 리툭시맵(rituximab), 2C3, CAMPATH 1H, 2G7, Alpha IR-3, ABX-EGF, MDX-447, 항-p75 IL-2R, 항-p64 IL-2R, 및 2A11 등이 있으며, 이의 임의 사용은 본 발명의 구현예일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 "치료 핵산"은 항고혈압제(antihypertensives), 항우울제(antidepressants), 항불안제(antianxiety agent), 항응고제(anticlotting agent), 항경련제(anticonvulsants), 혈당 강하제(blood glucose-lowering agent), 소염제(decongestants), 항히스타민제(antihistamines), 진해제(antitussive), 항염증제(anti-inflammatory), 항정신병제(antipsychotic agent), 인지 강화제(cognitive enhancer), 콜레스테롤 저하제(cholesterol-reducing agent), 항비만제(antiobesity agent), 자가면역 장애제(autoimmune disorder agent), 항-발기부전제(anti-impotence agent), 항세균제, 항진균제, 최면제(hypnotic agent), 항파킨슨제(anti-Parkinsonism agent), 항생제, 항바이러스제, 항종양제(anti-neoplasty), 바르비투레이트(barbituate), 진정제, 영양제, β 차단제, 구토제, 항-구토제, 이뇨제, 항응고제(anticoagulant), 강심제(cardiotonic), 안드로겐, 코르티코이드, 동화제(anabolic agent), 성장 호르몬 분비 촉진제(growth hormone secretagogue), 항감염제, 관상 혈관확장제(coronary vasodilator), 탄산탈수효소 저해제(carbonic anhydrase inhibitor), 항원충제(antiprotozoal), 위장제(gastrointestinal agent), 세로토닌 길항제, 마취제, 혈당강하제(hypoglycemic agent), 도파민제(dopaminergic agent), 항-알츠하이머제(anti-Alzheimer's Disease agent), 항궤양제(anti-ulcer agent), 혈소판 저해제 및 글리코젠 포스포릴라제 저해제를 코딩하거나, 또는 "치료 폴리펩타이드"는 이로서 제공되는 분자일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 "치료 제형"은 항세균제, 항바이러스제, 항진균제 또는 항원충제이다. 다른 구현예에서, 치료 제형은 세포독성이나 항암 활성을 가진다. 다른 구현예에서, 치료 제형은 면역자극성이다. 다른 구현예에서, 치료 제형은 염증이나 면역 반응을 저해한다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 인터페론 또는 인터루킨 등의 사이토카인, 또는 이의 수용체를 코딩하거나, 또는 치료 폴리펩타이드는 인터페론 또는 인터루킨 등의 사이토카인, 또는 이의 수용체일 수 있다. 사이토카인 또는 적정 물질의 발현 결핍은 질병의 감수성과 관련있으며, 발현이 강화되면 다수의 감염에 대해 내성을 유도할 수 있다. 사이토카인의 발현 패턴은, 예컨대, 감염 또는 자가면역 질환에서 Th1 타입의 발현 패턴 또는 Th2 타입의 발현 패턴으로 면역 반응을 편향되게 하는 등과 같은, 유익한 효과를 형성하도록 변형될 수 있으며, 발현 패턴 변형은 숙주에게 유익한 것으로 입증될 수 있다.
다른 구현예에서, 치료 핵산은 글리코젠의 저장 또는 분해에 관여하는 효소 등의 효소를 코딩하거나, 또는 치료 폴리펩타이드는 상기 효소일 수 있다. 다른 구현예에서, 치료 단백질은, 이온 트랜스포터, 예컨대 CFTR, 또는 글루코스 트랜스포터, 또는 이의 결핍 또는 부적절한 발현으로 다양한 질환이 발병하는 그외 트랜스포터 등의, 트랜스포터를 포함한다.
다른 구현예에서, 치료 핵산은, 암 관련 병태의 진행을 변형시키는, 종양 억제자 또는 프로-세포자살 화합물을 코딩하거나, 또는 치료 폴리펩타이드는 상기한 종양 억제자 또는 프로-세포자살 화합물이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 치료 핵산은 면역조절성 단백질을 코딩할 수 있거나, 또는 치료 폴리펩타이드는 상기 면역조절성 단백질일 수 있다. 일 구현예에서, 면역조절성 단백질은 사이토카인, 케모카인, 보체 또는 구성 성분, 예컨대, 인터루킨 1 - 15, 인터페론 α, β 또는 γ, 종양 괴사 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 호중구 활성화 단백질(NAP) 등의 케모카인, 대식세포 화학유인제 및 활성화 인자(MCAF), RANTES, 대식세포 염증 펩타이드 MIP-1a 및 MIP-1b, 또는 보체 성분을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 치료 핵산은 성장 인자 또는 조직-촉진 인자를 코딩하거나, 또는 치료 폴리펩타이드는 상기 성장 인자 또는 조직-촉진 인자일 수 있다. 일 구현예에서, 치료 화합물은 골 구조형성 단백질(bone morphogenetic protein), 또는 OP-1, OP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-9, DPP, Vg-1, 60A, 또는 Vgr-1이다. 다른 구현예에서, 치료 핵산은 신경 재생 또는 회복을 촉진하는 RNA 또는 펩타이드를 코딩하며, NGF 또는 그외 성장 인자를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 신경 재생 또는 회복을 촉진하며, NGF 또는 그외 성장 인자를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 치료 핵산은 천연 또는 비천연 인슐린, 아밀라제, 프로테아제, 리파제, 키나제, 포스파타제, 글리코실 트랜스퍼라제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카르복시펩티다제, 호르몬, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아실글리세롤 리파제, 포스포리파제 A2, 엘라스타제, 아밀라제, 혈액 응고 인자, UDP 글루쿠로닐 트랜스퍼라제, 오르니틴 트랜스카르바모일라제, 시토크롬 p4502 효소, 아데노신 탈아민효소, 혈청 흉선 인자, 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor), 티모포이에틴(thymopoietin), 성장 호르몬, 소마토메딘(somatomedin), 공동자극 인자(costimulatory factor), 항체, 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 상피 성장 인자, 간의 에리트로포이에틴 인자(헤파토포이에틴), 간세포 성장 인자, 인터루킨, 인터페론, 네거티브 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, α 패밀리의 형질전환성 성장 인자(transforming growth factor), β 패밀리의 형질전환성 성장 인자(transforming growth factor), 게스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 소마토스타틴, 세로토닌, 물질 P, 전사 인자 또는 이의 조합을 코딩하거나, 또는 치료 폴리펩타이드는 상기한 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 유전자는 리포터 유전자이다. 일 구현예에서, 리포터 유전자는 플루오레센트 단백질을 코딩한다. 일 구현예에서, 상기 플루오레센트 단백질은 yECitrine 또는 옐로우 플루오레센트 단백질이다. 일 구현예에서, 플루오레센트 단백질은 해파리 그린 플루오레센트 단백질, 또는 이의 돌연변이 또는 변이체이다. 다른 구현예에서, GMMO는 리포터 유전자 또는 리포터 단백질을 코딩하는 유전자 이외의 임의의 유전자를 특이적으로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 리포터 유전자는 약물 내성을 부여한다. 일 구현예에서, 리포터 유전자는, 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 예컨대 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린 등의 항생제에 대해 내성을 부여한다. 다른 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 네오마이신(neo), 블라스티시딘, 스펙티노마이신, 에리트로마이신, 플레오마이신, Tn917, 겐타마이신 및 블레오마이신에 대해 내성을 부여하는 것을 포함할 수 있다. 네오마이신 내성 유전자의 예로는, G418 및 카나마이신 등의, 다양한 항생제에 대해 내성을 부여하는, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 11을 코딩하는, 트랜스포존 Tn5의 네오마이신 내성 유전자가 있다. 다른 구현예에서, 리포터는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(cat)이고, 이는 클로람페니콜에 대해 내성을 부여한다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 바이러스 감염, 또는 다른 구현예에서, 박테리아, 원충 또는 진균 감염이나 이의 조합에 대한 예방 또는 치료적 개입(therapeutic intervention)을 위한 것이다.
본 발명의 이러한 측면에서, 본 발명의 제형 및 방법은 질병의 예방 또는 치료적 개입을 위한 것이다. 일 구현예에서, 그에 따라 개체에서 치료되는 질환으로는, 근 위축증, 암, 심혈관 질환, 고혈압, 감염, 신장병, 신경퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 무도병, 크레츠펠트-야콥병, 자가면역 질환, 예컨대 루푸스, 류마티스 관절염, 심내막염, 그레이브 질환 또는 ALD, 호흡기 질환, 예컨대 천식 또는 낭성 섬유증, 골 질환, 예컨대 골다공증, 관절 질환, 간 질환, 피부병, 예컨대 건선 또는 습진, 안 질환, 이비인후과 질환, 그외 신경성 질환, 예컨대 튜렛 증후군, 정신분열증, 우울증, 자폐증 또는 발작, 또는 대사 질환, 예컨대 글리코겐 저장 질병 또는 당뇨병을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특정 단백질의 발현, 치료 단백질의 제시, 약물의 제시, 특정 단백질의 발현 저해 등이 본 발명의 제형을 통해 그리고 본 발명의 방법에 따라 달성될 수 있는, 임의 질환들은 본 발명의 일부분으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 미세-기관의 세포에 도입되는 핵산 분자는 핵산에 의해 코딩된 유전자 산물을 세포내에서 발현하기에 적합한 형태이다. 따라서, 일 구현예에서, 핵산 분자는 유전자의 전사에 필요한 조절 서열과 코딩 서열 (또는 이의 일부)을 포함한다. 유전자 산물이 단백질 또는 펩타이드인 경우, 핵산 분자는 핵산 분자의 번역에 필요한 조절 서열과 코딩 서열을 포함하며, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 코딩된 단백질 또는 펩타이드의 수송에 필요한 서열, 예컨대 단백질 또는 펩타이드를 세포 표면으로 수송 또는 일 구현예에서, 분비하기 위한 N-말단 신호 서열을 포함한다.
유전자 산물의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 서열 (예, 프로모터 및 인핸서 서열)은 유전자 산물이 발현되는 세포 타입과 유전자 산물의 원하는 발현 수준에 따라 선택된다. 예컨대, 프로모터에 연결된 유전자의 세포 타입 특이적인 발현을 부여하는 것으로 공지된 프로모터를 사용할 수 있다. 근원세포(myoblast) 유전자 발현에 특이적인 프로모터를 대상 유전자에 연결하여, 유전자 산물의 근육 특이적인 발현을 부여할 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 근육 특이적인 조절 요소로는, 디스트로핀(dystrophin) 유전자 (Klamut et al., (1989) Mol. Cell Biol.9:2396), 크레아틴 키나제 유전자 (Buskin and Hauschka, (1989) Mol. Cell Biol. 9:2627) 및 트로포닌 유전자 (Mar and Ordahl, (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA. 85:6404)의 상류 영역을 포함한다. 케라틴 유전자내 네거티브 반응 요소들은 전사 억제를 매개한다 (Jho Sh et al, (2001). J. Biol Chem). 다른 세포 타입에 특이적인 조절 요소들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (예, 간 특이적인 발현을 위한 알부민 인핸서; 췌장 섬세포에서 특이적인 발현을 위한 인슐린 조절 요소; 신경 디스트로핀, 신경 에놀라제 및 A4 아밀로이드 프로모터 등의, 다양한 신경 세포 특이적인 조절 요소). 다른 예로, 다양한 세포 타입들에서 유전자의 구성적인 발현(constitutive expression)을 지시할 수 있는, 바이러스 조절 요소 등의 조절 요소를 사용할 수 있다. 유전자 발현을 추진하기 위해 일반적으로 사용되는 바이러스 프로모터의 예로는, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된 프로모터, 및 레트로바이러스 LTR이 있다. 다른 예로, 이에 연결된 유전자의 유도성 발현을 제공하는 조절 요소를 사용할 수 있다. 유도성 조절 요소 (예, 유도성 프로모터)의 사용은 세포에서 유전자 산물의 생산을 조절할 수 있다. 진핵 세포에서 이용하기 위한 잠재적으로 유용한 유도성 조절 시스템의 예로는 호르모-조절 요소 (예, Mader, S. and White, J. H. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90:5603-5607), 합성 리간드-조절 요소 (예, Spencer, D. M. et al 1993) Science 262:1019-1024) 및 이온 방사성(ionizing radiation)-조절 요소 (예, Manome, Y. Et al. (1993) Biochemistry 32:10607-10613; Datta, R. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:1014-10153)를 포함한다. 개발될 수 있는 부가적인 조직 특이적인 또는 유도성 조절 시스템을 본 발명에 따라 사용할 수도 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조절 서열은 CMV 프로모터를 포함하며, 다른 구현예에서, 조절 서열은 CAG 프로모터를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, CAG 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스 최초기 인핸서, 변형된 닭 β-액틴 프로모터 및 첫번째 인트론이 조합된, 복합 프로모터이다. 일 구현예에서, 조절 서열은, 일 구현예에서, 대부분의 메신저 RNA가 진핵 생물에서 3' 말단에서 종결되는 기전인, 시미안 바이러스 (SV)-40 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리아데노신(poly-A) 꼬리는 mRNA를 엑소뉴클레아제로부터의 보호, 전사 종결, 핵으로부터 mRNA의 방출 및 번역에 중요하다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제형은 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, SV40 폴리아데닐화 서열과 함께 연결되는 CMV 또는 CAG 프로모터를 포함하는 본 발명의 제형은, EPO 및 IFN-α를 장기간 시험관내 (도 1, 5 및 6B) 및 생체내 (도 6A)에서 높은 수준으로 발현하는 것으로 확인되었다. 이론으로 결부되지 않으나, 본 발명의 미세-기관으로부터 유전자 산물의 장기적으로 지속적인 고수준의 발현에 기여할 수 있는 한가지 인자는, CMV를 사용하는 것이거나, 또는 다른 구현예에서, 구성적인 유전자 발현을 촉진시키는데 있어 미세-기관 외식편에 특히 효과적일 수 있는 CAG를 프로모터로서 사용하는 것이다.
일 구현예에서, 용어 "프로모터"는, 일 구현예에서, 코딩 서열의 바로 상류에 위치하며, 유전자의 기본 및/또는 조절된 전사에 중요한, DNA 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 본 발명의 프로모터는 대상 유전자와 작동가능하게 연결된다. 다른 구현예에서, 상기 프로모터는, 정상적으로는 적절한 조건하에 대상 유전자의 발현과 조합되어 있는, 내인성 프로모터의 돌연변이이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물의 프로모터 및 방법에 사용하기 위한 프로모터는 조절가능한 프로모터이다. 다른 구현예에서, 조절가능한 프로모터는, 유전자 하류의 발현이 특정 프로모터로부터 발현을 자극하는 특정 조건의 형성 또는 제시에 의해 이루어지게 하는 프로모터를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이러한 조건은 발현을 직접 작동시키는 결과를 발생시키거나, 또는 다른 구현예에서, 발현에 대한 장해를 제거한다. 일부 구현예에서, 이러한 조건은 발현을 작동 중지시키거나 또는 발현을 감소시킨다.
일 구현예에서, 이러한 조건은, 당업자에게 공지되는 바와 같이, 특정 온도, 영양물질, 영양물질의 부재, 금속의 존재 또는 그외 자극이나 환경 인자를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 조절가능한 프로모터는 갈락토스 (예, UDP-갈락토스 에피머라제(GAL1O), 갈락토키나제(GAL1)), 글루코스(예, 알코올 데하이드로게나제 II(ADH2)), 또는 포스페이트(예, 산 포스파타제(PHO5))에 의해 조절될 수 있다. 다른 구현예에서, 조절가능한 프로모터는 열 충격(열 충격 프로모터) 또는 IPTG 또는 테트라사이클린 등의 당해 기술 분야에 공지된 바와 같은 화합물에 의해 활성화될 수 있다. 모든 조절가능한 프로모터와 이러한 조절을 하기 위한 조건은 본 발명의 벡터, 핵산 및 방법에 포함되는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 일 구현예에 해당된다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 수준을 기저 수준 보다 5% 이상 증가시킨다. 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 수준은 7% 이상 증가되며, 다른 구현예에서, 10% 이상, 다른 구현예에서, 15% 이상, 다른 구현예에서, 20% 이상, 다른 구현예에서, 25% 이상, 다른 구현예에서, 30% 이상, 다른 구현예에서, 40% 이상, 다른 구현예에서, 50% 이상, 다른 구현예에서, 60% 이상, 다른 구현예에서, 75% 이상, 다른 구현예에서, 100% 이상, 다른 구현예에서, 125% 이상, 다른 구현예에서, 150% 이상, 다른 구현예에서, 200% 이상으로 증가된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 투여시 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 수준을 증가시키며, 이때 상기 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 수준은 다시 기저 수준 또는 거의 기저 수준으로 회복된다. 일 구현예에서, 기저 수준 또는 거의 기저 수준으로의 회복은 상기 치료 펩타이드 또는 핵산의 투여 후 1달 이내에 이루어진다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형을 통해, 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 발현은 "기저 수준"에 비해 증가되며, 일 구현예에서, 상기 기저 수준은 본 발명의 치료 제형과 접촉되거나 또는 투여받은 적 없는 세포 배양물 또는 숙주에서 발현되는 유전자의 수준이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 수준을 대략 2000 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 1500 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 1000 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 750 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 500 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 250 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 150 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 100 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 75 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 50 ng/일로, 또는 다른 구현예에서, 25 ng/일로 증가시킨다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 치료 폴리펩타이드의 수준을 20-70 mU/mL로, 또는 다른 구현예에서, 50-100 mU/mL로, 또는 다른 구현예에서, 5-20 mU/mL로, 또는 다른 구현예에서, 100-200 mU/mL로, 또는 다른 구현예에서, 10-70 mU/mL로, 또는 다른 구현예에서, 5-80 mU/mL로 증가시킨다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 치료 폴리펩타이드의 수준을 500-1000 mU/mL로, 또는 다른 구현예에서, 250-750 mU/mL로, 또는 다른 구현예에서, 500-5000 mU/mL로 증가시킨다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 기능성 마커의 수준, 일 구현예에서, 헤마토크릿 수준을 기저 수준 대비 5% 이상으로 증가시킨다. 다른 구현예에서, 기능성 마커의 수준은, 기저 수준 대비, 7% 이상, 다른 구현예에서, 10% 이상, 다른 구현예에서, 15% 이상, 다른 구현예에서, 20% 이상, 다른 구현예에서, 25% 이상, 다른 구현예에서, 30% 이상, 다른 구현예에서, 40% 이상, 다른 구현예에서, 50% 이상, 다른 구현예에서, 60% 이상, 다른 구현예에서, 75% 이상, 다른 구현예에서, 100% 이상, 다른 구현예에서, 125% 이상, 다른 구현예에서, 150% 이상, 다른 구현예에서, 200% 이상 증가된다.
일 구현예에서, 본 발명의 치료 제형은, 일 구현예에서, 치료 폴리펩타이드나 핵산의 분비, 발현, 생산, 순환 또는 지속성을 증가시킬 수 있는 제형을 지칭하는, "장기 지속형" 제형이다. 일 구현예에서, 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 발현 수준은 적어도 1달, 또는 다른 구현예에서, 적어도 6달 동안 기저에 비해 증가된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 치료 제형은 기능성 마커의 분비, 발현, 생산, 순환 또는 지속성을 증가시킬 수 있는 제형을 지칭하는, "장기 지속형" 제형이다. 일 구현예에서, 상기 기능성 마커는 헤마토크릿(hematocrit)이다. 다른 구현예에서, 상기 기능성 마커는 Hb이다. 또 다른 구현예에서, 상기 기능성 마커, 예컨대 헤마토크릿 또는 Hb의 수준은, 최소 2주, 다른 구현예에서, 최소 3주, 다른 구현예에서, 최소 4주, 다른 구현예에서, 최소 5주, 다른 구현예에서, 최소 6주, 다른 구현예에서, 최소 8주, 다른 구현예에서, 최소 2달, 다른 구현예에서, 최소 3달, 다른 구현예에서, 최소 4달, 다른 구현예에서, 최소 5달, 다른 구현예에서, 최소 7달, 다른 구현예에서, 최소 8달, 다른 구현예에서, 최소 9달, 다른 구현예에서, 최소 10달, 다른 구현예에서, 최소 11달, 다른 구현예에서, 최소 1년간, 증가된다. 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 발현 수준은 적어도 4-6달간 증가된다.
일 구현예에서, 치료 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 또는 핵산 서열은 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 발현 수준 증가나, 또는 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 지속 기간 연장, 또는 다른 구현예에서, 이의 조합을 위해 최적화된다.
일 구현예에서, 용어 "최적화"는 바람직한 변화, 일 구현예에서, 유전자 발현, 다른 구현예에서, 단백질의 발현 변화를 의미한다. 일 구현예에서, 최적화된 유전자 발현은 유전자 발현의 최적화된 조절이다. 다른 구현예에서, 최적화된 유전자 발현은 유전자의 발현 증가이다. 이러한 측면과 일 구현예에 있어서, 야생형과 비교하여 유전자 발현의 2배 내지 1000배 증가가 고려된다. 다른 구현예에서, 유전자 발현의 2배 내지 500배 증가, 다른 구현예에서, 유전자 발현의 2배 내지 100배 증가, 다른 구현예에서, 유전자 발현의 2배 내지 50배 증가, 다른 구현예에서, 유전자 발현의 2배 내지 20배 증가, 다른 구현예에서, 유전자 발현의 2배 내지 10배 증가, 다른 구현예에서, 유전자 발현의 3배 내지 5배 증가가 고려된다.
다른 구현예에서, 최적화된 유전자 발현은 특정 환경 조건에서의 유전자 발현 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 최적화된 유전자 발현은, 일 구현예에서, 특정 환경 조건하에서만 이루어질 수 있는, 유전자 발현의 감소를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 최적화된 유전자 발현은 유전자의 발현 지속 기간 연장이다. 상기한 측면과 일 구현예에 있어서, 유전자의 발현 지속 기간은 야생형과 비교하여 2배 내지 1000배로 증가된다. 다른 구현예에서, 유전자의 발현 지속기간은 2배 내지 500배 증가, 다른 구현예에서, 유전자의 발현 지속기간은 2배 내지 100배 증가, 다른 구현예에서, 유전자의 발현 지속기간은 2배 내지 50배 증가, 다른 구현예에서, 유전자의 발현 지속기간은 2배 내지 20배 증가, 다른 구현예에서, 유전자의 발현 지속기간은 2배 내지 10배 증가, 다른 구현예에서, 유전자의 발현 지속기간은 3배 내지 5배 증가된다. 다른 구현예에서, 유전자의 발현 지속 기간 증가는 비-벡터-발현성 대조군에서의 유전자 발현을 기준으로 한 것이거나, 또는 야생형-벡터-발현성 대조군에서의 유전자 발현을 기준으로 한 것이다.
포유류 세포에서의 발현은, 일 구현예에서, 전사 침묵화, mRNA의 짧은 반감기, 얼터네이티브 스플라이싱 현상, 미성숙 폴리아데닐화, 비효율적인 핵 전위 및 희귀 rRNA 풀의 이용가능성에 의해 방해받는다. 포유류 발현에서 다수 문제점들의 원천은 많은 주요 포유류 유전자의 자가 발현에 포함되는 트랜스유전자를 코딩하는 메세지에서 확인된다. 포유류 RNA의 최적화는 cis 작용 요소의 변형, 이의 GC 함량의 순응(adaptation), 포유류 세포의 비제한적인 tRNA 풀과 관련있는 코돈 편향성 변경, 서로간 상동적인 영역의 회피 및 RNAi의 배제를 포함할 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 정교하게 설계된 합성 유전자에 따라, 반감기가 긴 안정적인 메세지, 구성적인 핵 배출 및 포유류 숙주내에서의 고수준의 단백질 생산을 예측할 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 유전자의 최적화는, 숙주 유전자, 일 구현예에서, 호모사피엔스의 유전자의 코돈 편향성에 맞게 코돈 용법(codon usage)을 적용하고; GC 함량이 매우 높거(> 80%)나 매우 낮은(< 30%) 영역을 조정하고; 하기 cis-작용성 서열 모티프 중 1종 이상을 회피 설계하는 것을 수반한다: 내부 TATA 박스, chi-부위와 리보좀 도입부; AT-rich 또는 GC-rich 서열 가닥(sequence stretch); ARE, BMS, CRS 서열 요쇠 반복 서열 및 RNA 2차 구조; (숨겨진(cryptic)) 스플라이스 도너 및 어셉터 부위, 분지 부위(branch point); 또는 이의 조합. 일 구현예에서, 유전자는 호모 사피엔 세포에서의 발현에 맞게 최적화된다. 다른 구현예에서, 유전자는 미세-기관에서의 발현에 대해 최적화된다. 또 다른 구현예에서, 유전자는 진피 세포에서의 발현에 대해 최적화된다. 또 다른 구현예에서, 유전자의 발현 최적화는 유전자의 측면 부위에 및/또는 발현 벡터의 도처에 서열 인자의 부가를 수반한다. 유전자의 발현을 최적화하기 위해 부가될 수 있는 서열 인자로는, 예를 들어, 매트릭스-부착 영역 (MAR), 특수 크로마틴 구조 (SCS) 및 우드척 간염 전사 후 규제 인자 (WPRE: woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element)를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, EPO와 같은 최적화된 유전자는 gutless 아데노바이러스 벡터로부터 발현되는 비-최적화된 EPO 또는 아데노바이러스 5 벡터로부터 발현되는 비-최적화된 EPO 둘다와 비교하여, 장기간 증가되는 피크 발현율을 유지한다(도 3 및 4).
일 구현예에서, 용어 "유전자"는 코딩 서열 앞에 위치한 조절 서열(5' 비코딩 서열)과 뒤에 위치한 서열(3' 비코딩 서열)을 포함하는 특이적인 단백질로서 발현될 수 있는, 핵산 단편을 지칭한다. "천연 유전자(native gene)"는 자신의 조절 서열과 함께 천연적으로 발견되는 유전자를 지칭한다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 발견되지 않는, 조절 서열과 코딩 서열을 포함하는, 천연 유전자를 제외한, 임의의 유전자를 지칭한다. 즉, 키메라 유전자는 상이한 소스로부터 유래된 조절 서열과 코딩 서열, 또는 동일한 서열로부터 유래되었지만 천연적으로 확인되는 바와는 다른 방식으로 정렬된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈에서 본래 위치에 있는 천연 유전자를 지칭한다. "외래" 유전자는 숙주 유기체에서는 정상적으로 발견되지 않지만 유전자 전달에 의해 숙주 유기체에 도입된 유전자를 지칭한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체에 삽입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포괄할 수 있다. "트랜스유전자"는 형질전환 공정에 의해 게놈내 도입되어진 유전자이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 RNA 분자 (센스 또는 안티센스), 펩타이드, 폴리펩타이드, 당단백질, 지단백질 또는 이의 조합, 또는 임의의 다른 후 변형된 폴리펩타이드를 코딩하는 모든 유전자일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 대상 유전자는 조직 샘플에서 자연적으로 발현될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 조직 샘플이 유전자 조작되어, 하나 이상의 세포가 자연적으로는 세포에서 발현하지 않거나 또는 세포내에서 발현 프로파일이 변경된 대상 유전자를 발현하게 될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 치료 핵산은 미국 특허 출원번호 10/376,506에 기재된 단백질들 중 어느 하나를 코딩하거나, 치료 폴리펩타이드는 상기 단백질일 수 있으며, 상기 미국 특허는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 미세-기관은 유전자 변형된 진피 미세-기관이다. "진피" 미세-기관 ("DMO")은 복수의 진피 성분을 포함할 수 있으며, 진피는, 일 구현예에서, 상피 아래에 위치한 피부의 일부분이다. 이들 성분들로는 피부 섬유모세포, 상피 세포, 그외 세포 타입, 모낭의 기부(base), 신경 말단, 땀샘, 피지샘, 혈관 및 림프관을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 진피 미세-기관은 지방 조직을 포함할 수 있으며, 다른 구현예에서, 진피 미세-기관은 지방 조직을 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 진피 미세-기관은 표피 기저층의 조직과, 선택적으로 피부의 다른 표피 층을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 진피 미세-기관은 기저 조직 층을 포함하지 않는다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 진피 미세-기관은 표피 층을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 상기 진피 미세-기관은 불완전 상피 층을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 진피 미세-기관은 표피 조직의 일부 층을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 진피 미세-기관은 상피가 진피로 함입된 것을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 진피 미세-기관은 땀샘 및/또는 모낭과 같은 부가적인 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 DMO는 진피의 전체 횡단 섹션(entire cross-section)을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 진피 미세-기관은 진피의 횡단 섹션의 일부를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 DMO는 진피의 횡단 섹션의 대부분, 즉 유두상 및 망상 진피 등의 진피 층 및 구성 요소들 대부분을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 DMO는 주로 진피 조직을 포함하지만, 지방 조직도 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 DMO는 케라틴을 생산하지 않거나 또는 케라틴을 미소량으로 생산하여, 수여체로의 이식 후, 예를 들어 피하 또는 진피내 이식 후, 케라틴 낭(keratin cyst)이 형성되지 않도록 방지된다. 진피 미세-기관의 수득 방법, 배양 유지 방법 및 이식하는 방법을 포함하여, 진피 미세-기관에 대한 보다 구체적인 사항은 PCT 특허 출원 WO2004/099363에 기술되어 있으며, 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관을 제공하는 단계; 및 상기 유전자 변형된 미세-기관을 상기 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에게 장기간 치료 폴리펩타이드를 제공하는 방법을 제공하며, 이때 상기 핵산 서열은 치료 폴리펩타이드를 코딩하며, 그에 따라 치료 핵산 또는 폴리펩타이드의 발현 수준은 기저 수준에 비해 5% 이상 증가되며, 상기한 증가는 1달 이상 유지된다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관을 필요로하는 제공하는 단계; 및 상기 유전자 변형된 미세-기관을 상기 개체에게 이식하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에게 장기간 치료 폴리펩타이드를 제공하는 방법을 제공하며, 이때 상기 핵산 서열은 치료 폴리펩타이드를 코딩하며, 상기 벡터는 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터이다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관을 제공하는 단계; 및 상기 유전자 변형된 미세-기관을 상기 개체에게 이식하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에게 치료 폴리펩타이드를 제공하는 방법을 제공하며, 이때 상기 핵산 서열은 치료 폴리펩타이드를 코딩하며, 상기 벡터는 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터이다.
다른 구현예에서, 전술한 방법은 치료 핵산을 필요로하는 개체에 제공하며, 이때 상기 치료 핵산 또는 폴리펩타이드의 발현 수준이 기저 수준에서 5% 이상으로 증가하며, 상기 증가는 1시간 이상, 3시간 이상, 6시간 이상, 9시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 1일 이상 또는 2일 이상 유지되며, 상기 벡터는 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터이거나, 또는 이의 조합이다.
일 구현예에서, 본 발명은 치료 폴리펩타이드가 에리트로포이에틴이거나, 치료 핵산이 에리트로포이에틴을 코딩하는, 전술한 치료 제형을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 유전자 변형된 미세-기관을 포함하는, 장기 지속형 에리트로포이에틴 제형을 제공하며, 여기서, 상기 핵산 서열은 에리트로포이에틴을 코딩하며, 그에 따라 상기 제형은 에리트로포이에틴을 기저 수준에 비해 5% 이상으로 증가시키며, 이러한 에리트로포이에틴의 증가는 1달 이상 지속된다. 다른 구현예에서, 상기 제형은 에리트로포이에틴 수준을 기저 수준에 비해 5% 이상 증가시키며, 이러한 에리트로포이에틴 수준 증가는 1달 미만 지속된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 치료 폴리펩타이드가 에리트로포이에틴이거나, 치료 핵산이 에리트로포이에틴을 코딩하는, 치료 제형을 필요한 개체에게 제공하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 필요한 개체에게 에리트로포이에틴을 제공하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관을 제공하는 단계; 및 상기 유전자 변형된 미세-기관을 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에게 에리트로포이에틴을 장기간 전달하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 에리트로포이에틴을 코딩하며, 그에 따라 에리트로포이에틴 수준이 기저 수준에 비해 5% 이상으로 증가하며, 이러한 에리트로포이에틴의 증가는 1달 동안 지속된다. 다른 구현예에서, 에리트로포이에틴 수준은 기저 수준에 비해 5% 이상 증가하며, 이러한 에리트로포이에틴 수준 증가는 1달 이하 동안 지속된다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관을 제공하는 단계; 및 상기 유전자 변형된 미세-기관을 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 새로운 혈액 세포의 형성을 장기간 유도하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 에리트로포이에틴을 코딩하며, 그에 따라 에리트로포이에틴 수준은 기저 수준 대비 5% 이상으로 증가하며, 이러한 에리트로포이에틴의 증가는 1달 동안 지속된다. 또 다른 구현예에서, 에리트로포이에틴 수준은 기저 수준에 비해 5% 이상 증가하며, 이러한 에리트로포이에틴 수준 증가는 1달 이하 동안 지속된다.
일 구현예에서, 에리트로포이에틴(EPO)은 적혈구성 선조 세포를 적혈구로 성숙시키는데 관여하는 당단백질 호르몬이다. 일 구현예에서, 에리트로포이에틴은 적혈구 세포의 순환 수준을 조절하는데 필수적이다. 자연적으로 생성되는 에리트로포이에틴은 신장과 간에서 생산되며, 혈액에서 순환하며, 골수에서, 일 구현예에서, 저산소증에 반응하여, 적혈구 세포의 생산을 자극한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 EPO는 인간 또는 동물의 뇨, 또는 다른 구현예에서, 혈장에서 추출된 EPO와 유사한 당화 패턴을 포함한다.
에리트로포이에틴을 코딩하는 유전자의 동정, 클로닝 및 발현은 미국 특허 5,756,349; 5,955,422; 5,618,698; 5,547,933; 5,621,080; 5,441,868; 및 4,703,008에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 재조합 에리트로포이에틴 플라스미드를 포함하고 있는 포유류 세포의 생장을 뒷받침하는 세포 배지로부터 재조합 에리트로포이에틴을 정제하는 방법에 대한 설명은 Lai 등의 미국 특허 4,667,016에 기술되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 에리트로포이에틴을 코딩하는 유전자로 형질전환된 숙주 세포로부터 시험관내 단백질 산물을 발현시키는 것을 포함하는, 유전자 조작 기법에 의해 제조되는 재조합 에리트로포이에틴은, 만성 신부전으로 인한 빈혈 치료에 사용되고 있다. 현재, EPO는 신부전으로 인한 빈혈, 지도부딘(AZT) 처방 환자에서에서의 HIV 감염과 관련된 빈혈, 및 암 화학요법과 관련있는 빈혈에 대한 치료제로 사용되고 있다. rhu-EPO는 신 기능부전(renal insufficiency)으로 인한 빈혈의 치료제로서 보편화되어 있는데, 주 당 3번 제공되는 투여량 50-75 u/kg의 사용으로 헤마토크릿은 서서히 회복되며, 수혈 교환(transfusion dependency)이 필요없게 된다.
진핵 세포에서 생산되는 다수의 세포 표면 단백질들과 분비 단백질들은 당화라고 하는 하나 이상의 올리고사카라이드 기들로 변형되는데, 이는 단백질의 안정성, 분비성 및 세포내 국지성 뿐만 아니라 생물학적 활성에 현저한 영향을 미칠 수 있다. 일 구현예에서, 인간 뇨 유래의 에리트로포이에틴과 인간 에리트로포이에틴의 1-165 아미노산 서열을 포함하는 재조합 에리트로포이에틴(포유류 세포에서 발현됨) 둘다, 당단백질의 총 분자량의 약 40%를 구성하는, N-연결된 및 O-연결된 올리고사카라이드 체인 3개를 포함하고 있다. 일 구현예에서, 당화되지 않은 에리트로포이에틴은 당화된 형태에 비해 생체내 활성이 매우 낮지만, 시험관내 활성은 일부 유지된다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물의 에리트로포이에틴 및 본 발명의 방법에 사용하기 위한 에리트로포이에틴은 완전히 당화된(fully glycosylated) 것이며, 다른 구현예에서, 이는 일부 당화된 잔기를 포함하며, 다른 구현예에서, 이는 당화되지 않은 것이다.
일 구현예에서, EPO 유전자는 야생형 EPO 유전자일 수 있으며, 다른 구현예에서, EPO 유전자는 변형된 것일 수 있다. 일 구현예에서, 변형된 EPO 유전자는 최적화될 수 있다.
일 구현예에서, EPO 유전자는 유전자은행 등재 번호 X02158; AF202312; AF202311; AF202309; AF202310; AF053356; AF202306; AF202307; 또는 AF202308 로 기재된 것에 해당되는 핵산 서열, 또는 유전자은행 등재 번호 CAA26095; AAF23134; AAF17572; AAF23133; AAC78791; 또는 AAF23132에 기재된 것에 해당되는 단백질 서열을 코딩하는 핵산 서열을 가진다. 다른 구현예에서, EPO 전구체 유전자는 유전자은행 등재 번호 NM_000799; M11319; BC093628; 또는 BC111937에 기재된 것에 해당하는 핵산 서열 또는 유전자은행 등재 번호 NP_000790; AAA52400; AAH93628; 또는 AAI11938에 기재된 것에 해당하는 단백질 서열을 코딩하는 핵산 서열을 가진다. 다른 구현예에서, EPO 유전자는 서열번호 7로 제시된 핵산 서열을 가지며, 다른 구현예에서, EPO 유전자는 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열을 가진다. 다른 구현예에서, EPO 유전자는 서열번호 7로 제시된 서열과 상동한 핵산을 가지며, 다른 구현예에서, EPO 유전자는 서열번호 8로 제시된 서열과 상동한 아미노산 서열을 가진다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형은 빈혈인 개체를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 빈혈은 "적혈구 세포내 산소를 운반하는 Hb이 양적으로 병적 결핍된 상태"로 정의된다. 빈혈 증상으로는, 피곤, 일상적인 기능 수행력 감소, 인지 기능 손상, 두통, 현기증, 흉통 및 숨가뿜, 구역질, 우울증, 통증 또는 이의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 빈혈은 예후 불량 및 사망율 증가와 관련있다.
빈혈은 신장에서의 에리트로포이에틴 생산 저하로 인한 신부전이 원인인 경우가 많다. 다른 구현예에서, 빈혈은 암 침윤, 림프종 또는 백혈병으로 인한 골수에서의 적혈구 세포(적구성 세포: erythroid)의 생산 저하나, 또는 골수 치환에 의해 발생된다. 그외 빈혈의 원인으로는, 출혈 또는 비정상적인 월경으로 인한 출혈 등의 과다 출혈로 인한 혈액 감소; 암 치료, 예컨대 수술, 방사선치료, 화학치료, 면역 치료 또는 이의 조합; 암성 골수의 침윤이나 치환; 일 구현예에서, 적혈구 세포의 분해 또는 파괴인 용혈 증가; 에리트로포이에틴의 낮은 수준, 또는 이의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 빈혈은, 판코니 빈혈을 지칭하며, 일구현예에서, 골수 부전 (재생 불량성 빈혈)을 유도하고 종종 급성 AML(acute myelogenous leukemia)을 유발하는, 유전성 빈혈이다. 다른 구현예에서, 빈혈은 다이아몬드 블랙판 빈혈(Diamond Blackfan anemia), 정적혈구성 빈혈(normocytic anemia), 재생불량성 빈혈, 철 결핍성 빈혈, 비타민 결핍성 빈혈, 철적모구성 빈혈(Sideroblastic Anemia), 발작성 야간혈색소뇨증(Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria), 만성 질환의 빈혈, 신장 질환 및 투석에서의 빈혈, 또는 이의 조합을 지칭한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 지속형 EPO 제형은 당뇨병 개체를 치료하는데 사용된다. 상기 측면과 일 구현예에서, 본 발명의 EPO 제형은, 특히 인슐린 투여, 경구용 저혈당제, 예컨대 설폰유레아 약물, 일 구현예에서, 특히 글루코트롤, 글리부리드, 글리나제 및 아마릴; 글루코파지, 특히 레줄린, 엑토스 및 아반디아 등의 티아졸리딘디온; 또는 이들의 조합 등의, 당해 기술 분야에 공지된 기타 당뇨병 치료제와 함께 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 지속형 EPO 제형은, 만성적인 신장 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는데 사용되며, 다른 구현예에서, 말기 신장 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는데, 사용된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제형은 전술한 질환이나 병태에 걸리기 쉬운 개체에 사용된다.
본 발명의 제형 및 방법을 이용하여, 빈혈의 원인과 무관하게, 그리고 빈혈의 원인이 규명되었는지 여부와 상관없이, 빈혈을 치료할 수 있는 것으로 이해된다.
일 구현예에서, 상기 제형 및 방법은 효과적인 EPO 치료법을 제공한다.
용어 "효과적인 EPO 치료법"은, 환자의 Hb 수치를 치료 범위 (therapeutic window)로 만드는데 충분한 EPO의 양을 의미한다. 일 구현예에서, "효과적인 EPO 치료법"은 필요한 개체에서 적혈구생성 증가를 지칭한다. 일 구현예에서, "효과적인 EPO 치료법"은 필요한 개체에서 적혈구생성 감소를 예방하는 것을 의미한다. 본원에서, 용어 "효과적인 EPO 치료법"은 또한 본원에서 에리트로포이에틴의 "유효 투여량" 또는 "유효 용량"으로서 지칭될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은, 하나 이상의 (1) 인간 EPO-GMMO (hEPO-GMMO)를 환자에게 이식함으로써 달성된다. 다른 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은 2 이상의 (2) hEPO-GMMO를 환자에게 이식함으로써 달성된다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은 3 이상의 (3) hEPO-GMMO를 환자에게 이식함으로써 달성된다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은 4 이상의 (4) hEPO-GMMO를 환자에게 이식함으로써 달성된다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은 5 이상의 (5) hEPO-GMMO를 환자에게 이식함으로써 달성된다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은 6 이상의 (6) hEPO-GMMO를 환자에게 이식함으로써 달성된다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은 >6의 (6) hEPO-GMMO를 환자에게 이식함으로써 달성된다.
본원에서, 용어 "치료 범위"는, 필요한 개체에서의 바람직한 Hb 수준을 지칭한다. 일 구현예에서, 치료 범위는 10 gm/dl - 12 gm/dl 범위의 Hb 농도를 지칭한다. 일 구현예에서, Hb 농도는 9.5 - 12.6 gm/dl의 범위이다. 일 구현예에서, Hb 농도는 9 - 13.2 gm/dl의 범위이다. 일 구현예에서, Hb 농도는 8.5 - 13.8 gm/dl의 범위이다. 일 구현예에서, Hb 농도는 8 - 14.4 gm/dl의 범위이다.
일 구현예에서, 상기 필요한 개체는 인간이다. 일 구현예에서, 상기 필요한 개체는 신장 환자이다. 다른 구현예에서, 상기 필요한 개체는 말기 신장 질환 환자이다. 또 다른 구현예에서, 상기 필요한 개체는 만성 신장 질환 (CKD) 환자이다. 또 다른 구현예에서, 상기 개체는 투석전 CKD 환자이다. 다른 구현예에서, 개체는 당뇨병 환자이다.
본 발명의 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은 환자에서 Hb ("Hb") 수준을 치료 범위에 포함되게 한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은 환자에서 Hb 수준을 치료 범위 +/- 10% 범위에 해당되게 만든다. 본 발명의 다른 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법은 환자에서 Hb 수준을 치료 범위 +/- 20% 범위에 해당되게 만든다.
본원에서, 용어 "유효 투여량" 또는 "유효 용량"은 1일 당 하나 이상의 GMMO로부터 발현되는 치료 폴리펩타이드의 유효량을 지칭한다.
일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 18-150 UI/kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 20-40 UI/kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 40-60 UI/ kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 60-80 UI/ kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 80-100 UI/ kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 100-120 UI/ kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 120-150 UI/ kg(환자 체중)/일이다.
다른 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 18-25 IU/kg(체중)/일 (저용량)이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 35-45 IU/kg(체중)/일 (중간 용량)이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 55-65 IU/kg(체중)/일 (고용량)이다.
일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 20 IU / kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 40 IU/ kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 60 IU/ kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 80 IU/ kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 100 IU/ kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 120 IU/ kg(환자 체중)/일이다. 일 구현예에서, 효과적인 EPO 치료법을 위한 투여량은 150 IU/ kg(환자 체중)/일이다.
일 구현예에서, 하나 이상의 hEPO-GMMO 이식에 따른 반응은 Hb 수준 증가가 적어도 1달간 지속되는 것이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 hEPO-GMMO 이식에 따른 반응은 Hb 수준 증가가 적어도 2달간 지속되는 것이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 hEPO-GMMO 이식에 따른 반응은 Hb 수준 증가가 적어도 3달간 지속되는 것이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 hEPO-GMMO 이식에 따른 반응은 Hb 수준 증가가 적어도 4달간 지속되는 것이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 hEPO-GMMO 이식에 따른 반응은 Hb 수준 증가가 적어도 5달간 지속되는 것이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 hEPO-GMMO 이식에 따른 반응은 Hb 수준 증가가 적어도 6달간 지속되는 것이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 hEPO-GMMO 이식에 따른 반응은 Hb 수준 증가가 6달 보다 길게 지속되는 것이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 hEPO-GMMO 이식에 따른 반응은 Hb 수준 증가가 9달 이상 지속되는 것이다. 일 구현예에서, 하나 이상의 hEPO-GMMO 이식에 따른 반응은 Hb 수준 증가가 1년 이상 지속되는 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 빈혈 치료에 효과적인 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 다른 치료제는, 철 보충제, 비타민 B12 보충제, 부가적인 소스의 에리트로포이에틴, 안드로겐, G-CSF 등의 성장 안자, 또는 이의 조합이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 혈액과 골수 줄기 세포 이식 등의 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 치료 폴리펩타이드가 인터페론이거나, 또는 치료 핵산이 인터페론, 일 구현예에서, 인터페론 α, 일 구현예에서, 인터페론 α 2a를 코딩하는, 전술한 치료 제형을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 유전자 변형된 미세-기관을 포함하는, 장기 지속형 인터페론 α 제형을 제공하며, 상기 핵산 서열은 인터페론 α를 코딩하며, 그에 따라 상기 제형은 인터페론 α 수준을 기저 수준 대비 5% 이상으로 증가시키며, 이러한 인터페론 α의 증가는 1달 이상 지속된다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 치료 폴리펩타이드가 인터페론이거나, 또는 치료 핵산이 인터페론, 일 구현예에서, 인터페론 α, 일 구현예에서, 인터페론 α 2a를 코딩하는, 치료 제형을 필요한 개체에게 제공하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 인터페론, 일 구현예에서, 인터페론 α, 일 구현예에서, 인터페론 α 2a인, 치료 폴리펩타이드를, 필요한 개체에 제공하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 인터페론은, 세포에서, 항-바이러스, 항-증식성 및 항-염증성 효과 등의 다면적인 효과(pleitrophic effect)를 발휘할 수 있는 다기능성의 사이토카인이다. 인터페론에 대한 이러한 세포 반응들로 인해, 인터페론 α 및 인터페론 β는 다발성 경화증, B형 간염, C형 간염 및 여러가지 유형의 암 등의 바이러스성 질환, 증식성 질환 및 염증성 질환의 치료에 임상적으로 유용한 것으로 확인된 바 있다. 인터페론 요법은, 또한, 그외 염증성 질환들, 바이러스성 질환 및 증식성 질환을 치료하기 위한 잠재적인 용도를 가질 수 있다. 따라서, 인터페론을 필요로하는 개체는 전술한 질환 또는 병태들 중 한가지 또는 전부를 앓고 있을 수 있다.
인터페론은 주된 3종의 클래스가 있다: 알파(α), 베타(β) 및 감마(γ). 이들 인터페론은 항-바이러스 및 항-종양 특성 외에도, 대식세포와 천연 살상 림프구를 활성화하여, 주조직적합성 복합체 당단백질 클래스 I 및 II를 강화한다. 인터페론-α는 백혈구(B 세포 및 T 세포)에서 분비된다. 인터페론-β는 섬유모세포로부터 분비되며, 인터페론-γ는 T 세포 및 천연 살상 림프구에서 분비된다.
일 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 인터페론 α, 다른 구현예에서, 인터페론 β, 또는 다른 구현예에서, 인터페론 γ이다. 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 인터페론 α의 임의 서브타입들이며, 예로 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17 또는 21이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 인터페론 ω, ε, κ 또는 이의 상동체이다. 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 인터페론 λ 또는 이의 상동체이다. 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 인터페론 λ의 임의 서브타입들이며, 예로 인터페론(IL) 28A, IL28B, 또는 IL29가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드는 인터페론 ζ, ν, τ, δ 또는 이의 상동체이다.
일 구현예에서, IFN은, 특이적인 세포 표면 수용체 컴플렉스, 일 구현예에서, IFNAR1 및 IFNAR2 체인을 포함하는 인터페론 α 수용체(IFNAR), 다른 구현예에서, 두개의 IFNGR1 및 두개의 IFNGR2 서브유닛을 포함하는 인터페론 감마 수용체(IFNGR), 다른 구현예에서, IL10R2 및 IFNLR1을 포함하는 수용체 컴플렉스에 결합한다. 일 구현예에서, 인터페론은 JAK-STAT 시그널링 경로를 통해 신호전달한다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법에서 인터페론은 인터페론 α이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법에서 인터페론은 인터페론 α2b이다. 일 구현예에서, IFN α2b는 인간 백혈구 유래의 IFN α2b에 대한 유전자를 포함하는, 재조합의 비당화된 165-아미노산 α 인터페론 단백질이다. IFN α2b는 I형의 수용성 인터페론으로, 분자량은 19,271 달톤(19.271 kDa)이다. 일 구현예에서, IFN α2b는 HPLC 분석으로 측정시 약 2.6 x 108 (260 million) International Units/mg의 비활성(specific activity)을 가진다.
일 구현예에서, IFN α2b는, 성장 호르몬, 인터루킨, 수종의 콜로니 자극 인자 및 수종의 그외 조절 분자가 포함된, 큰 나선형 사이토카인 슈퍼패밀리에 속하는, I형의 인터페론 중 하나이다. 이들 모두 IFNAR1 및 IFNAR2로 알려진 세포 표면 수용체 컴플렉스와 상호작용하여, 다양한 시그널링 경로를 활성화함으로써, 세포 활성의 조절자로서 기능한다. 인터페론은 세포에서 항-바이러스 및 항-증식성 반응을 발생시킨다.
일 구현예에서, 본 발명의 장기 지속형 IFN α 제형은 유모세포 백혈병(hairy cell leukemi), 성병성 사마귀(venereal wart), 카포시 육종, 만성 비-A, 비-B형 감염, B형 간염 또는 이의 조합의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 지속형 IFN α 제형은 전술한 질병이나 병태들 중 한가지에 걸리기 쉬운 개체나 또는 본원에 기술된 감염성 물질에 노출된 적이 있거나 노출될 개체에서 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 지속형 IFN α 제형은 C형 간염의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 이러한 측면과 일 구현예에 있어서, 본 발명의 제형은 특히 리바바린, 인터페론, 페길화된 인터페론 또는 이의 조합 등의 기타 C형 감염 치료제와 동시에 또는 교대로 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 장기 지속형 IFN α 제형은, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 표재성 방광암, 피부암 (특히 기저 세포암과 악성 흑색종이 포함됨), 신장 세포암, 난소암, 저등급 림프성 및 피부성 T 세포 림프종 및 신경교종 등의, 그외 다양한 세포 증식성 장애에, 단독으로 또는 화학치료제와 병용하여 사용하거나 고려할 수 있다. 다른 구현예에서, 장기 지속형 IFN α 제형은 폐암, 결장직장암 및 유방암으로부터 발생하는 고형암의 예방 또는 치료에, 단독으로 또는 다른 화학치료제와 함께 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 장기 지속형 IFN α 제형은 다발성 경화증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 장기 지속형 IFN α 제형은 조직구성 질환(histiocytic disease), 일 구현예에서, 에드하임-체스터 질환(ECD), 일 구현예에서, 신체의 결합 조직을 공격하며, 일 구현예에서, 조직구의 과다 생산에 의해 초래되며, 일 구현예에서, 조성 결합 조직(loose connective tissue)에 축적되어 비후화 및 치밀화가 초래되는, 잠재적인 태아 장애의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 장기 지속형 IFN α 제형은 중증 베체트 안 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, IFN α 유전자는 유전자은행 등재 번호 K01900; M11003; 또는 M71246에 제시된 서열에 해당하는 핵산 서열을 가지거나, 또는 유전자은행 등재 번호 AAA52716; AAA52724; 또는 AAA52713에 제시된 서열에 해당하는 단백질 서열을 코딩한다. 일 구현예에서, 인터페론 β 유전자는 유전자은행 등재 번호 M25460; AL390882; 또는 CH236948에 제시된 서열에 해당하는 핵산 서열을 가지거나, 또는 유전자은행 등재 번호 AAC41702; CAH70160; 또는 EAL24265에 제시된 서열에 해당하는 단백질 서열을 코딩한다. 일 구현예에서, 인터페론 ν 유전자는 유전자은행 등재 번호 J00219; AF506749; NM_000619; 또는 X62468에 제시된 서열에 해당하는 핵산 서열을 가지거나, 또는 유전자은행 등재 번호 AAB59534; AAM28885; NP_000610; 또는 CAA44325에 제시된 서열에 해당하는 단백질 서열을 코딩한다. 다른 구현예에서, 인터페론 α 유전자는 서열번호 9로 제시된 핵산 서열을 가지며, 다른 구현예에서, 인터페론 α 유전자는 서열번호 10으로 제시된 아미노산 서열을 가진다. 다른 구현예에서, 인터페론 α 유전자는 서열번호 9로 제시된 서열과 상동한 핵산을 포함하며, 다른 구현예에서, 인터페론 α 유전자는 서열번호 10으로 제시된 서열과 상동한 아미노산 서열을 가진다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관을 제공하는 단계; 및 상기 유전자 변형된 미세-기관을 개체에 이식하는 단계를 포함하되, 상기 핵산 서열이 인터페론 α를 코딩하며, 그에 따라 인터페론 α의 수준이 기저 수준 보다 5% 이상으로 증가되며, 상기한 인터페론 α의 수준 증가가 1달 이상 유지되는, 장기간 필요한 개체에게 인터페론 α를 전달하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형 및 방법은 핵산에 의해 코딩된 치료 폴리펩타이드의 발현 수준 증가, 지속기간 증대 또는 이의 조합이 이루어지도록 최적화된 핵산을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1과 85% 이상의 상동성을 갖는 핵산, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 2와 85% 이상의 상동성을 갖는 핵산, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
용어 "상동성"은 본원에서 핵산 서열에 대해 사용되는 경우, 대응되는 천연 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 %를 의미한다.
일 구현예에서, 용어 "상동성", "상동체" 또는 "상동적인"은, 일 구현예에서, 서열이 표시된 서열과 적어도 70% 이상의 부합성(correspondence)을 보이는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 72%의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 75%의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 77%의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 80%의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 82%의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 85%의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 87%의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 90%의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 92%의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 적어도 95% 또는 그 이상의 부합성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 표시된 서열과 95 % - 100%의 부합성을 나타낸다. 마찬가지로, 특정 서열에 대한 부합성은 직접적인 일치 뿐만 아니라 본원에 기술된 바와 같이 서열에 대한 상동성 둘다를 포함한다.
상동성은 당해 기술 분야에 잘 설명되어 있는 방법으로 컴퓨터 서열 정렬 알고리즘으로 결정할 수 있다. 예컨대, 핵산 서열 상동성에 대한 컴퓨터 알고리즘 분석은, 예컨대, BLAST, DOMAIN, BEAUTY (BLAST Enhanced Alignment Utility), GENPEPT 및 TREMBL 패키지 등의 이용가능한 많은 소프트웨어 패키지의 이용을 포함할 수 있다.
상동성을 결정하는 다른 방법은 핵산 서열 혼성화 결정을 통한 것으로, 이러한 방법은 당해 기술 분야에 잘 기술되어 있다 (예, "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1985); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Volumes 1-3) Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). 일 구현예에서, 혼성화 방법은 온건 조건 내지 엄격 조건하에서 수행될 수 있다. 예컨대, 10-20% 포름아미드, 5 X SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 사이트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트(pH 7. 6), 5 X 덴하트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 ㎍/ml의 시어드 연어 정자 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 하룻밤 인큐베이션하는 혼성화 조건을 예로 들 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 미세-기관을 포함하는 치료 제형과 이의 이용 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 치료적 미세-기관의 제조는, (a) 공여 개체로부터, 미세-기관 외식편 각각이 세포 집단을 포함하며, 미세-기관 외식편 각각이 이것이 유래된 장기의 미세-구조(micro-architecture)를 유지하면서 동시에 영양분 부족 및/또는 미세-기관 외식편내 폐기물의 축적으로 인한 세포 독성과 수반되는 세포 사멸을 최소화하기 위해 미세-기관 외식편내에서 적정 영양분과 가스가 세포로 확산가능하고 미세-기관 외식편의 외부로 세포 폐기물을 확산시킬 수 있도록 선택된 구조를 가지고 있는, 복수의 미세-기관 외식편을 수득하는 단계; (b) 상기 복수의 미세-기관 외식편을 유전자 변형시켜, 하나 이상의 아미노산 차이가 있는 단백질을 포함하며, 이를 분비하는, 유전자 변형된 복수의 미세-기관 외식편을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 복수의 유전자 변형된 미세-기관 외식편을 복수의 수여 개체에 이식하는 단계를 포함한다.
미세-기관을 유전자 변형된 미세-기관으로 제작 및 가공하는 방법은 WO2004/099363에 기술되어 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 미세-기관은, 3차 구조의 미세-기관내에서 모든 세포로의 영영분과 가스의 확산, 및 외식편 외부로의 세포 폐기물의 충분한 확산이 확보되도록, 규정된 조직 구조를 포함한다. 미세-기관의 생체외, 일 구현예에서, 최소 배지에서의 유지는, 장기간 지속시킬 수 있으며, 이때 바이러스나 비-바이러스성 벡터를 이용하여 미세-기관의 세포에 원하는 후보 유전자를 도입하는 생체외 조절성 형질전이를 수행함으로써, 유전자 변형된 미세-기관을 제작한다.
일 구현예에서, 미세-기관은 후술되는 바와 같이 드릴 및 코링바늘(coring needle)을 이용하여 회수한다. 다른 구현예에서, 미세-기관은 코링 드릴을 삽입하는 동안에 진공으로 피부 긴장을 유지하고 슬릿(slit)을 여는, 회수 시스템을 이용하여 회수한다. 다른 구현예에서, 진피 조직의 회수에 사용할 수 있는 모든 툴을 이용하여, 적합한 크기의 미세-기관을 회수할 수 있으며, PCT 출원 WO 04/099363에 기술된 툴 및 방법들이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
유전자 변형된 미세-기관을 제조하기 위한 미세-기관내 재조합 핵산의 도입 또는 바이오펌프의 도입은 당해 기술 분야에 널리 공지된 여러가지 방법들로 달성할 수 있다. 핵산 구조체를 이용하여 미세-기관 세포를 안정적으로 또는 일시적으로 형질전이시킬 수 있다. 안정적인 형질전이에서, 핵산 분자는 미세-기관 세포의 게놈에 삽입되며, 이로써 안정적이고 유전되는 형질이 표현되게 된다. 일시적인 형질전이의 경우, 핵산 분자는 에피좀으로서 형질전이된 세포에서 유지되며, 세포에서 발현되지만 게놈내로 삽입되진 않는다. 상기 에피좀은, 형질전이된 세포가 빠르게 분열하는 세포인 경우, 에피좀의 소실로 인해, 또는 형질전이된 세포가 비-분열성 세포인 경우에는 오랜 발현으로 인해, 일시적으로 발현될 수 있다.
전형적으로, 핵산 서열은, 전술한 바와 같이 미세-기관내로 서열을 도입하는 바람직한 방법에 따라, 특정 벡터에 서브클로닝된다. 일단 바람직한 핵산 세그먼트를 특정 벡터에 서브클로닝하면, 재조합 벡터가 된다.
일 구현예에서, 미세-기관은 유전자 변형 전 및 후에 32℃에서 인큐베이션하며, 다른 구현예에서, 37℃에서 인큐베이션한다. 다른 구현예에서, 미세-기관은 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 38℃, 39℃, 40℃, 28℃, 30℃, 31℃, 25℃, 42℃, 또는 45℃에서 인큐베이션한다.
일 구현예에서, 미세-기관은 유전자 변형 전 및 후에 10% CO2에서 인큐베이션하며, 다른 구현예에서, 5% CO2에서 인큐베이션한다. 다른 구현예에서, 미세-기관은 12% CO2, 15% CO2, 17% CO2, 또는 20% CO2에서 인큐베이션한다. 다른 구현예에서, 미세-기관은 2% CO2, 6% CO2, 7% CO2, 8% CO2, 또는 9% CO2에서 인큐베이션한다.
다른 구현예에서, 인큐베이션 온도, CO2 농도 또는 이의 조합은 유전자 변형 전에, 중에 및 후에, 한가지 온도 또는 농도로 유지시킬 수 있으며, 다른 구현예에서, 인큐베이션 온도, CO2 농도 또는 이의 조합은 유전자 변형 전에, 중에 및 후에 다른 범위로 조정될 수 있다.
다른 구현예에서, 미세-기관은 85-100% 습도, 일 구현예에서, 95% 습도, 다른 구현예에서, 90% 습도, 다른 구현예에서, 98% 습도에서 인큐베이션한다.
일 구현예에서, 치료 핵산 또는 폴리펩타이드의 수준은 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 핵산을 세포에 도입하는 특정 발현 벡터 시스템과 방법의 효율은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 표준 방법으로 분석할 수 있다. 예컨대, 세포에 도입된 DNA는 필터 혼성화 기법(예, 서든 블롯팅)으로 검출할 수 있으며, 도입된 DNA의 전사에 의해 만들어진 RNA는 예컨대 노던 블롯팅, RNase 보호 또는 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 검출할 수 있다. 유전자 산물은 예컨대 특이 항체를 이용하는 것과 같은 제조된 단백질을 면역학적으로 검출함으로써, 또는 효소적 분석과 같이 유전자 산물의 기능적 활성을 검출하기 위한 기능성 분석에 의해 검출할 수 있다. 일 구현예에서, ELISA, 웨스턴 블롯 또는 방사면역분석으로 단백질을 검출할 수 있다. 세포에 의해 발현되는 대상 유전자 산물을 쉽게 분석하기 어렵다면, 사용되는 조절 요소와 벡터에 연결되는 리포터 유전자를 이용하여 발현 시스템을 먼저 최적화할 수 있다. 리포터 유전자는 쉽게 검출가능한 유전자 산물을 코딩하므로, 시스템의 효율을 평가하는데 사용할 수 있다. 당해 기술 분야에서 사용되는 표준 리포터 유전자로는, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 루시퍼라제 및 인간 성장 호르몬 코딩 유전자들이 있다.
따라서, 일 구현예에서, 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 발현 수준은 시험관내에서 측정하며, 다른 구현예에서, 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 발현 수준은 생체내에서 측정한다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드 또는 핵산의 발현 수준은, 일 구현예에서, EPO 수준은, 다른 구현예에서, IFNα 수준을 시험관내 측정함으로써, 미세-기관에 의한 치료 물질의 시험관내 분비 수준을 측정하는 단계; 시험관내 생산 및 분비 수준과 치료 물질의 생체내 혈청 수준 사이의 연관성을 추정하는 단계; 및 상기 측정된 분비 수준과 추정된 연관성을 기반으로 이식할 치료 제형의 양을 결정하는 단계를 통해, 환자에게 이식할 미세-기관의 수를 결정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드(들)는 또한 미세-기관의 세포에서 발현되는 내인성 유전자나 또는 미세-기관으로 도입되는 부가적인 재조합 유전자의 전사 또는 번역 중 어느 한가지를 조절하는, 트랜스- 또는 시스-작용성 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수 있다. 포유류 세포에서 이용될 수 있는 적합한 전사 또는 번역 조절 서열에 대한 다수 예들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
예컨대, 전사 조절 요소는 특이적인 프로모터로부터의 전사 활성화에 필요한 시스- 또는 트랜스-작용성 요소를 포함한다 [(Carey et al., (1989), J. Mol. Biol. 209:423-432; Cress et al., (1991), Science 251 :87-90; 및 Sadowski et al., (1988), Nature 335:5631-564)].
번역 활성자는 콜리플로워 모자이크 바이러스 번역 활성자(TAV)로 예시되어 있다 [예, Futterer and Hohn, (1991), EMBO J. 10:3887-3896 참조]. 이 시스템에서, 이중-시스트론 mRNA가 생산된다. 즉, 2가지 코딩 영역들은 동일한 프로모터로부터 동일한 mRNA로 전사된다. TAV가 없는 경우, 첫번째 시스트론만 리보좀에 의해 번역되지만, TAV를 발현하는 세포에서는 2가지 시스트론 모두 번역된다.
시스-작용성 조절 요소의 폴리뉴클레오티드 서열은 통상적으로 사용되는 유전자 낫-인(knock-in) 기법을 통해 미세-기관의 세포로 도입할 수 있다. 유전자의 낫-인/아웃 방법에 대한 개괄적인 사항은, 예로, 미국 특허 5,487,992, 5,464,764, 5,387,742, 5,360,735, 5,347,075, 5,298,422, 5,288,846, 5,221,778, 5,175,385, 5,175,384, 5,175,383, 4,736,866을 참조하며, Burke and Olson, Methods in Enzymology, 194:251-270, 1991; Capecchi, Science 244:1288-1292, 1989; Davies et al., Nucleic Acids Research, 20 (11) 2693-2698, 1992; Dickinson et al., Human Molecular Genetics, 2(8):1299-1302, 1993; Duff and Lincoln, "Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells", Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, 1995; Huxley et al., Genomics, 9:742-750 1991; Jakobovits et al., Nature, 362:255-261 1993; Lamb et al., Nature Genetics, 5: 22-29, 1993; Pearson and Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:10578-82; Rothstein, Methods in Enzymology, 194:281-301, 1991; Schedl et al., Nature, 362: 258-261, 1993; Strauss et al., Science, 259:1904-1907, 1993, WO 94/23049, WO 93/14200, WO 94/06908 및 WO 94/28123에서도 정보를 얻을 수 있다.
재조합 산물의 생산을 배제하기 위해서는, 내인성 서열을 하향-조절하는 것이 바람직할 수 있다. 이를 위해, 안티센스 RNA를 내인성 서열 불활성화의 수단으로 사용할 수 있다. 내인성 nRNA 서열에 상보적인 서열을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드(들)를 미세-기관의 세포들에서 전사시킨다. 또한, 하향 조절은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 실무인 유전자 낫-아웃 기법을 통해 구현할 수 있다 ("Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)).
재조합 산물의 과다 발현이 물론 바람직할 수도 있다. 과다발현은 해당 벡터에 하나 이상의 코딩 서열을 고카피 수로 제공함으로써 달성할 수 있다. 이들 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 이의 발현을 조절하기 위해 포유류 발현 벡터의 적정 프로모터의 전사 통제하에 위치시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 수종의 관련 유전자나 동일 유전자의 다수 카피를 폴리펩타이드 또는 핵산 발현을 증가시키기 위한 수단으로서 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 발현은 DNA 요소, 일 구현예에서, 기질-조합 영역(MAR) 또는 스캐폴드-조합 영역(SAR)에 의해 안정화된다.
일 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 사용하기 위한 벡터이다. 아데노바이러스 벡터를 벡터로 사용하는 일 구현예에서, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 시스템을, 일 구현예에서, 미세-기관을 형질전환하기 위한 치료 폴리펩타이드 또는 핵산을 발현하는 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터를 제조하는데 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 그러한 헬퍼-의존형 아데노바이러스 시스템은 헬퍼-의존형 아데노바이러스, 헬퍼 바이러스 및 생산자 세포주를 포함하며, 본 발명의 제형 제조에 사용되며, 이러한 내용은 Palmer and Ng, 2003 Mol Ther 8:846 및 Palmer and Ng, 2004 Mol Ther 10:792에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 293으로 명명되는 헬퍼 세포주는 Ad5 DNA 단편에 의해 인간 배아성 신장 세포로부터 형질전환된 것으로, 구성적으로 E1 단백질을 발현하며, 이를 사용하여 복제 불능 아데노바이러스 벡터를 제조 및 증폭시킨다. 다른 구현예에서, 헬퍼 세포주는 인간 근세포, 조혈세포 또는 그외 인간 배아성 간엽 또는 상피 세포로부터 유래할 수 있다. 또한, 헬퍼 세포는 인간 아데노바이러스를 용인하는 다른 포유류 종의 세포로부터 유래할 수 있다. 이러한 세포로는, 예컨대 Vero 세포, 또는 그외 원숭이 배아성 간엽 또는 상피 세포가 있다.
일 구현예에서, 미세-기관은 수시간 내지 수개월의 범위일 수 있는 기간 동안 생체외에서 유지된다. 일 구현예에서, 생체외 유지는 바이러스 벡터를 이용하여 생체외 유전자 조작한 미세-기관의 유지, 즉 GMMO의 유지를 지칭한다. 다른 구현예에서, 생체외 유지는 유전자 조작 전의 미세-기관 유지를 지칭한다.
일 구현예에서, 유전자 변형된 미세-기관은 수일간, 다른 구현예에서, 이식 전 수주간 유지된다. 일 구현예에서, 미세-기관은 이식 전 9-14일간 유지된다. 일 구현예에서, 미세-기관은 이식 전 2-4주간 유지된다. 일 구현예에서, 미세-기관은 이식 전 3주간 유지된다. 일 구현예에서, 미세-기관은 이식 전 4주 이상 유지된다. 또 다른 구현예에서, 미세-기관은 9일 이상 유지된다.
이론에 결부되지 않으면서, 일 구현예에서, 상기 인큐베이션은, 바이러스 벡터의 형질전이의 결과로서 나타나는, 바이러스 단백질, 일 구현예에서, 바이러스 캡시드를, 상기 세포가 처리 및 분해하게 한다. 일 구현예에서, 이러한 캡시드 단백질의 반감기는 2-3일이므로, 일 구현예에서, 생체외에서 바이러스 캡시드 단백질은 10일째까지 거의 잔류하지 않는다. 일 구현예에서, 바이러스 캡시드의 분해는 본 발명의 제형의 면역원성을 추가로 감소시키고, 대상 유전자나 유전자들의 발현 수준과 지속 기간을 더 증가시킨다. 다른 구현예에서, 인큐베이션은, 일 구현예에서, 아데노 유전자 전사체의 부재시 24시간 보다 길게 지속되지 않을, 초기 HD-Ad 벡터-유도성 선천 면역 반응이 시험관내에서 발생되게 한다. 다른 구현예에서, 정상적으로 전사-컴피턴트 제1-세대-Ad 벡터를 투여한 후 후행되는 후기 후천적인 반응들은, 일 구현예에서, 림프구 침윤, 다른 구현예에서, Ad-특이적인 CTL의 유도가 주된 특징이며, 이는 HD-Ad 벡터에 의해서는 발생되지 않는다.
일 구현예에서, 생체외 미세-기관은 바이러스 벡터에 1.6 - 3x109 감염 입자(ip)/ml, 3 - 4x1012 바이러스 입자 수/ml, 또는 2x1011 바이러스 입자 수/ml의 농도로 노출된다. 다른 구현예에서, 생체외 미세-기관은 바이러스 벡터에 1x103 내지 1x1012 바이러스 입자 수/ml, 다른 구현예에서, 1x103 내지 1x109, 및 다른 구현예에서, 1x106 내지 1x109, 다른 구현예에서, 1x106 내지 1x1012 바이러스 입자 수/ml로 노출된다. 일 구현예에서, 개체의 미세-기관내에 투여되는 바이러스 입자 수/ 개체의 체중의 투여량은 1x103 미만이며, 다른 구현예에서, 1x102 미만, 다른 구현예에서, 1x101 미만이다.
일 구현예에서, 성장 인자는 미세-기관의 세포 수적 증가를 위해 사용된다.
일 구현예에서, 시험관내 발현은 이식하기 전에 평가하여, 발현되는 재조합 단백질의 시험관내 또는 생체내 관련 가능성을 확인할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 이식할 유전자 변형된 세포를 포함하여 조직 샘플의 양은, 규제 가이드라인, 구체적인 임상 프로토콜 또는 유사한 개체들에 대한 집단 통계를 기초로 개체에 통상적으로 투여되는 대상 치료제의 해당 양, 주입 또는 다른 경로를 통해 이전에 투여받은 사례에서 동일 개체에 대해 특이적으로 대상 단백질 등의 치료제의 해당 양, 체중, 연령, 신체 상태, 임상적인 상태, 다른 유사 개체에 대한 유전자 변형된 세포의 투여를 포함한 이전 조직 샘플로부터 수득한 약동학 데이타, 개체에 대한 유전자 변형된 세포의 투여를 포함하는 이전 조직 샘플에 대한 반응, 또는 이의 조합들 중 하나 이상에 의해 결정된다. 따라서, 일 구현예에서, 하나 이상의 미세-기관에 의한 유전자 산물의 발현 수준은 시험관내에서 결정되며, 시험관내 및 생체내 치료 폴리펩타이드 또는 핵산의 발현 수준 간의 관련성이 결정 또는 추정되며, 특정 환자에게 이식할 미세-기관의 수는 계산 또는 추정된 관련성을 기초로 결정된다. 치료제의 투여량은 기존에 공지된 바와 같이 조정할 수 있다(WO2004/099363).
일 구현예에서, 미세-기관 또는 유전자 변형된 미세-기관은 숙주로 이식하여야할 때까지, 금지 기간 동안 시험관내에서 유지시킬 수 있다. 일 구현예에서, 미세-기관 또는 유전자 변형된 미세-기관은 1-7일, 1-8주 또는 1-4달 동안 배양 상태로 유지 또는 보관할 수 있다. 다른 구현예에서, 조직 샘플을 둘러싸고 있는 상층 배지에 둔 치료제를 분리하여, 동일하거나 또는 상이한 개체에 주입 또는 적용할 수 있다.
다른 예로, 또는 부가적으로, 유전자 변형된 미세-기관은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 동결 보존할 수 있으며, 그 예로는 조직 샘플로부터 제조되는 직후 또는 유전자 변형 직후에, 10% DMSO가 포함된 DMEM 중에서의 단계적 동결을 수행하는 방법 (0℃, -20℃, -80℃, -196℃)이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제형 투여는 필요한 개체로의 이식에 의한 것일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 제형은, 미세-기관을 원하는 부위로 위치시키는 방법 또는 경로에 의해, 치료 또는 예방할 질환 또는 장애에 걸린 장기나 시스템에 이식할 수 있다. 다른 구현예에서, 이식되는 제형의 위치는 질병이나 장애에 걸린 장기 또는 시스템의 원위부(distal)일 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 재조합 단백질은 국소적으로 방출되며, 다른 구현예에서, 재조합 단백질은 림프계로 확산되며, 일 구현예에서, 궁극적으로 재조합 단백질의 전신 공급을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 필요한 개체의 임의 부위에서 질병 또는 장애 증상을 치료하기 위한 다양한 농도로의 치료 제형의 사용을 제공한다.
이러한 측면과 일 구현예에 있어서, 본 발명의 제형은 종양내에 이식할 수 있다. 다른 구현예에서, 제형은, 종양에서, 일 구현예에서, 특정 타입의 종양의 전이와 관련있는, 먼 위치에 이식할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제형은 개체의 신장에 이식할 수 있으며, 일 구현예에서, 피막하(subcapsular) 이식할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제형은 복강경에 의해 이식한다.
일 구현예에서, 본 발명의 제형은 일시적인 증상을 신속하게 치료하기 위해 한번 이식하거나, 또는 특히 진행성, 재발성 또는 퇴행성 질환인 경우에는 2회 이상 이식할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 제형 하나 이상을 동시에 투여할 수 있거나, 또는 다른 구현예에서, 교차 방식(staggered fashion)으로 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 교차 방식은 질병의 기(stage) 또는 단계(phase)에 의해 결정된다.
일 구현예에서, 미세-기관은 미세-기관 세포들 중 적어도 일부분가 살아있는 상태로 존재하는 방식으로 개체의 원하는 부위에 이식된다. 본 발명의 일 구현예에서, 적어도 약 5% 이상, 본 발명의 다른 구현예에서, 적어도 약 10% 이상, 본 발명의 다른 구현예에서, 적어도 약 20% 이상, 본 발명의 다른 구현예에서, 적어도 약 30% 이상, 본 발명의 다른 구현예에서, 적어도 약 40% 이상, 본 발명의 다른 구현예에서, 적어도 약 50% 또는 그 이상의 세포들이, 개체에 투여된 후, 살아있는 상태를 유지한다. 개체에 투여된 후 세포의 생존 기간은 짧게는 수시간, 예컨대 24시간 내지 수일에서 길게는 수주 내지 수개월 또는 수년일 수 있다.
수여 개체에 미세-기관의 이식은 재조합 산물의 지속적인 투약을 제공한다. 미세-기관은, 숙주내 효과적인 삽입을 위해, 이식 전에 제조되며, 예컨대 이식된 조직내에서의 혈액 생성을 용이하게 만들 수 있다. 따라서, 재조합 산물은 생산 후 말초 수여 순환계로 즉각적으로 전달될 수 있다. 다른 예로, 미세-기관은, 숙주내 세포 부착 및 효율적인 병합을 방지하기 위해, 이식 전에, 제조할 수 있다. 혈관 생성을 방지하는 방법의 예로는, 실크, 나일론 또는 예컨대 GORE-TEX 백 (Terrill P J, Kedwards S JVI, ana Lawrence J C. (1991) The use of GORE-TEX bags for hand bums. Burns 17(2): 161-5) 등의 기타 물질로 제작된 상업적으로 이용가능한 세포 투과를 방지하는 직경의 생물학적 메쉬 백이나, 예컨대 테플론 등의 세포 부착을 방지하는 물질로 코팅된 다른 다공성 막 안에 미세-기관이 들어 있는 것을 포함한다.
미세-기관에 의해 생산되는 유전자 산물은, 이후, 예컨대 단백질성 바이오약제 등의 전달 제어형 화합물, 예컨대 약물에 대해 고안된 폴리머 장치를 통해 전달할 수 있다. 생분해성 및 비-분해성 폴리머 둘다를 비롯한 다양한 생체적합성 폴리머(하이드로겔 포함)를 이용하여, 특정 타겟 부위에서, 본 발명에 따른 미세-기관의 유전자 산물을 지속적으로 방출하는 임플란트를 만들 수 있다. 이러한 임플란트의 제조는 일반적으로 당해 기술 분야에 공지되어 있다(예, Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, ed. By David Williams (MIT Press: Cambridge, Mass., 1990); Sabel et al. 미국 특허 4,883,666; Aebischer et al. 미국 특허 4,892,538; Aebischer et al. 미국 특허 5,106,627; Lim 미국 특허 4,391,909; 및 Sefton 미국 특허 4,353,888 참조). 일 구현예에서, GMMO는 캡슐화된다. 다른 구현예에서, GMMO는 캡슐화되지 않는다.
본 발명에 따른 유전자 변형된 미세-기관의 임플란트화(implantation)는 표준 외과 기법이나 또는 미세-기관의 투여에 적합한 게이지의 바늘을 적용한 특수 제작된 시린지로 포유류의 의도한 조직 영역에 미세-기관 조제물을 주입함으로써 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 카테터를 미세-기관 이식에 사용한다. 일 구현예에서, PCT 공개번호 WO2 04/099363에 기술된 임플란트화 방법을 이용할 수 있으며, 이는 본 발명의 일 구현예로 간주된다.
일 구현예에서, 미세-기관은 피하, 진피내, 근육내, 복막내 또는 위내에 이식된다. 일 구현예에서, 용어 이식은 부분층(split-thickness) 피부 이식 또는 전층 피부 이식으로 이식되는 것을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 이식 전 또는 이식하는 동안에 조치를 취하여, 동종이계 또는 이종 조직을 미세-기관의 제조에 이용할 수도 있지만, 이식 거부 반응 및/또는 이식 편대 숙주 질환(GVHD)을 피하기 위해, 이식에 이용되는 공여 미세-기관은 바람직하기로는 수여 포유류의 장기 조직으로부터 제조하거나(즉, 자가), 또는 동계(syngeneic) 포유류의 장기 조직으로부터 제조한다. 본원에서, GYHD는 수여 숙주에 대한 이식 면역 반응에 의해 초래되는 조직 이식(graft)의 결과인 이식 편대 숙주 질환을 의미한다. 보다 구체적으로는, 이식 편대 숙주 질환은 수여체를 외래로 인식하여 수여 세포를 공격하는 공여체 T 림프구(T 세포)에 의해 유발된다. 이식 거부 반응 또는 GVHD를 예방 또는 완화하기 위한 여러가지 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 숙주에 의해 면역학적 공격을 받을 수 있는, 예컨대 돼지-인간 이식 등의 이종 이식이 사용된, 조직에서의, 세포 집단의 이식을 용이하게 하기 위해, 미세-기관을, 재충전가능하며, 비-생분해성 또는 생분해성의 장치 등의 생체적합한 면역-예방된 물질에 삽입 또는 캡슐화한 후, 수여체 개체로 이식할 수 있다.
다른 구현예에서, 임플란트화에 이용되는 공여 미세-기관은 바람직하게는 수여체와 인간 백혈구 항원(HLA)이 일치되는 공여체로부터 준비되며, 일 구현예에서, HLA는 인간에서의 주조직 친화성 복합체(major histocompatibility complex)이다. 일 구현예에서, 공여체와 수여체는 클래스 I 주조직 친화성 복합체 (MHC) 유전자, 클래스 II MHC 유전자 또는 이의 조합이 일치된다. 일 구현예에서, 클래스 I MHC 유전자는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 포함하며, 일 구현예에서, 클래스 I MHC 유전자가 미스매치되면 이식 거부 반응의 위험성이 증가되며, 일 구현예에서, 클래스 II MHC 유전자는 HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1을 포함하여, 일 구현예에서, 클래스 II MHC 유전자가 미스매치되면 GVHD 위험성이 증가된다. 다른 구현예에서, 공여체와 수여체는 HLA-DM 및 HLA-DO 유전자가 일치된다.
일 구현예에서, 생체외 바이러스 턴오버 또는 세포로부터의 소거는 당해 기술 분야에 공지된 기법, 예컨대 물리적인 방법, 일 구현예에서, 가열, 항바이러스성 물질을 사용함으로써 증강되며, 상기 물질은 세포 등에 의한 바이러스의 턴오버를 자극한다.
일 구현예에서, 본 발명의 장기 지속형 제형은 핵산 또는 폴리펩타이드의 발현 수준과 지속 기간을 증가시키지만, 핵산 또는 폴리펩타이드의 발현 수준은 무한정 증가되는 것은 아니다.
세포의 일시적인 형질전이 또는 신속하게 턴오버하는 세포를 포함하는 기타 방법들과는 대조적으로, 본 발명의 장기 지속형 EPO 제형은 더이상 복제하지 않는 세포를 포함한다. 따라서, EPO 제형은 안정한 구조체로부터 안정한 단백질을 생산하며, 이미 특정화된 단백질을 계속적으로 생산할 것으로 예상된다.
실시예
실험 재료 및 방법
재료 및 장치 리스트
생산 배지를 사용하여 미세-기관을 생장시켰으며, 생산 배지는 1% 글루타민, 50 ㎍/ml 젠타마이신 (RAFA labs, 주입용) 및 0.1% 암포테리신 B (BMS, Fungizone LV.) (배지내 최종 농도 2.5 ㎍/ml 암포테리신 B)가 첨가된 DMEM-HEPES 배지 (고함량의 글루코스 4,500 mg/L 및 25 mM HEPES; Hi-Clone Cat# SH3A1448.02)이다. 일부 실험들에서, 10% 혈청 대체 보충제 (SSS, Irvine Scientific, Cat # 99193), 10% 자가 인간 혈청 (autologous human serum) 또는 10% 소 태아 혈청 (FBS 또는 FCS)을 생산 배지에 첨가하였다.
진피 미세-기관의 회수 - 동심원 니들법(concentric needle method)
공여체의 하부 복부에서 일정 피부 구역으로부터 인간 진피 미세-기관을 수득하였다. 상피가 회수되지 않도록 하기 위해, 얕은 슬릿 (1-2 mm 폭)을 과립층 각막(stratum cornea)을 통해 진피로 통과시켜, 미세-기관을 회수되는 피부 영역의 한쪽에서 직선으로 절개하고, 동일한 슬릿으로 첫번째 슬릿과 30 mm 거리로 평행하게 절개하였다. 2개의 슬릿 사이의 거리가 미세-기관의 길이를 결정하며, 실험 전체에서 일관되게 유지되었다.
가는 게이지 (전형적으로 22GA)의 피하 바늘을 식염수가 든 1 ml 시린지에 꽂고, 첫번째 슬릿에서 노출된 진피에 삽입하고, 필요에 따라 반대쪽 슬릿에서 진피를 관통하여 나가도록 각도로 기울인 바늘을 이용하여 반대쪽 슬릿쪽으로 회수 부위의 진피를 따라 이동시켰다.
다음으로, 가이드 바늘의 길이방향으로 바깥쪽 피부에 외과 클램프를 끼워넣었다. 진피에 끼워둔 바늘을 약간 들어올려, 이를 둘러싼 주변 피부 부분을 들어올리고, 때로는 집기 전에 삽입한 피하 바늘 지점 아래에 후크형의 장치를 사용하여 피부를 들어올리는 행위를 보조하였다. 이의 유출부에서 튀어나오는 가이드 바늘의 끝을, 코링 바늘(직경 1-3 mm, Point Technologies, CO USA)의 날카로운 리딩 말단으로 삽입하고, 상업적으로 이용가능한 드릴 (예, Aesculap Micro Speed GD 650, GD 657)로 고정하였다. 소량의 멸균 식염수를 주사기를 통해 코링 바늘로 주사하였다. 드릴을 움직여 코링 바늘을 고속으로 회전 (전형적으로 3000-7000 RPM)시키고, 회전시키는 동안에 드릴과 코링 바늘을 수동으로 가이드 바늘의 축을 따라 정방향으로 밀어, 코링 바늘의 내부 직경과 거의 유사한 외부 직경을 갖는 30-40 mm 길이의 실린더형 진피 코어(진피 미세-기관)를 절개한다. 진피 미세-기관은 통상적으로 가이드 바늘과 접촉된 상태로 유지되며, 코링 바늘 안에서 빼내어, (전술한) 생산 배지로 이동시키고, 코링 바늘을 피부에서 뺀다.
핀셋을 이용하여, 각 미세-기관을 1000 ㎕의 생산 배지가 들어있는 24 웰 플레이트에서 표시한 하나의 웰로 이동시킨다. 찌꺼기를 제거하기 위해, 각 미세-기관에 대해 1000 ㎕로 2번의 배지 교체를 수행한다. 생산 배지 1000 ㎕ 중에 미세-기관이 든 플레이트를 인큐베이터에 넣고, 24시간의 회복 기간동안 32℃, 10% CO2, 및 ~95% 습도에서 평형화한다.
바이러스 형질전이
각 미세-기관을, 바이러스를 유지하는데 필요한 액체의 총 부피가 적게드는 48웰 플레이트의 웰로, 형질전이하기 위해 이동시켰다. 미세-기관 내부를 교란시키지 않으면서 각 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하였다. 전임상 실험을 수행하는 동안에, 각각 재조합 인간 EPO 유전자, 최적화된 재조합 인간 EPO 유전자 또는 최적화된 IFN-α 유전자를 포함하는, 3종의 상이한 벡터: 1.6 - 3 x 109 감염성 입자(ip)/ml 제1 세대 아데노바이러스 (Molecular Medicine), 약 3 - 4 x 1012 바이러스 입자/ml 헬퍼-의존형 아데노바이러스 (Baylor), 또는 약 2 x 1011 바이러스 입자/ml 아데노 부속 바이러스 (University of Pennsylvania)를 시험하였고, 각각 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:500, 또는 1:1000으로 FCS 첨가 또는 무첨가된 DMEM-HEPES (Gibco Cat# 42430-025)로 희석하였다. 48웰 플레이트의 각 웰에 바이러스 희석 비율들 중 한가지를 100 ㎕로 넣었다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 넣고, 2시간 동안 300 rpm으로 디지탈 마이크로타이터 교반기에서 교반한 다음 교반하지 않고 16-22시간 인큐베이션하여, 형질전이되게 하였다.
형질전이된 미세-기관을 형질전이 후 24-웰 플레이트로 이동시킨 다음, 생산 배지(FCS 무첨가) 1 mL로 3번 세정하여, 형질전이되지 않은 바이러스 입자들을 제거하였다. 세정 후, 바이오펌프를 1 mL 생산 배지에서 표준 고습도 CO2 인큐베이터에서 95% 습도, 10% CO2, 및 32℃의 조건하에서 유지시켰다. 바이러스 벡터를 제거한 후 72 시간 후, 생산 배지를 신선한 배지로 교체하고, 사용한 배지의 일부로 분비된 재조합 단백질 수준을 평가하였다.
생체외 미세-기관 유지
3-4일 마다 사용한 생산 배지를 취하여, 분비된 재조합 단백질과 글루코스 수준을 바이어펌프의 생존성과 함께 분석하였다. 신선한 생산 배지를 24웰 플레이트에 첨가하였다.
분비된 단백질 측정
인간 EPO (hEPO)와 IFNα 농도 및 분비율을 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA) 키트 (Quantikine human erythropoietin; R&D Systems; Human interferon alpha ELISA kit, PBL Biomedical Laboratories)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 분석하였다.
글루코스 측정
조직의 글루코스 소비를 시그마-알드리치사의 GAGO20 Glucose (GO) 분석 키트를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 분석하였다.
헤마토크릿 측정
헤마토크릿 수준은 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 국립 임상 실험 표준 위원회 (NCCLS)로부터 추천된 표준 방법으로 원심분리를 이용하여 분석하였다. 헤마토크릿을 측정하기 위해, 시험관내 전체 혈액을 10-15,000　xg로 5분간 원심분리하여 적색 세포를 펠렛화하고(팩킹된 적혈구로 지칭됨), 모세관에서의 샘플의 총 길이에 대한 팩킹된 적혈구의 컬럼의 비를 원심분리한 후 10분 이내에 그래픽 리딩 장치로 측정하였다.
헤모글로빈 측정
Hb 농도 수준을 모든 실험실에서의 혈액 분석의 일부로서 측정하였고, Hb, 헤마토크릿, 백혈구, 적혈구, MCV, MCH, 망상 적혈구 및 혈소판 양을 측정하였다. 예를 들어, 자동화된 Seimens ADVIA 플랫폼을 이용하여 전체 혈액 카운트(Complete Blood Count)를 측정하였다. Hb는 표준 시안 메테모글로빈 비색법과 유세포 측정법 2가지 방법으로 평가하였다.
미세-기관 임플란트화-SCID
일부 실험들에서, 유전자 변형된 미세-기관 또는 대조군 미세-기관을, 미세-기관의 생존성을 확인하기 위해, 조직의 글루코스 소비를 분석한 후, SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency) 마우스에 피하 이식하였다. 체중 25 g의 수컷 및 암컷 SCID 마우스를 140 ㎕의 희석한 Ketaset (ketamine HCl)(400 ㎕ Ketaset 및 600 ㎕ 식염수)로 마취하고, 대조군 또는 EPO를 발현하는 미세-기관을 미세-기관의 형질전이 후 10일째에 피하 이식하였다.
미세-기관 임플란트화-인간
임상 실험 중에, 사전 동의 확보, 실험 테스트, 병력, 신체 검사, ECG 및 수반되는 약물 치료 문서 등의, 환자 탐색 기간 후, 인간 환자에게 유전자 변형된 또는 대조군 미세-기관을 피하 또는 진피내 이식하였다. 인간 임상 실험에 대한 본원에 기술된 결과에서, "0"일은 이식한 날이다. 또한, GMMO와 대조군 미세-기관에서 조직의 글루코스 소비를 분석하여, 미세-기관의 생존성을 확인하였다. 대조군 또는 EPO-발현성 미세-기관을 피하 또는 진피내로 이식하였다.
실시예 1
GMMO에 의한 시험관내 EPO 및 IFNα 생산 수준
미세-기관을 전술한 바와 같이 준비하고, 전술한 바와 같이 CAG 프로모터에 연결된 최적화된 IFNα 유전자를 발현하는 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터로 형질전이하였다. 그 후, GMMO는 배양으로 유지시키고, 생산되는 IFN α 수준을 ELISA로 평가하였다. 최적화된 IFNα-발현성 미세-기관은 회수 후 적어도 40일 동안 IFNα를 시험관내에서 > 1000 ng/일로 생산하였고 (도 1), 재조합 hEPO를 발현하는 미세-기관은 회수 후 적어도 142일간 hEPO를 시험관내에서 > 1000 ng/일로 생산하였다 (도 2A-B).
최적화된 hEPO를 코딩하는 gutless 아데노바이러스 벡터를 포함하는 GMMO는, hEPO를 코딩하는 아데노바이러스-5 벡터를 포함하는 미세-기관에 비해, 200일 이상 높은 피크 발현율을 유지하였다 (도 3). 또한, 최적화된 hEPO를 코딩하는 gutless 아데노바이러스 벡터를 포함하는 미세-기관은, 최적화되지 않은 hEPO를 코딩하는 gutless 아데노바이러스 벡터를 포함하는 미세-기관에 비해, 장기간 높은 피크 발현율을 유지하였다 (도 4). 마지막으로, CAG 프로모터의 하류에 hEPO를 코딩하고 있는 gutless 아데노바이러스 벡터를 포함하는 미세-기관은, CMV 프로모터 하류에 hEPO를 코딩하는 gutless 아데노바이러스 벡터를 포함하는 미세-기관와 비교하여, hEPO를 보다 높은 수준으로 발현하였으며, 형질전이 후 경과 시간에 대한 함수로서 점차 현저하게 증가하였다 (도 5).
실시예 2
이식된 SCID 마우스의 혈청 및 시험관내에서 유지시킨 인간 EPO를 발현하는 GMMO에 의한 EPO의 생산 수준
EPO를 발현하는 미세-기관을 전술한 바와 같이 준비하였다. 총 9일간 배양한 후, 미세-기관 당 EPO 생산량을 측정하고, 이 수치로 각 마우스가 EPO를 등가 수준으로 발현하는 미세-기관으로 이식되었는지를 결정하였다. 10일째에, 2개의 미세-기관을 각 SCID 마우스에 피하 이식하였고, 10일 후 1차 측정시, SCID 마우스의 혈청에서 측정되는 hEPO 수치는 기저 수준 보다 훨씬 높은 것으로 나타났다. 이식 후 적어도 216일간 이러한 수준은 높게 유지되었고, 적어도 157일간 SCID 마우스에서 헤마토크릿 수치도 현저하게 증가되었다 (도 6A). 이식한 EPO-발현성 미세-기관와 동시에 동일한 공여체로부터 제조하였지만 시험관내에서 유지시킨, 이식되지 않은 EPO를 발현하는 미세-기관에서도, EPO 생산이 높은 수준으로 유지되었다 (도 6B). 최적화된 hEPO 유전자를 포함하는 벡터로 형질전이된 미세-기관은 재조합 hEPO 유전자로 형질전이한 미세-기관 보다 생체내(도 6A) 및 시험관내(도 6B) 모두에서 EPO를 보다 높은 수준으로 생산하였다. EPO-비-생산성 미세-기관이 이식된 대조군 SCID 마우스에서는 이식 전과 비교하여 미세-기관 이식 후 혈청 EPO 수준 증가와 헤마토크랫 수준의 현저한 변화는 관찰되지 않았다 (도 6A). 양성 대조군으로 사용한 EPO-발현성 아데노바이러스-5를 포함하는 미세-기관은, EPO-발현성의 최적화된 아데노바이러스 또는 비-최적화된 gutless 아데노바이러스를 포함하는 미세-기관이 1:100 역가인데 비하여, 1:10 역가로 사용하였다.
실시예 3
인간 EPO-발현성 GMMO 이식에 의해 생산되는 헤모글로빈(Hb) 수준 증가 - 인간 임상 실험
임상 실험 개요
아래 임상 실험은 빈혈이 있는 투석 전 만성 신장 (CKD 3-4기) 질환자를 대상으로 하였다. CKD 등급은 MDRD-GFR [Modification of Diet in Renal Disease (MDRD) Study equation for estimating Glomerular Filtration Rate (GFR) from serum creatinine]에 따른다. 참여 환자는 준거로서 트랜스패린 포화율 (TSAT %) 및 패리틴 (ng/ml) 측정값을 이용하여 철 부족은 아니었다. 환자는 EPO-의존성에 대해 나이브(naive)이었거나, 또는 EPO-의존적인 경우, 4주 이상의 기간 동안 적혈구 생성 자극제(ESA)를 중단시켰다. 용어 "환자"는 본원에서 "개체"로서 언급될 수 있다.
Hb 베이스라인 측정을 위해, 나이브 참가자들에서 미리 30일간 평균 베이스라인 Hb 값을 결정하거나, 또는 마지막 ESA 주입 후 100일간 예상되는 최저로부터 베이스라인을 결정하였고, 이용가능한 경우 기록된 Hb 값과 비교하였다. 도 11A 및 11B는 임플란트화 및 예상되는 최저 이전의 Hb 값을 보여준다. 임플란트화 후 Hb 값도 나타낸다. 기본 측정들: RBC 카운트, Hb, Hct (%), 절대 망상 적혈구 카운트, 혈청 EPO 수치 (mU/ml), 이식 -30일, -9일 및 당일 (0일) 철 상태를 측정하여, 수집하였다.
EPO 수준, Hb 및 헤마토크릿을 측정하고, 첫 2주간 주당 3회, 6주째까지 주당 2회, 그 이후 매주 망상 적혈구 카운트를 수집함으로써, 효능 평가를 수행하였다. 평가 준거에는 Hb 반응 및 효능 지속 기간이 포함된다.
도 15는 아래 기술된 실험들에서의 참가자들에 대한 인구통계 데이타를 나타낸다.
임상 실험의 안전성 결과들은 임상 조건에서의 유전자 변형된 미세-기관의 유용성을 뒷받침해준다. 구체적으로, 안전성 결과는, (a) 처리한 모든 참가자들에서 부작용이 발생되지 않으며; (b) 과정이 간단하고 용인성이 양호하며; (c) 항-EPO 항체 형성 증거가 없으며 (처리 전, 중 및 후에 혈액 샘플을 테스트하였으며, 처리 결과로서 EPO 항체 증가는 관찰되지 않았음); 및 (d) 지금까지 혈청 EPO 수치는 60 mU/ml을 초과하지 않는 것으로 나타났다.
임상 실험 - 단회 투여
I 상 임상 실험을 이스라엘에서 수행하였으며, 투석-전 빈혈이 있는 III기 및 IV기의 만성 신장 질환 (CKD) 환자에 본 발명의 서방형 (장기-지속형 치료 제형) 자가 hEPO-GMMO를 이식하였다. GMMO-hEPO 1회 이식 처리는 효과적인 EPO 요법을 3개월 내지 16개월 이상 제공하였다. I/II 상 GMMO hEPO 실험은 이스라엘 보건부로부터 승인을 받았으며, 하다사 의학 센터와 텔 아비브 소라스키 의학센터에서 수행하였다. 임상 실험은 이후 US 기준의 임상 실험을 위해 FDA 규제 및 임상 기준에 따라 수행하였다.
환자에게 18-25 IU/kg/일 (저용량), 35-45 IU/kg/일 (중간 용량) 또는 55-65 IU/kg/일 (고용량)을 처리하였다. 도 7은 베이스라인 대비 순 피크(Net Peak) 혈청 EPO 상승과 투여한 EPO 용량 (IU/kg/일)의 상관성을 나타낸다.
그 결과, Hb 수준 (Hb)이 18-25 IU/kg/일의 저용량, 35-45 IU/kg/일의 중간 용량 또는 55-65 IU/kg/일의 고용량을 이용한 환자들 대부분에서 10-12 g/dl 범위 (치료 범위)로 유지되었다. 도 8A, 8B 및 8C는 치료 범위에서 유지되는 Hb 반응이 1 - 24개월간 지속됨을 보여준다. 이러한 지속되는 Hb 반응 결과는 임의의 EPO 주사와는 무관하다.
21-82세의 남성 및 여성 환자를 본 실험에 포함시켰다.
환자 1은 EPO 나이브 환자였다. 환자 1에 대한 임상 통계 및 EPO 실험의 상세 내용은 다음과 같다: 82세 남성; 4기 CDK 환자; GFR 21 ml/min, 철 저장량 충분 (트랜스패린 포화율 33%, 패리틴 340 ng/ml); 및 EPO 저용량 투여 (18-25 IU/kg/일) - 2 hEPO-GMMO 투여함.
치료 코멘트는 다음과 같다: 부작용 없음; 양호한 Hb 반응; 및 잦은 혈액 샘플링과 실험 프로토콜에 대한 추적 방문으로 인한 피로에도 불구하고 치료에 만족함 - 4.5개월 후 조기 중단을 요청함.
도 9는 131일간 환자 1의 지속적인 Hb 반응을 나타낸다.
환자 2는 EPO 의존형 환자였다. 환자 2에 대한 임상 통계 및 EPO 실험에 대한 상세 사항은 다음과 같다: 71세 남성, 3기 CKD 환자; 18개월간 EPO 의존적임, 10일 마다 6000 IU 투여, EPO 처리 40일 전 마지막 투여; GFR 57 ml/min, 철 저장량 충분 (트랜스패린 포화율 26%, 패리틴 105 ng/ml); EPO 저용량 투여 (18-25 IU/kg/일) - 3 hEPO-GMMO 투여됨.
치료 코멘트는 다음과 같다: 부작용 없음; 처리에 만족함; 양호한 Hb 반응; 및 12개월간의 추적 조사에서 성공적으로 종료됨. 환자는 신체적으로 활동형이며, 현 치료 후 고용량을 위한 재등록을 요청하였다.
도 10A는 환자 2에서 Hb 반응이 2년간 치료 범위내에서 지속됨을 보여준다. 도 10B 및 10C는 환자 2에서 200일 이상의 기간 동안의 망상 적혈구 및 혈청 EPO 수준을 각각 보여준다.
환자 3은 EPO 의존형 환자였다. 환자 3에 대한 임상 통계 및 EPO 실험에 대한 상세 사항은 다음과 같다: 58세 남성, 4기 CKD 환자; 16개월간 EPO 의존적임, 주당 1회로 5000 IU 투여, 최종 투여는 EPO 처리 전 39일에 수행됨; GFR 26 ml/min, 철 저장량 충분 (트랜스패린 포화율 23%, 패리틴 243 ng/ml); 및 저용량 EPO 투여 (18-25 IU/kg/일) - 4 hEPO-GMMO 투여됨.
치료 코멘트는 다음과 같다: 부작용 없음; 양호한 Hb 반응: Hb 베이스 라인 대비 ~2gm/dl 증가. 현 투여량에서는 타겟 수준이 지속되지 않았다. 본 실험에서 이 환자는 보충적인 EPO 주입을 제공받는 것으로 종결지었다.
도 11A는 환자에서 Hb 반응이 92일간 타겟 치료 범위 바로 아래에서 지속됨을 보여준다.
환자 4는 EPO 나이브 환자였다. 환자 4에 대한 임상 통계 및 EPO 실험에 대한 상세 사항은 다음과 같다: 57세 여성, 3기 CKD 환자; EPO 나이브; GFR 32 ml/min, 충분한 철 저장; 및 저용량 EPO 투여 (18-25 IU/kg/일) - 5 hEPO-GMMO 투여받음.
치료 코멘트는 다음과 같다: 부작용 없음 및 양호한 Hb 반응.
도 12는 환자 4에서 Hb 반응이 224일간 치료 범위내에서 지속됨을 보여준다.
환자 5는 EPO 의존형 환자였다. 환자 5에 대한 임상 통계 및 EPO 실험에 대한 상세 사항은 다음과 같다: 51세 여성, 4기 CKD 환자, 다낭성 신장 질환; EPO 의존형, 3주간 1회로 Aranesp 60 ㎍ 복용함, EPO 처리 전 113일째에 마지막 투여함; GFR 18 ml/min, 충분한 철 저장 (트랜스패린 포화율 39%, 패리틴 371 ng/ml); 및 저용량 EPO 투여 (18-25 IU/kg/일) - 6 hEPO-GMMO 투여받음.
치료 코멘트로는 다음과 같다: 부작용 없음, 일시적인 Hb 반응, 불충분; 35일째에 실험 중단.
환자 6는 EPO 의존형 환자였다. 환자 6에 대한 임상적인 통계 및 상세 사항은 다음과 같다: 40세 여성, 4기 CKD 환자, 다낭성 신장 질환 - 이식 후보; 6주간 EPO 의존적임, 주당 2회 2000 IU 복용함, 마지막 복용일은 EPO 처리 전 29일째임; GFR 25 ml/min, 충분한 철 저장 (트랜스패린 포화율 33%); 및 저용량 EPO 투여 (18-25 IU/kg/일) - 4 hEPO-GMMO 투여받음.
치료 코멘트는 다음과 같다: 부작용 없음, 우수한 초기 Hb 반응; 신장 기능의 저하; 보충적인 EPO 주입 제공. 환자는 실험을 중단하고, 투석을 받았다.
도 13은 환자 6에서 Hb 반응이 89일간 치료 범위내에서 지속됨을 보여준다.
환자 7은 EPO 나이브 환자였다. 환자 7에 대한 임상 통계와 EPO 실험에 대한 상세 사항은 다음과 같다: 77세 남성, 4기 CDK 환자; EPO 나이브; GFR 19 ml/min, 충분한 철 저장; 중간 용량의 EPO 투여 35-45 IU/kg/일) - 8 hEPO-GMMO 투여받음.
치료 코멘트는 다음과 같다: 부작용 없음, 반응성 낮음.
도 14는 환자 7에서 Hb 반응이 172일간 대부분 치료 범위내에서 지속됨을 보여준다.
본 실험의 결과는 저용량 및 중간 용량의 hEPO-GMMO를 투여받은 환자의 혈액에서 Hb 수준이 장기간 치료 범위내에서 유지되는 것으로 나타났다. 아울러, 환자에서는 부작용이 나타나지 않았으며, 진행하는 동안 또는 그 이후에 어떠한 불편함도 보고되지 않았다.
임상 실험 - 2차 투여에 의한 용량 증대
환자 10은 저용량으로 2번 투여한 EPO 의존형 환자였다. 1차 투여는 0일에 수행하였고, 2차 투여는 70일에 수행하였다. 도 16은, 1차 용량이 EPO 상승을 베이스라인 10 mU/ml에서 2-5 mU/ml로 높게 유지시키며, Hb를 바닥 수준 8.8 g/dl 대비 10.2 g/dl로 유지시킴을 보여준다. 2차 투여 후, EPO 혈청 수준 및 망상 적혈구에서 비슷한 피크 반응이 관찰되었으며, Hb의 명확한 증가가 관찰되었다.
2차 투여 결과, 재처리가 실현가능하며, 안전하고, 유효한 것으로 보인다.
요약
제시된 임상 실험에서, hEPO-GMMO이 안전하며, 처리를 다양한 투여량으로 수정할 수 있으며, 약 18-25 IU/kg/일, 35-45 IU/kg/일 및 55-65 IU/kg/일의 투여량이 타당한 것으로 입증되었다. 놀랍게도, hEPO-GMMO 단회 투여가 대부분의 환자에서 Hb 반응을 3개월 이상 - 24개월 이상 동안 치료 범위(10-12 g/dl 혈액 Hb)로 유지시키는 것으로 확인되었다.
반복 투여가 안전하고 유용한 것으로 입증되었다. 동시에, 피하 hEPO-GMMO 이식이 이를 필요한 개체에서 지속적인 EPO 소스로 제공된다는 것이, 본원에서 입증되었다. 따라서, 피하 hEPO-GMMO 이식은, ESA를 잦은 빈도로 수개월 볼루스 주사하는 경우에 비해, 필요한 개체에 대해 대안적인 유효한 지속적인 치료를 제공한다는 점에서 현저한 진보이다.
실시예 4
SCID 마우스에서 전임상 독성 실험
양호한 실험 실무 (GLP) 독성 실험을 이스라엘 하를란 바이오텍에서 수행하였다. 본 실험의 목적은, 만성적인 신장 부전 질환에서 장기간 약물 전달하기 위한 지속적인 소스로서의 이의 의도한 용도에 대하여, 12주의 최대 노출 기간 동안 NOD-SCID 마우스에 단회 피하 이식한 후 테스트 프로덕트 바이오펌프 HDAd-hEPO의 잠재적인 독성 효과를 평가하기 위한 것이었다.
독성 실험 설계를 상세하게 검토하였고, FDA 전임상 분과 수장으로부터 허락을 받았으며, 그에 따라 구현하였다.
SCID 마우스의 비교적 짧은 수명 (ca 18 mo)을 고려하면, 표 1에 나타낸 지속 기간이 제안된 임상 실험을 뒷받침하기 위한 독성 안전성을 테스트하는데 합리적인 것으로 판단되었다.
표 1. 실험 설계
BP 용량 마우스의 총 수 2주째 희생된 개체 수 8주째 희생된 개체 수 12주째 희생된 개체 수
300-450 IU Epo/일 30 (15M, 15F) 5M, 5F 5M, 5F 5M, 5F
대조군 - 형질전이 안함 18 (9M, 9F) 3M, 3F 3M, 3F 3M, 3F
대조군 - 미세 기관 없음 18 (9M, 9F) 3M, 3F 3M, 3F 3M, 3F
제1 그룹에서, 각 동물에는 300-450 IU EPO/일 범위로 분비하는 바이오펌프 (GMMO)의 일부를 제공하였다.
제2 그룹은 이식한 대조군으로서, 각 동물에는 형질전이되지 않은 진피 미세 기관을 비슷한 크기로 제공하였다.
제3 그룹은 "미세-기관 비제공" 대조군으로서, 각 동물에는 이식없이 대조군으로서 동일한 피하 시술을 진행하였다.
임상 신호: 관찰 전 기간 동안, 세심한 임상적인 검사를 수행하였고, 실험에서 매일 1회 이상 모든 동물을 대상으로 기록하였다. 관찰은 피부, 털, 눈, 점막, 분비 및 배출 현상 (예, 설사) 및 자율 활성의 변화를 포함한다. 걸음걸이, 자세 및 취급에 따른 반응에 대한 변화 뿐만 아니라, 특이한 행동, 떨림 경련, 수면 및 코마의 존배 여부도 관찰하였고, 기록하였다.
체중: 실험에서 모든 동물들을 대상으로 무작위 공정으로서 개별적으로 체중을 측정한 다음, 단회 피하 이식/모의 수술하기 전에, 수술 2일 후, 그리고 매주 체중을 측정하였다.
사료 섭취: 적응 기간 동안 사료 섭취량을 측정하였고, 실험에서 모든 동물을 대상으로 전체 관찰 기간 동안 매주 측정하였다.
혈액 샘플 수집 (중간 채혈 기간): 동물들 모두 혈액 & 생화학 파라미터를 위해 중간 채혈 기간(interim bleeding session)을 적용하여, 1회 피하 이식한 날부터 13-15일 간격으로 수행하였다. 실험에서 균일성을 유지하기 위해, 실험의 모든 동물들을 대상으로 중간 채혈 기간을 적용하였다. 헤마토크릿 (HCT) 수준을 측정하기 위해, 특히 혈액 샘플을 사용하였다.
검시 공정 & 육안 검사: 잠재적인 독성 평가에 대해 본래 할당된 동물들 모두를 대상으로 전체 상세 검시(full detailed necropsy)와 전체 병리학적 검사를 수행하였다.
장기/조직 수집, 무게 측정 & 고정: 각 계획된 검시 기간 동안 모든 장기/조직을 수집하였다.
결과:
검사 제품을 처리한 암컷 마우스가 실험 7일째 우리에서 사망한 것으로 확인되었다. 또한, 검사 제품을 처리한 수컷 마우스도 52일째에 사망한 것으로 확인되었다. 검사 제품, 대조군 아이템 또는 모의 수술한 그룹 (나머지 포함)들 전체에서 더 이상의 사망은 발생되지 않았다.
전체 관찰 기간 동안 검사 제품, 대조군 아이템 또는 모의 수술한 생존 동물들에서 명확한 치료-관련 반응들은 관찰되지 않았다.
검사 제품 자체에 의한 연속적인 hEPO 분비 측면에서, 검사 제품 - 처리 동물들에서는 전체 관찰 기간 동안에, HCT 수준 증가가 기록되었다. 각 모의 수술한 그룹들의 평균 값에 대하여, 15일, 28일, 43일, 57일 및 70일째에, HCT 값이 통계학적으로 유의하게 증가된 것으로 확인되었다 (p,0.05 & p,0.01).
이러한 실험 조건에서 수득되는 조직병리학적 결과에 비추어, 최대 12주간의 노출 기간 동안 300-450IU/동물/일의 투여량으로 장기간 약물을 전달하기 위한 지속적인 소스로서 NOD-SCID 마우스에 피하 이식된 검사 제품 바이오펌프 HDAd-hEPO는, 단지 3가지의 계획된 종결 시간대 모두에서 관찰되는 약리학적 변화와 관련있는 것으로 결론내릴 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명이 상기에서 구체적으로 나타내고 기술한 바로 한정되지 않음을 인지할 것이다. 본 발명의 범위는 아래 첨부된 청구항으로만 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> Pearlman, Andrew L. <120> LONG LASTING DRUG FORMULATIONS AND METHODS THEREOF <130> P-74239-USP <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 582 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> optimized variation of human EPO <400> 1 atgggcgtgc acgagtgccc cgcctggctg tggctgctgc tgtccctgct gtctctgccc 60 ctgggcctgc ctgtgctggg agcccctccc cggctgatct gcgacagccg ggtgctggaa 120 agatacctgc tggaagccaa agaggccgag aacatcacca ccggctgcgc cgagcactgc 180 agcctgaacg agaatatcac cgtgcccgac accaaggtga acttctacgc ctggaagcgg 240 atggaagtgg gccagcaggc cgtggaagtg tggcagggcc tggccctgct gtccgaggcc 300 gtgctgagag ggcaggccct gctggtgaac agcagccagc cctgggagcc tctgcagctg 360 cacgtggaca aggccgtgag cggcctgcgg agcctgacca ccctgctgag ggccctgggc 420 gcccagaaag aggccatcag cccccctgat gccgcctctg ccgcccctct gcggaccatc 480 accgccgaca ccttccggaa gctgttccgg gtgtacagca acttcctgcg gggcaagctg 540 aagctgtaca ccggcgaggc ctgccggacc ggcgatcgct ga 582 <210> 2 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> optimized variation of human IFN alpha 2b <400> 2 ggcgcgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagact gccatggccc tgaccttcgc 60 cctgctggtg gccctgctgg tgctgtcctg caagagcagc tgcagcgtgg gctgcgacct 120 gccccagacc cacagcctgg gcagccggcg gaccctgatg ctgctggccc agatgcggcg 180 gatcagcctg ttcagctgcc tgaaggaccg gcacgacttc ggcttccccc aggaagagtt 240 cggcaaccag ttccagaagg ccgagaccat ccccgtgctg cacgagatga tccagcagat 300 cttcaacctg ttcagcacca aggacagcag cgccgcctgg gacgagaccc tgctggacaa 360 gttctacacc gagctgtacc agcagctgaa cgacctggaa gcctgcgtga tccagggcgt 420 gggcgtgacc gagacccccc tgatgaaaga ggacagcatc ctggccgtgc ggaagtactt 480 ccagcggatc accctgtacc tgaaagagaa gaagtacagc ccctgcgcct gggaagtggt 540 gcgggccgag atcatgcgga gcttcagcct gagcaccaac ctgcaggaaa gcctgcggag 600 caaagagtga ggatccccgg gtaccgagct cgaattctta attaa 645 <210> 3 <211> 4684 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sequences from adenovirus, CMV, and variation of human EPO <400> 3 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg 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catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420 cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480 tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540 tccgacaccg ggaggcgcgc cctcgagcta gctgttgaca ttgattattg actagttatt 600 aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 660 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 720 taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 780 agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 840 cccctattga cgtcaatgac 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agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 4260 ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 4320 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 4380 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 4440 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 4500 tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 4560 aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 4620 gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcaggggc cgctgcggc 4669 <210> 6 <211> 5246 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sequences from adenovirus, CAG, and variation of human IFN alpha 2b <400> 6 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420 cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480 tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540 tccgacaccg ggaggcgcgc cctcgagcta gcccctagtt attaatagta atcaattacg 600 gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc 660 ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 720 atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact 780 gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat 840 gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact 900 tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc 960 tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt 1020 taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg 1080 gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc 1140 ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag 1200 cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc 1260 gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg 1320 cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct 1380 tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagc gccggcagga aggaaatggg 1440 cggggagggc cttcgtgcgt cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg 1500 ctgtccgcgg ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg 1560 gcgtgtgacc ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct 1620 acagctcctg ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat 1680 taattcgagc gaacgcgtcg agtcgctcgg tacgatttaa attgaattgg gctcgagatc 1740 tgcgatctaa gtaagcttgc atgcctgcag gtcgactcta gactgccatg gccctgacct 1800 tcgccctgct ggtggccctg ctggtgctgt cctgcaagag cagctgcagc gtgggctgcg 1860 acctgcccca gacccacagc ctgggcagcc ggcggaccct gatgctgctg gcccagatgc 1920 ggcggatcag cctgttcagc tgcctgaagg accggcacga cttcggcttc ccccaggaag 1980 agttcggcaa ccagttccag aaggccgaga ccatccccgt gctgcacgag atgatccagc 2040 agatcttcaa cctgttcagc accaaggaca gcagcgccgc ctgggacgag accctgctgg 2100 acaagttcta caccgagctg taccagcagc tgaacgacct ggaagcctgc gtgatccagg 2160 gcgtgggcgt gaccgagacc cccctgatga aagaggacag catcctggcc gtgcggaagt 2220 acttccagcg gatcaccctg tacctgaaag agaagaagta cagcccctgc gcctgggaag 2280 tggtgcgggc cgagatcatg cggagcttca gcctgagcac caacctgcag gaaagcctgc 2340 ggagcaaaga gtgaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt ctttgtagag gttttacttg 2400 ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg 2460 ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 2520 tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 2580 tatcgatatc ggcgcgccgg gcccctacgt cacccgcccc gttcccacgc cccgcgccac 2640 gtcacaaact ccaccccctc attatcatat tggcttcaat ccaaaataag gtatattatt 2700 gatgatggcc gcagcggccc ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 2760 caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 2820 gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 2880 cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 2940 aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 3000 cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 3060 ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 3120 aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 3180 ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt 3240 acaatttagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 3300 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 3360 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 3420 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 3480 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 3540 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 3600 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 3660 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 3720 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 3780 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 3840 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 3900 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 3960 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 4020 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 4080 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 4140 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 4200 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 4260 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 4320 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 4380 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 4440 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 4500 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 4560 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 4620 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 4680 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 4740 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 4800 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 4860 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 4920 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 4980 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 5040 ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 5100 ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 5160 tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga 5220 ttcattaatg caggggccgc tgcggc 5246 <210> 7 <211> 582 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60 ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120 aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180 agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240 atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300 gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360 catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga 420 gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480 actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540 aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582 <210> 8 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggcgcgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagact gccatggcct tgacctttgc 60 tttactggtg gccctcctgg tgctcagctg caagtcaagc tgctctgtgg gctgtgatct 120 gcctcaaacc cacagcctgg gtagcaggag gaccttgatg ctcctggcac agatgaggag 180 aatctctctt ttctcctgct tgaaggacag acatgacttt ggatttcccc aggaggagtt 240 tggcaaccag ttccaaaagg ctgaaaccat ccctgtcctc catgagatga tccagcagat 300 cttcaatctc ttcagcacaa aggactcatc tgctgcttgg gatgagaccc tcctagacaa 360 attctacact gaactctacc agcagctgaa tgacctggaa gcctgtgtga tacagggggt 420 gggggtgaca gagactcccc tgatgaagga ggactccatt ctggctgtga ggaaatactt 480 ccaaagaatc actctctatc tgaaagagaa gaaatacagc ccttgtgcct gggaggttgt 540 cagagcagaa atcatgagat ctttttcttt gtcaacaaac ttgcaagaaa gtttaagaag 600 taaggaatga ggatccccgg gtaccgagct cgaattctta attaa 645 <210> 9 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys 1 5 10 15 Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser 35 40 45 Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His 65 70 75 80 Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser 85 90 95 Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr 100 105 110 Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val 115 120 125 Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys 130 135 140 Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro 145 150 155 160 Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu 165 170 175 Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 180 185 <210> 10 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg

Claims (16)

  1. 에리트로포이에틴을 발현 및 방출하는 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관(micro-organ)을 포함하는 장기 지속형 에리트로포이에틴 제형으로서,
    상기 미세-기관은 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터를 포함하며,
    상기 벡터는 에리트로포이에틴을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며,
    상기 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터는, 바이러스를 코딩하는 모든 서열이 제거되어 아데노바이러스 단백질을 발현하지 않는, 내인성 유전자가 없는 바이러스 벡터(gutless vector)이고,
    상기 제형을 개체에게 18 - 150 UI (에리트로포이에틴) / kg (개체의 체중) / 일로 투여시 헤모글로빈 수준이 증가하여 적어도 1달간 유지되며,
    상기 증가된 헤모글로빈 수준이 상기 적어도 1달간 상기 증가된 수준에서 90% 이상의 기간 동안 8.5 - 13.8 gm/dl로 유지되는 것을 특징으로 하는, 장기 지속형 에리트로포이에틴 제형.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 상기 조절 서열이 CAG 프로모터, 또는 CAG 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열로 이루어지고, 상기 CAG 프로모터 핵산 서열이 서열번호 4에서 위치 575-1752의 핵산 서열로 이루어지고, 상기 SV-40 폴리아데닐화 서열은 서열번호 4에서 위치 2397-2599의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 장기 지속형 에리트로포이에틴 제형.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관이 유전자 변형된 진피 미세-기관인 것을 특징으로 하는, 장기 지속형 에리트로포이에틴 제형.
  5. 인간 개체에서 장기간 빈혈을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
    에리트로포이에틴을 발현 및 방출하는 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관을 포함하고,
    상기 미세-기관은 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터를 포함하며,
    상기 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터는, 바이러스를 코딩하는 모든 서열이 제거되어 아데노바이러스 단백질을 발현하지 않는, 내인성 유전자가 없는 바이러스 벡터(gutless vector)이고,
    상기 벡터는 에리트로포이에틴을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며,
    a. 상기 조성물의 에리트로포이에틴 방출율은 시험관내에서 결정되며;
    b. 상기 조성물은 18 - 150 UI (에리트로포이에틴) / kg (개체의 체중) / 일의 투여량을 제공할 수 있으며;
    c. 상기 조성물은 상기 개체에서 적어도 1달간 헤모글로빈 수준을 증가시킬 수 있으며, 증가된 헤모글로빈 수준이 상기 적어도 1달간 상기 증가된 수준에서 90% 이상의 기간 동안 8.5 - 13.8 gm/dl로 유지되는 것을 특징으로 하는, 빈혈을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 투여량이 18 - 25 UI (에리트로포이에틴) / kg (개체의 체중) / 일인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 투여량이 35 - 45 UI (에리트로포이에틴) / kg (개체의 체중) / 일인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 투여량이 55 - 65 UI (에리트로포이에틴) / kg (개체의 체중) / 일인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 핵산 서열이 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 상기 조절 서열이 CAG 프로모터, 또는 CAG 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열로 이루어지고, 상기 CAG 프로모터 핵산 서열이 서열번호 4에서 위치 575-1752의 핵산 서열로 이루어지고, 상기 SV-40 폴리아데닐화 서열은 서열번호 4에서 위치 2397-2599의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 변형된 미세-기관이 유전자 변형된 진피 미세-기관인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  12. 제5항에 있어서, 상기 증가된 헤모글로빈 수준이 적어도 1년간 유지되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  13. 제5항에 있어서, 상기 조성물이 상기 빈혈 치료에 사용되기 전 적어도 9일간 시험관내에서 유지되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  14. 제5항에 있어서, 상기 개체가 만성 신장 질환 (CKD)을 앓고 있는 투석 전(pre-dialysis) CKD 개체인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  15. 제5항에 있어서, 상기 개체가 말기 신장 질환을 앓고 있는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  16. 삭제
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8454948B2 (en) 2006-09-14 2013-06-04 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations
US9155749B2 (en) * 2006-09-14 2015-10-13 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations
WO2011159758A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations
TW201517916A (zh) * 2013-03-15 2015-05-16 Lilly Co Eli Ｖｅｇｆｒ１抗體之治療用途
EP3060144A1 (en) 2013-10-24 2016-08-31 Medgenics Medical Israel, Ltd Micro-organs providing sustained delivery of a therapeutic polypeptide and methods of use thereof
KR101645811B1 (ko) 2014-10-08 2016-08-04 (주) 더바이오 스마트폰 부착형 혈액분석장치
KR101653931B1 (ko) 2015-10-20 2016-09-02 (주) 더바이오 스마트폰 거치형 혈액분석장치
CN111118016B (zh) * 2018-10-30 2022-04-15 上海朗昇生物科技有限公司 治疗视网膜色素变性疾病的基因治疗载体

Family Cites Families (158)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US376511A (en) 1888-01-17 James d
US1516071A (en) 1921-11-02 1924-11-18 Stanley L Apolant Method of performing skin-grafting operations and surgical instrument used therefor
US3076461A (en) 1956-12-31 1963-02-05 Meek Cicero Parker Microdermatome
US3470782A (en) 1966-01-03 1969-10-07 Eric O Acker Slitting machine
US3613242A (en) 1966-12-29 1971-10-19 Michigan Research Corp Skin graft cutter
CA992255A (en) 1971-01-25 1976-07-06 Cutter Laboratories Prosthesis for spinal repair
DE7235643U (de) 1972-09-28 1974-06-27 Fischer A Hüftgelenkkopfprothese
US4115346A (en) 1974-02-12 1978-09-19 Kulzer & Co. Gmbh Hydroxy group containing diesters of acrylic acids and their use in dental material
US4043343A (en) 1975-08-01 1977-08-23 Williams Robert W Forceps
US4391909A (en) 1979-03-28 1983-07-05 Damon Corporation Microcapsules containing viable tissue cells
DE2939057C3 (de) 1979-09-27 1982-02-25 Aesculap-Werke Ag Vormals Jetter & Scheerer, 7200 Tuttlingen Schneidvorrichtung zum Einbringen von Schnitten in die Haut
SE420009B (sv) 1979-12-21 1981-09-07 Ericsson Telefon Ab L M Expanderskruv for fastsettning i en halighet
US4369788A (en) 1980-01-31 1983-01-25 Goald Harold J Reversed forceps for microdisc surgery
US4353888A (en) 1980-12-23 1982-10-12 Sefton Michael V Encapsulation of live animal cells
DE3247387C2 (de) 1982-12-22 1984-11-22 Rolf Prof. Dr.med. 7400 Tübingen Hettich Verfahren zur Herstellung eines Transplantats und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
DE3432897C2 (de) 1984-09-07 1986-07-03 Aesculap-Werke Ag Vormals Jetter & Scheerer, 7200 Tuttlingen Hautnetz-Dermatom
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4966849A (en) 1985-09-20 1990-10-30 President And Fellows Of Harvard College CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression
US5266480A (en) 1986-04-18 1993-11-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional skin culture system
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US4954437A (en) 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
US5804178A (en) 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
US4883666A (en) 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
ATE132266T1 (de) 1987-05-01 1996-01-15 Stratagene Inc Mutagenesetest durch verwendung von nicht menschlichen lebewesen, die test-dns-sequenzen enthalten
US4951684A (en) 1987-05-15 1990-08-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Device for collecting biological material
US5175385A (en) 1987-09-03 1992-12-29 Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center Virus-resistant transgenic mice
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
WO1989005358A1 (en) 1987-11-30 1989-06-15 University Of Iowa Research Foundation Dna and rna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5024841A (en) 1988-06-30 1991-06-18 Collagen Corporation Collagen wound healing matrices and process for their production
US5221778A (en) 1988-08-24 1993-06-22 Yale University Multiplex gene regulation
CA2000181A1 (en) 1988-10-14 1990-04-14 Chung-Faye Chao Process for producing cultured epidermal sheet, product and method of use
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5175383A (en) 1989-02-17 1992-12-29 President And Fellows Of Harvard College Animal model for benign prostatic disease
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5043711A (en) 1989-06-09 1991-08-27 Xerox Corporation Representation of polygons defined by non-zero winding numbers
US4973301A (en) 1989-07-11 1990-11-27 Israel Nissenkorn Catheter and method of using same
EP0455757B1 (en) 1989-08-04 1999-03-31 GRANDICS, Peter An integrated cell culture-protein purification system for the automated production and purification of cell culture products
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
JPH0390237A (ja) 1989-08-31 1991-04-16 Matsutani Seisakusho Co Ltd アイレス縫合針の加工方法
DE3936703A1 (de) 1989-11-03 1991-05-08 Lutz Biedermann Knochenschraube
US5059193A (en) 1989-11-20 1991-10-22 Spine-Tech, Inc. Expandable spinal implant and surgical method
CH680564A5 (ko) 1989-12-07 1992-09-30 Experimentelle Chirurgie Schwe
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
DE4104092A1 (de) 1990-02-13 1991-08-14 Christoph Dr Med Rieger Von einem flexiblen kunststoffschlauch ueberzogene metallkanuele
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
CA2080693C (en) 1990-04-24 2001-11-27 Mark Eisenberg Composite living skin equivalents
ATE260974T1 (de) 1990-06-15 2004-03-15 Scios Inc Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt
US5236445A (en) 1990-07-02 1993-08-17 American Cyanamid Company Expandable bone anchor and method of anchoring a suture to a bone
US5725529A (en) 1990-09-25 1998-03-10 Innovasive Devices, Inc. Bone fastener
US5268001A (en) 1990-09-25 1993-12-07 Innovasive Devices, Inc. Bone fastener
US5288846A (en) 1990-10-19 1994-02-22 The General Hospital Corporation Cell specific gene regulators
US5720753A (en) 1991-03-22 1998-02-24 United States Surgical Corporation Orthopedic fastener
EP0585368B1 (en) 1991-04-25 1997-08-06 Brown University Research Foundation Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products
GB9112898D0 (en) 1991-06-14 1991-07-31 Digital Equipment Int Communication networks
DK0610345T3 (da) 1991-10-21 2000-10-23 Cell Genesys Inc Kombinerede cellulære og immunosuppressive terapier
US5298422A (en) 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
AU671093B2 (en) 1992-01-07 1996-08-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Transgenic animal models for alzheimer's disease
US5360735A (en) 1992-01-08 1994-11-01 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human 5-HT1F receptor, vectors, and host cells
US5958764A (en) 1992-04-30 1999-09-28 Baylor College Of Medicine Specific expression vectors and methods of use
EP0652948B1 (en) 1992-04-30 2001-11-14 Baylor College Of Medicine Development of a vector to target gene expression to the epidermis of transgenic animals
JP2660641B2 (ja) 1992-07-22 1997-10-08 株式会社東洋設計 ロール混練機の材料巻込み機構
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
WO1994006908A1 (en) 1992-09-11 1994-03-31 The Regents Of The University Of California Transgenic non-human animals having targeted lymphocyte transduction genes
US5888720A (en) 1992-10-27 1999-03-30 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem In vitro micro-organs
US5423330A (en) 1993-03-10 1995-06-13 The University Of Miami Capsule suction punch instrument and method of use
CA2158443C (en) 1993-03-16 2003-11-25 Stephen E. Hughes Method for preparation and transplantation of volute grafts and surgical instrument therefor
WO1994023049A2 (en) 1993-04-02 1994-10-13 The Johns Hopkins University The introduction and expression of large genomic sequences in transgenic animals
US6664107B1 (en) 1993-05-26 2003-12-16 Ontario Cancer Institute, University Health Network CD45 disrupted nucleic acid
US5480400A (en) 1993-10-01 1996-01-02 Berger; J. Lee Method and device for internal fixation of bone fractures
US5423850A (en) 1993-10-01 1995-06-13 Berger; J. Lee Balloon compressor for internal fixation of bone fractures
JP3585238B2 (ja) 1993-12-09 2004-11-04 トーマス ジェファーソン ユニバーシティー 真核細胞における部位特異的突然変異誘発のための化合物および方法
US6248110B1 (en) 1994-01-26 2001-06-19 Kyphon, Inc. Systems and methods for treating fractured or diseased bone using expandable bodies
WO1995020362A1 (en) 1994-01-26 1995-08-03 Reiley Mark A Improved inflatable device for use in surgical protocol relating to fixation of bone
US5477862A (en) 1994-03-14 1995-12-26 Haaga; John R. Cutting tip for biopsy needle
EP0679402B1 (en) 1994-04-25 2003-09-10 Japan Science and Technology Corporation Biologically active substance-secreting hybrid gel
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US5622866A (en) 1994-06-23 1997-04-22 Merck & Co., Inc. Expression cassettes useful in construction of integrative and replicative expression vectors for Streptomyces
US5693064A (en) 1994-11-04 1997-12-02 Arnold; James E. Dermal punch for hair transplantation and methods
US6472200B1 (en) 1999-07-23 2002-10-29 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Device and method for performing a biological modification of a fluid
WO2003035851A1 (en) 2001-10-23 2003-05-01 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem In vitro micro-organs, and uses related thereto
US20030157074A1 (en) 1994-11-16 2003-08-21 Mitrani Eduardo N. Vitro micro-organs, and uses related thereto
JP3091113B2 (ja) 1994-11-22 2000-09-25 科学技術振興事業団 生理活性物質分泌性のハイブリッド型ゲル
US5782851A (en) 1996-04-10 1998-07-21 Rassman; William R. Hair transplantation system
US5652256A (en) 1995-06-06 1997-07-29 Knowles; W. Roy Topical composition for fungal treatment
US5861313A (en) 1995-06-07 1999-01-19 Ontogeny, Inc. Method of isolating bile duct progenitor cells
US5985653A (en) 1995-06-07 1999-11-16 Aastrom Biosciences, Inc. Incubator apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US5591444A (en) 1995-07-28 1997-01-07 Isolagen Technologies, Inc. Use of autologous dermal fibroblasts for the repair of skin and soft tissue defects
JPH11511975A (ja) 1995-08-25 1999-10-19 ライフセル コーポレイション 再構成皮膚
US5857982A (en) 1995-09-08 1999-01-12 United States Surgical Corporation Apparatus and method for removing tissue
US6090618A (en) 1996-10-07 2000-07-18 Arch Development Corporation DNA constructs and viral vectors comprising a smooth muscle promoter
US5782830A (en) 1995-10-16 1998-07-21 Sdgi Holdings, Inc. Implant insertion device
US5932459A (en) 1995-10-20 1999-08-03 Sittinger; Michael Artificial tissues, methods for the production and the use thereof
US6071284A (en) 1995-10-30 2000-06-06 Biomedical Enterprises, Inc. Materials collection system and uses thereof
DE19607517C1 (de) 1996-02-28 1997-04-10 Lutz Biedermann Knochenschraube
AU722375B2 (en) 1996-09-06 2000-08-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
NL1004276C2 (nl) 1996-10-15 1998-04-20 Willem Marie Ysebaert Werkwijzen voor het vervaardigen van huideilandjes, voor het verplaatsen van huid of huideilandjes, voor het spreiden van huideilandjes en het aanbrengen hiervan op een brandwond, alsmede een houder, snijraam, snijtafel, contradrager, klemorgaan, membraan, transportorgaan en spreidingsorgaan om te worden toegepast voor dergelijke werkwijzen.
KR20000049243A (ko) 1996-10-18 2000-07-25 이. 엘. 나가부샨, 리차드 비. 머피 인터페론-알파 핵산의 운반 및 발현 방법 및 이를 위한 조성물
HK1045171A1 (zh) 1997-01-16 2002-11-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem 进行一种液体的生物学上改良的装置及方法
US5817120A (en) 1997-02-10 1998-10-06 Rassman; William R. Hair implanting instrument
WO1998039035A1 (en) 1997-03-07 1998-09-11 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Method and compositions for healing tissue defects and inducing hypervascularity in mammalian tissue
US5972015A (en) 1997-08-15 1999-10-26 Kyphon Inc. Expandable, asymetric structures for deployment in interior body regions
US6171812B1 (en) 1997-07-15 2001-01-09 The National Institute Of Biogerontology, Inc. Combined perfusion and mechanical loading system for explanted bone
GB9716198D0 (en) 1997-07-31 1997-10-08 Plessey Telecomm RAP routeing for ISO 10589
CA2298811A1 (en) 1997-07-31 1999-02-11 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for the treatment of grafts
CA2300964A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Ludwig Institute For Cancer Research Stimulation, modulation and/or inhibition of endothelial proteolytic activity and/or angiogenic activity
AU767312B2 (en) 1997-08-19 2003-11-06 Philipp Lang Measurement of capillary related interstitial fluid using ultrasound methods and devices
US20040019923A1 (en) 1997-10-16 2004-01-29 Ivarie Robert D. Exogenous proteins expressed in avians and their eggs
US7687057B2 (en) 1998-01-09 2010-03-30 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem In vitro micro-organs, and uses related thereto
WO1999043270A1 (en) 1998-02-24 1999-09-02 Gerigene Medical Corporation Augmentation and repair of dermal, subcutaneous, and vocal cord tissue defects
US6331166B1 (en) 1998-03-03 2001-12-18 Senorx, Inc. Breast biopsy system and method
EP1064353B1 (en) 1998-03-18 2002-11-06 Massachusetts Institute Of Technology Vascularized perfused microtissue/micro-organ arrays
WO1999047678A2 (en) 1998-03-19 1999-09-23 Valentis, Inc. Interferon alpha plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same
US6303136B1 (en) 1998-04-13 2001-10-16 Neurotech S.A. Cells or tissue attached to a non-degradable filamentous matrix encapsulated by a semi-permeable membrane
US5944673A (en) 1998-05-14 1999-08-31 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Biopsy instrument with multi-port needle
US6027512A (en) 1998-05-28 2000-02-22 Bridges; Ronzee M. Hair follicle harvesting device
WO2000011151A2 (en) 1998-08-25 2000-03-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Direct oviduct transgenesis
CA2362593A1 (en) 1999-02-10 2000-08-17 Curis, Inc. Pancreatic progenitor cells, methods and uses related thereto
US6264659B1 (en) 1999-02-22 2001-07-24 Anthony C. Ross Method of treating an intervertebral disk
US6245101B1 (en) 1999-05-03 2001-06-12 William J. Drasler Intravascular hinge stent
CN1361793A (zh) 1999-05-19 2002-07-31 利思进药品公司 干扰素－α蛋白作为Fc融合蛋白的表达和运输
EP1374889A1 (en) 1999-06-25 2004-01-02 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method of inducing angiogenesis by micro-organs
US20030152562A1 (en) * 2001-10-23 2003-08-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Vitro micro-organs, and uses related thereto
MXPA02000877A (es) 1999-07-28 2002-08-06 Regeneration Tech Inc Matriz de hueso o cartilago como un vehiculo para suministro de acido nucleico.
JP2005098702A (ja) 1999-10-07 2005-04-14 Seitai Kagaku Kenkyusho:Kk 生物組織試料作製方法および器具
WO2001042449A2 (en) 1999-12-10 2001-06-14 Anticancer, Inc. Methods for introducing genes into mammalian subjects
US6893462B2 (en) 2000-01-11 2005-05-17 Regeneration Technologies, Inc. Soft and calcified tissue implants
WO2001060424A2 (en) 2000-02-18 2001-08-23 Regeneration Technologies, Inc. Implantable tissues infused with growth factors and other additives
AU2001250922A1 (en) 2000-03-22 2001-10-03 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Secreting products from skin by adeno-associated virus (aav) gene transfer
US20020154114A1 (en) 2000-11-30 2002-10-24 Christensen Thomas Kragh Method and system for customising build-to-order products
DE60215644T2 (de) 2001-06-22 2007-02-15 Dow Agrosciences Llc, Indianapolis 2-(2,6-disubstituierte phenyl)-4-aryl-5-alkyl-1,3-oxazoline derivate zur verwendung als insektizide und acarizide
ES2184623B1 (es) 2001-06-29 2004-09-16 Centro De Investigaciones Energeticas, Medioambientales Y Tecnologicas (C.I.E.M.A.T.) Piel artificial autologa secretora de leptina y metodo de obtencion.
WO2003006669A2 (en) * 2001-07-09 2003-01-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Efficient methods for assessing and validating candidate protein-based therapeutic molecules encoded by nucleic acid sequences of interest
AU2002325758A1 (en) * 2001-09-20 2003-04-01 Centre For Translational Research In Cancer Cultured stromal cells and uses thereof
IL161472A0 (en) 2001-10-23 2004-09-27 Yissum Res Dev Co In vitro micro-organs, and uses related thereto
US7468242B2 (en) 2001-11-05 2008-12-23 Medgenics, Inc. Dermal micro organs, methods and apparatuses for producing and using the same
IL161746A0 (en) * 2001-11-05 2005-11-20 Medgenics Inc Closed automated system for tissue based therapy, dosing and administration using same
EP1463823B1 (en) 2001-12-06 2013-03-06 Fibrogen, Inc. Methods of increasing endogenous erythropoietin (epo)
JP3806900B2 (ja) 2001-12-11 2006-08-09 独立行政法人産業技術総合研究所 育毛剤
US7297540B2 (en) 2002-01-15 2007-11-20 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Methods of generating tissue using devitalized, acellular scaffold matrices derived from micro-organs
US7666134B2 (en) 2002-09-28 2010-02-23 Kci Licensing, Inc. System and method for transplantation of dermal tissue
US20040091961A1 (en) 2002-11-08 2004-05-13 Evans Glen A. Enhanced variants of erythropoietin and methods of use
NZ540043A (en) 2002-11-18 2007-11-30 Maxygen Inc Isolated or recombinant Interferon-alpha polypeptides and conjugates
CA2516554C (en) 2003-02-27 2012-09-25 Applied Tissue Technologies, Llc Method and apparatus for processing dermal tissue
US7708746B2 (en) 2003-02-27 2010-05-04 Wright Medical Technology, Inc. Method and apparatus for processing dermal tissue
JP5128813B2 (ja) * 2003-05-01 2013-01-23 メドジニックス・インコーポレイテッド 真皮小器官及びそれを作成及び使用するための方法及び器具
DE102004037611B4 (de) 2004-08-03 2013-10-02 Geneart Ag Induzierbare Genexpression
WO2006110843A2 (en) 2005-04-12 2006-10-19 Applied Tissue Technologies Llc Engineered deremal tissue particles and transplantation methods
US7785339B2 (en) 2005-08-09 2010-08-31 Innovia, Llc Tool for coring portions of one or more hair follicles
US9155749B2 (en) 2006-09-14 2015-10-13 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations
WO2011159758A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013532152A (ja) 2013-08-15
EP2582396A2 (en) 2013-04-24
AU2014224093A1 (en) 2014-10-02
AU2011268458B2 (en) 2014-06-12
US20110286983A1 (en) 2011-11-24
AU2011268458A2 (en) 2013-01-31
WO2011159758A4 (en) 2012-03-08
KR20130086035A (ko) 2013-07-30
AU2011268458A1 (en) 2013-01-24
WO2011159758A3 (en) 2012-02-09
CN103260649A (zh) 2013-08-21
CA2802726A1 (en) 2011-12-22
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