JP2024530647A - 標的ｒｎａ送達のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、標的遺伝子の発現および機能、例えば、ＰＣＳＫ９などの、脂質およびコレステロール代謝に関与するタンパク質を改変するための治療剤の標的送達のための、組成物、その製造方法、ならびに方法が提供される。【選択図】図４８
Description
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、それらの各々が、その全体が参照によって、本明細書に組み込まれる、２０２１年８月３日に出願された米国仮出願第６３／２２９，０６０号、２０２１年９月２２日に出願された米国仮出願第６３／２４６，８５８号、および２０２１年１１月３日に出願された米国仮出願第６３／２７５，３３５号の利益を主張する。
[0001]本出願は、それらの各々が、その全体が参照によって、本明細書に組み込まれる、２０２１年８月３日に出願された米国仮出願第６３／２２９，０６０号、２０２１年９月２２日に出願された米国仮出願第６３／２４６，８５８号、および２０２１年１１月３日に出願された米国仮出願第６３／２７５，３３５号の利益を主張する。
開示の分野
[0002]本開示は、遺伝子編集能力を改善するための脂質ナノ粒子を形成する方法に関する。本開示はまた、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡおよび他の核酸薬剤などの治療剤の標的送達のための組成物および方法にも関する。
[0002]本開示は、遺伝子編集能力を改善するための脂質ナノ粒子を形成する方法に関する。本開示はまた、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡおよび他の核酸薬剤などの治療剤の標的送達のための組成物および方法にも関する。
[0003]本明細書の全ての刊行物は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれるように示された場合と同程度まで、参照により組み込まれる。以下の説明は、本開示を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれかが先行技術であるか、もしくは現在請求されている発明に関連していること、または具体的または暗示的に参照されているなんらの出版物も先行技術であることを認めるものではない。
[0004]一態様では、本明細書に記載されるのは、ＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子（ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、（ｉ）１つもしくは複数の核酸活性剤、（ｉｉ）ステロールもしくはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つもしくは複数の脂質賦形剤、ならびに／または（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つ、および（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、抗酸化剤を前記第１の溶液と組み合わせるステップを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、前記第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを形成するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを実行するステップを含み得る。
[0005]いくつかの実施形態では、この方法のステップは同時に行われる。いくつかの実施形態では、この方法のステップは連続して行われる。
[0006]いくつかの実施形態では、水性緩衝液はポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールは、約２００～約１０００の範囲（例えば、約２００、約４００、約５００、約６００、または約１０００）の数平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＧａｌＮＡｃ－脂質を水溶液中で希釈して、希釈ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液を生成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、対象への直接投与用に構成されている。いくつかの実施形態では、この方法は、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを溶液中で１回または複数回希釈するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、前記水混和性有機溶媒を緩衝溶液と１回または複数回交換するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、濃縮するステップは、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを膜に通過させるステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第２の濃縮プロセスをさらに含み、第２の濃縮は、交換緩衝液を膜に通過させることによって前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップを含む。
[0006]いくつかの実施形態では、水性緩衝液はポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールは、約２００～約１０００の範囲（例えば、約２００、約４００、約５００、約６００、または約１０００）の数平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＧａｌＮＡｃ－脂質を水溶液中で希釈して、希釈ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液を生成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、対象への直接投与用に構成されている。いくつかの実施形態では、この方法は、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを溶液中で１回または複数回希釈するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、前記水混和性有機溶媒を緩衝溶液と１回または複数回交換するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、濃縮するステップは、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを膜に通過させるステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第２の濃縮プロセスをさらに含み、第２の濃縮は、交換緩衝液を膜に通過させることによって前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップを含む。
[0007]いくつかの実施形態では、この方法は、膜を通して前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濾過するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ステップｅの後に第２のインキュベーションをさらに含み、インキュベーションは約１分～約１２０分行われる。いくつかの実施形態では、この方法は、摂氏約－８０度（℃）～約２５℃の温度で前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを保存するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、摂氏約－８０度（℃）、または約２℃～約８℃の温度で前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを保存するステップをさらに含む。
[0008]いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）保存されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを解凍するステップ、（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰをプールするステップ、（ｉｉｉ）溶液中でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを希釈するステップ、および（ｉｖ）対象に前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの用量を投与する前に膜を通して前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濾過するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を実施する順序は逆にされる。いくつかの実施形態では、前記混和性有機溶媒は、エタノールである。いくつかの実施形態では、前記抗酸化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。いくつかの実施形態では、前記第２の溶液は、全ての受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、前記受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部は、混合ステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わせられる。
[0009]いくつかの実施形態では、混合は、インラインミキサー、クロスミキサー、またはＴミキサー装置で行われる。いくつかの実施形態では、混合は、層流混合、ボルテックス混合、乱流混合、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、接線流濾過（ＴＦＦ）プロセスを使用して、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、クロマトグラフィー、透析、またはＴＦＦプロセスを使用して、緩衝液交換を行うステップをさらに含む。
[0010]いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。いくつかの実施形態では、前記ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートは、表４で特定される構造から選択される。いくつかの実施形態では、混合は、前記第１の溶液を前記第１の混合チャンバに別々に導入する第１のポートと、前記第２の溶液を前記第１の混合チャンバに別々におよび同時に導入する第２のポートとを備える、第１の混合チャンバを有するインライン混合装置によって行われる。いくつかの実施形態では、前記第１の溶液はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートの濃度（ｍｏｌ％）は、約０．０１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態では、前記中性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。いくつかの実施形態では、前記ステルス脂質は、ポリエチレングリコール－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である。いくつかの実施形態では、前記第２の溶液中の前記ステルス脂質濃度は、０ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態では、前記核酸薬剤の濃度は、約０．１～約５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、４、または５ｍｇ／ｍＬ）である。いくつかの実施形態では、前記混合物は、約１分～約２４時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、前記混合物は、約１分～約１２０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、前記混合物は、約１時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液は、Ｔｒｉｓ緩衝液を含む。
[0011]いくつかの実施形態では、最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液は、凍結保護剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記凍結保護剤はスクロースである。いくつかの実施形態では、前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度は、約０．１ｍＭ～約５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度は、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度は、約３００ｍＭである。
[0012]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、摂氏約－８０度（℃）の温度で保存される。いくつかの実施形態では、最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液は、凍結保護剤をさらに含まない。いくつかの実施形態では、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約２℃～約８℃で保存される。いくつかの実施形態では、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約６～約９のｐＨを有する溶液中にある。いくつかの実施形態では、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約７～８（例えば、７～８、７．２～７．８、７．３～７．７、または７．４～７．６）のｐＨを有する溶液中にある。
[0013]いくつかの実施形態では、この方法は、総体積に対して少なくとも０．０１（例えば、少なくとも０．０１、０．０５、０．１、または０．５）ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、総体積に対して少なくとも１ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、総体積に対して少なくとも３ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、総体積に対して少なくとも５ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む。
[0014]いくつかの実施形態では、この方法は、総体積に対して少なくとも７ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、総体積に対して少なくとも９ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、総体積に対して少なくとも１０ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む。
[0015]別の態様では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される方法によって調製することが可能なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。いくつかの実施形態では、前記ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布は実質的に均一である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、約０．０１～０．５ｍｏｌ％の濃度でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰに存在する。
[0016]別の態様では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるものなどのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを哺乳動物に投与する方法である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬｒ）遺伝子およびＣａｓ９ ｍＲＮＡを標的とする１つまたは複数のｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数の前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを含む用量を哺乳動物に投与し、それによって前記用量を投与していない対応する対象と比較して、血液中のＬＤＬ－Ｃレベルを少なくとも３００％増加させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ＬＤＬ－Ｃレベルは少なくとも３５０％増加する。いくつかの実施形態では、前記ＬＤＬ－Ｃレベルは少なくとも４００％増加する。いくつかの実施形態では、前記ＬＤＬ－Ｃレベルは少なくとも５００％増加する。いくつかの実施形態では、前記ＬＤＬ－Ｃレベルは少なくとも５５０％増加する。いくつかの実施形態では、前記ＬＤＬ－Ｃレベルは少なくとも６００％増加する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｇＲＮＡは、ＧＡ４６８／ＧＡ４７０および／またはＧＡ４６９／ＧＡ４７１を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡはＭＳ００４である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（例えば、カニクイザル）である。
[0017]別の態様では、本明細書に記載されるのは、アデニンベースエディター（ＡＢＥ）ｍＲＮＡを含むＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。いくつかの実施形態では、前記ｍＲＮＡはＭＡ００４である。いくつかの実施形態では、ＡＢＥ ｍＲＮＡは、本明細書に記載される３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、表１９のＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、本明細書に記載されるＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、本明細書に記載されるＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをさらに含む。
[0018]いくつかの実施形態では、ＡＢＥ ｍＲＮＡは、本明細書に記載される５’ＵＴＲ、例えば、表１９のＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、本明細書に記載されるＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、本明細書に記載されるＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをさらに含む。
[0019]いくつかの実施形態では、前記ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布は、哺乳動物細胞において約１５％～約６０％のＰＣＳＫ９編集パーセント（％）を提供する。いくつかの実施形態では、前記ＰＣＳＫ９編集％は約５０％～６０％である。いくつかの実施形態では、前記ＰＣＳＫ９編集％は約４０％～約５０％である。いくつかの実施形態では、前記ＰＣＳＫ９編集％は約３０％～約４０％である。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９編集％は約２０％～約３０％である。
[0020]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い編集パーセントによって決定されるとおり、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供する。いくつかの実施形態では、前記編集パーセントは、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５０％高い。いくつかの実施形態では、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い編集パーセントによって決定されるとおり、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供する。いくつかの実施形態では、前記編集パーセントは、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５０％高い。
[0021]別の態様では、本明細書に記載されるのは、受容体ターゲティングコンジュゲートを含むＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであって、受容体ターゲティングコンジュゲートが、式（Ｖ）：
[0022]
[0022]
[0023]
の化合物を含み、
[0024]式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
[0025]各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－、または結合であり；
[0026]Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
[0027]各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
[0028]Ｒは、親油性有機残基であり；
[0029]ｍは、１～１０から選択される整数であり；
[0030]ｎは、１～２００から選択される整数であり；
[0031]ｐは、１～２００から選択される整数である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。
の化合物を含み、
[0024]式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
[0025]各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－、または結合であり；
[0026]Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
[0027]各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
[0028]Ｒは、親油性有機残基であり；
[0029]ｍは、１～１０から選択される整数であり；
[0030]ｎは、１～２００から選択される整数であり；
[0031]ｐは、１～２００から選択される整数である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。
[0032]別の態様では、本明細書に記載されるのは、受容体ターゲティングコンジュゲートを含むＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであって、受容体ターゲティングコンジュゲートが、式（ＶＩ）の化合物：
[0033]
[0033]
[0034]
を含み、
[0035]式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
[0036]各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
[0037]Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
[0038]各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
[0039]Ｒは、親油性有機残基であり；
[0040]ｍは、１～１０から選択される整数であり；
[0041]ｎは、１～２００から選択される整数であり；
[0042]ｐは、１～２００から選択される整数である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。
を含み、
[0035]式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
[0036]各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
[0037]Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
[0038]各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
[0039]Ｒは、親油性有機残基であり；
[0040]ｍは、１～１０から選択される整数であり；
[0041]ｎは、１～２００から選択される整数であり；
[0042]ｐは、１～２００から選択される整数である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。
[0043]いくつかの実施形態では、Ａは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体である。
[0044]別の態様では、本明細書に記載されるのは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）またはヒト対象にＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを投与することによって前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを導入するステップを含む、遺伝子を編集する方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、末梢静脈（例えば、伏在または上腕）でのＩＶ注入を介してＮＨＰに導入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの各々は独立して、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、または６ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、ＮＨＰは、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの導入の前にステロイドで処置される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの導入は、少なくとも１５日（例えば、約１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１８０日）の期間にわたって少なくとも約２０％（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、または７０％）の遺伝子編集をもたらす。
[0044]別の態様では、本明細書に記載されるのは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）またはヒト対象にＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを投与することによって前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを導入するステップを含む、遺伝子を編集する方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、末梢静脈（例えば、伏在または上腕）でのＩＶ注入を介してＮＨＰに導入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの各々は独立して、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、または６ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、ＮＨＰは、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの導入の前にステロイドで処置される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの導入は、少なくとも１５日（例えば、約１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１８０日）の期間にわたって少なくとも約２０％（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、または７０％）の遺伝子編集をもたらす。
[0045]いくつかの実施形態では、少なくとも２つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、非ヒト霊長類に導入される。いくつかの実施形態では、ＮＨＰは、筋肉内注射によりステロイドで処置される。いくつかの実施形態では、ステロイドはデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、ステロイドは、ファモチジンおよび／またはジフェンヒドラミンと同時投与される。いくつかの実施形態では、この方法は、ＬＤＬＲ ＫＤ／ＫＯ ＮＨＰを生成するために使用される。いくつかの実施形態では、ＮＨＰは、ＬＤＬｒノックアウトを有する。
[0046]別の態様では、本明細書に記載されるのは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤、ならびに（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤を含む、方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、水混和性有機溶媒中に１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、任意選択で、抗酸化剤を前記第１の溶液と組み合わせるステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、前記第１の溶液と第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＬＮＰを形成するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを任意選択で実行するステップを含む。
[0047]別の態様では、本明細書に記載されるのは、式（ＶＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩：
[0048]
[0048]
[0049]
を含む組成物であって、
[0050]式中、Ａは、受容体ターゲティング部分（例えば、
を含む組成物であって、
[0050]式中、Ａは、受容体ターゲティング部分（例えば、
）であり；
[0051]Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は、
[0051]Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は、
であり；
[0052]Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は、
[0052]Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は、
であり；
[0053]Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり；
[0054]Ｌ１０は、非置換のＣ２アルキレンであり；
[0055]Ｌ１１は、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ＋１－であり；
[0056]Ｒ１は、水素であり；
[0057]Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｒは、
[0053]Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり；
[0054]Ｌ１０は、非置換のＣ２アルキレンであり；
[0055]Ｌ１１は、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ＋１－であり；
[0056]Ｒ１は、水素であり；
[0057]Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｒは、
であり、ｎは、３３、３４、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数であり；または
[0058]Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり、Ｒは、非置換のＣ１８～Ｃ２０アルキルであり、ｎは、１、１１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数である、組成物である。
[0058]Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり、Ｒは、非置換のＣ１８～Ｃ２０アルキルであり、ｎは、１、１１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数である、組成物である。
[0059]いくつかの実施形態では、化合物は、
[0060]１０８８（ｎ＝３３）
[0060]１０８８（ｎ＝３３）
[0061]１０８９（ｎ＝３４）
[0062]
[0063]１０９０（ｎ＝３５）
[0063]１０９０（ｎ＝３５）
[0064]
[0065]および１０９２（ｎ＝３７）
[0065]および１０９２（ｎ＝３７）
[0066]の群から選択される。
[0067]別の態様では、本明細書に記載されるのは、式（Ｖ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩：
[0068]
[0067]別の態様では、本明細書に記載されるのは、式（Ｖ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩：
[0068]
[0069]
を含む組成物であって、
[0070]式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
[0071]Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ７は、非置換のＣ４アルキレンであり；
[0072]Ｌ６、およびＬ９は、非置換のＣ３アルキレンであり；
[0073]Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり；
[0074]Ｌ１０は、非置換のＣ２アルキレンであり；
[0075]Ｌ１１は、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ＋１－であり；
[0076]Ｒ１は、水素であり；
[0077]Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｒは、
を含む組成物であって、
[0070]式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
[0071]Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ７は、非置換のＣ４アルキレンであり；
[0072]Ｌ６、およびＬ９は、非置換のＣ３アルキレンであり；
[0073]Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり；
[0074]Ｌ１０は、非置換のＣ２アルキレンであり；
[0075]Ｌ１１は、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ＋１－であり；
[0076]Ｒ１は、水素であり；
[0077]Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｒは、
であり、ｎは、３３、３４、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数であり；または
[0078]Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり、Ｒは、非置換のＣ１８～Ｃ２０アルキルであり、
[0079]ｎは、１、１１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数である。
[0078]Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり、Ｒは、非置換のＣ１８～Ｃ２０アルキルであり、
[0079]ｎは、１、１１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数である。
[0080]
[0081]いくつかの実施形態では、化合物は、
[0082]１１０１（ｎ＝３３）
[0081]いくつかの実施形態では、化合物は、
[0082]１１０１（ｎ＝３３）
[0083]１１０２（ｎ＝３４）
[0084]１１０３（ｎ＝３５）
[0085]１１０５（ｎ＝３７）
[0086]１１０６（ｎ＝３８）
[0087]１１０７（ｎ＝３９）
[0088]１１０８（ｎ＝４０）
[0089]１１１２（ｎ＝１）
[0090]１１１３（ｎ＝１１）
[0091]１１１４（ｎ＝３３）
[0092]１１１５（ｎ＝３４）
[0093]１１１６（ｎ＝３５）
[0094]１１１７（ｎ＝３６）
[0095]１１１８（ｎ＝３７）
[0096]１１１９（ｎ＝３８）
[0097]１１２０（ｎ＝３９）
[0098]１１２１（ｎ＝４０）
[0099]１１２２（ｎ＝４１）
[0100]１１２３（ｎ＝４２）
[0101]１１２４（ｎ＝４３）
[0102]１１２５（ｎ＝１）
[0103]
[0104]１１２６（ｎ＝１１）
[0104]１１２６（ｎ＝１１）
[0105]１１２７（ｎ＝３３）
[0106]１１２８（ｎ＝３４）
[0107]１１２９（ｎ＝３５）
[0108]１１３０（ｎ＝３６）
[0109]１１３１（ｎ＝３７）
[0110]１１３２（ｎ＝３８）
[0111]１１３３（ｎ＝３９）
[0112]１１３４（ｎ＝４０）
[0113]１１３５（ｎ＝４１）
[0114]１１３６（ｎ＝４２）
[0115]１１３７（ｎ＝４３）
[0116]１１４０（ｎ＝３３）
[0117]１１４１（ｎ＝３４）
[0118]１１４２（ｎ＝３５）
[0119]１１４４（ｎ＝３７）
[0120]１１４５（ｎ＝３８）
[0121]１１４６（ｎ＝３９）
[0122]１１４７（ｎ＝４０）
[0123]１１４８（ｎ＝４１）
[0124]１１４９（ｎ＝４２）
および
[0125]１１５０（ｎ＝４３）
[0125]１１５０（ｎ＝４３）
の群から選択される。
[0126]別の態様では、本明細書に記載されるのは、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを含む薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、
[0127]１つまたは複数の核酸活性剤；
[0128]ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤；ならびに
[0129]ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートであって、ＧａｌＮａｃ－ＬＮＰが、表１４、表１５、表１６、または表１７から選択される賦形剤ｍｏｌ％比に従って製剤化される、ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。
[0126]別の態様では、本明細書に記載されるのは、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを含む薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、
[0127]１つまたは複数の核酸活性剤；
[0128]ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤；ならびに
[0129]ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートであって、ＧａｌＮａｃ－ＬＮＰが、表１４、表１５、表１６、または表１７から選択される賦形剤ｍｏｌ％比に従って製剤化される、ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。
[0130]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰはアミノ脂質を含み、アミノ脂質はＶＬ４２２の構造
を有する。
[0131]
[0132]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、
[0133]１つまたは複数の核酸活性剤；
[0134]ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤；
[0135]ＶＬ４２２の構造
[0131]
[0132]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、
[0133]１つまたは複数の核酸活性剤；
[0134]ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤；
[0135]ＶＬ４２２の構造
を有するアミノ脂質を含む１つまたは複数の脂質賦形剤
[0136]ならびに
[0137]（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。
[0136]ならびに
[0137]（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。
[0138]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰはアミノ脂質を含み、アミノ脂質は、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、または５０７の構造を有する。
[0139]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰはステルス脂質を含み、脂質はＶＰ１５８の構造
[0140]
を有する。
[0141]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰはステルス脂質を含み、脂質はＶＰ１５９の構造
を有する。
[0141]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰはステルス脂質を含み、脂質はＶＰ１５９の構造
[0142]
を有する。
[0143]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、少なくとも２つのＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～１ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．５ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．２５ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．１ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．０５ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．０１ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７９を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。
を有する。
[0143]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、少なくとも２つのＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～１ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．５ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．２５ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．１ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．０５ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約０～０．０１ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７９を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。
[0144]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約４０～６０ｍｏｌ％のアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約４５ｍｏｌ％のアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約５０ｍｏｌ％のアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約５５ｍｏｌ％のアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約３４～３５（例えば、３４．１、３４．６、または３４．９）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約３７．１～３７．３（例えば、３７．２）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約３７．６～３７．８（例えば、３７．７）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約３７．９～３８．０（例えば、３７．９５）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約３８．１～３８．３（例えば、３８．２）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約３８．３～３８．５（例えば、３８．４）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約４～１０（例えば、４．７、９、または１０）ｍｏｌ％の中性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約１～３（例えば、１．３、１．６、２．１、または３）ｍｏｌ％のステルス脂質を含む。
[0145]別の態様では、本明細書に記載されるのは、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの表面上のＧａｌＮＡｃ脂質の量をアッセイする方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰをＡＳＰＧＲタンパク質と接触させるステップであって、ＡＳＰＧＲタンパク質が検出マーカーで標識されている、ステップと；ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの存在下で検出マーカーのシグナルシフトを測定するステップとを含む。
[0146]いくつかの実施形態では、シグナルシフトは光学シフトである。いくつかの実施形態では、シグナルシフトは、生体層干渉法を使用して測定される。いくつかの実施形態では、検出マーカーはＨｉｓタグである。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＧＲタンパク質は、組換えヒトＡＳＰＧＲタンパク質である。
[0147]一態様では、本明細書に記載されるのは、ＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子（ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤、ならびに（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、（ａ）水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと、（ｂ）（ｉ）１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つ、および（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと、（ｃ）抗酸化剤を前記第１の溶液と組み合わせるステップと、（ｄ）前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合するステップと、（ｅ）前記第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを形成するステップと、（ｆ）任意選択で、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを実行するステップとを含む、方法である。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、水溶液中でさらに希釈されて、希釈ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液を生成する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ溶液は直接投与用に構成されている。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液は、さらに１回または複数回希釈される。一態様では、水混和性有機溶媒は、緩衝液と１回または複数回交換される。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰはさらに濃縮される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを膜に通過させることによって濃縮される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを膜に通過させることによって２回濃縮される。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは膜を通して濾過される。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約１分～約１２０分の範囲で２回インキュベートされる。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約－８０℃～約２５℃の範囲の温度で保存される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは約－８０℃で保存される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約２℃～約８℃で保存される。一態様では、この方法は、（ｉ）保存されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを解凍するステップ、（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰをプールするステップ、（ｉｉｉ）溶液中でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを希釈するステップ、および（ｉｖ）対象または哺乳動物にＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの用量を投与する前に膜を通してＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濾過するステップをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を実施する順序は逆にされる。いくつかの実施形態では、混和性有機溶媒は、エタノールである。いくつかの実施形態では、抗酸化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。一態様では、第２の溶液は、全ての受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。一態様では、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部は、混合ステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、混合は、インラインミキサー、クロスミキサー、またはＴミキサー装置で行われる。いくつかの実施形態では、混合は、層流混合、ボルテックス混合、乱流混合、またはそれらの組合せを含む。一態様では、方法は、接線流濾過（ＴＦＦ）プロセスを使用して、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップをさらに含む。一態様では、方法は、クロマトグラフィー、透析、またはＴＦＦプロセスを使用して、緩衝液交換を行うステップをさらに含む。一態様では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートは、表４で特定される構造から選択される。一態様では、混合は、第１の溶液を第１の混合チャンバに別々に導入する第１のポートと、第２の溶液を第１の混合チャンバに別々におよび同時に導入する第２のポートとを備える、第１の混合チャンバを有するインライン混合装置によって行われる。いくつかの実施形態では、第１の溶液はＲＮＡを含む。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートの濃度（ｍｏｌ％）は、約０．０１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％である。一態様では、中性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。一態様では、ステルス脂質は、ポリエチレングリコール－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である。いくつかの実施形態では、前記第２の溶液中のステルス脂質濃度は、０ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％である。一態様では、核酸薬剤の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬである。一態様では、混合物は、約１分～約２４時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、混合物は、約１分～約１２０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、混合物は、約１時間インキュベートされる。一態様では、最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液は、Ｔｒｉｓ緩衝液を含む。一態様では、最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液は、凍結保護剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、凍結保護剤はスクロースである。いくつかの実施形態では、最終溶液中の凍結保護剤は、約０．１ｍＭ～約５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、最終溶液中の凍結保護剤の濃度は、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、最終溶液中の凍結保護剤は、約３００ｍＭである。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、摂氏約－８０度（℃）の温度で保存される。一態様では、最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液は、凍結保護剤をさらに含まない。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約２℃～約８℃で保存される。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約７～約８のｐＨを有する溶液中にある。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、約７．４のｐＨを有する溶液中にある。一態様では、方法は、総体積に対して少なくとも０．１ｍｏｌ％の濃度で第２の溶液中に受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、総体積に対して少なくとも１ｍｏｌ％の濃度で第２の溶液中に導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、総体積に対して少なくとも３ｍｏｌ％の濃度で第２の溶液中に導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、総体積に対して少なくとも５ｍｏｌ％の濃度で第２の溶液中に導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、総体積に対して少なくとも７ｍｏｌ％の濃度で第２の溶液中に導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、総体積に対して少なくとも９ｍｏｌ％の濃度で第２の溶液中に導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、総体積に対して少なくとも１０ｍｏｌ％の濃度で第２の溶液中に導入される。
[0148]一態様では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであり、ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布は実質的に均一である。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、５ｍｏｌ％の濃度でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰに存在するＧａｌＮＡｃ－脂質を有する。一態様では、本明細書に記載される方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであり、哺乳動物への１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを含む用量の投与は、用量を投与していない対応する対象よりも血液中のＬＤＬレベルを少なくとも３００％増加させる。いくつかの実施形態では、ＬＤＬレベルは少なくとも３５０％増加する。いくつかの実施形態では、ＬＤＬレベルは少なくとも４００％増加する。いくつかの実施形態では、ＬＤＬレベルは少なくとも５００％増加する。いくつかの実施形態では、ＬＤＬレベルは少なくとも５５０％増加する。いくつかの実施形態では、ＬＤＬレベルは少なくとも６００％増加する。
[0149]一態様では、本明細書に記載されるのは、アデニンベースエディター（ＡＢＥ）ｍＲＮＡをさらに含む、本明細書に記載される方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはＭＡ００４である。いくつかの実施形態では、ＡＢＥ ｍＲＮＡは、本明細書に記載される３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、本明細書に記載されるＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＥ ｍＲＮＡは、本明細書に記載される５’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをさらに含む。
[0150]一態様では、本明細書に記載されるのは、ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであり、ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布は、哺乳動物細胞において約１５％～約６０％のＰＣＳＫ９編集パーセント（％）をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９編集％は約５０％～６０％である。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９編集％は約４０％～約５０％である。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９編集％は約３０％～約４０％である。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９編集％は約２０％～約３０％である。
[0151]一態様では、本明細書に記載されるのは、ＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡを含むＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであり、ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布は、哺乳動物細胞において約１５％～約６０％のＡＮＧＰＴＬ３編集パーセント（％）をもたらす。いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３編集％は約５０％～６０％である。いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３編集％は約４０％～約５０％である。いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３編集％は約３０％～約４０％である。いくつかの実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３編集％は約２０％～約３０％である。
[0152]一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い編集パーセントによって決定されるとおり、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供する。いくつかの実施形態では、編集パーセントは、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５０％高い。一態様では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い編集パーセントによって決定されるとおり、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供する。いくつかの実施形態では、編集パーセントは、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５０％高い。
[0153]一態様では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであって、受容体ターゲティングコンジュゲートが、式（Ｖ）：
の化合物を含み、
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－、または結合であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－、または結合であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。
[0154]一態様では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであって、受容体ターゲティングコンジュゲートが、式（ＶＩ）：
の化合物を含み、
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰである。
[0155]一態様では、式（Ｖ）および式（ＶＩ）に記載されるＡ部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体である。
[0156]一態様では、本明細書に記載されるのは、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に導入するステップを含む、遺伝子を編集する方法であって、ＮＨＰがＬＤＬｒノックアウトを有する、方法である。
[0156]一態様では、本明細書に記載されるのは、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に導入するステップを含む、遺伝子を編集する方法であって、ＮＨＰがＬＤＬｒノックアウトを有する、方法である。
[0157]一態様では、本明細書に記載されるのは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤、ならびに（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤を含み、（ａ）水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと、（ｂ）１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つを水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと、（ｃ）抗酸化剤を第１の溶液と組み合わせるステップと、（ｄ）第１の溶液と第２の溶液とを混合するステップと、（ｅ）第１の溶液と第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＬＮＰを形成するステップと、（ｆ）任意選択で、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを実行するステップとを含む、方法である。
参照による組み込み
[0158]本明細書で言及された全ての刊行物、参考文献、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。この文書と、参照により組み込まれた文書との間で使用法が一致しない場合、組み込まれた参照における使用法は、この文書の使用法を補足するものと見なされるべきである。和解できない不一致については、本明細書での使用法が優先する。
[0158]本明細書で言及された全ての刊行物、参考文献、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。この文書と、参照により組み込まれた文書との間で使用法が一致しない場合、組み込まれた参照における使用法は、この文書の使用法を補足するものと見なされるべきである。和解できない不一致については、本明細書での使用法が優先する。
[0159]本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
[0215]様々な実施形態の完全な理解を提供するために、この説明の特定の詳細を記載する。しかしながら、当業者は、本開示がこれらの詳細なしで実施され得ることを理解するであろう。他の例では、実施形態の説明を不必要に曖昧にすることを避けるために、周知の構造および／または方法を詳細に示しても説明もしていない。文脈上別段の要求がない限り、以下に続く明細書および特許請求の範囲全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語句のその変形は、オープンで包括的な意味で、すなわち、「限定するものではないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」として解釈されるべきである。さらに、本明細書で提供される見出しは便宜上のものにすぎず、特許請求される開示の範囲または意味を解釈するものではない。本明細書で使用されているセクションの見出しは、構成のみを目的としており、説明されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
[0216]細胞への効率的な送達には、特異的な標的化、および細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的な保護が必要である。特異的標的化を達成する１つの方法は、ターゲティング部分を活性剤または核酸剤などの薬学的エフェクターにコンジュゲートし、それにより、ターゲティング部分の特異性に応じて、活性剤または薬学的エフェクターを、特定の細胞または組織に誘導するステップである。ターゲティング部分が送達を改善し得る１つの方法は、受容体媒介エンドサイトーシス活性によるものである。場合によっては、この取り込みの機構は、膜構造の陥入を介して膜によって、または送達系と細胞膜との融合によって、包囲される領域の内部への、膜受容体に結合した核酸剤の移動を伴い得る。このプロセスは、受容体への特定のリガンドの結合に続く細胞表面または膜受容体の活性化を介して開始される。ガラクトース、マンノース、マンノース－６－リン酸などの糖、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、ビタミンＢ１２、インスリン、および上皮成長因子（ＥＧＦ）などのペプチドおよびタンパク質を認識するシステムなど、多くの受容体を介したエンドサイトーシス系が公知であり、研究されている。コレステロールまたは脂肪酸などの親油性部分は、核酸などの親水性の高い分子に結合すると、血漿タンパク質結合を大幅に強化し、その結果、循環半減期を延長し得る。標的送達アプローチの細胞内輸送を改善するために、親油性コンジュゲートをターゲティングリガンドと組み合わせて使用してもよい。
[0217]アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ－Ｒ）は、高容量の受容体であり、肝細胞上に非常に豊富に存在する。ＡＳＧＰ－Ｒは、Ｄ－ＧａｌよりもＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトシルアミン（ＧａｌＮＡｃ）に対して５０倍高い親和性を示す。以前の研究では、糖間の間隔も重要である一方で、高い親和性を達成するには多価性が必要であることが示されている。ここで、本発明者らは、上述の核酸または核酸関連複合体を用いた治療薬のインビボ送達の欠点に対処する、新しい受容体特異的リガンドコンジュゲートのＲＮＡまたはＤＮＡ剤およびそれらの調製方法に対する明確な必要性があることを認識した。本開示は、この非常に重要な目的に向けられている。
[0218]本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ（１つの、ある）」、「ａｎ（１つの、ある）」、および「ｔｈｅ（この、その）」は、内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。「または」という用語は、一般に、内容が明確に別段の指示をしない限り、「および／または」を含む意味で使用されることにも留意されたい。
[0219]別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を使用し得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で引用された全ての参考文献は、完全に記載されているかのように、参照によりその全体が組み込まれている。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第３版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ２００１）；ＭａｒｃＨ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 第５版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ２００１）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ ２００１）は、当業者に、本出願で使用される多くの用語に対する一般的なガイドを提供する。
特定の定義
[0220]置換基の数を示す場合、「１つまたは複数」という用語は、１つの置換基から置換の可能な最大数、例えば、１つの水素の置き換えから置換基による全ての水素の置き換えまでという範囲を指す。
[0220]置換基の数を示す場合、「１つまたは複数」という用語は、１つの置換基から置換の可能な最大数、例えば、１つの水素の置き換えから置換基による全ての水素の置き換えまでという範囲を指す。
[0221]「任意の」または「任意選択で」という用語は、その後に記述される事象または状況が発生する必要はないが、その事象または状況が発生する場合および発生しない場合が記述に含まれることを意味する。
[0222]「核酸分子実体」という用語は、「核酸」と交換可能に使用される。
[0223]本明細書で使用される「核酸」という用語は、一般に、１つまたは複数の核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを指し、この用語には、ポリ核酸塩基、ポリヌクレオシド、およびポリヌクレオチドが含まれる。核酸には、ポリヌクレオチド、モノヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドが含まれ得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの混合物を含んでもよく、一本鎖、二本鎖、または部分的に一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、二次構造を形成してもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、複数の二本鎖セグメントおよび一本鎖セグメントを有する。例えば、核酸は、ポリヌクレオチド例えば、その中に複数の二本鎖セグメントを持つｍＲＮＡを含んでもよい。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予め凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体および組合せの形態であり得る。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、塩基編集因子ＲＮＡおよびそれらの組合せの形態であり得る。核酸としては、合成、天然、および非天然であり、かつ参照核酸と同様の結合特性を有する、既知のヌクレオチド類似体または改変された主鎖残基もしくは結合を含む核酸が挙げられる。このような類似体の例としては、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、およびペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。特に断りのない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけでなく、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る。（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８：９１－９８（１９９４））。「ヌクレオチド」とは、置換および／もしくは非置換糖デオキシリボース（ＤＮＡ）、または置換および／もしくは非置換糖リボース（ＲＮＡ）、または置換および／もしくは非置換炭素環、または置換および／もしくは非置換非環式部分（グリコール核酸、例えば）、塩基、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を介して一緒に結合されている。「塩基」には、プリンおよびピリミジンが挙げられ、これらにはさらに天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、ならびにプリンおよびピリミジンの天然類似体および合成誘導体が含まれ、これには限定するものではないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびハロゲン化アルキルなどの新しい反応基を配置する修飾を含む。
[0223]本明細書で使用される「核酸」という用語は、一般に、１つまたは複数の核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを指し、この用語には、ポリ核酸塩基、ポリヌクレオシド、およびポリヌクレオチドが含まれる。核酸には、ポリヌクレオチド、モノヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドが含まれ得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの混合物を含んでもよく、一本鎖、二本鎖、または部分的に一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、二次構造を形成してもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、複数の二本鎖セグメントおよび一本鎖セグメントを有する。例えば、核酸は、ポリヌクレオチド例えば、その中に複数の二本鎖セグメントを持つｍＲＮＡを含んでもよい。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予め凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体および組合せの形態であり得る。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、塩基編集因子ＲＮＡおよびそれらの組合せの形態であり得る。核酸としては、合成、天然、および非天然であり、かつ参照核酸と同様の結合特性を有する、既知のヌクレオチド類似体または改変された主鎖残基もしくは結合を含む核酸が挙げられる。このような類似体の例としては、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、およびペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。特に断りのない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけでなく、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る。（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８：９１－９８（１９９４））。「ヌクレオチド」とは、置換および／もしくは非置換糖デオキシリボース（ＤＮＡ）、または置換および／もしくは非置換糖リボース（ＲＮＡ）、または置換および／もしくは非置換炭素環、または置換および／もしくは非置換非環式部分（グリコール核酸、例えば）、塩基、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を介して一緒に結合されている。「塩基」には、プリンおよびピリミジンが挙げられ、これらにはさらに天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、ならびにプリンおよびピリミジンの天然類似体および合成誘導体が含まれ、これには限定するものではないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびハロゲン化アルキルなどの新しい反応基を配置する修飾を含む。
[0224]「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの産生に必要な部分長または全長コード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。
[0225]本明細書で使用される「遺伝子産物」とは、ＲＮＡ転写物またはポリペプチドなどの遺伝子の産物を指す。
[0225]本明細書で使用される「遺伝子産物」とは、ＲＮＡ転写物またはポリペプチドなどの遺伝子の産物を指す。
[0226]本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に、２つ以上の結合した核酸サブユニット、例えばヌクレオチドを含む分子を指し、「オリゴヌクレオチド」と交換可能に使用され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、またはそれらのバリアントから選択される１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは一般に、ヌクレオシド、および少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のリン酸（ＰＯ３）基を含む。ヌクレオチドには、核酸塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）、および１つまたは複数のリン酸基が挙げられる。リボヌクレオチドには、糖がリボースであるヌクレオチドが挙げられる。デオキシリボヌクレオチドには、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸またはヌクレオシドポリリン酸であり得る。例えば、ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシドポリリン酸であってもよく、例示的なｄＮＴＰには、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）が挙げられる。ｄＮＴＰはまた、発光タグまたはマーカー（例えば、フルオロフォア）などの検出可能なタグも含んでもよい。例えば、ヌクレオチドは、プリン（例えば、ＡもしくはＧ、またはそれらのバリアント）またはピリミジン（例えば、Ｃ、ＴもしくはＵ、またはそれらのバリアント）であり得る。いくつかの実施例では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはそれらの誘導体もしくはバリアントである。例示的なポリヌクレオチドとしては、限定するものではないが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小型核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、および異核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）が挙げられ、ヌクレオチド配列と、一本鎖、二本鎖、三本鎖、らせん、ヘアピン、ステムループ、バルジなどのその任意の構造的実施形態の両方を含む。場合によっては、ポリヌクレオチドは環状である。ポリヌクレオチドは、様々な長さを有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも約７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１キロベース（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、またはそれ以上の長さを有し得る。ポリヌクレオチドは、細胞または組織から単離され得る。例えば、ポリヌクレオチド配列は、単離および精製されたＤＮＡ／ＲＮＡ分子、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ分子、および／または合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体を含み得る。
[0227]ポリヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体および／または修飾ヌクレオチドを含む、１つまたは複数のヌクレオチドバリアントを含み得る。修飾ヌクレオチドの例としては、限定するものではないが、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリンなどが挙げられる。場合によっては、ヌクレオチドは、三リン酸部分への修飾を含む、それらのリン酸部分の修飾を含み得る。このような修飾の非限定的な例としては、より長いリン酸鎖（例えば、４、５、６、７、８、９、１０個以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）およびチオール部分による修飾（例えば、α－チオ三リン酸およびベータチオ三リン酸））が挙げられる。核酸分子はまた、塩基部分で（例えば、典型的には相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成するのに利用できる１つまたは複数の原子で、および／または相補的なヌクレオチドと水素結合を典型的には形成できない１つまたは複数の原子で）、糖部分またはリン酸骨格で修飾されてもよい。核酸分子はまた、アミノアリル １－ｄＵＴＰ（ａａ－ｄＵＴＰ）およびアミノヘキシルアクリルアミド－ｄＣＴＰ（ａｈａ－ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含んでもよく、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性部分の共有結合を可能にする。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対またはＲＮＡ塩基対の代替物は、１立方ｍｍあたりのビット密度におけるさらなる高密度、より高い安全性（天然毒素の偶発的または意図的な合成に対する耐性）、光プログラムポリメラーゼにおけるより容易な識別、または下位二次構造をもたらし得る。デノボおよび／または増幅合成のための天然および変異のポリメラーゼと適合するそのような代替塩基対は、Ｂｅｔｚ Ｋ、ＭａｌｙｓｈｅｖＤａ、Ｌａｖｅｒｇｎｅ Ｔ、Ｗｅｌｔｅ Ｗ、Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ Ｋ、Ｄｗｙｅｒ ＴＪ、Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ Ｐ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ ＦＥ、Ｍａｒｘ Ａ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ；８（７）：６１２－４に記載されており、これは、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
[0228]本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基のポリマーを指し、２つ以上のポリペプチド鎖から構成され得る。「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は、アミド結合を通じて一緒に結合された少なくとも２つのアミノ酸モノマーのポリマーを指す。アミノ酸は、Ｌ光学異性体であっても、またはＤ光学異性体であってもよい。より具体的には、「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は、特定の順序で、例えば、タンパク質をコードする遺伝子またはＲＮＡのヌクレオチドの塩基配列によって決定される順序で、２つ以上のアミノ酸から構成される分子を指す。タンパク質は、体の細胞、組織、および器官の構造、機能、および調節に不可欠であり、各タンパク質には独自の機能がある。例は、ホルモン、酵素、抗体、およびそれらの任意のフラグメントである。場合によっては、タンパク質は、タンパク質の一部、例えばタンパク質のドメイン、サブドメイン、またはモチーフであり得る。場合によっては、タンパク質は、天然に存在する（または少なくとも既知の）タンパク質のアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸残基が、挿入、欠失、および／または置換されている、タンパク質のバリアント（または変異）であってもよい。タンパク質またはそのバリアントは、天然であっても、または組換え体であってもよい。
[0229]本明細書で使用される場合、「インターカレートする」または「インターカレーション」という用語は、ＤＮＡの連続する塩基間に入り込む物質（例えば、小分子）の作用を指す。場合によっては、インターカレーションがＤＮＡの適切な機能を妨げる。
[0230]本明細書で使用される場合、「相補体」は、標準的なワトソン／クリック対合規則による核酸に対する相補的配列を意味する。相補配列はまた、ＤＮＡ配列またはその相補配列に相補的なＲＮＡの配列であってもよく、またｃＤＮＡであってもよい。相補体は、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするように、完全に相補的であっても、または部分的に相補的であってもよい。当業者は、相補的または実質的に相補的な配列がその全長に沿ってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。特定の実施形態では、相補的または実質的に相補的な配列は、標的配列にハイブリダイズする塩基の連続配列に対して３’または５’に位置する、標的配列にハイブリダイズしない塩基の連続配列を含んでもよい。
[0231]本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」とは、ワトソン・クリック塩基対形成規則に従って、２つの核酸鎖がそれぞれにアニーリングするプロセスを指す。核酸ハイブリダイゼーション技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列は安定してハイブリダイズするが、相補性がより低い配列はハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション／洗浄条件の適切なストリンジェンシーを決定する方法は、当業者は理解している。ハイブリダイゼーションの条件およびパラメーターの例については、例えば、その全てが、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら １９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ、Ｎ．Ｊを参照のこと。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２０～１００ヌクレオチド長の核酸分子間で起こり得る。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００連続するヌクレオチド間で起こり得る。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズする核酸分子は、許容される、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０までのミスマッチを含んでもよい。
[0232]本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、バイオマーカー、および／または代謝物を調製および検査し得る任意の生物学的材料を意味する。非限定的な例には、全血、血漿、唾液、頬スワブ、糞便検体、尿検体、細胞塊、または任意の他の体液もしくは組織が含まれる。
[0233]本明細書で使用される「投与する」、「投与すること、投与するステップ」、「投与」などの用語は、生物学的作用の所望の部位への化合物または組成物の送達を可能にするために使用され得る方法を指す。これらの方法としては、限定するものではないが、経口経路（ｐ．ｏ．）、十二指腸内経路（ｉ．ｄ．）、非経口注射（例としては、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内または注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ｉｎｆ））、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）（ｔｏｐ．）および直腸（ｐ．ｒ．）投与が挙げられる。当業者は、本明細書に記載の化合物および方法で使用できる投与技術に精通している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は経口投与される。
[0234]本明細書で使用される「併用投与（co-administration）」などの用語は、選択された治療剤の単一の患者への投与を包含することを意味し、薬剤が同じ患者または異なる投与経路、または同時もしくは異なる時間で投与される治療レジメンを含むことが意図される。
[0235]本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、処置されている疾患または状態の１つまたは複数の症状をある程度緩和する（例えば、疾患の１つまたは複数の徴候、症状、もしくは原因の減少および／または軽減、あるいは生物系の他の任意の所望の変更）、投与される薬剤または化合物の十分な量を指す。例えば、治療用途の「有効量」は、１つまたは複数の疾患症状を臨床的に有意に減少させる薬剤の量であり得る。適切な「有効な」量は、個々の症例で、用量漸増試験などの技術を使用して決定し得る。
[0236]本明細書で使用される「増強する」または「増強する」という用語は、所望の効果の量、効力または期間のいずれかを増加または延長することを意味する。
[0237]本明細書で使用される場合、「炭水化物」は、各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を有する少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状、または環状であってもよい）を有する１つまたは複数の単糖単位から構成される炭水化物自体である化合物；あるいは各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を有する、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状または環状であってもよい）を各々が有する１つまたは複数の単糖単位から構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物、のいずれかを指す。代表的な炭水化物としては、糖類（約４～９個の単糖単位を含む単糖、二糖、三糖、およびオリゴ糖）、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５以上（好ましくはＣ５～Ｃ８）の糖が挙げられ；二糖および三糖には、２つまたは３つの単糖単位（好ましくはＣ５～Ｃ８）を有する糖が挙げられる。
[0237]本明細書で使用される場合、「炭水化物」は、各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を有する少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状、または環状であってもよい）を有する１つまたは複数の単糖単位から構成される炭水化物自体である化合物；あるいは各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子を有する、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状または環状であってもよい）を各々が有する１つまたは複数の単糖単位から構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物、のいずれかを指す。代表的な炭水化物としては、糖類（約４～９個の単糖単位を含む単糖、二糖、三糖、およびオリゴ糖）、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５以上（好ましくはＣ５～Ｃ８）の糖が挙げられ；二糖および三糖には、２つまたは３つの単糖単位（好ましくはＣ５～Ｃ８）を有する糖が挙げられる。
[0238]「単糖」という用語は、アロース、アルトロース、アラビノース、クラジノース、エリスロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ－フシトール、Ｌ－フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ－ガラクトサミニトール、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース－６－リン酸グロースグリセルアルデヒド、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノス－ヘプロース、グリセロール、グリセロン、グロースイドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース－６－リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トロース、キシロースおよびキシルロースのラジカルを、包含する。単糖は、Ｄ配置であっても、またはＬ配置であってもよい。単糖類はさらに、デオキシ糖（アルコール性ヒドロキシ基が水素で置き換え）、アミノ糖（アルコール性ヒドロキシ基がアミノ基で置き換え）、チオ糖（アルコール性ヒドロキシ基がチオールで置き換え、またはＣ＝ＯがＣ＝Ｓで置き換え、または環状形態の環酸素が硫黄で置き換え）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素が窒素で置き換え）、イミノ糖（環酸素が窒素で置き換え）、ホスファノ糖（環酸素がリンで置き換え）、リン糖（環炭素がリンで置き換え）、Ｃ－置換単糖（非末端炭素原子の水素が炭素で置き換え）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基がＣＨＯＨ基で置き換え）、アルドン酸（アルデヒド基がカルボキシ基で置き換え）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などであってもよい。アミノ糖としては、アミノ単糖、好ましくはガラクトサミン、グルサミン、マンノサミン、フコスミン、キナボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カノサミン、マイカミノース、ミオサミン、ペルソサミン、ニューモサミン、プルプロサミン、ロドスミンが挙げられる。単糖などはさらに置換されてもよいことが理解される。
[0239]本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」は、脂質（または脂質）中のイオン化可能な（例えば、生理学的ｐＨ範囲における）窒素原子と、核酸分子実体（または核酸分子実体）中の、例えば、脂質成分およびＲＮＡを含むナノ粒子組成物中の、リン酸基とのモル比である。イオン化可能な窒素原子は、例えば、約ｐＨ１、約ｐＨ２、約ｐＨ３、約ｐＨ４、約ｐＨ５、約ｐＨ６、約ｐＨ７、約ｐＨ７．５、または約ｐＨ８以上でプロトン化され得る窒素原子を含み得る。生理的ｐＨ範囲は、例えば、異なる細胞区画（器官、組織、および細胞など）および体液（血液、ＣＳＦ、胃液、牛乳、胆汁、唾液、涙、および尿など）のｐＨ範囲を含み得る。特定の実施形態では、生理学的ｐＨ範囲とは、哺乳動物における血液のｐＨ範囲、例えば、約７．３５～約７．４５を指す。いくつかの実施形態では、イオン化可能な窒素原子は、５～１４の間のｐＨ範囲内でイオン化可能な窒素原子を指す。
[0240]「二糖類」、「三糖類」および「多糖類」という用語は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２－デオキシリボース、２－デオキシグルコースジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース、フラクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖、ゲンチアノース、ゲニチオビオース、グルカン、グルコゲン、グリコーゲン、ハマメロス、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β－マルトース、マルトリオース、マンナンオリゴ糖、アムニノトリオース、メレジトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、マイシノース、ノイラミン酸、ミゲロース、ノジリマイコン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリムベロース、ラフィノース、ロドン、ルチノース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリムベロース、ラフィノース、ロジンオース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α－トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロス、キシロビオース、ウンベリフェロースなどを包含する。さらに、「二糖」、「三糖」および「多糖」などは、さらに置換され得ることが理解される。二糖類には、アミノ糖およびそれらの誘導体、特に、Ｃ－４’位で誘導体化されたミカミノースまたはＣ－６’位で誘導体化された４デオキシ－３－アミノ－グルコースも含まれる。
[0241]「対象」または「患者」という用語は、哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、限定するものではないが、哺乳動物クラスの任意のメンバー；ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌ、およびネコなどの家畜；ラット、マウス、モルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などが挙げられる。一態様では、哺乳動物はヒトである。本明細書で使用される「動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。一実施形態では、「非ヒト動物」は、哺乳動物、例えばラットまたはマウスなどのげっ歯類である。一実施形態では、非ヒト動物はマウスまたはサルである。
[0242]本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療」という用語は、疾患または状態の少なくとも１つの症状を軽減、寛解または改善すること、追加の症状を予防すること、疾患または状態を阻害すること、例えば、疾患または状態の発症を抑止すること、疾患または状態を緩和すること、疾患または状態の退行を生じること、疾患または状態によって引き起こされた状態の緩和、あるいは疾患または状態の症状の予防的および／または治療的停止を含む。排除されないが、障害または状態を治療するステップは、その障害、状態、またはそれに関連する症状が完全に排除されることは必要としないことが理解される。
[0243]疾患状態の「予防する」または「予防」という用語は、疾患状態にさらされる可能性があるか、またはその素因があるが、まだその病状の症状を経験も呈示もしていない対象において、疾患状態の臨床症状が発生しないようにすることを意味する。
[0244]「薬学的組成物」および「薬学的製剤」（または「製剤」）という用語は、交換可能に使用され、対象、例えばそれを必要としているヒトに投与される１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に、治療有効量の活性薬学的成分を含む混合物または溶液を意味する。
[0245]本明細書で使用される用語「薬学的組合せ」という用語は、複数の有効成分を混合または組み合わせることにより得られる製品を意味し、その有効成分の固定および非固定の両方の組合せを含む。「固定された組合せ」という用語は、有効成分、例えば、本明細書に記載の化合物および助剤の両方が、単一の実体または用量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。「固定されていない組合せ」という用語は、有効成分、例えば、本明細書に記載の化合物および助剤が、別個の実体として、同時に、併用して、または特定の介在時間制限なしで逐次的に患者に投与され、そのような投与は、患者の体内で２つの化合物の有効レベルを提供することを意味する。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の有効成分の投与にも適用される。
[0246]「薬学的に許容される」という用語は、一般に安全で、毒性がなく、生物学的にも他の方法でも望ましくないものではなく、獣医およびヒトの薬学的使用に許容される薬学的組成物を調製するのに有用な材料の属性を意味する。「薬学的に許容される」とは、化合物の生物学的活性または特性を無効にせず、比較的無毒である担体または希釈剤などの材料を指してもよく、例えば、その材料は望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれている組成物の任意の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することもなく、個体に投与され得る。
[0247]「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容されるビヒクル」、および「治療的に不活性な賦形剤」という用語は、互換的に使用してもよく、治療活性を有さず、投与される対象に非毒性である薬学的組成物中の任意の薬学的に許容される成分、例えば、医薬品の製剤化に使用される崩壊剤、結合剤、充填剤、溶媒、緩衝剤、等張化剤、安定剤、抗酸化剤、界面活性剤、担体、希釈剤、賦形剤、防腐剤または潤滑剤などを意味する。
[0248]「塩基編集（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）」および「塩基修正（ｂａｓｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、塩基修飾をもたらす標的遺伝子内の標的配列における塩基の変化または変異を示すために交換可能に使用される。特定の実施形態では、塩基編集は、標的配列の単一の塩基で起こる。好ましい実施形態では、塩基編集は、標的配列の二本鎖切断を伴わない。
[0249]本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。これらの薬剤は、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知の細胞質の多タンパク質複合体と関連している。ＲＮＡ干渉を誘導するのに有効な薬剤は、本明細書ではｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ薬剤、またはｉＲＮＡ薬剤とも呼ばれる。本明細書で使用するｓｉＲＮＡという用語には、マイクロＲＮＡおよびプレマイクロＲＮＡが含まれる。本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ活性」および「ＲＮＡｉ活性」という用語は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングを指す。
[0250]「２’－Ｏ－メトキシエチル」（２’－ＭＯＥ、２’－Ｏ（ＣＨ２）２－ＯＣＨ３および２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）ともいう）という用語は、フロシル環の２’位のＯ－メトキシ－エチル修飾を指す。２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖は修飾糖である。
[0251]「２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオチド」という用語は、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖部分を含むヌクレオチドを意味する。
[0252]「５－メチルシトシン」という用語は、５’位に結合したメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５－メチルシトシンは修飾核酸塩基である。
[0252]「５－メチルシトシン」という用語は、５’位に結合したメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５－メチルシトシンは修飾核酸塩基である。
[0253]「オキソ」という用語は、＝Ｏ置換基を指す。
[0254]「アルキル」という用語は、１個から２０個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りの部分に結合している、直鎖または分枝炭化水素鎖基を指す。最大で１０個の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ１０アルキルと呼ばれ、同様に、例えば、最大で６個の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。他の数の炭素原子を含むアルキル（および本明細書で定義される他の部分）も同様に表される。アルキル基としては、限定するものではないが、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ９アルキル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ１～Ｃ７アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルキル、Ｃ３～Ｃ８アルキルおよびＣ４～Ｃ８アルキルが挙げられる。代表的なアルキル基としては、限定するものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（ｉ－プロピル）、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）、３－メチルヘキシル、２－メチルヘキシル、１－エチル－プロピルなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、アルキルはメチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、アルキルは－ＣＨ（ＣＨ３）２または－Ｃ（ＣＨ３）３である。本明細書において特に断りのない限り、アルキル基は、以下に記載するように任意選択で置換されていてもよい。「アルキレン」または「アルキレン鎖」は、分子の残りをラジカル基に連結する直鎖または分枝鎖の二価炭化水素鎖を指す。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
[0254]「アルキル」という用語は、１個から２０個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りの部分に結合している、直鎖または分枝炭化水素鎖基を指す。最大で１０個の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ１０アルキルと呼ばれ、同様に、例えば、最大で６個の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。他の数の炭素原子を含むアルキル（および本明細書で定義される他の部分）も同様に表される。アルキル基としては、限定するものではないが、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ９アルキル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ１～Ｃ７アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルキル、Ｃ３～Ｃ８アルキルおよびＣ４～Ｃ８アルキルが挙げられる。代表的なアルキル基としては、限定するものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（ｉ－プロピル）、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）、３－メチルヘキシル、２－メチルヘキシル、１－エチル－プロピルなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、アルキルはメチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、アルキルは－ＣＨ（ＣＨ３）２または－Ｃ（ＣＨ３）３である。本明細書において特に断りのない限り、アルキル基は、以下に記載するように任意選択で置換されていてもよい。「アルキレン」または「アルキレン鎖」は、分子の残りをラジカル基に連結する直鎖または分枝鎖の二価炭化水素鎖を指す。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、アルキレンは、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
[0255]「アルコキシ」という用語は、式－ＯＲのラジカルを指し、式中、Ｒは定義されたアルキル基である。本明細書において特に断りのない限り、アルコキシ基は、以下に記載するように任意選択で置換されていてもよい。代表的なアルコキシ基としては、限定するものではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシが挙げられる。いくつかの実施形態では、アルコキシはメトキシである。いくつかの実施形態では、アルコキシはエトキシである。
[0256]「アルキルアミノ」という用語は、式－ＮＨＲまたは－ＮＲＲのラジカルを指し、ここで、各Ｒは独立して、上で定義したアルキル基である。本明細書において特に断りのない限り、アルキルアミノ基は、以下に記載するように任意選択で置換されていてもよい。
[0257]「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合が存在する種類のアルキル基を指す。一実施形態では、アルケニル基は、式－Ｃ（Ｒ）＝ＣＲ２を有し、ここで、Ｒはアルケニル基の残りの部分を指し、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＲはＨまたはアルキルである。いくつかの実施形態では、アルケニルは、エテニル（すなわちビニル）、プロペニル（すなわちアリル）、ブテニル、ペンテニル、ペンタジエニルなどから選択される。アルケニル基の非限定的な例としては、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨＣＨ３、および－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２が挙げられる。構造に応じて、アルケニル基は一価または二価（すなわち、アルケニレン基）であってもよい。
[0258]「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合が存在する種類のアルキル基を指す。したがって、「アルキニレン」は、二価のアルキニル基を指す場合がある。一実施形態では、アルケニル基は、式－Ｃ≡Ｃ－Ｒを有し、ここでＲはアルキニル基の残りの部分を指す。いくつかの実施形態では、ＲはＨまたはアルキルである。いくつかの実施形態では、アルキニルは、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどから選択される。アルキニル基の非限定的な例としては、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｃ≡ＣＣＨ３－Ｃ≡ＣＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２Ｃ≡ＣＨが挙げられる。
[0259]「アリール」という用語は、環を形成する原子の各々が炭素原子である芳香環を指す。アリール基は、任意選択で置換されてもよい。アリール基の例としては、限定するものではないが、フェニルおよびナフチルが挙げられる。いくつかの実施形態では、アリールはフェニルである。構造に応じて、アリール基は一価または二価（すなわち、「アリーレン」基）であってもよい。本明細書で特に断りのない限り、「アリール」という用語または接頭辞「ａｒ－」（「アラルキル」など）は、任意選択で置換されてもよいアリールラジカルを含むことを意味する。いくつかの実施形態では、アリール基は部分的に還元されて、本明細書で定義されるシクロアルキル基を形成する。いくつかの実施形態では、アリール基は完全に還元されて、本明細書で定義されるシクロアルキル基を形成する。いくつかの実施形態では、アリール基は、Ｃ６～Ｃ１４アリールである。いくつかの実施形態では、アリール基は、Ｃ６～Ｃ１０アリールである。
[0260]「シクロアルキル」という用語は、環を形成する原子（すなわち、骨格原子）の各々が炭素原子である、単環式または多環式の非芳香族ラジカルを指す。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは、飽和または部分不飽和である。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは、スピロ環または架橋化合物である。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは芳香環と縮合している（この場合、シクロアルキルは非芳香環炭素原子を介して結合されている）。シクロアルキル基には、３～１０個の環原子を有する基が含まれる。代表的なシクロアルキルとしては、限定するものではないが、３～１０個の炭素原子、３～８個の炭素原子、３～６個の炭素原子、または３～５個の炭素原子を有するシクロアルキルが挙げられる。単環式シクロアルキルラジカルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。いくつかの実施形態では、単環式シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルである。いくつかの実施形態では、単環式シクロアルキルは、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルである。いくつかの実施形態では、単環式シクロアルキルは、シクロペンテニルである。多環式基としては、例えば、アダマンチル、１，２－ジヒドロナフタレニル、１，４－ジヒドロナフタレニル、テトライニル、デカリニル、３，４－ジヒドロナフタレニル－１（２Ｈ）－オン、スピロ［２．２］ペンチル、ノルボルニルおよびビシクロ［１．１．１］ペンチルが挙げられる。本明細書において特に断りのない限り、シクロアルキル基は任意選択で置換されていてもよい。構造に応じて、シクロアルキル基は一価または二価（すなわち、シクロアルキレン基）であってもよい。
[0261]「ハロアルキル」という用語は、アルキル基の水素原子の少なくとも１つが同じまたは異なるハロゲン原子、特にフルオロ原子で置き換えられているアルキル基を意味する。ハロアルキルの例としいては、モノフルオロ－、ジフルオロ－またはトリフルオロ－メチル、－エチルまたは－プロピル、例えば、３，３，３－トリフルオロプロピル、２－フルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、フルオロメチル、またはトリフルオロメチルが挙げられる。「ペルハロアルキル」という用語は、アルキル基の全ての水素原子が同じまたは異なるハロゲン原子で置き換えられているアルキル基を意味する。
[0262]「ヘテロアルキレン」という用語は、アルキルの１つまたは複数の炭素原子がＯ、ＮまたはＳ原子で置き換えられている、上記のアルキル基を指す。「ヘテロアルキレン」または「ヘテロアルキレン鎖」は、分子の残りをラジカル基に連結する直鎖または分枝鎖の二価ヘテロアルキル鎖を指す。本明細書で特に断りのない限り、ヘテロアルキルまたはヘテロアルキレン基は、以下に記載するように置換されていてもよい。代表的なヘテロアルキレン基としては、限定するものではないが、－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、または－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－が挙げられる。
[0263]「ヘテロシクロアルキル」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むシクロアルキル基を指す。本明細書で特に断りのない限り、ヘテロシクロアルキル基は、単環式または二環式の環系であってもよく、これは縮合（アリールまたはヘテロアリール環と縮合する場合、ヘテロシクロアルキルは非芳香族環原子を介して結合される）または架橋の環系を含んでもよい。ヘテロシクリル基中の窒素、炭素または硫黄原子は、任意選択で酸化されていてもよい。窒素原子は、任意選択で四級化されていてもよい。ヘテロシクロアルキル基は部分的または完全に飽和されている。ヘテロシクロアルキル基の例としては、限定するものではないが、ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、デカヒドロキノリル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２－オキソピペラジニル、２－オキソピペリジニル、２－オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１－オキソ－チオモルホリニル、１，１－ジオキソ－チオモルホリニルが挙げられる。ヘテロシクロアルキルという用語には、また単糖、二糖、およびオリゴ糖を含むがこれらに限定されない炭水化物の全ての環形も含まれる。特に断りのない限り、ヘテロシクロアルキルは環に２～１２個の炭素を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環に２～１０個の炭素を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１０個の炭素および１個または２個のＮ原子を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１０個の炭素および３または４個のＮ原子を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１２個の炭素、０～２個のＮ原子、０～２個のＯ原子、０～２個のＰ原子、および０～１個のＳ原子を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２個～１２個の炭素、１個～３個のＮ原子、０個～１個のＯ原子、および０個～１個のＳ原子を有する。ヘテロシクロアルキル中の炭素原子の数に言及するとき、ヘテロシクロアルキル中の炭素原子の数は、ヘテロシクロアルキルを構成する原子（すなわち、ヘテロシクロアルキル環の骨格原子）の総数（ヘテロ原子を含む）と同じではないことが理解される。本明細書において特に断りのない限り、ヘテロシクロアルキル基は任意選択で置換されていてもよい。本明細書で使用される「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、二価のヘテロシクロアルキル基を指す場合がある。
[0264]「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される１つまたは複数の環ヘテロ原子を含むアリール基を指す。ヘテロアリールは単環式または二環式である。単環式ヘテロアリールの具体例としては、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、ピリダジニル、トリアジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、インドリジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、１，８－ナフチリジン、およびプテリジンが挙げられる。単環式ヘテロアリールの具体例としては、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、ピリダジニル、トリアジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、およびフラザニルが挙げられる。二環式ヘテロアリールの具体例としては、インドリジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、１，８－ナフチリジン、およびプテリジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、チエニル、チアジアゾリルまたはフリルである。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に０～６個のＮ原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に１～４個のＮ原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に４～６個のＮ原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に０～４個のＮ原子、０～１個のＯ原子、０～１個のＰ原子、および０～１個のＳ原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、環内に１～４個のＮ原子、０～１個のＯ原子、および０～１個のＳ原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、Ｃ１～Ｃ９ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、単環式ヘテロアリールは、Ｃ１～Ｃ５ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、単環式ヘテロアリールは、５員または６員のヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、二環式ヘテロアリールは、Ｃ６～Ｃ９ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、部分的に還元されて、本明細書で定義されるヘテロシクロアルキル基を形成する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は完全に還元されて、本明細書で定義されるヘテロシクロアルキル基を形成する。構造に応じて、ヘテロアリール基は一価であってもまたは二価（すなわち、「ヘテロアリーレン」基）であってもよい。
[0265]「置換された」、「置換基」などの用語は、別段の指示がない限り、特定の置換基の基で個々にかつ独立して、所与の構造中の１つまたは複数の水素基を置き換えるステップを指してもよく、この置換基としては、限定するものではないが、以下：Ｄ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＨ２、－ＮＨ（アルキル）、－Ｎ（アルキル）２、－ＯＨ、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ２、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ（アルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（アルキル）２、アルキル、シクロアルキル、フルオロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、フルオロアルコキシ、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホン、およびアリールスルホンが挙げられる。いくつかの他の実施形態では、任意選択の置換基は独立して、Ｄ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＨ２、－ＮＨ（ＣＨ３）、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＯＨ、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１－Ｃ４アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ２、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ４フルオロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４フルオロアルコキシ、－ＳＣ１～Ｃ４アルキル、－Ｓ（＝Ｏ）Ｃ１～Ｃ４アルキル、および－Ｓ（＝Ｏ）２（Ｃ１～Ｃ４アルキル）から選択される。いくつかの実施形態では、任意の置換基は独立してＤ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＮＨ（ＣＨ３）、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＮＨ（シクロプロピル）、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＦ３、－ＯＣＨ３、および－ＯＣＦ３から選択される。いくつかの実施形態では、置換基は、前述の基の１つまたは２つで置換されている。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素原子（非環状または環状）上の任意の置換基としては、オキソ（＝Ｏ）が挙げられる。
[0266]「非置換」という用語は、特定の基が置換基を持たないことを意味する。「任意選択で置換されてもよい」という用語は、特定の基が置換されていないか、または可能な置換基の群から独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていることを意味する。置換基の数を示す場合、「１つまたは複数」という用語は、１つの置換基から可能な限り多くの置換まで、すなわち置換基による１個の水素の置き換えから全ての水素の置き換えまでを意味する。
[0267]「約」とは、値の±１０％以内を意味する。例えば、「マーカーを約５０％増加し得る」と記載されている場合、マーカーが４５％～５５％の間で増加し得ることを意味する。
[0268]「活性剤」とは、個体に投与された場合に治療効果をもたらす、薬学的組成物中の１種または複数の物質を意味する。
[0269]「投与単位」とは、医薬品が提供される形態、例えば、丸薬、錠剤、または当該技術分野で知られている他の剤形を意味する。特定の実施形態では、剤形は、凍結乾燥アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。特定の実施形態では、剤形は、再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。
[0269]「投与単位」とは、医薬品が提供される形態、例えば、丸薬、錠剤、または当該技術分野で知られている他の剤形を意味する。特定の実施形態では、剤形は、凍結乾燥アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。特定の実施形態では、剤形は、再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。
[0270]「用量」とは、単回投与で、または特定の期間に提供される医薬品の特定の量を意味する。特定の実施形態では、用量は、１回、２回、またはそれ以上のボーラス、錠剤、または注射で投与されてもよい。例えば、皮下投与が望まれる特定の実施形態では、所望の用量は、１回の注射では容易に対応できない量を必要とするため、所望の用量を達成するために２回以上の注射を使用してもよい。特定の実施形態では、医薬品は、長期間または連続的に注入によって投与される。用量は、１時間、１日、１週間、または１カ月あたりの医薬品の量として表してもよい。投与量はまた、ｍｇ／ｋｇまたはｇ／ｋｇで表してもよい。
[0271]「改変されたヌクレオシド間結合」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合からの置換または任意の変化を指す。例えば、ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
[0272]「修飾核酸塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、またはウラシル以外の任意の核酸塩基を指す。例えば、５－メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。「非修飾核酸塩基」とは、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。
[0273]「修飾ヌクレオシド」とは、少なくとも１つの修飾糖部分および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
[0274]「修飾ヌクレオチド」とは、少なくとも１つの修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。
[0274]「修飾ヌクレオチド」とは、少なくとも１つの修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。
[0275]「修飾オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。
[0276]「修飾糖」は、天然糖からの置換または変化を指す。例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖は修飾糖である。
[0276]「修飾糖」は、天然糖からの置換または変化を指す。例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖は修飾糖である。
[0277]「モチーフ」とは、アンチセンス化合物における化学的に異なる領域のパターンを意味する。
[0278]「スタチン」とは、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの活性を阻害する薬剤を意味する。
[0278]「スタチン」とは、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの活性を阻害する薬剤を意味する。
[0279]「心血管の疾患または障害の症状」とは、心血管の疾患または障害に起因し付随する現象であって、その指標として機能する現象を意味する。例えば、狭心症；胸痛；呼吸困難；動悸；虚弱；めまい；悪心；発汗；頻脈；徐脈；不整脈；心房細動；下肢の腫れ；チアノーゼ；倦怠感；失神；顔のしびれ；手足のしびれ；跛行もしくは筋肉のけいれん；腹部の膨満；または発熱は、心血管疾患または障害の症状である。
[0280]「標的核酸」および「標的配列」とは、ゲノム編集組成物によって標的され得る核酸を指す。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内またはそれに隣接する標的ＤＮＡ配列は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに関連するガイドヌクレオチドによって標的化され得る。
[0281]生物学的材料中のポリペプチドの検出および／または測定のための方法は、当該技術分野で周知であり、これには、限定するものではないが、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および様々なプロテオミクス技術が挙げられる。ポリペプチドを測定または検出する例示的な方法は、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量は、特定の抗原を捕捉し得る抗体、および捕捉された抗原を検出し得る二次抗体に基づいてもよい。ポリペプチドの検出および／または測定のための例示的なアッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
[0282]生物学的材料中のＲＮＡの検出および／または測定の方法は、当該技術分野で周知であり、これには、限定するものではないが、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ保護アッセイ、ＲＴ ＰＣＲが挙げられる。適切な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）Ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ．Ｇｒｅｅｎ、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｐｅｔｅｒ ＭａｃＣａｌｌｕｍ ２０１２、２、０２８ｐｐ、ＩＳＢＮ ９７８－１－９３６１１３－４２－２に記載されている。
[0283]リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、ＲＮＡを含む核タンパク質を指す。ＲＮＰは、リボ核酸とＲＮＡ結合タンパク質の複合体であってもよい。このような組合せは、タンパク質－ＲＮＡ複合体と呼ばれることもある。これらの複合体は、限定するものではないが、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修飾、遺伝子発現、ＲＮＡの代謝および修飾、ならびにプレｍＲＮＡスプライシングを含む、いくつかの生物学的機能で機能し得る。
[0284]本明細書で使用される「核酸塩基編集因子（ＢＥ）」または「塩基編集因子（ＢＥ）」という用語は、組成物、例えば、核酸塩基修飾を行うことができるポリペプチドおよびＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼに融合したＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、野生型Ｃａｓ９配列、例えば、配列番号１（これにより、Ｃａｓ９は核酸二重鎖の１つの鎖のみを切断できるようになる）で番号付けされたＣａｓ９のＤ１０Ｘ変異またはＨ８４０Ｘ変異を含む。いくつかの実施形態では、塩基編集因子は、デアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメイン）に融合または連結されたプログラム可能なＤＮＡヌクレアーゼドメインを含む。塩基編集因子（エディター）の詳細は、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されており、これらは各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。またその内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」Ｎａｔｕｒｅ５３３、４２０－４２４（２０１６）；Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．ら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」Ｎａｔｕｒｅ５５１、４６４－４７１（２０１７）；Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．ら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ」Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）；Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｋ．ら「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ３５３，ａａｆ８７２９（２０１６）；Ｇｅｈｒｋｅ ＪＭ、Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ Ｏ、Ｃｌｅｍｅｎｔ ＭＫ、Ｗｕ Ｙ、Ｚｅｎｇ Ｊ、Ｂａｕｅｒ ＤＥ、Ｐｉｎｅｌｌｏ Ｌ、Ｊｏｕｎｇ ＪＫ．Ａｎ ＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｃａｓ９ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ａｎｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８ Ｎｏｖ；３６（１０）：９７７－９８２も参照のこと。
[0285]本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」または「マーカー」という用語は、患者由来のサンプルを、心血管疾患または障害などの病的状態と関連するものとして分類するために使用され得る任意の生化学的マーカー、血清学的マーカー、遺伝子マーカー、または他の臨床的もしくは超音波検査的特徴を指すために交換可能に使用される。
[0286]本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、限定するものではないが、ポリクローナルであっても、もしくはモノクローナルであってもよく、任意のクラスおよびアイソタイプであってもよい免疫グロブリン分子の集団、または免疫グロブリン分子のフラグメントを含む。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭという５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１（ヒト）、ＩｇＡ２（ヒト）、ＩｇＡａ（イヌ）、ＩｇＡｂ（イヌ）、ＩｇＡｃ（イヌ）、およびＩｇＡｄ（イヌ）に分割され得る。そのようなフラグメントは、一般に、抗原に特異的に結合する抗体分子の部分を含む。例えば、当該技術分野でＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２として公知の免疫グロブリン分子のフラグメントは、抗体という用語の意味に含まれる。
[0287]本明細書で使用される「標識」という用語は、検出可能な化合物、組成物、または固体支持体であって、モノクローナル抗体またはタンパク質に直接的または間接的に（例えば、共有結合または非共有結合によって、単独でまたはカプセル化して）コンジュゲートし得るものを指す。この標識は、それ自体で検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識、化学発光色素、電気化学標識、金属キレート、ラテックス粒子、または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素など）。本開示で使用される標識は、限定するものではないが、アルカリホスファターゼ；グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；イソルミノールなどの化学発光剤、フルオレセインおよびローダミン化合物などの蛍光剤；リボザイム；ならびに色素であってもよい。標識とはまた、それ自体が検出可能な特異的結合分子であってもよい（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジギオキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、例えば、ヘキサヒスチジン（配列番号１１４）、２，４－ジニトロベンゼン、フェニルアルセネート、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）。標識の利用は、電磁放射線の検出または直接可視化などの手段によって検出され、任意選択では測定され得るシグナルを生成する。
[0288]「実質的な結合」または「実質的に結合する」とは、特定のアッセイ条件下でのアッセイ混合物中の分子間の特異的結合または親和性の量を指す。その最も広い態様では、実質的な結合は、第１分子が第２分子に結合も認識できないことと、第１分子が第３分子に結合も認識できないこととの間の差に関連し、その差は意味のあるアッセイを可能にして、分子の相対濃度、ならびにインキュベーションの時間および温度を含む特定の一連のアッセイ条件下で、特異的結合を識別するために実施するのに十分である。別の態様では、１つの分子は、第１の分子が第２の分子に対して、例えば、分子の相対濃度およびインキュベーションを含む、特定の一連のアッセイ条件下で、第３の分子に対して示される反応性の２５％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満の反応性を示す場合、交差反応性の意味で別の分子を結合または認識することは実質的に不可能である。特異的結合は、いくつかの広く知られている方法、例えば、免疫組織化学アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはウェスタンブロットアッセイなどを使用して試験され得る。
[0289]本明細書で使用される用語「実質的に同じアミノ酸配列」には、天然に存在するアミノ酸配列と類似しているが同一ではないアミノ酸配列が含まれる。例えば、フラジェリンタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、例えばポリペプチドは、天然に存在するフラジェリンタンパク質のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の付加、欠失、または置換などの１つまたは複数の修飾を有し得、ただし、これは改変されたポリペプチドが、免疫反応性などのフラジェリンの少なくとも１つの生物学的活性を実質的に保持するという条件下である。２つの配列間の「類似性パーセンテージ」とは、一致する残基または２つの配列によって共有される保存的残基を含む位置の数を、比較される位置の数で割って１００倍した関数である。これに関して、配列内の保存的残基とは残基であって、対応する参照残基と物理的または機能的に類似している、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性、例としては、共有結合または水素結合などを形成する能力を有する残基である。
[0290]「ターゲティング部分」という用語は、選択された標的、例えば、細胞、細胞型、組織、器官、体の領域、またはコンパートメント、例えば、細胞、組織、または器官コンパートメントに対して増強された親和性を提供する任意の分子を指す。いくつかの例示的なターゲティング部分としては、限定するものではないが、抗体、抗原、炭水化物塩基部分、葉酸塩、受容体リガンド、炭水化物、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬおよびＨＤＬリガンドが挙げられる。炭水化物ベースのターゲティング部分としては、限定するものではないが、Ｄ－ガラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、多価ＧａｌＮＡｃ、例えば、ＧａｌＮＡｃ２およびＧａｌＮＡｃ３；Ｄ－マンノース、多価マンノース、多価ラクトース、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸およびレクチンが挙げられる。多価という用語は、複数の単糖単位が存在することを示す。そのような単糖サブユニットは、グリコシド結合を介して互いに結合されてもよいし、または足場分子に結合されてもよい。
[0291]「異種」という用語は、自然界では互いに同じ関係では通常見出されない任意の２つ以上の核酸またはポリペプチド配列を指す。例えば、異種核酸は、典型的には、組換えによって産生され、例えば、ある供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域など、新しい機能的核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。同様に、異種ポリペプチドは、多くの場合、自然界では互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を指す（例えば、融合タンパク質）。
[0292]本明細書で使用される場合、「フラグメント」という用語は、そのフラグメントが疾患患者の血清中の少なくとも１つの抗体との反応性を保持するという条件で、全長タンパク質のアミノ酸のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質セグメントを含む。
[0293]「エピトープ」とは、ポリペプチドに特異的な抗体、例えばＩＢＤ関連抗体上のパラトープによる結合について認識される、ポリペプチド上の抗原決定基である。
[0294]「臨床因子」という用語には、心血管疾患に関連する患者の症状が含まれる。臨床的要因の例としては、限定するものではないが、狭心症；胸痛；呼吸困難；動悸；衰弱；めまい；悪心；発汗；頻脈；徐脈；不整脈；心房細動；下肢の腫れ；チアノーゼ；倦怠感；失神；顔のしびれ；手足のしびれ；跛行もしくは筋肉のけいれん；腹部の膨満；または発熱が挙げられる。いくつかの実施形態では、心血管疾患の診断は、統計アルゴリズムを使用して患者における１つまたは複数のマーカーの存在またはレベルを分析することと、患者が１つまたは複数の臨床因子を有するか否かを決定することとの組合せに基づく。
[0294]「臨床因子」という用語には、心血管疾患に関連する患者の症状が含まれる。臨床的要因の例としては、限定するものではないが、狭心症；胸痛；呼吸困難；動悸；衰弱；めまい；悪心；発汗；頻脈；徐脈；不整脈；心房細動；下肢の腫れ；チアノーゼ；倦怠感；失神；顔のしびれ；手足のしびれ；跛行もしくは筋肉のけいれん；腹部の膨満；または発熱が挙げられる。いくつかの実施形態では、心血管疾患の診断は、統計アルゴリズムを使用して患者における１つまたは複数のマーカーの存在またはレベルを分析することと、患者が１つまたは複数の臨床因子を有するか否かを決定することとの組合せに基づく。
[0295]「予後」という用語は、病的状態、例えば心血管疾患、または疾患からの回復という可能性のある経過および転帰の予測を含む。いくつかの実施形態では、統計アルゴリズムの使用によって、患者の心血管疾患の予後が得られる。例えば、予後は、手術、１つまたは複数の臨床的要因の発生、または疾患からの回復であり得る。
[0296]ＬＮＰにおける「ＲＮＡ」という用語は、一般に、前記ＬＮＰを調製するために、存在するか、封入されるか、または使用される全ＲＮＡペイロードを指す。全ＲＮＡペイロードは、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンタゴミール（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、アプタマー、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）およびそれらの任意の組合せなどの任意の核酸実体を含み得る。
[0297]本明細書では、核酸剤などの治療剤の標的送達のための方法および組成物が提供される。本明細書で使用される治療剤は、標的化送達を支援するために、ターゲティング部分に接続または会合され得る。例えば、治療剤とターゲティング部分とはコンジュゲートを形成し得る。治療剤は、ガイドＲＮＡなどの核酸と複合体を形成した核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼ系を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、化学修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは、ＤＮＡの挿入または欠失によって遺伝子が変更、操作、編集、および修飾され得る、遺伝子に関連する任意の疾患、障害、または状態の治療のための医薬品の調製に使用され得る。本開示のさらなる態様によれば、修飾ガイドＲＮＡは、ＤＮＡを欠失、置換、修復または挿入するステップによって遺伝子を変更するために使用され得る。これは、微生物または動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトで行うことができる。ヒト細胞または組織は、インビトロで本開示のガイドＲＮＡおよび当該技術分野で公知のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して遺伝的に変更または修正され、次いで、それを必要とする患者に戻され得る。本開示の別の態様では、本開示による修飾ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。この薬学的組成物は、本開示の修飾ガイドＲＮＡを有するベクターまたは細胞を含み得る。本開示のさらなる態様では、修飾ガイドＲＮＡと、ＧａｌＮＡｃ、ポリマー、リポソーム、ペプチド、アプタマー、抗体、ウイルスベクター、葉酸塩またはトランスフェリンから選択される少なくとも１つの送達手段とを含む組成物が提供される。
ヌクレアーゼシステム
[0298]本明細書では、核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む活性剤または治療剤の標的送達のための組成物および方法が提供される。活性剤は、薬学的組成物、薬物、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＲＮＰ、脂質ナノ粒子、またはタンパク質－ＲＮＡ複合体であってもよい。本明細書に記載の標的送達は、活性剤を特定の所望の位置、例えば、特定のインビボ位置、細胞、組織、または器官、細胞内マトリックス内の認識位置、細胞内の特定の位置に導き得る。いくつかの実施形態では、活性剤は、ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに関連するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、活性剤は、１つまたは複数の標的遺伝子、例えば、ＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の活性および／または機能を改変し得るヌクレアーゼ系を含む。
[0298]本明細書では、核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む活性剤または治療剤の標的送達のための組成物および方法が提供される。活性剤は、薬学的組成物、薬物、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＲＮＰ、脂質ナノ粒子、またはタンパク質－ＲＮＡ複合体であってもよい。本明細書に記載の標的送達は、活性剤を特定の所望の位置、例えば、特定のインビボ位置、細胞、組織、または器官、細胞内マトリックス内の認識位置、細胞内の特定の位置に導き得る。いくつかの実施形態では、活性剤は、ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに関連するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、活性剤は、１つまたは複数の標的遺伝子、例えば、ＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の活性および／または機能を改変し得るヌクレアーゼ系を含む。
[0299]いくつかの実施形態では、活性剤は、ヌクレアーゼ系を含むゲノム編集組成物を含む。いくつかの実施形態では、このゲノム編集組成物は、標的特異的ゲノム編集組成物である。いくつかの実施形態では、ゲノム編集組成物は、核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼまたはその一部を含む。本開示のいくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ系は、少なくとも１つのヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ系は、少なくとも１つのプログラム可能なヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼはＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを切断し得る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼはＲＮＡを切断し得る。
[0300]いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓタンパク質ドメイン（「Ｃａｓヌクレアーゼ」とも呼ばれる）を含んでもよい。Ｃａｓタンパク質は、ガイド核酸、例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相互作用する少なくとも１つのドメインを含んでもよい。さらに、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡによって標的配列に向けられ得る。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質が標的配列に向けられ、標的配列を切断し得るように、Ｃａｓタンパク質および標的配列と相互作用する。特定の実施形態、例えばＣａｓ９では、Ｃａｓタンパク質は、単一のタンパク質エフェクター、ＲＮＡ誘導型（ＲＮＡガイドの）ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、このガイドＲＮＡは、標的切断に対する特異性を提供し、Ｃａｓタンパク質は普遍的であり、異なるガイドＲＮＡと対になって異なる標的配列を切断し得る。Ｃａｓタンパク質およびＣａｓヌクレアーゼという用語は、本明細書では交換可能に使用される。
[0301]いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、もしくはＩＩＩ型の系の構成要素、またはそれらの任意のオルソログを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座の更新された分類スキームは、タイプＩ～ＶまたはＶＩを有するクラス１およびクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを定義する。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３（１１）：７２２－３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、６０：３８５－３９７（２０１５）を参照のこと。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、単一のタンパク質エフェクターがある。タイプＩＩ、Ｖ、およびＶＩのＣａｓタンパク質は、本明細書において「クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ」と呼ばれる、単一タンパク質のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであってもよい。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、およびＣ２ｃ３タンパク質が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質、Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｃｅｌｌ、１６３：１－１３（２０１５）は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン．Ｓ３を含む。
[0302]いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系由来のＣａｓ９タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質などの単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼに由来し得る。タンパク質のＣａｓ９およびＣｐｆ１ファミリーは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素であり、本明細書でさらに説明するように、適切なガイドＲＮＡを設計することによって、所望の核酸標的を切断するように指示され得る。
[0303]ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系構成要素は、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型系に由来し得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの構造および配列は、当業者に公知である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２、３３７：８１６－８２１；Ｄｅｌｃｈｅｖａら Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、４７１：６０２－６０７）。いくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＮＣＢＩ参照番号ＮＣ＿００２７３７．２、配列番号２）およびＵｎｉｐｒｏｔ参照Ｑ９９ＺＷ２（配列番号１）に対応する。
[0304]Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（野生型）タンパク質配列（配列番号１）
[0305]ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＴＴＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＶＮＩＶＫＫＴＥＶＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ。
[0305]ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＴＴＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＶＮＩＶＫＫＴＥＶＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ。
[0306]Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（野性型）ヌクレオチド配列（配列番号２）
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[0307]Ｃａｓ９タンパク質または他の構成要素が由来し得る種の非限定的な例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、およびＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒａｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒａｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来してもよい。
[0308]いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つ以上のヌクレアーゼドメインを含んでもよい。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも１つのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃｐｆ１／Ｃａｓ１２ａ）および少なくとも１つのＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、標的配列にＤＳＢを導入することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、機能的ヌクレアーゼドメインを１つだけ含むように修飾してもよい。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つが変異するか、完全にまたは部分的に欠失してその核酸切断活性が低下するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、機能的なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含まないように修飾されてもよい。他の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、機能的なＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含まないように修飾されてもよい。ヌクレアーゼドメインの１つだけが機能するいくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、標的配列に一本鎖切断（「ニック」）を導入し得るニッカーゼであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存されたアミノ酸が置換されて、ヌクレアーゼ活性が低下または変更される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ニッカーゼは、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含んでもよい。ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含んでもよい。ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、およびＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヌクレアーゼ系は、標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖にそれぞれ相補的なニッカーゼおよび一対のガイドＲＮＡを含んでもよい。ガイドＲＮＡは、標的配列の反対側の鎖上にニックを生成すること（すなわち、二重ニッキング）によって、ニッカーゼを標的に向け、ＤＳＢを導入するように指示し得る。タンパク質の１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の一部によって置き換えられている、キメラＣａｓ９タンパク質もまた使用されてもよい。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられ得る。Ｃａｓ９タンパク質は修飾ヌクレアーゼであってもよい。
[0309]様々な種由来の野生型Ｃａｓ９およびＣａｓ９配列を整列させて、対応する相同アミノ酸残基を決定し、例えば、配列番号１のＤ１０およびＨ８４０のアミノ酸残基を決定および／または修飾して、相同アミノ酸残基の対応する変異を伴うＣａｓ９バリアントの生成を可能にし得る。整列方法は、当業者に公知である。例えば、アラインメントは、ＮＣＢＩ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ－ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＣＯＢＡＬＴ、ｓｔ－ｖａ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｃｏｂａｌｔでアクセス可能）を使用して実行してもよい。
[0310]代替の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の構成要素であり得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
融合タンパク質
[0311]遺伝子、例えば、ＰＣＳＫ９、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ３、ＬＰＡ、ＡＰＯＢ、ＭＴＰ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ８、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＥ、ＬＤＬＲ、ＩＤＯＬ、ＮＰＣ１Ｌ１、ＡＳＧＲ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＧＡＬＮＴ２、ＧＣＫＲ、ＬＰＬ、ＭＬＸＩＰＬ、ＳＯＲＴ１、ＴＲＩＢ１、ＭＡＲＣ１、ＡＢＣＧ５、またはＡＢＣＧ８の標的化修飾の組成物および方法が本明細書に提供される。特定の例では、修飾はエクスビボであっても、またはインビボであってもよい。好ましい実施形態では、標的化された修飾は、特定のタイプの臓器、組織、または細胞、例えば肝臓の肝細胞に向けられ得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、融合タンパク質を含むゲノム編集組成物で遺伝的に修飾される。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子の標的化修飾のための融合タンパク質が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、標的特異的ヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼは、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であってもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインが変異してそのヌクレアーゼ切断活性が低下するように、ヌクレアーゼドメインを修飾してもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性は完全に消失する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性が部分的に低下する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレアーゼドメインは、修飾Ｃａｓタンパク質ドメインを含んでもよい。特定の実施形態では、修飾Ｃａｓタンパク質ドメインは、修飾Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、修飾Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメインである。いくつかの実施形態では、修飾ｄＣａｓ９ドメインは、ニッカーゼドメインである。いくつかの実施形態では、修飾Ｃａｓ９ドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づいて、Ｄ１０Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ９８３ＡおよびＤ９８６Ａから選択される少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレアーゼドメインは、触媒的に不活性なＣｐｆ１ドメイン、触媒的に不活性なＣａｓ１３ａドメイン、触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂドメイン、または触媒的に不活性なＣａｓ１３ｃドメインである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレアーゼドメインは、触媒的に不活性なＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、およびＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質ドメインである。
[0311]遺伝子、例えば、ＰＣＳＫ９、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ３、ＬＰＡ、ＡＰＯＢ、ＭＴＰ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ８、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＥ、ＬＤＬＲ、ＩＤＯＬ、ＮＰＣ１Ｌ１、ＡＳＧＲ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＧＡＬＮＴ２、ＧＣＫＲ、ＬＰＬ、ＭＬＸＩＰＬ、ＳＯＲＴ１、ＴＲＩＢ１、ＭＡＲＣ１、ＡＢＣＧ５、またはＡＢＣＧ８の標的化修飾の組成物および方法が本明細書に提供される。特定の例では、修飾はエクスビボであっても、またはインビボであってもよい。好ましい実施形態では、標的化された修飾は、特定のタイプの臓器、組織、または細胞、例えば肝臓の肝細胞に向けられ得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、融合タンパク質を含むゲノム編集組成物で遺伝的に修飾される。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子の標的化修飾のための融合タンパク質が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、標的特異的ヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼは、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であってもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインが変異してそのヌクレアーゼ切断活性が低下するように、ヌクレアーゼドメインを修飾してもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性は完全に消失する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性が部分的に低下する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレアーゼドメインは、修飾Ｃａｓタンパク質ドメインを含んでもよい。特定の実施形態では、修飾Ｃａｓタンパク質ドメインは、修飾Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、修飾Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメインである。いくつかの実施形態では、修飾ｄＣａｓ９ドメインは、ニッカーゼドメインである。いくつかの実施形態では、修飾Ｃａｓ９ドメインは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づいて、Ｄ１０Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ９８３ＡおよびＤ９８６Ａから選択される少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレアーゼドメインは、触媒的に不活性なＣｐｆ１ドメイン、触媒的に不活性なＣａｓ１３ａドメイン、触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂドメイン、または触媒的に不活性なＣａｓ１３ｃドメインである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレアーゼドメインは、触媒的に不活性なＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、およびＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質ドメインである。
[0312]いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメイン以外に１つまたは複数の機能ドメインを含む。少なくとも１つのタンパク質ドメインは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部位置に位置し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の異種タンパク質ドメインが、融合タンパク質上の１つまたは複数の位置にある。機能ドメインの非限定的な例としては、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、デメチラーゼドメインが挙げられる。いくつかの実施形態では、機能ドメインは、塩基編集酵素ドメインを含む。いくつかの実施形態では、機能ドメインは、シチジンデアミナーゼドメインである。例えば、シチジンデアミナーゼは、特定のシチジンをウラシルに脱アミノ化し、Ｕ－Ｇミスマッチをもたらし、その後、細胞修復メカニズムを介して分離され、Ｕ－Ａ塩基対を形成し、続いてＴ－Ａ塩基対を形成し、それによりＣ→Ｔ置換を作成する。シチジンデアミナーゼドメインおよびシチジン－デアミナーゼ融合タンパク質配列は、Ｋｏｍｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ２０１７、３（８）：ｅａａｏ４７７４；Ｋｏｍｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ２０１６、５３３：４２０－４２４に記載のとおり、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、機能ドメインは、アデニンデアミナーゼドメインである。例えば、アデニンデアミナーゼドメインは、アデノシンを脱アミノ化してイノシンを生成し得、イノシンはシチジンと塩基対を形成し、続いて細胞修復機構によってグアニンに修正され、それによりＡをＧに変換する。例示的なアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇａｕｄｅｌｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ２０１７ ５５１（７６８１）：４６４－４７１に記載のとおりである。
[0313]いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、２、３、４、または５個のＮＬＳを含んでもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、１～１０個のＮＬＳを含んでもよい。ＮＬＳ配列は、融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端で融合され得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号４）などの単一部分配列であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、例えば、ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号５）などの２部分配列であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、その野生型対応物から遺伝子修飾され得る。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、ＡＢＥ７．１０の配列（配列番号６）を含む。
[0314]いくつかの実施形態では、融合タンパク質はタグドメインをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、タグドメインは、蛍光タグ、精製タグ、エピトープタグ、またはレポーター遺伝子タグを含んでもよい。いくつかの実施形態では、タグドメインは蛍光タンパク質ドメインを含んでもよい。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ、）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ（ミドリイシ）－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、タグドメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグを含んでもよい。非限定的なタグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６×Ｈｉｓ（配列番号１１４）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、タグドメインは、レポーター遺伝子ドメインを含んでもよい。非限定的な例示的なレポーター遺伝子としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
[0315]さらなる実施形態では、ヌクレアーゼ系におけるヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質以外の１つまたは複数のプログラム可能なヌクレアーゼを含んでもよい。例えば、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ）、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびメガＴＡＬから選択され得る。
[0316]天然に存在するメガヌクレアーゼは、約１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識して切断し得、一般に５つのファミリーに分類される。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、ＨＮＨファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリー、およびＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫファミリーから選択され得る。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、その同族標的配列以外の配列を認識して結合するように操作され得る。いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、異種ヌクレアーゼドメインに融合され得る。いくつかの実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼなどのメガヌクレアーゼを、ＴＡＬモジュールに融合させて、「メガＴＡＬ」タンパク質などのハイブリッドタンパク質を作成してもよい。メガＴＡＬタンパク質は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインおよびＴＡＬモジュールの両方の標的配列を認識することにより、ＤＮＡ標的特異性を改善した場合もある。
[0317]ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（「ジンクフィンガー」または「ＺＦ」）およびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質である。各々の天然に存在するＺＦは、３つの連続した塩基対（ＤＮＡトリプレット）に結合し得、ＺＦ反復が組み合わさって、ＤＮＡ標的配列を認識し、十分な親和性を提供する。したがって、操作されたＺＦ反復を組み合わせて、例えば、９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ、または１８ｂｐなどのより長いＤＮＡ配列を認識してもよい。いくつかの実施形態では、ＺＦＮは、制限エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインに融合したＺＦを含んでもよい。例えば、制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼが二量体化して活性になる場合などに、二量体化ドメインを含んでもよく、ＺＦ反復およびヌクレアーゼドメインを含む一対のＺＦＮは、その間に相互接続配列がある（文献ではスペーサーと呼ばれることもある）、ＤＮＡ分子の反対側の鎖の上の各ＺＦ反復によって認識される２つの半標的を含む標的配列を標的とするように設計されてもよい。例えば、相互接続配列は、長さが５～７ｂｐであってもよい。対の両方のＺＦＮが結合すると、ヌクレアーゼドメインは二量体化し、相互接続配列内にＤＳＢを導入し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインの二量体化ドメインは、二量体化を促進するノブイントゥホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）モチーフを含んでもよい。例えば、ＺＦＮは、ＦｏｋＩの二量体化ドメインにノブイントゥホールへモチーフを含んでもよい。
[0318]ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインは、通常、可変数の３４または３５アミノ酸反復（「モジュール」または「ＴＡＬモジュール」）を含み、各モジュールは、単一のＤＮＡ塩基対、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣに結合する。各モジュールの１２位および１３位の隣接する残基（「反復可変二残基」またはＲＶＤ）は、モジュールが結合する単一のＤＮＡ塩基対を指定する。Ｇを認識するために使用されるモジュールは、Ａにも親和性がある可能性があるが、ＴＡＬＥＮは単純な認識コード（４つの塩基のそれぞれに１つのモジュール）の恩恵を受け、これにより、特定の標的配列を認識するＤＮＡ結合ドメインのカスタマイズが大幅に簡素化される。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、制限エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインを含んでもよい。例えば、制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであってもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインを二量体化して活性になってもよく、間に相互接続する配列があるＤＮＡ分子の反対側の鎖上の各ＤＮＡ結合ドメインによって認識される２つの半分の標的配列を含む標的配列を標的とするように、ＴＡＬＥＮＳの対を設計してもよい。例えば、各半分標的配列は、１０～２０ｂｐの範囲であり得、相互接続配列は、長さが１２～１９ｂｐであり得る。ペアの両方のＴＡＬＥＮが結合すると、ヌクレアーゼドメインが二量体化し、相互接続配列内にＤＳＢを導入し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインの二量体化ドメインは、二量体化を促進するノブイントゥホールモチーフを含んでもよい。例えば、ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩの二量体化ドメインに、ノブイントゥホールのモチーフを含んでもよい。
[0319]本開示の特定の実施形態は、ベクター上に提供される、本明細書に記載のヌクレアーゼ系をコードする核酸も提供する。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡ分子であってもよい。他の実施形態では、核酸はＲＮＡ分子であってもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡ分子であり得る。
[0320]いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、１つまたは複数の真核細胞型における効率的な発現のために最適化されたコドンであり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、１つまたは複数の哺乳動物細胞における効率的な発現のために最適化されたコドンであり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸は、ヒト細胞における効率的な発現のために最適化されたコドンであり得る。コドン使用表およびコドン最適化アルゴリズムを含むコドン最適化の方法は、当該技術分野で利用可能である。
ガイドポリヌクレオチド
[0321]本開示のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を標的核酸分子上の標的配列に誘導し得、そこでガイドＲＮＡがハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質が標的配列を切断する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体であり得る。
[0321]本開示のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を標的核酸分子上の標的配列に誘導し得、そこでガイドＲＮＡがハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質が標的配列を切断する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体であり得る。
[0322]ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、Ｃａｓタンパク質に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド内の特定の位置に標的し得る。ガイド核酸は、核酸標的化セグメントおよびＣａｓタンパク質結合セグメントを含んでもよい。
[0323]ガイド核酸は、別の核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る核酸を指し得る。ガイド核酸は、ＲＮＡ、例えばガイドＲＮＡであってもよい。ガイド核酸はＤＮＡであってもよい。ガイド核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでもよい。ガイド核酸は一本鎖であってもよい。ガイド核酸は二本鎖であってもよい。ガイド核酸は、ヌクレオチド類似体を含んでもよい。ガイド核酸は修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ガイド核酸は、部位特異的に核酸の配列に結合するようにプログラムしても、または設計してもよい。
[0324]ガイド核酸は、核酸に新しい特徴または向上した特徴を提供するために、１つまたは複数の修飾を含んでもよい。ガイド核酸は、核酸親和性タグを含んでもよい。ガイド核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、および／または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
[0325]ガイド核酸は、標的ポリヌクレオチド中のプロトスペーサー配列に相補的な核酸標的領域（例えば、スペーサー領域）を、例えば、５’末端もしくは３’末端にまたはその近くに含んでもよい。ガイド核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（塩基対形成）を介して、配列特異的な方法でプロトスペーサーと相互作用し得る。プロトスペーサー配列は、標的ポリヌクレオチドのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’または３’に位置し得る。スペーサー領域のヌクレオチド配列は変動し得、ガイド核酸が相互作用し得る標的核酸内の位置を決定し得る。ガイド核酸のスペーサー領域は、標的核酸内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように設計しても、または改変してもよい。
[0326]ガイド核酸は、デュアルガイド核酸と呼ぶことができる２つの別々の核酸分子を含んでもよい。ガイド核酸は、シングルガイド（単一のガイド）核酸（例えば、ｓｇＲＮＡ）と呼ぶことができる、単一の核酸分子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、融合ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むシングルガイド核酸である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含むシングルガイド核酸である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含むがｔｒａｃＲＮＡを欠くシングルガイド核酸である。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、非融合ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルガイド核酸である。例示的なデュアルガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ様分子およびｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を含んでもよい。例示的なシングルガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ様分子を含んでもよい。例示的なシングルガイド核酸は、融合されたｃｒＲＮＡ様分子およびｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を含んでもよい。
[0327]ｃｒＲＮＡは、ガイド核酸の核酸標的セグメント（例えば、スペーサー領域）と、ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合セグメントの二本鎖－二重鎖の半分を形成し得るヌクレオチドの一続きとを含んでもよい。
[0328]ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＣａｓタンパク質結合セグメントの二本鎖の二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドの一続きを含んでもよい。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドの一続きは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドの一続きに相補的であり、それとハイブリダイズして、ガイド核酸のＣａｓタンパク質結合ドメインの二本鎖の二重鎖を形成し得る。
[0329]ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡはハイブリダイズしてガイド核酸を形成し得る。ｃｒＲＮＡはまた、標的核酸認識配列（例えば、プロトスペーサー）にハイブリダイズする一本鎖核酸標的化セグメント（例えば、スペーサー領域）を提供し得る。スペーサー領域を含むｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列は、ガイド核酸が使用される種に特異的であるように設計してもよい。
[0330]ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のガイドＲＮＡは、典型的には、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｃｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムのガイドＲＮＡは、通常、ｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的核酸分子上の標的配列に相補的でかつハイブリダイズするターゲティング配列を含んでもよい。ｃｒＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部に相補的でかつハイブリダイズする配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のスペーサーとして作用する、細菌のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写された天然に存在するｃｒＲＮＡの構造と匹敵し得る。
[0331]ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡのターゲティング配列を介して目的の任意の配列を標的化し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列と標的核酸分子上の標的配列との間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列および標的核酸分子上の標的配列は、１００％相補的であり得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列および標的核酸分子上の標的配列は、少なくとも１つのミスマッチを含んでもよい。例えば、ガイドＲＮＡのターゲティング配列および標的核酸分子上の標的配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列および標的核酸分子上の標的配列は、１～６個のミスマッチを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列および標的核酸分子上の標的配列は、５つまたは６つのミスマッチを含んでもよい。
[0332]ターゲティング配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよび使用される構成要素に依存し得る。例えば、異なる細菌種由来の異なるＣａｓ９タンパク質は、様々な最適なターゲティング配列の長さを有する。したがって、ターゲティング配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０を超えるヌクレオチド長を含み得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング配列は、１８～３０ヌクレオチド長を含み得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング配列は、１９～２４ヌクレオチド長を含み得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング配列は、２０ヌクレオチド長を含み得る。
[0333]ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒは、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の形成を促進するのに十分な相補性を有する任意の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒとの間の相補的配列は、同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおけるｔｒａｃｒ ＲＮＡに相補的である天然に存在するｃｒＲＮＡの配列（「タグ」または「ハンドル」とも呼ばれる）の全部または一部を含み得る。いくつかの実施形態では、相補配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系由来の反復配列の全部または一部を含み得る。いくつかの実施形態では、相補配列は、短縮または修飾タグまたはハンドル配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ ＲＮＡと、２つの配列のうち短い方の長さに沿ってｔｒａｃｒ ＲＮＡとハイブリダイズする相補部分の部分との間の相補性の程度は、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上、ただし１００％未満であり得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒおよび／またはウォブル塩基対形成の上に１つまたは複数のバルジ構造が存在するので、ｔｒａｃｒ ＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡとハイブリダイズする部分は、２つの配列のうち短い方の長さに沿って１００％相補的ではない。ｔｒａｃｒに相補的なｔｒａｃｒ ＲＮＡ部分の長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムまたはｔｒａｃｒ ＲＮＡに依存し得る。例えば、相補的部分は、１０～５０ヌクレオチド、または５０ヌクレオチドを超える長さを含み得る。いくつかの実施形態では、相補的部分は、１５～４０ヌクレオチド長を含み得る。他の実施形態では、相補的部分は、２０～３０ヌクレオチド長を含み得る。さらに他の実施形態では、相補的部分は、２２ヌクレオチド長を含み得る。例えば、デュアルガイドＲＮＡを用いる場合、相補部分の長さに上限はなくてもよい。
[0334]いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ ＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系由来の野生型ｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列の全部または一部を含み得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ ＲＮＡは、野生型ｔｒａｃｒ ＲＮＡの短縮型または改変型バリアントを含み得る。ｔｒａｃｒ ＲＮＡの長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに依存し得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ ＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超えるヌクレオチド長を含んでもよい。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒは、少なくとも２６ヌクレオチド長である。追加の実施形態では、ｔｒａｃｒは、少なくとも４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ ＲＮＡは、例えば、１つまたは複数のヘアピンもしくはステムループ構造、または１つまたは複数のバルジ構造などの特定の二次構造を含んでもよい。
[0335]いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ分子を含んでもよく、本明細書では「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒａｃｒ ＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含んでもよい。第１および第２のＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ上のフラッグポールとｔｒａｃｒ ＲＮＡとの間の塩基対形成を介してＲＮＡ二重鎖を形成し得る。
[0336]いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、シングル（単一の）ＲＮＡ分子を含んでもよく、本明細書では「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ＲＮＡに共有結合されたｃｒＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、リンカーを介して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、単分子ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ上のフラッグポールとｔｒａｃｒ ＲＮＡとの間の塩基対形成を介してステムループ構造を含んでもよい。
[0337]本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のガイドＲＮＡをコードする核酸、例えばベクターも提供する。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡ分子であってもよい。他の実施形態では、核酸はＲＮＡ分子であってもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列の全部または一部が隣接するターゲティング配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｔｒａｃｒ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、２つの別個の核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、単一の核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、単一の核酸の反対側の鎖によってコードされ得る。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、単一核酸の同じ鎖によってコードされ得る。
[0338]特定の実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系と共に使用してもよい。各ガイド ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２つ以上の標的配列を切断するように、異なるターゲティング配列を含む場合がある。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡが、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体内の活性または安定性など、同じまたは異なる特性を有し得る。２つ以上のガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡは同じベクター上でコードされても、または異なるベクター上でコードされてもよい。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。
[0339]高い特異性および低いオフターゲット効果を有する効率的な標的化のためのガイドＲＮＡを選択する方法は、当業者に公知である。プログラム可能な塩基編集の場合、標的配列を含むゲノム配列の選択は、参照により本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ、５３３、４２０－４２４（２０１６）に記載されているとおりであり得る。ガイドＲＮＡ配列およびＰＡＭの優先度は、プログラム可能なヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ９ｎ、Ｃｐｆｌ、ＮｇＡｇｏドメイン）のゲノム標的配列を定義する。Ｈｓｕら（Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１３、３１（９）：８２７－８３２）、Ｆｕｓｉら（ｂｉｏＲｘｉｖ０２１５６８；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０２１５６８）、Ｃｈａｒｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１５、１２（９）：８２３－６）、Ｄｏｅｎｃｈら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４、３２（１２）：１２６２－７）、Ｗａｎｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４、３４３）（６１６６）：８０－４）、Ｍｏｒｅｎｏ－Ｍａｔｅｏｓら（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１５、１２（１０）：９８２－８）、Ｈｏｕｓｄｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２０１５、８（３９３）：ｒｓ９）、Ｈａｅｕｓｓｌｅｒら、（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１６、１７：１４８）に記載のとおりオフターゲット結合を減少させる方法は、参照により本明細書に組み込まれる。ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの間のバルジ形成の可能性、および標的配列結合に影響を与え得るその他のパラメーターも、Ｂａｅら（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１４、３０、１４７３－５）に記載されているように考慮してもよく、Ｈｏｕｓｄｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２０１５、８（３９３）：ｒｓ９）およびＦａｒｂｏｕｄら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１５、１９９（４）：９５９－７１）も参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ修飾
[0340]本明細書では、標的化されたエクスビボおよびインビボ送達系に適した修飾ＲＮＡ分子が提供される。修飾ＲＮＡ分子は、２つ以上の連結したリボ核酸サブユニットを含み得る。非限定的な修飾ＲＮＡの例としては、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小型核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、および異核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）が挙げられる。本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、ＲＮＡ配列およびその任意の構造的実施形態の両方、例えば、一本鎖、二本鎖、三本鎖、環状、らせん、ヘアピン、ステムループ、バルジなどを包含する。修飾ＲＮＡは、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００塩基の長さを含み得る。修飾ＲＮＡは、少なくとも約１キロベース（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、またはそれ以上の長さを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。ｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡであっても、またはデュアルガイドＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞から単離しても、または組織から単離してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはＤＮＡから転写され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは化学的に合成されてもよい。
[0340]本明細書では、標的化されたエクスビボおよびインビボ送達系に適した修飾ＲＮＡ分子が提供される。修飾ＲＮＡ分子は、２つ以上の連結したリボ核酸サブユニットを含み得る。非限定的な修飾ＲＮＡの例としては、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小型核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、および異核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）が挙げられる。本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、ＲＮＡ配列およびその任意の構造的実施形態の両方、例えば、一本鎖、二本鎖、三本鎖、環状、らせん、ヘアピン、ステムループ、バルジなどを包含する。修飾ＲＮＡは、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００塩基の長さを含み得る。修飾ＲＮＡは、少なくとも約１キロベース（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、またはそれ以上の長さを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。ｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡであっても、またはデュアルガイドＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞から単離しても、または組織から単離してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはＤＮＡから転写され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは化学的に合成されてもよい。
[0341]特定の実施形態では、本明細書で提供される修飾ＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅまたは他のエキソヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。特定の実施形態では、本明細書で提供される修飾ＲＮＡ分子は、エンドヌクレアーゼによる分解を防ぐために安定化される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＲＮＡ分子は、インビボ送達に適しており、非修飾ＲＮＡと比較して、細胞性免疫受容体活性化（例えば、ＴＬＲ、ＲＩＧ－Ｉ）の誘導が少ない。ＲＮＡ修飾は、全体が両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｉｅｂｏｌｄ（２００８）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．Ａｐｒ ２９；６０（７）：８１３－２３）およびＳｏｒｒｅｎｔｉｎｏ（１９９８）Ｃｅｌｌｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ａｕｇ；５４（８）：７８５－９４に記載されているとおりである。
[0342]プリン核酸塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン核酸塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）などの「非修飾」または「天然」核酸塩基に加えて、当業者に公知の多くの修飾された核酸塩基または核酸塩基模倣体が、本明細書に記載の化合物に適している。非修飾または天然核酸塩基を修飾または置き換えて、特性が改善されたオリゴヌクレオチドを提供してもよい。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成および天然核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、またはツベルシジン）および本明細書に記載のオリゴマー修飾のいずれか１つを用いて調製し得る。あるいは、上記の塩基および「ユニバーサル塩基」のいずれかの置換または修飾された類似体を使用してもよい。天然塩基が非天然および／またはユニバーサル塩基によって置き換えられる場合、ヌクレオチドは、本明細書において修飾核酸塩基および／または核酸塩基修飾を含むと言われる。修飾核酸塩基および／または核酸塩基修飾にはまた、コンジュゲート部分、例えば、本明細書に記載のリガンドを含む、天然、非天然、およびユニバーサル塩基も含まれる。核酸塩基とのコンジュゲーションに好ましいコンジュゲート部分としては、適切なアルキル、アルケニル、またはアミド結合を有するリンカーを介して核酸塩基にコンジュゲートされ得るカチオン性アミノ基が挙げられる。
[0343]本明細書において用いる場合、「非修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。例示的な修飾核酸塩基としては、限定するものではないが、他の合成および天然核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、２－（ハロ）アデニン、２－（アルキル）アデニン、２－（プロピル）アデニン、２－（アミノ）アデニン、２－（アミノアルキルル）アデニン、２－（アミノプロピル）アデニン、２－（メチルチオ）－Ｎ６－（イソペンテニル）アデニン、６－（アルキル）アデニン、６－（メチル）アデニン、７－（デアザ）アデニン、８－（アルケニル）アデニン、８－（アルキル）アデニン、８－（アルキニル）アデニン、８－（アミノ）アデニン、８－（ハロ）アデニン、８－（ヒドロキシル）アデニン、８－（チオアルキル）アデニン、８－（チオール）アデニン、Ｎ６－（イソペンチル）アデニン、Ｎ６－（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６－（ジメチル）アデニン、２－（アルキル）グアニン、２－（プロピル）グアニン、６－（アルキル）グアニン、６－（メチル）グアニン、７－（アルキル）グアニン、７－（メチル）グアニン、７－（デアザ）グアニン、８－（アルキル）グアニン、８－（アルケニル）グアニン、８－（アルキニル）グアニン、８－（アミノ）グアニン、８－（ハロ）グアニン、８－（ヒドロキシル）グアニン、８－（チオアルキル）グアニン、８－（チオール）グアニン、Ｎ－（メチル）グアニン、２－（チオ）シトシン、３－（デアザ）－５－（アザ）シトシン、３－（アルキル）シトシン、３－（メチル）シトシン、５－（アルキル）シトシン、５－（アルキニル）シトシン、５－（ハロ）シトシン、５－（メチル）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（トリフルオロメチル）シトシン、６－（アゾ）シトシン、Ｎ４－（アセチル）シトシン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル、２－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２－（チオ）ウラシル、４－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２，４－（ジチオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２，４－（ジチオ）ウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－（アルキル）ウラシル、５－（アルキニル）ウラシル、５－（アリルアミノ）ウラシル、５－（アミノアリル）ウラシル、５－（アミノアルキル）ウラシル、５－（グアニジニウマルキル）ウラシル、５－（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル、５－（シアノアルキル）ウラシル、５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５－（ハロ）ウラシル、５－（メトキシ）ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、６－（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ－（メチル）ウラシル、５－ウラシル（すなわち、シュードウラシル）、２－（チオ）シュードウラシル、４－（チオ）シュードウラシル、２，４－（ジチオ）シュードウラシル、５－（アルキル）シュードウラシル、５－（メチル）シュードウラシル、５－（アルキル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－４－（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）－４－（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、５－（メチル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１－メチルシュードウラシル（Ｎ１－メチルシュードウラシル）、１－置換シュードウラシル、１－置換２（チオ）－シュードウラシル、１－置換４－（チオ）シュードウラシル、１－置換２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１－（アミノカルボニルエチルエニル）－シュードウラシル、１－（アミノカルボニルエチルエニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１－（アミノカルボニルエチルエニル）－４－（チオ）シュードウラシル、１－（アミノカルボニルエチルエニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）－シュードウラシル、１－（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチルエニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）－４－（チオ）シュードウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウマルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウマルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウマルキル－ヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウマルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２－アザ－イノシニル、７－デアザ－イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３－（メチル）イソカルボスチリリル、５－（メチル）イソカルボスチリリル、３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、７－（アザ）インドリル、６－（メチル）－７－（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９－（メチル）－イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、２，４，５－（トリメチル）フェニル、４－（メチル）インドリル、４，６－（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンゾイミダゾール、４－（メチル）ベンゾイミダゾール、６－（アゾ）チミン、２－ピリジノン、５－ニトロインドール、３－ニトロピロール、６－（アザ）ピリミジン、２－（アミノ）プリン、２，６－（ジアミノ）プリン、５－置換ピリミジン、Ｎ２－置換プリン、Ｎ６－置換プリン、０６－置換プリン、置換１，２，４－トリアゾール、ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ｏｒｉ／ｚｏ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ｂｉｓ－ｏｒｉ／ｚｏ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ｏｒｉ／ｚｏ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ｂｉｓ－ｏｒｉ／ｚｏ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－ピリドピリミジン－３－イル、または任意のＯ－アルキル化もしくはＮ－アルキル化されたその誘導体が挙げられる。あるいは、上記の塩基および「ユニバーサル塩基」のいずれかの置換または修飾類似体が使用されてもよい。ユニバーサル核酸塩基は、融解挙動、細胞内酵素による認識、またはオリゴヌクレオチド二重鎖の活性に実質的に影響を与えることなく、４つの天然に存在する核酸塩基の全てと塩基対を形成し得る任意の核酸塩基である。いくつかの例示的なユニバーサル核酸塩基としては、限定するものではないが、２，４－ジフルオロトルエン、ニトロピロリル、ニトロインドリル、８－アザ－７－デアザデニン、４－フルオロ－６－メチルベンズイミダズル、４－メチルベンジミダズル、３－メチルイソカルボスチリリル、５－メチルイソカルボスチリリル、３－メチル－７－プロピニルイソカルボスチリリル、７－アザインドリル、６－メチル－７－アザインドリル、イミジゾピリジニル、９－メチル－イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７－プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル－７－アザインドリル、２，４，５－トリメチルフェニル、４－メチリノリル、４，６－ジメチルインドリル、フェニル、ナプタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、およびそれらの構造誘導体（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｌｏａｋｅｓ、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９、２４３７－２４４７を参照のこと）が挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示される核酸塩基；２００９年３月２６日出願の国際出願番号ＰＣＴ ＵＳ０９／０３８４２５に開示される核酸塩基；ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８－８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０に開示される核酸塩基；Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３に開示される核酸塩基；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｉｎ，Ｐ．編、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００８に開示される核酸塩基；ならびにＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、１５章、ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９－３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３に開示される核酸塩基が挙げられる。上記の全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。
[0344]いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、ＧａｌＮＡｃなどの送達部分および／またはターゲティング部分を結合するように修飾される。適切には、ＧａｌＮＡｃは、ＲＮＡの３’末端、５’末端、またはその両方に結合され得る。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃは３’末端に結合している。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、非修飾の同等物と比較して改善を示す。そのような改善は、特異性の改善（例えば、オフターゲット効果が減少するか、より低い濃度のｇＲＮＡが必要とされるなど）、安定性の改善（例えば、ヌクレアーゼなどの酵素に対する耐性）、機能性の改善、または免疫原性もしくは免疫刺激特性の低下に関連し得る。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、細胞への効率的なトランスフェクション、および／または生物、組織、体液、もしくは細胞内へのＲＮＡの送達および維持を可能にする改善された特性を示し、その結果、ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡの機能が発生し得る。これらの改善された特性を、それらの非修飾の同等物と比較して測定する方法は、当業者に公知であり、本明細書に記載の方法が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、非修飾の同等物と比較して安定性が増加した修飾ＲＮＡが本明細書に提供される。非修飾の同等物とは、ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡであって、同じ特定の遺伝子配列を標的とし、同じＣａｓ９またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用し、天然ヌクレオチドを含むガイドＲＮＡを意味する。安定性の向上には、細胞、組織、または体液に存在し得る、そうでなければ機能が低下するようなＲＮＡの分解に寄与し得るヌクレアーゼなどの酵素に対する安定性または耐性の向上が含まれる。特定の実施形態では、安定性の増加には、血清安定性の増加が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、非修飾の同等物と比較して増加したＣＲＩＳＰＲ活性を有する修飾ガイドＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ活性を測定する方法は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書において、非修飾の同等物と比較して免疫刺激活性が低下した修飾ガイドＲＮＡが提供される。免疫刺激を測定する方法は、本明細書に記載されている。
[0345]本明細書では、標的送達のための修飾ｍＲＮＡ分子が提供される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ｂ、または塩基編集因子（ベースエディター）（ＢＥ）をコードするｍＲＮＡは、特定の組織を標的にするために修飾されてもよい。ｍＲＮＡは、２’位置でおよび／または骨格修飾で少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ中のヌクレオチドは、チオエートの修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、および５－エトキシウリジンのうちの１つまたは複数の修飾を含み得る。
[0346]特定の実施形態では、本明細書で提供されるｍＲＮＡ配列は、完全に修飾された、または部分的に修飾されたｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、フラグメント、または全長の複数のフラグメントに化学修飾を含む。ｍＲＮＡのヌクレオチドまたはそのセグメントの非限定的な例示的な修飾および修飾パターンを表２および表３に示す。
[0347]本明細書に提供されるのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系で使用するための修飾ガイドＲＮＡであり、このガイドＲＮＡは、２’位の少なくとも１つのヌクレオチドの化学修飾および／または骨格修飾によって修飾され得る。骨格修飾は、チオエートの修飾を含み得る。特定の実施形態において、修飾されるヌクレオチドは、Ｃａｓタンパク質中のＣａｓアミノ酸と相互作用してガイドＲＮＡのＣａｓへの結合をもたらすヌクレオチドの群から選択される。特定の実施形態では、この修飾は、ヌクレオチド上の２’－ＯＨが、Ｈ、－ＯＲ、－Ｒ、－Ｏ－Ｃ１～Ｃ６－アルキレン－ＯＲ、－Ｏ－Ｃ１～Ｃ６－アルキレン－ＯＨ、ハロ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ１～Ｃ６－アルキレン－ＮＨ２、－Ｃ１～Ｃ６－アルキレン－ＮＨＲ、－Ｃ１～Ｃ６－アルキレン－Ｎ（Ｒ）２、またはＣＮのうちの少なくとも１つで置き換えられており、ここで各Ｒは独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、またはＣ２～Ｃ６アルキニルおよびハロは、Ｆ、ＣＩ、ＢｒまたはＩである修飾を含み得る。場合によっては、この修飾は、２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－Ｆである。いくつかの実施形態では、この修飾は、２’－Ｆ、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、非環式ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、および２’－ａｒａ－Ｆ修飾のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－ＭＯＥを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、４’－メトキシおよび４’－エトキシ修飾などの４－Ｏ－アルキルリボ糖を含む。
[0348]好適には、修飾ガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、または任意の他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓにあるＲＮＡと適合され得る。この修飾または類似の修飾パターンはまた、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１またはＡｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＢＶ３Ｌ６由来のＣｐｆ１のＲＮＡをガイドするために行ってもよい。
[0349]特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、完全修飾シングルガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ＲＮＡ部分に化学修飾を含む。本開示によるガイドＲＮＡのヌクレオチドの非限定的な例示的修飾および修飾パターンを、表２および表３に示す。
[0350]本明細書に記載の修飾ガイドＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素との複合体で使用して、標的遺伝子またはＤＮＡ配列に変化をもたらし得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３などのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのヌクレアーゼ活性が修飾または低減されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含み得る。例えば、Ｃａｓ９酵素の一方または両方のヌクレアーゼサブドメインに変異を導入して、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９を生成し得る。Ｃａｓ９における例示的な不活化変異には、配列番号１の位置Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、またはＤ９８６における変更が含まれる。例えば、ＲｕｖＣサブドメインにおけるＤ１０Ａ変異およびＣａｓ９のＨＮＨサブドメインにおけるＨ８４０Ａ変異は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ不活性をもたらす。Ｃａｓ９のＲｕｖＣサブドメインのＤ１０Ａ変異またはＨＮＨサブドメインのＨ８４０Ａは、Ｃａｓ９ニッカーゼを生成する。Ｃａｓ９における追加のアミノ酸置換は、ＷＯ１５／８９３５４で考察されており、その全体が本明細書に組み込まれている。
[0351]修飾ガイドＲＮＡは、標的遺伝子または標的ＤＮＡ配列などの標的ヌクレオチドと配列同一性を共有するか、またはハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、修飾ガイドＲＮＡは、遺伝子の標的ヌクレオチドまたは標的ＤＮＡに対して少なくとも１００％、９９％、９８％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％の対応または同一性を有する。
[0352]本明細書に記載のヌクレオチドは、合成されても、または化学修飾されてもよい。例えば、本明細書で提供されるガイドＲＮＡは、合成または化学修飾されたガイドＲＮＡであってもよい。修飾されるガイドＲＮＡ中のヌクレオチドは、ガイドＲＮＡとＣａｓ９との結合領域中の１つまたは複数のヌクレオチド、および／またはガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの結合領域中のヌクレオチドに対応するヌクレオチドであってもよい。ガイドＲＮＡの残りの非修飾のヌクレオチドは、塩基の２’－ＯＨ位置へのＣａｓ９の結合を最小限に抑えるために特定する必要があるヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖部分の２’位で修飾され得る。いくつかの実施形態において、糖部分の２’－ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、Ｈ２、ＮＨＲ、Ｎ（Ｒ）２またはＣＮから選択される基によって置き換えられ、ここでＲはＣ１～Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。他の修飾としては、逆位の（デオキシ）無塩基、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、メトキシ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１～Ｃ１０（ＣＩ ｔｏ ＣＩＯ）低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｚｙｃｌｏａｌｋｙｌ）；ヘテロシクロアルカリール（ｈｅｔｅｒｏｚｙｃｌｏａｌｋａｒｙｌ）；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノまたは置換シリルが挙げられる。特定の配列および修飾を有するＲＮＡを作製する方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら（２０１１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１３３、１１５４０；米国特許第８，２０２，９８３号；Ｋｕｍａｒら、（２００７）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１２９、６８５９－６４；ＷＯ２０１３１７６８４４において、当業者に公知である。
[0353]いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは合成であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、化学的に合成されたガイドＲＮＡであってもよい。合成ＲＮＡの生産量は、配列および修飾に基づいている。２’－Ｏ－メチル修飾は、ＲＮＡ合成中のカップリングの有効性または効率を高め、したがって、化学的に合成されたＲＮＡの収量を増加させることが示されている。さらに、ヌクレオチドは、ホスホロチオエートによって修飾され得る。ホスホチオエート（ホスホロチオエート）（ＰＳ）結合は、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格の非架橋酸素を硫黄原子に置換する。したがって、本開示の例示的なヌクレオチドとしては、限定するものではないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ類、例としては、β－Ｄ－リボ配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ配置を有するａ－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、および２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ａ－ＬＮＡ）またはそのハイブリッドが挙げられる。
標的送達のためのコンジュゲート
[0354]本明細書では、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド、または他の微小分子もしくは高分子などの薬剤の標的送達に適したコンジュゲートが提供される。コンジュゲートは、エクスビボまたはインビボでの標的送達のための１つまたは複数のアプタマー、リガンド、または部分を含み得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ターゲティング部分（またはリガンド）、リンカー、およびターゲティング部分に接続された活性剤（またはペイロード）を含む。活性剤は、治療剤、予防剤、または診断／予後剤であってもよい。活性剤は、対象における生理学的機能（例えば、遺伝子発現）を操作する能力を有し得る。活性剤は、ガイドＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、またはペプチドであってもよい。活性剤は、リンカーを介して、非共有結合を介して、核酸塩基の対合形成を介して、またはそれらの任意の組合せによって、ターゲティング部分と結合され得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、式（Ｉ）：Ｘ－Ｙ－Ｚを有する単一の活性剤と単一のターゲティング部分との間のコンジュゲートであってもよく、式中、Ｘは、ターゲティング部分であり；Ｙはリンカーであり；かつＺはガイドＲＮＡである。特定の実施形態では、１つのターゲティングリガンドを２つ以上の活性剤にコンジュゲートしてもよく、このコンジュゲートは式：Ｘ－（Ｙ－Ｚ）ｎを有する。例えば、このコンジュゲートは、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態では、１つの活性剤を２つ以上のターゲティングリガンドに連結してもよく、このコンジュゲートは式：（Ｘ－Ｙ）ｎ－Ｚを有する。他の実施形態では、１つまたは複数のターゲティング部分は、コンジュゲート式が（Ｘ－Ｙ－Ｚ）ｎであり得る１つまたは複数の活性ペイロードに結合され得る。様々な組合せにおいて、コンジュゲートの式は、例えば、Ｘ－Ｙ－Ｚ－Ｙ－Ｘ、（Ｘ－Ｙ－Ｚ）ｎ－Ｙ－Ｚ、またはＸ－Ｙ－（Ｘ－Ｙ－Ｚ）ｎであってもよく、ここでＸはターゲティング部分であり；Ｙはリンカーであり；Ｚは活性剤、例えば、ガイドＲＮＡである。コンジュゲート中の各部分の数は、薬剤の種類、コンジュゲートのサイズ、送達標的、コンジュゲートのパッケージングに使用される粒子、他の活性剤（例えば、免疫学的アジュバント）および投与経路に応じて変動し得る。Ｘ、Ｙ、およびＺの各存在は、同じでも異なっていてもよく、例えば、コンジュゲートは、複数の種類のターゲティング部分、複数の種類のリンカー、および／または複数の種類の活性剤を含んでもよく、ｎは１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは１～５０の間、または２～２０の間、または５～４０の間の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の整数であってもよい。
[0354]本明細書では、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド、または他の微小分子もしくは高分子などの薬剤の標的送達に適したコンジュゲートが提供される。コンジュゲートは、エクスビボまたはインビボでの標的送達のための１つまたは複数のアプタマー、リガンド、または部分を含み得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ターゲティング部分（またはリガンド）、リンカー、およびターゲティング部分に接続された活性剤（またはペイロード）を含む。活性剤は、治療剤、予防剤、または診断／予後剤であってもよい。活性剤は、対象における生理学的機能（例えば、遺伝子発現）を操作する能力を有し得る。活性剤は、ガイドＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、またはペプチドであってもよい。活性剤は、リンカーを介して、非共有結合を介して、核酸塩基の対合形成を介して、またはそれらの任意の組合せによって、ターゲティング部分と結合され得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、式（Ｉ）：Ｘ－Ｙ－Ｚを有する単一の活性剤と単一のターゲティング部分との間のコンジュゲートであってもよく、式中、Ｘは、ターゲティング部分であり；Ｙはリンカーであり；かつＺはガイドＲＮＡである。特定の実施形態では、１つのターゲティングリガンドを２つ以上の活性剤にコンジュゲートしてもよく、このコンジュゲートは式：Ｘ－（Ｙ－Ｚ）ｎを有する。例えば、このコンジュゲートは、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態では、１つの活性剤を２つ以上のターゲティングリガンドに連結してもよく、このコンジュゲートは式：（Ｘ－Ｙ）ｎ－Ｚを有する。他の実施形態では、１つまたは複数のターゲティング部分は、コンジュゲート式が（Ｘ－Ｙ－Ｚ）ｎであり得る１つまたは複数の活性ペイロードに結合され得る。様々な組合せにおいて、コンジュゲートの式は、例えば、Ｘ－Ｙ－Ｚ－Ｙ－Ｘ、（Ｘ－Ｙ－Ｚ）ｎ－Ｙ－Ｚ、またはＸ－Ｙ－（Ｘ－Ｙ－Ｚ）ｎであってもよく、ここでＸはターゲティング部分であり；Ｙはリンカーであり；Ｚは活性剤、例えば、ガイドＲＮＡである。コンジュゲート中の各部分の数は、薬剤の種類、コンジュゲートのサイズ、送達標的、コンジュゲートのパッケージングに使用される粒子、他の活性剤（例えば、免疫学的アジュバント）および投与経路に応じて変動し得る。Ｘ、Ｙ、およびＺの各存在は、同じでも異なっていてもよく、例えば、コンジュゲートは、複数の種類のターゲティング部分、複数の種類のリンカー、および／または複数の種類の活性剤を含んでもよく、ｎは１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは１～５０の間、または２～２０の間、または５～４０の間の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の整数であってもよい。
[0355]いくつかの実施形態では、ウイルス、ポリマーおよびリポソーム製剤、細胞透過性ペプチド、アプタマー、リガンド、またはコンジュゲートおよび抗体アプローチを使用して、活性剤、例えばガイドＲＮＡを細胞および組織に送達し得る。部分またはリガンドは、ガイドＲＮＡを特定の器官、組織、または細胞、例えば肝臓の肝細胞に対して誘導し得、ターゲティング部分と呼んでもよい。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷およびクリアランスを含むがこれらに限定されない、付着分子（例えば、ｍＲＮＡまたはガイドＲＮＡ）の１つまたは複数の特性を改変する。
[0356]本明細書に記載の活性剤に結合し得る例示的な部分としては、限定するものではないが、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸塩、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素、コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３）；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９４、４、１０５３）；チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオ－ル（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３、２７６５）；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３）；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９１、１０、１１１；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５、４９）；リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム－ｌ，２－ジ－０－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７）；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９）；アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１）；パルミチル基（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３）が挙げられる（全ての引用文献は、その全体が本明細書に援用される）。ターゲティング部分には、天然に存在する分子、または組換えもしくは合成の分子が挙げられ、これには、限定するものではないが、ＧａｌＮＡｃもしくはその誘導体（例えば、ＧａｌＮＡｃまたはその誘導体の二量体、三量体、もしくは四量体）、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－糖化）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ－２Ｋ、ＰＥＧ－５Ｋ、ＰＥＧ－１０Ｋ、ＰＥＧ－１２Ｋ、ＰＥＧ－１５Ｋ、ＰＥＧ－２０Ｋ、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、ポリホスファジン、ポリエチレンイミン、カチオン基、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン脂質、カチオンポルフィリン、ポリアミンの四級塩、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、アプタマー、アシアロフェツイン、ヒアルロン酸、プロコラーゲン、免疫グロブリン（例えば、抗体）、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、糖アルブミンコンジュゲート、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（例えば、ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、ステロイド、胆汁酸、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、０３－（オレオイル）リトコール酸、０３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、ペプチド（例えば、αらせんペプチド、両親媒性ペプチド、ＲＧＤペプチド、細胞透過性ペプチド、エンドソーム分解／融合性ペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、ナプロキセン、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾルクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、ＡＰ、抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、レクチン、炭水化物、多価炭水化物、ビタミン（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、およびピリドキサール）、ビタミン補因子、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、ＮＦ－κＢの活性化因子、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド、ラトランキュリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、ミオセルビン、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａｌｐｈａ）、インターロイキン－１ベータ、ガンマインターフェロン、天然または組換え低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、天然または組換え高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、および細胞透過剤（例えば、ヘリカル細胞透過剤）、ペプチドおよびペプチド模倣リガンド、例えば、ＤまたはＬペプチドなどの天然に存在するかまたは修飾されたペプチドを有するもの；α、β、またはγペプチド；Ｎ－メチルペプチド；アザペプチド；１つまたは複数のアミドを有するペプチド、すなわちペプチド結合を１つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で置き換えたペプチド；または環状ペプチド；両親媒性ペプチド、例としては、限定するものではないが、セクロピン、ライコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン、Ｓ．ｃｌａｖａペプチド、メクラウナギ腸内抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン－２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス－１、およびカエリンが挙げられる。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の定義された三次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチドまたはペプチド模倣リガンドまたは部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、他のペプチド、例えば、ソマトスタチン、オクテオチド、ＬＨＲＨ（黄体形成ホルモン放出ホルモン）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ペプチド、アプチドまたは二座ペプチド、ＲＧＤ含有ペプチド、タンパク質足場、例えば、フィブロネクチンドメイン、単一ドメイン抗体、安定なｓｃＦｖ、または他のホーミングペプチドであってもよい。非限定的な例として、タンパク質またはペプチドベースのターゲティング部分は、タンパク質、例えば、トロンボスポンジン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、アネキシンＶ、インターフェロン、アンギオスタチン、エンドスタチン、サイトカイン、トランスフェリン、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球－マクロファージコロニー－刺激因子）、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、（血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの増殖因子であってもよい。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、抗体、抗体フラグメント、ＲＧＤペプチド、葉酸、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）であってもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質足場は、抗体由来のタンパク質足場であってもよい。非限定的な例としては、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ナノボディ、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、アビボディ、ミニボディ、ＣＨ２Ｄドメイン、Ｆｃａｂ、および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは安定したｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖは超安定特性を有する。いくつかの実施形態では、ナノボディは、ラクダ科抗体の単一可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来し得る。
[0357]いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、標的細胞、マーカー、または特定の細胞の表面に排他的または主に存在する分子を認識するか、または結合する。例えば、ターゲティング部分は、腫瘍抗原に結合し、活性化剤、例えば、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ複合体を悪性細胞へ誘導し得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、細胞内タンパク質を認識する。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、コンジュゲートを特定の組織、細胞、または細胞内の位置に誘導する。ターゲティング部分は、コンジュゲートを培養中もしくは生物全体、またはその両方に誘導し得る。いずれの場合も、ターゲティング部分は、標的細胞の表面または内部に存在する受容体に結合し得、このターゲティング部分は、有効な特異性、親和性および結合力で受容体に結合する。他の実施形態では、ターゲティング部分は、コンジュゲートを肝臓、腎臓、肺、または膵臓などの特定の組織に標的する。他の場合には、ターゲティング部分は、コンジュゲートを網状内皮もしくはリンパ系の細胞に、またはマクロファージもしくは好酸球などの専門的な食細胞に誘導し得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ＲＴＫ受容体、ＥＧＦ受容体、セリンまたはトレオニンキナーゼ、Ｇタンパク質カップリングされた受容体、メチルＣｐＧ結合タンパク質、細胞表面糖タンパク質、癌幹細胞抗原またはマーカー、炭酸脱水酵素、細胞溶解性Ｔリンパ球抗原、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、細胞外酵素、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー共受容体、グリピカン関連内在性膜プロテオグリカン、熱ショックタンパク質、低酸素誘導型タンパク質、多剤耐性トランスポーター、腫瘍関連マクロファージマーカー、腫瘍関連炭水化物抗原、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー、膜貫通タンパク質、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、腫瘍分化抗原、亜鉛依存性メタロエキソペプチダーゼ、亜鉛輸送体、ナトリウム依存性膜貫通輸送タンパク質、レクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーのメンバー、またはマトリックスメタロプロテイナーゼを認識し得る。
[0358]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲート、例えば、ガイドＲＮＡコンジュゲートは、少なくとも１つのＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－Ａｃ－グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（例えば、マンノース－６－リン酸塩）を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、少なくとも１つのＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－Ａｃ－グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（例えば、マンノース－６－ホスフェート）を含む。
[0359]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む１つまたは複数のターゲティング部分を含む。そのようなコンジュゲートはまた、本明細書ではＧａｌＮＡｃコンジュゲートとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ＲＮＡを特定の細胞、例えば肝臓細胞、例えば肝細胞を標的する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカー、例えば二価または三価の分枝リンカーを介して結合され得る。
[0360]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートは、炭水化物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、炭水化物コンジュゲートは単糖を含む。いくつかの実施形態では、単糖はＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃ誘導体は、肝臓の肝細胞に主に発現するレクチンである、Ａｓｈｗｅｌｌ－Ｍｏｒｅｌｌ受容体としても公知のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合し得る。
[0361]ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、米国特許第８，１０６，０２２号に記載されており、この全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ガイドＲＮＡを特定の細胞を標的するリガンドとして機能する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、肝臓細胞（例えば、肝細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドとして働くことにより、ガイドＲＮＡを肝臓細胞に標的化する。いくつかの実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカー、例えば、二価または三価の分枝リンカーを介して結合され得る。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカー、例えば、本明細書に記載のリンカーを介して活性剤（例えば、ガイドＲＮＡの３’末端）にコンジュゲートされる。いくつかの他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカー、例えば、本明細書に記載のリンカーを介して活性剤に（例えば、ガイドＲＮＡの５’末端に）コンジュゲートされる。
[0362]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーおよびスペーサーを介してより短いオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得、ここで、より短いオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＲＮＡのセグメントに相補的である。ＲＮＡは、例えば、目的のｍＲＮＡおよび目的のガイドＲＮＡを含む、ＲＮＡ分子の全ての長さ、構造、および形態を包含する。いくつかの実施形態では、ショートマー－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートおよびＲＮＡが、薬学的組成物を構成する。例えば、より短いＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ、例えばカップリング配列は、相補的ヌクレオチドのＷ－Ｃ Ｈ結合を介して一緒に薬学的組成物を構成し得る。より短いオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０を超えるヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、カップリング配列は、１５～４０ヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、カップリング配列は、１９～３０のヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、カップリング配列は、２０～２４のヌクレオチド長を含んでもよい。
[0363]いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃコンジュゲートのショートマーオリゴヌクレオチドおよび１つまたは複数のＲＮＡを含む薬学的組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、単一の（シングル）ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのショートマーオリゴヌクレオチド、例えばＧａｌＮＡｃコンジュゲートのＲＮＡは、ＲＮＡ内の複数のオリゴヌクレオチドセグメントに相補的であり得る。例えば、単一の（シングル）ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのショートマーは、ＲＮＡ内の複数のセグメントに相補的なカップリング配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ内の複数のオリゴヌクレオチドセグメントに相補的である複数のＧａｌＮＡｃリガンドコンジュゲートのショートマーオリゴヌクレオチドが、薬学的組成物を構成し得る。
[0364]特定の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートのターゲティング部分は、以下の表１に示す構造を有するリガンドを含む。
[0365]表１に示されるように、ｔ、ｎ、ｐ、ｑおよびｍの各々は独立して、０、または１～３０の整数である。いくつかの実施形態では、表１のｔ、ｎ、ｐ、ｑおよびｍの各々は独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１３、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。いくつかの実施形態では、表１のｔ、ｎ、ｐ、ｑおよびｍは各々、独立して、０、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態では、表１のｔ、ｎ、ｐ、ｑおよびｍの各々は独立して、０、１、２、または３である。いくつかの実施形態では、表１のｔ、ｎ、ｐ、ｑおよびｍの各々は独立して、１または２である。したがって、表１の化合物のいくつかの実施形態では、ｔは０～１０であることが本明細書で企図されることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、ｔは１～５である。いくつかの実施形態では、ｔは１０～２０である。いくつかの実施形態では、ｔは１または２である。いくつかの実施形態では、ｔは１である。いくつかの実施形態では、ｔは２である。表１の化合物のいくつかの実施形態では、ｍは０～１０である。いくつかの実施形態では、ｍは１～５である。いくつかの実施形態では、ｍは１０～２０である。いくつかの実施形態では、ｍは１または２である。いくつかの実施形態では、ｍは１である。いくつかの実施形態では、ｍは２である。表１の化合物のいくつかの実施形態では、ｎは０～１０である。いくつかの実施形態では、ｎは１～５である。いくつかの実施形態では、ｎは１０～２０である。いくつかの実施形態では、ｎは１または２である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。いくつかの実施形態では、ｎは２である。表１の化合物のいくつかの実施形態では、ｐは０～１０である。いくつかの実施形態では、ｐは１～５である。いくつかの実施形態では、ｐは１０～２０である。いくつかの実施形態では、ｐは１または２である。いくつかの実施形態では、ｐは１である。いくつかの実施形態では、ｐは２である。表１の化合物のいくつかの実施形態では、ｑは０～１０である。いくつかの実施形態では、ｑは、１～５である。いくつかの実施形態では、ｑは１０～２０である。いくつかの実施形態では、ｑは１または２である。いくつかの実施形態では、ｑは１である。いくつかの実施形態では、ｑは２である。いくつかの実施形態では、各Ｒは、ＯＨもしくはＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３またはその組合せである。いくつかの実施形態では、表１の化合物（１－１ａ）、（１－２ａ）、（１－３ａ）、（１－４ａ）、（１－５ａ）、（１－６ａ）、（１－７ａ）、（１－８ａ）、（１－９ａ）、（１－１０ａ）、（１－１１ａ））、（１－１２ａ）、（１－１６ａ）、（１－２１ａ）、（１－２２ａ）、（１－２３ａ）、（１－２４ａ）、（１－２５ａ）、および（１－２６ａ）において、ｘは０または１～５の整数である。いくつかの実施形態では、表１の化合物（１－１ｂ）、（１－２ｂ）、（１－３ｂ）、（１－４ｂ）、（１－５ｂ）、（１－６ｂ）、（１－７ｂ）、（１－８ｂ）、（１－９ｂ）、（１－１０ｂ）、（１－１１ｂ））、（１－１２ｂ）、（１－１６ｂ）、（１－２１ｂ）、（１－２２ｂ）、（１－２３ｂ）、（１－２４ｂ）、（１－２５ｂ）、および（１－２６ｂ）において、ｘは０または１～５の整数である。いくつかの実施形態では、ｘは１である。いくつかの実施形態では、ｘは２である。いくつかの実施形態では、ｘは０である。いくつかの実施形態では、ｘは３である。いくつかの実施形態では、ｘは４である。いくつかの実施形態では、ｘは５である。
[0366]ターゲティング部分は、核酸塩基、糖部分、または核酸、例えば、ガイドＲＮＡまたはｍＲＮＡのヌクレオシド間結合にコンジュゲートし得る。プリン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションは、環内原子および環外原子を含む任意の位置で起こり得る。いくつかの実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、または８位が、ある部分に結合している。ピリミジン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションはまた、任意の位置でも起こり得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、および６位をある部分で置換してもよい。ある部分が核酸塩基にコンジュゲートする場合、好ましい位置とは、ハイブリダイゼーションを妨げない、すなわち、塩基対合に必要な水素結合相互作用を妨げない位置である。
[0367]ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは、任意の炭素原子で発生し得る。コンジュゲート部分に結合し得る糖部分の炭素原子の例としては、２’、３’、および５’炭素原子が挙げられる。ガンマ位はまた、脱塩基残基などのコンジュゲート部分に結合することもできる。ヌクレオシド間結合は、コンジュゲート部分を有することもできる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオテート、ホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分は、リン原子にまたはリン原子に結合したＯ、Ｎ、またはＳ原子に対して直接結合し得る。アミンまたはアミドを含むヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分は、アミンまたはアミドの窒素原子にまたは隣接する炭素原子に結合し得る。
[0368]オリゴヌクレオチドのコンジュゲートを調製するための多数の方法がある。一般に、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド上の反応基（例えば、ＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、アルデヒドなど）と、コンジュゲート部分上の反応基とを接触させることによって、コンジュゲート部分に結合される。いくつかの実施形態では、一方の反応基は求電子性であり、他方は求核性である。例えば、求電子基はカルボニル含有官能基であってもよく、求核基は、アミンまたはチオールであってもよい。核酸および関連するオリゴマー化合物の、連結基の有無によるコンジュゲーションの方法は、文献、例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅＢｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｓ．、１９９３、第１７章などに十分記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[0369]ターゲティング部分は、ＲＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＤＮＡの塩基対合およびハイブリダイゼーションを介して、ガイドＲＮＡなどの本明細書に記載の活性剤または治療用核酸に結合され得る。いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、ターゲティング部分は、活性剤、例えばガイドＲＮＡまたはｍＲＮＡを認識するか、またはそれに結合し得るカップリング配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、ガイドＲＮＡの５’部分、３’部分、または中間部分にハイブリダイズし得るカップリング配列を含む。カップリング配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡは、伸長部を含んでもよい。例えば、カップリング配列は、ガイドＲＮＡの伸長配列とハイブリダイズし得、それによってガイドＲＮＡを所望のインビボ、エキソビボ、細胞間または細胞内の位置に誘導する一方で、ＣＲＩＳＰＲ酵素との相互作用または標的配列との結合などのガイドＲＮＡ機能は影響を受けない。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ポリヌクレオチドテールを含む伸長部を含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、それぞれ、ポリ（Ｕ）テール、ポリ（Ａ）テール、またはカップリング配列のポリ（Ａ）テールとハイブリダイズし得る、ポリ（Ａ）テール、ポリ（Ｕ）テールまたはポリ（Ｔ）テールを含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、（Ａ）ｎまたは（Ｕ）ｎの配列を含むガイドＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ガイド核酸はＤＮＡを含んでもよく、（Ａ）ｎまたは（Ｔ）ｎの配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、カップリング配列は、（Ａ）ｎ（配列番号１１５）、（Ｕ）ｎ（配列番号１１６）または（Ｔ）ｎ（配列番号１１７）の配列を含み得る。すぐに使用されるように、ｎは１～２００までの任意の整数であり得る。
[0370]カップリング配列は、核酸活性剤またはその一部との配列同一性または相補性を共有し得る。いくつかの実施形態では、カップリング配列は、本明細書に記載のガイドＲＮＡまたはそのようなガイドＲＮＡの一部と少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を共有し得る。いくつかの実施形態では、カップリング配列は、本明細書に記載のガイドＲＮＡの相補的配列と少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、の少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性、またはそのようなガイドＲＮＡの一部の相補性を共有し得る。いくつかの実施形態では、カップリング配列は、ガイドＲＮＡの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、少なくとも８１、少なくとも８２、少なくとも８３、少なくとも８４、少なくとも８５、少なくとも８６、少なくとも８７、少なくとも８８、少なくとも８９、少なくとも９０、少なくとも９１、少なくとも９２、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８、少なくとも９９、または少なくとも１００連続する核酸塩基との同一性または相補性、またはその相補性を含み得る。
[0371]いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、化学修飾されたカップリング配列を含むか、またはそれに関連付けられ得る。いくつかの実施形態では、カップリング配列は、治療用核酸、例えば、ガイドＲＮＡ、またはその一部とハイブリダイズする伸長部を含む。いくつかの実施形態では、カップリング配列の伸長部は、化学修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、治療用核酸、例えば、ガイドＲＮＡは、伸長部を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの伸長部は、化学修飾されてもよい。ガイドＲＮＡの伸長部および相補的または実質的に相補的なカップリング配列の伸長部の非限定的な例を以下の表２に示す。
[0372]表２で使用されているように、大文字のＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、それぞれ核酸塩基のアデニン、シトシン、グアニジン、およびウラシルを有するリボヌクレオチドを指す。小文字のａ、ｃ、ｇ、およびｕは、それぞれ核酸塩基のアデニン、シトシン、グアニジン、およびウラシルを含む修飾された（例えば、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥ）リボヌクレオチドを指す。文字「Ｔ」は、チミジンまたはデオキシチミジンを指す。文字「ｓ」とは、リン含有結合（ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、ホスホジエステル結合、またはホスホロジチオエート結合など）を指す。表２で使用されるように、「（ＧａｌＮＡｃ）」とは、ＧａｌＮＡｃまたはその誘導体を含むターゲティング部分などのターゲティング部分を指す。表２で使用されるように、「（ＧａｌＮＡｃ）」とはまた、複数のＧａｌＮＡｃ構造またはその誘導体、例えば、ＧａｌＮＡｃの二量体、三量体、四量体またはその誘導体（表１に記載されるＧａｌＮＡｃ構造を含む）を含むターゲティング部分を包含する。いくつかの実施形態において、「ｓ」とはホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。本明細書に開示されるように、ヌクレオチド配列および修飾パターンは、全ての長さ、構造、およびＲＮＡの種類またはそのフラグメント、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、デュアルガイドＲＮＡ、またはｍＲＮＡなどを包含する。例えば、上記表２に記載のヌクレオチド配列および修飾パターンは、シングルガイドＲＮＡ、デュアルガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼｍＲＮＡ、またはそれらの任意のフラグメントもしくはセグメントにおける、ＲＮＡ配列および修飾パターンを示し得る。
[0373]受容体ターゲティング部分およびターゲティング部分を含むカップリング配列にコンジュゲートされたガイドＲＮＡの非限定的な例を以下の表３に示す。（ＧａｌＮＡｃ）コンジュゲート部分は、ガイドＲＮＡの３’および／もしくは５’末端に共有結合するか、ならびに／またはガイドＲＮＡの３’および／または５’末端に共有結合し、このリガンドとガイドＲＮＡとの間に追加のヌクレオチドスペーサーがある。ガイドＲＮＡコンジュゲート３－１および３－２（表３）は、ガイドＲＮＡへのＧａｌＮＡｃリガンドの直接コンジュゲーションの代表的な例である。ガイドＲＮＡは、３－１０から３－２１にコンジュゲートし、このＧａｌＮＡｃリガンドは、追加の３’および／または５’ヌクレオチドスペーサーの３’／５’末端にコンジュゲートされる。ガイドＲＮＡ鎖は、３’末端もしくは５’末端、または両方の末端まで、所望のヌクレオチド数で伸長される。（ＧａｌＮＡｃ）は、ガイドＲＮＡ鎖の伸長ヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端、または両端にコンジュゲートして、単一の化学物質につながる相補的な二重鎖を形成する。このコンジュゲート設計の３－３から３－８は、伸長ヌクレオチドスペーサーおよびＧａｌＮＡｃリガンドを保有するスペーサー相補鎖から構築される。表３で使用されているように、大文字のＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、それぞれ核酸塩基のアデニン、シトシン、グアニジン、およびウラシルを有するリボヌクレオチドを指す。小文字のａ、ｃ、ｇ、およびｕは、それぞれ核酸塩基のアデニン、シトシン、グアニジン、およびウラシルを保有する修飾（例えば、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥ）リボヌクレオチドを指す。文字「Ｔ」は、チミジンまたはデオキシチミジンを指す。文字「ｓ」は、リン酸結合（ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、ホスホジエステル結合、またはホスホロジチオエート結合など）を指す。いくつかの実施形態では、「ｓ」は、ＰＳ結合を表す。表３で使用されるように、「（ＧａｌＮＡｃ）」は、ＧａｌＮＡｃまたはその誘導体を含むものなどのターゲティング部分を指す。表３で使用されるように、「（ＧａｌＮＡｃ）」は、複数のＧａｌＮＡｃ構造またはその誘導体、例えばＧａｌＮＡｃの二量体、三量体、四量体またはそれらの誘導体を含むターゲティング部分も包含する。
[0374]本明細書に開示されるように、ヌクレオチド配列および修飾パターンは、全ての長さ、構造、および種類のＲＮＡまたはそのフラグメント、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ、デュアルガイドＲＮＡ、またはｍＲＮＡを含む。例えば、上記表３に記載のヌクレオチド配列および修飾パターンは、シングルガイドＲＮＡ、デュアルガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼｍＲＮＡ、またはそれらの任意のフラグメントもしくはセグメントにおけるＲＮＡ配列および修飾パターンを示し得る。
[0375]ターゲティング部分は、担体を介して本明細書に記載の核酸に結合し得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合ポイント」、好ましくは２つの「骨格結合ポイント」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザリング結合ポイント」を含んでもよい。本明細書で使用される「骨格結合点」とは、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、オリゴヌクレオチドの骨格、例えばリン酸塩、または修飾リン酸塩、例えば硫黄含有骨格への担体モノマーの組み込みに利用可能であり、それに適している結合を指す。「テザリング結合点」（ＴＡＰ）は、選択された部分を結合する担体モノマーの原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子とは異なる）を指す。選択された部分は、例えば炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖であってもよい。任意選択で、選択された部分は介在するテザーによって担体モノマーに結合される。したがって、担体は、多くの場合、アミノ基などの官能基を含むか、または一般に、構成原子へのリガンドなどの別の化学物質の組み込みまたはテザリングに適した結合を提供する。核酸のコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定するものではないが、その内容がその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，１４９，７８２号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，６８８，９４１号；同第５，７１４，１６６号；同第６，１５３，７３７号；同第６，１７２，２０８号；同第６，３００，３１９号；同第６，３３５，４３４号；同第６，３３５，４３７号；同第６，３９５，４３７号；同第６，４４４，８０６号；同第６，４８６，３０８号；同第６，５２５，０３１号；同第６，５２８，６３１号；同第６，５５９，２７９号が挙げられる。
[0376]ターゲティング部分は活性剤、例えば、ガイドＲＮＡにリンカーを介して結合し得る。リンカーは、１つまたは複数の活性剤およびターゲティング部分リガンドに結合してコンジュゲートを形成し得、このコンジュゲートは少なくとも１つの活性剤、例えば、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ－Ｃａｓ複合体を、標的細胞への送達時に放出する。リンカーは、エステル結合、ジスルフィド、アミド、アシルヒドラゾン、エーテル、カルバメート、カーボネート、および尿素から独立して選択される官能基によって、ターゲティング部分および活性剤に結合されてもよい。あるいは、リンカーは、チオールとマレイミド、アジドとアルキンとの間のコンジュゲーションによって提供されるような切断不可能な基によって、ターゲティング部分または活性剤のいずれかに結合し得る。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、１つまたは複数のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のリンカーは、ターゲティング部分の一部をターゲティング部分の異なる一部に接続する。例えば、ターゲティング部分は、１つまたは複数のリンカーによって接続された２、３、４、５個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ構造またはその誘導体を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ターゲティング部分における２つ以上のＧａｌＮＡｃ構造またはその誘導体は、１つまたは複数の非切断性リンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートは、ターゲティング部分の糖部分に直接結合された活性剤を含む。
[0377]リンカーは、各々独立して、エチレングリコール、プロピレングリコール、アミド、エステル、エーテル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の官能基を含んでもよく、ここで、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール基の各々は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルバモイル、エーテル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルバメート、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルから各々独立して選択される、１つまたは複数の基で置換されていてもよく、ここで、各々のカルボキシル、カルバモイル、エーテル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルバメート、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルの各々は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルバモイル、エーテル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、カルバメート、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルから各々独立して選択される１つまたは複数の基で任意選択で置換される。いくつかの実施形態では、リンカーは独立して、リン酸塩、ホスホロチオエート、アミド、エーテル、オキシム、ヒドラジンまたはカルバメートを含む。本明細書で企図されるように、いくつかの実施形態では、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）のターゲティングコンジュゲートは、本明細書に記載のリンカーを含むことが理解されるべきである。例えば、基ＲおよびＬ１～Ｌ１２のいずれも、１つまたは複数のリンカーを含んでもよい。
[0378]いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ１～Ｃ１０直鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ１０直鎖Ｏ－アルキル、Ｃ１～Ｃ１０直鎖置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１０直鎖置換Ｏ－アルキル、Ｃ４～Ｃ１３分枝鎖アルキル、Ｃ４～Ｃ１３分岐鎖Ｏ－アルキル、Ｃ２～Ｃ１２直鎖アルケニル、Ｃ２～Ｃ１２直鎖Ｏ－アルケニル、アラルキル、Ｃ３～Ｃ１２直鎖置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ１２直鎖置換Ｏ－アルケニル、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｒｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリシアノアクリレート、ケトン、アリール、複素環、コハク酸エステル、アミノ酸、芳香族基、エーテル、クラウンエーテル、尿素、チオ尿素、アミド、プリン、ピリミジン、ビピリジン（ｂｙｐｉｒｉｄｉｎｅ）、架橋剤として作用するインドール誘導体、キレート剤、アルデヒド、ケトン、ビスアミン、ビスアルコール、複素環構造、アジリン、ジスルフィド、チオエーテル、ヒドラゾンおよびそれらの組合せを独立して含んでもよい。例えば、リンカーは、Ｃ３直鎖アルキルであっても、またはケトンであってもよい。リンカーのアルキル鎖は、１つまたは複数の置換基またはヘテロ原子で置換されてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーのアルキル鎖は任意選択で、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＲ、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－から選択される１つまたは複数の原子または基によって中断され得る。
[0379]いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能であり得、切断されて活性剤を放出する。切断可能な官能基は、インビボで加水分解されてもよいし、または例えばカテプシンＢによって酵素的に加水分解されるように設計されてもよい。本明細書において使用される「切断可能な」リンカーとは、物理的または化学的に切断され得る任意のリンカーを指す。物理的切断の例は、光、放射性放出または熱による切断であり得、化学的切断の例としては、酸化還元反応、加水分解、ｐＨ依存的切断による切断が挙げられる。
[0380]リンカーは、直接結合、または酸素もしくは硫黄などの原子、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または原子の鎖、例えば、限定されないが、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールを含んでもよく、ここで１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ’）、Ｃ（Ｏ）、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換の複素環によって中断されても、終わらせられてもよく；ここでＲ’は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。一実施形態では、リンカーは、１～２４原子、好ましくは４～２４原子、好ましくは６～１８原子、より好ましくは８～１８原子、最も好ましくは８～１６原子である。
[0381]一実施形態では、リンカーは－［（Ｐ－Ｑ”－Ｒ）ｑ－Ｘ－（Ｐ’Ｑ’”－Ｒ’）ｑ’］ｑ”－Ｔ－であり、式中Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ’、Ｒ’およびＴは、各存在について、各独立して存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ；ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＨ－Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり；Ｑ”およびＱ’”は、各存在について、各独立して存在しないか、－（ＣＨ２）ｎ－、－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ１）（Ｒ２）－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２－、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－であり；Ｘは、存在しないか、または切断可能な連結基であり；ＲａはＨまたはアミノ酸側鎖であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して各々の存在についてＨ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨまたはＮ（ＲＮ）２であり；ＲＮは、各々の存在について、独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはベンジルであり；ｑ、ｑ’およびｑ”は、各々の存在について、各々独立して０～２０であり、ここでこの反復単位は、同じであっても異なってもよく；ｎは、各々の存在について、独立して、１～２０であり；かつｍは、各々の存在について、独立して、０～５０である。
[0382]一実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの切断可能な連結基を含む。特定の実施形態では、リンカーは分岐リンカーである。分岐リンカーの分岐点は、少なくとも三価であってもよいが、四価、五価もしくは六価の原子、またはそのような複数の原子価を示す基であってもよい。特定の実施形態では、分岐点は、－Ｎ、－Ｎ（Ｏ）－Ｃ、－Ｏ－Ｃ、－Ｓ－Ｃ、－ＳＳ－Ｃ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｏ）－Ｃ、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｏ）－Ｃ、－Ｎ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）－Ｃ、または－Ｎ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃであり；式中、Ｑは、各存在について、独立して、Ｈまたは任意選択で置換アルキルである。他の実施形態では、分岐点は、グリセロールまたはグリセロール誘導体である。
[0383]一実施形態では、リンカーは酵素によって切断され得る。非限定的な例として、リンカーは、細胞内ペプチダーゼによって切断されるポリペプチド部分であってもよい（例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｏｖｉｎｄａｎに対するＷＯ２０１００９３３９５のＡＡ）。Ｇｏｖｉｎｄａｎは、リンカー中のＡＡが、Ａｌａ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ、およびＡｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕなどのジペプチド、トリペプチド、またはテトラペプチドであってもよいことを教示している。別の例では、切断可能なリンカーは分枝ペプチドであってもよい。分枝ペプチドリンカーは、酵素切断部位を提供する２つ以上のアミノ酸部分を含んでもよい。ＤｕｂｏｗｃｈｉｋのＷＯ１９９８０１９７０５に開示されている任意の分枝ペプチドリンカー（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、本開示のコンジュゲートにおけるリンカーとして使用され得る。別の例として、リンカーは、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｏｖｉｎｄａｎらに対する米国特許第８８７７９０１号に開示されたリソソームで切断可能なポリペプチドを含んでもよい。別の例として、リンカーは、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅらの米国特許第６２１４３４５号に開示されている任意のＹおよびＺ構造など、腫瘍関連プロテアーゼによって選択的に酵素的に切断可能なタンパク質ペプチド配列を含んでもよい。
[0384]いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能な連結基を含んでもよい。切断可能な連結基とは、細胞外では十分に安定であるが、標的細胞に入る際に切断されて、リンカーが一緒に保持している２つの部分を放出する基である。好ましい実施形態では、切断可能な連結基は、対象の血液中においてよりも、標的細胞内で、または第１の基準条件（例えば、細胞内条件を模倣するかまたは表すために選択し得る）下で、または第２の参照条件（例えば、血液または血清に見られる条件を模倣するかまたは表すために選択され得る）の下で、少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍速く切断される。切断可能な連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、または分解分子の存在の影響を受けやすい場合がある。一般に、切断剤は、血清または血液中よりも細胞内でより優先的であるか、またはより高いレベルもしくは活性で見られる。このような分解剤の例としては、特定の基質に対して選択されるか、または基質特異性を持たない酸化還元剤が挙げられ、これには、例えば、細胞内に存在する酸化酵素もしくは還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤（還元によって酸化還元切断可能な連結基を分解し得る）；エステラーゼ；酸性環境を創出し得るエンドソームまたは薬剤、例えば、ｐＨ５以下にするもの；一般的な酸、ペプチダーゼ（基質特異的である可能性がある）、およびホスファターゼとして作用することにより、酸切断可能な連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
[0385]ジスルフィド結合などの切断可能な連結基は、ｐＨの影響を受けやすい可能性がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは５．５～６．０の範囲で、より酸性のｐＨを有し、リソソームは約５．０でさらに酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な連結基を有し、それによってカチオン性脂質を、細胞内のリガンドから、または細胞の所望のコンパートメントに放出する。
[0386]リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能な連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な連結基の種類は、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓ターゲティングリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に結合し得る。肝臓細胞は、エステラーゼが豊富であるため、リンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞タイプよりも肝臓細胞でより効率的に切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
[0387]切断可能な連結基の１つのクラスは、還元または酸化によって切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。候補の切断可能な連結基が、適切な「還元的に切断可能な連結基」であるか否か、または例えば、特定のＲＮＡ部分および特定の標的化剤との使用に適しているか否かを判断するには、本明細書に記載の方法を調べてもよい。例えば、候補は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または細胞、例えば標的細胞で観察される切断速度を模倣する当該技術分野で公知の試薬を使用する他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補は、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価してもよい。好ましい実施形態では、候補化合物は、血液中で最大１０％まで切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液中（または細胞外条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（または細胞内条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）で少なくとも２、４、１０または１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内培地を模倣するように選択された条件下で、および細胞外培地を模倣するために選択された条件と比較して、標準的な酵素動力学アッセイを使用して決定し得る。
[0388]いくつかの実施形態では、リンカーは、リン酸ベースの切断可能な連結基を含んでもよい。リン酸ベースの切断可能な連結基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸塩ベースの連結基（すなわち、リン含有連結またはリン含有リンカー）の例は、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－、Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、リン酸塩ベースの連結基は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、リン酸塩ベースのリンカーは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。
[0389]いくつかの実施形態では、リンカーは、酸で切断可能な連結基を含んでもよい。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能な連結基は、ｐＨが約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境で、または一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラが、酸で切断可能な連結基の切断環境を提供し得る。酸で切断可能な連結基の例としては、限定するものではないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸で切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上記のものと同様の方法を使用して評価され得る。
[0390]いくつかの実施形態において、リンカーは、エステルベースの連結基を含んでもよい。エステルベースの切断可能な連結基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な連結基の例としては、限定するものではないが、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上記のものと同様の方法を使用して評価され得る。
[0391]いくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチドベースの連結基を含んでもよい。ペプチドベースの切断可能な連結基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生成するためにアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）の間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を生成するためにアミノ酸間で形成される特殊な種類のアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般に、ペプチドを生成するアミノ酸とタンパク質との間に形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まれない。ペプチドベースの切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、ここでＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。
[0392]ペプチド結合を含むリンカーは、肝臓細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼが豊富な細胞型を標的とする場合に使用してもよい。
[0393]一般に、候補の切断可能な連結基の適合性は、候補の連結基を切断する分解剤（または条件）の能力を試験することによって評価し得る。また、血液中または他の非標的組織と接触したときの切断に抵抗する能力について、切断可能な連結基の候補を試験することも望ましいであろう。したがって、第１の状態が標的細胞における切断を示すように選択され、第２の状態が他の組織または体液、例えば、血液または血清における切断を示すように選択される場合、第１の状態と第２の状態との間の切断に対する相対的な感受性を決定し得る。評価は、無細胞系、細胞内、細胞培養、臓器もしくは組織培養、または動物全体で行うことができる。無細胞または培養条件で初期評価を行い、動物全体でのさらなる評価によって確認することが役立つ場合がある。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（または細胞内条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）で少なくとも２、４、１０または１００倍速く切断される。
[0393]一般に、候補の切断可能な連結基の適合性は、候補の連結基を切断する分解剤（または条件）の能力を試験することによって評価し得る。また、血液中または他の非標的組織と接触したときの切断に抵抗する能力について、切断可能な連結基の候補を試験することも望ましいであろう。したがって、第１の状態が標的細胞における切断を示すように選択され、第２の状態が他の組織または体液、例えば、血液または血清における切断を示すように選択される場合、第１の状態と第２の状態との間の切断に対する相対的な感受性を決定し得る。評価は、無細胞系、細胞内、細胞培養、臓器もしくは組織培養、または動物全体で行うことができる。無細胞または培養条件で初期評価を行い、動物全体でのさらなる評価によって確認することが役立つ場合がある。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（または細胞内条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下）で少なくとも２、４、１０または１００倍速く切断される。
[0394]いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、式（Ｉ）の構造
を含み、
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、Ｗは活性剤またはカップリング配列を表す。式（Ｉ）の１つまたは複数のリンカーは、各々独立して、本開示に記載のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の保護基の各々は独立して、４－アセトキシ－２，２－ジメチルブタノイル（ＡＤＭＢ）、３－（２－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジメチルプロパノエート（ＤＭＢＰＰ）、３－（２－ヒドロキシ－４，６－ジメチルフェニル）－３，３－ジメチルプロパン酸基（ＴＭＢＰＰ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、２，２－ジメチルトリメチレン（ＤＭＴＭ）ホスフェート、２－ピリジルメチル、マンデル酸エチル、（フェニルチオメチル）ベンジル、ペンタフルオロプロピオニル（ＰＦＰ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、バシロサミン（Ｂａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、１－ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジリデンアセタール、プロパルギル、ナフチルプロパルギル、カーボネート、ジクロロアセチル、ｔｅｒｔ－ブチルシリレン、テトライソプロピルジシロキサニリデン（ＴＩＰＤＳ）、メトキシベンジル（ＰＭＢ）、キシリレン、およびｐ－メトキシフェニル（ＭＰ）から選択される。例示的な保護基は、Ｇｕｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１０、１５、７２３５－７２６５にさらに開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＸはＨである。いくつかの実施形態では、各Ｘは独立して、ＨおよびＢｚから選択される。式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｗは活性剤である。いくつかの実施形態では、Ｗは核酸である。いくつかの実施形態では、ＷはｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｗは、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸である。式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｗはカップリング配列である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。Ｗは、１つまたは複数の修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基を含み得る。核酸塩基は、本明細書に記載の任意の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、２’－ＯＨまたは２’－ＯＭｅ修飾を含む。例えば、Ｗは、（ａ）、（ｃ）、（ｇ）、または（ｕ）と呼ばれる、１つまたは複数の２’－ＯＭｅ修飾アデニン、シトシン、グアニジン、およびウラシルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上の修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列の５’末端付近、３’末端付近、または中間に１つまたは複数の修飾核酸塩基を含む。修飾ＲＮＡ内の修飾核酸塩基は、連続していてもいなくてもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列の長さに沿って散在する１つまたは複数の２’－ＯＭｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列の長さに沿って散在する１つまたは複数の２’ＯＨ修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、交互の２’－ＯＨおよび２’ＯＭｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ここでｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～５０の整数である（配列番号１１８）。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～２０（配列番号１１９）または３～１５（配列番号１２０）の整数である。いくつかの実施形態では、Ｗは、カップリング配列に相補的な１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、１つまたは複数のグアニンまたはシチジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはより多くのグアニンまたはシチジンを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のグアニンまたはシチジンは、カップリング配列において１つまたは複数のシチンジンまたはグアニンに相補的である。いくつかの実施形態では、グアニンまたはシチジンは、Ｗまたはカップリング配列の末端にある。いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、グアニン－シチジン対合は、結合親和性を増加させる「ＧＣロック」または「ＣＧロック」を形成すると考えられる。Ｗまたはカップリング配列中のグアニンおよび／またはシチジンは、連続していてもいなくてもよく、本明細書に記載の化学修飾、例えば、２’－ＯＭｅまたは２’－ＯＨ修飾のいずれか１つを含んでもよい。
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、Ｗは活性剤またはカップリング配列を表す。式（Ｉ）の１つまたは複数のリンカーは、各々独立して、本開示に記載のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の保護基の各々は独立して、４－アセトキシ－２，２－ジメチルブタノイル（ＡＤＭＢ）、３－（２－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジメチルプロパノエート（ＤＭＢＰＰ）、３－（２－ヒドロキシ－４，６－ジメチルフェニル）－３，３－ジメチルプロパン酸基（ＴＭＢＰＰ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、２，２－ジメチルトリメチレン（ＤＭＴＭ）ホスフェート、２－ピリジルメチル、マンデル酸エチル、（フェニルチオメチル）ベンジル、ペンタフルオロプロピオニル（ＰＦＰ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、バシロサミン（Ｂａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、１－ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジリデンアセタール、プロパルギル、ナフチルプロパルギル、カーボネート、ジクロロアセチル、ｔｅｒｔ－ブチルシリレン、テトライソプロピルジシロキサニリデン（ＴＩＰＤＳ）、メトキシベンジル（ＰＭＢ）、キシリレン、およびｐ－メトキシフェニル（ＭＰ）から選択される。例示的な保護基は、Ｇｕｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１０、１５、７２３５－７２６５にさらに開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＸはＨである。いくつかの実施形態では、各Ｘは独立して、ＨおよびＢｚから選択される。式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｗは活性剤である。いくつかの実施形態では、Ｗは核酸である。いくつかの実施形態では、ＷはｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｗは、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸である。式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｗはカップリング配列である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。Ｗは、１つまたは複数の修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基を含み得る。核酸塩基は、本明細書に記載の任意の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、２’－ＯＨまたは２’－ＯＭｅ修飾を含む。例えば、Ｗは、（ａ）、（ｃ）、（ｇ）、または（ｕ）と呼ばれる、１つまたは複数の２’－ＯＭｅ修飾アデニン、シトシン、グアニジン、およびウラシルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上の修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列の５’末端付近、３’末端付近、または中間に１つまたは複数の修飾核酸塩基を含む。修飾ＲＮＡ内の修飾核酸塩基は、連続していてもいなくてもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列の長さに沿って散在する１つまたは複数の２’－ＯＭｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列の長さに沿って散在する１つまたは複数の２’ＯＨ修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、交互の２’－ＯＨおよび２’ＯＭｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ここでｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～５０の整数である（配列番号１１８）。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～２０（配列番号１１９）または３～１５（配列番号１２０）の整数である。いくつかの実施形態では、Ｗは、カップリング配列に相補的な１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、１つまたは複数のグアニンまたはシチジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはより多くのグアニンまたはシチジンを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のグアニンまたはシチジンは、カップリング配列において１つまたは複数のシチンジンまたはグアニンに相補的である。いくつかの実施形態では、グアニンまたはシチジンは、Ｗまたはカップリング配列の末端にある。いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、グアニン－シチジン対合は、結合親和性を増加させる「ＧＣロック」または「ＣＧロック」を形成すると考えられる。Ｗまたはカップリング配列中のグアニンおよび／またはシチジンは、連続していてもいなくてもよく、本明細書に記載の化学修飾、例えば、２’－ＯＭｅまたは２’－ＯＨ修飾のいずれか１つを含んでもよい。
[0395]いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のコンジュゲートは、式（Ｉａ）の構造
を含む。
[0396]いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のコンジュゲートは、式（Ｉｂ）の構造
[0396]いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のコンジュゲートは、式（Ｉｂ）の構造
を含む。
[0397]いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、式（ＩＩ）の構造
[0397]いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、式（ＩＩ）の構造
を含み、
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、Ｚは、修飾または非修飾Ｃ５またはＣ６単糖であり、Ｗは、活性剤またはカップリング配列を表す。式（ＩＩ）の１つまたは複数のリンカーは、各々独立して、本開示に記載のリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の各々の保護基は独立して、４－アセトキシ－２，２－ジメチルブタノイル（ＡＤＭＢ）、３－（２－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジメチルプロパノエート（ＤＭＢＰＰ）、３－（２－ヒドロキシ－４，６－ジメチルフェニル）－３，３－ジメチルプロパン酸基（ＴＭＢＰＰ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、２，２－ジメチルトリメチレン（ＤＭＴＭ）ホスフェート、２－ピリジルメチル、マンデル酸エチル、（フェニルチオメチル）ベンジル、ペンタフルオロプロピオニル（ＰＦＰ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、バシロサミン（Ｂａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、１－ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジリデンアセタール、プロパルギル、ナフチルプロパルギル、カーボネート、ジクロロアセチル、ｔｅｒｔ－ブチルシリレン、テトライソプロピルジシロキサニリデン（ＴＩＰＤＳ）、メトキシベンジル（ＰＭＢ）、キシリレン、およびｐ－メトキシフェニル（ＭＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＸはＨである。いくつかの実施形態では、各Ｘは独立して、ＨおよびＢｚから選択される。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｚはガラクトースまたはマンノースである。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ＺはＧａｌＮＡｃである。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｗは活性剤である。いくつかの実施形態では、Ｗは核酸である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｗは、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸である。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｗはカップリング配列である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～５０の整数である（配列番号１１８）。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～２０（配列番号１１９）または３～１５（配列番号１２０）の整数である。
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、Ｚは、修飾または非修飾Ｃ５またはＣ６単糖であり、Ｗは、活性剤またはカップリング配列を表す。式（ＩＩ）の１つまたは複数のリンカーは、各々独立して、本開示に記載のリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の各々の保護基は独立して、４－アセトキシ－２，２－ジメチルブタノイル（ＡＤＭＢ）、３－（２－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジメチルプロパノエート（ＤＭＢＰＰ）、３－（２－ヒドロキシ－４，６－ジメチルフェニル）－３，３－ジメチルプロパン酸基（ＴＭＢＰＰ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、２，２－ジメチルトリメチレン（ＤＭＴＭ）ホスフェート、２－ピリジルメチル、マンデル酸エチル、（フェニルチオメチル）ベンジル、ペンタフルオロプロピオニル（ＰＦＰ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、バシロサミン（Ｂａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、１－ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジリデンアセタール、プロパルギル、ナフチルプロパルギル、カーボネート、ジクロロアセチル、ｔｅｒｔ－ブチルシリレン、テトライソプロピルジシロキサニリデン（ＴＩＰＤＳ）、メトキシベンジル（ＰＭＢ）、キシリレン、およびｐ－メトキシフェニル（ＭＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＸはＨである。いくつかの実施形態では、各Ｘは独立して、ＨおよびＢｚから選択される。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｚはガラクトースまたはマンノースである。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ＺはＧａｌＮＡｃである。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｗは活性剤である。いくつかの実施形態では、Ｗは核酸である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｗは、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸である。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｗはカップリング配列である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～５０の整数である（配列番号１１８）。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～２０（配列番号１１９）または３～１５（配列番号１２０）の整数である。
[0398]いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩａ）の構造
を含む。
[0399]いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩｂ）の構造
[0399]いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩｂ）の構造
を含む。
[0400]いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩｃ）の構造
[0400]いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩｃ）の構造
を含む。
[0401]いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）の構造
[0401]いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）の構造
を含み、
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、Ｚは、修飾または非修飾Ｃ５またはＣ６単糖であり、Ｗは、活性剤またはカップリング配列を表す。式（ＩＩＩ）の１つまたは複数のリンカーは、各々独立して、本開示に記載のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の保護基の各々は独立して、４－アセトキシ－２，２－ジメチルブタノイル（ＡＤＭＢ）、３－（２－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジメチルプロパノエート（ＤＭＢＰＰ）、３－（２－ヒドロキシ－４，６－ジメチルフェニル）－３，３－ジメチルプロパン酸基（ＴＭＢＰＰ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、２，２－ジメチルトリメチレン（ＤＭＴＭ）ホスフェート、２－ピリジルメチル、マンデル酸エチル、（フェニルチオメチル）ベンジル、ペンタフルオロプロピオニル（ＰＦＰ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、バシロサミン（Ｂａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、１－ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジリデンアセタール、プロパルギル、ナフチルプロパルギル、カーボネート、ジクロロアセチル、ｔｅｒｔ－ブチルシリレン、テトライソプロピルジシロキサニリデン（ＴＩＰＤＳ）、メトキシベンジル（ＰＭＢ）、キシリレン、およびｐ－メトキシフェニル（ＭＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＸはＨである。いくつかの実施形態では、各Ｘは、ＨおよびＢｚから選択される。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｚはガラクトースまたはマンノースである。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、ＺはＧａｌＮＡｃである。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｗは活性剤である。いくつかの実施形態では、Ｗは核酸である。いくつかの実施形態では、ＷはｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｗは、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸である。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｗはカップリング配列である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～５０の整数である（配列番号１１８）。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～２０（配列番号１１９）または３～１５（配列番号１２０）の整数である。
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、Ｚは、修飾または非修飾Ｃ５またはＣ６単糖であり、Ｗは、活性剤またはカップリング配列を表す。式（ＩＩＩ）の１つまたは複数のリンカーは、各々独立して、本開示に記載のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の保護基の各々は独立して、４－アセトキシ－２，２－ジメチルブタノイル（ＡＤＭＢ）、３－（２－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジメチルプロパノエート（ＤＭＢＰＰ）、３－（２－ヒドロキシ－４，６－ジメチルフェニル）－３，３－ジメチルプロパン酸基（ＴＭＢＰＰ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、２，２－ジメチルトリメチレン（ＤＭＴＭ）ホスフェート、２－ピリジルメチル、マンデル酸エチル、（フェニルチオメチル）ベンジル、ペンタフルオロプロピオニル（ＰＦＰ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、バシロサミン（Ｂａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、１－ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジリデンアセタール、プロパルギル、ナフチルプロパルギル、カーボネート、ジクロロアセチル、ｔｅｒｔ－ブチルシリレン、テトライソプロピルジシロキサニリデン（ＴＩＰＤＳ）、メトキシベンジル（ＰＭＢ）、キシリレン、およびｐ－メトキシフェニル（ＭＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＸはＨである。いくつかの実施形態では、各Ｘは、ＨおよびＢｚから選択される。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｚはガラクトースまたはマンノースである。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、ＺはＧａｌＮＡｃである。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｗは活性剤である。いくつかの実施形態では、Ｗは核酸である。いくつかの実施形態では、ＷはｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｗは、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸である。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｗはカップリング配列である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～５０の整数である（配列番号１１８）。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～２０（配列番号１１９）または３～１５（配列番号１２０）の整数である。
[0402]いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩａ）の構造
を含む。
[0403]いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩｂ）の構造
[0403]いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩｂ）の構造
を含む。
[0404]いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩｃ）の構造
[0404]いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩｃ）の構造
を含み、
式中、ＹはＯまたはＳである。
[0405]いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩｄ）の構造
式中、ＹはＯまたはＳである。
[0405]いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩｄ）の構造
を含み、
式中、ＹはＯまたはＳである。
[0406]いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩｅ）の構造
式中、ＹはＯまたはＳである。
[0406]いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のコンジュゲートは、式（ＩＩＩｅ）の構造
を含み、
式中、ＹはＯまたはＳである。
[0407]いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、式（ＩＶ）の構造
式中、ＹはＯまたはＳである。
[0407]いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、式（ＩＶ）の構造
を含み、
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、ＲＡは、－ＯＸまたは－ＮＨＡｃであり、Ｙは、ＯまたはＳであり、Ｗは、活性剤またはカップリング配列を表す。式（ＩＶ）の１つまたは複数のリンカーは、各々独立して、本開示に記載のリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、式（ＩＶ）の保護基の各々は独立して、４－アセトキシ－２，２－ジメチルブタノイル（ＡＤＭＢ）、３－（２－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジメチルプロパノエート（ＤＭＢＰＰ）、３－（２－ヒドロキシ－４，６－ジメチルフェニル）－３，３－ジメチルプロパン酸基（ＴＭＢＰＰ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、２，２－ジメチルトリメチレン（ＤＭＴＭ）ホスフェート、２－ピリジルメチル、マンデル酸エチル、（フェニルチオメチル）ベンジル、ペンタフルオロプロピオニル（ＰＦＰ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、バシロサミン（Ｂａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、１－ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジリデンアセタール、プロパルギル、ナフチルプロパルギル、カーボネート、ジクロロアセチル、ｔｅｒｔ－ブチルシリレン、テトライソプロピルジシロキサニリデン（ＴＩＰＤＳ）、メトキシベンジル（ＰＭＢ）、キシリレン、およびｐ－メトキシフェニル（ＭＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＸはＨである。いくつかの実施形態では、各Ｘは独立して、ＨおよびＢｚから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＡは－ＯＸである。いくつかの実施形態では、ＲＡは－ＯＨである。いくつかの実施形態では、ＲＡは－ＮＨＡｃである。式（ＩＶ）のいくつかの実施形態では、Ｗは活性剤である。いくつかの実施形態では、Ｗは核酸である。いくつかの実施形態では、ＷはｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｗは、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸である。式（ＩＶ）のいくつかの実施形態では、Ｗはカップリング配列である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～５０の整数である（配列番号１１８）。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～２０（配列番号１１９）または３～１５（配列番号１２０）の整数である。
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、ＲＡは、－ＯＸまたは－ＮＨＡｃであり、Ｙは、ＯまたはＳであり、Ｗは、活性剤またはカップリング配列を表す。式（ＩＶ）の１つまたは複数のリンカーは、各々独立して、本開示に記載のリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、式（ＩＶ）の保護基の各々は独立して、４－アセトキシ－２，２－ジメチルブタノイル（ＡＤＭＢ）、３－（２－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジメチルプロパノエート（ＤＭＢＰＰ）、３－（２－ヒドロキシ－４，６－ジメチルフェニル）－３，３－ジメチルプロパン酸基（ＴＭＢＰＰ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、２，２－ジメチルトリメチレン（ＤＭＴＭ）ホスフェート、２－ピリジルメチル、マンデル酸エチル、（フェニルチオメチル）ベンジル、ペンタフルオロプロピオニル（ＰＦＰ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、バシロサミン（Ｂａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、１－ベンゼンスルフィニルピペリジン（ＢＳＰ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジリデンアセタール、プロパルギル、ナフチルプロパルギル、カーボネート、ジクロロアセチル、ｔｅｒｔ－ブチルシリレン、テトライソプロピルジシロキサニリデン（ＴＩＰＤＳ）、メトキシベンジル（ＰＭＢ）、キシリレン、およびｐ－メトキシフェニル（ＭＰ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＸはＨである。いくつかの実施形態では、各Ｘは独立して、ＨおよびＢｚから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＡは－ＯＸである。いくつかの実施形態では、ＲＡは－ＯＨである。いくつかの実施形態では、ＲＡは－ＮＨＡｃである。式（ＩＶ）のいくつかの実施形態では、Ｗは活性剤である。いくつかの実施形態では、Ｗは核酸である。いくつかの実施形態では、ＷはｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｗは、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸である。式（ＩＶ）のいくつかの実施形態では、Ｗはカップリング配列である。いくつかの実施形態では、Ｗは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～５０の整数である（配列番号１１８）。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～２０（配列番号１１９）または３～１５（配列番号１２０）の整数である。
[0408]いくつかの実施形態では、式（ＩＶ）のコンジュゲートは、表１に示すとおり、１－１、１－２、１－５、１－６、１－９、１－１０、１－１１、または１－１２の構造を含む。
[0409]式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｃ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）、式（ＩＩＩｃ）、式（ＩＩＩｄ）、式（ＩＩＩｅ）、または式（ＩＶ）のいくつかの実施形態において、前述の式のボックスで参照される「１つまたは複数のリンカー」は、以下からなる群から選択される構造を含む：
であり、各リンカーは独立している。式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）、式（ＩＩＩｃ）、式（ＩＩＩｄ）、式（ＩＩＩｅ）、または式（ＩＶ）のいくつかの実施形態において、ここで、リンカーの各々は独立して、－（Ｌ１）ｋ１－（Ｌ２）ｋ２－（Ｌ３）ｋ３－（Ｌ４）ｋ４－の構造を有し、式中、ｋ１、ｋ２、ｋ３、およびｋ４の各々は独立して、０、１または２であり、かつＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４の各々は独立して、オキソ、エステル、アミド、アミノ、Ｃ１～Ｃ３アルキレン、および－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）１～３－から選択される。いくつかの実施形態では、ｋ１、ｋ２、ｋ３、およびｋ４の合計は、１以上の整数である。いくつかの実施形態では、ｋ１、ｋ２、ｋ３、およびｋ４の合計は、２以上の整数である。当業者が認識するように、「Ｎ」は窒素を指し、
「
「
」は結合点を意味する。
[0410]式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）、式（ＩＩＩｃ）、式（ＩＩＩｄ）、式（ＩＩＩｅ）、または式（ＩＶ）のいくつかの実施形態において、式中、リンカーの各々は独立して、－（Ｌ１）ｋ１－（Ｌ２）ｋ２－（Ｌ３）ｋ３－（Ｌ４）ｋ４－の構造を有し、式中、ｋ１、ｋ２、ｋ３、およびｋ４の各々は独立して、０、１または２であり、かつＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４の各々は独立して、－Ｏ－、－Ｓ－，Ｓ（＝Ｏ）１～２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－ＮＲＬ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－ＮＲＬＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲＬＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－Ｐ（＝Ｏ）ＲＬ－、－ＮＲＬＳ（＝Ｏ）（＝ＮＲＬ）－、－ＮＲＬＳ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲＬ－、－Ｎ＝Ｎ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）１～６－、直鎖状もしくは分岐状のＣ１～６アルキレン、直鎖状もしくは分岐状のＣ２～６アルケニレン、直鎖状もしくは分岐状のＣ２～６アルキニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキレン、Ｃ６～Ｃ１０アリーレン、およびＣ５～Ｃ９ヘテロアリーレンから選択され、ここでアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンは置換されるか、または非置換であり、ここで各ＲＬは独立して、Ｈ、Ｄ、シアノ、ハロゲン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、－ＣＤ３、－ＯＣＨ３、－ＯＣＤ３、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ハロアルキル、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、－ＯＣＨ３、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ハロアルキル、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、または置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキルである。
[0410]式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）、式（ＩＩＩｃ）、式（ＩＩＩｄ）、式（ＩＩＩｅ）、または式（ＩＶ）のいくつかの実施形態において、式中、リンカーの各々は独立して、－（Ｌ１）ｋ１－（Ｌ２）ｋ２－（Ｌ３）ｋ３－（Ｌ４）ｋ４－の構造を有し、式中、ｋ１、ｋ２、ｋ３、およびｋ４の各々は独立して、０、１または２であり、かつＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４の各々は独立して、－Ｏ－、－Ｓ－，Ｓ（＝Ｏ）１～２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－ＮＲＬ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－ＮＲＬＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲＬＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－Ｐ（＝Ｏ）ＲＬ－、－ＮＲＬＳ（＝Ｏ）（＝ＮＲＬ）－、－ＮＲＬＳ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲＬ－、－Ｎ＝Ｎ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）１～６－、直鎖状もしくは分岐状のＣ１～６アルキレン、直鎖状もしくは分岐状のＣ２～６アルケニレン、直鎖状もしくは分岐状のＣ２～６アルキニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキレン、Ｃ６～Ｃ１０アリーレン、およびＣ５～Ｃ９ヘテロアリーレンから選択され、ここでアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンは置換されるか、または非置換であり、ここで各ＲＬは独立して、Ｈ、Ｄ、シアノ、ハロゲン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、－ＣＤ３、－ＯＣＨ３、－ＯＣＤ３、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ハロアルキル、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、－ＯＣＨ３、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ハロアルキル、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、または置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキルである。
[0411]式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）、式（ＩＩＩｃ）、式（ＩＩＩｄ）、式（ＩＩＩｅ）、または式（ＩＶ）のいくつかの実施形態では、リンカーの各々は独立して、以下：
から選択される構造を含み、式中、ｐ、ｑ、ｍ、およびｎの各々は独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１３、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。いくつかの実施形態では、ｐ、ｑ、ｍ、およびｎの各々は独立して、０、１、２、３、４、または５である。
[0412]式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）、式（ＩＩＩｃ）、式（ＩＩＩｄ）、式（ＩＩＩｅ）、または式（ＩＶ）のいくつかの実施形態では、ここで、前述の式のボックスにおいて言及される「１つまたは複数のリンカー」は、
である構造を含み、式中、ｐ、ｑ、ｍ、およびｎの各々は独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１３、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。いくつかの実施形態では、ｐ、ｑ、ｍ、およびｎの各々は独立して、０、１、２、３、４、または５である。
[0413]式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、式（ＩＩＩｃ）、式（ＩＩＩｄ）、式（ＩＩＩｅ）、または式（ＩＶ）のいくつかの実施形態において、Ｗは１つまたは複数の修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基を含む。核酸塩基は、本明細書に記載の任意の化学修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、２’－ＯＨまたは２’－ＯＭｅ修飾を含む。例えば、Ｗは、（ａ）、（ｃ）、（ｇ）、または（ｕ）と呼ばれる、１つまたは複数の２’－ＯＭｅ修飾アデニン、シトシン、グアニジン、およびウラシルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはより多くの修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列の５’末端付近、３’末端付近、または中間に１つまたは複数の修飾核酸塩基を含む。修飾ＲＮＡ内の修飾核酸塩基は、連続していてもいなくてもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列の長さに沿って散在する１つまたは複数の２’－ＯＭｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、配列の長さに沿って散在する１つまたは複数の２’ＯＨ修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、交互の２’－ＯＨおよび２’ＯＭｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～５０の整数である（配列番号１１８）。いくつかの実施形態では、Ｗは（ｕ）ｎを含み、ｎは３～２０（配列番号１１９）または３～１５（配列番号１２０）の整数である。いくつかの実施形態では、Ｗは、カップリング配列に相補的な１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、１つまたは複数のグアニンまたはシチジンを含む。いくつかの実施形態では、Ｗは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはより多くのグアニンまたはシチジンを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のグアニンまたはシチジンは、カップリング配列において１つまたは複数のシチンジンまたはグアニンに相補的である。いくつかの実施形態では、グアニンまたはシチジンは、Ｗまたはカップリング配列の末端にある。いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、グアニン－シチジン対合は、結合親和性を増加させる「ＧＣロック」または「ＣＧロック」を形成すると考えられる。Ｗまたはカップリング配列中のグアニンおよび／またはシチジンは、連続していてもいなくてもよく、本明細書に記載の化学修飾のいずれか１つ、例えば、２’－ＯＭｅまたは２’－ＯＨ修飾を含んでもよい。
受容体ターゲティングコンジュゲート
[0414]核酸ベースの治療を達成するための鍵は、特定の細胞型および組織へのペイロードの安全かつ効果的な送達である。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、現時点で最も高度な非ウイルス性薬物送達技術プラットフォームを表している。ＬＮＰは、物理的に血管を通過して肝細胞に到達し得る［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１０、１７６、１４－２１］。また、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）タンパク質は、ＬＮＰ表面からＰＥＧ脂質が拡散した後、血流中で中性電荷に近い状態でＬＮＰに結合し、肝細胞に対する内因性リガンドとして機能することが明らかになり、これは低密度のリポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）を表している［Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１０、１８、１３５７－１３６４］。したがって、ＬＮＰの効率的な肝臓送達を制御する２つの重要な因子は、１）血清中のＬＮＰ表面からの効果的なＰＥＧ脂質脱落、および２）ＬＮＰへのＡｐｏＥ結合であると想定される。上記の内因性ＡｐｏＥ媒介ＬＤＬｒ依存性ＬＮＰ送達経路は、ＬＤＬｒ欠損患者集団に対するＬＮＰベースの肝臓遺伝子送達を達成するための有効な経路ではないことが想像される。
[0414]核酸ベースの治療を達成するための鍵は、特定の細胞型および組織へのペイロードの安全かつ効果的な送達である。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、現時点で最も高度な非ウイルス性薬物送達技術プラットフォームを表している。ＬＮＰは、物理的に血管を通過して肝細胞に到達し得る［Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１０、１７６、１４－２１］。また、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）タンパク質は、ＬＮＰ表面からＰＥＧ脂質が拡散した後、血流中で中性電荷に近い状態でＬＮＰに結合し、肝細胞に対する内因性リガンドとして機能することが明らかになり、これは低密度のリポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）を表している［Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１０、１８、１３５７－１３６４］。したがって、ＬＮＰの効率的な肝臓送達を制御する２つの重要な因子は、１）血清中のＬＮＰ表面からの効果的なＰＥＧ脂質脱落、および２）ＬＮＰへのＡｐｏＥ結合であると想定される。上記の内因性ＡｐｏＥ媒介ＬＤＬｒ依存性ＬＮＰ送達経路は、ＬＤＬｒ欠損患者集団に対するＬＮＰベースの肝臓遺伝子送達を達成するための有効な経路ではないことが想像される。
[0415]一態様では、受容体ターゲティングコンジュゲートを含むＬＮＰが本明細書に記載される。いくつかの態様において、本明細書に記載されるのは、受容体ターゲティングコンジュゲートである。標的コンジュゲートを有するＬＮＰは、粒子の表面または周辺に受容体ターゲティング部分を有するように構成される。一態様では、受容体ターゲティングコンジュゲートの低いｍｏｌ％を、標的化ＬＮＰを構成しながら使用して、粒子の表面／周辺上のターゲティング部分の低い表面密度を達成する。別の態様では、受容体ターゲティングコンジュゲートの高いｍｏｌ％を、標的化ＬＮＰを構成しながら使用して、粒子の表面／周辺上のターゲティング部分の高い表面密度を達成する。別の態様では、受容体ターゲティングコンジュゲートの所望のｍｏｌ％を使用して、粒子の表面／周辺上のターゲティング部分の表面密度の範囲を達成する。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、ターゲティング部分（またはリガンド）、リンカー、およびターゲティング部分に連結された親油性部分を含む。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティング部分（またはリガンド）は、レクチン受容体を標的とする。いくつかの実施形態では、レクチン受容体はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティング部分は、ＡＳＧＰＲを標的とするＧａｌＮＡｃまたは誘導体ＧａｌＮＡｃである。一態様では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、１つのＧａｌＮＡｃ部分またはその誘導体を含む。別の態様において、受容体ターゲティングコンジュゲートは、２つのＧａｌＮＡｃ部分またはその誘導体を含む。別の態様において、受容体ターゲティングコンジュゲートは、３つのＧａｌＮＡｃ部分またはその誘導体を含む。別の態様では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、親油性である。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ部分および１つまたは複数の脂質部分、すなわちＧａｌＮＡｃ－脂質を含む。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートはＧａｌＮＡｃ－脂質である。
[0416]本開示は、ＬＤＬｒに依存しない様式での肝細胞への組織特異的な効率的なＬＮＰ送達を提供する。本開示により開発された三価ＧａｌＮＡｃ部分は、異なるＰＥＧスペーサーを介して、疎水性グリセロールベースのジアルキル脂質鎖、ステロール（例えば、コレステロール）および疎水性α－トコフェロールに結合される。次いで、これらのＧａｌＮＡｃコンジュゲート脂質は、様々な賦形剤と共に処方されて、肝細胞の表面に高度に発現されるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を標的とするようにカスタム設計されたＧａｌＮＡｃリガンドの表面密度が低いものから高いものまでを保持する、ＬＮＰを生成する。
[0417]操作されたＬＮＰの表面上のリガンドは、肝細胞へのＡＳＧＰＲ媒介性組織特異的取り込みを促進する。異なるＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＡｐｏＥ結合を回避し、ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＰＲ相互作用を可能にしてクラスリンを介した肝細胞への取り込みを促進するように構成されている。本明細書に記載のＰＥＧ－脂質を、様々なＰＥＧ－テザーを有するＧａｌＮＡｃ－脂質と組み合わせて使用することにより、ＰＥＧ脱落速度論を調節し、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ粒子の正味の表面電荷密度を調節することで、内因性ＡｐｏＥ結合特性を欠くＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが得られ、安全で有効な用量のＬＤＬＲ欠損前臨床動物モデルの肝細胞に特異的なＲＮＡペイロードを保持する粒子が送達される。前臨床動物モデルでの用量最適化によってさらに、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ（またはＬＮＰ）が臨床開発に進み、ＬＤＬＲ欠損患者集団を治療して、治療上実行可能な安全かつ有効な用量でゲノム編集を誘発する。
[0418]したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、式（Ｖ）の化合物：
を含む受容体ターゲティングコンジュゲートであり、
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－または－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－または結合であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立してＨまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質または脂質ナノ粒子であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数である。
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－または－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－または結合であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立してＨまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質または脂質ナノ粒子であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数である。
[0419]いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、式（Ｖ）の化合物：
を含み、
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、または置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質または脂質ナノ粒子であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数である。
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、または置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質または脂質ナノ粒子であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数である。
[0420]いくつかの実施形態では、Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－である。
[0421]式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ａはレクチンに結合する。いくつかの実施形態では、レクチンはアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である。いくつかの実施形態では、Ａは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
[0421]式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ａはレクチンに結合する。いくつかの実施形態では、レクチンはアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である。いくつかの実施形態では、Ａは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
[0422]式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態において、Ａは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ＡはＧａｌＮＡｃである。いくつかの実施形態では、Ａはガラクトースであるか、またはガラクトースを含む。
[0423]式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は各々独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は独立して、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである。式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は、Ｃ４アルキレンである。
[0424]式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－または－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
[0425]式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３は、置換または非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである。式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ３は、Ｃ４アルキレンである。式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ６およびＬ９は各々独立して、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１０アルキレンである。式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ６およびＬ９は独立して、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである。式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ６およびＬ９は、Ｃ３アルキレンである。
[0426]式（Ｖ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１はメチルである。
[0427]別の態様では、本明細書に開示されるのは、受容体ターゲティングコンジュゲートであり、これは、式（ＶＩ）：
の化合物を含み、
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－または結合であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立してＨまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質または脂質ナノ粒子であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数である。
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－または結合であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立してＨまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質または脂質ナノ粒子であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数である。
[0428]いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、受容体ターゲティングコンジュゲートであり、これは、式（ＶＩ）：
の化合物を含み、
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝Ｎ（Ｒ１））－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－または結合であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、または置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立してＨまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質または脂質ナノ粒子であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、０～１０から選択される整数である。
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝Ｎ（Ｒ１））－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－または結合であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、または置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立してＨまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質または脂質ナノ粒子であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、０～１０から選択される整数である。
[0429]いくつかの実施形態では、Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－である。
[0430]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ａは、レクチンに結合する。いくつかの実施形態では、レクチンは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である。いくつかの実施形態では、Ａは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
[0430]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ａは、レクチンに結合する。いくつかの実施形態では、レクチンは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である。いくつかの実施形態では、Ａは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
[0431]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ａは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、Ａは、ＧａｌＮＡｃである。
[0432]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。
[0433]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。
[0434]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は独立して、１～１０個のＯ原子を含む、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。
[0434]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は独立して、１～１０個のＯ原子を含む、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。
[0435]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は独立して、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１－（ＣＨ２）ｑ１－であり；式中、ｐ１は、１～８であり；ｑ１は、１～６である。
[0436]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３－（ＣＨ２）２－である。
[0437]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。
[0437]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。
[0438]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は独立して、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである。
[0439]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は、Ｃ４アルキレンである。
[0439]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は、Ｃ４アルキレンである。
[0440]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。
[0441]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－または－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。
[0442]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である。
[0442]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である。
[0443]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
[0444]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。
[0444]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。
[0445]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は独立して、１～１０個のＯ原子を含む、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。
[0446]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は独立して、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ２－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ２－であり；式中、ｐ２は、１～８であり；ｑ２は、１～６である。いくつかの実施形態では、ｐ２は１である。いくつかの実施形態では、ｐ２は２である。いくつかの実施形態では、ｐ２は３である。いくつかの実施形態では、ｐ２は４である。いくつかの実施形態では、ｐ２は５である。いくつかの実施形態では、ｐ２は６である。いくつかの実施形態では、ｐ２は７である。いくつかの実施形態では、ｐ２は８である。いくつかの実施形態では、ｑ２は１である。いくつかの実施形態では、ｑ２は２である。いくつかの実施形態では、ｑ２は３である。いくつかの実施形態では、ｑ２は４である。いくつかの実施形態では、ｑ２は５である。いくつかの実施形態では、ｑ２は６である。
[0447]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－である。
[0448]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は独立して、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ３－であり；式中、ｑ３は、１～８である。いくつかの実施形態では、ｑ３は１である。いくつかの実施形態では、ｑ３は２である。いくつかの実施形態では、ｑ３は３である。いくつかの実施形態では、ｑ３は４である。いくつかの実施形態では、ｑ３は５である。いくつかの実施形態では、ｑ３は６である。いくつかの実施形態では、ｑ３は７である。いくつかの実施形態では、ｑ３は８である。
[0448]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は独立して、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ３－であり；式中、ｑ３は、１～８である。いくつかの実施形態では、ｑ３は１である。いくつかの実施形態では、ｑ３は２である。いくつかの実施形態では、ｑ３は３である。いくつかの実施形態では、ｑ３は４である。いくつかの実施形態では、ｑ３は５である。いくつかの実施形態では、ｑ３は６である。いくつかの実施形態では、ｑ３は７である。いくつかの実施形態では、ｑ３は８である。
[0449]式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－である。
[0450]いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩａ）：
[0450]いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩａ）：
の構造を有し、
式中、
各ｑ４は１～１０である。
式中、
各ｑ４は１～１０である。
[0451]式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｑ４は、１～８である。いくつかの実施形態では、ｑ４は１～４である。いくつかの実施形態では、ｑ４は１～３である。いくつかの実施形態では、ｑ４は１である。いくつかの実施形態では、ｑ４は２である。いくつかの実施形態では、ｑ４は３である。いくつかの実施形態では、ｑ４は４である。いくつかの実施形態では、ｑ４は５である。
[0452]式（Ｖ）または式（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換または非置換のＣ１～Ｃ４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、Ｃ２アルキレンである。
[0453]いくつかの実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩｂ）：
の構造を有し、
式中、
ｒは１～４である。
式中、
ｒは１～４である。
[0454]式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｒは１、２または３である。いくつかの実施形態では、ｒは、１または２である。いくつかの実施形態では、ｒは、２または３である。いくつかの実施形態では、ｒは１である。いくつかの実施形態では、ｒは２である。いくつかの実施形態では、ｒは３である。いくつかの実施形態では、ｒは４である。
[0455]式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ１１は、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－である。いくつかの実施形態では、ｎは、１～１００である。いくつかの実施形態では、ｎは、２～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは、１０～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは、２０～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは、３０～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは、４０～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは、２，１２，３７、または４５である。いくつかの実施形態では、ｎは、１である。いくつかの実施形態では、ｎは、２である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４である。いくつかの実施形態では、ｎは、５である。いくつかの実施形態では、ｎは、６である。いくつかの実施形態では、ｎは、７である。いくつかの実施形態では、ｎは、８である。いくつかの実施形態では、ｎは、９である。いくつかの実施形態では、ｎは、１０である。いくつかの実施形態では、ｎは、１１である。いくつかの実施形態では、ｎは、１２である。いくつかの実施形態では、ｎは、１３である。いくつかの実施形態では、ｎは、１４である。いくつかの実施形態では、ｎは、１５である。いくつかの実施形態では、ｎは、１６である。いくつかの実施形態では、ｎは、１７である。いくつかの実施形態では、ｎは、１８である。いくつかの実施形態では、ｎは、１９である。いくつかの実施形態では、ｎは、２０である。いくつかの実施形態では、ｎは、２１である。いくつかの実施形態では、ｎは、２２である。いくつかの実施形態では、ｎは、２３である。いくつかの実施形態では、ｎは、２４である。いくつかの実施形態では、ｎは、２５である。いくつかの実施形態では、ｎは、２６である。いくつかの実施形態では、ｎは、２７である。いくつかの実施形態では、ｎは、２８である。いくつかの実施形態では、ｎは、２９である。いくつかの実施形態では、ｎは、３０である。いくつかの実施形態では、ｎは、３１である。いくつかの実施形態では、ｎは、３２である。いくつかの実施形態では、ｎは、３３である。いくつかの実施形態では、ｎは、３４である。いくつかの実施形態では、ｎは、３５である。いくつかの実施形態では、ｎは、３６である。いくつかの実施形態では、ｎは、３７である。いくつかの実施形態では、ｎは、３８である。いくつかの実施形態では、ｎは、３９である。いくつかの実施形態では、ｎは、４０である。いくつかの実施形態では、ｎは、４１である。いくつかの実施形態では、ｎは、４２である。いくつかの実施形態では、ｎは、４３である。いくつかの実施形態では、ｎは、４４である。いくつかの実施形態では、ｎは、４５である。いくつかの実施形態では、ｎは、４６である。いくつかの実施形態では、ｎは、４７である。いくつかの実施形態では、ｎは、４８である。いくつかの実施形態では、ｎは、４９である。いくつかの実施形態では、ｎは、５０である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも５である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも６である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも７である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも８である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも９である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１０である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１１である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１２である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１３である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１４である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１５である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１６である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１７である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１８である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも１９である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２０である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２１である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２２である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２３である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２４である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２５である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２６である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２７である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２８である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも２９である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３０である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３１である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３２である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３３である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３４である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３５である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３６である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３７である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３８である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも３９である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４０である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４１である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４２である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４３である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４４である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４５である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４６である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４７である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４８である。いくつかの実施形態では、ｎは、少なくとも４９である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも５である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも６である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも７である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも８である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも９である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１０である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１１である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１２である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１３である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１４である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１５である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１６である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１７である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１８である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも１９である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２０である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２１である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２２である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２３である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２４である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２５である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２６である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２７である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２８である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも２９である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３０である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３１である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３２である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３３である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３４である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３５である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３６である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３７である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３８である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも３９である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４０である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４１である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４２である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４３である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４４である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４５である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４６である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４７である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４８である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも４９である。いくつかの実施形態では、ｎは、多くとも５０である。
[0456]式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、または－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－または－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である。
[0457]式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、置換または非置換のＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１はメチルである。
[0458]前述の言及された式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ１は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は結合である。
[0459]前述の言及された式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ２は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＣＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＮＲＨＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（Ｒ－）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は結合である。
[0460]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ３は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、非置換Ｃ３～４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、非置換Ｃ１～４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は結合である。
[0461]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ４は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、非置換Ｃ４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ４は結合である。
[0462]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ５は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＮＲＨＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ５は結合である。
[0463]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ６は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、非置換Ｃ３－４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、非置換Ｃ１～４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ６は結合である。
[0464]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ７は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、非置換のＣ４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ７は結合である。
[0465]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ８は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、－ＮＲＨＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ８は結合である。
[0466]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ９は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、非置換Ｃ３～４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、非置換Ｃ１～４アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ９は結合である。
[0467]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換または非置換のＣ１～Ｃ６アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換または非置換のＣ１～Ｃ３アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、置換または非置換のＣ２～Ｃ３アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は、－ＣＨ２ＣＨ２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１０は結合である。
[0468]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２）ｎ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ１１は、置換または非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１１は、置換または非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１１は、置換または非置換の－（ＣＨ２）ｎ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１１は、結合である。いくつかの実施形態では、ｎは、３０～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは、３０～４０である。いくつかの実施形態では、ｎは、４０～５０である。
[0469]前述の言及した式によれば、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ１２は、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、または結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、置換または非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｓ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｓ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、ＯＣ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｎ（ＯＲ１）－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、置換または非置換のＣ１～Ｃ６アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、置換または非置換のＣ１～Ｃ３アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、置換または非置換のＣ２～Ｃ３アルキレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－ＣＨ２ＣＨ２－である。式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、基Ｒとインターカレートする有機分子残基である。いくつかの実施形態では、Ｌ１２は、塩基対とイオン的／静電的に相互作用するか、または塩基対と共有結合し得る。基Ｒとインターカレートする有機分子残基のいくつかの非限定的な例は、ベルベリン、臭化エチジウム、ダウノマイシン、サリドマイド、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アフラトキシンＢ１、アムサクリン、アクリジン（例えば、プロフラビン、キナクリン、アクリジンオレンジ、ピラゾロアクリジン）、アクリフラビン、アモナフィド、１，１０－フェナントロリン、多環式芳香族リガンドを有する金属カチオン（例えば、Ｒｈ（ＩＩＩ）などの金属、Ｉｒ（ＩＩＩ）、ジピリジン、テルピリジンなどのリガンド）、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、およびエリプチシンが挙げられる。
[0470]式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｍは、１～１０から選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、１～３から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、１～５から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、３～８から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、２～５から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、５～１０から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態では、ｍは、１である。いくつかの実施形態では、ｍは、２である。いくつかの実施形態では、ｍは、３である。
[0471]式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｎは、１～２００から選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１～２０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、１～５０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、１～１００から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、５０～１００から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、２５～５０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、３０～４０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、２５～７５から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、１００～２００から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、５０～１５０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、１５０～２００から選択される。
[0472]式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｍは、１～１０から選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｍは、１～３から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、１～５から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、３～８から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、２～５から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、５～１０から選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態では、ｍは、１である。いくつかの実施形態では、ｍは、２である。いくつかの実施形態では、ｍは、３である。
[0473]式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、ｎは、１～２００から選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１～２０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、１～５０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、１～１００から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、５０～１００から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、２５～５０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、３０～４０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、２５～７５から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、１００～２００から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、５０～１５０から選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、１５０～２００から選択される。
[0474]式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｒ１は独立して、Ｈまたは－ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ１はＨである。
[0475]式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒは、１つまたは複数の脂肪アルコール、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロリピド、ポリケチド、ステロール脂質、およびプレノール脂質を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、１つまたは複数の脂肪アルコールを含む。いくつかの実施形態では、各々の脂肪アルコールは独立して、飽和、一価不飽和、または多価不飽和脂肪アルコールである。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールは、１つまたは複数のＣ２～Ｃ２６脂肪アルコールを含む。いくつかの実施形態では、脂肪アルコールは、２つ以上のＣ２～Ｃ２６脂肪アルコールを含む。いくつかの実施形態では、各脂肪アルコールは、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、またはＣ２２脂肪アルコールである。いくつかの実施形態では、各脂肪アルコールは独立して、ドコサヘキサエノール、エイコサペンタエノール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルアルコール、（Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルアルコール、ドコサニルアルコール、（Ｅ）－オクタデカ－９－エン－１－イルアルコール、イコサニルアルコール、（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－オクタデカ－９，１２，１５－トリエン－１－イルアルコール、またはパルミチルアルコールである。いくつかの実施形態では、各脂肪アルコールは、ステアリルアルコールである。いくつかの実施形態では、Ｒは、１つまたは複数のステロール脂質を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、１つまたは複数のビタミンを含む。いくつかの実施形態では、各ビタミンは独立して、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、またはビタミンＫである。
[0476]いくつかの実施形態では、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）で示されるＲ基は、本明細書に記載のペイロードを含む。いくつかの実施形態では、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）で示されるＲ基は、脂質を含む。
[0477]いくつかの実施形態では、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）で得られるＲ基は、核酸を含む。いくつかの実施形態では、この核酸は一本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、この核酸は二本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、この二本鎖核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、この二本鎖核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、この二本鎖核酸はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドである。いくつかの実施形態では、核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはダイサー基質ｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、Ｒは、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ分子、すなわちＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、１つまたは複数のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、修復または組換えのためのテンプレート核酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、遺伝子編集因子ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、塩基編集因子ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、制限酵素をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲはジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲはガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＰＣＳＫ９、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ３、ＬＰＡ、ＡＰＯＢ、ＭＴＰ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ８、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＥ、ＬＤＬＲ、ＩＤＯＬ、ＮＰＣ１Ｌ１、ＡＳＧＲ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＧＡＬＮＴ２、ＧＣＫＲ、ＬＰＬ、ＭＬＸＩＰＬ、ＳＯＲＴ１、ＴＲＩＢ１、ＭＡＲＣ１、ＡＢＣＧ５、およびＡＢＣＧ８から選択される遺伝子とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはＰＣＳＫ９とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、Ｒは、本明細書に記載のガイドＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、本明細書に記載のカップリング配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｒは、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、デコイＲＮＡ、またはアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｒが核酸である場合、Ｌ１２は、基Ｒにインターカレートまたは結合し得る。
[0478]いくつかの実施形態では、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）で得られるＲ基は、アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸は天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、このアミノ酸は、２０の標準アミノ酸の外側にあるアミノ酸である。アミノ酸は修飾されてもよい。
[0479]いくつかの実施形態では、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）で提供されるＲ基は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、このタンパク質はアルゴノートタンパク質である。いくつかの実施形態では、このタンパク質はｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質はＲＮＰである。
[0480]いくつかの実施形態では、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）で提供されるＲ基は、脂質ナノ粒子を含む。
[0481]Ｌ１２とＲとの間の結合は、共有結合、水素結合、分子間相互作用または分子内相互作用であり得ることが理解されるべきである。
[0481]Ｌ１２とＲとの間の結合は、共有結合、水素結合、分子間相互作用または分子内相互作用であり得ることが理解されるべきである。
[0482]式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ａは、
またはその誘導体であり、アノマー連結は、アルファ、ベータまたはアルファとベータの混合物であり、糖部分をＬ１と連結する原子は、Ｏ、Ｓ、Ｎまたはメチレン（ＣＨ２）のＣである。式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、Ａはグルコースである。
[0483]いくつかの実施形態では、本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートは、表４に示す構造を有するＧａｌＮＡｃコンジュゲート脂質である。
[0484]特に指定のない限り、表４の各不斉炭素は、ラセミ、ＲおよびＳ配置を表す。表４に示されるように、ｎ、ｐ、およびｑの各々は独立して０、または１～２００の整数である。いくつかの実施形態では、表４のｎ、ｐ、およびｑは独立して、０、または１～１００の整数である。いくつかの実施形態では、表４のｎ、ｐ、およびｑの各々は独立して０、または１～５０の整数である。いくつかの実施形態では、表４のｎ、ｐ、およびｑの各々は独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１３、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。いくつかの実施形態では、表４のｎ、ｐ、およびｑの各々は独立して、０、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態では、表４のｎ、ｐ、およびｑの各々は独立して、０、１、２、または３である。いくつかの実施形態では、表４のｎ、ｐ、およびｑの各々は独立して、１または２である。いくつかの実施形態では、表４において、ｎは１～６０であり、ｐおよびｑの各々は独立して、１～９である。いくつかの実装では、表４由来の例示的なＧａｌＮＡｃコンジュゲート脂質ＩＤ番号１００１、１０１１、１０１５、１０２０、１０２５、１０３０、１０３７、１０４０、１０４１、１０４５、１０５０、１０５５、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、および１０８２は、ｎ＝１、１１、３６または４４である。表４の例示的なＧａｌＮＡｃコンジュゲート脂質のいくつかの実施形態では、ｎは１～１００である。いくつかの実施形態では、ｎは１～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは２５～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは１～１０である。いくつかの実施形態では、ｎは１～５である。いくつかの実施形態では、ｎは１～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは２５～７５である。いくつかの実施形態では、ｎは１００～１５０である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。いくつかの実施形態では、ｎは１１である。いくつかの実施形態では、ｎは３６である。いくつかの実施形態では、ｎは４４である。いくつかの実施形態では、ｎは４０～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは３０～４０である。表４の例示的なＧａｌＮＡｃコンジュゲート脂質のいくつかの実施形態では、ｐは１～１００である。いくつかの実施形態では、ｐは１～５０である。いくつかの実施形態では、ｐは２５～５０である。いくつかの実施形態では、ｐは１～１０である。いくつかの実施形態では、ｐは１～５である。いくつかの実施形態では、ｐは１～５０である。いくつかの実施形態では、ｐは２５～７５である。いくつかの実施形態では、ｐは１００～１５０である。いくつかの実施形態では、ｐは４０～５０である。いくつかの実施形態では、ｐは３０～４０である。表４の例示的なＧａｌＮＡｃコンジュゲート脂質のいくつかの実施形態では、ｑは１～１００である。いくつかの実施形態では、ｑは１～５０である。いくつかの実施形態では、ｑは２５～５０である。いくつかの実施形態では、ｑは１～１０である。いくつかの実施形態では、ｑは１～５である。いくつかの実施形態では、ｑは１～５０である。いくつかの実施形態では、ｑは２５～７５である。いくつかの実施形態では、ｑは１００～１５０である。いくつかの実施形態では、ｑは４０～５０である。いくつかの実施形態では、ｑは３０～４０である。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
[0485]一態様では、本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、（ｉ）治療剤などのペイロード、または目的の標的、および（ｉｉ）本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体（すなわち、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡなどの核酸）と、（ｉｉ）本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートとを含む脂質ナノ粒子組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、２つ以上の受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、それらのコンジュゲートは同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸分子実体は、本明細書に記載の核酸を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸分子実体は、肝細胞で生じた目的の病原遺伝子を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸分子実体は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸分子実体のうちの少なくとも１つは、化学修飾、例えば、本明細書に記載の化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、２’－Ｆ修飾、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、非環式ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、４’－Ｏ－メチル、または２’－ａｒａ－Ｆ修飾である。いくつかの実施形態では、化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾である。
[0485]一態様では、本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、（ｉ）治療剤などのペイロード、または目的の標的、および（ｉｉ）本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体（すなわち、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡなどの核酸）と、（ｉｉ）本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートとを含む脂質ナノ粒子組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、２つ以上の受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、それらのコンジュゲートは同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸分子実体は、本明細書に記載の核酸を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸分子実体は、肝細胞で生じた目的の病原遺伝子を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸分子実体は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸分子実体のうちの少なくとも１つは、化学修飾、例えば、本明細書に記載の化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、２’－Ｆ修飾、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、非環式ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、４’－Ｏ－メチル、または２’－ａｒａ－Ｆ修飾である。いくつかの実施形態では、化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾である。
[0486]いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、本明細書に記載のナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約０．００１ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、本明細書に記載のナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約０．０１ｍｏｌ％～約１ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、本明細書に記載のナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約０．００１ｍｏｌ％、約０．００５ｍｏｌ％、約０．０１ｍｏｌ％、約０．０２ｍｏｌ％、約０．０３ｍｏｌ％、約０．０４ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％、約０．０６ｍｏｌ％、約０．０７ｍｏｌ％、約０．０８ｍｏｌ％、または約０．０９ｍｏｌ％、～約１ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、または約２０ｍｏｌ％までを構成する。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、本明細書に記載のナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約０．００１ｍｏｌ％、約０．００５ｍｏｌ％、約０．０１ｍｏｌ％、約０．０２ｍｏｌ％、約０．０３ｍｏｌ％、約０．０４ｍｏｌ％、または約０．０５ｍｏｌ％、～約０．０６ｍｏｌ％、約０．０７ｍｏｌ％、約０．０８ｍｏｌ％、約０．０９ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、または約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、本明細書に記載のナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約０．０１ｍｏｌ％、約０．０２ｍｏｌ％、約０．０３ｍｏｌ％、約０．０４ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％、約０．０６ｍｏｌ％、約０．０７ｍｏｌ％、約０．０８ｍｏｌ％、約約０．０９ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ％、約０．４ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％、約１．１ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％、約１．６ｍｏｌ％、約１．７ｍｏｌ％、約１．８ｍｏｌ％、約１．９ｍｏｌ％、約２．０ｍｏｌ％、約３．０ｍｏｌ％、約４．０ｍｏｌ％、または約５．０ｍｏｌ％を構成する。
[0487]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて、約０．０００００１ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて、約０．０００１ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて、約０．０００１、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２５、０．０５、または０．２５ｍｏｌ％～約０．５、１、１．１２５、１．２５、１．５、１．７５、２、５、１０、１５、２０または、２５ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて約０．００１ｍｏｌ％～約１ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて約０．００５ｍｏｌ％～約１ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて約０．０２５ｍｏｌ％～約１、１．５または２ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて約０．２５ｍｏｌ％～約１ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて約０．２５ｍｏｌ％～約１．５または２ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて、約０．０５ｍｏｌ％～約１．５または２ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて約０．０５ｍｏｌ％～約１ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて約０．００１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて約０．００５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２５、０．７５、または１ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて、受容体ターゲティングコンジュゲートの最大約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて、最大で約１ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、総脂質または総賦形剤含有量に基づいて、最大で約２ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。
[0488]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、マイクロメートル以下のオーダーのサイズであり、脂質二重層を含んでもよい。ナノ粒子組成物には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（脂質小胞など）、およびリポプレックスが含まれる。例えば、ナノ粒子組成物は、直径５００ｎｍ以下の脂質二重層を有するリポソームであってもよい。本明細書に記載のＬＮＰは、約１ｎｍ～約２５００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１５００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約８０ｎｍの平均直径を有し得る。本明細書に記載のＬＮＰは、約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、１５０ｎｍ、またはそれ以上の平均直径を有し得る。本明細書に記載のＬＮＰは、実質的に非毒性であり得る。
コレステロール
[0489]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、コレステロールまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は構造脂質を含む。この構造脂質は、ステロイド、ステロール、アルキルレゾレイノール、コレステロールまたはその誘導体、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、およびそれらの組合せから選択され得る。いくつかの実施形態では、構造脂質は、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、およびヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイドである。いくつかの実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、またはコレステロールヘミスクシネートである。いくつかの実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、コレステロールである。
[0489]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、コレステロールまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は構造脂質を含む。この構造脂質は、ステロイド、ステロール、アルキルレゾレイノール、コレステロールまたはその誘導体、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、およびそれらの組合せから選択され得る。いくつかの実施形態では、構造脂質は、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、およびヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイドである。いくつかの実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、またはコレステロールヘミスクシネートである。いくつかの実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、コレステロールである。
[0490]いくつかの実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、コレステロール誘導体である。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、極性コレステロール類似体である。いくつかの実施形態では、極性コレステロール類似体は、５α－コレスタノール、５β－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、または６－ケトコレスタノールである。いくつかの実施形態では、極性コレステロール類似体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルである。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、非極性コレステロール類似体である。いくつかの実施形態では、非極性コレステロール類似体は、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５β－コレスタノン、またはデカン酸コレステリルである。
[0491]いくつかの実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質のうちの２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質のうち約２０ｍｏｌ％、約２１ｍｏｌ％、約２２ｍｏｌ％、約２３ｍｏｌ％、約２４ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％、約２６ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％、約２８ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、約３６ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％、約３８ｍｏｌ％、約３９ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％、約４１ｍｏｌ％、約４２ｍｏｌ％、約４３ｍｏｌ％、約４４ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約４６ｍｏｌ％、約４７ｍｏｌ％、約４８ｍｏｌ％、または約５０ｍｏｌ％を構成する。
リン脂質
[0492]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、リン脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミンアミン、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロホスホノ、スフィンゴ脂質、ホスホノ脂質、天然レシチン、および水素化リン脂質からなる群から選択される脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリンを含む。例示的なホスファチジルコリンしては、限定するものではないが、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、２－オレオイル－１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、およびジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）が挙げられる。特定の実施形態では、リン脂質はＤＳＰＣである。
[0492]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、リン脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミンアミン、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロホスホノ、スフィンゴ脂質、ホスホノ脂質、天然レシチン、および水素化リン脂質からなる群から選択される脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリンを含む。例示的なホスファチジルコリンしては、限定するものではないが、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、２－オレオイル－１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、およびジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）が挙げられる。特定の実施形態では、リン脂質はＤＳＰＣである。
[0493]いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミンアミンを含む。いくつかの実施形態では、ホスファチジルエタノールアミンアミンは、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１６－Ｏ－Ｍｏｎｏｍｅ Ｌｅ ＰＥ、１６－Ｏ－ジメチル ＰＥ、１８－１－トランス ＰＥ、パルミトイル オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、または１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）である。いくつかの実施形態では、リン脂質はグリセロリン脂質を含む。いくつかの実施形態では、グリセロリン脂質は、プラズマローゲン（ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎ）、ホスファチデート、またはホスファチジルコリンである。いくつかの実施形態では、グリセロリン脂質は、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、またはリゾホスファチジルコリンである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、スフィンゴリン脂質を含む。いくつかの実施形態では、スフィンゴリン脂質は、スフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、またはセラミドホスホグリセロリン酸である。いくつかの実施形態では、リン脂質は天然レシチンを含む。いくつかの実施形態では、天然レシチンは卵黄レシチンまたは大豆レシチンである。いくつかの実施形態では、リン脂質は水素化リン脂質を含む。いくつかの実施形態では、水素化リン脂質は、水素化大豆ホスファチジルコリンである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリンからなる群から選択される。
[0494]いくつかの実施形態では、リン脂質は、以下：１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ），１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、２－オレオイル－１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ジエーテル ＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、およびスフィンゴミエリンから選択される脂質を含む。
[0495]リン脂質は、リン脂質部分および１つまたは複数の脂肪酸部分を含んでもよい。リン脂質部分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、またはスフィンゴミエリンを含んでもよい。脂肪酸部分は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸を含んでもよい。いくつかの特定の実施形態では、リン脂質は、アジドへの曝露時に銅触媒付加環化を受けることができる１つまたは複数のアルキンで官能化または架橋されてもよい。
[0496]いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、複数のリン脂質、例えば、少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上の異なるリン脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち１ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約８ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％、約９ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、約１１ｍｏｌ％、約１２ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％、約１４ｍｏｌ％、または約１５ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約９ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、または約１１ｍｏｌ％を構成する。
ステルス脂質
[0497]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、ステルス脂質を含む。「ステルス脂質」は、ナノ粒子がインビボ（例えば、血液中）に存在し得る時間の長さを変更する脂質を指し得る。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を減少させ、粒子サイズを制御することによって、製剤プロセスを支援し得る。本明細書で使用されるステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態学的特性を調節し得る。本開示の脂質組成物における使用に適したステルス脂質としては、脂質部分に結合した親水性頭部基を有するステルス脂質が含まれ得るが、これらに限定されない。本開示の脂質組成物における使用に適切なステルス脂質、およびこのような脂質の生化学に関する情報は、Ｒｏｍｂｅｒｇら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＲｅｓｅａｒｃＨ、Ｖｏｌ．２５、Ｎｏ．１、２００８、ｐｇ．５５－７１およびＨｏｅｋｓｔｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６０（２００４）４１－５２に記載されている。追加の適切なＰＥＧ脂質は、例えばＷＯ２００６／００７７１２に開示されている。
[0497]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、ステルス脂質を含む。「ステルス脂質」は、ナノ粒子がインビボ（例えば、血液中）に存在し得る時間の長さを変更する脂質を指し得る。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を減少させ、粒子サイズを制御することによって、製剤プロセスを支援し得る。本明細書で使用されるステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態学的特性を調節し得る。本開示の脂質組成物における使用に適したステルス脂質としては、脂質部分に結合した親水性頭部基を有するステルス脂質が含まれ得るが、これらに限定されない。本開示の脂質組成物における使用に適切なステルス脂質、およびこのような脂質の生化学に関する情報は、Ｒｏｍｂｅｒｇら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＲｅｓｅａｒｃＨ、Ｖｏｌ．２５、Ｎｏ．１、２００８、ｐｇ．５５－７１およびＨｏｅｋｓｔｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６０（２００４）４１－５２に記載されている。追加の適切なＰＥＧ脂質は、例えばＷＯ２００６／００７７１２に開示されている。
[0498]いくつかの実施形態では、ステルス脂質はＰＥＧ脂質である。一実施形態では、ステルス脂質の親水性頭部基は、ＰＥＧ（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］に基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含む。ステルス脂質は、脂質部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ステルス脂質の脂質部分は、約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含む、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドに由来し得、この鎖は、例えば、アミドまたはエステルなどの１つまたは複数の官能基を含んでもよい。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換アルキル基をさらに含んでもよい。
ＰＥＧ脂質
[0499]いくつかの実施形態では、記載のＬＮＰ組成物は、ＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、記載されたＬＮＰ組成物は、２つ以上のＰＥＧ脂質を含む。例示的なＰＥＧ脂質としては、限定するものではないが、表２の脂質が挙げられる。例示的なＰＥＧ脂質としては、限定するものではないが、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびそれらの混合物が挙げられる。例えば、１つまたは複数のＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質、またはそれらの組合せを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの任意選択で置換された直鎖状または分枝状ポリマーである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、例えば、１つまたは複数のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシ、またはアリール基によって置換される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ－ポリウレタンまたはＰＥＧ－ポリプロピレンなどのＰＥＧコポリマーを含む（例えば、ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（１９９２）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧコポリマーを含まず、例えば、ＰＥＧモノポリマーであってもよい。例示的なＰＥＧ－脂質としては、限定するものではないが、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール、およびＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］）。
[0499]いくつかの実施形態では、記載のＬＮＰ組成物は、ＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、記載されたＬＮＰ組成物は、２つ以上のＰＥＧ脂質を含む。例示的なＰＥＧ脂質としては、限定するものではないが、表２の脂質が挙げられる。例示的なＰＥＧ脂質としては、限定するものではないが、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびそれらの混合物が挙げられる。例えば、１つまたは複数のＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質、またはそれらの組合せを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの任意選択で置換された直鎖状または分枝状ポリマーである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、例えば、１つまたは複数のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシ、またはアリール基によって置換される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ－ポリウレタンまたはＰＥＧ－ポリプロピレンなどのＰＥＧコポリマーを含む（例えば、ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（１９９２）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧコポリマーを含まず、例えば、ＰＥＧモノポリマーであってもよい。例示的なＰＥＧ－脂質としては、限定するものではないが、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール、およびＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］）。
[0500]いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ脂質コンジュゲート、例えば、ジアルキルオキシプロピルにカップリングしたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールにカップリングされたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールにカップリングされたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンにカップリングされたＰＥＧ、およびセラミドにコンジュゲートされたＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照）、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート；例えば、ＷＯ２０１０／００６２８２を参照のこと）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、およびそれらの混合物である。
[0501]ＰＥＧ脂質は、１つまたは複数のエチレングリコール単位、例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、または少なくとも１５０のエチレングリコール単位を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約２００Ｄａ～約５０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約５００Ｄａ～約３０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約７５０Ｄａ～約２５００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約７５０Ｄａ～約２５００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約５００Ｄａ、約７５０Ｄａ、約１０００Ｄａ、約１２５０Ｄａ、約１５００Ｄａ、約１７５０Ｄａ、または約２０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＰＥＧ脂質の多分散性指数（ＰＤＩ）は２未満である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＰＥＧ脂質のＰＤＩは、最大で１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＰＥＧ脂質のＰＤＩは、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。
[0502]いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約０．１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約０．１ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約０．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約２．０ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約１ｍｏｌ％、約１．１ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％、約１．６ｍｏｌ％、約１．７ｍｏｌ％、約１．７ｍｏｌ％、約１．８ｍｏｌ％、約１．９ｍｏｌ％、約２．０ｍｏｌ％、約２．１ｍｏｌ％、約２．２ｍｏｌ％、約２．３ｍｏｌ％、約２．４ｍｏｌ％、約２．５ｍｏｌ％、約２．６ｍｏｌ％、約２．７ｍｏｌ％、約２．８ｍｏｌ％、約２．９ｍｏｌ％、または約３．０ｍｏｌ％を構成する。
アミノ脂質
[0503]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、アミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、複数のアミノ脂質を含む。例えば、ＬＮＰ組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ脂質を含んでもよい。別の例では、ＬＮＰ組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも２０のアミノ脂質を含んでもよい。さらに別の例では、ＬＮＰ組成物は、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大９個、最大１０個、最大２０個、または最大３０個のアミノ脂質を含んでもよい。
[0503]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、アミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、複数のアミノ脂質を含む。例えば、ＬＮＰ組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ脂質を含んでもよい。別の例では、ＬＮＰ組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも２０のアミノ脂質を含んでもよい。さらに別の例では、ＬＮＰ組成物は、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大９個、最大１０個、最大２０個、または最大３０個のアミノ脂質を含んでもよい。
[0504]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、１つまたは複数のアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約１ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約４０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約１０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、または約６５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約４０ｍｏｌ％、約４１ｍｏｌ％、約４２ｍｏｌ％、約４３ｍｏｌ％、約４４ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約４６ｍｏｌ％、約４７ｍｏｌ％、約４８ｍｏｌ％、約４９ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約５１ｍｏｌ％、約５２ｍｏｌ％、約５３ｍｏｌ％、約５４ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％、約５６ｍｏｌ％、約５７ｍｏｌ％、約５８ｍｏｌ％、約５９ｍｏｌ％、約６０ｍｏｌ％、約６１ｍｏｌ％、約６２ｍｏｌ％、約６３ｍｏｌ％、約６４ｍｏｌ％、または約６５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、第１のアミノ脂質および第２のアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、第１のアミノ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総アミノ脂質のうち約１ｍｏｌ％～約９９ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、第１のアミノ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する全アミノ脂質のうち約１６．７ｍｏｌ％～約６６．７ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、第１のアミノ脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総アミノ脂質のうち約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する。
[0505]いくつかの実施形態では、アミノ脂質はイオン化可能な脂質である。イオン性脂質は、１つまたは複数のイオン性窒素原子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のイオン化可能な窒素原子のうちの少なくとも１つは、正に帯電している。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物中のイオン化可能な窒素原子のうち少なくとも１０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、７０ｍｏｌ％、８０ｍｏｌ％、９０ｍｏｌ％、９５ｍｏｌ％、または９９ｍｏｌ％が、正に帯電している。いくつかの実施形態では、アミノ脂質は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、イミン、アミド、グアニジン部分、ヒスチジン残基、リジン残基、アルギニン残基、またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、アミノ脂質は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、グアニジン部分、またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、アミノ脂質は、第三級アミンを含む。
[0506]いくつかの実施形態では、アミノ脂質はカチオン性脂質である。いくつかの実施形態では、アミノ脂質はイオン化可能な脂質である。いくつかの実施形態では、アミノ脂質は、１つまたは複数の窒素原子を含む。いくつかの実施形態では、アミノ脂質は、１つまたは複数のイオン化可能な窒素原子を含む。例示的なカチオン性および／またはイオン性脂質としては、限定するものではないが、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタナミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））が挙げられる。本開示に適したアミノ脂質のさらなる例は、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第２０１８０２９０９６５号Ａ１、ＷＯ２０１７／１７３０５４Ａｌ、米国特許出願公開第２０１５０２７３０６８号Ａ１、ＷＯ２０１５／０９５３４０Ａｌ、米国特許第９，３６５，６１０号、同第８，１９３，２４６号、同第８，１９２，７５３号、同第９，５４９，９８３号、同第８，０１７，８０４号、同第８，３５７，７２２号、同第７，７９９，５６５号、および同第７，７４５，６５１号に見出され得る。
[0507]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアミノ脂質は、薬学的に許容される塩などの塩の形態を取り得る。アミノ脂質の薬学的に許容される塩は全て、本開示に包含される。本明細書で使用される「アミノ脂質」という用語はまた、その薬学的に許容される塩、ならびにそのジアステレオマー、エナンチオマー、およびエピマーの形態も含む。
[0508]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアミノ脂質は、１つまたは複数の立体中心を有し、各立体中心は、Ｒ配置またはＳ配置のいずれかで独立して存在する。本明細書に提示される脂質としては、全てのジアステレオマー、エナンチオマー、およびエピマー形態、ならびにそれらの適切な混合物が挙げられる。本明細書で提供される脂質としては、全てのシス、トランス、シン、アンチ、エントゲゲン（Ｅ）、およびツザメン（Ｚ）異性体、ならびにそれらの適切な混合物が含まれる。
ペイロード
[0509]一態様では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物はペイロードを含む。本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、治療剤または目的の標的などのペイロードを送達するように設計され得る。例示的な治療剤としては、限定するものではないが、抗体（例えば、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ナノボディ、およびそれらのフラグメントなど）、コレステロール、ホルモン、ペプチド、タンパク質、化学療法剤および他の種類の抗腫瘍剤、低分子量薬物、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイおよびそれらの類似体、プラスミドおよび他の種類の発現ベクター、および低分子核酸分子、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸リボヌクレオチド（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（小型内部セグメント化干渉ＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称干渉ＲＮＡ）、ならびに細胞培養、対象または生物体などにおいて、関連する細胞および／または組織に対するセンス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ、２つ、またはそれ以上のミスマッチを有するｓｉＲＮＡが挙げられる。治療剤は、精製されても、または部分的に精製されてもよく、天然に存在してももしくは合成されても、または化学修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。いくつかの実施形態では、治療剤はｍＲＮＡである。
[0509]一態様では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物はペイロードを含む。本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、治療剤または目的の標的などのペイロードを送達するように設計され得る。例示的な治療剤としては、限定するものではないが、抗体（例えば、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ナノボディ、およびそれらのフラグメントなど）、コレステロール、ホルモン、ペプチド、タンパク質、化学療法剤および他の種類の抗腫瘍剤、低分子量薬物、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイおよびそれらの類似体、プラスミドおよび他の種類の発現ベクター、および低分子核酸分子、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸リボヌクレオチド（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（小型内部セグメント化干渉ＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称干渉ＲＮＡ）、ならびに細胞培養、対象または生物体などにおいて、関連する細胞および／または組織に対するセンス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ、２つ、またはそれ以上のミスマッチを有するｓｉＲＮＡが挙げられる。治療剤は、精製されても、または部分的に精製されてもよく、天然に存在してももしくは合成されても、または化学修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。いくつかの実施形態では、治療剤はｍＲＮＡである。
[0510]いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つまたは複数の核酸（すなわち、１つまたは複数の核酸分子実体）を含む。いくつかの実施形態では、この核酸は一本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、この核酸は二本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、この二本鎖核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、この二本鎖核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、この二本鎖核酸はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドである。いくつかの実施形態では、核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはダイサー基質ｄｓＲＮＡである。
[0511]いくつかの実施形態では、ペイロードは、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ分子、すなわちＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つまたは複数のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、修復または組換えのためのテンプレート核酸を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、遺伝子編集因子ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、塩基編集因子ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、制限酵素をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードはジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼを含む。
[0512]いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのｍＲＮＡペイロードを、安定性および／または免疫原性特性の改善のために修飾してもよい。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つまたは複数のヌクレオシドに対して行ってもよい。ｍＲＮＡ核酸塩基に対する化学修飾の例としては、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、および５－メチル－シチジンが挙げられる。安定性、発現、および免疫原性を改善するための追加の修飾も行ってもよい。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、真核細胞、哺乳動物細胞、またはより具体的にはヒト細胞などの特定の細胞型における発現のためにコドン最適化してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼとして、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはヒトコドン最適化Ｃｐｆヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、遺伝子編集因子（すなわち、ゲノム編集因子）ヌクレアーゼをコードし、遺伝子編集因子ｍＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子は、本明細書に記載のタンパク質などのＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子は、操作されたヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子は、目的の遺伝子に二本鎖切断を導入する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子は、目的の遺伝子内の標的点に二本鎖切断を導入する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子は、目的の遺伝子に一本鎖切断を導入する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子は、塩基編集因子である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子は、核酸配列を目的の遺伝子に挿入する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子は、目的の遺伝子から標的配列を欠失させる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡは、塩基編集因子ヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡは制限酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡは、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡは、メガヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡは、アルゴノートタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、沈殿法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿、または同等の方法、例えば、本明細書に記載の方法）またはクロマトグラフィーに基づく方法（例えば、ＨＰＬＣに基づく方法または同等の方法）を使用して精製される。
[0513]いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、３’または５’ＵＴＲは、ヒト遺伝子配列に由来し得る。例示的な３’および５’ＵＴＲには、α－およびβ－グロビン、アルブミン、ＨＳＤ１７Ｂ４、および真核伸長因子１ａが含まれる。さらに、ウイルス由来の５’および３’ＵＴＲも使用してもよく、オルソポックスウイルスおよびサイトメガロウイルスのＵＴＲ配列が含まれる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎなどの５’キャップを含む。特定の実施形態において、このキャップは、ヌクレオチドＮが２’ＯＭｅを含まないキャップ－０、またはヌクレオチドＮが２’ＯＭｅを含むキャップ－１、またはヌクレオチドＮおよびＮ＋１が２’ＯＭｅを含むキャップ－２であってもよい。いくつかの実施形態では、５’キャップは、核輸出を調節し；エキソヌクレアーゼによる分解を防ぎ；翻訳を促進し；および５’近位イントロンの切除を促進し得る。さらに、キャップは、真核生物の翻訳開始因子４Ｅ、ｅＩＦ４Ｅの結合エレメントとして機能する非核酸実体も含んでもよい。特定の実施形態では、ｍＲＮＡはポリ（Ａ）テールを含む。このテールは、約４０～約３００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、このテールは、約４０～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、このテールは約１００～約３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、このテールは約１００～約３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、このテールは約５０～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、このテールは、約５０～約２５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、このテールは、約１００、１５０、または２００ヌクレオチド長である。ポリ（Ａ）テールは、ホスホロチオエート結合および核酸塩基の修飾など、エキソヌクレアーゼの分解を防ぐための修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、修飾されたまたは非天然核酸塩基または他の合成部分を含んでもよい３’「キャップ」を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＲＮＡの細胞内半減期を改変し得る少なくとも１つのエレメントを含む。ＲＮＡの半減期は増減し得る。いくつかの実施形態では、このエレメントは、ＲＮＡの安定性を増加させるか、または減少させ得る。いくつかの実施形態では、このエレメントはＲＮＡ分解（ｄｅｃａｙ）を促進し得る。いくつかの実施形態では、このエレメントは翻訳を活性化し得る。いくつかの実施形態では、このエレメントは、ＲＮＡの３’ＵＴＲ内にあってもよい。例えば、このエレメントは、ｍＲＮＡ分解シグナルであってもよいし、またはポリアデニル化シグナル（ＰＡ）を含んでもよい。
[0514]いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）と相互作用する少なくとも１つのドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡによって標的配列に導かれる。ガイドＲＮＡは、標的配列への結合を指示し得るように、Ｃａｓタンパク質および標的配列と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的切断に対する特異性を提供し、Ｃａｓタンパク質は普遍的であり、異なるガイドＲＮＡと対になって、異なる標的配列を切断し得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを切断し得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡを切断し得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＲＮＡにニックを入れる場合がある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であってもよい。特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を低減または排除するために改変されてもよい。Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ配列に結合し、その発現または活性を調節するために使用され得る。
[0515]いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、リボ核酸タンパク質複合体を含む、クラス１またはクラス２の系の構成要素を含む。タンパク質のクラス２Ｃａｓヌクレアーゼファミリーは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素であり、本明細書でさらに説明するように、適切なガイドＲＮＡを設計することにより、所望の核酸標的を切断するように指示し得る。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素は、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、ＩＩＣ型、Ｖ型、またはＶＩ型システムに由来し得る。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、およびＣ２ｃ３タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系由来のＣａｓ９タンパク質、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質などの単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼに由来する。
[0516]Ｃａｓ９タンパク質または他の構成要素が由来し得る例示的な種としては、限定するものではないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒ ｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒ ｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒ ｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ ｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、およびＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来である。
[0517]いくつかの実施形態では、ペイロードは、少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡは、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼを、標的核酸分子上の標的配列に誘導し得、そこでガイドＲＮＡがハイブリダイズして、Ｃａｓヌクレアーゼは標的配列を切断または調節する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、クラス２ヌクレアーゼと結合し、それによる切断の特異性を提供する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体などのＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質による切断を標的とする。いくつかの実施形態では、ペイロードは、２つ以上のガイドＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡ分子は、同じ病原遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡ分子は、異なる遺伝子を標的とする。いくつかの特定の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ分子は、目的の２つの別個の病原遺伝子を標的とする。
[0518]ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｃｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）を含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的核酸分子上の標的配列に相補的で、かつハイブリダイズするターゲティング配列を含んでもよい。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部に相補的でかつハイブリダイズするフラッグポール（ｆｌａｇｐｏｌｅ）も含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、細菌のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写された天然に存在するｃｒＲＮＡの構造と平行し得、ターゲティング配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のスペーサーとして作用し、フラッグポールは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のスペーサーに隣接する反復配列の一部に対応する。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡのターゲティング配列を介して、目的の任意の配列を標的し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列と標的核酸分子上の標的配列との間の相補性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列および標的核酸分子上の標的配列は、１００％相補的であり得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列および標的核酸分子上の標的配列は、少なくとも１つのミスマッチを含んでもよい。例えば、ガイドＲＮＡのターゲティング配列および標的核酸分子上の標的配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列および標的核酸分子上の標的配列は、１～６個のミスマッチを含んでもよい。
[0519]いくつかの実施形態では、ターゲティング配列の長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および構成要素に依存する。例えば、異なる細菌種由来の異なるＣａｓタンパク質は、様々な最適なターゲティング配列の長さを有する。したがって、ターゲティング配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０を超えるヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ターゲティング配列は、１８～２４ヌクレオチド長を含んでいた。いくつかの実施形態では、ターゲティング配列は、１９～２１ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング配列は、２０ヌクレオチド長を含む。
[0520]いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」である。いくつかの実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒａｃｒ ＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１および第２のＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ上のフラッグポールとｔｒａｃｒ ＲＮＡとの間の塩基対合を介してＲＮＡ二重鎖を形成し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ＲＮＡに共有結合されたｃｒＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、リンカーを介して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、単一分子（ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ）ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ上のフラッグポールとｔｒａｃｒ ＲＮＡとの間の塩基対合を介してステムループ構造を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質によるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断を媒介し得る「Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ」である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質との活性複合体を形成し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、複数のガイドＲＮＡを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が複数の標的配列を切断するように、各ガイドＲＮＡには異なる標的配列が含まれている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体内での活性または安定性など、同じまたは異なる特性を有し得る。複数のガイドＲＮＡを使用する場合、各ガイドＲＮＡを同じ発現カセットまたは異なる発現カセットにコードしてもよい。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。
[0521]いくつかの実施形態では、ＲＮＡなどの核酸ペイロードが修飾される。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、ガイドＲＮＡに存在しても、またはｍＲＮＡに存在してもよい。１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｍＲＮＡをコードするガイドＲＮＡまたはＣａｓヌクレアーゼは、「修飾」ＲＮＡと呼ばれ、標準のＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵ残基の代わりに、またはそれに加えて使用される、１つまたは複数の非天然および／または天然に存在する構成要素または構成の存在を表す。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、非標準ヌクレオシドまたはヌクレオチドで合成される。修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含んでもよい：（ｉ）リン酸ジエステル骨格結合中の非連結リン酸酸素の一方もしくは両方および／または連結リン酸酸素の１つもしくは複数の変更、例えば置き換え（例示的な骨格修飾）；（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えばリボース糖の２’ヒドロキシルの変更、例えば置き換え（例示的な糖修飾）；（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱ホスホ」リンカーでの大規模に置き換え（例示的な骨格修飾）；（ｉｖ）非標準核酸塩基を含む、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（例示的な塩基修飾）；（ｖ）リボース－リン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）；（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置き換え、または部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション（このような３’または５’キャップ修飾は、糖および／または骨格の修飾を含み得る）；ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）。
[0522]いくつかの実施形態では、ペイロードはテンプレート核酸を含んでもよい。テンプレートを使用して、Ｃａｓヌクレアーゼの標的部位またはその近くで核酸配列を変更または挿入し得る。いくつかの実施形態では、テンプレートは相同組換えに使用される。いくつかの実施形態において、相同組換えは、テンプレート配列またはテンプレート配列の一部の標的核酸分子への組み込みをもたらし得る。いくつかの実施形態では、単一のテンプレートが提供される。他の実施形態では、相同組換えが２つ以上の標的部位で起こり得るように、２つ以上のテンプレートが提供される。
[0523]いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＲＮＡなどのペイロードは、粒子の脂質部分内に完全にカプセル化され、それによりＲＮＡをヌクレアーゼ分解から保護する。完全にカプセル化されているということは、遊離のＤＮＡまたはＲＮＡを有意に分解する血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、核酸脂質粒子内のＲＮＡが有意に分解されていないことを示し得る。いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子組成物は、粒子の脂質部分内に完全にカプセル化されるＲＮＡ分子を含み、その結果、その粒子のうち、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約３０％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（またはその任意の割合またはその中の範囲）が粒子の内にカプセル化されたＲＮＡを有する。
[0524]いくつかの実施形態では、ペイロードは、ｍＲＮＡおよび１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、遺伝子編集因子ヌクレアーゼをコードし、遺伝子編集因子ｍＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、塩基編集ヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡは、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集因子ｍＲＮＡは、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼをコードする。
[0525]いくつかの実施形態では、遺伝子編集ｍＲＮＡは、３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、３’もしくは５’ＵＴＲ、またはＵＴＲのセグメントは、哺乳動物またはヒト遺伝子配列由来であり得る；これらの３’および５’ＵＴＲは、同じ遺伝子由来である必要はない。例示的な３’および５’ＵＴＲとしては、ａ－およびβ－グロビン、アルブミン、ＨＳＤ１７Ｂ４、トランスフェリン、補体Ｃ３、フィブリノゲン、アポリポタンパク質Ａ２、シトクロムＰ４５０ ２Ｅ１、ハプトグロビン、シトクロムＣ－２４５アルファ鎖、オロソムコイド１、アルファ－１－アンチトリプシン、および真核伸長因子ｌａが挙げられる。例示的なヒトタンパク質由来のｍＲＮＡ ＵＴＲ配列を表１９に示す。さらに、ウイルス由来の５’および３’ＵＴＲも使用してもよく、オルソポックスウイルスおよびサイトメガロウイルスのＵＴＲ配列が含まれる。前述のＵＴＲまたはＵＴＲのセグメントは、それらが由来する配列と同一でなくてもよいことは理解されるべきである；特定の実施形態では、由来するＵＴＲまたはＵＴＲのセグメントは、少なくとも７０％の同一性を有する元の配列に対して完全または部分的な類似性を有する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎなどの５’キャップを含む。特定の実施形態では、このキャップは、ヌクレオチドＮが２’ＯＭｅを含まないキャップ－０、またはヌクレオチドＮが２’ＯＭｅを含むキャップ－１、またはヌクレオチドＮおよびＮ＋ｌが２’ＯＭｅを含むキャップ－２であってもよい。いくつかの実施形態では、５’キャップは、核輸出を調節し；エキソヌクレアーゼによる分解を防ぎ；翻訳を促進し；および５’近位イントロンの切除を促進し得る。さらに、キャップは、核酸官能基、および真核生物翻訳開始因子４Ｅ、ｅＩＦ４Ｅの結合エレメントとして機能する非核酸実体を含んでもよい。特定の実施形態では、ｍＲＮＡはポリ（Ａ）テールを含む。このテールは、約４０～約３００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、テールは約４０～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、テールは約１００～約３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、テールは約１００～約３００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、テールは約５０～約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、テールは約５０～約２５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、テールは、約１００、１５０、または２００ヌクレオチド長である。ポリ（Ａ）テールは、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｉｏａｔｅ）結合および核酸塩基の修飾など、エキソヌクレアーゼの分解を防ぐための修飾を含んでもより。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、修飾されたまたは非天然核酸塩基または他の合成部分を含んでもよい３’「キャップ」を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＲＮＡの細胞内半減期を改変し得る少なくとも１つのエレメントを含む。ＲＮＡの半減期は増減し得る。いくつかの実施形態では、エレメントは、ＲＮＡの安定性を増加させるか、または減少させ得る。いくつかの実施形態では、エレメントはＲＮＡ分解を促進し得る。いくつかの実施形態では、このエレメントは翻訳を活性化し得る。いくつかの実施形態では、このエレメントは、ＲＮＡの３’ＵＴＲ内にあってもよい。例えば、このエレメントは、ｍＲＮＡ分解シグナルであってもよいし、またはポリアデニル化シグナル（ＰＡ）を含んでもよい。
[0526]
ＬＮＰの追加の組成物
[0527]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、１つまたは複数の抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、カチオン性脂質、ペイロード、またはその両方の分解を減少させるように機能する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、親水性抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびクエン酸塩などのキレート剤である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は親油性抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、親油性抗酸化剤は、ビタミンＥ異性体またはポリフェノールを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、または少なくとも１００ｍＭの濃度でＬＮＰ組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、約２０ｍＭの濃度でＬＮＰ組成物中に存在する。
[0527]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、１つまたは複数の抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、カチオン性脂質、ペイロード、またはその両方の分解を減少させるように機能する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、親水性抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびクエン酸塩などのキレート剤である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は親油性抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、親油性抗酸化剤は、ビタミンＥ異性体またはポリフェノールを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、または少なくとも１００ｍＭの濃度でＬＮＰ組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、約２０ｍＭの濃度でＬＮＰ組成物中に存在する。
脂質ナノ粒子の作製方法
[0528]本開示では、ＬＮＰ組成物、例えば、ＧａｌＮＡｃ脂質などの受容体ターゲティングコンジュゲートを含むＬＮＰを作製するための革新的なプロセスについて記載する。
[0528]本開示では、ＬＮＰ組成物、例えば、ＧａｌＮＡｃ脂質などの受容体ターゲティングコンジュゲートを含むＬＮＰを作製するための革新的なプロセスについて記載する。
[0529]伝統的に、ＧａｌＮＡｃ脂質を含むＬＮＰは、事後添加プロセス（すなわち、ＧａｌＮＡｃ－脂質の事後添加）によって調製され、これには、インキュベーション期間後に、事前に形成されたＬＮＰへのＧａｌＮＡｃ－脂質の添加、その後の緩衝液交換を含む。伝統的に使用されている事後添加プロセスは、図９のプロセス１として示されている。
[0530]ＧａｌＮＡｃ－脂質などの受容体ターゲティングコンジュゲートを事前に形成されたＬＮＰに事後添加する従来のプロセスは、ナノ粒子を調製するのに有効であるが、本明細書に記載の革新的なプロセスは（例えば、ＧａｌＮＡｃ－脂質をＬＮＰ賦形剤に添加することによって、分割添加によって、または第３のチャネル／ポートを介してインライン混合チャンバにＧａｌＮＡｃ－脂質を連続的に導入することによって）、ＧａｌＮＡｃ－脂質の事後添加または挿入後の重要な利点を提供する。上記の利点としては、限定するものではないが、脂質ナノ粒子全体にわたるＧａｌＮＡｃ－脂質のより均一な分布、ならびにＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの挿入後および下流のプロセシングに対するより優れたプロセス制御が挙げられる。例えば、場合によっては、ＬＮＰ賦形剤へのＧａｌＮＡｃ－脂質の添加を含むプロセスによって調製された脂質ナノ粒子は、ＧａｌＮＡｃ－脂質の事後添加によって調製された対応する脂質ナノ粒子よりも、粒子の均一性が優れている、および／または編集効率が優れている。場合によっては、ＧａｌＮＡｃ－脂質の分割添加を含むプロセスによって調製された脂質ナノ粒子は、ＧａｌＮＡｃ－脂質の事後添加によって調製された対応する脂質ナノ粒子よりも粒子の均一性が高く、および／または編集効率が優れている。同様に、インライン混合チャンバへのＧａｌＮＡｃ－脂質の連続した３番目のポート挿入は、ＧａｌＮＡｃ－脂質の挿入後によって調製された対応する相当する脂質ナノ粒子よりも優れた粒子均一性および／または優れた編集効率をもたらした。
[0531]本開示では、本明細書に記載のナノ粒子を含む製剤を作製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに／または（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲート、を含む。したがって、一態様では、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子を含む製剤を作製する方法が本明細書で記載される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートはＧａｌＮＡｃ－脂質である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、表４の化合物から選択される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、表４の化合物１００４である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、表４の化合物１０５３、１０１４、１０４３、１００２、１０４４、１００４、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、表４の化合物である。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、式（Ｉ）、式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）、式（ＩＩＩｃ）、式（ＩＩＩｄ）、式（ＩＩＩｅ）、式（ＩＶ）、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩｂ）の構造を含む。
[0532]脂質ナノ粒子を作製するためのプロセスは、以下のいくつかの一般的なステップ：（ｉ）第１のリザーバーに１つまたは複数の核酸分子実体を含む、クエン酸塩またはリン酸塩緩衝液などの水溶液を用意するステップと；（ｉｉ）１つまたは複数の脂質およびアルコール（例えば、エタノール）などの有機溶媒を含む第２の溶液を第２のリザーバーに用意するステップと；（ｉｉｉ）水溶液を第２の溶液と混合するステップとを含んでもよい。第１のリザーバーは、任意選択で、第２のリザーバーと流体連通している。
[0533]このプロセスは、１つまたは複数の希釈ステップ、１つまたは複数のインキュベーションステップ、１つまたは複数の緩衝液交換ステップ、１つまたは複数の濃縮ステップ、および／または１つまたは複数の濾過ステップを任意選択で含んでもよい。いくつかの実施形態では、希釈ステップは、希釈緩衝液を添加するステップによる希釈を含む。いくつかの実施形態では、希釈ステップは、例えば、ポンピング装置（例えば、蠕動ポンプ）を使用して、水性緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液または純水）での希釈を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液はアルコールなどの有機溶液である。希釈ステップは、初期容積の１～２０倍、またはその間の任意の数もしくは範囲である希釈を含んでもよい。いくつかの実施形態では、希釈ステップは、初期容量の１～１０倍の希釈を含む。いくつかの実施形態では、希釈ステップの後に、緩衝液交換ステップまたはインキュベーションステップが続く。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、アミノ脂質、ＧａｌＮＡｃ－脂質、またはそれらの組合せなどの１つまたは複数の脂質を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液はステルス脂質を含む。いくつかの実施形態では、ステルス脂質は、希釈緩衝液中に０．０１ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％で存在する。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液はＧａｌＮＡｃ－脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、０．０１ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、またはその間の任意の数もしくは範囲で希釈緩衝液中に存在する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子中に存在するＧａｌＮＡｃ－脂質の一部は、希釈緩衝液を通して導入される。
[0534]インキュベーションステップは、混合ステップ由来の溶液を容器内でほぼ室温で、任意選択で光から保護して約０～約１００時間静置させるステップを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、０～２４時間、１分～２時間、または１分～６０分にわたって実行される。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、１分～１２０分まで実行される。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップの後に緩衝液交換ステップが続く。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップが緩衝液交換ステップに続く。
[0535]いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、より高濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液をもたらす溶媒交換を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、有機溶媒の全部または一部を除去するステップを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、適切な膜（例えば、１０，０００ｍｗｃの蛇皮膜）を通した透析を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、接線流濾過（ＴＦＦ）などの濾過を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、例えばＰＤ１０カラムなどの脱塩カラムを使用するクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは限外濾過を含む。限外濾過は、希釈溶液の濃縮とそれに続くダイアフィルトレーションを含み、これには、例えば、適切な限外濾過膜（例えば、ＧＥ中空繊維カートリッジまたは同等物）と組み合わせて、適切なポンピングシステム（例えば、蠕動ポンプまたはその同等物などのポンピング装置）を使用する。
[0536]いくつかの実施形態において、混合ステップは透明な単相を提供する。いくつかの実施形態では、混合ステップの後、有機溶媒を除去して粒子の懸濁液を提供し、ここでは１つまたは複数の核酸分子実体が脂質によってカプセル化される。有機溶媒の選択には、通常、溶媒の極性と、粒子形成の後の段階で溶媒を容易に除去できることを考慮する。可溶化剤として役立ち得る有機溶媒は、１つまたは複数の核酸分子実体および脂質の透明な単相混合物を提供するのに十分な量であり得る。有機溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノール、および他の脂肪族アルコール（例えば、Ｃ１～Ｃ８）、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、イソ－ブタノール、ペンタノール、およびヘキサノールのうち１つまたは複数（例えば、２つ）から選択され得る。有機溶媒を除去するために使用される方法は、減圧下でのダイアフィルトレーションもしくは透析もしくはエバポレーション、または混合物全体への不活性ガス流（例えば、窒素またはアルゴン）の吹き込みを含んでもよい。
[0537]他の実施形態では、方法は、本組成物を使用して細胞の形質転換を達成するのに有用な非脂質ポリカチオンを添加するステップをさらに含む。適切な非脂質ポリカチオンの例としては、限定するものではないが、ヘキサジメトリンブロマイド（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡから商品名ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）で販売）またはヘキサジメトリンの他の塩が挙げられる。他の適切なポリカチオンとしては、例えば、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンの塩が挙げられる。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子の形成は、単相系（例えば、ブライ・ダイアー単相または水性溶媒と有機溶媒との同様の混合物）または適切に混合した二相系のいずれで行ってもよい。
[0538]脂質ナノ粒子は、単相系で形成しても、または二相系で形成してもよい。いくつかの実施形態では、単相系において、アミノ脂質および１つまたは複数の核酸分子実体は、ある容積の単相混合物にそれぞれ溶解される。２つの溶液を組み合わせると、複合体が形成される単一の混合物が得られる。いくつかの実施形態では、二相系において、アミノ脂質は、（水相に存在する）１つまたは複数の核酸分子実体に結合し、したがって有機相への溶解度を増加させる。
[0539]いくつかの実施形態では、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、およびアミノ脂質の溶液は、有機溶媒を含む溶液である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－脂質の溶液は、エタノールなどの有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、ステルス脂質は水溶液で調製される。いくつかの実施形態では、ステルス脂質は有機溶液中で調製される。１つまたは複数の核酸分子実体を、１つまたは複数の脂質を含む有機溶液と接触させるステップは、１つまたは複数の核酸分子実体の第１の溶液と脂質の第２の溶液とを一緒に混合することによって達成され得る。
[0540]いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、水溶液を保持するための第１のリザーバーおよび有機脂質溶液を保持するための第２のリザーバーを含む装置で調製される。いくつかの実施形態では、装置は、水溶液（１つまたは複数の核酸分子実体の一部など）および／または有機溶液（ＧａｌＮＡｃ－脂質の全部または一部など）を保持するための追加のリザーバーを備える。この装置は、水性および有機脂質溶液を混合領域または混合チャンバに実質的に等しい流速でポンピングするように構成されたポンプ機構を備えてもよい。いくつかの実施形態では、混合領域または混合チャンバは、Ｔカップリングまたはその等価物を備え、これによって、水性および有機流体の流れが、Ｔコネクタへの入力として結合し、得られた結合された水性および有機溶液がＴコネクタから出て、収集リザーバーまたはその等価物に入ることを可能にする。
[0541]一態様では、ナノ粒子を含む製剤を調製する方法が本明細書に記載されており、ナノ粒子は、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲート、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）１つまたは複数の核酸分子実体のうちの少なくとも１つを含む第１の溶液を用意するステップと；（ｂ）１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；（ｃ）第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；（ｄ）受容体ターゲティングコンジュゲートを１つまたは複数の脂質と組み合わせるステップと；（ｅ）任意選択でインキュベーションステップを実行するステップと；（ｆ）任意選択で緩衝液交換ステップを実行するステップとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；（ｂ）１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；（ｃ）第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；（ｄ）受容体ターゲティングコンジュゲートを１つまたは複数の脂質と組み合わせるステップと；（ｅ）ナノ粒子をインキュベートするステップと；（ｆ）任意選択で緩衝液交換ステップを実行するステップとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；（ｂ）１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；（ｃ）第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；（ｄ）受容体ターゲティングコンジュゲートを１つまたは複数の脂質と組み合わせるステップであって、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部が、混合ステップの前または混合ステップと同時に、１つまたは複数の脂質と組み合わされるステップと；（ｅ）任意選択でナノ粒子をインキュベートするステップと；（ｆ）任意選択で緩衝液交換ステップを実行するステップと；を含む。
[0542]いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、混合ステップ後に１つまたは複数の脂質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、混合ステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、混合ステップと同時に１つまたは複数の脂質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部は、混合ステップと同時に１つまたは複数の脂質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部は、混合ステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、第２の溶液中の１つまたは複数の脂質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、インキュベーションステップ後に脂質ナノ粒子の他の構成要素と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、濃縮ステップ後に脂質ナノ粒子の他の構成要素と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、ナノ粒子を凍結融解した後、脂質ナノ粒子の他の構成要素と組み合わされる。
[0543]本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートは、１つまたは複数の核酸分子実体が、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質と混合された後、脂質ナノ粒子の他の構成要素と部分的または完全に組み合わされ得る。図１０～１１は、６つの例示的なプロトコール（プロトコール１～６）を示している。いくつかの実施形態では、核酸分子実体がステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、および／またはアミノ脂質と混合された後に、受容体ターゲティングコンジュゲートが導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートを希釈緩衝液に添加する。希釈緩衝液は、インライン混合チャンバから出てくる事前に形成された核酸－脂質ナノ粒子と混合されてもよく、それによりナノ粒子が形成される。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は、ステルス脂質などの脂質の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物中の全ての受容体ターゲティングコンジュゲートが希釈緩衝液に導入される。いくつかの実施形態では、混合物に希釈緩衝液を添加し、希釈混合物を一定期間保持した後、受容体ターゲティングコンジュゲートを脂質ナノ粒子に導入する。いくつかの実施形態では、保持時間は１～１２０分の間である。いくつかの実施形態では、保持時間は、１～９０分の間、１～６０分の間、または１０～４０分の間である。いくつかの実施形態では、保持時間は、約２５～３５分、約２０～４０分、約１０～５０分、または約５～６０分である。いくつかの実施形態では、保持時間は、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、または約５０分である。いくつかの実施形態では、保持時間は約３０分である。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、緩衝液交換後にナノ粒子に導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、緩衝液交換の直後にナノ粒子に導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、緩衝液交換および濃縮の後で、ただし保存前にナノ粒子に導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、緩衝液交換の後で、ただし濃縮および保存の前にナノ粒子に導入される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、保存および解凍後、かつ投薬または評価の前にナノ粒子に導入される。
[0544]本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートは、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質と部分的または完全に事前に混合されてもよく、それにより、プレミックスの他の成分と同時にナノ粒子に導入される（すなわち、ＧａｌＮＡｃ－脂質のＬＮＰ賦形剤への添加）。図１２～１３は、ＬＮＰ賦形剤へのＧａｌＮＡｃ－脂質添加の５つの例示的なプロトコール（プロトコール７～１１）を示す。ＬＮＰ賦形剤へのＧａｌＮＡｃ－脂質添加のさらなる例示的プロトコールは、図９のプロセス４として示されている。
[0545]本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートは、インライン混合によって脂質ナノ粒子の他の成分と部分的または完全に組み合わされ得る。例えば、１つまたは複数の核酸分子実体を、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質と混合した後、受容体ターゲティングコンジュゲートを、第３のチャネルまたはポートを通じるインライン混合を介して連続的に添加してもよい。連続するインライン混合により、受容体ターゲティングコンジュゲートとナノ粒子中の残りの成分との瞬間的な混合が可能になり、それにより標的ナノ粒子が形成される。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートの全部または一部を、交差混合によって他の構成要素と組み合わせる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートの全部または一部を、Ｔ型ミキサーを介して他の構成要素と組み合わせる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートの全部または一部を、マイクロフルイディクスミキサーを通じて他の構成要素と組み合わせる。図１４は、インライン混合によるＧａｌＮＡｃ－脂質添加の２つの例示的なプロトコール（プロトコール１２～１３）を示す。さらなる例示的なプロトコールは、図９にプロセス３として示されている。
[0546]本明細書に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートは、２つ以上の別個の独立した添加（すなわち、ＧａｌＮＡｃ－脂質の分割添加）によって脂質ナノ粒子の他の構成要素と組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の別個の添加は、異なるステップで実行される。いくつかの実施形態では、２つ以上の別々の添加が同時に行われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の別個の添加は、異なる溶液を含む。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部は、第２の溶液中の１つまたは複数の脂質と組み合わされ、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部は、混合後に１つまたは複数の脂質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部は、第２の溶液中の１つまたは複数の脂質と組み合わされ、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部は、インキュベーションステップ後に１つまたは複数の脂質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部は、第２の溶液中の１つまたは複数の脂質と組み合わされ、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部は、緩衝液交換ステップ後に１つまたは複数の脂質と組み合わされる。図１２～１３は、ＧａｌＮＡｃ－脂質の分割添加の５つの例示的なプロトコール（プロトコール７～１１）を示している。ＧａｌＮＡｃ－脂質の分割添加のさらなる例示的プロトコールを図１４に示す。同様に、ＬＮＰの他の構成要素は分割添加によって導入され得る。例えば、図１４のプロトコール１３に示されるように、１つまたは複数の核酸分子実体は、２つの別個の緩衝溶液に導入され得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸分子実体は、２から４の溶液に導入される。いくつかの実施形態では、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、および／またはアミノ脂質は、１～３溶液中のＬＮＰに独立して導入され、これは同時にまたは異なる時間に生じ得る。
[0547]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子を含む製剤を作製する方法は、希釈緩衝液を添加することにより、第１および第２の溶液を混合することによって生成された混合物を希釈するステップを含む。いくつかの実施形態では、この混合物はインラインで希釈される。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は、ステルス脂質の少なくとも一部を含む。
[0548]いくつかの実施形態では、第１の溶液は水性緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、第１の溶液は有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、第１の溶液は、有機溶媒と混合された水性緩衝液の混合物を含む。いくつかの実施形態では、水性緩衝液中に存在する有機溶媒は、エタノールである。いくつかの実施形態では、水性緩衝液中のエタノールのパーセンテージは、０．１％～５０％の範囲、またはその間の任意の数もしくは範囲である。いくつかの実施形態では、第２の溶液は、有機溶媒と混合された水性緩衝液の混合物を含む。いくつかの実施形態では、第２の溶液はエタノールを含む。いくつかの実施形態では、第２の溶液はエタノールおよび水を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は水性緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液はエタノールおよび水を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は、ＰＢＳ緩衝液中に１０％～２０％のエタノールを含む。
[0549]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－脂質などの受容体ターゲティングコンジュゲートが溶液としてナノ粒子に導入される。いくつかの実施形態では、溶液中の受容体ターゲティングコンジュゲートの濃度は、約０．１ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％、またはその間の任意の数もしくは範囲である。いくつかの実施形態では、溶液中の受容体ターゲティングコンジュゲートの濃度は、約１０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約０．２５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．２５ｍｏｌ％～約１ｍｏｌ％、約０．２５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、または約０．１ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態では、溶液中の受容体ターゲティングコンジュゲートの濃度は、約０．２５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％、または約２ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態では、溶液中の受容体ターゲティングコンジュゲートの濃度は、約０．２５ｍｏｌ％である。
[0550]いくつかの実施形態では、混合は、層流混合、ボルテックス混合、乱流混合、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、混合は交差混合を含む。いくつかの実施形態では、混合はインライン混合を含む。いくつかの実施形態では、混合は、第１の溶液の少なくとも一部を第１の入口チャネルを通して導入し、第２の溶液の少なくとも一部を第２の入口チャネルを通して導入するステップを含み、第１の入口チャネルと第２の入口チャネルとの間の角度は、約０～１８０度である。いくつかの実施形態では、第１の入口チャネルと第２の入口チャネルとの間の角度は、約１５～１８０度、約３０～１８０度、約４５～１８０度、約６０～１８０度、約９０～１８０度またはその間の任意の数値もしくは範囲である。いくつかの実施形態では、混合は、第３の入口チャネルを通して第１の溶液の一部を導入するステップを含む。この混合ステップは、例えばボルテックスミキサーなどの機械的手段など、任意のいくつかの方法で行ってもよい。いくつかの実施形態では、混合ステップはインライン混合を含む。例示的な混合プロセスは、図９～１４に示されている。いくつかの実施形態では、混合ステップは、図１４に示されるように、ＧａｌＮＡｃ－脂質を交差混合するステップを含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングコンジュゲートを含む溶液は、第３の入口を通してインライン混合チャンバに導入される。
[0551]いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子を含む製剤を作製する方法は、濾過ステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子を含む製剤を作製する方法は、緩衝液交換を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換は、透析、クロマトグラフィー、または接線流濾過（ＴＦＦ）を含む。
[0552]脂質混合法
[0553]本明細書に記載される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法は、ナノ粒子から構成されることができ、ナノ粒子は、１つまたは複数の核酸活性剤、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、アミノ脂質、およびＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートから選択される１つまたは複数の脂質賦形剤を含むことができる。脂質ナノ粒子を作製する方法は、いくつかのステップを含むことができる。
[0553]本明細書に記載される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法は、ナノ粒子から構成されることができ、ナノ粒子は、１つまたは複数の核酸活性剤、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、アミノ脂質、およびＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートから選択される１つまたは複数の脂質賦形剤を含むことができる。脂質ナノ粒子を作製する方法は、いくつかのステップを含むことができる。
[0554]いくつかの実施形態では、水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液が提供される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸活性剤はＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の溶液は水性緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、第１の溶液は有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、第１の溶液は、有機溶媒と混合された水性緩衝液の混合物を含む。いくつかの実施形態では、水性緩衝液中に存在する有機溶媒はエタノールである。いくつかの実施形態では、水性緩衝液中のエタノールのパーセンテージは、０．１％～５０％の範囲、またはその間の任意の数もしくは範囲である。有機溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノール、ならびにエタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、イソ－ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノールなどのその他の脂肪族アルコール（例えば、Ｃ１～Ｃ８）のうちの１つまたは複数（例えば、２つ）から選択され得る。
[0555]いくつかの実施形態では、（ｉ）１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つ、および（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液が提供される。いくつかの実施形態では、第２の溶液は、有機溶媒と混合された水性緩衝液の混合物を含む。いくつかの実施形態では、第２の溶液はエタノールを含む。いくつかの実施形態では、第２の溶液はエタノールおよび水を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は水性緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、第２の溶液は、溶液中に少なくとも０ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含み得る。いくつかの実施形態では、第２の溶液は、溶液中に少なくとも０．１ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％、０．４ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％、０．６ｍｏｌ％、０．７ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、０．９ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートを含み得る。いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも０％は、混合ステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、少なくとも０．１ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％、０．４ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％、０．６ｍｏｌ％、０．７ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、０．９ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％の受容体ターゲティングコンジュゲートは、混合ステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わせられる。
[0556]いくつかの実施形態では、中性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり得る。いくつかの実施形態では、中性脂質は、溶液中に少なくとも０．１ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％、０．４ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％、０．６ｍｏｌ％、０．７ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、０．９ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、または５０ｍｏｌ％を構成することができる。
[0557]いくつかの実施形態では、ステルス脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質であり得る。例示的なＰＥＧ－脂質としては、限定するものではないが、表２の脂質が挙げられる。例示的なＰＥＧ－脂質としては、限定するものではないが、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびそれらの混合物が挙げられる。例えば、１つまたは複数のＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質、またはそれらの組合せを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの任意選択で置換された直鎖状または分枝状ポリマーである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、例えば、１つまたは複数のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシ、またはアリール基によって置換される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ－ポリウレタンまたはＰＥＧ－ポリプロピレンなどのＰＥＧコポリマーを含む（例えば、ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９２）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧコポリマーを含まず、例えば、ＰＥＧモノポリマーであってもよい。例示的なＰＥＧ－脂質としては、限定するものではないが、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール、およびＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約２．０ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、ステルス脂質またはＰＥＧ－脂質は、ＬＮＰ組成物中に存在する総脂質のうち約１ｍｏｌ％、約１．１ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％、約１．６ｍｏｌ％、約１．７ｍｏｌ％、約１．８ｍｏｌ％、約１．９ｍｏｌ％、約２．０ｍｏｌ％、約２．１ｍｏｌ％、約２．２ｍｏｌ％、約２．３ｍｏｌ％、約２．４ｍｏｌ％、約２．５ｍｏｌ％、約２．６ｍｏｌ％、約２．７ｍｏｌ％、約２．８ｍｏｌ％、約２．９ｍｏｌ％、３．０ｍｏｌ％、３．５ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、４．５ｍｏｌ％、５．０ｍｏｌ％、５．５ｍｏｌ％、または約６ｍｏｌ％を構成する。
[0558]いくつかの実施形態では、核酸薬剤濃度は、溶液１ｍＬあたり約０ミリグラム、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．１ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、５．５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、または前述の値のうちのいずれか２つの間の範囲（包括的）である。
[0559]いくつかの実施形態では、抗酸化剤は、第１の溶液と組み合わされる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、親水性抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびクエン酸塩などのキレート剤である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は親油性抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、親油性抗酸化剤は、ビタミンＥ異性体またはポリフェノールを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、または少なくとも１００ｍＭの濃度でＬＮＰ組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、約２０ｍＭの濃度でＬＮＰ組成物中に存在する。
[0560]いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰ製剤は、水性緩衝液のクエン酸緩衝液成分に対して重量で０～１０％（例えば、０～１％、０～２％、０～３％、０．５％～１％、０～７％、または０～１０％）の範囲のポリエチレングリコール（例えば、約２００、４００、５００、６００、または１０００の範囲の平均分子量を有するポリエチレングリコール）の添加をさらに含むように製剤化され得る。ポリエチレングリコールの添加は、加工助剤として機能することができ、製剤化されたＬＮＰの長期安定性を向上させることができる。
[0561]いくつかの実施形態では、混合ステップは、前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合することを含む。いくつかの実施形態では、混合ステップは、インラインミキサー、クロスミキサー、またはＴミキサー装置で行われる。いくつかの実施形態では、混合ステップは、層流混合、ボルテックス混合、乱流混合、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、混合ステップは、第１の溶液を第１の混合チャンバに別々に導入することができる第１のポートと、前記第２の溶液を第１の混合チャンバに別々におよび同時に導入することができる第２のポートとを備える第１の混合チャンバを有するインライン混合装置によって行われる。
[0562]いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、混合ステップ由来の溶液を容器内でほぼ室温で、任意選択で光から保護して約０～１００時間で静置させることを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、０～２４時間、１分～２時間、または１分～６０分にわたって実行される。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、１分～１２０分まで実行される。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップの後に緩衝液交換ステップが続く。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、摂氏約０度（℃）、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、または１００℃で行われる。いくつかの実施形態では、第２のインキュベーションステップが緩衝液交換ステップに続く。
[0563]いくつかの実施形態では、濃縮ステップは、脂質ナノ粒子を膜に通過させることを含む。いくつかの実施形態では、濃縮ステップは、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用することを含む。
[0564]いくつかの実施形態では、希釈するステップは、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを溶液中で１回または複数回希釈することを含む。いくつかの実施形態では、希釈するステップは、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回行われる。いくつかの実施形態では、希釈するステップは行われない。
[0565]いくつかの実施形態では、溶媒を緩衝溶液と交換することを含む緩衝液交換ステップは、１回または複数回行われる。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回行われる。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは行われない。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、より高濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液をもたらす溶媒交換を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、有機溶媒の全部または一部を除去するステップを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、適切な膜（例えば、１０，０００ｍｗｃの蛇皮膜）を通した透析を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、接線流濾過（ＴＦＦ）などの濾過を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、例えばＰＤ１０カラムなどの脱塩カラムを使用するクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは限外濾過を含む。限外濾過は、希釈溶液の濃縮とそれに続くダイアフィルトレーションを含み、これには、例えば、適切な限外濾過膜（例えば、ＧＥ中空繊維カートリッジまたは同等物）と組み合わせて、適切なポンピングシステム（例えば、蠕動ポンプまたはその同等物などのポンピング装置）を使用する。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、ポリエーテルスルホン膜を通した濾過を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液はＴｒｉｓ緩衝液である。
[0566]いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子を含む溶液のｐＨは、約６、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．７、７．８、８、または先行する値のいずれか２つの範囲によって定義される任意のｐＨに調整され得る。
[0567]いくつかの実施形態では、凍結するステップは、脂質ナノ粒子を、約－１００℃、－９０℃、－８０℃、－５０℃、－３０℃、－２０℃、－１０℃、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃の温度に冷却することを含み得る。
[0568]いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）保存された脂質ナノ粒子を解凍するステップと、（ｉｉ）脂質ナノ粒子をプールするステップと、（ｉｉｉ）脂質ナノ粒子を溶液中で希釈するステップと、（ｉｖ）対象に脂質ナノ粒子の用量を投与する前に、膜を通して脂質ナノ粒子を濾過するステップとを含み得る。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を実行する順序は逆にされ得る。
[0569]いくつかの実施形態では、受容体ターゲティングコンジュゲートは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートは、表４に示される構造から選択される。
[0570]いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液は凍結保護剤を含み得る。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、スクロースまたは当該技術分野で公知の任意の他の凍結保護剤である。いくつかの実施形態では、最終溶液中の凍結保護剤の濃度は、約０．１ｍＭ～約５００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、凍結保護剤の濃度は、約１００ｍＭ～約４００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、凍結保護剤の濃度は、約２００ｍＭ～約３００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、凍結保護剤の濃度は、約３００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、凍結保護剤の濃度は、０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、凍結保護剤の濃度は、少なくとも５００ｍＭであり得る。
[0571]いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ナノ粒子にわたって脂質の均一な分布を有し得る。いくつかの実施形態では、分布は不規則であり得る。いくつかの実施形態では、分布はパターン化され得る。いくつかの実施形態では、分布は、ナノ粒子表面上の領域の少なくとも一部において均一であり得る。
[0572]いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも０．１ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、１．５ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、２．５ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、または１０ｍｏｌ％の濃度でナノ粒子の表面上に脂質を含み得る。
[0573]いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、細胞から遺伝子を編集することができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、遺伝子の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、または先行する値のいずれか２つによって提供されるパーセンテージの任意の範囲を編集するのを補助することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子はＰＣＳＫ９であり得る。
[0574]いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、または３００％高い編集パーセントによって決定されるとおり、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供することができる。
[0575]いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、または３００％高い編集パーセントによって決定されるとおり、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供することができる。
[0576]いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の用量は対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の用量は、脂質ナノ粒子の用量を投与していない対象と比較して、血液中の検出レベルＬＤＬまたはＬＤＬ－ｃを少なくとも５０％増加させる。いくつかの実施形態では、血液中で検出されるＬＤＬまたはＬＤＬ－ｃのレベルは、少なくとも１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％増加する。
[0577]いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、アデニンベースエディター（ＡＢＥ）ｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡまたはＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＢＥ ｍＲＮＡ、ＵＴＲ、およびｇＲＮＡのうちの１つまたは複数は、脂質ナノ粒子内で組み合わせられ得る。
薬学的組成物
[0578]一態様では、本明細書に開示されるのは、１つまたは複数の記載されたＬＮＰ組成物を含む薬学的組成物である。例えば、薬学的組成物は、１つまたは複数の異なるペイロードを含む１つまたは複数のＬＮＰ組成物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、同じであってもまたは異なってもよい、２つ以上のＬＮＰ組成物を含む。
[0578]一態様では、本明細書に開示されるのは、１つまたは複数の記載されたＬＮＰ組成物を含む薬学的組成物である。例えば、薬学的組成物は、１つまたは複数の異なるペイロードを含む１つまたは複数のＬＮＰ組成物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、同じであってもまたは異なってもよい、２つ以上のＬＮＰ組成物を含む。
[0579]一態様では、本明細書に開示されるのは、１つまたは複数の記載の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、同じであっても異なってもよい、２つ以上の受容体ターゲティングコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、（ｉ）第１の受容体ターゲティングコンジュゲートまたは第１のナノ粒子組成物と、（ｉｉ）第２の受容体ターゲティングコンジュゲートまたは第２のナノ粒子組成物と、を含む薬学的組成物である。
[0580]薬学的組成物は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、または補助成分をさらに含んでもよい。薬学的組成物および薬剤の製剤化および製造に関する一般的なガイドラインは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．、２００６から入手可能である。賦形剤または担体は、本開示の化合物、他の脂質成分およびペイロード以外の任意の成分を含んでもよい。賦形剤は、製剤に機能的（例えば、薬物放出速度制御）および／または非機能的（例えば、加工助剤または希釈剤）の特性のいずれかを付与し得る。賦形剤および担体の選択は、特定の投与様式、溶解性および安定性に対する賦形剤の効果、ならびに剤形の性質などの要因に依存し得る。非経口製剤は、典型的には、水性または油性の溶液または懸濁液である。糖（グルコース、マンニトール、ソルビトールなどを含むがこれらに限定されない）、塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくはｐＨ３～９まで）などの賦形剤または担体を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、無菌非水溶液と、または無菌パイロジェンフリー水（ＷＦＩ）などの適切なビヒクルと組み合わせて使用される乾燥形態として製剤化されてもよい。
[0581]いくつかの実施形態では、賦形剤または担体は、ナノ粒子組成物を含む薬学的組成物の総質量または容積の５０％超を構成し得る。例えば、賦形剤または担体は、薬学的組成物の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上を構成し得る。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤または担体は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、０．１％～１００％（重量／重量）の間の１つまたは複数のナノ粒子組成物を含んでもよい。特定の実施形態では、このナノ粒子組成物および／または薬学的組成物は、保管および／または輸送のために冷蔵または冷凍される（例えば、約－１５０℃～約０℃、または約－８０℃～約－２０℃の温度など、４℃以下の温度で保管される）。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物および／または薬学的組成物は、約－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃、または－１５０℃で冷蔵または冷凍される。
[0582]記載されたＬＮＰ組成物および／または薬学的組成物は、１つまたは複数の特定の細胞、組織、器官もしくは系またはそれらの群へのペイロードの送達によって提供される治療効果から利益を得る可能性のある患者または対象を含む、任意の患者または対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む、ヒト以外の霊長類または哺乳動物である。
[0583]１つまたは複数のナノ粒子組成物を含む薬学的組成物は、薬理学の分野で公知であるか、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法としては、有効成分を賦形剤および／または１つまたは複数の他の補助成分と組み合わせ、その後、所望または必要に応じて、その生成物を所望の単一またはマルチ剤形に分割、成形、および／または包装するステップを含む。
[0584]本開示による薬学的組成物は、単一単位用量として、および／または複数の単一単位用量として、バルクで調製、包装、および／または販売してもよい。本明細書で使用される場合、「単位用量」とは、所定量の有効成分（例えば、ナノ粒子組成物）を含む薬学的組成物の個別の量である。有効成分の量は、一般に、対象に投与される有効成分の投与量および／またはそのような投与量の都合のよい割合、例えば、そのような投与量の半分または３分の１に等しい。薬学的組成物は、様々な投与経路および方法に適した様々な形態で調製され得る。例えば、薬学的組成物は、液体剤形（例えば、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル）、注射可能な剤形、固体剤形（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤）、局所および／または経皮投与のための剤形（例えば、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、およびパッチ）、懸濁液、粉末、および他の形態で調製され得る。
[0585]いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のペイロードを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡなどの２つの別個のペイロードを含む。ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡは、同じＬＮＰ組成物に配置されてもよく、別々のＬＮＰ組成物に配置されてもよい。例えば、薬学的組成物は、一方がガイドＲＮＡペイロードを含み、他方がｍＲＮＡペイロードを含む、２つの別個のＬＮＰ組成物を含んでもよい。別の例では、薬学的組成物は、一方はガイドＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）ペイロードを含み、他方はｍＲＮＡペイロードおよびガイドＲＮＡペイロードの両方を含む、２つの別個のＬＮＰ組成物を含んでもよい。さらに別の例では、薬学的組成物は、ｍＲＮＡペイロードおよびガイドＲＮＡペイロードを含む１つのＬＮＰ組成物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２つ以上の別個のＬＮＰ組成物を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の別個のＬＮＰ組成物は、ｍＲＮＡ分子およびガイドＲＮＡ分子が本明細書に記載のモルまたは重量比になるように薬学的組成物中に存在する。
[0586]ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡペイロードは、様々なモル比または重量比で薬学的組成物中に存在し得る。例えば、薬学的組成物中のｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は、重量で０．０１～１００、および／またはその間の任意の値であり得る。例えば、薬学的組成物中のｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は、モルで０．０１～１００、および／またはその間の任意の値であり得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は、重量またはモルで約１～約５０、および／またはその間の任意の値である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は、重量またはモルで約０．１～約１０、および／またはその間の任意の値である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は、重量で約０．２～約５、約０．２５～約４、約０．３～約３、または約０．５～約２である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は、モルで約０．２～約５、約０．２５～約４、約０．３～約３、または約０．５～約２である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は、重量で約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は、モルで、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｍＲＮＡとｇＲＮＡの比は、重量で約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｍＲＮＡとｇＲＮＡの比は、モルで、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｇＲＮＡ対とｍＲＮＡの比は、重量で約１：１である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は、モルで約１：１である。
[0587]いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のｇＲＮＡは、肝細胞で生じた病原遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２つ以上のガイドＲＮＡを含む。例えば、薬学的組成物は、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の別個のガイドＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２つのガイドＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１つのｍＲＮＡおよび２つ以上のガイドＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡ分子は、同じ病原遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡ分子は、異なる遺伝子を標的とする。いくつかの特定の実施形態では、２つのガイドＲＮＡ分子は、肝細胞で生じた目的の２つの別個の病原遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡである。
[0588]本明細書に開示されるＬＮＰ組成物および薬学的組成物は、インビボおよびインビトロの両方で、遺伝子編集のための方法で使用され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞を本明細書に記載のＬＮＰ組成物または薬学的組成物と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はげっ歯類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は肝臓細胞である。特定の実施形態では、細胞はヒト肝臓細胞である。いくつかの実施形態では、肝臓細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態では、肝細胞はヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、肝臓細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞は肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）である。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞はクッパー細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞は肝星細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞は腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞は、肝幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡｐｏＥ結合受容体を含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞が提供され、例えば、操作された細胞は、本明細書に記載の細胞型のいずれか１つに由来し得る。このような操作された細胞は、本明細書に記載の方法に従って作製され得る。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、組織または器官、例えば対象内の肝臓内に存在する。
標的配列
[0589]本開示は、ゲノム編集組成物などの活性剤または治療剤、ならびにその標的送達のための方法および組成物を提供する。本明細書に記載の治療剤は、標的核酸分子上の標的配列を修飾、変更、または切断することを目的とするゲノム編集組成物を含んでもよい。例えば、活性剤は、標的配列に修飾をもたらし得る核酸または核酸－タンパク質複合体を含んでもよい。
[0589]本開示は、ゲノム編集組成物などの活性剤または治療剤、ならびにその標的送達のための方法および組成物を提供する。本明細書に記載の治療剤は、標的核酸分子上の標的配列を修飾、変更、または切断することを目的とするゲノム編集組成物を含んでもよい。例えば、活性剤は、標的配列に修飾をもたらし得る核酸または核酸－タンパク質複合体を含んでもよい。
[0590]標的配列は、ＤＮＡ配列であっても、またはＲＮＡ配列であってもよい。いくつかの実施形態では、活性剤または治療剤は、ＲＮＡ干渉因子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、活性剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡまたはアンチミール、スーパーミール、アンタゴミール、リボザイム、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化因子、またはＵｌアダプターを含んでもよい。活性剤は、標的配列を認識し得、標的配列の切断および／または分解を媒介し得る。いくつかの実施形態では、活性剤または治療剤は、ガイドＲＮＡを含んでもよい。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ酵素などの核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼ、または機能ドメインをさらに含むその融合タンパク質と複合体を形成し得る。標的配列は、核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼドメインによって認識され得る。標的配列は、核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼドメインによって切断されてもよく、および／または機能的ドメイン、例えば、デアミナーゼドメイン、メチラーゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、活性化ドメイン、リプレッサードメイン、ヌクレアーゼドメイン、トランスポザーゼドメイン、またはリコンビナーゼドメインによって修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡによって標的核酸分子の標的配列に誘導され得、ここでガイドＲＮＡはハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質が標的配列を切断する。いくつかの実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡのターゲティング配列に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのターゲティング配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの標的配列およびターゲティング配列は、１００％相補的であり得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的配列およびターゲティング配列は、少なくとも１つのミスマッチを含んでもよい。例えば、ガイドＲＮＡの標的配列およびターゲティング配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの標的配列およびターゲティング配列は、１～６個のミスマッチを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの標的配列およびターゲティング配列は、５個または６個のミスマッチを含んでもよい。
[0591]標的配列の長さは、使用されるヌクレアーゼ系に依存し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の標的配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０を超えるヌクレオチド長を含み得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、１８～２４ヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、１９～２１ヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、２０ヌクレオチド長を含んでもよい。ニッカーゼが使用される場合、標的配列は、ＤＮＡ分子の反対側の鎖上の一対のニッカーゼによって認識される一対の標的配列を含んでもよい。
[0592]いくつかの実施形態では、活性剤または治療剤は、メガヌクレアーゼ系を含んでもよい。メガヌクレアーゼの標的配列は、１２～４０またはそれ以上のヌクレオチド長を含んでもよい。ＺＦＮが使用される場合、標的配列は、ＤＮＡ分子の反対側の鎖上の一対のＺＦＮによって認識される２つの半標的配列を含んでもよく、その間に相互連結配列があってもよい。いくつかの実施形態では、ＺＦＮの各半標的配列は、独立して、９、１２、１５、１８、またはそれ以上のヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＺＦＮの相互接続配列は、４～２０ヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＺＦＮの相互接続配列は、５～７ヌクレオチド長を含んでもよい。
[0593]ＴＡＬＥＮが使用される場合、標的配列は、ＤＮＡ分子の反対側の鎖上の一対のＴＡＬＥＮによって認識される２つの半標的配列を同様に含み、その間に相互連結配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮの各半標的配列は、１０～２０以上のヌクレオチド長を独立して含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮの相互接続配列は、４～２０ヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮの相互接続配列は、１２～１９ヌクレオチド長を含んでもよい。
[0594]いくつかの実施形態では、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によって認識される短い配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し得る。プロトスペーサー隣接モチーフ、またはＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の標的結合に不可欠である。通常、ＰＡＭは、ＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡ標的配列の直後にある２～６塩基対のＤＮＡ配列である。ＰＡＭは、５’ＰＡＭであっても、または３’ＰＡＭであってもよい。ＰＡＭの正確な配列は、Ｃａｓタンパク質の種類に依存する。例えば、典型的なＳｐＣａｓ９結合には、カノニカルＰＡＭとしても公知の３’－ＮＧＧ－５’ＰＡＭが必要であり、ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴのいずれかである。特定のアミノ酸置換、例えば、Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、Ｇ１２１８Ｒ、および／またはＴ１３３７Ｒを有するＳｐＣａｓ９は、ＮＧＡ ＰＡＭまたはＮＧＣＧ ＰＡＭを認識し得る。ＳａＣａｓ９結合には、３’－ＮＮＧＲＲＴ－５’ＰＡＭが必要である。特定のアミノ酸置換、例えば、Ｋ７８１Ｅ、Ｋ６９７Ｎ、Ｈ１０１４Ｒを有するＳａＣａｓ９は、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを認識し得る。
[0595]いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、標的配列の３’末端の１、２、３、または４ヌクレオチドに隣接するか、または１、２、３、または４ヌクレオチド内にあり得る。ＰＡＭの長さおよび配列は、使用されるＣａｓ９タンパク質に依存し得る。例えば、ＰＡＭは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、５２０：１８６－１９１（２０１５）の図１に開示されているものを含む、特定のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログのコンセンサスまたは特定のＰＡＭ配列から選択され得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長を含んでもよい。非限定的な例示的なＰＡＭ配列としては、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ、ＮＧ、ＮＡＡＡＡＮ、ＮＮＡＡＡＡＷ、ＮＮＮＮＡＣＡ、ＧＮＮＮＣＮＮＡ、およびＮＮＮＮＧＡＴＴが挙げられる（Ｎは任意のヌクレオチドと定義され、ＷはＡまたはＴと定義される）。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＧＧであってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧＮＧであってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＮＡＡＡＡＷであってもよい。Ｈｕら、Ｅｖｏｌｖｅｄ Ｃａｓ９ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ＰＡＭ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、Ｎａｔｕｒｅ２０１８ ５５６（７６９９）：５７－６３に記載されている追加の進化したＣａｓバリアントおよびＰＡＭ配列は、その全体が本明細書に組み込まれている。
[0596]標的核酸分子は、細胞にとって内因性または外因性の任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。本明細書で使用される「内因性配列」という用語は、細胞に固有の配列を指す。「外因性配列」という用語は、細胞にとって天然ではない配列、または細胞のゲノムにおける天然の位置が異なる位置にある配列を指す。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、細胞由来または細胞内のプラスミド、ゲノムＤＮＡ、または染色体であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸分子の標的配列は、細胞由来または細胞内のゲノム配列であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は原核細胞であり得る。他の実施形態では、細胞は真核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞はげっ歯類細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞はヒト細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞は肝臓細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞は肝細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞は、実質細胞、類洞内皮細胞、貪食クッパー細胞、または星状細胞であり得る。さらなる実施形態では、標的配列はウイルス配列であり得る。さらに他の実施形態では、標的配列は、合成配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、ヒト染色体などの真核生物の染色体上にあり得る。
[0597]いくつかの実施形態では、標的配列は、遺伝子のコード配列、遺伝子のイントロン配列、遺伝子の転写制御配列、遺伝子の翻訳制御配列、または遺伝子間の非コード配列に位置し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子はタンパク質コード遺伝子であり得る。他の実施形態では、遺伝子は非コードＲＮＡ遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、疾患関連遺伝子の全部または一部を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、冠動脈疾患に関連する遺伝子の全部または一部を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、アポリポタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＰＣＳＫ９、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ３、ＬＰＡ、ＡＰＯＢ、ＭＴＰ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ８、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＥ、ＬＤＬＲ、ＩＤＯＬ、ＮＰＣ１Ｌ１、ＡＳＧＲ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＧＡＬＮＴ２、ＧＣＫＲ、ＬＰＬ、ＭＬＸＩＰＬ、ＳＯＲＴ１、ＴＲＩＢ１、ＭＡＲＣ１、ＡＢＣＧ５、およびＡＢＣＧ８から選択される遺伝子の少なくとも一部を含んでもよい。
[0598]いくつかの実施形態では、標的配列を本明細書に記載のゲノム編集組成物と接触させると、標的配列内または標的配列に隣接する塩基編集イベントが生じる。例えば、標的配列内または標的配列に隣接する標的塩基（例えば、Ｃ塩基）は、核酸誘導型ヌクレアーゼドメインおよびデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質を含む、本開示に開示されるゲノム編集組成物との接触の結果として、Ｔ塩基に変換され得る。いくつかの実施形態では、標的塩基は、ＰＡＭの上流（の５’末端）に位置する。いくつかの実施形態では、標的塩基は、ＰＡＭの上流（５’末端）の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基対に位置する。いくつかの実施形態では、標的塩基は、ＰＡＭの上流（５’末端）の１３～１７塩基対内の位置に位置する。いくつかの実施形態では、標的塩基は、ＰＡＭの上流（５’末端）の１３～１７塩基対の外側の位置に位置する。いくつかの実施形態では、標的塩基対は、ＰＡＭの上流（５’末端）の１０～１５塩基対の位置に位置する。いくつかの実施形態では、標的塩基は、ＰＡＭの上流の１１～１２塩基対の位置に位置する。いくつかの実施形態では、標的塩基は、ＰＡＭの１１塩基対上流（５’末端）である。いくつかの実施形態では、標的塩基は、標的配列、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子座）のコード領域（例えばエクソン）に位置する。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子座のコード領域における塩基の変換は、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質配列におけるアミノ酸変化、すなわち変異をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は機能喪失変異である。いくつかの実施形態では、変異は、標的配列のコード領域、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のコード領域に未成熟終止コドンを導入し得る。いくつかの実施形態では、機能喪失変異は、天然に生じる機能喪失変異である。いくつかの実施形態では、変異、例えば、Ｇ１０６Ｒ、Ｌ２５３Ｆ、Ａ４４３Ｔ、Ｒ９３Ｃ、Ｇ２４Ｄ、Ｓ４７Ｆ、Ｒ４６Ｈ、Ｓ１５３Ｎ、またはＨ１９３Ｙ変異は、ＰＣＳＫ９遺伝子のコード領域に位置する。いくつかの実施形態では、機能喪失変異は、未成熟終止コドンをＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のコード領域に導入する。いくつかの実施形態では、機能喪失変異を、ＡＰＯＣ３遺伝子のコード領域に導入し得る（例えば、Ｒ１９Ｘ変異）。いくつかの実施形態では、機能喪失変異を低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）タンパク質に導入し得る。いくつかの実施形態では、ＬＤＬ受容体の誘導性分解因子（ＩＤＯＬ）タンパク質に機能喪失変異を導入し得る。
[0599]いくつかの実施形態では、標的配列は、標的配列の非コード領域、例えば、標的遺伝子のイントロンまたはスプライシング部位に位置する。いくつかの実施形態では、標的配列は、スプライシング部位に位置し、そのような標的塩基の編集は、標的遺伝子ｍＲＮＡの選択的スプライシングを引き起こす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、機能喪失変異をもたらすことにつながる。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、標的ｍＲＮＡにおける未成熟終止コドンまたはフレームシフトの導入をもたらし、切断された、不安定な、または折り畳み欠陥のあるポリペプチドをもたらす。いくつかの実施形態において、終止コドンは、アポリポタンパク質をコードする遺伝子のコード配列中の正常な終止コドンの上流に導入され得る（「未成熟終止コドン」と呼ばれる）。いくつかの実施形態では、終止コドンを標的遺伝子のコード領域に導入してもよい。未成熟終止コドンは未成熟翻訳終結を引き起こし、その結果、切断された非機能的なタンパク質が生じ、ナンセンスを介したｍＲＮＡ減衰経路を介してｍＲＮＡの急速な分解が誘導される。例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ１６（３）：２９３－２９９、２００４；Ｃｈａｎｇら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７６：５１－７４、２００７；およびＢｅｈｍ－Ａｎｓｍａｎｔら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０（４）：３９１－３９８、２００６（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。本明細書に記載のゲノム編集組成物を使用して、複数の編集イベントを標的配列に導入してもよい。例えば、ゲノム編集組成物は、標的遺伝子における二本鎖切断、欠失、挿入、フレームシフト、復帰、または他の変更を誘導する核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼを含んでもよい。例えば、ゲノム編集組成物は、いくつかのアミノ酸を変換して終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）を作り出し得る核酸誘導型プログラム可能ヌクレアーゼ－デアミナーゼ融合タンパク質を含んでもよい。
[0600]いくつかの実施形態では、ＬＤＬ媒介コレステロールクリアランス経路における２つ以上のタンパク質因子への変異の同時導入が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、変異は、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＬＤＬＲ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＥ、ＩＤＯＬ、および他のＬＤＬ媒介経路関与遺伝子のうちの１つまたは複数、好ましくは少なくとも２つに同時に導入され得る。いくつかの実施形態において、機能喪失変異は、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＡＰＯＢ、および別のＬＤＬ媒介経路関与遺伝子の１つまたは複数、好ましくは少なくとも２つに同時に導入され得る。いくつかの実施形態では、変異は、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＬＤＬＲ、およびＩＤＯＬに同時に導入され得る。機能喪失変異を２つ以上のタンパク質に同時に導入するために、複数のガイドヌクレオチド配列が使用される。
[0601]いくつかの実施形態では、標的配列は、足場部位または遺伝子座制御領域など、クロマチン構成の態様を制御するゲノム内の非遺伝子機能部位に位置し得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、遺伝的セーフハーバー部位、すなわち、安全な遺伝子修飾を容易にする遺伝子座であり得る。
テンプレート
[0602]いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子の修復中に、少なくとも１つのテンプレートが基質として提供され得る。いくつかの実施形態では、テンプレートは、例えば、高忠実度相同組換えなどの相同組換えに使用され得る。いくつかの実施形態において、相同組換えは、テンプレート配列の標的核酸分子への組み込みをもたらし得る。いくつかの実施形態では、単一のテンプレートまたは同じテンプレートの複数のコピーが提供され得る。他の実施形態では、相同組換えが２つ以上の標的部位で起こり得るように、２つ以上のテンプレートが提供され得る。例えば、細胞内の単一の遺伝子、または細胞内の２つの異なる遺伝子を修復するために、異なるテンプレートが提供され得る。いくつかの実施形態では、異なるテンプレートが独立したコピー数で提供され得る。
[0602]いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子の修復中に、少なくとも１つのテンプレートが基質として提供され得る。いくつかの実施形態では、テンプレートは、例えば、高忠実度相同組換えなどの相同組換えに使用され得る。いくつかの実施形態において、相同組換えは、テンプレート配列の標的核酸分子への組み込みをもたらし得る。いくつかの実施形態では、単一のテンプレートまたは同じテンプレートの複数のコピーが提供され得る。他の実施形態では、相同組換えが２つ以上の標的部位で起こり得るように、２つ以上のテンプレートが提供され得る。例えば、細胞内の単一の遺伝子、または細胞内の２つの異なる遺伝子を修復するために、異なるテンプレートが提供され得る。いくつかの実施形態では、異なるテンプレートが独立したコピー数で提供され得る。
[0603]いくつかの実施形態では、テンプレートは、核酸の切断部位でのＤＮＡ鎖侵入を必要とする相同性指向の修復に使用され得る。いくつかの実施形態では、相同性指向修復は、テンプレート配列の標的核酸分子へのコピーをもたらし得る。いくつかの実施形態では、単一のテンプレートまたは同じテンプレートの複数のコピーが提供され得る。他の実施形態では、異なる配列を有する２つ以上のテンプレートが、相同性指向修復によって２つ以上の部位に挿入され得る。例えば、細胞内の単一の遺伝子、または細胞内の２つの異なる遺伝子を修復するために、異なるテンプレートが提供され得る。いくつかの実施形態では、異なるテンプレートが独立したコピー数で提供され得る。
[0604]いくつかの実施形態では、テンプレートは、非相同末端結合によって媒介される挿入として、切断された核酸に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、テンプレート配列は、切断部位付近の核酸配列と類似性を有さない。いくつかの実施形態では、テンプレート配列（例えば、テンプレート中のコード配列）は、切断部位付近の核酸配列と類似性を有さない。テンプレート配列は、切断部位近くの標的配列と類似または同一の配列を有し得る標的配列が隣接してもよい。いくつかの実施形態では、単一のテンプレートまたは同じテンプレートの複数のコピーが提供され得る。他の実施形態では、異なる配列を有する２つ以上のテンプレートを、非相同末端結合によって２つ以上の部位に挿入してもよい。例えば、細胞に単一のテンプレートを挿入するために、または細胞に２つの異なるテンプレートを挿入するために、異なるテンプレートが提供され得る。いくつかの実施形態では、異なるテンプレートが独立したコピー数で提供され得る。
[0605]いくつかの実施形態では、テンプレート配列は、標的細胞の内因性配列に対応し得る。いくつかの実施形態では、内因性配列は、細胞のゲノム配列であり得る。いくつかの実施形態では、内因性配列は、染色体配列であっても、または染色体外配列であってもよい。いくつかの実施形態では、内因性配列は、細胞のプラスミド配列であり得る。いくつかの実施形態では、テンプレート配列は、切断部位またはその近くで細胞内の内因性配列の一部と実質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子のテンプレートによる修復は、標的核酸分子の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質に１つまたは複数のアミノ酸変化をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、標的遺伝子から発現されるＲＮＡに１つまたは複数のヌクレオチド変化をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、標的遺伝子の発現レベルを変更させ得る。いくつかの実施形態では、変異は、標的遺伝子の発現の増加または減少をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は遺伝子ノックダウンをもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は遺伝子ノックアウトをもたらし得る。いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子のテンプレートによる修復は、標的遺伝子のエクソン配列、イントロン配列、転写制御配列、翻訳制御配列、または非コード配列の置き換えをもたらし得る。
[0606]他の実施形態では、テンプレート配列は外因性配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、外因性配列は、外因性配列の標的核酸分子への組み込みの際に、細胞が、組み込まれた配列によってコードされるタンパク質またはＲＮＡを発現し得るように、外因性プロモーター配列に作動可能に連結されたタンパク質またはＲＮＡコード配列を含み得る。他の実施形態では、外因性配列の標的核酸分子への組み込みの際に、組み込まれた配列の発現は、内因性プロモーター配列によって調節され得る。いくつかの実施形態では、外因性配列は、染色体配列であってもまたは染色体外配列であってもよい。いくつかの実施形態では、外因性配列は、タンパク質またはタンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を提供し得る。さらに他の実施形態では、外因性配列は、エクソン配列、イントロン配列、転写制御配列、翻訳制御配列、または非コード配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、外因性配列の組み込みは、遺伝子ノックインをもたらし得る。
[0607]テンプレートは、任意の適切な長さであってもよい。いくつかの実施形態では、テンプレートは、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、またはそれ以上の長さのヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、テンプレートは、標的配列を含む標的核酸分子の一部（すなわち、「相同アーム」）に相補的なヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、相同性アームは、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００またはそれ以上のヌクレオチド長を含んでもよい。いくつかの実施形態では、テンプレートは、標的核酸分子上の切断部位の上流または下流に位置する配列に相補的な相同性アームを含んでもよい。いくつかの実施形態では、テンプレートは、切断部位の上流および下流にそれぞれ位置する配列に相補的な第１のヌクレオチド配列および第２の相同性アームを含んでもよい。テンプレートが２つの相同性アームを含む場合、各アームは同じ長さであっても、または異なる長さであってもよく、相同性アーム間の配列は、相同性アーム間の標的配列と実質的に類似もしくは同一であってもよく、またはまったく無関係であってもよい。いくつかの実施形態では、テンプレート上の第１のヌクレオチド配列と、切断部位の上流の配列との間、およびテンプレート上の第２のヌクレオチド配列と切断部位の下流の配列との間の相補性の程度は、相同組換え、例えば、テンプレートと標的核酸分子との間の高忠実度相同組換えなどを可能にし得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は、約９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は、約９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は１００％であり得る。いくつかの実施形態、例えば、テンプレートが非相同末端結合によって媒介される挿入として切断された核酸に組み込まれる、本明細書に記載のテンプレートでは、テンプレートは相同性アームを有さない。いくつかの実施形態では、相同性アームを有さないテンプレートは、例えば本明細書に記載されるように、テンプレート配列の一方または両方の末端に隣接する標的配列を含む。いくつかの実施形態では、相同性アームを有さないテンプレートは、テンプレート配列の両端に隣接する標的配列を含む。いくつかの実施形態では、テンプレート配列の末端に隣接する標的配列は、約１０～５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、テンプレート配列の末端に隣接する標的配列は、約１０～２０ヌクレオチド、約１５～２０ヌクレオチド、約２０～２５ヌクレオチド、または約２０～３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、テンプレート配列の末端に隣接する標的配列は、約１７～２３ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、テンプレート配列の末端に隣接する標的配列は、約２０ヌクレオチドである。
[0608]いくつかの実施形態では、テンプレートとゲノム配列との間で相同組換えが起こる場合、核酸分子はテンプレートから発現される。いくつかの実施形態では、例えば、テンプレートは核酸分子を発現するためのプロモーターを有さないか、および／またはＡＴＧ転写開始部位がコード配列から除去される。
送達
[0609]本明細書では、ヌクレアーゼ系を用いて細胞内の核酸分子を編集するための方法および組成物、ならびにその標的送達が提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、ある遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、疾患または障害に関連する遺伝子をコードする核酸配列を含む。
[0609]本明細書では、ヌクレアーゼ系を用いて細胞内の核酸分子を編集するための方法および組成物、ならびにその標的送達が提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、ある遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、疾患または障害に関連する遺伝子をコードする核酸配列を含む。
[0610]本明細書に記載の核酸を含む活性剤、例えば、修飾ガイドＲＮＡは、所望のインビボ位置への標的送達のために、１つまたは複数のターゲティング部分とコンジュゲートされ得る。ガイドＲＮＡコンジュゲートまたはガイドＲＮＡ－タンパク質複合体コンジュゲートは、例えば、ウイルス感染またはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、脂質粒子またはベシクル形質導入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、例えば、カチオン性リポソーム、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、せん断駆動細胞透過、細胞透過性ペプチドへの融合、その後の細胞接触、マイクロインジェクション、およびナノ粒子媒介送達によって媒介されるトランスフェクションなど、当該技術分野で公知の任意の方法を介して細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ系は、ウイルス感染を介して細胞に導入され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ系は、バクテリオファージ感染を介して細胞に導入され得る。リポソームとしては、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）のＤｉＬａ２リポソーム、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、および限定するものではないが、ＤＯＸＩＬ（登録商標）（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ））などの小分子薬物を送達し得るリポソームから形成されるものが挙げられる。
[0611]いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、本明細書で説明されるベクター系を細胞に導入するステップを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ヌクレアーゼ系を全体的または部分的にコードする。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のベクターを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクター系の導入は、ベクターが失われる、例えば、自己破壊の標的となる間、編集された核酸分子を有する安定な細胞株をもたらし得る。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。真核細胞の非限定的な例としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、無脊椎動物由来の細胞、脊椎動物由来の細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、およびヒト細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞はげっ歯類細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核細胞はヒト細胞であってもよい。同様に、標的配列は、任意のそのような細胞に由来する場合もあるし、または任意のそのような細胞内にある場合もある。
[0612]いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡまたはｍＲＮＡは、官能化された脂質二重層または脂質－ポリカチオン複合体の間の架橋を有し得る、脂質ベシクル中に製剤化され得る。リポソーム製剤は、限定するものではないが、カチオン性脂質構成要素の選択、カチオン性脂質飽和度、ペグ化の性質、全成分の比、およびサイズなどの生物物理学的パラメーター、またはポリカチオン組成によって影響され得る。一実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、限定するものではないが、以前に記載され、インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチド送達に適切であることが示されている、安定化プラスミド脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成される組成物などのリポソームを含んでもよい。脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜バリアを貫通し得るように、粒子の表面特性を変えるように操作してもよい。粘液は、限定するものではないが、口腔（例えば、頬および食道の膜および扁桃腺組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、呼吸器（例えば、鼻、咽頭、気管および気管支の膜）、生殖器（例えば、膣、頸部および尿道の膜）などの粘膜組織に位置する。製剤は、１０～２００ｎｍより大きいナノ粒子を使用し得、これは、より高い薬物カプセル化効率、および大きすぎて粘膜バリアを介して迅速に拡散できないと考えられていた広範囲の薬物の持続的送達を提供する能力のために好ましいものである。ナノ粒子の動的輸送は、光退色後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）および高解像度複数粒子追跡（ＭＰＴ）を使用して測定し得る。製剤は、制御放出および／または標的送達のために作製され得る。粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子としては、表面改変剤、例えば、限定するものではないが、ｍＲＮＡ、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウムなどのカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコールおよびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ－アセチルシステイン、オオヨモギ、ブロメライン、パパイン、クレロデンドラム、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルソリン、サイモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）およびｒｈＤＮａｓｅを含む種々のＤＮａｓｅが挙げられる。表面改変剤は、粒子の表面に埋め込まれるかもしくは絡み合わされるか、または脂質ナノ粒子の表面に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）、配置もしくは分散され得る。
[0613]さらなる実施形態において、本開示のガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲシステムは、限定するものではないが、ＡＴＵＰＬＥＸ（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステムおよび他のｓｉＲＮＡ－リポプレックス技術などのリポプレックスとして製剤化され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して、例えば、細胞トランスフェクションの増加、コードされたタンパク質の翻訳の増加、または安定性の増加によって、修飾ガイドＲＮＡの有効性を改善し得る。細胞透過性ペプチドは、細胞内空間への送達を促進するポリカチオンに付着した細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来細胞浸透ペプチドなどの本開示の薬学的製剤と共に使用してもよい。別の実施形態では、特定の細胞型を標的とする脂質ナノ粒子を使用してもよい。あるいは、脂質ナノ粒子は、対象に注射されたときにゲルを形成し得る、当該技術分野で公知の任意のポリマーまたはヒドロゲルにカプセル化し得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックスにカプセル化され得る。さらに別の実施形態では、薬学的組成物は持続放出製剤であってもよい。さらなる実施形態では、持続放出製剤は皮下送達用であってもよい。持続放出製剤としては、限定するものではないが、ＰＬＧＡミクロスフェア、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、外科用シーラント、例えば、フィブリノゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ、ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）、ＰＥＧベースのシーラント、およびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）が挙げられ得る。
[0614]いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡなどの本明細書に記載の核酸は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成し得る。いくつかの実施形態では、複合体の一部または全部を、１つまたは複数のベクターを含むベクター系を介して送達し得る。いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡベクターであってもよい。他の実施形態では、ベクターはＲＮＡベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡベクターはｍＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは環状であり得る。他の実施形態では、ベクターは線状であってもよい。非限定的な例示的なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、および発現ベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはＲＮＡベクターによって、例えばｍＲＮＡとして提供され、テンプレートはウイルスベクターによって提供される。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、その野生型対応物から遺伝子修飾され得る。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを容易にするため、またはベクターの１つまたは複数の特性が変化するように、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含んでもよい。このような特性としては、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組み込み、複製、転写、および翻訳が挙げられる。いくつかの実施形態では、ウイルスがより大きなサイズを有する外因性配列をパッケージングできるように、ウイルスゲノムの一部を欠失させてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、形質導入効率が向上している場合がある。いくつかの実施形態では、宿主においてウイルスによって誘導される免疫応答を低下させてもよい。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムへのウイルス配列の組み込みを促進するウイルス遺伝子（例えば、インテグラーゼなど）は、ウイルスが非組み込みになるように変異されてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは複製欠損であってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ベクター上のコード配列の発現を駆動するための外因性転写または翻訳制御配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスはヘルパー依存性であり得る。例えば、ウイルスは、ベクターを増幅してウイルス粒子にパッケージ化するのに必要なウイルス成分（例えば、ウイルスタンパク質など）を供給するために、１つまたは複数のヘルパーウイルスを必要とし得る。そのような場合、ウイルス成分をコードする１つまたは複数のベクターを含む１つまたは複数のヘルパー構成要素を、本明細書に記載のベクター系と共に宿主細胞に導入してもよい。他の実施形態では、ウイルスはヘルパーフリーであり得る。例えば、ウイルスは、任意のヘルパーウイルスなしでベクターを増幅およびパッケージングし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクター系は、ウイルスの増幅およびパッケージングに必要なウイルス成分もコードし得る。
[0615]非限定的な例示的なウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）ベクター、バクテリオファージＴ４、バキュロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターであってもよい。他の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、レンチウイルスは非組み込み型であってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、高クローニング能力または「ガットレス」アデノウイルスであってよく、５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびパッケージングシグナル（Ψ）以外の全てのコードウイルス領域がウイルスから欠失されており、そのパッケージング能力が高まる。さらに他の実施形態では、ウイルスベクターはＨＳＶ－１ベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ－１ベースのベクターはヘルパー依存性であり、他の実施形態ではヘルパー非依存性である。例えば、パッケージング配列のみを保持するアンプリコンベクターは、パッケージングのための構造的構成要素を含むヘルパーウイルスが必要であるが、必須ではないウイルス機能を削除する３０ｋｂが欠失されたＨＳＶ－１ベクターにはヘルパーウイルスは必要ない。追加の実施形態では、ウイルスベクターはバクテリオファージＴ４であってもよい。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＴ４は、ウイルスの頭部が空になったときに、任意の線状または環状のＤＮＡまたはＲＮＡ分子をパッケージ化し得る場合がある。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターであってもよい。さらに別の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであってもよい。より小さいクローニング能力を有するＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを使用する実施形態では、本明細書に開示されるベクター系の全ての構成要素を送達するために、２つ以上のベクターを使用することが必要であり得る。例えば、１つのＡＡＶベクターは、Ｃａｓ９タンパク質をコードする配列を含んでもよいが、第２のＡＡＶベクターは、１つまたは複数のガイド配列および１つまたは複数のテンプレートのコピーを含んでもよい。
[0616]特定の実施形態では、ウイルスベクターを改変して、特定の組織または細胞型を標的とし得る。例えば、ウイルス表面タンパク質は、ウイルスタンパク質がその天然の細胞表面受容体に結合するのを減少または排除するように変更され得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、肝臓特異的送達のために改変され得る。表面タンパク質は、所望の細胞型に特異的な受容体と相互作用するように操作され得る。ウイルスベクターは、限定的またはリダイレクトされた向性を含む、宿主の向性を変更した可能性がある。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、第１の結合部分を発現または提示するように操作され得る。第１の結合部分は、ウイルス表面タンパク質または糖タンパク質に融合するか、ウイルスにコンジュゲートするか、ビリオンに化学的に架橋するか、ウイルスエンベロープに結合するか、または任意の他の適切な方法によってウイルスベクターに結合し得る。第１の結合部分は、第２の結合部分に結合し得、これを使用してウイルスを所望の細胞型に誘導し得る。いくつかの実施形態では、第１の結合部分は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、カプタアビジン、または別のビオチン結合部分であり、第２の結合部分はビオチンまたはその類似体である。次いで、ビオチン化された標的化剤をウイルスベクター上のアビジンに結合させ、ウイルスを所望の細胞型に誘導するために使用され得る。例えば、Ｔ４ベクターは、その表面タンパク質の１つまたは複数にビオチン結合部分を提示するように操作され得る。次いで、そのようなＴ４ベクターの細胞特異性は、選択した細胞に向けられたビオチン化抗体またはリガンドを結合することによって変更され得る。別の実施形態では、第１および第２の結合部分は、ハプテンおよび抗ハプテン結合タンパク質；ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン結合タンパク質；フルオレセインおよび抗フルオレセイン結合タンパク質；または結合パートナーである任意の他の適切な第１および第２の結合部分である。
[0617]いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞内で１つまたは複数のコード配列の発現を駆動し得る場合がある。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば細菌細胞などの原核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞はげっ歯類細胞であり得る。いくつかの実施形態では、真核細胞はヒト細胞であり得る。異なる種類の細胞で発現を駆動するのに適したプロモーターは、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、プロモーターは野生型であり得る。他の実施形態では、プロモーターは、より効率的または有効な発現のために改変され得る。さらに他の実施形態では、プロモーターは切断されてもその機能は保持されている場合がある。例えば、プロモーターは、ウイルスへのベクターの適切なパッケージングに適した通常のサイズであっても、または減少したサイズであってもよい。
[0618]いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載のヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーを含んでもよい。他の実施形態では、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の２つ以上のコピーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳制御配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳制御配列に作動可能に連結され得る。
[0619]いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的、誘導的、または組織特異的であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターであり得る。非限定的な例示的な構成プロモーターとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期（ＭＬＰ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの機能的フラグメント、または前述のいずれかの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは切断されたＣＭＶプロモーターであり得る。他の実施形態では、プロモーターはＥＦ１αプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。非限定的な例示的な誘導性プロモーターとしては、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）など、低い基礎（非誘導型）発現レベルを有するプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、肝臓組織で排他的または主に発現される。非限定的な例示的な組織特異的プロモーターとしては、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、Ｎｐｈｓｌプロモーター、ＯＧ－２プロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターが挙げられる。
[0620]いくつかの実施形態では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓ９タンパク質の一部、例えば、Ｃａｓタンパク質またはＣｐｆ１タンパク質をコードし得る。ベクター系は、本明細書に記載のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ガイドＲＮＡの１つのコピーを含んでもよい。他の実施形態では、ベクター系は、ガイドＲＮＡの２つ以上のコピーを含んでもよい。２つ以上のガイドＲＮＡを有する実施形態では、ガイドＲＮＡは、それらが異なる標的配列を標的とするか、またはＣａｓ９ ＲＮＰ複合体内の活性または安定性などの他の異なる特性を有するように、同一でなくてもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳制御配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識され得る。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６、Ｈ１およびｔＲＮＡプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトＵ６プロモーターに作動可能に連結され得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトＨ１プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトｔＲＮＡプロモーターに作動可能に連結され得る。２つ以上のガイドＲＮＡを有する実施形態では、発現を駆動するために使用されるプロモーターは同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドおよびガイドＲＮＡのｔｒａｃｒ ＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同じベクター上に提供され得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同じプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、単一の転写物に転写され得る。例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、単一の転写物から処理されて、二重分子ガイドＲＮＡを形成し得る。あるいは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡに転写され得る。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、同じベクター上のそれらの対応するプロモーターによって駆動され得る。さらに他の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ ＲＮＡは、異なるベクターによってコードされ得る。
[0621]いくつかの実施形態では、ベクター系は、本明細書に記載のテンプレートを含むベクターをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、テンプレートの１つのコピーを含んでもよい。他の実施形態では、ベクター系は、テンプレートの複数のコピーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、テンプレートの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、テンプレートの４、５、６、７、８、またはそれ以上のコピーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、テンプレートの５、６、７、またはそれ以上のコピーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、テンプレートの６つのコピーを含んでもよい。テンプレートの複数のコピーは、同じまたは異なるベクター上に配置されてもよい。テンプレートの複数のコピーは、互いに隣接していてもよいし、他のヌクレオチド配列またはベクターエレメントによって分離されていてもよい。他の実施形態では、相同組換えが２つ以上の標的部位で起こり得るように、２つ以上のテンプレートが提供され得る。例えば、細胞内の単一の遺伝子、または細胞内の２つの異なる遺伝子を修復するために、異なるテンプレートが提供され得る。いくつかの実施形態では、異なるテンプレートが独立したコピー数で提供され得る。
[0622]ベクター系は、１～３個のベクターを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つの単一ベクターを含んでもよい。他の実施形態では、ベクター系は、２つのベクターを含んでもよい。追加の実施形態では、ベクター系は、３つのベクターを含んでもよい。
[0623]いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列およびテンプレートは、同じまたは別個のベクター上に位置し得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列およびテンプレートは、同じベクター上に位置し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列およびテンプレートは、別個のベクター上に位置し得る。配列は、ベクター上で任意の順序で、同じ方向または異なる方向に配向されてもよい。
[0624]いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびテンプレートは、同じまたは別個のベクター上に位置し得る。いくつかの実施形態では、配列の全てが同じベクター上に位置し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列が同じベクター上に位置し得る。配列は、ベクター上で任意の順序で、同じ方向または異なる方向に配向されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、同じベクター上に位置してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびテンプレートは、同じベクター上に位置してもよい。特定の実施形態では、ベクター系は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター、およびテンプレートまたはテンプレートの複数のコピーをコードするヌクレオチド配列を含む第２のベクターを含んでもよい。
[0625]いくつかの実施形態では、テンプレートは、ベクター系によってコードされるヌクレアーゼ系によって、それが配置されているベクターから放出され得る。いくつかの実施形態では、テンプレートは、ｍＲＮＡから提供されるＣａｓ９タンパク質によってベクターから放出され得る。テンプレートは、ガイドＲＮＡによって認識される少なくとも１つの標的配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、テンプレートは、テンプレートの５’末端および３’末端で標的配列に隣接していてもよい。Ｃａｓ９タンパク質の発現およびガイドＲＮＡの送達の際に、ガイドＲＮＡは、ハイブリダイズし得、Ｃａｓ９タンパク質は、テンプレートがベクターから放出されるように、テンプレートの両端で標的配列を切断し得る。さらなる実施形態では、テンプレートは、テンプレートの５’末端および３’末端でヌクレアーゼによって認識される標的配列を有することによって、ベクター系によりコードされるヌクレアーゼによってベクターから放出され得る。テンプレートのいずれかの末端の標的配列は、ＰＡＭ配列がテンプレートにより近くなるように配向され得る。このような配向では、ベクターからの放出後にテンプレートの末端に残る非テンプレート核酸は少なくなる。いくつかの実施形態では、テンプレートに隣接する標的配列は、同じであってもよい。いくつかの実施形態では、テンプレートに隣接する標的配列は、例えば、ＨＲ、ＨＤＲ、または非相同末端結合によって、テンプレートが組み込まれる、切断部位で見出される標的配列と同じであってもよい。他の実施形態では、テンプレートに隣接する標的配列は、異なっていてもよい。例えば、テンプレートの５’末端の標的配列は、１つのガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼによって認識され得、テンプレートの３’末端の標的配列は、別のガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼによって認識され得る。
[0626]いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ系をコードするベクターは、発現されるヌクレアーゼ系の量を制御するための自己破壊（または「自己切断」または「自己不活化」）ベクター系を作成するために、ベクター内に少なくとも１つの標的配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、自己破壊ベクター系は、ヌクレアーゼ活性の量の減少をもたらす。さらなる実施形態において、自己破壊ベクター系は、ベクター核酸の量の減少をもたらす。この系がＣａｓ９を含む実施形態では、標的配列を認識するガイドＲＮＡも含む。このようにして、ヌクレアーゼ系の滞留時間および／または活性レベルを一時的に制御して、ヌクレアーゼ系の過剰発現に伴う悪影響を回避し得る。そのような悪影響には、例えば、ヌクレアーゼによるオフターゲット効果が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの発現時に、ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼをコードする配列を含むベクター中の標的配列を認識して切断するように、１つまたは複数の標的配列をベクター上の任意の場所に配置してもよい。自己破壊ベクターの１つまたは複数の標的配列は同じであってもよい。必要に応じて、自己破壊ベクターは、複数の標的配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的配列での切断は、例えばＣａｓ９などのヌクレアーゼ系の少なくとも１つの構成要素の発現を低下させ得る。いくつかの実施形態では、切断は、ヌクレアーゼ転写物の発現を低下させ得る。例えば、標的配列は、切断がコード領域の破壊をもたらすように、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列内に位置し得る。他の実施形態では、標的配列は、ヌクレアーゼをコードするベクター上の非コード領域内に位置し得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、切断がプロモーター配列の破壊をもたらすように、ヌクレアーゼの発現を駆動するプロモーター内に位置し得る。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９配列を標的とする標的配列（およびそれに対応するガイドＲＮＡ）を含んでもよい。特定の実施形態において、標的配列は、プロモーターとヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列との間に位置し得、その結果、切断がそのプロモーターからのコード配列の分離をもたらす。特定の実施形態では、ヌクレアーゼコード配列外の標的配列およびヌクレアーゼコード配列内の標的配列が含まれる。
[0627]いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質をコードするベクターは、ガイドＲＮＡによって認識される少なくとも１つの標的配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡの発現の際に、ガイドＲＮＡがハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質がＣａｓ９タンパク質をコードするベクター内の標的配列を切断するように、ベクター上の任意の場所に位置し得る。いくつかの実施形態では、標的配列での切断は、Ｃａｓ９タンパク質転写物の発現を低下させ得る。例えば、標的配列は、切断がコード領域の破壊をもたらすように、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列内に位置し得る。他の実施形態では、標的配列は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするベクター上の非コード領域内に位置し得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、切断がプロモーター配列の破壊をもたらすように、Ｃａｓ９タンパク質の発現を駆動するプロモーター内に位置し得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、切断がコード配列の破壊をもたらすように、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列内に位置してもよい。他の実施形態において、標的配列は、プロモーターとＣａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列との間に位置し得、その結果、切断がそのプロモーターからのコード配列の分離をもたらす。
[0628]テンプレートの放出のため、ベクターの自己破壊のため、および細胞内のヌクレアーゼ系による標的化のための標的配列は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、テンプレートの放出が同時にヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の発現の破壊をもたらすように、テンプレートの３’末端の標的配列は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の発現を駆動するプロモーター内に存在してもよい。いくつかの実施形態では、テンプレートに隣接する標的配列、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の発現を妨害するための標的配列、および細胞内の標的核酸分子中の標的配列の両方が、シングルガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼによって認識される同じ配列であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つの種類の標的配列のみを含んでもよく、ヌクレアーゼ系は、１つのガイドＲＮＡのみを含んでもよい。他の実施形態では、これらの標的配列は、異なるガイドＲＮＡによって認識される異なる配列を含んでもよい。
[0629]いくつかの実施形態では、ベクター系は、標的細胞に送達された後にのみ発現を開始する誘導性プロモーターを含んでもよい。非限定的な例示的な誘導性プロモーターとしては、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）など、低い基礎（非誘導型）発現レベルを有するプロモーターであってもよい。
[0630]追加の実施形態では、ベクター系は、特定の組織に送達された後にのみ発現を開始する組織特異的プロモーターを含んでもよい。非限定的な例示的な組織特異的プロモーターとしては、アルブミンプロモーター、α－１アンチトリプシンプロモーター、ヘモペキシンプロモーター、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、Ｎｐｈｓｌプロモーター、ＯＧ－２プロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターが挙げられる。特定の実施形態では、組織特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、α－１アンチトリプシンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、またはヘモペキシン遺伝子プロモーターである。肝臓特異的プロモーターを調べる方法は、Ｋｒａｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ７（３）：３７５－３８５（２００３）に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[0631]本開示のいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ系の活性は、ヌクレアーゼ系の発現された構成要素の滞留時間、量、および／または活性を調節することによって一時的に調節され得る。例えば、本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの細胞内半減期を改変し得るタンパク質ドメインと融合され得る。２つ以上のベクターが関与する特定の実施形態（例えば、本明細書に記載の構成要素が２つ以上の別個のベクター上にコードされるベクター系）では、ヌクレアーゼ系の活性は、ベクターが送達されるタイミングを制御することによって一時的に調節され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ系をコードするベクターは、テンプレートをコードするベクターの前にヌクレアーゼを送達し得る。他の実施形態では、テンプレートをコードするベクターは、ヌクレアーゼ系をコードするベクターより前にテンプレートを送達し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ系およびテンプレートをコードするベクターは、同時に送達される。特定の実施形態では、同時に送達されるベクターは、例えば、ヌクレアーゼ、テンプレート、および／またはガイドＲＮＡ成分を一時的に送達する。さらなる実施形態では、ベクター上のコード配列から転写されたＲＮＡ（例えば、ヌクレアーゼ転写物など）は、ＲＮＡの細胞内半減期を改変し、および／または翻訳制御を調節し得る少なくとも１つのエレメントをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの半減期を延長してもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの半減期が減少する場合がある。いくつかの実施形態では、このエレメントは、ＲＮＡの安定性を高め得る。いくつかの実施形態では、このエレメントは、ＲＮＡの安定性を低下させ得る。いくつかの実施形態では、このエレメントは、ＲＮＡの３’ＵＴＲ内にあってもよい。いくつかの実施形態では、このエレメントは、ポリアデニル化シグナル（ＰＡ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、このエレメントは、キャップ、例えばｍＲＮＡの上流末端を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＡは、ＲＮＡの３’ＵＴＲに付加され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、転写後に細胞内でより迅速に分解されるように、ＰＡを含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、このエレメントは、少なくとも１つのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を含んでもよい。ＡＲＥは、組織タイプ、細胞タイプ、タイミング、細胞局在、および環境に依存する方法で、ＡＲＥ結合タンパク質（ＡＲＥ－ＢＰ）によって結合され得る。いくつかの実施形態では、不安定化エレメントは、ＲＮＡの崩壊を促進し、ＲＮＡの安定性に影響を与え、または翻訳を活性化し得る。いくつかの実施形態では、ＡＲＥは、５０～１５０ヌクレオチドの長さを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＡＲＥは、配列ＡＵＵＵＡの少なくとも１つのコピーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＲＥをＲＮＡの３’ＵＴＲに付加してもよい。いくつかの実施形態では、エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）の転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であり得、これは転写物からの発現を増強するために三次構造を作り出す。さらなる実施形態では、このエレメントは、例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７３（４）：２８８６－９２（１９９９）およびＦｌａｊｏｌｅｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２（７）：６１７５－８０（１９９８）に記載されているように、転写物からの発現を増強し得る修飾および／または短縮されたＷＰＲＥ配列である。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥまたは等価物を、ＲＮＡの３’ＵＴＲに付加してもよい。いくつかの実施形態では、このエレメントは、急速にまたはゆっくりと崩壊する転写物に富む他のＲＮＡ配列モチーフから選択され得る。
[0632]本開示の実施形態はまた、本明細書に記載のベクター系で患者を治療するステップも包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載のベクター系を患者に投与するステップを含んでもよい。この方法は、単一の治療法として、または当該技術分野で利用可能な他の治療法と組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態では、患者は、疾患関連遺伝子に変異（例えば、挿入、欠失、置換、染色体転座など）を有し得る。いくつかの実施形態において、ベクター系の投与は、患者における疾患関連遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異をもたらし得る。特定の実施形態は、疾患関連遺伝子における患者の変異を修復する方法を含んでもよい。いくつかの実施形態では、変異は、疾患関連遺伝子から発現されるタンパク質において１つまたは複数のアミノ酸変化をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、疾患関連遺伝子から発現されるＲＮＡに１つまたは複数のヌクレオチド変化をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、疾患関連遺伝子の発現レベルを変化させ得る。いくつかの実施形態では、変異は、遺伝子の発現の増加または減少をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、患者において遺伝子ノックダウンをもたらし得る。いくつかの実施形態において、ベクター系の投与は、疾患関連遺伝子における患者の変異の修正をもたらし得る。いくつかの実施形態において、ベクター系の投与は、患者において遺伝子ノックアウトをもたらし得る。いくつかの実施形態において、ベクター系の投与は、疾患関連遺伝子のエクソン配列、イントロン配列、転写制御配列、翻訳制御配列、または非コード配列の置き換えをもたらし得る。
[0633]いくつかの実施形態では、ベクター系の投与により、テンプレートの外因性配列が患者のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、外因性配列は、外因性プロモーター配列に作動可能に連結されたタンパク質またはＲＮＡコード配列を含んでもよく、これにより、外因性配列が患者のゲノムＤＮＡに組み込まれると、患者は、組み込まれた配列によってコードされるタンパク質またはＲＮＡを発現し得る。外因性配列は、補足的または置き換えタンパク質コード配列または非コード配列を提供し得る。例えば、ベクター系の投与は、患者における疾患関連遺伝子の変異部分の置き換えをもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異部分は、疾患関連遺伝子のエクソンを含んでもよい。他の実施形態において、外因性配列の組み込みは、患者のゲノムＤＮＡ上に存在する内因性プロモーター配列からの組み込み配列の発現をもたらし得る。例えば、ベクター系の投与は、疾患関連遺伝子の機能的遺伝子産物の供給をもたらし、患者の変異を修正し得る。いくつかの実施形態において、ベクター系の投与は、タンパク質またはタンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ配列の組み込みをもたらし得る。さらに他の実施形態では、ベクター系の投与は、患者のゲノムＤＮＡへのエクソン配列、イントロン配列、転写制御配列、翻訳制御配列、または非コード配列の組み込みをもたらし得る。いくつかの実施形態において、ベクター系の投与は、患者における遺伝子ノックインをもたらし得る。
投与および使用方法
[0634]本明細書では、細胞内の標的核酸を編集するための方法および組成物が提供される。本明細書においてさらに提供されるのは、対象の細胞における標的遺伝子の機能および活性を改変するための薬学的組成物および方法である。本明細書に記載のゲノム編集組成物は、その組成物を必要とする対象に対して、治療有効量で投与して、高循環コレステロールレベルおよび／または冠動脈疾患に関連する状態、例えば、高コレステロール血症、総コレステロール値の上昇、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、ＬＤＬコレステロールレベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠状動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、およびそれらの組合せを治療し得、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、結腸内、直腸内または腹腔内を含む様々な方法で対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、対象の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって、薬学的に許容される塩と同時投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、肝臓組織などの特定の組織に直接注射され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、非経口、静脈内、筋肉内、または経口で投与され得る。経口製剤は、胃での溶解を防止または低減するために、さらにコーティングまたは処理され得る。本開示の組成物は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して対象に投与され得る。本開示で使用するのに適した製剤および送達方法は、一般に当該技術分野で周知である。例えば、本開示の組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む薬学的組成物として製剤化され得る。この組成物は、ほぼ生理学的な条件に必要な薬学的に許容される補助物質、例としては、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含んでもよい。
[0634]本明細書では、細胞内の標的核酸を編集するための方法および組成物が提供される。本明細書においてさらに提供されるのは、対象の細胞における標的遺伝子の機能および活性を改変するための薬学的組成物および方法である。本明細書に記載のゲノム編集組成物は、その組成物を必要とする対象に対して、治療有効量で投与して、高循環コレステロールレベルおよび／または冠動脈疾患に関連する状態、例えば、高コレステロール血症、総コレステロール値の上昇、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、ＬＤＬコレステロールレベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠状動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、およびそれらの組合せを治療し得、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、結腸内、直腸内または腹腔内を含む様々な方法で対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、対象の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって、薬学的に許容される塩と同時投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、肝臓組織などの特定の組織に直接注射され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、非経口、静脈内、筋肉内、または経口で投与され得る。経口製剤は、胃での溶解を防止または低減するために、さらにコーティングまたは処理され得る。本開示の組成物は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して対象に投与され得る。本開示で使用するのに適した製剤および送達方法は、一般に当該技術分野で周知である。例えば、本開示の組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む薬学的組成物として製剤化され得る。この組成物は、ほぼ生理学的な条件に必要な薬学的に許容される補助物質、例としては、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含んでもよい。
[0635]本明細書に記載の薬学的製剤は、経口、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、髄内注射、髄腔内、直接脳室内、腹腔内、リンパ内、鼻腔内注射）、鼻腔内、頬側、局所または経皮投与経路を含むがこれらに限定されない複数の投与経路による様々な方法で対象に投与可能であり得る。本明細書に記載の薬学的製剤としては、限定するものではないが、水性液体分散物、自己乳化分散物、固溶体、リポソーム分散物、エアロゾル、固体剤形、粉末、即時放出製剤、制御放出製剤、急速溶解製剤、錠剤、カプセル、丸薬、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤、ならびに混合即時放出および制御放出の製剤が挙げられる。
[0636]いくつかの実施形態では、薬学的製剤は錠剤の形態である。他の実施形態では、本明細書に記載の組成物または阻害剤を含有する薬学的製剤は、カプセルの形態である。一態様では、経口投与のための液体製剤剤形は、水性経口分散液、エマルジョン、溶液、エリキシル、ゲル、およびシロップを含むがこれらに限定されない群から選択される水性懸濁液または溶液の形態である。
[0637]吸入による投与のために、本明細書に記載の組成物または阻害剤は、エアロゾル、ミストまたは粉末として使用するために製剤化され得る。口腔または舌下投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤、ロゼンジ、またはゲルの形態を取り得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または阻害剤は、経皮剤形として調製され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または阻害剤は、筋肉内、皮下、または静脈内注射に適した薬学的組成物に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または阻害剤は、局所投与されてもよく、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリームまたは軟膏などの様々な局所投与可能な組成物に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または阻害剤は、浣腸、直腸ゲル、直腸泡状物、直腸エアロゾル、坐剤、ゼリー坐剤、または保持浣腸などの直腸用組成物に製剤化され得る。
[0638]一態様では、哺乳動物の疾患または状態を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の薬学的組成物を哺乳動物に投与するステップを含む方法が本明細書に開示される。一態様では、対象において、免疫原に対する免疫応答を引き起こすことを含む、疾患または状態を治療するための方法が本明細書に開示される。一実施形態では、疾患または状態は、ペイロードを投与することによって治療可能である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、タンパク質またはポリペプチド活性の欠如または異常によって特徴付けられる。例えば、欠損または異常なポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を、細胞に投与または送達してもよい。その後のｍＲＮＡの翻訳は、ポリペプチドを生成し、それにより、ポリペプチドによって引き起こされる活性の欠如または異常によって引き起こされる問題を軽減または排除し得る。ＬＮＰ組成物に含まれるペイロードはまた、所与の種の転写速度を変更し得、それにより遺伝子発現に影響を与え得る。
[0639]機能障害または異常なタンパク質またはポリペプチド活性によって特徴付けられる疾患および／または状態としては、限定するものではないが、希少疾患、感染症（ワクチンおよび治療の両方として）、がんおよび増殖性疾患、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患、腎血管疾患、および代謝性疾患が挙げられる。複数の疾患および／または状態は、タンパク質活性の欠落（または適切なタンパク質機能が起こらないように実質的に低下）によって特徴付けられ得る。そのようなタンパク質は存在しない場合もあるし、または本質的に非機能的である場合もある。機能不全タンパク質の特定の例は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス変異バリアントである。いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＮＡペイロードを含むＬＮＰ組成物または薬学的組成物を投与することによって、対象におけるそのような疾患および／または状態を治療するための方法を提供し、ここで、このＲＮＡは、対象の細胞に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するか、そうでなければ克服するポリペプチドをコードするｍＲＮＡであってもよい。
投与量
[0640]投与のための適切な投与量または有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ、性別および体重を含む個々の対象パラメーター、治療の期間、同時治療の性質（ある場合）、特定の投与経路、ならびに医療従事者の知識および専門知識の範囲内の同様の要因に応じて変化する。投与量の決定に関与する要因は、通常の試験以外に追加の実験を行うことなく、当業者に公知である。個々の成分またはそれらの組合せの最大用量、すなわち妥当な医学的判断による最高安全用量を使用することが一般に好ましい。半減期などの経験的な考慮事項は、一般的に投与量の決定に貢献する。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体由来の領域を含むポリペプチドなどのヒト免疫系と適合する治療剤を使用して、ポリペプチドの半減期を延長し、ポリペプチドが宿主の免疫系によって攻撃されるのを防ぐことができる。
[0640]投与のための適切な投与量または有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ、性別および体重を含む個々の対象パラメーター、治療の期間、同時治療の性質（ある場合）、特定の投与経路、ならびに医療従事者の知識および専門知識の範囲内の同様の要因に応じて変化する。投与量の決定に関与する要因は、通常の試験以外に追加の実験を行うことなく、当業者に公知である。個々の成分またはそれらの組合せの最大用量、すなわち妥当な医学的判断による最高安全用量を使用することが一般に好ましい。半減期などの経験的な考慮事項は、一般的に投与量の決定に貢献する。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体由来の領域を含むポリペプチドなどのヒト免疫系と適合する治療剤を使用して、ポリペプチドの半減期を延長し、ポリペプチドが宿主の免疫系によって攻撃されるのを防ぐことができる。
[0641]投与の頻度は、治療の過程で決定および調整してもよく、必ずしもそうではないが、一般に、疾患の治療および／または抑制および／または改善および／または遅延に基づく。あるいは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの徐放製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤およびデバイスが、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、投薬量は、毎日、隔日、３日ごと、４日ごと、５日ごと、もしくは６日ごとである。いくつかの実施形態では、投薬頻度は、毎週、２週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、もしくは１０週間ごとであり；または毎月１回、２カ月ごと、３カ月ごと、またはそれ以上である。この治療の進行状況は、従来の技術およびアッセイによって簡単に監視される。
[0642]投薬レジメンは、経時的に変化し得る。いくつかの実施形態では、正常体重の成人対象について、約０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与してもよい。いくつかの実施形態では、用量は１～２００ｍｇである。いくつかの実施形態では、用量は、約０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１～０．１ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１～１ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１～１０ｍｇ／ｋｇの間、約０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの間、０．０１～５００ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～１ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～５ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～１０ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～５００ｍｇ／ｋｇの間、約０．１～１０００ｍｇ／ｋｇの間、約１～５ｍｇ／ｋｇの間、約１～１０ｍｇ／ｋｇの間、約１～１００ｍｇ／ｋｇの間、約１～５００ｍｇ／ｋｇの間、約１～１０００ｍｇ／ｋｇの間、約１０～１００ｍｇ／ｋｇの間、約１０～５００ｍｇ／ｋｇの間、約１０～１０００ｍｇ／ｋｇの間、または約１００～１０００ｍｇ／ｋｇの間という範囲であってもよい。特定の投薬レジメン、すなわち用量、タイミングおよび反復は、特定の対象およびその対象の病歴、ならびにポリペプチドまたはポリヌクレオチドの特性（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの半減期、および当該技術分野で周知の他の考慮事項など）に依存する。
[0643]当業者には明らかであるように、本明細書に記載の治療剤の適切な投薬量は、使用される特定の薬剤（またはその組成物）、製剤および投与経路、疾患の種類および重篤度、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが予防または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、対象の病歴およびアンタゴニストに対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する用量に達するまでポリペプチドを投与する。
[0644]１つまたは複数の治療用組成物、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはＲＮＰの投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療的か予防的か、および当業者に公知の他の要因に応じて、連続的であっても、または断続的であってもよい。ポリペプチドの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよいし、例えば、疾患の発症前、発症中、または発症後のいずれかに一連の間隔をあけた投与であってもよい。
生物学的サンプル
[0645]サンプル、例えば生物学的サンプルは、対象から採取され得る。生物学的サンプルは、複数の生物学的サンプルを含んでもよい。複数の生物学的サンプルは、２つ以上の生物学的サンプル；例えば、約２～１０００、２～５００、２～２５０、２～１００、２～７５、２～５０、２～２５、２～１０、１０～１０００、１０～５００、１０～２５０、１０～１００、１０～７５、１０～５０、１０～２５、２５～１０００、２５～５００、２５～２５０、２５～１００、２５～７５、２５～５０、５０～１０００、５０～５００、５０～２５０、５０～１００、５０～７５、６０～７０、１００～１０００、１００～５００、１００～２５０、２５０～１０００、２５０～５００、５００～１０００、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、またはそれ以上のサンプルを含んでもよい。この生物学的サンプルは、複数の対象から得られてもよく、複数のセットの複数のサンプルが得られる。この生物学的サンプルは、約２～約１０００以上の対象；例えば、約２～１０００、２～５００、２～２５０、２～１００、２～５０、２～２５、２～２０、２～１０、１０～１０００、１０～５００、１０～２５０、１０～１００、１０～５０、１０～２５、１０～２０、１５～２０、２５～１０００、２５～５００、２５～２５０、２５～１００、２５～５０、５０～１０００、５０～５００、５０～２５０、５０～１００、１００～１０００、１００～５００、１００～２５０、２５０～１０００、２５０～５００、５００～１０００、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００以上の対象から得てもよい。
[0645]サンプル、例えば生物学的サンプルは、対象から採取され得る。生物学的サンプルは、複数の生物学的サンプルを含んでもよい。複数の生物学的サンプルは、２つ以上の生物学的サンプル；例えば、約２～１０００、２～５００、２～２５０、２～１００、２～７５、２～５０、２～２５、２～１０、１０～１０００、１０～５００、１０～２５０、１０～１００、１０～７５、１０～５０、１０～２５、２５～１０００、２５～５００、２５～２５０、２５～１００、２５～７５、２５～５０、５０～１０００、５０～５００、５０～２５０、５０～１００、５０～７５、６０～７０、１００～１０００、１００～５００、１００～２５０、２５０～１０００、２５０～５００、５００～１０００、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、またはそれ以上のサンプルを含んでもよい。この生物学的サンプルは、複数の対象から得られてもよく、複数のセットの複数のサンプルが得られる。この生物学的サンプルは、約２～約１０００以上の対象；例えば、約２～１０００、２～５００、２～２５０、２～１００、２～５０、２～２５、２～２０、２～１０、１０～１０００、１０～５００、１０～２５０、１０～１００、１０～５０、１０～２５、１０～２０、１５～２０、２５～１０００、２５～５００、２５～２５０、２５～１００、２５～５０、５０～１０００、５０～５００、５０～２５０、５０～１００、１００～１０００、１００～５００、１００～２５０、２５０～１０００、２５０～５００、５００～１０００、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００以上の対象から得てもよい。
[0646]生物学的サンプルは、ヒト対象から得てもよい。生物学的サンプルは、異なる年齢のヒト対象から取得できる。ヒト対象とは、出生前（例えば、胎児）、子供（例えば、新生児、乳児、幼児、思春期前）、思春期、青春期、または成人（例えば、早期成人、中年、高齢者）であり得る。ヒト対象は、約０カ月～約１２０歳以上であり得る。ヒト対象は、約０～約１２カ月齢；例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月齢であってもよい。ヒト対象は約０歳から１２歳の間；例えば、約０～３０日齢；約１カ月～１２カ月齢；約１歳～３歳齢；約４歳～５歳齢；約４歳～１２歳齢；約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２歳齢であってもよい。ヒト対象は、約１３歳～１９歳齢；例えば、約１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９歳齢であってもよい。ヒト対象は、約２０歳～約３９歳齢；例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または３９歳齢であってもよい。ヒト対象は、約４０歳～約５９歳齢；例えば、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９歳齢であってもよい。ヒト対象は５９歳以上；例えば、約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９，９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０歳齢であってもよい。ヒト対象は、生きている対象または死亡した対象を含んでもよい。ヒト対象としては、男性対象および／または女性対象を含んでもよい。
[0647]生物学的サンプルは、例えば細胞、組織、体液もしくは分泌物、またはそれらに由来する遺伝子発現産物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸；タンパク質またはタンパク質フラグメントなどのポリペプチド）由来の遺伝子の発現レベルの決定を可能にする任意の適切な供給源から得てもよい。生物学的サンプルの性質は、対象の性質に依存し得る。生物学的サンプルが、単細胞生物または未分化組織を有する多細胞生物である対象由来のサンプルである場合、この生物学的サンプルは、細胞培養のサンプル、生物の切除物、または生物全体などの細胞を含んでもよい。生物学的サンプルが多細胞生物に由来する場合、生物学的サンプルは、組織サンプル、体液サンプル、または分泌物であり得る。
[0648]生物学的サンプルは、異なる組織から取得できる。組織という用語は、共通の発生起源であり、類似または同一の機能を有する細胞の集合体を含むことを意味する。組織という用語はまた、異なる起源を有し得る細胞の機能的分類および組織化であり得る、臓器を包含することを意味する。生物学的サンプルは、任意の組織から得ることができる。
[0649]生物学的サンプルは、１つまたは複数のヒトまたは非ヒト動物由来の異なる組織サンプルから得てもよい。適切な組織としては、結合組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織、またはそれらの一部もしくは組合せが含まれ得る。適切な組織としてはまた、肺、心臓、血管（例えば、動脈、静脈、毛細血管）、唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、結腸、直腸、肛門、視床下部、下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎、腎臓、尿管、膀胱、尿道、リンパ節、扁桃腺、アデノイド、胸腺、脾臓、皮膚、筋肉、脳、脊髄、神経、卵巣、卵管、子宮、膣組織、乳腺、精巣、輸精管、精嚢、前立腺、陰茎組織、咽頭、喉頭、気管、気管支、横隔膜、骨髄、毛包の全部もしくは一部、またはそれらの組合せを含んでもよい。ヒトまたはヒト以外の動物由来の生物学的サンプルとしてはまた、体液、分泌物、または排泄物を含んでもよい；例えば、生物学的サンプルは、房水、硝子体液、胆汁、血液、血清、母乳、脳脊髄液、内リンパ、外リンパ、女性の膣液、羊水、胃液、月経、粘液、腹水、胸水、唾液、皮脂、精液、汗、涙、膣分泌物、嘔吐物、尿、糞のサンプル、またはそれらの組合せが挙げられ得る。生物学的サンプルは、健康な組織、疾患の組織、疾患の疑いのある組織、またはそれらの組合せに由来する場合がある。
[0650]いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、流体サンプル、例えば、血液、血清、痰、尿、精液、または他の生物学的流体のサンプルである。特定の実施形態では、サンプルは血液サンプルである。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、組織における疾患の有無を決定するために採取された組織サンプルなどの組織サンプルである。特定の実施形態では、サンプルは甲状腺組織のサンプルである。
[0651]生物学的サンプルは、疾患進行の異なる段階または異なる状態にある対象から得てもよい。疾患の進行の異なる段階または異なる状態としては、健康、一次症状の発症時、二次症状の発症時、三次症状の発症時、一次症状の経過中、二次症状の経過中、三次症状の経過中、一次症状終了後、二次症状終了後、三次症状終了後、一次症状終了後、二次症状終了後、三次症状終了後、またはそれらの組合せが挙げられる。疾患の進行の異なる段階とは、疾患と診断された後、または疾患の疑いがある期間の一定期間であり；例えば、少なくとも約、または少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０週間；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２カ月；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０年後に疾患と診断されるか、または疾患を有すると疑われる。疾患の進行の異なる段階または異なる状態としては、行動または状態の前、最中、または後が挙げられ得る；例えば、薬物による治療、手術による治療、手順による治療、標準治療手順の実施、休息、睡眠、食事、絶食、ウォーキング、ランニング、認知課題の遂行、性行為、思考、ジャンプ、排尿、リラックスする、動けなくなる、感情的にトラウマを負う、ショックを受けるなど。
[0652]本開示の方法は、対象または対象のセット由来の生物学的サンプルの分析を提供する。対象は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ブタ、魚などを含むがこれらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）であり得る。本方法および組成物は、本明細書に記載されるように、ヒト由来の生物学的サンプルに適用し得る。
[0653]生物学的サンプルは、本明細書で提供される生検法、綿棒採取、掻き取り、瀉血、または任意の他の適切な方法などの当該技術分野で公知の方法によって得ることができる。生物学的サンプルは、本開示のキットの構成要素を使用して取得、保存、または輸送され得る。場合によっては、本開示の方法による分析、特徴付け、または診断のために、複数の甲状腺サンプルなどの複数の生物学的サンプルを得ることができる。場合によっては、本開示の方法による診断または特徴付けのために、１つの組織タイプ（例えば、甲状腺）由来の１つまたは複数のサンプルおよび別の組織タイプ（例えば、口腔）由来の１つまたは複数のサンプルなどの複数の生物学的サンプルを得てもよい。場合によっては、１つの組織タイプ（例えば、甲状腺）由来の１つまたは複数のサンプルと、別の組織（例えば、口腔）由来の１つまたは複数のサンプルなど、複数のサンプルは、同時にまたは異なる時間に取得してもよい。場合によっては、異なる時点で取得されたサンプルが、異なる方法で保存および／または分析される。例えば、細胞学的分析によって（例えば、通常の染色を使用して）サンプルを入手し、分析してもよい。場合によっては、細胞学的分析の結果に基づいて、対象からさらなるサンプルを得ることができる。疾患または状態、例えば、冠動脈疾患の診断には、医師、看護師、または他の医療専門家による対象の検査が含まれる場合がある。検査は、通常の検査の一部である場合もあれば、次のいずれかを含むがこれらに限定されない特定の苦痛に起因する検査である場合もある：疼痛、病気、病気の予測、疑わしいしこりまたは塊の存在、疾患、または状態。この対象は、疾患または状態を認識している場合と認識していない場合がある。医療専門家は、検査用の生物学的サンプルを入手できる。場合によっては、医療専門家は、生物学的サンプルの提出のために対象を検査センターまたは研究所に紹介し得る。本明細書で提供される取得方法としては、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、切開生検、切除生検、パンチ生検、剃毛生検または皮膚生検を含む生検の方法が挙げられる。場合によっては、本明細書で提供される方法および組成物は、ＦＮＡによって得られた生物学的サンプルからのデータのみに適用される。場合によっては、本明細書で提供される方法および組成物は、ＦＮＡまたは外科的生検によって得られた生物学的サンプルからのデータのみに適用される。場合によっては、本明細書で提供される方法および組成物は、外科的生検によって得られた生物学的サンプル由来のデータのみに適用される。生物学的サンプルは、非侵襲的な方法で取得できる。このような方法としては、限定するものではないが、皮膚または子宮頸部の擦過、頬の拭き取り、唾液の採取、尿の採取、糞の採取、月経、涙、または精液の採取が挙げられる。生物学的サンプルは、生検、肺胞または肺洗浄、針吸引、または瀉血を含むがこれらに限定されない手順などの侵襲的手順によって得ることができる。生検の方法としてはさらに、切開生検、切除生検、パンチ生検、剃毛生検、または皮膚生検が挙げられる。針吸引の方法は、細針吸引、コア針生検、真空支援生検、または大きなコア生検をさらに含んでもよい。十分な量の生物学的材料を確保するために、本明細書の方法によって複数の生物学的サンプルを得てもよい。生物学的サンプルを得るための一般的な方法も当該技術分野で知られており、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲａｍｚｙ、Ｉｂｒａｈｉｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ Ｂｉｏｐｓｙ２００１にさらに記載されている。生物学的サンプルは、甲状腺結節または疑わしい甲状腺腫瘍の細針吸引物であってもよい。細針吸引サンプリング手順は、超音波、Ｘ線、またはその他の画像装置を使用して手引きされ得る。
[0654]場合によっては、さらなる診断のために、腫瘍専門医、外科医、または内分泌専門医などの専門家に対象を紹介してもよい。専門家は、同様に、検査のために生物学的サンプルを取得するか、または生物学的サンプルの提出のために個人を検査センターまたは研究所に紹介し得る。いずれにせよ、生物学的サンプルは、医師、看護師、または他の医療専門家、例えば、医療技術者、内分泌専門医、細胞専門医、採血専門医、放射線専門医、または呼吸器専門医によって入手され得る。医療専門家は、サンプルに対して実施する適切な試験もしくはアッセイを示し得、または本開示の分子プロファイリング事業は、どのアッセイまたは試験が最も適切に示されるかについて相談し得る。分子プロファイリングビジネスは、コンサルティング業務、サンプルの取得および／または保存、材料、または提供される全ての製品およびサービスに対して、個人またはその医療もしくは保険提供者に請求できる。
[0655]医療専門家は、初期診断またはサンプルの取得に関与する必要はない。あるいは、市販のキットを使用してサンプルを入手してもよい。キットは、本明細書に記載の前記サンプルを得る手段、検査のためにサンプルを保存する手段、およびキットの適切な使用のための説明書を含んでもよい。場合によっては、分子プロファイリングサービスがキットの購入価格に含まれる。それ以外の場合、分子プロファイリングサービスは別途請求される。
[0656]分子プロファイリング事業による使用に適した生物学的サンプルは、試験される個体の組織、細胞、核酸、遺伝子、遺伝子フラグメント、発現産物、遺伝子発現産物、および／または遺伝子発現産物フラグメントを含む任意の材料であり得る。サンプルの適合性および／または妥当性を決定する方法が提供される。生物学的サンプルとしては、限定するものではないが、組織、細胞、および／または個体の細胞または個体の細胞に由来する生物学的材料が挙げられ得る。サンプルは、細胞または組織の不均一集団であっても、または均一集団であってもよい。生物学的サンプルは、本明細書に記載の分析方法に適したサンプルを提供できる当該技術分野で公知の任意の方法を使用して得ることができる。
[0657]生物学的サンプルの取得は、キットの使用によって支援され得る。生物学的サンプルを入手、保管、および／または輸送するための材料を含むキットが提供され得る。キットは、例えば、生物学的サンプルの収集のための、例えば、材料および／または器具（例えば、滅菌スワブ、滅菌綿、消毒剤、針、注射器、メス、麻酔スワブ、ナイフ、キュレットブレード、液体窒素など）を含んでもよい。キットは、例えば、生物学的サンプルの保存および／または保存のための材料および／または器具（例えば、容器；氷、アイスパック、コールドパック、ドライアイス、液体窒素などの温度制御のための材料；化学保存剤、または緩衝液、例えば、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アルコール、例えば、エタノールまたはメタノール、アセトン、酢酸、ＨＯＰＥ固定液（ヘペス－グルタミン酸緩衝液媒介有機溶媒保護効果）、ヘパリン、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸緩衝液；プロテアーゼ阻害剤、例えば、アプロチニン、ベスタチン、カルパイン阻害剤ＩおよびＩＩ、キモスタチン、Ｅ－６４、ロイペプチン、アルファ－２－マクログロブリン、ペファブロックＳＣ、ペプスタチン、フッ化フェニルメタンスルホニル、トリプシン阻害剤；ＤＮＡｓｅ阻害剤、例えば、２－メルカプトエタノール、２－ニトロ－５－チシアノ安息香酸、カルシウム、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ドデシル硫酸ナトリウム、ヨードアセテートなど；ＲＮＡｓｅ阻害剤、例えば、リボヌクレアーゼ阻害タンパク質；二重蒸留水；ＤＥＰＣ（ジエチルプロカーボネート）処理水など）を含んでもよい。キットには使用説明書が含まれている場合がある。キットは、輸送に適した容器として提供されてもよく、またはそれを含んでもよい。輸送用コンテナは、断熱コンテナであってもよい。輸送用コンテナは、回収業者（例えば、研究所、医療センター、遺伝子検査会社など）に対して自己宛てであってもよい。キットは、家庭用または医療専門家による使用のために対象に提供され得る。あるいは、キットは、医療専門家に直接提供され得る。
[0658]１つまたは複数の生物学的サンプルを、所与の対象から得てもよい。場合によっては、約１～約５０の生物学的サンプルが所与の対象から得られる。例えば、約１～５０、１～４０、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～７、１～５、５～５０、５～４０、５～３０、５～２５、５～１５、５～１０、１０～５０、１０～４０、１０～２５、１０～２０、２５～５０、２５～４０、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の生物学的サンプルを、所与の対象から取得できる。所与の対象由来の複数の生物学的サンプルは、同じ供給源（例えば、同じ組織）、例えば、複数の血液サンプル、または複数の組織サンプル、または複数の供給源（例えば、複数の組織）から得てもよい。所与の対象由来の複数の生物学的サンプルは、同時にまたは異なる時間に取得してもよい。所与の対象由来の複数の生物学的サンプルは、同じ条件または異なる条件で取得してもよい。所与の対象由来の複数の生物学的サンプルは、対象の同じ疾患進行または異なる疾患進行で得てもよい。複数の生物学的サンプルが特定の対象由来の同じ供給源（例えば、同じ組織）から収集された場合、サンプルは単一のサンプルに組み合わせることができる。この方法でサンプルを組み合わせると、試験および／または分析に十分な材料が確実に入手され得る。
[0659]本明細書では、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ－Ｃａｓ複合体などの治療剤の標的送達のための方法および組成物が提供される。本発明者らは驚くべきことに、ガイドＲＮＡとコンジュゲートされたＧａｌＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃ誘導体ターゲティング部分の異なる構造が高い組織特異的送達効率を示し、標的ＤＮＡに結合して修飾する能力を維持することを見出した。有利なことに、ＧａｌＮＡｃターゲティング部分と共有結合した修飾ガイドＲＮＡ、ならびに核酸塩基対合およびハイブリダイゼーションによってＧａｌＮＡｃターゲティング部分に接続したガイドＲＮＡは、肝臓への安定性および有効な特異的送達を示す。本発明者らは、共有結合またはハイブリダイゼーションのいずれかによる異なるＧａｌＮＡｃ部分とのｇＲＮＡのコンジュゲーションが、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体を効率的に肝細胞に誘導し、ｓｇＲＮＡの完全性、二次構造の安定性、ならびにＣＲＩＳＰＲ酵素活性およびインビボでのＣＲＩＳＰＲ編集効率の向上を維持することを初めて示した。
[0660]以下の実施例は、本開示をよりよく説明するために提供されるものであり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の材料が言及されている範囲において、それは単に例示を目的としており、開示を限定することを意図していない。当業者は、発明能力を行使することなく、また本開示の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発し得る。
実施例１．核酸／オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションのためのＮ－アセチルガルコサミン由来モノマーの合成
[0661]化合物６は、報告されているように（ＷＯ２０１８／１３６６２０Ａ２）、活性化された糖１から出発して調製される。化合物５は、商業的供給源から購入する。
[0662]ａ全ての中間体および標的化合物の光学的に純粋なＲ、Ｓ、およびラセミバージョンは、対応するキラル純粋またはラセミの出発物質から出発して調製される。
[0663]化合物１０は、商業的供給源から購入するか、文献（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ（１９９８）、７１（３）、７１７－７２１；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１０）、５３（１）、４３２－４４０、ＵＳ２０１２０１１４６９６Ａ１）で報告されるように調製される。アミンで保護されたＲ、Ｓ、およびラセミ体のリジン１６は、商業的供給源から購入する。光学的に純粋なラセミ体の完全に保護されたスペーサー２１は、化合物１０から開始して調製される。糖保護されたＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体２５は、報告された手順（ＷＯ２０１８／１３６６２０Ａ２）に従って調製される。中間体化合物２３は、化合物１８と市販のＮ－Ｂｏｃアミノ酸２２から調製される。完全に保護された糖中間体化合物２６は、化合物２３と糖中間体２５から調製される。
[0663]化合物１０は、商業的供給源から購入するか、文献（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ（１９９８）、７１（３）、７１７－７２１；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１０）、５３（１）、４３２－４４０、ＵＳ２０１２０１１４６９６Ａ１）で報告されるように調製される。アミンで保護されたＲ、Ｓ、およびラセミ体のリジン１６は、商業的供給源から購入する。光学的に純粋なラセミ体の完全に保護されたスペーサー２１は、化合物１０から開始して調製される。糖保護されたＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体２５は、報告された手順（ＷＯ２０１８／１３６６２０Ａ２）に従って調製される。中間体化合物２３は、化合物１８と市販のＮ－Ｂｏｃアミノ酸２２から調製される。完全に保護された糖中間体化合物２６は、化合物２３と糖中間体２５から調製される。
[0664]ａ任意選択で、全ての中間体および標的化合物の光学的に純粋なＲ、Ｓ、およびラセミバージョンは、対応するキラル純粋またはラセミの出発物質から出発して調製される。
[0665]所望のラクトン２７は、商業的に入手可能な供給源から購入する。化合物３２は、報告されているように（ＷＯ２０１８／１３６６２０Ａ２）Ｄ－ガラクトサミンから調製される。アミン中間体３１は化合物１０および所望のラクトン２７から調製される。次いで、化合物３１は、ペプチドカップリング条件下で酸３２と反応されて化合物３３が得られ、次にこれがＰｄ－Ｃ上で水素化されてアミン中間体３４が得られる。次いでアミンを酸２５とカップリングして化合物３５を得る。化合物３５をＨＦ－ｐｙで処理すると、化合物３６が得られる。化合物３６のホスフィチル化によって、ホスホラミダイト３７が得られる（ＷＯ２０１８／１３６６２０Ａ２）。ＤＭＡＰの存在下で化合物３６を無水コハク酸で処理し、続いてペプチドカップリング条件下で、アミン官能化固体支持体で半コハク酸塩を処理すると、固体支持体３８が得られる。支持体上の未反応アミンは、無水酢酸で処理することによってキャッピングされる。
[0666]商業的供給源から購入した化合物３９を、水素化ホウ素リチウムで処理して、トリオール４０を得る。化合物４０を、マイケル付加条件下で、アクリル酸メチルで処理すると、化合物４１が得られる。トリエステル４１の加水分解により、三酸４２が得られ、ペプチドカップリング条件下でアミン４とカップリングして、化合物４３が得られる。
[0667]化合物４０をマイケル付加条件下で、アクリロニトリルで処理して化合物４４を得、続いて水素下で、ラネーニッケルで処理してアミン４５を得る。アミン４５をペプチドカップリング条件下で、酸２５で処理して化合物４６を得る。
[0668]化合物４９は、化合物４１および３０から調製される。化合物４１を酸で処理し、続いて所望の無水物１９と反応させると、酸４６が得られる。１モル当量の酸４６を、１モル当量のアミン３０で、ペプチドカップリング条件下で処理して、化合物４７を得る。アミン４７を塩基の存在下でＣｂｚ－Ｃｌで処理し、続いてＬｉＯＨで処理すると、化合物４９が得られる。化合物４９と過剰のアミン４とのペプチドカップリング条件下での反応により、化合物５０を得る。化合物５０をＰｄ－Ｃ上の水素で処理して、化合物５１を得て、次いで、これをペプチドカップリング条件下で酸３２とカップリングして、化合物５２を得る。化合物５２をＰｙ－ＨＦで処理すると、化合物５３が得られる。５３をホスフィチル化すると、ホスホルアミダイト５４が得られる。塩基の存在下で、無水コハク酸で５３を処理し、続いてペプチドカップリング条件下でのアミン官能化固体支持体による処理により、固体支持体５５が得られる。支持体５５上の未反応アミンは、塩基の存在下、無水酢酸で処理することによってキャッピングされる。
[0669]ａ全ての中間体および標的化合物の光学的に純粋なＲ、Ｓ、およびラセミバージョンは、対応するキラルに純粋またはラセミの出発物質から出発して調製される。
[0670]酸６２は、ヒドロキシ酸５６の市販のメチルエステルから調製される。化合物５６のヒドロキシル基は、ＤＭＴｒとして保護され、次いで、エステルは、酸５９を得るために加水分解される。化合物５９は、メチオニンメチルエステルの塩酸塩と、塩基の存在下で、ペプチドカップリング条件下で反応させ、次に水の存在下でＬｉＯＨと反応させて酸６０を得る。酸６０を、連続して、（１）塩酸アミン６１と、ペプチドカップリング条件下で反応させてアミド結合を形成し；（２）イミダゾールの存在下でのＴＢＤＭＳ－Ｃｌと反応させ、および（３）水の存在下でのＬｉＯＨと反応させて、化合物６２を得る。アミン塩６３は、化合物４３から調製される。次いで、化合物６３を、ペプチドカップリング条件下で化合物６２と反応させて、化合物６４を得る。６４をＰｙ－ＨＦで処理すると、化合物６５が得られる。６５をホスフィチル化すると、ホスホラミダイト６６が得られる。ＤＭＡＰの存在下でのコハク酸無水物での、次いでペプチドカップリング条件下でのアミン官能化固体支持体による連続的な６５の処理によって、固体支持体６７を得る。次いで、固体支持体上の未反応アミンを、塩基の存在下で無水酢酸と反応させることによりクエンチした。
[0670]酸６２は、ヒドロキシ酸５６の市販のメチルエステルから調製される。化合物５６のヒドロキシル基は、ＤＭＴｒとして保護され、次いで、エステルは、酸５９を得るために加水分解される。化合物５９は、メチオニンメチルエステルの塩酸塩と、塩基の存在下で、ペプチドカップリング条件下で反応させ、次に水の存在下でＬｉＯＨと反応させて酸６０を得る。酸６０を、連続して、（１）塩酸アミン６１と、ペプチドカップリング条件下で反応させてアミド結合を形成し；（２）イミダゾールの存在下でのＴＢＤＭＳ－Ｃｌと反応させ、および（３）水の存在下でのＬｉＯＨと反応させて、化合物６２を得る。アミン塩６３は、化合物４３から調製される。次いで、化合物６３を、ペプチドカップリング条件下で化合物６２と反応させて、化合物６４を得る。６４をＰｙ－ＨＦで処理すると、化合物６５が得られる。６５をホスフィチル化すると、ホスホラミダイト６６が得られる。ＤＭＡＰの存在下でのコハク酸無水物での、次いでペプチドカップリング条件下でのアミン官能化固体支持体による連続的な６５の処理によって、固体支持体６７を得る。次いで、固体支持体上の未反応アミンを、塩基の存在下で無水酢酸と反応させることによりクエンチした。
[0671]ホスホロアミダイト６８および固体支持体６９は、スキーム６の最初の部分に示され、上記されているように、化合物４６および６２から調製される。
[0672]ａ全ての中間体および標的化合物の光学的に純粋なＲ、Ｓ、およびラセミバージョンは、対応するキラルに純粋またはラセミの出発物質から出発して調製される。
[0672]ａ全ての中間体および標的化合物の光学的に純粋なＲ、Ｓ、およびラセミバージョンは、対応するキラルに純粋またはラセミの出発物質から出発して調製される。
[0673]ホスホルアミダイト７３および固体支持体７４は、スキーム７に示されるように、所望の出発物質２３から調製される。２３を酸で処理すると、化合物７０が得られる。次いで、化合物７０を、ペプチドカップリング条件下で化合物６０と反応させて化合物７１を得る。化合物７１を大気圧でＰｄ－Ｃ上で水素化し、化合物７２へのペプチドカップリング条件下で化合物２５と反応させる。化合物７２のホスフィチル化によって、ホスホラミダイト７３を得る。塩基の存在下でのコハク酸無水物による化合物７２の処理、続いて、ペプチドカップリング条件下でのアミン官能化固体支持体による処理によって、固体支持体７４を得る。得られた支持体上の未反応アミンは、塩基の存在下で無水酢酸と反応させることによりクエンチされ、核酸／オリゴヌクレオチド合成の準備が整った固体支持体が得られる。
実施例２．ＧａｌＮＡｃコンジュゲート合成。
[0674]所望の核酸コンジュゲートを、スキーム１～７および刊行物Ｂｒｏｗｎら、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ（ＤＯＩ：１０．１０８９／ｎａｔ．２０１９．０７８２）に記載され、以下の刊行物：Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５、１６、９０３－９０８、Ｎａｉｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４、１３６、１６９５８－１６９６１およびＷＯ２０１８／１３６６２０Ａ２に記載される、固体支持体およびホスホラミダイトを用いて合成する。
[0674]所望の核酸コンジュゲートを、スキーム１～７および刊行物Ｂｒｏｗｎら、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ（ＤＯＩ：１０．１０８９／ｎａｔ．２０１９．０７８２）に記載され、以下の刊行物：Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５、１６、９０３－９０８、Ｎａｉｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４、１３６、１６９５８－１６９６１およびＷＯ２０１８／１３６６２０Ａ２に記載される、固体支持体およびホスホラミダイトを用いて合成する。
実施例３．インビトロでの肝細胞へのｍＲＮＡの標的送達。
[0675]ＲＮＡポリ（Ａ）テールは、ＧａｌＮＡｃリガンドとコンジュゲートした短い相補的オリゴヌクレオチドでアニーリングされる（表２）。このようにして形成された単一化学実体を、ＡＳＧＰＲ発現、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒト初代肝細胞、および／または肝癌細胞株とインキュベートして、ＡＳＧＰＲ媒介の細胞への取り込みを可能にし、対応するタンパク質の発現を誘発する。目的のタンパク質の発現をアッセイして、ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＰＲ媒介したｍＲＮＡの送達の効率を確認する。最初に、ＧＦＰおよびＧＦＰ－Ｌｕｃ ｍＲＮＡの発現をプローブとして使用する。
[0675]ＲＮＡポリ（Ａ）テールは、ＧａｌＮＡｃリガンドとコンジュゲートした短い相補的オリゴヌクレオチドでアニーリングされる（表２）。このようにして形成された単一化学実体を、ＡＳＧＰＲ発現、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒト初代肝細胞、および／または肝癌細胞株とインキュベートして、ＡＳＧＰＲ媒介の細胞への取り込みを可能にし、対応するタンパク質の発現を誘発する。目的のタンパク質の発現をアッセイして、ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＰＲ媒介したｍＲＮＡの送達の効率を確認する。最初に、ＧＦＰおよびＧＦＰ－Ｌｕｃ ｍＲＮＡの発現をプローブとして使用する。
実施例４．げっ歯類および非ヒト霊長類におけるインビボでの肝細胞へのｍＲＮＡの標的送達。
[0676]ＲＮＡポリ（Ａ）テールは、ＧａｌＮＡｃリガンドとコンジュゲートした短い相補的オリゴヌクレオチドでアニーリングされる（表２）。このように形成された単一化学実体を、皮下または静脈内に投与して、肝細胞へのＡＳＧＰＲを介したＲＮＡペイロードの取り込みを可能にし、肝臓でのタンパク質発現を誘発する。処置された動物の肝臓におけるタンパク質の発現を、投与後に一定の間隔でアッセイする。
[0676]ＲＮＡポリ（Ａ）テールは、ＧａｌＮＡｃリガンドとコンジュゲートした短い相補的オリゴヌクレオチドでアニーリングされる（表２）。このように形成された単一化学実体を、皮下または静脈内に投与して、肝細胞へのＡＳＧＰＲを介したＲＮＡペイロードの取り込みを可能にし、肝臓でのタンパク質発現を誘発する。処置された動物の肝臓におけるタンパク質の発現を、投与後に一定の間隔でアッセイする。
実施例５．インビトロでのＡＳＧＰＲ発現細胞株へのガイドＲＮＡの標的送達。
[0677]ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートしたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（表１）を、ＡＳＧＰＲを発現するげっ歯類、非ヒト霊長類およびヒト初代肝細胞、および／または肝癌細胞株と共にインキュベートして、細胞へのＡＳＧＰＲ媒介取り込みを可能にする。遺伝子編集タンパク質をコードするｍＲＮＡは、リポフェクタミンもしくは同等のトランスフェクション剤を使用する単純なトランスフェクションによって、またはタンパク質を発現するためにＡＡＶまたはＡＶベクターを使用することによって、これらの細胞株に送達される。
[0677]ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートしたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（表１）を、ＡＳＧＰＲを発現するげっ歯類、非ヒト霊長類およびヒト初代肝細胞、および／または肝癌細胞株と共にインキュベートして、細胞へのＡＳＧＰＲ媒介取り込みを可能にする。遺伝子編集タンパク質をコードするｍＲＮＡは、リポフェクタミンもしくは同等のトランスフェクション剤を使用する単純なトランスフェクションによって、またはタンパク質を発現するためにＡＡＶまたはＡＶベクターを使用することによって、これらの細胞株に送達される。
[0678]ｇＲＮＡおよび修飾ｇＲＮＡを、ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートした相補的な短いオリゴヌクレオチドでアニーリングし、ＡＳＧＰＲを発現するげっ歯類、非ヒト霊長類およびヒト初代肝細胞、ならびにＨｅｐＧ２細胞株とインキュベートして、ＡＳＧＰＲを介した細胞への取り込みを可能にする。肝細胞および肝癌細胞における遺伝子編集は、ｇＲＮＡとのインキュベーション後１２～３６時間後にアッセイされる。
実施例６．肝細胞における遺伝子編集。
[0679]ＲＮＡは、ＡＡＶまたはＡＶベクターを使用してＡＳＧＰＲ発現細胞株に送達され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を発現することが可能になる。次いで、細胞株を、表２または３の、または表２および３から構成されるＧａｌＮＡｃコンジュゲートガイドＲＮＡと共にインキュベートする。受容体発現細胞へのＧａｌＮＡｃコンジュゲートのガイドＲＮＡのＡＳＧＰＲ媒介送達。細胞に取り込まれた後のガイドＲＮＡは、発現したＲＮＰと複合体を形成し、遺伝子編集を誘発する。
[0679]ＲＮＡは、ＡＡＶまたはＡＶベクターを使用してＡＳＧＰＲ発現細胞株に送達され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を発現することが可能になる。次いで、細胞株を、表２または３の、または表２および３から構成されるＧａｌＮＡｃコンジュゲートガイドＲＮＡと共にインキュベートする。受容体発現細胞へのＧａｌＮＡｃコンジュゲートのガイドＲＮＡのＡＳＧＰＲ媒介送達。細胞に取り込まれた後のガイドＲＮＡは、発現したＲＮＰと複合体を形成し、遺伝子編集を誘発する。
[0680]表１のＧａｌＮＡｃによる修飾ガイドＲＮＡは、特定の間隔、すなわちＲＮＡをコードするＡＡＶまたはＡＶベクターを投与してから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日後、または１４日を超えた後の時点で、細胞株とインキュベートされる。ｇＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃの異なる濃度は、遺伝子編集因子ＲＮＡ ＡＡＶおよびまたはＡＶベクターの異なる間隔で投与後に評価される。肝細胞および肝癌細胞における遺伝子編集は、ｇＲＮＡとのインキュベーションの１２～３６時間後にアッセイされる。
実施例７．目的のＲＮＰをコードするＲＮＡは、インビトロでＡＳＧＰＲ発現細胞系においてタンパク質を発現するために、ＬＮＰ媒介送達によって投与される。
[0681]表１のＧａｌＮＡｃによる修飾ガイドＲＮＡは、特定の間隔、すなわちｍＲＮＡ投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、または３６時間後に細胞株とインキュベートされる。ｍＲＮＡとガイドの異なる重量およびモル比も、同じ実験条件下で評価される。最高のｍＲＮＡとガイドの比は、１００：１で、最低は１：１００である。１００：１から１：１００の間の比も評価される。処置動物の肝臓における遺伝子編集は、ｇＲＮＡとの２４～９６時間のインキュベーション後にアッセイされ、結果は同じ時点で未処置の対照と比較される。
[0681]表１のＧａｌＮＡｃによる修飾ガイドＲＮＡは、特定の間隔、すなわちｍＲＮＡ投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、または３６時間後に細胞株とインキュベートされる。ｍＲＮＡとガイドの異なる重量およびモル比も、同じ実験条件下で評価される。最高のｍＲＮＡとガイドの比は、１００：１で、最低は１：１００である。１００：１から１：１００の間の比も評価される。処置動物の肝臓における遺伝子編集は、ｇＲＮＡとの２４～９６時間のインキュベーション後にアッセイされ、結果は同じ時点で未処置の対照と比較される。
実施例８．げっ歯類および非ヒト霊長類におけるインビボでの肝臓における遺伝子編集。
[0682]ＲＮＡは、ＡＡＶまたはＡＶベクターを使用してげっ歯類および非ヒト霊長類の肝臓に送達され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を発現させる。表２もしくは３からの、または表２および３から構成されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートのガイドＲＮＡの皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）投与により、肝細胞へのＧａｌＮＡｃコンジュゲートのガイドＲＮＡのＡＳＧＰＲ媒介送達が可能になる。肝細胞に取り込まれた後のガイドＲＮＡは、発現したＲＮＰと複合体を形成し、ＲＮＰ－ガイドＲＮＡ複合体を形成して遺伝子編集を生じる。
[0682]ＲＮＡは、ＡＡＶまたはＡＶベクターを使用してげっ歯類および非ヒト霊長類の肝臓に送達され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を発現させる。表２もしくは３からの、または表２および３から構成されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートのガイドＲＮＡの皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）投与により、肝細胞へのＧａｌＮＡｃコンジュゲートのガイドＲＮＡのＡＳＧＰＲ媒介送達が可能になる。肝細胞に取り込まれた後のガイドＲＮＡは、発現したＲＮＰと複合体を形成し、ＲＮＰ－ガイドＲＮＡ複合体を形成して遺伝子編集を生じる。
[0683]表１のＧａｌＮＡｃによる修飾ガイドＲＮＡは、一定の間隔、すなわちＲＮＡをコードするＡＡＶもしくはＡＶベクターを投与した後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日後に、または１４日を超えた後の時点で皮下または静脈内に投与される。ｇＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃの異なる濃度は、遺伝子編集因子ＲＮＡ ＡＡＶおよびまたはＡＶベクターの異なる間隔で投与後に評価される。処置動物の肝臓における遺伝子編集は、ｇＲＮＡとの２４～９６時間のインキュベーション後にアッセイされ、結果は同じ時点で未処置の対照と比較される。
実施例９．インビボ投与
[0684]目的のＲＮＰをコードするＲＮＡは、３０分～１２０分の範囲の期間にわたるＩＶ注入により、ＬＮＰ媒介送達によってげっ歯類および非ヒト霊長類に投与される。注入時間は、ＬＮＰ製剤の総投与量および／または総投与容量に基づいて決定される。特定のＬＮＰ投与では、急性注入関連反応を回避するために、サルをステロイド前処置に供する。生理食塩水または同等の希釈液中の表１のＧａｌＮＡｃによる修飾ガイドＲＮＡは、特定の間隔、すなわち、ｍＲＮＡを投与した後０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４または３６時間後に皮下から静脈内に投与される。ガイドに対するｍＲＮＡの異なる重量とモル比も、同じ実験条件下で評価される。最高のｍＲＮＡとガイドの比は１００：１で、最低は１：１００である。１００：１から１：１００の間の比も評価される。処置動物の肝臓における遺伝子編集は、ｇＲＮＡとの２４～９６時間のインキュベーション後にアッセイされ、結果は同じ時点で未処置の対照と比較される。
[0684]目的のＲＮＰをコードするＲＮＡは、３０分～１２０分の範囲の期間にわたるＩＶ注入により、ＬＮＰ媒介送達によってげっ歯類および非ヒト霊長類に投与される。注入時間は、ＬＮＰ製剤の総投与量および／または総投与容量に基づいて決定される。特定のＬＮＰ投与では、急性注入関連反応を回避するために、サルをステロイド前処置に供する。生理食塩水または同等の希釈液中の表１のＧａｌＮＡｃによる修飾ガイドＲＮＡは、特定の間隔、すなわち、ｍＲＮＡを投与した後０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４または３６時間後に皮下から静脈内に投与される。ガイドに対するｍＲＮＡの異なる重量とモル比も、同じ実験条件下で評価される。最高のｍＲＮＡとガイドの比は１００：１で、最低は１：１００である。１００：１から１：１００の間の比も評価される。処置動物の肝臓における遺伝子編集は、ｇＲＮＡとの２４～９６時間のインキュベーション後にアッセイされ、結果は同じ時点で未処置の対照と比較される。
実施例１０．インビトロでの肝細胞への遺伝子編集因子ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的送達。
[0685]ＡＳＧＰＲ発現初代肝細胞を、遺伝子編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体およびガイドＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートとインキュベートして、肝細胞における標的遺伝子の編集を行う。遺伝子－編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体およびｇＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは次のとおりである：
（１）重量で１００：１～１：１００の範囲の異なるｍＲＮＡとｇＲＮＡの比、およびその間のいくつかの比で共培養。
（２）遺伝子－編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体を最初に細胞株と、次に表２もしくは３の異なる比のｇＲＮＡ－ガイドとインキュベートし、または表２および３から構成されるものを、同じ細胞株と、すなわち、ｍＲＮＡ投与後０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４または３６時間の間隔でインキュベートする。ｍＲＮＡとガイドの異なる重量およびモル比も、同じ実験条件下で評価される。最高のｍＲＮＡとガイドの比は１００：１で、最低は１：１００である。１００：１から１：１００の間の比も評価される。
[0685]ＡＳＧＰＲ発現初代肝細胞を、遺伝子編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体およびガイドＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートとインキュベートして、肝細胞における標的遺伝子の編集を行う。遺伝子－編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体およびｇＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは次のとおりである：
（１）重量で１００：１～１：１００の範囲の異なるｍＲＮＡとｇＲＮＡの比、およびその間のいくつかの比で共培養。
（２）遺伝子－編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体を最初に細胞株と、次に表２もしくは３の異なる比のｇＲＮＡ－ガイドとインキュベートし、または表２および３から構成されるものを、同じ細胞株と、すなわち、ｍＲＮＡ投与後０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４または３６時間の間隔でインキュベートする。ｍＲＮＡとガイドの異なる重量およびモル比も、同じ実験条件下で評価される。最高のｍＲＮＡとガイドの比は１００：１で、最低は１：１００である。１００：１から１：１００の間の比も評価される。
[0686]処理細胞における遺伝子編集を、ｇＲＮＡとのインキュベーション後２４～３６時間後にアッセイし、その結果を未処理対照と同じ時点で比較する。
実施例１１．げっ歯類および非ヒト霊長類におけるインビボでの肝臓への遺伝子編集因子ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的送達。
実施例１１．げっ歯類および非ヒト霊長類におけるインビボでの肝臓への遺伝子編集因子ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的送達。
[0687]遺伝子編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体およびｇＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、肝細胞で標的遺伝子の編集を生じる。遺伝子編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体およびｇＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは次のとおりである：
（１）重量で１００：１～１：１００の範囲の異なるｍＲＮＡとｇＲＮＡの比、およびその間のいくつかの比で、皮下または静脈内に同時投与。
（２）遺伝子編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体を最初に細胞株と、次に表２もしくは３の異なる比のｇＲＮＡガイドとインキュベートするか、または表１および２から構成されるものを、同じ細胞株と、すなわち、ｍＲＮＡ投与後０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４または３６時間の間隔でインキュベートする。ｍＲＮＡとガイドの異なる重量およびモル比も、同じ実験条件下で評価される。最高のｍＲＮＡとガイドの比は１００：１で、最低は１：１００である。１００：１から１：１００の間の比も評価される。
（１）重量で１００：１～１：１００の範囲の異なるｍＲＮＡとｇＲＮＡの比、およびその間のいくつかの比で、皮下または静脈内に同時投与。
（２）遺伝子編集因子ｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ単一化学実体を最初に細胞株と、次に表２もしくは３の異なる比のｇＲＮＡガイドとインキュベートするか、または表１および２から構成されるものを、同じ細胞株と、すなわち、ｍＲＮＡ投与後０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４または３６時間の間隔でインキュベートする。ｍＲＮＡとガイドの異なる重量およびモル比も、同じ実験条件下で評価される。最高のｍＲＮＡとガイドの比は１００：１で、最低は１：１００である。１００：１から１：１００の間の比も評価される。
実施例１２．ＲＮＰ－ｇＲＮＡ複合体の調製および組み込む評価
[0688]処置動物の肝臓における遺伝子編集を、ｇＲＮＡとのインキュベーション後の２４～９６時間後にアッセイし、その結果を未処置対照と同じ時点で比較する。
[0688]処置動物の肝臓における遺伝子編集を、ｇＲＮＡとのインキュベーション後の２４～９６時間後にアッセイし、その結果を未処置対照と同じ時点で比較する。
実施例１３．げっ歯類および非ヒト霊長類へのｇＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃおよびｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃの単一化学実体ならびに表１および２のもののインビボ投与。
[0689]表１および２の単一化学実体ｇＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃおよびｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃを、投与前にナノ粒子の他の成分と混合する。投与されるｇＲＮＡとｍＲＮＡは、ナノ粒子組成物に個別に製剤化される。あるいは、ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡは、ナノ粒子の形成前に事前に混合されてもよい。混合後、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを投与し、処置動物の肝臓における遺伝子編集を実施例１１に記載のようにアッセイする。
[0689]表１および２の単一化学実体ｇＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃおよびｍＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃを、投与前にナノ粒子の他の成分と混合する。投与されるｇＲＮＡとｍＲＮＡは、ナノ粒子組成物に個別に製剤化される。あるいは、ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡは、ナノ粒子の形成前に事前に混合されてもよい。混合後、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを投与し、処置動物の肝臓における遺伝子編集を実施例１１に記載のようにアッセイする。
実施例１４．インビトロおよびインビボでの肝細胞への標的送達のためのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを構成するためのＮ－アセチルガルコサミン－脂質（ＧａｌＮＡｃ－脂質）コンジュゲートの合成。
[0690]
[0691]
実施例１５．ＧａｌＮＡｃ－脂質１０４２、１０４３および１０４４の合成。
[0692]化合物２００２は、報告された手順（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．、２０１０、１２、５２６２）に従って調製した。化合物２００２（１モル当量）、アクリロニトリル（４．６モル当量）および５ＭのＮａＯＨ水溶液（０．１６６容積）およびＴＨＦ（１０．０容積）は、周囲温度で４８時間撹拌した。この反応混合物を、濃縮して、残渣を、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、５．０容積）に溶解し、そして水およびブラインで洗浄した。有機層を、濃縮して、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ溶出液を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物２００３を、淡黄色の液体として得た（収率：５０％）。
[0692]化合物２００２は、報告された手順（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．、２０１０、１２、５２６２）に従って調製した。化合物２００２（１モル当量）、アクリロニトリル（４．６モル当量）および５ＭのＮａＯＨ水溶液（０．１６６容積）およびＴＨＦ（１０．０容積）は、周囲温度で４８時間撹拌した。この反応混合物を、濃縮して、残渣を、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、５．０容積）に溶解し、そして水およびブラインで洗浄した。有機層を、濃縮して、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ溶出液を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物２００３を、淡黄色の液体として得た（収率：５０％）。
[0693]化合物２００３（１モル当量）およびラネーニッケル（Ｒａｎｅｙ－Ｎｉ）（２００ｗ／ｗ％）を、１：１の２５％のアンモニア／水溶液（１０．０容積）に懸濁し、５０ｋｇ／ｃｍ３圧で水素化した。この反応混合物を、セライトを通して濾過し、濃縮して化合物２００４を淡黄色の液体として得た（収率：８４％）。
[0694]アミン２００４（１モル当量）、化合物２００５（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４、１３６、１６９５８；３．６モル当量）をＤＭＦ（１０容積）中のＥＤＣ・ＨＣｌ（４モル当量）、ＨＯＢｔ（０．１モル当量）およびＤＩＥＡ（１０モル当量）と０℃～ＲＴで１６時間撹拌した。この反応混合物を、氷－水中に移し、上層を、デカントした。残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、５％のクエン酸水溶液、続いて５％のＮａ２ＣＯ３水溶液およびブラインで洗浄した。有機層を濃縮して、粗化合物を泡沫状の固体として得た。このようにして得られた粗生成物を、次にカラムクロマトグラフィーによって精製して、所望の化合物２００６を得た（５２％）。
[0695]化合物２００６（１モル当量）を、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸（４容積）と、０℃～ＲＴで２４時間撹拌した。この反応混合物を濃縮して揮発性物質を除去した；残渣をトルエン（２容積×２）と共蒸留した。残渣をメタノール（１容積）およびｎ－ヘキサン（１０容積）に溶解し；上層をデカントして、残渣をジクロロメタンに溶解した。溶媒および揮発性物質を真空中でエバポレートして、化合物２００７を無色のペーストとして得た（収率：１００％）。
[0696]化合物２００８（１モル当量）および４－ニトロフェニルクロロホルメート（４モル当量）を、ジクロロメタン（１０容積）と、ピリジン（４モル当量）の存在下で、周囲温度で４時間撹拌した。この反応混合物を、真空中でエバポレートして、残渣をカラムクロマトグラフィー精製して、化合物２００９を得た。
[0697]化合物２００９（１モル当量）を、ジクロロメタン（１０容積）中のアミン２０１０（１．５モル当量）と、ピリジン（２モル当量）の存在下で、周囲温度で一晩撹拌した。この反応混合物を、水で希釈した。生成物を、ジクロロメタン中に抽出し、濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物２０１１を得た（収率：８１％）。２０１１（１モル当量）をジクロロメタン中のギ酸（５容積）で、周囲温度で６時間処理。溶媒および揮発性物質を真空中で除去した。残渣をトルエンで２回、およびジエチルエーテルで洗浄し、化合物２０１２を得た（収率：８０％）。
[0698]化合物２００９（１モル当量）を、ピリジン（２モル当量）の存在下、ジクロロメタン（１０容積）中のアミン２０１３（１．５モル当量）と共に周囲温度で一晩撹拌した。反応混合物を水で希釈した。生成物をジクロロメタンで抽出し、濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物２０１４を得た（収率：６５％）。２０１４（１モル当量）をジクロロメタン中のギ酸（５容積）で、周囲温度で６時間処理。溶媒および揮発性物質を真空中で除去した。残渣をトルエンで２回、ジエチルエーテルで洗浄し、化合物２０１５を得た（収率：８７％）。
[0699]化合物２００９（１モル当量）を、ピリジン（２モル当量）の存在下、ジクロロメタン（１０容積）中のアミン２０１６（１．５モル当量）と共に周囲温度で一晩撹拌した。反応混合物を水で希釈した。生成物をジクロロメタンで抽出し、濃縮乾固した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物２０１７を得た（収率：５１％）。周囲温度で６時間、ジクロロメタン（２容積）中のギ酸（５容積）で２０１７（１モル当量）を処理。溶媒および揮発性物質を真空中で除去した。残渣をトルエンで２回、ジエチルエーテルで洗浄し、化合物２０１８を得た（収率：８７％）。
[0700]化合物２００７（１モル当量）および化合物２０１５（１．１モル当量）を、ジクロロメタン（１０容積）中のＨＢＴＵ（１．２モル当量）、ＨＯＢｔ（０．１モル当量）およびＤＩＥＡ（３モル当量）と、２時間の撹拌下で、０℃～ＲＴで混合した。反応混合物を水で洗浄し、有機層を真空中で濃縮した。次いで、粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２０２０を得た（収率：３５％）。エタノール（３ｍＬ）中の化合物２０２０（０．７ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（６ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下４０℃で濃縮する。得られた残渣をジエチルエーテル（２×５ｍＬ）およびアセトニトリル（３×５ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１０４３をオフホワイトの固体として得る（２００ｍｇ、収率：３８．８７％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.70-7.80 (m, 2H), 7.60 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.05-7.15 (m, 4H), 4.44-4.57 (m, 9H), 4.20 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 3.86-3.98 (m, 2H), 3.62-3.68 (m, 9H), 3.46-3.55 (m, 55H), 3.25-3.39 (m, 18H), 3.02-3.08 (m, 8H), 2.02 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.78 (s, 9H), 1.56-1.69 (m, 12 H), 1.40-1.48 (m, 17H), 1.22 (s, 56H), 0.82-0.85 (m, 6H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋Ｎａ］＋理論値２５９８．７１および２６２０．７；実測値２５９８．７２および２６２０．７３。
[0701]化合物２００７（１モル当量）および化合物２０１８（１．１モル当量）を、ジクロロメタン（１０容積）中のＨＢＴＵ（１．２モル当量）、ＨＯＢｔ（０．１モル当量）、およびＤＩＥＡ（３モル当量）と、０℃～ＲＴで２時間撹拌しながら混合した。この反応混合物を水で洗浄し、有機層を真空中で濃縮した。次いで、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２０２１を得た（収率：３０％）。エタノール（３ｍＬ）中の化合物２０２１（０．８ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（６ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣をジエチルエーテル（２×５ｍＬ）およびアセトニトリル（３×５ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて化合物１０４４をオフホワイトの固体として得た（４５０ｍｇ、収率：７０％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.71-7.74 (m, 1H), 7.61 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.10-7.14 (m, 1H), 4.52-4.62 (m, 2H), 4.46 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.19(d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.86-3.98 (m, 1H), 3.61-3.68 (m, 4H), 3.46-3.55 (m, 57 H), 3.27-3.42 (m, 8H), 3.0-3.15 (m, 3H), 2.0-2.03 (m, 2H), 1.78-1.81 (m, 3H), 1.65-1.69(m, 2H), 1.56-1.59 (m, 2H), 1.38-1.49 (m, 6H), 1.15-1.25 (m, 23H), 0.81-0.85 (m, 2H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋ＮＨ４］＋理論値３６７２．３４；実測値３６７２．３７。
[0702]エタノール（３ｍＬ）中の２０１９（８５０ｍｇ、００２７４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（６ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣をジエチルエーテル（５×１５ｍＬ）およびアセトニトリル（５×１０ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１０４２をオフホワイトの固体として得た（４００ｍｇ、収率：６７．５％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.71 (t, J = 5.6 Hz, 3H), 7.59 (d, J = 9.2 Hz, 3H), 7.12-7.15 (m, 2H), 4.52-4.57 (m, 6H), 4.44 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.20 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 3.86-3.98 (m, 2H), 3.62-3.68 (m, 9H), 3.45-3.53 (m, 22H), 3.31-3.39 (m, 19H), 3.02-3.10 (m, 9H), 2.02 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 1.78 (s, 9H), 1.64-1.70 (m, 6 H), 1.54-1.61 (m, 6H), 1.38-1.49 (m, 18H), 1.21 (s, 62H), 0.82-0.85 (m, 6H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値２１５８．４４；実測値２１５８．４５。
実施例１６．ＧａｌＮＡｃ－脂質１００２、１００３および１００４の合成。
[0703]化合物２０２２（１モル当量）および化合物２０２２Ａ（１モル当量）を、ＤＭＦ中のＤＩＥＡ（２モル当量）およびＨＯＢｔ（０．１モル当量）の存在下で、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１．１モル当量）と０℃～ＲＴで１６時間撹拌した。反応混合物を氷水にゆっくり注ぎ、上層をデカントした。残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、５％クエン酸水溶液、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液、続いて水およびブラインによって洗浄した。有機層を濃縮して、化合物２０２３を泡沫状固体として得た（収率：８８．７％）。このようにして得られた粗生成物は、さらに精製することなく次の工程に使用され得る。
[0703]化合物２０２２（１モル当量）および化合物２０２２Ａ（１モル当量）を、ＤＭＦ中のＤＩＥＡ（２モル当量）およびＨＯＢｔ（０．１モル当量）の存在下で、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１．１モル当量）と０℃～ＲＴで１６時間撹拌した。反応混合物を氷水にゆっくり注ぎ、上層をデカントした。残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、５％クエン酸水溶液、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液、続いて水およびブラインによって洗浄した。有機層を濃縮して、化合物２０２３を泡沫状固体として得た（収率：８８．７％）。このようにして得られた粗生成物は、さらに精製することなく次の工程に使用され得る。
[0704]化合物２０２３（１モル当量）をジクロロメタン（４容量）中のトリフルオロ酢酸（４容量）と共に０℃～ＲＴで２４時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮して揮発性物質を除去し、残渣をトルエンと共蒸留した。このようにして得られた残渣をメタノール（１容量）に溶解し、１０容量のｎ－ヘキサンを添加した。上層をデカントし、ガム状の塊をジクロロメタンに溶解し、エバポレートさせて化合物２０２４を無色のペーストとして得た（収率：９４．３％）。
[0705]化合物２０２４（１モル当量）および化合物２００５（３．６モル当量）を、ＤＭＦ（１０容積）中のＤＩＥＡ（１０モル当量）およびＨＯＢｔ（０．１モル当量）の存在下で、ＥＤＣ．ＨＣｌ（４モル当量）と０℃～ＲＴで１６時間撹拌した。反応混合物を氷水にゆっくり注ぎ、上層をデカントした。残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、５％クエン酸水溶液、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液、続いて水およびブライン洗浄で洗浄した。有機層を泡沫状固体に濃縮し、次いで、これをカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２０２５を泡沫状固体として得た（収率：７０％）。
[0706]化合物２０２５（１モル当量）をＴＨＦ：ＩＰＡ（１：３、１０容積）中の１０％Ｐｄ－Ｃ上に懸濁させ、常圧で水素化した。反応混合物を、セライト床を通して濾過した。濾液を真空で濃縮してオフホワイトの固体にし、続いてこれをカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物２０２６を得た（収率：５８％）。
[0707]化合物２０２６（１モル当量）および化合物２０１２（１．１モル当量）をジクロロメタン（１０容積）中のＤＩＥＡ（３モル当量）およびＨＯＢｔ（０．１モル当量）の存在下で、ＨＢＴＵ（１．２モル当量）と０℃～ＲＴで２時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、有機層を濃縮して粗化合物を薄茶色の泡沫状固体として得た。粗生成物のカラムクロマトグラフィー精製により、化合物２０２７を得た（収率：６０．７％）。メタノール（１４．０ｍＬ）中の２０２７（１．４ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、メタノール（１ｍＬ）中のナトリウムメトキシド（２６．０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の溶液を０℃±５℃で添加し、得られた反応混合物を室温まで２時間加温した。反応混合物を、ＤＣＭ（５．０ｍＬ）で希釈し、樹脂ＤｏｗｅｘでｐＨ約５～６に酸性化した。反応混合物をブフナー漏斗で濾過し、濾液を減圧下４０℃で濃縮した。得られた残渣を、ジエチルエーテル（５×２０ｍＬ）およびアセトニトリル（５×１０ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１００３をオフホワイトの固体として得た（０．５ｇ、収率：５２．９％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.11 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.83 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.69-7.74 (m, 2H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 3H), 7.18 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.52-4.60 (m, 1H), 4.20-4.25 (m, 3H), 3.80-4.05 (m, 19H), 3.64-3.74 (m, 10H), 3.42-3.52 (m, 17H), 3.25-3.40 (m, 16H), 2.97-3.10 (m, 9H), 2.30-2.41 (m, 2H), 2.01-2.08 (m, 6H), 1.79 (s, 9 H), 1.42-1.50 (m, 21 H), 1.22 (s, 61H), 0.82-0.86 (m, 6H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋Ｎａ］＋理論値１９５１．３１および１９７３．３１；実測値１９５１．３１および１９７３．２９。
[0708]化合物２０２６（１モル当量）および化合物２０１２（１．１モル当量）を、ジクロロメタン（１０容積）中のＤＩＥＡ（３モル当量）およびＨＯＢｔ（０．１モル当量）の存在下で、ＨＢＴＵ（１．２モル当量）と０℃～ＲＴで２時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、有機層を濃縮して粗化合物を薄茶色の泡沫状固体として得た。粗生成物のカラムクロマトグラフィー精製により、化合物２０２８を得た（収率：６８．７％）。エタノール（３．０ｍＬ）中の２０２８（１．２ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（６．０ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を、４０℃で４８時間加温した。反応混合物を、減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣をジエチルエーテル（３×１０ｍＬ）およびアセトニトリル（４×１０ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、化合物１００２をオフホワイトの固体として得た（４７０ｍｇ、収率：５４．５％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.09 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.81 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.67-7.72 (m, 2H), 7.60 (d, J = 9.2 Hz, 3H), 7.13 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.52-4.58 (m, 7H), 4.44 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.20 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 3.86-3.98 (m, 3H), 3.57-3.71 (m, 10H), 3.42-3.52 (m, 55H), 2.94-3.11 (m, 8H), 2.0-2.06 (m, 6H), 1.78 (s, 9 H), 1.35-1.75 (m, 21 H), 1.22 (s, 60H), 0.80-0.85 (m, 6H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値２３９１．５７；実測値２３９１．５８。
[0709]化合物２０２６（１モル当量）および化合物２０１８（１．１モル当量）を、ジクロロメタン（１０容積）中のＤＩＥＡ（３モル当量）およびＨＯＢｔ（０．１モル当量）の存在下でＨＢＴＵ（１．２モル当量）と、０℃～ＲＴで２時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、有機層を濃縮して粗化合物を薄茶色の泡沫状固体として得た。粗生成物のカラムクロマトグラフィー精製により、化合物２０２９が得られた（収率：６８．７％）。エタノール（２．０ｍＬ）中の２０２９（０．５５ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（４．０ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣を、ジエチルエーテル（２×５ｍＬ）およびアセトニトリル（３×５ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１００４をオフホワイトの固体として得た（２３０ｍｇ、収率：５３．１７％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.11 (d, J = 10 Hz, 1H), 7.85-7.95 (m, 1H), 7.70-7.80 (m, 1H), 7.62 (d, J = 11.6 Hz, 2H), 7.14 (bs, 1H), 4.47-4.57 (m, 8H), 4.21 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 3.95-4.05 (m, 3H), 3.86-3.96 (m, 3H), 3.63-3.67 (m, 13H), 3.28-3.38 (m, 30H), 2.95-3.15 (m, 10H), 1.95-2.15 (m, 6H), 1.79 (s, 9 H), 1.35-1.45 (m, 20 H), 1.22 (s, 52H), 0.85-0.95 (m, 6H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値３４４８．２０；実測値３４４８．２１。
実施例１７．ＧａｌＮＡｃ－脂質１０１３および１０５２の合成。
[0710]クロロギ酸コレステリルを、化合物２０１３と、ジクロロメタン中で塩基の存在下で反応させて、化合物２０３０を得た。化合物２０３０を、ＴＨＦ中で、ギ酸で処理して、化合物２０３１を得た。実施例１６に記載のように、化合物２０３１を化合物２００７と反応させて、化合物２０３２を得た。エタノール（３ｍＬ）中の２０３２（８８０ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（６ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を、４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣を、ジエチルエーテル（１０×１０ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１０５２をオフホワイトの固体として得た（５００ｍｇ、収率：７９．５％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.65-7.75 (m, 1H), 7.81 (bs, 1H), 7.70-7.80 (m, 1H), 7.59-7.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.0-7.11 (bs, 3H), 5.30 (s, 1H), 4.50-4.70 (m, 6H), 4.40-4.50 (m, 3H), 4.26-4.44 (m, 3H), 3.61-3.67 (m, 8H), 3.35-3.47 (m, 45H), 2.95-3.07 (m, 8H), 1.95-2.01 (m, 6H), 1.76 (s, 13 H), 1.30-1.47 (m, 26 H), 1.05-1.15 (m, 8H), 0.95-1.0 (m, 4H), 0.8-0.95 (m, 8H), 0.65 (s, 3H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値２３７４．９１；実測値２３７４．３７。
[0710]クロロギ酸コレステリルを、化合物２０１３と、ジクロロメタン中で塩基の存在下で反応させて、化合物２０３０を得た。化合物２０３０を、ＴＨＦ中で、ギ酸で処理して、化合物２０３１を得た。実施例１６に記載のように、化合物２０３１を化合物２００７と反応させて、化合物２０３２を得た。エタノール（３ｍＬ）中の２０３２（８８０ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（６ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を、４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣を、ジエチルエーテル（１０×１０ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１０５２をオフホワイトの固体として得た（５００ｍｇ、収率：７９．５％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.65-7.75 (m, 1H), 7.81 (bs, 1H), 7.70-7.80 (m, 1H), 7.59-7.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.0-7.11 (bs, 3H), 5.30 (s, 1H), 4.50-4.70 (m, 6H), 4.40-4.50 (m, 3H), 4.26-4.44 (m, 3H), 3.61-3.67 (m, 8H), 3.35-3.47 (m, 45H), 2.95-3.07 (m, 8H), 1.95-2.01 (m, 6H), 1.76 (s, 13 H), 1.30-1.47 (m, 26 H), 1.05-1.15 (m, 8H), 0.95-1.0 (m, 4H), 0.8-0.95 (m, 8H), 0.65 (s, 3H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値２３７４．９１；実測値２３７４．３７。
[0711]エタノール（３ｍＬ）中の２０３３（７３０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（６ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を、４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣を、ジエチルエーテル（５×１０ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１０１３をオフホワイトの固体として得た（５００ｍｇ、収率：９７．９％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.08 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.80-7.90 (m, 1H), 7.65-7.75 (m, 2H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.0-7.11 (m, 3H), 5.30 (s, 1H), 4.51-4.55 (m, 6H), 4.44-4.45 (m, 2H), 4.17-4.27 (m, 3H), 3.62-3.70 (m, 8H), 3.37-3.60 (m, 45H), 2.95-3.15 (m, 8H), 1.95-2.10 (m, 6H), 1.76 (s, 9 H), 1.25-1.75 (m, 30 H), 1.05-1.20 (m, 9H), 0.80-1.0 (m, 12H), 0.45-.55 (m, 3H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値２１８１．６７；実測値２１８２．３２。
実施例１８．ＧａｌＮＡｃ－脂質１０１４および１０５３の合成。
[0712]エタノール（３ｍＬ）中の２０３７（０．９ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（６ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣をジエチルエーテル（６×１０ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１０１４（３００ｍｇ、収率：４２．９７％）をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.10 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.83 (t, , J = 6.8 Hz, 1H), 7.72 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 7.02 (t, , J = 5.2 Hz, 1H), 5.33 (bs, 1H), 4.53-4.59 (m, 7H), 4.46 (d, , J = 4.0 Hz, 3H), 4.20-4.32 (m, 4H), 3.63-3.72 (m, 11H), 3.30-3.60 (m, 157H), 2.95-3.15 (m, 9H), 2.26-2.38 (m, 3H), 2.03-2.08 (m, 6 H), 1.90-2.0 (m, 2H), 1.75-1.86 (m, 13H), 1.30-1.60 (m, 31H), 0.95-1.15 ( m, 13H), 0.83-0.90 (m, 10H), 0.64 (s, 3H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値３２３８．９４；実測値３２３８．９５。
[0712]エタノール（３ｍＬ）中の２０３７（０．９ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（６ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣をジエチルエーテル（６×１０ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１０１４（３００ｍｇ、収率：４２．９７％）をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.10 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.83 (t, , J = 6.8 Hz, 1H), 7.72 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 7.02 (t, , J = 5.2 Hz, 1H), 5.33 (bs, 1H), 4.53-4.59 (m, 7H), 4.46 (d, , J = 4.0 Hz, 3H), 4.20-4.32 (m, 4H), 3.63-3.72 (m, 11H), 3.30-3.60 (m, 157H), 2.95-3.15 (m, 9H), 2.26-2.38 (m, 3H), 2.03-2.08 (m, 6 H), 1.90-2.0 (m, 2H), 1.75-1.86 (m, 13H), 1.30-1.60 (m, 31H), 0.95-1.15 ( m, 13H), 0.83-0.90 (m, 10H), 0.64 (s, 3H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値３２３８．９４；実測値３２３８．９５。
[0713]エタノール（６ｍＬ）中の２０３６（１．２ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（１２ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を４０℃で４８時間加温した。反応混合物を減圧下、４０℃で濃縮した。得られた残渣をジエチルエーテル（１２×１０ｍＬ）で摩砕し、真空下で乾燥させて、１０５３をオフホワイトワックスとして得た（５００ｍｇ、収率：５３．０％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.70-7.75 (m, 2H), 7.59 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.95-7.15 (m, 4H), 5.32 (bs, 1H), 4.51-4.56 (m, 2H), 4.44-4.45 (m, 1H), 4.18 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.61-3.67 (m, 4H), 3.34-3.67 (m, 51H), 3.29-3.34 (m, 6H), 3.03-3.05 (m, 3H), 2.0-2.04 (m, 3H), 1.88-1.96 (m, 2H), 1.76 (s, 4H), 1.65-1.75 (m, 2H), 1.55-1.65 (m, 3H), 1.30-1.50 (m, 8H), 1.0-1.20 (m, 3H), 0.90-0.93 (m, 1H), 0.86 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 0.81 (dd, J = 6.4 Hz, J = 1.6 Hz, 2H), 0.6 (s, 1H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値３４４６．０５；実測値３４４６．０８。
実施例１９．ＧａｌＮＡｃ－脂質１０６２および１０６５の合成。
[0714]化合物２０３８を、塩基の存在下でクロロギ酸４－ニトロフェニルと反応させて、対応する炭酸４－ニトロフェニルを形成する。このようにして形成された炭酸塩を化合物２０１６と反応させて、化合物２０３９を得る。化合物２０３９をギ酸で処理して、化合物２０４０を得る。化合物２０４０を、実施例１５に記載のペプチドカップリング条件下で２００７にカップリングさせて、化合物２０４１を得る。化合物２０４１を、ＮａＯＭｅに続いて、実施例１５／１６に記載のように後処理および精製して、化合物１０６２を得た。
[0714]化合物２０３８を、塩基の存在下でクロロギ酸４－ニトロフェニルと反応させて、対応する炭酸４－ニトロフェニルを形成する。このようにして形成された炭酸塩を化合物２０１６と反応させて、化合物２０３９を得る。化合物２０３９をギ酸で処理して、化合物２０４０を得る。化合物２０４０を、実施例１５に記載のペプチドカップリング条件下で２００７にカップリングさせて、化合物２０４１を得る。化合物２０４１を、ＮａＯＭｅに続いて、実施例１５／１６に記載のように後処理および精製して、化合物１０６２を得た。
[0715]化合物１０６５は、上記のように化合物２０４０および２０２６から調製される。
実施例２０．ＧａｌＮＡｃ－脂質１０６２および１０６５の合成。
実施例２０．ＧａｌＮＡｃ－脂質１０６２および１０６５の合成。
[0716]化合物２０３８を、塩基の存在下でクロロギ酸４－ニトロフェニルと反応させて、対応する炭酸４－ニトロフェニルを形成する。このようにして形成された炭酸塩を、ジクロロメタン中で塩基の存在下、化合物２０１３と反応させて、化合物２０４３を得る。化合物２０４３を、ＴＨＦ中のギ酸で処理して、化合物２０４４を得る。化合物２０４４を、実施例１６に記載のように化合物２００７と反応させて、化合物２０４５を得る。化合物２０４５をＮａＯＭｅで処理し、続いて同様の後処理および精製を行い、化合物１０６２を得る。
[0717]化合物１０６５は、上記のように化合物２０４４および２０２６から調製される。化合物１０８３、１０８４および１０８５もまた、上記の１００４の調製に従って同様の方法でガラクトースから調製され得る。
実施例２０Ａ：ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７６の例示的な合成：
[0718]ＤＣＭ（４６ｍＬ）中の３０００（４．６ｇ、９．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ピリジン（３．０ｍＬ）をＲＴで１０分間にわたって滴下した。上記溶液に、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（７．６６ｇ、３８．０ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、得られた懸濁液をＲＴで１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、溶離剤としてヘキサン中の８％ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標） ｒｆ）によって粗生成物を精製して、３００１を無色の液体として得た（３．０１ｇ、収率：４８．７８％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.26-8.29 (m, 2H), 7.37-7.41 (m, 2H), 5.44-5.48 (m, 1H), 4.31-4.35 (m, 1H), 3.71-3.73 (m, 1H), 3.44-3.61 (m, 6H), 1.53-1.60(m, 4H), 1.25-1.31(m, 8H), 0.86-0.89 (m, 6H).ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の３００１（３ｇ、４．６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ピリジン（０．７４ｍＬ）および２０１６（１１．９８ｇ、６．９ｍｏｌ）をＲＴで添加した。反応をＲＴで１２時間継続し、反応混合物を減圧下で濃縮し、粗化合物を、溶離剤としてヘキサン中の８０％ＥｔＯＡｃを使用する、中性アルミナカラムクロマトグラフィー（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ｒｆ）により精製して、３００２をオフホワイトの固体として得た（５．３５ｇ、収率：５１．８９％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.13 (t, J=5.6 Hz, 1H), 3.86-3.99 (m, 2H), 3.47-3.57 (m, 4H), 3.30-3.49 (m, 146H), 3.07-3.11 (m, 2H), 2.39-2.49 (m, 2H), 1.45-1.55 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.20-1.45(m, 43H), 0.75-0.85 (m, 6H)。
[0718]ＤＣＭ（４６ｍＬ）中の３０００（４．６ｇ、９．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ピリジン（３．０ｍＬ）をＲＴで１０分間にわたって滴下した。上記溶液に、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（７．６６ｇ、３８．０ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、得られた懸濁液をＲＴで１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、溶離剤としてヘキサン中の８％ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標） ｒｆ）によって粗生成物を精製して、３００１を無色の液体として得た（３．０１ｇ、収率：４８．７８％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.26-8.29 (m, 2H), 7.37-7.41 (m, 2H), 5.44-5.48 (m, 1H), 4.31-4.35 (m, 1H), 3.71-3.73 (m, 1H), 3.44-3.61 (m, 6H), 1.53-1.60(m, 4H), 1.25-1.31(m, 8H), 0.86-0.89 (m, 6H).ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の３００１（３ｇ、４．６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ピリジン（０．７４ｍＬ）および２０１６（１１．９８ｇ、６．９ｍｏｌ）をＲＴで添加した。反応をＲＴで１２時間継続し、反応混合物を減圧下で濃縮し、粗化合物を、溶離剤としてヘキサン中の８０％ＥｔＯＡｃを使用する、中性アルミナカラムクロマトグラフィー（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ｒｆ）により精製して、３００２をオフホワイトの固体として得た（５．３５ｇ、収率：５１．８９％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.13 (t, J=5.6 Hz, 1H), 3.86-3.99 (m, 2H), 3.47-3.57 (m, 4H), 3.30-3.49 (m, 146H), 3.07-3.11 (m, 2H), 2.39-2.49 (m, 2H), 1.45-1.55 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.20-1.45(m, 43H), 0.75-0.85 (m, 6H)。
[0719]ギ酸（３５．０ｍＬ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の３００２（５．０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に氷冷温度で添加し、得られた反応物をＲＴで６時間撹拌した。反応混合物を濃縮してギ酸を除去し、減圧下でトルエンと共蒸留して、所望の３００３をオフホワイトの固体として得た（４．２８ｇ、収率：８９．１％）。３００３は次のステップでそのまま使用した。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.27 (bs, 1H), 4.06-4.20 (m, 4H), 3.75-3.85 (m, 3H), 3.50-3.70 (m, 144H), 3.30-3.50 (m, 6H), 2.59 (t, J = 6Hz, 2H), 1.53-1.56 (m, 4H), 1.20-1.30 (m, 45H), 0.80-0.90 (m, 6H).ＤＣＭ（３２．０ｍＬ）中の３００３（３．３２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＯＢｔ（０．０２ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（０．７１ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を氷冷温度で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．７８ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＣＭ（１５．０ｍＬ）中の２０２６（３．２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の溶液を、ＲＴで上記反応に添加し、得られた反応混合物をＲＴで１時間撹拌した。水（３０．０ｍＬ）をこの反応混合物に添加し、ＤＣＭ（２×３０．０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０．０ｍＬ）、続いてブライン（５０．０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を濾過し、濾液を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、溶離剤としてＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ｒｆ）によって精製して、３００４（２．９ｇ、収率：４５．２４％）を灰色の半固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.97-8.13 (m, 4H), 7.88-7.92 (m, 12H), 7.83 (t, J = 4.8 Hz, 1 H), 7.66-7.73 (m, 11H), 7.62 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 7.53-7.58 (m, 9H), 7.47 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 7.37 (t, J = 8 Hz, 6H), 7.15 (t, J = 6 Hz, 1H), 5.73-5.75 (m, 3H), 5.35 (dd, J = 10.8 Hz, J = 2.8 Hz, 3H), 4.71 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.45-4.57 (m, 1H), 4.41-4.45 (m, 6H), 4.22-4.35 (m, 6H), 3.30-4.0 (m, 12H), 3.08-3.20 (m, 9H), 2.03-2.07 (m, 1.68 (s, 11H),1.42-1.49 (m, 22H), 1.21-1.30 (m, 48H), 0.80-0.90 (m, 6H)。
[0720]アンモニア水（１６．８ｍＬ）を、エタノール（８．４ｍＬ）中の３００４（２．８ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＲＴで添加し、得られた反応混合物を４０℃で４８時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。得られた残渣を、ジエチルエーテル（１０×５０ｍＬ）で摩砕し、残渣を真空下で乾燥させて、１０７６を淡黄色固体として得た（１．８５ｇ、収率：８０．４３％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.11 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.81-7.84 (m, 1H), 7.69-7.74 (m, 2H), 7.61 (d, J = 8.8 Hz, 3H), 7.14 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.54-4.59 (m, 7H), 4.46-4.47(m, 3H), 4.20 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 3.86-3.99 (m, 2H), 3.62-3.68 (m, 10H), 3.30-3.50 (m, 159H), 2.96-3.11 (m, 11H), 2.0-2.07 (m, 7H), 1.78 (s, 9 H), 1.41-1.47 (m, 26 H), 1.18-1.22 (m, 54H), 0.80-0.85 (m, 8H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値３３３６．０８；実測値３３３６．０。
実施例２０Ｂ：１０７９の例示的合成（スキーム１９）
[0721]ＤＣＭ（８．６ｍＬ）中のステアリン酸（０．４３ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＯＢｔ（０．０２ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をＲＴで添加した。この反応混合物に、ＨＢＴＵ（０．７２ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を氷冷温度で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．７８ｍＬ、４．５３ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＣＭ（２．１ｍＬ、５容積）中の２０１６の溶液（２．６１ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を、氷冷温度で上記反応混合物に添加し、得られた混合物をＲＴで４時間撹拌した。反応物に水（３０．０ｍＬ）を添加し、ＤＣＭ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、ブライン（３０．０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下でエバポレートさせ、溶離剤としてＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ｒｆ）によって粗生成物を精製して、３００５をオフホワイトの固体として得た（２．３１ｇ、収率：７６．７４％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.30-6.40 (bs, 1H), 3.38-3.72 (m, 151H), 2.68 (bs, 3H), 2.49 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 2.19 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 1.61-1.64 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.20-1.45(m, 29H), 0.80-0.85 (m, 3H)。
[0721]ＤＣＭ（８．６ｍＬ）中のステアリン酸（０．４３ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＯＢｔ（０．０２ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をＲＴで添加した。この反応混合物に、ＨＢＴＵ（０．７２ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を氷冷温度で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．７８ｍＬ、４．５３ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＣＭ（２．１ｍＬ、５容積）中の２０１６の溶液（２．６１ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を、氷冷温度で上記反応混合物に添加し、得られた混合物をＲＴで４時間撹拌した。反応物に水（３０．０ｍＬ）を添加し、ＤＣＭ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、ブライン（３０．０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下でエバポレートさせ、溶離剤としてＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ｒｆ）によって粗生成物を精製して、３００５をオフホワイトの固体として得た（２．３１ｇ、収率：７６．７４％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.30-6.40 (bs, 1H), 3.38-3.72 (m, 151H), 2.68 (bs, 3H), 2.49 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 2.19 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 1.61-1.64 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.20-1.45(m, 29H), 0.80-0.85 (m, 3H)。
[0722]ギ酸（１４．７ｍＬ）を、ＤＣＭ（１０．５ｍＬ）中の３００５（２．１ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に氷冷温度で添加した。得られた反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物を濃縮してギ酸を除去し、減圧下でトルエン（３×）と共蒸留した。残渣をジエチルエーテル（２１．０ｍＬ）で摩砕し、濾過し、得られた残渣を真空下で乾燥させて、３００６をオフホワイトの固体として得た（１．８１ｇ、収率：８８．７２％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.25 (bs, 1H), 3.54-3.81 (m, 144H), 3.42-3.47 (m, 3H), 2.59 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.17 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.40-1.63 (m, 4H), 1.20-1.45(m, 27H), 0.80-0.85 (m, 3H)。
[0723]ＤＣＭ（８．０ｍＬ）中の３００６（０．５８ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＯＢｔ（０．０３８ｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）をＲＴで添加した。この反応混合物に、ＨＢＴＵ（０．１３ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を氷冷温度で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ、０．８５ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＣＭ（３．０ｍＬ）中の２０２６（０．６ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の溶液を、上記に氷冷温度で添加し、得られた反応混合物を、ＲＴで２時間撹拌した。反応混合物に水（２５ｍＬ）を添加し、ＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下でエバポレートさせ、溶離剤としてＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ｒｆ）によって粗生成物を精製して、３００７を灰色の半固体として得た（０．７６ｇ、収率：６６．６６％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.74 (bs, 1H), 8.11 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 9.2 Hz, 3H), 7.88-7.92 (m, 13 H), 7.78-7.85 (m, 2H), 7.66-7.74 (m, 11H), 7.62 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 7.52-7.58 (m, 9H), 7.47 (t, J = 8 Hz, 6H), 7.39 (t, J = 8 Hz, 6H), 5.73-5.75 (m, 3H), 5.35 (dd, J = 14 Hz, J = 3.2 Hz, 3H), 4.72 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.50-4.57 (m, 1H), 4.41-4.45 (m, 6H), 4.24-4.33 (m, 6H), 3.76-3.79 (m, 3H), 3.43-3.61 (m, 175H), 3.32-3.38 (m, 3H), 3.08-3.16 (m, 8H), 2.90-3.0 (m, 5H), 2.0-2.07 (m, 8H), 1.68 (s,12H), 1.40-1.49 (m, 21H), 1.21-1.27 (m, 62H), 0.80-0.90 (m, 3H)。
[0724]エタノール（２．２ｍＬ）中の３００７（０．７５ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＲＴでアンモニア水（４．５ｍＬ）を添加し、生じた反応を４０℃で４８時間続けた。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物をジエチルエーテル（５×２０ｍＬ）で摩砕した。濾過後の固体残渣を減圧下で乾燥させて、１０７９をオフホワイトの固体として得た（０．３５ｇ、収率：６０．８％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.11 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.80-7.85 (m, 2H), 7.70-7.75 (m, 2H), 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 3H)), 4.47-4.59 (m, 9H), 4.20 (d, J = 8 Hz, 3H), 3.62-3.68 (m, 12H), 3.49 (s, 141H), 2.97-3.16 (m, 11H), 2.0-2.03 (m, 8H), 1.78 (s, 9H), 1.42-1.47 (m, 19 H), 1.21 (s, 29H), 0.80-0.855 (m, 3H);ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値３０９１．８７；実測値３０９２．７５。
実施例２０Ｃ：１０７８の例示的合成（スキーム２０）
[0725]ＤＣＭ（１０．０ｍＬ）中のアラキジン酸（０．４６ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＯＢｔ（０．０１８ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＲＴで添加した。この反応混合物に、ＨＢＴＵ（０．６７ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を氷冷温度で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．７６ｍＬ、４．２０ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＣＭ（５ｍＬ）中の２０１６（２．５４ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の溶液を、氷冷温度で添加し、得られた反応混合物をＲＴで４時間撹拌した。反応混合物に、水（３０．０ｍＬ）を添加し、ＤＣＭ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、ブライン（３０．０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下でエバポレートさせ、得られた粗生成物を、溶離剤としてＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、３００８をオフホワイトの固体として得た（２．５２ｇ、収率：８９．０４％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.38 (bs, 1H), 3.38-3.72 (m, 132H), 2.47-2.57 (m, 4H), 2.19 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 1.61-1.64 (m, 1H), 1.43 (s, 9H), 1.20-1.24(m, 29H), 0.80-0.85 (m, 3H)。
[0725]ＤＣＭ（１０．０ｍＬ）中のアラキジン酸（０．４６ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＯＢｔ（０．０１８ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＲＴで添加した。この反応混合物に、ＨＢＴＵ（０．６７ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を氷冷温度で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．７６ｍＬ、４．２０ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＣＭ（５ｍＬ）中の２０１６（２．５４ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の溶液を、氷冷温度で添加し、得られた反応混合物をＲＴで４時間撹拌した。反応混合物に、水（３０．０ｍＬ）を添加し、ＤＣＭ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、ブライン（３０．０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下でエバポレートさせ、得られた粗生成物を、溶離剤としてＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、３００８をオフホワイトの固体として得た（２．５２ｇ、収率：８９．０４％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.38 (bs, 1H), 3.38-3.72 (m, 132H), 2.47-2.57 (m, 4H), 2.19 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 1.61-1.64 (m, 1H), 1.43 (s, 9H), 1.20-1.24(m, 29H), 0.80-0.85 (m, 3H)。
[0726]ギ酸（１６．１ｍＬ）を、３００８（２．３ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に氷冷温度で、ＤＣＭ（１１．５ｍＬ）中で添加し、得られた反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物を濃縮して、ギ酸を除去し、減圧下で、トルエン（３×）で共蒸留し、得られた残渣をジエチルエーテル（２３ｍＬ）で摩砕し、濾過し、残渣を高真空下で乾燥させて、３００９をオフホワイト固体として得た（２．１１ｇ、収率：９４．６％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.29 (bs, 1H), 5.03 (bs, 3H), 3.54-3.82 (m, 146H), 3.44-3.46 (m, 3H), 2.59 (t, J = 6 Hz, 2H), 2.18 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.59-1.63 (m, 2H), 1.25-1.35 (s, 32H), 0.80-0.85 (m, 3H)。
[0727]ＤＣＭ（６ｍＬ）中の３００９（０．５９ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＯＢｔ（０．０３８ｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この反応混合物に、ＨＢＴＵ（０．１３５ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を氷冷温度で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ、０．８５ｍｍｏｌ）を添加した。ＤＣＭ（３ｍＬ）中の２０２６（０．６ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、得られた反応混合物をＲＴで２時間撹拌した。反応混合物に水（２５ｍＬ）を添加し、ＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、ブライン（３０．０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧下でエバポレートさせ、溶離剤としてＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ｒｆ）によって粗生成物を精製して、３０１０を灰色の半固体として得た（０．９１ｇ、収率：７９．１３％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.11 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 9.2 Hz, 3H), 7.90 (t, J = 7.2 Hz, 12 H), 7.78-7.82 (m, 2H), 7.66-7.70 (m, 11H), 7.62-7.64 (m, 3H), 7.53-7.60 (m, 9H), 7.47 (t, J = 8 Hz, 6H), 7.37 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 5.73-5.74 (m, 4H), 5.35 (dd, J = 11.2 Hz, J = 2.8 Hz, 3H), 4.72 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.50-4.57 (m, 1H), 4.41-4.47 (m, 6H), 4.24-4.36 (m, 6H), 3.76-3.79 (m, 3H), 3.43-3.49 (m, 151H),3.35-3.38 (m, 3H), 2.96-3.18 (m, 10H), 2.30-2.35 (m, 1H), 2.0-2.06 (m, 8H), 1.68 (s,12H), 1.44-1.49 (m, 20H), 1.21-1.26 (m, 44H), 0.81-0.85 (m, 3H)。
[0728]エタノール（２．６ｍＬ）中の３０１０（０．８７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でアンモニア水（５．２ｍＬ）を添加し、得られた反応混合物を４０℃で４８時間続けた。１０７９の合成に記載されているように精製を行い、１０７８をオフホワイトの固体として得た（０．４５ｇ、収率：６７．２５％）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.10-8.12 (m, 1H), 7.80-7.85 (m, 2H), 7.70-7.75 (m, 2H), 7.63 (d, J = 7.6 Hz, 3H)), 4.50-4.60 (m, 9H), 4.20 (d, J = 8 Hz, 3H), 3.63-3.68 (m, 12H), 3.49 (s, 162H), 2.97-3.16 (m, 17H), 2.0-2.03 (m, 9H), 1.78 (s, 9H), 1.42-1.47 (m, 24H), 1.21 (s, 36H), 0.80-0.85 (m, 3H) ;ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋理論値３１１９．９１。実測値３１２０．８。
実施例２１．ｍＰＥＧ２０００－コレステロール５０４の合成。
[0729]ｍＰＥＧ－２０００－ＮＨ２（１モル当量）をジクロロメタン中ピリジン（３モル当量）の存在下、クロロギ酸コレステリル（１００１、１モル当量）と周囲温度で１８時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄した；溶媒および揮発性物質を真空中でエバポレートさせた。粗混合物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー精製にかけ、所望の化合物５０４を得た（収率：２２％）。ＥＬＳＤ－ＨＰＬＣ９９％；平均モル。重量２３２９；実測値：２３３０．５６。1H NMR (400 MHz, DMSO,d6): δ ppm 7.01-6.98 (t, 1H), 5.35 (bs, 1H), 4.41-4.21 (m, 1H), 3.85-3.64(m, 1H), 3.68-3.35 (m, 194H), 3.23 (s, 3H), 3.18-2.95 (m, 2H), 2.42-2.15 (m, 2H), 2.00-1.96 (m, 2H),1.95-1.76(m, 3H),1.75-0.32 (m, 36H), 0.23-0.15(s, 3H)。
[0729]ｍＰＥＧ－２０００－ＮＨ２（１モル当量）をジクロロメタン中ピリジン（３モル当量）の存在下、クロロギ酸コレステリル（１００１、１モル当量）と周囲温度で１８時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄した；溶媒および揮発性物質を真空中でエバポレートさせた。粗混合物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー精製にかけ、所望の化合物５０４を得た（収率：２２％）。ＥＬＳＤ－ＨＰＬＣ９９％；平均モル。重量２３２９；実測値：２３３０．５６。1H NMR (400 MHz, DMSO,d6): δ ppm 7.01-6.98 (t, 1H), 5.35 (bs, 1H), 4.41-4.21 (m, 1H), 3.85-3.64(m, 1H), 3.68-3.35 (m, 194H), 3.23 (s, 3H), 3.18-2.95 (m, 2H), 2.42-2.15 (m, 2H), 2.00-1.96 (m, 2H),1.95-1.76(m, 3H),1.75-0.32 (m, 36H), 0.23-0.15(s, 3H)。
実施例２２．ＬＮＰ評価のためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびｍＲＮＡ
[0730]表５に示されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護条件下で、制御された細孔ガラス支持体ならびに市販のホスホルアミダイトモノマーおよびオリゴヌクレオチド合成試薬下で合成した（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３、２０、８１－１１４；ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５、１０、１１８１－１１８７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。脱保護されたガイドＲＮＡを、ＨＰＬＣで精製し、各ガイドＲＮＡの完全性を質量分析で確認した。各ガイドＲＮＡの観測された質量は、計算された質量に一致した。
[0730]表５に示されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護条件下で、制御された細孔ガラス支持体ならびに市販のホスホルアミダイトモノマーおよびオリゴヌクレオチド合成試薬下で合成した（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３、２０、８１－１１４；ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５、１０、１１８１－１１８７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。脱保護されたガイドＲＮＡを、ＨＰＬＣで精製し、各ガイドＲＮＡの完全性を質量分析で確認した。各ガイドＲＮＡの観測された質量は、計算された質量に一致した。
ＳｐＣａｓ９、ＣＢＥ、およびＡＢＥタンパク質をコードするｍＲＮＡ
[0731]ＳｐＣａｓ９、ＣＢＥ、およびＡＢＥのｍＲＮＡは、当該技術分野で周知の異なる方法によって生成された。本明細書で使用されるそのような方法の１つは、Ｔ７ポリメラーゼまたは追加のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用するインビトロ転写（ＩＶＴ）であった。通常、ｍＲＮＡのＩＶＴは、Ｔ７ ポリメラーゼプロモーター、ｍＲＮＡコード配列（ＣＤＳ）、３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ポリＡテール、ならびに追加の複製および転写調節エレメントを含む線形化されたＤＮＡテンプレートを使用する。ＩＶＴの前は、ＤＮＡテンプレートは、プラスミド、ＰＣＲ産物、または追加の二本鎖ＤＮＡ構築物の形であった。典型的なＩＶＴ反応には、Ｔ７ポリメラーゼ、ＤＮＡテンプレート、ＲＮａｓｅ阻害剤、キャップアナログ、無機ピロホスファターゼ、ならびに天然に存在するリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）、例えば、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、または修飾ｒＮＴＰによる天然のｒＮＴＰの置換、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、およびＮ４－アセチルシチジンが挙げられる。キャップ類似体は、最初の開始ヌクレオチドが標準の２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、または追加の２’化学修飾を含む、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドキャップ構造であった。ワクシニアキャッピング酵素を使用して、ＩＶＴ反応後にキャップ類似体も添加した。ＩＶＴの後、場合によっては、ＤＮａｓｅを転写混合物に添加してＤＮＡテンプレートを除去する。あるいは、残留ＤＮＡを、イオン交換カラムクロマトグラフィーによって除去した。ｍＲＮＡの精製および濃縮は、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、沈殿、イオン対逆相クロマトグラフィー、酵素反応、サイズ排除クロマトグラフィー、および／または接線流濾過を用いて行った。同様のＩＶＴおよび精製プロセスを使用して、ＳｐＣａｓ９、ＣＢＥ、およびＡＢＥをコードするｍＲＮＡを生成した。全ての場合において、ＤＮＡテンプレート、反応条件、および精製パラメーターは、目的の特定の遺伝子に対して最適化された。いくつかの例では、キャップされ、ポリアデニル化されたＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００２は、商業的供給源（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ）から入手した。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００２およびアデノシンベースエディター（ＡＢＥ）ｍＲＮＡ ＭＡ００２およびＭＡ００４は、Ｖｅｒｖｅの研究室で調製した。
[0731]ＳｐＣａｓ９、ＣＢＥ、およびＡＢＥのｍＲＮＡは、当該技術分野で周知の異なる方法によって生成された。本明細書で使用されるそのような方法の１つは、Ｔ７ポリメラーゼまたは追加のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用するインビトロ転写（ＩＶＴ）であった。通常、ｍＲＮＡのＩＶＴは、Ｔ７ ポリメラーゼプロモーター、ｍＲＮＡコード配列（ＣＤＳ）、３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ポリＡテール、ならびに追加の複製および転写調節エレメントを含む線形化されたＤＮＡテンプレートを使用する。ＩＶＴの前は、ＤＮＡテンプレートは、プラスミド、ＰＣＲ産物、または追加の二本鎖ＤＮＡ構築物の形であった。典型的なＩＶＴ反応には、Ｔ７ポリメラーゼ、ＤＮＡテンプレート、ＲＮａｓｅ阻害剤、キャップアナログ、無機ピロホスファターゼ、ならびに天然に存在するリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）、例えば、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、または修飾ｒＮＴＰによる天然のｒＮＴＰの置換、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、およびＮ４－アセチルシチジンが挙げられる。キャップ類似体は、最初の開始ヌクレオチドが標準の２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、または追加の２’化学修飾を含む、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドキャップ構造であった。ワクシニアキャッピング酵素を使用して、ＩＶＴ反応後にキャップ類似体も添加した。ＩＶＴの後、場合によっては、ＤＮａｓｅを転写混合物に添加してＤＮＡテンプレートを除去する。あるいは、残留ＤＮＡを、イオン交換カラムクロマトグラフィーによって除去した。ｍＲＮＡの精製および濃縮は、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、沈殿、イオン対逆相クロマトグラフィー、酵素反応、サイズ排除クロマトグラフィー、および／または接線流濾過を用いて行った。同様のＩＶＴおよび精製プロセスを使用して、ＳｐＣａｓ９、ＣＢＥ、およびＡＢＥをコードするｍＲＮＡを生成した。全ての場合において、ＤＮＡテンプレート、反応条件、および精製パラメーターは、目的の特定の遺伝子に対して最適化された。いくつかの例では、キャップされ、ポリアデニル化されたＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００２は、商業的供給源（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ）から入手した。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００２およびアデノシンベースエディター（ＡＢＥ）ｍＲＮＡ ＭＡ００２およびＭＡ００４は、Ｖｅｒｖｅの研究室で調製した。
[0732]アデノシン核酸塩基エディターｍＲＮＡ ＭＡ００２は、以下に提供されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質を含む
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[0733]アデノシン核酸塩基エディターｍＲＮＡ ＭＡ００４は、以下に提供されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、ここで、ｕ’はＮ１－メチルシュードウリジンである。
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[0734]ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００４は、以下に提供されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、ここで、ｕ’はＮ１－メチルシュードウリジンである。
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実施例２３．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の調製
[0735]これらの研究で参照として使用されるＬＮＰは、公開された手順に従って調製され、公開されたＬＮＰ賦形剤およびゲノム編集因子ｍＲＮＡから構成される（Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７、５６、１０５９－１０６３；Ｙｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１６、３４、３２８－３３３）およびガイドＲＮＡ（Ｃｈａｄｗｉｃｋら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０１７、３７、１７４１－１７４７；Ｒｏｓｓｉｄｉｓら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１８、２４、１５１３－１５１８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１８－０１８４－６；Ｄｉｎｇら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２０１４、１１５、４８８－４９２）。ｇＲＮＡペイロードは表５から選択され、これらのＬＮＰを構成するために使用されるｍＲＮＡペイロードは、実施例２２に記載されるように調製されるか、または例えばＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの第三者から商業的に購入され得る。参照ＬＮＰ Ａ１（表６）は、文献（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２、５１、８５２９－８５３３）に記載のように、公開された脂質５０１（表６）、コレステロール、ＤＳＰＣおよび表７のＰＥＧ－脂質から構成される。同様に、ベンチマークのＬＮＰ Ｂ１およびＣ１は、脂質５０２（ＷＯ２０１５／０９５３４０Ａｌ）および５０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１８、２６、１５０９－１５１９）のそれぞれから、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧ（５０６および５０７、表７）と組み合わせて、表６に要約されているように構成される。報告されているゲノム編集因子ヌクレアーゼｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、参照ＬＮＰを構成するためのペイロードとして使用される。１つのアプローチにおいて、ＬＮＰ製剤Ａ１、Ｂ１およびＣ１は、ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを共製剤化することによって作製される。この共製剤法では、ｍＲＮＡとガイドＲＮＡの比は、１０：１～１：１０まで変化し、インビトロおよびインビボ遺伝子編集評価用の一連のＬＮＰが得られる。２番目のアプローチでは：ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡは、表６と同じ脂質比を使用して別々に製剤化され、その後、ガイドおよびｍＲＮＡを含む事前に製剤化されたＬＮＰを様々な比で一緒に混合して、遺伝子編集評価用の新しい一連のＬＮＰを取得する。
[0735]これらの研究で参照として使用されるＬＮＰは、公開された手順に従って調製され、公開されたＬＮＰ賦形剤およびゲノム編集因子ｍＲＮＡから構成される（Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７、５６、１０５９－１０６３；Ｙｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１６、３４、３２８－３３３）およびガイドＲＮＡ（Ｃｈａｄｗｉｃｋら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０１７、３７、１７４１－１７４７；Ｒｏｓｓｉｄｉｓら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１８、２４、１５１３－１５１８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１８－０１８４－６；Ｄｉｎｇら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２０１４、１１５、４８８－４９２）。ｇＲＮＡペイロードは表５から選択され、これらのＬＮＰを構成するために使用されるｍＲＮＡペイロードは、実施例２２に記載されるように調製されるか、または例えばＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの第三者から商業的に購入され得る。参照ＬＮＰ Ａ１（表６）は、文献（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２、５１、８５２９－８５３３）に記載のように、公開された脂質５０１（表６）、コレステロール、ＤＳＰＣおよび表７のＰＥＧ－脂質から構成される。同様に、ベンチマークのＬＮＰ Ｂ１およびＣ１は、脂質５０２（ＷＯ２０１５／０９５３４０Ａｌ）および５０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１８、２６、１５０９－１５１９）のそれぞれから、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧ（５０６および５０７、表７）と組み合わせて、表６に要約されているように構成される。報告されているゲノム編集因子ヌクレアーゼｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、参照ＬＮＰを構成するためのペイロードとして使用される。１つのアプローチにおいて、ＬＮＰ製剤Ａ１、Ｂ１およびＣ１は、ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを共製剤化することによって作製される。この共製剤法では、ｍＲＮＡとガイドＲＮＡの比は、１０：１～１：１０まで変化し、インビトロおよびインビボ遺伝子編集評価用の一連のＬＮＰが得られる。２番目のアプローチでは：ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡは、表６と同じ脂質比を使用して別々に製剤化され、その後、ガイドおよびｍＲＮＡを含む事前に製剤化されたＬＮＰを様々な比で一緒に混合して、遺伝子編集評価用の新しい一連のＬＮＰを取得する。
実施例２４．肝細胞標的化ＬＮＰの調製。
[0736]実施例２４－Ａ。
[0737]実施例２３のＬＮＰを、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００２および１００４（表４）で連続的に再構成して、所望の肝細胞標的化ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを得た。一連のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、表６に記載の組成物を用いて、各標的化脂質の異なるｍｏｌ％（０．０１～５ｍｏｌ％）で１００２または１００４を連続的に共製剤化することによって生成した。１００２および１００４が、インビトロおよびインビボでの遺伝子編集のために表６から予め製剤化されたＬＮＰに様々なｍｏｌ％（０．０１～５ｍｏｌ％）で連続的に添加された場合、ＬＮＰの別のセットが得られた。ＧａｌＮＡｃ－脂質（１００２または１００４）を標的とする肝細胞を、表８～１３に記載されるように製剤化の間に添加した。
[0736]実施例２４－Ａ。
[0737]実施例２３のＬＮＰを、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００２および１００４（表４）で連続的に再構成して、所望の肝細胞標的化ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを得た。一連のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、表６に記載の組成物を用いて、各標的化脂質の異なるｍｏｌ％（０．０１～５ｍｏｌ％）で１００２または１００４を連続的に共製剤化することによって生成した。１００２および１００４が、インビトロおよびインビボでの遺伝子編集のために表６から予め製剤化されたＬＮＰに様々なｍｏｌ％（０．０１～５ｍｏｌ％）で連続的に添加された場合、ＬＮＰの別のセットが得られた。ＧａｌＮＡｃ－脂質（１００２または１００４）を標的とする肝細胞を、表８～１３に記載されるように製剤化の間に添加した。
[0738]調製した全てのＬＮＰは、２～８℃または－８０℃のいずれかで保存した（表６、８～１３）。製剤化に続いて、ＬＮＰを緩衝液交換し、濃縮した。ＬＮＰは、０～２００ｍＭまで様々なイオン強度の緩衝液に緩衝液交換した。場合によっては、緩衝液交換は、ＰＤ－１０カラムで行い、他の場合は透析し、他の場合は、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用した。場合によっては、ＴＦＦを使用してＬＮＰを濃縮し、他の場合には、アミコン遠心分離濃縮カラムを使用した。ＬＮＰを、ｐＨ７または８の最終製剤緩衝液に交換し、濃縮した。最終製剤緩衝液中の凍結保護剤の最終濃度が０～５００ｍＭとなるように凍結保護剤を添加した。凍結保護剤を含まないＬＮＰは２～８℃で保存し、凍結保護剤を含むＬＮＰは最初に凍結して－８０℃で保存した。
[0739]実施例２４－Ｂ。
[0740]次いで、実施例２４－Ａの標的化脂質を、リガンドの提示が１００２、１００３および１００４のものとは異なる、標的化脂質１０４２、１０４３および１０４４（表４）と連続して置き換える。リガンド部分を隔てる脂質鎖およびテザーは、両方のシリーズの標的化脂質で同じに保たれる。ペイロード（ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の比が異なる同数の製剤、ならびにガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡの個々の製剤も、評価のために実施例２３に記載のように調製する。個々の製剤ごとに使用されるガイドＲＮＡは、表５から選択される。ｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ ｍＲＮＡ、ＭＳ００４、もしくはＭＡ００４、または任意の他のｍＲＮＡであり得る。
[0740]次いで、実施例２４－Ａの標的化脂質を、リガンドの提示が１００２、１００３および１００４のものとは異なる、標的化脂質１０４２、１０４３および１０４４（表４）と連続して置き換える。リガンド部分を隔てる脂質鎖およびテザーは、両方のシリーズの標的化脂質で同じに保たれる。ペイロード（ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の比が異なる同数の製剤、ならびにガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡの個々の製剤も、評価のために実施例２３に記載のように調製する。個々の製剤ごとに使用されるガイドＲＮＡは、表５から選択される。ｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ ｍＲＮＡ、ＭＳ００４、もしくはＭＡ００４、または任意の他のｍＲＮＡであり得る。
[0741]次いで、実施例２４－Ａの標的化脂質を、標的化脂質１０１２、１０１４、１０５１および１０５３（表４）で連続的に置き換え、ジステアリルグリセロール部分をコレステロール部分で置き換える。ペイロード（ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の比が異なる同数の製剤およびガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡの個々の製剤も、評価のために実施例２３に記載のように調製する。個々の製剤ごとに使用されるガイドＲＮＡは、表５から選択される。ｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ ｍＲＮＡ、ＭＳ００４、もしくはＭＡ００４、または任意の他のｍＲＮＡあり得る。
[0742]実施例２４－Ａの標的化脂質を、標的化脂質１０６２および１０６５に置き換えて、評価のための新しい標的化ＬＮＰを生成する。このようにして得られた新しい製剤では、ジステアリルグリセロール部分がトコフェロール部分で置き換えられている。
[0743]実施例２４－Ａの標的化脂質を、標的化脂質１００３に置き換えて、評価のための新しい標的化ＬＮＰを生成する。
実施例２５．ＬＮＰを用いたＧａｌＮＡｃ－脂質の事後添加プロセス。
実施例２５．ＬＮＰを用いたＧａｌＮＡｃ－脂質の事後添加プロセス。
[0744]表６、８、９～１７および７の特定のＬＮＰ組成物を製剤化し、１分間～１２０分間の範囲で静置させた。ステルス脂質は、最初の脂質混合物および／または希釈緩衝液に、場合によっては０～５のｍｏｌ％で含まれた。場合によっては、とりわけＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を、ＬＮＰ製剤化後に０．０１～１０のｍｏｌ％でエタノール／水溶液に添加した。これは、ＬＮＰ製剤化後１分～１２０分の範囲で添加され、エタノール／水性緩衝液中で１分～１２０分間ＬＮＰと相互作用させられた後、緩衝液を製剤緩衝液に交換した。ある場合には、ＰＤ－１０カラムで緩衝液交換を行った場合もあり、透析を行った場合もあり、ＴＦＦを使用した場合もあった。場合によっては、ＴＦＦを使用してＬＮＰを濃縮し、他の場合にはアミコン遠心分離濃縮カラムを使用した。
[0745]ＬＮＰへのＧａｌＮＡｃ－脂質の事後添加は、表８～１３に記載されている。その中にデータが示されている。
[0746]
[0746]
[0747]
[0748]
[0749]
[0750]
ＨＰＬＣを用いたＬＮＰ構成要素の評価
[0751]ＬＮＰの脂質組成物は、図１Ａ～図１Ｂに見られるように、ＨＰＬＣ法によって特徴付けられた。使用したＨＰＬＣ法は、蒸発光散乱検出（ＩＰ－ＲＰＬＣ－ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ）を備えたイオン対逆相高速液体クロマトグラフィーであって、所定のサンプル中の各脂質の％を定量化した。各脂質成分は、定量限界を超えるサンプル検出（Ｓ／Ｎ≧１０）で標準曲線に対して較正した。図１Ａ～図１Ｂは、ＧａｌＮＡｃ－脂質の取り込みを実証するＨＰＬＣクロマトグラムを示す：（図１Ａ）ＧａｌＮＡｃ－脂質が存在しない参照ＬＮＰ、および（図１Ｂ）ＧａｌＮＡｃ－脂質で構成されたＬＮＰ。ＰＥＧ－ＤＭＧとして標識された保持時間（ＲＴ）６．７２１分でのＨＰＬＣピークは、ＰＥＧ－脂質５０７であり、ＶＬ０１と標識されたＲＴ８．１７６分でのピークは、図１Ａのアミノ脂質５０２である。ＰＥＧ－ＤＭＧと標識されたＲＴ６．９０１分でのＨＰＬＣピークは、ＰＥＧ－脂質５０７であり、ＶＬ０１として標識されたＲＴ８．４０２でのピークは、アミノ脂質５０２であり、ＧａｌＮＡｃとして標識されたＲＴ１０．７４９分でのＨＰＬＣピークは、図１Ｂの１００４である。ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰにおけるＧａｌＮＡｃ－脂質の存在およびレベルを分析するために別の方法を使用した。ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを、ＧａｌＮＡｃ（アルファ１，３）を含有する糖と優先的に結合するグリシンマックスレクチン固定化樹脂（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＡＫ－１３０１－２）を充填したカラムを使用したレクチンアフィニティークロマトグラフィーによって分画した。ダイズレクチン樹脂をＰＢＳで平衡化し、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを結合させ、樹脂を１×ＰＢＳで洗浄し、結合したＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを１×ＰＢＳ＋５００ｍＭガラクトースで溶出した。収集した画分をＩＰ－ＲＰＬＣ－ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤにより分析して、ＧａｌＮＡｃ表面の取り込みおよび均一性を確認した。図３９は、製剤中にＧａｌＮＡｃ－脂質を有するおよび有しないＬＮＰについてのデータを示す。
[0751]ＬＮＰの脂質組成物は、図１Ａ～図１Ｂに見られるように、ＨＰＬＣ法によって特徴付けられた。使用したＨＰＬＣ法は、蒸発光散乱検出（ＩＰ－ＲＰＬＣ－ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ）を備えたイオン対逆相高速液体クロマトグラフィーであって、所定のサンプル中の各脂質の％を定量化した。各脂質成分は、定量限界を超えるサンプル検出（Ｓ／Ｎ≧１０）で標準曲線に対して較正した。図１Ａ～図１Ｂは、ＧａｌＮＡｃ－脂質の取り込みを実証するＨＰＬＣクロマトグラムを示す：（図１Ａ）ＧａｌＮＡｃ－脂質が存在しない参照ＬＮＰ、および（図１Ｂ）ＧａｌＮＡｃ－脂質で構成されたＬＮＰ。ＰＥＧ－ＤＭＧとして標識された保持時間（ＲＴ）６．７２１分でのＨＰＬＣピークは、ＰＥＧ－脂質５０７であり、ＶＬ０１と標識されたＲＴ８．１７６分でのピークは、図１Ａのアミノ脂質５０２である。ＰＥＧ－ＤＭＧと標識されたＲＴ６．９０１分でのＨＰＬＣピークは、ＰＥＧ－脂質５０７であり、ＶＬ０１として標識されたＲＴ８．４０２でのピークは、アミノ脂質５０２であり、ＧａｌＮＡｃとして標識されたＲＴ１０．７４９分でのＨＰＬＣピークは、図１Ｂの１００４である。ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰにおけるＧａｌＮＡｃ－脂質の存在およびレベルを分析するために別の方法を使用した。ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを、ＧａｌＮＡｃ（アルファ１，３）を含有する糖と優先的に結合するグリシンマックスレクチン固定化樹脂（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＡＫ－１３０１－２）を充填したカラムを使用したレクチンアフィニティークロマトグラフィーによって分画した。ダイズレクチン樹脂をＰＢＳで平衡化し、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを結合させ、樹脂を１×ＰＢＳで洗浄し、結合したＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを１×ＰＢＳ＋５００ｍＭガラクトースで溶出した。収集した画分をＩＰ－ＲＰＬＣ－ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤにより分析して、ＧａｌＮＡｃ表面の取り込みおよび均一性を確認した。図３９は、製剤中にＧａｌＮＡｃ－脂質を有するおよび有しないＬＮＰについてのデータを示す。
実施例２６．ＰＥＧ－ＤＳＧ（５０８）で構成されたＬＮＰ
[0752]実施例２３、２４および２５で使用したＰＥＧ－脂質賦形剤を、ＰＥＧ－ＤＳＧ（５０８、表７）で置き換えて、さらなる評価のために標的化および非標的化ＬＮＰを得て、インビトロおよびインビボでの送達効率および遺伝子編集を、ＬＮＰを介した送達／取り込み条件下で比較する。
[0752]実施例２３、２４および２５で使用したＰＥＧ－脂質賦形剤を、ＰＥＧ－ＤＳＧ（５０８、表７）で置き換えて、さらなる評価のために標的化および非標的化ＬＮＰを得て、インビトロおよびインビボでの送達効率および遺伝子編集を、ＬＮＰを介した送達／取り込み条件下で比較する。
実施例２７．ＰＥＧ－コレステロール（５０４）で構成されたＬＮＰ
[0753]実施例２６でＬＮＰを構成するために使用されるＰＥＧ－ＤＳＧを、ＰＥＧ－コレステロール（５０４および５０５、表７）で置き換えて、さらなる評価のために標的化および非標的化ＬＮＰを得て、インビトロおよびインビボでの送達効率および遺伝子編集を、ＬＮＰを介した送達／取り込み条件下で比較する。
[0753]実施例２６でＬＮＰを構成するために使用されるＰＥＧ－ＤＳＧを、ＰＥＧ－コレステロール（５０４および５０５、表７）で置き換えて、さらなる評価のために標的化および非標的化ＬＮＰを得て、インビトロおよびインビボでの送達効率および遺伝子編集を、ＬＮＰを介した送達／取り込み条件下で比較する。
実施例２８．単一のｍＲＮＡペイロードで構成されたＬＮＰ
[0754]実施例２３～２７のペイロードは、単一のｍＲＮＡペイロード（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１８、２６、１５０９－１５１９）に置き換えて、インビトロおよびインビボでのｍＲＮＡ発現を、ＬＮＰ媒介送達／取り込み条件下で評価する。
[0754]実施例２３～２７のペイロードは、単一のｍＲＮＡペイロード（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１８、２６、１５０９－１５１９）に置き換えて、インビトロおよびインビボでのｍＲＮＡ発現を、ＬＮＰ媒介送達／取り込み条件下で評価する。
実施例２９．単一のｓｉＲＮＡペイロードで構成されたＬＮＰ
[0755]実施例２３～２８のペイロードをｓｉＲＮＡで置き換えて、ＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを評価する。評価に使用されるｓｉＲＮＡは、ＬＮＰを介した送達／取り込み条件下で報告されているＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡである（Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２、５１、８５２９－８５３３）。
[0755]実施例２３～２８のペイロードをｓｉＲＮＡで置き換えて、ＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを評価する。評価に使用されるｓｉＲＮＡは、ＬＮＰを介した送達／取り込み条件下で報告されているＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡである（Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２、５１、８５２９－８５３３）。
実施例３０．アンチセンスオリゴヌクレオチドペイロードで構成されたＬＮＰ
[0756]実施例２３～２８のペイロードを、アンチセンスオリゴヌクレオチドで置き換えて、ＬＮＰ媒介送達／取り込み条件下でインビトロおよびインビボでアンチセンス効果を評価する（Ｐｒａｋａｓｈら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１３、８（７）、１４０２－１４０６）。
[0756]実施例２３～２８のペイロードを、アンチセンスオリゴヌクレオチドで置き換えて、ＬＮＰ媒介送達／取り込み条件下でインビトロおよびインビボでアンチセンス効果を評価する（Ｐｒａｋａｓｈら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１３、８（７）、１４０２－１４０６）。
実施例３１．アンチミール／アンタゴミールペイロードで構成されたＬＮＰ
[0757]実施例２３～２８のペイロードは、ＬＮＰ媒介送達／取り込み条件下で、インビトロおよびインビボでのｍｉＲＮＡ活性評価のためにｍｉＲＮＡに置き換えられる（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ２０１３、１６８、２５１－２６１；Ｋｒｕｅｔｚｆｅｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ２００５、４３８、６８５－６８９）。
[0757]実施例２３～２８のペイロードは、ＬＮＰ媒介送達／取り込み条件下で、インビトロおよびインビボでのｍｉＲＮＡ活性評価のためにｍｉＲＮＡに置き換えられる（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ２０１３、１６８、２５１－２６１；Ｋｒｕｅｔｚｆｅｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ２００５、４３８、６８５－６８９）。
実施例３２．マイクロＲＮＡペイロードで構成されたＬＮＰ
[0758]実施例２６のペイロードは、ＬＮＰ媒介送達／取り込み条件下でのインビトロおよびインビボでのマイクロＲＮＡ活性評価のためにｍｉＲＮＡに置き換えられる（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ２０１３、２８、６９０－８）。
[0758]実施例２６のペイロードは、ＬＮＰ媒介送達／取り込み条件下でのインビトロおよびインビボでのマイクロＲＮＡ活性評価のためにｍｉＲＮＡに置き換えられる（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ２０１３、２８、６９０－８）。
実施例３３．ＬＮＰのインビトロ評価
[0759]実施例２３～４７から得られたＬＮＰの遺伝子編集活性は、Ｆｉｎｎら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８、２２、２２２７～２２３５に記載されているように、肝細胞（げっ歯類、サルおよびヒト）において評価される。
[0759]実施例２３～４７から得られたＬＮＰの遺伝子編集活性は、Ｆｉｎｎら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８、２２、２２２７～２２３５に記載されているように、肝細胞（げっ歯類、サルおよびヒト）において評価される。
[0760]ＬＮＰの編集効率 これらのＬＮＰＳは、培地中の血清の有無の下で試験される。
[0761]さらに、実施例２３～４７で得られたＬＮＰを、無血清条件下および組換えヒトＡｐｏＥの有無の下で上記の細胞株において試験する（Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０、１８、１３５７－６４）。
[0761]さらに、実施例２３～４７で得られたＬＮＰを、無血清条件下および組換えヒトＡｐｏＥの有無の下で上記の細胞株において試験する（Ａｋｉｎｃら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０、１８、１３５７－６４）。
[0762]これら全てのＬＮＰの遺伝子編集活性は、上記の全ての条件下で、ＡＳＧＰＲ、ＬＤＬｒおよびＡｐｏＥノックアウト肝細胞（ヒト、サルおよびげっ歯類）においても評価される。
実施例３４．ＡＳＧＰＲへのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ結合の評価
[0763]実施例２３～４７１から得られる全てのＡＳＧＰＲ標的化ＬＮＰのＡＳＧＰＲ結合を、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０、１８、１３５７－６４に記載のとおり測定する。
[0763]実施例２３～４７１から得られる全てのＡＳＧＰＲ標的化ＬＮＰのＡＳＧＰＲ結合を、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０、１８、１３５７－６４に記載のとおり測定する。
実施例３５．ＬＮＰ形成後のＧａｌＮＡｃ－脂質封入
[0764]ＬＮＰを製剤化し、１分～１２０分の範囲で静置させた。ステルス脂質は、最初の脂質混合物および／または希釈緩衝液に、場合によっては０～５のｍｏｌ％で含まれた。ＬＮＰを緩衝液交換して濃縮し、場合によってはＴＦＦを使用して濃縮し、他の場合にはアミコン遠心分離濃縮カラムを使用した。いくつかの例では、緩衝液交換は、ＰＤ－１０カラムによって実行され、他の例では透析であり、他の例ではＴＦＦを使用した。次いで、ＬＮＰ濃縮後１～１２０分の範囲で、０．０１～１０のｍｏｌ％で、エタノール／水溶液中にＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を添加し、ＬＮＰと相互作用させた。
[0764]ＬＮＰを製剤化し、１分～１２０分の範囲で静置させた。ステルス脂質は、最初の脂質混合物および／または希釈緩衝液に、場合によっては０～５のｍｏｌ％で含まれた。ＬＮＰを緩衝液交換して濃縮し、場合によってはＴＦＦを使用して濃縮し、他の場合にはアミコン遠心分離濃縮カラムを使用した。いくつかの例では、緩衝液交換は、ＰＤ－１０カラムによって実行され、他の例では透析であり、他の例ではＴＦＦを使用した。次いで、ＬＮＰ濃縮後１～１２０分の範囲で、０．０１～１０のｍｏｌ％で、エタノール／水溶液中にＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を添加し、ＬＮＰと相互作用させた。
[0765]別の製剤化アプローチでは、ＬＮＰを製剤化し、１分～１２０分の範囲で静置させた。ステルス脂質は、場合によっては、初期脂質混合物および／または希釈緩衝液に０～５のｍｏｌ％で含まれ得る。ＬＮＰは、最初の容積の１～１０００％の範囲で、希釈緩衝液で希釈される。次いで、ＬＮＰ製剤化後１分～１２０分の範囲で、０．０１～１０のｍｏｌ％でＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を、エタノール／水溶液に添加し、エタノール／水性緩衝液中のＬＮＰと１分～１２０分間相互作用させた後、ｐＨ７または８で最終の製剤へ緩衝液交換する。
[0766]ＬＮＰを上記のように製剤化し、緩衝液を最終製剤緩衝液に交換する。ステルス脂質は、最初の脂質混合物および／または希釈緩衝液に、場合によっては０～５のｍｏｌ％で含まれた。次いで、溶液中のＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を、０．０１～１０の範囲のｍｏｌ％で添加し、１～１２０分間の範囲で相互作用させ、次いで溶液を最終製剤緩衝液に緩衝液交換する。
[0767]他の実施形態では、ＬＮＰを上記のように製剤化し、最終製剤緩衝液に緩衝液交換する。ステルス脂質は、最初の脂質混合物および／または希釈緩衝液に、場合によっては０～５のｍｏｌ％で含まれた。次いで、溶液中のＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を、０．０１～１０の範囲のｍｏｌ％で添加し、１～１２０分間の範囲で相互作用させる。
[0768]いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、０．０１～１０の範囲のｍｏｌ％で溶液中にＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含有する希釈緩衝液中に、製剤化後に直接収集される。ステルス脂質は、場合によっては、初期脂質混合物および／または希釈緩衝液に０～５のｍｏｌ％で含まれ得る。ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４は、溶液中のＬＮＰに組み込まれ、１～１２０分の期間の後、溶液は最終製剤緩衝液に緩衝液交換される。
[0769]ＬＮＰをまた、製剤化して、最終製剤化緩衝液に緩衝液交換した／する。次いで、実施例２４に記載のように、このようにして形成されたＬＮＰに凍結保護剤を添加して、－８０℃で保存する。凍結保護剤を欠いているＬＮＰを２～８℃で保存し、凍結保護剤を含む最終製剤を－８０℃で保存する。次いで、凍結ＬＮＰを、室温で解凍する。次いで、エタノール／水溶液中のＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を、解凍したＬＮＰに０．０１～１０のｍｏｌ％で添加する。場合によっては、その後、ＬＮＰを、最終製剤緩衝液に緩衝液交換する。他の例では、ＧａｌＮＡｃ－脂質添加後にはＬＮＰは緩衝液交換されない。
[0770]場合によっては、ＰＤ－１０脱塩カラム（脱塩および緩衝液交換によって低分子量化合物から高分子量化合物を分離するＳｅｐｈａｄｅを充填したカラム）、透析または接線流濾過（ＴＦＦ）を通して緩衝液交換を行った。場合によっては、ＬＮＰは、ＧａｌＮＡｃ－脂質添加および緩衝液交換後、２～８℃または－８０℃で保管する。
[0771]次いで、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を表４の他のＧａｌＮＡｃ－脂質で置き換えることによって構成される。
実施例３６．ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを得るための製剤化前脂質混合物中のＧａｌＮＡｃ－脂質封入。
実施例３６．ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを得るための製剤化前脂質混合物中のＧａｌＮＡｃ－脂質封入。
[0772]表４の例示的なＧａｌＮＡｃ－脂質１００４が、０．０１～１０のｍｏｌ％で、ＬＮＰの製剤化前に最初の脂質混合物（イオン性脂質、ステルス脂質、ヘルパー脂質などを含むが、これらに限定されない）に含まれた。ステルス脂質は、場合によっては０～５のｍｏｌ％で含まれた。ＬＮＰを製剤化し、製剤化後１分から１日の範囲で緩衝液を交換し、実施例２４に記載のように保存した。
[0773]表４からの例示的なＧａｌＮＡｃ－脂質１００４は、場合によっては、ＬＮＰの製剤化前に、０．０１～１０ｍｏｌ％で、最初の脂質混合物（イオン化可能な脂質、ステルス脂質、ヘルパー脂質などを含むが、これらに限定されない）に含まれる。ステルス脂質は、場合によっては０～５のｍｏｌ％で含まれた。ＬＮＰを製剤化し、０．０１～１０ｍｏｌ％のＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む溶液に直接回収した。ＬＮＰは１～１２０分間静置させた後、２～８℃で保存するためにおよび／または－８０℃で保存するために、実施例２４に記載されているように、最終製剤化緩衝液に緩衝液交換する。
[0774]ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４は、場合によっては、０．０１～１０ｍｏｌ％で、ＬＮＰの製剤化前に初期の脂質混合物（イオン化可能な脂質、ステルス脂質、ヘルパー脂質などを含むが、これらに限定されない）に含まれた。ステルス脂質は、場合によっては０～５のｍｏｌ％で含まれた。ＬＮＰを製剤化し、１分から１２０分間静置させた。次いで、エタノール／水溶液中のＧａｌＮＡｃ－脂質を、０．０１～１０のｍｏｌ％でＬＮＰに添加し、混合物をさらに１分間～１２０分間静置させる。次いで、ＬＮＰを、実施例２４に記載されるように、２～８℃で保存するため、および／または－８０℃で保存するために、最終製剤緩衝液に緩衝液交換する。
[0775]ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４は、場合によっては、０．０１～１０のｍｏｌ％で、ＬＮＰの製剤化前に脂質の初期混合物（イオン性脂質、ステルス脂質、ヘルパー脂質などを含むが、これらに限定されない）に含まれる。ステルス脂質は、場合によっては０～５のｍｏｌ％で含まれてもよい。実施例２４に記載のように、ＬＮＰを製剤化し、次いで、２～８℃で保存するため、および／または－８０℃で保存するために、保存緩衝液に緩衝液を交換し、２～８℃および／または－８０℃で保存する。次いで、ＬＮＰを、室温で解凍する。次いで、エタノール／水溶液中のＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を、０．０１～１０のｍｏｌ％でＬＮＰに添加し、混合物をさらに１分間～１２０分間静置させる。
[0776]ＬＮＰは、実施例２４に記載のように保存した。場合によっては、緩衝液交換は、ＰＤ－１０カラム、透析、または接線流濾過（ＴＦＦ）によって行う／行った。場合によっては、ＧａｌＮＡｃ－脂質を添加し、望ましい保存条件に応じて適切な緩衝液交換を行った後、ＬＮＰを２～８℃または－８０℃で保存する／した。
[0777]次いで、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を表４の他のＧａｌＮＡｃ－脂質で置き換えることによって構成する。
実施例３７．ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを構成するためのＧａｌＮＡｃによるＬＮＰのインライン希釈。
実施例３７．ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを構成するためのＧａｌＮＡｃによるＬＮＰのインライン希釈。
[0778]ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、インライン（第３チャネル）希釈法を用いて製剤化した。１つのチャネル／ラインは脂質混合物である（イオン性脂質、ステルス脂質、ヘルパー脂質などを含むが、これらに限定されない）。もう一方のチャネル／ラインは、水溶液中のカーゴを含む（ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むが、これらに限定されない）。第３のチャネル／ラインは、ＬＮＰ中の最終ｍｏｌ％が０．０１～１０の範囲になるように、エタノール／水溶液中に所望のＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰを、１分～１２０分間静置させた後、緩衝液を、実施例２４に記載のように最終製剤緩衝液に交換して保存した。
[0779]他の例では、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、インライン（第３チャネル）希釈法を使用して製剤化する。１つのチャネル／ラインは、脂質混合物である（イオン性脂質、ステルス脂質、ヘルパー脂質などを含むが、これらに限定されない）。もう一方のチャネル／ラインは、水溶液中のカーゴを含む（ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むが、これらに限定されない）。第３のチャネル／ラインは、ＬＮＰ中の最終ｍｏｌ％が０．０１～１０％の範囲になるように、エタノール／水溶液中に所望のＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。次いで、ＬＮＰは、同じＧａｌＮＡｃ－脂質の０．０１～１０ｍｏｌ％を含む溶液に直接収集される。ＬＮＰは、１分間～１２０分間静置させた後、実施例２４に記載されるように、２～８℃で保存するため、および／または－８０℃で保存するために、最終製剤緩衝液に緩衝液交換する。
[0780]他の例では、ＬＮＰは、インライン（第３チャネル）希釈法を使用して製剤化する。１つのチャネル／ラインは脂質混合物である（イオン性脂質、ステルス脂質、ヘルパー脂質などを含むが、これらに限定されない）。もう一方のチャネル／ラインには、水溶液中のカーゴを含む（ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むが、これらに限定されない）。３番目のチャネル／ラインは、表４の所望のＧａｌＮＡｃ－脂質を、エタノール／水溶液中に含み、その結果、ＬＮＰの最終ｍｏｌ％は、０．０１～１０の範囲になる。ＬＮＰを製剤化し、１分～１２０分間静置させる。次いで、エタノール／水溶液中のＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を、０．０１～１０のｍｏｌ％でＬＮＰに添加し、混合物をさらに１～１２０分間静置させる。次いで、ＬＮＰを、実施例２４に記載されるように、２～８℃で保存するため、および／または－８０℃で保存するために、最終製剤緩衝液に緩衝液交換する。
[0781]ＬＮＰは、実施例２４に記載のように保存した／する。場合によっては、緩衝液交換は、ＰＤ－１０カラムを使用して、透析により、または接線流濾過（ＴＦＦ）により行う／行った。場合によっては、ＧａｌＮＡｃ－脂質を添加し、適切な保存緩衝液を交換した後、ＬＮＰを２～８℃または－８０℃で保存する。
[0782]次いで、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を表４の他のＧａｌＮＡｃ－脂質で置き換えることによって構成する。
実施例３８．ＬＮＰのインビボ遺伝子編集評価
[0783]実施例２３～２７のいくつかの製剤化したＬＮＰの遺伝子編集活性を、野生型ならびにＬＤＬｒおよびＡｐｏＥノックアウトげっ歯類モデルならびにＬＤＬｒノックダウン（ＫＤ）非ヒト霊長類において評価した。全てのノックアウトモデルはホモ接合性であり、－／－としても示されるが、ヘテロ接合性として明示的に特定されない限り、－／＋または＋／－としても示される。
実施例３８．ＬＮＰのインビボ遺伝子編集評価
[0783]実施例２３～２７のいくつかの製剤化したＬＮＰの遺伝子編集活性を、野生型ならびにＬＤＬｒおよびＡｐｏＥノックアウトげっ歯類モデルならびにＬＤＬｒノックダウン（ＫＤ）非ヒト霊長類において評価した。全てのノックアウトモデルはホモ接合性であり、－／－としても示されるが、ヘテロ接合性として明示的に特定されない限り、－／＋または＋／－としても示される。
[0784]マウスは、動物の世話、取り扱い、および終了に関する施設の倫理ガイドラインに従って処理した。マウスは病原体のない施設で飼育し、標準的な餌および水を自由に摂取できるようにした。マウスには、体重に応じて後眼窩経路により、試験物質または媒体としてのＰＢＳを投与した。投与後５日目または６日目に関連組織を採取した。ゲノムＤＮＡを抽出し、標的配列のパーセント編集を、次世代シーケンシングによって評価して編集効率を決定し、結果を図３～８に示す。
[0785]図２は、実施例３３に記載のように、ＮＧＳ分析のために採取する前の３日間、７－１７、７－１６－Ｌ、および７－１６－Ｍでトランスフェクションした後のインビトロでの初代ヒト肝細胞におけるＰＣＳＫ９編集効率を示す。ＬＮＰは、３１２．５ｎｇ／ｍＬのＬＮＰ濃度から２５００ｎｇ／ｍＬのＬＮＰ濃度までにわたる用量反応で投与した。
[0786]図３は、野生型（第１および２群）、ＬＤＬＲノックアウト（ＬＤＬＲ－／－、第３および４群）およびＡｐｏＥノックアウト（ＡｐｏＥ－／－、第５および６群）マウス（ｎ＝５）肝臓におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集を、１ｍｇ／ｋｇ用量で、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（ＭＳ００４）およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ（ＧＡ０５５）を１：１の比で保持するＬＮＰ ７－１７－１および７－１６の後眼窩投与後に図示する。７－１７－１は参照ＬＮＰであり、７－１６は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであり、１００４がＧａｌＮＡｃ－脂質である。第１、３、および５群は、７－１７－１で処理され、第２、４、および６群は、７－１６で処理した。ＬＮＰ ＩＤを表８および９に示す。ＧａｌＮＡｃ－脂質を欠く参照ＬＮＰ７－１７－１は、ＬＤＬＲ－／－およびＡｐｏＥ－／－マウスにおいて、低いかまたは非常に不十分な編集を生じた。
[0787]図４は、１：１の比で、ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００２およびｇＲＮＡ ＧＡ２５９を保有する本明細書のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ組成物の後眼窩投与後のＬＤＬＲ－／－マウス肝臓における遺伝子編集を示す。７－１６－Ａ、７－１６－Ｂ、および７－１６－Ｃは、ＡＮＧＰＴＬ３ガイドＧＡ２５９およびＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００２を用いて、表９に記載のとおりに調製した。７－１９および７－２０は、ＡＮＧＰＴＬ３ガイドＧＡ２５９およびＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００２を用いて、表１０に記載のように調製した。７－２９は、ＡＮＧＰＴＬ３ガイドＧＡ２５９およびＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００２を用いて、表１１に記載のように調製し、７－３４および７－３５は、ＡＮＧＰＴＬ３ガイドＧＡ２５９およびＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００２を用いて、表１２に記載のように調製した。このデータは、７－１６－Ａの用量反応と、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ（７－１６－Ｂ、７－１６－Ｃ、７－２９）の製剤プロセスが肝臓の遺伝子編集活性に及ぼす影響を強調している。７－１９および７－２０は、インビボでの肝臓遺伝子編集に対するＧａｌＮＡｃ－脂質（１００４）ｍｏｌ％滴定の効果を示す。７－３４および７－３５（表４）によって、脂質アンカーとしてコレステロールを有する。７－２９および７－３５の編集データは、脂質アンカーがＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰのインビボ有効性に影響を与えると結論付けられる。
[0788]図５は、ＡＢＥ ｍＲＮＡ（ＭＡ００４）およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ（ＧＡ２５７）を１：１の比で保持するＬＮＰの後眼窩投与後の野性型（第１、２、および３群）およびＬＤＬＲ－／－（第４、５、６および７群）マウス（ｎ＝５）肝臓におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集を示す。７－１６－Ｉは、第１、４および５群に投与し；第２および６群は、０．２５ｍｇ／ｍＬの全ＲＮＡ用量の７－１６－Ｈで処理した；７－２６は、０．２５ｍｇ／ｍＬで第３および７群に投与した。第１、２、４、および６群には、０．２５ｍｇ／ｋｇで投与した。そして第５群には、０．１２５ｍｇ／ｋｇを投与した。ＬＮＰ ＩＤおよび製剤情報を、表９および表１１に示す。製剤７－１６－Ｈおよび７－１６－Ｉは、それぞれ、ＰＤ－１０ カラムによって緩衝液を交換し、２～８℃で保存、およびＴＦＦを介して緩衝液交換し、－８０℃で保存した場合の同じ製剤の編集効率を比較した。製剤７－２６（０．２５ｍｇ／ｋｇでの第３群野生型；第７群ＬＤＬＲ－／－）では、ＰＥＧ－脂質５０７が、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４に完全に置き換えられた。第１群（７－１６－Ｉ）、第２群（７－１６－Ｈ）、第４群（７－１６－Ｉ）、および第６群（７－１６－Ｈ）は、それぞれ、ＷＴおよびＬＤＬＲ－／－マウスにおける肝臓遺伝子編集に対する同じＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ脂質組成物（表９）の緩衝液交換条件の効果を示す。第４群および５群は、ＬＤＬＲ－／－マウスにおける肝遺伝子活性に対する用量反応効果を示すために、それぞれ０．２５および０．１２５ｍｇ／ｋｇ用量の製剤７－１６－Ｉで処置した。
[0789]図６は、ＬＮＰ７－１６－Ｊおよび７－１６－Ｅの眼窩後投与後の野生型雌性マウス（ｎ＝５）肝細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集を示す（表９）。７－１６－Ｊは、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（ＭＳ００４）とＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ（ＧＡ０５５）とで構成され、７－１６－Ｅは、ＡＢＥ ｍＲＮＡ（ＭＡ００４）とＰＣＳＫ９（ＧＡ２５７）ｇＲＮＡで１：１の比で構成された。７－１６－Ｊおよび７－１６－Ｅは、それぞれ０．２５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇで投与された。
[0790]図７は、０．２５ｍｇ／ｋｇでのＬＮＰ７－１６－Ｉおよび７－１６－Ｋの眼窩後投与後の野生型雌性マウス（ｎ＝５）肝細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集を示す。両方のＬＮＰには、ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ２５７が含まれている。両方の製剤とも、同じ賦形剤および１００４のｍｏｌ％を含む。７－１６－Ｉおよび７－１６－Ｋの調製のために、インライン混合後のＬＮＰを、１６％エタノールを含むＰＢＳおよび１６％エタノールを含む水にそれぞれ集めた。ＬＮＰ ＩＤおよび製剤情報を、表９に示す。
[0791]図８は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを保有するＬＮＰを、０．５ｍｇ／ｋｇ用量で後眼窩投与した後のＬＤＬＲ－／－雌性マウス（ｎ＝５）肝細胞におけるＰＣＳＫ９編集を示す。７－１７－１（表８）、７－１６（表９）、７－１８（表１０）、７－１７－Ａ（表１０）、７－２４（表１０）、７－３３－Ａ（表１１）、７－２３（表１０）、および７－３３（表１１）は、ｓｐＣａｓ９のｍＲＮＡおよびｇＲＮＡで構成されている。７－１７－１（表８）、７－１６（表９）、７－１８（表１０）、および７－１７－Ａ（表１０）は、ＬＤＬＲ－／－マウス肝細胞における遺伝子編集活性に対するＧａｌＮＡｃ－脂質（１００４）ｍｏｌ％滴定の効果（それぞれ０、０．５、１．０および２．０ｍｏｌ％）を示す。３つの製剤は全て、図９のプロセス１に従って調製された。遺伝子編集効率に対する様々な製剤プロセスの効果は、７－２４、７－３３－Ａ、７－２３および７－３３のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰによって試験されている。製剤７－１７－１は、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を欠く対照ＬＮＰである。７－２４は、０．５ｍｏｌ％の１００４を含有し、ＧａｌＮＡｃ－脂質が、収集緩衝液に添加された（プロセス２、図９）。７－３３－Ａは、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を、第３ポート／インライン混合を通して混合チャンバに導入することによって調製した（プロセス３、図９）。７－２３のＧａｌＮＡｃ－脂質は、マウスに後眼窩投与する前に解凍した後、－８０℃で保存された事前に形成されたＬＮＰに添加した。７－３３は、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を、他の脂質賦形剤と予備混合することによって調製した（プロセス４、図９）。７－３４および７－３５（表１２）は、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４がそれぞれ１０５３および１０１４（挿入後０．５ｍｏｌ％）で置き換えられた１：１の比で、ＡＢＥ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡで構成され、ここでＧａｌＮＡｃ－１００４を、それぞれ１０５３および１０１４で置き換え（挿入後０．５ｍｏｌ％）、１００４を含むＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、より効果的な設計になり得ることが実証される。
[0792]図１５は、ＬＮＰ７－１６－Ｎおよび７－３８－Ａの０．２５ｍｇ／ｋｇでの眼窩後投与後のＬＤＬＲ－／－雌性マウス（ｎ＝５）肝細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集を示す。７－１６－Ｎには１００４が含まれており、表９に記載されており、７－３８－Ａには１０４４が含まれており、表１２に記載されている。７－１６－Ｎおよび７－３８－Ａは、ＰＣＳＫ９ガイドＲＮＡ ＧＡ２５６およびＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００４を含む。１００４は、１０４４と比較して、同じ製剤化方法でより高い有効性を示している。これらは両方とも、図９のプロセス１および図１０のプロトコール１に従って作成した。
[0793]図１６は、０．２５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２５６を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。この研究で使用したＬＮＰは表９～１２に記載され、それらの調製は実施例３５および３６に記載されている。７－１６－Ｏ＊および７－３８－Ａは、図９のプロセス１および図１０のプロトコール１により製造した。７－１６－Ｐ＊は、図９のプロセス２および図１１のプロトコール５により作製した。７－４１は、図９のプロセス３および図１２のプロトコール９により作製した。７－２２は、図９のプロセス１および図１１のプロトコール６により作製した。７－３９および７－４０は、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。７－１１２および７－１１３は、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有しない対照であり、表１４にも記載されている。
[0794]図１７は、０．１２５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２５６を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。この研究で使用したＬＮＰは表１４に記載され、それらの調製は実施例３５、３６、および３７に記載されている。ＬＮＰ７－４２および７－４３は、図９のプロセス３および図１４のプロトコール１３に示されているように、第３のポートのインライン希釈により実施例３７に記載されているように調製した。そこでは、ＧａｌＮＡｃ－脂質は第３のポートのインライン混合法に含まれ、他の脂質賦形剤では含まれなかった。その他は全て、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。ＬＮＰ ＩＤ７－１１４は、表１４に記載されているＧａｌＮＡｃ－脂質を有しない対照ＬＮＰであった。
[0795]図１８は、ＬＤＬＲ ＫＯでは０．１２５ｍｇ／ｋｇ、およびＷＴマウスでは０．０５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２５６を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝４～５）およびＷＴマウス（ｎ＝４～５）から単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。この研究で使用したＬＮＰは表１４に記載され、それらの調製は実施例３５および３６に記載されている。７－４９は図９のプロセス１および図１０のプロトコール１により製造した。その他は全て、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。７－１１５は表１４に記載されているＧａｌＮＡｃ－脂質を用いずに作製した対照である。７－１１６は７－４４と組成が同一であり、リピートバッチから予想されるように、Ｚ平均サイズおよび包含がわずかに異なるリピートバッチである。これは表１４に記載されている。
[0796]図１９は、ＬＤＬＲ ＫＯにおける０．１２５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２５６を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰは表１４に記載され、それらの調製は実施例３５および３６に記載されている。これらは、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。７－１１７はＧａｌＮＡｃ－脂質を用いずに作製した対照ＬＮＰであり、表１４に記載されている。７－１１８は７－５０と同じ組成を共有し、７－１１９は７－５１と同じ組成であるが、これらはリピートバッチであるため、わずかに異なる特性を有する。
[0797]図２０は、３種類全てのマウスにおける１、０．２５、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２６０を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ホモ接合性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）、雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）、および雌性ヘテロ接合性ＬＤＬＲノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集パーセンテージを示す。この研究で使用したＬＮＰは表１４に記載され、それらの調製は実施例３５および３６に記載されている。用量は、各マウスの種類について左から右に移動して、７－６４については１、０．２５、０．０５、および７－６５については０．２５ｍｇ／ｋｇである。これらは、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。この図には、表１４に記載されている、非ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ対照、ＬＮＰ ＩＤ７－１０５も含まれる。
[0798]図２１は、ＬＤＬＲ ＫＯおよびＷＴマウスにおける０．０５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２５６を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）および雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示す。この研究で使用したＬＮＰは表１４に記載され、それらの調製は実施例３５および３６に記載されている。これらは、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。７－１２２、７－１２３、および７－１２４は、ＧａｌＮＡｃ－脂質を含まない異なる組成を有する対照ＬＮＰであり、表１４に記載されている。ＬＮＰ ＩＤ７－１２５は１００４を含む。このグラフは、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、異なる組成を有するＴｒｉｓ緩衝液中で作製され、ＷＴマウスでは裸のＬＮＰと同様に機能し、一方、ＬＤＬＲ ＫＯマウスでは編集を救済することができることを示している。
[0799]図２２は、ＬＤＬＲ ＫＯでは０．１２５ｍｇ／ｋｇ、ならびにＷＴマウスでは０．１２５ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２５６を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）および雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。この研究で使用したＬＮＰは表１５および表１６に記載され、それらの調製は実施例３５、３６、および４２に記載されている。ＬＮＰ７－６０の２用量のみをＷＴマウスに投与した（０．１２５および０．０５ｍｇ／ｋｇ）。これらは、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。ＬＮＰ７－１２０はＧａｌＮＡｃ－脂質を用いずに作製した対照ＬＮＰであり、ＬＮＰ７－１２１は７－１１８と同じ組成であるが、リピートバッチである（表１４）。
[0800]図２３は、ＬＤＬＲ ＫＯでは０．０５ｍｇ／ｋｇ、およびＷＴマウスでは０．０５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２５６を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）および雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。この研究で使用したＬＮＰは表１４に記載され、それらの調製は実施例３６に記載されている。これらは、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。７－１２６、７－１２７、７－１２８および７－１２９は全てＧａｌＮＡｃ－脂質を用いずに作製した対照ＬＮＰであり、表１４に記載されている。
[0801]図２４は、ＬＤＬＲ ＫＯでは０．０５ｍｇ／ｋｇ、およびＷＴマウスでは０．０５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２５６を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）および雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。この研究で使用したＬＮＰは表１４に記載され、それらの調製は実施例３６に記載されている。これらは、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。７－１３０はＧａｌＮＡｃ－脂質を用いずに作製した対照ＬＮＰであり、表１４に記載されている。
[0802]図２５は、ＬＤＬＲ ＫＯでは０．０５ｍｇ／ｋｇ、およびＷＴマウスでは０．０５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２５７を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）および雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。この研究で使用したＬＮＰは表１４に記載され、それらの調製は実施例３６に記載されている。これらは、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。
[0803]図２６は、用量応答を示すために３種類全てのマウスにおける０．０２５、０．０５、０．１、および０．２５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡ ＧＡ２６０を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ホモ接合性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）、雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）、および雌性ＡｐｏＥノックアウトマウスから単離された肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。この研究では、同じＬＮＰであるＬＮＰ７－９１を、用量が異なるだけで、全ての群に投与した。この研究で使用したＬＮＰ ＩＤ７－９１は表１４に記載され、その調製は実施例３６に記載されている。これは図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。
[0804]図２７は、ＧＡ０９７およびｍＲＮＡ ＭＡ００４を用いて作製した１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与した後の、ＷＴ ＮＨＰから単離された肝臓組織におけるＰＣＳＫ９遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰを実施例３５に記載されているように作製し、実施例３８に記載されているように投与し、ＬＮＰを表１３に示す。ＬＮＰ７－１７は対照として機能し、一方、ＬＮＰ７－１６－Ｌおよび７－１６－Ｍは、それぞれ０．５％および１％で製剤中にＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を有した。
[0805]図２８は、１または２ｍｇ／ｋｇ用量でＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂを投与した後のＮＨＰの血液中のＬＤＬレベルを示すグラフである。ＬＮＰ ＡおよびＬＮＰ Ｂの両方には、ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＬＤＬＲを標的とする２つの異なるガイド対：ＧＡ４６８／ＧＡ４７０またはＧＡ４６９／ＧＡ４７１のうちの一対を負荷する。次いでこの処置により、ＮＨＰはＷＴからＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰに変化した。これらのＬＮＰおよびＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰの作製は実施例４８に記載されている。
[0806]図２９は、１または２ｍｇ／ｋｇの用量でＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂを投与した元のＷＴ ＮＨＰから単離された肝臓組織におけるＬＤＬＲ遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰ ＡおよびＬＮＰ Ｂの両方には、ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＬＤＬＲを標的とする２つの異なるガイド対：ＧＡ４６８／ＧＡ４７０またはＧＡ４６９／ＧＡ４７１のうちの一対を負荷した。次いでこの処置により、ＮＨＰはＷＴからＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰに変化した。これらのＬＮＰおよびＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰの作製は実施例４８に記載されている。
[0807]図３０は、実施例４９に記載されているように、２ｍｇ／ｋｇの用量でＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＬＤＬＲ ＫＯ／ＫＤ ＮＨＰからのＡＮＧＰＴＬ３レベルを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。これらは、示した場合を除いて、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰ ＩＤ７－９９は、ＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有しないため、対照として機能した。ＬＮＰ ＩＤ７－１００は、ＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。ＬＤＬＲがノックダウン／ノックアウトされたＮＨＰにおいても、ＡＮＧＰＴＬ３レベルはＧａｌＮＡｃを含むことにより低下する。
[0808]図３１は、実施例４９に記載されているように、２ｍｇ／ｋｇの用量で、ＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。これらは、示した場合を除いて、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰ ＩＤ７－９９は、ＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有しないため、対照として機能した。ＬＮＰ ＩＤ７－１００は、ＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。ＬＤＬＲがノックダウンされたＮＨＰにおいても、ＡＮＧＰＴＬ３レベルはＧａｌＮＡｃを含むことにより低下する。
[0809]図３２は、ホモ接合性ＬＤＬＲ ＫＯでは０．１ｍｇ／ｋｇ、およびＷＴマウスでは０．１ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２６０を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）および雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。この研究で使用したＬＮＰは表１４に記載され、それらの調製は実施例３５および３６に記載されている。ＬＮＰ ＩＤ７－８８および７－８９は、図９のプロセス１および図１０のプロトコール１により製造した。ＬＮＰ ＩＤの残りは、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。これらは、示した場合を除いて、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。これは、ＡＮＧＰＴＬ３の得られた肝臓編集、および添加方法の比較を調べるためのＧａｌＮＡｃ－脂質の滴定である。
[0810]図３３は、２ｍｇ／ｋｇの用量での、ＬＮＰ Ｃを投与した元のＷＴ ＮＨＰから単離された肝臓組織におけるＬＤＬＲ遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰ Ｃには、ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＬＤＬＲを標的とするガイド対ＧＡ４６８／ＧＡ４７０を負荷する。次いでこの処置により、ＮＨＰはＷＴからＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰに変化した。これらのＬＮＰおよびＬＤＬＲ ＫＯ／ＫＤ ＮＨＰの作製は実施例４８に記載されている。
[0811]図３４は、２ｍｇ／ｋｇの用量でＬＮＰ Ｃを投与した後の元のＷＴ ＮＨＰの血液中のＬＤＬレベルを示すグラフである。ＬＮＰ Ｃには、ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＬＤＬＲを標的とするガイド対ＧＡ４６８／ＧＡ４７０を負荷する。次いでこの処置により、ＮＨＰはＷＴからＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰに変化した。これらのＬＮＰおよびＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰの作製は実施例４８に記載されている。
[0812]図３６は、実施例４９に記載されているように、２ｍｇ／ｋｇの用量でＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰからの処置の２週間後のＡＮＧＰＴＬ３レベルを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。これらは、示した場合を除いて、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰ ＩＤ７－１０３はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有しないため、対照として機能した。ＬＮＰ ＩＤ７－１０２はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。ＬＮＰ ＩＤ７－１０１はアミノ脂質として５０２を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。
[0813]図３７は、実施例４９に記載されているように、２ｍｇ／ｋｇの用量でＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰからの処置の２週間後のトリグリセリドレベルを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。これらは、示した場合を除いて、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰ ＩＤ７－１０３はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有しないため、対照として機能した。ＬＮＰ ＩＤ７－１０２はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。ＬＮＰ ＩＤ７－１０１はアミノ脂質として５０２を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。
[0814]図３８Ａは、ホモ接合性ＬＤＬＲ ＫＯおよびＷＴマウスにおける０．３ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２６０を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯマウス（ｎ＝５）および雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造した。この研究は、異なるＧａｌＮＡｃリガンドを使用した場合の異なるレベルの編集を示し、１００４が優れている。図３８Ｂは、０．３ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２６０を保有するＬＮＰの注射後５日目および９日目の、図３８Ａに示したＬＤＬＲ ＫＯおよびＷＴマウスの血液中の対応するＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現を示す。発現レベルは０日目の処置前レベルに正規化した。
[0815]図３９は、本明細書に記載されているように、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有するおよび有しないＬＮＰをレクチンカラムに流した場合のレクチンクロマトグラフィーの結果を示す。ＧａｌＮＡｃ（アルファ１，３）を含有する糖に優先的に結合するグリシンマックスレクチン固定化樹脂（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＡＫ－１３０１－２）を充填したカラムを使用して、レクチンアフィニティークロマトグラフィーによりＬＮＰを分画した。ダイズレクチン樹脂をＰＢＳで平衡化し、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを結合させ、樹脂を１×ＰＢＳで洗浄し、結合したＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを１×ＰＢＳ＋５００ｍＭのガラクトースで溶出した。収集した画分をＩＰ－ＲＰＬＣ－ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤにより分析して、ＧａｌＮＡｃ表面の取り込みおよび均一性を確認した。ＧａｌＮＡｃを有しないＬＮＰはレクチンアフィニティーカラムに結合しないが、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有するＬＮＰは結合し、レクチンアフィニティーカラムから溶出する。１００４を有するＬＮＰは、ＬＮＰ ＩＤ７－１６－Ｆであった。
[0816]図４０Ａ～図４０Ｃは、生体層干渉法（ＢＬＩ）アッセイの結果を示す。図４０Ａは、プロセスがどのように機能するかの概略を示す。図４０Ｂは、製剤中にＧａｌＮＡｃ－脂質を有しないＬＮＰである７－１７からのデータを示す。図４０Ｂは、図４０Ｃと等価のＲＮＡ濃度においてＬＮＰ（１００４を有しない）と固定化ＡＳＧＰＲとの生体分子相互作用がないことを示すセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）である。ｙ軸上の波長のシフトは、相互作用が起こっているときにＡＳＧＰＲが固定化された先端の光学的厚さの変化を測定している。したがって、１００４がないことは、ＡＳＧＰＲに結合するものがないことを意味しているため、ｙ軸上に波長のシフトはない。図４０Ｃは、製剤中にＧａｌＮＡｃ－脂質を有するＬＮＰである７－１６－Ｌからのデータを示す。図４０Ｃは、固定化ＡＳＧＰＲに対する１００４ ＧａｌＮＡｃ脂質で修飾されたＬＮＰの濃度依存的な生体分子相互作用を示すセンソグラムである。ｙ軸上の波長のシフトは、ＡＳＧＰＲが固定化された先端の光学的厚さの変化を測定している。これは、ＧａｌＮＡｃ－脂質がＡＳＧＰＲに結合していることを示す。
[0817]図４１は、３種類全てのマウスにおける０．２５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２６０を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯ（ＬＤＬＲ－／－）マウス（ｎ＝５）、雌性ＬＤＬＲ＋／－ヘテロ接合性マウス（ｎ＝５）、および雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤ７－１３３および７－１３４は、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造し、表１８に記載されている。この研究は、１００４を有するおよび有しないＬＮＰが、ＷＴおよびＬＤＬＲ＋／－マウスにおいて同様に編集されたが、１００４を含むことにより、ＬＤＬＲ－／－マウスにおける編集が救済されたことを示す。
[0818]図４２は、３種類全てのマウスにおける０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、および０．５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２６０を保有するＬＮＰの眼窩後注射後の雌性ＬＤＬＲ ＫＯ（ＬＤＬＲ－／－）マウス（ｎ＝５）、雌性ＬＤＬＲ＋／－ヘテロ接合性マウス（ｎ＝５）、および雌性ＷＴマウス（ｎ＝５）から単離された肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤ７－１３２は、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により製造し、表１８に記載されている。この研究は、１００４を有するＬＮＰが、ＷＴ、ＬＤＬＲ＋／－マウス、およびＬＤＬＲ－／－マウスにおいて同様に編集されたことを示す。
[0819]図４３は、０．２５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２６０を保有するＬＮＰの注射後９日目の、図４１に示したＬＤＬＲ－／－、ＬＤＬＲ＋／－、およびＷＴマウスの血液中の対応するＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現を示す。発現レベルは０日目の処置前レベルに正規化した。ＬＤＬＲ－／－マウスに投与した製剤中に１００４を含めると、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の低下が救済された。
[0820]図４４は、０．１、０．２５、および０．５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびｇＲＮＡ ＧＡ２６０を保有するＬＮＰの注射後９日目の、図４２に示したＬＤＬＲ－／－、ＬＤＬＲ＋／－、およびＷＴマウスの血液中の対応するＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現を示す。発現レベルは０日目の処置前レベルに正規化した。この研究は、１００４を有するＬＮＰが、ＷＴ、ＬＤＬＲ＋／－マウス、およびＬＤＬＲ－／－マウスにおいて同様にＡＮＧＰＴＬ３を低下させることを示す。
[0821]図４５は、２ｍｇ／ｋｇの用量での、ＬＮＰ Ｃを投与した元のＷＴ ＮＨＰから単離された肝臓組織におけるＬＤＬＲ遺伝子編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰ Ｃには、ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＬＤＬＲを標的とするガイド対ＧＡ４６８／ＧＡ４７０が負荷される。次いでこの処置により、ＮＨＰがＷＴからＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰに変化した。これらのＬＮＰおよびＬＤＬＲ ＫＯ／ＫＤ ＮＨＰの作製は実施例４８に記載されている。これは図３３と同じデータであるが、ビヒクル対照を示す。
[0822]図４６は、２ｍｇ／ｋｇの用量での、ＬＮＰ Ｃを投与した元のＷＴ ＮＨＰから単離された肝臓組織におけるＬＤＬＲ ｐｇ／ｍｇ肝臓タンパク質レベルを示すグラフである。ＬＮＰ Ｃには、ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＬＤＬＲを標的とするガイド対ＧＡ４６８／ＧＡ４７０が負荷される。次いでこの処置により、ＮＨＰはＷＴからＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰに変化した。これらのＬＮＰおよびＬＤＬＲ ＫＯ／ＫＤ ＮＨＰの作製は実施例４８に記載されている。ＬＤＬＲレベルは、ＬＮＰ Ｃを受けたＮＨＰにおいて大幅に低減した。
[0823]図４７は、１または２ｍｇ／ｋｇの用量での、ＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂを投与した元のＷＴ ＮＨＰから単離された肝臓組織におけるＬＤＬＲ ｐｇ／ｍｇ肝臓タンパク質レベルを示すグラフである。ＬＮＰ Ａには、ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＬＤＬＲを標的とするガイド対ＧＡ４６８／ＧＡ４７０が負荷され、一方、ＬＮＰ Ｂには、ＭＳ００４およびガイド対ＧＡ４６９／ＧＡ４７１が負荷される。次いでこの処置により、ＮＨＰはＷＴからＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰに変化した。これらのＬＮＰおよびＬＤＬＲ ＫＯ／ＫＤ ＮＨＰの作製は実施例４８に記載されている。ＬＤＬＲレベルは、ＬＮＰ ＡまたはＢを受けたＮＨＰにおいて大幅に低減した。
[0824]図４８は、２ｍｇ／ｋｇの用量でＬＮＰ Ｃを投与した後の元のＷＴ ＮＨＰの血液中のＬＤＬレベル（ｍｇ／ｄＬ）の延長された時間経過を示すグラフである。ＬＮＰ Ｃには、ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＬＤＬＲを標的とするガイド対ＧＡ４６８／ＧＡ４７０が負荷される。次いでこの処置により、ＮＨＰはＷＴからＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰに変化した。これらのＬＮＰおよびＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰの作製は実施例４８に記載されている。このグラフは図３４に見られるデータの延長された時間経過であり、また図３４の正規化と比較した、ｍｇ／ｄＬでのＬＤＬの絶対値である。
[0825]図４９は、実施例４９に記載されているように、２ｍｇ／ｋｇの用量で、ＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。これらは、示した場合を除いて、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰ ＩＤ７－１０１は５０２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％のＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を有した。ＬＮＰ ＩＤ７－１０２はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。ＬＤＬＲがノックダウンされたＮＨＰにおいても、ＡＮＧＰＴＬ３レベルはＧａｌＮＡｃ－脂質を含むことにより低下する。
[0826]図５０は、２ｍｇ／ｋｇの用量で、ＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＷＴ ＮＨＰから単離された、処置後の経時的なＡＮＧＰＴＬ３血中タンパク質レベルを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。これらは、示した場合を除いて、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰ ＩＤ７－１０３はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有しないため、対照として機能した。ＬＮＰ ＩＤ７－１０２はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。ＬＮＰ ＩＤ７－１０１はアミノ脂質として５０２を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。これは図３６の時間経過である。
[0827]図５１は、実施例４９に記載されているように、２ｍｇ／ｋｇの用量で、ＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰから単離された、処置後の経時的なＡＮＧＰＴＬ３血中タンパク質レベルを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。これらはＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰ ＩＤ７－１０２はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。ＬＮＰ ＩＤ７－１０１はアミノ脂質として５０２を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。
[0828]図５２は、実施例４９に記載されているように、２ｍｇ／ｋｇの用量で、ＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰから単離された、処置後の経時的なＬＤＬ血中レベルを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。これらはＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰ ＩＤ７－１０２はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。ＬＮＰ ＩＤ７－１０１はアミノ脂質として５０２を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。どちらのＬＮＰもＬＤＬＲ ＫＯモデルで見られた高ＬＤＬを低下させた。
[0829]図５３は、１または２ｍｇ／ｋｇの用量でＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂを投与した後のＮＨＰの血液中のベースラインに対するパーセントとしてのＬＤＬレベルを示すグラフである。ＬＮＰ ＡおよびＬＮＰ Ｂの両方には、ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＬＤＬＲを標的とする２つの異なるガイド対：ＧＡ４６８／ＧＡ４７０またはＧＡ４６９／ＧＡ４７１のうちの一対を負荷した。次いでこの処置により、ＮＨＰはＷＴからＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰに変化した。これらのＬＮＰおよびＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰの作製は実施例４８に記載されている。これは図２８の時間経過である。
[0830]図５４は、実施例４９に記載されているように、２ｍｇ／ｋｇの用量で、ＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰから単離された、処置後の経時的なＬＤＬ血中レベルを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。ＬＮＰ ＩＤ７－９９はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有しないため、対照として機能した。ＬＮＰ ＩＤ７－１００はＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。１００４を含めることにより、ＬＤＬレベルの低下が救済された。
[0831]図５５は、実施例４９に記載されているように、２ｍｇ／ｋｇの用量で、ＭＡ００４ ｍＲＮＡおよびＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧＡ３４７ガイドＲＮＡを負荷したＬＮＰで処置したＬＤＬＲ ＫＤ ＮＨＰの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３編集パーセンテージを示すグラフである。ＬＮＰ ＩＤは表１７に記載され、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７により実施例３６に記載されているように製造する。これらは、示した場合を除いて、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む。ＬＮＰ ＩＤ７－９９は、ＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有しないため、対照として機能した。ＬＮＰ ＩＤ７－１００は、ＶＬ４２２アミノ脂質を用いて作製し、０．０５％の１００４を有した。ＬＤＬＲがノックダウンされたＮＨＰにおいても、ＡＮＧＰＴＬ３レベルはＧａｌＮＡｃを含むことにより低下する。この図は、ＮＨＰの複製を示した図３１である。
[0832]ＬＮＰはまた、カニクイザル非ヒト霊長類に１ｍｇ／ｋｇ用量で投与された。ＬＮＰは、１時間かけてＩＶ注入によって投与した。ＬＮＰは、実施例２４に記載され、表１３に示されるＧａｌＮＡｃ－脂質添加法に従って、表５および／または７に与えられるＬＮＰ ＩＤを用いて調製した。ＬＮＰは、実施例２４に記載のように－８０℃で事前に保存した。ＬＮＰ７－１７は、対照として機能するが、ＬＮＰ ７－１６－Ｌおよび７－１６－Ｍは、製剤中にＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を有した。投与後１日目または１４日目に霊長類を屠殺した。エンドポイントとしては、限定するものではないが、他の脂質パラメーターのなかでも、血液中のＬＤＬ－ｃレベル、肝臓の肝細胞における標的遺伝子の編集％、血液中のＰＣＳＫ９タンパク質レベル、血液中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルが挙げられる。
[0833]次いで、これらの製剤を、実施例３３に記載のようにヒトおよびサルの初代肝細胞と共にインキュベートし、その結果を図２に要約する。図２は、ＬＮＰ製剤７－１７、７－１６－Ｌおよび７－１６－Ｍの初代ヒト肝細胞におけるインビトロのＰＣＳＫ９遺伝子編集効率を示す。
[0834]
ゲノムＤＮＡ単離
[0835]製造業者のプロトコールに従って、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ自動抽出装置（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、ビーズベースの抽出キット、ＭａｇＭＡＸ－９６ ＤＮＡマルチサンプルキット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、約２０μＬの全マウス肝臓溶解物からゲノムＤＮＡを単離した。製造業者のプロトコールに従って、ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４システム（ＭＰ Ｂｉｏ）を使用して、マウスの肝臓全体を溶解した。０．５ｍＬのＰＢＳを含む２ｍＬの溶解マトリックスチューブ（ＭＰ Ｂｉｏ）に肝臓をロードした。抽出したゲノムＤＮＡは、さらに使用するまで４℃で保存するか、長期保存のために－８０℃で保存した。
[0835]製造業者のプロトコールに従って、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ自動抽出装置（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、ビーズベースの抽出キット、ＭａｇＭＡＸ－９６ ＤＮＡマルチサンプルキット（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、約２０μＬの全マウス肝臓溶解物からゲノムＤＮＡを単離した。製造業者のプロトコールに従って、ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４システム（ＭＰ Ｂｉｏ）を使用して、マウスの肝臓全体を溶解した。０．５ｍＬのＰＢＳを含む２ｍＬの溶解マトリックスチューブ（ＭＰ Ｂｉｏ）に肝臓をロードした。抽出したゲノムＤＮＡは、さらに使用するまで４℃で保存するか、長期保存のために－８０℃で保存した。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）および編集効率の解析
[0836]遺伝子編集の程度を決定するために、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはディープシーケンシングを目的の領域に対して実施した。製造業者のプロトコールに従って、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してサンプルを調製した。簡単に言えば、最初に目的の領域を増幅するために、２ラウンドのＰＣＲを実行し、次にディープシーケンシングおよびサンプル識別に必要なＤＮＡ配列を最初の製品に追加した。最終的なアンプリコンは、製造業者のプロトコールに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置で配列決定した。ペアエンド読み取りは、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２パイプラインで分析した（Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｋ．、Ｒｅｅｓ，Ｈ．、Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ら、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３７、２２４－２２６（２０１９）を参照のこと）。要するに、低品質の読み取りを除外し、アダプター配列を読み取りからトリミングして、ペアエンド読み取りをマージして、アンプリコン配列に整列させた。編集の割合は、整列された読み取りの総数に対する、挿入または削除をサポートする読み取りの数として計算した。Ｃａｓ９の場合、編集の割合は、整列された読み取りの総数に対する、挿入または削除をサポートする読み取りの数として計算した。
[0836]遺伝子編集の程度を決定するために、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはディープシーケンシングを目的の領域に対して実施した。製造業者のプロトコールに従って、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してサンプルを調製した。簡単に言えば、最初に目的の領域を増幅するために、２ラウンドのＰＣＲを実行し、次にディープシーケンシングおよびサンプル識別に必要なＤＮＡ配列を最初の製品に追加した。最終的なアンプリコンは、製造業者のプロトコールに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置で配列決定した。ペアエンド読み取りは、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２パイプラインで分析した（Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｋ．、Ｒｅｅｓ，Ｈ．、Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ら、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３７、２２４－２２６（２０１９）を参照のこと）。要するに、低品質の読み取りを除外し、アダプター配列を読み取りからトリミングして、ペアエンド読み取りをマージして、アンプリコン配列に整列させた。編集の割合は、整列された読み取りの総数に対する、挿入または削除をサポートする読み取りの数として計算した。Ｃａｓ９の場合、編集の割合は、整列された読み取りの総数に対する、挿入または削除をサポートする読み取りの数として計算した。
実施例３９．ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７６から構成されるＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
[0837]所望のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、実施例２５～３８のＧａｌＮＡｃ－脂質をＧａｌＮＡｃ－脂質１０７６で置き換えることによって構成される。
[0837]所望のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、実施例２５～３８のＧａｌＮＡｃ－脂質をＧａｌＮＡｃ－脂質１０７６で置き換えることによって構成される。
実施例４０．ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７９から構成されるＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
[0838]所望のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、実施例２５～３８のＧａｌＮＡｃ－脂質をＧａｌＮＡｃ－脂質１０７９で置き換えることによって構成される。
[0838]所望のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、実施例２５～３８のＧａｌＮＡｃ－脂質をＧａｌＮＡｃ－脂質１０７９で置き換えることによって構成される。
[0839]前述の図９～１４は、本明細書に開示されるＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの代表的な製造プロセスの図である。図９に示されているのは、プロセス１～４である。プロセス１は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの調製方法を示しており、その態様は、Ｓａｔｏら Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１７、２６６、２１６－２２５でより完全に説明されている。プロセス２は、水性緩衝液中の核酸が１つ（または複数）のチャネルおよび脂質成分（アミノ脂質、ヘルパー脂質、構造脂質／ステロール、およびステルス脂質を含むがこれらに限定されない）は、別個の１つまたは複数のチャネルを通ってミキサーに送られる、ＬＮＰの作成方法を図示する。ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤との２つの流れが別々のチャネルを通ってミキサーに入り、ミキサー内で混合されること；ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤とは、ミキサーに入る前には互いに接触しないこと、を理解すべきである。混合チャンバで一過性に形成されたＬＮＰは、所望のｍｏｌ％のＧａｌＮＡｃ－脂質を含む希釈緩衝液に収集される。その後、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰｓは保持時間に入り、緩衝液交換に進む。プロセス３は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを調製するためのインライン混合法を示しており、これにより、水性緩衝液中の核酸は、１つ（または複数の）チャネルを通ってインラインミキサーに送られ、および脂質成分（アミノ脂質、ヘルパー脂質、構造脂質、およびステルス脂質を含むが、これらに限定されない）は、別々の１つまたは複数のチャネルを通ってミキサーに送られる。ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤との２つの流れが別々のチャネルを通ってミキサーに入り、ミキサー内で混合されること；ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤とは、ミキサーに入る前には互いに接触しないこと、を理解する必要がある。ある場合にはミキサーはＴミキサーであり、他の場合にはクロスミキサーである。次に、溶液は非常に短い距離のチューブを通って移動し、すぐに連続して別のインラインミキサーに入り、ここでこの最初のミキサーの出力は、ＧａｌＮＡｃ－脂質を含む希釈緩衝液とインラインで混合され、その結果、他の脂質と比較して最終の所望の標的ｍｏｌ％が達成される。２つのミキサー間の距離は非常に短いため、２つの連続する混合事象は、ほぼ瞬時に行われると理解され得る。その後、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは、保持時間に入った後、緩衝液交換に進む。プロセス４は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの調製方法を示しており、これにより、水性緩衝液中の核酸は、１つ（または複数の）チャネルを通じてインラインミキサーに送られ、および脂質成分（アミノ脂質、ヘルパー脂質、構造脂質、ステルス脂質、およびＧａｌＮＡｃ－脂質の少なくとも一部または所望のｍｏｌ％を含むが、これらに限定されない）は、別個の１つまたは複数のチャネルを通ってミキサーに送られる。ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤との２つの流れが別々のチャネルを通ってミキサーに入り、ミキサー内で混合されること；ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤とは、ミキサーに入る前には互いに接触しないこと、を理解すべきである。次いで、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰは希釈緩衝液と混合され、保持時間および緩衝液交換に進む。プロセス４では、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、ミキサーに入る脂質賦形剤を含む流れに完全にまたは少なくとも部分的に含まれる。ＧａｌＮＡｃ脂質の残り（他の脂質と比較して所望の目標最終ｍｏｌ％が達成されるように）があれば、プロセス３に記載されているように連続インラインミキサーを通じて含まれてもよいし、またはプロセスの後半のポイントで添加されてもよい。
[0840]図１０～１４に示すように、これらのプロセスの特定の態様をさらに詳述する前述のプロセスのそれぞれに、特定のプロトコールを使用してもよい。図１０は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成するために図９のプロセスに関連して使用され得るプロトコール１～３を示しており、これにより、水性緩衝液中の核酸は、１つ（または複数）のチャネルを通ってミキサーに送られる／送られた、そして脂質成分（アミノ脂質、ヘルパー脂質、構造脂質またはステロール脂質、およびステルス脂質を含むがこれらに限定されない）は、別個の１つまたは複数のチャネルを通ってミキサーに送られる／送られた。ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤との２つの流れが別々のチャネルを通ってミキサーに入り／入った、そしてミキサー内で混合されること；ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤とは、ミキサーに入る前には互いに接触しないこと、を理解すべきである。その後、混合溶液はミキサーを出る。プロトコール１、２、および３は、プロセス１のバージョンであり、ＧａｌＮＡｃ－脂質が事後添加によって追加される段階のみが異なる。
[0841]図１１は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成するために図９のプロセスと関連して使用され得るプロトコール４～６を示しており、これにより、水性緩衝液中の核酸は、１つ（または複数）のチャネルを通ってミキサーに送られ、および脂質成分（アミノ脂質、ヘルパー脂質、構造脂質またはステロール脂質、およびステルス脂質を含むがそれらに限定されない）は、別個の１つまたは複数のチャネルを通ってミキサーに送られる。ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤との２つの流れが別々のチャネルを通ってミキサーに入り、ミキサー内で混合されること；ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤とは、ミキサーに入る前には互いに接触しないことが理解されるべきである。次いで、混合溶液はミキサーを出る。プロトコール４は、図９のプロセス１のバージョンであり、濃縮後にＧａｌＮＡｃ－脂質が添加される。プロトコール５は、図９のプロセス２を利用し、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、収集容器内の静的希釈緩衝液に含まれている。プロトコール６はプロセス１を利用しており、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、濃縮、濾過、および保存の後に添加される。
[0842]図１２は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成するために図９のプロセスと関連して使用され得るプロトコール７～９を示しており、これにより、水性緩衝液中の核酸は、１つ（または複数）のチャネルを通ってミキサーに送られ、および脂質成分（アミノ脂質、ヘルパー脂質、構造脂質またはステロール脂質、ステルス脂質、およびＧａｌＮＡｃ－脂質の少なくとも一部を含むが、これらに限定されない）は、別個の１つまたは複数のチャネルを通じてミキサーに送られる。ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤との２つの流れが別々のチャネルを通ってミキサーに入り、ミキサー内で混合されること；ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤とは、ミキサーに入る前には互いに接触しないこと、を理解する必要がある。次いで、混合溶液はミキサーを出る。図は、混合物を出る流れが希釈緩衝液に入ることを示している。これは、流れが収集容器内の静的希釈緩衝液と接触するか、流れを後続のインラインミキサーに運ぶ非常に短い長さのチューブに入り、そこで最初のミキサーからの流れが、この連続ミキサーで希釈緩衝液とインラインで混合されることを意味すると理解される。プロトコール７は、図９のプロセス４を利用してＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成する。ここで、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、ミキサーに入る他の脂質の混合物に完全に含まれている。別個の核酸水性流れと脂質流れとは、ミキサー内で混合された後に出て、上記の方法の１つで希釈緩衝液と接触する。プロトコール８は、図９のプロセス４のバージョンを利用して、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成する。ここで、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、ミキサーに入る他の脂質の混合物の中に、および上記の２つの方法のいずれかでプロトコールに含められ得る希釈緩衝液に含まれる。プロトコール９は、図９のプロセス４のバージョンを利用して、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成する。ここで、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、ミキサーに入る他の脂質の混合物に含まれ、プロセスの後の時点でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰｓに添加される。この場合、上記のいずれかの方法で希釈緩衝液がＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰに導入された後、それらは保持時間を完了し、その後、ＧａｌＮＡｃ－脂質の添加に続いて別の保持時間が完了し、緩衝液が交換される。
[0843]図１３は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成するために図９のプロセスに関連して使用し得るプロトコール１０および１１を示しており、これにより、水性緩衝液中の核酸は、１つ（または複数）のチャネルを通じてミキサーに送られ、および脂質成分（アミノ脂質、ヘルパー脂質、構造脂質またはステロール脂質、ステルス脂質、およびＧａｌＮＡｃ－脂質の少なくとも一部を含むが、これらに限定されない）は、別個の１つまたは複数のチャネルを通ってミキサーに送られる。ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤との２つの流れが別々のチャネルを通ってミキサーに入り、ミキサー内で混合されること；ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤とは、ミキサーに入る前には互いに接触しないこと、を理解すべきである。次いで、混合溶液はミキサーを出る。図は、混合物を出る流れが希釈緩衝液に入ることを示している。これは、流れが収集容器内の静的希釈緩衝液と接触するか、流れを後続のインラインミキサーに運ぶ非常に短い長さのチューブに入り、そこで最初のミキサーからの流れが、この連続ミキサー中で希釈緩衝液とインラインで混合されることを意味すると理解される。プロトコール１０は、図９のプロセス４のバージョンを利用して、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成する。ここで、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、ミキサーに入る他の脂質の混合物に含まれ、プロセスの後の時点で、（この場合は緩衝液交換後に）ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰに添加される。プロトコール１１は、図９のプロセス４のバージョンを利用して、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成する。ここで、ＧａｌＮＡｃ－脂質は、ミキサーに入る他の脂質の混合物に含まれており、また希釈緩衝液にも存在するか、ない可能性があるか、または他の脂質構成要素の一部である。希釈緩衝液は、上記の方法のいずれかでＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰに接触すると理解されている。
[0844]図１４は、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成するために図９のプロセスに関連して使用され得るプロトコール１２および１３を示しており、これにより、水性緩衝液中の核酸は、１つ（または複数）のチャネルを通ってミキサーに送られ、および脂質成分（アミノ脂質、ヘルパー脂質、構造脂質またはステロール脂質、ステルス脂質、およびＧａｌＮＡｃ－脂質の少なくとも一部を含むがこれに限定されない）は、別個の１つまたは複数のチャネルを通ってミキサーに送られる。ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤との２つの流れが別々のチャネルを通ってミキサーに入り、ミキサー内で混合されること；ＲＮＡペイロードとＬＮＰ賦形剤とは、ミキサーに入る前には互いに接触しないこと、を理解すべきである。次いで、この混合溶液はミキサーを出て、非常に短い長さのチューブに入り、このチューブは、流れを次に続くインラインミキサーに運び、最初のミキサーからの流れは、この次に続くインラインミキサー中にＧａｌＮＡｃ－脂質を含む希釈緩衝液とインラインで混合される。プロトコール１２は、図９のプロセス３を利用してＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成する。ここでは、ＧａｌＮＡｃ－脂質の一部が、最初のＴミキサーに入る他の脂質と一緒に流れに含まれているか、まったく含まれていない。プロトコール１２に示されるプロトコールは、第１のミキサーに入る他の脂質を含む流れにおいてＧａｌＮＡｃ－脂質の有無にかかわらず実施できることが理解されるべきである。最初のＴミキサーを出る流れは、非常に短い長さのチューブを通じて別の次に続くＴミキサーに運ばれ、そこでＧａｌＮＡｃ－脂質を含む希釈緩衝液と混合される。プロトコール１３は、図９のプロセス３を利用してＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを生成する。ここで、ＧａｌＮＡｃ－脂質の一部が、最初のクロスミキサーに入る他の脂質と共に流れに含まれるか、まったく含まれない。プロトコール１３に示されるプロトコールは、第１のミキサーに入る他の脂質を含む流れにおいて、ＧａｌＮＡｃ－脂質の有無にかかわらず実施できることが理解されるべきである。最初のクロスミキサーを出る流れは、次いで、非常に短い長さのチューブを通じて次のＴミキサーに運ばれ、ＧａｌＮＡｃ－脂質を含む希釈緩衝液とインラインで混合される。
実施例４１．例示的なＲＮＡ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの調製
[0845]例えば、ＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート２－１は、１３量体のオリゴ（２’－Ｏ－メトキシウリジン）と、配列（配列番号８）の５’末端で、ＲＮＡ（配列番号７、表２）の３’末端のポリ（Ａ）テールへ共有結合的にコンジュゲートされたＧａｌＮＡｃリガンドとのハイブリダイゼーションによって調製される。コンジュゲート２－２において、ＧａｌＮＡｃリガンドは、ＲＮＡ（配列番号８）のポリ（Ａ）とハイブリダイズするオリゴ（２’－Ｏ－メトキシウリジン）（配列番号１０）の３’末端に共有結合される。ＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート２－３では、配列番号１１のポリ（Ａ）テールが、オリゴヌクレオチドの両端にＧａｌＮＡｃリガンドを保持するオリゴ（２’－Ｏ－メトキシウリジン）（配列番号１２）とハイブリダイズされる。ＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート２－４、２－５、および２－６の調製では、オリゴ（２’－Ｏ－メトキシウリジン）の長さを、２４マーに増やす。ＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンゲート２－７～２－３０は、表２に記載されているように、２’－Ｏ－メトキシウリジン（ｕ）をウリジン（Ｕ）またはチミジン（Ｔ）のいずれかで部分的または完全に置換することによって調製される。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのオリゴヌクレオチド８～１０および１２～３６は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４、１３６、１６９５８－１６９６１に記載の固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護のもとでＧａｌＮＡｃリガンド単量体３７および３８を用いて調製する（例えば、スキーム３）を使用して調製される。
[0845]例えば、ＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート２－１は、１３量体のオリゴ（２’－Ｏ－メトキシウリジン）と、配列（配列番号８）の５’末端で、ＲＮＡ（配列番号７、表２）の３’末端のポリ（Ａ）テールへ共有結合的にコンジュゲートされたＧａｌＮＡｃリガンドとのハイブリダイゼーションによって調製される。コンジュゲート２－２において、ＧａｌＮＡｃリガンドは、ＲＮＡ（配列番号８）のポリ（Ａ）とハイブリダイズするオリゴ（２’－Ｏ－メトキシウリジン）（配列番号１０）の３’末端に共有結合される。ＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート２－３では、配列番号１１のポリ（Ａ）テールが、オリゴヌクレオチドの両端にＧａｌＮＡｃリガンドを保持するオリゴ（２’－Ｏ－メトキシウリジン）（配列番号１２）とハイブリダイズされる。ＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート２－４、２－５、および２－６の調製では、オリゴ（２’－Ｏ－メトキシウリジン）の長さを、２４マーに増やす。ＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンゲート２－７～２－３０は、表２に記載されているように、２’－Ｏ－メトキシウリジン（ｕ）をウリジン（Ｕ）またはチミジン（Ｔ）のいずれかで部分的または完全に置換することによって調製される。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのオリゴヌクレオチド８～１０および１２～３６は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４、１３６、１６９５８－１６９６１に記載の固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護のもとでＧａｌＮＡｃリガンド単量体３７および３８を用いて調製する（例えば、スキーム３）を使用して調製される。
[0846]本明細書で言及された全ての特許および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例４２ 製剤中の複数のＧａｌＮＡｃ－脂質の組合せ
表１５に示したＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを実施例２５～４０に記載されているように調製し、ＧａｌＮＡｃ－脂質の混合物を単一のＧａｌＮＡｃ－脂質の代わりに使用した。ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４および１０７６を、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７に従って、所望の比率で混合してＬＮＰを調製した。ＬＮＰ中のＧａｌＮＡｃ－脂質の会合体のｍｏｌ％は１００４および１０７６から構成される。
表１５に示したＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを実施例２５～４０に記載されているように調製し、ＧａｌＮＡｃ－脂質の混合物を単一のＧａｌＮＡｃ－脂質の代わりに使用した。ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４および１０７６を、図９のプロセス４および図１２のプロトコール７に従って、所望の比率で混合してＬＮＰを調製した。ＬＮＰ中のＧａｌＮＡｃ－脂質の会合体のｍｏｌ％は１００４および１０７６から構成される。
添加方法は、実施例３５（図９のプロセス１）に記載されているように後添加であってもよい。
添加方法は、実施例３５（図９のプロセス２）に記載されているように、ＧａｌＮＡｃ－脂質含有希釈緩衝液への収集であってもよい。
添加方法は、実施例３５（図９のプロセス２）に記載されているように、ＧａｌＮＡｃ－脂質含有希釈緩衝液への収集であってもよい。
添加方法は、実施例３６（図９のプロセス４）に記載されているように、脂質賦形剤としての脂質混合物添加であってもよい。
添加方法は、実施例３７（図９のプロセス３）に記載されているように、第３のポートの希釈／インライン混合であってもよい。
添加方法は、実施例３７（図９のプロセス３）に記載されているように、第３のポートの希釈／インライン混合であってもよい。
実施例４３ 一本鎖ＧａｌＮＡｃ－脂質
実施例２３～４２に記載されているＬＮＰを、ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７８を用いることを除いて、記載されているように調製する。
実施例２３～４２に記載されているＬＮＰを、ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７８を用いることを除いて、記載されているように調製する。
実施例４４
実施例２３～４２に記載されているＬＮＰを、ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７９を用いることを除いて、記載されているように調製する。
実施例２３～４２に記載されているＬＮＰを、ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７９を用いることを除いて、記載されているように調製する。
実施例４５－ＰＥＧ脂質ＶＰ１５８を用いる
実施例２３～４４に記載されているＬＮＰを、ステルス脂質について５０７の代わりにＶＰ１５８を用いることを除いて、記載されているように調製する。
実施例２３～４４に記載されているＬＮＰを、ステルス脂質について５０７の代わりにＶＰ１５８を用いることを除いて、記載されているように調製する。
実施例４６－ＰＥＧ脂質ＶＰ１５９を用いる
実施例２３～４４に記載されているＬＮＰを、ステルス脂質について５０７の代わりにＶＰ１５９を用いることを除いて、記載されているように調製する。
実施例２３～４４に記載されているＬＮＰを、ステルス脂質について５０７の代わりにＶＰ１５９を用いることを除いて、記載されているように調製する。
実施例４７－ＶＬ４２２
実施例２３～４４に記載されているＬＮＰを、アミノ酸脂質について５０２の代わりに、同時係属出願ＰＣＴ／ＵＳ２１／５０５１１に記載されているように、ＶＬ４２２を用いることを除いて記載されているように調製する。
実施例２３～４４に記載されているＬＮＰを、アミノ酸脂質について５０２の代わりに、同時係属出願ＰＣＴ／ＵＳ２１／５０５１１に記載されているように、ＶＬ４２２を用いることを除いて記載されているように調製する。
実施例４８－ＬＤＬＲ ＫＤ／ＫＯ ＮＨＰモデルの作製
ＬＤＬＲ ＫＤ／ＫＯ ＮＨＰの作製では、標的遺伝子上の異なる位置を標的とする２つのガイドをＬＮＰに共製剤化すると、編集効率が向上することを利用した。全てのガイドはＬＤＬ受容に対する配列を標的とした。ガイド対は、ＧＡ４７０と対になったＧＡ４６８、およびＧＡ４７１と対になったＧＡ４６９であり、それらの配列を表５に示す。このように、ＬＮＰは、１つのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ＭＳ００４、および２つのガイドを用いて製造した。本明細書ではＬＮＰ Ａと呼ばれる１つのＬＮＰについて、重量で１：０．５：０．５のｍＲＮＡ：ガイドＲＮＡ１：ガイドＲＮＡ２の比で、ｍＲＮＡはＭＳ００４であり、２つのガイドはＧＡ４６８／ＧＡ４７０であった。このＬＮＰ Ａを、混合装置に入った水流中で一緒に混合したガイドを用いて製剤化した。本明細書ではＬＮＰ Ｂと呼ばれる別のＬＮＰについては、質量で１：０．５：０．５のｍＲＮＡ：ガイドＲＮＡ１：ガイドＲＮＡ２の比で、ｍＲＮＡはＭＳ００４であり、２つのガイドはＧＡ４６９／ＧＡ４７１であった。このＬＮＰ Ｂもまた、混合装置に入った水流中で一緒に混合したガイドを用いて製剤化した。ＷＴ ＮＨＰに、ＬＮＰ ＡおよびＬＮＰ Ｂの両方が両方の用量で別々に投与されるように、１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂを投与した。合計８つの処置群があった。このモデルの作製のために、１．５～３．０ｋｇの体重のカニクイザルを使用した。試験物質を、１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇ、および６ｍＬ／ｋｇの用量体積で適切な末梢静脈（例えば、伏在または上腕）を介して６０分のＩＶ注入で投与した。全ての処置群の動物は、全て筋肉内投与した１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン、０．５ｍｇ／ｋｇのファモチジン、および５ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンを含むステロイド前処置を受けた。全ての前処置は－１日目および１日目に投与の３０～６０分前に施した。８、１５、４７、５２、５９、７１、および９０日目（投与が１日目の場合）に血液を採取して、ＬＤＬ、トリグリセリド、およびその他の脂質パラメーターを測定した。２０日目に肝生検を行って、肝臓のＬＤＬｒ編集を評価した。図２８は、ＬＮＰ ＡおよびＬＮＰ Ｂを投与した後の時間の関数としての処置したＮＨＰのＬＤＬレベルを示し、ＬＤＬレベルがＬＤＬ受容体のノックダウン／アウトレベルに起因して増加していることを示している。図２９は、処置したＮＨＰから採取した肝生検試料におけるＬＤＬＲ遺伝子編集を示し、ＬＤＬＲの肝臓遺伝子編集が起こっていることを示している。
ＬＤＬＲ ＫＤ／ＫＯ ＮＨＰの作製では、標的遺伝子上の異なる位置を標的とする２つのガイドをＬＮＰに共製剤化すると、編集効率が向上することを利用した。全てのガイドはＬＤＬ受容に対する配列を標的とした。ガイド対は、ＧＡ４７０と対になったＧＡ４６８、およびＧＡ４７１と対になったＧＡ４６９であり、それらの配列を表５に示す。このように、ＬＮＰは、１つのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ＭＳ００４、および２つのガイドを用いて製造した。本明細書ではＬＮＰ Ａと呼ばれる１つのＬＮＰについて、重量で１：０．５：０．５のｍＲＮＡ：ガイドＲＮＡ１：ガイドＲＮＡ２の比で、ｍＲＮＡはＭＳ００４であり、２つのガイドはＧＡ４６８／ＧＡ４７０であった。このＬＮＰ Ａを、混合装置に入った水流中で一緒に混合したガイドを用いて製剤化した。本明細書ではＬＮＰ Ｂと呼ばれる別のＬＮＰについては、質量で１：０．５：０．５のｍＲＮＡ：ガイドＲＮＡ１：ガイドＲＮＡ２の比で、ｍＲＮＡはＭＳ００４であり、２つのガイドはＧＡ４６９／ＧＡ４７１であった。このＬＮＰ Ｂもまた、混合装置に入った水流中で一緒に混合したガイドを用いて製剤化した。ＷＴ ＮＨＰに、ＬＮＰ ＡおよびＬＮＰ Ｂの両方が両方の用量で別々に投与されるように、１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂを投与した。合計８つの処置群があった。このモデルの作製のために、１．５～３．０ｋｇの体重のカニクイザルを使用した。試験物質を、１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇ、および６ｍＬ／ｋｇの用量体積で適切な末梢静脈（例えば、伏在または上腕）を介して６０分のＩＶ注入で投与した。全ての処置群の動物は、全て筋肉内投与した１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン、０．５ｍｇ／ｋｇのファモチジン、および５ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンを含むステロイド前処置を受けた。全ての前処置は－１日目および１日目に投与の３０～６０分前に施した。８、１５、４７、５２、５９、７１、および９０日目（投与が１日目の場合）に血液を採取して、ＬＤＬ、トリグリセリド、およびその他の脂質パラメーターを測定した。２０日目に肝生検を行って、肝臓のＬＤＬｒ編集を評価した。図２８は、ＬＮＰ ＡおよびＬＮＰ Ｂを投与した後の時間の関数としての処置したＮＨＰのＬＤＬレベルを示し、ＬＤＬレベルがＬＤＬ受容体のノックダウン／アウトレベルに起因して増加していることを示している。図２９は、処置したＮＨＰから採取した肝生検試料におけるＬＤＬＲ遺伝子編集を示し、ＬＤＬＲの肝臓遺伝子編集が起こっていることを示している。
別の研究では、本明細書ではＬＮＰ Ｃと呼ばれる別のＬＮＰを製剤化した。ｍＲＮＡ ＭＳ００４ならびに２つのＬＤＬｒ ｇＲＮＡであったＧＡ４６８およびＧＡ４７０（表５）は、質量で１：０．５：０．５のＭＳ００４：ＧＡ４６８：ＧＡ４７０の比で取得した。このＬＮＰ Ｃもまた、混合装置に入った水流中で一緒に混合したガイドを用いて製剤化した。ＷＴ ＮＨＰに２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ Ｃを投与した。このモデルの作製のために、１．５～３．０ｋｇの体重のカニクイザルを使用した。試験物質を、２ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇの用量体積で適切な末梢静脈（例えば、伏在または上腕）を介して６０分のＩＶ注入で投与した。全ての処置群の動物は、全て筋肉内投与した１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン、０．５ｍｇ／ｋｇのファモチジン、および５ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンを含むステロイド前処置を受けた。全ての前処置は－１日目および１日目に投与の３０～６０分前に施した。ＬＮＰ Ｃを投与してから７および１４日後に血液を採取して、ＬＤＬ、トリグリセリド、バイオマーカー、およびその他の脂質パラメーターのレベルを測定した。ＬＮＰ Ｃの投与後１９日目に肝生検を行って、肝臓のＬＤＬｒ編集およびタンパク質ノックダウンを評価した。ＬＮＰ Ｃの投与後１８０日目にＮＨＰを屠殺した。図３３は、ＬＮＰ Ｃを投与してから１９日後に行った肝生検からのＬＤＬＲ編集を示す。図３４は、ＬＮＰ Ｃの投与後の血液中のＬＤＬのレベルを示す。
実施例４９：野生型およびＬＤＬｒノックダウンサルへのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの投与
[0847]ＬＮＰをカニクイザル非ヒト霊長類（「ＮＨＰ」）に、この場合２ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ＬＮＰは１時間かけてＩＶ注入により投与した。ＬＮＰは、実施例３６（図９のプロセス４および図１２のプロトコール７）に記載されているＧａｌＮＡｃ－脂質添加方法に従って、表１７に示されるＬＮＰ ＩＤを用いて調製した。ＬＮＰは実施例２４に記載されているように事前に－８０℃で保存していた。ＬＮＰは、ｐＨ４．０～６．５の範囲の原薬ｐＨ、および７．０～８．０の範囲の最終薬物製品ｐＨで作製した。ＬＮＰ ＩＤ７－１００、７－１０１、７－１０２は、製剤中にＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を有し、一方、ＬＮＰ７－９９および７－１０３は、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有さず、対照として使用した。表１７の全てのＬＮＰ ＩＤには、１：１の比でＭＡ００４ ＡＢＥ ｍＲＮＡおよびＧＡ３４７ ＡＮＧＰＴＬ３ガイドＲＮＡを負荷した。第１の研究では、霊長類を７－９９および７－１００の投与後４５日目に屠殺した。第２の研究では、霊長類をＬＮＰ ＩＤ７－１０１、７－１０２、および７－１０３の投与後９０日目に屠殺した。エンドポイントには、血液中のＬＤＬ－ｃレベル、肝臓肝細胞における標的遺伝子の編集％、血液中のＰＣＳＫ９タンパク質レベル、血液中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル、その他の脂質パラメーターが含まれたが、これらに限定されない。図３０は、ＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂで処置してから９０日後、ならびに表１７からのＬＮＰ ＩＤ７－９９および７－１００で処置してから４５日後のＮＨＰの血液中のＡＮＧＰＴＬ３レベルを示す。図３１は、ＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂで処置してから９０日後、ならびに表１７からのＬＮＰ ＩＤ７－９９および７－１００で処置してから４５日後のＮＨＰの屠殺後の肝臓試料からのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集を示す。図３６は、表１７に示されるＬＮＰ ＩＤ７－１０１、７－１０２、および７－１０３で処置してから１５日後の、上記で言及した第２の研究でのＮＨＰの血液からのＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のノックダウンを示す。図３７は、表１７に示されるＬＮＰ ＩＤ７－１０１、７－１０２、および７－１０３で処置してから１５日後の、上記で言及した第２の研究でのＮＨＰの血液からのトリグリセリドデータを示す。
[0847]ＬＮＰをカニクイザル非ヒト霊長類（「ＮＨＰ」）に、この場合２ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ＬＮＰは１時間かけてＩＶ注入により投与した。ＬＮＰは、実施例３６（図９のプロセス４および図１２のプロトコール７）に記載されているＧａｌＮＡｃ－脂質添加方法に従って、表１７に示されるＬＮＰ ＩＤを用いて調製した。ＬＮＰは実施例２４に記載されているように事前に－８０℃で保存していた。ＬＮＰは、ｐＨ４．０～６．５の範囲の原薬ｐＨ、および７．０～８．０の範囲の最終薬物製品ｐＨで作製した。ＬＮＰ ＩＤ７－１００、７－１０１、７－１０２は、製剤中にＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を有し、一方、ＬＮＰ７－９９および７－１０３は、ＧａｌＮＡｃ－脂質を有さず、対照として使用した。表１７の全てのＬＮＰ ＩＤには、１：１の比でＭＡ００４ ＡＢＥ ｍＲＮＡおよびＧＡ３４７ ＡＮＧＰＴＬ３ガイドＲＮＡを負荷した。第１の研究では、霊長類を７－９９および７－１００の投与後４５日目に屠殺した。第２の研究では、霊長類をＬＮＰ ＩＤ７－１０１、７－１０２、および７－１０３の投与後９０日目に屠殺した。エンドポイントには、血液中のＬＤＬ－ｃレベル、肝臓肝細胞における標的遺伝子の編集％、血液中のＰＣＳＫ９タンパク質レベル、血液中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル、その他の脂質パラメーターが含まれたが、これらに限定されない。図３０は、ＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂで処置してから９０日後、ならびに表１７からのＬＮＰ ＩＤ７－９９および７－１００で処置してから４５日後のＮＨＰの血液中のＡＮＧＰＴＬ３レベルを示す。図３１は、ＬＮＰ ＡまたはＬＮＰ Ｂで処置してから９０日後、ならびに表１７からのＬＮＰ ＩＤ７－９９および７－１００で処置してから４５日後のＮＨＰの屠殺後の肝臓試料からのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集を示す。図３６は、表１７に示されるＬＮＰ ＩＤ７－１０１、７－１０２、および７－１０３で処置してから１５日後の、上記で言及した第２の研究でのＮＨＰの血液からのＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のノックダウンを示す。図３７は、表１７に示されるＬＮＰ ＩＤ７－１０１、７－１０２、および７－１０３で処置してから１５日後の、上記で言及した第２の研究でのＮＨＰの血液からのトリグリセリドデータを示す。
[0848]実施例５０ ＬＮＰを製剤化する方法
[0849]図９～１４に関連して記載され、示されているＬＮＰ製造プロセスに従って、ＬＮＰを形成し（例えば、インライン、クロスまたはＴミキサー装置などのミキサーにより１つまたは複数の核酸ペイロードをＬＮＰ賦形剤と混合した後）、ＬＮＰ溶液を指定した時間（例えば、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６時間）保持して、形成後処理の前にＬＮＰを十分に安定化させると、次に製剤化したＬＮＰを濃縮し、濾過し、将来の使用のために－８０Ｃで保存する。投与前の長期貯蔵を容易にするために、以下のプロセスが特に適していることが見出されている。
[0849]図９～１４に関連して記載され、示されているＬＮＰ製造プロセスに従って、ＬＮＰを形成し（例えば、インライン、クロスまたはＴミキサー装置などのミキサーにより１つまたは複数の核酸ペイロードをＬＮＰ賦形剤と混合した後）、ＬＮＰ溶液を指定した時間（例えば、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６時間）保持して、形成後処理の前にＬＮＰを十分に安定化させると、次に製剤化したＬＮＰを濃縮し、濾過し、将来の使用のために－８０Ｃで保存する。投与前の長期貯蔵を容易にするために、以下のプロセスが特に適していることが見出されている。
[0850]ステップ１：核酸ストック溶液の調製：以前に記載されているように、本明細書に記載されているポリエチレングリコールを含み得る水性緩衝液中に懸濁された核酸ペイロード分子を含み得る核酸ペイロード溶液（例えば、ＲＮＡストック溶液）を調製する。
[0851]ステップ２：脂質ストック溶液の調製：以前に記載されているように、ＧａｌＮＡｃを含むかまたは含まないエタノール緩衝液中に懸濁したＬＮＰ賦形剤（例えば、アミノ脂質；コレステロールまたはその誘導体；リン脂質または中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）；ステルス脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ））を含み得るＬＮＰ賦形剤溶液（例えば、脂質ストック溶液）を調製する。
[0852]ステップ３：ＥＤＴＡの添加：ＬＮＰ形成前に、核酸ペイロード緩衝溶液にＥＤＴＡを添加する。
[0853]ステップ４：ＬＮＰ形成：ＬＮＰ賦形剤および核酸溶液を混合し、ＬＮＰ形成に必要な時間保持する（例えば、プロセス１～４、プロトコール１～１３に従う）ことによりＬＮＰを形成して、水性緩衝液およびエタノールの溶液中に含まれる形成されたＬＮＰを生成する。以前に記載されているように、ＬＮＰ形成プロセスは、濃縮／濾過の前に、１つまたは複数の希釈および／または緩衝液交換ステップを任意選択で含むことができる。
[0853]ステップ４：ＬＮＰ形成：ＬＮＰ賦形剤および核酸溶液を混合し、ＬＮＰ形成に必要な時間保持する（例えば、プロセス１～４、プロトコール１～１３に従う）ことによりＬＮＰを形成して、水性緩衝液およびエタノールの溶液中に含まれる形成されたＬＮＰを生成する。以前に記載されているように、ＬＮＰ形成プロセスは、濃縮／濾過の前に、１つまたは複数の希釈および／または緩衝液交換ステップを任意選択で含むことができる。
[0854]ステップ５：第１の濃縮ステップ：ＬＮＰ形成後、ＬＮＰを含有する緩衝液を、形成されたＬＮＰを液体緩衝液およびその中に含まれるより小さな微粒子（例えば、ＬＮＰ賦形剤および／または核酸分子の残留物）から分離するように寸法決めされたＴＦＦ（例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）または再生セルロースのいずれかで作製されたフラットシート、またはホローファイバーＴＦＦ）カセットに通過させることによって、ＬＮＰを濃縮する。ＴＦＦカセットは、ゲル層の形成および膜表面のファウリングを緩和することが見出されている親水性膜から構成される。４０～１１５ｎｍの範囲（例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、または１１０ｎｍから、約４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、または１１５ｎｍまで）の平均直径を有する形成されたＬＮＰに関して、３０～１００キロダルトンの孔径を有するＴＦＦカセットが良好に機能することが見出されている。
[0855]ステップ６：Ｔｒｉｓ緩衝液への緩衝液交換：ＬＮＰ溶液から（例えば、ＬＮＰ賦形剤を含有するエタノール溶液から）エタノールを除去し、ｐＨ中性のＴｒｉｓ緩衝液に交換する。この緩衝液交換ステップは、第１の濃縮ステップと同時に行ってもよい。ＴＦＦカセットは、エタノールを含有する液体緩衝溶液を通過させながら、形成されたＬＮＰを分離または選別する。Ｔｒｉｓ緩衝液は、ＴＦＦカセットからＬＮＰを収集するプロセスにおいて、必要なダイア容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）でカセットをＴｒｉｓ緩衝液で洗浄することによってＬＮＰに添加される。このプロセスの結果、製剤化されたＬＮＰは、所望の容量のｐＨ中性の平坦なＴｒｉｓ緩衝液中に懸濁される。
[0856]ステップ７：第２の濃縮ステップ：ｔｒｉｓ緩衝液中に含まれる製剤化されたＬＮＰを、ＬＮＰ溶液を３０ｋＤ～１００ｋＤのＴＦＦカセットに通過させ、第１の濃縮ステップに記載されているようにカセットをＴｒｉｓ緩衝液で洗浄することによってｐＨ中性のＴｒｉｓ緩衝液中にＬＮＰを収集することによりさらに濃縮／濾過することができる。このステップは、必要な場合または所望の場合、反復することができる。
[0857]ステップ８：ＬＮＰの採取：ＬＮＰが適切に濃縮されると、ｐＨ中性のＴｒｉｓ緩衝液中に含まれるＬＮＰは、濃縮されたＬＮＰバルクを収集し、ＴＦＦカセットを透析濾過緩衝液で追跡して、完全な回収を確実にすることによって採取される。製剤化されたＬＮＰが採取されると、ＴＦＦプロセス（例えば、ステップ５～７）は完了する。
[0858]ステップ９：ＬＮＰ濃度の調整：ＬＮＰを採取したら、ＬＮＰの濃度を凍結保護剤（例えば、スクロース）のストック溶液を添加することによって調整して、バイアル内の所望の最終ヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）濃度で凍結保護剤の所望の目標モル濃度（例えば、製品ラベルに記載されているモル濃度）を達成する。ＬＮＰの濃度は分析的に決定することができ、一旦決定されると、バイアル内の所望の最終ＲＮＡ濃度で凍結保護剤の最終目標モル濃度を達成するために必要な凍結保護剤および透析濾過緩衝液の必要量を計算するために使用することができる。例えば、０．１～２．５（例えば、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５）ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ濃度での１００～１０００（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００）ミリモル濃度（ｍＭ）の凍結保護剤の最終目標モル濃度が、凍結保護剤およびＲＮＡの相対濃度に応じて、良好に機能することができることが見出されている。
[0859]ステップ１０：濾過、バイアル充填および貯蔵：ＬＮＰの濃度を調整したら、必要な凍結保護剤を含有するＴｒｉｓ緩衝液中に懸濁した製剤化ＬＮＰを、投与前に必要な温度（例えば、－８０Ｃ）で長期貯蔵するためにバイアルに充填する前に、滅菌グレードのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を通して濾過する。
[0860]ステップ１１：希釈物投与：適切な場合、必要な数の凍結ＬＮＰバイアルを解凍し、一緒にプールする。プールしたＬＮＰを、対象への投与に適切な所望の濃度に水溶液（例えば、生理食塩水）中で希釈する前に、滅菌グレードのＰＥＳ膜を通して滅菌濾過する。
[0861]前述のプロセスは、ホローファイバーＴＦＦカセットを利用するプロセスと比較して、よりスケーラブルであることが見出されている。再生セルロースフラットシートＴＦＦカセットは、所与のスループット率に対して、より低いポンプ容量／圧力をより助長することが見出されている。また、前述の方法で処理された製剤化ＬＮＰは、－８０Ｃで長期間安定に保存できることが見出された。図３５は、前述のステップの態様を示すフローチャートである。
[0862]実施例５１．生体層干渉アッセイ
[0863]アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合するＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの能力を、Ｇａｔｏｒ Ｂｉｏ製の生体層干渉アッセイ（ＢＬＩ）技術によって評価した。組換えヒトＡＳＧＰＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ．４３９４－ＡＳ－０５０）を、１０ｕｇ／ｍＬの濃度で抗Ｈｉｓバイオセンサーに固定化した。ＧａｌＮＡｃ－脂質、ＧａｌＮＡｃ ＬＮＰ、およびＧａｌＮＡｃを含まないＬＮＰと、固定化ＡＳＧＰＲとの相互作用は、６００ｎＭ、２００ｎＭ、および６６ｎＭの濃度のＧａｌＮＡｃ（またはＧａｌＮＡｃを含まないＬＮＰの場合は等価のＲＮＡ含量）で行った。図４０Ａは、プロセスを模式図で詳細に示している。図４０Ｂは、製剤中にＧａｌＮＡｃリガンドを有しないＬＮＰ ＩＤ７－１７からのデータを示す。図４０Ｃは、製剤中に０．５％の１００４を有したＬＮＰであるＬＮＰ ＩＤ７－１６－Ｌからのデータを示す。
[0863]アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合するＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの能力を、Ｇａｔｏｒ Ｂｉｏ製の生体層干渉アッセイ（ＢＬＩ）技術によって評価した。組換えヒトＡＳＧＰＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ．４３９４－ＡＳ－０５０）を、１０ｕｇ／ｍＬの濃度で抗Ｈｉｓバイオセンサーに固定化した。ＧａｌＮＡｃ－脂質、ＧａｌＮＡｃ ＬＮＰ、およびＧａｌＮＡｃを含まないＬＮＰと、固定化ＡＳＧＰＲとの相互作用は、６００ｎＭ、２００ｎＭ、および６６ｎＭの濃度のＧａｌＮＡｃ（またはＧａｌＮＡｃを含まないＬＮＰの場合は等価のＲＮＡ含量）で行った。図４０Ａは、プロセスを模式図で詳細に示している。図４０Ｂは、製剤中にＧａｌＮＡｃリガンドを有しないＬＮＰ ＩＤ７－１７からのデータを示す。図４０Ｃは、製剤中に０．５％の１００４を有したＬＮＰであるＬＮＰ ＩＤ７－１６－Ｌからのデータを示す。
表１８、および表９から表１７を通して、本発明者らは、Ｚ平均、ＰＤＩ、および封入についてのデータを示す。これらのパラメーターは、従来の方法、例えば：Ｚ平均サイズおよびＰＤＩについてはＤＬＳ、ならびに封入についてはＲｉｂｏｇｒｅｅｎによって測定されることは当業者によって理解されるべきである。これらは、混合後、および限定されないが、緩衝液交換後、濃縮後、凍結濃度への希釈後などのその後の様々な時点で測定することができる。与えられた値は最終的なＬＮＰ値である。
他の実施形態
[0864]前述の説明から、本明細書に記載の開示に変更および修正を加えて、それを様々な用途および条件に採用できることは明らかであろう。そのような実施形態も、以下の特許請求の範囲内にある。
[0864]前述の説明から、本明細書に記載の開示に変更および修正を加えて、それを様々な用途および条件に採用できることは明らかであろう。そのような実施形態も、以下の特許請求の範囲内にある。
[0865]本明細書における変数の任意の定義における要素の項目の記載には、任意の単一要素または列挙された要素の組合せ（またはサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の記載は、その実施形態を、任意の単一の実施形態、実施形態の任意の部分として、または任意の他の実施形態もしくはその任意の部分と組み合わせて含む。
[0866]本明細書に記載されているように、本開示は、ターゲティング部分構造、ＧａｌＮａｃコンジュゲートカップリング配列、ガイドＲＮＡ Ｇａｌｎａｃコンジュゲート設計、リンカーおよびその他の成分を含むＧａｌＮａｃコンジュゲート構造、ＧａｌＮａｃコンジュゲート脂質、ｇＲＮＡ設計およびそれらに対する改変、脂質組成物、脂質賦形剤製剤、限定するものではないが、ＲＮＡを含む活性剤ペイロードの有無による脂質ナノ粒子組成物、受容体欠損細胞および哺乳動物におけるトランスフェクションおよび活性剤の有効性を促進するリガンドとして作用するＧａｌＮａｃ－脂質からなる脂質ナノ粒子の特定の実施形態および実施例；ならびに、疾患を治療するための、ならびにＡｐｏＥの存在しない条件下での哺乳動物細胞へのおよび／またはＬＤＬ受容体を欠いているそのような哺乳動物細胞への活性剤のインビボおよびインビトロ送達のための、薬学的組成物として、含んでいる前述の合成、製造、使用、および有効性を個別におよび組み合わせて説明する特定の例および実施形態を含むことが理解されるであろう。
[0867]特定の実施例および多数の実施形態が、前述の態様および態様の組合せを示すために提供されてきたが、例示的または開示された実施形態の任意の態様またはそれらの組合せは、限定するものではないが、別の実施形態を構成するためにそれらから除外され得、任意のこのような実施形態は、別のかつ独立した請求項を構成し得ると企図されることが認識され、理解されるべきである。同様に、１つまたは複数の実施形態の任意の態様または態様の組合せはまた、１つまたは複数の実施形態の任意の態様または態様の組合せに含まれるか、それらと組み合わされてもよいこと、およびそれらの全てのそのような組合せが本開示の範囲内におさまり、限定するものではないが、別々のかつ独立した請求項として提示され得ることが本明細書において企図されることが認識され、理解されるべきである。したがって、ある請求項に提示された任意の特徴が別の請求項に含まれ得ることを理解されたい。１つの請求項に示された任意の特徴は、その特徴のない請求項を構成するために請求項から除かれてもよい。１つの請求項に提示された任意の特徴は、別の請求項の任意の特徴と組み合わされてもよく、これらのそれぞれは本明細書で企図されている。以下の列挙された条項は、前述の実施形態および実施例の態様および態様の組合せのさらなる例示的な例である。
１．受容体ターゲティングコンジュゲートであって、式（Ｖ）：
の化合物を含み、
式中、
Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－または結合であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立してＨまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、受容体ターゲティングコンジュゲート。
式中、
Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－または結合であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立してＨまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、受容体ターゲティングコンジュゲート。
２．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである、条項１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、置換または非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである、条項２に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、置換または非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである、条項２に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が、Ｃ４アルキレンである、条項２に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５．各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８が独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－または結合である、条項１～４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５．各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８が独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－または結合である、条項１～４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
６．各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８が独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－または－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である、条項１～５のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
７．各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８が、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である、条項６に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
８．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９が独立して、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである、条項１～７のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
８．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９が独立して、置換または非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである、条項１～７のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
９．各Ｌ３が、置換または非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである、条項８に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１０．Ｌ３が、Ｃ４アルキレンである、条項８に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１０．Ｌ３が、Ｃ４アルキレンである、条項８に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１１．各Ｌ６およびＬ９が独立して、置換または非置換のＣ２～Ｃ１０アルキレンである、条項１～１０のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１２．各Ｌ６およびＬ９が独立して、置換または非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである、条項１１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１２．各Ｌ６およびＬ９が独立して、置換または非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである、条項１１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１３．各Ｌ６およびＬ９が、Ｃ３アルキレンである、条項１１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１４．受容体ターゲティングコンジュゲートであって、式（ＶＩ）の化合物：
１４．受容体ターゲティングコンジュゲートであって、式（ＶＩ）の化合物：
を含み、
式中、
Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、受容体ターゲティングコンジュゲート。
式中、
Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、受容体ターゲティングコンジュゲート。
１５．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである、条項１４に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１６．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである、条項１４または１５に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１７．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、１～１０個のＯ原子を含む、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである、条項１６に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１８．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１－（ＣＨ２）ｑ１－であり；式中、ｐ１は、１～８であり；ｑ１は、１～６である、条項１７に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
１９．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３－（ＣＨ２）２－である、条項１８に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２０．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである、条項１４または１５に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２０．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである、条項１４または１５に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２１．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が独立して、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ６アルキレンである、条項２０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２２．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が、Ｃ４アルキレンである、条項２１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２２．各Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７が、Ｃ４アルキレンである、条項２１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２３．各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８が独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である、条項１４～２２のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２４．各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８が独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－または－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－である、条項２３に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２５．各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８が、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である、条項２４に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２５．各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８が、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である、条項２４に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２６．各Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８が、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である、条項２４に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２７．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９が独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである、条項１４～２６のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２７．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９が独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである、条項１４～２６のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９が独立して、１～１０個のＯ原子を含む、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレンである、条項２７に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２９．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９が独立して、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ２－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ２－であり；式中、ｐ２は、１～８であり；ｑ２は、１～６である、条項２７または２８に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３０．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９が、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－である、条項２９に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３１．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は独立して、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ３－であり；式中、ｑ３は１～８である、条項１４～２６のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３１．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は独立して、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ３－であり；式中、ｑ３は１～８である、条項１４～２６のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３２．各Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９が、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－である、条項３１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３３．Ｌ１０が、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである、条項１～３２のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３３．Ｌ１０が、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレンである、条項１～３２のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３４．Ｌ１０が、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ４アルキレンである、条項３３に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３５．Ｌ１０が、Ｃ２アルキレンである、条項３４に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３５．Ｌ１０が、Ｃ２アルキレンである、条項３４に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３６．Ｌ１１が、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－である、条項１～３５のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３７．ｎが、１～１００である、条項３６に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３７．ｎが、１～１００である、条項３６に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３８．ｎが、２～５０である、条項３７に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３９．ｎが、２、１２、３７、または４５である、条項３８に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
３９．ｎが、２、１２、３７、または４５である、条項３８に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４０．Ｌ１２が、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、または－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である、条項１～３９のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４１．Ｌ１２が、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－または－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である、条項４０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４２．Ｌ１２が、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である、条項４０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４２．Ｌ１２が、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である、条項４０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４３．Ｌ１２が、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－である、条項４０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４４．Ｌ１２が、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である、条項４０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４４．Ｌ１２が、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である、条項４０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４５．Ａがレクチンに結合する、条項１～４４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４６．レクチンが、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である、条項４５に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４６．レクチンが、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である、条項４５に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４７．Ａが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体である、条項１～４４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４８．Ａが、
４８．Ａが、
である、条項１～４４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４９．各Ｒ１が独立して、Ｈまたは－ＣＨ３である、条項１～４８のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
４９．各Ｒ１が独立して、Ｈまたは－ＣＨ３である、条項１～４８のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５０．各Ｒ１がＨである、条項１～４９のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５１．親油性有機残基が、１つまたは複数の脂肪アルコール、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロリピド、ポリケチド、ステロール脂質、およびプレノール脂質を含む、条項１～５０のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５１．親油性有機残基が、１つまたは複数の脂肪アルコール、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロリピド、ポリケチド、ステロール脂質、およびプレノール脂質を含む、条項１～５０のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５２．親油性有機残基が、１つまたは複数の脂肪アルコールを含む、条項１～５１のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５３．各脂肪アルコールが独立して、飽和、一価不飽和、または多価不飽和脂肪アルコールである、条項５２に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５３．各脂肪アルコールが独立して、飽和、一価不飽和、または多価不飽和脂肪アルコールである、条項５２に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５４．脂肪アルコールが、１つまたは複数のＣ２～Ｃ２６脂肪アルコールを含む、条項５２または５３に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５５．脂肪アルコールが、２つ以上のＣ２～Ｃ２６脂肪アルコールを含む、条項５２～５４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５５．脂肪アルコールが、２つ以上のＣ２～Ｃ２６脂肪アルコールを含む、条項５２～５４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５６．各脂肪アルコールが、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、またはＣ２２脂肪アルコールである、条項５２～５４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５７．各脂肪アルコールが独立して、ドコサヘキサエノール、エイコサペンタエノール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルアルコール、（Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルアルコール、ドコサニルアルコール、（Ｅ）－オクタデカ－９－エン－１－イルアルコール、イコサニルアルコール、（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－オクタデカ－９，１２，１５－トリエン－１－イルアルコール、またはパルミチルアルコールである、条項５２～５４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５８．各脂肪アルコールがステアリルアルコールである、条項５２～５４のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５９．親油性有機残基が１つまたは複数のステロール脂質を含む、条項１～５０のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
５９．親油性有機残基が１つまたは複数のステロール脂質を含む、条項１～５０のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
６０．親油性有機残基が１つまたは複数のビタミンを含む、条項１～４９のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
６１．各ビタミンが独立して、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、またはビタミンＫである、条項１～４９、または６０のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
６１．各ビタミンが独立して、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、またはビタミンＫである、条項１～４９、または６０のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
６２．表４由来の化合物を含む受容体ターゲティングコンジュゲート。
６３．ナノ粒子組成物であって、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体；および
ｂ．前述の条項のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート
を含むナノ粒子組成物。
６３．ナノ粒子組成物であって、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体；および
ｂ．前述の条項のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート
を含むナノ粒子組成物。
６４．受容体ターゲティングコンジュゲートが、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約０．００１ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する、条項６３に記載のナノ粒子組成物。
６５．受容体ターゲティングコンジュゲートが、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約０．０１ｍｏｌ％～約１ｍｏｌ％を構成する、条項６３に記載のナノ粒子組成物。
６６．ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の１０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％を構成する、ステロールまたはその誘導体をさらに含む、条項６３～６５に記載のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
６７．ステロールまたはその誘導体が、コレステロールまたはコレステロール誘導体である、条項６６に記載のナノ粒子組成物。
６８．コレステロールまたはコレステロール誘導体が、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％を構成する、条項６７に記載のナノ粒子組成物。
６８．コレステロールまたはコレステロール誘導体が、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％を構成する、条項６７に記載のナノ粒子組成物。
６９．ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の１ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％を構成するリン脂質をさらに含む、条項６３～６８のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
７０．リン脂質が、前記ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％を構成する、条項６９に記載のナノ粒子組成物。
７０．リン脂質が、前記ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％を構成する、条項６９に記載のナノ粒子組成物。
７１．リン脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、２－オレオイル－１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびスフィンゴミエリンから選択される、条項６９または７０に記載のナノ粒子組成物。
７２．リン脂質がＤＳＰＣである、条項６９または７０に記載のナノ粒子組成物。
７３．ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の０．１ｍｏｌ％～６ｍｏｌ％を構成するステルス脂質をさらに含む、条項６３～７２のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
７３．ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の０．１ｍｏｌ％～６ｍｏｌ％を構成するステルス脂質をさらに含む、条項６３～７２のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
７４．ステルス脂質が、前記ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約２．０ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％を構成する、条項７３に記載のナノ粒子組成物。
７５．ステルス脂質が、約２００Ｄａ～約５０００Ｄａまでの数平均分子量を有するＰＥＧ脂質である、条項７３または７４に記載のナノ粒子組成物。
７５．ステルス脂質が、約２００Ｄａ～約５０００Ｄａまでの数平均分子量を有するＰＥＧ脂質である、条項７３または７４に記載のナノ粒子組成物。
７６．ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成するアミノ脂質をさらに含む、条項６３～７５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
７７．抗酸化剤を含む、条項６３～７６のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
７８．抗酸化剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、条項７７に記載のナノ粒子組成物。
７８．抗酸化剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、条項７７に記載のナノ粒子組成物。
７９．１つまたは複数の核酸分子実体が、肝細胞で生じた目的の病原遺伝子を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、条項６３～７８のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
８０．１つまたは複数の核酸分子実体が、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、条項６３～７８のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
８１．１つまたは複数の核酸分子実体のうちの少なくとも１つが化学修飾を含む、条項６３～８０のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
８１．１つまたは複数の核酸分子実体のうちの少なくとも１つが化学修飾を含む、条項６３～８０のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
８２．化学修飾が、２’－Ｆ修飾、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、非環式ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、４’－Ｏ－メチル、または２’－ａｒａ－Ｆ修飾である、条項８１に記載のナノ粒子組成物。
８３．化学修飾が２’－Ｏ－メチル修飾である、条項８１に記載のナノ粒子組成物。
８４．条項１～６２のいずれかに記載の受容体ターゲティングコンジュゲートまたは条項６３～８３のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物、および賦形剤または担体を含む薬学的組成物。
８４．条項１～６２のいずれかに記載の受容体ターゲティングコンジュゲートまたは条項６３～８３のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物、および賦形剤または担体を含む薬学的組成物。
８５．遺伝子編集因子ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、条項８４に記載の薬学的組成物。
８６．１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を含む、条項８４または８５に記載の薬学的組成物。
８６．１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を含む、条項８４または８５に記載の薬学的組成物。
８７．２つ以上のガイドＲＮＡ分子を含む、条項８４または８５に記載の薬学的組成物。
８８．前記２つ以上のガイドＲＮＡ分子が、２つ以上の目的の遺伝子を標的とする、条項８７に記載の薬学的組成物。
８８．前記２つ以上のガイドＲＮＡ分子が、２つ以上の目的の遺伝子を標的とする、条項８７に記載の薬学的組成物。
８９．ｍＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする、条項８４～８８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
９０．ｍＲＮＡが塩基編集因子ヌクレアーゼをコードする、条項８４～８８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
９０．ｍＲＮＡが塩基編集因子ヌクレアーゼをコードする、条項８４～８８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
９１．ｍＲＮＡおよび１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子が、同じナノ粒子組成物中に存在する、条項８６～９０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
９２．ｍＲＮＡおよび１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子が、異なるナノ粒子組成物中に存在する、条項８６～９０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
９２．ｍＲＮＡおよび１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子が、異なるナノ粒子組成物中に存在する、条項８６～９０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
９３．薬学的組成物中のｍＲＮＡ分子に対するｇＲＮＡ分子の比が、重量またはモルで約０．０１～約１００である、条項８６～９２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
９４．前記薬学的組成物中の前記ｇＲＮＡ分子と前記ｍＲＮＡの比が、重量またはモルで、約５０：１、約４０：１、約３０：１、約２０：１、約１８：１、約１６：１、約１４：１、約１２：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、条項９３に記載の薬学的組成物。
９４．前記薬学的組成物中の前記ｇＲＮＡ分子と前記ｍＲＮＡの比が、重量またはモルで、約５０：１、約４０：１、約３０：１、約２０：１、約１８：１、約１６：１、約１４：１、約１２：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、条項９３に記載の薬学的組成物。
９５．薬学的組成物であって、
ａ．条項１～６２のいずれか１項に記載の第１の受容体ターゲティングコンジュゲートまたは条項６３～８３のいずれか１項に記載の第１のナノ粒子組成物、および
ｂ．条項１～６２のいずれか１項に記載の第２の受容体ターゲティングコンジュゲート、または条項６３～８３のいずれか１項に記載の第２のナノ粒子組成物
を含む薬学的組成物。
ａ．条項１～６２のいずれか１項に記載の第１の受容体ターゲティングコンジュゲートまたは条項６３～８３のいずれか１項に記載の第１のナノ粒子組成物、および
ｂ．条項１～６２のいずれか１項に記載の第２の受容体ターゲティングコンジュゲート、または条項６３～８３のいずれか１項に記載の第２のナノ粒子組成物
を含む薬学的組成物。
９６．前記第１のナノ粒子組成物が遺伝子編集因子ｍＲＮＡを含む、条項９５に記載の薬学的組成物。
９７．前記第２のナノ粒子組成物が１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を含む、条項９５または９６に記載の薬学的組成物。
９７．前記第２のナノ粒子組成物が１つまたは複数のガイドＲＮＡ分子を含む、条項９５または９６に記載の薬学的組成物。
９８．前記薬学的組成物中のガイドＲＮＡ分子とｍＲＮＡの比が、重量またはモルで、約５０：１、約４０：１、約３０：１、約２０：１、約１８：１、約１６：１、約１４：１、約１２：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：１：８、約１：９、または約１：１０である、条項９５から９７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
９９．細胞に核酸を送達する方法であって、細胞を条項６３～８３のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物または条項８４～９８のいずれか１項に記載の薬学的組成物と接触させるステップを含み、それにより核酸が前記細胞に送達される方法。
１００．前記細胞をインビボ、エクスビボ、またはインイントロで接触させる、条項９９に記載の方法。
１０１．細胞内で目的のポリペプチドを産生する方法であって、前記細胞を条項６３～８３のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物または条項８４～９８のいずれか１項に記載の薬学的組成物と接触させるステップを含み、それにより核酸が前記細胞内で翻訳されてポリペプチドを産生し得る方法。
１０１．細胞内で目的のポリペプチドを産生する方法であって、前記細胞を条項６３～８３のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物または条項８４～９８のいずれか１項に記載の薬学的組成物と接触させるステップを含み、それにより核酸が前記細胞内で翻訳されてポリペプチドを産生し得る方法。
１０２．対象の疾患または状態を治療する方法であって、条項８４～９８のいずれか１項に記載の治療有効量の薬学的組成物を対象に投与するステップを含む方法。
１０３．疾患または状態が冠動脈疾患である、条項１０２に記載の方法。
１０３．疾患または状態が冠動脈疾患である、条項１０２に記載の方法。
１０４．対象が低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）欠損症である、条項１０２または１０３に記載の方法。
１０５．対象の肝臓に核酸分子実体を送達する方法であって、条項８４～９８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を対象に投与するステップを含み、それにより核酸分子実体を送達する方法。
１０５．対象の肝臓に核酸分子実体を送達する方法であって、条項８４～９８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を対象に投与するステップを含み、それにより核酸分子実体を送達する方法。
１０６．ヌクレオチドコンジュゲートであって、
（ａ）核酸、および
（ｂ）表１の構造を含む、（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分
を含むヌクレオチドコンジュゲート。
（ａ）核酸、および
（ｂ）表１の構造を含む、（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分
を含むヌクレオチドコンジュゲート。
１０７．ターゲティング部分が、（ａ）の核酸とハイブリダイズするカップリング配列をさらに含む、条項１０６に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１０８．ヌクレオチドコンジュゲートであって、
（ａ）核酸、および
（ｂ）（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分であって、（ａ）の核酸とハイブリダイズするカップリング配列を含むターゲティング部分
を含むヌクレオチドコンジュゲート。
１０８．ヌクレオチドコンジュゲートであって、
（ａ）核酸、および
（ｂ）（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分であって、（ａ）の核酸とハイブリダイズするカップリング配列を含むターゲティング部分
を含むヌクレオチドコンジュゲート。
１０９．核酸が、一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸を含み、ターゲティング部分が受容体ターゲティング部分である、条項１０６～１０８のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１０．ターゲティング部分がレクチンに結合する、条項１０６～１０９のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１１．レクチンがアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である、条項１１０に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１１．レクチンがアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である、条項１１０に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１２．ターゲティング部分が１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項１１１に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１３．ターゲティング部分がスペーサーを含む、条項１０６～１１２のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１４．スペーサーがポリエチレングリコール、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ１２アルキレン、またはその両方を含み、ポリエチレングリコールが１～５個の反復単位を有する、条項１１３に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１４．スペーサーがポリエチレングリコール、置換もしくは非置換Ｃ１～Ｃ１２アルキレン、またはその両方を含み、ポリエチレングリコールが１～５個の反復単位を有する、条項１１３に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１５．ターゲティング部分が、１つまたは複数のリンカーを介して核酸の１つまたは複数の鎖に結合している、条項１０６～１１４のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１６．ターゲティング部分が表１の構造を含む、条項１０８～１１５のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１７．カップリング配列が（ａ）の核酸とハイブリダイズする、条項１０７～１１６のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１７．カップリング配列が（ａ）の核酸とハイブリダイズする、条項１０７～１１６のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１８．カップリング配列が（ａ）の核酸の伸長部とハイブリダイズする、条項１１７に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１９．ターゲティング部分が、核酸配列の５’末端、核酸配列の３’末端、または核酸配列の中央に結合している、条項１０６～１１８のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１１９．ターゲティング部分が、核酸配列の５’末端、核酸配列の３’末端、または核酸配列の中央に結合している、条項１０６～１１８のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２０．ターゲティング部分が少なくとも２つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項１０６～１１９のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２１．ターゲティング部分が少なくとも３つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項１０６～１２０のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２１．ターゲティング部分が少なくとも３つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項１０６～１２０のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２２．ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体が、ターゲティング部分におけるリンカーを介して、（ａ）の核酸とハイブリダイズするターゲティング部分におけるカップリング配列のハイブリダイゼーションを介して、またはそれらの組合せを介して、（ａ）の核酸に接続している、条項１１４～１２１のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２３．ターゲティング部分が、（ａ）の核酸とハイブリダイズする少なくとも２つのカップリング配列を含む、条項１０７～１２２のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２４．少なくとも２つのカップリング配列が同一である、条項１２３に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２５．少なくとも２つのカップリング配列が異なる、条項１２３に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２５．少なくとも２つのカップリング配列が異なる、条項１２３に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２６．第２のターゲティング部分をさらに含む、条項１０６～１２５のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２７．第２のターゲティング部分がアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合する、第１２６項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２７．第２のターゲティング部分がアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合する、第１２６項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２８．第２のターゲティング部分が、スペーサーを介して、および／または１つまたは複数のリンカーを介して核酸の１つまたは複数の鎖に結合している、条項１２７に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１２９．第２のターゲティング部分がＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項１２８に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３０．第２のターゲティング部分が少なくとも３つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項１２９に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３０．第２のターゲティング部分が少なくとも３つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項１２９に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３１．ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体が、ターゲティング部分のリンカーを介して、（ａ）の核酸とハイブリダイズするターゲティング部分のカップリング配列のハイブリダイゼーションを介して、またはそれらの組合せを介して、（ａ）の核酸に接続している、条項１２９または１３０に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３２．第２のターゲティング部分が表１の構造を含む、条項１２６～１３１のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３３．第２のターゲティング部分が、核酸とハイブリダイズするカップリング配列を含む、条項１２６～１３２のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３３．第２のターゲティング部分が、核酸とハイブリダイズするカップリング配列を含む、条項１２６～１３２のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３４．第２のターゲティング部分が、核酸の５’末端、核酸の３’末端、または核酸の中央に結合している、条項１２６～１３３のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３５．（ａ）の核酸がＲＮＡまたはＤＮＡを含む、条項１０６～１３４のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３６．カップリング配列が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学修飾ＲＮＡ、化学修飾ＤＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドを含む、条項１０７～１３５のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３６．カップリング配列が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学修飾ＲＮＡ、化学修飾ＤＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドを含む、条項１０７～１３５のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３７．カップリング配列が、（ａ）、（ｃ）、（ｇ）、（ｕ）、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎのうちの１つまたは複数を含み、ここでｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｃは２’－Ｏ－メチルアシチジン（２’－ＯＭｅ－Ｃ）であり、ｇは２’－Ｏ－メチルアシチジングアニン（２’－ＯＭｅ－Ｇ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である、条項１０７～１３６のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３８．カップリング配列が、（ａ）、（ｃ）、（ｇ）、（ｕ）、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎのうちの１つまたは複数を含み、ここでｎは３以上の整数であり、ａは２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｃは２’－Ｏ－メチルアシチジン（２’－ＯＭｅ－Ｃ）であり、ｇは２’－Ｏ－メチルアシチジングアニン（２’－ＯＭｅ－Ｇ）であり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である、条項１０７～１３７のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１３９．（ａ）、（ｃ）、（ｇ）、または（ｕ）が、核酸またはカップリング配列に沿って散在している、条項１３７または１３８に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４０．核酸およびカップリング配列がハイブリダイゼーション二重鎖内に１つまたは複数のＧ－Ｃ塩基対を含み、カップリング配列が核酸とハイブリダイズし、前記１つまたは複数のＧ－Ｃ塩基対合が、ハイブリダイゼーション二重鎖の安定性を高める、条項１３７～１３９のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４０．核酸およびカップリング配列がハイブリダイゼーション二重鎖内に１つまたは複数のＧ－Ｃ塩基対を含み、カップリング配列が核酸とハイブリダイズし、前記１つまたは複数のＧ－Ｃ塩基対合が、ハイブリダイゼーション二重鎖の安定性を高める、条項１３７～１３９のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４１．リンカーが共有結合リンカーを含む、条項１１５～１４０のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４２．リンカーが非共有結合リンカーを含む、条項１１５～１４０のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４２．リンカーが非共有結合リンカーを含む、条項１１５～１４０のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４３．リンカーが、一価リンカー、二価リンカー、三価リンカー、またはそれらの組合せを含む、条項１１５～１４２のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４４．リンカーが生体切断性リンカーを含む、条項１１５～１４３のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４４．リンカーが生体切断性リンカーを含む、条項１１５～１４３のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４５．リンカーが非生体切断性リンカーを含む、条項１１５～１４３のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４６．リンカーが、リン酸、ホスホロチオエート、アミド、エーテル、オキシム、ヒドラジンまたはカルバメートを含む、条項１４２に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４６．リンカーが、リン酸、ホスホロチオエート、アミド、エーテル、オキシム、ヒドラジンまたはカルバメートを含む、条項１４２に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４７．リンカーがリン酸またはホスホロチオエートである、条項１４６に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４８．（ａ）の核酸が化学修飾を含む、条項１０６～１４７のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４８．（ａ）の核酸が化学修飾を含む、条項１０６～１４７のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１４９．（ａ）の核酸が、２’－Ｆ修飾、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、非環式ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、４’－Ｏ－メチル、または２’－ａｒａ－Ｆ修飾を含む、条項１４８に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５０．核酸が２’－Ｏ－メチル修飾を含む、条項１４９に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５１．核酸がホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む、条項１４９に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５１．核酸がホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む、条項１４９に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５２．核酸が、ゲノムの標的遺伝子内の標的配列とハイブリダイズし得る、条項１０６～１５１のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５３．核酸が、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡまたはアンチミール、スーパーミール、アンタゴミール、リボザイム、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化因子、ＵＩアダプター、ガイドＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含む、条項１５２に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５３．核酸が、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡまたはアンチミール、スーパーミール、アンタゴミール、リボザイム、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化因子、ＵＩアダプター、ガイドＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含む、条項１５２に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５４．核酸がタンパク質をコードする、条項１５３に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５５．核酸がＣＲＩＳＰＲ酵素である、条項１５４に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５５．核酸がＣＲＩＳＰＲ酵素である、条項１５４に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５６．核酸が、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成し得るガイドＲＮＡである、条項１５３に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５７．ガイドＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡである、条項１５６に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５７．ガイドＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡである、条項１５６に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５８．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、および塩基編集因子融合タンパク質からなる群から選択される、条項１５７に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１５９．核酸が、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡをさらに含む、条項１５８のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１６０．ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列の変化をもたらす、条項１５９に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１６０．ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列の変化をもたらす、条項１５９に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１６１．標的遺伝子が脂質代謝経路に関与する、条項１５２～１６０のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１６２．標的遺伝子が、ＰＣＳＫ９、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ３、ＬＰＡ、ＡＰＯＢ、ＭＴＰ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ８、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＥ、ＬＤＬＲ、ＩＤＯＬ、ＮＰＣ１Ｌ１、ＡＳＧＲ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＧＡＬＮＴ２、ＧＣＫＲ、ＬＰＬ、ＭＬＸＩＰＬ、ＳＯＲＴ１、ＴＲＩＢ１、ＭＡＲＣ１、ＡＢＣＧ５、およびＡＢＣＧ８からなる群から選択される、条項１６１に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１６２．標的遺伝子が、ＰＣＳＫ９、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ３、ＬＰＡ、ＡＰＯＢ、ＭＴＰ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ８、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＥ、ＬＤＬＲ、ＩＤＯＬ、ＮＰＣ１Ｌ１、ＡＳＧＲ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＧＡＬＮＴ２、ＧＣＫＲ、ＬＰＬ、ＭＬＸＩＰＬ、ＳＯＲＴ１、ＴＲＩＢ１、ＭＡＲＣ１、ＡＢＣＧ５、およびＡＢＣＧ８からなる群から選択される、条項１６１に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
１６３．条項１５５～１６２のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲートおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含む粒子。
１６４．脂質ナノ粒子、リポソーム、無機ナノ粒子、またはＲＮＰである、条項１６３に記載の粒子。
１６４．脂質ナノ粒子、リポソーム、無機ナノ粒子、またはＲＮＰである、条項１６３に記載の粒子。
１６５．条項１０６～１６２のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲートを含む細胞。
１６６．原核細胞、真核細胞、脊椎動物細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、条項１６５に記載の細胞。
１６６．原核細胞、真核細胞、脊椎動物細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、条項１６５に記載の細胞。
１６７．条項１０６～１６２のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート、条項１６３もしくは１６４に記載の粒子、または条項１６５もしくは１６６に記載の細胞を含む薬学的組成物。
１６８．薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、担体、保存剤、賦形剤、緩衝剤、安定剤、またはそれらの組合せをさらに含む、条項１６７に記載の薬学的組成物。
１６９．担体が、溶媒、分散媒、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、脂質、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、コア－シェルナノ粒子、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、またはそれらの組合せを含む、条項１６８に記載の薬学的組成物。
１６９．担体が、溶媒、分散媒、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、脂質、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、コア－シェルナノ粒子、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、またはそれらの組合せを含む、条項１６８に記載の薬学的組成物。
１７０．条項１０６～１６２のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲートを含むキット。
１７１．冠動脈疾患のリスクの低減を必要とする対象における冠動脈疾患のリスクを低減するための方法であって、条項１０６～１６２のいずれか１項に記載の有効量のヌクレオチドコンジュゲートを対象に投与するステップを含む方法。
１７１．冠動脈疾患のリスクの低減を必要とする対象における冠動脈疾患のリスクを低減するための方法であって、条項１０６～１６２のいずれか１項に記載の有効量のヌクレオチドコンジュゲートを対象に投与するステップを含む方法。
１７２．冠動脈疾患のリスクの低減を必要とする対象における冠動脈疾患のリスクを低減するための方法であって、有効量の薬学的組成物を対象に投与するステップを含み、前記薬学的組成物が、
（ａ）核酸、および
（ｂ）表１の構造を含む、（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分
を含む、方法。
（ａ）核酸、および
（ｂ）表１の構造を含む、（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分
を含む、方法。
１７３．対象の肝臓に核酸を送達する方法であって、表１の構造を含むターゲティング部分に接続された前記核酸を対象に投与するステップを含む方法。
１７４．ターゲティング部分が、（ａ）の核酸とハイブリダイズするカップリング配列をさらに含む、条項１７２または１７３に記載の方法。
１７４．ターゲティング部分が、（ａ）の核酸とハイブリダイズするカップリング配列をさらに含む、条項１７２または１７３に記載の方法。
１７５．冠動脈疾患のリスクの低減を必要とする対象における冠動脈疾患のリスクを低減するための方法であって、有効量の薬学的組成物を対象に投与するステップを含み、前記薬学的組成物が、
（ａ）核酸、および
（ｂ）（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分であって、（ａ）の核酸とハイブリダイズするカップリング配列を含むターゲティング部分
を含む、方法。
（ａ）核酸、および
（ｂ）（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分であって、（ａ）の核酸とハイブリダイズするカップリング配列を含むターゲティング部分
を含む、方法。
１７６．対象の肝臓に核酸を送達する方法であって、核酸とハイブリダイズするカップリング配列を含むターゲティング部分に接続された前記核酸を対象に投与するステップを含む方法。
１７７．核酸が、一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖、またはヘアピンステムループ核酸を含み、ターゲティング部分が受容体ターゲティング部分である、条項１７２～１７６のいずれか１項に記載の方法。
１７８．ターゲティング部分がレクチンに結合する、条項１７２～１７７のいずれか１項に記載の方法。
１７９．レクチンがアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である、条項１７８に記載の方法。
１７９．レクチンがアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）である、条項１７８に記載の方法。
１８０．ターゲティング部分が１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項１７２～１７９のいずれか１項に記載の方法。
１８１．ターゲティング部分が少なくとも３つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項１８０に記載の方法。
１８２．核酸が、（ｉ）ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、または（ｉｉ）ヌクレアーゼＲＮＰに複合体を形成したガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡが、ヌクレアーゼを標的遺伝子の標的配列へ誘導し得る、条項１７２～１８１のいずれか１項に記載の方法。
１８２．核酸が、（ｉ）ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、または（ｉｉ）ヌクレアーゼＲＮＰに複合体を形成したガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡが、ヌクレアーゼを標的遺伝子の標的配列へ誘導し得る、条項１７２～１８１のいずれか１項に記載の方法。
１８３．ガイドＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡを含む、条項１８２に記載の方法。
１８４．ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ酵素である、条項１８３に記載の方法。
１８４．ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ酵素である、条項１８３に記載の方法。
１８５．ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、および塩基編集因子融合タンパク質からなる群から選択される、条項１８４に記載の方法。
１８６．ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列の変化をもたらす、条項１８５に記載の方法。
１８７．投与が、対象の肝臓における標的遺伝子の発現の低下をもたらす、条項１８２～１８６のいずれか１項に記載の方法。
１８７．投与が、対象の肝臓における標的遺伝子の発現の低下をもたらす、条項１８２～１８６のいずれか１項に記載の方法。
１８８．対象の肝臓における標的遺伝子の発現が、対象の対照組織と比較して、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９．９９％を超えて低下する、条項１８６または１８７に記載の方法。
１８９．標的遺伝子が冠動脈疾患に関連する、条項１８２～１８８のいずれか１項に記載の方法。
１９０．標的遺伝子が、ＰＣＳＫ９、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ３、ＬＰＡ、ＡＰＯＢ、ＭＴＰ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ８、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＥ、ＬＤＬＲ、ＩＤＯＬ、ＮＰＣ１Ｌ１、ＡＳＧＲ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＧＡＬＮＴ２、ＧＣＫＲ、ＬＰＬ、ＭＬＸＩＰＬ、ＳＯＲＴ１、ＴＲＩＢ１、ＭＡＲＣ１、ＡＢＣＧ５、およびＡＢＣＧ８からなる群から選択される、条項１８９に記載の方法。
１９０．標的遺伝子が、ＰＣＳＫ９、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ３、ＬＰＡ、ＡＰＯＢ、ＭＴＰ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ８、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＥ、ＬＤＬＲ、ＩＤＯＬ、ＮＰＣ１Ｌ１、ＡＳＧＲ１、ＴＭ６ＳＦ２、ＧＡＬＮＴ２、ＧＣＫＲ、ＬＰＬ、ＭＬＸＩＰＬ、ＳＯＲＴ１、ＴＲＩＢ１、ＭＡＲＣ１、ＡＢＣＧ５、およびＡＢＣＧ８からなる群から選択される、条項１８９に記載の方法。
１９１．ガイドＲＮＡが、配列番号１～２３からなる群から選択される配列を含む、条項１８２～１９０のいずれか１項に記載の方法。
１９２．カップリング配列が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学修飾ＲＮＡ、化学修飾ＤＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドを含む、条項１７４～１９１のいずれか１項に記載の方法。
１９２．カップリング配列が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学修飾ＲＮＡ、化学修飾ＤＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドを含む、条項１７４～１９１のいずれか１項に記載の方法。
１９３．カップリング配列が（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ｎが３以上の整数であり、ａが２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－ＯＭｅ Ａ）であり、ｕが２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－ＯＭｅ－Ｕ）である、条項１７４～１９２のいずれか１項に記載の方法。
１９４．（ａ）の核酸が（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｕ）ｎ、（ａ）ｎ、または（ｕ）ｎを含み、ｎが３以上の整数であり、ａが２’－Ｏ－メチルアデノシンであり、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジンである、条項１７２～１９３のいずれか１項に記載の方法。
１９５．ターゲティング部分が、ターゲティング部分のリンカーを介して、（ａ）の核酸とハイブリダイズするターゲティング部分のカップリング配列のハイブリダイゼーションを介して、またはそれらの組合せを介して（ａ）の核酸に連結している、条項１７２～１９４のいずれか１項に記載の方法。
１９６．リンカーが共有結合リンカーを含む、条項１９５に記載の方法。
１９７．リンカーが、リン酸、ホスホロチオエート、アミド、エーテル、オキシム、ヒドラジン、またはカルバメートを含む、条項１９６に記載の方法。
１９７．リンカーが、リン酸、ホスホロチオエート、アミド、エーテル、オキシム、ヒドラジン、またはカルバメートを含む、条項１９６に記載の方法。
１９８．リンカーがリン酸またはホスホロチオエートである、条項１９７に記載の方法。
１９９．（ａ）の核酸が化学修飾を含む、１７２～１９８のいずれか１項に記載の方法。
１９９．（ａ）の核酸が化学修飾を含む、１７２～１９８のいずれか１項に記載の方法。
２００．（ａ）の核酸が、２’－Ｆ修飾、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、非環式ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、または２’－ａｒａ－Ｆ修飾を含む、条項１９９に記載の方法。
２０１．核酸が２’－Ｏ－メチル修飾を含む、条項２００に記載の方法。
２０２．核酸がホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む、条項２０１に記載の方法。
２０２．核酸がホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む、条項２０１に記載の方法。
２０３．対象の肝臓における核酸のレベルが、送達の少なくとも１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、２日間、１週間、２週間、３週間、６週間、または８週間後、対象の他の組織と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍高い、条項１７２～２０２のいずれか１項に記載の方法。
２０４．有効量が約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇである、条項１７５～２０３のいずれか１項に記載の方法。
２０５．投与が、血中トリグリセリドの減少および／または低密度リポタンパク質コレステロールの減少を必要とする対象において血中トリグリセリドの減少および／または低密度リポタンパク質コレステロールの減少をもたらす、条項１７５～２０４に記載の方法。
２０５．投与が、血中トリグリセリドの減少および／または低密度リポタンパク質コレステロールの減少を必要とする対象において血中トリグリセリドの減少および／または低密度リポタンパク質コレステロールの減少をもたらす、条項１７５～２０４に記載の方法。
２０６．投与が、静脈内、髄腔内、筋肉内、脳室内、大脳内、小脳内、側脳室内、実質組織内、皮下、またはそれらの組合せで行われる、条項１７５～２０５のいずれか１項に記載の方法。
２０７．冠動脈疾患のリスクの低減を必要とする対象における冠動脈疾患のリスクを低減するための方法であって、
（ａ）（ｉ）シングルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉ）デュアルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉｉ）シングルガイドＲＮＡおよびＲＮＰ、または（ｉｖ）デュアルガイドＲＮＡおよびＲＮＰと、
（ｂ）（ａ）の核酸に接続されたアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）ターゲティング部分と
を含む薬学的組成物を対象に投与するステップを含み、
シングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡは、４つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾および２つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ターゲティング部分は表１の構造を含み、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子とハイブリダイズする、方法。
（ａ）（ｉ）シングルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉ）デュアルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉｉ）シングルガイドＲＮＡおよびＲＮＰ、または（ｉｖ）デュアルガイドＲＮＡおよびＲＮＰと、
（ｂ）（ａ）の核酸に接続されたアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）ターゲティング部分と
を含む薬学的組成物を対象に投与するステップを含み、
シングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡは、４つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾および２つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ターゲティング部分は表１の構造を含み、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子とハイブリダイズする、方法。
２０８．冠動脈疾患のリスクの低減を必要とする対象における冠動脈疾患のリスクを低減するための方法であって、
（ａ）（ｉ）シングルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉ）デュアルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉｉ）シングルガイドＲＮＡおよびＲＮＰ、または（ｉｖ）デュアルガイドＲＮＡおよびＲＮＰと、
（ｂ）（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分と
を含む薬学的組成物を対象に投与するステップを含み、
シングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡは、４つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾および２つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ターゲティング部分は、（ａ）のシングルガイドＲＮＡとハイブリダイズするカップリング配列を含み、ここでガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子とハイブリダイズする、方法。
（ａ）（ｉ）シングルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉ）デュアルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉｉ）シングルガイドＲＮＡおよびＲＮＰ、または（ｉｖ）デュアルガイドＲＮＡおよびＲＮＰと、
（ｂ）（ａ）の核酸に接続されたターゲティング部分と
を含む薬学的組成物を対象に投与するステップを含み、
シングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡは、４つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾および２つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ターゲティング部分は、（ａ）のシングルガイドＲＮＡとハイブリダイズするカップリング配列を含み、ここでガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子とハイブリダイズする、方法。
２０９．ヌクレアーゼｍＲＮＡおよび／またはシングルガイドＲＮＡが少なくとも１つの化学修飾を含む、条項２０７または２０８に記載の方法。
２１０．化学修飾が、２’－Ｆ修飾、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、非環式ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、４’－Ｏ－メチル、および２’－ａｒａ－Ｆ修飾からなる群から選択される、条項２０９に記載の方法。
２１０．化学修飾が、２’－Ｆ修飾、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、非環式ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、４’－Ｏ－メチル、および２’－ａｒａ－Ｆ修飾からなる群から選択される、条項２０９に記載の方法。
２１１．核酸コンジュゲートの投与が、前記化学修飾のない対照核酸コンジュゲートと比較して免疫応答のレベルの低下をもたらす、条項２１０に記載の方法。
２１２．式（ＩＶ）
２１２．式（ＩＶ）
の構造を含むヌクレオチドコンジュゲートであって、
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、ＲＡは－ＯＸまたは－ＮＨＡｃであり、ＹはＯまたはＳであり、Ｗは
（ａ）（ｉ）シングルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉ）デュアルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉｉ）シングルガイドＲＮＡおよびＲＮＰ、または（ｉｖ）デュアルガイドＲＮＡおよびＲＮＰ；または
（ｂ）カップリング配列
を表す、ヌクレオチドコンジュゲート。
式中、各Ｘは独立して、Ｈまたは保護基であり、ＲＡは－ＯＸまたは－ＮＨＡｃであり、ＹはＯまたはＳであり、Ｗは
（ａ）（ｉ）シングルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉ）デュアルガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼｍＲＮＡ、（ｉｉｉ）シングルガイドＲＮＡおよびＲＮＰ、または（ｉｖ）デュアルガイドＲＮＡおよびＲＮＰ；または
（ｂ）カップリング配列
を表す、ヌクレオチドコンジュゲート。
２１３．１つまたは複数のリンカーが、
からなる群から選択される構造を含む、条項２１２に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
２１４．リンカーの各々が独立して、－（Ｌ１）ｋ１－（Ｌ２）ｋ２－（Ｌ３）ｋ３－（Ｌ４）ｋ４－の構造を有し、ｋ１、ｋ２、ｋ３、およびｋ４の各々は独立して、０、１または２であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４の各々は独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、Ｓ（＝Ｏ）１～２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－ＮＲＬ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－ＮＲＬＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲＬＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－Ｐ（＝Ｏ）ＲＬ－、－ＮＲＬＳ（＝Ｏ）（＝ＮＲＬ）－、－ＮＲＬＳ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲＬ－、－Ｎ＝Ｎ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）１～６－、直鎖状もしくは分岐状のＣ１～６アルキレン、直鎖状もしくは分岐状のＣ２～６アルケニレン、直鎖状もしくは分岐状のＣ２～６アルキニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキレン、Ｃ６～Ｃ１０アリーレン、およびＣ５～Ｃ９ヘテロアリーレンであり、ここでアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンが置換もしくは非置換であり、ここで各ＲＬが独立して、Ｈ、Ｄ、シアノ、ハロゲン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、－ＣＤ３、－ＯＣＨ３、－ＯＣＤ３、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ハロアルキル、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり、いくつかの実施形態では、各ＲＬは独立してＨ、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、－ＯＣＨ３、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ハロアルキル、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、または置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキルである、条項２１２または２１３に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
２１４．リンカーの各々が独立して、－（Ｌ１）ｋ１－（Ｌ２）ｋ２－（Ｌ３）ｋ３－（Ｌ４）ｋ４－の構造を有し、ｋ１、ｋ２、ｋ３、およびｋ４の各々は独立して、０、１または２であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４の各々は独立して、－Ｏ－、－Ｓ－、Ｓ（＝Ｏ）１～２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－ＮＲＬ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－ＮＲＬＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲＬＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ－、－Ｐ（＝Ｏ）ＲＬ－、－ＮＲＬＳ（＝Ｏ）（＝ＮＲＬ）－、－ＮＲＬＳ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲＬ－、－Ｎ＝Ｎ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）１～６－、直鎖状もしくは分岐状のＣ１～６アルキレン、直鎖状もしくは分岐状のＣ２～６アルケニレン、直鎖状もしくは分岐状のＣ２～６アルキニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキレン、Ｃ６～Ｃ１０アリーレン、およびＣ５～Ｃ９ヘテロアリーレンであり、ここでアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンが置換もしくは非置換であり、ここで各ＲＬが独立して、Ｈ、Ｄ、シアノ、ハロゲン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、－ＣＤ３、－ＯＣＨ３、－ＯＣＤ３、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ハロアルキル、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり、いくつかの実施形態では、各ＲＬは独立してＨ、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、－ＯＣＨ３、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ハロアルキル、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、または置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ７ヘテロシクロアルキルである、条項２１２または２１３に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
２１５．ｋ１、ｋ２、ｋ３、およびｋ４の合計が１、２、または３である、条項２１２～２１４のいずれか１項に記載のヌクレオチドコンジュゲート。
２１６．ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．受容体ターゲティングコンジュゲートをステップ（ｃ）で生成されたナノ粒子と混合するステップと；
ｅ．ナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法。
２１６．ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．受容体ターゲティングコンジュゲートをステップ（ｃ）で生成されたナノ粒子と混合するステップと；
ｅ．ナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法。
２１７．受容体ターゲティングコンジュゲートが、（ｃ）における混合ステップの後に１つまたは複数の脂質と組み合わされる、条項２１６に記載の方法。
２１８．受容体ターゲティングコンジュゲートが希釈緩衝液に添加され、希釈緩衝液が、インライン混合チャンバから出てくる事前に形成された核酸－脂質ナノ粒子と混合され、それによりナノ粒子が形成される、条項２１６に記載の方法。
２１８．受容体ターゲティングコンジュゲートが希釈緩衝液に添加され、希釈緩衝液が、インライン混合チャンバから出てくる事前に形成された核酸－脂質ナノ粒子と混合され、それによりナノ粒子が形成される、条項２１６に記載の方法。
２１９．混合物に希釈緩衝液を添加し、希釈した混合物を一定時間保持した後に、受容体ターゲティングコンジュゲートを導入する、条項２１６に記載の方法。
２２０．保持時間は１分～１２０分の間である、条項２１９に記載の方法。
２２０．保持時間は１分～１２０分の間である、条項２１９に記載の方法。
２２１．保持時間が１分～９０分の間、１分～６０分の間、または１０分～４０分の間である、条項２１９に記載の方法。
２２２．保持時間が約３０分である、条項２１９に記載の方法。
２２２．保持時間が約３０分である、条項２１９に記載の方法。
２２３．受容体ターゲティングコンジュゲートが、緩衝液交換後にナノ粒子に導入される、条項２１６に記載の方法。
２２４．受容体ターゲティングコンジュゲートが、緩衝液交換および濃縮の後で、ただし保存前にナノ粒子に導入される、条項２１６に記載の方法。
２２４．受容体ターゲティングコンジュゲートが、緩衝液交換および濃縮の後で、ただし保存前にナノ粒子に導入される、条項２１６に記載の方法。
２２５．受容体ターゲティングコンジュゲートが、保存および解凍後、かつ投薬または評価の前にナノ粒子に導入される、条項２１６に記載の方法。
２２６．ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とをインラインで混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．ステップ（ｃ）の混合物に受容体ターゲティングコンジュゲートをインライン混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体、１つまたは複数の脂質、および受容体ターゲティングコンジュゲートを含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｅ．希釈緩衝液を添加することによりステップ（ｄ）の混合物を希釈するステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法。
２２６．ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とをインラインで混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．ステップ（ｃ）の混合物に受容体ターゲティングコンジュゲートをインライン混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体、１つまたは複数の脂質、および受容体ターゲティングコンジュゲートを含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｅ．希釈緩衝液を添加することによりステップ（ｄ）の混合物を希釈するステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法。
２２７．ステップ（ｃ）のインライン混合およびステップ（ｄ）のインライン混合が連続して実行される、条項２２６に記載の方法。
２２８．ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．（ｉ）１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つ、および（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それによりナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．任意選択でナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｅ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法。
２２８．ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．（ｉ）１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つ、および（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それによりナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．任意選択でナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｅ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法。
２２９．第２の溶液が全ての受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、条項２２８に記載の方法。
２３０．ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．受容体ターゲティングコンジュゲートを１つまたは複数の脂質と組み合わせるステップであって、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部は、混合ステップの前または混合ステップと同時に、１つまたは複数の脂質と組み合わされるステップと；
ｅ．任意選択でナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法。
２３０．ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．受容体ターゲティングコンジュゲートを１つまたは複数の脂質と組み合わせるステップであって、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部は、混合ステップの前または混合ステップと同時に、１つまたは複数の脂質と組み合わされるステップと；
ｅ．任意選択でナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法。
２３１．受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部が、混合ステップと同時に１つまたは複数の脂質と組み合わされる、条項２３０に記載の方法。
２３２．受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部が、混合ステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わされる、条項２３０に記載の方法。
２３２．受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部が、混合ステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わされる、条項２３０に記載の方法。
２３３．受容体ターゲティングコンジュゲートが、第２の溶液中の１つまたは複数の脂質と組み合わされる、条項２３２に記載の方法。
２３４．受容体ターゲティングコンジュゲートの一部が第２の溶液中の１つまたは複数の脂質と組み合わされ、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部が混合後に１つまたは複数の脂質と組み合わされる、条項２２８または２３０に記載の方法。
２３４．受容体ターゲティングコンジュゲートの一部が第２の溶液中の１つまたは複数の脂質と組み合わされ、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部が混合後に１つまたは複数の脂質と組み合わされる、条項２２８または２３０に記載の方法。
２３５．受容体ターゲティングコンジュゲートの一部が第２の溶液中の１つまたは複数の脂質と組み合わされ、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部がインキュベーションステップ後に１つまたは複数の脂質と組み合わされる、条項２２８または２３０に記載の方法。
２３６．受容体ターゲティングコンジュゲートの一部が第２の溶液中の１つまたは複数の脂質と組み合わされ、受容体ターゲティングコンジュゲートの一部が緩衝液交換ステップ後に１つまたは複数の脂質と組み合わされる、条項２２８または２３０に記載の方法。
２３７．希釈緩衝液を添加することにより、第１および第２の溶液を混合することによって生成された混合物を希釈するステップをさらに含む、条項２２８または２３０のいずれか１項に記載の方法。
２３８．混合物がインラインで希釈される、条項２３７に記載の方法。
２３９．希釈緩衝液が、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を含む、条項２３７または２３８に記載の方法。
２３９．希釈緩衝液が、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を含む、条項２３７または２３８に記載の方法。
２４０．希釈緩衝液がステルス脂質の少なくとも一部を含む、条項２３７～２３９のいずれか１項に記載の方法。
２４１．第１の溶液が水性緩衝液を含む、条項２１６～２４０のいずれか１項に記載の方法。
２４１．第１の溶液が水性緩衝液を含む、条項２１６～２４０のいずれか１項に記載の方法。
２４２．第２の溶液がエタノールを含む、条項２１６～２４１のいずれか１項に記載の方法。
２４３．混合が、層流混合、ボルテックス混合、乱流混合、またはそれらの組合せを含む、条項２１６または２２８～２４２のいずれか１項に記載の方法。
２４３．混合が、層流混合、ボルテックス混合、乱流混合、またはそれらの組合せを含む、条項２１６または２２８～２４２のいずれか１項に記載の方法。
２４４．混合が交差混合を含む、条項２１６または２２８～２４２のいずれか１項に記載の方法。
２４５．混合がインライン混合を含む、条項２１６または２２８～２４２のいずれか１項に記載の方法。
２４５．混合がインライン混合を含む、条項２１６または２２８～２４２のいずれか１項に記載の方法。
２４６．混合が、第１の溶液の少なくとも一部を第１の入口チャネルを通して導入し、第２の溶液の少なくとも一部を第２の入口チャネルを通して導入するステップを含み、第１の入口チャネルと第２の入口チャネルとの間の角度は、約１５～１８０度である、条項２１６～２４２のいずれか１項に記載の方法。
２４７．混合が、第１の溶液の一部を第３の入口チャネルを通して導入するステップを含む、条項２４６に記載の方法。
２４８．緩衝液交換が、透析、クロマトグラフィー、または接線流濾過（ＴＦＦ）を含む、条項２１６～２４７のいずれか１項に記載の方法。
２４８．緩衝液交換が、透析、クロマトグラフィー、または接線流濾過（ＴＦＦ）を含む、条項２１６～２４７のいずれか１項に記載の方法。
２４９．濾過ステップをさらに含む、条項２１６～２４８のいずれか１項に記載の方法。
２５０．受容体ターゲティングコンジュゲートが１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項２１６～２４９のいずれか１項に記載の方法。
２５０．受容体ターゲティングコンジュゲートが１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、条項２１６～２４９のいずれか１項に記載の方法。
２５１．受容体ターゲティングコンジュゲートが表４から選択される、条項２５０に記載の方法。
２５２．受容体ターゲティングコンジュゲートが、条項１～６２のいずれか１つに記載されている、条項２１６～２４９のいずれか１項に記載の方法。
２５２．受容体ターゲティングコンジュゲートが、条項１～６２のいずれか１つに記載されている、条項２１６～２４９のいずれか１項に記載の方法。
２５３．ナノ粒子が、条項６３～８３のいずれか１項に記載の第１のナノ粒子組成物を含む、条項２１６～２４９のいずれか１項に記載の方法。
２５４．製剤が条項８４～９８のいずれか１項に記載の薬学的組成物である、条項２１６～２４９のいずれか１項に記載の方法。
２５４．製剤が条項８４～９８のいずれか１項に記載の薬学的組成物である、条項２１６～２４９のいずれか１項に記載の方法。
２５５．ナノ粒子を含む薬学的組成物であって、ナノ粒子が（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、製剤が、条項２１６～２５３のいずれか１つの方法によって調製される、薬学的組成物。
２５６．ナノ粒子を含む薬学的組成物であって、ナノ粒子が（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、
製剤が、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．受容体ターゲティングコンジュゲートをステップ（ｃ）で生成されたナノ粒子と混合するステップと；
ｅ．ナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法によって調製される、薬学的組成物。
製剤が、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．受容体ターゲティングコンジュゲートをステップ（ｃ）で生成されたナノ粒子と混合するステップと；
ｅ．ナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法によって調製される、薬学的組成物。
２５７．ナノ粒子を含む薬学的組成物であって、ナノ粒子が（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、製剤が、以下：
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．受容体ターゲティングコンジュゲートを１つまたは複数の脂質と組み合わせるステップであって、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部は、混合ステップの前または混合ステップと同時に、１つまたは複数の脂質と組み合わされるステップと、
ｅ．任意選択でナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法によって調製される、薬学的組成物。
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．受容体ターゲティングコンジュゲートを１つまたは複数の脂質と組み合わせるステップであって、受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部は、混合ステップの前または混合ステップと同時に、１つまたは複数の脂質と組み合わされるステップと、
ｅ．任意選択でナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法によって調製される、薬学的組成物。
２５８．ナノ粒子を含む薬学的組成物であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、製剤は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とをインラインで混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．ステップ（ｃ）の混合物に受容体ターゲティングコンジュゲートをインライン混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体、１つまたは複数の脂質、および受容体ターゲティングコンジュゲートを含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｅ．希釈緩衝液を添加することによりステップ（ｄ）の混合物を希釈するステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法によって調製される、薬学的組成物。
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とをインラインで混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体および１つまたは複数の脂質を含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．ステップ（ｃ）の混合物に受容体ターゲティングコンジュゲートをインライン混合し、それにより、１つまたは複数の核酸分子実体、１つまたは複数の脂質、および受容体ターゲティングコンジュゲートを含むナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｅ．希釈緩衝液を添加することによりステップ（ｄ）の混合物を希釈するステップと；
ｆ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法によって調製される、薬学的組成物。
２５９．ナノ粒子を含む薬学的組成物であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質、ならびに（ｉｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、製剤は、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．（ｉ）１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つ、および（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それによりナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．任意選択でナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｅ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法によって調製される、薬学的組成物。
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．（ｉ）１つまたは複数の脂質のうちの少なくとも１つ、および（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合し、それによりナノ粒子を含む混合物を生成するステップと；
ｄ．任意選択でナノ粒子をインキュベートするステップと；
ｅ．任意選択で緩衝液交換プロセスを実行するステップと
を含む方法によって調製される、薬学的組成物。
２６０．ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、または臨床的アテローム性動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）を有する、上記の条項のいずれか１項で参照される対象。
２６１．心血管イベントのリスクが高く、最大耐量の脂質低下療法にもかかわらず、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）をさらに低下させる必要がある、上記の条項のいずれか１項で参照される対象。
２６２．脂質ナノ粒子組成物であって、
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体；および
ｂ．上記の条項のいずれかで参照される受容体ターゲティングコンジュゲート
を含む脂質ナノ粒子組成物。
ａ．１つまたは複数の核酸分子実体；および
ｂ．上記の条項のいずれかで参照される受容体ターゲティングコンジュゲート
を含む脂質ナノ粒子組成物。
２６３．受容体ターゲティングコンジュゲートが、総脂質含有量の約０．００１ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する、条項２６２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２６４．受容体ターゲティングコンジュゲートが、総脂質含有量の約０．００５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成する、条項２６２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２６４．受容体ターゲティングコンジュゲートが、総脂質含有量の約０．００５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成する、条項２６２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２６５．受容体ターゲティングコンジュゲートが、存在する総脂質含有量の約０．０１ｍｏｌ％～約１．０ｍｏｌ％を構成する、条項２６２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２６６．アミノ脂質、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、およびＰＥＧ－脂質をさらに含む、条項２６２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２６６．アミノ脂質、ステロールまたはその誘導体、リン脂質、およびＰＥＧ－脂質をさらに含む、条項２６２に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２６７．アミノ脂質が、１つまたは複数のアミノ脂質から構成され、総アミノ脂質が総脂質含有量の約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％を構成する、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２６８．アミノ脂質が、総脂質含有量の約４０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％を構成する、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２６９．アミノ脂質が、総脂質含量の約４５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２６９．アミノ脂質が、総脂質含量の約４５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２７０．ステロールまたはその誘導体が、総脂質含有量の約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％を構成する、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２７１．ステロールまたはその誘導体がコレステロールである、条項２７０に記載の組成物の脂質ナノ粒子。
２７１．ステロールまたはその誘導体がコレステロールである、条項２７０に記載の組成物の脂質ナノ粒子。
２７２．リン脂質が、総脂質含有量の約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％を構成する、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２７３．リン脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２７３．リン脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２７４．ステルス脂質が、前記ナノ粒子組成物中に存在する総脂質含有量の約０ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％を構成する、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２７５．ステルス脂質が、約２００Ｄａ～約５０００Ｄａの数平均分子量を有するＰＥＧ－脂質である、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２７５．ステルス脂質が、約２００Ｄａ～約５０００Ｄａの数平均分子量を有するＰＥＧ－脂質である、条項２６６に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２７６．ＰＥＧ－脂質が、約１５００Ｄａ～約３０００Ｄａの数平均分子量を有する、条項２７５に記載の脂質ナノ粒子組成物。
２７７．条項２７６に記載の脂質ナノ粒子組成物であって、
ａ．約０．００１ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の、先行する条項のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートと；
ｂ．約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％の１つまたは複数のアミノ脂質と；
ｃ．約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％のステロールと；
ｄ．約３ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％のリン脂質と；
ｅ．約０．１ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％のステルス脂質と
を含む脂質ナノ粒子組成物。
２７７．条項２７６に記載の脂質ナノ粒子組成物であって、
ａ．約０．００１ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の、先行する条項のいずれか１項に記載の受容体ターゲティングコンジュゲートと；
ｂ．約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％の１つまたは複数のアミノ脂質と；
ｃ．約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％のステロールと；
ｄ．約３ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％のリン脂質と；
ｅ．約０．１ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％のステルス脂質と
を含む脂質ナノ粒子組成物。
２７８．条項２７７に記載の脂質ナノ粒子組成物であって、
ａ．ターゲティングコンジュゲートが表４から選択され、総脂質含有量の０．００１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％を構成し；
ｂ．アミノ脂質が総脂質含有量の約２０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％を構成し；
ｃ．ステロールがコレステロールであり、総脂質含有量の約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成し；
ｄ．リン脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、総脂質含有量の約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％を構成し；
ｅ．ステルス脂質が、約２００Ｄａ～約５０００Ｄａの数平均分子量を有するＰＥＧ脂質であり、約０ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％を構成する、
脂質ナノ粒子組成物。
ａ．ターゲティングコンジュゲートが表４から選択され、総脂質含有量の０．００１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％を構成し；
ｂ．アミノ脂質が総脂質含有量の約２０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％を構成し；
ｃ．ステロールがコレステロールであり、総脂質含有量の約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成し；
ｄ．リン脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、総脂質含有量の約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％を構成し；
ｅ．ステルス脂質が、約２００Ｄａ～約５０００Ｄａの数平均分子量を有するＰＥＧ脂質であり、約０ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％を構成する、
脂質ナノ粒子組成物。
２７９．条項２７７に記載の脂質ナノ粒子組成物であって、
ａ．ターゲティングコンジュゲートが表４から選択され、総脂質含有量の０．００１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成し；
ｂ．アミノ脂質が総脂質含有量の約４０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％を構成し；
ｃ．ステロールがコレステロールであり、総脂質含有量の約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成し；
ｄ．リン脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、総脂質含有量の約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％を構成する、
脂質ナノ粒子組成物。
ａ．ターゲティングコンジュゲートが表４から選択され、総脂質含有量の０．００１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成し；
ｂ．アミノ脂質が総脂質含有量の約４０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％を構成し；
ｃ．ステロールがコレステロールであり、総脂質含有量の約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成し；
ｄ．リン脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、総脂質含有量の約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％を構成する、
脂質ナノ粒子組成物。
２８０．受容体ターゲティングコンジュゲートであって、式（Ｖ）：
の化合物を含み、
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、または置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質もしくは脂質ナノ粒子を含むか、またはそれらであり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、受容体ターゲティングコンジュゲート。
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、または置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質、核酸、アミノ酸、タンパク質もしくは脂質ナノ粒子を含むか、またはそれらであり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８１．
ａ．複数のＡ基がレクチン受容体ターゲティングリガンドを含み；
ｂ．Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ７の各々が、－（ＣＨ２）４－を含み；
ｃ．Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８の各々が－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を含み；
ｄ．Ｌ６およびＬ９の各々が－（ＣＨ２）３－を含み；
ｅ．Ｌ１０が－（ＣＨ２）１～３－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－または－ＣＨ２Ｏ－であり；
ｆ．Ｌ１１が－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり、式中ｎが１～５０から選択される整数であり；
ｇ．Ｌ１２が－ＮＨ（ＣＯ）Ｏ－であり；
ｈ．Ｒが、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、ステロール、Ｃ１０～Ｃ３０炭素原子を含むｎ－アルキル、Ｃ１０～Ｃ３０炭素原子を含む分岐アルキル、またはトコフェロールからなる群から選択される、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
ａ．複数のＡ基がレクチン受容体ターゲティングリガンドを含み；
ｂ．Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ７の各々が、－（ＣＨ２）４－を含み；
ｃ．Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８の各々が－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を含み；
ｄ．Ｌ６およびＬ９の各々が－（ＣＨ２）３－を含み；
ｅ．Ｌ１０が－（ＣＨ２）１～３－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－または－ＣＨ２Ｏ－であり；
ｆ．Ｌ１１が－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり、式中ｎが１～５０から選択される整数であり；
ｇ．Ｌ１２が－ＮＨ（ＣＯ）Ｏ－であり；
ｈ．Ｒが、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、ステロール、Ｃ１０～Ｃ３０炭素原子を含むｎ－アルキル、Ｃ１０～Ｃ３０炭素原子を含む分岐アルキル、またはトコフェロールからなる群から選択される、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８２．ｎが１～３、９～１５、３３～３９または４１～４９である、条項２８１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８３．レクチン受容体がアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）であり、複数のＡ基がＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはそれらの組合せを含む、条項２８１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８３．レクチン受容体がアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）であり、複数のＡ基がＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはそれらの組合せを含む、条項２８１に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８４．Ａ基の各々がＮ－アセチルガラクトサミン
である、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８５．表４の１００１～１０１９、１０６０、１０６５、１０６６、および１０７５～１０８５から選択されるコンジュゲートである、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８５．表４の１００１～１０１９、１０６０、１０６５、１０６６、および１０７５～１０８５から選択されるコンジュゲートである、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８６．
１００４
である、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８７．Ｒが、脂肪アルコール、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド、もしくはステロールまたはそれらの誘導体のうちの１つまたは複数を含む、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
である、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８７．Ｒが、脂肪アルコール、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド、もしくはステロールまたはそれらの誘導体のうちの１つまたは複数を含む、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８８．Ｒが、１つまたは複数の遺伝子編集因子ヌクレアーゼまたは塩基編集因子をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡ、および１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む脂質ナノ粒子である、条項２８０に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２８９．冠動脈疾患のリスクの低減を必要とする対象における冠動脈疾患のリスクを低減するための方法であって、対象に、１つまたは複数の薬学的に活性な薬剤を含むペイロードを封入している脂質ナノ粒子を投与するステップを含み、脂質ナノ粒子は、式（Ｖ）：
の受容体ターゲティングコンジュゲートをさらに含み、
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、または置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質を含むか、または脂質であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、方法。
式中、
複数のＡ基は、集合的に受容体ターゲティングリガンドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２の各々は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、置換もしくは非置換の－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、または置換もしくは非置換の－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、脂質を含むか、または脂質であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、方法。
２９０．
ａ．複数のＡ基がレクチン受容体ターゲティングリガンドを含み；
ｂ．Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ７の各々が、－（ＣＨ２）４－を含み；
ｃ．Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８の各々が－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を含み；
ｄ．Ｌ６およびＬ９の各々が－（ＣＨ２）３－を含み；
ｅ．Ｌ１０が－（ＣＨ２）１～３－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－または－ＣＨ２Ｏ－であり；
ｆ．Ｌ１１が－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり、式中ｎが１～５０から選択される整数であり；
ｇ．Ｌ１２が－ＮＨ（ＣＯ）Ｏ－であり；
ｈ．Ｒが、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、ステロール、Ｃ１０～Ｃ３０炭素原子を含むｎ－アルキル、Ｃ１０～Ｃ３０炭素原子を含む分岐アルキル、またはトコフェロールからなる群から選択される、条項２８９に記載の方法。
ａ．複数のＡ基がレクチン受容体ターゲティングリガンドを含み；
ｂ．Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ７の各々が、－（ＣＨ２）４－を含み；
ｃ．Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８の各々が－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を含み；
ｄ．Ｌ６およびＬ９の各々が－（ＣＨ２）３－を含み；
ｅ．Ｌ１０が－（ＣＨ２）１～３－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－または－ＣＨ２Ｏ－であり；
ｆ．Ｌ１１が－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－または－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－であり、式中ｎが１～５０から選択される整数であり；
ｇ．Ｌ１２が－ＮＨ（ＣＯ）Ｏ－であり；
ｈ．Ｒが、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、ステロール、Ｃ１０～Ｃ３０炭素原子を含むｎ－アルキル、Ｃ１０～Ｃ３０炭素原子を含む分岐アルキル、またはトコフェロールからなる群から選択される、条項２８９に記載の方法。
２９１．受容体ターゲティングコンジュゲートが、表４の１００１～１０１９、１０６０、１０６５、１０６６、および１０７５～１０８５から選択されるコンジュゲートである、条項２８９に記載の受容体ターゲティングコンジュゲート。
２９２．受容体ターゲティングコンジュゲートが表４のコンジュゲート１００４である、条項２８９に記載の方法。
２９３．受容体ターゲティングコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が、ＬＤＬｒ欠損哺乳動物において、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応する脂質ナノ粒子よりも少なくとも５０％高い編集パーセントによって決定される改善された送達を提供する、条項２９２に記載の方法。
２９３．受容体ターゲティングコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が、ＬＤＬｒ欠損哺乳動物において、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応する脂質ナノ粒子よりも少なくとも５０％高い編集パーセントによって決定される改善された送達を提供する、条項２９２に記載の方法。
２９４．受容体ターゲティングコンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応する脂質ナノ粒子よりも少なくとも５０％高い編集パーセントによって決定されるとおり、ＡｐｏＥを欠く哺乳動物において改善された送達を提供する、条項２９２に記載の方法。
２９５．１つまたは複数の活性剤が、遺伝子編集因子ヌクレアーゼまたは塩基編集因子をコードするｍＲＮＡ、および１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む、条項２８９に記載の方法。
２９６．ｍＲＮＡがアデノシン塩基編集因子であり、１つまたは複数のガイドＲＮＡが、（ｉ）ＰＣＳＫ９遺伝子のセグメント、（ｉｉ）ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のセグメント、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方に相補的である、条項２９５に記載の方法。
２９７．１つまたは複数のガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つが、表５の配列番号１２１～１２６のガイドＲＮＡ配列から選択される、条項２９５に記載の方法。
２９８．受容体ターゲティングコンジュゲートが、脂質ナノ粒子中の全賦形剤の約０．００１ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％を構成する、条項２８９に記載の方法。
２９８．受容体ターゲティングコンジュゲートが、脂質ナノ粒子中の全賦形剤の約０．００１ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％を構成する、条項２８９に記載の方法。
２９９．ＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質を含む脂質賦形剤、ならびに（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．（ｉ）脂質賦形剤および（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部をエタノールなどの水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合するステップと；
ｄ．第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＧａｌＮＡｃ脂質ナノ粒子を形成するステップと；
ｅ．任意選択で、１つまたは複数の、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、およびＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子評価プロセスを実行するステップと
を含む方法。
ａ．水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．（ｉ）脂質賦形剤および（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部をエタノールなどの水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．第１の溶液と第２の溶液とを混合するステップと；
ｄ．第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＧａｌＮＡｃ脂質ナノ粒子を形成するステップと；
ｅ．任意選択で、１つまたは複数の、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、およびＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子評価プロセスを実行するステップと
を含む方法。
３００．ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートが、表４で特定される構造から選択される、条項２９９に記載の方法。
３０１．混合が、第１の溶液を第１の混合チャンバに別々に導入する第１のポートと、第２の溶液を第１の混合チャンバに別々におよび同時に導入する第２のポートとを備える、第１の混合チャンバを有するインライン混合装置によって行われる、条項２９９に記載の方法。
３０１．混合が、第１の溶液を第１の混合チャンバに別々に導入する第１のポートと、第２の溶液を第１の混合チャンバに別々におよび同時に導入する第２のポートとを備える、第１の混合チャンバを有するインライン混合装置によって行われる、条項２９９に記載の方法。
３０２．第１の溶液と第２の溶液とを混合した後に、受容体ターゲティングコンジュゲートの第２の部分を添加するステップをさらに含み、受容体ターゲティングコンジュゲートの第２の部分の添加は、水混和性有機溶媒に予め溶解され、水性溶液と組み合わされて、水性希釈緩衝液を形成し、インキュベーション前にインライン混合装置の第１の混合チャンバと連結され、その下流にある第２の混合チャンバ内で、事前に混合された第１および第２の溶液と混合される、条項３０１に記載の方法。
３０３．受容体ターゲティングコンジュゲートの第２の部分が添加された後に緩衝液交換プロセスをさらに含む、条項３０２に記載の方法。
３０４．ＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）１つまたは複数のステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、またはアミノ脂質を含む脂質賦形剤、ならびに（ｉｉｉ）１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．水混和性有機溶媒中に１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を含む第３の溶液を用意するステップと；
ｄ．第１の溶液、第２の溶液、および第３の溶液を１つまたは複数の混合チャンバ内で混合するステップであって、各溶液は入口ポートを介して１つまたは複数の混合チャンバに別々に導入されるステップと；
ｅ．第１、第２、および第３の溶液の混合物をインキュベートして、ＧａｌＮＡｃ脂質ナノ粒子を形成するステップと；
ｆ．任意選択で、１つまたは複数の、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、およびＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子評価プロセスを実行するステップと
を含む方法。
３０４．ＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が（ｉ）１つまたは複数の核酸分子実体、（ｉｉ）１つまたは複数のステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、またはアミノ脂質を含む脂質賦形剤、ならびに（ｉｉｉ）１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、方法は、
ａ．水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸分子実体を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．水混和性有機溶媒中に１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つを含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を含む第３の溶液を用意するステップと；
ｄ．第１の溶液、第２の溶液、および第３の溶液を１つまたは複数の混合チャンバ内で混合するステップであって、各溶液は入口ポートを介して１つまたは複数の混合チャンバに別々に導入されるステップと；
ｅ．第１、第２、および第３の溶液の混合物をインキュベートして、ＧａｌＮＡｃ脂質ナノ粒子を形成するステップと；
ｆ．任意選択で、１つまたは複数の、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、およびＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子評価プロセスを実行するステップと
を含む方法。
３０５．第１の溶液が水性緩衝液を含み、第２の溶液および第３の溶液が水混和性アルコールからそれぞれ独立して調製される、条項３０４に記載の方法。
３０６．第１の溶液、第２の溶液、および第３の溶液が同時にミキサーに導入される、条項３０４に記載の方法。
３０６．第１の溶液、第２の溶液、および第３の溶液が同時にミキサーに導入される、条項３０４に記載の方法。
３０７．第１の溶液、第２の溶液、および第３の溶液が、インキュベーションの前に順次ミキサーに導入される、条項３０４に記載の方法。
３０８．第１の溶液、第２の溶液、および第３の溶液が、第２の下流混合チャンバに連結された第１の混合チャンバを有するインラインミキサー装置内で組み合わされ、第１および第２の溶液が第１の混合チャンバ内で予め混合され、直ちに第２の混合チャンバ内に流れ込み、第３の溶液が第２の混合チャンバ内で第１および第２の溶液と混合され、ここで、第３の溶液は、水性希釈緩衝液中に混合されたまたは水性希釈緩衝液で希釈された水混和性有機溶媒に予め溶解されたターゲティングコンジュゲートおよび／または脂質賦形剤を任意選択で含み得る、条項３０４に記載の方法。
３０８．第１の溶液、第２の溶液、および第３の溶液が、第２の下流混合チャンバに連結された第１の混合チャンバを有するインラインミキサー装置内で組み合わされ、第１および第２の溶液が第１の混合チャンバ内で予め混合され、直ちに第２の混合チャンバ内に流れ込み、第３の溶液が第２の混合チャンバ内で第１および第２の溶液と混合され、ここで、第３の溶液は、水性希釈緩衝液中に混合されたまたは水性希釈緩衝液で希釈された水混和性有機溶媒に予め溶解されたターゲティングコンジュゲートおよび／または脂質賦形剤を任意選択で含み得る、条項３０４に記載の方法。
３０９．水混和性有機溶媒がエタノールである、条項３０４に記載の方法。
３１０．ターゲティング部分または受容体ターゲティングコンジュゲートが表１に表される構造を有する、先行する条項のいずれか１項で参照されるターゲティング部分または受容体ターゲティングコンジュゲート。
３１０．ターゲティング部分または受容体ターゲティングコンジュゲートが表１に表される構造を有する、先行する条項のいずれか１項で参照されるターゲティング部分または受容体ターゲティングコンジュゲート。
３１１．表２または表３に示される配列を含む、先行する条項のいずれか１項で参照されるＧａｌＮＡｃコンジュゲート。
３１２．受容体ターゲティングコンジュゲートが表４の構造を含む、先行する条項のいずれか１項で参照される受容体ターゲティングコンジュゲート。
３１２．受容体ターゲティングコンジュゲートが表４の構造を含む、先行する条項のいずれか１項で参照される受容体ターゲティングコンジュゲート。
３１３．ガイドＲＮＡが表５に示される配列を含む、先行する条項のいずれか１項で参照されるガイドＲＮＡ。
３１４．脂質賦形剤が表６または表７の構造を含む、先行する条項のいずれか１項で参照される脂質賦形剤。
３１４．脂質賦形剤が表６または表７の構造を含む、先行する条項のいずれか１項で参照される脂質賦形剤。
３１５．表８、表９、表１０、表１１、表１２、または表１３の組成物を含む、先行する条項のいずれか１項で参照される脂質ナノ粒子。
さらなる実施形態
１．ＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子（ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤、ならびに（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、
ａ．水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．（ｉ）１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つおよび（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．抗酸化剤を前記第１の溶液と組み合わせるステップと；
ｄ．前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合するステップと；
ｅ．前記第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを形成するステップと；
ｆ．任意選択で、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを実行するステップと
を含む、方法。
さらなる実施形態
１．ＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子（ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤、ならびに（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、
ａ．水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．（ｉ）１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つおよび（ｉｉ）受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．抗酸化剤を前記第１の溶液と組み合わせるステップと；
ｄ．前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合するステップと；
ｅ．前記第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを形成するステップと；
ｆ．任意選択で、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを実行するステップと
を含む、方法。
２．水溶液中でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを希釈して、希釈ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液を生成するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．前記ＧａｌＮＡｃ溶液が、直接投与用に構成されている、実施形態２に記載の方法。
３．前記ＧａｌＮＡｃ溶液が、直接投与用に構成されている、実施形態２に記載の方法。
４．溶液中で前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを１回または複数回希釈するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
５．前記水混和性有機溶媒を緩衝溶液と１回または複数回交換するステップをさらに含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載の方法。
５．前記水混和性有機溶媒を緩衝溶液と１回または複数回交換するステップをさらに含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載の方法。
６．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップをさらに含む、実施形態１から５のいずれか１つに記載の方法。
７．濃縮するステップが、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを膜に通過させるステップを含む、実施形態６に記載の方法。
７．濃縮するステップが、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを膜に通過させるステップを含む、実施形態６に記載の方法。
８．第２の濃縮プロセスをさらに含み、第２の濃縮が、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを膜に通過させるステップを含む、実施形態６または７に記載の方法。
９．膜を通して前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濾過するステップをさらに含む、実施形態１から７のいずれか１つに記載の方法。
９．膜を通して前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濾過するステップをさらに含む、実施形態１から７のいずれか１つに記載の方法。
１０．ステップｅの後に第２のインキュベーションをさらに含み、インキュベーションが、約１分～約１２０分行われる、実施形態１から８のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを摂氏約－８０度（℃）～約２５℃の温度で保存するステップをさらに含む、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを摂氏約－８０度（℃）～約２５℃の温度で保存するステップをさらに含む、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを摂氏約－８０度（℃）または約２℃～約８℃の温度で保存するステップをさらに含む、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．（ｉ）保存されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを解凍するステップ、（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰをプールするステップ、（ｉｉｉ）溶液中でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを希釈するステップ、および（ｉｖ）対象に前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの用量を投与する前に膜を通して前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濾過するステップをさらに含む、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法。
１３．（ｉ）保存されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを解凍するステップ、（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰをプールするステップ、（ｉｉｉ）溶液中でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを希釈するステップ、および（ｉｖ）対象に前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの用量を投与する前に膜を通して前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濾過するステップをさらに含む、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を実施する順序が逆にされる、実施形態１３に記載の方法。
１５．前記混和性有機溶媒がエタノールである、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記混和性有機溶媒がエタノールである、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．前記抗酸化剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、実施形態１から１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記第２の溶液が、全ての受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、実施形態１から１６のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記第２の溶液が、全ての受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、実施形態１から１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部が、混合ステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わせられる、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．混合が、インラインミキサー、クロスミキサー、またはＴミキサー装置で行われる、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．混合が、層流混合、ボルテックス混合、乱流混合、またはそれらの組合せを含む、実施形態１から１９のいずれか１つに記載の方法。
２０．混合が、層流混合、ボルテックス混合、乱流混合、またはそれらの組合せを含む、実施形態１から１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．接線流濾過（ＴＦＦ）プロセスを使用して、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップをさらに含む、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．クロマトグラフィー、透析、またはＴＦＦプロセスを使用して、緩衝液交換を行うステップをさらに含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法。
２２．クロマトグラフィー、透析、またはＴＦＦプロセスを使用して、緩衝液交換を行うステップをさらに含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．受容体ターゲティングコンジュゲートが、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、実施形態１から２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートが、表４で特定される構造から選択される、実施形態２３に記載の方法。
２５．混合が、前記第１の溶液を前記第１の混合チャンバに別々に導入する第１のポートと、前記第２の溶液を前記第１の混合チャンバに別々におよび同時に導入する第２のポートとを備える、第１の混合チャンバを有するインライン混合装置によって行われる、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法。
２５．混合が、前記第１の溶液を前記第１の混合チャンバに別々に導入する第１のポートと、前記第２の溶液を前記第１の混合チャンバに別々におよび同時に導入する第２のポートとを備える、第１の混合チャンバを有するインライン混合装置によって行われる、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記第１の溶液がＲＮＡを含む、実施形態１から２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートの濃度（ｍｏｌ％）が、約０．０１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％である、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートの濃度（ｍｏｌ％）が、約０．０１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％である、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記中性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、実施形態１から２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．前記ステルス脂質が、ポリエチレングリコール－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である、実施形態１から２８のいずれか１つに記載の方法。
２９．前記ステルス脂質が、ポリエチレングリコール－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である、実施形態１から２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．前記第２の溶液中の前記ステルス脂質の濃度が、０ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％である、実施形態１から２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．前記核酸薬剤の濃度が、約１ｍｇ／ｍＬである、実施形態１から３０のいずれか１つに記載の方法。
３１．前記核酸薬剤の濃度が、約１ｍｇ／ｍＬである、実施形態１から３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．前記混合物が、約１分～約２４時間インキュベートされる、実施形態１から３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．前記混合物が、約１分～約１２０分間インキュベートされる、実施形態３２に記載の方法。
３３．前記混合物が、約１分～約１２０分間インキュベートされる、実施形態３２に記載の方法。
３４．前記混合物が、約１時間インキュベートされる、実施形態３３に記載の方法。
３５．最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液が、Ｔｒｉｓ緩衝液を含む、実施形態１から３４のいずれか１つに記載の方法。
３５．最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液が、Ｔｒｉｓ緩衝液を含む、実施形態１から３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液が、凍結保護剤をさらに含む、実施形態１から３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．前記凍結保護剤がスクロースである、実施形態３６に記載の方法。
３７．前記凍結保護剤がスクロースである、実施形態３６に記載の方法。
３８．前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度が、約０．１ｍＭ～約５００ｍＭである、実施形態３６または３７に記載の方法。
３９．前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度が、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭである、実施形態３８に記載の方法。
３９．前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度が、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭである、実施形態３８に記載の方法。
４０．前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度が、約３００ｍＭである、実施形態３９に記載の方法。
４１．ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、摂氏約－８０度（℃）の温度で保存される、実施形態３９または４０に記載の方法。
４１．ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、摂氏約－８０度（℃）の温度で保存される、実施形態３９または４０に記載の方法。
４２．最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液が、凍結保護剤をさらに含まない、実施形態１から３５のいずれか１つに記載の方法。
４３．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約２℃～約８℃で保存される、実施形態４２に記載の方法。
４３．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約２℃～約８℃で保存される、実施形態４２に記載の方法。
４４．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約７～約８のｐＨを有する溶液中にある、実施形態１から４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約７．４のｐＨを有する溶液中にある、実施形態４４に記載の方法。
４５．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約７．４のｐＨを有する溶液中にある、実施形態４４に記載の方法。
４６．総体積に対して少なくとも０．１ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、実施形態１から４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．総体積に対して少なくとも１ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、実施形態４６に記載の方法。
４８．総体積に対して少なくとも３ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、実施形態４７に記載の方法。
４９．総体積に対して少なくとも５ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、実施形態４８に記載の方法。
５０．総体積に対して少なくとも７ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、実施形態４９に記載の方法。
５１．総体積に対して少なくとも９ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、実施形態５０に記載の方法。
５２．総体積に対して少なくとも１０ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、実施形態５１に記載の方法。
５３．実施形態１から５２のいずれか１つに記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであって、前記ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布が実質的に均一である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
５４．ＧａｌＮＡｃ－脂質が、５ｍｏｌ％の濃度でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰに存在する、実施形態５３に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。実施形態１から５４のいずれか１つに記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであって、１つまたは複数の前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを含む用量を哺乳動物に投与することにより、前記用量を投与していない対応する対象よりも血液中のＬＤＬレベルを少なくとも３００％増加させる、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
５５．前記ＬＤＬレベルが少なくとも３５０％増加する、実施形態５４に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
５６．前記ＬＤＬレベルが少なくとも４００％増加する、実施形態５５に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
５６．前記ＬＤＬレベルが少なくとも４００％増加する、実施形態５５に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
５７．前記ＬＤＬレベルが少なくとも５００％増加する、実施形態５６に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
５８．前記ＬＤＬレベルが少なくとも５５０％増加する、実施形態５７に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
５８．前記ＬＤＬレベルが少なくとも５５０％増加する、実施形態５７に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
５９．前記ＬＤＬレベルが少なくとも６００％増加する、実施形態５８に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６０．アデニンベースエディター（ＡＢＥ）ｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１～５４のいずれか１つに記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６０．アデニンベースエディター（ＡＢＥ）ｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１～５４のいずれか１つに記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６１．前記ｍＲＮＡがＭＡ００４である、実施形態６０に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６２．ＡＢＥ ｍＲＮＡが、本明細書に記載される３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、表１８のＵＴＲをさらに含む、実施形態６０に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６２．ＡＢＥ ｍＲＮＡが、本明細書に記載される３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、表１８のＵＴＲをさらに含む、実施形態６０に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６３．本明細書に記載されるＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡをさらに含む、実施形態６２に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６４．本明細書に記載されるＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをさらに含む、実施形態６２に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６４．本明細書に記載されるＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをさらに含む、実施形態６２に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６５．ＡＢＥ ｍＲＮＡが、本明細書に記載される５’ＵＴＲ、例えば、表１８のＵＴＲをさらに含む、実施形態６０に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６６．本明細書に記載されるＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡをさらに含む、実施形態６５に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６６．本明細書に記載されるＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡをさらに含む、実施形態６５に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６７．本明細書に記載されるＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをさらに含む、実施形態６５に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６８．前記ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布が、哺乳動物細胞において約１５％～約６０％のＰＣＳＫ９編集パーセント（％）をもたらす、実施形態５３に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６８．前記ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布が、哺乳動物細胞において約１５％～約６０％のＰＣＳＫ９編集パーセント（％）をもたらす、実施形態５３に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
６９．前記ＰＣＳＫ９編集％が約５０％～６０％である、実施形態６８に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７０．前記ＰＣＳＫ９編集％が約４０％～約５０％である、実施形態６９に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７０．前記ＰＣＳＫ９編集％が約４０％～約５０％である、実施形態６９に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７１．前記ＰＣＳＫ９編集％が約３０％～約４０％である、実施形態７０に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７２．前記ＰＣＳＫ９編集％が約２０％～約３０％である、実施形態７１に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７２．前記ＰＣＳＫ９編集％が約２０％～約３０％である、実施形態７１に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７３．受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い編集パーセントによって決定されるとおり、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供する、実施形態５３から７２のいずれか１つに記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７４．前記編集パーセントが、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５０％高い、実施形態７３に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７５．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い編集パーセントによって決定されるとおり、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供する、実施形態７２に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７５．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い編集パーセントによって決定されるとおり、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供する、実施形態７２に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７６．前記編集パーセントが、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５０％高い、実施形態７５に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７７．前記受容体ターゲティングコンジュゲートが、式（Ｖ）：
７７．前記受容体ターゲティングコンジュゲートが、式（Ｖ）：
の化合物を含み、
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－、または結合であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、実施形態１に記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－、または結合であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、実施形態１に記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７８．前記受容体ターゲティングコンジュゲートが、式（ＶＩ）：
の化合物を含み、
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、実施形態１に記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、実施形態１に記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
７９．Ａが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体である、実施形態７６または７８に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
８０．実施形態５３から７９のいずれか１つに記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを導入するステップを含む遺伝子を編集する方法であって、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを導入するステップであって、前記ＮＨＰがＬＤＬｒノックアウトを有する、ステップを含む、方法。
８０．実施形態５３から７９のいずれか１つに記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを導入するステップを含む遺伝子を編集する方法であって、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを導入するステップであって、前記ＮＨＰがＬＤＬｒノックアウトを有する、ステップを含む、方法。
８１．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法であって、ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤、ならびに（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤を含み、
ａ．水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つを水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．抗酸化剤を前記第１の溶液と組み合わせるステップと；
ｄ．前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合するステップと；
ｅ．前記第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＬＮＰを形成するステップと；
ｆ．任意選択で、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを実行するステップと
を含む、方法。
ａ．水性緩衝液中に１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つを水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．抗酸化剤を前記第１の溶液と組み合わせるステップと；
ｄ．前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合するステップと；
ｅ．前記第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＬＮＰを形成するステップと；
ｆ．任意選択で、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを実行するステップと
を含む、方法。
また、本開示を再検討することにより、一組の条項に提示された１つまたは複数の態様もしくは特徴が、他の条項に含まれるか、または他の条項における１つまたは複数の態様もしくは特徴と組み合わせて含まれてもよいことが企図されることが理解されるであろう。
Claims (140)
- ＧａｌＮＡｃ－脂質ナノ粒子（ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法であって、前記ナノ粒子が（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤、（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤、ならびに（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含み、
ａ．水性緩衝液中に前記１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．（ｉ）前記１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つおよび（ｉｉ）前記受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部を水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．任意選択で、抗酸化剤を前記第１の溶液と組み合わせるステップと；
ｄ．前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合するステップと；
ｅ．前記第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを形成するステップと；
ｆ．任意選択で、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを実行するステップと
を含む、方法。 - ステップａおよびｂが同時に行われる、請求項１に記載の方法。
- ステップａおよびｂが連続して行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記水性緩衝液がポリエチレングリコールを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリエチレングリコールが、約２００～約１０００の範囲（例えば、約２００、約４００、約５００、約６００、または約１０００）の数平均分子量を有する、請求項４に記載の方法。
- 水溶液中でＧａｌＮＡｃ－脂質を希釈して、希釈ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液を生成するステップをさらに含む、請求項１から５に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、対象への直接投与用に構成されている、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
- 溶液中で前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを１回または複数回希釈するステップをさらに含む、請求項１から８に記載の方法。
- 前記水混和性有機溶媒を緩衝溶液と１回または複数回交換するステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮するステップが、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを膜に通過させるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
- 第２の濃縮プロセスをさらに含み、前記第２の濃縮が、交換緩衝液を膜に通過させることによって前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
- 膜を通して前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濾過するステップをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
- ステップｅの後に第２のインキュベーションをさらに含み、インキュベーションが、約１分～約１２０分行われる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを摂氏約－８０度（℃）～約２５℃の温度で保存するステップをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを摂氏約－８０度（℃）または約２℃～約８℃の温度で保存するステップをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
- （ｉ）保存されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを解凍するステップ、（ｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰをプールするステップ、（ｉｉｉ）溶液中でＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを希釈するステップ、および（ｉｖ）対象に前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの用量を投与する前に膜を通して前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濾過するステップをさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を実施する順序が逆にされる、請求項１７に記載の方法。
- 前記混和性有機溶媒がエタノールである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗酸化剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の溶液が、全ての前記受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記受容体ターゲティングコンジュゲートの少なくとも一部が、前記混合するステップの前に１つまたは複数の脂質と組み合わせられる、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合が、インラインミキサー、クロスミキサー、またはＴミキサー装置で行われる、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合が、層流混合、ボルテックス混合、乱流混合、またはそれらの組合せを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
- 接線流濾過（ＴＦＦ）プロセスを使用して、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを濃縮するステップをさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
- クロマトグラフィー、透析、またはＴＦＦプロセスを使用して、緩衝液交換を行うステップをさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記受容体ターゲティングコンジュゲートが、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートが、表４で特定される構造から選択される、請求項２７に記載の方法。
- 前記混合が、前記第１の溶液を前記第１の混合チャンバに別々に導入する第１のポートと、前記第２の溶液を前記第１の混合チャンバに別々におよび同時に導入する第２のポートとを備える、第１の混合チャンバを有するインライン混合装置によって行われる、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の溶液がＲＮＡを含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートの濃度（ｍｏｌ％）が、約０．０１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％である、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中性脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステルス脂質が、ポリエチレングリコール－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の溶液中の前記ステルス脂質の濃度が、０ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸薬剤の濃度が、約０．１～約５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、４、または５ｍｇ／ｍＬ）である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物が、約１分～約２４時間インキュベートされる、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物が、約１分～約１２０分間インキュベートされる、請求項３６に記載の方法。
- 前記混合物が、約１時間インキュベートされる、請求項３７に記載の方法。
- 最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液が、Ｔｒｉｓ緩衝液を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
- 最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液が、凍結保護剤をさらに含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記凍結保護剤がスクロースである、請求項４０に記載の方法。
- 前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度が、約０．１ｍＭ～約５００ｍＭである、請求項４０または４１に記載の方法。
- 前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度が、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭである、請求項４２に記載の方法。
- 前記最終溶液中の前記凍結保護剤の濃度が、約３００ｍＭである、請求項４３に記載の方法。
- ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、摂氏約－８０度（℃）の温度で保存される、請求項４３または４４に記載の方法。
- 最終的なＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ溶液が、凍結保護剤をさらに含まない、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約２℃～約８℃で保存される、請求項４６に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約６～約９のｐＨを有する溶液中にある、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約７～８（例えば、７～８、７．２～７．８、７．３～７．７、または７．４～７．６）のｐＨを有する溶液中にある、請求項４８に記載の方法。
- 総体積に対して少なくとも０．０１（例えば、少なくとも０．０１、０．０５、０．１、または０．５）ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
- 総体積に対して少なくとも１ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
- 総体積に対して少なくとも３ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
- 総体積に対して少なくとも５ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
- 総体積に対して少なくとも７ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
- 総体積に対して少なくとも９ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
- 総体積に対して少なくとも１０ｍｏｌ％の濃度で前記第２の溶液中に前記受容体ターゲティングコンジュゲートを導入するステップをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
- 請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰであって、前記ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布が実質的に均一である、ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－脂質が、約０．０１～０．５ｍｏｌ％の濃度で前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰに存在する、請求項５７に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- ＬＤＬ－受容体（ＬＤＬｒ）遺伝子およびＣａｓ９ ｍＲＮＡを標的とする１つまたは複数のｇＲＮＡを含むＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを哺乳動物に投与する方法であって、１つまたは複数の前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを含む用量を前記哺乳動物に投与し、それによって前記用量を投与していない対応する対象と比較して、血液中のＬＤＬ－Ｃレベルを少なくとも３００％増加させるステップを含む、方法。
- 前記ＬＤＬ－Ｃレベルが少なくとも３５０％増加する、請求項５９に記載の方法。
- 前記ＬＤＬ－Ｃレベルが少なくとも４００％増加する、請求項６０に記載の方法。
- 前記ＬＤＬ－Ｃレベルが少なくとも５００％増加する、請求項６１に記載の方法。
- 前記ＬＤＬｒ遺伝子が少なくとも約４０％（例えば、少なくとも５０、６０、７０、８０、または９０％）編集される、請求項５９に記載の方法。
- 前記ＬＤＬ－Ｃレベルが少なくとも６００％増加する、請求項６３に記載の方法。
- 前記１つまたは複数のｇＲＮＡが、ＧＡ４６８／ＧＡ４７０および／またはＧＡ４６９／ＧＡ４７１を含む、請求項５９から６４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｃａｓ９ ｍＲＮＡがＭＳ００４である、請求項５９から６５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（例えば、カニクイザル）である、請求項５９から６６のいずれか一項に記載の方法。
- アデニンベースエディター（ＡＢＥ）ｍＲＮＡをさらに含む、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ｍＲＮＡがＭＡ００４である、請求項６８に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ＡＢＥ ｍＲＮＡが、本明細書に記載される３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、表１９のＵＴＲをさらに含む、請求項６８に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 本明細書に記載されるＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡをさらに含む、請求項７０に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 本明細書に記載されるＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをさらに含む、請求項７０に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ＡＢＥ ｍＲＮＡが、本明細書に記載される５’ＵＴＲ、例えば、表１９のＵＴＲを含むことをさらに含む、請求項６８に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 本明細書に記載されるＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡをさらに含む、請求項７３に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 本明細書に記載されるＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをさらに含む、請求項７３に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ＬＮＰにわたるＧａｌＮＡｃ－脂質の分布が、哺乳動物細胞において約１５％～約６０％のＰＣＳＫ９編集パーセント（％）をもたらす、請求項５７に記載のＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ＰＣＳＫ９編集％が約５０％～６０％である、請求項７６に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ＰＣＳＫ９編集％が約４０％～約５０％である、請求項７７に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ＰＣＳＫ９編集％が約３０％～約４０％である、請求項７８に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ＰＣＳＫ９編集％が約２０％～約３０％である、請求項７９に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い編集パーセントによって決定されるとおり、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供する、請求項１から５８のいずれか一項に方法によって作製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰまたは請求項６８から８０のいずれか一項に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記編集パーセントが、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５０％高い、請求項８１に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５％高い編集パーセントによって決定されるとおり、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）を欠く哺乳動物において改善された送達を提供する、請求項８０に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記編集パーセントが、受容体ターゲティングコンジュゲートのない対応するＬＮＰよりも少なくとも５０％高い、請求項８３に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 前記受容体ターゲティングコンジュゲートが、式（Ｖ）：
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（ＯＲ１）－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｏ－］Ｏ－、－Ｏ［（Ｐ＝Ｏ）Ｓ－］Ｏ－、－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ－、－Ｓ－Ｓ－、または結合であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、請求項１に記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。 - 前記受容体ターゲティングコンジュゲートが、式（ＶＩ）：
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
各Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０およびＬ１２は独立して、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２アルキレン、置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１２ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２～Ｃ１２アルキニレン、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）（＝ＮＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒ１）－、または－Ｎ（ＯＲ１）－であり；
Ｌ１１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－、または結合であり；
各Ｒ１は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ６アルキルであり；
Ｒは、親油性有機残基であり；
ｍは、１～１０から選択される整数であり；
ｎは、１～２００から選択される整数であり；
ｐは、１～２００から選択される整数である、請求項１に記載の方法に従って調製されたＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。 - Ａが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体である、請求項８５または８６に記載のＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰ。
- 請求項６８から８７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを導入するステップを含む遺伝子を編集する方法であって、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）またはヒト対象に前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを投与するステップを含む、方法。
- 前記少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、末梢静脈（例えば、伏在または上腕）でのＩＶ注入を介して前記ＮＨＰに導入される、請求項８８に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの各々が独立して、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、または６ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項８８から８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＮＨＰが、前記少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの導入の前にステロイドで処置される、請求項８８から９０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの導入が、少なくとも１５日（例えば、約１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１８０日）の期間にわたって少なくとも約２０％（例えば、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％）の遺伝子編集をもたらす、請求項８８から９１のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも２つのＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、前記非ヒト霊長類に導入される、請求項８８から９２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、目的の１つまたは複数の遺伝子を標的とする２つ以上のｇＲＮＡおよびＡＢＥ ｍＲＮＡを含む、請求項８８から９３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、目的の１つまたは複数の遺伝子を標的とする２つ以上のｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む、請求項８８から９４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＮＨＰが、筋肉内注射により前記ステロイドで処置される、請求項９１に記載の方法。
- 前記ステロイドがデキサメタゾンを含む、請求項９１または９４に記載の方法。
- 前記ステロイドが、ファモチジンおよび／またはジフェンヒドラミンと同時投与される、請求項９７に記載の方法。
- ＬＤＬＲ ＫＤ／ＫＯ ＮＨＰを生成するために使用される、請求項５９から６７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＮＨＰが、ＬＤＬｒノックアウトを有する、請求項８８から９８のいずれか一項に記載の方法。
- 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む製剤を調製する方法であって、前記ナノ粒子が、（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤、ならびに（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤を含み、
ａ．水性緩衝液中に前記１つまたは複数の核酸活性剤を含む第１の溶液を用意するステップと；
ｂ．前記１つまたは複数の脂質賦形剤のうちの少なくとも１つを水混和性有機溶媒中に含む第２の溶液を用意するステップと；
ｃ．任意選択で、抗酸化剤を前記第１の溶液と組み合わせるステップと；
ｄ．前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合するステップと；
ｅ．前記第１および第２の溶液の混合物をインキュベートして、ＬＮＰを形成するステップと；
ｆ．任意選択で、希釈、緩衝液交換、濃縮、濾過、凍結、解凍、インキュベーションおよびＬＮＰ評価から選択される１つまたは複数のプロセスを実行するステップと
を含む、方法。 - 式（ＶＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩：
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分（例えば、
Ｌ１、Ｌ４、およびＬ７は、
Ｌ３、Ｌ６、およびＬ９は、
Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり；
Ｌ１０は、非置換のＣ２アルキレンであり；
Ｌ１１は、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ＋１－であり；
Ｒ１は、水素であり；
Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｒは、
ｎは、３３、３４、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数であり；または
Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり、Ｒは、非置換のＣ１８～Ｃ２０アルキルであり、ｎは、１、１１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数である、組成物。 - 前記化合物が、
１０８８（ｎ＝３３）
- 式（Ｖ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩：
式中、Ａは、受容体ターゲティング部分であり；
Ｌ１、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ７は、非置換のＣ４アルキレンであり；
Ｌ６、およびＬ９は、非置換のＣ３アルキレンであり；
Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり；
Ｌ１０は、非置換のＣ２アルキレンであり；
Ｌ１１は、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ＋１－であり；
Ｒ１は、水素であり；
Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｒは、
ｎは、３３、３４、３５、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数であり；または
Ｌ１２は、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）－もしくは－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－であり、Ｒは、非置換のＣ１８～Ｃ２０アルキルであり、
ｎは、１、１１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３から選択される整数である、組成物。 - 前記化合物が、
１１０１（ｎ＝３３）
１１５０（ｎ＝４３）
- ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを含む薬学的製剤であって、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、
（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤；
（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤；ならびに
（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲート
を含み、
前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、表１４、表１５、表１６、または表１７から選択される賦形剤のｍｏｌ％比を含む、薬学的製剤。 - 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰがアミノ脂質を含み、前記アミノ脂質がＶＬ４２２の構造
- ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰを含む薬学的製剤であって、前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、
（ｉ）１つまたは複数の核酸活性剤；
（ｉｉ）ステロールまたはその誘導体、リン脂質、ステルス脂質、およびアミノ脂質から選択される１つまたは複数の脂質賦形剤であって、
ＶＬ４２２の構造
（ｉｉｉ）ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲート
を含む、薬学的製剤。 - 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰがアミノ脂質を含み、前記アミノ脂質が、５０１、５０２、５０３の構造を有し、前記ステロールが、５０４もしくは５０５の構造を有し、または前記ステルス脂質が、５０６もしくは５０７の構造を有する、請求項１０６から１０８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰがステルス脂質を含み、前記脂質がＶＰ１５８の構造
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰがステルス脂質を含み、前記脂質がＶＰ１５９の構造
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、少なくとも２つのＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、請求項１０６から１１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記少なくとも２つのＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートが、少なくとも２つの異なるＧａｌＮＡｃリガンドを含む、請求項１１２に記載の薬学的組成物。
- 前記少なくとも２つのＧａｌＮＡｃ－脂質受容体が、２つの異なるＰＥＧ－脂質にコンジュゲートした２つの異なるＧａｌＮＡｃ－リガンドを含む、請求項１１２に記載の薬学的組成物。
- 前記少なくとも２つのＧａｌＮＡｃ－脂質受容体が、２つの異なるＰＥＧ－脂質にコンジュゲートした同じＧａｌＮＡｃ－リガンドを含む、請求項１１２に記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約０～１ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、請求項１０６から１１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約０～０．５ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、請求項１０６から１１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約０～０．２５ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、請求項１０６から１１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約０～０．１ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、請求項１０６から１１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約０～０．０５ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、請求項１０６から１１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約０～０．０１ｍｏｌ％の総ＧａｌＮＡｃ－脂質受容体ターゲティングコンジュゲートを含む、請求項１０６から１１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、ＧａｌＮＡｃ－脂質１０７９を含む、請求項１０６から１２１のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、ＧａｌＮＡｃ－脂質１００４を含む、請求項１０６から１２２のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約４０～６０ｍｏｌ％のアミノ脂質を含む、請求項１０６から１２３のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約４５ｍｏｌ％のアミノ脂質を含む、請求項１０６から１２４のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約５０ｍｏｌ％のアミノ脂質を含む、請求項１０６から１２４のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約５５ｍｏｌ％のアミノ脂質を含む、請求項１０６から１２４のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約３４～３５（例えば、３４．１、３４．６、または３４．９）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む、請求項１０６から１２７のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約３７．１～３７．３（例えば、３７．２）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む、請求項１０６から１２７のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約３７．６～３７．８（例えば、３７．７）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む、請求項１０６から１２７のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約３７．９～３８．０（例えば、３７．９５）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む、請求項１０６から１２７のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約３８．１～３８．３（例えば、３８．２）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む、請求項１０６から１２７のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約３８．３～３８．５（例えば、３８．４）ｍｏｌ％のコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む、請求項１０６から１２７のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約４～１０（例えば、４．７、９、または１０）ｍｏｌ％の中性脂質を含む、請求項１０６から１３３のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰが、約１～３（例えば、１．３、１．６、２．１、または３）ｍｏｌ％のステルス脂質を含む、請求項１０６から１３４のいずれかに記載の薬学的組成物。
- ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの表面上のＧａｌＮＡｃ脂質の量をアッセイする方法であって、
ａ．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰをＡＳＰＧＲタンパク質と接触させるステップであって、前記ＡＳＰＧＲタンパク質が検出マーカーで標識されている、ステップと；
ｂ．前記ＧａｌＮＡｃ－ＬＮＰの存在下で前記検出マーカーのシグナルシフトを測定するステップと
を含む、方法。 - 前記シグナルシフトが光学シフトである、請求項１３６に記載の方法。
- 前記シグナルシフトが、生体層干渉法を使用して測定される、請求項１３６から１３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出マーカーがＨｉｓタグである、請求項１３６から１３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＳＰＧＲタンパク質が、組換えヒトＡＳＰＧＲタンパク質である、請求項１３６から１３９のいずれか一項に記載の方法。
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