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CN115484932B - 用于靶向rna递送的组合物和方法 - Google Patents

用于靶向rna递送的组合物和方法 Download PDF

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CN115484932B
CN115484932B CN202180033341.7A CN202180033341A CN115484932B CN 115484932 B CN115484932 B CN 115484932B CN 202180033341 A CN202180033341 A CN 202180033341A CN 115484932 B CN115484932 B CN 115484932B
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利萨·N·卡西维奇
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卡罗琳·瑞斯
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Abstract

本文提供了组合物、其制备方法以及用于靶向递送治疗性药剂以改变靶基因(例如参与脂质和胆固醇代谢的蛋白质，例如PCSK9)的表达和功能的方法。本文还提供了治疗冠状动脉疾病相关病况的组合物和方法。

Description

用于靶向RNA递送的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年9月16日提交的美国临时申请第63/078,982号和2020年3月4日提交的美国临时申请第62/984,866号的权益，这些申请在此通过引用以其整体并入。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且该序列表在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2021年3月3日，命名为53989706601_SL.txt，并且大小为67,230字节。
技术领域
本发明涉及用于靶向递送治疗性药剂(例如CRISPR-指导RNA和其他核酸药剂)的组合物和方法。
背景技术
本文中的所有出版物均通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被明确且单独地指出通过引用并入。以下描述包括可用于理解本发明的信息。这并非承认本文提供的信息中的任一个是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或隐含引用的任何出版物是现有技术。
发明内容
在一方面，本文描述了一种受体靶向缀合物，其包含式(V)的化合物：
其中，
多个A基团共同包含受体靶向配体；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-或-N(OR1)-；
L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-，或者取代或未取代的-(OCH2CH2)n-；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R为脂质、核酸、氨基酸、蛋白质或脂质纳米颗粒；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
在一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C2-C6亚烷基。在一些实施方案中，L1、L4和L7各自为C4亚烷基。在一些实施方案中，L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-或-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-或-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L2、L5和L8各自为-C(＝O)NH-。在一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L3各自为取代或未取代的C2-C6亚烷基。在一些实施方案中，L3为C4亚烷基。在一些实施方案中，L6和L9各自独立地为取代或未取代的C2-C10亚烷基。在一些实施方案中，L6和L9各自独立地为取代或未取代的C2-C6亚烷基。在一些实施方案中，L6和L9各自为C3亚烷基。在一方面，本文描述了一种受体靶向缀合物，其包含式(VI)的化合物：
其中，
多个A基团共同包含受体靶向配体；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-或-N(OR1)-；
L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-，或者取代或未取代的-(OCH2CH2)n-；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R为脂质、核酸、氨基酸、蛋白质或脂质纳米颗粒；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
在一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基，或者取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为包含1-10个O原子的取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为-(CH2CH2O)p1-(CH2)q1-；其中p1为1-8；并且q1为1-6。在一些实施方案中，L1、L4和L7各自为-(CH2CH2O)3-(CH2)2-。在一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C2-C6亚烷基。在一些实施方案中，L1、L4和L7各自为C4亚烷基。在一些实施方案中，L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-或-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-或-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L2、L5和L8各自为-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，L2、L5和L8各自为-C(＝O)NH-。在一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为包含1-10个O原子的取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为-(CH2CH2O)p2-(CH2CH2CH2O)q2-；其中p2为1-8；并且q2为1-6。在一些实施方案中，L3、L6和L9各自为-(CH2CH2O)-(CH2CH2CH2O)-。在一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为-(CH2CH2CH2O)q3-；其中q3为1-8。在一些实施方案中，L3、L6和L9各自为-(CH2CH2CH2O)2-。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C1-C4亚烷基。在一些实施方案中，L10为C2亚烷基。在一些实施方案中，L11为-(OCH2CH2)n-。在一些实施方案中，n为1-100。在一些实施方案中，n为2-50。在一些实施方案中，n为2、12、37或45。在一些实施方案中，L12为-O-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-或-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为-C(＝O)O-或-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为-NHC(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，A结合至凝集素。在一些实施方案中，凝集素是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，A为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或衍生物或其衍生物。A为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物。在一些实施方案中，每个R1独立地为H或-CH3。在一些实施方案中，每个R1为H。在一些实施方案中，R包括脂肪醇、脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮、甾醇脂质和异戊烯醇脂质(prenol lipid)中的一种或多种。在一些实施方案中，R包括一种或多种脂肪醇。在一些实施方案中，每种脂肪醇独立地为饱和、单不饱和或多不饱和脂肪醇。在一些实施方案中，脂肪醇包含一种或多种C2-C26脂肪醇。在一些实施方案中，脂肪醇包含两种或更多种C2-C26脂肪醇。在一些实施方案中，每种脂肪醇是C12、C14、C16、C18、C20或C22脂肪醇。在一些实施方案中，每种脂肪醇独立地为二十二碳六烯醇、二十碳五烯醇、油醇、硬脂醇、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基醇、(Z)-二十二碳-13-烯-1-基醇、二十二烷醇、(E)-十八碳-9-烯-1-基醇、二十碳烷醇、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯-1-基醇或棕榈醇。在一些实施方案中，每种脂肪醇是硬脂醇。在一些实施方案中，R包括一种或多种甾醇脂质。在一些实施方案中，R包括维生素中的一种或多种。在一些实施方案中，每种维生素独立地为维生素A、维生素D、维生素E或维生素K。在一些实施方案中，R包括核酸。在一些实施方案中，核酸是mRNA、指导RNA、siRNA、反义寡核苷酸、适体、微小RNA(microRNA)、免疫刺激性寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸(splice switchingoligonucleotide)、自扩增RNA、环状RNA或DNA，但不限于上述核酸。在一些实施方案中，R包括蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是基因编辑器蛋白、抗体、抗原结合抗体片段或肽，但不限于上述蛋白质。
在一方面，本文描述了一种受体靶向缀合物，其包含来自表4的化合物。
在一方面，本文描述了一种纳米颗粒组合物，其包含：(a)一种或多种核酸分子实体；以及(b)如本文所述的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，受体靶向缀合物占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.001mol％至约20mol％。在一些实施方案中，受体靶向缀合物占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.01mol％至约1mol％。在一些实施方案中，包含甾醇或其衍生物，占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的10mol％至70mol％。在一些实施方案中，甾醇或其衍生物是胆固醇或胆固醇衍生物。在一些实施方案中，胆固醇或胆固醇衍生物占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至50mol％。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含磷脂，磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的1mol％至20mol％。在一些实施方案中，磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约5mol％至约15mol％。在一些实施方案中，磷脂选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、2-油酰-1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和鞘磷脂。在一些实施方案中，磷脂是DSPC。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含隐形脂质(stealth lipid)，隐形脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的0.1mol％至6mol％。在一些实施方案中，隐形脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约2.0mol％至约2.5mol％。在一些实施方案中，隐形脂质是数均分子量为约200Da至约5000Da的PEG-脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含氨基脂质，氨基脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约10mol％至约60mol％。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含抗氧化剂。在一些实施方案中，抗氧化剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子实体包含靶向肝细胞中产生的致病目的基因的单指导RNA(sgRNA)或指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子实体包含编码Cas核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子实体中的至少一种包含化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰是2’-F修饰、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、4’-O-甲基或2’-ara-F修饰。在一些实施方案中，化学修饰是2’-O-甲基修饰。
在一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的受体靶向缀合物或本文所述的纳米颗粒组合物，以及赋形剂或载体。在一些实施方案中，药物组合物包含编码基因编辑器核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种指导RNA分子。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种指导RNA分子。在一些实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向两个或更多个目的基因。在一些实施方案中，mRNA编码Cas9核酸酶。在一些实施方案中，mRNA编码碱基编辑器核酸酶。在一些实施方案中，mRNA和一种或多种指导RNA分子存在于同一纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，mRNA和一种或多种指导RNA分子存在于不同的纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA分子与mRNA的比为约0.01至约100(按重量计或按摩尔计)。在一些实施方案中，所述药物组合物中所述gRNA分子与所述mRNA的比为约50∶1、约40∶1、约30∶1、约20∶1、约18∶1、约16∶1、约14∶1、约12∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10(按重量计或按摩尔计)。
在一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)如本文所述的第一受体靶向缀合物或第一纳米颗粒组合物，以及(b)如本文所述的第二受体靶向缀合物或第二纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，第一纳米颗粒组合物包含基因编辑器mRNA。在一些实施方案中，第二纳米颗粒组合物包含一种或多种指导RNA分子。在一些实施方案中，所述药物组合物中指导RNA分子与mRNA的比为约50∶1、约40∶1、约30∶1、约20∶1、约18∶1、约16∶1、约14∶1、约12∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10(按重量计或按摩尔计)。
在一方面，本文提供了一种将核酸递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与如本文所述的纳米颗粒组合物或药物组合物接触，由此将核酸递送至所述细胞。在一些实施方案中，使细胞在体内、离体或体外接触。
在一方面，本文提供了一种在细胞中产生目的多肽的方法，该方法包括使所述细胞与如本文所述的纳米颗粒组合物或药物组合物接触，由此核酸能够在所述细胞中翻译，以产生多肽。
在一方面，本文提供了一种治疗对象的疾病或病况的方法，该方法包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，疾病或病况是冠状动脉疾病。在一些实施方案中，对象是低密度脂蛋白受体(LDLR)缺陷型的。在一些实施方案中，对象具有杂合性家族性高胆固醇血症(HeFH)、纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH)或临床动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)。在一些实施方案中，对象处于心血管事件的高风险中。在一些实施方案中，尽管最大限度地耐受降脂疗法，但对象仍需要另外降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
在一方面，本文提供了一种将核酸分子实体递送至对象肝脏的方法，该方法包括向对象施用如本文所述的药物组合物，从而递送核酸分子实体。
在一方面，本文描述了一种核苷酸缀合物，其包含：(a)核酸，以及(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，其中靶向部分包含表1的结构。在一些实施方案中，靶向部分还包含与(a)中的核酸杂交的偶联序列。在一方面，本文描述了一种核苷酸缀合物，其包含：(a)核酸，以及(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，其中靶向部分包含与(a)中的核酸杂交的偶联序列。在一些实施方案中，核酸包括单链、双链、部分双链或发夹茎环核酸，并且其中靶向部分是受体靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分结合至凝集素。在一些实施方案中，凝集素是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，靶向部分包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，靶向部分包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物以及间隔区。在一些实施方案中，靶向部分包含一个或多个半乳糖或半乳糖衍生物。在一些实施方案中，靶向部分包含一个或多个半乳糖或半乳糖衍生物以及间隔区。在一些实施方案中，间隔区包括聚乙二醇、取代或未取代的C1-C12亚烷基或两者，其中聚乙二醇具有1至5个重复单元。在一些实施方案中，靶向部分通过一个或多个接头与核酸的一条或多条链连接。在一些实施方案中，靶向部分包含表1的结构。在一些实施方案中，偶联序列与(a)中的核酸杂交。在一些实施方案中，偶联序列与(a)中的核酸的延伸部分杂交。在一些实施方案中，靶向部分附接至核酸序列的5’端、核酸序列的3’端或核酸序列的中间。在一些实施方案中，靶向部分包含至少两个GalNAc或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，靶向部分包含至少三个GalNAc或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物经由靶向部分中的接头、经由与(a)中的核酸杂交的靶向部分中偶联序列的杂交，或经由其组合与(a)中的核酸连接。在一些实施方案中，靶向部分包含至少两个半乳糖或半乳糖衍生物。在一些实施方案中，靶向部分包含至少三个半乳糖或半乳糖衍生物。在一些实施方案中，半乳糖或半乳糖衍生物经由靶向部分中的接头、经由与(a)中的核酸杂交的靶向部分中偶联序列的杂交，或经由其组合与(a)中的核酸连接。在一些实施方案中，靶向部分包含至少两个与(a)中的核酸杂交的偶联序列。在一些实施方案中，至少两个偶联序列相同。在一些实施方案中，至少两个偶联序列不同。在一些实施方案中，核苷酸缀合物还包含第二靶向部分。在一些实施方案中，第二靶向部分结合至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，第二靶向部分通过间隔区和/或通过一个或多个接头与核酸的一条或多条链连接。在一些实施方案中，第二靶向部分包含GalNAc或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，第二靶向部分包含至少三个GalNAc部分或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物经由靶向部分中的接头、经由与(a)中的核酸杂交的靶向部分中偶联序列的杂交，或经由其组合与(a)中的核酸连接。在一些实施方案中，第二靶向部分包含半乳糖或半乳糖衍生物。在一些实施方案中，第二靶向部分包含至少三个半乳糖部分或半乳糖衍生物。在一些实施方案中，半乳糖或半乳糖衍生物经由靶向部分中的接头、经由与(a)中的核酸杂交的靶向部分中偶联序列的杂交，或经由其组合与(a)中的核酸连接。在一些实施方案中，第二靶向部分包含表1的结构。在一些实施方案中，第二靶向部分包含与核酸杂交的偶联序列。在一些实施方案中，第二靶向部分附接至核酸的5’端、核酸的3’端或核酸的中间。在一些实施方案中，(a)中的核酸包含RNA或DNA。在一些实施方案中，偶联序列包含RNA、DNA、化学修饰的RNA、化学修饰的DNA、、或DNA和RNA的杂交体。在一些实施方案中，偶联序列包含(a)、(c)、(g)、(u)、(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n中的一个或多个，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，其中c为2’-O-甲基胞苷(2’-OMe-C)，其中g为2’-O-甲基胞苷鸟嘌呤(2’-OMe-G)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。在一些实施方案中，偶联序列包含(a)、(c)、(g)、(u)、(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n中的一个或多个，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，其中c为2’-O-甲基胞苷(2’-OMe-C)，其中g为2’-O-甲基胞苷鸟嘌呤(2’-OMe-G)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。在一些实施方案中，(a)、(c)、(g)或(u)沿着核酸或偶联序列分散。在一些实施方案中，核酸和偶联序列在杂交双链体内包含一个或多个G-C碱基配对，其中偶联序列与核酸杂交，并且其中所述一个或多个G-C碱基配对提高了杂交双链体的稳定性。在一些实施方案中，接头包括共价接头。在一些实施方案中，接头包括非共价接头。在一些实施方案中，接头包括单价接头、二价接头、三价接头或其组合。在一些实施方案中，接头包括可生物切割的接头。在一些实施方案中，接头包括不可生物切割的接头。在一些实施方案中，接头包括磷酸酯、硫代磷酸酯、酰胺、醚、肟、肼或氨基甲酸酯。在一些实施方案中，接头是磷酸酯或硫代磷酸酯。在一些实施方案中，(a)中的核酸包含化学修饰。在一些实施方案中，(a)中的核酸包含2’-F修饰、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、4’-O-甲基或2’-ara-F修饰。在一些实施方案中，核酸包含2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，核酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。在一些实施方案中，核酸能够与基因组的靶基因内的靶序列杂交。在一些实施方案中，核酸包括mRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、微小RNA、抗微小RNA或antimir、supermir、antagomir、核酶、三链体形成寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、免疫刺激性寡核苷酸、RNA激活剂、U1衔接子、指导RNA或其任何组合。在一些实施方案中，核酸编码蛋白质。在一些实施方案中，核酸是CRISPR酶。在一些实施方案中，核酸是能够与CRISPR酶形成复合体的指导RNA。在一些实施方案中，指导RNA是单指导RNA或双指导RNA。在一些实施方案中，CRISPR酶选自Cas9、Cpf1、CasX、CasY、C2c1、C2c3以及碱基编辑器融合蛋白。在一些实施方案中，核酸还包括编码CRISPR酶的mRNA。在一些实施方案中，CRISPR酶导致靶序列的改变。在一些实施方案中，靶基因参与脂质代谢途径。在一些实施方案中，靶基因选自PCSK9、ANGPTL3、APOC3、LPA、APOB、MTP、ANGPTL4、ANGPTL8、APOA5、APOE、LDLR、IDOL、NPC1L1、ASGR1、TM6SF2、GALNT2、GCKR、LPL、MLXIPL、SORT1、TRIB1、MARC1、ABCG5和ABCG8。在一些实施方案中，指导RNA包含选自表3序列的序列。在一些实施方案中，指导RNA包含选自表5序列的序列。
在一方面，本文描述了一种颗粒，其包含所述核苷酸缀合物和所述CRISPR酶。在一些实施方案中，颗粒是脂质纳米颗粒、脂质体、无机纳米颗粒或RNP。
在一方面，本文描述了一种细胞，其包含前述权利要求中任一项的核苷酸缀合物。在一些实施方案中，细胞是原核细胞、真核细胞、脊椎动物细胞、小鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人类细胞。
在一方面，本文描述了一种药物组合物，其包含所述核苷酸缀合物、颗粒或细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的佐剂、稀释剂、载体、防腐剂、赋形剂、缓冲液、稳定剂或其组合。在一些实施方案中，载体包括溶剂、分散介质、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、脂质、类脂质(lipidoids)、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物或其组合。
在一方面，本文描述了一种试剂盒，其包含所述核苷酸缀合物。
在一方面，本文描述了一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用有效量的所述核苷酸缀合物。在一方面，本文描述了一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含(a)核酸，以及(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，其中靶向部分包含表1的结构。在一方面，本文描述了一种将核酸递送至对象肝脏的方法，该方法包括向对象施用与靶向部分连接的所述核酸，其中靶向部分包含表1的结构。在一些实施方案中，靶向部分还包含与(a)中的核酸杂交的偶联序列。在一方面，本文描述了一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含(a)核酸，以及(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，其中靶向部分包含与(a)中的核酸杂交的偶联序列。在一方面，本文描述了一种将核酸递送至对象肝脏的方法，该方法包括向对象施用与靶向部分连接的所述核酸，其中靶向部分包含与核酸杂交的偶联序列。在一些实施方案中，核酸包括单链、双链、部分双链或发夹茎环核酸，并且其中靶向部分是受体靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分结合至凝集素。在一些实施方案中，凝集素是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，靶向部分包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，靶向部分包含至少三个GalNAc或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，靶向部分包含一个或多个半乳糖或半乳糖衍生物。在一些实施方案中，靶向部分包含至少三个半乳糖或半乳糖衍生物。在一些实施方案中，核酸包含(i)指导RNA和核酸酶mRNA，或(ii)与核酸酶RNP复合的指导RNA，并且其中指导RNA能够将核酸酶引导至靶基因中的靶序列。在一些实施方案中，指导RNA包括单指导RNA或双指导RNA。在一些实施方案中，核酸酶是CRISPR酶。在一些实施方案中，CRISPR酶选自Cas9、Cpf1、CasX、CasY、C2c1、C2c3以及碱基编辑器融合蛋白。在一些实施方案中，CRISPR酶导致靶序列的改变。在一些实施方案中，施用导致对象肝脏中靶基因的表达减少。在一些实施方案中，与对象的对照组织相比，对象肝脏中靶基因的表达减少了至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或大于99.99％。在一些实施方案中，靶基因与冠状动脉疾病相关。在一些实施方案中，靶基因选自PCSK9、ANGPTL3、APOC3、LPA、APOB、MTP、ANGPTL4、ANGPTL8、APOA5、APOE、LDLR、IDOL、NPC1L1、ASGR1、TM6SF2、GALNT2、GCKR、LPL、MLXIPL、SORT1、TRIB1、MARC1、ABCG5和ABCG8。在一些实施方案中，偶联序列包含RNA、DNA、化学修饰的RNA、化学修饰的DNA、或DNA和RNA的杂交体。在一些实施方案中，偶联序列包含(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。在一些实施方案中，(a)中的核酸包含(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷，并且其中u为2’-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，靶向部分经由靶向部分中的接头、经由与(a)中的核酸杂交的靶向部分中偶联序列的杂交，或经由其组合与(a)中的核酸连接。在一些实施方案中，接头包括共价接头。在一些实施方案中，接头包括磷酸酯、硫代磷酸酯、酰胺、醚、肟、肼或氨基甲酸酯。在一些实施方案中，接头是磷酸酯或硫代磷酸酯。在一些实施方案中，(a)中的核酸包含化学修饰。在一些实施方案中，(a)中的核酸包含2’-F修饰、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)或2’-ara-F修饰。在一些实施方案中，核酸包含2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，核酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。在一些实施方案中，在递送后至少1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、2天、1周、2周、3周、6周或8周，与对象的其他组织相比，对象肝脏中的核酸水平高至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍。在一些实施方案中，有效量为约1mg/kg至约10mg/kg。在一些实施方案中，施用导致有需要的对象的血液甘油三酯减少和/或低密度脂蛋白胆固醇减少。在一些实施方案中，施用通过静脉内、鞘内、肌内、心室内、大脑内、小脑内、脑室内、实质内(intraperenchymally)、皮下或其组合进行。
在一方面，本文描述了一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用药物组合物，该药物组合物包含(a)(i)单指导RNA和核酸酶mRNA，(ii)双指导RNA和核酸酶mRNA，(iii)单指导RNA和RNP，或(iv)双指导RNA和RNP；以及(b)与(a)中的核酸连接的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)靶向部分，其中单指导RNA或双指导RNA包含4个或更多个2’-O-甲基修饰以及2个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中靶向部分包含表1的结构，并且其中指导RNA与PCSK9基因杂交。在一方面，本文描述了一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用药物组合物，该药物组合物包含(a)(i)单指导RNA和核酸酶mRNA，(ii)双指导RNA和核酸酶mRNA，(iii)单指导RNA和RNP，或(iv)双指导RNA和RNP；以及(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，其中单指导RNA或双指导RNA包含4个或更多个2’-O-甲基修饰以及两个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中靶向部分包含与(a)中的单指导RNA杂交的偶联序列，并且其中指导RNA与PCSK9基因杂交。在一些实施方案中，核酸酶mRNA和/或单指导RNA包含至少一个化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰选自2’-F修饰、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、4’-O-甲基和2’-ara-F修饰。在一些实施方案中，与不含所述化学修饰的对照核酸缀合物相比，施用核酸缀合物导致免疫应答水平降低。
在一方面，本文描述了一种核苷酸缀合物，其包含式(IV)的结构
其中每个X独立地为H或保护基团，RA为-OX或-NHAc，Y为O或S，并且W表示
(a)(i)单指导RNA和核酸酶mRNA，(ii)双指导RNA和核酸酶mRNA，(iii)单指导RNA和RNP，或(iv)双指导RNA和RNP；或
(b)偶联序列。
在一些实施方案中，一个或多个接头包含选自以下的结构：
在一些实施方案中，接头中的每一个独立地具有-(L1)k1-(L2)k2-(L3)k3-(L4)k4-的结构，其中k1、k2、k3和k4中的每一个独立地为0、1或2，并且L1、L2、L3和L4中的每一个独立地选自-O-、-S-、S(＝O)1-2-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-NRL-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-NRLC(＝O)NRL-、-P(＝O)RL-、-NRLS(＝O)(＝NRL)-、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-N＝N-、-(CH2-CH2-O)1-6-、直链或支链C1-6亚烷基、直链或支链C2-6亚烯基、直链或支链C2-6亚炔基、C3-C8环亚烷基、C2-C7杂环亚烷基、C6-C10亚芳基和C5-C9杂亚芳基，其中亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基被取代或未被取代，并且其中每个RL独立地为H、D、氰基、卤素、取代或未取代的C1-C6烷基、-CD3、-OCH3、-OCD3、取代或未取代的C1-C6卤代烷基、取代或未取代的C1-C6杂烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C2-C7杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，每个RL独立地为H、取代或未取代的C1-C6烷基、-OCH3、取代或未取代的C1-C6卤代烷基、取代或未取代的C1-C6杂烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基，或者取代或未取代的C2-C7杂环烷基。在一些实施方案中，k1、k2、k3和k4的总和为1、2或3。
在一方面，本文描述了一种制备包含纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，该方法包括：(a)提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；(c)混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；(d)将受体靶向缀合物与步骤(c)中产生的纳米颗粒混合；(e)孵育纳米颗粒；以及(f)任选地进行缓冲液交换过程。在一些实施方案中，在(c)的混合步骤之后，将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物添加在稀释缓冲液中，并且其中将稀释缓冲液与从在线混合室出来的预形成的核酸-脂质纳米颗粒混合，从而形成纳米颗粒。在一些实施方案中，在向混合物中添加稀释缓冲液并将稀释的混合物保持一段时间之后，引入受体靶向缀合物。在一些实施方案中，保持时间为1至120分钟。在一些实施方案中，保持时间为1至90分钟、1至60分钟或10至40分钟。在一些实施方案中，保持时间为约30分钟。在一些实施方案中，在缓冲液交换之后，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。在一些实施方案中，在缓冲液交换和浓缩之后，但在储存之前，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。在一些实施方案中，在储存和解冻之后且在给药或评估之前，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。在一方面，本文描述了一种制备包含纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，该方法包括：(a)提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；(c)在线混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；(d)在线混合受体靶向缀合物和步骤(c)的混合物，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体、一种或多种脂质以及受体靶向缀合物；(e)通过添加稀释缓冲液稀释步骤(d)的混合物；以及(f)任选地进行缓冲液交换过程。在一些实施方案中，步骤(c)的在线混合和步骤(d)的在线混合依次进行。在一方面，本文描述了一种制备包含纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，该方法包括：(a)提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含(i)一种或多种脂质中的至少一种以及(ii)受体靶向缀合物的至少一部分的第二溶液；(c)混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物；(d)任选地孵育纳米颗粒；以及(e)任选地进行缓冲液交换过程。在一些实施方案中，第二溶液包含所有受体靶向缀合物。在一方面，本文描述了一种制备包含纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，该方法包括：(a)提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；(c)混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；(d)将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合，其中在混合步骤之前或同时，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合；(e)任选地孵育纳米颗粒；以及(f)任选地进行缓冲液交换过程。在一些实施方案中，在混合步骤的同时，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，在混合步骤之前，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物与第二溶液中的一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物的一部分与第二溶液中的一种或多种脂质组合，并且在混合之后，将受体靶向缀合物的一部分与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物的一部分与第二溶液中的一种或多种脂质组合，并且在孵育步骤之后，将受体靶向缀合物的一部分与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物的一部分与第二溶液中的一种或多种脂质组合，并且在缓冲液交换步骤之后，将受体靶向缀合物的一部分与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，该方法还包括通过添加稀释缓冲液来稀释通过混合第一溶液和第二溶液产生的混合物。在一些实施方案中，混合物在线稀释。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含受体靶向缀合物的至少一部分。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含隐形脂质的至少一部分。在一些实施方案中，第一溶液包含水性缓冲液。在一些实施方案中，第二溶液包含乙醇。在一些实施方案中，混合包括层流混合、涡流混合、湍流混合或其组合。在一些实施方案中，混合包括交叉混合。在一些实施方案中，混合包括在线混合。在一些实施方案中，混合包括通过第一入口通道引入第一溶液的至少一部分以及通过第二入口通道引入第二溶液的至少一部分，并且其中第一入口通道和第二入口通道之间的角度为约15至180度。在一些实施方案中，混合包括通过第三入口通道引入第一溶液的一部分。在一些实施方案中，缓冲液交换包括透析、色谱或切向流过滤(TFF)。在一些实施方案中，该方法还包括过滤步骤。在一些实施方案中，受体靶向缀合物包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，受体靶向缀合物包含一个或多个半乳糖或半乳糖衍生物。在一些实施方案中，受体靶向缀合物选自表4。在一些实施方案中，受体靶向缀合物是本文所述的靶向缀合物。在一些实施方案中，纳米颗粒包含本文所述的第一纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，制剂是本文所述的药物组合物。
在一方面，本文描述了一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过本文所述的方法制备。在一方面，本文描述了一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过包括以下步骤的方法制备：(a)提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；(c)混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；(d)将受体靶向缀合物与步骤(c)中产生的纳米颗粒混合；(e)孵育纳米颗粒；以及(f)任选地进行缓冲液交换过程。在一方面，本文描述了一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过包括以下步骤的方法制备：(a)提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；(c)混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；(d)将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合，其中在混合步骤之前或同时，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合；(e)任选地孵育纳米颗粒；以及(f)任选地进行缓冲液交换过程。在一方面，本文描述了一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过包括以下步骤的方法制备：(a)提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；(c)在线混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；(d)在线混合受体靶向缀合物和步骤(c)的混合物，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体、一种或多种脂质以及受体靶向缀合物；(e)通过添加稀释缓冲液稀释步骤(d)的混合物；以及(f)任选地进行缓冲液交换过程。在一方面，本文描述了一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过包括以下步骤的方法制备：(a)提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含(i)一种或多种脂质中的至少一种以及(ii)受体靶向缀合物的至少一部分的第二溶液；(c)混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物；(d)任选地孵育纳米颗粒；以及任选地进行缓冲液交换过程。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、参考文献、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地表明通过引用并入。在本文件与通过引用并入的那些文件之间用法不一致的情况下，并入的参考文献中的用法应被视为对本文件的用法的补充；对于不可调和的不一致性，以本文件中的用法为准。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别阐述。通过参照以下对利用本发明原理的说明性实施方案进行阐述的详细描述和附图，将更好地理解本发明的特征和优点，在附图中：
图1A-图1B示出了本文组合物的GalNAc-脂质掺入的HPLC色谱图。图1A显示了不存在GalNAc-脂质的参考LNP，图1B显示了由GalNAc-脂质构成的LNP。
图2示出了本文组合物中LNP制剂在原代人肝细胞中的体外PCSK9基因编辑效率。
图3示出了在眶后施用其中携带1∶1比的SpCas9 mRNA和PCSK9 gRNA的本文的LNP组合物之后，野生型、LDLr-/-和ApoE-/-小鼠肝脏中的PCSK9基因编辑。
图4示出了在眶后施用携带1∶1比的ABE mRNA和ANGPTL3gRNA的本文的LNP组合物之后，LDLr-/-小鼠肝脏中的ANGPTL3基因编辑。
图5示出了在眶后施用携带1∶1比的ABE mRNA和PCSK9gRNA的LNP之后，野生型和LDLr-/-小鼠肝脏中的PCSK9基因编辑。
图6示出了在眶后施用本文的LNP组合物之后，野生型雌性小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。
图7示出了在眶后施用本文的LNP组合物之后，野生型雌性小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。
图8示出了在眶后施用携带Cas9 mRNA和gRNA的本文的LNP组合物之后，LDLR-/-雌性小鼠肝细胞中的PCSK9编辑。
图9示出了将GalNAc-脂质引入至脂质纳米颗粒的四种通用过程。
图10示出了包括后添加GalNAc-脂质的用于制备脂质纳米颗粒的三种方案。
图11示出了包括后添加GalNAc-脂质的用于制备脂质纳米颗粒的三种方案。
图12示出了包括将GalNAc-脂质添加至LNP赋形剂中以及分开添加GalNAc-脂质的用于制备脂质纳米颗粒的三种方案。
图13示出了包括将GalNAc-脂质添加至LNP赋形剂中以及分开添加GalNAc-脂质的用于制备脂质纳米颗粒的两种方案。
图14示出了包括交叉混合GalNAc-脂质的用于制备脂质纳米颗粒的两种方案。
图15示出了在眶后施用携带1∶1比的PCSK9 ABE mRNA和指导RNA的本文的LNP组合物之后，LDLR-/-雌性小鼠肝细胞中的PCSK9编辑。
具体实施方式
为了提供对各种实施方案的透彻理解，阐述了本说明书的某些具体细节。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践本发明。在其他情况下，没有详细示出或描述公知的结构和/或方法，以避免不必要地模糊对实施方案的描述。除非上下文另有要求，否则在整个说明书和随后的权利要求书中，词语“包含(comprise)”及其变体，例如，“包含(comprises/comprising)”应以开放的、包容的意义来解释，即为“包括但不限于”。此外，本文提供的标题仅为了方便起见，并不解释要求保护的发明的范围或含义。本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所述的主题。
有效递送至细胞需要特异性靶向和对细胞外环境(特别是血清蛋白)的实质性保护。实现特异性靶向的一种方法是将靶向部分与活性药剂或药物效应物(例如核酸药剂)缀合，从而根据靶向部分的特异性将活性药剂或药物效应物引导至特定的细胞或组织。靶向部分可以改善递送的一种方式是通过受体介导的胞吞活性。在一些情况下，这种摄取机制可以涉及经由膜结构的内陷或通过递送系统与细胞膜的融合而将结合至膜受体的核酸药剂移动至被膜包封的区域的内部。该过程经由在特异性配体与受体结合后激活细胞表面或膜受体来启动。许多受体介导的胞吞系统是已知的并且已经研究过，包括识别糖(例如半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸)、肽和蛋白质(例如转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白、维生素B12、胰岛素和表皮生长因子(EGF))的那些。当附接至高度亲水性分子(例如核酸)时，亲脂性部分(例如胆固醇或脂肪酸)可显著增强血浆蛋白结合并因此延长循环半衰期。为了改善靶向递送方法的细胞内运输，亲脂性缀合物也可与靶向配体组合使用。
脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)是高容量受体，其在肝细胞上非常丰富。ASGP-R对N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)的亲和力比对D-Gal高50倍。先前的工作已经表明，实现高亲和力需要多价，而糖之间的间隔也是至关重要的。本发明人在此认识到，显然需要新的受体特异性配体缀合的RNA或DNA药剂及其制备方法，其解决如上所述的用核酸或核酸相关复合体体内递送治疗剂的缺点。本发明针对这个非常重要的目的。
除非上下文另有明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。还应注意，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的意义使用。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料相似或等效的那些，但下文描述了合适的方法和材料。本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入，如同完全阐述一样。Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第3版.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第5版.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；以及Sambrook and Russel,Molecular Cloning:ALaboratory Manual第3版.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold SpringHarbor,NY 2001)，为本领域技术人员提供了本申请中所用的许多术语的通用指导。
具体定义
当指示取代基的数量时，术语“一个或多个”是指从一个取代基至可能的最高取代数量的范围，例如一个氢被取代基置换直至所有氢被取代基置换。
术语“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情况可以但不必须发生，并且该描述包括事件或情况发生的实例和事件或情况不发生的实例。
术语“核酸分子实体”可与“核酸”互换使用。
如本文所用的术语“核酸”通常是指一种或多种核碱基、核苷或核苷酸，并且该术语包括多核碱基、多核苷和多核苷酸。核酸可以包括多核苷酸、单核苷酸和寡核苷酸。核酸可以包括DNA、RNA或其混合物，并且可以是单链、双链或者部分单或双链的，并且可以形成二级结构。在一些实施方案中，核酸具有多个双链区段和单链区段。例如，核酸可以包含多核苷酸，例如mRNA，其内具有多个双链区段。DNA可以是例如反义分子、质粒DNA、预缩合DNA、PCR产物、载体、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。RNA可以是siRNA、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)、CRISPR RNA、碱基编辑器RNA及其组合的形式。核酸包括含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸相似的结合特性。这种类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸以及肽核酸(PNA)。除非具体限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选定的(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mal.Cell.Probes,8:91-98(1994))。“核苷酸”含有取代的和/或未取代的糖脱氧核糖(DNA)，或取代的和/或未取代的糖核糖(RNA)，或取代的和/或未取代的碳环，或取代的和/或未取代的无环部分(例如，二醇核酸)、碱基和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷以及嘌呤和嘧啶的天然类似物和合成衍生物，其包括但不限于放置新反应基团的修饰，例如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸酯和烷基卤化物。
术语“基因”是指包含产生多肽或前体多肽所必需的部分长度或全长编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。
如本文所用的“基因产物”是指基因(例如RNA转录物)的产物或多肽。
如本文所用的术语“多核苷酸”通常是指包含两个或更多个连接的核酸亚基(例如，核苷酸)的分子，并且可与“寡核苷酸”互换使用。例如，多核苷酸可以包括一个或多个核苷酸，其选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体。核苷酸通常包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸(PO3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸包括其中糖是核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸包括其中糖是脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可以是核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸或核苷多磷酸。例如，核苷酸可以是脱氧核糖核苷多磷酸，例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。示例性dNTP包括脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、尿苷三磷酸(dUTP)以及脱氧胸苷三磷酸(dTTP)。dNTP还可以包括可检测的标签，例如发光标签或标志物(例如，荧光团)。例如，核苷酸可以是嘌呤(例如，A或G或其变体)或嘧啶(例如，C、T或U或其变体)。在一些实例中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其衍生物或变体。示例性多核苷酸包括但不限于短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、质粒DNA(pDNA)、短发夹RNA(shRNA)、小核RNA(snRNA)、信使RNA(mRNA)、前体mRNA(pre-mRNA)、反义RNA(asRNA)以及异核RNA(hnRNA)，并且包括核苷酸序列及其任何结构体现，例如单链、双链、三链、螺旋、发夹、茎环、凸起等。在一些情况下，多核苷酸是环状的。多核苷酸可以具有各种长度。例如，多核苷酸的长度可以为至少约7个碱基、8个碱基、9个碱基、10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更大。多核苷酸可以分离自细胞或组织。例如，多核苷酸序列可以包括分离和纯化的DNA/RNA分子、合成的DNA/RNA分子和/或合成的DNA/RNA类似物。
多核苷酸可以包括一种或多种核苷酸变体，包括非标准核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(beta-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸可以包括其磷酸部分的修饰，包括对三磷酸部分的修饰。这种修饰的非限制性实例包括较大长度的磷酸链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸部分的磷酸链)和硫醇部分的修饰(例如，α-硫代三磷酸和β-硫代三磷酸)。核酸分子还可以在碱基部分(例如，在通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处被修饰。核酸分子还可以含有胺修饰的基团，例如氨基烯丙基1-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以允许共价附接胺反应性部分，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)。本发明寡核苷酸中的标准DNA碱基对或RNA碱基对的替代物可以提供更高的位/立方mm密度、更高的安全性(抵抗意外或有目的地合成天然毒素)、光编程聚合酶中更容易辨别或更低的二级结构。在Betz K,Malyshev DA,Lavergne T,Welte W,Diederichs K,Dwyer TJ,Ordoukhanian P,Romesberg FE,Marx A.Nat.Chem.Biol.2012Jul；8(7):612-4中描述了与用于从头合成和/或扩增合成的天然和突变聚合酶相容的这种可替代的碱基对，其出于所有目的通过引用并入本文。
如本文所用，术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可互换使用，并且是指经由肽键连接的氨基酸残基的聚合物，其可由两条或更多条多肽链组成。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是指通过酰胺键连接在一起的至少两个氨基酸单体的聚合物。氨基酸可以是L-光学异构体或D-光学异构体。更具体地，术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是指由两个或更多个氨基酸以特定顺序组成的分子；例如，由编码蛋白质的基因或RNA中核苷酸的碱基序列确定的顺序。蛋白质对于体细胞、组织和器官的结构、功能和调控是必需的，并且每种蛋白质具有独特的功能。实例是激素、酶、抗体及其任何片段。在一些情况下，蛋白质可以是蛋白质的一部分，例如蛋白质的结构域、亚结构域或基序。在一些情况下，蛋白质可以是蛋白质的变体(或突变)，其中一个或多个氨基酸残基被插入、缺失和/或取代到蛋白质天然存在的(或至少已知的)氨基酸序列中。蛋白质或其变体可以是天然存在的或重组的。
如本文所用，术语“插入(intercalating/intercalation)”是指将其自身插入DNA中连续碱基之间的药剂(例如，小分子)的作用。在某些情况下，插入阻止了DNA的正确功能。
如本文所用，“互补”是指根据标准沃森/克里克(Watson/Crick)配对规则与核酸互补的序列。互补序列也可以是与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列，并且也可以是cDNA。互补可以是完全互补或部分互补，使得两条序列在严格杂交条件下杂交。本领域技术人员将理解，互补或基本上互补的序列不需要沿其全长杂交。在特定实施方案中，互补或基本上互补的序列可以包含不与靶序列杂交的连续碱基序列，位于与靶序列杂交的连续碱基序列的3’或5’。
如本文所用，“杂交”是指两条核酸链根据沃森-克里克碱基配对规则彼此退火的过程。核酸杂交技术是本领域公知的。参见例如，Sambrook等人，1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y。本领域技术人员理解如何确定杂交/洗涤条件的适当严格性，使得具有至少所需互补性水平的序列将稳定杂交，而具有较低互补性的序列将不杂交。对于杂交条件和参数的实例，参见例如，Sambrook等人，1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold SpringHarbor Press,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.等人，1994,Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley&Sons,Secaucus,N.J，这些中的全部通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中，杂交可发生在长度为20-100个核苷酸的核酸分子之间。在一些实施方案中，杂交可发生在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个连续核苷酸之间。在一些实施方案中，杂交核酸分子可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个可容忍的错配。
如本文所用，术语“生物样品”是指可以从中制备和检测多核苷酸、多肽、生物标志物和/或代谢物的任何生物材料。非限制性实例包括全血、血浆、唾液、颊拭子、粪便样本、尿样本、细胞团块或任何其他体液或组织。
如本文所用，术语“施用(administer/administering/administration)”等是指可用于将化合物或组合物能够递送至所需生物作用部位的方法。这些方法包括但不限于口服途径(p.o.)、十二指肠内途径(i.d.)、肠胃外注射(包括静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、血管内或输注(inf.))、局部(top.)和直肠(p.r.)施用。本领域技术人员熟悉可以与本文所述的化合物和方法一起使用的施用技术。在一些实施方案中，本文所述的化合物和组合物口服施用。
如本文所用，术语“共同施用”等是指包括向单个患者施用选定的治疗性药剂，并且旨在包括其中通过相同或不同施用途径或在相同或不同时间施用药剂的治疗方案。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的药剂或化合物的足够量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病或病况症状中的一种或多种；例如疾病的一种或多种体征、症状或病因的减少和/或减轻，或生物系统的任何其他所需改变。例如，用于治疗用途的“有效量”可以是提供一种或多种疾病症状的临床上显著降低的药剂的量。适当的“有效”量可以在个体情况下使用例如剂量递增研究的技术来确定。
如本文所用，术语“增强(enhance/enhancing)”是指增加或延长所需效果的量、效力或持续时间。
如本文所用，“碳水化合物”是指这样的化合物，其本身是由一个或多个具有至少6个碳原子的单糖单元组成的碳水化合物(其可以是直链、支链或环状的)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子键合；或是具有作为其一部分的碳水化合物部分的化合物，该碳水化合物部分由一个或多个单糖单元组成，每个单糖单元具有至少六个碳原子(其可以是直链、支链或环状的)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子键合。代表性碳水化合物包括糖(含有约4-9个单糖单元的单糖、二糖、三糖和寡糖)和多糖，例如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括C5及以上(优选C5-C8)糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元(优选C5-C8)的糖。
术语“单糖”包括阿洛糖、阿卓糖、阿拉伯糖、克拉定糖、赤藓糖、赤藓酮糖、果糖、D-岩藻糖醇、L-岩藻糖醇、岩藻糖胺、岩藻糖、墨角藻糖、半乳糖胺、D-半乳糖醇、N-乙酰基-半乳糖胺、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、葡糖胺醇、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸古洛糖甘油醛、L-甘油-D-甘露庚糖(L-glycero-D-mannos-heprose)、甘油、甘油酮、古洛糖艾杜糖、来苏糖、甘露糖胺、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、阿洛酮糖、奎诺糖、奎诺糖胺、鼠李糖醇、鼠李糖胺、鼠李糖、核糖、核酮糖、景天庚酮糖、山梨糖、塔格糖、塔罗糖、酒石酸、throse、木糖和木酮糖的基团。单糖可以是D-或L-构型。单糖可以进一步是脱氧糖(被氢置换的醇羟基)、氨基糖(被氨基置换的醇羟基)、硫糖(被硫醇置换的醇羟基，或被C＝S置换的C＝O，或被硫置换的环状形式的环氧)、硒基糖、碲基糖、氮杂糖(被氮置换的环碳)、亚氨基糖(被氮置换的环氧)、phosphano糖(被磷置换的环氧)、磷杂糖(phospha sugar)(被磷置换的环碳)、C-取代的单糖(非末端碳原子上的氢被碳置换)、不饱和单糖、糖醇(羰基被CHOH基团置换)、醛糖酸(醛基被羧基置换)、酮醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸等。氨基糖包括氨基单糖，优选半乳糖胺、glusamine、甘露糖胺、fucosmine、quinavosamine、神经氨酸、胞壁酸、乳糖二胺(lactosediamine)、acosamine、bacillosamine、六碳氨糖(daunosamine)、红霉脱氧糖胺、福洛氨糖(forosamine)、加拉糖胺、kanosamine、kanosamine、碳霉糖、myosamine、persosamine、pneumosamine、绛红糖胺环(purpurosamine)、rhodosmine。应理解，单糖等可以被进一步取代。
如本文所用，“N/P比”是脂质中(例如，在生理pH范围内)可电离的氮原子与核酸分子实体中磷酸基团的摩尔比，例如，在包含脂质组分和RNA的纳米颗粒组合物中。可电离的氮原子可以包括例如可在约pH 1、约pH 2、约pH 3、约pH 4、约pH 5、约pH 6、约pH 7、约pH7.5或约pH 8或更高时质子化的氮原子。生理pH范围可以包括例如不同细胞区室(例如器官、组织和细胞)和体液(例如血液、CSF、胃液、乳汁、胆汁、唾液、泪液和尿)的pH范围。在某些具体实施方案中，生理pH范围是指哺乳动物血液的pH范围，例如，约7.35至约7.45。在一些实施方案中，可电离的氮原子是指在pH 5至14范围内可电离的那些氮原子。
术语“二糖”、“三糖”和“多糖”包括阿比可糖、阿卡波糖、amicetose、支链淀粉、直链淀粉、芹菜糖、阿卡诺糖(arcanose)、蛔糖、抗坏血酸、波依文糖(boivinose)、纤维二糖、纤维三糖、纤维素、马铃薯三糖、查耳糖、壳多糖、可立糖、环糊精、磁麻糖、糊精、2-脱氧核糖、2-脱氧葡萄糖、狄吉糖、毛地黄糖、毛地黄毒糖、evalose、依维米特糖(evemitrose)、低聚果糖、galto-低聚糖、龙胆三糖、龙胆二糖(genitiobiose)、葡聚糖、gluicogen、glylcogen、金缕梅糖、肝素、菊粉、异左旋葡萄糖酮(isolevoglucosenone)、异麦芽糖、异麦芽三糖、异葡糖基麦芽糖、曲二糖、乳糖、氨基乳糖苷、乳糖二胺、昆布二糖、左旋葡聚糖、左旋葡萄糖酮、β-麦芽糖、麦芽三糖、甘露聚糖-寡糖、甘露三糖(amnninotriose)、松三糖、蜜二糖、胞壁酸、碳霉糖、阿洛糖、神经氨酸、migerose、nojirimycon、诺维糖、齐墩果糖、潘糖、泊雷糖、车前糖、樱草糖、棉子糖、rhodone、芸香糖、齐墩果糖、潘糖、泊雷糖、车前糖、樱草糖、棉子糖、玫红糖(rhodinose)、芸香糖、沙门糖、景天庚酮糖、景天庚酮糖酐、茄三糖、槐糖、水苏糖、链霉糖、蔗糖、α,α-海藻糖、海藻糖胺(trahalosamine)、松二糖、泰威糖、木二糖、伞形糖等的基团。此外，应理解，“二糖”、“三糖”和“多糖”等可以被进一步取代。二糖还包括氨基糖及其衍生物，特别是在C-4’位衍生的碳霉糖或在C-6’位衍生的4-脱氧-3-氨基-葡萄糖。
术语“对象”或“患者”包括哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人、非人灵长类动物(例如黑猩猩)以及其他猿和猴物种；农场动物，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，例如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一方面，哺乳动物是人。如本文所用的术语“动物”包括人类和非人动物。在一个实施方案中，“非人动物”是哺乳动物，例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在一个实施方案中，非人动物是小鼠或猴。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括减轻、减少或改善疾病或病况的至少一种症状，预防另外的症状，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展、缓解疾病或病况、引起疾病或病况的消退、缓解由疾病或病况引起的病况，或预防性地和/或治疗性地停止疾病或病况的症状。术语“治疗”还包括如下所述的“预防(prevent/preventing/prevention)”的概念。应理解，尽管不排除，但治疗病症或病况不要求完全消除与其相关的病症、病况或症状。
术语疾病状态的“预防(preventing/prevention)”表示使疾病状态的临床症状不在可暴露于或易患疾病状态但尚未经历或显示疾病状态的症状的对象中发展。
术语“药物组合物”和“药物制剂”(或“制剂”)可互换使用，并且表示包含治疗有效量的活性药物成分以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的混合物或溶液，以施用至对象，例如有需要的人。
如本文所用的术语“药物组合”是指由混合或组合多于一种活性成分产生的产物，并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分(例如，本文所述的化合物和共同药剂)均以单一实体或剂量的形式同时施用至患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如，本文所述的化合物和共用药剂)作为单独实体同时、并行或依次施用至患者，没有特定的间隔时间限制，其中这种施用在患者体内提供两种化合物的有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如，三种或更多种活性成分的施用。
术语“药学上可接受的”表示可用于制备药物组合物的材料的属性，其通常是安全、无毒的，并且在生物学上或其他方面都不是不希望的，并且对于兽医以及人的药物用途是可接受的。“药学上可接受的”可以指不消除化合物的生物活性或特性并且相对无毒的材料，例如载体或稀释剂，例如，该材料可以施用至个体，而不会引起不希望的生物效应或以有害的方式与包含它的组合物组分中的任一种相互作用。
术语“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的媒介物”和“治疗惰性赋形剂”可以互换使用，并且表示在药物组合物中不具有治疗活性并且对施用的对象无毒的任何药学上可接受的成分，例如用于配制药物产品的崩解剂、粘合剂、填充剂、溶剂、缓冲液、张度剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、载体、稀释剂、赋形剂、防腐剂或润滑剂。
术语“碱基编辑”和“碱基校正”可互换使用，以指示在靶基因内的靶序列处导致碱基修饰的碱基改变或突变。在某些实施方案中，碱基编辑发生在靶序列的单个碱基处。在优选实施方案中，碱基编辑不涉及靶序列的双链断裂。
如本文所用，术语“siRNA”是指介导RNA转录物的靶向切割的药剂。这些药剂与称为RNAi诱导的沉默复合体(RISC)的胞质多蛋白复合体相关。有效诱导RNA干扰的药剂在本文中也称为siRNA、RNAi药剂或iRNA药剂。如本文所用，术语siRNA包括微小RNA和前体微小RNA(pre-microRNA)。如本文所用，术语“siRNA活性”和“RNAi活性”是指siRNA的基因沉默。
术语“2’-O-甲氧基乙基”(也称为2’-MOE、2’-O(CH2)2-OCH3和2’-O-(2-甲氧基乙基))是指呋喃糖基环(furosyl ring)的2’位的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
术语“2’-O-甲氧基乙基核苷酸”是指包含2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分的核苷酸。
术语“5-甲基胞嘧啶”是指用附接至5’位的甲基基团修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
术语“氧代”是指＝O取代基。
术语“烷基”是指具有一个至二十个碳原子的直链或支链烃链基团，并且其通过单键附接至分子的其余部分。包含至多10个碳原子的烷基被称为C1-C10烷基，同样地，例如，包含至多6个碳原子的烷基是C1-C6烷基。相似地表示包含其他数量碳原子的烷基(和本文定义的其他部分)。烷基基团包括但不限于C1-C10烷基、C1-C9烷基、C1-C8烷基、C1-C7烷基、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、C2-C8烷基、C3-C8烷基以及C4-C8烷基。代表性烷基基团包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、1-乙基丙基等。在一些实施方案中，烷基是甲基或乙基。在一些实施方案中，烷基是-CH(CH3)2或-C(CH3)3。除非在本说明书中另有具体陈述，否则烷基基团可以如下所述任选地被取代。“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2CH2CH2-。
术语“烷氧基”是指式-OR的基团，其中R为如定义的烷基基团。除非在本说明书中另有具体陈述，否则烷氧基基团可以如下所述任选地被取代。代表性烷氧基基团包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基。在一些实施方案中，烷氧基是甲氧基。在一些实施方案中，烷氧基是乙氧基。
术语“烷基氨基”是指式-NHR或-NRR的基团，其中每个R独立地为如上定义的烷基基团。除非在本说明书中另有具体陈述，否则烷基氨基基团可以如下所述任选地被取代。
术语“烯基”是指其中存在至少一个碳-碳双键的一类烷基基团。在一个实施方案中，烯基基团具有式-C(R)＝CR2，其中R是指烯基基团的剩余部分，其可以相同或不同。在一些实施方案中，R为H或烷基。在一些实施方案中，烯基选自次乙基(即，乙烯基)、丙烯基(即，烯丙基)、丁烯基、戊烯基、戊二烯基等。烯基基团的非限制性实例包括-CH＝CH2、-C(CH3)＝CH2、-CH＝CHCH3、-C(CH3)＝CHCH3以及-CH2CH＝CH2。根据结构，烯基基团可以是单价或二价的(即，亚烯基基团)。
术语“炔基”是指其中存在至少一个碳-碳三键的一类烷基基团。因此，“亚炔基”可以指二价炔基基团。在一个实施方案中，烯基基团具有式-C≡C-R，其中R指炔基基团的剩余部分。在一些实施方案中，R为H或烷基。在一些实施方案中，炔基选自乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。炔基基团的非限制性实例包括-C≡CH、-C≡CCH3、-C≡CCH2CH3、-CH2C≡CH。
术语“芳基”是指其中形成环的原子中的每一个是碳原子的芳族环。芳基基团可以任选地被取代。芳基基团的实例包括但不限于苯基和萘基。在一些实施方案中，芳基是苯基。根据结构，芳基基团可以是单价或二价的(即，“亚芳基”基团)。除非在本说明书中另有具体陈述，否则术语“芳基”或(例如在“芳烷基”中的)前缀“ar-”是指包括任选取代的芳基基团。在一些实施方案中，芳基基团被部分还原，以形成本文定义的环烷基基团。在一些实施方案中，芳基基团被完全还原，以形成本文定义的环烷基。在一些实施方案中，芳基基团是C6-C14芳基。在一些实施方案中，芳基基团是C6-C10芳基。
术语“环烷基”是指单环或多环非芳族基团，其中形成环的原子中的每一个(即骨架原子)是碳原子。在一些实施方案中，环烷基是饱和的或部分不饱和的。在一些实施方案中，环烷基是螺环或桥连化合物。在一些实施方案中，环烷基与芳族环稠合(在这种情况下，环烷基通过非芳族环碳原子键合)。环烷基基团包括具有3至10个环原子的基团。代表性环烷基包括但不限于具有三至十个碳原子、三至八个碳原子、三至六个碳原子或三至五个碳原子的环烷基。单环环烷基基团包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基以及环辛基。在一些实施方案中，单环环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一些实施方案中，单环环烷基是环戊烯基或环己烯基。在一些实施方案中，单环环烷基是环戊烯基。多环基团包括例如金刚烷基、1,2-二氢萘基、1,4-二氢萘基、四氢化萘基(tetrainyl)、十氢化萘基(decalinyl)、3,4-二氢萘基-1(2H)-酮、螺[2.2]戊基、降冰片基以及二环[1.1.1]戊基。除非在本说明书中另有具体陈述，否则环烷基基团可以任选地被取代。根据结构，环烷基基团可以是单价或二价的(即，亚环烷基基团)。
术语“卤代烷基”表示其中烷基基团氢原子中的至少一个已被相同或不同的卤素原子、特别是氟原子置换的烷基基团。卤代烷基的实例包括单氟-、二氟-或三氟-甲基、-乙基或-丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基。术语“全卤代烷基”表示其中烷基基团的所有氢原子已被相同或不同的卤素原子置换的烷基基团。
术语“杂亚烷基”是指其中烷基的一个或多个碳原子被O、N或S原子置换的如上所述的烷基基团。“杂亚烷基”或“杂亚烷基链”是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支链二价杂烷基链。除非在本说明书中另有具体陈述，否则杂烷基或杂亚烷基基团可以如下所述任选地被取代。代表性杂亚烷基包括但不限于-OCH2CH2O-、-OCH2CH2OCH2CH2O-或-OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O-。
术语“杂环烷基”是指包括至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的环烷基基团。除非在本说明书中另有具体陈述，否则杂环烷基基团可以是单环或双环环系统，其可以包括稠合的(当与芳基或杂芳基环稠合时，杂环烷基通过非芳族环原子键合)或桥连环系统。杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以任选被氧化。氮原子可以任选地被季铵化。杂环烷基基团是部分或完全饱和的。杂环烷基基团的实例包括但不限于二氧戊环基(dioxolanyl)、噻吩基[1,3]二噻烷基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基，咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代-硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基。术语杂环烷基还包括碳水化合物的所有环形式，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。除非另有说明，否则杂环烷基的环具有2至12个碳。在一些实施方案中，杂环烷基的环具有2至10个碳。在一些实施方案中，杂环烷基的环具有2至10个碳以及1或2个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基的环具有2至10个碳以及3或4个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基的环具有2至12个碳、0-2个N原子、0-2个O原子、0-2个P原子以及0-1个S原子。在一些实施方案中，杂环烷基的环具有2至12个碳、1-3个N原子、0-1个O原子以及0-1个S原子。应理解，当提及杂环烷基中的碳原子数量时，杂环烷基中的碳原子数量与构成杂环烷基(即杂环烷基环的骨架原子)的原子(包括杂原子)总数不同。除非在本说明书中另有具体陈述，否则杂环烷基基团可以任选地被取代。如本文所用，术语“杂环亚烷基”可以指二价杂环烷基基团。
术语“杂芳基”是指包括一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子的芳基基团。杂芳基是单环或双环的。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、吲嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶以及蝶啶。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基以及呋咱基。双环杂芳基的说明性实例包括吲嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶以及蝶啶。在一些实施方案中，杂芳基是吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基、噻吩基、噻二唑基或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基的环含有0-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基的环含有1-4个N原子。在一些实施方案中，杂芳基的环含有4-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基的环含有0-4个N原子、0-1个O原子、0-1个P原子以及0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基的环含有1-4个N原子、0-1个O原子以及0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基是C1-C9杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是C1-C5杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是5元或6元杂芳基。在一些实施方案中，双环杂芳基是C6-C9杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基基团被部分还原，以形成本文定义的杂环烷基基团。在一些实施方案中，杂芳基基团被完全还原，以形成本文定义的杂环烷基基团。根据结构，杂芳基基团可以是单价或二价的(即，“杂亚芳基”基团)。
除非另有说明，否则术语“取代的”、“取代基”等可以指用特定取代基的基团单独地和独立地置换给定结构中的一个或多个氢基团，该特定取代基包括但不限于：D、卤素、-CN、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-OH、-CO2H、-CO2烷基、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(烷基)、-S(＝O)2N(烷基)2、烷基、环烷基、氟烷基、杂烷基、烷氧基、氟代烷氧基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基砜以及芳基砜。在一些其他实施方案中，任选的取代基独立地选自D、卤素、-CN、-NH2、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-OH、-CO2H、-CO2(C1-C4烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(C1-C4烷基)、-C(＝O)N(C1-C4烷基)2、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(C1-C4烷基)、-S(＝O)2N(C1-C4烷基)2、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C4氟烷基、C1-C4杂烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4氟代烷氧基、-SC1-C4烷基、-S(＝O)C1-C4烷基以及-S(＝O)2(C1-C4烷基)。在一些实施方案中，任选的取代基独立地选自D、卤素、-CN、-NH2、-OH、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-NH(环丙基)、-CH3、-CH2CH3、-CF3、-OCH3以及-OCF3。在一些实施方案中，被取代的基团被前述基团中的一种或两种取代。在一些实施方案中，脂肪族碳原子(无环或环状)上的任选的取代基包括氧代(＝O)。
术语“未取代的”是指特定基团不带有取代基。术语“任选取代的”是指特定基团是未取代的或被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自可能的取代基。当指示取代基的数量时，术语“一个或多个”是指从一个取代基至可能的最高取代数量，即一个氢被取代基置换直至所有氢被取代基置换。
“约”是指在值的±10％内。例如，如果陈述“标志物可以增加约50％”，则暗示着标志物可以增加45％-55％。
“活性药剂”是指在施用至个体时提供治疗益处的药物组合物中的物质。
“剂量单位”是指其中提供药剂的形式，例如丸剂、片剂或本领域已知的其他剂量单位。在某些实施方案中，剂量单位是含有冻干的反义寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位是含有重构的反义寡核苷酸的小瓶。
“剂量”是指在单次施用中或在特定时间段内提供的药剂的特定量。在某些实施方案中，剂量可以以一次、两次或更多次大丸剂、片剂或注射剂施用。例如，在需要皮下施用的某些实施方案中，所需剂量需要单次注射不容易容纳的体积，因此，可以使用两次或多次注射来实现所需剂量。在某些实施方案中，通过在延长的时间段内或连续输注来施用药剂。剂量可以陈述为每小时、每天、每周或每月药剂的量。剂量也可以陈述为mg/kg或g/kg。
“修饰的核苷间键”是指天然存在的核苷间键的取代或任何改变。例如，硫代磷酸酯键是修饰的核苷间键。
“修饰的核碱基”是指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的任何核碱基。例如，5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。“未修饰的核碱基”是指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷”是指具有至少一个修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的核苷酸”是指具有至少一个修饰的糖部分、修饰的核苷间键和/或修饰的核碱基的核苷酸。
“修饰的寡核苷酸”是指包含至少一个修饰的核苷酸的寡核苷酸。
“修饰的糖”是指天然糖的取代或改变。例如，2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
“基序”是指反义化合物中化学上不同区域的模式。
“他汀”是指抑制HMG-CoA还原酶活性的药剂。
“心血管疾病或病症的症状”是指由心血管疾病或病症引起并伴随心血管疾病或病症的现象，并用作心血管疾病或病症的指示。例如，心绞痛；胸痛；呼吸短促；心悸；虚弱；头晕；恶心；出汗；心动过速；心动过缓；心律失常；心房颤动；下肢肿胀；发绀；疲劳；昏厥；面部麻痹；四肢麻痹；跛行或肌肉痉挛；腹胀；或发热是心血管疾病或病症的症状。
“靶核酸”和“靶序列”是指能够被基因组编辑组合物靶向的核酸。例如，ANGPTL3基因内或邻近ANGPTL3基因的靶DNA序列可被与Cas9核酸酶相关的指导核苷酸靶向。
用于检测和/或测量生物材料中多肽的方法是本领域公知的，包括但不限于蛋白质印迹、流式细胞术、ELISA、RIA以及各种蛋白质组学技术。测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定，例如ELISA。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特定抗原的抗体以及能够检测被捕获的抗原的第二抗体。Harlow,E.和Lane,D.Antibodies:ALaboratory Manual,(1988),Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述了用于检测和/或测量多肽的示例性试验。
用于检测和/或测量生物材料中RNA的方法是本领域公知的，包括但不限于Northern印迹、RNA保护试验、RT-PCR。在Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版)By Michael R.Green,Joseph Sambrook,Peter MacCallum 2012,2,028pp,ISBN 978-1-936113-42-2中描述了合适的方法。
核糖核蛋白(RNP)是指含有RNA的核蛋白。RNP可以是核糖核酸和RNA结合蛋白的复合体。这种组合也可以称为蛋白质-RNA复合体。这些复合体可以发挥许多生物学功能，包括但不限于DNA复制、DNA修饰、基因表达、代谢和RNA的修饰，以及pre-mRNA剪接。
如本文所用，术语“核碱基编辑器(BE)”或“碱基编辑器(BE)”是指组合物，例如包含能够进行核碱基修饰的多肽和Cas蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含与脱氨酶融合的核酸酶失活的Cas9(dCas9)。在一些实施方案中，融合蛋白包含与脱氨酶融合的Cas9切口酶。在一些实施方案中，融合蛋白包含如野生型Cas9序列(例如SEQ ID NO:1)中编号的Cas9的D10X突变或H840X突变，其使得Cas9仅能够切割核酸双链体的一条链。在一些实施方案中，碱基编辑器包含与脱氨酶结构域(例如，腺苷脱氨酶结构域或胞苷脱氨酶结构域)融合或连接的可编程DNA核酸酶结构域。国际PCT申请第PCT/2017/045381(WO2018/027078)和PCT/US2016/058344(WO2017/070632)号中描述了碱基编辑器的细节，其中每一个都通过引用以其整体并入本文。还参见Komor,A.C.,等人，“Programmable editing of atarget base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)；Gaudelli,N.M.,等人，“Programmable base editing of A·T to G·Cin genomic DNA without DNA cleavage”Nature 551,464-471(2017)；Komor,A.C.,等人，“Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam proteinyields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity”Science Advances 3:eaao4774(2017)；Nishida,K.等人“Targeted nucleotide editingusing hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems”,Science 353,aaf8729(2016)；Gehrke JM,Cervantes O,Clement MK,Wu Y,Zeng J,Bauer DE,PinelloL,Joung JK.An APOBEC3A-Cas9base editor with minimized bystander and off-target activities.Nat Biotechnol.2018Nov；36(10):977-982，其全部内容在此通过引用并入。
如本文所用，术语“生物标志物”或“标志物”可互换使用，是指任何生物化学标志物、血清学标志物、遗传标志物，或可以用于将来自患者的样品分类为与病理状况(例如心血管疾病或病症)相关的其他临床或回波描记特征。
如本文所用，术语“抗体”包括但不限于免疫球蛋白分子群体或免疫球蛋白分子的片段，该免疫球蛋白分子可以是多克隆或单克隆的，并且具有任何类别和同种型。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1(人)、IgA2(人)、IgAa(犬)、IgAb(犬)、IgAc(犬)和IgAd(犬)。这种片段通常包含特异性结合抗原的抗体分子的一部分。例如，本领域称为Fab、Fab’或F(ab’)2的免疫球蛋白分子的片段包括在术语抗体的含义内。
如本文所用，术语“标记”是指可检测的化合物、组合物或固体载体，其可以(例如，经由共价或非共价手段、单独或包封)直接或间接缀合至单克隆抗体或蛋白质。标记可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记、化学发光染料、电化学标记、金属螯合物、乳胶颗粒或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变(例如，酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)。本发明中使用的标记可以是但不限于碱性磷酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)；辣根过氧化物酶(HRP)；化学发光剂(例如异鲁米诺)、荧光剂(例如荧光素和罗丹明化合物)；核酶；以及染料。标记也可以是本身可检测的特异性结合分子(例如，生物素、亲和素、链霉亲和素、digioxigenin、麦芽糖、寡组氨酸(例如，六组氨酸(SEQ ID NO:114))、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、dsDNA等)。标记的使用产生信号，该信号可以通过例如电磁辐射的检测或直接可视化的手段来检测，并且其可以任选地被测量。
“基本结合(Substantial binding)”或“基本上结合(substantially binding)”是指在特定试验条件下试验混合物中分子之间的特异性结合或亲和力的量。在其最广泛的方面，基本结合涉及第一分子不能结合或识别第二分子与第一分子结合或识别第三分子的能力之间的差异，使得该差异足以允许进行有意义的试验，以区分一组特定试验条件下的特异性结合，包括分子的相对浓度以及孵育的时间和温度。在另一方面，在交叉反应性意义上，一种分子基本上不能结合或识别另一种分子，其中在包括分子的相对浓度和孵育的一组特定试验条件下，第一分子对第二分子显示的反应性小于对第三分子显示的反应性的25％，例如小于10％，例如，小于5％。可以使用许多广泛已知的方法来测试特异性结合，例如，免疫组织化学试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或蛋白质印迹试验。
如本文所用，术语“基本上相同的氨基酸序列”包括与天然存在的氨基酸序列相似但不相同的氨基酸序列。例如，具有与鞭毛蛋白基本上相同的氨基酸序列的氨基酸序列(例如，多肽)相对于天然存在的鞭毛蛋白的氨基酸序列可以具有一个或多个修饰，例如氨基酸添加、缺失或取代，条件是修饰的多肽基本上保留鞭毛蛋白的至少一种生物活性，例如免疫反应性。两条序列之间的“相似性百分比”是含有两条序列共有的匹配残基或保守残基的位置数除以比较位置数乘以100的函数。在这方面，序列中的保守残基是与相应的参考残基在物理上或功能上相似的残基，例如，其具有相似的大小、形状、电荷、化学特性，包括具有形成共价键或氢键的能力等。
术语“靶向部分”是指对选定的靶(例如，细胞、细胞类型、组织、器官、身体区域或隔室(例如，细胞、组织或器官隔室))提供增强的亲和力的任何分子。一些示例性靶向部分包括但不限于抗体、抗原、碳水化合物碱基部分、叶酸、受体配体、碳水化合物、适体、整联蛋白受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL和HDL配体。基于碳水化合物的靶向部分包括但不限于D-半乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)、多价GalNAc，例如GalNAc2和GalNAc3；D-甘露糖、多价甘露糖、多价乳糖、N-乙酰基-葡糖胺、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸以及凝集素。术语多价表示存在多于一个单糖单元。这些单糖亚基可以通过糖苷键彼此连接或连接至支架分子。
术语“异源性”是指在自然界中通常彼此未发现相同关系的任何两条或更多条核酸或多肽序列。例如，异源性核酸通常是重组产生的，具有两条或多条序列，例如，来自不相关基因的序列，其经排列以产生新的功能性核酸，例如，来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。相似地，异源性多肽通常是指在自然界中彼此未发现相同关系的两条或更多条子序列(例如，融合蛋白)。
如本文所用，术语“片段”包括全长蛋白质的氨基酸的肽、多肽或蛋白质区段，条件是该片段保留与疾病患者血清中的至少一种抗体的反应性。
“表位”是多肽上的抗原决定簇，其由多肽特异性抗体(例如，IBD相关抗体)上的互补位识别结合。
术语“临床因素”包括与心血管疾病相关的患者的症状。临床因素的实例包括但不限于心绞痛；胸痛；呼吸短促；心悸；虚弱；头晕；恶心；出汗；心动过速；心动过缓；心律失常；心房颤动；下肢肿胀；发绀；疲劳；昏厥；面部麻痹；四肢麻痹；跛行或肌肉痉挛；腹胀；或发热。在一些实施方案中，心血管疾病的诊断基于使用统计学算法分析患者的一种或多种标志物的存在或水平以及确定患者是否具有一种或多种临床因素的组合。
术语“预后”包括对病理状况(例如心血管疾病)的可能过程和结果的预测，或从疾病中恢复的可能性。在一些实施方案中，统计学算法的使用提供了患者心血管疾病的预后。例如，预后可以是手术、一种或多种临床因素的发展或从疾病中恢复。
本文提供了用于靶向递送治疗性药剂(例如核酸药剂)的方法和组合物。如本文所用的治疗性药剂可以与靶向部分连接或相关，以帮助靶向递送。例如，治疗性药剂和靶向部分可以形成缀合物。治疗性药剂可以包含与核酸(例如指导RNA)复合的核酸指导的可编程核酸酶系统。在一些实施方案中，指导RNA可以被化学修饰。在一些实施方案中，修饰的指导RNA可以用于制备治疗与基因相关的任何疾病、病症或病况的药物，其中基因可通过DNA的插入或缺失而改变、操纵、编辑和修饰。根据本发明的另一方面，修饰的指导RNA可以用于通过缺失、取代、修复或插入DNA来改变基因。这可以在微生物或动物、特别是哺乳动物、更特别是人中进行。可以使用本发明的指导RNA和本领域已知的CRISPR/Cas系统在体外对人类细胞或组织进行遗传改变或修正，然后将其插回到有需要的患者中。在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的修饰的指导RNA和CRISPR-Cas系统以及药学上可接受的载体或赋形剂。药物组合物可以包括具有本发明的修饰的指导RNA的载体或细胞。在本发明的又一方面，提供了一种组合物，其包含修饰的指导RNA和至少一种递送手段，其选自GalNAc、聚合物、脂质体、肽、适体、抗体、病毒载体、叶酸或转铁蛋白。
核酸酶系统
本文提供了用于靶向递送活性药剂或治疗性药剂(包括核酸、多核苷酸或寡核苷酸)的组合物和方法。活性药剂可以是药物组合物、药物、多核苷酸、寡核苷酸、RNP、脂质纳米颗粒或蛋白质-RNA复合体。如本文所述的靶向递送可以将活性药剂引导至特定所需位置，例如，至特定体内位置、细胞、组织或器官、细胞内基质中的识别位置、细胞内的特定位置。在一些实施方案中，活性药剂包含与核酸酶(例如CRISPR核酸酶)相关的指导RNA。在一些实施方案中，活性药剂包含能够修饰一种或多种靶基因(例如PCSK9或ANGPTL3基因)的活性和/或功能的核酸酶系统。
在一些实施方案中，活性药剂包含基因组编辑组合物，其包含核酸酶系统。在一些实施方案中，基因组编辑组合物是靶特异性基因组编辑组合物。在一些实施方案中，基因组编辑组合物包含核酸指导的可编程核酸酶或其部分。在本发明的一些实施方案中，核酸酶系统包括至少一种核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶系统包括至少一种可编程核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶可以包含至少一个DNA结合结构域和至少一个核酸酶结构域。在一些实施方案中，核酸酶结构域与DNA结合结构域可以是异源性的。在某些实施方案中，核酸酶是DNA核酸内切酶，并且可以切割单链或双链DNA。在某些实施方案中，核酸酶可以切割RNA。
在一些实施方案中，核酸酶系统可以包括来自CRISPR/Cas系统的Cas蛋白结构域(也称为“Cas核酸酶”)。Cas蛋白可以包含至少一个与指导核酸(例如指导RNA(gRNA))相互作用的结构域。另外，可以通过指导RNA将Cas蛋白引导至靶序列。指导RNA与Cas蛋白以及靶序列相互作用，使得Cas蛋白被引导至靶序列，并且可以能够切割靶序列。在某些实施方案中，例如，Cas9，Cas蛋白是单蛋白效应物、RNA指导的核酸酶。在一些实施方案中，指导RNA为靶向切割提供特异性，并且Cas蛋白可以是通用的并与不同的指导RNA配对，以切割不同的靶序列。术语Cas蛋白和Cas核酸酶在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统可以包含I型、II型或III型系统组分，或其任何直向同源物。更新的CRISPR/Cas基因座分类方案定义了具有I型至V型或VI型的1类和2类CRISPR/Cas系统。参见例如，Makarova等人，Nat Rev Microbiol,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人，Molecular Cell,60:385-397(2015)。2类CRISPR/Cas系统具有单蛋白效应物。II型、V型和VI型Cas蛋白可以是单蛋白、RNA-指导的核酸内切酶，本文称为“2类Cas核酸酶”。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2以及C2c3蛋白。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell,163:1-13(2015))与Cas9是同源性的，并且含有RuvC样核酸酶结构域。S3.
在一些实施方案中，Cas蛋白可以来自II型CRISPR/Cas系统，即，来自CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白可以来自2类CRISPR/Cas系统，即，单蛋白Cas核酸酶，例如Cas9蛋白或Cpf1蛋白。如本文进一步描述的，Cas9和Cpf1蛋白家族是具有DNA核酸内切酶活性的酶，并且它们可以通过设计适当的指导RNA而被引导以切割所需的核酸靶。
II型CRISPR/Cas系统组分可以来自IIA型、IIB型或IIC型系统。Cas9核酸酶结构和序列是本领域技术人员已知的(Jinek等人，Science2012,337:816-821；Delcheva等人，Nature 2011,471:602-607，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，野生型Cas9对应于酿脓链球菌Cas9(NCBI参考号NC_002737.2，SEQ ID NO:2)和Uniprot参考Q99ZW2(SEQ IDNO:1)。
酿脓链球菌Cas9(野生型)蛋白序列(SEQ ID NO:1)
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGEAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENTTKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPVNIVKKTEVTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
酿脓链球菌Cas9(野生型)核苷酸序列(SEQ ID NO:2)
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA
可以衍生Cas9蛋白或其他组分的非限制性示例性物种包括酿脓链球菌、嗜热链球菌、链球菌属、金黄色葡萄球菌、无害李斯特菌、加氏乳杆菌、新凶手弗朗西斯菌、产琥珀酸沃廉菌、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、伽玛变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、空肠弯曲杆菌、多杀巴氏杆菌、琥珀酸纤维杆菌、红色红螺菌、达氏诺卡氏菌、原始螺旋链霉菌、绿色产色链霉菌、绿色产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌、假蕈状芽孢杆菌、硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、布氏乳杆菌、齿垢密螺旋体、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德菌、食萘极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌属、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆藻属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻、聚球藻属、阿拉伯糖醋盐杆菌、Ammonifex degensii、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、Candidatus Desulforudis、肉毒杆菌、艰难梭菌、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobiusthermophilus)、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁硫杆菌、Allochromatium vinosum、海杆菌属、嗜盐亚硝化球菌、Nitrosococcus watsoni、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻、节旋藻属、鞘丝藻属、原型微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)、颤藻属、Petrotoga mobilis、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌、灰色奈瑟球菌、红嘴鸥弯曲杆菌、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、白喉棒状杆菌或Acaryochloris marina。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以来自酿脓链球菌。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以衍生自嗜热链球菌。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以衍生自脑膜炎奈瑟氏菌。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以衍生自金黄色葡萄球菌。
在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含多于一个核酸酶结构域。例如，Cas9蛋白可以包含至少一个RuvC样核酸酶结构域(例如Cpf1/Cas12a)和至少一个HNH样核酸酶结构域(例如Cas9)。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以能够将DSB引入靶序列中。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以被修饰为仅含有一个功能性核酸酶结构域。例如，Cas9蛋白可以经修饰，使得核酸酶结构域中的一个突变或完全或部分缺失，以降低其核酸切割活性。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以被修饰为不含有功能性RuvC样核酸酶结构域。在其他实施方案中，Cas9蛋白可以被修饰为不含有功能性HNH样核酸酶结构域。在其中核酸酶结构域中仅有一个是功能性的一些实施方案中，Cas9蛋白可以是能够将单链断裂(“切口”)引入靶序列的切口酶。在一些实施方案中，Cas9蛋白核酸酶结构域内的保守氨基酸被取代，以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas蛋白切口酶可以在RuvC样核酸酶结构域中包含氨基酸取代。RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括(基于酿脓链球菌Cas9蛋白的)D10A。在一些实施方案中，切口酶可以在HNH样核酸酶结构域中包含氨基酸取代。HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括(基于酿脓链球菌Cas9蛋白的)E762A、H840A、N863A、H983A和D986A。在一些实施方案中，本文所述的核酸酶系统可以包含切口酶和一对指导RNA，指导RNA分别与靶序列的有义链和反义链互补。指导RNA可以将切口酶引导至靶，并且通过在靶序列的相反链上产生切口(即，双切口)来引入DSB。也可以使用嵌合Cas9蛋白，其中蛋白的一个结构域或区域被不同蛋白的一部分置换。例如，可以用来自不同核酸酶(例如Fok1)的结构域置换Cas9核酸酶结构域。Cas9蛋白可以是修饰的核酸酶。
可以比对野生型Cas9和来自各种物种的Cas9序列，以确定相应的同源性氨基酸残基，并确定和/或修饰在例如SEQ ID NO:1的D10和H840处的氨基酸残基，从而允许产生具有同源性氨基酸残基相应突变的Cas9变体。比对方法是本领域技术人员已知的。例如，可以使用NCBI基于约束的多重比对工具(COBALT，可在st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt访问)进行比对。
在可替代实施方案中，Cas蛋白可以来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白可以是I型CRISPR/Cas系统的级联复合体的组分。例如，Cas蛋白可以是Cas3蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白可以来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白可以来自IV型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白可以来自V型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白可以来自VI型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白可以具有RNA切割活性。
融合蛋白
本文提供了靶向修饰基因的组合物和方法，例如PCSK9、ANGPTL3、APOC3、LPA、APOB、MTP、ANGPTL4、ANGPTL8、APOA5、APOE、LDLR、IDOL、NPC1L1、ASGR1、TM6SF2、GALNT2、GCKR、LPL、MLXIPL、SORT1、TRIB1、MARC1、ABCG5或ABCG8。在某些情况下，修饰可以是离体的或体内的。在优选实施方案中，靶向修饰可以针对特定类型的器官、组织或细胞，例如肝脏肝细胞。在一些实施方案中，用包含融合蛋白的基因组编辑组合物遗传修饰靶基因。因此，在一些实施方案中，本文提供了用于靶向修饰基因的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含靶特异性核酸酶结构域。在一些实施方案中，融合蛋白包含核酸指导的可编程核酸酶结构域。在一些实施方案中，核酸指导的可编程核酸酶可以包含至少一个DNA结合结构域和至少一个核酸酶结构域。在一些实施方案中，核酸酶结构域与DNA结合结构域可以是异源性的。在一些实施方案中，核酸酶结构域可以经修饰，使得核酸酶结构域突变，以降低其核酸酶切割活性。在一些实施方案中，核酸酶活性完全丧失。在一些实施方案中，核酸酶活性部分降低。在一些实施方案中，修饰的核酸酶结构域可以包含修饰的Cas蛋白结构域。在某些实施方案中，修饰的Cas蛋白结构域是修饰的Cas9。在一些实施方案中，修饰的Cas9结构域是核酸酶失活的Cas9(dCas9)结构域。在一些实施方案中，修饰的dCas9结构域是切口酶结构域。在一些实施方案中，基于酿脓链球菌Cas9蛋白，修饰的Cas9结构域含有至少一个取代基，其选自D10A、N497A、R661A、Q695A、E762A、H840A、N863A、Q926A、H983A和D986A。在一些实施方案中，修饰的核酸酶结构域是无催化活性的Cpf1结构域、无催化活性的Cas13a结构域、无催化活性的Cas13b结构域或无催化活性的Cas13c结构域。在一些实施方案中，修饰的核酸酶结构域是无催化活性的CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3和Argonaute蛋白结构域。
在一些实施方案中，如本文所述的融合蛋白除了核酸酶结构域之外还包含一个或多个功能性结构域。至少一个蛋白质结构域可以位于融合蛋白的N-末端、C-末端或内部位置。在一些实施方案中，两个或更多个异源性蛋白质结构域位于融合蛋白上的一个或多个位置。功能性结构域的非限制性实例包括阻遏物结构域、激活剂结构域、甲基转移酶结构域、脱甲基化酶结构域。在一些实施方案中，功能性结构域包含碱基编辑酶结构域。在一些实施方案中，功能性结构域是胞苷脱氨酶结构域。例如，胞苷脱氨酶可以使特定的胞苷脱氨基为尿嘧啶，导致U-G错配，随后经由细胞修复机制解决，以形成U-A碱基对，并且随后形成T-A碱基对，从而产生C至T的取代。胞苷脱氨酶结构域和胞苷脱氨酶融合蛋白序列是本领域技术人员已知的，如在Komor等人，Science Advances2017,3(8):eaao4774；Komor等人，Nature 2016,533:420-424中描述的。在一些实施方案中，功能性结构域是腺嘌呤脱氨酶结构域。例如，腺嘌呤脱氨酶结构域可以使腺苷脱氨基以生成肌苷，其可以与胞苷碱基配对，随后通过细胞修复机制校正为鸟嘌呤，从而将A转化为G。如Gaudelli等人，Nature 2017551(7681):464-471中描述的示例性腺苷脱氨酶融合蛋白，其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，如本文所述的融合蛋白包含核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，融合蛋白可以包含2、3、4或5个NLS。在一些实施方案中，融合蛋白可以包含1-10个NLS。NLS序列可以在融合蛋白的N末端和/或C末端融合。在一些实施方案中，NLS可以是单分序列，例如，SV40 NLS、PKKKRKV(SEQ ID NO:3)或PKKKRRV(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，NLS可以是二分序列，例如，核质蛋白的NLS、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，NLS可以从其野生型对应物遗传修饰。在优选实施方案中，融合蛋白包含ABE7.10(SEQ ID NO:6)的序列。
在一些实施方案中，融合蛋白可以进一步包含标签结构域。在一些实施方案中，标签结构域可以包含荧光标签、纯化标签、表位标签或报告基因标签。在一些实施方案中，标签结构域可以包含荧光蛋白结构域。合适的荧光蛋白的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、MonomericAzami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreenl)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellowl)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)或任何其他合适的荧光蛋白。在一些实施方案中，标签结构域可以包含纯化标签和/或表位标签。非限制性示例性标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6×His(SEQ IDNO:114)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)以及钙调蛋白。在一些实施方案中，标签结构域可以包含报告基因结构域。非限制性示例性报告基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶或荧光蛋白。
在另外的实施方案中，核酸酶系统中的核酸酶可以包含除Cas蛋白以外的一种或多种可编程核酸酶。例如，核酸酶可以选自大范围核酸酶(例如，归巢核酸内切酶)、ZFN、TALEN和megaTAL。
天然存在的大范围核酸酶可以识别和切割约12至40个碱基对的双链DNA序列，并且通常分成五个家族。在一些实施方案中，大范围核酸酶可以选自LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、HNH家族、His-Cys盒家族和PD-(D/E)XK家族。在一些实施方案中，大范围核酸酶的DNA结合结构域可以被工程化，以识别和结合至除其同源靶序列以外的序列。在一些实施方案中，大范围核酸酶的DNA结合结构域可以与异源性核酸酶结构域融合。在一些实施方案中，大范围核酸酶(例如归巢核酸内切酶)可以与TAL模块(module)融合，以产生杂交蛋白，例如“megaTAL”蛋白。通过识别大范围核酸酶的DNA结合结构域和TAL模块的靶序列，megaTAL蛋白可具有改善的DNA靶向特异性。
ZFN是包含锌指DNA结合结构域(“锌指”或“ZF”)和核酸酶结构域的融合蛋白。每个天然存在的ZF可以结合至三个连续的碱基对(DNA三联体)，并且ZF重复被组合，以识别DNA靶序列并提供足够的亲和力。因此，工程化的ZF重复可以被组合，以识别更长的DNA序列，例如，9bp、12bp、15bp或18bp等。在一些实施方案中，ZFN可以包含与来自限制性核酸内切酶的核酸酶结构域融合的ZF。例如，限制性核酸内切酶可以是FokI。在一些实施方案中，例如当核酸酶二聚化变为有活性时，核酸酶结构域可以包含二聚化结构域，并且可以设计包含ZF重复和核酸酶结构域的一对ZFN，用于靶向靶序列，该靶序列包含由DNA分子相反链上的每个ZF重复识别的两个半靶序列，其间具有互连序列(在文献中有时称为间隔区)。例如，互连序列的长度可以为5bp至7bp。当配对的两个ZFN结合时，核酸酶结构域可以二聚化并在互连序列内引入DSB。在一些实施方案中，核酸酶结构域的二聚化结构域可以包含杵-臼(knob-into-hole)基序，以促进二聚化。例如，ZFN可以在FokI的二聚化结构域中包含杵-臼基序。
TALEN的DNA结合结构域通常包含可变数量的34或35个氨基酸重复(“模块”或“TAL模块”)，每个模块结合至单个DNA碱基对A、T、G或C。每个模块的12位和13位相邻残基(“重复可变二残基”或RVD)指定该模块所结合的单个DNA碱基对。尽管用于识别G的模块也可以对A具有亲和力，但TALEN受益于简单的识别代码-对于4个碱基中的每一个都有一个模块-这极大地简化了识别特定靶序列的DNA结合结构域的定制。在一些实施方案中，TALEN可以包含来自限制性核酸内切酶的核酸酶结构域。例如，限制性核酸内切酶可以是FokI。在一些实施方案中，核酸酶结构域可以二聚化变为有活性，并且可以设计一对TALEN，用于靶向靶序列，该靶序列包含由DNA分子相反链上的每个DNA结合结构域识别的两个半靶序列，其间具有互连序列。例如，每个半靶序列的范围可以为10bp至20bp，并且互连序列的长度可以为12bp至19bp。当配对的两个TALEN结合时，核酸酶结构域可以二聚化并在互连序列内引入DSB。在一些实施方案中，核酸酶结构域的二聚化结构域可以包含杵-臼基序，以促进二聚化。例如，TALEN可以在FokI的二聚化结构域中包含杵-臼基序。
本发明的某些实施方案还提供编码本文所述的核酸酶系统的核酸，其在载体上提供。在一些实施方案中，核酸可以是DNA分子。在其他实施方案中，核酸可以是RNA分子。在一些实施方案中，编码核酸酶的核酸可以是mRNA分子。
在一些实施方案中，编码核酸酶的核酸可以进行密码子优化，用于在一种或多种真核细胞类型中有效表达。在一些实施方案中，编码核酸酶的核酸可以进行密码子优化，用于在一种或多种哺乳动物细胞中有效表达。在一些实施方案中，编码核酸酶的核酸可以进行密码子优化，用于在人类细胞中有效表达。包括密码子使用表和密码子优化算法的密码子优化方法是本领域可用的。
指导多核苷酸
在本发明的一些实施方案中，CRISPR/Cas核酸酶系统包括至少一种指导多核苷酸，例如，指导RNA。在一些实施方案中，指导RNA和Cas蛋白可以形成核糖核蛋白(RNP)，例如，CRISPR/Cas复合体。指导RNA可以将Cas蛋白指导至靶核酸分子上的靶序列，其中指导RNA与靶序列杂交，并且Cas蛋白切割靶序列。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合体可以是Cpf1/指导RNA复合体。在一些实施方案中，CRISPR复合体可以是II型CRISPR/Cas9复合体。在一些实施方案中，Cas蛋白可以是Cas9蛋白。在一些实施方案中，CRISPR/Cas9复合体可以是Cas9/指导RNA复合体。
指导核酸(例如，指导RNA)可以结合至Cas蛋白，并且将Cas蛋白靶向至靶多核苷酸内的特定位置。指导核酸可以包含核酸靶向区段和Cas蛋白结合区段。
指导核酸可以指能与另一核酸(例如，细胞基因组中的靶多核苷酸)杂交的核酸。指导核酸可以是RNA，例如，指导RNA。指导核酸可以是DNA。指导核酸可以包含DNA和RNA。指导核酸可以是单链的。指导核酸可以是双链的。指导核酸可以包含核苷酸类似物。指导核酸可以包含修饰的核苷酸。指导核酸可以被编程或设计为结合至核酸位点特异性序列。
指导核酸可以包含一个或多个修饰，以提供具有新的或增强的特征的核酸。指导核酸可以包含核酸亲和标签。指导核酸可以包含合成的核苷酸、合成的核苷酸类似物、核苷酸衍生物和/或修饰的核苷酸。
指导核酸可以例如在5’端或3’端处或附近包含核酸靶向区域(例如，间隔区区域)，其与靶多核苷酸中的前间隔区序列互补。指导核酸的间隔区可以经由杂交(碱基配对)以序列特异性方式与前间隔区相互作用。前间隔区序列可以位于靶多核苷酸中前间隔区相邻基序(PAM)的5’或3’。间隔区区域的核苷酸序列可以变化并确定靶核酸内指导核酸可以与之相互作用的位置。可以设计或修饰指导核酸的间隔区区域，以与靶核酸内的任何所需序列杂交。
指导核酸可以包含两个单独的核酸分子，其可以称为双指导核酸。指导核酸可以包含单个核酸分子，其可以称为单指导核酸(例如，sgRNA)。在一些实施方案中，指导核酸是包含融合的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸是包含crRNA的单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸是包含crRNA但缺乏tracRNA的单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸是包含非融合的crRNA和tracrRNA的双指导核酸。示例性双指导核酸可以包含crRNA样分子和tracrRNA样分子。示例性单指导核酸可以包含crRNA样分子。示例性单指导核酸可以包含融合的crRNA样和tracrRNA样分子。
crRNA可以包含指导核酸的核酸靶向区段(例如，间隔区)和能形成指导核酸的Cas蛋白结合区段的双链双链体的一半的一段核苷酸。
tracrRNA可以包含形成gRNA的Cas蛋白结合区段的双链双链体的另一半的一段核苷酸。crRNA的一段核苷酸可以与tracrRNA的一段核苷酸互补并杂交，以形成指导核酸的Cas蛋白结合结构域的双链双链体。
crRNA和tracrRNA可以杂交，以形成指导核酸。crRNA还可以提供与靶核酸识别序列(例如，前间隔区)杂交的单链核酸靶向区段(例如，间隔区区域)。crRNA(包括间隔区区域)或tracrRNA分子的序列可以被设计为对于其中指导核酸待使用的物种是特异性的。
CRISPR/Cas9系统的指导RNA通常包含CRISPR RNA(crRNA)和tracrRNA(tracr)。CRISPR/Cpf1系统的指导RNA通常包含crRNA。在一些实施方案中，crRNA可以包含与靶核酸分子上的靶序列互补并杂交的靶向序列。crRNA还可以包含与tracrRNA的一部分互补并杂交的序列。在一些实施方案中，crRNA可以与从细菌的CRISPR基因座转录的天然存在的crRNA的结构相似，其中靶向序列用作CRISPR/Cas9系统的间隔区。
指导RNA可以经由crRNA的靶向序列靶向任何目的序列。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与靶核酸分子上的靶序列之间的互补性程度可以为约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与靶核酸分子上的靶序列可以100％互补。在其他实施方案中，指导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以含有至少一个错配。例如，指导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以含有1-6个错配。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以含有5个或6个错配。
靶向序列的长度可以取决于所用的CRISPR/Cas9系统和组分。例如，来自不同细菌物种的不同Cas9蛋白具有不同的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列的长度可以包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或多于50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度可以包含18-30个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度可以包含19-24个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度可以包含20个核苷酸。
crRNA和tracr可以包含具有足够互补性的任何序列，以促进功能性CRISPR/Cas9复合体的形成。在一些实施方案中，crRNA和tracr之间的互补序列可以包含与同一CRISPR/Cas9系统中的tracrRNA互补的天然存在的crRNA序列(也称为“标签”或“柄”)的全部或一部分。在一些实施方案中，互补序列可以包含天然存在的CRISPR/Cas9系统中重复序列的全部或一部分。在一些实施方案中，互补序列可以包含截短的或修饰的标签或柄序列。在一些实施方案中，tracrRNA与沿两条序列中较短序列的长度与tracrRNA杂交的互补部分的部分之间的互补性程度可以为约40％、50％、60％、70％、80％或更高，但低于100％。在一些实施方案中，tracrRNA和与tracrRNA杂交的部分沿两条序列中较短序列的长度不是100％互补的，因为在tracr和/或摆动碱基配对上存在一个或多个凸起结构。tracrRNA与tracr互补部分的长度可以取决于所用的CRISPR/Cas9系统或tracrRNA。例如，互补部分的长度可以包含10-50个核苷酸，或多于50个核苷酸。在一些实施方案中，互补部分的长度可以包含15-40个核苷酸。在其他实施方案中，互补部分的长度可以包含20-30个核苷酸。在其他实施方案中，互补部分的长度可以包含22个核苷酸。例如，当使用双指导RNA时，互补部分的长度可以没有上限。
在一些实施方案中，tracrRNA可以包含天然存在的CRISPR/Cas9系统中野生型tracrRNA序列的全部或一部分。在一些实施方案中，tracrRNA可以包含野生型tracrRNA的截短的或修饰的变体。tracrRNA的长度可以取决于所用的CRISPR/Cas9系统。在一些实施方案中，tracrRNA的长度可以包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或多于100个核苷酸。在某些实施方案中，tracr的长度为至少26个核苷酸。在另外的实施方案中，tracr的长度为至少40个核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA可以包含某些二级结构，例如，一个或多个发夹或茎-环结构，或一个或多个凸起结构。
在一些实施方案中，指导RNA可以包含两个RNA分子，并且在本文中称为“双指导RNA”或“dgRNA”。在一些实施方案中，dgRNA可以包含包括crRNA的第一RNA分子以及包括tracrRNA的第二RNA分子。第一和第二RNA分子可以经由crRNA上的旗杆(flagpole)和tracrRNA之间的碱基配对形成RNA双链体。
在一些实施方案中，指导RNA可以包含单个RNA分子，并且在本文中称为“单指导RNA”或“sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA可以包含与tracrRNA共价连接的crRNA。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA可以经由接头共价连接。在一些实施方案中，单分子指导RNA可以经由crRNA上的旗杆(flagpole)和tracrRNA之间的碱基配对包含茎-环结构。
本发明的某些实施方案还提供了编码本文所述的指导RNA的核酸，例如，载体。在一些实施方案中，核酸可以是DNA分子。在其他实施方案中，核酸可以是RNA分子。在一些实施方案中，核酸可以包含编码crRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸序列包含靶向序列，其两侧为天然存在的CRISPR/Cas系统中重复序列的全部或一部分。在一些实施方案中，核酸可以包含编码tracrRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA可以由两个单独的核酸编码。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA可以由单个核酸编码。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA可以由单个核酸的相反链编码。在其他实施方案中，crRNA和tracrRNA可以由单个核酸的相同链编码。
在某些实施方案中，可以将多于一种指导RNA与CRISPR/Cas核酸酶系统一起使用。每种指导RNA可以含有不同的靶向序列，使得CRISPR/Cas系统切割多于一个靶序列。在一些实施方案中，一种或多种指导RNA可以具有相同或不同的特性，例如在Cas9 RNP复合体内的活性或稳定性。在使用多于一种指导RNA的情况下，每种指导RNA可以在相同或不同的载体上被编码。用于驱动多于一种指导RNA表达的启动子可以相同或不同。
选择用于高特异性和低脱靶效应的有效靶向的指导RNA的方法是本领域技术人员已知的。对于可编程碱基编辑，含有靶序列的基因组序列的选择可以如Komor等人，Nature,533,420-424(2016)中所述，其通过引用并入本文。指导RNA序列和PAM偏好定义了可编程核酸酶结构域(例如Cas9、dCas9、Cas9n、Cpf1、NgAgo结构域)的基因组靶序列。如Hsu等人(Nature biotechnology,2013,31(9):827-832)、Fusi等人(bioRxiv 021568；doi:http://dx.doi.org/10.1101/021568)、Chari等人(Nature Methods,2015,12(9):823-6)、Doench等人(Nature Biotechnology,2014,32(12):1262-7)、Wang等人(Science,2014,343(6166):80-4)、Moreno-Mateos等人(Nature Methods,2015,12(10):982-8)、Housden等人(Science Signaling,2015,8(393):rs9)、Haeussler等人(Genome Biol.2016；17:148)中所述的减少脱靶结合的方法通过引用并入本文。指导RNA和靶DNA之间形成凸起的可能性以及可能影响靶序列结合的其他参数也可以被认为如Bae等人(Bioinformatics,2014,30,1473-5)、Housden等人(Science Signaling,2015,8(393):rs9)和Farboud等人(Genetics,2015,199(4):959-71)中所述，其也通过引用并入本文。
RNA修饰
本文提供了适合于靶向离体和体内递送系统的修饰的RNA分子。修饰的RNA分子可以包含两个或多个连接的核糖核酸亚基。非限制性示例性修饰的RNA包括CRISPR指导RNA、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小核RNA(snRNA)、信使RNA(mRNA)、前体mRNA(pre-mRNA)、反义RNA(asRNA)以及异核RNA(hnRNA)。如本文所述的修饰的RNA包括RNA序列和其任何结构体现，例如单链、双链、三链、环状、螺旋、发夹、茎环、凸起等。修饰的RNA可以包含至少约3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个碱基的长度。修饰的RNA可以包含至少约1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、20kb、50kb或更大的长度。在一些实施方案中，修饰的RNA是CRISPR指导RNA(gRNA)。gRNA可以是单指导RNA或双指导RNA。在一些实施方案中，修饰的RNA是mRNA。在一些实施方案中，mRNA可以分离自细胞或组织。在一些实施方案中，mRNA可以转录自DNA。在一些实施方案中，mRNA可以是化学合成的。
在某些实施方案中，本文提供的修饰的RNA分子对RNA酶或其他核酸外切酶的降解具有抗性。在某些实施方案中，本文提供的修饰的RNA分子是稳定的，以防止核酸内切酶的降解。在一些实施方案中，与未修饰的RNA相比，本文提供的修饰的RNA分子适合于体内递送并诱导较少的细胞免疫受体激活(例如TLR、RIG-I)。如Diebold(2008)Adv Drug DelivRev.Apr 29；60(7):813-23)和Sorrentino(1998)Cell Mol Life Sci.Aug；54(8):785-94中所述的RNA修饰，两者的整体通过引用并入本文。
除“未修饰的”或“天然”核碱基(例如嘌呤核碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))以外，本领域技术人员已知的许多修饰的核碱基或核碱基模拟物适用于本文所述的化合物。未修饰的或天然核碱基可以经修饰或置换，以提供具有改善的特性的寡核苷酸。例如，核酸酶抗性寡核苷酸可以用这些碱基或用合成的和天然核碱基(例如，肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟嘌呤(isoguanisine)或杀结核菌素(tubercidine))和本文所述的寡聚物修饰中的任何一种来制备。可替代地，可以使用上述碱基和“通用碱基”中的任何取代或修饰的类似物。当天然碱基被非天然和/或通用碱基置换时，核苷酸在本文中被称为包含修饰的核碱基和/或核碱基修饰。修饰的核碱基和/或核碱基修饰还包括天然、非天然和通用碱基，其包含缀合部分，例如本文所述的配体。用于与核碱基缀合的优选缀合物部分包括阳离子氨基基团，其可以经由适当的烷基、烯基或具有酰胺键的接头与核碱基缀合。
如本文所用，“未修饰的”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。示例性修饰的核碱基包括但不限于其他合成的和天然核碱基，例如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟嘌呤、杀结核菌素、2-(卤代)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2-(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2-(氨基丙基)腺嘌呤、2-(甲硫基)-N6-(异戊烯基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7-(脱氮)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(氨基)腺嘌呤、8-(卤代)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8-(硫代烷基)腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6-(甲基)腺嘌呤、N6,N6-(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2-(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6-(甲基)鸟嘌呤、7-(烷基)鸟嘌呤、7-(甲基)鸟嘌呤、7-(脱氮)鸟嘌呤、8-(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8-(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8-(卤代)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8-(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(硫醇)鸟嘌呤、N-(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3-(脱氮)-5-(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(卤代)胞嘧啶、5-(甲基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N4-(乙酰基)胞嘧啶、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)-4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫代)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)-2,4-(二硫代)尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5-(氨基烯丙基)尿嘧啶、5-(氨基烷基)尿嘧啶、5-(胍基烷基)尿嘧啶、5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5-(二甲氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤代)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-(甲氧羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲氧羰基-甲基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、6-(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N-(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2-(硫代)假尿嘧啶、4-(硫代)假尿嘧啶、2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶(N1-甲基假尿嘧啶)、1-取代的假尿嘧啶、1-取代的2(硫代)-假尿嘧啶、1-取代的4-(硫代)假尿嘧啶、1-取代的2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基亚乙基)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基亚乙基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基亚乙基)-4-(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基亚乙基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基亚乙基)-假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基-羰基亚乙基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基亚乙基)-4-(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基亚乙基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、l-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-l-基、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-l-基、l-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-l-基、7-取代的l,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-l-基、7-取代的-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-l-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-l-基、7-取代的l-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-l-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基-羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-l-基、1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂环己烷)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、杀结核菌素、异鸟嘌呤、肌苷基(inosinyl)、2-氮杂肌苷基、7-脱氮-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹诺酮基、5-(甲基)异喹诺酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、均二苯乙烯基、并四苯基、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟代)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2-(氨基)嘌呤、2,6-(二氨基)嘌呤、5-取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、O6-取代的嘌呤、取代的1,2,4-三唑、吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、对位取代的-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、邻位取代的-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、双邻位取代的6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、双邻～(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基，或者其任何O-烷基化或其N-烷基化衍生物。可替代地，可以使用上述碱基和“通用碱基”中的任何取代或修饰的类似物。通用核碱基是能够与四种天然存在的核碱基中的全部碱基配对而基本上不影响解链行为、胞内酶识别或寡核苷酸双链体的活性的任何核碱基。一些示例性通用核碱基包括但不限于2,4-二氟甲苯、硝基吡咯基、硝基吲哚基、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、4-氟代-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基异喹诺酮基、5-甲基异喹诺酮基、3-甲基-7-丙炔基异喹诺酮基、7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-丙炔基异喹诺酮基、丙炔基-7-氮杂吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、均二苯乙烯基、并四苯基、并五苯基及其结构衍生物(参见例如，Loakes,2001,Nucleic AcidsResearch,29,2437-2447，其通过引用以其整体并入本文)。其他核碱基包括美国专利第3,687,808号中公开的那些；2009年3月26日提交的国际申请第PCT US09/038425号中公开的那些；the Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I,编著.John Wiley&Sons,1990中公开的那些；English等人，AngewandteChemie,国际版,1991,30,613中公开的那些；Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijin,P.Ed.Wiley-VCH,2008中公开的那些；以及由Sanghvi,Y.S.,第15章,dsRNA Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编著.,CRC Press,1993公开的那些。上述文献中的所有内容均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的RNA经修饰以附接递送和/或靶向部分，例如GalNAc。合适地，GalNAc可以附接至RNA的3’端、5’端或两者。在一些实施方案中，GalNAc附接至3’端。在一些实施方案中，修饰的RNA相对于其未修饰的等效物显示出改善。这种改善可以涉及改善的特异性(使得例如脱靶效应降低或需要更低浓度的gRNA)、改善的稳定性(例如对酶(例如核酸酶)的抗性)、改善的功能性或降低的免疫原性或免疫刺激特性。在一些实施方案中，修饰的RNA显示出有效转染至细胞中和/或改善的特性，允许其在生物体、组织、体液或细胞中递送和维持，使得RNA(例如指导RNA)可以发挥功能性。与它们未修饰的等效物相比，测量这些改善的特性的方法是本领域技术人员已知的，并且包括本文所述的那些方法。因此，在一些实施方案中，本文提供了一种修饰的RNA，其与未修饰的等效物相比具有提高的稳定性。未修饰的等效物是指RNA，例如靶向相同的特异性基因序列并与相同的Cas9或CRISPR核酸酶相互作用并且包含天然核苷酸的指导RNA。提高的稳定性包括提高的稳定性或对酶(例如核酸酶)的抗性，该酶可以存在于细胞、组织或体液中，并且可以另外有助于RNA的降解，使得其功能性降低。在某些实施方案中，提高的稳定性包括增加的血清稳定性。在一些实施方案中，本文提供了一种修饰的指导RNA，其与未修饰的等效物相比具有提高的CRISPR活性。本文描述了用于测量CRISPR活性的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种修饰的指导RNA，其与未修饰的等效物相比具有降低的免疫刺激活性。本文描述了用于测量免疫刺激的方法。
本文提供了用于靶向递送的修饰的mRNA分子。例如，编码CRISPR酶(例如Cas9、Cas12b或碱基编辑器(BE))的mRNA可以经修饰，用于特异性组织靶向。mRNA可以在2’位处被修饰至少一个核苷酸和/或骨架修饰。在一些实施方案中，mRNA中的核苷酸可以包括硫代酸酯(thioate)的修饰。在一些实施方案中，mRNA可以包括2’-OMe、2’-F、N-1-甲基-5-假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和5-乙氧基尿苷中的一种或多种的修饰。
在某些实施方案中，本文提供的mRNA序列包含完全修饰的或部分修饰的mRNA。在一些实施方案中，mRNA在整个长度的片段或多个片段中包含化学修饰。mRNA或其区段的核苷酸的非限制性示例性修饰和修饰模式在表2和表3中示出。
本文提供了与CRISPR/Cas系统一起使用的修饰的指导RNA，其中该指导RNA可以通过在2’位处化学修饰至少一个核苷酸和/或骨架修饰来修饰。骨架修饰可以包括硫代酸酯的修饰。在某些实施方案中，修饰的核苷酸选自与Cas蛋白中的Cas氨基酸相互作用以实现指导RNA与Cas结合的核苷酸。在某些实施方案中，修饰可以包含核苷酸上的2’-OH被H、-OR、-R、-O-C1-C6-亚烷基-OR、-O-C1-C6-亚烷基-OH、卤素、-SH、-SR、-NH2、-NHR、-N(R)2、-C1-C6-亚烷基-NH2、-C1-C6-亚烷基-NHR、-C1-C6-亚烷基-N(R)2或CN中的至少一种置换，其中每个R独立地为C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基，并且卤素为F、Cl、Br或I。在一些情况下，修饰是2’-O-甲基和/或2’-F。在一些实施方案中，修饰包含2’-F、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)和2’-ara-F修饰中的一种或多种。在一些实施方案中，修饰包含2’-MOE。在一些实施方案中，修饰包含硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。在一些实施方案中，修饰包含4-O-烷基核糖糖，例如4’-甲氧基和4’-乙氧基修饰。
合适地，修饰的指导RNA可以与酿脓链球菌CRISPR/Cas9系统或任何其他CRISPR/Cas系统(例如金黄色葡萄球菌或溶血葡萄球菌中的那些)一起施加。还可以对来自毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌ND2006的Cpf1或来自氨基酸球菌(Acidominococcus)物种BV3L6的Cpf1的指导RNA进行修饰或相似的修饰模式。
在某些实施方案中，指导RNA序列包含完全修饰的单指导RNA。在一些实施方案中，指导RNA在tracrRNA部分包含化学修饰。根据本发明的指导RNA的核苷酸的非限制性示例性修饰和修饰模式在表2和表3中示出。
如本文所述的修饰的指导RNA可以与CRISPR/Cas系统或CRISPR/Cas酶复合使用，以实现靶基因或DNA序列的改变。CRISPR/Cas酶可以包含CRISPR核酸酶，例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2或C2c3。在一些实施方案中，CRISPR/Cas酶可以包含具有修饰的或降低的核酸酶活性的CRISPR核酸酶，例如核酸酶失活的Cas9或Cpf1。例如，可以将突变引入Cas9酶的一个或两个核酸酶亚结构域中，以生成Cas9切口酶或核酸酶失活的Cas9。Cas9中的示例性失活性突变包括SEQ ID NO:1的D10、E762、H840、N854、N863或D986位的改变。例如，Cas9的RuvC亚结构域中的D10A突变和HNH亚结构域中的H840A突变使得Cas9核酸酶失活。Cas9的RuvC亚结构域中的D10A突变或HNH亚结构域中的H840A生成Cas9切口酶。在WO15/89354中讨论了Cas9中的另外的氨基酸取代，其以其整体并入本文。
修饰的指导RNA与靶核苷酸(例如靶基因或靶DNA序列)共享序列同一性或能够与其杂交。在一些实施方案中，修饰的指导RNA与基因或靶DNA的靶核苷酸具有至少100％、99％、98％、96％、95％、90％、85％、80％、75％或70％的对应性或同一性。
如本文所述的核苷酸可以是合成的或化学修饰的。例如，本文提供的指导RNA可以是合成的或化学修饰的指导RNA。修饰的指导RNA中的核苷酸可以是对应于指导RNA与Cas9的结合区域中的一个或多个核苷酸和/或指导RNA与靶DNA的结合区域中的核苷酸的那些。指导RNA的剩余未修饰的核苷酸可以是为了使Cas9与碱基上的2’-OH位的结合最小化而需要鉴定的那些。在一些实施方案中，核苷酸可以在核苷酸的糖部分的2’位处被修饰。在一些实施方案中，糖部分的2’-OH基团被选自H、OR、R、卤素、SH、SR、H2、NHR、N(R)2或CN的基团置换，其中R为C1-C6烷基、烯基或炔基，并且卤素为F、Cl、Br或I。其他修饰可以包括反向(脱氧)无碱基、氨基、氟代、氯代、溴代、CN、CF、甲氧基、咪唑、羧酸酯、硫代酸酯、C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、杂环烷基；杂环烷芳基；氨烷基氨基；聚烷基氨基或取代的甲硅烷基。制备具有特定序列和修饰的RNA的方法是本领域技术人员已知的，例如，Dellinger等人(2011),J.Am.Chem.Soc,133,11540；US 8,202,983；Kumar等人，(2007),J.Am.Chem.Soc,129,6859-64；WO2013176844，其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，如本文提供的多核苷酸或寡核苷酸可以是合成的。例如，指导RNA可以是化学合成的指导RNA。合成RNA的产量基于序列和修饰。2’-O-甲基修饰已显示出在RNA合成期间增加偶联效力或效率，并因此增加化学合成RNA的产量。此外，核苷酸可以被硫代磷酸酯修饰。硫代磷酸酯(PS)键取代寡核苷酸的磷酸酯骨架中非桥氧的硫原子。因此，本发明的示例性核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有a-L-核糖构型的a-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2’-氨基官能化的2’-氨基-LNA以及具有2’-氨基官能化的2’-氨基-a-LNA)或其杂交体。
用于靶向递送的缀合物
本文提供了适合于靶向递送药剂(例如mRNA、指导RNA、miRNA、siRNA、DNA、肽或其他微小或大分子)的缀合物。缀合物可以含有一个或多个适体、配体或部分，用于离体或体内靶向递送。在一些实施方案中，缀合物包含靶向部分(或配体)、接头和连接至靶向部分的活性药剂(或有效负载)。活性药剂可以是治疗性药剂、预防性药剂或诊断/预后药剂。活性药剂可以具有操纵对象的生理功能(例如，基因表达)的能力。活性药剂可以是指导RNA、mRNA、miRNA、siRNA、DNA或肽。活性药剂可以经由接头、经由非共价键、经由核碱基配对或其任何组合与靶向部分连接。在一些实施方案中，缀合物可以是单一活性药剂和单一靶向部分之间的缀合物，其具有式(I)：X-Y-Z，其中X为靶向部分；Y为接头；并且Z为指导RNA。在某些实施方案中，一个靶向配体可以与两个或更多个活性药剂缀合，其中缀合物具有式：X-(Y-Z)n。例如，缀合物可以包含指导RNA和mRNA。在某些实施方案中，一个活性药剂可以连接至两个或更多个靶向配体，其中缀合物具有式：(X-Y)n-Z。在其他实施方案中，一个或多个靶向部分可连接至一个或多个活性有效负载，其中缀合物可以为式(X-Y-Z)n。在各种组合中，缀合物可以为例如式X-Y-Z-Y-X、(X-Y-Z)n-Y-Z或X-Y-(X-Y-Z)n，其中X为靶向部分；Y为接头；Z为活性药剂，例如指导RNA。缀合物中每个部分的数量可以根据药剂的类型、缀合物的大小、递送靶、用于包装缀合物的颗粒、其他活性药剂(例如，免疫佐剂)和施用途径而改变。每次出现的X、Y和Z可以相同或不同，例如缀合物可以含有多于一种类型的靶向部分、多于一种类型的接头和/或多于一种类型的活性药剂，n为等于或大于1的整数。在一些实施方案中，n为1至50，或2至20，或5至40之间的整数。在一些实施方案中，n可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、41、43、44、45、46、47、48、49或50的整数。
在一些实施方案中，可以使用病毒、聚合物和脂质体制剂、细胞穿透肽、适体、配体或缀合物以及抗体方法将活性药剂(例如指导RNA)递送至细胞和组织。部分或配体可以将指导RNA引导至特定器官、组织或细胞，例如，肝脏肝细胞，并且可以称为靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分修改附接的分子(例如，mRNA或指导RNA)的一种或多种特性，包括但不限于药效学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。
可以附接至本文所述的活性药剂的示例性部分包括但不限于嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、染料、脂质部分(例如胆固醇部分)(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553)；胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.NY.Acad.Sci.,1992,660,306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765)；硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20,533)；脂肪族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.,1991,10,111；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259,327；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75,49)；磷脂，例如，双十六烷基-rac-甘油或三乙基铵-1,2-双-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18,3777)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969)；金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651)；棕榈酰基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229)；或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923)，所有参考文献以其整体并入本文。靶向部分可以包括天然存在的分子或者重组或合成的分子，包括但不限于GalNAc或其衍生物(例如，GalNAc或其衍生物的二聚体、三聚体或四聚体)、聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-co-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG，例如，PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、聚膦嗪、聚乙烯亚胺、阳离子基团、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、模拟肽聚胺、树状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化的聚氨基酸、转铁蛋白、二磷酸酯、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、适体、脱唾液酸胎球蛋白、透明质酸、前胶原、免疫球蛋白(例如，抗体)、胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、糖-白蛋白缀合物、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(例如，TPPC4、德克萨卟啉(texaphyrin)、Sapphyrin)、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，类固醇、胆汁酸、胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽(例如，α螺旋肽、两亲性肽、RGD肽、细胞渗透肽、内体裂解性/融合肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，萘普生、阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合体)、二硝基苯基、HRP、AP、抗体、激素和激素受体、凝集素、碳水化合物、多价碳水化合物、维生素(例如，维生素A、维生素E、维生素K、维生素B，例如，叶酸、B12、核黄素、生物素和吡哆醛)、维生素辅因子、脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂、NF-κB的激活剂、分类单元、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、杰斯内酯(japlakinolide)、拉春库林A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine、myoservin、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β、γ干扰素、天然或重组低密度脂蛋白(LDL)、天然或重组高密度脂蛋白(HDL)，以及细胞渗透剂(例如，螺旋细胞渗透剂)、肽和模拟肽配体，包括具有天然存在或修饰的肽(例如，D或L肽)的那些；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；具有一个或多个被一个或多个脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰脲键置换的酰胺键(即，肽键)的肽；或环状肽；两亲性肽，包括但不限于天蚕抗菌肽、lycotoxin、paradaxin、buforin、CPF、bombinin样肽(BLP)、凯萨林菌素(cathelicidin)、ceratotoxin、柄海鞘肽、八目鳗肠抗微生物肽(HFIAP)、magainine、brevinins-2、dermaseptin、蜂毒肽、pleurocidin、H2A肽、爪蟾肽、esculentinis-1以及caerin。模拟肽(本文也称为模拟寡肽)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽或模拟肽配体或部分可以为约5-50个氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。在一些实施方案中，靶向部分可以是其他肽，例如生长激素抑制素、奥曲肽、LHRH(促黄体激素释放激素)、表皮生长因子受体(EGFR)结合肽、aptide或双足肽(bipodal peptide)、含RGD的肽、蛋白质支架(例如纤连蛋白结构域)、单结构域抗体、稳定的scFv或其他归巢肽。作为非限制性实例，基于蛋白质或肽的靶向部分可以是蛋白质，例如血小板反应蛋白、肿瘤坏死因子(TNF)、膜联蛋白V、干扰素、血管抑素、内皮抑素、细胞因子、转铁蛋白、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)或生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。在一些实施方案中，靶向部分可以是抗体、抗体片段、RGD肽、叶酸或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。在一些实施方案中，蛋白质支架可以是抗体衍生的蛋白质支架。非限制性实例包括单结构域抗体(dAb)、纳米抗体、单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)、抗体(Avibody)、微抗体(minibody)、CH2D结构域、Fcab以及双特异性T细胞接合器(bite)分子。在一些实施方案中，scFv是稳定的scFv，其中scFv具有超稳定特性。在一些实施方案中，纳米抗体可以衍生自骆驼科抗体的单可变结构域(VHH)。
在一些实施方案中，靶向部分识别或结合仅存在于或主要存在于特定细胞表面上的靶细胞、标志物或分子。例如，靶向部分可结合肿瘤抗原，并且将激活剂(例如指导RNA-Cas复合体)引导至恶性细胞。在一些实施方案中，靶向部分识别细胞内蛋白质。在一些实施方案中，靶向部分将缀合物引导至特定组织、细胞或细胞中的位置。靶向部分可以在培养物中或在整个生物体中或在两者中引导缀合物。在不同情况下，靶向部分可结合至存在于靶细胞表面上或靶细胞内的受体，其中靶向部分以有效的特异性、亲和力和活动性结合至受体。在其他实施方案中，靶向部分将缀合物靶向至特定组织，例如肝脏、肾、肺或胰腺。在其他情况下，靶向部分可以将缀合物引导至网状内皮或淋巴系统的细胞，或引导至专门的吞噬细胞，例如巨噬细胞或嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，靶向部分可以识别RTK受体、EGF受体、丝氨酸或苏氨酸激酶、G蛋白偶联受体、甲基CpG结合蛋白、细胞表面糖蛋白、癌症干细胞抗原或标志物、碳酸酐酶、溶细胞性T淋巴细胞抗原、DNA甲基转移酶、胞外酶、糖基磷脂酰肌醇锚定的共受体、磷脂酰肌醇聚糖相关整合膜蛋白聚糖、热休克蛋白、缺氧诱导蛋白、多药抗性转运体、肿瘤相关巨噬细胞标志物、肿瘤相关糖抗原、TNF受体家族成员、跨膜蛋白、肿瘤坏死因子受体超家族成员、肿瘤分化抗原、锌依赖性金属外肽酶、锌转运体、钠依赖性跨膜转运蛋白、凝集素SIGLEC家族成员或基质金属蛋白酶。
在一些实施方案中，本文所述的缀合物(例如，指导RNA缀合物)包含至少一个N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基-葡糖胺(GluNAc)或甘露糖(例如，甘露糖-6-磷酸)。在一些实施方案中，靶向部分包含至少一个N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基-葡糖胺(GluNAc)或甘露糖(例如，甘露糖-6-磷酸)。
在一些实施方案中，本文所述的缀合物包含一个或多个靶向部分，该靶向部分包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。这种缀合物在本文中也称为GalNAc缀合物。在一些实施方案中，缀合物将RNA靶向至特定细胞，例如，肝脏细胞，例如，肝细胞。在一些实施方案中，GalNAc衍生物可以经由接头(例如，二价或三价支链接头)附接。
在一些实施方案中，本文所述的缀合物是碳水化合物缀合物。在一些实施方案中，碳水化合物缀合物包含单糖。在一些实施方案中，单糖是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。GalNAc和GalNAc衍生物能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，其也称为Ashwell-Morell受体，是主要在肝脏肝细胞上表达的凝集素。
例如，美国专利第8,106,022号中描述了GalNAc缀合物，其全部内容在此通过引用并入本文。在一些实施方案中，GalNAc缀合物用作将指导RNA靶向至特定细胞的配体。在一些实施方案中，例如，通过用作肝脏细胞(例如，肝细胞)的脱唾液酸糖蛋白受体的配体，GalNAc缀合物将指导RNA靶向至肝脏细胞。在一些实施方案中，碳水化合物缀合物包含一个或多个GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以经由接头(例如，二价或三价支链接头)附接。在一些实施方案中，GalNAc缀合物与有义链的3’端缀合。在一些实施方案中，GalNAc配体经由接头(例如，如本文所述的接头)与活性药剂(例如，指导RNA的3’端)缀合。在一些其他实施方案中，GalNAc配体经由接头(例如，如本文所述的接头)与活性药剂(例如，指导RNA的5’端)缀合。
在一些实施方案中，GalNAc配体可以经由接头和间隔区与短聚体寡核苷酸缀合，其中较短的寡核苷酸缀合物与RNA的区段互补。RNA包括RNA分子的所有长度、结构和形式，包括例如目的mRNA和目的指导RNA。在一些实施方案中，短聚体GalNAc缀合物和RNA构成药物组合物。例如，短聚体GalNAc缀合的寡核苷酸和RNA(例如偶联序列)可以一起经由互补核苷酸的W-C H-键合构成药物组合物。短聚体寡核苷酸缀合物的长度可以包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或多于50个核苷酸。在一些实施方案中，偶联序列的长度可以包含15-40个核苷酸。在一些实施方案中，偶联序列的长度可以包含19-30个核苷酸。在一些实施方案中，偶联序列的长度可以包含20-24个核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供了药物组合物，其包含一种或多种GalNAc缀合的短聚体寡核苷酸以及一种或多种RNA。在一些实施方案中，单个GalNAc缀合的短聚体寡核苷酸(例如，GalNAc缀合的RNA)可以与RNA中的多个寡核苷酸区段互补。例如，单个GalNAc缀合的短聚体可以包含与RNA中的多个区段互补的偶联序列。在一些实施方案中，与RNA内的多个寡核苷酸区段互补的多个GalNAc配体缀合的短聚体寡核苷酸可构成药物组合物。
在某些实施方案中，本文所述的缀合物的靶向部分包含配体，该配体具有下表1中所示的结构。
表1.靶向部分结构的非限制性实例。
如表1所示，t、n、p、q和m中的每一个独立地为0或1至30的整数。在一些实施方案中，表1的t、n、p、q和m中的每一个独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、13、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，表1的t、n、p、q和m中的每一个独立地为0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，表1的t、n、p、q和m中的每一个独立地为0、1、2或3。在一些实施方案中，表1的t、n、p、q和m中的每一个独立地为1或2。因此，应理解，本文预期在表1的化合物的一些实施方案中，t为0至10。在一些实施方案中，t为1至5。在一些实施方案中，t为10至20。在一些实施方案中，t为1或2。在一些实施方案中，t为1。在一些实施方案中，t为2。在表1的化合物的一些实施方案中，m为0至10。在一些实施方案中，m为1至5。在一些实施方案中，m为10至20。在一些实施方案中，m为1或2。在一些实施方案中，m为1。在一些实施方案中，m为2。在表1的化合物的一些实施方案中，n为0至10。在一些实施方案中，n为1至5。在一些实施方案中，n为10至20。在一些实施方案中，n为1或2。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。在表1的化合物的一些实施方案中，p为0至10。在一些实施方案中，p为1至5。在一些实施方案中，p为10至20。在一些实施方案中，p为1或2。在一些实施方案中，p为1。在一些实施方案中，p为2。在表1的化合物的一些实施方案中，q为0至10。在一些实施方案中，q为1至5。在一些实施方案中，q为10至20。在一些实施方案中，q为1或2。在一些实施方案中，q为1。在一些实施方案中，q为2。在一些实施方案中，每个R为OH或NHC(O)CH3或其组合。在一些实施方案中，在表1的化合物(1-1a)、(1-2a)、(1-3a)、(1-4a)、(1-5a)、(1-6a)、(1-7a)、(1-8a)、(1-9a)、(1-10a)、(1-11a)、(1-12a)、(1-16a)、(1-21a)、(1-22a)、(1-23a)、(1-24a)、(1-25a)和(1-26a)中，x为0或1-5的整数。在一些实施方案中，在表1的化合物(1-1b)、(1-2b)、(1-3b)、(1-4b)、(1-5b)、(1-6b)、(1-7b)、(1-8b)、(1-9b)、(1-10b)、(1-11b)、(1-12b)、(1-16b)、(1-21b)、(1-22b)、(1-23b)、(1-24b)、(1-25b)和(1-26b)中，x为0或1-5的整数。在一些实施方案中，x为1。在一些实施方案中，x为2。在一些实施方案中，x为0。在一些实施方案中，x为3。在一些实施方案中，x为4。在一些实施方案中，x为5。
靶向部分可以与核酸(例如，指导RNA或mRNA)的核碱基、糖部分或核苷间键缀合。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可以发生在任何位置，包括内环和外环原子。在一些实施方案中，嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位附接至部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合也可以发生在任何位置。在一些实施方案中，嘧啶核碱基的2-、5-和6-位可以被部分取代。当部分与核碱基缀合时，优选位置是不干扰杂交(即，不干扰碱基配对所需的氢键相互作用)的位置。
与核苷的糖部分的缀合可以发生在任何碳原子上。可以附接至缀合物部分的糖部分的示例性碳原子包括2’、3’和5’碳原子。γ-位也可以附接至(例如无碱基残基中的)缀合物部分。核苷间键也可以带有缀合物部分。对于含磷键(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)，缀合物部分可以直接附接至磷原子或附接至与磷原子结合的O、N或S原子。对于含胺或酰胺的核苷间键(例如，PNA)，缀合物部分可以附接至胺或酰胺的氮原子或附接至相邻碳原子。
有许多制备寡核苷酸缀合物的方法。通常，寡核苷酸通过使寡核苷酸上的反应性基团(例如，OH、SH、胺、羧基、醛等)与缀合物部分上的反应性基团接触而附接至缀合物部分。在一些实施方案中，一个反应基团是亲电子的，另一个是亲核的。例如，亲电子基团可以是含羰基的官能团，亲核基团可以是胺或硫醇。具有和不具有连接基团的核酸和相关寡聚化合物的缀合方法在文献(例如，Manoharan in Antisense Research and Applications,Crooke和LeBleu,编著.,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993,第17章)中有很好的描述，其通过引用以其整体并入本文。
靶向部分可以经由RNA-RNA或RNA-DNA碱基配对和杂交附接至本文所述的活性药剂或治疗性核酸，例如指导RNA。不希望受任何理论束缚，靶向部分可以包含偶联序列，其能够识别或结合活性药剂(例如，指导RNA或mRNA)。在一些实施方案中，靶向部分包含能够与指导RNA的5’部分、3’部分或中间部分杂交的偶联序列。与偶联序列杂交的指导RNA可以包含延伸部分。例如，偶联序列可以能够与指导RNA的延伸部分序列杂交，从而将指导RNA引导至体内、离体、细胞间或细胞内所需的位置，同时指导RNA的功能性(例如与CRISPR酶的相互作用或与靶序列的结合)不受影响。在一些实施方案中，指导RNA包含延伸部分，其包括多核苷酸尾。在一些实施方案中，指导核酸包含能够分别与偶联序列的聚(U)尾、聚(A)尾或聚(A)尾杂交的聚(A)尾、聚(U)尾或聚(T)尾。在一些实施方案中，指导核酸可以是包含(A)n或(U)n序列的指导RNA。在一些实施方案中，指导核酸可以包含DNA并且可以包含(A)n或(T)n序列。在一些实施方案中，偶联序列可以包含(A)n(SEQ ID NO:115)、(U)n(SEQ ID NO:116)或(T)n(SEQ ID NO:117)序列。如立即使用的，n可以为1至200之间的任何整数。
偶联序列可以与核酸活性药剂或其部分共享序列同一性或互补性。在一些实施方案中，偶联序列可以与本文所述的指导RNA或这种指导RNA的一部分共享至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方案中，偶联序列可以与本文所述的指导RNA的互补序列或这种指导RNA的一部分的互补序列共享至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方案中，偶联序列可以包含与指导RNA或其互补序列的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59、至少60、至少61、至少62、至少63、至少64、至少65、至少66、至少67、至少68、至少69、至少70、至少71、至少72、至少73、至少74、至少75、至少76、至少77、至少78、至少79、至少80、至少81、至少82、至少83、至少84、至少85、至少86、至少87、至少88、至少89、至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98、至少99或至少100个连续核碱基的同一性或互补性。
在一些实施方案中，靶向部分可以包含化学修饰的偶联序列或与化学修饰的偶联序列相关。在一些实施方案中，偶联序列包含与治疗性核酸(例如指导RNA)或其部分杂交的延伸部分。在一些实施方案中，偶联序列的延伸部分可以被化学修饰。在一些实施方案中，治疗性核酸(例如指导RNA)可以包含延伸部分。在一些实施方案中，指导RNA的延伸部分可以被化学修饰。指导RNA延伸部分和互补或基本上互补的偶联序列延伸部分的非限制性实例在下表2中示出。
表2.示例性RNA GalNAc缀合物单一化学实体偶联序列。
如表2中所用的，大写字母A、C、G和U分别指带有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的核糖核苷酸；小写字母a、c、g和u分别指带有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的修饰的(例如，2’-OMe或2’-MOE)核糖核苷酸；字母“T”是指胸腺嘧啶或脱氧胸苷；并且字母“s”是指含磷键(例如硫代磷酸酯(PS)键、磷酸二酯键或二硫代磷酸酯键)。如表2中所用的，“(GalNAc)”是指靶向部分，例如包含GalNAc或其衍生物的靶向部分。如表2中所用的，“(GalNAc)”还包括包含多个GalNAc结构或其衍生物(例如GalNAc或其衍生物的二聚体、三聚体、四聚体，包括表1中所述的GalNAc结构)的靶向部分。在一些实施方案中，“s”表示硫代磷酸酯(PS)键。如本文公开的，核苷酸序列和修饰模式包括RNA或其片段、CRISPR指导RNA(例如sgRNA)、双指导RNA或mRNA的所有长度、结构和类型。例如，如上表2中所述的核苷酸序列和修饰模式可指示单指导RNA、双指导RNA、核酸酶mRNA或其任何片段或区段中的RNA序列和修饰模式。
与受体靶向部分缀合的指导RNA和包含靶向部分的偶联序列的非限制性实例在下表3中提供。(GalNAc)缀合物部分与指导RNA的3’和/或5’端共价缀合，和/或与指导RNA的3’和/或5’端共价缀合并在配体和指导RNA之间具有另外的核苷酸间隔区。指导RNA缀合物3-1和3-2(表3)是GalNAc配体与指导RNA直接缀合的代表性实例。指导RNA缀合物3-10至3-21，其中GalNAc配体与另外的3’和/或5’核苷酸间隔区的3’/5’端缀合。将指导RNA链延伸至具有所需数量的核苷酸的3’端或5’端或两者。(GalNAc)与寡核苷酸的3’端、5’端或两者缀合，该寡核苷酸与指导RNA链上延伸的核苷酸互补，以形成导致单一化学实体的互补双链体。缀合物设计3-3至3-8由延伸的核苷酸间隔区和携带GalNAc配体的间隔区互补链构成。如表3中所用的，大写字母A、C、G和U分别指带有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的核糖核苷酸；小写字母a、c、g和u分别指带有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的修饰的(例如，2’-OMe或2’-MOE)核糖核苷酸；字母“T”是指胸腺嘧啶或脱氧胸苷；并且字母“s”是指磷酸酯键(例如硫代磷酸酯(PS)键、磷酸二酯键或二硫代磷酸酯键)。在一些实施方案中，“s”表示PS键。如表3中所用的，“(GalNAc)”是指靶向部分，例如包含GalNAc或其衍生物的靶向部分。如表3中所用的，“(GalNAc)”还包括包含多个GalNAc结构或其衍生物(例如GalNAc或其衍生物的二聚体、三聚体、四聚体)的靶向部分。
表3.指导RNA GalNAc缀合物设计
如本文公开的，核苷酸序列和修饰模式包括RNA或其片段、CRISPR指导RNA(例如sgRNA)、双指导RNA或mRNA的所有长度、结构和类型。例如，如上表3中所述的核苷酸序列和修饰模式可指示单指导RNA、双指导RNA、核酸酶mRNA或其任何片段或区段中的RNA序列和修饰模式。
靶向部分可以经由载体附接至本文所述的核酸。载体可以包括(i)至少一个“骨架附接点”，优选两个“骨架附接点”，以及(ii)至少一个“系链附接点”。如本文所用的“骨架附接点”是指官能团(例如羟基基团)，或者通常可用于且适合于将载体单体掺入至寡核苷酸骨架(例如，磷酸酯或修饰的磷酸酯，例如，含硫骨架)中的键。“系链附接点”(TAP)是指连接选定部分的载体单体的原子，例如，碳原子或杂原子(不同于提供骨架附接点的原子)。选定部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。任选地，选定部分通过居间系链连接至载体单体。因此，载体将通常包括官能团(例如，氨基基团)或通常提供键，其适合于将另一化学实体(例如，配体)掺入或系链至组成原子。示教核酸缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利第4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,149,782；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,672,662；5,688,941；5,714,166；6,153,737；6,172,208；6,300,319；6,335,434；6,335,437；6,395,437；6,444,806；6,486,308；6,525,031；6,528,631；6,559,279号；其内容通过引用以其整体并入本文。
靶向部分可以经由接头附接至活性药剂，例如指导RNA。接头可以结合至一种或多种活性药剂和靶向部分配体，以形成缀合物，其中缀合物在递送至靶细胞后释放至少一种活性药剂，例如指导RNA或指导RNA-Cas复合体。接头可以通过官能团附接至靶向部分和活性药剂，该官能团独立地选自酯键、二硫化物、酰胺、酰腙、醚、氨基甲酸酯、碳酸酯和脲。可替代地，接头可以通过(例如由硫醇和马来酰亚胺、叠氮化物和炔烃之间的缀合提供的)不可切割基团附接至靶向部分或活性药剂。在一些实施方案中，靶向部分包含一个或多个接头。在一些实施方案中，如本文所述的一个或多个接头将靶向部分的一部分连接至靶向部分的不同部分。例如，靶向部分可以包含2、3、4、5或更多个GalNAc结构或其衍生物，其通过一个或多个接头连接。在一些实施方案中，靶向部分中的两个或更多个GalNAc结构或其衍生物通过一个或多个不可切割接头连接。在一些实施方案中，本文所述的缀合物包含直接连接至靶向部分的糖部分的活性药剂。
接头可以各自独立地包含一个或多个官能团，其选自乙二醇、丙二醇、酰胺、酯、醚、烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基基团中的每一个任选被一个或多个基团取代，该基团各自独立地选自卤素、氰基、硝基、羟基、羧基、氨基甲酰基、醚、烷氧基、芳氧基、氨基、酰胺、氨基甲酸酯、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳基、杂环基，其中羧基、氨基甲酰基、醚、烷氧基、芳氧基、氨基、酰胺、氨基甲酸酯、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳基或杂环基中的每一个任选被一个或多个基团取代，该基团各自独立地选自卤素、氰基、硝基、羟基、羧基、氨基甲酰基、醚、烷氧基、芳氧基、氨基、酰胺、氨基甲酸酯、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂芳基、杂环基。在一些实施方案中，接头独立地包含磷酸酯、硫代磷酸酯、酰胺、醚、肟、肼或氨基甲酸酯。如本文所预期的，应理解，在一些实施方案中，式(V)、(VI)、(VIa)或(VIb)的靶向缀合物包含本文所述的接头。例如，基团R和L1-L12中的任一个可以包含一个或多个接头。
在一些实施方案中，接头可以独立地包含C1-C10直链烷基、C1-C10直链O-烷基、C1-C10直链取代的烷基、C1-C10直链取代的O-烷基、C4-C13支链烷基、C4-C13支链O-烷基、C2-C12直链烯基、C2-C12直链O-烯基、芳烷基、C3-C12直链取代的烯基、C3-C12直链取代的O-烯基、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(丙交酯-co-乙交酯)、聚己内酯、聚氰基丙烯酸酯、酮、芳基、杂环、琥珀酸酯、氨基酸、芳族基团、醚、冠醚、脲、硫脲、酰胺、嘌呤、嘧啶、双吡啶、用作交联剂的吲哚衍生物、螯合剂、醛、酮、双胺、双醇、杂环结构、吖丙啶、二硫化物、硫醚、腙及其组合。例如，接头可以是C3直链烷基或酮。接头的烷基链可以被一个或多个取代基或杂原子取代。在一些实施方案中，接头的烷基链可以任选被一个或多个原子或基团中断，该原子或基团选自-O-、-C(＝0)-、-NR、-0-C(＝0)-NR-、-S-、-S-S-。
在一些实施方案中，接头可以是可切割的并且被切割以释放活性药剂。可切割官能团可以在体内水解或可以设计成(例如通过组织蛋白酶B)酶促水解。如本文所用，“可切割”接头是指可以物理或化学切割的任何接头。物理切割的实例可以是通过光、放射性发射或热来切割，而化学切割的实例包括通过氧化还原反应、水解、pH依赖性切割来切割。
接头可以包含直接键或原子(例如氧或硫)、单元(例如NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，例如但不限于取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳烷基、杂芳烯基、杂芳炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳烷基、烷基芳烯基、烷基芳炔基、烯基芳烷基、烯基芳烯基、烯基芳炔基、炔基芳烷基、炔基芳烯基、炔基芳炔基、烷基杂芳烷基、烷基杂芳烯基、烷基杂芳炔基、烯基杂芳烷基、烯基杂芳烯基、烯基杂芳炔基、炔基杂芳烷基、炔基杂芳烯基、炔基杂芳炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R’)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环中断或封端；其中R’为氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。在一个实施方案中，接头为1-24个原子，优选4-24个原子，优选6-18个原子，更优选8-18个原子，最优选8-16个原子。
在一个实施方案中，接头是—[(P-Q”-R)q—X—(P’Q’”-R’)q’]q”-T-，其中P、R、T、P’、R’和T在每次出现时各自独立地为不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、CH2O；NHCH(Ra)C(O)、—C(O)—CH(Ra)—NH—、CH═N—O、 或杂环基；Q”和Q’”在每次出现时各自独立地为不存在、—(CH2)n—、—C(R1)(R2)(CH2)n—、—(CH2)nC(R1)(R2)—、—(CH2CH2O)mCH2CH2—或—(CH2CH2O)mCH2CH2NH—；X不存在或为可切割连接基团；Ra为H或氨基酸侧链；R1和R2在每次出现时各自独立地为H、CH3、OH、SH或N(RN)2；RN在每次出现时独立地为H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或苄基；q、q’和q”在每次出现时各自独立地为0-20，并且其中重复单元可以相同或不同；n在每次出现时独立地为1-20；m在每次出现时独立地为0-50。
在一个实施方案中，接头包含至少一个可切割连接基团。在某些实施方案中，接头是支链接头。支链接头的分支点可以是至少三价，但可以是四价、五价或六价的原子，或呈现这种多价的基团。在某些实施方案中，分支点是—N、—N(O)—C、—O—C、—S—C、—SS—C、—C(O)N(O)—C、—OC(O)N(O)—C、—N(O)C(O)—C或—N(O)C(O)O—C；其中Q在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基。在其他实施方案中，分支点是甘油或甘油衍生物。
在一个实施方案中，接头可以被酶切割。作为非限制性实例，接头可以是多肽部分，例如Govindan的WO2010093395中的AA，其内容通过引用以其整体并入本文；其可被细胞内肽酶切割。Govindan示教了接头中的AA可以是二肽、三肽或四肽，例如Ala-Leu、Leu-Ala-Leu和Ala-Leu-Ala-Leu。在另一实例中，可切割接头可以是分支肽。分支肽接头可以包含两个或更多个提供酶切割位点的氨基酸部分。Dubowchik的WO1998019705中公开的任何分支肽接头(其内容通过引用以其整体并入本文)可以用作本发明缀合物中的接头。作为另一实例，接头可以包含Govindan等人的US 8877901中公开的溶酶体可切割多肽，其内容通过引用以其整体并入本文。作为另一实例，接头可以包含可被肿瘤相关蛋白酶选择性酶切割的蛋白肽序列，例如Firestone等人的US 6214345中公开的任何Y和Z结构，其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，接头可以包含可切割连接基团。可切割连接基团是在细胞外足够稳定、但在进入靶细胞后被切割以释放接头结合的两个部分的连接基团。在优选实施方案中，可切割连接基团在靶细胞中或在第一参考条件(其可以例如经选定以模拟或代表细胞内条件)下的切割比在对象的血液中或在第二参考条件(其可以例如经选定以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)下的切割快至少10倍或更多，优选快至少100倍。可切割连接基团可以对切割剂敏感，例如，pH、氧化还原电位或降解分子的存在。通常，切割剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性发现。这种降解剂的实例包括：针对特定底物选定的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂(例如硫醇)，其可通过还原降解氧化还原可切割连接基团；酯酶；能够产生酸性环境的内体或试剂，例如，导致pH为五或更低的那些；可以通过用作通用酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可切割连接基团的酶。
可切割连接基团(例如二硫键)可以对pH敏感。人血清的pH为7.4，而细胞内平均pH稍低，范围为约7.1-7.3。内体具有更酸性的pH，范围为5.5-6.0，并且溶酶体具有甚至更酸性的pH，约5.0。一些接头将具有可切割连接基团，其在优选pH下被切割，从而将阳离子脂质从细胞内的配体释放，或释放至细胞的所需隔室中。
接头可以包括可被特定酶切割的可切割连接基团。掺入至接头中的可切割连接基团的类型可以取决于待靶向的细胞。例如，肝脏靶向配体可以通过包括酯基团的接头与阳离子脂质连接。肝脏细胞富含酯酶，因此接头在肝脏细胞中比在不富含酯酶的细胞类型中更有效地切割。其他富含酯酶的细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。
一类可切割连接基团是氧化还原可切割连接基团，其在还原或氧化后被切割。可还原切割连接基团的实例是二硫化物连接基团(—S—S—)。为了确定候选可切割连接基团是否是合适的“可还原切割连接基团”或例如是否适合于与特定的RNA部分和特定的靶向剂一起使用，可以考虑本文所述的方法。例如，可以使用本领域已知的试剂通过与二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂一起孵育来评估候选物，该试剂模拟将在细胞(例如，靶细胞)中观察到的切割速率。也可以在经选定以模拟血液或血清条件的条件下评估候选物。在优选实施方案中，候选化合物在血液中至多切割10％。在优选实施方案中，与血液(或在经选定以模拟细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选化合物在细胞中(或在经选定以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解快至少2、4、10或100倍。在经选定以模拟细胞内介质的条件下，并且与经选定以模拟细胞外介质的条件相比，可以使用标准酶动力学试验来确定候选化合物的切割速率。
在一些实施方案中，接头可以包含基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的试剂切割。切割细胞中磷酸酯基团的试剂的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团(即，含磷键或含磷接头)的实例是—P(O)(ORk)-O—、—O—P(S)(ORk)—O—、—O—P(S)(SRk)—O—、—S—P(O)(ORk)—O—、—O—P(O)(ORk)-S—、—S—P(O)(ORk)-S—、—O—P(S)(ORk)-S—、—S—P(S)(ORk)—O—、—O—P(O)(Rk)—O—、—O—P(S)(Rk)—O—、—S—P(O)(Rk)—O—、—S—P(S)(Rk)—O—、—S—P(O)(Rk)-S—、—O—P(S)(Rk)-S—。在一些实施方案中，基于磷酸酯的连接基团是—O—P(O)(OH)—O—、—O—P(S)(OH)—O—、—O—P(S)(SH)—O—、—S—P(O)(OH)—O—、—O—P(O)(OH)—S—、—S—P(O)(OH)—S—、—O—P(S)(OH)—S—、—S—P(S)(OH)—O—、—O—P(O)(H)—O—、—O—P(S)(H)—O—、—S—P(O)(H)—O—、—S—P(S)(H)—O—、—S—P(O)(H)—S—、—O—P(S)(H)—S—S—。在一些实施方案中，基于磷酸酯的接头是—O—P(O)(OH)—O—。
在一些实施方案中，接头可以包含酸可切割连接基团。酸可切割连接基团是在酸性条件下被切割的连接基团。在优选实施方案中，酸可切割连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中被切割，或通过可以用作通用酸的试剂(例如酶)被切割。在细胞中，特定的低pH细胞器(例如内体和溶酶体)可以提供酸可切割连接基团的切割环境。酸可切割连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式—C═NN—、C(O)O或—OC(O)。优选实施方案是当附接至酯的氧的碳(烷氧基基团)是芳基基团、取代的烷基基团或叔烷基(例如二甲基戊基或叔丁基)时。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法来评估。
在一些实施方案中，接头可以包含基于酯的连接基团。基于酯的可切割连接基团在细胞中被酶(例如酯酶和酰胺酶)切割。基于酯的可切割连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式—C(O)O—或—OC(O)—。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法来评估。
在一些实施方案中，接头可以包含基于肽的连接基团。基于肽的可切割连接基团在细胞中被酶(例如肽酶和蛋白酶)切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包括酰胺基团(—C(O)NH—)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的可切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式—NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)—，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团。
当靶向富含肽酶的细胞类型(例如肝脏细胞和滑膜细胞)时，可以使用含有肽键的接头。
通常，候选可切割连接基团的适合性可以通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评估。还需要测试候选可切割连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定第一和第二条件之间对切割的相对敏感性，其中第一条件经选定以指示靶细胞中的切割，并且第二条件经选定以指示其他组织或生物流体(例如，血液或血清)中的切割。可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行评估。在无细胞或培养条件下进行初始评估并通过在整个动物中进一步评估来证实可能是有用的。在优选实施方案中，与血液或血清(或在经选定以模拟细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选化合物在细胞中(或在经选定以模拟细胞内条件的体外条件下)的切割快至少2、4、10或100倍。
在一些实施方案中，本文所述的缀合物包含式(I)的结构，
其中每个X独立地为H或保护基团，并且W表示活性药剂或偶联序列。式(I)的一个或多个接头可以各自独立地包含如本发明中所述的接头。在一些实施方案中，式(I)的保护基团中的每一个独立地选自：4-乙酰氧基-2,2-二甲基丁酰基(ADMB)、3-(2-羟苯基)-3,3-二甲基丙酸酯(DMBPP)、3-(2-羟基-4,6-二甲基苯基)-3,3-二甲基丙酸酯基团(TMBPP)、甲磺酰基乙氧基羰基(Msc)、2,2-二甲基环丙烷(DMTM)磷酸酯、2-吡啶基甲基、扁桃酸乙酯、(苯硫基甲基)苄基、五氟代丙酰(PFP)、苯甲酰基(Bz)、乙酰基(Ac)、杆菌胺(Bac)、苄基(Bn)、1-苯亚磺酰基哌啶(BSP)、叔丁氧基羰基(Boc)、亚苄基缩醛、炔丙基、萘基炔丙基、碳酸酯、二氯乙酰基、叔丁基亚甲硅基、四异丙基二亚硅氧烷基(TIPDS)、甲氧苄基(PMB)、亚二甲苯基和对甲氧苯基(MP)。示例性保护基团在Guo等人，Molecules 2010,15,7235-7265中进一步公开，其在此通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，X为H。在一些实施方案中，每个X独立地选自H和Bz。在式(I)的一些实施方案中，W为活性药剂。在一些实施方案中，W为核酸。在一些实施方案中，W为gRNA。在一些实施方案中，W为单链、双链、部分双链或发夹茎环核酸。在式(I)的一些实施方案中，W为偶联序列。在一些实施方案中，W包含RNA或DNA序列。W可以包含一个或多个修饰的DNA或RNA碱基。核碱基可以包含如本文所述的任何化学修饰。在一些实施方案中，核碱基包括2’-OH或2’-OMe修饰。例如，W可以包含一个或多个2’-OMe修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶，称为(a)、(c)、(g)或(u)。在一些实施方案中，修饰的RNA(例如gRNA或mRNA)包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50或更多个修饰的核碱基。在一些实施方案中，修饰的RNA在序列的5’端附近、3’端附近或中间包含一个或多个修饰的核碱基。修饰的RNA中的修饰的核碱基可以连续或可以不连续。在一些实施方案中，修饰的RNA包含沿着序列长度分散的一个或多个2’-OMe修饰。在一些实施方案中，修饰的RNA包含沿着序列长度分散的一个或多个2’OH修饰。在一些实施方案中，修饰的RNA包含交替的2’-OH和2’OMe修饰。在一些实施方案中，W包含(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至50的整数(SEQ ID NO:118)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至20(SEQ ID NO:119)或3至15(SEQ ID NO:120)的整数。在一些实施方案中，W包含与偶联序列互补的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，W包含一个或多个鸟嘌呤或胞苷。在一些实施方案中，W包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50或更多个鸟嘌呤或胞苷。在一些实施方案中，一个或多个鸟嘌呤或胞苷与偶联序列中的一个或多个胞苷或鸟嘌呤互补。在一些实施方案中，鸟嘌呤或胞苷在W或偶联序列的末端。不希望受任何理论束缚，预期鸟嘌呤-胞苷配对形成“GC锁”或“CG锁”，其将增加结合亲和力。W或偶联序列中的鸟嘌呤和/或胞苷可以连续或可以不连续，并且可以包含如本文所述的化学修饰中的任一种，例如2’-OMe或2’-OH修饰。
在一些实施方案中，式(I)的缀合物包含式(Ia)的结构，
在一些实施方案中，式(I)的缀合物包含式(Ib)的结构，
在一些实施方案中，本文所述的缀合物包含式(II)的结构，
其中每个X独立地为H或保护基团，Z为修饰的或未修饰的C5或C6单糖，并且W表示活性药剂或偶联序列。式(II)的一个或多个接头可以各自独立地包含如本发明中所述的接头。在一些实施方案中，式(II)的保护基团中的每一个独立地选自：4-乙酰氧基-2,2-二甲基丁酰基(ADMB)、3-(2-羟苯基)-3,3-二甲基丙酸酯(DMBPP)、3-(2-羟基-4,6-二甲基苯基)-3,3-二甲基丙酸酯基团(TMBPP)、甲磺酰基乙氧基羰基(Msc)、2,2-二甲基环丙烷(DMTM)磷酸酯、2-吡啶基甲基、扁桃酸乙酯、(苯硫基甲基)苄基、五氟代丙酰(PFP)、苯甲酰基(Bz)、乙酰基(Ac)、杆菌胺(Bac)、苄基(Bn)、1-苯亚磺酰基哌啶(BSP)、叔丁氧基羰基(Boc)、亚苄基缩醛、炔丙基、萘基炔丙基、碳酸酯、二氯乙酰基、叔丁基亚甲硅基、四异丙基二亚硅氧烷基(TIPDS)、甲氧苄基(PMB)、亚二甲苯基和对甲氧苯基(MP)。在一些实施方案中，X为H。在一些实施方案中，每个X独立地选自H和Bz。在式(II)的一些实施方案中，Z为半乳糖或甘露糖。在式(II)的一些实施方案中，Z为GalNAc。在式(II)的一些实施方案中，W为活性药剂。在一些实施方案中，W为核酸。在一些实施方案中，W为gRNA。在一些实施方案中，W为单链、双链、部分双链或发夹茎环核酸。在式(II)的一些实施方案中，W为偶联序列。在一些实施方案中，W包含RNA或DNA序列。在一些实施方案中，W包含(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至50的整数(SEQ ID NO:118)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至20(SEQ ID NO:119)或3至15(SEQ ID NO:120)的整数。
在一些实施方案中，式(II)的缀合物包含式(IIa)的结构，
在一些实施方案中，式(II)的缀合物包含式(IIb)的结构，
在一些实施方案中，式(II)的缀合物包含式(IIc)的结构，
在一些实施方案中，本文所述的缀合物包含式(III)的结构，
其中每个X独立地为H或保护基团，Z为修饰的或未修饰的C5或C6单糖，并且W表示活性药剂或偶联序列。式(III)的一个或多个接头可以各自独立地包含如本发明中所述的接头。在一些实施方案中，式(III)的保护基团中的每一个独立地选自：4-乙酰氧基-2,2-二甲基丁酰基(ADMB)、3-(2-羟苯基)-3,3-二甲基丙酸酯(DMBPP)、3-(2-羟基-4,6-二甲基苯基)-3,3-二甲基丙酸酯基团(TMBPP)、甲磺酰基乙氧基羰基(Msc)、2,2-二甲基环丙烷(DMTM)磷酸酯、2-吡啶基甲基、扁桃酸乙酯、(苯硫基甲基)苄基、五氟代丙酰(PFP)、苯甲酰基(Bz)、乙酰基(Ac)、杆菌胺(Bac)、苄基(Bn)、1-苯亚磺酰基哌啶(BSP)、叔丁氧基羰基(Boc)、亚苄基缩醛、炔丙基、萘基炔丙基、碳酸酯、二氯乙酰基、叔丁基亚甲硅基、四异丙基二亚硅氧烷基(TIPDS)、甲氧苄基(PMB)、亚二甲苯基和对甲氧苯基(MP)。在一些实施方案中，X为H。在一些实施方案中，每个X独立地选自H和Bz。在式(III)的一些实施方案中，Z为半乳糖或甘露糖。在式(III)的一些实施方案中，Z为GalNAc。在式(III)的一些实施方案中，W为活性药剂。在一些实施方案中，W为核酸。在一些实施方案中，W为gRNA。在一些实施方案中，W为单链、双链、部分双链或发夹茎环核酸。在式(III)的一些实施方案中，W为偶联序列。在一些实施方案中，W包含RNA或DNA序列。在一些实施方案中，W包含(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至50的整数(SEQ ID NO:118)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至20(SEQ ID NO:119)或3至15(SEQ ID NO:120)的整数。
在一些实施方案中，式(III)的缀合物包含式(IIIa)的结构，
在一些实施方案中，式(III)的缀合物包含式(IIIb)的结构，
在一些实施方案中，式(III)的缀合物包含式(IIIc)的结构，
其中Y为O或S。
在一些实施方案中，式(III)的缀合物包含式(IIId)的结构，
其中Y为O或S。
在一些实施方案中，式(III)的缀合物包含式(IIIe)的结构，
其中Y为O或S。
在一些实施方案中，本文所述的缀合物包含式(IV)的结构，
其中每个X独立地为H或保护基团，RA为-OX或-NHAc，Y为O或S，并且W表示活性药剂或偶联序列。式(IV)的一个或多个接头可以各自独立地包含如本发明中所述的接头。在一些实施方案中，式(IV)的保护基团中的每一个独立地选自：4-乙酰氧基-2,2-二甲基丁酰基(ADMB)、3-(2-羟苯基)-3,3-二甲基丙酸酯(DMBPP)、3-(2-羟基-4,6-二甲基苯基)-3,3-二甲基丙酸酯基团(TMBPP)、甲磺酰基乙氧基羰基(Msc)、2,2-二甲基环丙烷(DMTM)磷酸酯、2-吡啶基甲基、扁桃酸乙酯、(苯硫基甲基)苄基、五氟代丙酰(PFP)、苯甲酰基(Bz)、乙酰基(Ac)、杆菌胺(Bac)、苄基(Bn)、1-苯亚磺酰基哌啶(BSP)、叔丁氧基羰基(Boc)、亚苄基缩醛、炔丙基、萘基炔丙基、碳酸酯、二氯乙酰基、叔丁基亚甲硅基、四异丙基二亚硅氧烷基(TIPDS)、甲氧苄基(PMB)、亚二甲苯基和对甲氧苯基(MP)。在一些实施方案中，X为H。在一些实施方案中，每个X独立地选自H和Bz。在一些实施方案中，RA为-OX。在一些实施方案中，RA为-OH。在一些实施方案中，RA为-NHAc。在式(IV)的一些实施方案中，W为活性药剂。在一些实施方案中，W为核酸。在一些实施方案中，W为gRNA。在一些实施方案中，W为单链、双链、部分双链或发夹茎环核酸。在式(IV)的一些实施方案中，W为偶联序列。在一些实施方案中，W包含RNA或DNA序列。在一些实施方案中，W包含(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至50的整数(SEQ ID NO:118)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至20(SEQ ID NO:119)或3至15(SEQ ID NO:120)的整数。
在一些实施方案中，式(IV)的缀合物包含如表1所示的1-1、1-2、1-5、1-6、1-9、1-10、1-11或1-12的结构。
在式(I)、式(Ia)、式(II)、式(IIa)、式(IIc)、式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)、式(IIIc)、式(IIId)、式(IIIe)或式(IV)的一些实施方案中，其中在前述式的框中提及的“一个或多个接头”包含选自以下的结构：
其中每个接头是独立的。在式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(II)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIc)、式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)、式(IIIc)、式(IIId)、式(IIIe)或式(IV)的一些实施方案中，其中接头中的每一个独立地具有-(L1)k1-(L2)k2-(L3)k3-(L4)k4-结构，其中k1、k2、k3和k4中的每一个独立地为0、1或2，并且L1、L2、L3和L4中的每一个独立地选自氧代、酯、酰胺、氨基、C1-C3亚烷基和-(CH2-CH2-O)1-3-。在一些实施方案中，k1、k2、k3和k4的总和为大于或等于1的整数。在一些实施方案中，k1、k2、k3和k4的总和为大于或等于2的整数。如本领域普通技术人员将认识到的，“N”指的是氮并且指的是附接点。
在式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(II)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIc)、式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)、式(IIIc)、式(IIId)、式(IIIe)或式(IV)的一些实施方案中，其中接头中的每一个独立地具有-(L1)k1-(L2)k2-(L3)k3-(L4)k4-结构，其中k1、k2、k3和k4中的每一个独立地位0、1或2，并且L1、L2、L3和L4独立地选自-O-、-S-、S(＝O)1-2-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-NRL-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-NRLC(＝O)NRL-、-P(＝O)RL-、-NRLS(＝O)(＝NRL)-、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-N＝N-、-(CH2-CH2-O)1-6-、直链或支链C1-6亚烷基、直链或支链C2-6亚烯基、直链或支链C2-6亚炔基、C3-C8环亚烷基、C2-C7杂环亚烷基、C6-C10亚芳基和C5-C9杂亚芳基，其中亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基是取代或未取代的，并且其中每个RL独立地为H、D、氰基、卤素、取代或未取代的C1-C6烷基、-CD3、-OCH3、-OCD3、取代或未取代的C1-C6卤代烷基、取代或未取代的C1-C6杂烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C2-C7杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，每个RL独立地为H、取代或未取代的C1-C6烷基、-OCH3、取代或未取代的C1-C6卤代烷基、取代或未取代的C1-C6杂烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、或者取代或未取代的C2-C7杂环烷基。
在式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(II)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIc)、式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)、式(IIIc)、式(IIId)、式(IIIe)或式(IV)的一些实施方案中，接头中的每一个独立地包含选自以下的结构： 其中p、q、m和n中的每一个独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，p、q、m和n中的每一个独立地为0、1、2、3、4或5。
在式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(II)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIc)、式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)、式(IIIc)、式(IIId)、式(IIIe)或式(IV)的一些实施方案中，其中在前述式的框中提及的“一个或多个接头”包含以下结构：
其中p、q、m和n中的每一个独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、13、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，p、q、m和n中的每一个独立地为0、1、2、3、4或5。
在式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(II)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIc)、式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)、式(IIIc)、式(IIId)、式(IIIe)或式(IV)的一些实施方案中，W包含一个或多个修饰的DNA或RNA碱基。核碱基可以包含如本文所述的任何化学修饰。在一些实施方案中，核碱基包括2’-OH或2’-OMe修饰。例如，W可以包含一个或多个2’-OMe修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶，称为(a)、(c)、(g)或(u)。在一些实施方案中，修饰的RNA(例如gRNA或mRNA)包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50或更多个修饰的核碱基。在一些实施方案中，修饰的RNA在序列的5’端附近、3’端附近或中间包含一个或多个修饰的核碱基。修饰的RNA中的修饰的核碱基可以连续或可以不连续。在一些实施方案中，修饰的RNA包含沿着序列长度分散的一个或多个2’-OMe修饰。在一些实施方案中，修饰的RNA包含沿着序列长度分散的一个或多个2’OH修饰。在一些实施方案中，修饰的RNA包含交替的2’-OH和2’OMe修饰。在一些实施方案中，W包含(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至50的整数(SEQ ID NO:118)。在一些实施方案中，W包含(u)n，其中n为3至20(SEQ ID NO:119)或3至15(SEQ ID NO:120)的整数。在一些实施方案中，W包含与偶联序列互补的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，W包含一个或多个鸟嘌呤或胞苷。在一些实施方案中，W包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50或更多个鸟嘌呤或胞苷。在一些实施方案中，一个或多个鸟嘌呤或胞苷与偶联序列中的一个或多个胞苷或鸟嘌呤互补。在一些实施方案中，鸟嘌呤或胞苷在W或偶联序列的末端。不希望受任何理论束缚，预期鸟嘌呤-胞苷配对形成“GC锁”或“CG锁”，其将增加结合亲和力。W或偶联序列中的鸟嘌呤和/或胞苷可以连续或可以不连续，并且可以包含如本文所述的化学修饰中的任一种，例如2’-OMe或2’-OH修饰。
受体靶向缀合物
实现基于核酸的治疗的关键是将有效负载安全有效地递送至特定细胞类型和组织。脂质纳米颗粒(LNP)表示目前最先进的非病毒药物递送技术平台。LNP物理上能够穿过血管并到达肝细胞[Am.J.Pathol.2010,176,14-21]。还已经揭示，载脂蛋白E(ApoE)蛋白在PEG-脂质从LNP表面扩散后结合至LNP，其在血流中具有接近中性的电荷，并且充当针对肝细胞的内源性配体，该肝细胞表达低密度脂蛋白受体(LDLr)[Mol.Ther.,2010,18,1357-1364]。因此，设想控制LNP的有效肝递送的两个关键因素是：1)血清中LNP表面的PEG-脂质有效脱落，以及2)结合至LNP的ApoE。上述内源性ApoE介导的LDLr依赖性LNP递送途径对于LDLr缺陷型患者群体不是实现基于LNP的肝基因递送的有效途径。
在一方面，本文描述了LNP，其包含受体靶向缀合物。在某些方面，本文描述了受体靶向缀合物。构成带靶向缀合物的LNP，以在颗粒的表面或外周具有受体靶向部分。在一方面，使用低mol％的受体靶向缀合物，同时构成靶向LNP，以实现靶向部分在颗粒的表面/外周上的低表面密度。在另一方面，使用高mol％的受体靶向缀合物，同时构成靶向LNP，以实现靶向部分在颗粒的表面/外周上的高表面密度。在另一方面，使用所需mol％的受体靶向缀合物，以实现靶向部分在颗粒的表面/外周上的表面密度范围。在一些实施方案中，受体靶向缀合物包含靶向部分(或配体)、接头和连接至靶向部分的亲脂性部分。在一些实施方案中，受体靶向部分(或配体)靶向凝集素受体。在一些实施方案中，凝集素受体是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，受体靶向部分是GalNAc或靶向ASGPR的GalNAc衍生物。在一方面，受体靶向缀合物包含一个GalNAc部分或其衍生物。在另一方面，受体靶向缀合物包含两个GalNAc部分或其衍生物。在另一方面，受体靶向缀合物包含三个GalNAc部分或其衍生物。在另一方面，受体靶向缀合物是亲脂性的。在一些实施方案中，受体靶向缀合物包含一个或多个GalNAc部分以及一个或多个脂质部分，即，GalNAc-脂质。在一些实施方案中，受体靶向缀合物是GalNAc-脂质。
本发明提供了以独立于LDLr的方式向肝细胞递送组织特异性有效LNP。本发明开发的三价GalNAc部分通过不同的PEG-间隔区附接至疏水性基于甘油的二烷基脂质链、甾醇(例如胆固醇)和疏水性α-生育酚。然后将这些与GalNAc缀合的脂质与各种赋形剂一起配制，以产生携带低至高表面密度的定制设计的GalNAc配体的LNP，以靶向脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，该脱唾液酸糖蛋白受体在肝细胞表面上高度表达。
工程化LNP表面上的配体促进ASGPR介导的组织特异性摄取至肝细胞中。构成不同的GalNAc-LNP，以避免ApoE结合并使GalNAc-ASGPR能够相互作用以促进网格蛋白介导的摄取至肝细胞中。通过使用本文所述的PEG-脂质与具有不同PEG-系链的GalNAc-脂质组合来调节PEG脱落动力学和调节GalNAc-LNP颗粒的净表面电荷密度产生缺乏内源性ApoE结合特征的GalNAc-LNP，从而以安全且有效的剂量将携带RNA有效负载的颗粒特异性递送至LDLR缺陷型临床前动物模型的肝细胞。临床前动物模型中的剂量优化进一步推动了将GalNAc-LNP(或LNP)引至临床开发以治疗LDLR缺陷型患者群体，从而以治疗上可行的安全且有效的剂量引发基因组编辑。
因此，在一方面，本文公开了一种受体靶向缀合物，其包含式(V)的化合物：
其中，
多个A基团共同包含受体靶向配体；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12中的每一个独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-或-O[(P＝O)S-]O-或键；
L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-、取代或未取代的-(OCH2CH2)n-、取代或未取代的-(CH2)n-或键；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R为脂质、核酸、氨基酸、蛋白质或脂质纳米颗粒；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
在一些实施方案中，受体靶向缀合物包含式(V)的化合物：
其中，
多个A基团共同包含受体靶向配体；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12中的每一个独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-或-N(OR1)-；
L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-，或者取代或未取代的-(OCH2CH2)n-；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R为脂质、核酸、氨基酸、蛋白质或脂质纳米颗粒；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
在一些实施方案中，L11为-(CH2CH2O)n-或-(OCH2CH2)n-。
在式(V)的化合物的一些实施方案中，A结合至凝集素。在一些实施方案中，凝集素是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，A包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。
在式(V)的化合物的一些实施方案中，A为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物。在一些实施方案中，A为GalNAc。在一些实施方案中，A为或包含半乳糖。
在式(V)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在式(V)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C2-C6亚烷基。在式(V)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自为C4亚烷基。
在式(V)的化合物的一些实施方案中，L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-或-C(＝O)NR1C(＝O)-。在式(V)的化合物的一些实施方案中，L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-或-NR1C(＝O)-。在式(V)的化合物的一些实施方案中，L2、L5和L8各自为-C(＝O)NH-。
在式(V)的化合物的一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在式(V)的化合物的一些实施方案中，每个L3为取代或未取代的C2-C6亚烷基。在式(V)的化合物的一些实施方案中，L3为C4亚烷基。在式(V)的化合物的一些实施方案中，L6和L9各自独立地为取代或未取代的C2-C10亚烷基。在式(V)的化合物的一些实施方案中，L6和L9各自独立地为取代或未取代的C2-C6亚烷基。在式(V)的化合物的一些实施方案中，L6和L9各自为C3亚烷基。
在式(V)的化合物的一些实施方案中，R1为H。在一些实施方案中，R1为取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R1为甲基。
在另一方面，本文公开了一种受体靶向缀合物，其包含式(VI)的化合物：
其中，
多个A基团共同包含受体靶向配体；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12中的每一个独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键；
L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-、取代或未取代的-(OCH2CH2)n-、取代或未取代的-(CH2)n-或键；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R为脂质、核酸、氨基酸、蛋白质或脂质纳米颗粒；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
在一些实施方案中，本文公开了一种受体靶向缀合物，其包含式(VI)的化合物：
其中，
多个A基团共同包含受体靶向配体；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12中的每一个独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-或-N(OR1)-；
L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-，或者取代或未取代的-(OCH2CH2)n-；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R为脂质、核酸、氨基酸、蛋白质或脂质纳米颗粒；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
在一些实施方案中，L11为-(CH2CH2O)n-或-(OCH2CH2)n-。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，A结合至凝集素。在一些实施方案中，凝集素是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些实施方案中，A包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，A为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物。在一些实施方案中，A为GalNAc。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基，或者取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为包含1-10个O原子的取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为-(CH2CH2O)p1-(CH2)q1-；其中p1为1-8；并且q1为1-6。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自为-(CH2CH2O)3-(CH2)2-。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C2-C6亚烷基。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L1、L4和L7各自为C4亚烷基。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-或-C(＝O)NR1C(＝O)。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-或-NR1C(＝O)-。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L2、L5和L8各自为-NHC(＝O)-。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L2、L5和L8各自为-C(＝O)NH-。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为包含1-10个O原子的取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为-(CH2CH2O)p2-(CH2CH2CH2O)q2-；其中p2为1-8；并且q2为1-6。在一些实施方案中，p2为1。在一些实施方案中，p2为2。在一些实施方案中，p2为3。在一些实施方案中，p2为4。在一些实施方案中，p2为5。在一些实施方案中，p2为6。在一些实施方案中，p2为7。在一些实施方案中，p2为8。在一些实施方案中，q2为1。在一些实施方案中，q2为2。在一些实施方案中，q2为3。在一些实施方案中，q2为4。在一些实施方案中，q2为5。在一些实施方案中，q2为6。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L3、L6和L9各自为-(CH2CH2O)-(CH2CH2CH2O)-。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L3、L6和L9各自独立地为-(CH2CH2CH2O)q3-；其中q3为1-8。在一些实施方案中，q3为1。在一些实施方案中，q3为2。在一些实施方案中，q3为3。在一些实施方案中，q3为4。在一些实施方案中，q3为5。在一些实施方案中，q3为6。在一些实施方案中，q3为7。在一些实施方案中，q3为8。
在式(VI)的化合物的一些实施方案中，L3、L6和L9各自为-(CH2CH2CH2O)2-。
在一些实施方案中，式(VI)的化合物具有式(VIa)的结构：
其中
每个q4为1-10。
在式(VIb)的化合物的一些实施方案中，q4为1-8。在一些实施方案中，q4为1-4。在一些实施方案中，q4为1-3。在一些实施方案中，q4为1。在一些实施方案中，q4为2。在一些实施方案中，q4为3。在一些实施方案中，q4为4。在一些实施方案中，q4为5。
在式(V)或式(VI)的化合物的一些实施方案中，L10为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C1-C4亚烷基。在一些实施方案中，L10为C2亚烷基。
在一些实施方案中，式(VI)的化合物具有式(VIb)的结构：
其中，
r为1-4。
在式(VIb)的化合物的一些实施方案中，r为1、2或3。在一些实施方案中，r为1或2。在一些实施方案中，r为2或3。在一些实施方案中，r为1。在一些实施方案中，r为2。在一些实施方案中，r为3。在一些实施方案中，r为4。
在式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的化合物的一些实施方案中，L11为-(OCH2CH2)n-。在一些实施方案中，n为1-100。在一些实施方案中，n为2-50。在一些实施方案中，n为10-50。在一些实施方案中，n为20-50。在一些实施方案中，n为30-50。在一些实施方案中，n为40-50。在一些实施方案中，n为2、12、37或45。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为3。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，n为5。在一些实施方案中，n为6。在一些实施方案中，n为7。在一些实施方案中，n为8。在一些实施方案中，n为9。在一些实施方案中，n为10。在一些实施方案中，n为11。在一些实施方案中，n为12。在一些实施方案中，n为13。在一些实施方案中，n为14。在一些实施方案中，n为15。在一些实施方案中，n为16。在一些实施方案中，n为17。在一些实施方案中，n为18。在一些实施方案中，n为19。在一些实施方案中，n为20。在一些实施方案中，n为21。在一些实施方案中，n为22。在一些实施方案中，n为23。在一些实施方案中，n为24。在一些实施方案中，n为25。在一些实施方案中，n为26。在一些实施方案中，n为27。在一些实施方案中，n为28。在一些实施方案中，n为29。在一些实施方案中，n为30。在一些实施方案中，n为31。在一些实施方案中，n为32。在一些实施方案中，n为33。在一些实施方案中，n为34。在一些实施方案中，n为35。在一些实施方案中，n为36。在一些实施方案中，n为37。在一些实施方案中，n为38。在一些实施方案中，n为39。在一些实施方案中，n为40。在一些实施方案中，n为41。在一些实施方案中，n为42。在一些实施方案中，n为43。在一些实施方案中，n为44。在一些实施方案中，n为45。在一些实施方案中，n为46。在一些实施方案中，n为47。在一些实施方案中，n为48。在一些实施方案中，n为49。在一些实施方案中，n为50。在一些实施方案中，n为至少1。在一些实施方案中，n为至少2。在一些实施方案中，n为至少3。在一些实施方案中，n为至少4。在一些实施方案中，n为至少5。在一些实施方案中，n为至少6。在一些实施方案中，n为至少7。在一些实施方案中，n为至少8。在一些实施方案中，n为至少9。在一些实施方案中，n为至少10。在一些实施方案中，n为至少11。在一些实施方案中，n为至少12。在一些实施方案中，n为至少13。在一些实施方案中，n为至少14。在一些实施方案中，n为至少15。在一些实施方案中，n为至少16。在一些实施方案中，n为至少17。在一些实施方案中，n为至少18。在一些实施方案中，n为至少19。在一些实施方案中，n为至少20。在一些实施方案中，n为至少21。在一些实施方案中，n为至少22。在一些实施方案中，n为至少23。在一些实施方案中，n为至少24。在一些实施方案中，n为至少25。在一些实施方案中，n为至少26。在一些实施方案中，n为至少27。在一些实施方案中，n为至少28。在一些实施方案中，n为至少29。在一些实施方案中，n为至少30。在一些实施方案中，n为至少31。在一些实施方案中，n为至少32。在一些实施方案中，n为至少33。在一些实施方案中，n为至少34。在一些实施方案中，n为至少35。在一些实施方案中，n为至少36。在一些实施方案中，n为至少37。在一些实施方案中，n为至少38。在一些实施方案中，n为至少39。在一些实施方案中，n为至少40。在一些实施方案中，n为至少41。在一些实施方案中，n为至少42。在一些实施方案中，n为至少43。在一些实施方案中，n为至少44。在一些实施方案中，n为至少45。在一些实施方案中，n为至少46。在一些实施方案中，n为至少47。在一些实施方案中，n为至少48。在一些实施方案中，n为至少49。在一些实施方案中，n为至多2。在一些实施方案中，n为至多3。在一些实施方案中，n为至多4。在一些实施方案中，n为至多5。在一些实施方案中，n为至多6。在一些实施方案中，n为至多7。在一些实施方案中，n为至多8。在一些实施方案中，n为至多9。在一些实施方案中，n为至多10。在一些实施方案中，n为至多11。在一些实施方案中，n为至多12。在一些实施方案中，n为至多13。在一些实施方案中，n为至多14。在一些实施方案中，n为至多15。在一些实施方案中，n为至多16。在一些实施方案中，n为至多17。在一些实施方案中，n为至多18。在一些实施方案中，n为至多19。在一些实施方案中，n为至多20。在一些实施方案中，n为至多21。在一些实施方案中，n为至多22。在一些实施方案中，n为至多23。在一些实施方案中，n为至多24。在一些实施方案中，n为至多25。在一些实施方案中，n为至多26。在一些实施方案中，n为至多27。在一些实施方案中，n为至多28。在一些实施方案中，n为至多29。在一些实施方案中，n为至多30。在一些实施方案中，n为至多31。在一些实施方案中，n为至多32。在一些实施方案中，n为至多33。在一些实施方案中，n为至多34。在一些实施方案中，n为至多35。在一些实施方案中，n为至多36。在一些实施方案中，n为至多37。在一些实施方案中，n为至多38。在一些实施方案中，n为至多39。在一些实施方案中，n为至多40。在一些实施方案中，n为至多41。在一些实施方案中，n为至多42。在一些实施方案中，n为至多43。在一些实施方案中，n为至多44。在一些实施方案中，n为至多45。在一些实施方案中，n为至多46。在一些实施方案中，n为至多47。在一些实施方案中，n为至多48。在一些实施方案中，n为至多49。在一些实施方案中，n为至多50。
在式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的化合物的一些实施方案中，L12为-O-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-或-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为-C(＝O)O-或-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为-NHC(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为-NHC(＝O)-。
在式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的化合物的一些实施方案中，R1为H。在一些实施方案中，R1为取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R1为甲基。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L1为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L1为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L1为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L1为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L1为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L1为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L1为-O-。在一些实施方案中，L1为-S-。在一些实施方案中，L1为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L1为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L1为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L1为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L1为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L1为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L1为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L1为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L1为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L1为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L1为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L1为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L1为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L1为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L1为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L1为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L1为-NR1-。在一些实施方案中，L1为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L1为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L1为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L1为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L2为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L2为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L2为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L2为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L2为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L2为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L2为-O-。在一些实施方案中，L2为-S-。在一些实施方案中，L2为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L2为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L2为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L2为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L2为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L2为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L2为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L2为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L2为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L2为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L2为-NRHC(＝O)-。在一些实施方案中，L2为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L2为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L2为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L2为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L2为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L2为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L2为-NR1-。在一些实施方案中，L2为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L2为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L2为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L2为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L3为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L3为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L3为未取代的C3-4亚烷基。在一些实施方案中，L3为未取代的C1-4亚烷基。在一些实施方案中，L3为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L3为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L3为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L3为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L3为-O-。在一些实施方案中，L3为-S-。在一些实施方案中，L3为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L3为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L3为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L3为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L3为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L3为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L3为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L3为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L3为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L3为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L3为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L3为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L3为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L3为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L3为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L3为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L3为-NR1-。在一些实施方案中，L3为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L3为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L3为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L3为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L4为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L4为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L4为未取代的C4亚烷基。在一些实施方案中，L4为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L4为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L4为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L4为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L4为-O-。在一些实施方案中，L4为-S-。在一些实施方案中，L4为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L4为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L4为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L4为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L4为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L4为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L4为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L4为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L4为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L4为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L4为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L4为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L4为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L4为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L4为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L4为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L4为-NR1-。在一些实施方案中，L4为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L4为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L4为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L4为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L5为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L5为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L5为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L5为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L5为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L5为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L5为-O-。在一些实施方案中，L5为-S-。在一些实施方案中，L5为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L5为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L5为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L5为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L5为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L5为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L5为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L5为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L5为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L5为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L2为-NRHC(＝O)-。在一些实施方案中，L5为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L5为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L5为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L5为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L5为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L5为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L5为-NR1-。在一些实施方案中，L5为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L5为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L5为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L5为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L6为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L6为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L6为未取代的C3-4亚烷基。在一些实施方案中，L6为未取代的C1-4亚烷基。在一些实施方案中，L6为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L6为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L6为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L6为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L6为-O-。在一些实施方案中，L6为-S-。在一些实施方案中，L6为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L6为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L6为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L6为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L6为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L6为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L6为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L6为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L6为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L6为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L6为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L6为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L6为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L6为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L6为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L6为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L6为-NR1-。在一些实施方案中，L6为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L6为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L6为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L6为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L7为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L7为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L7为未取代的C4亚烷基。在一些实施方案中，L7为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L7为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L7为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L7为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L7为-O-。在一些实施方案中，L7为-S-。在一些实施方案中，L7为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L7为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L7为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L7为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L7为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L7为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L7为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L7为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L7为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L7为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L7为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L7为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L7为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L7为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L7为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L7为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L7为-NR1-。在一些实施方案中，L7为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L7为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L7为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L7为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L8为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L8为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L8为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L8为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L8为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L8为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L8为-O-。在一些实施方案中，L8为-S-。在一些实施方案中，L8为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L8为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L8为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L8为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L8为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L8为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L8为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L8为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L8为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L8为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L8为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L8为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L2为-NRHC(＝O)-。在一些实施方案中，L8为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L8为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L8为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L8为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L8为-NR1-。在一些实施方案中，L8为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L8为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L8为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L8为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L9为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L9为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L9为未取代的C3-4亚烷基。在一些实施方案中，L9为未取代的C1-4亚烷基。在一些实施方案中，L9为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L9为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L9为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L9为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L9为-O-。在一些实施方案中，L9为-S-。在一些实施方案中，L9为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L9为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L9为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L9为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L9为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L9为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L9为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L9为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L9为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L9为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L9为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L9为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L9为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L9为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L9为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L9为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L9为-NR1-。在一些实施方案中，L9为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L9为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L9为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L9为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L10为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L10为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L10为-O-。在一些实施方案中，L10为-S-。在一些实施方案中，L10为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L10为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L10为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L10为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L10为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L10为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L10为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L10为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L10为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L10为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L10为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L10为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L10为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L10为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L10为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L10为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L10为-NR1-。在一些实施方案中，L10为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L10为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L10为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C1-C6亚烷基。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C1-C3亚烷基。在一些实施方案中，L10为取代或未取代的C2-C3亚烷基。在一些实施方案中，L10为-CH2CH2-。在一些实施方案中，L10为键。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-、取代或未取代的-(OCH2CH2)n-、取代或未取代的-(CH2)n-或键。在一些实施方案中，L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-。在一些实施方案中，L11为取代或未取代的-(OCH2CH2)n-。在一些实施方案中，L11为取代或未取代的-(CH2)n-。在一些实施方案中，L11为键。在一些实施方案中，n为30至50。在一些实施方案中，n为30至40。在一些实施方案中，n为40至50。
根据前述提及的式，在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L12为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-、-N(OR1)-、-O[(P＝O)O-]O-、-O[(P＝O)S-]O-或键。在一些实施方案中，L12为取代或未取代的C1-C12亚烷基。在一些实施方案中，L12为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。在一些实施方案中，L12为取代或未取代的C2-C12亚烯基。在一些实施方案中，L12为取代或未取代的C2-C12亚炔基。在一些实施方案中，L12为-(CH2CH2O)m-或-(OCH2CH2)m-。在一些实施方案中，L12为-O-。在一些实施方案中，L12为-S-。在一些实施方案中，L12为-S(＝O)-。在一些实施方案中，L12为-S(＝O)2-。在一些实施方案中，L12为-S(＝O)(＝NR1)-。在一些实施方案中，L12为-C(＝O)-。在一些实施方案中，L12为-C(＝N-OR1)-。在一些实施方案中，L12为-C(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为OC(＝O)-。在一些实施方案中，L12为-C(＝O)C(＝O)-。在一些实施方案中，L12为-C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L12为-NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L12为-OC(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L12为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为-NR1C(＝O)NR1-。在一些实施方案中，L12为-C(＝O)NR1C(＝O)-。在一些实施方案中，L12为-S(＝O)2NR1-。在一些实施方案中，L12为-NR1S(＝O)2-。在一些实施方案中，L12为-NR1-。在一些实施方案中，L12为-N(OR1)-。在一些实施方案中，L12为-O[(P＝O)O-]O-。在一些实施方案中，L12为-O[(P＝O)S-]O-。在一些实施方案中，L12为取代或未取代的C1-C6亚烷基。在一些实施方案中，L12为取代或未取代的C1-C3亚烷基。在一些实施方案中，L12为取代或未取代的C2-C3亚烷基。在一些实施方案中，L12为-CH2CH2-。在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，L12为-NR1C(＝O)O-。在一些实施方案中，L12为键。在一些实施方案中，L12为插入基团R的有机分子残基。在一些实施方案中，L12可以与碱基对离子/静电相互作用或与碱基对共价键合。插入基团R的有机分子残基的一些非限制性实例可以包括小檗碱、溴化乙锭、道诺霉素、沙利度胺、多柔比星(阿霉素)、黄曲霉毒素B1、安吖啶、吖啶(例如，原黄素、奎纳克林、吖啶橙、吡唑并吖啶)、吖啶黄、氨萘非特、1,10-菲咯啉、具有多环芳族配体的金属阳离子(例如金属，例如Rh(III)；配体，例如Ir(III)、联吡啶、三联吡啶)、博来霉素、放线菌素D以及玫瑰树碱。
在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，m为选自1至10的整数。在一些实施方案中，m选自1至3。在一些实施方案中，m选自1至5。在一些实施方案中，m选自3至8。在一些实施方案中，m选自2至5。在一些实施方案中，m选自5至10。在一些实施方案中，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，m为1。在一些实施方案中，m为2。在一些实施方案中，m为3。
在式(V)或(VI)的化合物的一些实施方案中，n为选自1至200的整数。在一些实施方案中，n选自1至20。在一些实施方案中，n选自1至50。在一些实施方案中，n选自1至100。在一些实施方案中，n选自50至100。在一些实施方案中，n选自25至50。在一些实施方案中，n选自30至40。在一些实施方案中，n选自25至75。在一些实施方案中，n选自100至200。在一些实施方案中，n选自50至150。在一些实施方案中，n选自150至200。
在式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的化合物的一些实施方案中，m为选自1至10的整数。在一些实施方案中，m选自1至3。在一些实施方案中，m选自1至5。在一些实施方案中，m选自3至8。在一些实施方案中，m选自2至5。在一些实施方案中，m选自5至10。在一些实施方案中，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，m为1。在一些实施方案中，m为2。在一些实施方案中，m为3。
在式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的化合物的一些实施方案中，n为选自1至200的整数。在一些实施方案中，n选自1至20。在一些实施方案中，n选自1至50。在一些实施方案中，n选自1至100。在一些实施方案中，n选自50至100。在一些实施方案中，n选自25至50。在一些实施方案中，n选自30至40。在一些实施方案中，n选自25至75。在一些实施方案中，n选自100至200。在一些实施方案中，n选自50至150。在一些实施方案中，n选自150至200。
在式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的化合物的一些实施方案中，每个R1独立地为H或-CH3。在一些实施方案中，R1为H
在式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的化合物的一些实施方案中，R包括脂肪醇、脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮、甾醇脂质和异戊烯醇脂质(prenol lipid)中的一种或多种。在一些实施方案中，R包括一种或多种脂肪醇。在一些实施方案中，每种脂肪醇独立地为饱和、单不饱和或多不饱和脂肪醇。在一些实施方案中，脂肪醇包含一种或多种C2-C26脂肪醇。在一些实施方案中，脂肪醇包含两种或更多种C2-C26脂肪醇。在一些实施方案中，每种脂肪醇是C12、C14、C16、C18、C20或C22脂肪醇。在一些实施方案中，每种脂肪醇独立地为二十二碳六烯醇、二十碳五烯醇、油醇、硬脂醇、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基醇、(Z)-二十二碳-13-烯-1-基醇、二十二烷醇、(E)-十八碳-9-烯-1-基醇、二十碳烷醇、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯-1-基醇或棕榈醇。在一些实施方案中，每种脂肪醇是硬脂醇。在一些实施方案中，R包括一种或多种甾醇脂质。在一些实施方案中，R包括维生素中的一种或多种。在一些实施方案中，每种维生素独立地为维生素A、维生素D、维生素E或维生素K。
在一些实施方案中，式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)中提供的R基团包含如本文所述的有效负载。在一些实施方案中，式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)中提供的R基团包含脂质。
在一些实施方案中，式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)中提供的R基团包含核酸。在一些实施方案中，核酸是单链核酸。在一些实施方案中，单链核酸是DNA。在一些实施方案中，单链核酸是RNA。在一些实施方案中，核酸是双链核酸。在一些实施方案中，双链核酸是DNA。在一些实施方案中，双链核酸是RNA。在一些实施方案中，双链核酸是DNA-RNA杂交体。在一些实施方案中，核酸是信使RNA(mRNA)、微小RNA(microRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、小发夹RNA(shRNA)或Dicer-底物dsRNA。在一些实施方案中，核酸是mRNA。在一些实施方案中，R包括编码Cas核酸酶的mRNA分子，即，Cas核酸酶mRNA。在一些实施方案中，R包括一种或多种指导RNA或编码指导RNA的核酸。在一些实施方案中，R包括用于修复或重组的模板核酸。在一些实施方案中，R包括编码基因编辑器核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，R包括编码碱基编辑器核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，R包括编码限制性内切酶的mRNA。在一些实施方案中，R包括锌指核酸酶或TALEN核酸酶。在一些实施方案中，R包括指导RNA。在一些实施方案中，gRNA与选自PCSK9、ANGPTL3、APOC3、LPA、APOB、MTP、ANGPTL4、ANGPTL8、APOA5、APOE、LDLR、IDOL、NPC1L1、ASGR1、TM6SF2、GALNT2、GCKR、LPL、MLXIPL、SORT1、TRIB1、MARC1、ABCG5和ABCG8的基因杂交。在一些实施方案中，gRNA与PCSK9杂交。在一些实施方案中，gRNA与ANGPTL3杂交。在一些实施方案中，R包括如本文所述的指导RNA序列。在一些实施方案中，R包括如本文所述的偶联序列。在一些实施方案中，R包括mRNA、指导RNA、siRNA、反义寡核苷酸、微小RNA、诱饵RNA或适体。在一些实施方案中，当R为核酸时，L12可以插入基团R或结合至基团R。
在一些实施方案中，式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)中提供的R基团包含氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是天然氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是20个标准氨基酸以外的氨基酸。氨基酸可以被修饰。
在一些实施方案中，式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)中提供的R基团包含蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是Argonaute蛋白。在一些实施方案中，蛋白质是cas蛋白。在一些实施方案中，蛋白质是RNP。
在一些实施方案中，式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)中提供的R基团包含脂质纳米颗粒。
应理解，L12和R之间的键可以是共价键、氢键、分子间或分子内相互作用。
在式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的化合物的一些实施方案中，A为在式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的化合物的一些实施方案中，A为半乳糖。
在一些实施方案中，本文所述的受体靶向缀合物是GalNAc缀合的脂质，其具有表4中给出的结构。
表4.示例性GalNAc缀合的脂质
除非另有说明，否则表4中的每个不对称碳表示外消旋、R和S构型。如表4所示，n、p和q中的每一个独立地为0或1至200的整数。在一些实施方案中，表4的n、p和q中的每一个独立地为0或1至100的整数。在一些实施方案中，表4的n、p和q中的每一个独立地为0或1至50的整数。在一些实施方案中，表4的n、p和q中的每一个独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、13、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，表4的n、p和q中的每一个独立地为0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，表4的n、p和q中的每一个独立地为0、1、2或3。在一些实施方案中，表4的n、p和q中的每一个独立地为1或2。在一些实施方案中，n为1-60，并且表4中p和q中的每一个独立地为1-9。在一些实施方案中，表4中的示例性GalNAc缀合的脂质ID号1001、1011、1015、1020、1025、1030、1037、1040、1041、1045、1050、1055、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067和1082具有n＝1、11、36或44。在表4的示例性GalNAc缀合的脂质的一些实施方案中，n为1至100。在一些实施方案中，n为1至50。在一些实施方案中，n为25至50。在一些实施方案中，n为1至10。在一些实施方案中，n为1至5。在一些实施方案中，n为1至50。在一些实施方案中，n为25至75。在一些实施方案中，n为100至150。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为11。在一些实施方案中，n为36。在一些实施方案中，n为44。在一些实施方案中，n为40至50。在一些实施方案中，n为30至40。在表4的示例性GalNAc缀合的脂质的一些实施方案中，p为1至100。在一些实施方案中，p为1至50。在一些实施方案中，p为25至50。在一些实施方案中，p为1至10。在一些实施方案中，p为1至5。在一些实施方案中，p为1至50。在一些实施方案中，p为25至75。在一些实施方案中，p为100至150。在一些实施方案中，p为40至50。在一些实施方案中，p为30至40。在表4的示例性GalNAc缀合的脂质的一些实施方案中，q为1至100。在一些实施方案中，q为1至50。在一些实施方案中，q为25至50。在一些实施方案中，q为1至10。在一些实施方案中，q为1至5。在一些实施方案中，q为1至50。在一些实施方案中，q为25至75。在一些实施方案中，q为100至150。在一些实施方案中，q为40至50。在一些实施方案中，q为30至40。
脂质纳米颗粒(LNP)组合物
在一方面，本文公开了脂质纳米颗粒组合物，其包含如本文所述的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，本文公开了脂质纳米颗粒组合物，其包含(i)有效负载(例如治疗性药剂)或目的靶，以及(ii)如本文所述的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，本文公开了脂质纳米颗粒组合物，其包含(i)一种或多种核酸分子实体(即，核酸，例如mRNA和gRNA)，以及(ii)如本文所述的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒组合物包含两种或更多种受体靶向缀合物，该缀合物可以相同或不同。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子实体包含本文所述的核酸。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子实体包含靶向肝细胞中产生的致病目的基因的单指导RNA(sgRNA)或指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子实体包含编码Cas核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子实体中的至少一种包含化学修饰，例如，如本文所述的化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰是2’-F修饰、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、4’-O-甲基或2’-ara-F修饰。在一些实施方案中，化学修饰是2’-O-甲基修饰。
在一些实施方案中，受体靶向缀合物占存在于本文所述的纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.001mol％至约20mol％。在一些实施方案中，受体靶向缀合物占存在于本文所述的纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.01mol％至约1mol％。在一些实施方案中，受体靶向缀合物占存在于本文所述的纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.001mol％、约0.005mol％、约0.01mol％、约0.02mol％、约0.03mol％、约0.04mol％、约0.05mol％、约0.06mol％、约0.07mol％、约0.08mol％或约0.09mol％至约1mol％、约1.5mol％、约2mol％、约5mol％、约10mol％或约20mol％。在一些实施方案中，受体靶向缀合物占存在于本文所述的纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.001mol％、约0.005mol％、约0.01mol％、约0.02mol％、约0.03mol％、约0.04mol％或约0.05mol％至约0.06mol％、约0.07mol％、约0.08mol％、约0.09mol％、约1mol％、约1.5mol％、约2mol％、约5mol％、约10mol％或约20mol％。在一些实施方案中，受体靶向缀合物占存在于本文所述的纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.01mol％、约0.02mol％、约0.03mol％、约0.04mol％、约0.05mol％、约0.06mol％、约0.07mol％、约0.08mol％、约0.09mol％、约0.1mol％、约0.2mol％、约0.3mol％、约0.4mol％、约0.5mol％、约0.6mol％、约0.7mol％、约0.8mol％、约0.9mol％、约1mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约3.0mol％、约4.0mol％或约5.0mol％。
在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.000001mol％至约30mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.0001mol％至约25mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.0001、0.001、0.005、0.01、0.025、0.05或0.25mol％至约0.5、1、1.125、1.25、1.5、1.75、2、5、10、15、20或25mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.001mol％至约1mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.005mol％至约1mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.025mol％至约1、1.5或2mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.25mol％至约1mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.25mol％至约1.5或2mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.05mol％至约1.5或2mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.05mol％至约1mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.001mol％至约2mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含约0.005mol％至约2mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含至少约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.75或1mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含至多约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含至多约1mol％的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，基于总脂质或总赋形剂含量，本文所述的LNP包含至多约2mol％的受体靶向缀合物。
在一些实施方案中，本文所述的LNP组合物的大小近似微米或更小，并且可以包括脂质双层。纳米颗粒组合物包括脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如，脂质囊泡)以及脂质复合物。例如，纳米颗粒组合物可以是具有直径为500nm或更小的脂质双层的脂质体。本文所述的LNP的平均直径可以为约1nm至约2500nm、约10nm至约1500nm、约20nm至约1000nm、约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70nm至约90nm、约80nm至约90nm、或约70nm至约80nm。本文所述的LNP的平均直径可以为约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm或更大。本文所述的LNP可以基本上无毒。
胆固醇
在一些实施方案中，本文所述的LNP组合物包含胆固醇或其衍生物。在一些实施方案中，LNP组合物包含结构脂质。结构脂质可以选自类固醇、甾醇、烷基间苯二酚、胆固醇或其衍生物、fecosterol、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、番茄碱、番茄素、乌索酸、α-生育酚及其组合。在一些实施方案中，结构脂质是皮质类固醇，例如泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松。在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物是胆固醇、5-十七烷基间苯二酚或胆固醇半琥珀酸酯。在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物是胆固醇。
在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物是胆固醇衍生物。在一些实施方案中，胆固醇衍生物是极性胆固醇类似物。在一些实施方案中，极性胆固醇类似物是5α-胆甾烷醇、5β-粪甾醇、胆甾醇基-(2’-羟基)-乙基醚、胆甾醇基-(4’-羟基)-丁基醚或6-酮胆甾烷醇。在一些实施方案中，极性胆固醇类似物是胆固醇基-(4’-羟基)-丁基醚。在一些实施方案中，胆固醇衍生物是非极性胆固醇类似物。在一些实施方案中，非极性胆固醇类似物是5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5β-胆甾烷酮或胆甾醇癸酸酯。
在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的20mol％至50mol％。在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％、约21mol％、约22mol％、约23mol％、约24mol％、约25mol％、约26mol％、约27mol％、约28mol％、约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％、约39mol％、约40mol％、约41mol％、约42mol％、约43mol％、约44mol％、约45mol％、约46mol％、约47mol％、约48mol％或约50mol％。
磷脂
在一些实施方案中，本文所述的LNP组合物包含磷脂。在一些实施方案中，磷脂包含选自以下的脂质：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺、甘油磷脂、鞘氨醇磷脂、Guriserohosuhono、鞘脂、磷脂、天然卵磷脂和氢化磷脂。在一些实施方案中，磷脂包含磷脂酰胆碱。示例性磷脂酰胆碱包括但不限于大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、2-油酰-1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)以及二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。在某些具体实施方案中，磷脂是DSPC。
在一些实施方案中，磷脂包含磷脂酰乙醇胺。在一些实施方案中，磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)或1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。在一些实施方案中，磷脂包含甘油磷脂。在一些实施方案中，甘油磷脂是缩醛磷脂、磷脂酸酯或磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，甘油磷脂是磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)或溶血磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，磷脂包含鞘氨醇磷脂。在一些实施方案中，鞘氨醇磷脂是鞘磷脂、神经酰胺磷酸乙醇胺、神经酰胺磷酸甘油或神经酰胺磷酸甘油磷酸。在一些实施方案中，磷脂包含天然卵磷脂。在一些实施方案中，天然卵磷脂是蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂。在一些实施方案中，磷脂包括氢化磷脂。在一些实施方案中，氢化磷脂是氢化大豆磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，磷脂选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。
在一些实施方案中，磷脂包含选自以下的脂质：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-十一酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、2-油酰-1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰-2-胆甾醇半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。
磷脂可以包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。磷脂部分可以包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱或鞘磷脂。脂肪酸部分可以包含月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。在一些具体实施方案中，磷脂可以用一种或多种炔烃官能化或交联，该炔烃在暴露于叠氮化物后可以经历铜催化的环加成。
在一些实施方案中，LNP组合物包含多个磷脂，例如，至少2、3、4、5或更多个不同的磷脂。在一些实施方案中，磷脂占存在于LNP组合物中的总脂质的1mol％至20mol％。在一些实施方案中，磷脂占存在于LNP组合物中的总脂质的约5mol％至约15mol％。在一些实施方案中，磷脂占存在于LNP组合物中的总脂质的约8mol％至约12mol％。在一些实施方案中，磷脂占存在于LNP组合物中的总脂质的约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％、约12mol％、约13mol％、约14mol％或约15mol％。在一些实施方案中，磷脂占存在于LNP组合物中的总脂质的约9mol％、约10mol％或约11mol％。
隐形脂质
在一些实施方案中，本文所述的LNP组合物包含隐形脂质。“隐形脂质”可以指改变纳米颗粒可在体内(例如，在血液中)存在的时间长度的脂质。隐形脂质可以通过例如减少颗粒聚集和控制颗粒大小来帮助配制过程。本文所用的隐形脂质可以调节LNP的药代动力学特性。适合于本发明的脂质组合物中的隐形脂质可以包括但不限于具有连接至脂质部分的亲水性头部基团的隐形脂质。适用于本发明的脂质组合物中的隐形脂质和关于这种脂质的生物化学信息可以见于Romberg等人，Pharmaceutical Research,Vol.25,No.1,2008,pg.55-71和Hoekstra等人，Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52。例如在WO2006/007712中公开了另外合适的PEG脂质。
在一些实施方案中，隐形脂质是PEG-脂质。在一个实施方案中，隐形脂质的亲水性头部基团包含聚合物部分，其选自基于PEG(有时称为聚(环氧乙烷))、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]的聚合物。隐形脂质可以包含脂质部分。在一些实施方案中，隐形脂质的脂质部分可以衍生自二酰基甘油或二酰基甘氨酰胺，包括包含二烷基甘油或二烷基甘氨酰胺基团的那些，该基团的烷基链长独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和的碳原子，其中链可以包含一个或多个官能团，例如，酰胺或酯。二烷基甘油或二烷基甘氨酰胺基团可以进一步包含一个或多个取代的烷基基团。
PEG-脂质
在一些实施方案中，所述的LNP组合物包含PEG-脂质。在一些实施方案中，所述的LNP组合物包含两种或更多种PEG-脂质。示例性PEG-脂质包括但不限于表2中的脂质。示例性PEG-脂质还包括但不限于PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG-修饰的磷脂酸、PEG-修饰的神经酰胺、PEG-修饰的二烷基胺、PEG-修饰的二酰基甘油、PEG-修饰的二烷基甘油及其混合物。例如，一种或多种PEG-脂质可以包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE脂质或其组合。在一些实施方案中，PEG部分是任选取代的乙二醇或环氧乙烷的直链或支链聚合物。在一些实施方案中，PEG部分被例如一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基基团取代。在一些实施方案中，PEG部分包括PEG共聚物，例如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如，j.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications(1992))。在一些实施方案中，PEG部分不包括PEG共聚物，例如，它可以是PEG单聚物。示例性PEG-脂质包括但不限于PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二甾醇甘油，PEG-二月桂酰甘氨酰胺、PEG-二肉豆蔻酰甘氨酰胺、PEG-二棕榈酰甘氨酰胺、PEG-二甾醇甘氨酰胺、PEG-胆固醇以及PEG-DMB(3,4-二-十四碳氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000])。
在一些实施方案中，PEG-脂质是PEG-脂质缀合物(例如，偶联至二烷氧基丙基的PEG(例如，PEG-DAA缀合物)、偶联至二酰基甘油的PEG(例如，PEG-DAG缀合物)、偶联至胆固醇的PEG、偶联至磷脂酰乙醇胺的PEG以及偶联至神经酰胺的PEG)(参见例如，美国专利第5,885,613号)、阳离子PEG脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物(例如，POZ-DAA缀合物；参见例如，WO2010/006282)、聚酰胺寡聚物(例如，ATTA-脂质缀合物)及其混合物。
PEG-脂质可以包含一个或多个乙二醇单元，例如，至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120或至少150个乙二醇单元。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量为约200Da至约5000Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量为约500Da至约3000Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量为约750Da至约2500Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量为约750Da至约2500Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数均分子量为约500Da、约750Da、约1000Da、约1250Da、约1500Da、约1750Da或约2000Da。在一些实施方案中，一种或多种PEG-脂质的多分散指数(PDI)小于2。在一些实施方案中，一种或多种PEG-脂质的PDI为至多1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。在一些实施方案中，一种或多种PEG-脂质的PDI为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约0.1mol％至约10mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约0.1mol％至约6mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约0.5mol％至约5mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约1mol％至约3mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约2.0mol％至约2.5mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约1mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％或约3.0mol％。
氨基脂质
在一些实施方案中，本文所述的LNP组合物包含氨基脂质。在一些实施方案中，LNP包含多个氨基脂质。例如，LNP组合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基脂质。对于另一实例，LNP组合物可以包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少9、至少10或至少20个氨基脂质。对于又一实例，LNP组合物可以包含至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多9、至多10、至多20或至多30个氨基脂质。
在一些实施方案中，本文所述的LNP组合物包含一种或多种氨基脂质。在一些实施方案中，一种或多种氨基脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约1mol％至约65mol％。在一些实施方案中，一种或多种氨基脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约10mol％至约60mol％。在一些实施方案中，一种或多种氨基脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约40mol％至约65mol％。在一些实施方案中，一种或多种氨基脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约10mol％、约15mol％、约20mol％、约25mol％、约30mol％、约35mol％或约40mol％至约45mol％、50mol％、55mol％、60mol％或约65mol％。在一些实施方案中，一种或多种氨基脂质占存在于LNP组合物中的总脂质的约40mol％、约41mol％、约42mol％、约43mol％、约44mol％、约45mol％、约46mol％、约47mol％、约48mol％、约49mol％、约50mol％、约51mol％、约52mol％、约53mol％、约54mol％、约55mol％、约56mol％、约57mol％、约58mol％、约59mol％、约60mol％、约61mol％、约62mol％、约63mol％、约64mol％或约65mol％。在一些实施方案中，LNP组合物包含第一氨基脂质和第二氨基脂质。在一些实施方案中，第一氨基脂质占存在于LNP组合物中的总氨基脂质的约1mol％至约99mol％。在一些实施方案中，第一氨基脂质占存在于LNP组合物中的总氨基脂质的约16.7mol％至约66.7mol％。在一些实施方案中，第一氨基脂质占存在于LNP组合物中的总氨基脂质的约20mol％至约60mol％。
在一些实施方案中，氨基脂质是可电离的脂质。可电离的脂质可以包含一个或多个可电离的氮原子。在一些实施方案中，一个或多个可电离的氮原子中的至少一个带正电荷。在一些实施方案中，LNP组合物中至少10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％、90mol％、95mol％或99mol％的可电离的氮原子带正电荷。在一些实施方案中，氨基脂质包含伯胺、仲胺、叔胺、亚胺、酰胺、胍部分、组氨酸残基、赖氨酸残基、精氨酸残基或其任何组合。在一些实施方案中，氨基脂质包含伯胺、仲胺、叔胺、胍部分或其任何组合。在一些实施方案中，氨基脂质是叔胺。
在一些实施方案中，氨基脂质是阳离子脂质。在一些实施方案中，氨基脂质是可电离的脂质。在一些实施方案中，氨基脂质包含一个或多个氮原子。在一些实施方案中，氨基脂质包含一个或多个可电离的氮原子。示例性阳离子和/或可电离的脂质包括但不限于3-(二-十二烷基氨基)-N1,N1,4-三-十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(二-十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三-十二烷基-1,4-哌嗪乙胺(KL22)、14,25-二-十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、4-(N,N-二甲基胺基)丁酸-6,9,28,31-四烯-19-三十七醇酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨丙基(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))以及(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。适合于本发明的氨基脂质的其他实例可以见于US 20180290965A1、WO2017/173054A1、US 20150273068A1、WO2015/095340A1、US 9,365,610、US 8,193,246、US 8,192,753、US 9,549,983、US 8,017,804、US 8,357,722、US 7,799,565和US 7,745,651，其中的全部在此通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，本文所述的氨基脂质可以采用盐的形式，例如药学上可接受的盐。本发明包括氨基脂质的所有药学上可接受的盐。如本文所用，术语“氨基脂质”还包括其药学上可接受的盐，以及其非对映体、对映体和差向异构体形式。
在一些实施方案中，本文所述的氨基脂质具有一个或多个立构中心，并且每个立构中心独立地以R或S构型存在。本文提供的脂质包括所有非对映异构体、对映异构体和差向异构体形式及其适当的混合物。本文提供的脂质包括所有顺式(cis)、反式(trans)、顺(syn)、反(anti)、entgegen(E)和zusammen(Z)异构体及其适当的混合物。
有效负载
在一方面，本文所述的LNP组合物包含有效负载。本文所述的LNP组合物可以被设计成递送有效负载，例如治疗性药剂或目的靶。示例性治疗性药剂包括但不限于抗体(例如，单克隆、嵌合、人源化、纳米抗体及其片段等)、胆固醇、激素、肽、蛋白质、化疗剂和其他类型的抗肿瘤剂、低分子量药物、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶的核酸、反义核酸、形成三链体的寡核苷酸、反义DNA或RNA组合物、嵌合DNA:RNA组合物、等位酶、适体、核酶、诱饵及其类似物、质粒和其他类型的表达载体，以及小核酸分子、RNAi药剂、短干扰核酸(siNA)、信使核糖核酸(信使RNA、mRNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子、肽核酸(PNA)、锁核酸核糖核苷酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、sisiRNA(小内部分段干扰RNA)、aiRNA(不对称干扰RNA)以及与(例如细胞培养物、对象或生物体中的)相关细胞和/或组织具有有义链和反义链之间的1、2或更多个错配的siRNA。治疗性药剂可以是纯化的或部分纯化的，并且可以是天然存在的或合成的，或化学修饰的。在一些实施方案中，治疗性药剂是RNAi药剂、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)分子。在一些实施方案中，治疗性药剂是mRNA。
在一些实施方案中，有效负载包含一种或多种核酸(即，一种或多种核酸分子实体)。在一些实施方案中，核酸是单链核酸。在一些实施方案中，单链核酸是DNA。在一些实施方案中，单链核酸是RNA。在一些实施方案中，核酸是双链核酸。在一些实施方案中，双链核酸是DNA。在一些实施方案中，双链核酸是RNA。在一些实施方案中，双链核酸是DNA-RNA杂交体。在一些实施方案中，核酸是信使RNA(mRNA)、微小RNA(microRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、小发夹RNA(shRNA)或Dicer-底物dsRNA。
在一些实施方案中，有效负载包含mRNA。在一些实施方案中，有效负载包含编码Cas核酸酶的mRNA分子，即，Cas核酸酶mRNA。在一些实施方案中，有效负载包含一种或多种指导RNA或编码指导RNA的核酸。在一些实施方案中，有效负载包含用于修复或重组的模板核酸。在一些实施方案中，有效负载包含编码基因编辑器核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，有效负载包含编码碱基编辑器核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，有效负载包含编码限制性内切酶的mRNA。在一些实施方案中，有效负载包含锌指核酸酶或TALEN核酸酶。
在一些实施方案中，mRNA有效负载(例如Cas核酸酶mRNA)可以被修饰，用于改善稳定性和/或免疫原性特性。可以对mRNA内的一个或多个核苷进行修饰。对mRNA核碱基化学修饰的实例包括假尿苷、1-甲基-假尿苷以及5-甲基-胞苷。还可以进行另外的修饰，以改善稳定性、表达和免疫原性。编码Cas核酸酶的mRNA可以进行密码子优化，用于在特定细胞类型(例如真核细胞、哺乳动物细胞，或更具体地，人类细胞)中表达。在一些实施方案中，mRNA将人密码子优化的Cas9核酸酶或人密码子优化的Cpf核酸酶编码为Cas核酸酶。在一些实施方案中，mRNA编码基因编辑器(即，基因组编辑器)核酸酶并被称为基因编辑器mRNA。在一些实施方案中，基因编辑器是Cas蛋白，例如本文所述的Cas蛋白。在一些实施方案中，基因编辑器是工程化核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器将双链断裂引入目的基因。在一些实施方案中，基因编辑器将双链断裂引入目的基因内的靶点处。在一些实施方案中，基因编辑器将单链断裂引入目的基因。在一些实施方案中，基因编辑器是碱基编辑器。在一些实施方案中，基因编辑器将核酸序列插入至目的基因中。在一些实施方案中，基因编辑器从目的基因中删除靶序列。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码Cas9核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码碱基编辑器核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码限制性内切酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码锌指核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码基于转录激活子样效应物的核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码大范围核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码Argonaute蛋白。在一些实施方案中，mRNA是纯化的。在一些实施方案中，使用沉淀方法(例如，LiCl沉淀、醇沉淀或等效方法，例如，如本文所述的)或基于色谱的方法(例如，基于HPLC的方法或等效方法)来纯化mRNA。
在一些实施方案中，Cas核酸酶mRNA包含3’或5’非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，3’或5’UTR可以衍生自人类基因序列。示例性3’和5’UTR包括α-和β-球蛋白、白蛋白、HSD17B4和真核延伸因子1a。另外，还可以使用病毒衍生的5’和3’UTR，包括正痘病毒和巨细胞病毒UTR序列。在某些实施方案中，mRNA包括5’帽，例如m7G(5’)ppp(5’)N。在某些实施方案中，该帽可以是其中核苷酸N不含有2’OMe的帽-0，或者其中核苷酸N含有2’OMe的帽-1，或者其中核苷酸N和N+1含有2’OMe的帽-2。在一些实施方案中，5’帽可以调控核输出；防止核酸外切酶的降解；促进翻译；并且促进5’近端内含子切除。另外，帽还可以含有非核酸实体，其用作真核翻译起始因子4E(eIF4E)的结合元件。在某些实施方案中，mRNA包括聚(A)尾。该尾的长度可以为约40至约300个核苷酸。在一些实施方案中，尾的长度为约40至约100个核苷酸。在一些实施方案中，尾的长度为约100至约300个核苷酸。在一些实施方案中，尾的长度为约100至约300个核苷酸。在一些实施方案中，尾的长度为约50至约200个核苷酸。在一些实施方案中，尾的长度为约50至约250个核苷酸。在某些实施方案中，尾的长度为约100、150或200个核苷酸。聚(A)尾可以含有防止核酸外切酶降解的修饰(包括硫代磷酸酯键)和对核碱基的修饰。在一些实施方案中，聚(A)尾含有3’“帽”，其可以包括修饰的或非天然的核碱基或其他合成部分。在一些实施方案中，mRNA包含至少一个能够改变RNA的细胞内半衰期的元件。RNA的半衰期可以增加或减少。在一些实施方案中，元件能够提高或降低RNA的稳定性。在一些实施方案中，元件可以促进RNA衰变。在一些实施方案中，元件可以激活翻译。在一些实施方案中，元件可以在RNA的3’UTR内。例如，元件可以是mRNA衰变信号或可以包括多腺苷酸化信号(PA)。
在一些实施方案中，Cas核酸酶mRNA编码来自CRISPR/Cas系统的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含至少一个与指导RNA(“gRNA”)相互作用的结构域。在一些实施方案中，通过指导RNA将Cas蛋白引导至靶序列。指导RNA可以与Cas蛋白以及靶序列相互作用，使得它可以直接结合至靶序列。在一些实施方案中，指导RNA为靶向切割提供特异性，并且Cas蛋白可以是通用的并与不同的指导RNA配对，以切割不同的靶序列。在某些实施方案中，Cas蛋白可以切割单链或双链DNA。在某些实施方案中，Cas蛋白可以切割RNA。在某些实施方案中，Cas蛋白可以是切口RNA。在一些实施方案中，Cas蛋白包含至少一个DNA结合结构域和至少一个核酸酶结构域。在一些实施方案中，核酸酶结构域与DNA结合结构域可以是异源性的。在某些实施方案中，Cas蛋白可以被修饰，以降低或消除核酸酶活性。Cas蛋白可以用于结合DNA序列至并调节其表达或活性。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包含1类或2类系统组分，包括核糖核酸蛋白复合体。如本文进一步描述的，蛋白质的2类Cas核酸酶家族是具有DNA核酸内切酶活性的酶，并且它们可以通过设计适当的指导RNA而被引导以切割所需的核酸靶。2类CRISPR/Cas系统组分可以来自IIA型、IIb型、IIc型、V型或VI型系统。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2以及C2c3蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白来自II型CRISPR/Cas系统(即，来自CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白)或V型CRISPR/Cas系统(例如，Cpf1蛋白)。在一些实施方案中，Cas蛋白来自2类CRISPR/Cas系统，即，单蛋白Cas核酸酶，例如Cas9蛋白或Cpf1蛋白。
可以衍生Cas9蛋白或其他组分的示例性物种包括但不限于酿脓链球菌、嗜热链球菌、链球菌属、金黄色葡萄球菌、无害李斯特菌、加氏乳杆菌、新凶手弗朗西斯菌、产琥珀酸沃廉菌、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、伽玛变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、空肠弯曲杆菌、多杀巴氏杆菌、琥珀酸纤维杆菌、红色红螺菌、达氏诺卡氏菌、原始螺旋链霉菌、绿色产色链霉菌、绿色产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌、假蕈状芽孢杆菌、硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)、德氏乳杆菌、唾液乳杆菌、布氏乳杆菌、齿垢密螺旋体、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德菌、食萘极地单胞菌(Polar omonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌属、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆藻属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻、聚球藻属、阿拉伯糖醋盐杆菌、Ammonifex degensii、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、Candidatus Desulforudis、肉毒杆菌、艰难梭菌、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobiusthermophilus)、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculum thermopropionium)、硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁硫杆菌、Allochromatium vinosum、海杆菌属、嗜盐亚硝化球菌、Nitrosococcus watsoni、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodular ia spumigena)、念珠藻属、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻、节旋藻属、鞘丝藻属、原型微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)、颤藻属、Petrotoga mobilis、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌、灰色奈瑟球菌、红嘴鸥弯曲杆菌、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、白喉棒状杆菌或Acaryochloris marina。在一些实施方案中，Cas9蛋白来自酿脓链球菌。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以来自嗜热链球菌。在一些实施方案中，Cas9蛋白来自金黄色葡萄球菌。
在一些实施方案中，有效负载包含至少一种指导RNA。指导RNA可以将2类Cas核酸酶指导至靶核酸分子上的靶序列，其中指导RNA与靶序列杂交，并且Cas核酸酶切割或调节靶序列。在一些实施方案中，指导RNA与2类核酸酶结合并提供2类核酸酶切割的特异性。在一些实施方案中，指导RNA和Cas蛋白可以形成核糖核蛋白(RNP)，例如，CRISPR/Cas复合体。在一些实施方案中，CRISPR复合体可以是II型CRISPR/Cas9复合体。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合体可以是V型CRISPR/Cas复合体，例如Cpf1/指导RNA复合体。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是单蛋白Cas核酸酶，例如Cas9蛋白或Cpf1蛋白。在一些实施方案中，指导RNA靶向Cas9蛋白的切割。在一些实施方案中，有效负载包含两种或更多种指导RNA分子。在一些实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向相同的致病基因。在一些实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向不同的基因。在一些具体实施方案中，两种指导RNA分子靶向两种单独的致病目的基因。
CRISPR/Cas9核酸酶系统的指导RNA包含CRISPR RNA(crRNA)和tracrRNA(tracr)。在一些实施方案中，crRNA可以包含与靶核酸分子上的靶序列互补并杂交的靶向序列。crRNA还可以包含与tracrRNA的一部分互补并杂交的旗杆(flagpole)。在一些实施方案中，crRNA可以与从细菌的CRISPR基因座转录的天然存在的crRNA的结构相似，其中靶向序列用作CRISPR/Cas9系统的间隔区，并且旗杆(flagpole)对应于CRISPR基因座上的间隔区侧翼的重复序列的一部分。指导RNA可以经由crRNA的靶向序列靶向任何目的序列。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与靶核酸分子上的靶序列之间的互补性程度为至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与靶核酸分子上的靶序列可以100％互补。在其他实施方案中，指导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以含有至少一个错配。例如，指导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以含有1-6个错配。
在一些实施方案中，靶向序列的长度取决于所用的CRISPR/Cas系统和组分。例如，来自不同细菌物种的不同Cas蛋白具有不同的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列的长度可以包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或多于50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度包含18-24个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度包含19-21个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度包含20个核苷酸。
在一些实施方案中，指导RNA是“双指导RNA”或“dgRNA”。在一些实施方案中，dgRNA包含包括crRNA的第一RNA分子以及包括tracrRNA的第二RNA分子。第一和第二RNA分子可以经由crRNA上的旗杆(flagpole)和tracrRNA之间的碱基配对形成RNA双链体。在一些实施方案中，指导RNA是“单指导RNA”或“sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA可以包含与tracrRNA共价连接的crRNA。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA可以经由接头共价连接。在一些实施方案中，单分子指导RNA可以经由crRNA上的旗杆(flagpole)和tracrRNA之间的碱基配对包含茎-环结构。在一些实施方案中，sgRNA是能够通过Cas9蛋白介导RNA指导的DNA切割的“Cas9 sgRNA”。在某些实施方案中，指导RNA包含足以与Cas9蛋白形成活性复合体并介导RNA指导的DNA切割的crRNA和tracrRNA。在一些实施方案中，有效负载包含多于一种指导RNA；每种指导RNA含有不同的靶向序列，使得CRISPR/Cas系统切割多于一个靶序列。在一些实施方案中，一种或多种指导RNA可以具有相同或不同的特性，例如CRISPR/Cas复合体内的活性或稳定性。在使用多于一种指导RNA的情况下，每种指导RNA可以在相同或不同的表达盒上被编码。用于驱动多于一种指导RNA表达的启动子可以相同或不同。
在一些实施方案中，核酸有效负载(例如RNA)被修饰。修饰的核苷或核苷酸可以存在于指导RNA或mRNA中。编码包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的mRNA的指导RNA或Cas核酸酶被称为“修饰的”RNA，以描述存在一种或多种非天然和/或天然存在的用于代替标准A、G、C和U残基或除标准A、G、C和U残基以外的组分或构型。在一些实施方案中，用非标准核苷或核苷酸合成修饰的RNA。修饰的核苷和核苷酸可以包括以下一种或多种：(i)磷酸二酯骨架键中的非连接磷酸酯氧中的一个或两个和/或连接磷酸酯氧中的一个或多个的改变，例如，置换(示例性骨架修饰)；(ii)核糖糖的组成(例如，核糖糖上的2’羟基)的改变，例如，置换(示例性糖修饰)；(iii)磷酸酯部分用“脱磷”接头的批量置换(示例性骨架修饰)；(iv)天然存在的核碱基的修饰或置换，包括用非标准核碱基(示例性碱基修饰)；(v)核糖-磷酸酯骨架的置换或修饰(示例性骨架修饰)；(vi)寡核苷酸3’端或5’端的修饰，例如，末端磷酸酯基团的去除、修饰或置换，或者部分、帽或接头的缀合(这种3’或5’帽修饰可以包含糖和/或骨架修饰)；以及(vii)糖的修饰或置换(示例性糖修饰)。
在一些实施方案中，有效负载可以包括模板核酸。模板可以用于在Cas核酸酶的靶位点处或附近改变或插入核酸序列。在一些实施方案中，模板用于同源重组。在一些实施方案中，同源重组可以导致模板序列或模板序列的一部分整合至靶核酸分子中。在一些实施方案中，提供单个模板。在其他实施方案中，提供两个或更多个模板，使得同源重组可以发生在两个或更多个靶位点处。
在一些实施方案中，有效负载(例如一种或多种RNA)被完全包封在颗粒的脂质部分内，从而保护RNA免于核酸酶降解。完全包封可以指示在暴露于将显著降解游离DNA或RNA的血清或核酸酶试验之后，核酸-脂质颗粒中的RNA不显著降解。在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒组合物包含完全包封在颗粒的脂质部分内的RNA分子，使得约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约30％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％，或至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或其任何部分或其中的范围)的颗粒具有包封在其中的RNA。
在一些实施方案中，有效负载包含mRNA以及一种或多种指导RNA。在一些实施方案中，mRNA编码基因编辑器核酸酶并被称为基因编辑器mRNA。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码Cas9核酸酶。在一些实施方案中，mRNA编码碱基编辑器核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码锌指核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码TALEN核酸酶。
LNP的另外组合物
在一些实施方案中，本文所述的LNP组合物包含一种或多种抗氧化剂。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂发挥减少阳离子脂质、有效负载或两者降解的功能。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂包括亲水性抗氧化剂。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸盐。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是EDTA。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂包括亲脂性抗氧化剂。在一些实施方案中，亲脂性抗氧化剂包括维生素E异构体或多酚。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂以至少1mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM或至少100mM的浓度存在于LNP组合物中。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂以约20mM的浓度存在于LNP组合物中。
制备脂质纳米颗粒的方法
本发明中描述了用于制备LNP组合物(例如，包含受体靶向缀合物(例如GalNAc-脂质)的LNP)的创新过程。
传统上，通过后添加过程(即，后添加GalNAc-脂质)制备包含GalNAc-脂质的LNP，其涉及在孵育期之后将GalNAc-脂质添加至预形成的LNP中，随后进行缓冲液交换。传统上所用的后添加过程如图9中的过程1所示。
虽然将受体靶向缀合物(例如GalNAc-脂质)后添加至预形成的LNP中的传统过程在制备纳米颗粒中有效，但本文所述的创新过程(例如，通过将GalNAc-脂质添加至LNP赋形剂中，通过分开添加，或通过将GalNAc-脂质连续引入通过第三通道/端口至在线混合室中)提供了优于后添加或后插入GalNAc-脂质的显著优点。所述优点包括但不限于GalNAc-脂质在脂质纳米颗粒上更均匀的分布，以及对GalNAc-LNP的后插入和下游加工更好的过程控制。例如，在一些情况下，与通过后添加GalNAc-脂质制备的相应脂质纳米颗粒相比，通过涉及将GalNAc-脂质添加至LNP赋形剂中的过程制备的脂质纳米颗粒具有更好的颗粒均匀性和/或提供更好的编辑功效。在一些情况下，与通过后添加GalNAc-脂质制备的相应脂质纳米颗粒相比，通过涉及分开添加GalNAc-脂质的过程制备的脂质纳米颗粒具有更好的颗粒均匀性和/或提供更好的编辑功效。相似地，与通过后插入GalNAc-脂质制备的相应脂质纳米颗粒相比，将GalNAc-脂质连续第三端口插入至在线混合室中产生更好的颗粒均匀性和/或更好的编辑功效。
本发明提供了一种制备包含本文所述的纳米颗粒的制剂的方法。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，和/或(iii)受体靶向缀合物。因此，在一方面，本文描述了一种制备包含脂质纳米颗粒的制剂的方法，该脂质纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物。在一些实施方案中，受体靶向缀合物是GalNAc-脂质。在一些实施方案中，GalNAc-脂质选自表4的化合物。在一些实施方案中，GalNAc-脂质是表4中的化合物1004。在一些实施方案中，GalNAc-脂质是表4中的化合物1053、1014、1043、1002、1044、1004或其组合。在一些实施方案中，受体靶向缀合物是表4中的化合物。在一些实施方案中，受体靶向缀合物包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，受体靶向缀合物包含式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(II)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIc)、式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)、式(IIIc)、式(IIId)、式(IIIe)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VIa)或式(VIb)的结构。
制备脂质纳米颗粒的过程可以包括几个通用步骤：(i)在第一储器中提供包含一种或多种核酸分子实体的水性溶液，例如柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液；(ii)在第二储器中提供包含一种或多种脂质和有机溶剂(例如醇(例如，乙醇))的第二溶液；以及(iii)将水性溶液与第二溶液混合。第一储器任选地与第二储器流体连通。
该过程可以任选地包括一个或多个稀释步骤、一个或多个孵育步骤、一个或多个缓冲液交换步骤、一个或多个浓缩步骤和/或一个或多个过滤步骤。在一些实施方案中，稀释步骤涉及通过添加稀释缓冲液进行稀释。在一些实施方案中，稀释步骤涉及用水性缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液或纯水)稀释，例如，使用泵装置(例如蠕动泵)。在一些实施方案中，稀释缓冲液是有机溶液，例如醇。稀释步骤可以包括初始体积的1至20倍或者其间的任何数量或范围的稀释。在一些实施方案中，稀释步骤包括初始体积的1至10倍的稀释。在一些实施方案中，稀释步骤之后是缓冲液交换步骤或孵育步骤。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含一种或多种脂质，例如甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质、氨基脂质、GalNAc-脂质或其组合。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含隐形脂质。在一些实施方案中，隐形脂质以0.01mol％至5mol％存在于稀释缓冲液中。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含GalNAc-脂质。在一些实施方案中，GalNAc-脂质以0.01mol％至10mol％或者其间的任何数量或范围存在于稀释缓冲液中。在一些实施方案中，通过稀释缓冲液引入存在于纳米颗粒中的GalNAc-脂质的一部分。
孵育步骤包括在约室温下并任选地避光，使来自混合步骤的溶液在容器中静置约0至约100小时。在一些实施方案中，孵育步骤进行0至24小时、1分钟至2小时或1分钟至60分钟。在一些实施方案中，孵育步骤进行1分钟至120分钟。在一些实施方案中，孵育步骤之后是缓冲液交换步骤。在一些实施方案中，孵育步骤在缓冲液交换步骤之后。
在一些实施方案中，缓冲液交换步骤包括溶剂交换，其导致较高浓度的磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液交换步骤包括除去有机溶剂的全部或一部分。在一些实施方案中，缓冲液交换步骤包括通过合适的膜(例如10,000mwc蛇皮膜)透析。在一些实施方案中，缓冲液交换步骤包括过滤，例如切向流过滤(TFF)。在一些实施方案中，缓冲液交换步骤包括(例如使用脱盐柱，例如，PD10柱)色谱。在一些实施方案中，缓冲液交换步骤包括超滤。超滤包括(例如，使用合适的泵系统(例如泵装置，例如蠕动泵或其等效物)结合合适的超滤膜(例如GE中空纤维盒或等效物))浓缩稀释的溶液，随后渗滤。
在一些实施方案中，混合步骤提供了澄清的单相。在一些实施方案中，在混合步骤之后，除去有机溶剂以提供颗粒的悬浮液，其中一种或多种核酸分子实体被脂质包封。有机溶剂的选择通常涉及考虑溶剂极性和在颗粒形成的后期可以除去溶剂的容易度。可用作增溶剂的有机溶剂的量可以足以提供一种或多种核酸分子实体和脂质的澄清的单相混合物。有机溶剂可选自氯仿、二氯甲烷、二乙基醚、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、甲醇和其他脂肪族醇(例如C1至C8，例如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、异丁醇、戊醇和己醇)中的一种或多种(例如，两种)。用于除去有机溶剂的方法可以涉及渗滤或透析或减压蒸发或将惰性气体(例如氮气或氩气)流吹过混合物。
在其他实施方案中，该方法还包括添加非脂质聚阳离子，其可用于实现使用本发明组合物的细胞转化。合适的非脂质聚阳离子的实例包括但不限于溴化己二甲胺(以商品名出售，购自美国威斯康星州密尔沃基市奥德里奇化学公司(AldrichChemical Co.))或己二甲胺的其他盐。其他合适的聚阳离子包括例如聚-L-鸟氨酸、聚-L-精氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚烯丙胺以及聚乙烯亚胺的盐。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒的形成可以在单相系统(例如Bligh和Dyer单相或者水性和有机溶剂的相似混合物)中或在具有合适混合的双相系统中进行。
脂质纳米颗粒可以在单相或双相系统中形成。在一些实施方案中，在单相系统中，氨基脂质以及一种或多种核酸分子实体各自溶解于一定体积的单相混合物中。将两种溶液组合得到其中形成复合体的单一混合物。在一些实施方案中，在双相系统中，氨基脂质结合至一种或多种核酸分子实体(其存在于水相中)，并且因此提高了在有机相中的溶解度。
在一些实施方案中，甾醇或其衍生物、磷脂脂质和氨基脂质的溶液是包含有机溶剂的溶液。在一些实施方案中，GalNAc-脂质的溶液包含有机溶剂，例如乙醇。在一些实施方案中，隐形脂质在水性溶液中制备。在一些实施方案中，隐形脂质在有机溶液中制备。通过将一种或多种核酸分子实体的第一溶液和脂质的第二溶液混合在一起，可以实现使一种或多种核酸分子实体与包含一种或多种脂质的有机溶液接触。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒在包括用于容纳水性溶液的第一储器和用于容纳有机脂质溶液的第二储器的装置中制备。在一些实施方案中，该装置包括另外的储器，用于容纳(例如一种或多种核酸分子实体的一部分的)水性溶液和/或(例如GalNAc-脂质的全部或一部分的)有机溶液。该装置可以包括泵机构，其配置为以基本上相等的流速将水性和有机脂质溶液泵至混合区域或混合室中。在一些实施方案中，混合区域或混合室包括T型联接或其等效物，其允许水性流体流和有机流体流作为输入组合进入T型连接器中，并且所得的结合的水性和有机溶液离开T型连接器进入收集储器或其等效物中。
在一方面，本文描述了一种制备包含纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物。在一些实施方案中，该方法包括(a)提供包含一种或多种核酸分子实体中的至少一种的第一溶液；(b)提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；(c)混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；(d)将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合；(e)任选地进行孵育步骤；以及(f)任选地进行缓冲液交换步骤。在一些实施方案中，该方法包括(a)提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；(c)混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；(d)将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合；(e)孵育纳米颗粒；以及(f)任选地进行缓冲液交换步骤。在一些实施方案中，该方法包括提供(a)包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；(b)提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；(c)混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；(d)将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合，其中在混合步骤之前或同时，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合；(e)任选地孵育纳米颗粒；以及(f)任选地进行缓冲液交换步骤。
在一些实施方案中，在混合步骤之后，将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，在混合步骤之前，将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，在混合步骤的同时，将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，在混合步骤的同时，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，在混合步骤之前，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物与第二溶液中的一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，在孵育步骤之后，将受体靶向缀合物与脂质纳米颗粒的其他组分组合。在一些实施方案中，在浓缩步骤之后，将受体靶向缀合物与脂质纳米颗粒的其他组分组合。在一些实施方案中，在冻融纳米颗粒之后，将受体靶向缀合物与脂质纳米颗粒的其他组分组合。
在一种或多种核酸分子实体与一种或多种选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的脂质混合之后，本文所述的受体靶向缀合物可以部分或完全与脂质纳米颗粒的其他组分组合。图10-11示出了6个示例性方案(方案1-6)。在一些实施方案中，在核酸分子实体与甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和/或氨基脂质混合之后，引入受体靶向缀合物。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物添加在稀释缓冲液中。稀释缓冲液可以与从在线混合室出来的预形成的核酸-脂质纳米颗粒混合，从而形成纳米颗粒。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含脂质(例如隐形脂质)的至少一部分。在一些实施方案中，将LNP组合物中的所有受体靶向缀合物引入稀释缓冲液中。在一些实施方案中，在向混合物中添加稀释缓冲液并将稀释的混合物保持一段时间之后，将受体靶向缀合物引入至脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，保持时间为1至120分钟。在一些实施方案中，保持时间为1至90分钟、1至60分钟或10至40分钟。在一些实施方案中，保持时间为约25至35分钟、约20至40分钟、约10至50分钟，或约5至60分钟。在一些实施方案中，保持时间为约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟或约50分钟。在一些实施方案中，保持时间为约30分钟。在一些实施方案中，在缓冲液交换之后，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。在一些实施方案中，在缓冲液交换之后，立即将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。在一些实施方案中，在缓冲液交换和浓缩之后，但在储存之前，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。在一些实施方案中，在缓冲液交换之后，但在浓缩和储存之前，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。在一些实施方案中，在储存和解冻之后且在给药或评估之前，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。
本文所述的受体靶向缀合物可以与一种或多种选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的脂质部分或完全预混合，从而与预混物的其他组分同时引入至纳米颗粒(即，将GalNAc-脂质添加至LNP赋形剂中)。图12-13示出了将GalNAc-脂质添加至LNP赋形剂中的5个示例性方案(方案7-11)。将GalNAc-脂质添加之LNP赋形剂中的其他示例性方案如图9中的过程4所示。
本文所述的受体靶向缀合物可以通过在线混合与脂质纳米颗粒的其他组分部分或完全组合。例如，在将一种或多种核酸分子实体与一种或多种选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的脂质混合之后，可以通过第三通道或端口经由在线混合连续添加受体靶向缀合物。连续在线混合可以提供受体靶向缀合物与纳米颗粒中其余组分的瞬时混合，从而形成靶纳米颗粒。在一些实施方案中，受体靶向缀合物的全部或一部分经由交叉混合与其他组分组合。在一些实施方案中，受体靶向缀合物的全部或一部分经由T型混合器与其他组分组合。在一些实施方案中，受体靶向缀合物的全部或一部分经由微流体混合器与其他组分组合。图14示出了经由在线混合添加GalNAc-脂质的2个示例性方案(方案12-13)。其他示例性方案如图9中的过程3所示。
本文所述的受体靶向缀合物可以通过两次或更多次单独、独立的添加(即，分开添加GalNAc-脂质)与脂质纳米颗粒的其他组分组合。在一些实施方案中，在不同的步骤中进行两次或更多次单独的添加。在一些实施方案中，同时进行两次或更多次单独的添加。在一些实施方案中，两次或更多次单独的添加涉及不同的溶液。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物的一部分与第二溶液中的一种或多种脂质组合，并且在混合之后，将受体靶向缀合物的一部分与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物的一部分与第二溶液中的一种或多种脂质组合，并且在孵育步骤之后，将受体靶向缀合物的一部分与一种或多种脂质组合。在一些实施方案中，将受体靶向缀合物的一部分与第二溶液中的一种或多种脂质组合，并且在缓冲液交换步骤之后，将受体靶向缀合物的一部分与一种或多种脂质组合。图12-13示出了分开添加GalNAc-脂质的5个示例性方案(方案7-11)。图14示出了分开添加GalNAc-脂质的其他示例性方案。相似地，可以通过分开添加引入LNP的其他组分。例如，如图14的方案13所示，可以将一种或多种核酸分子实体引入两种单独的缓冲液溶液中。在一些实施方案中，将一种或多种核酸分子实体引入2至4种溶液中。在一些实施方案中，将甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和/或氨基脂质独立地引入至1-3种溶液中的LNP，其可以同时或在不同时间发生。
在一些实施方案中，制备包含本文所述的纳米颗粒的制剂的方法包括通过添加稀释缓冲液来稀释通过混合第一溶液和第二溶液产生的混合物。在一些实施方案中，混合物在线稀释。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含受体靶向缀合物的至少一部分。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含隐形脂质的至少一部分。
在一些实施方案中，第一溶液包含水性缓冲液。在一些实施方案中，第一溶液包含有机溶剂。在一些实施方案中，第一溶液包含与有机溶剂混合的水性缓冲液的混合物。在一些实施方案中，存在于水性缓冲液中的有机溶剂是乙醇。在一些实施方案中，水性缓冲液中的乙醇百分比为0.1％至50％或者其间的任何数量或范围。在一些实施方案中，第二溶液包含与有机溶剂混合的水性缓冲液的混合物。在一些实施方案中，第二溶液包含乙醇。在一些实施方案中，第二溶液包含乙醇和水。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含水性缓冲液。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含有机溶剂。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含乙醇和水。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含PBS缓冲液中的10％至20％的乙醇。
在一些实施方案中，将受体靶向缀合物(例如GalNAc-脂质)作为溶液引入至纳米颗粒。在一些实施方案中，溶液中受体靶向缀合物的浓度为约0.1mol％至20mol％或者其间的任何数量或范围。在一些实施方案中，溶液中受体靶向缀合物的浓度为约10mol％至约20mol％、约5mol％至约10mol％、约0.25mol％至约5mol％、约0.5mol％至约3mol％、约0.5mol％至约2mol％、约0.25mol％至约1mol％、约0.25mol％至约0.5mol％、约1mol％至约2mol％、约2mol％至约3mol％，或约0.1mol％至约0.5mol％。在一些实施方案中，溶液中受体靶向缀合物的浓度为约0.25mol％、约0.5mol％、约0.9mol％、约1mol％、约1.5mol％或约2mol％。在一些实施方案中，溶液中受体靶向缀合物的浓度为约0.25mol％。
在一些实施方案中，混合包括层流混合、涡流混合、湍流混合或其组合。在一些实施方案中，混合包括交叉混合。在一些实施方案中，混合包括在线混合。在一些实施方案中，混合包括通过第一入口通道引入第一溶液的至少一部分以及通过第二入口通道引入第二溶液的至少一部分，并且其中第一入口通道和第二入口通道之间的角度为约0至180度。在一些实施方案中，第一入口通道和第二入口通道之间的角度为约15至180度、约30至180度、约45至180度、约60至180度、约90至180度或者其间的任何数量或范围。在一些实施方案中，混合包括通过第三入口通道引入第一溶液的一部分。混合步骤可以通过许多方法进行，例如，通过机械手段，例如涡旋混合器。在一些实施方案中，混合步骤包括在线混合。图9-14中示出了示例性混合过程。在一些实施方案中，如图14所示，混合步骤包括交叉混合GalNAc-脂质。在一些实施方案中，通过第三入口将含有靶向缀合物的溶液引入至在线混合室中。
在一些实施方案中，制备包含本文所述的纳米颗粒的制剂的方法包括过滤步骤。在一些实施方案中，制备包含本文所述的纳米颗粒的制剂的方法包括缓冲液交换。在一些实施方案中，缓冲液交换包括透析、色谱或切向流过滤(TFF)。
药物组合物
在一方面，本文公开了药物组合物，其包含一种或多种所述的LNP组合物。例如，药物组合物可以包含一种或多种LNP组合物，其包括一种或多种不同的有效负载。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种LNP组合物，其可以相同或不同。
在一方面，本文公开了药物组合物，其包含一种或多种所述的受体靶向缀合物。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种受体靶向缀合物，其可以相同或不同。在一些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含(i)第一受体靶向缀合物或第一纳米颗粒组合物，以及(ii)第二受体靶向缀合物或第二纳米颗粒组合物。
药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或辅助成分，例如本文所述的那些。配制和制造药物组合物和药剂的通用原则可在例如Remington’sThe Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006中获得。赋形剂或载体可以包括除本发明的化合物、其他脂质组分和有效负载以外的任何成分。赋形剂可以赋予制剂功能性(例如药物释放速率控制)和/或非功能性(例如加工助剂或稀释剂)特征。赋形剂和载体的选择可以取决于因素，例如特定的施用模式、赋形剂对溶解度和稳定性的影响，以及剂型的性质。肠胃外制剂通常是水性或油性溶液或悬浮液。可以使用赋形剂或载体，例如糖(包括但不限于葡萄糖、甘露醇、山梨醇等)、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH为3至9)。在一些实施方案中，LNP组合物可以用无菌非水性溶液配制或配制为干燥形式，以与合适的媒介物(例如无菌无热原水(WFI))结合使用。
在一些实施方案中，赋形剂或载体可以构成包含纳米颗粒组合物的药物组合物总质量或体积的大于50％。例如，赋形剂或载体可以构成药物组合物的50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂或载体纯度为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施方案中，药物组合物可以包含0.1％至100％(wt/wt)的一种或多种纳米颗粒组合物。在某些实施方案中，将纳米颗粒组合物和/或药物组合物冷藏或冷冻用于储存和/或运输(例如，储存在4℃或更低的温度下，例如约-150℃至约0℃或约-80℃至约-20℃的温度)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物和/或药物组合物在约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃下冷藏或冷冻。
所述的LNP组合物和/或药物组合物可以施用至任何患者或对象，包括可受益于通过将有效负载递送至一个或多个特定细胞、组织、器官或系统或其组而提供的治疗效果的那些患者或对象。在一些实施方案中，对象是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，对象是非人灵长类动物或哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠。
包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物可以通过药物学领域已知或此后开发的任何方法制备。通常，这种制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分混合，然后，如果需要或必要，则将产品划分、成形和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
根据本发明的药物组合物可以作为单单位剂量和/或作为多个单单位剂量大批制备、包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分(例如，纳米颗粒组合物)的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于施用至对象的活性成分的剂量和/或这种剂量的适当分数，例如，这种剂量的一半或三分之一。药物组合物可以以适合于多种施用途径和方法的多种形式制备。例如，药物组合物可以以液体剂型(例如，乳剂、微乳剂、纳米乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂)、可注射形式、固体剂型(例如，胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒)、用于局部和/或经皮施用的剂型(例如，软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴剂)、悬浮液、粉末和其他形式制备。
在一些实施方案中，药物组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种有效负载。在一些实施方案中，药物组合物包含两种不同的有效负载，例如指导RNA和mRNA。指导RNA和mRNA可以位于相同的LNP组合物中，或者它们可以位于单独的LNP组合物中。例如，药物组合物可以包含两种不同的LNP组合物，一种包含指导RNA有效负载，另一种包含mRNA有效负载。对于另一实例，药物组合物可以包含两种不同的LNP组合物，一种包含指导RNA(或mRNA)有效负载，另一种包含mRNA有效负载和指导RNA有效负载两者。对于又一实例，药物组合物可以包含一种LNP组合物，其包含mRNA有效负载和指导RNA有效负载。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种不同的LNP组合物。在一些实施方案中，两种或更多种不同的LNP组合物存在于药物组合物中，使得mRNA分子和指导RNA处于本文所述的摩尔或重量比。
gRNA和mRNA有效负载可以以各种摩尔或重量比存在于药物组合物中。例如，药物组合物中gRNA与mRNA的比可以为0.01至100(按重量计)和/或其间的任何值。例如，药物组合物中gRNA与mRNA的比可以为0.01至100(按摩尔计)和/或其间的任何值。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比为约1至约50(按重量计或按摩尔计)和/或其间的任何值。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比为约0.1至约10(按重量计或按摩尔计)和/或其间的任何值。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比为约0.2至约5、约0.25至约4、约0.3至约3，或约0.5至约2(按重量计)。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比为约0.2至约5、约0.25至约4、约0.3至约3，或约0.5至约2(按摩尔计)。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比为约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10(按重量计)。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比为约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10(按摩尔计)。在一些实施方案中，药物组合物中mRNA与gRNA的比为约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10(按重量计)。在一些实施方案中，药物组合物中mRNA与gRNA的比为约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10(按摩尔计)。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比为约1∶1(按重量计)。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比为约1∶1(按摩尔计)。
在一些实施方案中，药物组合物中的gRNA靶向肝细胞中产生的致病基因。在一些实施方案中，药物组合物包含多于一种指导RNA。例如，药物组合物可以包含2、3、4、5或更多种不同的指导RNA。在一些实施方案中，药物组合物包含两种指导RNA分子。在一些实施方案中，药物组合物包含一种mRNA以及两种或更多种指导RNA分子。在一些实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向相同的致病基因。在一些实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向不同的基因。在一些具体实施方案中，两种指导RNA分子靶向肝细胞中产生的两个单独的致病目的基因。在一些实施方案中，gRNA是sgRNA。在一些实施方案中，gRNA是dgRNA。
本文公开的LNP组合物和药物组合物可以用于体内和体外两者基因编辑的方法中。在一些实施方案中，该方法包括使细胞与本文所述的LNP组合物或药物组合物接触。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是啮齿动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人类细胞。在一些实施方案中，细胞是肝脏细胞。在一些实施方案中，细胞是人肝脏细胞。在一些实施方案中，肝脏细胞是肝细胞。在一些实施方案中，肝细胞是人肝细胞。在一些实施方案中，肝脏细胞是干细胞。在一些实施方案中，人肝脏细胞是肝窦内皮细胞(LSEC)。在一些实施方案中，人肝脏细胞是枯式(Kupffer)细胞。在一些实施方案中，人肝脏细胞是肝星状细胞。在一些实施方案中，人肝脏细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，人肝脏细胞是肝脏干细胞。在一些实施方案中，细胞包含ApoE结合受体。在一些实施方案中，提供了工程化细胞；例如，工程化细胞可以衍生自如本文所述的细胞类型中的任一种。这种工程化细胞可以根据本文所述的方法产生。在一些实施方案中，工程化细胞存在于对象的组织或器官(例如，肝脏)内。
靶序列
本发明提供了活性药剂或治疗性药剂(例如基因组编辑组合物)以及用于其靶向递送的方法和组合物。本文所述的治疗性药剂可以包含基因组编辑组合物，其被引导至并修饰、改变或切割靶核酸分子上的靶序列。例如，活性药剂可以包含能够实现对靶序列的修饰的核酸或核酸-蛋白质复合体。
靶序列可以是DNA序列或RNA序列。在一些实施方案中，活性药剂或治疗性药剂可以包含RNA干扰因子。在一些实施方案中，活性药剂可以包含siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、微小RNA、抗微小RNA或antimir、supermir、antagomir、核酶、三链体形成寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、免疫刺激性寡核苷酸、RNA激活剂或U1衔接子。活性药剂可以识别靶序列并介导靶序列的切割和/或降解。在一些实施方案中，活性或治疗性药剂可以包含指导RNA。指导RNA可以与核酸指导的可编程核酸酶(例如CRISPR酶，例如Cas9)或其进一步包含功能性结构域的融合蛋白复合。靶序列可以由核酸指导的可编程核酸酶结构域识别。靶序列可以被核酸指导的可编程核酸酶结构域切割和/或被功能性结构域(例如脱氨酶结构域、甲基化酶结构域、甲基转移酶结构域、激活结构域、阻遏物结构域、核酸酶结构域、转座酶结构域或重组酶结构域)修饰。在一些实施方案中，通过指导RNA可以将Cas9蛋白引导至靶核酸分子的靶序列，其中指导RNA与靶序列杂交，并且Cas蛋白切割靶序列。在一些实施方案中，靶序列可以与指导RNA的靶向序列互补。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与其相应靶序列之间的互补性程度可以为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，靶序列和指导RNA的靶向序列可以100％互补。在其他实施方案中，靶序列和指导RNA的靶向序列可以含有至少一个错配。例如，靶序列和指导RNA的靶向序列可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。在一些实施方案中，靶序列和指导RNA的靶向序列可以含有1-6个错配。在一些实施方案中，靶序列和指导RNA的靶向序列可以含有5个或6个错配。
靶序列的长度可以取决于所用的核酸酶系统。例如，CRISPR/Cas系统的靶序列的长度可以包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或多于50个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列的长度可以包含18-24个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列的长度可以包含19-21个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列的长度可以包含20个核苷酸。当使用切口酶时，靶序列可以包含由DNA分子相反链上的一对切口酶识别的一对靶序列。
在一些实施方案中，活性药剂或治疗性药剂可以包含大范围核酸酶系统。大范围核酸酶的靶序列的长度可以包含12-40个或更多个核苷酸。当使用ZFN时，靶序列可以包含由DNA分子相反链上的一对ZFN识别的两个半靶序列，其间具有互连序列。在一些实施方案中，ZFN的每个半靶序列的长度可以独立地包含9、12、15、18或更多个核苷酸。在一些实施方案中，ZFN的互连序列的长度可以包含4-20个核苷酸。在一些实施方案中，ZFN的互连序列的长度可以包含5-7个核苷酸。
当使用TALEN时，靶序列可以相似地包含由DNA分子相反链上的一对TALEN识别的两个半靶序列，其间具有互连序列。在一些实施方案中，TALEN的每个半靶序列的长度可以独立地包含10-20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，TALEN的互连序列的长度可以包含4-20个核苷酸。在一些实施方案中，TALEN的互连序列的长度可以包含12-19个核苷酸。
在一些实施方案中，靶序列可以邻近前间隔区相邻基序(PAM)，即由CRISPR/Cas复合体识别的短序列。前间隔区相邻基序(或PAM)对于CRISPR/Cas复合体的靶结合是必需的。通常，PAM是紧接Cas核酸酶的DNA靶序列的2-6个碱基对DNA序列。PAM可以是5’PAM或3’PAM。PAM的确切序列取决于Cas蛋白的类型。例如，通常的SpCas9结合需要3’-NGG-5’PAM(也称为标准PAM)，其中N为A、G、C或T中的任一个。具有某些氨基酸取代(例如D1135E、R1335Q、G1218R和/或T1337R)的SpCas9可以识别NGA PAM或NGCG PAM。SaCas9结合需要3’-NNGRRT-5’PAM。具有某些氨基取代(例如K781E、K697N、H1014R)的SaCas9可以识别NNNRRT PAM。
在一些实施方案中，PAM可以邻近或在靶序列3’端的1、2、3或4个核苷酸内。PAM的长度和序列可以取决于所用的Cas9蛋白。例如，PAM可以选自特定Cas9蛋白或Cas9直向同源物的共有序列或特定PAM序列，包括Ran等人，Nature,520:186-191(2015)的图1中公开的那些，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，PAM的长度可以包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。非限制性示例性PAM序列包括NGG、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA和NNNNGATT(其中N定义为任何核苷酸，W定义为A或T)。在一些实施方案中，PAM序列可以是NGG。在一些实施方案中，PAM序列可以是NGGNG。在一些实施方案中，PAM序列可以是NNAAAAW。如Hu等人，Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and highDNA specificity,Nature 2018 556(7699):57-63中所述的另外的进化型Cas变体和PAM序列以其整体并入本文。
靶核酸分子可以是细胞内源性或外源性的任何DNA或RNA分子。如本文所用，术语“内源性序列”是指细胞天然的序列。术语“外源性序列”是指细胞非天然的序列，或其在细胞基因组中的天然位置在不同位置的序列。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是来自细胞或细胞中的质粒、基因组DNA或染色体。在一些实施方案中，靶核酸分子的靶序列可以是来自细胞或细胞中的基因组序列。在一些实施方案中，细胞可以是原核细胞。在其他实施方案中，细胞可以是真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是啮齿动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是人类细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是肝脏细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是肝细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是实质细胞、肝窦内皮细胞、吞噬枯式(phagocyticKupffer)细胞或星状细胞。在进一步的实施方案中，靶序列可以是病毒序列。在其他实施方案中，靶序列可以是合成序列。在一些实施方案中，靶序列可以在真核染色体上，例如人染色体。
在一些实施方案中，靶序列可以位于基因的编码序列、基因的内含子序列、基因的转录控制序列、基因的翻译控制序列或基因之间的非编码序列中。在一些实施方案中，基因可以是蛋白质编码基因。在其他实施方案中，基因可以是非编码RNA基因。在一些实施方案中，靶序列可以包含疾病相关基因的全部或一部分。在一些实施方案中，靶序列可以包含与冠状动脉疾病相关的基因的全部或一部分。在一些实施方案中，靶序列可以包含编码载脂蛋白的基因的至少一部分。在一些实施方案中，靶序列可以包含选自PCSK9、ANGPTL3、APOC3、LPA、APOB、MTP、ANGPTL4、ANGPTL8、APOA5、APOE、LDLR、IDOL、NPC1L1、ASGR1、TM6SF2、GALNT2、GCKR、LPL、MLXIPL、SORT1、TRIB1、MARC1、ABCG5和ABCG8的基因的至少一部分。
在一些实施方案中，使靶序列与本文所述的基因组编辑组合物接触导致在靶序列内或邻近靶序列的碱基编辑事件。例如，由于与如本发明中公开的包含融合蛋白的基因组编辑组合物接触，靶序列内或邻近靶序列的靶碱基(例如C碱基)可以转化为T碱基，该融合蛋白包含核酸指导的核酸酶结构域和脱氨酶结构域。在一些实施方案中，靶碱基位于PAM上游(5’端)。在一些实施方案中，靶碱基位于PAM上游(5’端)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基对的位置。在一些实施方案中，靶碱基位于PAM上游(5’端)的13至17个碱基对内的位置。在一些实施方案中，靶碱基位于PAM上游(5’端)的13至17个碱基对以外的位置。在一些实施方案中，靶碱基对位于PAM上游(5’端)的10-15个碱基对的位置。在一些实施方案中，靶碱基位于PAM上游的11-12个碱基对的位置。在一些实施方案中，靶碱基是PAM上游(5’端)的11个碱基对。在一些实施方案中，靶碱基位于靶序列(例如ANGPTL3编码多核苷酸(例如，ANGPTL3基因座))的编码区(例如，外显子)中。例如，ANGPTL3基因座编码区中碱基的转化可以导致ANGPTL3蛋白序列中的氨基酸改变，即，突变。在一些实施方案中，突变是功能缺失突变。在一些实施方案中，突变可以将提前终止密码子(pre-mature stop codon)引入至靶序列的编码区，例如ANGPTL3基因的编码区。在一些实施方案中，功能缺失突变是天然存在的功能缺失突变。在一些实施方案中，突变位于PCSK9基因的编码区中，例如G106R、L253F、A443T、R93C、G24D、S47F、R46H、S153N或H193Y突变。在一些实施方案中，功能缺失突变将提前终止密码子引入至ANGPTL3基因的编码区。在一些实施方案中，可以将功能缺失突变引入至APOC3基因的编码区，例如R19X突变。在一些实施方案中，可以将功能缺失突变引入至低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白中。在一些实施方案中，可以将功能缺失突变引入至LDL受体(IDOL)蛋白的可诱导降解剂中。
在一些实施方案中，靶序列位于靶序列的非编码区中，例如，位于靶基因的内含子或剪接位点中。在一些实施方案中，靶序列位于剪接位点中，并且这种靶碱基的编辑导致靶基因mRNA的选择性剪接。在一些实施方案中，选择性剪接导致功能缺失突变体。在一些实施方案中，选择性剪接导致在靶mRNA中引入提前终止密码子或移码，从而导致截短的、不稳定的或折叠缺陷型多肽。在一些实施方案中，可以将终止密码子引入至正常终止密码子(被称为“提前终止密码子”)上游的载脂蛋白编码基因的编码序列中。在一些实施方案中，可以将终止密码子引入至靶基因的编码区。提前终止密码子导致翻译提前终止，进而导致截短的和无功能性蛋白质，并且经由无义介导的mRNA衰变途径诱导mRNA快速降解。参见例如，Baker等人，Current Opinion in Cell Biology 16(3):293-299,2004；Chang等人，AnnualReview of Biochemistry 76:51-74,2007；以及Behm-Ansmant等人，Genes&Development20(4):391-398,2006，其中的每一个通过引用并入本文。本文所述的基因组编辑组合物可以用于将多个编辑事件引入至靶序列。例如，基因组编辑组合物可以包含核酸指导可编程核酸酶，其在靶基因中诱导双链断裂、缺失、插入、移码、回复或其他改变。例如，基因组编辑组合物可以包含核酸指导的可编程核酸酶-脱氨酶融合蛋白，其可以转化几个氨基酸，以产生终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)。
在一些实施方案中，提供了将突变同时引入至LDL介导的胆固醇清除途径中的多于一种蛋白质因子中。例如，在一些实施方案中，可以将突变同时引入至ANGPTL3、PCSK9、LDLR、APOB、APOE、IDOL和其他LDL介导的途径相关基因中的一种或多种，优选至少两种。在一些实施方案中，可以将功能缺失突变同时引入至ANGPTL3、PCSK9、APOB和另一LDL介导的途径相关基因中的一种或多种，优选至少两种。在一些实施方案中，可以将突变同时引入至ANGPTL3、PCSK9、LDLR和IDOL中。为了将功能缺失突变同时引入至多于一种蛋白质，使用多个指导核苷酸序列。
在一些实施方案中，靶序列可以位于基因组中控制染色质组织方面的非基因功能性位点，例如支架位点或基因座控制区。在一些实施方案中，靶序列可以是遗传安全港(genetic safe harbor)位点，即，促进安全遗传修饰的基因座。
模板
在一些实施方案中，在修复切割的靶核酸分子期间，可以提供至少一种模板作为底物。在一些实施方案中，模板可以用于同源重组，例如，高保真同源重组。在一些实施方案中，同源重组可以导致模板序列整合至靶核酸分子中。在一些实施方案中，可以提供单个模板或多个拷贝的相同模板。在其他实施方案中，可以提供两个或更多个模板，使得同源重组可以发生在两个或更多个靶位点处。例如，可以提供不同的模板来修复细胞中的单个基因或细胞中的两个不同基因。在一些实施方案中，可以以独立的拷贝数提供不同的模板。
在一些实施方案中，模板可以用于同源定向修复，需要DNA链侵入核酸中的切割位点。在一些实施方案中，同源定向修复可以导致模板序列拷贝至靶核酸分子中。在一些实施方案中，可以提供单个模板或多个拷贝的相同模板。在其他实施方案中，具有不同序列的两个或更多个模板可以通过同源定向修复在两个或多个位点插入。例如，可以提供不同的模板来修复细胞中的单个基因或细胞中的两个不同基因。在一些实施方案中，可以以独立的拷贝数提供不同的模板。
在一些实施方案中，模板可以作为通过非同源性末端连接介导的插入掺入至切割的核酸中。在一些实施方案中，模板序列与切割位点附近的核酸序列没有相似性。在一些实施方案中，模板序列(例如，模板中的编码序列)与切割位点附近的核酸序列没有相似性。模板序列的两侧可以是与切割位点附近的靶序列具有相似或相同序列的靶序列。在一些实施方案中，可以提供单个模板或多个拷贝的相同模板。在其他实施方案中，具有不同序列的两个或多个模板可以通过非同源性末端连接在两个或更多个位点插入。例如，可以提供不同的模板来插入细胞中的单个模板或细胞中的两个不同模板。在一些实施方案中，可以以独立的拷贝数提供不同的模板。
在一些实施方案中，模板序列可以对应于靶细胞的内源性序列。在一些实施方案中，内源性序列可以是细胞的基因组序列。在一些实施方案中，内源性序列可以是染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，内源性序列可以是细胞的质粒序列。在一些实施方案中，模板序列可以与细胞中切割位点处或附近的内源性序列的一部分基本上相同，但包含至少一个核苷酸改变。在一些实施方案中，用模板修复切割的靶核酸分子可以导致突变，包括靶核酸分子的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，突变可以导致由包含靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一些实施方案中，突变可以导致由靶基因表达的RNA中的一个或多个核苷酸改变。在一些实施方案中，突变可以改变靶基因的表达水平。在一些实施方案中，突变可以导致靶基因的表达增加或减少。在一些实施方案中，突变可以导致基因敲低。在一些实施方案中，突变可以导致基因敲除。在一些实施方案中，用模板修复切割的靶核酸分子可以导致靶基因的外显子序列、内含子序列、转录控制序列、翻译控制序列或非编码序列的置换。
在其他实施方案中，模板序列可以包含外源性序列。在一些实施方案中，外源性序列可以包含可操作连接至外源性启动子序列的蛋白质或RNA编码序列，使得在外源性序列整合至靶核酸分子后，细胞能够表达由整合的序列编码的蛋白质或RNA。在其他实施方案中，在外源性序列整合至靶核酸分子中后，整合的序列的表达可以由内源性启动子序列调控。在一些实施方案中，外源性序列可以是染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，外源性序列可以提供编码蛋白质或蛋白质的一部分的cDNA序列。在其他实施方案中，外源性序列可以包含外显子序列、内含子序列、转录控制序列、翻译控制序列或非编码序列。在一些实施方案中，外源性序列的整合可以导致基因敲入。
模板可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，模板的长度可以包含10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000或更多个核苷酸。在一些实施方案中，模板可以包含与包含靶序列的靶核酸分子的一部分互补的核苷酸序列(即，“同源臂”)。在一些实施方案中，同源臂的长度可以包含10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000、1500、2000、2500、3000或更多个核苷酸。在一些实施方案中，模板可以包含同源臂，其与位于靶核酸分子上切割位点上游或下游的序列互补。在一些实施方案中，模板可以包含第一核苷酸序列和第二同源臂，其分别与位于切割位点上游和下游的序列互补。当模板含有两个同源臂时，每个臂可以具有相同长度或不同长度，并且同源臂之间的序列可以与同源臂之间的靶序列基本上相似或相同，或完全不相关。在一些实施方案中，模板上的第一核苷酸序列与切割位点上游的序列之间以及模板上的第二核苷酸序列与切割位点下游的序列之间的互补性程度可以允许模板与靶核酸分子之间同源重组，例如，高保真同源重组。在一些实施方案中，互补性程度可以为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可以为约95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可以为约98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可以为100％。在一些实施方案中，例如本文所述的那些，其中模板作为通过非同源性末端连接介导的插入掺入至切割的核酸中，该模板不具有同源臂。在一些实施方案中，例如，如本文所述，不具有同源臂的模板包含模板序列一端或两端侧翼的靶序列。在一些实施方案中，不具有同源臂的模板包含模板序列两端侧翼的靶序列。在一些实施方案中，模板序列末端侧翼的靶序列是约10-50个核苷酸。在一些实施方案中，模板序列末端侧翼的靶序列是约10-20个核苷酸、约15-20个核苷酸、约20-25个核苷酸或约20-30个核苷酸。在一些实施方案中，模板序列末端侧翼的靶序列是约17-23个核苷酸。在一些实施方案中，模板序列末端侧翼的靶序列是约20个核苷酸。
在一些实施方案中，如果在模板和基因组序列之间发生同源重组，则由模板表达核酸分子。在一些实施方案中，例如，模板不具有用于表达核酸分子的启动子，和/或ATG转录起始位点从编码序列中除去。
递送
本文提供了用于用核酸酶系统编辑细胞中的核酸分子及其靶向递送的方法和组合物。在一些实施方案中，核酸包含编码基因的核酸序列。在一些实施方案中，核酸包含编码与疾病或病症相关的基因的核酸序列。
包含本文所述的核酸(例如修饰的指导RNA)的活性药剂可以与一个或多个靶向部分缀合，用于靶向递送至所需的体内位置。可以经由本领域已知的任何方法将指导RNA缀合物或指导RNA-蛋白质复合体缀合物引入至细胞中，该方法例如病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、脂质颗粒或囊泡转导、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染(例如通过阳离子脂质体介导的转染)、基因枪技术、磷酸钙沉淀、剪切驱动的细胞渗透、与细胞穿透肽融合随后细胞接触、显微注射和纳米颗粒介导的递送。在一些实施方案中，可以经由病毒感染将核酸酶系统引入至细胞中。在一些实施方案中，可以经由噬菌体感染将核酸酶系统引入至细胞中。脂质体可以包括由1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体、来自Marina Biotech(华盛顿州博塞尔)的DiLa2脂质体、1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)和可以递送小分子药物(例如但不限于(来自Janssen Biotech,Inc.(宾夕法尼亚州霍舍姆))的脂质体)形成的那些。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物可以包括将本文所述的载体系统引入至细胞中。在一些实施方案中，载体系统整体或部分编码核酸酶系统。在一些实施方案中，载体系统包含一个、两个、三个或更多个载体。在一些实施方案中，将载体系统引入至细胞中可以产生具有编辑的核酸分子的稳定细胞系，同时载体丢失，例如，靶向自毁。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。真核细胞的非限制性实例包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、来自无脊椎动物的细胞、来自脊椎动物的细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞以及人类细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是啮齿动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是人类细胞。相似地，靶序列可以来自任何这种细胞或在任何这种细胞中。
在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸或寡核苷酸(例如指导RNA或mRNA)可以配制在脂质囊泡中，其可以在官能化脂质双层或脂质-聚阳离子复合体之间形成交联。脂质体制剂可以受到但不限于阳离子脂质组分的选择、阳离子脂质饱和的程度、PEG化的性质、所有组分的比和生物物理参数(例如大小)或聚阳离子组合物的影响。在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可以包括但不限于脂质体，例如由稳定的质粒-脂质颗粒(SPLP)或稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)的合成形成的那些，稳定的质粒-脂质颗粒(SPLP)或稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)先前已被描述并显示出适合于体外和体内寡核苷酸递送。脂质纳米颗粒可以经工程化以改变颗粒的表面特性，使得脂质纳米颗粒可以穿透粘膜屏障。粘液位于粘膜组织上，例如但不限于口腔(例如，颊和食管膜以及扁桃体组织)、眼、胃肠(例如，胃、小肠、大肠、结肠、直肠)、呼吸道(例如，鼻、咽、气管和支气管膜)、生殖器(例如，阴道、宫颈和尿道膜)。制剂可以使用大于10-200nm的纳米颗粒，其对于较高的药物包封效率和提供多种药物持续递送的能力是优选的，该药物被认为过大而不能通过粘膜屏障快速扩散。纳米颗粒的动态转运可以使用荧光漂白恢复(FRAP)和高分辨率多颗粒跟踪(MPT)来测量。可以制备用于控释和/或靶向递送的制剂。工程化以穿透粘液的脂质纳米颗粒可以包括表面改变剂，例如但不限于mRNA、阴离子蛋白质(例如，牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如，阳离子表面活性剂，例如二甲基二-十八烷基溴化铵)、糖或糖衍生物(例如，环糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如，N-乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青属(clerodendrum)、乙酰半胱氨酸、溴己新、羧甲司坦、依普拉酮、美司钠、氨溴索、索布瑞醇、多米奥醇、来托司坦、司替罗宁、硫普罗宁、凝溶胶蛋白、胸腺素β4、阿法链道酶、奈替克新、厄多司坦)和包括重组人DNA酶的各种DNA酶。表面改变剂可以包埋或拌住在颗粒表面中或者(例如，通过涂覆、吸附、共价键或其他过程)设置或分散在脂质纳米颗粒的表面上。
在进一步的实施方案中，本发明的指导RNA和CRISPR系统可以配制为脂质复合物，例如但不限于ATUPLEXTM系统、DACC系统、DBTC系统和其他siRNA-脂质复合物技术。脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒可以用于改善修饰的指导RNA的功效，例如通过增加细胞转染、增加编码蛋白的翻译或提高稳定性。细胞穿透肽可以与本发明的药物制剂一起使用，例如附接至促进递送至细胞内空间的聚阳离子的细胞穿透肽序列，例如，HIV衍生的TAT肽、穿透蛋白、转运蛋白或hCT衍生的细胞穿透肽。在另一实施方案中，可以使用靶向特定细胞类型的脂质纳米颗粒。可替代地，可以将脂质纳米颗粒包封至本领域已知的任何聚合物或水凝胶中，当注射至对象中时，其可以形成凝胶。作为另一非限制性实例，可以将脂质纳米颗粒包封至可生物降解的聚合物基质中。在另一实施方案中，药物组合物可以是缓释制剂。在另一实施方案中，缓释制剂可以用于皮下递送。缓释制剂可以包括但不限于PLGA微球、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics,Inc.，佛罗里达州阿拉楚阿)、(Halozyme Therapeutics，加利福尼亚州圣地亚哥)、外科密封剂(例如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.，佐治亚州科尼利亚))、(BaxterInternational,Inc，伊利诺伊州迪尔菲尔德)、基于PEG的密封剂以及(Baxter International,Inc，伊利诺伊州迪尔菲尔德)。
在一些实施方案中，如本文所述的核酸(例如指导RNA)可以与CRISPR酶复合。在一些实施方案中，可以经由包含一个或多个载体的载体系统递送复合体的部分或全部。在一些实施方案中，载体可以是DNA载体。在其他实施方案中，载体可以是RNA载体。在一些实施方案中，RNA载体可以是mRNA，例如编码核酸酶(例如Cas9)的mRNA。在一些实施方案中，载体可以是环状的。在其他实施方案中，载体可以是线性的。非限制性示例性载体包括质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体、微染色体、转座子、病毒载体以及表达载体。在一些实施方案中，核酸酶由RNA载体(例如，作为mRNA)提供，并且模板由病毒载体提供。在一些实施方案中，载体可以是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以从其野生型对应物进行遗传修饰。例如，病毒载体可以包含一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代，以促进克隆或使得载体的一个或多个特性改变。这种特性可以包括包装能力、转导效率、免疫原性、基因组整合、复制、转录以及翻译。在一些实施方案中，可以缺失病毒基因组的一部分，使得病毒能够包装具有更大大小的外源性序列。在一些实施方案中，病毒载体可以具有增强的转导效率。在一些实施方案中，可以降低宿主中病毒诱导的免疫应答。在一些实施方案中，促进病毒序列整合至宿主基因组的病毒基因(例如，整合酶)可以突变，使得病毒变成非整合。在一些实施方案中，病毒载体可以是复制缺陷型的。在一些实施方案中，病毒载体可以包含外源性转录或翻译控制序列，以驱动载体上的编码序列表达。在一些实施方案中，病毒可以是辅助依赖性的。例如，病毒可能需要一种或多种辅助病毒来提供将载体扩增和包装成病毒颗粒所需的病毒组分(例如，病毒蛋白)。在这种情况下，可以将一种或多种辅助组分(包括一种或多种编码病毒组分的载体)与本文所述的载体系统一起引入至宿主细胞中。在其他实施方案中，病毒可以是无辅助的。例如，病毒可以能够扩增和包装载体，而不需要任何辅助病毒。在一些实施方案中，本文所述的载体系统还可以编码病毒扩增和包装所需的病毒组分。
非限制性示例性病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV-1)载体、噬菌体T4、杆状病毒载体以及逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是AAV载体。在其他实施方案中，病毒载体可以是慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒可以是非整合的。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺病毒载体。在一些实施方案中，腺病毒可以是高克隆能力或“裸(gutless)”腺病毒，其中除5’和3’末端反向重复(ITR)和包装信号(Ψ)之外的所有编码病毒区域从病毒中缺失，以提高其包装能力。在其他实施方案中，病毒载体可以是HSV-1载体。在一些实施方案中，基于HSV-1的载体是辅助依赖性的，而在其他实施方案中，它是辅助非依赖性的。例如，仅保留包装序列的扩增子载体需要具有用于包装的结构组分的辅助病毒，而除去非必需病毒功能的30kb缺失的HSV-1载体不需要辅助病毒。在另外的实施方案中，病毒载体可以是噬菌体T4。在一些实施方案中，当病毒头部清空时，噬菌体T4可以能够包装任何线性或环状DNA或RNA分子。在进一步的实施方案中，病毒载体可以是杆状病毒载体。在又进一步的实施方案中，病毒载体可以是逆转录病毒载体。在使用具有较小克隆能力的AAV或慢病毒载体的实施方案中，可能需要使用多于一种载体来递送如本文公开的载体系统的所有组分。例如，一种AAV载体可以含有编码Cas9蛋白的序列，同时第二种AAV载体可以含有一个或多个指导序列以及一个或多个拷贝的模板。
在某些实施方案中，病毒载体可以被修饰，以靶向特定的组织或细胞类型。例如，可以改变病毒表面蛋白，以减少或消除结合至其天然细胞表面受体的病毒蛋白。在一些实施方案中，载体可以被修饰，用于肝脏特异性递送。表面蛋白也可以工程化，以与所需的细胞类型特异性受体相互作用。病毒载体可以具有改变的宿主向性，包括有限的或重定向的向性。在一些实施方案中，病毒载体可以工程化，以表达或展示第一结合部分。第一结合部分可以与病毒表面蛋白或糖蛋白融合、与病毒缀合、与病毒体化学交联、与病毒包膜结合，或通过任何其他合适的方法与病毒载体连接。第一结合部分能够结合至第二结合部分，其可以用于将病毒引导至所需的细胞类型。在一些实施方案中，第一结合部分是抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性抗生物素蛋白、captavidin或另一种生物素结合部分，并且第二结合部分是生物素或其类似物。然后可以将生物素化的靶向剂结合至病毒载体上的抗生物素蛋白，并用于将病毒引导至所需的细胞类型。例如，T4载体可以工程化，以在其表面蛋白中的一种或多种上展示生物素结合部分。然后可以通过结合引导至所选细胞的生物素化抗体或配体来改变这种T4载体的细胞特异性。在可替代的实施方案中，第一和第二结合部分是半抗原和抗-半抗原结合蛋白；地高辛配基和抗地高辛配基结合蛋白；荧光素和抗荧光素结合蛋白；或为结合配偶体的任何其他合适的第一和第二结合部分。
在一些实施方案中，载体可以能够驱动细胞中一种或多种编码序列的表达。在一些实施方案中，细胞可以是原核细胞，例如，细菌细胞。在一些实施方案中，细胞可以是真核细胞，例如，酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是啮齿动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可以是人类细胞。在不同类型的细胞中驱动表达的合适的启动子是本领域已知的。在一些实施方案中，启动子可以是野生型的。在其他实施方案中，启动子可以被修饰，用于更有效或高效地表达。在其他实施方案中，启动子可以是截短的但保留其功能。例如，启动子可以具有适合于将载体正确包装至病毒中的正常大小或减小的大小。
在一些实施方案中，载体可以包含编码本文所述的核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体系统可以包含一个拷贝的编码核酸酶的核苷酸序列。在其他实施方案中，载体系统可以包含多于一个拷贝的编码核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列可以可操作地连接至至少一个转录或翻译控制序列。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列可以可操作地连接至至少一个启动子。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列可以可操作地连接至至少一个转录或翻译控制序列。
在一些实施方案中，启动子可以是组成型、诱导型或组织特异性的。在一些实施方案中，启动子可以是组成型启动子。非限制性示例性组成型启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期(MLP)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延长因子-α(EF1α)启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能性片段或前述中任一种的组合。在一些实施方案中，启动子可以是CMV启动子。在一些实施方案中，启动子可以是截短的CMV启动子。在其他实施方案中，启动子可以是EF1α启动子。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。非限制性示例性诱导型启动子包括由热休克、光、化学品、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的那些。在一些实施方案中，诱导型启动子可以是具有低基础(非诱导)表达水平的启动子，例如，启动子(Clontech)。在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子仅或主要在肝脏组织中表达。非限制性示例性组织特异性启动子包括B29启动子、CD14启动子、CD43启动子、CD45启动子、CD68启动子、结蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、内皮糖蛋白启动子、纤连蛋白启动子、Flt-1启动子、GFAP启动子、GPIIb启动子、ICAM-2启动子、INF-β启动子、Mb启动子、Nphs1启动子、OG-2启动子、SP-B启动子、SYN1启动子以及WASP启动子。
在一些实施方案中，载体可以编码Cas蛋白或Cas蛋白的一部分，例如Cas9蛋白或Cpf1蛋白。载体系统可以进一步包含包括编码本文所述的指导RNA的核苷酸序列的载体。在一些实施方案中，载体系统可以包含一个拷贝的指导RNA。在其他实施方案中，载体系统可以包含多于一个拷贝的指导RNA。在具有多于一种指导RNA的实施方案中，指导RNA可以不相同，使得它们靶向不同的靶序列或具有其他不同的特性，例如Cas9 RNP复合体内的活性或稳定性。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接至至少一个转录或翻译控制序列。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接至至少一个启动子。在一些实施方案中，启动子可以由RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例包括U6、H1以及tRNA启动子。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接至小鼠或人U6启动子。在其他实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接至小鼠或人H1启动子。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接至小鼠或人tRNA启动子。在具有多于一种指导RNA的实施方案中，用于驱动表达的启动子可以相同或不同。在一些实施方案中，编码指导RNA的crRNA的核苷酸和编码指导RNA的tracrRNA的核苷酸可以在相同的载体上提供。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸和编码tracrRNA的核苷酸可以由相同的启动子驱动。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA可以转录为单一转录物。例如，可以从单一转录物加工crRNA和tracrRNA，以形成双分子指导RNA。可替代地，crRNA和tracrRNA可以转录为单分子指导RNA。在其他实施方案中，crRNA和tracrRNA可以由它们相同载体上的相应启动子驱动。在其他实施方案中，crRNA和tracrRNA可以由不同的载体编码。
在一些实施方案中，载体系统可以进一步包含包括本文所述的模板的载体。在一些实施方案中，载体系统可以包含一个拷贝的模板。在其他实施方案中，载体系统可以包含多于一个拷贝的模板。在一些实施方案中，载体系统可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝的模板。在一些实施方案中，载体系统可以包含4、5、6、7、8或更多个拷贝的模板。在一些实施方案中，载体系统可以包含5、6、7或更多个拷贝的模板。在一些实施方案中，载体系统可以包含6个拷贝的模板。多个拷贝的模板可以位于相同或不同的载体上。多个拷贝的模板也可以彼此相邻，或者被其他核苷酸序列或载体元件分离。在其他实施方案中，可以提供两个或更多个模板，使得同源重组可以发生在两个或更多个靶位点处。例如，可以提供不同的模板来修复细胞中的单个基因或细胞中的两个不同基因。在一些实施方案中，可以以独立的拷贝数提供不同的模板。
载体系统可以包含1-3个载体。在一些实施方案中，载体系统可以包含一个单一载体。在其他实施方案中，载体系统可以包含两个载体。在另外的实施方案中，载体系统可以包含三个载体。
在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列和模板可以位于相同或单独的载体上。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列和模板可以位于相同的载体上。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列和模板可以位于单独的载体上。序列可以在载体上以相同或不同的方向和任何顺序取向。
在一些实施方案中，编码Cas9蛋白的核苷酸序列和模板可以位于相同或单独的载体上。在一些实施方案中，序列中的全部可以位于相同的载体上。在一些实施方案中，两个或更多个序列可以位于相同的载体上。序列可以在载体上以相同或不同的方向和任何顺序取向。在一些实施方案中，编码Cas9蛋白的核苷酸序列和编码指导RNA的核苷酸序列可以位于相同的载体上。在一些实施方案中，编码Cas9蛋白的核苷酸序列和模板可以位于相同的载体上。在特定实施方案中，载体系统可以包含包括编码Cas9蛋白的核苷酸序列的第一载体以及包括编码模板或多个拷贝的模板的核苷酸序列的第二载体。
在一些实施方案中，模板可以由载体系统编码的核酸酶系统从其所位于的载体释放。在一些实施方案中，模板可以通过由mRNA提供的Cas9蛋白从载体释放。模板可以包含至少一个由指导RNA识别的靶序列。在一些实施方案中，模板的两侧可以是模板5’和3’端的靶序列。在表达Cas9蛋白和递送指导RNA后，指导RNA可以与模板两端的靶序列杂交，并且Cas9蛋白可以切割该靶序列，使得模板从载体释放。在另外的实施方案中，通过在模板5’和3’端由核酸酶识别靶序列，由载体系统编码的核酸酶可以从载体释放模板。模板任一端的靶序列可以取向，使得PAM序列更接近模板。在这种取向上，从载体释放之后，较少的非模板核酸保留在模板的末端。在一些实施方案中，模板侧翼的靶序列可以相同。在一些实施方案中，模板侧翼的靶序列可以与例如通过HR、HDR或非同源性末端连接掺入模板的切割位点处发现的靶序列相同。在其他实施方案中，模板侧翼的靶序列可以不同。例如，模板5’端的靶序列可以由一种指导RNA或核酸酶识别，并且模板3’端的靶序列可以由另一种指导RNA或核酸酶识别。
在一些实施方案中，编码核酸酶系统的载体可以在载体内包含至少一个靶序列，以产生自毁(或“自切割”或“自失活”)载体系统，从而控制待表达的核酸酶系统的量。在一些实施方案中，自毁载体系统导致核酸酶活性的量降低。在进一步的实施方案中，自毁载体系统导致载体核酸的量减少。在系统包含Cas9的实施方案中，其还包含识别靶序列的指导RNA。以此方式，可以暂时控制核酸酶系统的停留时间和/或活性水平，以避免与核酸酶系统过表达相关的副作用。这种副作用可以包括例如核酸酶的脱靶效应。在一些实施方案中，一个或多个靶序列可以位于载体上的任何位置处，使得在核酸酶表达后，核酸酶识别并切割含有核酸酶编码序列的载体中的靶序列。自毁载体的一个或多个靶序列可以相同。任选地，自毁载体可以包含多个靶序列。在一些实施方案中，靶序列处的切割可以减少核酸酶系统的至少一种组分(例如，Cas9)的表达。在一些实施方案中，切割可以减少核酸酶转录物的表达。例如，靶序列可以位于编码核酸酶的核苷酸序列内，使得切割导致编码区的破坏。在其他实施方案中，靶序列可以位于编码核酸酶的载体上的非编码区内。在一些实施方案中，靶序列可以位于驱动核酸酶表达的启动子内，使得切割导致启动子序列的破坏。例如，载体可以含有靶向Cas9序列的靶序列(及其相应的指导RNA)。在某些实施方案中，靶序列可以位于启动子和编码核酸酶的核苷酸序列之间，使得切割导致编码序列与其启动子分离。在某些实施方案中，包括核酸酶编码序列以外的靶序列和核酸酶编码序列内的靶序列。
在一些实施方案中，编码Cas9蛋白的载体可以包含至少一个由指导RNA识别的靶序列。在一些实施方案中，靶序列可以位于载体上的任何位置处，使得在表达Cas9蛋白和指导RNA后，指导RNA与编码Cas9蛋白的载体中的靶序列杂交，并且Cas9蛋白切割该靶序列。在一些实施方案中，靶序列处的切割可以减少Cas9蛋白转录物的表达。例如，靶序列可以位于编码Cas9蛋白的核苷酸序列内，使得切割导致编码区的破坏。在其他实施方案中，靶序列可以位于编码Cas9蛋白的载体上的非编码区内。在一些实施方案中，靶序列可以位于驱动Cas9蛋白表达的启动子内，使得切割导致启动子序列的破坏。在一些实施方案中，靶序列可以位于编码Cas9蛋白的核苷酸序列内，使得切割导致编码序列的破坏。在其他实施方案中，靶序列可以位于启动子和编码Cas9蛋白的核苷酸序列之间，使得切割导致编码序列与其启动子分离。
用于释放模板、用于载体自毁以及用于细胞中核酸酶系统靶向的靶序列可以相同或不同。例如，模板3’端的靶序列可以存在于驱动核酸酶(例如，Cas9蛋白)表达的启动子内，使得释放模板的同时导致核酸酶(例如，Cas9蛋白)表达的破坏。在一些实施方案中，模板侧翼的靶序列、用于破坏核酸酶(例如，Cas9蛋白)表达的靶序列以及细胞中靶核酸分子中的靶序列可以是由单指导RNA或核酸酶识别的相同序列。因此，在一些实施方案中，载体系统可以仅包含一种类型的靶序列，并且核酸酶系统可以仅包含一种指导RNA。在其他实施方案中，这些靶序列可以包含由不同指导RNA识别的不同序列。
在一些实施方案中，载体系统可以包含诱导型启动子，以仅在其被递送至靶细胞之后开始表达。非限制性示例性诱导型启动子包括由热休克、光、化学品、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的那些。在一些实施方案中，诱导型启动子可以是具有低基础(非诱导)表达水平的启动子，例如，启动子(Clontech)。
在另外的实施方案中，载体系统可以包含组织特异性启动子，以仅在其被递送到特定组织中后启动表达。非限制性示例性组织特异性启动子包括白蛋白启动子、α-1抗胰蛋白酶启动子、血红素结合蛋白启动子、B29启动子、CD14启动子、CD43启动子、CD45启动子、CD68启动子、结蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、内皮糖蛋白启动子、纤连蛋白启动子、Flt-1启动子、GFAP启动子、GPIIb启动子、ICAM-2启动子、INF-β启动子、Mb启动子、Nphs1启动子、OG-2启动子、SP-B启动子、SYN1启动子以及WASP启动子。在特定实施方案中，组织特异性启动子是白蛋白启动子、α-1抗胰蛋白酶启动子、乙型肝炎病毒核心启动子或血红素结合蛋白基因启动子。Kramer等人，Molecular Therapy7(3):375-385(2003)中描述了检查肝脏特异性启动子的方法，其通过引用以其整体并入本文。
在本发明的一些实施方案中，核酸酶系统的活性可以暂时通过调节核酸酶系统的表达组分的停留时间、量和/或活性来调控。例如，如本文所述，核酸酶可以与能够改变核酸酶的细胞内半衰期的蛋白质结构域融合。在涉及两个或更多个载体(例如，本文所述的组分编码在两个或更多个单独的载体上的载体系统)的某些实施方案中，核酸酶系统的活性可以暂时通过控制递送载体的时间来调控。例如，在一些实施方案中，编码核酸酶系统的载体可以在编码模板的载体之前递送核酸酶。在其他实施方案中，编码模板的载体可以在编码核酸酶系统的载体之前递送模板。在一些实施方案中，编码核酸酶系统的载体和模板同时递送。在某些实施方案中，同时递送的载体暂时递送例如核酸酶、模板和/或指导RNA组分。在进一步的实施方案中，从载体上的编码序列转录的RNA(例如，核酸酶转录物)可以进一步包含至少一个元件，该元件能够改变RNA的细胞内半衰期和/或调节翻译控制。在一些实施方案中，RNA的半衰期可以增加。在一些实施方案中，RNA的半衰期可以降低。在一些实施方案中，元件可以能够提高RNA的稳定性。在一些实施方案中，元件可以能够降低RNA的稳定性。在一些实施方案中，元件可以在RNA的3’UTR内。在一些实施方案中，元件可以包括多腺苷酸化信号(PA)。在一些实施方案中，元件可以包括帽，例如，上游mRNA末端。在一些实施方案中，可以将PA添加至RNA的3’UTR。在一些实施方案中，RNA可以不包含PA，使得它在转录之后在细胞中经历更快降解。在一些实施方案中，元件可以包括至少一个富含AU的元件(ARE)。ARE可以通过ARE结合蛋白(ARE-BP)以依赖于组织类型、细胞类型、时间、细胞定位和环境的方式结合。在一些实施方案中，去稳定元件可以促进RNA衰变、影响RNA稳定性或激活翻译。在一些实施方案中，ARE的长度可以包含50至150个核苷酸。在一些实施方案中，ARE可以包含至少一个拷贝的序列AUUUA。在一些实施方案中，可以将至少一个ARE添加至RNA的3’UTR。在一些实施方案中，元件可以是土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)，其产生三级结构以增强转录物的表达。在进一步的实施方案中，如例如Zufferey等人，J Virol,73(4):2886-92(1999)和Flajolet等人，J Virol,72(7):6175-80(1998)中所述的，元件是修饰的和/或截短的WPRE序列，其能够增强转录物的表达。在一些实施方案中，可以将WPRE或等效物添加至RNA的3’UTR。在一些实施方案中，元件可以选自富集于快速或缓慢衰变转录物的其他RNA序列基序。
本发明的实施方案还包括用本文所述的载体系统治疗患者。在一些实施方案中，该方法可以包括向患者施用本文所述的载体系统。该方法可以作为单一疗法使用，或者与本领域可用的其他疗法组合使用。在一些实施方案中，患者可以在疾病相关基因中具有突变(例如，插入、缺失、取代、染色体易位)。在一些实施方案中，施用载体系统可以导致突变，包括患者疾病相关基因的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代。某些实施方案可以包括修复患者疾病相关基因中的突变的方法。在一些实施方案中，突变可以导致由疾病相关基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一些实施方案中，突变可以导致由疾病相关基因表达的RNA中的一个或多个核苷酸改变。在一些实施方案中，突变可以改变疾病相关基因的表达水平。在一些实施方案中，突变可以导致基因表达的增加或减少。在一些实施方案中，突变可以导致患者的基因敲低。在一些实施方案中，施用载体系统可以导致患者疾病相关基因中突变的纠正。在一些实施方案中，施用载体系统可以导致患者的基因敲除。在一些实施方案中，施用载体系统可以导致疾病相关基因的外显子序列、内含子序列、转录控制序列、翻译控制序列或非编码序列的置换。
在一些实施方案中，施用载体系统可以导致模板的外源性序列整合至患者的基因组DNA中。在一些实施方案中，外源性序列可以包含可操作地连接至外源性启动子序列的蛋白质或RNA编码序列，使得在外源性序列整合至患者基因组DNA中后，患者能够表达由整合的序列编码的蛋白质或RNA。外源性序列可以提供补充的或置换的蛋白质编码或非编码序列。例如，施用载体系统可以导致患者疾病相关基因的突变部分的置换。在一些实施方案中，突变部分可以包括疾病相关基因的外显子。在其他实施方案中，外源性序列的整合可以导致整合序列由存在于患者基因组DNA上的内源性启动子序列表达。例如，施用载体系统可以导致提供疾病相关基因的功能基因产物，以纠正患者的突变。在一些实施方案中，施用载体系统可以导致编码蛋白质或蛋白质的一部分的cDNA序列的整合。在其他实施方案中，施用载体系统可以导致外显子序列、内含子序列、转录控制序列、翻译控制序列或非编码序列整合至患者的基因组DNA中。在一些实施方案中，施用载体系统可以导致患者的基因敲入。
施用和使用方法
本文提供了用于编辑细胞中的靶核酸的方法和组合物。本文进一步提供了用于改变对象细胞中靶基因的功能和活性的药物组合物和方法。本文所述的基因组编辑组合物可以以治疗有效量施用至有需要的对象，以治疗与高循环胆固醇水平和/或冠状动脉疾病(例如高胆固醇血症)、升高的总胆固醇水平、升高的低密度脂蛋白(LDL)水平、升高的LDL-胆固醇水平、降低的高密度脂蛋白水平、肝脏脂肪变性、冠心病、局部缺血、中风、周围血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、升高的高血压、动脉粥样硬化、肥胖症、阿尔茨海默病、神经变性及其组合相关的病况，其可以以多种方式施用至对象，包括肠胃外、静脉内、皮内、肌内、结肠、直肠或腹膜内。在一些实施方案中，药物组合物可以与药学上可接受的盐通过对象的腹膜内注射、肌内注射、皮下注射或静脉内注射共同施用。在一些实施方案中，药物组合物可以直接注射至特定组织，例如肝脏组织。在一些实施方案中，药物组合物可以经肠胃外、静脉内、肌内或口服施用。口服制剂可以进一步包衣或处理，以防止或减少在胃中溶解。可以使用本领域已知的任何合适的方法向对象施用本发明的组合物。用于本发明的合适的制剂和递送方法通常是本领域公知的。例如，本发明的组合物可以与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起配制为药物组合物。组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，包括pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本文所述的药物制剂可以通过多种施用途径以多种方式施用至对象，包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌内、髓内注射、鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴管内、鼻内注射)、鼻内、颊、局部或经皮施用途径。本文所述的药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固体溶液、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉末、速释制剂、控释制剂、速溶(fast melt)制剂、片剂、胶囊、丸剂、迟释制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及速释和控释混合的制剂。
在一些实施方案中，药物制剂为片剂形式。在其他实施方案中，含有本文所述的组合物或抑制剂的药物制剂为胶囊形式。在一方面，用于口服施用的液体制剂剂型为水性悬浮液或溶液形式，其选自包括但不限于水性口服分散体、乳剂、溶液、酏剂、凝胶和糖浆。
对于吸入施用，本文所述的组合物或抑制剂可以配制用作气溶胶、雾剂或粉末。对于颊或舌下施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂、锭剂或凝胶形式。在一些实施方案中，本文所述的组合物或抑制剂可以制备为经皮剂型。在一些实施方案中，本文所述的组合物或抑制剂可以配制为适合于肌内、皮下或静脉内注射的药物组合物。在一些实施方案中，本文所述的组合物或抑制剂可以局部施用，并且可以配制为多种可局部施用的组合物，例如溶液、悬浮液、洗剂、凝胶、糊剂、含药棒、香膏、乳膏或软膏。在一些实施方案中，本文所述的组合物或抑制剂可以配制为直肠组合物，例如灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气溶胶、栓剂、胶冻栓剂或保留灌肠剂。
在一方面，本文公开了一种治疗哺乳动物的疾病或病况的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。在一方面，本文公开了用于治疗对象的疾病或病况的方法，包括提高对免疫原的免疫应答。在一个实施方案中，疾病或病况可通过施用有效负载来治疗。在一些实施方案中，疾病或病况的特征在于缺少或异常的蛋白质或多肽活性。例如，包含编码缺少或异常多肽的mRNA的LNP组合物可以施用或递送至细胞。随后mRNA的翻译可以产生多肽，从而减少或消除由多肽缺乏或异常活性引起的问题。包括在LNP组合物中的有效负载还可以能够改变给定物种的转录速率，从而影响基因表达。
特征在于功能失调或异常蛋白质或多肽活性的疾病和/或病况可以包括但不限于罕见疾病、感染性疾病(作为疫苗和治疗剂)、癌症和增殖性疾病、遗传疾病(例如，囊性纤维化)、自身免疫性疾病、糖尿病、神经变性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢疾病。多种疾病和/或病况的特征可以在于缺少(或显著减弱使得不发生蛋白质的正确功能)蛋白质活性。这种蛋白质可以不存在，或者它们可以基本上无功能。功能失调蛋白的具体实例是囊性纤维化跨膜传导调控因子(CFTR)基因的错义突变变体。在一些实施方案中，本发明提供了一种通过施用包含RNA有效负载的LNP组合物或药物组合物来治疗对象的这种疾病和/或病况的方法，其中RNA可以是编码拮抗或以其他方式克服存在于对象细胞中的异常蛋白质活性的多肽的mRNA。
剂量
如本领域技术人员认识到的，用于施用的适当剂量或有效量根据所治疗的特定病况、病况的严重程度、个体对象参数(包括年龄、身体状况、大小、性别和体重)、治疗的持续时间、并行疗法的性质(如果有的话)、施用的具体途径以及健康护理人员的知识和专业内的类似因素而变化。剂量确定中涉及的因素是本领域普通技术人员已知的，除常规试验以外无需另外的实验。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即，根据合理的医学判断的最高安全剂量。经验上的考虑(例如半衰期)通常有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的治疗性药剂(例如包含来自人源化抗体或完全人抗体的区域的多肽)可以用于延长多肽的半衰期，并且防止多肽受到宿主免疫系统的攻击。
施用频率可以在治疗过程中确定和调节，并且通常但不一定基于疾病的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，多肽或多核苷酸的连续缓释制剂可能是合适的。用于实现缓释的各种制剂和装置是本领域已知的。在一些实施方案中，剂量是每天、每两天、每三天、每四天、每五天或每六天。在一些实施方案中，给药频率为每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或每月、每2个月，或每3个月或更长一次。这种治疗的进展容易通过常规技术和试验来监测。
给药方案可以随时间改变。在一些实施方案中，对于正常体重的成年对象，可以施用的剂量范围为约0.01至1000mg/kg。在一些实施方案中，剂量为1至200mg。在一些实施方案中，剂量的范围可以为约0.01至0.05mg/kg、约0.01至0.1mg/kg、约0.01至1mg/kg、约0.01至10mg/kg、约0.01至100mg/kg、0.01至500mg/kg、约0.1至1mg/kg、约0.1至5mg/kg、约0.1至10mg/kg、约0.1至100mg/kg、约0.1至500mg/kg、约0.1至1000mg/kg、约1至5mg/kg、约1至10mg/kg、约1至100mg/kg、约1至500mg/kg、约1至1000mg/kg、约10至100mg/kg、约10至500mg/kg、约10至1000mg/kg，或约100至1000mg/kg。特定给药方案(即，剂量、时间和重复)将取决于特定对象和该对象的病史，以及多肽或多核苷酸的特性(例如多肽或多核苷酸的半衰期以及本领域熟知的其他考虑)。
对于本领域技术人员显而易见的是，如本文所述的治疗性药剂的适当剂量将取决于所用的具体药剂(或其组合物)、制剂和施用途径、疾病的类型和严重程度、多肽或多核苷酸是否出于预防性或治疗性目的施用、先前的疗法、对象的临床病史和对拮抗剂的应答，以及主治医生的判断。通常，临床医生将施用多肽，直到达到实现所需结果的剂量。
一种或多种治疗性组合物(例如多肽、多核苷酸或RNP)的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及技术从业者已知的其他因素。多肽的施用可以在预选的时间段内基本上是连续的，或者可以是以一系列间隔的剂量，例如，在疾病发展之前、期间或之后。
生物样品
样品(例如，生物样品)可以取自对象。生物样品可以包含多个生物样品。多个生物样品可以含有两个或更多个生物样品；例如，约2-1000、2-500、2-250、2-100、2-75、2-50、2-25、2-10、10-1000、10-500、10-250、10-100、10-75、10-50、10-25、25-1000、25-500、25-250、25-100、25-75、25-50、50-1000、50-500、50-250、50-100、50-75、60-70、100-1000、100-500、100-250、250-1000、250-500、500-1000、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多个生物样品。生物样品可以从多个对象中获得，得到多组多个样品。生物样品可以从约2至约1000个对象或更多中获得；例如，约2-1000、2-500、2-250、2-100、2-50、2-25、2-20、2-10、10-1000、10-500、10-250、10-100、10-50、10-25、10-20、15-20、25-1000、25-500、25-250、25-100、25-50、50-1000、50-500、50-250、50-100、100-1000、100-500、100-250、250-1000、250-500、500-1000，或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、68、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000或更多个对象。
生物样品可以从人类对象中获得。生物样品可以从不同年龄的人类对象中获得。人类对象可以是产前的(例如，胎儿)、儿童(例如，新生儿、婴儿、学步儿童、青春期前儿童)、青少年、青春期青少年或成人(例如，早期成人、中年成人、老年人)。人类对象可以为约0个月至约120岁或更大。人类对象可以为约0至约12个月大；例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月大。人类对象可以为约0至12岁；例如，约0至30天大；约1个月至12个月大；约1岁至3岁；约4岁至5岁；约4岁至12岁；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12岁。人类对象可以为约13岁至19岁；例如，约13、14、15、16、17、18或19岁。人类对象可以为约20岁至39岁；例如，约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39岁。人类对象可以为约40岁至59岁；例如，约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59岁。人类对象可以大于59岁；例如，约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120岁。人类对象可以包括活的对象或死的对象。人类对象可以包括男性对象和/或女性对象。
生物样品可以从允许确定基因表达水平的任何合适来源中获得，例如从细胞、组织、体液或分泌物，或从其衍生的基因表达产物(例如，核酸，例如DNA或RNA；多肽，例如蛋白质或蛋白质片段)中获得。生物样品的性质可以取决于对象的性质。如果生物样品来自单细胞生物体或具有未分化组织的多细胞生物体的对象，则生物样品可以包含细胞，例如细胞培养物的样品、生物体的切除物或整个生物体。如果生物样品来自多细胞生物体，则生物样品可以是组织样品、流体样品或分泌物。
生物样品可以从不同的组织中获得。术语组织是指包括具有共同发育起源并具有相似或相同功能的细胞集合。术语组织还指包括器官，其可以是具有不同起源的细胞的功能性分组和组织。生物样品可以从任何组织中获得。
生物样品可以从一个或多个人或非人动物的不同组织样品中获得。合适的组织可以包括结缔组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织或其一部分或组合。合适的组织还可以包括肺、心脏、血管(例如，动脉、静脉、毛细血管)、唾液腺、食管、胃、肝脏、胆囊、胰腺、结肠、直肠、肛门、下丘脑、垂体、松果腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、肾、输尿管、膀胱、尿道、淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道组织、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺、阴茎组织、咽、喉、气管、支气管、隔膜、骨髓、毛囊或其组合的全部或一部分。来自人或非人动物的生物样品还可以包括体液、分泌物或排泄物；例如，生物样品可以是水状液、玻璃状液、胆汁、血液、血清、母乳、脑脊液、内淋巴、外淋巴、女性精液、羊水、胃液、月经、粘液、腹膜液、胸膜液、唾液、皮脂、精液、汗液、泪液、阴道分泌物、呕吐物、尿、粪便或其组合的样品。生物样品可以来自健康组织、患病组织、疑似患病的组织或其组合。
在一些实施方案中，生物样品是流体样品，例如血液、血清、痰、尿、精液或其他生物流体的样品。在某些实施方案中，样品是血液样品。在一些实施方案中，生物样品是组织样品，例如用于确定组织中疾病存在与否的组织样品。在某些实施方案中，样品是甲状腺组织的样品。
生物样品可以从处于疾病进展的不同阶段或不同病况的对象中获得。疾病进展的不同阶段或不同病况可以包括健康、在原发性症状发作时、在继发性症状发作时、在三级症状发作时、在原发性症状过程期间、在继发性症状过程期间、在三级症状过程期间、在原发性症状结束时、在继发性症状结束时、在三级症状结束时、在原发性症状结束之后、在继发性症状结束之后、在三级症状结束之后或其组合。疾病进展的不同阶段可以是在被诊断或疑似患有疾病之后的一段时间；例如，在被诊断或疑似患有疾病之后的至少约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50年。疾病进展的不同阶段或不同病况可以包括在行动或状态之前、期间或之后；例如，用药物治疗、用手术治疗、用程序治疗、执行标准护理程序、休息、睡眠、进食、禁食、行走、跑步、执行认知任务、性活动、思考、跳跃、排尿、放松、固定不动、情感创伤、休克等。
本发明的方法提供了对来自对象或一组对象的生物样品的分析。对象可以是例如任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物、狗、猫、猪、鱼等。如本文所述，本方法和组合物可以应用于来自人的生物样品。
生物样品可以通过本领域已知的方法获得，例如本文提供的活检方法、拭取、刮取、静脉切开术或任何其他合适的方法。可以使用本发明的试剂盒的组分获得、储存或运输生物样品。在一些情况下，可以获得多个生物样品，例如多个甲状腺样品，用于根据本发明的方法分析、表征或诊断。在一些情况下，可以获得多个生物样品，例如来自一种组织类型(例如，甲状腺)的一个或多个样品以及来自另一种组织类型(例如，颊)的一个或多个样品，用于通过本发明的方法诊断或表征。在一些情况下，可以在相同或不同时间获得多个样品，例如来自一种组织类型(例如，甲状腺)的一个或多个样品以及来自另一种组织(例如，颊)的一个或多个样品。在一些情况下，在不同时间获得的样品通过不同方法储存和/或分析。例如，可以获得样品并通过细胞学分析(例如，使用常规染色)进行分析。在一些情况下，可以基于细胞学分析的结果从对象中获得其他样品。疾病或病况(例如冠状动脉疾病)的诊断可以包括由医生、护士或其他医学专家检查对象。检查可以是常规检查的一部分，或者检查可以是由于具体异议，包括但不限于以下中的一种：疼痛、疾病、疾病的预期、可疑肿块或团块的存在、疾病或病况。对象可能知道或可能不知道疾病或病况。医学专家可以获得生物样品，用于测试。在一些情况下，医学专家可以将对象转至测试中心或实验室，用于提交生物样品。本文提供的获得方法包括活检方法，包括细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检、切开活检、切除活检、钻取活检、刮取活检或皮肤活检。在一些情况下，本文提供的方法和组合物应用于仅来自通过FNA获得的生物样品的数据。在一些情况下，本文提供的方法和组合物应用于仅来自通过FNA或手术活检获得的生物样品的数据。在一些情况下，本文提供的方法和组合物应用于仅来自通过手术活检获得的生物样品的数据。生物样品可以通过非侵入性方法获得，这种方法包括但不限于：皮肤或子宫颈的刮取、脸颊的拭取、唾液收集、尿收集、粪便收集、月经、泪液或精液的收集。生物样品可以通过侵入性程序获得，这种程序包括但不限于：活检、肺泡或肺灌洗、针抽吸或静脉切开术。活检方法可以进一步包括切开活检、切除活检、钻取活检、刮取活检或皮肤活检。针抽吸方法可以进一步包括细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或粗芯活检。可以通过本文的方法获得多个生物样品，以确保足够量的生物材料。用于获得生物样品的通用方法也是本领域已知的，并且进一步在例如Ramzy,IbrahimClinical Cytopathology and Aspiration Biopsy 2001中描述，其通过引用以其整体并入本文。生物样品可以是甲状腺结节或疑似甲状腺肿瘤的细针抽吸物。细针抽吸取样程序可以通过使用超声、X射线或其他成像装置来指导。
在一些情况下，可以将对象转至专家，例如肿瘤学家、外科医生或内分泌学家，用于进一步诊断。专家同样可以获得生物样品，用于测试，或者将个体转至测试中心或实验室，用于提交生物样品。在任何情况下，生物样品可以由医生、护士或其他医学专家(例如医学技术人员、内分泌学家、细胞学家、抽血者、放射科医生或肺脏学家)获得。医学专家可以指示对样品执行的适当测试或试验，或者本发明的分子分析业务可以咨询最适当地指示哪些试验或测试。分子分析业务可以为个人或其医疗或保险提供者开具账单，用于咨询工作、用于样品获取和/或储存、用于材料或用于提供的所有产品和服务。
医疗专家无需参与初始诊断或样品获取。个体可以可替代地通过使用非计数试剂盒获得样品。试剂盒可以含有如本文所述的用于获得所述样品的手段、用于储存样品以供检查的手段，以及试剂盒的正确使用说明书。在一些情况下，分子分析服务包括在购买试剂盒的价格中。在其他情况下，分子分析服务被单独开具账单。
适用于分子分析业务的生物样品可以是含有待测试个体的组织、细胞、核酸、基因、基因片段、表达产物、基因表达产物和/或基因表达产物片段的任何材料。提供了用于确定样品适合性和/或充分性的方法。生物样品可以包括但不限于组织、细胞和/或来自个体细胞或衍生自个体细胞的生物材料。样品可以是细胞或组织的异质或同质群体。可以使用本领域已知的任何方法获得生物样品，该方法可以提供适合于本文所述的分析方法的样品。
使用试剂盒可以帮助获得生物样品。可以提供包含用于获得、储存和/或运输生物样品的材料的试剂盒。试剂盒可以含有例如用于收集生物样品的材料和/或仪器(例如，无菌拭子、无菌棉、消毒剂、针、注射器、手术刀、麻醉拭子、刀、刮刀、液氮等)。试剂盒可以含有例如用于储存和/或保存生物样品的材料和/或仪器，例如，容器；用于温度控制的材料，例如冰、冰袋、冷袋、干冰、液氮；化学防腐剂或缓冲液，例如甲醛、福尔马林、多聚甲醛、戊二醛、醇(例如乙醇或甲醇)、丙酮、乙酸、HOPE固定剂(Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护效应)、肝素、盐水、磷酸盐缓冲盐水、TAPS、N,N-二羟乙基甘氨酸、Tris、三(羟甲基)甲基甘氨酸、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、cadodylate、SSC、MES、磷酸盐缓冲液；蛋白酶抑制剂，例如抑肽酶、苯丁抑制素、钙蛋白酶抑制素I和II、胰凝乳蛋白酶抑制素、E-64、亮抑酶肽、α-2-巨球蛋白、pefabloc SC、胃酶抑素、苯甲磺酰氟、胰蛋白酶抑制剂；DNA酶抑制剂，例如2-巯基乙醇、2-硝基-5-三氰基苯甲酸、钙、EGTA、EDTA、十二烷基硫酸钠、碘乙酸酯等；RNA酶抑制剂，例如核糖核酸酶抑制剂蛋白；双蒸水；经DEPC(二乙基丙碳酸酯)处理的水等)。试剂盒可以含有使用说明书。试剂盒可以提供为或含有合适的容器，用于运输。运输容器可以是保温容器。运输容器可以自寻址到代收者(例如，实验室、医学中心、遗传测试公司等)。试剂盒可以提供给对象以供家庭使用或由医学专家使用。可替代地，试剂盒可以直接提供给医学专家。
一个或多个生物样品可以从给定对象中获得。在一些情况下，约1至约50个的生物样品从给定对象中获得；例如，约1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-7、1-5、5-50、5-40、5-30、5-25、5-15、5-10、10-50、10-40、10-25、10-20、25-50、25-40，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个生物样品从给定对象中获得。来自给定对象的多个生物样品可以从相同来源(例如，相同组织)中获得，例如，多个血液样品或多个组织样品，或者从多个来源(例如，多个组织)中获得。来自给定对象的多个生物样品可以同时或在不同时间获得。来自给定对象的多个生物样品可以在相同条件或不同条件下获得。来自给定对象的多个生物样品可以在对象的相同疾病进展或不同疾病进展时获得。如果从来自特定对象的相同来源(例如，相同组织)收集多个生物样品，则可以将样品组合成单个样品。以此方式组合样品可以确保获得足够的材料，用于测试和/或分析。
本文提供了用于靶向递送治疗性药剂(例如指导RNA或指导RNA-Cas复合体)的方法和组合物。本发明人惊奇地发现，与指导RNA缀合的GalNAc和GalNAc衍生物靶向部分的不同结构展示出高组织特异性递送效率，并维持结合和修饰靶DNA的能力。有利地，与GalNAc靶向部分共价缀合的修饰的指导RNA，以及通过核酸碱基配对和杂交连接至GalNAc靶向部分的指导RNA显示出稳定性和有效特异性递送至肝脏。本发明人首次表明，通过共价键或通过杂交使gRNA与不同GalNAc部分的缀合有效地将gRNA或gRNA-Cas9复合体引导至肝细胞，并且在体内维持sgRNA完整性、二级结构稳定性以及CRISPR酶活性和增加的CRISPR编辑功效。
实施例
提供以下实施例以更好地说明本发明，并且这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。就提及的具体材料而言，其仅出于说明的目的，并不旨在限制本发明。本领域技术人员可以在不行使发明能力和不脱离本发明范围的情况下开发等效手段或反应物。
实施例1.用于缀合至核酸/寡核苷酸的N-乙酰半乳糖胺衍生单体的合成
方案1.
如报道的(WO2018/136620A2)，由激活的糖1开始制备化合物6。化合物5购自商业来源。
方案2a
a由相应的手性纯或外消旋原料开始制备光学纯R、S和外消旋形式的所有中间体和靶化合物。
化合物10购自商业来源或如文献(Bull.Chem.Soc.Japan(1998),71(3),717-721；J.Med.Chem.(2010),53(1),432-440,US20120114696 A1)中报道的制备。胺保护的R、S和外消旋赖氨酸16购自商业来源。由化合物10开始制备光学纯和外消旋形式的完全保护的间隔区21。根据报道的程序(WO2018/136620A2)制备糖保护的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物25。由化合物18和市售的N-Boc氨基酸22制备中间体化合物23。由化合物23和糖中间体25制备完全保护的糖中间体化合物26。
方案3a
a由相应的手性纯或外消旋原料开始制备光学纯R、S和外消旋形式的所有中间体和靶化合物。
所需内酯27购自市售来源。如报道的(WO2018/136620A2)，由D-半乳糖胺制备化合物32。由化合物10和所需内酯27制备胺中间体31。然后在肽偶联条件下使化合物31与酸32反应，得到化合物33，然后使其在Pd-C上进行氢化，得到胺中间体34。然后将胺与酸25偶联，得到化合物35。用HF-py处理化合物35，得到化合物36。化合物36亚磷酸酯化，得到亚磷酰胺37(WO2018/136620A2)。在DMAP存在下，用琥珀酸酐处理化合物36，随后在肽偶联条件下，用胺官能化的固体载体处理半琥珀酸酯，得到固体载体38。通过用乙酸酐处理将载体上未反应的胺加帽。
方案4.
用硼氢化锂处理购自商业来源的化合物39，得到三醇40。在迈克尔加成(Michaeladdition)条件下，用丙烯酸甲酯处理化合物40，得到化合物41。三酯41水解，得到三酸42，其然后在肽偶联条件下与胺4偶联，得到化合物43。
在迈克尔加成条件下，用丙烯腈处理化合物40，得到化合物44，随后在氢气下用雷尼镍(Raney-Ni)处理，得到胺45。在肽偶联条件下，用酸25处理胺45，得到化合物46。
方案5
由化合物41和30制备化合物49。用酸处理化合物41，随后与所需酸酐19反应，得到酸46。在肽偶联条件下，用1mol当量的胺30处理1mol当量的酸46，得到化合物47。在碱的存在下，用Cbz-Cl处理胺47，随后用LiOH处理，得到化合物49。在肽偶联条件下，化合物49与过量胺4反应，产生化合物50。在Pd-C上用氢处理化合物50，得到化合物51，然后在肽偶联条件下将其与酸32偶联，得到化合物52。用Py-HF处理化合物52，得到化合物53。53亚磷酸酯化，得到亚磷酰胺54。在碱的存在下，用琥珀酸酐处理53，随后在肽偶联条件下，用胺官能化的固体载体处理，产生固体载体55。在碱的存在下，通过用乙酸酐处理将载体55上未反应的胺加帽。
方案6a
a由相应的手性纯或外消旋原料开始制备光学纯R、S和外消旋形式的所有中间体和靶化合物。
由市售的羟基酸的甲酯56制备酸62。将化合物56的羟基基团保护为DMTr，然后水解酯，得到酸59。在肽偶联条件下，在碱的存在下，使化合物59与甲硫氨酸甲酯的盐酸盐反应，然后在水的存在下与LiOH反应，得到酸60。酸60依次与(1)胺盐酸盐61在肽偶联条件下反应，形成酰胺键；(2)与TBDMS-Cl在咪唑的存在下以及(3)与LiOH在水的存在下反应，得到化合物62。由化合物43制备胺盐63。然后在肽偶联条件下，使化合物63与化合物62反应，产生化合物64。用Py-HF处理64，得到化合物65。65亚磷酸酯化，产生亚磷酰胺66。在DMAP的存在下，用琥珀酸酐连续处理65，然后在肽偶联条件下，用胺官能化的固体载体处理，产生固体载体67。然后在碱的存在下，通过与乙酸酐反应淬灭固体载体上未反应的胺。
如方案6的第一部分所示和如上所述，由化合物46和62制备亚磷酰胺68和固体载体69。
方案7a
a由相应的手性纯或外消旋原料开始制备光学纯R、S和外消旋形式的所有中间体和靶化合物。
如方案7所示，由所需原料23制备亚磷酰胺73和固体载体74。用酸处理23，得到化合物70。然后在肽偶联条件下，使化合物70与化合物60反应，得到化合物71。在大气压下，化合物71在Pd-C上氢化，并在肽偶联条件下与化合物25反应，得到化合物72。化合物72亚磷酸酯化，得到亚磷酰胺73。在碱的存在下，用琥珀酸酐处理化合物72，随后在肽偶联条件下，用胺官能化的固体载体处理，得到固体载体74。通过在碱的存在下与乙酸酐反应淬灭所得的载体上未反应的胺，产生准备用于核酸/寡核苷酸合成的固体载体。
实施例2.GalNAc缀合物合成。
使用方案1-7和出版物Brown等人，NUCLEIC ACID THERAPEUTICS(DOI:10.1089/nat.2019.0782)中所述的固体载体和亚磷酰胺并且如出版物：Rajeev等人，ChemBioChem2015,16,903-908、Nair等人，J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958-16961和WO2018/136620A2中所述的合成所需核酸缀合物。
实施例3.mRNA体外靶向递送至肝细胞。
用与GalNAc配体缀合的短互补性寡核苷酸(表2)退火RNA聚(A)尾。将由此形成的单一化学实体与表达ASGPR的啮齿动物、非人灵长类动物和人原代肝细胞和/或肝癌细胞系一起孵育，以使ASGPR介导的摄取进入细胞，从而引发相应蛋白质的表达。测定目的蛋白的表达，以检查GalNAc-ASGPR介导的mRNA递送的效率。GFP和GFP-Luc mRNA的表达最初用作探针。
实施例4.mRNA体内靶向递送至啮齿动物和非人灵长类动物的肝细胞。
用与GalNAc配体缀合的短互补性寡核苷酸(表2)退火RNA聚(A)尾。将由此形成的单一化学实体皮下或静脉内施用，以使ASGPR介导的RNA有效负载摄取至肝细胞中，从而在肝脏中引发蛋白质表达。在施用之后，每隔一定时间测定经处理的动物肝脏中蛋白质的表达。
实施例5.指导RNA体外靶向递送至表达ASGPR的细胞系。
将与GalNAc缀合的指导RNA(gRNA)(表1)与表达ASGPR的啮齿动物、非人灵长类动物和人原代肝细胞和/或肝癌细胞系一起孵育，以使ASGPR介导的摄取进入细胞。通过使用lipofectamine或等效转染剂的简单转染或通过使用AAV或AV载体以表达该蛋白来将编码基因编辑蛋白的mRNA递送至这些细胞系。
用与GalNAc缀合的互补性短寡核苷酸退火gRNA和修饰的gRNA，与表达ASGPR的啮齿动物、非人灵长类动物和人原代肝细胞以及HepG2细胞系一起孵育，以使ASGPR介导的摄取进入细胞。在与gRNA一起孵育后12至36h之后，测定肝细胞和肝癌细胞中的基因编辑。
实施例6.肝细胞中的基因编辑。
使用AAV或AV载体将RNA递送至表达ASGPR的细胞系，并且使其表达核糖核蛋白(RNP)。然后将细胞系与来自表2或3的或由表2和3构成的GalNAc缀合的指导RNA一起孵育。将GalNAc缀合的指导RNA ASGPR介导的递送至表达受体的细胞中。在摄取进入细胞之后，指导RNA与表达的RNP形成复合体，以引发基因编辑。
在施用编码RNA的AAV或AV载体之后的一定间隔(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)之后，或在超过14天的稍后时间点，将来自表1的用GalNAc修饰的指导RNA与细胞系一起孵育。在施用基因编辑器RNA AAV和/或AV载体后，以不同间隔评估不同浓度的gRNA-GalNAc。在与gRNA一起孵育后12至36h之后，测定肝细胞和肝癌细胞中的基因编辑。
实施例7.通过LNP介导的递送施用编码目的RNP的RNA，以在表达ASGPR的细胞系中体外表达蛋白质。
在施用mRNA之后的一定间隔(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或36h)之后，将来自表1的用GalNAc修饰的指导RNA与细胞系一起孵育。在相同实验条件下，还评估mRNA与指导RNA的不同重量和摩尔比。mRNA与指导RNA的比最高为100∶1，最低为1∶100。还评估了100∶1和1∶100之间的比。在与gRNA一起孵育后24至96h之后，测定经处理的动物肝脏中的基因编辑，并将结果与相同时间点未经处理的对照进行比较。
实施例8.啮齿动物和非人灵长类动物体内肝脏中的基因编辑。
使用AAV或AV载体将RNA递送至啮齿动物和非人灵长类动物的肝脏，并且使其表达核糖核蛋白(RNP)。皮下(SC)或静脉内(IV)施用来自表2或3或由表2和3构成的GalNAc缀合的指导RNA，使GalNAc缀合的指导RNA ASGPR介导的递送至肝细胞中。在摄取进入肝细胞之后，指导RNA与表达的RNP形成复合体，以形成RNP-指导RNA复合体，从而产生基因编辑。
在施用编码RNA的AAV或AV载体之后的一定间隔(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)之后，或在超过14天的稍后时间点，皮下或静脉内施用来自表1的用GalNAc修饰的指导RNA。在施用基因编辑器RNA AAV和/或AV载体后，以不同间隔评估不同浓度的gRNA-GalNAc。在与gRNA一起孵育后24至96h之后，测定经处理的动物肝脏中的基因编辑，并将结果与相同时间点未经处理的对照进行比较。
实施例9.体内施用
在30min至120min的时间段内，通过LNP介导的递送至啮齿动物和非人灵长类动物、通过IV输注施用编码目的RNP的RNA。基于LNP制剂的总剂量和/或总给药体积确定输注时间。在某些LNP给药中，对猴子进行类固醇预处理，以避免急性输注相关反应。在施用mRNA之后的一定间隔(即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或36h)之后，皮下或静脉内施用在盐水或等效稀释剂中的来自表1的用GalNAc修饰的指导RNA。在相同实验条件下，还评估mRNA与指导RNA的不同重量和摩尔比。mRNA与指导RNA的比最高为100∶1，最低为1∶100。还评估了100∶1和1∶100之间的比。在与gRNA一起孵育后24至96h之后，测定经处理的动物肝脏中的基因编辑，并将结果与相同时间点未经处理的对照进行比较。
实施例10.将基因编辑器mRNA和指导RNA(gRNA)体外靶向递送至肝细胞。
将表达ASGPR的原代肝细胞与基因-编辑器mRNA-GalNAc单一化学实体和指导RNA-GalNAc缀合物一起孵育，以在肝细胞中产生靶基因的编辑。基因-编辑器mRNA-GalNAc单一化学实体和gRNA-GalNAc缀合物是：
(1)以100∶1至1∶100(按重量计)范围内的不同mRNA与gRNA比以及其间的若干比共孵育。
(2)首先将基因-编辑器mRNA-GalNAc单一化学实体与细胞系一起孵育，然后以施用mRNA之后的间隔(即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或36h)，将来自表2或3或由表2和3构成的不同比的gRNA-指导RNA与相同的细胞系一起孵育。在相同实验条件下，还评估mRNA与指导RNA的不同重量和摩尔比。mRNA与指导RNA的比最高为100∶1，最低为1∶100。还评估了100∶1和1∶100之间的比。
在与gRNA一起孵育后24至36h之后，测定经处理的细胞中的基因编辑，并将结果与相同时间点未经处理的对照进行比较。
实施例11.将基因编辑器mRNA和指导RNA(gRNA)体内靶向递送至啮齿动物和非人灵长类动物的肝脏。
基因编辑器mRNA-GalNAc单一化学实体和gRNA-GalNAc缀合物在肝细胞中产生靶基因的编辑。基因-编辑器mRNA-GalNAc单一化学实体和gRNA-GalNAc缀合物是：
(1)以100∶1至1∶100(按重量计)范围内的不同mRNA与gRNA比以及其间的若干比皮下或静脉内共同施用。
(2)首先将基因-编辑器mRNA-GalNAc单一化学实体与细胞系一起孵育，然后以施用mRNA之后的间隔(即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或36h)，将来自表2或3或由表1和2构成的不同比的gRNA-指导RNA与相同的细胞系一起孵育。在相同实验条件下，还评估mRNA与指导RNA的不同重量和摩尔比。mRNA与指导RNA的比最高为100∶1，最低为1∶100。还评估了100∶1和1∶100之间的比。
实施例12.待并入的RNP-gRNA复合体制备和评估
在与gRNA一起孵育后24至96h之后，测定经处理的动物肝脏中的基因编辑，并将结果与相同时间点未经处理的对照进行比较。
实施例13.将gRNA-GalNAc和mRNA-GalNAc以及来自表1和2的单一化学实体体内施用至啮齿动物和非人灵长类动物。
在给药前，将来自表1和2的单一化学实体gRNA-GalNAc和mRNA-GalNAc与纳米颗粒的其他组分混合。将待给药的gRNA和mRNA单独配制为纳米颗粒组合物。可替代地，在纳米颗粒形成之前，gRNA和mRNA可以预混合。混合之后，给药mRNA和gRNA，并如实施例11所述的测定经处理的动物肝脏中的基因编辑。
实施例14.N-乙酰半乳糖胺-脂质(GalNAc-脂质)缀合物的合成，以构成用于体外和体内靶向递送至肝细胞的GalNAc-LNP。
方案8
方案9
方案10
方案11
方案12
方案13
方案14
方案15
方案16
方案17
方案18
实施例15.GalNAc-脂质1042、1043和1044的合成。
根据报道的程序(Organic Lett.,2010,12,5262)制备化合物2002。在环境温度下，将化合物2002(1mol当量)、丙烯腈(4.6mol当量)以及5M NaOH水溶液(0.166vol)和THF(10.0vol)搅拌48h。浓缩反应混合物，并将残余物溶解于乙酸乙酯(EtOAc，5.0vol)中，用水和盐水洗涤。浓缩有机层，并使用EtOAc/MeOH洗脱液通过柱色谱纯化，得到呈浅黄色液体的化合物2003(产率：50％)。
将化合物2003(1mol当量)和雷尼镍(200％w/w)悬浮于1∶1的25％氨/水(10.0vol)水溶液中，并在50kg/cm3压力下氢化。将反应混合物通过硅藻土(celite)过滤并浓缩，得到呈浅黄色液体的化合物2004(产率：84％)。
在0℃室温下，将胺2004(1mol当量)、化合物2005(J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958；3.6mol当量)与EDC.HCl(4mol当量)、HOBt(0.1mol当量)和DIEA(10mol当量)的DMF溶液(10vol)搅拌16h。将反应混合物缓慢转移至冰水中，并倾析顶层。将残余物溶解于EtOAc中，用5％柠檬酸水溶液洗涤，接着用5％ Na2CO3水溶液和盐水洗涤。浓缩有机层，得到呈泡沫状固体的粗化合物。然后通过柱色谱纯化由此得到的粗产物，得到所需化合物2006(52％)。
在0℃室温下，将化合物2006(1mol当量)与三氟乙酸(4vol.)在二氯甲烷中搅拌24h。浓缩反应混合物以除去挥发物；将残余物与甲苯(2vol x 2)共蒸馏。将残余物溶解于甲醇(1vol)和正己烷(10vol)中；倾析顶层，并将残余物溶解于二氯甲烷中。真空蒸发溶剂和挥发物，得到呈无色糊状物的化合物2007(产率：100％)。
在吡啶(4mol当量)的存在下，在环境温度下，将化合物2008(1mol当量)和氯甲酸4-硝基苯基酯(4mol当量)在二氯甲烷(10vol)中搅拌4h。真空蒸发反应混合物，并且通过柱色谱纯化残余物，得到化合物2009。
在吡啶(2mol当量)的存在下，在环境温度下，将化合物2009(1mol当量)与胺2010(1.5mol当量)的二氯甲烷溶液(10vol)搅拌过夜。反应混合物用水稀释。将产物提取至二氯甲烷中，并浓缩至干燥。通过柱色谱纯化残余物，得到化合物2011(产率：81％)。在环境温度下，将2011(1mol当量)在二氯甲烷中用甲酸(5vol)处理6h。真空除去溶剂和挥发物。将残余物用甲苯洗涤两次，并用二乙醚洗涤，得到化合物2012(产率：80％)。
在吡啶(2mol当量)的存在下，在环境温度下，将化合物2009(1mol当量)与胺2013(1.5mol当量)的二氯甲烷溶液(10vol)搅拌过夜。反应混合物用水稀释。将产物提取至二氯甲烷中，并浓缩至干燥。通过柱色谱纯化残余物，得到化合物2014(产率：65％)。在环境温度下，将2014(1mol当量)在二氯甲烷中用甲酸(5vol)处理6h。真空除去溶剂和挥发物。将残余物用甲苯洗涤两次，并用二乙醚洗涤，得到化合物2015(产率：87％)。
在吡啶(2mol当量)的存在下，在环境温度下，将化合物2009(1mol当量)与胺2016(1.5mol当量)的二氯甲烷溶液(10vol)搅拌过夜。反应混合物用水稀释。将产物提取至二氯甲烷中，并浓缩至干燥。通过柱色谱纯化残余物，得到化合物2017(产率：51％)。在环境温度下，将2017(1mol当量)在二氯甲烷(2vol)中用甲酸(5vol)处理6h。真空除去溶剂和挥发物。将残余物用甲苯洗涤两次，并用二乙醚洗涤，得到化合物2018(产率：87％)。
在0℃室温下，在搅拌下，将化合物2007(1mol当量)和化合物2015(1.1mol当量)与HBTU(1.2mol当量)、HOBt(0.1mol当量)和DIEA(3mol当量)的二氯甲烷溶液(10vol)混合2h。将反应混合物用水洗涤，并真空浓缩有机层。然后通过硅胶柱色谱纯化粗产物，得到化合物2020(产率：35％)。在室温下，向化合物2020(0.7g，0.19mmol)的乙醇溶液(3mL)的搅拌溶液中添加氨水(6mL)，并且将所得反应混合物在40℃下加热48h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将得到的残余物用二乙醚(2x5mL)和乙腈(3x5mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的1043(200mg，产率：38.87％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.70-7.80(m,2H),7.60(d,J＝9.2Hz,2H),7.05-7.15(m,4H),4.44-4.57(m,9H),4.20(d,J＝8.4Hz,3H),3.86-3.98(m,2H),3.62-3.68(m,9H),3.46-3.55(m,55H),3.25-3.39(m,18H),3.02-3.08(m,8H),2.02(t,J＝6.8Hz,6H),1.78(s,9H),1.56-1.69(m,12H),1.40-1.48(m,17H),1.22(s,56H),0.82-0.85(m,6H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+和[M+Na]+计算值为2598.71和2620.7；实测值为2598.72和2620.73。
在0℃室温下，在搅拌下，将化合物2007(1mol当量)和化合物2018(1.1mol当量)与HBTU(1.2mol当量)、HOBt(0.1mol当量)和DIEA(3mol当量)在二氯甲烷(10vol)中混合2h。将反应混合物用水洗涤，并真空浓缩有机层。然后通过硅胶柱色谱纯化粗产物，得到化合物2021(产率：30％)。在室温下，向化合物2021(0.8g，0.17mmol)的乙醇溶液(3mL)的搅拌溶液中添加氨水(6mL)，并且将所得反应混合物在40℃下加热48h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将得到的残余物用二乙醚(2x5mL)和乙腈(3x5mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的化合物1044(450mg，产率：70％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.71-7.74(m,1H),7.61(d,J＝8.8Hz,1H),7.10-7.14(m,1H),4.52-4.62(m,2H),4.46(d,J＝4.4Hz,1H),4.19(d,J＝8.4Hz,1H),3.86-3.98(m,1H),3.61-3.68(m,4H),3.46-3.55(m,57H),3.27-3.42(m,8H),3.0-3.15(m,3H),2.0-2.03(m,2H),1.78-1.81(m,3H),1.65-1.69(m,2H),1.56-1.59(m,2H),1.38-1.49(m,6H),1.15-1.25(m,23H),0.81-0.85(m,2H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+NH4]+计算值为3672.34；实测值为3672.37。
在室温下，向2019(850mg，00274mmol)的乙醇溶液(3mL)的搅拌溶液中添加氨水(6mL)，并且将所得反应混合物在40℃下加热48h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将得到的残余物用二乙醚(5x15mL)和乙腈(5x10mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的1042(400mg，产率：67.5％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.71(t,J＝5.6Hz,3H),7.59(d,J＝9.2Hz,3H),7.12-7.15(m,2H),4.52-4.57(m,6H),4.44(d,J＝4.0Hz,3H),4.20(d,J＝8.4Hz,3H),3.86-3.98(m,2H),3.62-3.68(m,9H),3.45-3.53(m,22H),3.31-3.39(m,19H),3.02-3.10(m,9H),2.02(t,J＝7.2Hz,6H),1.78(s,9H),1.64-1.70(m,6H),1.54-1.61(m,6H),1.38-1.49(m,18H),1.21(s,62H),0.82-0.85(m,6H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为2158.44；实测值为2158.45。
实施例16.GalNAc-脂质1002、1003和1004的合成。
在0℃室温下，在DIEA(2mol当量)和HOBt(0.1mol当量)的DMF溶液的存在下，将化合物2022(1mol当量)和化合物2022A(1mol当量)与EDC.HCl(1.1mol当量)一起搅拌16h。将反应混合物缓慢倒入冰水中，并倾析顶层。将残余物溶解于EtOAc中，用5％柠檬酸水溶液、5％ Na2CO3水溶液洗涤，随后用水和盐水洗涤。浓缩有机层，得到呈泡沫状固体的化合物2023(产率：88.7％)。由此得到的粗产物可以用于下一步骤，而无需进一步纯化。
在0℃室温下，将化合物2023(1mol当量)与三氟乙酸(4vol)在二氯甲烷(4vol)中搅拌24h。真空浓缩反应混合物以除去挥发物，并将残余物与甲苯共蒸馏。将由此得到的残余物溶解于甲醇(1vol)中，并添加10vol的正己烷。倾析顶层，并且将胶状物质溶解于二氯甲烷中并蒸发，得到呈无色糊状物的化合物2024(产率：94.3％)。
在0℃室温下，在DIEA(10mol当量)和HOBt(0.1mol当量)的DMF溶液(10vol)的存在下，将化合物2024(1mol当量)和化合物2005(3.6mol当量)与EDC.HCl(4mol当量)一起搅拌16h。将反应混合物缓慢倒入冰水中，并倾析顶层。将残余物溶解于EtOAc中，用5％柠檬酸水溶液、5％ Na2CO3水溶液洗涤，随后用水和盐水洗涤。将有机层浓缩为泡沫状固体，然后通过柱色谱纯化，得到呈泡沫状固体的化合物2025(产率：70％)。
将化合物2025(1mol当量)悬浮于THF∶IPA(1∶3，10vol)中的105Pd-C上，并在正常压力下氢化。将反应混合物通过硅藻土床过滤。将滤液真空浓缩为灰白色固体，随后通过柱色谱纯化，得到化合物2026(产率：58％)。
在0℃室温下，在DIEA(3mol当量)和HOBt(0.1mol当量)的二氯甲烷溶液(10vol)的存在下，将化合物2026(1mol当量)和化合物2012(1.1mol当量)与HBTU(1.2mol当量)一起搅拌2h。将反应混合物用水洗涤，并浓缩有机层，得到呈浅棕色泡沫状固体的粗化合物。柱色谱纯化粗产物，得到化合物2027(产率：60.7％)。在0℃±5℃下，向2027(1.4g，0.48mmol)的甲醇溶液(14.0mL)的搅拌溶液中添加甲醇钠(26.0mg，0.48mmol)的甲醇溶液(1mL)，并将所得反应混合物加热至室温，持续2h。将反应混合物用DCM(5.0mL)稀释，并用树脂Dowex酸化至pH约5至6。将反应混合物通过布氏漏斗过滤，并且在40℃下，减压浓缩滤液。将得到的残余物用二乙醚(5x20mL)和乙腈(5x10mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的1003(0.5g，产率：52.9％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.11(d,J＝8Hz,1H),7.83(t,J＝5.2Hz,1H),7.69-7.74(m,2H),7.62(d,J＝8.8Hz,3H),7.18(t,J＝5.6Hz,1H),4.52-4.60(m,1H),4.20-4.25(m,3H),3.80-4.05(m,19H),3.64-3.74(m,10H),3.42-3.52(m,17H),3.25-3.40(m,16H),2.97-3.10(m,9H),2.30-2.41(m,2H),2.01-2.08(m,6H),1.79(s,9H),1.42-1.50(m,21H),1.22(s,61H),0.82-0.86(m,6H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+和[M+Na]+计算值为1951.31和1973.31；实测值为1951.31和1973.29。
在0℃室温下，在DIEA(3mol当量)和HOBt(0.1mol当量)的二氯甲烷溶液(10vol)的存在下，将化合物2026(1mol当量)和化合物2015(1.1mol当量)与HBTU(1.2mol当量)一起搅拌2h。将反应混合物用水洗涤，并浓缩有机层，得到呈浅棕色泡沫状固体的粗化合物。柱色谱纯化粗产物，得到化合物2028(产率：68.7％)。在室温下，向2028(1.2g，0.36mmol)的乙醇溶液(3.0mL)的搅拌溶液中添加氨水(6.0mL)，并且将所得反应混合物在40℃下加热48h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将得到的残余物用二乙醚(3x10mL)和乙腈(4x10mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的化合物1002(470mg，产率：54.5％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.09(d,J＝8Hz,1H),7.81(t,J＝5.2Hz,1H),7.67-7.72(m,2H),7.60(d,J＝9.2Hz,3H),7.13(t,J＝5.6Hz,1H),4.52-4.58(m,7H),4.44(d,J＝4.0Hz,3H),4.20(d,J＝8.4Hz,3H),3.86-3.98(m,3H),3.57-3.71(m,10H),3.42-3.52(m,55H),2.94-3.11(m,8H),2.0-2.06(m,6H),1.78(s,9H),1.35-1.75(m,21H),1.22(s,60H),0.80-0.85(m,6H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为2391.57；实测值为2391.58。
在0℃室温下，在DIEA(3mol当量)和HOBt(0.1mol当量)的二氯甲烷溶液(10vol)的存在下，将化合物2026(1mol当量)和化合物2018(1.1mol当量)与HBTU(1.2mol当量)一起搅拌2h。将反应混合物用水洗涤，并浓缩有机层，得到呈浅棕色泡沫状固体的粗化合物。柱色谱纯化粗产物，得到化合物2029(产率：68.7％)。在室温下，向2029(0.55g，0.12mmol)的乙醇溶液(2.0mL)的搅拌溶液中添加氨水(4.0mL)，并且将所得反应混合物在40℃下加热48h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将得到的残余物用二乙醚(2x5mL)和乙腈(3x5mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的1004(230mg，产率：53.17％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.11(d,J＝10Hz,1H),7.85-7.95(m,1H),7.70-7.80(m,1H),7.62(d,J＝11.6Hz,2H),7.14(bs,1H),4.47-4.57(m,8H),4.21(d,J＝10.8Hz,2H),3.95-4.05(m,3H),3.86-3.96(m,3H),3.63-3.67(m,13H),3.28-3.38(m,30H),2.95-3.15(m,10H),1.95-2.15(m,6H),1.79(s,9H),1.35-1.45(m,20H),1.22(s,52H),0.85-0.95(m,6H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为3448.20；实测值为3448.21。
实施例17.GalNAc-脂质1013和1052的合成。
在碱的存在下，使胆甾醇氯甲酸酯与化合物2013在二氯甲烷中反应，得到化合物2030。将化合物2030在THF中用甲酸处理，得到化合物2031。如实施例16所述，使化合物2031与化合物2007反应，产生化合物2032。在室温下，向2032(880mg，0.264mmol)的乙醇溶液(3mL)的搅拌溶液中添加氨水(6mL)，并且将所得反应混合物在40℃下加热48h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将得到的残余物用二乙醚(10x10mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的1052(500mg，产率：79.5％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.65-7.75(m,1H),7.81(bs,1H),7.70-7.80(m,1H),7.59-7.61(d,J＝8.4Hz,2H),7.0-7.11(bs,3H),5.30(s,1H),4.50-4.70(m,6H),4.40-4.50(m,3H),4.26-4.44(m,3H),3.61-3.67(m,8H),3.35-3.47(m,45H),2.95-3.07(m,8H),1.95-2.01(m,6H),1.76(s,13H),1.30-1.47(m,26H),1.05-1.15(m,8H),0.95-1.0(m,4H),0.8-0.95(m,8H),0.65(s,3H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为2374.91；实测值为2374.37。
在室温下，向2033(730mg，0.23mmol)的乙醇溶液(3mL)的搅拌溶液中添加氨水(6mL)，并且将所得反应混合物在40℃下加热48h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将得到的残余物用二乙醚(5x10mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的1013(500mg，产率：97.9％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.08(d,J＝7.2Hz,1H),7.80-7.90(m,1H),7.65-7.75(m,2H),7.60(d,J＝8.4Hz,2H),7.0-7.11(m,3H),5.30(s,1H),4.51-4.55(m,6H),4.44-4.45(m,2H),4.17-4.27(m,3H),3.62-3.70(m,8H),3.37-3.60(m,45H),2.95-3.15(m,8H),1.95-2.10(m,6H),1.76(s,9H),1.25-1.75(m,30H),1.05-1.20(m,9H),0.80-1.0(m,12H),0.45-.55(m,3H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为2181.67；实测值为2182.32。
实施例18.GalNAc-脂质1014和1053的合成。
在室温下，向2037(0.9g，0.21mmol)的乙醇溶液(3mL)的搅拌溶液中添加氨水(6mL)，并且将所得反应混合物在40℃下加热48h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将得到的残余物用二乙醚(6x10mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的1014(300mg，产率：42.97％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.10(d,J＝8.0Hz,1H),7.83(t,,J＝6.8Hz,1H),7.72(q,J＝5.6Hz,2H),7.62(d,J＝8.4Hz,3H),7.02(t,,J＝5.2Hz,1H),5.33(bs,1H),4.53-4.59(m,7H),4.46(d,,J＝4.0Hz,3H),4.20-4.32(m,4H),3.63-3.72(m,11H),3.30-3.60(m,157H),2.95-3.15(m,9H),2.26-2.38(m,3H),2.03-2.08(m,6H),1.90-2.0(m,2H),1.75-1.86(m,13H),1.30-1.60(m,31H),0.95-1.15(m,13H),0.83-0.90(m,10H),0.64(s,3H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为3238.94；实测值为3238.95。
在室温下，向2036(1.2mg，0.264mmol)的乙醇溶液(6mL)的搅拌溶液中添加氨水(12mL)，并且将所得反应混合物在40℃下加热48h。在40℃下，减压浓缩反应混合物。将得到的残余物用二乙醚(12x10mL)研磨，在真空压力下干燥，得到呈灰白色蜡的1053(500mg，产率：53.0％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.70-7.75(m,2H),7.59(d,J＝8.8Hz,2H),6.95-7.15(m,4H),5.32(bs,1H),4.51-4.56(m,2H),4.44-4.45(m,1H),4.18(d,J＝8.4Hz,1H),3.61-3.67(m,4H),3.34-3.67(m,51H),3.29-3.34(m,6H),3.03-3.05(m,3H),2.0-2.04(m,3H),1.88-1.96(m,2H),1.76(s,4H),1.65-1.75(m,2H),1.55-1.65(m,3H),1.30-1.50(m,8H),1.0-1.20(m,3H),0.90-0.93(m,1H),0.86(d,J＝6.4Hz,1H),0.81(dd,J＝6.4Hz,J＝1.6Hz,2H),0.6(s,1H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为3446.05；实测值为3446.08。
实施例19.GalNAc-脂质1062和1065的合成。
在碱的存在下，使化合物2038与氯甲酸4-硝基苯酯反应，形成相应的碳酸4-硝基苯酯。由此形成的碳酸酯与化合物2016反应，产生化合物2039。将化合物2039用甲酸处理，得到化合物2040。如实施例15所述，在肽偶联条件下，将化合物2040偶联至2007，得到化合物2041。如实施例15/16所述，将化合物2041用NaOMe处理，随后进行后处理和纯化，得到化合物1062。
如上所述，由化合物2040和2026制备化合物1065。
实施例20.GalNAc-脂质1062和1065的合成。
在碱的存在下，使化合物2038与氯甲酸4-硝基苯酯反应，形成相应的碳酸4-硝基苯酯。在碱的存在下，使由此形成的碳酸酯与化合物2013在二氯甲烷中反应，得到化合物2043。将化合物2043在THF中用甲酸处理，得到化合物2044。如实施例16所述，使化合物2044与化合物2007反应，产生化合物2045。将化合物2045用NaOMe处理，接着进行相似的后处理和纯化，得到化合物1062。
如上所述，由化合物2044和2026制备化合物1065。也可以根据如上所述的1004的制备以相似的方式由半乳糖制备化合物1083、1084和1085。
方案18
方案19
方案20
实施例20A：GallNAc-脂质1076的示例性合成：在室温(RT)下，在10min内，向3000(4.6g，9.5mmol)的DCM溶液(46mL)的悬浮液中逐滴添加吡啶(3.0mL)。向上述溶液中分批添加对硝基氯甲酸苯酯(7.66g，38.0mmol)，并将所得悬浮液在室温下搅拌1h。减压浓缩反应混合物，并且使用8％ EtOAc/己烷作为洗脱液，通过硅胶柱色谱(CombiFlash rf)纯化粗物质，得到呈无色液体的3001(3.01g，产率：48.78％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.26-8.29(m,2H),7.37-7.41(m,2H),5.44-5.48(m,1H),4.31-4.35(m,1H),3.71-3.73(m,1H),3.44-3.61(m,6H),1.53-1.60(m,4H),1.25-1.31(m,8H),0.86-0.89(m,6H)。在室温下，向3001(3g，4.6mmol)的DCM溶液(30mL)的搅拌溶液中添加吡啶(0.74mL)和2016(11.98g，6.9mol)。在室温下，继续反应12h，减压浓缩反应混合物，并且使用80％ EtOAc/己烷作为洗脱液，通过中性氧化铝柱色谱(CombiFlash rf)纯化粗化合物，得到呈灰白色固体的3002(5.35g，产率：51.89％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.13(t,J＝5.6Hz,1H),3.86-3.99(m,2H),3.47-3.57(m,4H),3.30-3.49(m,146H),3.07-3.11(m,2H),2.39-2.49(m,2H),1.45-1.55(m,4H),1.45(s,9H),1.20-1.45(m,43H),0.75-0.85(m,6H)。
在冰冷温度下，将甲酸(35.0mL)添加至3002(5.0g，2.2mmol)的DCM溶液(10mL)的搅拌溶液中，并将所得反应在室温下搅拌6h。浓缩反应混合物以除去甲酸，并与甲苯减压共蒸馏，得到所需呈灰白色固体的3003(4.28g，产率：89.1％)。3003按原样用于下一步骤。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ5.27(bs,1H),4.06-4.20(m,4H),3.75-3.85(m,3H),3.50-3.70(m,144H),3.30-3.50(m,6H),2.59(t,J＝6Hz,2H),1.53-1.56(m,4H),1.20-1.30(m,45H),0.80-0.90(m,6H)。在冰冷温度下，向3003(3.32g，1.5mmol)的DCM溶液(32.0mL)的搅拌溶液中添加HOBt(0.02g，0.15mmol)和HBTU(0.71g，1.8mmol)，随后添加DIPEA(0.78mL，4.5mmol)。在室温下，将2026(3.2g，1.5mmol)的DCM溶液(15.0mL)添加至上述反应，并且将所得反应混合物在室温下搅拌1h。将水(30.0mL)添加至反应混合物，并用DCM(2X 30.0mL)提取。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水性溶液(50.0mL)洗涤，随后用盐水(50.0mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥。将有机层过滤，并减压蒸发滤液。使用10％MeOH/DCM作为洗脱液，通过硅胶柱色谱(CombiFlash rf)纯化粗产物，得到呈灰色半固体的3004(2.9g，产率：45.24％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.97-8.13(m,4H),7.88-7.92(m,12H),7.83(t,J＝4.8Hz,1H),7.66-7.73(m,11H),7.62(t,J＝7.2Hz,3H),7.53-7.58(m,9H),7.47(t,J＝7.6Hz,6H),7.37(t,J＝8Hz,6H),7.15(t,J＝6Hz,1H),5.73-5.75(m,3H),5.35(dd,J＝10.8Hz,J＝2.8Hz,3H),4.71(d,J＝8.4Hz,3H),4.45-4.57(m,1H),4.41-4.45(m,6H),4.22-4.35(m,6H),3.30-4.0(m,12H),3.08-3.20(m,9H),2.03-2.07(m,1.68(s,11H),1.42-1.49(m,22H),1.21-1.30(m,48H),0.80-0.90(m,6H)。
在室温下，将氨水(16.8mL)添加至3004(2.8g，0.69mmol)的乙醇溶液(8.4mL)的搅拌溶液中，并且将所得反应混合物在40℃下搅拌48h。减压浓缩反应混合物。将所得残余物用二乙醚(10X 50mL)研磨，并将残余物在真空压力下干燥，得到呈浅黄色固体的1076(1.85g，产率：80.43％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.11(d,J＝5.6Hz,1H),7.81-7.84(m,1H),7.69-7.74(m,2H),7.61(d,J＝8.8Hz,3H),7.14(t,J＝5.6Hz,1H),4.54-4.59(m,7H),4.46-4.47(m,3H),4.20(d,J＝8.4Hz,3H),3.86-3.99(m,2H),3.62-3.68(m,10H),3.30-3.50(m,159H),2.96-3.11(m,11H),2.0-2.07(m,7H),1.78(s,9H),1.41-1.47(m,26H),1.18-1.22(m,54H),0.80-0.85(m,8H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为3336.08；实测值为3336.0。
实施例20B：1079的示例性合成(方案19)
在室温下，向硬脂酸(0.43g，1.51mmol)的DCM溶液(8.6mL)的搅拌溶液中添加HOBt(0.02g，0.15mmol)。在冰冷温度下，向该反应混合物中添加HBTU(0.72g，1.81mmol)，随后添加DIPEA(0.78mL，4.53mmol)。在冰冷温度下，将2016(2.61g，1.51mmol)的DCM溶液(2.1mL，5vol)添加至上述反应混合物中，并且将所得混合物在室温下搅拌4h。将水(30.0mL)添加至反应，并用DCM(2X30 mL)提取。将合并的有机层用盐水(30.0mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并过滤。减压蒸发滤液，并且使用10％ MeOH/DCM作为洗脱液，通过硅胶柱色谱(CombiFlashrf)纯化粗产物，得到呈灰白色固体的3005(2.31g，产率：76.74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.30-6.40(bs,1H),3.38-3.72(m,151H),2.68(bs,3H),2.49(t,J＝8.8Hz,2H),2.19(t,J＝9.6Hz,2H),1.61-1.64(m,4H),1.45(s,9H),1.20-1.45(m,29H),0.80-0.85(m,3H)。
在冰冷温度下，将甲酸(14.7mL)添加至3005(2.1g，1.0mmol)的DCM溶液(10.5mL)的搅拌溶液中。将所得反应混合物在室温下搅拌12h。浓缩反应混合物以除去甲酸，并与甲苯(3X)减压共蒸馏。将残余物用二乙醚(21.0mL)研磨、过滤，并将所得残余物在真空压力下干燥，得到呈灰白色固体的3006(1.81g，产率：88.72％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.25(bs,1H),3.54-3.81(m,144H),3.42-3.47(m,3H),2.59(t,J＝6.4Hz,2H),2.17(t,J＝7.6Hz,2H),1.40-1.63(m,4H),1.20-1.45(m,27H),0.80-0.85(m,3H)。
在室温下，向3006(0.58g，0.29mmol)的DCM溶液(8.0mL)的搅拌溶液中添加HOBt(0.038g，0.028mmol)。在冰冷温度下，向该反应混合物中添加HBTU(0.13g，0.34mmol)，随后添加DIPEA(0.14mL，0.85mmol)。在冰冷温度下，将2026(0.6g，0.28mmol)的DCM溶液(3.0mL)添加至上述，并且将所得反应混合物在室温下搅拌2h。向反应混合物中添加水(25mL)，并用DCM(2X 20mL)提取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并过滤。减压蒸发滤液，并使用10％ MeOH/DCM作为洗脱液，通过硅胶柱色谱(CombiFlash rf)纯化粗产物，得到呈灰色半固体的3007(0.76g，产率：66.66％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.74(bs,1H),8.11(d,J＝8Hz,1H),7.99(d,J＝9.2Hz,3H),7.88-7.92(m,13H),7.78-7.85(m,2H),7.66-7.74(m,11H),7.62(t,J＝7.2Hz,3H),7.52-7.58(m,9H),7.47(t,J＝8Hz,6H),7.39(t,J＝8Hz,6H),5.73-5.75(m,3H),5.35(dd,J＝14Hz,J＝3.2Hz,3H),4.72(d,J＝8.4Hz,3H),4.50-4.57(m,1H),4.41-4.45(m,6H),4.24-4.33(m,6H),3.76-3.79(m,3H),3.43-3.61(m,175H),3.32-3.38(m,3H),3.08-3.16(m,8H),2.90-3.0(m,5H),2.0-2.07(m,8H),1.68(s,12H),1.40-1.49(m,21H),1.21-1.27(m,62H),0.80-0.90(m,3H)。
在室温下，向3007(0.75g，0.69mmol)的乙醇溶液(2.2mL)的搅拌溶液中添加氨水(4.5mL)，并且将所得反应在40℃下继续48h。减压浓缩反应混合物，并将粗产物用二乙醚(5X 20mL)研磨。将过滤后的固体残余物减压干燥，得到呈灰白色固体的1079(0.35g，产率：60.8％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.11(d,J＝7.6Hz,1H),7.80-7.85(m,2H),7.70-7.75(m,2H),7.63(d,J＝8.4Hz,3H)),4.47-4.59(m,9H),4.20(d,J＝8Hz,3H),3.62-3.68(m,12H),3.49(s,141H),2.97-3.16(m,11H),2.0-2.03(m,8H),1.78(s,9H),1.42-1.47(m,19H),1.21(s,29H),0.80-0.855(m,3H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为3091.87；实测值为3092.75。
实施例20C：1078的示例性合成(方案20)
在室温下，向花生酸(0.46g，1.40mmol)的DCM溶液(10.0mL)的搅拌溶液中添加HOBt(0.018g，0.14mmol)。在冰冷温度下，向该反应混合物中添加HBTU(0.67g，1.68mmol)，随后添加DIPEA(0.76mL，4.20mmol)。在冰冷温度下，添加2016(2.54g，1.40mmol)的DCM溶液(5mL)，并且将所得反应混合物在室温下搅拌4h。向反应混合物中添加水(30.0mL)，并用DCM(2X 30mL)提取。将合并的有机层用盐水(30.0mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并过滤。减压蒸发滤液，并且使用10％ MeOH/DCM作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化得到的粗产物，得到呈灰白色固体的3008(2.52g，产率：89.04％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.38(bs,1H),3.38-3.72(m,132H),2.47-2.57(m,4H),2.19(t,J＝9.6Hz,1H),1.61-1.64(m,1H),1.43(s,9H),1.20-1.24(m,29H),0.80-0.85(m,3H)。
将甲酸(16.1mL)添加至3008(2.3g，1.10mmol)在冰冷温度下的DCM(11.5mL)中的搅拌溶液中，并且将所得反应混合物在室温下搅拌12h。浓缩反应混合物以除去甲酸，并与甲苯(3X)减压共蒸馏，将得到的残余物用二乙醚(23mL)研磨、过滤，并将残余物在高真空下干燥，得到呈灰白色固体的3009(2.11g，产率：94.6％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.29(bs,1H),5.03(bs,3H),3.54-3.82(m,146H),3.44-3.46(m,3H),2.59(t,J＝6Hz,2H),2.18(t,J＝7.6Hz,2H),1.59-1.63(m,2H),1.25-1.35(s,32H),0.80-0.85(m,3H)。
在室温下，向3009(0.59g，0.29mmol)的DCM溶液(6mL)的搅拌溶液中添加HOBt(0.038g，0.028mmol)。在冰冷温度下，向该反应混合物中添加HBTU(0.135g，0.34mmol)，随后添加DIPEA(0.14mL，0.85mmol)。添加2026(0.6g，0.28mmol)的DCM溶液(3mL)，并且将所得反应混合物在室温下搅拌2h。向反应混合物中添加水(25mL)，并用DCM(2X 20mL)提取。将合并的有机层用盐水(30.0mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并过滤。减压蒸发滤液，并使用10％MeOH/DCM作为洗脱液，通过硅胶柱色谱(CombiFlash rf)纯化粗产物，得到呈灰色半固体的3010(0.91g，产率：79.13％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.11(d,J＝7.6Hz,1H),7.97(d,J＝9.2Hz,3H),7.90(t,J＝7.2Hz,12H),7.78-7.82(m,2H),7.66-7.70(m,11H),7.62-7.64(m,3H),7.53-7.60(m,9H),7.47(t,J＝8Hz,6H),7.37(t,J＝7.6Hz,6H),5.73-5.74(m,4H),5.35(dd,J＝11.2Hz,J＝2.8Hz,3H),4.72(d,J＝8.4Hz,3H),4.50-4.57(m,1H),4.41-4.47(m,6H),4.24-4.36(m,6H),3.76-3.79(m,3H),3.43-3.49(m,151H),3.35-3.38(m,3H),2.96-3.18(m,10H),2.30-2.35(m,1H),2.0-2.06(m,8H),1.68(s,12H),1.44-1.49(m,20H),1.21-1.26(m,44H),0.81-0.85(m,3H)。
在室温下，向3010(0.87g，0.21mmol)的乙醇溶液(2.6mL)的搅拌溶液中添加氨水(5.2mL)，并且将所得反应混合物在40℃下继续48h。如1079合成中所述的进行纯化，得到呈灰白色固体的1078(0.45g，产率：67.25％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.10-8.12(m,1H),7.80-7.85(m,2H),7.70-7.75(m,2H),7.63(d,J＝7.6Hz,3H)),4.50-4.60(m,9H),4.20(d,J＝8Hz,3H),3.63-3.68(m,12H),3.49(s,162H),2.97-3.16(m,17H),2.0-2.03(m,9H),1.78(s,9H),1.42-1.47(m,24H),1.21(s,36H),0.80-0.85(m,3H)；HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+计算值为3119.91；实测值为3120.8。
实施例21.mPEG2000-胆固醇504的合成。
在环境温度下，在吡啶(3mol当量)的存在下，将mPEG-2000-NH2(1mol当量)与胆甾醇氯甲酸酯(1001，1mol当量)在二氯甲烷中搅拌18h。将反应混合物用水洗涤；真空蒸发溶剂和挥发物。将粗混合物进行硅胶柱色谱纯化，得到所需化合物504(产率：22％)。ELSD-HPLC99％；平均mol.Wt.2329；实测值：2330.56。1H NMR(400MHz,DMSO,d6):δppm 7.01-6.98(t,1H),5.35(bs,1H),4.41-4.21(m,1H),3.85-3.64(m,1H),3.68-3.35(m,194H),3.23(s,3H),3.18-2.95(m,2H),2.42-2.15(m,2H),2.00-1.96(m,2H),1.95-1.76(m,3H),1.75-0.32(m,36H),0.23-0.15(s,3H)。
实施例22.用于LNP评估的指导RNA(gRNA)和mRNA
在固相寡核苷酸合成和脱保护条件下，使用受控孔玻璃载体以及市售的亚磷酰胺单体和寡核苷酸合成试剂合成表5中所示的指导RNA(gRNA)(Methods in MolecularBiology,1993,20,81-114；ACS Chem.Biol.2015,10,1181-1187，其通过引用以其整体并入本文)。通过HPLC纯化脱保护的指导RNA，并通过质谱分析证实每个指导RNA的完整性。每个指导RNA的观察质量与计算质量一致。
表5.实施例2-25中描述的用于研究的单指导RNA(gRNA)
*gRNA设计为靶向小鼠、大鼠、猴和人PCSK9和ANGPTL3基因。#指导RNA序列中的大写和小写字母分别表示携带2’-核糖(2’-OH)和2’-O-甲基(2’-OMe)核糖糖部分的核苷酸，字母“s”表示硫代磷酸酯(PS)键。
编码SpCas9、CBE和ABE蛋白的mRNA
SpCas9、CBE和ABE的mRNA通过本领域公知的不同方法产生。本文所用的这些方法中的一种是使用T7聚合酶或另外的RNA聚合酶变体的体外转录(IVT)。通常，mRNA的IVT使用线性化DNA模板，其包含T7聚合酶启动子、mRNA编码序列(CDS)、3’和5’非翻译区(UTR)、聚A尾以及另外的复制和转录调控元件。在IVT前，DNA模板是质粒、PCR产物或另外的双链DNA构建体形式。通常的IVT反应包括T7聚合酶、DNA模板、RNA酶抑制剂、帽类似物、无机焦磷酸酶以及天然存在的核糖核苷酸(rNTP，例如GTP、ATP、CTP、UTP)，或用修饰的rNTP(例如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、N6-甲基腺苷和N4-乙酰胞苷)取代天然rNTP。帽类似物是二核苷酸或三核苷酸帽结构，其中第一初始核苷酸含有标准的2’-羟基基团、2’-O-甲基基团或另外的2’化学修饰。在IVT反应之后，也使用牛痘加帽酶添加Cap类似物。在IVT之后，在一些情况下，将DNA酶添加至转录混合物，以除去DNA模板；可替代地，通过离子交换柱色谱除去残留的DNA。用离子交换色谱、亲和色谱、沉淀、离子对反相色谱、酶反应、大小排阻色谱和/或切向流过滤进行mRNA的纯化和浓缩。使用相似的IVT和纯化过程产生编码SpCas9、CBE和ABE的mRNA；在所有情况下，针对特定目的基因优化DNA模板、反应条件和纯化参数。在一些实施例中，加帽和聚腺苷酸化的mRNA从商业来源(例如，TriLink)获得。实施例23.脂质纳米颗粒(LNP)的制备
这些研究中用作参考的LNP根据公开的程序来制备，并且由公开的LNP赋形剂和基因组编辑器mRNA(Miller等人，Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,1059-1063；Yin等人，NatureBiotechnology 2016,34,328-333)以及指导RNA(Chadwick等人，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2017,37,1741-1747；Rossidis等人，Nat.Med.2018,24,1513-1518.doi:10.1038/s41591-018-0184-6；Ding等人，Circ Res.2014,115,488-492)构成。gRNA有效负载选自表5，并且用于构成这些LNP的mRNA有效负载如实施例22所述的制备或者可以商购自第三方，例如TriLink BioTechnologies。如文献(Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,8529–8533)中所述，参考LNP A1(表6)由公开的脂质501(表6)、胆固醇、DSPC和来自表7的PEG-脂质构成。相似地，如表6所总结的，基准LNP B1和C1分别由脂质502(WO2015/095340A1)和503(Molecular Therapy2018,26,1509-1519)与胆固醇、DSPC和PEG-DMG(506和507，表7)组合构成。报道的基因组编辑器核酸酶mRNA和指导RNA用作构成参考LNP的有效负载。在一种方法中，LNP制剂A1、B1和C1通过共同配制mRNA和指导RNA来制备。在该共同配制方法中，mRNA与指导RNA的比从10∶1变化至1∶10，这产生一系列用于体外和体内基因编辑评估的LNP。在第二种方法中：使用与表6中相同的脂质比分别配制指导RNA和mRNA，然后将具有指导RNA的预配制LNP与mRNA以各种比混合在一起，得到新系列的用于基因编辑评估的LNP。
表6.LNP A1、B1和C1的示例性脂质组合物
表7.用于LNP制备的脂质和PEG-脂质赋形剂
实施例24.肝细胞靶向LNP的制备。
实施例24-A.
将来自实施例23的LNP依次与GalNAc-脂质1002和1004(表4)重构，得到所需的靶向肝细胞的GalNAc-LNP。使用表6中所述的组合物以每种靶向脂质的不同mol％(0.01至5mol％)，通过依次共同配制1002或1004生成一系列GalNAc-LNP。当将1002和1004以各种mol％(0.01至5mol％)依次添加至来自表6的用于体外和体内基因编辑的预配制LNP中时，产生另一组LNP。如表8-13所述，在配制期间，添加肝细胞靶向GalNAc-脂质(1002或1004)。
制备的所有LNP储存在2-8℃或-80℃下(表6，8-13)。配制后，将LNP缓冲液交换和浓缩。将LNP缓冲液交换为离子强度从0至200mM变化的缓冲液。在一些情况下，通过PD-10柱进行缓冲液交换，在其他情况下它是透析，而在其他情况下使用切向流过滤(TFF)。在一些情况下，使用TFF来浓缩LNP，而在其他情况下使用amicon离心浓缩柱。将LNP交换为pH 7或8的最终制剂缓冲液并浓缩。添加冷冻保护剂，使得最终制剂缓冲液中冷冻保护剂的最终浓度为0-500mM。首先将具有冷冻保护剂的LNP冷冻并储存在-80℃下，然后将不含冷冻保护剂的LNP储存在2-8℃下。
实施例24-B.
然后用靶向脂质1042、1043和1044(表4)依次置换实施例24-A的靶向脂质，其中配体的呈递不同于1002、1003和1004的呈递。分离配体部分的脂质链和系链在两个系列的靶向脂质中保持相同。也如实施例23所述的制备具有不同有效负载(指导RNA和mRNA)比的相同数量的制剂以及指导RNA和mRNA的单独制剂，用于评估。用于每种单独制剂的指导RNA选自表5。mRNA可以是Trilink mRNA、MS004或MA004或任何其他mRNA。
然后用靶向脂质1012、1014、1051和1053(表4)依次置换实施例24-A的靶向脂质，其中用胆固醇部分置换二硬脂酰甘油部分。也如实施例23所述的制备具有不同有效负载(指导RNA和mRNA)比的相同数量的制剂以及指导RNA和mRNA的单独制剂，用于评估。用于每种单独制剂的指导RNA选自表5。mRNA可以是Trilink mRNA、MS004或MA004或任何其他mRNA。
用靶向脂质1062和1065置换实施例24-A的靶向脂质，以生成新的靶向LNP，用于评估。在由此得到的新制剂中，用生育酚部分置换二硬脂酰甘油部分。
用靶向脂质1003置换实施例24-A的靶向脂质，以生成新的靶向LNP，用于评估。
实施例25.与LNP的GalNAc-脂质后添加过程。
配制表6、8、9-12和7的某些LNP组合物，并使其静置1分钟至120分钟。在一些情况下，隐形脂质以0-5mol％包括在初始脂质混合物和/或稀释缓冲液中。在一些情况下，在LNP配制后，将GalNAc-脂质1004等以0.01-10mol％添加在乙醇/水性溶液中。在LNP配制后，在1分钟至120分钟内添加GalNAc-脂质，并允许其在乙醇/水性缓冲液中与LNP相互作用1分钟到120分钟，然后缓冲液交换为制剂缓冲液。在一些情况下，通过PD-10柱进行缓冲液交换，在其他情况下它是透析，而在其他情况下使用TFF。在一些情况下使用TFF浓缩LNP，而在其他情况下使用amicon离心浓缩柱。
表8-13中描述了将GalNAc-脂质后添加至LNP。数据显示在其中。
表8.示例性脂质组合物
1用GA055 PCSK9指导RNA和MS004 Cas9 mRNA制备7-17-1。
表9：使用1004作为GalNAc-脂质的GalNAc-LNP配制参数和特征的实施例。在配制后，将1004添加至LNP。LNP组合物(mol％)：脂质(502)/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(507)＝47.1∶4.7∶46.1∶2.1。
*LNP组合物(mol％)为脂质(502)/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(507)＝55∶4.7∶38.2∶2.1。本文陈述的比值基于添加GalNAc脂质之前LNP组分的比值。在包括GalNAc脂质后，组合物略有变化。
表10：使用1004作为GalNAc-脂质的GalNAc-LNP配制参数和特征的实施例。在配制后，将1004添加至LNP。LNP组合物(mol％)：脂质(502)/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(507)＝47.1∶4.7∶46.1∶2.1。7-19和7-20携带1∶1比的MA002(ABE mRNA)和GA259(ANGPTL3指导RNA)。7-22含有1∶1比的MA004 ABE mRNA和GA256(PCSK9指导RNA)。所有其他陈述的GalNAc-LNP携带1∶1比的MS004(SpCas9mRNA)和GA055(PCSK9 gRNA)。
表11.使用1004作为GalNAc-脂质的GalNAc-LNP配制参数和特征的实施例。在配制过程的各个阶段，将1004添加至LNP。在所有实施例期间，LNP组合物(mol％)：脂质(502)/DSPC/胆固醇(＝47.1∶4.7∶46.1)保持不变。所有GalNAc-LNP携带1∶1比的MS004(SpCas9mRNA)和GA055(PCSK9 gRNA)，除了7-39、7-40和7-41是1∶1比的gRNA GA256和mRNAMA004；制剂7-26含有GA257 gRNA和mRNA MA004；制剂7-29含有GA259 gRNA和mRNA MA002
#稀释缓冲液是16.5％乙醇/PBS。*如图9的过程3中所反映的，使用第三端口混合添加GalNAc-脂质1004。
表12.使用各种GalNAc-脂质的GalNAc-LNP配制参数和特征的实施例。按照LNP 7-16(表9)的方法制备LNP 7-34和7-35，而按照如制备7-16-D(表9)所述的方法制备7-36和7-37。LNP组合物(mol％)：脂质(502)/DSPC/胆固醇/PEG-DMG(507)＝47.1/4.7/46.1/2.1。所有GalNAc-LNP携带1∶1比的GA259(gRNA)和MA004(mRNA)，除了7-38A是gRNA GA256和mRNAMA004。
使用HPLC评估LNP组分
如图1A-图1B所示，通过HPLC方法表征LNP的脂质组合物。所用的HPLC方法是带有蒸发光散射检测的离子对反相高效液相色谱(IP-RPLC-HPLC-ELSD)，以定量给定样品中每种脂质的％。根据标准曲线校准每种脂质组分，其中样品检测高于定量限(S/N≥10)。图1A-图1B展示了证明GalNAc-脂质掺入的HPLC色谱图：(图1A)不存在GalNAc-脂质的参考LNP以及(图1B)由GalNAc-脂质构成的LNP。在图1A中，标记为PEG-DMG的保留时间(RT)6.721min处的HPLC峰是PEG-脂质507，标记为VL01的RT 8.176min处的峰是氨基脂质502。在图1B中，标记为PEG-DMG的RT 6.901min处的HPLC峰是PEG-脂质507，标记为VL01的RT 8.402处的峰是氨基脂质502，标记为GalNAc的RT 10.749min处的HPLC峰是1004。
实施例26.由PEG-DSG(508)构成的LNP
用PEG-DSG(508，表7)置换实施例23、24和25中所用的PEG-脂质赋形剂，得到靶向和非靶向LNP，用于进一步评估，并且在LNP介导的递送/摄取条件下，比较体外和体内的递送效率和基因编辑。
实施例27.由PEG-胆固醇(504)构成的LNP
用PEG-胆固醇(504和505，表7)置换实施例26中用于构成LNP的PEG-DSG，得到靶向和非靶向LNP，用于进一步评估，并且在LNP介导的递送/摄取条件下，比较体外和体内的递送效率和基因编辑。
实施例28.由单一mRNA有效负载构成的LNP
用单一mRNA有效负载置换实施例23-27中的有效负载(Molecular Therapy 2018,26,1509-1519)，以在LNP介导的递送/摄取条件下，评估mRNA体外和体内的表达。
实施例29.由单一siRNA有效负载构成的LNP
用siRNA置换实施例23-28中的有效负载，以评估RNAi介导的基因沉默。在LNP介导的递送/摄取条件下，用于评估的siRNA是报道的FVII siRNA(Jayaraman等人，Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,8529-8533)。
实施例30.由反义寡核苷酸有效负载构成的LNP
用反义寡核苷酸置换实施例23-28中的有效负载，以在LNP介导的递送/摄取条件下，评估体外和体内的反义效应(Prakash等人，ACS Chemical Biology,2013,8(7),1402-1406)。
实施例31.由antimir/antagomir有效负载构成的LNP
用miRNA置换实施例23-28中的有效负载，用于在LNP介导的递送/摄取条件下，进行体外和体内miRNA活性评估(Zhang等人，J.Controlled Release 2013,168,251-261；kruetzfeldt等人，Nature 2005,438,685-689)。
实施例32.由微小RNA有效负载构成的LNP
用miRNA置换实施例26中的有效负载，用于在LNP介导的递送/摄取条件下，进行体外和体内微小RNA活性评估(Wang等人，J.Control Release 2013,28,690-8)。
实施例33.LNP的体外评估
如Finn等人，Cell Reports 2018,22,2227-2235中所述，在肝细胞(啮齿动物、猴和人)中评估从实施例23-27中获得的LNP的基因编辑活性。
在存在和不存在血清的培养基中测试这些LNP的编辑效率。
另外，在无血清条件下，在存在或不存在重组人ApoE的上述细胞系中测试实施例23-27获得的LNP(Akinc等人，Mol Ther.2010,18,1357-64)。
在上述所有条件下，还在ASGPR、LDLr和ApoE敲除肝细胞(人、猴和啮齿动物)中评估了所有这些LNP的基因编辑活性。
实施例34.结合至ASGPR的GalNAc-LNP的评估
如Mol Ther.2010,18,1357-64中所述，测量从实施例23-31中获得的所有ASGPR靶向LNP的ASGPR结合。
实施例35.LNP形成之后的GalNAc-脂质包含
配制LNP，并使其静置1min至120min。在一些情况下，隐形脂质以0-5mol％包括在初始脂质混合物和/或稀释缓冲液中。将LNP缓冲液交换和浓缩，在一些情况下使用TFF浓缩，在其他情况下使用amicon离心浓缩柱。在一些情况下，通过PD-10柱进行缓冲液交换，在其他情况下它是透析，而在其他情况下使用TFF。然后在LNP浓缩后，在1至120分钟内将GalNAc-脂质1004以0.01-10mol％添加在乙醇/水性溶液中，并使其与LNP相互作用。
在另一种配制方法中，配制LNP，并使其静置1分钟至120分钟。在一些情况下，隐形脂质可以以0-5mol％包括在初始脂质混合物和/或稀释缓冲液中。将LNP在稀释缓冲液中稀释至初始体积的1％至1000％。然后在LNP配制后，在1分钟至120分钟内将GalNAc-脂质1004以0.01-10mol％添加在乙醇/水性溶液中，并使其与LNP在乙醇/水性缓冲液中相互作用1分钟至120分钟，然后缓冲液交换为pH 7或8的最终制剂缓冲液。
如上所述配制LNP，并缓冲液交换为最终制剂缓冲液。在一些情况下，隐形脂质以0-5mol％包括在初始脂质混合物和/或稀释缓冲液中。然后以0.01-10mol％添加GalNAc-脂质1004溶液，使其相互作用1至120分钟，然后将溶液缓冲液交换为最终制剂缓冲液。
在其他实施方案中，如上所述配制LNP，并缓冲液交换为最终制剂缓冲液。在一些情况下，隐形脂质以0-5mol％包括在初始脂质混合物和/或稀释缓冲液中。然后以0.01-10mol％添加GalNAc-脂质1004溶液，使其相互作用1至120分钟。
在一些实施方案中，将LNP在配制后以0.01-10mol％直接收集至含有GalNAc-脂质1004溶液的稀释缓冲液中。在一些情况下，隐形脂质可以以0-5mol％包括在初始脂质混合物和/或稀释缓冲液中。将GalNAc-脂质1004掺入至LNP溶液中，并在1至120分钟后将溶液缓冲液交换为最终制剂缓冲液。
还配制LNP，并缓冲液交换为最终制剂缓冲液。然后如实施例24所述，将冷冻保护剂添加至由此形成的LNP，以储存在-80℃下。将不含冷冻保护剂的LNP储存在2-8℃下，并且将含有冷冻保护剂的最终制剂储存在-80℃下。然后将冷冻的LNP在室温下解冻。然后以0.01-10mol％将GalNAc-脂质1004的乙醇/水性溶液添加至解冻的LNP。在一些情况下，然后将LNP缓冲液交换为最终制剂缓冲液。在其他情况下，它们在添加GalNAc-脂质后不进行缓冲液交换。
在一些情况下，通过PD-10脱盐柱(填充有Sephadex以通过脱盐和缓冲液交换将高分子量化合物与低分子量化合物分离的柱)、透析或切向流过滤(TFF)进行缓冲液交换。在一些情况下，将LNP在添加GalNAc-脂质和缓冲液交换后储存在2-8℃或-80℃下。
然后通过用来自表4的其他GalNAc-脂质置换GalNAc-脂质1004来构成GalNAc-LNP。
实施例36.将GalNAc-脂质包含在预配制脂质混合物中,得到GalNAc-LNP。
来自表4的示例性GalNAc-脂质1004以0.01-10mol％包括在初始脂质混合物(包括但不限于：可电离脂质、隐形脂质、辅助脂质等)中，预配制LNP。在一些情况下，以0-5mol％包括隐形脂质。如实施例24所述，配制LNP，并且在配制后的1分钟至1天内缓冲液交换，并储存。
在一些情况下，来自表4的示例性GalNAc-脂质1004以0.01-10mol％包括在初始脂质混合物(包括但不限于：可电离脂质、隐形脂质、辅助脂质等)中，预配制LNP。在一些情况下，以0-5mol％包括隐形脂质。配制LNP并直接收集至含有0.01-10mol％的GalNAc-脂质1004的溶液中。如实施例24所述，使LNP静置1至120min，然后缓冲液交换为最终制剂缓冲液，用于储存在2-8℃下和/或用于储存在-80℃下。
在一些情况下，GalNAc-脂质1004以0.01-10mol％包括在初始脂质混合物(包括但不限于：可电离脂质、隐形脂质、辅助脂质等)中，预配制LNP。在一些情况下，以0-5mol％包括隐形脂质。配制LNP并使其静置1min至120min。然后将GalNAc-脂质的乙醇/水性溶液以0.01-10mol％添加至LNP，并使混合物再静置1min至120min。然后如实施例24所述，将LNP缓冲液交换为最终制剂缓冲液，用于储存在2-8℃下和/或用于储存在-80℃下。
在一些情况下，GalNAc-脂质1004以0.01-10mol％包括在脂质的初始混合物(包括但不限于：可电离脂质、隐形脂质、辅助脂质等)中，预配制LNP。在一些情况下，可以以0-5mol％包括隐形脂质。如实施例24所述，配制LNP，然后缓冲液交换为储存缓冲液，用于储存在2-8℃下和/或用于储存在-80℃下，并在2-8℃和/或-80℃储存。然后将LNP在室温下解冻。然后将GalNAc-脂质1004的乙醇/水性溶液以0.01-10mol％添加至LNP，并使混合物再静置1min至120min。
如实施例24所述，储存LNP。在一些情况下，通过PD-10柱、透析或切向流过滤(TFF)进行缓冲液交换。在一些情况下，根据所需储存条件，将LNP在添加GalNAc-脂质和适当的缓冲液交换后储存在2-8℃或-80℃下。
然后通过用来自表4的其他GalNAc-脂质置换GalNAc-脂质1004来构成GalNAc-LNP。
实施例37.用GalNAc在线稀释LNP以构成GalNAc-LNP。
使用在线(第三通道)稀释法配制GalNAc-LNP。一个通道/线是脂质混合物(包括但不限于：可电离脂质、隐形脂质、辅助脂质等)。另一个通道/线含有载物的水性溶液(包括但不限于：指导RNA和mRNA)。第三通道/线含有所需GalNAc-脂质1004的乙醇/水性溶液，使得LNP的最终mol％在0.01-10的范围内。如实施例24所述，使LNP静置1min至120min，然后缓冲液交换为最终制剂缓冲液，并储存。
在其他情况下，使用在线(第三通道)稀释方法配制GalNAc-LNP。一个通道/线是脂质混合物(包括但不限于：可电离脂质、隐形脂质、辅助脂质等)。另一个通道/线含有载物的水性溶液(包括但不限于：指导RNA和mRNA)。第三通道/线含有所需GalNAc-脂质1004的乙醇/水性溶液，使得LNP的最终mol％在0.01％-10％的范围内。然后将LNP直接收集至含有0.01-10mol％的相同GalNAc-脂质的溶液中。如实施例24中所述，使LNP静置1min至120min，然后缓冲液交换为最终制剂缓冲液，用于储存在2-8℃下和/或用于储存在-80℃下。
在其他情况下，使用在线(第三通道)稀释方法配制LNP。一个通道/线是脂质混合物(包括但不限于：可电离脂质、隐形脂质、辅助脂质等)。另一个通道/线含有载物的水性溶液(包括但不限于：指导RNA和mRNA)。第三通道/线含有来自表4的所需GalNAc-脂质的乙醇/水性溶液，使得LNP的最终mol％在0.01-10的范围内。配制LNP并使其静置1min至120min。然后将GalNAc-脂质1004的乙醇/水性溶液以0.01-10mol％添加至LNP，并使混合物再静置1至120min。然后如实施例24所述，将LNP缓冲液交换为最终制剂缓冲液，用于储存在2-8℃下和/或用于储存在-80℃下。
如实施例24所述，储存LNP。在一些情况下，通过使用PD-10柱、通过透析或通过切向流过滤(TFF)进行缓冲液交换。在一些情况下，将LNP在添加GalNAc-脂质和适当的储存缓冲液交换后储存在2-8℃或-80℃下。
然后通过用来自表4的其他GalNAc-脂质置换GalNAc-脂质1004来构成GalNAc-LNP。
实施例38.LNP的体内基因编辑评估
在野生型以及LDLr和ApoE敲除啮齿动物模型中以及在非人灵长类动物中评估来自实施例23-27的许多配制的LNP的基因编辑活性。
根据动物护理、处理和处死的制度伦理原则(institutional ethicalguidelines)处理小鼠。将小鼠保持在无病原体的设备中，自由获取标准食物和水。根据小鼠的体重，通过眶后途径用测试品或作为媒介物的PBS对小鼠进行给药。在给药后第五或第六天，收集相关组织。提取基因组DNA，并通过下一代测序评估靶序列的编辑百分比，以确定编辑效率，结果如图3-8所示。
图2示出了在如实施例33所述获得NGS分析之前用7-17、7-16-L和7-16-M转染三天后，原代人肝细胞中的体外PCSK9编辑效率。LNP以312.5ng/mL LNP浓度至2500ng/mL LNP浓度范围的剂量反应给药。
图3示出了在眶后施用携带1∶1比的SpCas9 mRNA(MS004)和PCSK9 gRNA(GA055)的LNP 7-17-1和7-16之后，1mg/kg剂量下野生型(grp1和2)、LDLR敲除(LDLR-/-，grp3和4)和ApoE敲除(ApoE-/-，grp5和6)小鼠(n＝5)肝脏中的PCSK9基因编辑。7-17-1是参考LNP，并且7-16是具有作为GalNAc-脂质的1004的GalNAc-LNP。grp1、3和5用7-17-1处理，并且grp2、4和6用7-16处理。LNP ID在表8和9中给出。缺乏GalNAc-脂质的参考LNP 7-17-1在LDLR-/-和ApoE-/-小鼠中产生低或极差的编辑。
图4示出了在眶后施用携带1∶1比的ABE mRNA MA002和gRNA GA259的本文的GalNAc-LNP组合物之后，LDLR-/-小鼠肝脏中的基因编辑。用ANGPTL3指导GA259和ABE mRNAMA002如表9所述的制备7-16-A、7-16-B和7-16-C；用ANGPTL3指导GA259和ABE mRNA MA002如表10所述的制备7-19和7-20；用ANGPTL3指导GA259和ABE mRNA MA002如表11所述的制备7-29；以及用ANGPTL3指导GA259和ABE mRNA MA002如表12所述的制备7-34和7-35。数据突出了7-16-A的剂量反应以及GalNAc-LNP(7-16-B、7-16-C、7-29)的配制过程对肝基因编辑活性的影响。7-19和7-20示出了GalNAc-脂质(1004)mol％滴定对体内肝基因编辑的影响。7-34和7-35(表4)具有胆固醇作为脂质锚。7-29和7-35的编辑数据推断出脂质锚影响GalNAc-LNP的体内功效。
图5示出了在眶后施用携带1∶1比的ABE mRNA(MA004)和PCSK9 gRNA(GA257)的LNP之后，野生型(grp1、2和3)和LDLR-/-(grp4、5、6和7)小鼠(n＝5)肝脏中的PCSK9基因编辑。将7-16-I施用至grp1、4和5；用0.25mg/mL总RNA剂量的7-16-H处理grp2和6；将7-26以0.25mg/mL施用至组3和7。Grp1、2、4和6以0.25mg/kg给药；并且grp5以0.125mg/kg给药。LNPID和制剂信息在表9和表11中给出。制剂7-16-H和7-16-I分别比较了当通过PD-10柱进行缓冲液交换并在2-8℃下储存时以及经由TFF进行缓冲液交换并在-80℃下储存时相同制剂的编辑效率。在制剂7-26(grp3野生型；grp7 LDLR-/-，0.25mg/kg)中，用GalNAc-脂质1004完全置换PEG-脂质507。Grp1(7-16-I)、grp2(7-16-H)、grp4(7-16-I)和grp6(7-16-H)分别示出了相同GalNAc-LNP脂质组合物(表9)的缓冲液交换条件对WT和LDLR-/-小鼠中肝基因编辑的影响。分别用0.25和0.125mg/kg剂量的制剂7-16-I处理Grp4和5，以显示对LDLR-/-小鼠中肝基因活性的剂量反应影响。
图6示出了在眶后施用LNP 7-16-J和7-16-E(表9)之后，野生型雌性小鼠(n＝5)肝细胞中的PCSK9基因编辑。7-16-J由SpCas9 mRNA(MS004)和PCSK9 gRNA(GA055)构成，并且7-16-E由1∶1比的ABE mRNA(MA004)和PCSK9(GA257)gRNA构成。7-16-J和7-16-E分别以0.25mg/kg和0.5mg/kg给药。
图7示出了在以0.25mg/kg眶后施用LNP 7-16-I和7-16-K之后，野生型雌性小鼠(n＝5)肝细胞中的PCSK9基因编辑。两种LNP含有ABE mRNA MA004和PCSK9 gRNA GA257。两种制剂含有相同的赋形剂和1004mol％。为了制备7-16-I和7-16-K，将在线混合之后的LNP分别收集在含有16％乙醇的PBS和含有16％乙醇的水中。LNP ID和制剂信息在表9中给出。
图8示出了在以0.5mg/kg剂量眶后施用携带Cas9 mRNA和gRNA的LNP之后，LDLR-/-雌性小鼠(n＝5)肝细胞中的PCSK9编辑。7-17-1(表8)、7-16(表9)、7-18(表10)、7-17-A(表10)、7-24(表10)、7-33-A(表11)、7-23(表10)和7-33(表11)由spCas9 mRNA和gRNA构成。7-17-1(表8)、7-16(表9)、7-18(表10)和7-17-A(表10)显示了GalNAc-脂质(1004)mol％(分别为0、0.5、1.0和2.0mol％)滴定对LDLR-/-小鼠肝细胞中的基因编辑活性的影响。通过以下图9中的过程1制备所有三种制剂。用7-24、7-33-A、7-23和7-33GalNAc-LNP测试各种配置过程对基因编辑效力的影响。制剂7-17-1是缺乏GalNAc-脂质1004的对照LNP。7-24含有0.5mol％的1004，其中将GalNAc-脂质添加至收集缓冲液(过程2，图9)。通过第三端口/在线混合将GalNAc-脂质1004引入至混合室中来制备7-33-A(过程3，图9)。7-23在向小鼠眶后施用前、解冻之后，将GalNAc-脂质添加至储存在-80℃下的预形成LNP。通过将GalNAc-脂质1004与其他脂质赋形剂预混合来制备7-33(过程4，图9)。7-34和7-35(表12)由1∶1比的ABEmRNA和ANGPTL3gRNA构成，其中分别用1053和1014置换GalNAc-脂质1004(插入后0.5mol％)，并且证明了含有1004的GalNAc-LNP能够成为更有效的设计。
图15示出了在以0.25mg/kg眶后施用LNP 7-16-N和7-38-A之后，LDLR-/-雌性小鼠(n＝5)肝细胞中的PCSK9基因编辑。7-16-N包括1004并在表9中描述，并且7-38-A包括1044并在表12中描述。7-16-N和7-38-A含有PCSK9指导RNAGA256和ABE mRNA MA004。与1044相比，对于相同的配制方法，1004显示出更高的功效。它们都根据图9中的过程1和图10中的方案1制备。
LNP也以1mg/kg剂量给药至食蟹猴非人灵长类动物。在1小时内经由IV输注给予LNP。根据实施例24所述的GalNAc-脂质添加方法和表13所示的，用表5和/或7中给出的LNPID制备LNP。如实施例24所述，LNP先前已储存在-80℃下。LNP 7-17用作对照，而LNP 7-16-L和7-16-M在制剂中具有GalNAc-脂质1004。在给药后第1天或第14天处死灵长类动物。终点包括但不限于：血液中的LDL-c水平、肝脏肝细胞中靶基因的％编辑、血液中的PCSK9蛋白水平、血液中的ANGPTL3蛋白水平以及其他脂质参数。
然后如实施例33所述，将这些制剂与人和猴原代肝细胞一起孵育，结果总结在图2中。图2示出了LNP制剂7-17、7-16-L和7-16-M在原代人肝细胞中的体外PCSK9基因编辑效率。
表13：如实施例23和24所述制备LNP，并如实施例24所述储存在-80℃下。然后在非人灵长类动物中测试它们。以1mg/kg剂量经由IV输注施用LNP。
基因组DNA分离
根据制造商的方案，在Kingfisher Flex自动提取仪器(Thermo-FisherScientific)上使用基于珠的提取试剂盒MagMAX-96DNA多样品试剂盒(Thermo-FisherScientific)从约20μL的小鼠整个肝脏裂解物中分离基因组DNA。根据制造商的方案，使用FastPrep-24系统(MP Bio)裂解小鼠整个肝脏。将肝脏装入含0.5mL PBS的2mL裂解矩阵管(MP Bio)中。将提取的基因组DNA储存在4℃下直至进一步使用，或者在-80℃下长期储存。
下一代测序(NGS)和编辑效率的分析
对目的区域进行下一代测序(NGS)或深度测序，以确定基因编辑的程度。根据制造商的方案，使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒(Illumina)制备样品。简言之，首先进行两轮PCR以扩增目的区域，其次向初始产物添加深度测序和样品鉴定所需的DNA序列。根据制造商的方案，在Illumina MiSeq仪器上对最终扩增子进行测序。用CRISPResso2流水线分析双端读段(参见Clement,K.,Rees,H.,Canver,M.C.等人，CRISPResso2 provides accurateand rapid genome editing sequence analysis.Nat Biotechnol 37,224–226(2019))。简言之，过滤掉低质量的读段，从读段中修整衔接子序列，将双端读段合并并与扩增子序列比对。编辑百分比计算为支持插入或缺失的读段数与对比的读段总数之比。对于Cas9，编辑百分比计算为支持插入或缺失的读段数与对比的读段总数之比。
实施例39.由GalNAc-脂质1076构成的GalNAc-LNP。
通过用GalNAc-脂质1076置换实施例25-38的GalNAc-脂质来构成所需GalNAc-LNP。
实施例40.由GalNAc-脂质1079构成的GalNAc-LNP。
通过用GalNAc-脂质1079置换实施例25-38的GalNAc-脂质来构成所需GalNAc-LNP。
如前所述的图9-14是本文公开的GalNAc-LNP的代表性制造过程的图示。图9中示出了过程1-4。过程1描绘了制备GalNAc-LNP的方法，其方面在Sato等人，ControlledRelease,2017,266,216-225中更完全地描述。过程2示出了用于产生LNP的方法，由此将水性缓冲液中的核酸通过一个(或多个)通道送至混合器中，并且将脂质组分(包括但不限于：氨基脂质、辅助脂质、结构脂质/甾醇以及隐形脂质)通过单独的一个或多个通道送至混合器中。应理解，RNA有效负载和LNP赋形剂的两个流通过单独的通道进入混合器，并在混合器内混合；它们在进入混合器之前彼此不接触。然后将在混合室中瞬时形成的LNP收集在含有所需mol％的GalNAc-脂质的稀释缓冲液中。然后，GalNAc-LNP在进行缓冲液交换之前进入保持时间。过程3示出了用于制备GalNAc-LNP的在线混合方法，由此将水性缓冲液中的核酸通过一个(或多个)通道送至在线混合器中，并且将脂质组分(包括但不限于：氨基脂质、辅助脂质、结构脂质以及隐形脂质)通过单独的一个或多个通道送至混合器中。应理解，RNA有效负载和LNP赋形剂的两个流通过单独的通道进入混合器，并在混合器内混合；它们在进入混合器之前彼此不接触。在一些情况下，混合器是T型混合器，在其他情况下它是交叉混合器。然后溶液经过非常短距离的管立即并连续地进入另一个在线混合器，其中第一混合器的输出物与含有GalNAc-脂质的稀释缓冲液在线混合，使得实现与其他脂质相比最终所需的mol％目标。两个混合器之间的距离非常短，因此两个连续的混合事件可以理解为几乎是瞬时的。然后，GalNAc-LNP在进行缓冲器交换之前进入保持时间。过程4示出了用于制备GalNAc-LNP的方法，由此将水性缓冲液中的核酸通过一个(或多个)通道送至在线混合器中，并且将脂质组分(包括但不限于：氨基脂质、辅助脂质、结构脂质、隐形脂质以及GalNAc-脂质的至少一部分或所需mol％的GalNAc-脂质)通过单独的一个或多个通道送至混合器中。应理解，RNA有效负载和LNP赋形剂的两个流通过单独的通道进入混合器，并在混合器内混合；它们在进入混合器之前彼此不接触。然后将GalNAc-LNP与稀释缓冲液混合，并进行保持时间和缓冲液交换。在过程4中，GalNAc-脂质全部或至少部分包括在进入混合器的含有脂质赋形剂的流中。然后如果有的话，可以通过如过程3中所述的连续在线混合器包括其余的GalNAc-脂质(使得实现与其他脂质相比所需的目标最终mol％)，或者可以在过程的稍后时间点添加。
如图10-14所示，特定方案可以与还详述那些过程的特定方面的前述过程中的每一个一起使用。图10示出了方案1-3，其可以与图9的过程结合使用，以生成GalNAc-LNP，由此将水性缓冲液中的核酸通过一个(或多个)通道送至混合器中，并且将脂质组分(包括但不限于：氨基脂质、辅助脂质、结构或甾醇脂质以及隐形脂质)通过单独的一个或多个通道送至混合器中。应理解，RNA有效负载和LNP赋形剂的两个流通过单独的通道进入混合器，并在混合器内混合；它们在进入混合器之前彼此不接触。然后混合的溶液离开混合器。方案1、2和3是过程1的形式，其区别仅在于在哪个阶段经由后添加来添加GalNAc-脂质。
图11示出了方案4-6，其可以与图9的过程结合使用，以生成GalNAc-LNP，由此将水性缓冲液中的核酸通过一个(或多个)通道送至混合器中，并且将脂质组分(包括但不限于：氨基脂质、辅助脂质、结构或甾醇脂质以及隐形脂质)通过单独的一个或多个通道送至混合器中。应理解，RNA有效负载和LNP赋形剂的两个流通过单独的通道进入混合器，并在混合器内混合；它们在进入混合器之前彼此不接触。然后混合的溶液离开混合器。方案4是图9中过程1的形式，其中在浓缩之后添加GalNAc-脂质。方案5利用图9中的过程2，其中GalNAc-脂质包含在收集容器中的静态稀释缓冲液中。方案6利用过程1，其中在浓缩、过滤和储存之后添加GalNAc-脂质。
图12示出了方案7-9，其可以与图9的过程结合使用，以生成GalNAc-LNP，由此将水性缓冲液中的核酸通过一个(或多个)通道送至混合器中，并且将脂质组分(包括但不限于：氨基脂质、辅助脂质、结构或甾醇脂质、隐形脂质以及GalNAc-脂质的至少一部分)通过单独的一个或多个通道送至混合器中。应理解，RNA有效负载和LNP赋形剂的两个流通过单独的通道进入混合器，并在混合器内混合；它们在进入混合器之前彼此不接触。然后混合的溶液离开混合器。该图表明离开混合物的流进入至稀释缓冲液中。这应理解为是指该流与收集容器中的静态稀释缓冲液接触或进入非常短长度的管，该管将流输送至连续在线混合器中，其中来自第一混合器的流与稀释缓冲液在该连续混合器中在线混合。方案7利用来自图9的过程4，以生成GalNAc-LNP。在此，GalNAc-脂质完全包括在进入混合器的其他脂质的混合物中。在以上述方式中的一种离开和接触稀释缓冲液之前，单独的核酸水性流和脂质流在混合器内混合。方案8利用来自图9的过程4的形式，以生成GalNAc-LNP。在此，GalNAc-脂质包括在进入混合器的其他脂质的混合物中以及稀释缓冲液中，其可以以上述两种方式中的任一种包括在方案中。方案9利用来自图9的过程4的形式，以生成GalNAc-LNP。在此，GalNAc-脂质包括在进入混合器的其他脂质的混合物中，并且在该过程的稍后时间点(在这种情况下，在将稀释缓冲液以上述任一种方式引入至GalNAc-LNP之后)添加至GalNAc-LNP，并且在完成GalNAc-脂质添加和缓冲液交换后的另一保持时间之前，它们完成保持时间。
图13示出了方案10和11，其可以与图9的过程结合使用，以生成GalNAc-LNP，由此将水性缓冲液中的核酸通过一个(或多个)通道送至混合器中，并且将脂质组分(包括但不限于：氨基脂质、辅助脂质、结构或甾醇脂质、隐形脂质以及GalNAc-脂质的至少一部分)通过单独的一个或多个通道送至混合器中。应理解，RNA有效负载和LNP赋形剂的两个流通过单独的通道进入混合器，并在混合器内混合；它们在进入混合器之前彼此不接触。然后混合的溶液离开混合器。该图表明离开混合物的流进入至稀释缓冲液中。这应理解为是指该流与收集容器中的静态稀释缓冲液接触或进入非常短长度的管，该管将流输送至连续在线混合器中，其中来自第一混合器的流与稀释缓冲液在该连续混合器中在线混合。方案10利用来自图9的过程4的形式，以生成GalNAc-LNP。在此，GalNAc-脂质包括在进入混合器的其他脂质的混合物中，并且在该过程的稍后时间点(在这种情况下，在缓冲液交换之后)添加至GalNAc-LNP。方案11利用来自图9的过程4的形式，以生成GalNAc-LNP。在此，GalNAc-脂质包括在进入混合器的其他脂质的混合物中，并且也存在(可能没有或可能具有其他脂质组分的一部分)于稀释缓冲液中。稀释缓冲液应理解为以上述方式中的任一种接触GalNAc-LNP。
图14示出了方案12和13，其可以与图9的过程结合使用，以生成GalNAc-LNP，由此将水性缓冲液中的核酸通过一个(或多个)通道送至混合器中，并且将脂质组分(包括但不限于：氨基脂质、辅助脂质、结构或甾醇脂质、隐形脂质以及GalNAc-脂质的至少一部分)通过单独的一个或多个通道送至混合器中。应理解，RNA有效负载和LNP赋形剂的两个流通过单独的通道进入混合器，并在混合器内混合；它们在进入混合器之前彼此不接触。然后，混合的溶液离开混合器并进入非常短长度的管，该管将流输送至连续在线混合器中，其中来自第一混合器的流与含有GalNAc-脂质的稀释缓冲液在该连续混合器中在线混合。方案12利用图9中的过程3，以生成GalNAc-LNP。在此，GalNAc-脂质中的一些或没有GalNAc-脂质与进入第一T型混合器的其他脂质一起包括在流中。应理解，方案12所描绘的方案可以在具有或不具有进入第一混合器的其他脂质的流中的GalNAc-脂质的情况下进行。然后将离开第一T型混合器的流经由非常短长度的管输送至另一连续T型混合器中，在那里它与含有GalNAc-脂质的稀释缓冲液混合。方案13利用图9中的过程3，以生成GalNAc-LNP。在此，GalNAc-脂质中的一些或没有GalNAc-脂质与进入第一交叉混合器的其他脂质一起包括在流中。应理解，方案13所描绘的方案可以在具有或不具有进入第一混合器的其他脂质的流中的GalNAc-脂质的情况下进行。然后将离开第一交叉混合器的流经由非常短长度的管输送至连续T型混合器中，在那里它与含有GalNAc-脂质的稀释缓冲液在线混合。
实施例41.示例性RNA GalNAc缀合物的制备
例如，RNA-GalNAc缀合物2-1通过序列(SEQ ID No 8)5’端带有共价缀合的GalNAc配体的13聚体寡聚(2’-O-甲氧基尿苷)与RNA(SEQ ID No 7，表2)3’端的聚(A)尾的杂交来制备。在缀合物2-2中，GalNAc配体与寡聚(2’-O-甲氧基尿苷)(SEQ ID No 10)的3’端共价连接，该寡聚(2’-O-甲氧基尿苷)与RNA(SEQ ID No 8)的聚(A)杂交。在RNA-GalNAc缀合物2-3中，SEQ ID No 11的聚(A)尾与寡聚(2’-O-甲氧基尿苷)(SEQ ID No 12)杂交，该寡聚(2’-O-甲氧基尿苷)在寡核苷酸的两端携带GalNAc配体。为了制备RNA-GalNAc缀合物2-4、2-5和2-6，将寡聚(2’-O-甲氧基尿苷)长度增加至24聚体。如表2中所述，RNA-GalNAc缀合物2-7至2-30通过用尿苷(U)或胸苷(T)部分或完全取代2’-O甲氧基尿苷(u)来制备。如J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958-16961中所述，在固相寡核苷酸合成和脱保护下，使用GalNAc配体单体37和38(例如，方案3)制备GalNAc缀合的寡核苷酸8-10和12-36。
本说明书中提及的所有专利和出版物通过引用并入本文，其程度如同每个独立的专利和出版物被明确且单独地表明通过引用并入。
其他实施方案
从前述描述中，显而易见的是，可以对本文所述的公开内容进行变化和修改，以将其用于各种用途和条件。这样的实施方案也在以下权利要求的范围内。
本文变量的任何定义中的要素列表的列举包括该变量作为所列要素的任何单个要素或组合(或子组合)的定义。本文实施方案的列举包括作为任何单个实施方案、实施方案的任何部分或与任何其他实施方案或其任何部分组合的实施方案。
如本文所阐述的，应理解，本发明包括靶向部分结构、GalNac缀合物偶联序列、指导RNA Galnac缀合物设计、包括接头及其其他组分的GalNac缀合物结构、GalNac缀合的脂质、gRNA设计及其修饰、脂质组合物、脂质赋形剂制剂、具有和不具有活性药剂有效负载(包括但不限于RNA)的脂质纳米颗粒组合物、由用作配体以促进活性药剂在受体缺陷型细胞和哺乳动物中的转染和功效的GalNAc-脂质组成的脂质纳米颗粒的具体实施方案和实施例；以及描述前述单独和组合的合成、制造、用途和功效的具体实施例和实施方案，包括作为药物组合物用于治疗疾病以及用于在缺乏ApoE的条件下将活性药剂体内和体外递送至哺乳动物细胞和/或递送至这种LDL受体缺陷型哺乳动物细胞。
虽然已经提供了具体实施例和许多实施方案来说明前述的方面和方面的组合，但应理解和明白，示例性或公开的实施方案的任何方面或其组合可以从其中排除，以构成另一实施方案而非限制，并且预期任何这种实施方案可以构成单独和独立的权利要求。相似地，应理解和明白，一个或多个实施方案的任何方面或方面的组合也可以包括在一个或多个实施方案的任何方面或方面的组合中，或者与一个或多个实施例的任何方面或方面的组合组合，并且本文预期其所有这种组合落入本发明的范围内，并可以作为单独和独立的权利要求存在而无限制。因此，应理解，存在于一项权利要求中的任何特征可以包括在另一项权利要求中；存在于一项权利要求中的任何特征可以从该权利要求中去除，以构成没有该特征的权利要求；并且存在于一项权利要求中的任何特征可以与另一项权利要求中的任何特征组合，其中的每一项特征都在本文中被预期。以下列举的条款是前述实施方案和实施例的方面和方面的组合的进一步说明性实例：
1.一种受体靶向缀合物，其包含式(V)的化合物：
其中，
A为受体靶向部分；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、
-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-或-N(OR1)-；
L11为-(CH2CH2O)n-或-(OCH2CH2)n-；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R为亲脂性有机残基；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
2.根据条款1的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基。
3.根据条款2的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C2-C6亚烷基。
4.根据条款2的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自为C4亚烷基。
5.根据条款1-4中任一项的受体靶向缀合物，其中L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-或-C(＝O)NR1C(＝O)-。
6.根据条款1-5中任一项的受体靶向缀合物，其中L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-或-NR1C(＝O)-。
7.根据条款6的受体靶向缀合物，其中L2、L5和L8各自为-C(＝O)NH-。
8.根据条款1-7中任一项的受体靶向缀合物，其中L3、L6和L9各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基。
9.根据条款8的受体靶向缀合物，其中每个L3为取代或未取代的C2-C6亚烷基。
10.根据条款8的受体靶向缀合物，其中L3为C4亚烷基。
11.根据条款1-10中任一项的受体靶向缀合物，其中L6和L9各自独立地为取代或未取代的C2-C10亚烷基。
12.根据条款11的受体靶向缀合物，其中L6和L9各自独立地为取代或未取代的C2-C6亚烷基。
13.根据条款11的受体靶向缀合物，其中L6和L9各自为C3亚烷基。
14.一种受体靶向缀合物，其包含式(VI)的化合物：
其中，
A为受体靶向部分；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-或-N(OR1)-；
L11为-(CH2CH2O)n-或-(OCH2CH2)n-；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R为亲脂性有机残基；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
15.根据条款14的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基，或者取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
16.根据条款14或15的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
17.根据条款16的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自独立地为包含1-10个O原子的取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
18.根据条款17的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自独立地为-(CH2CH2O)p1-(CH2)q1-；其中p1为1-8；并且q1为1-6。
19.根据条款18的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自为-(CH2CH2O)3-(CH2)2-。
20.根据条款14或15的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基。
21.根据条款20的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自独立地为取代或未取代的C2-C6亚烷基。
22.根据条款21的受体靶向缀合物，其中L1、L4和L7各自为C4亚烷基。
23.根据条款14-22中任一项的受体靶向缀合物，其中L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-或-C(＝O)NR1C(＝O)-。
24.根据条款23的受体靶向缀合物，其中L2、L5和L8各自独立地为-C(＝O)NR1-或-NR1C(＝O)-。
25.根据条款24的受体靶向缀合物，其中L2、L5和L8各自为-NHC(＝O)-。
26.根据条款24的受体靶向缀合物，其中L2、L5和L8各自为-C(＝O)NH-。
27.根据条款14-26中任一项的受体靶向缀合物，其中L3、L6和L9各自独立地为取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
28.根据条款27的受体靶向缀合物，其中L3、L6和L9各自独立地为包含1-10个O原子的取代或未取代的C1-C12杂亚烷基。
29.根据条款27或28的受体靶向缀合物，其中L3、L6和L9各自独立地为-(CH2CH2O)p2-(CH2CH2CH2O)q2-；其中p2为1-8；并且q2为1-6。
30.根据条款29的受体靶向缀合物，其中L3、L6和L9各自为-(CH2CH2O)-(CH2CH2CH2O)-。
31.根据条款14-26中任一项的受体靶向缀合物，其中L3、L6和L9各自独立地为-(CH2CH2CH2O)q3-；其中q3为1-8。
32.根据条款31的受体靶向缀合物，其中L3、L6和L9各自为-(CH2CH2CH2O)2-。
33.根据条款1-32中任一项的受体靶向缀合物，其中L10为取代或未取代的C1-C12亚烷基。
34.根据条款33的受体靶向缀合物，其中L10为取代或未取代的C1-C4亚烷基。
35.根据条款34的受体靶向缀合物，其中L10为C2亚烷基。
36.根据条款1-35中任一项的受体靶向缀合物，其中L11为-(OCH2CH2)n-。
37.根据条款36的受体靶向缀合物，其中n为1-100。
38.根据条款37的受体靶向缀合物，其中n为2-50。
39.根据条款38的受体靶向缀合物，其中n为2、12、37或45。
40.根据条款1-39中任一项的受体靶向缀合物，其中L12为-O-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-或-NR1C(＝O)O-。
41.根据条款40的受体靶向缀合物，其中L12为-C(＝O)O-或-NR1C(＝O)O-。
42.根据条款40的受体靶向缀合物，其中L12为-C(＝O)O-。
43.根据条款40的受体靶向缀合物，其中L12为-NHC(＝O)O-。
44.根据条款40的受体靶向缀合物，其中L12为-NHC(＝O)-。
45.根据条款1-44中任一项的受体靶向缀合物，其中A结合至凝集素。
46.根据条款45的受体靶向缀合物，其中凝集素是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
47.根据条款1-44中任一项的受体靶向缀合物，其中A为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物。
48.根据条款1-44中任一项的受体靶向缀合物，其中A为
49.根据条款1-48中任一项的受体靶向缀合物，其中每个R1独立地为H或-CH3。
50.根据条款1-49中任一项的受体靶向缀合物，其中每个R1为H。
51.根据条款1-50中任一项的受体靶向缀合物，其中亲脂性有机残基包括脂肪醇、脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮、甾醇脂质和异戊烯醇脂质中的一种或多种。
52.根据条款1-51中任一项的受体靶向缀合物，其中亲脂性有机残基包含一种或多种脂肪醇。
53.根据条款52的受体靶向缀合物，其中每种脂肪醇独立地为饱和、单不饱和或多不饱和脂肪醇。
54.根据条款52或53的受体靶向缀合物，其中脂肪醇包含一种或多种C2-C26脂肪醇。
55.根据条款52-54中任一项的受体靶向缀合物，其中脂肪醇包含两种或更多种C2-C26脂肪醇。
56.根据条款52-54中任一项的受体靶向缀合物，其中每种脂肪醇是C12、C14、C16、C18、C20或C22脂肪醇。
57.根据条款52-54中任一项的受体靶向缀合物，其中每种脂肪醇独立地为二十二碳六烯醇、二十碳五烯醇、油醇、硬脂醇、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基醇、(Z)-二十二碳-13-烯-1-基醇、二十二烷醇、(E)-十八碳-9-烯-1-基醇、二十碳烷醇、(9Z,12Z,15Z)-十八碳-9,12,15-三烯-1-基醇或棕榈醇。
58.根据条款52-54中任一项的受体靶向缀合物，其中每种脂肪醇是硬脂醇。
59.根据条款1-50中任一项的受体靶向缀合物，其中亲脂性有机残基包含一种或多种甾醇脂质。
60.根据条款1-49中任一项的受体靶向缀合物，其中亲脂性有机残基包含维生素中的一种或多种。
61.根据条款1-49或60中任一项的受体靶向缀合物，其中每种维生素独立地为维生素A、维生素D、维生素E或维生素K。
62.一种受体靶向缀合物，其包含来自表4的化合物。
63.一种纳米颗粒组合物，其包含：
a.一种或多种核酸分子实体；以及
b.前述条款中任一项的受体靶向缀合物。
64.根据条款63的纳米颗粒组合物，其中受体靶向缀合物占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.001mol％至约20mol％。
65.根据条款63的纳米颗粒组合物，其中受体靶向缀合物占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.01mol％至约1mol％。
66.根据条款63至65中任一项的纳米颗粒组合物，其还包含甾醇或其衍生物，该甾醇或其衍生物占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的10mol％至70mol％。
67.根据条款66的纳米颗粒组合物，其中甾醇或其衍生物是胆固醇或胆固醇衍生物。
68.根据条款67的纳米颗粒组合物，其中胆固醇或胆固醇衍生物占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至50mol％。
69.根据条款63至68中任一项的纳米颗粒组合物，其还包含磷脂，该磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的1mol％至20mol％。
70.根据条款69的纳米颗粒组合物，其中磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约5mol％至约15mol％。
71.根据条款69或70的纳米颗粒组合物，其中磷脂选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、2-油酰-1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和鞘磷脂。
72.根据条款69或70的纳米颗粒组合物，其中磷脂是DSPC。
73.根据条款63至72中任一项的纳米颗粒组合物，其还包含隐形脂质，该隐形脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的0.1mol％至6mol％。
74.根据条款73的纳米颗粒组合物，其中隐形脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约2.0mol％至约2.5mol％。
75.根据条款73或74的纳米颗粒组合物，其中隐形脂质是数均分子量为约200Da至约5000Da的PEG-脂质。
76.根据条款63至75中任一项的纳米颗粒组合物，其还包含氨基脂质，该氨基脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约10mol％至约60mol％。
77.根据条款63至76中任一项的纳米颗粒组合物，其中纳米颗粒组合物包含抗氧化剂。
78.根据条款77的纳米颗粒组合物，其中抗氧化剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)。
79.根据条款63至78中任一项的纳米颗粒组合物，其中一种或多种核酸分子实体包含靶向肝细胞中产生的致病目的基因的单指导RNA(sgRNA)或指导RNA(gRNA)。
80.根据条款63至78中任一项的纳米颗粒组合物，其中一种或多种核酸分子实体包含编码Cas核酸酶的mRNA。
81.根据条款63至80中任一项的纳米颗粒组合物，其中一种或多种核酸分子实体中的至少一种包含化学修饰。
82.根据条款81的纳米颗粒组合物，其中化学修饰是2’-F修饰、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、4’-O-甲基或2’-ara-F修饰。
83.根据条款81的纳米颗粒组合物，其中化学修饰是2’-O-甲基修饰。
84.一种药物组合物，其包含条款1至62的受体靶向缀合物或条款63至83中任一项的纳米颗粒组合物，以及赋形剂或载体。
85.根据条款84的药物组合物，其中药物组合物包含编码基因编辑器核酸酶的mRNA。
86.根据条款84或85的药物组合物，其中药物组合物包含一种或多种指导RNA分子。
87.根据条款84或85的药物组合物，其中所述药物组合物包含两种或更多种指导RNA分子。
88.根据条款87的药物组合物，其中所述两种或更多种指导RNA分子靶向两个或更多个目的基因。
89.根据条款84至88中任一项的药物组合物，其中mRNA编码Cas9核酸酶。
90.根据条款84至88中任一项的药物组合物，其中mRNA编码碱基编辑器核酸酶。
91.根据条款86至90中任一项的药物组合物，其中mRNA和一种或多种指导RNA分子存在于同一纳米颗粒组合物中。
92.根据条款86至90中任一项的药物组合物，其中mRNA和一种或多种指导RNA分子存在于不同的纳米颗粒组合物中。
93.根据条款86至92中任一项的药物组合物，其中药物组合物中gRNA分子与mRNA的比为按重量计或按摩尔计约0.01至约100。
94.根据条款93的药物组合物，其中所述药物组合物中所述gRNA分子与所述mRNA的比为按重量计或按摩尔计约50∶1、约40∶1、约30∶1、约20∶1、约18∶1、约16∶1、约14∶1、约12∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10。
95.一种药物组合物，其包含：
a.条款1-62中任一项的第一受体靶向缀合物或条款63-83中任一项的第一纳米颗粒组合物，以及
b.条款1-62中任一项的第二受体靶向缀合物或条款63-83中任一项的第二纳米颗粒组合物。
96.根据条款95的药物组合物，其中所述第一纳米颗粒组合物包含基因编辑器mRNA。
97.根据条款95或96的药物组合物，其中所述第二纳米颗粒组合物包含一种或多种指导RNA分子。
98.根据条款95至97中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物中指导RNA分子与mRNA的比为按重量计或按摩尔计约50∶1、约40∶1、约30∶1、约20∶1、约18∶1、约16∶1、约14∶1、约12∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10。
99.一种将核酸递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与条款63-83中任一项的纳米颗粒组合物或条款84-98中任一项的药物组合物接触，由此将核酸递送至所述细胞。
100.根据条款99的方法，其中使所述细胞在体内、离体或体外接触。
101.一种在细胞中产生目的多肽的方法，该方法包括使所述细胞与条款63-83中任一项的纳米颗粒组合物或条款84-98中任一项的药物组合物接触，由此核酸能够在所述细胞中翻译，以产生多肽。
102.一种治疗对象的疾病或病况的方法，该方法包括向对象施用治疗有效量的条款84-98中任一项的药物组合物。
103.根据条款102的方法，其中疾病或病况是冠状动脉疾病。
104.根据条款102或103的方法，其中对象是低密度脂蛋白受体(LDLR)缺陷型的。
105.一种将核酸分子实体递送至对象肝脏的方法，该方法包括向对象施用条款84至98中任一项的药物组合物，从而递送核酸分子实体。
106.一种核苷酸缀合物，其包含：
(a)核酸，以及
(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，其中靶向部分包含表1的结构。
107.根据条款106的核苷酸缀合物，其中靶向部分还包含与(a)中的核酸杂交的偶联序列。
108.一种核苷酸缀合物，其包含：
(a)核酸，以及
(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，其中靶向部分包含与(a)中的核酸杂交的偶联序列。
109.根据条款106-108中任一项的核苷酸缀合物，其中核酸包括单链、双链、部分双链或发夹茎环核酸，并且其中靶向部分是受体靶向部分。
110.根据条款106-109中任一项的核苷酸缀合物，其中靶向部分结合至凝集素。
111.根据条款110的核苷酸缀合物，其中凝集素是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
112.根据条款111的核苷酸缀合物，其中靶向部分包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。
113.根据条款106-112中任一项的核苷酸缀合物，其中靶向部分包含间隔区。
114.根据条款113的核苷酸缀合物，其中间隔区包括聚乙二醇、取代或未取代的C1-C12亚烷基或两者，其中聚乙二醇具有1至5个重复单元。
115.根据条款106-114中任一项的核苷酸缀合物，其中靶向部分通过一个或多个接头与核酸的一条或多条链连接。
116.根据条款108-115中任一项的核苷酸缀合物，其中靶向部分包含表1的结构。
117.根据条款107-116中任一项的核苷酸缀合物，其中偶联序列与(a)中的核酸杂交。
118.根据条款117的核苷酸缀合物，其中偶联序列与(a)中的核酸的延伸部分杂交。
119.根据条款106-118中任一项的核苷酸缀合物，其中靶向部分附接至核酸序列的5’端、核酸序列的3’端或核酸序列的中间。
120.根据条款106-119中任一项的核苷酸缀合物，其中靶向部分包含至少两个GalNAc或GalNAc衍生物。
121.根据条款106-120中任一项的核苷酸缀合物，其中靶向部分包含至少三个GalNAc或GalNAc衍生物。
122.根据条款114-121中任一项的核苷酸缀合物，其中GalNAc或GalNAc衍生物经由靶向部分中的接头、经由与(a)中的核酸杂交的靶向部分中偶联序列的杂交，或经由其组合与(a)中的核酸连接。
123.根据条款107-122中任一项的核苷酸缀合物，其中靶向部分包含至少两个与(a)中的核酸杂交的偶联序列。
124.根据条款123的核苷酸缀合物，其中至少两个偶联序列相同。
125.根据条款123的核苷酸缀合物，其中至少两个偶联序列不同。
126.根据条款106-125中任一项的核苷酸缀合物，其还包含第二靶向部分。
127.根据条款126的核苷酸缀合物，其中第二靶向部分结合至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
128.根据条款127的核苷酸缀合物，其中第二靶向部分通过间隔区和/或通过一个或多个接头与核酸的一条或多条链连接。
129.根据条款128的核苷酸缀合物，其中第二靶向部分包含GalNAc或GalNAc衍生物。
130.根据条款129的核苷酸缀合物，其中第二靶向部分包含至少三个GalNAc或GalNAc衍生物。
131.根据条款129或130的核苷酸缀合物，其中GalNAc或GalNAc衍生物经由靶向部分中的接头、经由与(a)中的核酸杂交的靶向部分中偶联序列的杂交，或经由其组合与(a)中的核酸连接。
132.根据条款126-131中任一项的核苷酸缀合物，其中第二靶向部分包含表1的结构。
133.根据条款126-132中任一项的核苷酸缀合物，其中第二靶向部分包含与核酸杂交的偶联序列。
134.根据条款126-133中任一项的核苷酸缀合物，其中第二靶向部分附接至核酸的5’端、核酸的3’端或核酸的中间。
135.根据条款106-134中任一项的核苷酸缀合物，其中(a)中的核酸包含RNA或DNA。
136.根据条款107-135中任一项的核苷酸缀合物，其中偶联序列包含RNA、DNA、化学修饰的RNA、化学修饰的DNA、或DNA和RNA的杂交体。
137.根据条款107-136中任一项的核苷酸缀合物，其中偶联序列包含(a)、(c)、(g)、(u)、(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n中的一个或多个，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，其中c为2’-O-甲基胞苷(2’-OMe-C)，其中g为2’-O-甲基胞苷鸟嘌呤(2’-OMe-G)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。
138.根据条款107-137中任一项的核苷酸缀合物，其中偶联序列包含(a)、(c)、(g)、(u)、(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n中的一个或多个，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，其中c为2’-O-甲基胞苷(2’-OMe-C)，其中g为2’-O-甲基胞苷鸟嘌呤(2’-OMe-G)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。
139.根据条款137或138的核苷酸缀合物，其中(a)、(c)、(g)或(u)沿着核酸或偶联序列分散。
140.根据条款137-139中任一项的核苷酸缀合物，其中核酸和偶联序列在杂交双链体内包含一个或多个G-C碱基配对，其中偶联序列与核酸杂交，并且其中所述一个或多个G-C碱基配对提高了杂交双链体的稳定性。
141.根据条款115-140中任一项的核苷酸缀合物，其中接头包括共价接头。
142.根据条款115-140中任一项的核苷酸缀合物，其中接头包括非共价接头。
143.根据条款115-142中任一项的核苷酸缀合物，其中接头包括单价接头、二价接头、三价接头或其组合。
144.根据条款115-143中任一项的核苷酸缀合物，其中接头包括可生物切割的接头。
145.根据条款115-143中任一项的核苷酸缀合物，其中接头包括不可生物切割的接头。
146.根据条款142的核苷酸缀合物，其中接头包括磷酸酯、硫代磷酸酯、酰胺、醚、肟、肼或氨基甲酸酯。
147.根据条款146的核苷酸缀合物，其中接头是磷酸酯或硫代磷酸酯。
148.根据条款106-147中任一项的核苷酸缀合物，其中(a)中的核酸包含化学修饰。
149.根据条款148的核苷酸缀合物，其中(a)中的核酸包含2’-F修饰、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、4’-O-甲基或2’-ara-F修饰。
150.根据条款149的核苷酸缀合物，其中核酸包含2’-O-甲基修饰。
151.根据条款149的核苷酸缀合物，其中核酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
152.根据条款106-151中任一项的核苷酸缀合物，其中核酸能够与基因组的靶基因内的靶序列杂交。
153.根据条款152的核苷酸缀合物，其中核酸包括mRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、微小RNA、抗微小RNA或antimir、supermir、antagomir、核酶、三链体形成寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、免疫刺激性寡核苷酸、RNA激活剂、U1衔接子、指导RNA或其任何组合。
154.根据条款153的核苷酸缀合物，其中核酸编码蛋白质。
155.根据条款154的核苷酸缀合物，其中核酸是CRISPR酶。
156.根据条款153的核苷酸缀合物，其中核酸是能够与CRISPR酶形成复合体的指导RNA。
157.根据条款156的核苷酸缀合物，其中指导RNA是单指导RNA或双指导RNA。
158.根据条款157的核苷酸缀合物，其中CRISPR酶选自Cas9、Cpf1、CasX、CasY、C2c1、C2c3以及碱基编辑器融合蛋白。
159.根据条款158中任一项的核苷酸缀合物，其中核酸还包括编码CRISPR酶的mRNA。
160.根据条款159的核苷酸缀合物，其中CRISPR酶导致靶序列的改变。
161.根据条款152-160中任一项的核苷酸缀合物，其中靶基因参与脂质代谢途径。
162.根据条款161的核苷酸缀合物，其中靶基因选自PCSK9、ANGPTL3、APOC3、LPA、APOB、MTP、ANGPTL4、ANGPTL8、APOA5、APOE、LDLR、IDOL、NPC1L1、ASGR1、TM6SF2、GALNT2、GCKR、LPL、MLXIPL、SORT1、TRIB1、MARC1、ABCG5和ABCG8。
163.一种颗粒，其包含核苷酸缀合物和条款155-162中任一项的CRISPR酶。
164.根据条款163的颗粒，其中颗粒是脂质纳米颗粒、脂质体、无机纳米颗粒或RNP。
165.一种细胞，其包含条款106-162中任一项的核苷酸缀合物。
166.根据条款165的细胞，其中细胞是原核细胞、真核细胞、脊椎动物细胞、小鼠细胞、非人灵长类动物细胞或人类细胞。
167.一种药物组合物，其包含条款106-162中任一项的核苷酸缀合物、条款163或164的颗粒或者条款165或166的细胞。
168.根据条款167的药物组合物，其还包含药学上可接受的佐剂、稀释剂、载体、防腐剂、赋形剂、缓冲液、稳定剂或其组合。
169.根据条款168的药物组合物，其中载体包括溶剂、分散介质、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、脂质、类脂质、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物或其组合。
170.一种试剂盒，其包含条款106-162中任一项的核苷酸缀合物。
171.一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用有效量的条款106-162中任一项的核苷酸缀合物。
172.一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含
(a)核酸，以及
(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，其中靶向部分包含表1的结构。
173.一种将核酸递送至对象肝脏的方法，该方法包括向对象施用与靶向部分连接的所述核酸，其中靶向部分包含表1的结构。
174.根据条款172或173的方法，其中靶向部分还包含与(a)中的核酸杂交的偶联序列。
175.一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含
(a)核酸，以及
(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，其中靶向部分包含与(a)中的核酸杂交的偶联序列。
176.一种将核酸递送至对象肝脏的方法，该方法包括向对象施用与靶向部分连接的所述核酸，其中靶向部分包含与核酸杂交的偶联序列。
177.根据条款172-176中任一项的方法，其中核酸包括单链、双链、部分双链或发夹茎环核酸，并且其中靶向部分是受体靶向部分。
178.根据条款172-177中任一项的方法，其中靶向部分结合至凝集素。
179.根据条款178的方法，其中凝集素是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
180.根据条款172-179中任一项的方法，其中靶向部分包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。
181.根据条款180的方法，其中靶向部分包含至少三个GalNAc或GalNAc衍生物。
182.根据条款172-181中任一项的方法，其中核酸包含(i)指导RNA和核酸酶mRNA，或(ii)与核酸酶RNP复合的指导RNA，并且其中指导RNA能够将核酸酶引导至靶基因中的靶序列。
183.根据条款182的方法，其中指导RNA包括单指导RNA或双指导RNA。
184.根据条款183的方法，其中核酸酶是CRISPR酶。
185.根据条款184的方法，其中CRISPR酶选自Cas9、Cpf1、CasX、CasY、C2c1、C2c3以及碱基编辑器融合蛋白。
186.根据条款185的方法，其中CRISPR酶导致靶序列的改变。
187.根据条款182-186中任一项的方法，其中施用导致对象肝脏中靶基因的表达减少。
188.根据条款186或187的方法，其中与对象的对照组织相比，对象肝脏中靶基因的表达减少了至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或大于99.99％。
189.根据条款182-188中任一项的方法，其中靶基因与冠状动脉疾病相关。
190.根据条款189的方法，其中靶基因选自PCSK9、ANGPTL3、APOC3、LPA、APOB、MTP、ANGPTL4、ANGPTL8、APOA5、APOE、LDLR、IDOL、NPC1L1、ASGR1、TM6SF2、GALNT2、GCKR、LPL、MLXIPL、SORT1、TRIB1、MARC1、ABCG5和ABCG8。
191.根据条款182-190中任一项的方法，其中指导RNA包括选自SEQ ID NO 1-23的序列。
192.根据条款174-191中任一项的方法，其中偶联序列包含RNA、DNA、化学修饰的RNA、化学修饰的DNA、或DNA和RNA的杂交体。
193.根据条款174-192中任一项的方法，其中偶联序列包含(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷(2’-OMe A)，并且其中u为2’-O-甲基尿苷(2’-OMe-U)。
194.根据条款172-193中任一项的方法，其中(a)中的核酸包含(A)n、(T)n、(U)n、(a)n或(u)n，其中n为不小于3的整数，其中a为2’-O-甲基腺苷，并且其中u为2’-O-甲基尿苷。
195.根据条款172-194中任一项的方法，其中靶向部分经由靶向部分中的接头、经由与(a)中的核酸杂交的靶向部分中偶联序列的杂交，或经由其组合与(a)中的核酸连接。
196.根据条款195的方法，其中接头包括共价接头。
197.根据条款196的方法，其中接头包括磷酸酯、硫代磷酸酯、酰胺、醚、肟、肼或氨基甲酸酯。
198.根据条款197的方法，其中接头是磷酸酯或硫代磷酸酯。
199.根据172-198中任一项的方法，其中(a)中的核酸包含化学修饰。
200.根据条款199的方法，其中(a)中的核酸包含2’-F修饰、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)或2’-ara-F修饰。
201.根据条款200的方法，其中核酸包含2’-O-甲基修饰。
202.根据条款201的方法，其中核酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
203.根据条款172-202中任一项的方法，其中在递送后至少1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、2天、1周、2周、3周、6周或8周，与对象的其他组织相比，对象肝脏中的核酸水平高至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍。
204.根据条款175-203中任一项的方法，其中有效量为约1mg/kg至约10mg/kg。
205.根据条款175-204的方法，其中施用导致有需要的对象的血液甘油三酯减少和/或低密度脂蛋白胆固醇减少。
206.根据条款175-205中任一项的方法，其中施用通过静脉内、鞘内、肌内、心室内、大脑内、小脑内、脑室内、实质内、皮下或其组合进行。
207.一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用药物组合物，该药物组合物包含
(a)(i)单指导RNA和核酸酶mRNA，(ii)双指导RNA和核酸酶mRNA，(iii)单指导RNA和RNP，或(iv)双指导RNA和RNP；以及
(b)与(a)中的核酸连接的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)靶向部分，
其中单指导RNA或双指导RNA包含4个或更多个2’-O-甲基修饰以及2个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中靶向部分包含表1的结构，并且其中指导RNA与PCSK9基因杂交。
208.一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用药物组合物，该药物组合物包含
(a)(i)单指导RNA和核酸酶mRNA，(ii)双指导RNA和核酸酶mRNA，(iii)单指导RNA和RNP，或(iv)双指导RNA和RNP；以及
(b)与(a)中的核酸连接的靶向部分，
其中单指导RNA或双指导RNA包含4个或更多个2’-O-甲基修饰以及两个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中靶向部分包含与(a)中的单指导RNA杂交的偶联序列，并且其中指导RNA与PCSK9基因杂交。
209.根据条款207或208的方法，其中核酸酶mRNA和/或单指导RNA包含至少一个化学修饰。
210.根据条款209的方法，其中化学修饰选自2’-F修饰、硫代磷酸酯核苷酸间键修饰、无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、4’-O-甲基和2’-ara-F修饰。
211.根据条款210的方法，其中与不含所述化学修饰的对照核酸缀合物相比，施用核酸缀合物导致免疫应答水平降低。
212.一种核苷酸缀合物，其包含式(IV)的结构
其中每个X独立地为H或保护基团，RA为-OX或-NHAc，Y为O或S，并且W表示
(a)(i)单指导RNA和核酸酶mRNA，(ii)双指导RNA和核酸酶mRNA，(iii)单指导RNA和RNP，或(iv)双指导RNA和RNP；或
(b)偶联序列。
213.根据条款212的核苷酸缀合物，其中一个或多个接头包含选自以下的结构：
214.根据条款212或213的核苷酸缀合物，其中接头中的每一个独立地具有-(L1)k1-(L2)k2-(L3)k3-(L4)k4-的结构，其中k1、k2、k3和k4中的每一个独立地为0、1或2，并且L1、L2、L3和L4中的每一个独立地选自-O-、-S-、S(＝O)1-2-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-NRL-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-NRLC(＝O)NRL-、-P(＝O)RL-、-NRLS(＝O)(＝NRL)-、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-N＝N-、-(CH2-CH2-O)1-6-、直链或支链C1-6亚烷基、直链或支链C2-6亚烯基、直链或支链C2-6亚炔基、C3-C8环亚烷基、C2-C7杂环亚烷基、C6-C10亚芳基和C5-C9杂亚芳基，其中亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基被取代或未被取代，并且其中每个RL独立地为H、D、氰基、卤素、取代或未取代的C1-C6烷基、-CD3、-OCH3、-OCD3、取代或未取代的C1-C6卤代烷基、取代或未取代的C1-C6杂烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C2-C7杂环烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，每个RL独立地为H、取代或未取代的C1-C6烷基、-OCH3、取代或未取代的C1-C6卤代烷基、取代或未取代的C1-C6杂烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基，或者取代或未取代的C2-C7杂环烷基。
215.根据条款212至214中任一项的核苷酸缀合物，其中k1、k2、k3和k4的总和为1、2或3。
216.一种制备包含纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，该方法包括：
a.提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；
b.提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；
c.混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；
d.将受体靶向缀合物与步骤(c)中产生的纳米颗粒混合；
e.孵育纳米颗粒；以及
f.任选地进行缓冲液交换过程。
217.根据条款216的方法，其中在(c)的混合步骤之后，将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合。
218.根据条款216的方法，其中将受体靶向缀合物添加在稀释缓冲液中，并且其中将稀释缓冲液与从在线混合(inline mixing)室出来的预形成的核酸-脂质纳米颗粒混合，从而形成纳米颗粒。
219.根据条款216的方法，其中在向混合物中添加稀释缓冲液并将稀释的混合物保持一段时间之后，引入受体靶向缀合物。
220.根据条款219的方法，其中保持时间为1至120分钟。
221.根据条款219的方法，其中保持时间为1至90分钟、1至60分钟或10至40分钟。
222.根据条款219的方法，其中保持时间为约30分钟。
223.根据条款216的方法，其中在缓冲液交换之后，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。
224.根据条款216的方法，其中在缓冲液交换和浓缩之后，但在储存之前，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。
225.根据条款216的方法，其中在储存和解冻之后且在给药或评估之前，将受体靶向缀合物引入至纳米颗粒。
226.一种制备包含纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，该方法包括：
a.提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；
b.提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；
c.在线混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；
d.在线混合受体靶向缀合物和步骤(c)的混合物，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体、一种或多种脂质以及受体靶向缀合物；
e.通过添加稀释缓冲液稀释步骤(d)的混合物；以及
f.任选地进行缓冲液交换过程。
227.根据条款226的方法，其中步骤(c)的在线混合和步骤(d)的在线混合依次进行。
228.一种制备包含纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，该方法包括：
a.提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；
b.提供包含(i)一种或多种脂质中的至少一种以及(ii)受体靶向缀合物的至少一部分的第二溶液；
c.混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物；
d.任选地孵育纳米颗粒；以及
e.任选地进行缓冲液交换过程。
229.根据条款228的方法，其中第二溶液包含所有受体靶向缀合物。
230.一种制备包含纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，该方法包括：
a.提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；
b.提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；
c.混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；
d.将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合，其中在混合步骤之前或同时，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合；
e.任选地孵育纳米颗粒；以及
f.任选地进行缓冲液交换过程。
231.根据条款230的方法，其中在混合步骤的同时，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合。
232.根据条款230的方法，其中在混合步骤之前，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合。
233.根据条款232的方法，其中将受体靶向缀合物与第二溶液中的一种或多种脂质组合。
234.根据条款228或230的方法，其中将受体靶向缀合物的一部分与第二溶液中的一种或多种脂质组合，并且在混合之后，将受体靶向缀合物的一部分与一种或多种脂质组合。
235.根据条款228或230的方法，其中将受体靶向缀合物的一部分与第二溶液中的一种或多种脂质组合，并且在孵育步骤之后，将受体靶向缀合物的一部分与一种或多种脂质组合。
236.根据条款228或230的方法，其中将受体靶向缀合物的一部分与第二溶液中的一种或多种脂质组合，并且在缓冲液交换步骤之后，将受体靶向缀合物的一部分与一种或多种脂质组合。
237.根据条款228或230中任一项的方法，其还包括通过添加稀释缓冲液来稀释通过混合第一溶液和第二溶液产生的混合物。
238.根据条款237的方法，其中混合物在线稀释。
239.根据条款237或238的方法，其中稀释缓冲液包含受体靶向缀合物的至少一部分。
240.根据条款237至239中任一项的方法，其中稀释缓冲液包含隐形脂质的至少一部分。
241.根据条款216至240中任一项的方法，其中第一溶液包含水性缓冲液。
242.根据条款216至241中任一项的方法，其中第二溶液包含乙醇。
243.根据条项216或228至242中任一项的方法，其中混合包括层流混合、涡流混合、湍流混合或其组合。
244.根据条款216或228至242中任一项的方法，其中混合包括交叉混合。
245.根据条款216或228至242中任一项的方法，其中混合包括在线混合。
246.根据条款216至242中任一项的方法，其中混合包括通过第一入口通道引入第一溶液的至少一部分以及通过第二入口通道引入第二溶液的至少一部分，并且其中第一入口通道和第二入口通道之间的角度为约15至180度。
247.根据条款246的方法，其中混合包括通过第三入口通道引入第一溶液的一部分。
248.根据条款216至247中任一项的方法，其中缓冲液交换包括透析、色谱或切向流过滤(TFF)。
249.根据条款216至248中任一项的方法，其还包括过滤步骤。
250.根据条款216至249中任一项的方法，其中受体靶向缀合物包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。
251.根据条款250的方法，其中受体靶向缀合物选自表4。
252.根据条款216至249中任一项的方法，其中条款1至62中任一项描述了受体靶向缀合物。
253.根据条款216至249中任一项的方法，其中纳米颗粒包含条款63-83中任一项的第一纳米颗粒组合物。
254.根据条款216至249中任一项的方法，其中制剂是条款84至98中任一项的药物组合物。
255.一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过条款216至253中任一项的方法制备。
256.一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过包括以下步骤的方法制备：
a.提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；
b.提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；
c.混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；
d.将受体靶向缀合物与步骤(c)中产生的纳米颗粒混合；
e.孵育纳米颗粒；以及
f.任选地进行缓冲液交换过程。
257.一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过包括以下步骤的方法制备：
a.提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；
b.提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；
c.混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；
d.将受体靶向缀合物与一种或多种脂质组合，其中在混合步骤之前或同时，将受体靶向缀合物的至少一部分与一种或多种脂质组合；
e.任选地孵育纳米颗粒；以及
f.任选地进行缓冲液交换过程。
258.一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过包括以下步骤的方法制备：
a.提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；
b.提供包含一种或多种脂质中的至少一种的第二溶液；
c.在线混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体以及一种或多种脂质；
d.在线混合受体靶向缀合物和步骤(c)的混合物，从而产生包含纳米颗粒的混合物，该纳米颗粒包含一种或多种核酸分子实体、一种或多种脂质以及受体靶向缀合物；
e.通过添加稀释缓冲液稀释步骤(d)的混合物；以及
f.任选地进行缓冲液交换过程。
259.一种药物组合物，其包含纳米颗粒，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)选自甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的一种或多种脂质，以及(iii)受体靶向缀合物，其中制剂通过包括以下步骤的方法制备：
a.提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液；
b.提供包含(i)一种或多种脂质中的至少一种以及(ii)受体靶向缀合物的至少一部分的第二溶液；
c.混合第一溶液和第二溶液，从而产生包含纳米颗粒的混合物；
d.任选地孵育纳米颗粒；以及
e.任选地进行缓冲液交换过程。
260.如上述条款中任一项提及的对象，其中对象具有杂合性家族性高胆固醇血症(HeFH)、纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH)或临床动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)。
261.如上述条款中任一项提及的对象，其中对象处于心血管事件的高风险中，并且尽管最大限度地耐受降脂疗法，但仍需要另外降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。
262.一种脂质纳米颗粒组合物，其包含：
a.一种或多种核酸分子实体；以及
b.如上述条款中任一项提及的受体靶向缀合物。
263.根据条款262的脂质纳米颗粒组合物，其中受体靶向缀合物占总脂质含量的约0.001mol％至约20mol％。
264.根据条款262的脂质纳米颗粒组合物，其中受体靶向缀合物占总脂质含量的约0.005mol％至约2mol％。
265.根据条款262的脂质纳米颗粒组合物，其中受体靶向缀合物占总脂质含量存在的约0.01mol％至约1.0mol％。
266.根据条款262的脂质纳米颗粒组合物，其中纳米颗粒组合物还包含氨基脂质、甾醇或其衍生物、磷脂以及PEG-脂质。
267.根据条款266的脂质纳米颗粒组合物，其中氨基脂质由1个或多个氨基脂质构成，并且总氨基脂质占总脂质含量的约10mol％至约70mol％。
268.根据条款266的脂质纳米颗粒组合物，其中氨基脂质占总脂质含量的约40mol％至约55mol％。
269.根据条款266的脂质纳米颗粒组合物，其中氨基脂质占总脂质含量的约45mol％至约50mol％。
270.根据条款266的脂质纳米颗粒组合物，其中甾醇或其衍生物占总脂质含量的约10mol％至约70mol％。
271.根据条款270的组合物的脂质纳米颗粒，其中甾醇或其衍生物是胆固醇。
272.根据条款266的脂质纳米颗粒组合物，其中磷脂占总脂质含量的约5mol％至约15mol％。
273.根据条款266的脂质纳米颗粒组合物，其中磷脂是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
274.根据条款266的脂质纳米颗粒组合物，其中隐形脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0mol％至约6mol％。
275.根据条款266的脂质纳米颗粒组合物，其中隐形脂质是数均分子量为约200Da至约5000Da的PEG-脂质。
276.根据条款275的脂质纳米颗粒组合物，其中PEG-脂质的数均分子量为约1500Da至约3000Da。
277.根据条款276的脂质纳米颗粒组合物，其包含：
a.约0.001mol％至约20mol％的前述条款中任一项的受体靶向缀合物；
b.约10mol％至约70mol％的一种或多种氨基脂质；
c.约10mol％至约70mol％的甾醇；
d.约3mol％至约15mol％的磷脂；以及
e.约0.1mol％至约6mol％的隐形脂质。
278.根据条款277的脂质纳米颗粒组合物，其中
a.靶向缀合物选自表4，并且占总脂质含量的0.001mol％至约4mol％；
b.氨基脂质占总脂质含量的约20mol％至70mol％；
c.甾醇是胆固醇，并且其占总脂质含量的约20mol％至约60mol％；
d.磷脂是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，并且占总脂质含量的约5mol％至约15mol％；以及
e.隐形脂质是数均分子量为约200Da至约5000Da的PEG-脂质，并且占约0mol％至约5mol％。
279.根据条款277的脂质纳米颗粒组合物，其中
a.靶向缀合物选自表4，并且占总脂质含量的0.001mol％至约2mol％；
b.氨基脂质占总脂质含量的约40mol％至70mol％；
c.甾醇是胆固醇，并且其占总脂质含量的约20mol％至约60mol％；以及
d.磷脂是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，并且占总脂质含量的约5mol％至约15mol％。
280.一种受体靶向缀合物，其包含式(V)的化合物：
其中，
多个A基团共同包含受体靶向配体；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12中的每一个独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-或-N(OR1)-；
L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-，或者取代或未取代的-(OCH2CH2)n-；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R包括或为脂质、核酸、氨基酸、蛋白质或脂质纳米颗粒；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
281.根据条款280的受体靶向缀合物，其中
a.多个A基团包含凝集素受体靶向配体；
b.L1、L3、L4和L7中的每一个包含-(CH2)4-；
c.L2、L5和L8中的每一个包含-C(＝O)NH-；
d.L6和L9中的每一个包含-(CH2)3-；
e.L10为-(CH2)1-3-、-CH2CH2O-或-CH2O-；
f.L11为-(CH2CH2O)n-或-(OCH2CH2)n-，其中n为选自1至50的整数；
g.L12为-NH(CO)O-；并且
h.R选自二烷基甘油、二酰基甘油、甾醇、包含C10-C30碳原子的正烷基、包含C10-C30碳原子的支链烷基或生育酚。
282.根据条款281的受体靶向缀合物，其中n为1-3、9-15、33-39或41-49。
283.根据条款281的受体靶向缀合物，其中凝集素受体是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，并且多个A基团包含N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或其组合。
284.根据条款280的受体靶向缀合物，其中A基团中的每一个为N-乙酰半乳糖胺
285.根据条款280的受体靶向缀合物，其中受体靶向缀合物是选自表4中的1001-1019、1060、1065、1066和1075-1085的缀合物。
286.根据条款280的受体靶向缀合物，其中受体靶向缀合物是
287.根据条款280的受体靶向缀合物，其中R包括脂肪醇、脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮或甾醇或其衍生物中的一种或多种。
288.根据条款280的受体靶向缀合物，其中R为脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒包含编码一种或多种基因编辑器核酸酶或碱基编辑器的一种或多种mRNA以及一种或多种指导RNA。
289.一种用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的方法，该方法包括向对象施用包封有效负载的脂质纳米颗粒，该有效负载包含一种或多种药学上的活性药剂，其中脂质纳米颗粒还包含式(V)的受体靶向缀合物：
其中，
多个A基团共同包含受体靶向配体；
L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10和L12中的每一个独立地为取代或未取代的C1-C12亚烷基、取代或未取代的C1-C12杂亚烷基、取代或未取代的C2-C12亚烯基、取代或未取代的C2-C12亚炔基、-(CH2CH2O)m-、-(OCH2CH2)m-、-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝N-OR1)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)C(＝O)-、-C(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)-、-OC(＝O)NR1-、-NR1C(＝O)O-、-NR1C(＝O)NR1-、-C(＝O)NR1C(＝O)-、-S(＝O)2NR1-、-NR1S(＝O)2-、-NR1-或-N(OR1)-；
L11为取代或未取代的-(CH2CH2O)n-，或者取代或未取代的-(OCH2CH2)n-；
每个R1独立地为H，或者取代或未取代的C1-C6烷基；
R包括或为脂质；
m为选自1至10的整数；并且
n为选自1至200的整数。
290.根据条款289的方法，其中
a.多个A基团包含凝集素受体靶向配体；
b.L1、L3、L4和L7中的每一个包含-(CH2)4-；
c.L2、L5和L8中的每一个包含-C(＝O)NH-；
d.L6和L9中的每一个包含-(CH2)3-；
e.L10为-(CH2)1-3-、-CH2CH2O-或-CH2O-；
f.L11为-(CH2CH2O)n-或-(OCH2CH2)n-，其中n为选自1至50的整数；
g.L12为-NH(CO)O-；并且
h.R选自二烷基甘油、二酰基甘油、甾醇、包含C10-C30碳原子的正烷基、包含C10-C30碳原子的支链烷基或生育酚。
291.根据条款289的方法，其中受体靶向缀合物是选自表4中的1001-1019、1060、1065、1066和1075-1085的缀合物。
292.根据条款289的方法，其中受体靶向缀合物是表4中的缀合物1004。
293.根据条款292的方法，其中包含受体靶向缀合物的脂质纳米颗粒在LDLr缺陷型哺乳动物中提供了改善的递送，如通过比不含受体靶向缀合物的相应脂质纳米颗粒高至少50％的编辑百分比确定的。
294.根据条款292的方法，其中包含受体靶向缀合物的脂质纳米颗粒在缺乏ApoE的哺乳动物中提供了改善的递送，如通过比不含受体靶向缀合物的相应脂质纳米颗粒高至少50％的编辑百分比确定的。
295.根据条款289的方法，其中一种或多种活性药剂包含编码基因编辑器核酸酶或碱基编辑器的mRNA以及一种或多种指导RNA。
296.根据条款295的方法，其中mRNA是腺苷碱基编辑器，并且一种或多种指导RNA与(i)PCSK9基因的区段、(ii)ANGPTL3基因的区段，或(i)和(ii)两者互补。
297.根据条款295的方法，其中一种或多种指导RNA中的至少一种选自表5的SEQID NO:121-126的指导RNA序列。
298.根据条款289的方法，其中受体靶向缀合物占脂质纳米颗粒中总赋形剂的约0.001mol％至约0.5mol％。
299.一种制备包含GalNAc-脂质纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸活性药剂，(ii)包含甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的脂质赋形剂，以及(iii)GalNAc-脂质受体靶向缀合物，该方法包括：
a.提供第一溶液，该第一溶液包含水性缓冲液中的一种或多种核酸活性药剂；
b.提供第二溶液，该第二溶液包含(i)脂质赋形剂以及(ii)水溶性有机溶剂(例如乙醇)中的受体靶向缀合物的至少一部分；
c.混合第一溶液和第二溶液；
d.孵育第一溶液和第二溶液的混合物，以形成GalNAc-脂质纳米颗粒；以及
e.任选地进行一种或多种稀释、缓冲液交换、浓缩、过滤和GalNAc-脂质纳米颗粒评估过程。
300.根据条款299的方法，其中GalNAc-脂质受体靶向缀合物选自表4中鉴定的结构。
301.根据条款299的方法，其中混合通过具有第一混合室的在线混合装置进行，第一混合室包括单独将第一溶液引入至第一混合室的第一端口以及单独并同时将第二溶液引入至第一混合室的第二端口。
302.根据条款301的方法，其还包括在混合第一溶液和第二溶液之后，添加受体靶向缀合物的第二部分，其中受体靶向缀合物的第二部分的添加被预溶解于水溶性有机溶剂中并与水性溶液合并，以形成水性稀释缓冲液，该水性稀释缓冲液在孵育前，在第二混合室中与先前混合的第一溶液和第二溶液混合，该第二混合室与在线混合装置的第一混合室相连并在第一混合室的下游。
303.根据条款302的方法，其还包括在添加受体靶向缀合物的第二部分之后的缓冲液交换过程。
304.一种制备包含GalNAc-脂质纳米颗粒的制剂的方法，其中纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)包含一种或多种甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质或氨基脂质的脂质赋形剂，以及(iii)一种或多种GalNAc-脂质受体靶向缀合物，该方法包括：
a.提供第一溶液，该第一溶液包含水性缓冲液中的一种或多种核酸分子实体；
b.提供第二溶液，该第二溶液包含水溶性有机溶剂中的一种或多种脂质赋形剂中的至少一种；
c.提供第三溶液，该第三溶液包含受体靶向缀合物的至少一部分；
d.在一个或多个混合室中混合第一溶液、第二溶液和第三溶液，其中经由入口将每种溶液单独引入至一个或多个混合室；
e.孵育第一溶液、第二溶液和第三溶液的混合物，以形成GalNAc-脂质纳米颗粒；以及
f.任选地进行一种或多种稀释、缓冲液交换、浓缩、过滤和GalNAc-脂质纳米颗粒评估过程。
305.根据条款304的方法，其中第一溶液包含水性缓冲液，并且其中第二溶液和第三溶液各自独立地由水溶性醇制备。
306.根据条款304的方法，其中将第一溶液、第二溶液和第三溶液同时引入至混合器。
307.根据条款304的方法，其中在孵育前，将第一溶液、第二溶液和第三溶液依次引入至混合器。
308.根据条款304的方法，其中第一溶液、第二溶液和第三溶液在具有与第二下游混合室相连的第一混合室的在线混合器装置中合并，其中第一溶液和第二溶液在第一混合室中预混合，并立即流入第二混合室，并且其中第三溶液在第二混合室中与第一溶液和第二溶液混合；并且其中第三溶液可以任选地包含预溶解于水溶性有机溶剂中的靶向缀合物和/或脂质赋形剂，水溶性有机溶剂混合在水性稀释缓冲液中或用水性稀释缓冲液稀释。
309.根据条款304的方法，其中水溶性有机溶剂是乙醇。
310.一种如前述条款中任一项提及的靶向部分或受体靶向缀合物，其中靶向部分或受体靶向缀合物具有表1中所示的结构。
311.一种如前述条款中任一项提及的GalNAc缀合物，其中GalNAc缀合物包含表2或表3中所示的序列。
312.一种如前述条款中任一项提及的受体靶向缀合物，其中受体靶向缀合物包含表4的结构。
313.一种如前述条款中任一项提及的指导RNA，其中指导RNA包含表5中所示的序列。
314.一种如前述条款中任一项提及的脂质赋形剂，其中脂质赋形剂包含表6或表7的结构。
315.一种如前述条款中任一项提及的脂质纳米颗粒，其中脂质纳米颗粒包含表8、表9、表10、表11、表12或表13的组合物。
通过审阅本发明还应理解，预期存在于一组条款中的一个或多个方面或特征也可以包括在其他条款中或与其他条款中的一个或多个方面或特征组合。
序列表
<110> 维乎医疗有限公司
<120> 用于靶向RNA递送的组合物和方法
<130> 53989-706.601
<140>
<141>
<150> 63/078,982
<151> 2020-09-16
<150> 62/984,866
<151> 2020-03-04
<160> 126
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 1362
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌
<400> 1
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His
115 120 125
Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser
130 135 140
Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
165 170 175
Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys
195 200 205
Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu
210 215 220
Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu
225 230 235 240
Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp
245 250 255
Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp
260 265 270
Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu
275 280 285
Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile
290 295 300
Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp
340 345 350
Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln
355 360 365
Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly
370 375 380
Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly
405 410 415
Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met
450 455 460
Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val
465 470 475 480
Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn
485 490 495
Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
500 505 510
Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr
515 520 525
Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys
530 535 540
Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val
545 550 555 560
Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser
565 570 575
Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr
580 585 590
Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn
595 600 605
Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu
610 615 620
Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His
625 630 635 640
Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr
645 650 655
Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys
660 665 670
Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala
675 680 685
Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys
690 695 700
Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His
705 710 715 720
Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile
725 730 735
Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg
740 745 750
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Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly
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Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn
785 790 795 800
Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly
805 810 815
Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp
820 825 830
Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser
835 840 845
Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser
850 855 860
Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp
865 870 875 880
Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn
885 890 895
Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly
900 905 910
Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val
915 920 925
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Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val
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Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn
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Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr
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Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly
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Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val
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Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn
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Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
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Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg
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Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360
<210> 2
<211> 4107
<212> DNA
<213> 酿脓链球菌
<400> 2
atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60
atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
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caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
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gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500
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gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740
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cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040
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gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280
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attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580
gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640
aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700
acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760
ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820
actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880
aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940
taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000
tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060
atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120
aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180
cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240
gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300
cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360
gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420
tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480
aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540
tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600
tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660
caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720
cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780
cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840
attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900
ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960
cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020
gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080
gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 猿猴病毒40
<400> 3
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
肽
<400> 4
Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val
1 5
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
核质蛋白二分NLS序列
<400> 5
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 6
<211> 1775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 6
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro
35 40 45
Ile Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser
180 185 190
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr
195 200 205
Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg
210 215 220
Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly
225 230 235 240
Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala
245 250 255
Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg
260 265 270
Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys
275 280 285
Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val
290 295 300
Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His
305 310 315 320
Tyr Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala
325 330 335
Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln
340 345 350
Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly
355 360 365
Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
370 375 380
Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys
385 390 395 400
Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val
405 410 415
Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly
420 425 430
Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu
435 440 445
Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala
450 455 460
Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu
465 470 475 480
Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg
485 490 495
Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His
500 505 510
Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr
515 520 525
Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys
530 535 540
Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe
545 550 555 560
Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp
565 570 575
Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe
580 585 590
Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu
595 600 605
Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln
610 615 620
Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu
625 630 635 640
Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu
645 650 655
Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp
660 665 670
Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala
675 680 685
Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val
690 695 700
Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg
705 710 715 720
Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg
725 730 735
Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys
740 745 750
Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe
755 760 765
Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu
770 775 780
Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr
785 790 795 800
Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His
805 810 815
Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn
820 825 830
Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val
835 840 845
Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys
850 855 860
Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys
865 870 875 880
Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys
885 890 895
Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu
900 905 910
Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu
915 920 925
Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile
930 935 940
Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu
945 950 955 960
Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile
965 970 975
Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp
980 985 990
Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn
995 1000 1005
Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu
1010 1015 1020
Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu
1025 1030 1035
Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr
1040 1045 1050
Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
1055 1060 1065
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly
1070 1075 1080
Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu
1085 1090 1095
Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly
1100 1105 1110
Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala
1115 1120 1125
Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu
1130 1135 1140
Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu
1145 1150 1155
Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser
1160 1165 1170
Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly
1175 1180 1185
Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln
1190 1195 1200
Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met
1205 1210 1215
Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
1220 1225 1230
Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile
1235 1240 1245
Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser
1250 1255 1260
Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr
1265 1270 1275
Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
1280 1285 1290
Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
1295 1300 1305
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile
1310 1315 1320
Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys
1325 1330 1335
Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr
1340 1345 1350
Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe
1355 1360 1365
Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala
1370 1375 1380
Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro
1385 1390 1395
Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp
1400 1405 1410
Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala
1415 1420 1425
Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys
1430 1435 1440
Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu
1445 1450 1455
Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly
1460 1465 1470
Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val
1475 1480 1485
Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys
1490 1495 1500
Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg
1505 1510 1515
Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro
1520 1525 1530
Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly
1535 1540 1545
Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr
1550 1555 1560
Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu
1565 1570 1575
Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys
1580 1585 1590
Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg
1595 1600 1605
Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala
1610 1615 1620
Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr
1625 1630 1635
Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu
1640 1645 1650
Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln
1655 1660 1665
Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu
1670 1675 1680
Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile
1685 1690 1695
Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn
1700 1705 1710
Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp
1715 1720 1725
Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu
1730 1735 1740
Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu
1745 1750 1755
Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg
1760 1765 1770
Lys Val
1775
<210> 7
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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aaaaaaaaaa aaa 13
<210> 8
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 8
uuuuuuuuuu uuu 13
<210> 9
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 9
aaaaaaaaaa aaa 13
<210> 10
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 10
uuuuuuuuuu uuu 13
<210> 11
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 11
aaaaaaaaaa aaa 13
<210> 12
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 12
uuuuuuuuuu uuu 13
<210> 13
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 13
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 14
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 14
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuu 24
<210> 15
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 15
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 16
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 16
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuu 24
<210> 17
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 17
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 18
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuu 24
<210> 19
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
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uuuuuuuuuu uuu 13
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<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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uuuuuuuuuu uuu 13
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<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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aaaaaaaaaa aaa 13
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<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 24
uuuuuuuuuu uuu 13
<210> 25
<211> 24
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 25
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 26
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 26
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuu 24
<210> 27
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 27
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 28
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuu 24
<210> 29
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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<211> 24
<212> RNA
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<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuu 24
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<212> RNA
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寡核苷酸
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<212> RNA
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<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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uuuuuuuuuu uuu 13
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<212> RNA
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寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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uuuuuuuuuu uuu 13
<210> 35
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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uuuuuuuuuu uuu 13
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<212> RNA
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<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuu 24
<210> 39
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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<210> 40
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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<210> 41
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
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<210> 42
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 42
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuu 24
<210> 43
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 43
aaaaaaaaaa aaa 13
<210> 44
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 44
ututututut utu 13
<210> 45
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 45
aaaaaaaaaa aaa 13
<210> 46
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 46
ututututut utu 13
<210> 47
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 47
aaaaaaaaaa aaa 13
<210> 48
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 48
ututututut utu 13
<210> 49
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 49
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 50
uututututu tututututu tutu 24
<210> 51
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 51
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 52
uututututu tututututu tutu 24
<210> 53
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 53
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 54
uututututu tututututu tutu 24
<210> 55
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 55
aaaaaaaaaa aaa 13
<210> 56
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 56
tttttttttt ttt 13
<210> 57
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 57
aaaaaaaaaa aaa 13
<210> 58
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 58
ttuttttttt ttt 13
<210> 59
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 59
aaaaaaaaaa aaa 13
<210> 60
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 60
tttttttttt ttt 13
<210> 61
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 61
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 62
tttttttttt tttttttttt tttt 24
<210> 63
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 63
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 64
tttttttttt tttttttttt tttt 24
<210> 65
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 65
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 66
tttttttttt tttttttttt tttt 24
<210> 67
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 67
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 68
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 68
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 69
<211> 115
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 69
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuccuuuguu uuugc 115
<210> 70
<211> 115
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 70
ccuuuguuuu ugcuuggcug augaggccgc acaugguuuu agagcuagaa auagcaaguu 60
aaaauaaggc uaguccguua ucaacuugaa aaaguggcac cgagucggug cuuuu 115
<210> 71
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 71
gcaaaaacaa agg 13
<210> 72
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 72
gcaaaaacaa agg 13
<210> 73
<211> 130
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 73
ccuuuguuuu ugcuuggcug augaggccgc acaugguuuu agagcuagaa auagcaaguu 60
aaaauaaggc uaguccguua ucaacuugaa aaaguggcac cgagucggug cuuuuuuccu 120
uuguuuuugc 130
<210> 74
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 74
gcaaaaacaa agg 13
<210> 75
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 75
gcaaaaacaa agg 13
<210> 76
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 76
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu tttccuuugu uuuugc 116
<210> 77
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 77
gcaaaaacaa agg 13
<210> 78
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 78
ccuuuguuuu ugctttggcu gaugaggccg cacaugguuu uagagcuaga aauagcaagu 60
uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuuu 116
<210> 79
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 79
gcaaaaacaa agg 13
<210> 80
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 80
ccuuuguuuu ugctttggcu gaugaggccg cacaugguuu uagagcuaga aauagcaagu 60
uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuuutttc 120
cuuuguuuuu gc 132
<210> 81
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 81
gcaaaaacaa agg 13
<210> 82
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 82
gcaaaaacaa agg 13
<210> 83
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 83
uuuggcugau gaggccgcac augguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 84
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 84
uuuggcugau gaggccgcac augguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 85
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 85
uuuggcugau gaggccgcac augguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 86
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 86
uuuggcugau gaggccgcac augguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 87
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 87
tttggcugau gaggccgcac augguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 88
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 88
tttggcugau gaggccgcac augguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 89
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 89
tttggcugau gaggccgcac augguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 90
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 90
tttggcugau gaggccgcac augguuuuag agcuagaaau agcaaguuaa aauaaggcua 60
guccguuauc aacuugaaaa aguggcaccg agucggugcu uuu 103
<210> 91
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 91
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu ttt 103
<210> 92
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 92
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu ttt 103
<210> 93
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 93
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuuuu 106
<210> 94
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 94
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuuuu 106
<210> 95
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 95
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuuuu 106
<210> 96
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 96
aaaaaaaaaa aaaaaaattt ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc 60
aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 120
tttaaaaaaa aaaaaaaaaa 140
<210> 97
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 97
uuuuuuuuuu uuuuuuu 17
<210> 98
<211> 117
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 98
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu aaaaaaaaaa aaaaaaa 117
<210> 99
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 99
uuuuuuuuuu uuuuuuu 17
<210> 100
<211> 120
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 100
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
<210> 101
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 101
uuuuuuuuuu uuuuuuu 17
<210> 102
<211> 120
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 102
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
<210> 103
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 103
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 104
caggttccat gggatgctct 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 105
ggctgatgag gccgcacatg 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 106
cccatacctt ggagcaacgg 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 107
cccatacctt ggagcaacgg 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 108
cccatacctt ggagcaacgg 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 109
cccatacctt ggagcaacgg 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 110
cccgcacctt ggcgcagcgg 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 111
gagatacctg agtaactttc 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 112
gagatacctg agtaactttc 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
前间隔区序列
<400> 113
gagatacctg agtaactttc 20
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
6xHis标签
<400> 114
His His His His His His
1 5
<210> 115
<211> 200
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(200)
<223> 该序列可包含1-200个核苷酸
<400> 115
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 200
<210> 116
<211> 200
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(200)
<223> 该序列可包含1-200个核苷酸
<400> 116
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 120
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 180
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 200
<210> 117
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(200)
<223> 该序列可包含1-200个核苷酸
<400> 117
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180
tttttttttt tttttttttt 200
<210> 118
<211> 50
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> 该序列可包含3-50个核苷酸
<400> 118
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 50
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 该序列可包含3-20个核苷酸
<400> 119
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 20
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> 该序列可包含3-15个核苷酸
<400> 120
uuuuuuuuuu uuuuu 15
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 121
cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 122
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 122
ggcugaugag gccgcacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 123
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 123
cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 124
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸
<400> 124
cccauacuug gagcaacggg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99
<210> 125
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 125
cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 126
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多核苷酸
<400> 126
gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims (33)

1.一种受体靶向缀合物，其包含式(V)的化合物：
其中，
每个A基团均包含如下结构的N-乙酰半乳糖胺：
L1、L4和L7中的每一个独立地为C2-C6亚烷基；
L2、L5和L8中的每一个独立地为-C(＝O)NR1-或-NR1C(＝O)-；
L3、L6和L9中的每一个独立地为C2-C6亚烷基；
L10为C1-C3亚烷基；
L12为-NR1C(＝O)-或-NR1C(＝O)O-；
L11为-(CH2CH2O)n-，或者-(OCH2CH2)n-；
每个R1独立地为H，或者-CH3；
R包括二烷基甘油；并且
n为选自1至50的整数。
2.根据权利要求1所述的受体靶向缀合物，其中
L1、L3、L4和L7中的每一个为-(CH2)4-；
L2、L5和L8中的每一个为-C(＝O)NH-；
L6和L9中的每一个为-(CH2)3-；并且
L12为-NH(CO)O-或-NH(CO)-。
3.根据权利要求1所述的受体靶向缀合物，其中所述n为1-3、9-15、33-39或41-49。
4.根据权利要求1所述的受体靶向缀合物，其中所述n为33-39。
5.根据权利要求4所述的受体靶向缀合物，其中所述n为33。
6.根据权利要求4所述的受体靶向缀合物，其中所述n为34。
7.根据权利要求4所述的受体靶向缀合物，其中所述n为35。
8.根据权利要求4所述的受体靶向缀合物，其中所述n为36。
9.根据权利要求4所述的受体靶向缀合物，其中所述n为37。
10.根据权利要求4所述的受体靶向缀合物，其中所述n为38。
11.根据权利要求4所述的受体靶向缀合物，其中所述n为39。
12.根据权利要求1所述的受体靶向缀合物，其中所述受体靶向缀合物是选自表4中的1001-1004、1075和1076的缀合物。
13.根据权利要求1所述的受体靶向缀合物，其中所述受体靶向缀合物是其中p和q为2，且n为34。
14.根据权利要求1所述的受体靶向缀合物，其中所述受体靶向缀合物是其中p和q为2，且n为35。
15.根据权利要求1所述的受体靶向缀合物，其中所述受体靶向缀合物是
16.组合物在制备用于降低有需要的对象的冠状动脉疾病风险的药物中的用途，所述组合物包括包封有效负载的脂质纳米颗粒，所述有效负载包含一种或多种药学上的活性药剂，其中所述脂质纳米颗粒还包含如权利要求1所述的受体靶向缀合物。
17.根据权利要求16所述的用途，其中包含所述受体靶向缀合物的所述脂质纳米颗粒在LDLr缺陷型哺乳动物中提供了改善的递送，如通过比不含所述受体靶向缀合物的相应脂质纳米颗粒高至少50％的编辑百分比确定的。
18.根据权利要求16所述的用途，其中包含所述受体靶向缀合物的所述脂质纳米颗粒在缺乏ApoE的哺乳动物中提供了改善的递送，如通过比不含所述受体靶向缀合物的相应脂质纳米颗粒高至少50％的编辑百分比确定的。
19.根据权利要求16所述的用途，其中所述一种或多种活性药剂包含编码基因编辑器核酸酶或碱基编辑器的mRNA以及一种或多种指导RNA。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述mRNA是腺苷碱基编辑器，并且所述一种或多种指导RNA与(i)PCSK9基因的区段、(ii)ANGPTL3基因的区段，或(i)和(ii)两者互补。
21.根据权利要求19所述的用途，其中所述一种或多种指导RNA中的至少一种选自表5的SEQ ID NO:121-126的指导RNA序列。
22.根据权利要求16所述的用途，其中所述受体靶向缀合物占所述脂质纳米颗粒中总赋形剂的0.001mol％至0.5mol％。
23.一种制备包含脂质纳米颗粒的制剂的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸活性药剂，(ii)包含甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质和氨基脂质的脂质赋形剂，以及(iii)权利要求1的受体靶向缀合物，所述方法包括：
a.提供第一溶液，所述第一溶液包含水性缓冲液中的所述一种或多种核酸活性药剂；
b.提供第二溶液，所述第二溶液包含(i)所述脂质赋形剂以及(ii)水溶性有机溶剂中的所述受体靶向缀合物的至少一部分；
c.混合所述第一溶液和所述第二溶液；
d.孵育所述第一溶液和第二溶液的混合物，以形成脂质纳米颗粒；以及
e.任选地进行一种或多种稀释、缓冲液交换、浓缩、过滤和脂质纳米颗粒评估过程。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述水溶性有机溶剂为乙醇。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述混合通过具有第一混合室的在线混合装置进行，所述第一混合室包括单独将所述第一溶液引入至所述第一混合室的第一端口以及单独并同时将所述第二溶液引入至所述第一混合室的第二端口。
26.根据权利要求25所述的方法，其还包括在混合所述第一溶液和所述第二溶液之后，添加所述受体靶向缀合物的第二部分，其中所述受体靶向缀合物的所述第二部分的添加被预溶解于水溶性有机溶剂中并与水性溶液合并，以形成水性稀释缓冲液，所述水性稀释缓冲液在孵育前，在第二混合室中与先前混合的第一溶液和第二溶液混合，所述第二混合室与所述在线混合装置的所述第一混合室相连并在所述第一混合室的下游。
27.根据权利要求26所述的方法，其还包括在添加所述受体靶向缀合物的所述第二部分之后的缓冲液交换过程。
28.一种制备包含脂质纳米颗粒的制剂的方法，其中所述纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)包含一种或多种甾醇或其衍生物、磷脂、隐形脂质或氨基脂质的一种或多种脂质赋形剂，以及(iii)权利要求1所述的受体靶向缀合物，所述方法包括：
a.提供第一溶液，所述第一溶液包含水性缓冲液中的所述一种或多种核酸分子实体；
b.提供第二溶液，所述第二溶液包含水溶性有机溶剂中的所述一种或多种脂质赋形剂中的至少一种；
c.提供第三溶液，所述第三溶液包含所述受体靶向缀合物的至少一部分；
d.在一个或多个混合室中混合所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液，其中经由入口将每种溶液单独引入至所述一个或多个混合室；
e.孵育所述第一溶液、第二溶液和第三溶液的混合物，以形成脂质纳米颗粒；以及
f.任选地进行一种或多种稀释、缓冲液交换、浓缩、过滤和脂质纳米颗粒评估过程。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一溶液包含水性缓冲液，并且其中所述第二溶液和所述第三溶液各自独立地由水溶性醇制备。
30.根据权利要求28所述的方法，其中将所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液同时引入至混合器。
31.根据权利要求28所述的方法，其中在孵育前，将所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液依次引入至混合器。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液在具有与第二下游混合室相连的第一混合室的在线混合器装置中合并，其中所述第一溶液和第二溶液在所述第一混合室中预混合，并立即流入第二混合室，并且其中所述第三溶液在所述第二混合室中与所述第一溶液和第二溶液混合；并且其中所述第三溶液可以任选地包含预溶解于水溶性有机溶剂中的靶向缀合物和/或脂质赋形剂，所述水溶性有机溶剂混合在水性稀释缓冲液中或用水性稀释缓冲液稀释。
33.根据权利要求28所述的方法，其中所述水溶性有机溶剂是乙醇。
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